JPH08505535A

JPH08505535A - 一本鎖ｄｎａ分子の生成方法

Info

Publication number: JPH08505535A
Application number: JP6516386A
Authority: JP
Inventors: ニキフォロフ、テオ; ナップ、マイケル・アール
Original assignee: モレキュラー・ツール，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-01-15
Filing date: 1994-01-18
Publication date: 1996-06-18
Anticipated expiration: 2017-10-07
Also published as: EP0679190A1; ATE239090T1; EP0679190B1; EP0679190A4; JP3330946B2; WO1994016090A1; JP3421664B2; JP2002209594A; AU674211B2; DE69432586T2; AU6126294A; CA2153898A1; DE69432586D1; US5518900A; CA2153898C

Abstract

(57)【要約】一本鎖核酸分子を生成する方法。５'→３’エキソヌクレアーゼに対して耐性となるように、該分子はヌクレアーゼ耐性修飾ヌクレオチドを含む。

Description

【発明の詳細な説明】一本鎖ＤＮＡ分子の生成方法発明の技術分野本発明は、一本鎖ＤＮＡ分子の生成方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、プライマーを介した伸長後に一本鎖核酸分子を生成するための修飾ヌクレオチドおよび５'→３’エキソヌクレアーゼの使用に関する。発明の背景核酸分子の構造、構成および配列の分析は、ヒトおよび動物の疾患の予測、診断および治療、法医学、疫学および公衆衛生、並びに遺伝子発現および発達を制御する因子の解明においてすこぶる重要である。特に重要な３つの分野として、所望の配列にハイブリダイズしうる核酸分子の開発、一本鎖の核酸分子の生成、および核酸分子のヌクレオチド配列の決定がある。Ｉ．核酸ハイブリダイゼーション核酸「プローブ」分子が相補的な核酸「標的」分子にハイブリダイズする（すなわち、塩基対形成する）能力は、広範囲の診断および治療手順の基礎を形成する。ハイブリダイゼーションは、感染疾患の原因となる因子の検出および同定、父性および血統に関する情報の提供、個体が遺伝病にかかる蓋然性の予測、または組織試料の同定に用いられる。かかる手順の診断的価値は、その感度によって決まる。感度は、検出できるように標識したプローブを使用することにより高めることができる。最も一般的な標識として、放射性同位元素標識の使用が挙げられる（フォーカウ(Fo1kow)ら、米国特許第４，３５８，５３５号；バーニンガー（ Berninger）、米国特許第４，４４６，２３７号）。標識の方法およびかかるハイブリダイゼーション反応を行う方法は、たとえば、サンブルック（Sambrook,J .）ら（Ｍolecular Ｃloning:ＡＬaboratory Ｍanual、コールドスプリングハーバーラボラトリーブレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９））およびヘイムズ（Ｈaymes,Ｂ.Ｄ.）ら（Nucleic Acid Ｈybridizatio n,ＡＰractical Ａpproach、ＩＲＬプレス、ワシントン，ＤＣ（１９８５））に開示されている（該文献を参照のため本明細書に引用する）。核酸ハイブリダイゼーション検出アッセイの感度はまた、検出が観察者に報告または表示される仕方を変えることによっても高めることができる。それゆえ、たとえば、検出できるように標識した試薬を使用することによって感度を高めることができる。広範囲の種々のかかる標識が、この目的のために使用されている。クリルスキー（Kourilsky）ら（米国特許第４，５８１，３３３号）は、検出アッセイにおいて感度を高めるために酵素標識を用いることを記載している。蛍光標識（アルバレラ（Albarella）ら、ＥＰ１４４９１４号）、化学標識（シェルドン（Sheldon）IIIら、米国特許第４，５８２，７８９号；アルバレラら、米国特許第４，５６３，４１７号）、修飾塩基（ミヨシ（Ｍiyoshi）ら、ＥＰ１１９４４８号）等もまた、ハイブリダイゼーションを観察する効率を良くするために用いられている。合成によりまたは酵素的に調製した一本鎖核酸プローブを用いたハイブリダイゼーションアッセイは、溶液中（バーク（Ｂerk,Ａ.Ｊ.）ら、Cell １２：７２１〜７３２（１９７７）；フード（Ｈood,Ｌ.Ｅ.）ら、Ｍolecular Ｂiology of Ｅukaryotic Cells：ＡＰroblems Ａpproach、メンロウパーク、カリフォルニア：ベンジャミン−カミングス（１９７５）；ウエットマー（Ｗetmer,Ｊ.Ｇ.）、Ａnn.Ｒev.Ｂlophys.Ｂioeng.５：３３７〜３６１（１９７６）；イタクラ（Ｉtakura,Ｋ.）ら、Ann.Rev.Biochem．53：323〜356（1984））、またはゲル電気泳動もしくは核酸結合膜ブロッティング法とともに行うことができる。このような方法はまた、該プローブのすべてまたは一部に相補的な配列を有する核酸分子を検出することも可能にする（アルウィン（Ａlwine,Ｊ.Ｃ.）ら、Ｐroc.Ｎat l.Ａcad.Ｓci．（ＵＳＡ）７４：５３５０〜５３５４（１９７７）；サザーン（Southern,Ｅ.Ｍ.）、Ｊ.Ｍolec.Ｂiol.９８：５０３〜５１７（１９７５）；ハークら、Cell １２：７２１〜７３２（１９７７）；イタクラら、Ａnn.Ｒev. Ｂiochem .５３：３２３〜３５６（１９８４）；ラドル（Ruddle,Ｆ. Ｈ.）ら、Ｎature ２９４：１１５〜１１９（１９８１）；ホワイト（White,Ｒ. ）ら、Ｓci.Ａmer.２５８：４０〜４８（１９８８）；マッギニス（ＭcＧinnis, Ｗ.）ら、Cell 37：４０３〜４０８（１９８４））。一本鎖核酸プローブはまた、「インシトゥハイブリダイゼーション」と呼ばれる方法において特定の核酸配列の位置をインシトゥで決定するのにも用いることができる（アベルソン（Ａbe lson,Ｊ.）ら、Science ２０９：１３１７〜１４３８（１９８０）；ギルバート（Ｇilbert,Ｗ.）ら、Ｓci.Ａmer.242：74〜94（1980））。ハイブリダイゼーションアッセイはまた、アフィニティークロマトグラフィー法を用いて行うこともできる。この方法では、一本鎖核酸分子（通常はオリゴヌクレオチド）を固体支持マトリックスに固定化し、第二の相補的な一本鎖核酸分子をハイブリダイズするためのプローブとして用いる。単一の所望の核酸分子の効率的な検出および回収は、これら２つの相補的な一本鎖配列が無制限の濃度で存在し、それぞれ実質的に純粋な形態である場合に促進される。たとえば、ギルハム（Ｇilham）ら（Ｊ.Ａmer.Ｃhem.Ｓoc.８６：４９８２（１９６４））およびクレムスキー（Ｋremsky）ら（Ｎucl．Ａcids Ｒes.１５：３１３１〜３１３９（１９８７））によって記載されているように、溶液中のオリゴマーに相補的な固定化（すなわち、固体支持マトリックスに結合させた）オリゴヌクレオチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、高純度の一本鎖オリゴヌクレオチドが溶液から単離されている。相補的なｍＲＮＡ分子にハイブリダイズし、それにより特定のタンパク質の翻訳を減弱するＤＮＡ分子の能力は、ハイブリダイゼーション技術の治療学的応用の基礎をなす。かかる「アンチセンス」法は、抗ウイルスおよび抗癌療法において有意の可能性を有する。アンチセンス法は、ヨーロッパ特許出願公開第２６３，７４０号；３３５，４５１号；および３２９，８８２号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ９０／００６２４号に記載されている（これらすべての文献を参照のため本明細書に引用する）。ハイブリダイゼーション法はまた、ＲＮＡの回収を促進するために活用することもできる。真核生物のｍＲＮＡの場合、このことは、セルロースからなる固体支持マトリックスに結合したポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを有するアフィニティーマトリックスクロマトグラフィーカラム（すなわち、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラム）を用いて行われている。このようなオリゴヌクレオチドは、すべての真核生物のｍＲＮＡ分子の３’末端上に通常認められるポリアデニンｍＲＮＡ「テール」にハイブリダイズすることができる（ギルハム、Ｊ.Ａm er.Ｃhem.Ｓoc .８６：４９８２（１９７１））。かかる一本鎖核酸分子の単離方法は、大量の出発物質を必要とする。 II．核酸分子の増幅試料中の所望の標的核酸分子の存在の検出能は、しばしば、二本鎖および一本鎖のいずれかの形態での該分子の濃度によって制限を受ける。このような多くの情況において、標的の濃度はインビボまたはインビトロのいずれかに基づく増幅系を用いることにより増幅することができる。インビボに基づく増幅系としては、クローニングベクターまたは発現ベクター中での標的ヌクレオチド分子の増殖（すなわち、複製および増幅）による増幅が挙げられる。クローニングベクターおよび発現ベクターは、たとえば、サンブルックら（Ｍolecular Ｃloning:ＡＬaboratory Ｍanual、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９））に開示されている。通常使用されるインビトロに基づく増幅系としては、ＤＮＡ依存性またはＲＮＡ依存性のＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼを用いた酵素的方法が挙げられる。最も広く使用されている核酸増幅法である「複製連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、熱的に安定なＤＮＡポリメラーゼを用いた鋳型に依存した伸長を含む（ムリス（Ｍullis,Ｋ.）ら、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｓymp.Ｑuant.Ｂiol.５１：２６３〜２７３（１９８６）；エーリッヒ（Ｅrlich Ｈ.）ら、ＥＰ５０,４２４号；ＥＰ８４，７９６号、ＥＰ２５８，０１７号、ＥＰ２３７，３６２号；ムリスら、ＥＰ２０１，１８４号；ムリスら、米国特許第４，６８３，２０２号；エーリッヒら、米国特許第４，５８２，７８８号；およびサイキ（Ｓaiki,Ｒ.）ら、米国特許第４，６８３，１９４号）（これら文献を参照のため本明細書に引用する）。ＰＣＲは、増幅しようとする配列の領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて特定の核酸配列の増幅を達成する。ついで、これらプライマーを取り込んだ伸長生成物は、引き続く複製工程の鋳型となる。複製連鎖反応の概説は、ムリス（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｓymp.Ｑuant.Ｂiol.５１：２６３〜２７３（１９８６））；サイキら（Bio/Technology ３：１００８〜１０１２（１９８５））；およびムリスら（Ｍeth.Ｅnzymol.１５５：３３５〜３５０（１９８７））によって提供されている（これら文献を参照のため本明細書に引用する）。他の核酸増幅法としては、転写に基づく増幅系（クウォー（Ｋwoh,Ｄ.）