DE102012008375A1

DE102012008375A1 - Methoden und Komponenten zur Detektion von Nukleinsäureketten

Info

Publication number: DE102012008375A1
Application number: DE102012008375A
Authority: DE
Inventors: Dmitry Cherkasov; Claus Becker; Norbert Basler; Andreas Müller-Hermann; Petra van Husen
Original assignee: Genovoxx GmbH
Current assignee: Genovoxx GmbH
Priority date: 2011-04-27
Filing date: 2012-04-26
Publication date: 2012-10-31
Also published as: EP2702171A1; US9994894B2; US20140295438A1; WO2012146377A1

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein neues Verfahren zur enzymatischen Markierung von Nukleinsäureketten (Zielsequenzen) mit Nukleotid-Konjugaten. Diese Nukleotid-Konjugate sind in der Lage, unter Reaktionsbedingungen spezifisch an die Zielsequenz zu binden und durch eine Polymerase in den komplementären wachsenden Strang eingebaut zu werden. Die mit solchen Konjugaten markierten Nukleinsäureketten können an die feste Phase gebunden werden. Die Markierug kann parallel zur enzymatischen Amplifikation von Zielsequenzen erfolgen.

Description

Beschreibung der Erfindung
Einleitung
1.1 Stand der Technik und Aufgaben der Erfindung
Bei der Analyse von Nukleinsäureketten handelt es sich oft um einen Nachweis einer spezifischen Sequenz aus einem Organismus, z. B. Erregernachweis in einem klinischen Material anhand einer spezifischen Sequenz. Diese Sequenz wird oft als Zielsequenz bezeichnet. Solche Zielsequenzen liegen oft nicht isoliert vor, sondern sind in eine Matrize mehr oder weniger eingebettet, das Material. Als Material kann Patientenmaterial, Nahrungsmittel, Teil eines Organismus sein. Die Überprüfung eines Materials auf Vorliegen der Zielsequenz stellt dabei die Zielsetzung der Analyse dar. Es ist einem Fachmann bekannt, dass ein spezifischer Nachweis von Nukleinsäureketten von großer medizinischer Bedeutung sein kann.
Moderne Analytik der Nukleinsäuereketten beinhaltet mehrere Prozesse, deren Ziel ist, ein spezifisches Signal (Informationsinhalt der Nukleinsäurekette) zu detektieren. Diese Prozesse schließen meistens folgende Teilprozesse ein: Amplifikation, Markierung, Isolierung und Nachweis von Nukleinsäureketten. Mehrere Störfaktoren können zu einem schlechten Signal-Rauschen-Verhältnis führen, z. B. unspezifische Amplifikation von Nukleinsäuren, unspezifische Markierung von Nukleinsäuren, unspezifische Detektion von Nukleinsäureketten. Ein schlechtes Signal-Rauschen-Verhältnis kann zu einem falschen Ergebnis der Gesamtanalyse führen.
Einem Fachmann sind viele konventionelle Methoden zur Vervielfältigung (Amplifikation) einer oder mehrerer Nukleinsäueresequenzen bekannt. Solche konventionelle Assay schließen beispielsweise als Amplifikationsmethoden PCR, HDA, SDA oder LAMP ein.
Diese Amplifikationsmethoden können unter Idealbedingungen definierte DNA-Fragmente spezifisch vervielfältigen. Im diagnostischen Alltag können unterschiedliche Reaktionsbedingugnen weit von Idealbedingungen abweichen, was zur Reduzierung der Qualität des Assay führt, z. B. geringe Spezifität, Verlust der Sensitivität etc. Aus diesem Grund reicht alleinige Amplifikation eines DNA-Fragmentes oft nicht für eine aussagekräftige Beurteilung des Assays. Vielmehr muss ein Fachmann die Spezifität des amplifizierten Fragments überprüfen, z. B. durch Hybridisierung mit einer spezifischen Sonde unter stringenten Bedingungen oder durch Sequenzierung.
Zur Steigerung der Spezifität der Analysen bzw. zur Verbesserung des Signal-Rauschen-Verhältnisses wurden mehrere Verfahren vorgeschlagen, z. B. Real-Time PCR mit 5'-Exonuklease-Abbau (Taqman, ABI), Oligohybridisierung mit FRET (Lightcycler, Roche), oder Hybridisierungs-Assay mit mehreren Wasch-Vorgängen unter stringenden Bedingungen oder Sequenzierung mit spezifischem Sequenznachweis durch Übereinstimmung mehrere Nukleotide in der Sequenz.
Diese Verfahren benötigen allerding oft eine komplexe Apparatur, was ihre Eignung für einen Einsatz außerhalb eines spezialisierten Labors eingeschränkt.
Die Aufgabe dieser Erfindung ist, Komponenten, Kompositionen und Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäureketten bereitzustellen, die eine höhere Spezifität der Analyse bzw. ein besseres Signal-Rauschen Verhältnis in einem Assay ermöglichen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch Bereitstellung der Verfahren und Komponenten zur Visualisierung der genetischen Information in vitro enthaltend in mindestens einer Nukleinsäureketten, wobei sequenzspezifische Nukleotid-Konjugaten in mindestens einem der folgenden Teil-Schritte der Visualisierung eingesetzt werden: Herstellung, Terminierung bzw. Unterdrückung der Vermehrung, Markierung Isolierung, Detektion.
Es werden neuartige Nuk-Makromoleküle mit neuen Strukturen der Marker-Kompontente und mit neuen Funktionen bereitgestellt. Die Nukleotid-Strukturen stellen neue Varianten von Nuk-Makromolekülen mit der Grundstuktur, beschrieben in Anmeldungen Cherkasov et al WO2011050938 , Cherkasov et al WO2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 , Cherkasov et al WO2008043426 , Cherkasov et al DE 10356837 , Cherkasov et al DE 10 2004 009 704 . Diese Anmeldungen sind hier als Referenzen eingeschlossen und werden als „incorporated by reference” im vollen Umfang zitiert.