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．（ＵＳＡ）８６：１１７３（１９８９）；ジンジェラス（ＧingerasＴ.Ｒ.）ら、ＰＣＴ出願ＷＯ８８／１０３１５号（優先権：米国特許出願第０６４，１４１号および２０２，９７８号）；ミラー（Ｍiller,Ｈ .Ｉ.）ら、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０６７００号（優先権：米国特許出願第１４６，４６２号）；ダベイ（Ｄavey,Ｃ.）ら（ヨーロッパ特許出願公開第３２９，８２２号））およびライゲーションに基づく増幅系（ウー（Ｗu,Ｄ.Ｙ.）ら、Ｇen omics ４：５６０（１９８９））が挙げられる。増幅法はポリヌクレオチド分子の迅速かつ広範な増幅を達成するのに用いることができるが、かかる方法からは一般に二本鎖のＤＮＡが生成される。それゆえ、これら方法では一般に、二本鎖標的分子のうちの一本鎖を増幅および単離するための選択的な手段を提供することができない。一本鎖ＤＮＡ分子は、一本鎖ＤＮＡバクテリオファージＭ１３を用いて生成することができる（メッシング（Ｍessing,Ｊ.）ら、Ｍeth.Ｅnzymol.１０１：２０（１９８３）；またサンブルックら（Ｍolecular Ｃloning:ＡＬaboratory Ｍanual 、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９））をも参照のこと）。しかしながら、一本鎖ＤＮＡを生成させるためのＭ１３の使用には、クローニングその他の時間のかかる操作が必要であり、それゆえ、Ｍ１３は主としてＤＮＡシークエンシングに用いられている。一般に、この方法は、標的ＤＮＡ分子をＭ１３の一本鎖ＤＮＡ鎖中にクローニングする必要がある。宿主細菌中に導入されたら、この組換えＭ１３ベクターは一本鎖ＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子の生成および押し出しを指令する。一本鎖ＤＮＡ分子を生成させるためにＭ１３を使用することには、幾つかの主たる不都合がある。まず、この方法は標的ＤＮＡのクローニング、および成熟バクテリオファージ粒子の最終的な単離精製を必要とする。従って、この方法は極めて時間のかかる方法である。さらに重要なことには、単離した標的ＤＮＡには不可避的にＭ１３ウイルスのＤＮＡ配列が結合している。Ｍ１３系に伴う他の不都合は、１０００ヌクレオチドよりも大きなＤＮＡ標的分子の不安定性であり、その結果、しばしば所望の組換えＭ１３ファージが失われる。以上の理由により、Ｍ１３はＤＮＡシークエンシング以外の殆どの応用に対して一本鎖ＤＮＡを生成するためには用いられない。一本鎖ＤＮＡ分子を生成させるために、現在、幾つかの方法が用いられている。ギレンステン（Ｇyllensten,Ｕ.）ら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．（ＵＳＡ）８５：７６５２〜７６５６（１９８８））およびミホビロビッチ（Ｍihovilovic ,Ｍ.）ら（ＢioＴechniques ７：１４（１９８９））は、通常は二本鎖ＤＮＡ分子の増幅に用いる標準的な「ＰＣＲ」法の修飾を含む方法を記載している。この修飾ＰＣＲ法（「非対称ＰＣＲ」と称する）では、異なるモル濃度で存在する増幅プライマーを用いる。「非対称ＰＣＲ」法において非対称なプライマー濃度を用いると、制限された濃度のプライマーは最初の１０〜１５増幅サイクルの後に使い果たされてしまう。サイクルを継続すると、制限のないプライマーに由来する一本鎖ＤＮＡが生成する。残念ながら、一本鎖ＤＮＡを得るために「非対称ＰＣＲ」を用いることには幾つかの不都合が存在する。標準的なＰＣＲ法を用いた場合に指数的なＤＮＡ増幅が得られるのとは対照的に、一本鎖ＤＮＡの増幅はサイクル数に関して直線的にしか起こらない。加えて、一本鎖生成物の収率を最適化するには、種々の濃度および比率のプライミングオリゴヌクレオチドを含む幾つかの別々の増幅反応を行うことがしばしば必要となる。それゆえ、標準的非−非対称ＰＣＲなどのような指数的に生成する増幅反応と組み合わせて一本鎖ＤＮＡを生成することの利点は明らかである。ヒグチ（Ｈiguchi,Ｒ.Ｇ.）ら（Ｎucl．Ａcids Ｒes.１７：５８６５（１９８５））は、一本鎖増幅生成物を生成するために現在用いられている他の方法を例示する。この方法は、二本鎖増幅生成物の一方の鎖の５’末端をリン酸化し、ついで５'→３’エキソヌクレアーゼ（λエキソヌクレアーゼなど）により該リン酸化した鎖を優先的に分解させることを必要とする。それゆえ、この方法は幾つかの欠点を有する。この方法の効率は、リン酸化反応の程度と特異性、およびエキソヌクレアーゼによって示される優先さの程度の両方に依存する。５'→３’エキソヌクレアーゼは、完全長の二本鎖ＤＮＡ分子から一本鎖ＤＮＡ断片を調製するのに用いられている。かかる完全長の分子を５'→３’エキソヌクレアーゼの存在下でインキュベートすると、各鎖の５’末端から分解が起こる。第一の鎖の分解は、該鎖に作用しているエキソヌクレアーゼが、第二の鎖に作用しているエキソヌクレアーゼによって分解された該第二の鎖の領域に達するまで続く。それゆえ、この方法では完全長の二本鎖ＤＮＡ分子から２つの「半分の長さの」非相補的な分子が生成する。加えて、他の方法では、一本鎖ＤＮＡ分子を生成するためにホスホロチオエート誘導体のヌクレアーゼ耐性という特性を活用している。ベンコビッチ（Ｂenko vic）ら（米国特許第４，５２１，５０９号；１９８５年６月４日）は、一本鎖ＤＮＡ分子を生成させるために、制限エンドヌクレアーゼおよびホスホロチオエート含有核酸配列の３’→５’エキソヌクレアーゼ耐性という特性を用いた。この方法では制限エンドヌクレアーゼを用い、単一の中断した（recessed）３’ヒドロキシル末端を有する二本鎖分子を生成させる。ホスホロチオエートヌクレオチドを用いて該末端を修飾し、それによりエキソヌクレアーゼ攻撃に対して耐性の鎖を生成させ、かくして一本鎖生成物の生成が可能となる。この方法は、標的ＤＮＡ配列が２つの所望の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有していなければならない点で制限がある。すなわち、第一の部位は中断した３’−ＯＨ末端を生成し、該標的分子の一方の末端になければならず、第二の部位は中断した５’末端を生成し、該標的分子の第二の末端になければならない。この方法の他の制限は、所望の一本鎖ＤＮＡ生成物の生成には高濃度の標的二本鎖ＤＮＡ分子が必要であることである。セイヤーズ（Ｓayers,Ｊ.Ｒ.）ら（Ｎuc1．Ａcids Ｒes.１６：７９１〜８０２（１９８８））は、一本鎖ＤＮＡを生成させるためにホスホロチオエート含有ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ耐性という特性を使用する方法を例示している。この方法では、プライマーを環状の標的分子にハイブリダイズさせる。ついで、ホスホロチオエートヌクレオチドの存在下でプライマー伸長を起こさせて、これらヌクレオチド誘導体が伸長生成物中に取り込まれるようにする。ついで、伸長生成物の末端をライゲートして二本鎖の環状分子を生成させる。環状化した伸長生成物中にホスホロチオエート残基が存在することにより、この鎖は制限エンドヌクレアーゼに対して耐性となる。それゆえ、かかるエンドヌクレアーゼとともにインキュベートすると標的鎖は開裂される。かかる開裂は末端を生成し、ついで該末端はエキソヌクレアーゼによる攻撃を受けることになる。重要なことに、ホスホロチオエート含有鎖のエキソヌクレアーゼ耐性は評価することができない。というのは、該鎖（環状である）はエキソヌクレアーゼの基質ではないからである。ホスホロチオエート含有オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼＩの５'→３’ 「ミスマッチ」エキソヌクレアーゼ活性による分解からオリゴヌクレオチドプライマーを保護することがわかっている（オット（Ｏtt,Ｊ.）ら、Ｂiochem ２６：８２３７〜８２４１（１９８７））。オットらの方法はポリメラーセを用いるので一本鎖ＤＮＡを生成することはできない。この方法は部位特異的突然変異誘発には適しているが、上記面倒で限定されたバクテリオファージＭ１３系を使用する必要がある点で制限される。加えて、セイヤーズらの方法は、標的分子中に制限エンドヌクレアーゼ開裂部位が存在することを必要とする。要するに、核酸分子を操作および活用しうるためには、一本鎖分子種の単離がしばしば必要となる。核酸増幅のための現在の方法は、一般に、二本鎖種の生成をもたらし、それゆえ一本鎖分子の精製した調製物を得るために処理工程がさらに必要となる。 III．核酸分子のシークエンシングＤＮＡ分子の配列を決定するための最初の試みは、ＲＮＡ分子のシークエンシングを可能とすべく開発された技術の拡張であった（サンガー（Ｓanger,Ｆ.）、Ｊ.Ｍolec.Ｂiol.１３：３７３（１９６５）；ブラウンリー（Ｂrownlee,Ｇ. Ｇ.）ら、Ｊ.Ｍolec.Ｂiol.３４：３７９（１９６８））。そのような初期の方法には、（１）酵素的消化（ロバートソン（Ｒobertson,Ｈ.Ｄ.）ら、Ｎature Ｎew Ｂiol .２４１：３８（１９７３）；ジフ（Ｚiff,Ｅ.Ｂ.）ら、Ｎature Ｎe w Ｂiol .２４１：３４（１９７３））；（２）最近傍分析（nearest neighbor a nalysis）（ウー（Ｗu,Ｒ.）ら、Ｊ.Ｍolec.Ｂiol.５７：４９１（１９７１））；および（３）「ワンダリングスポット（Ｗanderings Ｓpot）」法（サンガー、Proc.Ｎatl.Ａcad.Ｓcl．（ＵＳＡ）７０：１２０９（１９７３））によりＤＮＡを特異的に開裂して一層小さな断片とすることが含まれていた。より近年の発展により、ＤＮＡ分子の配列を解明するためによく利用される２つの方法：「ジデオキシ−媒体チェインターミネーター法」、「サンガー法」としても知られる（サンガーら、Ｊ.Ｍolec.Ｂio1.９４．４４１（１９７５））および「マクサム−ギルバート化学分解法」（マクサム（Ｍaxam,Ａ.Ｍ.）ら、Ｐr oc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）７４：５６０（１９７７））が開発された（両文献を参照のため本明細書に引用する）。ジデオキシ−媒体法またはマクサム −ギルバート法のいずれかを用いたＤＮＡのシークエンシング法は、当業者には広く知られている。そのような方法は、たとえば、マニアチスら、ＭolecularＣ loning,a Ｌaboratory Ｍanual、第２版、コールドスプリングハーバープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）およびジスキンド（Ｚ yskind,Ｊ.Ｗ.）ら、Ｒecombinant ＤＮＡＬaboratory Ｍanual、アカデミックプレス、ニューヨーク（１９８８）に開示されている（両文献を参照のため本明細書に引用する）。ジデオキシ−媒体法では、標的分子の配列の決定は４つの別々のプライマー伸長反応を用いて行い、各反応はポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマーおよびＤＮＡを重合するのに必要な４種のヌクレオチド三リン酸を用いて行う。各反応は、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧヌクレオシド三リン酸のいずれかの２'，３'ジデオキシ誘導体の存在下で行う。該誘導体は、デオキシリボースの３’位にヒドロキシル残基が欠けている点で通常のヌクレオチド三リン酸と異なる。