Überraschenderweise ermöglichen diese Strukturen in Kombination mit anderen Assay-Komponenten eine bessere Markierungseffizienz, Markierungsspezifität und Detektion. Die vorliegende Erfindung offenbart solche vorteilhafte Kombinationen für eine Markierungsreaktion von Zielsequenzen (z. B. Primer, modifizierte Primer, Zielsequenz usw.), (4), so dass neue Assays für die Nukleinsäureanalysen aufgebaut werden können. Die erfindungsgemäßen Verfahren erlauben eine größere Vielfalt von Molekülen an die Nukleinsäureketten sequenzspezifisch zu koppeln. Dadurch können viele Methoden in der Nukleinsäureketten-Analytik profitieren.
Gegenstand dieser Anmeldung schließt weiterhin Verfahren zur Herstellung bzw. Synthese, Vervielfältigung einer oder mehrerer Nukleinsäureketten (Zielsequenzen) ein, bei denen mindestens eine Art von erfindungsgemäßen Nukleotid-Konjugaten verwendet wird,
Der Gegenstand dieser Anmeldung schließt weiterhin Verfahren zur Markierung einer oder mehrerer Nukleinsäureketten (Zielsequenzen) ein, bei denen mindestens eine Art von erfindungsgemäßen Nukleotid-Konjugaten verwendet wird,
Der Gegenstand dieser Anmeldung schließt weiterhin Verfahren zur Isolierung einer oder mehrerer Nukleinsäureketten (Zielsequenzen) ein, bei denen mindestens eine Art von erfindungsgemäßen Nukleotid-Konjugaten verwendet wird,
Der Gegenstand dieser Anmeldung schließt weiterhin Verfahren zum Nachweis einer oder mehrerer Nukleinsäureketten (Zielsequenzen) ein, bei denen mindestens eine Art von erfindungsgemäßen Nukleotid-Konjugaten verwendet wird,
Der Gegenstand dieser Anmeldung schließt weiterhin Verfahren zur Modifikation der Nukleinsäureketten innerhalb der Zellen in vivo und in vitro.
1.2 Kurze Beschreibung der Gegenstände der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neue Komponenten und Kompositionen für enzymatische Synthesen von von Nukleinsäurekette und Methoden zu deren Anwendung bereit. Diese Komponenten und Kopositionen können beispiesweise bei Primerverlängerung, Vervielfältigung, Markierung, Isolierung und Detektion von Nukleinsäureketten eingesetzt werden. Ebenfalls können diese Komponeten und Kompositionen in diagnostischen Assays zur Vervielfältigung oder Markierung oder Nachweis oder Sequenzanalyse von Nukleinsäureketten verwendet werden. Ebenfalls können bestimmte Komponenten zur Beeinflussung der Genexpression bzw. Zellteilung in vivo eingesetzt werden.
Komponenten, Kompositionen und Verafhren für in vitro Assay
In einem Assay sind sowohl sequenzspezifische Signal-Generierung als auch sequenzspezifische Signal-Unterdrückung von Bedeutung, Ein Fachmann sollte bei Assay-Aufbau sicherstellen, dass die Signale von gesuchten Zielsequenzen eindeutig detektiert und unerwünschte Signale möglichst unterdrückt werden. Man kann daher positiv oder negativ zu selektierende Sequenzen in einem Assay definieren.
Signal-Verarbeitung auf Ebene von Nukleinsäuren
Bei modernen genetisch basierten Assays werden häufig folgende Verfahrensschritte verwendet: Amplifikation, Markierung, Isolierung und Detektion. Diese Schritte können teilweise in einem Ansatz kombiniert sein oder hintereinander erfolgen. In jedem dieser Schritte können Sequenzen in unterschiedlicher Art und Weise positiv oder negativ selektiert werden.
In einer Ausführungfrom der Erfindung werden positiv zu selektierende Zielsequenzen vervielfältigt im Stadium der Amplifikation, dagegen negativ zu selektierende Zielsequenzen werden in ihrer Vervielfältigung unterdrückt.
In einer weiteren Ausführungfrom der Erfindung werden positiv zu selektierende Zielsequenzen sequenzspezifisch markiert im Stadium der Markierung, dagegen negativ zu selektierende Zielsequenzen werden in ihrer Markierung unterdrückt.
In einer weiteren Ausführungfrom der Erfindung werden positiv zu selektierende Zielsequenzen sequenzspezifisch im Stadium der Isolierung selektioniert, dagegen negativ zu selektierende Zielsequenzen werden unterdrückt.
In einer weiteren Ausführungfrom der Erfindung werden positiv zu selektierende Zielsequenzen sequenzspezifisch im Stadium der Detektion detektiert, dagegen negativ zu selektierende Zielsequenzen werden in ihrer Detektion unterdrückt.
Grundlage für die in dieser Erfindung beschriebenen Komponenten und Verfahren stellt das Verfahren zum sequenzspezifischen Einbau von Nuk-Makromolekülen während einer enzymatischen Synthese dar (Cherkasov et al WO2011050938 ). Bei diesem Verfahren können sequenzspezifische Nukleotid-Konjugaten während einer enzymatischen Synthese in den komplementären Strang einer vorher ausgewählten Sequenz (genannt Zielsequenz) eingebaut werden. Solche sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugate gehören zur Klasse von makromolekularen Nukleotid-Verbindungen (Cherkasov et al WO2011050938, Cherkasov et al WO2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 ). Die hier genannten makromolekularen Nukleotid-Verbindungen werden auch als Nuk-Makromoleküle bezeichnet. Eine besondere Art von solchen Nuk-Makromolekülen stellen die sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugate, hier auch als „Smart-Nukleotide” bezeichnet. Die Bezeichnung „Smart” soll ihre Fähigkeit, Nukleinsäuresequenzen zu unterscheiden, zum Ausdruck bringen. Diese Eigenschaft unterscheidet die Smart-Nukleotide von konventionellen dNTP's.
Diese sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugate (Smart-Nukleotide) schließen beispielsweise folgende Bestandteile ein:

• mindestens ein Nukleosid-Triphosphat (Nuk-Komponente),
• mindestens ein Oligonukleotid (Target-Domäne) zur Erkennung der Zielsequenz
• mindestens einen Linker zwischen dem Nukleosid-Triphosphat und dem Oligonukleotid.
• Es können weitere Domänen (Signal-Domänen, Anker-Domänen usw.) an die Smart-Nukleotide gekoppelt sein.

Die Zusammensetzung der Oligonukleotidsequenz ist an die Sequenzzusammensetzung von mindestens einer Zielsequenz im Assay angepasst, so dass das Oligonukleotid vorwiegend sequenzspezifisch an diese Zielsequenz unter Assaybedingungen binden bzw. hybridisieren kann.
Die Eigenschaften der Nuk-Komponente, des Oligonukleotids (Target-Domäne) sowie weiterer Strukturen bestimmen über die Gesmateigenschaften der Nukleotid-Konjugate. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Nukleotid-Konjugate mit sequenzspezifischen terminierenden Eigenschaften verwendet. Diese Art von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten ist in der Lage, nach ihrem Einbau in den wachsenden Strang der Nukleinsäure die weitere enzymatische Synthese durch eine Polymerase zu stoppen oder signifikant zu verlangsamen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Nukleotid-Konjugate mit sequenzspezifischen markierenden Eigenschaften verwendet. Diese Art von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten schließt einen Marker ein, so dass nach ihrem Einbau in den wachsenden Strang der Nukleinsäure dieser Marker an diese Nukleinsäure gebunden ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Nukleotid-Konjugate mit sequenzspezifischen nuklease-protektiven Eigenschaften verwendet. Diese Art von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten schließt eine gegenüber Nuklease-Degradation resistente Modifikation von Nuk-Komponenten (z. B. Alpha-Phosphorothioat-dNTP) bzw. eine gegenüber Nuklease-Degradation risistente Oligonukleotid-Kette ein, z. B. Target-Domäne, so dass nach Einbau dieser Nukleotide-Konjugate in den wachsenden Strang diese markierte Nukleinsäurekette vor Nuklease-Degradation schützt.
Typischer Reaktionsansatz
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden sequenzspezifische Nukleotid-Konjuate in einem Assay eingesetzt, das noch weitere Komponenten einschließt: beispielweise mindestens eine Zielsequenz, mindestens eine Polymerase, mindestens eine weitere Art von Substraten für Polymerasen (z. B. dNTPs), mindestens ein weiteres Oligonukleotid (z. B. Primer).
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden Nukleotid-Konjuate in einem Assay eingesetzt, das noch weitere Komponenten einschließt: beispielweise mindestens zwei Zielsequenzen, mindestens eine Polymerase, mindestens vier weitere Arten von Substraten für Polymerasen (z. B. dATP, dGTP, dCTP, dTTP), mindestens zwei sequenzspezifische Primer.
Funktionsweise der selektiven Sequenzmarkierung mit Smart-Nukleotiden
In Präsenz von Primer-Matrize-Komplexen, dNTPs und Polymerase erfolgt eine Primer-Verlängerung, d. h. es werden komplementäre Stränge synthetisiert, wobei die Zielsequenz als Matrize dient. Während einer solchen Primer-Verlängerung werden sequenzspezifische Nukleotid-Konjugate nur dann eingebaut, wenn sie an die Zielsequenz über die Target-Domäne komplementär binden können. Die Konzentration von natürlichen dNTPs ist dermassen gewählt (vorzugsweise liegt sie höher als 10 μmol/l, z. B. zwischen 50 μmol/l und 1 mmol/l), dass die nicht an die Zielsequenz gebundenen Nuk-Makromoleküle durch die Polymerase nicht eingebaut werden. Ihr Einbau wird durch die natürlichen dNTPs kompetetiv unterdrückt. Es resultiert ein zielsequenzspezifischer Einbau von Smart-Nukleotiden in die neu synthetisierten komplementären Stränge der Zielsequenz. DNA-Abschnitte, die keine Hybridisierung mit Target-Domäne der sequenzspezifischen Nukleotid-Analoga eingehen, werden nicht markiert.