それゆえ、これら誘導体は新たに合成されたプライマー伸長物中に導入されうるが、導入は伸長反応の停止となる。４つの反応のそれぞれの正味の結果は、反応に使用した特定のジデオキシ誘導体によってそれぞれ停止された、入れ子状に重なった（nest ed）オリゴヌクレオチドのセットの生成である。かかる反応生成物は、標的分子の配列を得るべく容易に分析することができる。ＤＮＡシークエンシングのマクサム−ギルバート法は、分解法である。この方法では、ＤＮＡ断片の一方の末端を標識し、４つの別々の化学反応で部分開裂する。各反応は、特定の塩基（ＧまたはＣ）または特定のタイプの塩基（Ａ／Ｇ、Ｃ／Ｔ、またはＡ＞Ｃ）においてＤＮＡ分子を特異的に開裂する。上記ジデオキシ法と同様に、かかる反応の結果、その長さがシークエンシングしようとするＤＮＡ分子の長さに沿った特定の塩基の位置によって決定される入れ子状に重なった分子のセットが生成される。入れ子状に重なった反応生成物は標的分子の配列を得るべく分析することができる。一般に、標的分子の配列を決定するために複数のセットの入れ子状に重なったオリゴヌクレオチドを評価する必要があるが、種々の修飾、たとえば複数の識別しうる標識の使用により、増加した配列データを得ることが可能な「複合（mult iplexing）」法が開発された（チャーチ（Church,Ｇ.Ｍ.）ら、Ｓcience２４０：１８５〜１８８（１９８８）；チャーチら、米国特許第４，９４２，１２４号；テーバー（Tabor）ら、米国特許第４，９６２，０２０号；プローバー（Ｐrob er,Ｊ.Ｍ.）ら、Ｓcience ２３８：３３６〜３４０（１９８７））。マチェビッツ（Ｍacevicz,Ｓ.Ｃ.）によって記載された方法（米国特許第５，００２，８６７号）などの他の「複合」シークエンシング法は、複数の混合オリゴヌクレオチドプローブを用いたＤＮＡまたはＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の決定法に関する。配列情報は一連のハイブリダイゼーションを行うことによって得られ、その結果は、配列を決定しようとするＲＮＡまたはＤＮＡ中に起こるプローブ配列の相補性（complement）が起こる回数を各プローブに与える。ＲＮＡまたはＤＮＡのヌクレオチド配列を、この情報およびプローブ配列の知見から再構築する。配列を決定しようとする核酸を本明細書では標的配列と称する。ＤＮＡの二本鎖構造が配列分析手順を複雑にしている。ＤＮＡの二本の鎖は対称的で化学的に同一であるので、ＤＮＡ分子の両方の鎖を用いて行った配列分析からは２つの区別できないセットの配列データが得られる。それゆえ、二本の鎖のうちの一方のみを含むＤＮＡの調製物を用いて配列分析を行うことが非常に望ましい。残念ながら、これらＤＮＡ鎖は化学的に区別できないので、一方の鎖のみを含有するＤＮＡ調製物を得ることは一般に極めて困難である。ジデオキシシークエンシング法は、一本鎖のＤＮＡ源（バクテリオファージＭ１３またはファージミドベクター（サンブルックら、Ｍolecular Ｃloning,a ＬaboratoryＭanu al、第２版、コールドスプリングハーバープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９））（該文献を参照のため本明細書に引用する）など）を用いるかまたは標的分子の一方の鎖にのみ結合しうるプライマーを用いることによって、この問題を回避しようと試みている。認識されるであろうように、標的分子の配列は未知であるので、特定のプライマーが両ＤＮＡ鎖にハイブリダイズしないというアプリオリな保証はあり得ない。マクサム−ギルバート法の場合は、一般に標的分子の両鎖を標識し、これら鎖の一方の鎖から標識を選択的に除去する必要がある。これら操作は核酸配列の決定を複雑にする。一本鎖ＤＮＡを調製するための上記方法の欠点に鑑み、また種々の分子生物学および医学的手順に対するかかる方法の重要性に鑑み、所望の標的分子の単一の鎖を優先的に生成する、核酸増幅手順と組み合わせて用いることのできる方法が極めて望ましい。本発明は、かかる方法を提供するものである。発明の要約：本発明は、プライマーによって媒体された伸長または増幅反応の後に一本鎖ＤＮＡ分子を生成する方法を提供する。かかる分子はハイブリダイゼーションプローブとして、また核酸シークエンシングにおいて有用である。詳細には、本発明は、相補的な配列の核酸分子を実質的に含まない、所望の一本鎖核酸分子の生成方法を提供するものであり、該方法は、下記工程：（Ａ）前以て選択した核酸分子をプライマー分子の存在下でインキュベートし、その際、該プライマー分子は該前以て選択した分子にハイブリダイズすることができ、該プライマー分子は５'→３’エキソヌクレアーゼに対して耐性の領域を含み；（Ｂ）鋳型に依存した該プライマーの伸長を行って該所望の核酸分子を生成させ；ついで（Ｃ）該前以て選択した分子を除去するに充分な条件下で該インキュベーション液に５'→３’エキソヌクレアーゼを加え、それにより相補的な配列の核酸分子を実質的に含まない該所望の一本鎖分子を得るからなることを特徴とする。本発明はさらに、工程Ｂにおいて、所望の核酸分子を生成した後に、該分子にハイブリダイズすることができ鋳型に依存した仕方で伸長しうる第二のプライマー分子の存在下で該分子をインキュベートし、それにより該所望の分子の配列に実質的に相補的な配列を有する核酸分子を生成させる、上記方法の態様を包含する。本発明はまた、約１０〜約３０ヌクレオチドの長さを有し、５'→３’エキソヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチドを含有するプライマー分子にハイブリダイズした標的核酸分子を含む組成物をも提供する。本発明はとりわけ、５'→３’エキソヌクレアーゼに耐性の領域のエキソヌクレアーゼ耐性が複数のホスホロチオエートヌクレオチド誘導体によって付与される上記方法の態様に関する。本発明はまた、目的核酸中の特定の位置におけるヌクレオチド塩基を同定する方法であって、（Ａ）目的核酸が二本鎖である場合には、該特定の位置を包含する不対ヌクレオチド塩基を得るために該核酸を含有する試料を処理し、または該目的核酸が一本鎖である場合は直接工程（Ｂ）を用い、その際、該目的核酸は該目的核酸の所定の領域に５'→３’エキソヌクレアーゼ耐性を付与するに充分な数の５'→３’エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を含有し、（Ｂ）工程（Ａ）からの試料を、ハイブリダイズ条件下、同定しようとするヌクレオチド塩基の直ぐ隣に目的核酸中に存在するヌクレオチド塩基の連なりとハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて該プライマーと該目的核酸との間に二本鎖を生成させることにより、同定しようとするヌクレオチド塩基が該二本鎖中のプライマーの３’末端の直ぐ下流の鋳型中の最初の不対塩基となるようにし、（Ｃ）工程（Ｂ）からの二本鎖を、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＴＴＰの実質的不在下、少なくとも２つの異なるヌクレオチド三リン酸誘導体と接触させ、該誘導体は該最初の不対塩基に相補的な誘導体を含み、核酸鋳型に依存したプライマー伸長反応のターミネーターであり、その際、該ターミネーターの少なくとも一つは検出可能なマーカーで標識されており、該接触を該相補的ターミネーター誘導体と該最初の不対塩基との塩基対形成を可能とするに充分な条件下で行い、（Ｄ）該相補的ターミネーター誘導体をプライマーの３’末端中に導入するに充分な鋳型依存プライマー伸長反応を起こさせ、（Ｅ）該導入された誘導体を同定し、それにより該目的核酸中の特定の位置におけるヌクレオチド塩基を同定することを特徴とする方法を提供する。本発明はまた、上記工程（Ｃ）において、工程（Ｂ）からの二本鎖を４つのターミネーターと接触させ、その際、これらターミネーターのうちの一つのみが検出可能なマーカーを有し、工程（Ｃ）を４回行い、これらターミネーターの異なる一つが各回において標識されている上記方法の態様、または工程（Ｃ）において、工程（Ｂ）からの二本鎖を４つの標識したターミネーターと接触させ、これらターミネーターがそれぞれ異なる検出可能な標識を有する上記方法の態様を包含する。本発明はまた、複製連鎖反応の所望のエキソヌクレアーゼ耐性増幅生成物の検出方法であって、（Ａ）２つのプライマー分子を用いて複製連鎖反応を行い、その際、該プライマー分子の一つは該プライマーの５’末端に充分な数（最も好ましくは約４）のホスホロチオエートヌクレオチド誘導体を含むことによって該末端に５'→３’エキソヌクレアーゼに対する耐性が付与され、該反応は二本鎖増幅生成物を生成するに充分なものであり、（Ｂ）ついで、オリゴヌクレオチドにエキソヌクレアーゼに対する耐性を付与する充分な数のホスホロチオエート結合を欠くオリゴヌクレオチドを分解する条件下、増幅生成物を５'→３’エキソヌクレアーゼで処理し、（Ｃ）固体支持体に結合した相補的オリゴヌクレオチドに複製連鎖反応の所望の増幅生成物をハイブリダイズさせることにより、複製連鎖反応の所望の増幅生成物を検出することを特徴とする方法をも包含する。本発明はまた、複製連鎖反応間での交差汚染を最小にする方法であって、該反応のプライマー分子の少なくとも一つは該プライマーの３’末端に充分な数（すなわち、約４）のホスホロチオエートヌクレオチド誘導体を含むことによって５ '→３’エキソヌクレアーゼに対する耐性が付与され、該複製連鎖反応を行った後、該反応の増幅生成物を該５'→３’エキソヌクレアーゼの存在下、充分な数のホスホロチオエート結合を欠く未使用のプライマーのオリゴヌクレオチド領域および増幅生成物の分解を起こさせるに充分な条件下でインキュベートし、該分解により該未使用のプライマーおよび該増幅生成物をさらなる複製連鎖反応において基質として働き得ないようにさせ、それにより複製連鎖反応間での交差汚染を最小にすることを特徴とする方法をも包含する。本発明はまた、密接な区画において、第一のプライマーを入れた第一の容器（該第一のプライマーはホスホロチオエートヌクレオチド誘導体を含む）と、ホスホロチオエートヌクレオチド誘導体を欠く第二のプライマーを入れた第二の容器とを含み、これら２つのプライマーを前以て決定した遺伝子配列を増幅するのに用いることができるように特別に適合させたキットをも包含する。好ましい態様の記載：Ｉ．はじめに本発明は、とりわけＰＣＲなどのインビトロ増幅手順による二本鎖核酸分子の調製後、一本鎖ＤＮＡ分子を生成する方法を提供する。該方法は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を使用し、化学合成または酵素的手段によってこれら誘導体を天然に存在するヌクレオチドの代わりにプライマー分子中に取り込ませる。本発明を使用することによって得ることのできる分子は、数ヌクレオチドから数キロベースの範囲の長さを有する。本発明の「所望の」分子とは、核酸分子の「標的」鎖の配列に「相補的な」または実質的に相補的な配列を有するものをいう。本明細書において、２つの分子が少なくとも通常の「低厳格」条件下で互いにアニールしたまま保持されるほど充分安定に互いにハイブリダイズしうるならば、これら２つの分子は相補的であるという（サンブルックら、Ｍolecular Ｃlon ing,a Ｌaboratory Ｍanual、第２版、コールドスプリングハーバープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）参照）（該文献を参照のため本明細書に引用する）。標的分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよい。標的分子はまた、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。「標的」分子が二本鎖である場合は、本発明は、これら鎖を「標的」鎖または「相補」鎖（その配列は該標的配列に相補的である）のいずれかとして区別する。標的分子が二本鎖である場合は、かかる鎖のいずれかを生成させるために本発明の方法を用いることができる。重要なことに、本発明の方法によれば、標的分子と同じ長さを有する一本鎖分子を生成させることができる。完全長の分子（完全長の分子の断片のみを含む分子ではなく）を生成できることは、シークエンシング分析を極めて簡単にし、ハイブリダイゼーションプローブの調製を簡易にする。本発明は、標的分子の性質、起源または配列のいかんにかかわらず一本鎖分子を生成させることができる。それゆえ、本発明は、ウイルス（たとえば、ライノウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶなど）、細菌（たとえば、エシェリキア（Ｅscherichia）、クロストリジウム(Ｃlostridium）、マイコバクテリウム（Ｍycobacterium）、ネイセリア（Ｎeisseria）、マイコプラズマ（Ｍycoplasma）、ビブリオ（Ｖibrio）、クラミジア（Ｃhlamydia）、リケッチアなど）、酵母、真菌、その他の低級真核生物中に存在する配列のような天然に存在する配列を有する一本鎖分子を生成させるために用いることができる。とりわけ、本発明は、植物細胞または動物細胞（とりわけ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコまたはヒトなどの哺乳動物細胞）中に存在する配列を有する一本鎖分子を生成するために用いることができる。本発明はまた、純粋にまたは部分的に合成的な（すなわち天然に存在しない）一本鎖分子を生成するために用いることができる。重要なことに、本発明の方法は、生成する一本鎖分子を天然では結合している他の配列を「実質的に含むことなく」得ることを可能にする。本明細書において「実質的に含むことなく」とは、得られる配列またはその相補鎖に天然では結合している少なくとも一つの他の配列の削減または排除をいう。本発明は、エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を含む「プライマー」分子の使用および伸長によりかかる一本鎖分子の生成を達成する。かかる修飾ヌクレオチド誘導体の例示はゾン（Ｚon,Ｇ.）ら（Ａnti−Ｃancer Ｄrug Ｄesign ６：５３９〜５６８（１９９１））およひグッドチャイルド（Ｇoodchild,Ｊ）ら（Ｂioconjugate Ｃhem.１：６１３〜６２９（１９９０））により開示されている（両文献を参照のため本明細書に引用する）。一般に、適当なヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドのリン酸残基の非架橋酸素の一つまたは二つが硫黄含有基（とりわけ、ホスホチオエート）、アルキル基（とりわけ、メチルまたはエチルアルキル基）、窒素含有基（とりわけ、アミン）、および／またはセレン含有基等で置換されている誘導体が挙げられる。本発明の目的のためには、ホスホロチオエートヌクレオチド誘導体が最も好ましい誘導体である。ホスホロチオエートヌクレオチド誘導体（たとえば、ヌクレオシド５’−Ｏ−１−チオ三リン酸）は、オルトリン酸残基の酸素原子の代わりに非架橋性の（すなわち、モノ配位（monocoordinate））硫黄を含有する。理解されるであろうように、硫黄の導入により２つの立体異性体を形成することが可能になる。かかるラセミ混合物は本発明の目的に適している。重要なことに、選択したヌクレオチド誘導体はインビトロプライマー媒体伸長に適していなければならず、該誘導体を導入した核酸分子の領域にヌクレアーゼ耐性を付与しなければならない。最も好ましい態様において、該誘導体は、二本鎖ＤＮＡを５’末端から攻撃するエキソヌクレアーゼ（「５'→３’エキソヌクレアーゼ」）に対して耐性を付与しなければならない。かかるエキソヌクレアーゼの例としては、バクテリオファージＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ（「Ｔ７エキソヌクレアーゼ）およびバクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ（「 λエキソヌクレアーゼ」）が挙げられる。Ｔ７エキソヌクレアーゼもλエキソヌクレアーゼもともにホスホロチオエート結合の存在によって有意の程度に抑制されるため、鎖の一方の選択的な分解が可能となる。しかしながら、この目的のためにあらゆる二本鎖特異的な５'→３’エキソヌクレアーゼを用いることができるが、その活性がヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体の結合の存在によって影響を受けることを条件とする。ホスホロチオエート誘導体を用いる場合に好ましい酵素はＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼであり、該酵素は、Ｔａｑポリメラーゼを含む多くのＤＮＡ依存ポリメラーゼ緩衝液に使用されるのと同じ緩衝液中で最適の酵素活性を示す。ホスホロチオエート誘導体を含有するＤＮＡ分子の５' →３’エキソヌクレアーゼ耐性特性は、たとえば、クンケル（Ｋunkel,Ｔ.Ａ.）（Ｎucleic Ａcids and Ｍolecular Ｂiology、Ｖｏl.２、１２４〜１３５（エックスタイン（Ｅckstein,Ｆ.）ら編）、シュプリンガーーフェアラーク、ベルリン、（１９８８））に記載されている。ホスホロチオエートヌクレオチド含有核酸分子の３'→５’エキソヌクレアーゼ耐性特性は、パットニー（Ｐutney,Ｓ. Ｄ.）ら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）７８：７３５０〜７３５４（１９８１））およびグプタ（Ｇupta,Ａ.Ｐ.）ら（Ｎucl．Ａcids．Res.、１２：５８９７〜５９１１（１９８４））に開示されている。かかるエキソヌクレアーゼに対する耐性に加え、制限エンドヌクレアーゼ開裂認識部位にホスホロチオエート誘導体を含有する核酸分子は該開裂に対しても耐性である。テイラー（Ｔaylor,Ｊ.Ｗ.）ら（Ｎucl．Ａcids Ｒes.１３：８７４９〜８７６４（１９８５））は、ホスホロチオエートヌクレオチド含有核酸分子のエンドヌクレアーゼ耐性特性を記載している。ホスホロチオエート結合のヌクレアーゼ耐性は、ＤＮＡ増幅プロトコールにおいて利用されている（ウォーカー（Ｗalker,Ｔ.Ｇ.）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓ ci．（ＵＳＡ）８９：３９２〜３９６（１９９２））。ウォーカーらの方法においては、ホスホロチオエートヌクレオチド誘導体を二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖中の制限エンドヌクレアーゼ認識部位内に組み込む。ホスホロチオエートヌクレオチド誘導体の存在は該鎖を開裂から保護し、それゆえ、保護していない鎖が制限エンドヌクレアーゼによって切れ目を生じる結果となる。増幅は、鎖の切れ目生成および重合の繰り返しによって行う。同様に、このヌクレアーゼ攻撃に対する耐性は、修飾「サンガー」シークエンシング法の基礎として用いられている（ラベイト（Ｌabeit,Ｓ.）ら、ＤＮＡ５：１７３〜１７７（１９８６））。ラベイトらの方法においては、「サンガー」法のジデオキシヌクレオチドの代わりに³⁵Ｓ−標識したホスホロチオエートヌクレオチド誘導体を用いた。示したように、一本鎖分子を生成させる試みにおいて他の方法（非対称ＰＣＲなど）が用いられている。本発明の方法は、二本鎖のＰＣＲ生成物を正確に同じ長さの一本鎖生成物に定量的に変換するという利点を提供する。第二に、使用したエキソヌクレアーゼはＰＣＲ塩中で最適の酵素活性を示し、それゆえ、エキソヌクレアーゼ処理の前に精製または緩衝液の交換を必要としない。最後に、得られた一本鎖分子はＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼによるさらなる分解に対して完全に耐性である。本明細書において「プライマー」とは、「鋳型に依存した」伸長反応においてヌクレオチドの共有結合付加によって伸長することのできる一本鎖のオリゴヌクレオチドまたは一本鎖のポリヌクレオチドをいう。このような能力を有するためには、プライマーは３’ヒドロキシル末端を有していなければならず、第二の核酸分子（すなわち、「鋳型」）にハイブリダイズすることができなければならない。プライマーは一般に１１塩基またはそれより長い。最も好ましくはプライマーは２５塩基であるが、一層短いまたは一層長いプライマーも充分に用いることができる。「鋳型に依存した」伸長とは、伸長した配列が核酸鋳型の配列に相補的となるように、プライマーの伸長を媒体するポリメラーゼの能力をいう。「ポリメラーゼ」は、核酸分子が適当な鋳型核酸分子にハイブリダイズしたならば、ヌクレオシド三リン酸を取り込んで該核酸分子の３’ヒドロキシル基を伸長しうる酵素である。ポリメラーゼ酵素は、ワトソン（Ｗatson,Ｊ.Ｄ.）のＭolecular Ｂiology of the Ｇene、第３版、ベンジャミン、メンロパーク、カリフォルニア（１９７７）（参照のため本明細書に引用する）および同様の教科書に記載されている。増幅の目的のためには、好ましいＤＮＡポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼ（シータス（Ｃetus））である。他のポリメラーゼ、たとえば細菌の大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩの大きなタンパク質加水分解断片（通常、「クレノウ」ポリメラーゼとして知られる）、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ、およびバクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼなどもまた、本明細書記載の方法を行うために用いることができる。プライミング、プライマー伸長または鎖置換の速度または程度を増加させる条件または薬剤は、本発明の方法で得られる増幅の程度を増加させることができる。たとえば、ヘリカーゼまたは一本鎖核酸結合タンパク質の添加はＤＮＡポリメラーゼの鎖置換速度を増大させることができ、またはもともと実質的な増幅を与えないＤＮＡポリメラーゼの使用を可能とする。増幅反応に用いるすべての酵素は、同じ反応条件下で活性である。確かに、すべての酵素がほぼその最適反応条件となる緩衝液が存在する。Ｍｇ⁺⁺などの必要なコファクター、およびｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰまたは他のヌクレオシド三リン酸を、所望な増幅の程度を支持するのに充分な量で反応混合物に加えるのが望ましい。等価なヌクレオシド三リン酸類似体等（ピッチリルリ（Ｐiccirilli，Ｊ.Ａ.）ら、Ｎature ３４３：３３〜３７（１９９０））を上記のものの代わりにまたは上記のものに加えて用いることができるが、増幅が所望の程度まで進行しないほどに塩基対形成、ポリメラーゼおよび鎖置換機能が悪影響を受けないことを条件とする。本発明の特定の態様において使用する条件を定めるに際しては、増幅効率を減弱させるプライマー媒体の標的独立な反応が起こるかもしれないので、該反応をアッセイの最適化の間に調べる必要がある。この理由のため、それ自体の上でプライミングできないプライマーを選択する必要がある。プライマーはまた、異常なプロモーター独立の転写反応においてＤＮＡ鋳型としても働く（クルップ（Ｋ rupp,Ｇ.）ら、Ｎucl．Ａcids Ｒes.１７：３０３２〜３０３６（１９８９））。