Das Ergebnis des enzymatischen Einbaus von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten ist eine modifizierte DNA, die mindestens ein sequenzspezifisches, kovalent gekoppeltes Nukleotid-Konjugat einschließt. Die kovalente Kopplung zwischen den neu synthetisierten komplementären Strängen und eingebauten Nukleotid-Konjugaten zeichet sich durch hohe Stabilität aus. Durch die Auswahl der Eigenschaften von sequenzspezifichen Nukleotid-Konjugaten können auch die Eigenschaften der DNA entsprechend beeinflusst werden. Dadurch können sich physikalische, chemische und vor allem biochemische Eigenschaften dieser, mit Nukleotid-Analoga modifizierten DNA modifiziert werden.
Jede Komponente der Smart-Nukleotide kann die Eigenschaften der mit ihnen markierten DNA sequenzspezifisch beeinflüssen. Beispielsweise können Modifikationen an Nuk-Komponente für sequenzspezifische Änderungen der Eigenschaften der markierten Nukleinsäure führen. Beispiesweise führen ddNTP zu einer sequenzspezifischen Termination der Synthese. Alpha-Thio-Triphosphate erlaufen sequenzspezifischen Einbau eines nuklease-resistenten Nukleotids in die Kette. Modifikationen an der Target-Domäne des Nukleotid-Konjugates (Zielsequenzbindender Teil des Oligonukleotids) können beispielsweise Nuklease-Resistenz bedingen (z. B. PTO, PNA, LNA-Modifikation).
Die Art und Weise der Kopplung der Nuk-Komponente an die restliche Struktur der Nukleotid-Konjugate bedingt, ob nur die Nuk-Komponente im neu synthetisierten Strang verbleibt oder ganze Struktur der Nukleotid-Konjugate. Beispielsweise bedingt die Kopplung der Target-Domäne an die Base der Nuk-komponente über einen stabilen Linker, dass die eingebaute Nuk-Komponente und die Target-Domäne nach dem Einbauereignis gebunden bleiben. Hingegen Kopplung der Target-Domäne an die Gamma-Phosphat-Gruppe einer Nuk-Komponente über einen Linker bedeutet, dass nach dem Einbau der Nuk-Komponente, die Verbindung zwischen der nun eingebauten Nuk-Komponente und der Target-Domäne durch Polymerase unterbrochen wird und die Target-Domäne nicht mehr an die Nuk-Komponente gebunden ist.
Wie bereits erwähnt, kann die Spezifität der Analyse bzw. positive oder negative Selektion der Sequenzen oder Signale an mehreren Stellen der Verfahrenskette beeinflusst werden. Nachfolgend werden vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben, bei denen positive oder negative Selektion von Zielsequenzen im jeweiligen Schritt (Amplifikation, Markierung, Isolierung, Detektion) oder durch Kombination einzelner Schritte erfolgt.
Selektion der Nukleinsäuren während der Amplifikation bzw. während der Verlängerung mit Hilfe von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten mit terminierenden Eigenschaften
Die Verlängerung bzw. Vermehrung einer oder mehrerer Sequenzen (Population N1-Nx) sind einem Fachmann bekannt (beispielsweise PCR, HDA usw). Bei ensprechenden Bedingungen erfolgt eine spezifische Amplifikation eines Nukleinsäurefragments zwischen beiden Primern. Bei vorhandenen Unterschieden zwischen Sequenzen, die in den Nukleiunsäureabschnitten zwischen beiden Primern liegen, werden solchen Sequenzen ko-amplifiziert. Oft besteht Notwendigkeit, Nukleinsäureketten mit nur einer spezifischen Sequenz zu amplifziieren. Beispielsweise Sequenzen mit einer Mutation oder einer bestimmten SNP-Variante. Die Amplifikation anderer Sequenzen soll dagegen unterdrückt werden.
In einem Verfahren für Vermehrung der Nukleinsäureketten müssen oft folgende Ergebnisse erreicht werden:

• Verlängerung bzw. Vermehrung einer oder mehrerer Sequenzen (Population N1-Nx), solche Sequenzen werden positiv selektiert
• Unterdrückung der Verlängerung bzw. Vermehrung einer oder mehrerer Sequenzen (Population Z1-Zx), solche Sequenzen werden negativ selektiert Populationen N1-Nx sind durch ihre Sequenz unterscheidbar von Population Z1-Zx.
• Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung betrifft Bereitstellung der Komponenten und Verfahren für die sequenzspezifische Unterdrückung der matrizenabhängigen Synthese der Sequenzen (Population Z1-Zx)
• Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung betrifft Bereitstellung der Komponenten und Verfahren für die sequenzspezifische Unterdrückung der Vermehrung der Sequenzen (Population Z1-Zx)
• Ein weiterer bevorzugter Gegenstand der Erfindung betrifft Bereitstellung der Komponenten und Verfahren für die sequenzspezifische Unterdrückung der matrizenabhängigen Synthese der Sequenzen der Population Z1-Zx bei gleichzeitiger matrizenabhängigen Synthese der Sequenzen der Population N1-Nx
• Ein weiterer bevorzugter Gegenstand der Erfindung betrifft Bereitstellung der Komponenten und Verfahren für die sequenzspezifische Unterdrückung der Vermehrung der Sequenzen der Population Z1-Zx bei gleichzeitiger Vermehrung der Sequenzen der Population N1-Nx.