起こり得る妨害反応の蓋然性を最小限にするため、好ましくは候補のプライマーを増幅工程に用いる前にこれら問題を扱う反応において試験すべきである。本発明の好ましい態様において、本発明の一本鎖分子またはその増幅生成物を検出可能なように標識する。検出可能な標識のいかなる適当な手段も用いることができる。それゆえ、標識は酵素標識、蛍光標識、放射性同位体標識、化学ルミネセンス標識などであってよい。適当な酵素標識の例としては、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アルファ−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カタラーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、グリコアミラーゼ、ルシフェラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ウレアーゼ、および酵母−アルコールデヒドロゲナーゼが挙げられる。適当な蛍光標識の例としては、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、ｏ−フタルアルデヒド標識、フルオレスカミン標識などが挙げられる。適当な化学ルミネセンス標識の例としては、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジンエステル標識、イミダゾール標識、アクリジン塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、エクオリン標識などが挙げられる。 II．本発明の好ましい方法示したように、本発明は、エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体、最も好ましくはホスホロチオエートテオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド誘導体を含むプライマー分子を用いることにより一本鎖分子の生成を達成するこのである。このようなホスホロチオエート誘導体を製造するために種々の化学的方法のいずれをも用いることができる（たとえば、ゾンら、Ａnti−Ｃanc.Ｄr ug Ｄes .６：５３９〜５６８（１９９１）；キム（Ｋim,Ｓ.Ｇ.）ら、Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun .１７９：１６１４〜１６１９（１９９１）；ブー（Ｖu, Ｈ.）ら、Ｔetrahedron Ｌett.３２：３００５〜３００８（１９９１）；テイラー（Ｔaylor,Ｊ.Ｗ.）ら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.１３：８７４９〜８７６４（１９８５）；エックスタインら、Biochemistry １５：１６８５〜１６９１（１９７６），ルードウィッヒ（Ｌudwig,Ｊ.）ら、Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.５４：６３１〜６３５（１９８９））。ホスホロチオエートヌクレオチド誘導体はまた、アマーシャムまたはファルマシアから市販されている。最も好ましい態様において、ホスホロチオエート誘導体はプライマー中に含まれる。好ましくは、プライマー分子は長さが約２５ヌクレオチドであり、約４％〜約１００％、一層好ましくは約４％〜約４０％、最も好ましくは約１６％のホスホロチオエート残基（全残基と比較して）を含む。これらヌクレオチドはプライマーのいずれの位置にも導入することができ、互いに隣接していてもよいし、またはプライマーの全体または一部にわたって分散していてもよい。しかしながら、最も好ましくは、ホスホロチオエート残基は互いに隣接していて、プライマーの５’末端に導入される。一つの態様において、本発明は増幅プロトコール、たとえばＰＣＲとともに用いることができる。この態様においては、非修飾プライマーに対して確立されているＰＣＲプロトコールを変えることなくプライマーをＰＣＲ反応において用いることができるように、プライマーのホスホロチオエート結合の数を約１０（またはプライマーの長さの約半分）に制限するのが好ましい。プライマーがもっと多くのホスホロチオエート結合を有していると、反応を最適化するためにＰＣＲ条件を調節し、とりわけアニーリング温度の調節をする必要がある。４未満のホスホロチオエートの導入ではエキソヌクレアーゼ保護が不完全となる。それゆえ、４つのホスホロチオエート結合を含有するプライマーを用いるのが好ましい。かかるヌクレオチド誘導体のＤＮＡまたはＲＮＡ中への導入は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて酵素的に行うことができる（フォスバーグ（Ｖosberg,Ｈ.Ｐ.）ら、Ｂiochemistry １６：３６３３〜３６４０（１９７７）；バーガーズ（Ｂur gers,Ｐ.Ｍ.Ｊ.）ら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２５４：６８８９〜６８９３（１９７９）；クンケル、Ｎucleic Ａcids and Ｍolecular Ｂiology、Ｖｏｌ.２、１２４〜１３５（エックスタインら編）、スプリンガー−フェアラーク、ベルリン（１９８８）；オルセン（Ｏlsen,Ｄ.Ｂ.）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）８７：１４５１〜１４５５（１９９０）；グリープ（Ｇriep,Ｍ.Ａ.）ら、Ｂio chemistry ２９；９００６〜９０１４（１９９０）；セイヤーズら、Ｎucl．Ａc ids Ｒes .１６：７９１〜８０２（１９８８））。別法として、ホスホロチオエート誘導体はオリゴヌクレオチド中に合成的に導入することができる（ゾンら、Ａnti−Ｃanc.Ｄrug Ｄes .６：５３９〜５６８（１９９１））。プライマー分子を相補的な鋳型核酸分子にハイブリダイズさせ、ついで好ましくはポリメラーゼにより伸長されて伸長生成物を生成する。プライマー中にホスホロチオエートヌクレオチドが存在すると伸長生成物にヌクレアーゼ攻撃に対する耐性が付与される。示したように、ホスホロチオエートまたは他の適当なヌクレオチド誘導体を含有する増幅生成物は、Ｔ７エキソヌクレアーゼやλエキソヌクレアーゼなどの「５'→３’」エキソヌクレアーゼによる「除去」（すなわち分解）に対して実質的に耐性であり、それゆえ、５'→３’エキソヌクレアーゼは複数のホスホロチオエート残基（最も好ましくは約４（すなわち、３〜５））に出会ったところで核酸分子をさらに分解することは実質的にできないであろう。もっと多くの数のホスホロチオエート残基を使用することは、４つのかかる残基を使用するのと等価である。標的分子はヌクレアーゼ耐性残基を欠くので、伸長生成物およびその鋳型（標的）を５'→３’エキソヌクレアーゼの存在下でインキュベートすると鋳型鎖が破壊される結果となり、かくして所望の一本鎖の優先的な生成が達成される。 III．本発明によって生成した一本鎖分子の使用Ａ．ハイブリダイゼーション基質示したように、標的分子は一本鎖または二本鎖のいずれであってもよく、またＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。本発明の方法は二本鎖分子を増幅して一本鎖分子種を生成することができるが、これら鎖のうちのいずれを増幅すべきかについては制限がない。ＰＣＲなどの方法は最初の標的分子が一本鎖であるか二本鎖にかかわらず二本鎖分子の増幅という結果になるので、本発明は最初の二本鎖分子のいずれの鎖も生成させることができる。同様に、一本鎖分子の最初の鎖か、または該鎖の相補鎖のいずれをも本発明の方法により生成することができる。それゆえ、たとえば、本発明はｍＲＮＡ分子の配列に対応するｃＤＮＡを生成するのに用いることができるし、または該ｍＲＮＡ分子にハイブリダイズしうる「アンチセンス」分子を生成するのに用いることもできる。「アンチセンス」分子は、組織（血液、脊髄液、腫瘍組織等を含む）、食物、水、牛乳などに存在する病原菌（ウイルスかまたは細菌）を検出および同定するのに用いることができる。アンチセンス分子はまた、潜伏性のウイルスまたは細菌感染の持続性または重要性を評価するのに用いることもできる。このような使用の一つの態様において、本発明によって生成した一本鎖分子を好ましくは検出可能なように標識し、標的分子のハイブリダイゼーションプローブとして用いる。他の態様において、本発明の一本鎖分子（標識しているかまたは標識していない）をＰＣＲまたは他の手段を用いて増幅して、検出可能なように標識された増幅生成物を生成させることができる。そのような標識は、所望なら増幅生成物中のいたるところに導入することができるので、この態様は末端標識によって得られるものよりも比活性の高い標識を可能とする。アンチセンス分子の治療学的用途は、該分子が細胞内に導入されたときに相捕的な配列のｍＲＮＡ分子にハイブリダイズし、それにより該ｍＲＮＡ分子の遺伝子産物への翻訳を損なう（すなわち、減弱または妨害する）能力によるものである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして機能するためには、核酸分子は、標的ｍＲＮＡの翻訳を媒体する標的ｍＲＮＡ分子（または遺伝子）の部位に結合またはハイブリダイズすることができなければならない。本明細書に開示した方法によって生成した一本鎖核酸分子はまた、核酸配列変異のオワゴヌクレオチドに基づく診断アッセイ、とりわけゴエレット（Ｇoelet, Ｐ.）らによって開示された「ジェネティック・ビット・アナリシス（Ｇenetic Ｂit Ａnalysis）」（「ＧＢＡ^TM」）法（ＷＯ９２／１５７１２、参照のため本明細書に引用する）に使用するようなオリゴヌクレオチドを得るのに用いることもできる。ＧＢＡ^TMは、迅速な非放射性固相アッセイ手順による核酸試料中の単一ヌクレオチド遺伝子多型を検出する方法である。本質において、遺伝子座特異的なＤＮＡプライマーを固相に結合させ、ゲノム鋳型にハイブリダイズさせ、ついで配列に依存した仕方で好ましくはクレノウまたはＴ７ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させる。この鎖伸長反応の基質は、好ましくは、共有結合により結合したビオチン残基を有する新規な鎖停止性のジデオキシヌクレオチドである。ついで、所定の反応において導入された特定の塩基を、市販の酵素コンジュゲートを用いた比色反応により読み取ることができる。これら反応はＥＬＩＳＡ様の９６−ウエルフォーマットに適合され、標準ロボット液体操作システム（standard robotic liquid handling systems）を用いて自動化されている。近代的な遺伝子マッピング戦術は、ゲノムに沿って空間的に密な間隔にある情報性遺伝子マーカーの蓄積によっている。ＧＢＡ^TMの利点の一つは、標準的な反応条件を使用することにより、新たに定められた単一ヌクレオチド多型のための試験を容易に開発することができることである。ＧＢＡ^TMはまた、新たなマーカーの情報付与性（informativeness）を都合よく評価できるように、ある集団における予備的な対立遺伝子頻度（preliminary allelic frequencies）の迅速な決定を可能とする。それゆえ、ＧＢＡ^TMにおいては、定められた配列（標的分子に相補的である）を有する精製オリゴヌクレオチドを固相支持体に結合させる。標的分子を含有すると思われる試料を該支持体に接触させて置き、存在する標的分子を該結合オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。一つの態様においては、たとえば、ニッカーソン（Ｎickerson）らによって記載されているように（Ｐroc.Ｎatl.Ａca d. Ｓci．（ＵＳＡ）８７：８９２３〜８９２７（１９９０））、３’末端がプライマー伸長の基質として働きうるように該オリゴヌクレオチドの５’末端を固相支持体に結合させる。所望の分子の存在は、標識したヌクレオチドがプライマー依存性ポリメラーゼによって該結合オリゴヌクレオチドの３’末端に導入されることによって決定する。本発明の方法は、検出可能なリポーター基の結合のために修飾したオリゴヌクレオチドまたは固相支持体マトリックスへの結合のために修飾したオリゴヌクレオチドを含む修飾一本鎖オリゴヌクレオチドを調製するのに用いることができる（ルース（Ｒuth,Ｊ.Ｌ.）、米国特許第４，９４８，８８２号）。本発明の方法は、幾つかの顕著な利点を提供する。本発明は、プライマーに基づく核酸増幅反応、たとえばＰＣＲによる二本鎖ＤＮＡ分子の合成後に、完全長または部分的な長さの一本鎖ＤＮＡ分子を調製するための極めて便利で信頼性の高い方法を提供する。重要なことに、ヌクレアーゼ感受性鎖の分解を、二本鎖ＰＣＲ増幅生成物を前以て単離または精製することなしに行うことができる。ヒグチ（Ｈiguchi,Ｒ.Ｇ.）らの従来記載された方法では過剰のλエキソヌクレアーゼを用いたとしても一般に５０〜７０％の変換しか得られなかったのと対照的に、本発明の方法では一般にヌクレアーゼ感受性鎖の完全に定量的な分解が得られる。Ｂ．増幅上記に示唆したように、本発明の方法は、二本鎖分子のうちの一本鎖を特異的に増幅させるためにインビトロ増幅手順と都合よく組み合わせることができる。この本発明の側面はＰＣＲに関して以下に説明してあるが、従来記載された増幅手順のいずれをも用いることができる。この目的のため、一方のプライマーのみがホスホロチオエートヌクレオチドなどのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を含むように修飾した２つのプライマーを用いてＰＣＲを行う。得られるヌクレオチド耐性結合は二本鎖ＰＣＲ増幅生成物の「標的鎖」の必要不可欠の部分となる。対照的に、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を欠くプライマーから生成した、ＰＣＲ増幅生成物の「相補鎖」はヌクレアーゼ分解に感受性である。ＰＣＲ増幅後、得られた二本鎖ＤＮＡ生成物は、一方の鎖の５’末端のみにホスホロチオエート結合を含んでいるであろう。それゆえ、適当な二本鎖特異的な５'→３’エキソヌクレアーゼを使用することにより、この生成物は保護されていない相補鎖の選択的分解により一本鎖分子に変換される。所望の鎖中に存在するホスホロチオエート結合は、該鎖を酵素的加水分解から保護する。好ましくは、ついでＰＣＲ反応後、反応混合物にエキソヌクレアーゼ（好ましくはＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ）を直接加え、保護されていない鎖の加水分解を室温かまたは一層好ましくは３７℃で１５〜３０分間行うことができる。λエキソヌクレアーゼを用いる場合には、反応混合物を最も好ましくは９.４のｐＨ（この酵素の最適ｐＨ）に調節する。重要なことに、ヌクレアーゼ感受性鎖の完全な分解を望む場合は一層多くの酵素を用いる必要がある。λエキソヌクレアーゼはリン酸化されていない基質よりも５’−リン酸化された基質に対して有意の優先性を示すので、この酵素を用いて最適の結果を得るためにはヌクレアーゼ感受性ＰＣＲプライマーを５’−リン酸化するのが最も好ましい。それゆえ、５'→３’エキソヌクレアーゼは「相補鎖」を分解させるので、天然の汚染物質を実質的に含まない「標的鎖」の調製物が得られる。この一本鎖標的分子は、ハイブリダイゼーションプローブとして、シークエンシング鋳型として、または一本鎖ＤＮＡを必要とする他の応用において用いることができる。Ｃ．配列分析示したように、本発明によって生成した一本鎖分子は標的分子の配列を決定するために用いることができる。本発明の一つの態様において、プライマーから生成した伸長生成物を容易に検出または視覚化することができるように、ホスホロチオエートヌクレオチド誘導体を含むプライマーを標識するのが好ましい。この目的のため、放射性同位体、酵素、蛍光残基、化学ルミネセンス残基などのあらゆる適当な標識を用いることができる。別の態様においては、放射性硫黄同位元素（すなわち、³⁵Ｓ）の使用などによりホスホロチオエートヌクレオチド誘導体中に標識を導入する。さらに別の態様においては、本発明の一本鎖分子（標識しているかまたは標識していない）をＰＣＲまたは他の手段を用いて増幅して、検出可能なように標識した増幅生成物を製造することができる。上記のように、末端標識で得られるよりも高い比活性の標識を得るため、必要ならＰＣＲまたは他の手段によって得られた増幅生成物中に上記標識を導入することができる。それゆえ、本発明の方法は、５’末端かまたは場合により分子全体で標識された一本鎖分子の調製を可能とする。そのようなものとして、すでに記載したマクサム−ギルバートシークエンシング法を用いて該分子を容易かつ効率的に配列決定することができる。本発明は、「キット」などの製品を包含する。かかるキットは一般に、密接な区画において、ホスホロチオエートヌクレオチド誘導体を含む第一のプライマーを入れた第一の容器と、ホスホロチオエートヌクレオチド誘導体を含まない第二のプライマーを入れた第二の容器とを含み、これら２つのプライマーを前以て決定した遺伝子配列を増幅するのに用いることができるように特別に適合させてある。キットはさらに、緩衝液、酵素、使用説明書などを含んでいてよい。本発明を一般的に記載したので、本発明は以下の実施例を参照することによって一層容易に理解されるであろう。これら実施例は、説明のために記載したものであって、特に断らない限り本発明を限定することを意図するものではない。実施例１一本鎖ＤＮＡの製造ウマゲノムＤＮＡの２５７ｐｂ領域に対応する一本鎖分子種を、ＰＣＲおよび５’末端に４つのホスホロチオエート結合（「ｐｂ」はホスホロチオエート結合を示す）を有する２つの２５残基長のプライマーを用いて生成させた。ホスホロチオエート結合の導入は、市販の試薬であるテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）を用い、オリゴヌクレオチドの自動化合成において行った。ホスホロチオエートー標識ＰＣＲプライマーの精製は、市販のオリゴヌクレオチド精製カートリッジ（Ｏligonucleotide Ｐurification Ｃartridges）（ＯＰＣ）を用いて行った。上記プライマー（ＳＥＱＩＤＮＯ：１およびＳＥＱＩＤＮＯ：２）はまた非標識形としても調製した。一本鎖生成物の生成を必要とする全てのＰＣＲ反応において、これらＰＣＲプライマーの一方をホスホロチオエート標識し、他のプライマーは標識しなかった。ＰＣＲ増幅を３０または３５サイクル行い、各増幅サイクルには１分間の変性、６０℃での２分間のアニーリング、および７２℃での３分間の伸長が含まれていた。ＰＣＲ増幅後、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼの希釈液（１００μｌのＰＣＲ反応液に対して約１６単位の酵素）を加え、混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。ＥＤＴＡを１０ｍＭまで加えることにより反応を停止させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。ＰＣＲ増幅の結果、各プライマー結合部位によって隔てられる２５７塩基対配列の指数的増幅が得られた。エキソヌクレアーゼで処理すると、ヌクレアーゼ感受性鎖が完全に分解された。エキソヌクレアーゼ処理後の増幅物質の電気泳動分析により、この物質が２５７塩基長の一本鎖形状に変換されたことが明らかとなった。実施例２Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼによる加水分解に対するホスホロチオエート結合の安定性バクテリオファージＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡを５’ から３’の方向に加水分解する。通常のホスホジエステル結合をホスホロチオエートで置換することが該酵素活性に与える影響を調べるため、下記の３’をビオチン化した自己相補的なオリコヌクレオチドを合成した（４５量体；「Ｘ」は隣接するヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を示す；Ｂはビオチン残基を示す）。オリゴヌクレオチド＃１〜３をトリチル保護して合成し、逆相ＨＰＬＣにより精製し、８０％酢酸で処理することにより脱トリチルし、脱塩した。オリゴヌクレオチド＃１は５’末端にホスホロチオエート結合を含まない。オリゴヌクレオチド＃２は５’末端に一つのホスホロチオエート結合を含む。それゆえ、これは、ホスホロチオエート残基の方向に依存して２つのジアステレオマー、ＲｐおよびＳｐの混合物である。これら２つのジアステレオマーは、トリチル保護したレベルで逆相ＨＰＬＣによって充分に分離され、脱トリチル後に純粋な形態で得られた。かくして得られたオリゴヌクレオチド＃２の２つの個々のジアステレオマーを、以下、ピークＡ（先に溶出）およびピークＢ（遅れて溶出）と称する。オリゴヌクレオチド＃１〜３は、一本鎖ループとして５つのチミジン残基を有する安定なヘアピン型の自己相補的な二次構造を形成するように設計した。Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼで処理すると、これらオリゴヌクレオチドはチミジンループまで５’末端から加水分解され、それによって一本鎖分子に変換されるに違いない。これら加水分解によって得られた３’ビオチン化一本鎖オリゴヌクレオチトを固相上に捕捉するため、オリゴヌクレオチド＃４を９６ウエルプレート中に固定化した。このオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有する。このオリゴヌクレオチドの１６の３’末端塩基は、ビオチン化オリゴヌクレオチド＃１〜３の３’末端と相補的である。約６０ピコモルの精製オリゴヌクレオチド＃１〜３を０または４単位／μｌのＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼで３７℃にて１００μｌの全量にて処理した。この処理の後、アリコートを間隔をあけて除き、等容量の３ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＥＤＴＡと混合した。１.５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ中でさらに希釈工程を行った後、約１ピコモルのオリゴヌクレオチドを含有するアリコートを、固定化オリゴヌクレオチド＃４を含む９６ウエルプレートのウエルに加えた。ついで、ビオチンの存在または不存在を比色アッセイで検出した。このアッセイは以下のようにして行った。ハイブリダイゼーション後、ＴＮＴｗ中の１％ＢＳＡ中の抗ビオチン西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖector Ｌaboratories）、バーリンゲーム、カリフォルニア州）の１：１２００希釈とともにプレートを室温にて３０分間インキュベートした。ついで、このプレートをＴＮＴｗで６回洗浄し、０．０１２％Ｈ₂Ｏ₂を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中のｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（１ｍｇ／ｍｌ）の溶液を加えた。