Die sequenzspezifische Unterdrückung der Verlängerung bzw. Amplifikation der Population Z1-Zx erfolgt durch Einsatz von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten mit terminierenden Eigenschaften. Solche terminierenden Nukleotid-Konjugate können an Nukleinsäureketten der genannten Population Z1-Zx via ihre Target-Domäne sequenzspezifsich binden. Während der Synthese des komplementären Strangs wird die Nuk-Komponenten der gebundenen Nukleotid-Konjugate und durch die Polymerase eingebaut. Durch die Struktur der Nukleotid-Konjugate kommt es zu einer Terminierung der Synthese oder zu einer deutlichen Verlangsamung der Synthese, so dass keine Amplifikation der dieser Sequenzen stattfinden kann.
Im Falle einer Terminierung werden keine weiteren Nukleotide nach dem Einbau des terminirenden Nukleotid-Konjugates eingebaut. Ein solches Konjugat schließt beispielswiese eine Dideoxy-Nuk-Komponenten (z. B. 2',3'-ddUTP) ein. Bei einer deutlichen Verlangsamung der Synthese von komplementären Strängen können zwar weitere Nukleotide nach dem Einbau von terminierenden Nukleotid-Konjugaten eingebaut werden, die Synthesegeschwindigkeit ist allerdings deutlich verlangsamt. Durch die begrenzte Zeit für einen Verlängerungsschritt während einer Amplifikationsreaktion (z. B. 1 min bei PCR) kommt es nicht zu einer ausreichenden Verlängerung des komplementären Stranges, die Primerverlängerung wird vorzeitig abgebrochen. Die Amplifikation wird verhindert.
Eine sequenzspezifische Verhindung der Verlängerung des wachsenden Strangs bzw. Terminierung bzw. Verlangsamung der Synthese kann durch folgende Komponenten der Nuk-Makromoleküle bedingt sein:

• Eigenschaften der Nukleotid-Komponente:
– Es werden Nuk-Komponenten mit strang-terminierenden Eigenschaften verwendet, z. B. 2',3'-Dideoxy-Nukleotide, beispielsweise ddUTP, ddCTP, ddATP, ddGTP, weiterhin kommen in Frage einem Fachmann bekannte Variationen der Zuckerstruktur wie 3'-Azid, 3'-Amino, 3'-Mercapto usw.). Zusammenfassend haben solche Nukleotid-Strukturen modifizierte 3'-OH-Positionen.
– In einer Ausführungsform erfolgt die Kopplung der Target-Domäne in einem terminierenden Nukleotid-Konjugat über einen Linker an der Base der Nuk-Komponente. Dadurch verbleibt die Target-Domäne nach dem Einbau des Nukleotid im neu synthetisierten, terminierten Strang. In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Kopplung der Target-Domäne in einem terminierenden Nukleotid-Konjugat über einen Linker an der Gamma-Phosphat-Gruppe der Nuk-Komponente. Die Target-Domäne wird während des Einbaus des Nukleotid von ihm getrennt.
• Eigenschaften der restlichen Struktur des Nuk-Makromoleküls, z. B. die Struktur des Markers, oder eines Teils davon, z. B. Struktur der Target-Domäne. In solchen Ausführungsformen muss die Target-Domäne nach dem Einbau des Nukleotid-Konjugats an der eingebauten Nuk-Komponente verbleiben und kann Einfluss auf die weitere Synthese ausüben. Dieser Einfluss kann beispielsweise durch folgende Parameter des Nukleotid-Konjugates bedingt sein:
– Chemische Beschaffenheit der Target-Domäne, z. B. PNA oder LNA. Solche Strukturen sind bekannt, dass sie nach ihrer Bindung an die komplementäre Nukleinsäurekette zu einem Stop der Synthese führen können.
– Sequenz-Zusammensetzung des Oligonukleotid innerhalb des Nuk-Makromoleküls: Synthese-Reaktion kann beispielsweise durch sterische Hinderung der Polymerasen durch doppelsträngige Abschnitte des Oligonukleotids (Haarnadel-Strukturen) innerhalb des Nuk-Makromoleküls oder eine Triplex-Formation des Oligonukleotids des Nuk-Makromoleküls mit der Matrize
– Bestimmte Bestandteile des Nukleotid-Konjugates, z. B. kovalent an die Target-Domäne gekoppelte Nano-Teilchen, Polymere oder Proteine usw. können als sterisches Hindernis für die Reaktion dienen und dadurch die Synthesereaktion verlangsamen bzw. verhindern