プレートを直ちにプレートリーダー（Ｖ_max、モレキュラー・デバイスィズ（Ｍolecular Ｄevices））中に置き、４５０ｎｍにおける発色を２分間追跡した。その結果をｍＯＤ⁴⁵⁰／分として表した。このアッセイの結果を表１にまとめて示す。この表に示すシグナルは、エキソヌクレアーゼ処理の１５分後に得られたものである。インキュベーション時間を長くしてもシグナルの上昇は認められなかった。そえゆえ、表１はＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼの活性に対するホスホロチオエート残基の効果を示す。これら実験から幾つかの重要な結果が浮かび上がってきた。予想されたように、いずれの自己相補的な二本鎖オリコヌクレオチドも固相固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができなかった。ハイブリダイゼーションは、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ処理によって一本鎖のビオチン化オリゴヌクレオチドが得られた場合のみに起こった。このアッセイにおいて、オリゴヌクレオチド＃１並びにオリゴヌクレオチド＃２の両ジアステレオマーはエキソヌクレアーゼの同程度に良好な基質であることがわかった。それゆえ、わずかに一つのホスホロチオエート残基が存在するだけでは充分な保護が得られない。対照的に、オリゴヌクレオチド＃３の５’末端の４つのホスホロチオエート残基は、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼの加水分解活性から完全に保護した。最も考えられることは、該酵素は５’末端のホスホロチオエート結合を迂回して次のホスホジエステルから加水分解を開始できることである。実施例３９６ウエルプレー卜中のＰＣＲ生成物の比色検出ホスホロチオエート結合がＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼの加水分解活性から保護しうることが確立されたので、５’末端に４つのヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を含むＰＣＲプライマーを調製した。５番目のホスホロチオエート結合は、これらプライマーの５’末端ヌクレオチドをビオチン残基に結合させ、これによってＰＣＲ生成物の非放射性検出が可能となる。これら標識プライマーを未修飾の反対鎖プライマーとともに用いてウマゲノムＤＮＡから断片を増幅した。ＰＣＲプライマーおよび捕捉プローブの配列は以下の通りである。プライマーペアＡプライマーぺアＡの増幅生成物は９３塩基対の長さであり、以下の配列を有する捕捉プローブを用いて捕捉した。プライマーペアＢ：プライマーペアＢの増幅生成物は２０１塩基対の長さであり、以下の配列を有する補足プローブを用いて捕捉した。プライマーペアＣ：プライマーペアＣの増幅生成物は５４７塩基対の長さであり、以下の配列を有する捕捉プローブを用いて捕捉した。すべてのＰＣＲ反応において、ウマゲノムＤＮＡ以外はすべての反応成分を含む陰性コントロールを行った。このようなコントロール反応の陽性の結果は、以前に得られたＰＣＲ生成物による反応成分の一つの汚染を示している。ＰＣＲ増幅の後、反応混合物のアリコートを取って二本鎖ＰＣＲコントロールとし、混合物の残りはＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼで処理した。ついで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い、また９６ウエルプレート中に固定化したオリゴヌクレオチドプローブへのエキソヌクレアーゼ反応の一本鎖生成物のハイブリダイゼーションにより分析を行った。捕捉オリゴヌクレオチドはＰＣＲ生成物の内部領域にハイブリダイズするように設計してあり、それによりプライマー −ダイマーの捕捉の可能性を排除した。ハイブリダイゼーション工程の後、抗ビオチン西洋ワサビペルオキシダーゼコジュゲートを用いた比色反応によりビオチンの存在または不存在を決定した。ＰＣＲ生成物のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果は、使用したエキソヌクレアーゼが未修飾のＤＮＡ鎖を加水分解し、ホスホロチオエート鎖を完全なままで残したことを示した。ハイブリダイゼーションの特異性を示すため、エキソヌクレアーゼ処理後の同じ３つのＰＣＲ生成物のそれぞれを３つの捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれを含むウエルにハイブリダイズさせた。それゆえ、ＰＣＲ反応の生成物、Ａ、ＢおよびＣを２単位／μｌのＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼで処理することによって一本鎖とし、最初のＰＣＲ反応の５μｌに対応するアリコートを、ハイブリダイゼーションのための適当な捕捉オリゴヌクレオチドを含有するマイクロタイタープレートのウエルに加えた。比色アッセイの結果をｍＯＤ₄₅₀／分にて示した。実験はすべて２回行った。示した結果は平均値である（ＮＴ＝試験せず、「コントロール」＝陰性コントロール）。マイクロタイタープレートハイブリダイゼーションアッセイの結果を表２にまとめて示す。エキソヌクレアーゼ工程を経ずに二本鎖ＰＣＲ生成物を直接用いた場合にはハイブリダイゼーションシグナルが得られないことに注意すべきである。このこともまた、使用したエキソヌクレアーゼが未修飾のＤＮＡ鎖を加水分解し、ホスホロチオエート鎖を完全なままで残したことを示している。この交差ハイブリダイゼーション実験の結果も表２に示す。３つの各ＰＣＲ生成物は、その特異的な捕捉オリゴヌクレオチドにのみハイブリダイズした。実施例４ＰＣＲ生成物の滅菌（sterilization）のためのホスホロチオエートＰＣＲプライマーの使用本発明の一つの態様は、ＰＣＲプライマーの５’末端ではなく３’末端におけるホスホロチオエート結合の置換に関する。Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼで処理すると、二本鎖ＰＣＲ生成物の５’未修飾部分はホスホロチオエート結合のところまで分解されるであろう。得られる生成物は、一方のみのＰＣＲプライマーがホスホロチオエートを含有しているか両方のＰＣＲプライマーが含有しているかによって一本鎖かまたは二本鎖のいずれかでありうる。いずれの場合も、エキソヌクレアーゼ反応の非常に高い効率を仮定して、得られた生成物を同じプライマーを使用するその後の複製連鎖反応において再増幅すべきでない。というのは、これらプライマーがハイブリダイズする該分子中の部分は破壊されてしまっているであろうからである。このことは、ＰＣＲの交差汚染を防ぐ他の方法を構成する。実施例５ＧＢＡ^TMによるＤＮＡ単一塩基多型のタイプ分け上記に示したように、ジェネティック・ビット^TMアナリシス（ＧＢＡ^TM）は単一−ヌクレオチド多型のタイプ分けのための固相法である。この方法において、オリゴヌクレオチドプライマー（ＧＢＡ^TMプライマーと称する）をポリスチレンやガラスなどの固相上に固定化し、本発明の方法によって得られた一本鎖ＰＣＲ鋳型にハイブリダイズさせ、単一の標識したｄｄＮＴＰによって３’末端にて酵素的伸長に供する。導入したｄｄＮＴＰの性質を、反対鎖中に位置するヌクレオチド（多型ヌクレオチド）により決定する。このアッセイは、ポリスチレンＥＬＩＳＡプレート上、ポリスチレンピン上、またはスライドガラス上で都合よく行うことができる。ポリスチレンプレート上で行うＧＢＡ^TMの代表例を以下に示す。この実施例では、ＧＢＡ^TMをウマゲノムＤＮＡにおけるダイアレル（dialleli c）多型をタイプ分けするのに用いる。ＧＢＡ^TM中でのホスホロチオエート含有オリゴヌクレオチドの使用は、単一塩基多型を含むウマゲノムＤＮＡからの１１２ｂｐ領域を増幅するためのＰＣＲプライマーの使用によって例証される。これらＰＣＲプライマーは下記配列を有していた。ＳＥＱＩＤＮＯ：１７のＰＣＲプライマーは、その５’末端に４つのホスホロチオエート結合を含有する。これらは二本鎖ＰＣＲ生成物の該末端をＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼのエキソヌクレアーゼ加水分解作用から保護し、一本鎖ＰＣＲ生成物の調製を可能とする。４匹の異なるウマから単離したゲノムＤＮＡを用いた。オリゴヌクレオチドＳＥＱＩＤＮＯ：１６およびＳＥＱＩＤＮＯ：１７をプライマーとして用い、標準法によりＰＣＲによる増幅を行った。記載のようにして二本鎖ＰＣＲ生成物を一本鎖形態に変換し、これを下記の配列を有するＧＢＡ^TMプライマーとハイブリダイズさせた。このＧＢＡ^TMプライマーはポリスチレン９６ウエルプレート上に固定化してあった。ＰＣＲ由来の一本鎖ＤＮＡ断片を固定化ＧＢＡ^TMプライマーにハイブリダイズさせた後、後者の３’末端を大腸菌からのＤＮＡポリメラーゼＩの大きな断片（クレノウポリメラーゼ）の存在下で一つの標識ｄｄＮＴＰにより酵素的に伸長させた。使用した伸長混合物には以下の成分が含まれていた：２０ｍＭトリスーＨＣｌ、ｐＨ７.５；１０ｍＭＭｇＣｌ₂；２５ｍＭＮａＣｌ；１０ｍＭＭｎＣｌ₂；１５ｍｍイソクエン酸ナトリウム；それそれ１．５μＭの３つの非標識２’,３’−ジデオキシヌクレオシド５’−三リン酸および１.５μＭのビオチン標識２’,３’−ジデオキシアデノシン５’−三リン酸かまたは１.５μＭのビオチン標識２’,３’−ジデオキシグアノシン５’−三リン酸のいずれか；およびウエル当たり０．１５単位のクレノウポリメラーゼ。伸長は別々のウエル中で行い、それぞれ異なる標識ｄｄＮＴＰが含まれていた。ついで、上記のように比色検出によりビオチンの存在を明らかにした。この実験の結果を表３に示す。これら結果は、この多型に関して、ウマ１および３がヘテロ接合体、ウマ２がＧホモ接合体、およびウマ４がＡホモ接合体であることを示している。それゆえ、ＧＢＡ^TM（遺伝子小片分析）法は簡単で便利で自動化可能な遺伝子型決定法である。この方法では、核酸試料中の独特の多型部位を選択するために固相に結合したプライマーへの配列特異的なアリーリングを用いるものであり、この部位の探査（interrogation）は新規な非放射性ジデオキシヌクレオチド類似体のセットを用いた高度に正確なＤＮＡポリメラーゼ反応によるものである。ＧＢＡ^TM法の最も魅力的な特徴点の一つは、ＤＮＡポリメラーゼによって対立遺伝子の区別が実際に行われるので多くの多型遺伝子座を探査する（interrogate ）のに１セットの反応条件を用いることができることである。この特徴は、平行フォーマットを活用することにより複雑なＤＮＡ試験におけるコストの削減を可能とし、新規な試験の迅速な開発をもたらすものである。本態様におけるＧＢＡ^TM法の固有誤差率は低いと思われる。ホモ接合体に対する正しいヌクレオチドの導入と正しくないヌクレオチドの導入との対比としてのシグナル／ノイズ比は約２０：１であると思われる。それゆえ、ＧＢＡ^TMは、遺伝子型研究においてヘテロ接合体の信頼性のある検出を可能とするほど充分に定量的である。ＤＮＡポリメラーゼ媒体伸長反応中に４つのすべてのジデオキシヌクレオシド三リン酸が単独のヌクレオチド基質として存在することは、誤導入を抑制することにより遺伝子型決定の忠実度を高める。ＧＢＡ^TMは、周辺のＤＮＡ配列が知られていると仮定して、遺伝子マッピングおよび連鎖研究、遺伝子診断、および同定／父性試験を含む、点変異分析が現在用いられているあらゆる応用分野において用いることができる。配列表配列番号：１配列の長さ：２５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：（Ａ）生物名：エクウス・カバルス（Ｅquus caballus）配列：配列番号:２配列の長さ：２５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：（Ａ）生物名：エクウス・カバルス配列：配列番号：３配列の長さ：４５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：（Ａ）生物名：エクウス・カバルス配列：配列番号：４配列の長さ：４５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：（Ａ）生物名：エクウス・カバルス配列：配列番号:５配列の長さ：４５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源: （Ａ）生物名：エクウス・カバルス配列：配列番号：６配列の長さ：２５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：（Ａ）生物名：エクウス・カバルス配列：配列番号：７配列の長さ：２５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：（Ａ）生物名：エクウス・カバルス配列：配列番号：８配列の長さ：２５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：（Ａ）生物名：エクウス・カバルス配列：配列番号：９配列の長さ：２５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏ起源: （Ａ）生物名：エクウス・カバルス配列：配列番号：１０配列の長さ：２５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源: （Ａ）生物名：エクウス・カバルス配列：配列番号：１１配列の長さ：２６塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：（Ａ）生物名：エクウス・カバルス配列：配列番号：１２配列の長さ：２５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：（Ａ）生物名：エクウス・カバルス配列：配列番号：１３配列の長さ：２５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：（Ａ）生物名：エクウス・カバルス配列：配列番号：１４配列の長さ：２５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：（Ａ）生物名：エクウス・カバルス配列：配列番号:１５配列の長さ：２５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：（Ａ）生物名：エクウス・カバルス配列：配列番号：１６配列の長さ：２５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：（Ａ）生物名：エクウス・カバルス配列：配列番号：１７配列の長さ：２５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：（Ａ）生物名：エクウス・カバルス配列：配列番号：１８配列の長さ：２５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：（Ａ）生物名・エクウス・カバルス配列：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者ナップ、マイケル・アールアメリカ合衆国21218メリーランド、ボルチモア、ノース・カルバート2630番

Claims

【特許請求の範囲】１．相補的な配列の核酸分子を実質的に含まない、所望の一本鎖核酸分子の生成方法であって、下記工程：（Ａ）前以て選択した核酸分子をプライマー分子の存在下でインキュベートし、その際、該プライマー分子は該前以て選択した分子にハイブリダイズすることができ、該プライマー分子は５'→３’エキソヌクレアーゼに対して耐性の領域を含み；（Ｂ）鋳型に依存した該プライマーの伸長を行って該所望の核酸分子を生成させ；ついで（Ｃ）該前以て選択した分子を除去するに充分な条件下で該インキュベーション液に５'→３’エキソヌクレアーゼを加え、それにより相補的な配列の核酸分子を実質的に含まない該所望の一本鎖分子を得るからなることを特徴とする方法。２．工程（Ｂ）において、所望の核酸分子を生成した後に、該分子にハイブリダイズすることができ鋳型に依存した仕方で伸長しうる第二のプライマー分子の存在下で該分子をインキュベートし、それにより該所望の分子の配列に実質的に相補的な配列を有する核酸分子を生成させる、請求項１に記載の方法。３．工程（Ｂ）において、所望の核酸分子を生成した後に、該分子にハイブリダイズすることができる第二のプライマー分子の存在下、少なくとも一つのジデオキシヌクレオチド誘導体とともに、非停止性のデオキシヌクレオチド誘導体の不在下で該分子をインキュベートし、その際、該インキュベーションを鋳型に依存した仕方での該プライマーの伸長を可能とするに充分な条件下で行う、請求項１に記載の方法。４．該プライマーが約１０〜約３０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の方法。５．該プライマーが約２０〜約２５ヌクレオチドの長さを有する、請求項４に記載の方法。６．５'→３’エキソヌクレアーゼに対して耐性である該領域のエキソヌクレアーゼ耐性が複数のホスホロチオエートヌクレオチド誘導体によってもたらされる、請求項１に記載の方法。７．該領域が約４つのホスホロチオエートヌクレオチド誘導体を含む、請求項６に記載の方法。８．該プライマーを検出可能なように標識してある、請求項１に記載の方法。９．該プライマー分子に５'→３’エキソヌクレアーゼ耐性を付与する該ヌクレオチドが検出可能なように標識してある、請求項８に記載の方法。１０．該検出可能な標識が、酵素標識、蛍光標識、放射性同位体標識、および化学ルミネセンス標識よりなる群から選ばれたものである、請求項７に記載の方法。１１．該５'→３’エキソヌクレアーゼがＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。１２．該５'→３’エキソヌクレアーゼがλエキソヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。１３．該所望の一本鎖核酸分子が、鋳型に依存したプライマー伸長の間に標識ヌクレオチドを導入することによって検出可能なように標識される、請求項１に記載の方法。１４．該検出可能な標識が、酵素標識、蛍光標識、放射性同位体標識、および化学ルミネセンス標識よりなる群から選ばれたものである、請求項１３に記載の方法。１５．約１０〜約３０ヌクレオチドの長さを有し５'→３’エキソヌクレアーゼ耐性を付与する領域を含有するプライマー分子にハイブリダイズした標的核酸分子を含む組成物。１６．５'→３’エキソヌクレアーゼ耐性を付与する該領域が約４つのホスホロチオエート結合を含む、請求項１５に記載の組成物。１７．該プライマー分子が固相支持体に結合している、請求項１５に記載の組成物。１８．目的核酸中の特定の位置におけるヌクレオチド塩基を同定する方法であって、（Ａ）目的核酸が二本鎖である場合には、該特定の位置を包含する不対ヌクレオチド塩基を得るために該核酸を含有する試料を処理し、または該目的核酸が一本鎖である場合は直接工程（Ｂ）を用い、その際、該目的核酸は該目的核酸の所定の領域に５'→３’エキソヌクレアーゼ耐性を付与するに充分な数の５'→３’エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を含有し、（Ｂ）工程（Ａ）からの試料を、ハイブリダイズ条件下、同定しようとするヌクレオチド塩基の直ぐ隣に目的核酸中に存在するヌクレオチド塩基の連なりとハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて該プライマーと該目的核酸との間に二本鎖を生成させることにより、同定しょうとするヌクレオチド塩基が該二本鎖中のプライマーの３’末端の直ぐ下流の鋳型中の最初の不対塩基となるようにし、（Ｃ）工程（Ｂ）からの二本鎖を、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＴＴＰの実質的不在下、少なくとも２つの異なるヌクレオチド三リン酸誘導体と接触させ、該誘導体は該最初の不対塩基に相補的な誘導体を含み、核酸鋳型に依存したプライマー伸長反応のターミネーターであり、その際、該ターミネーターの少なくとも一つは検出可能なマーカーで標識されており、該接触を該相補的ターミネーター誘導体と該最初の不対塩基との塩基対形成を可能とするに充分な条件下で行い、（Ｄ）該相補的ターミネーター誘導体をプライマーの３’末端中に導入するに充分な鋳型依存プライマー伸長反応を起こさせ、（Ｅ）該導入された誘導体を同定し、それにより該目的核酸中の特定の位置におけるヌクレオチド塩基を同定することを特徴とする方法。１９．工程（Ｃ）において、工程（Ｂ）からの二本鎖を４つのターミネーターと接触させ、その際、これらターミネーターのうちの一つのみが検出可能なマーカーを有し、工程（Ｃ）を４回行い、これらターミネーターの異なる一つか各回において標識されている、請求項１８に記載の方法。２０．工程（Ｃ）において、工程（Ｂ）からの二本鎖を４つの標識したターミネーターと接触させ、これらターミネーターがそれぞれ異なる検出可能な標識を有する、請求項１８に記載の方法。２１．複製連鎖反応の所望のエキソヌクレアーゼ耐性増幅生成物の検出方法であって、（Ａ）２つのプライマー分子を用いて複製連鎖反応を行い、その際、該プライマー分子の一つは該プライマーの５’末端に充分な数（最も好ましくは約４）のホスホロチオエートヌクレオチド誘導体を含むことによって該末端に５'→３’エキソヌクレアーゼに対する耐性が付与され、該反応は二本鎖増幅生成物を生成するに充分なものであり、（Ｂ）ついで、オリゴヌクレオチドにエキソヌクレアーゼに対する耐性を付与する充分な数のホスホロチオエート結合を欠くオリゴヌクレオチドを分解する条件下、増幅生成物を５'→３’エキソヌクレアーゼで処理し、（Ｃ）固体支持体に結合した相補的オリゴヌクレオチドに複製連鎖反応の所望の増幅生成物をハイブリダイズさせることにより、複製連鎖反応の所望の増幅生成物を検出することを特徴とする方法。２２．該充分な数のホスホロチオエートヌクレオチド誘導体が約４である、請求項２１に記載の方法。２３．複製連鎖反応間での交差汚染を最小にする方法であって、該反応のプライマー分子の少なくとも一つは該プライマーの３’末端に充分な数（すなわち、約４）のホスホロチオエートヌクレオチド誘導体を含むことによって５'→３’ エキソヌクレアーゼに対する耐性が付与され、該複製連鎖反応を行った後、該反応の増幅生成物を該５'→３’エキソヌクレアーゼの存在下、充分な数のホスホロチオエート結合を欠く未使用のプライマーのオリゴヌクレオチド領域および増幅生成物の分解を起こさせるに充分な条件下でインキュベートし、該分解により該未使用のプライマーおよび該増幅生成物をさらなる複製連鎖反応において基質として働き得ないようにさせ、それにより複製連鎖反応間での交差汚染を最小にすることを特徴とする方法。２４．該充分な数のホスホロチオエートヌクレオチド誘導体が約４である、請求項２３に記載の方法。２５．密接な区画において、第一のプライマーを入れた第一の容器（該第一のプライマーはホスホロチオエートヌクレオチド誘導体を含む）と、ホスホロチオエートヌクレオチド誘導体を欠く第二のプライマーを入れた第二の容器とを含み、これら２つのプライマーを前以て決定した遺伝子配列を増幅するのに用いることができるように特別に適合させたキット。２６．さらに５'→３’エキソヌクレアーゼを含む、請求項２５に記載のキット。