Selektion der Nukleinsäuren während der Markierung mit Hilfe von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten mit markierenden Eigenschaften
In genetisch basierten Testen besteht oft Notwendigkeit, Nukleinsäureketten mit nur einer spezifischen Sequenz zu markieren. Eine solche Markierung kann während einer Primer-Verlängerung erfolgen oder auch mit einem Verfahren zur Amplifikation der Nukleinsäurekette vebunden sein. Die Markierung soll dabei sequenzspezifisch erfolgen, so dass folgende Ergebnisse erreicht werden:

• Spezifische Markierung einer oder mehrerer Sequenzen (Population N1-Nx), solche Sequenzen werden positiv selektiert
• Fehlende Markierung einer oder mehrerer Sequenzen (Population Z1-Zx), solche Sequenzen werden negativ selektiert

• Eine vorteilhafte Ausführungsfrom der Erfindung betrifft Bereitstellung der Komponenten und Verfahren für die sequenzspezifische Markierung der Sequenzen (Population N1-Nx) während einer matrizenabhängigen Synthese der Sequenzen (Population N1-Nx)
• Eine weitere vorteilhafte Ausführungsfrom der Erfindung betrifft Bereitstellung der Komponenten und Verfahren für die sequenzspezifische Markierung der Sequenzen (Population N1-Nx) während der Vermehrung der Sequenzen (Population N1-Nx)
• Eine vorteilhafte Ausführungsfrom der Erfindung betrifft Bereitstellung der Komponenten und Verfahren für die sequenzspezifische Markierung der Sequenzen (Population N1-Nx) während einer matrizenabhängigen Synthese der Sequenzen (Population N1-Nx und Population Z1-Zx)
• Eine weitere vorteilhafte Ausführungsfrom der Erfindung betrifft Bereitstellung der Komponenten und Verfahren für die sequenzspezifische Markierung der Sequenzen (Population N1-Nx) während der Vermehrung der Sequenzen (Population N1-Nx und Population Z1-Zx).

Die Markierung der Sequenzen (Population N1-Nx) kann dabei durch folgende Strukturen des Nukleotid-Konjugats vermittelt werden: Target-Domäne, Signal-Domäne oder Anker-Domäne.
Die durch sequenzspezifische Markierung bedingte Unterschiede zwischen markierten und nicht markierten DNA-Fragmenten können beispielsweise zur Isolierung und Detektion der markierten DNA genützt werden. Dabei können verschiedener Verfahren markierte und nicht markierte DNA-Fragmente von einander Trennen, bzw. Interaktion zwischen markierten bzw. nicht markierten DNA-Fragmenten verhindern. Solche „Filter-Systeme” oder Filter-Verfahren ermöglichen eine bessere Trennung des spezifischen Signals vom Rauschen
Beispielsweise wird der einzelsträngige Anteil der Target-Domäne nach dem kovalenten Einbau von Nuk-Makromolekülen nicht mehr benötigt. Auch andere Sequenzen im Assay müssen nicht mehr zwingenderweise in einem einzelsträngigen Zustand vorliegen: Nukleotid-Konjugat sind in die neu synthetisierten DNA-Stränge kovalent gebunden. Dies öffnet überraschen neue Möglichkeiten für die Verbesserung der Spezifität der Analyse: es können weitere Verfahrenschritte und Komponenten verwendet werden, die normalerweise nicht mit der Analyse der Nukleinsäureketten kompatibel sind.
In einer vorteilhaften Ausführungsform werden Verfahren und Komponenten verwendet, die eine kompetetive Absättigung der einzelsträngigen Bereichen der Target-Domäne durch zustäzliche Oligonukleotide ermöglichen. Die Absättigung der Target-Domäne verhindert eine mögliche unspezifische Interaktion des Nukleotid-Konjugats mit weiteren Sequenzen. Dadurch kann beispielweise die Spezifität der Analyse verbessert werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform werden Verfahren und Komponenten verwendet, die eine affine Isolierung der sequenzspezifisch markierten Nukleinsäureketten ermöglichen. Beispielsweise erfolgt die Isolierung über die Anker-Domäne der eingebauten Nukleotid-Konjugate.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden Nukleasen zur Isolierung markierten DNA-Fragmenten und zum Abbau von nicht markierten DNA-Fragmenten verwendet. In dieser vorteilhaften Ausführungsform schließen sequenzspezifische Nukleotid-Analoga beispielsweise eine Target-Domäne ein, die gegenüber Nukleasen widerstandsfähig ist. Diese Eigenschaft der Nukleotid-Konjugate führt dazu dass die markierte DNA, bzw. ein Teil davon ebenfalls gegenüber Nukleasen resisten wird. Durch Abbau von nicht markierten DNA-Fragmenten wird Möglichkeit einer unspezifischen Interaktion zwischen den markierten DNA-Fragmenten mit nicht markierten Strängen eliminiert. Die Spezifität eines Assays kann dadurch gesteigert werden.
Ein weiterer wesentlicher Bestandteil dieser Erfindung ist eine mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten markierte DNA oder ihre mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten markierten Fragmente. Diese markierte DNA wird durch enzymatische, matrizenabhängige Synthese erstellt. Eigenschaften dieser markierten DNA werden durch die Eigenschaften der für ihre Herstellung verwendeten Primer, dNTP und sequenzspezifischen Nukleotide-Analoga bedingt.
Ein weiterer Bestandteil dieser Erfindung sind Verfahren, die Isolierung des markierten Teils dieser DNA beschreiben. Ein weiterer Bestandteil dieser Erfindung sind weiterhin Verfahren, die Detektion der markierten DNA bzw. des isolierten, markierten Teils dieser DNA beschreiben.
Modifikation von Nukleinsäureketten In Vivo
Die Fähigkeit von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten, die Verlängerung der Nukleinsäureketten zu kontrollieren, kann auch zur Steuerung der Funktionen der Nukleinsäureketten in vivo eingesetzt werden. Erfindungsgemäße Nukleotid-Konjugate können beispielsweise ähnlich wie Oligonukleotide bei Antisense-Technologien für Steuerung der Verlängerung der Nukleinsäureketten in Zellen dienen. Beispiele für Antisense Anwendungen von Oligonukleotdie sind einem Fachmann bekannt (Expert Opin Biol Ther. 2007 Jul; 7(7): 1021–34. The versatility of oligonucleotides as potential therapeutics. Eckstein F.) Ein entscheidender Vorteil von erfindungsgemäßen Nukleotid-Konjugaten ist, dass sie kovalent in den wachsenden Strang durch zelleigene DNA- bzw. RNA-Polymerasen eingebaut werden können und damit irreversibel die Verlängerung der Stränge blockieren können. Sequenzspezifisch terminierende Nukleotid-Konjugate vereinbauren somit die Eigenschaften der Antisense-Oligonukleotiden, die sequenzspezifisch ihre Wirkung entfalten mit der Eigenschaft von Nukleosid-/Nukleotid-Analoga zur Ketten-Terminierung die bereits seit längerer Zeit in Medizin eingesetzt werden.
Sequenzspezifisch terminierende Nukleotid-Konjugate können in folgenden Bereichen eingesetzt werden:

• Unterdrückung der Verlängerung der DNA, bzw. Replikation bestimmter Abschnitte der Chromosomen bzw. genetisch definierten Genom-Abschnitten der Tumor-Zellen. In dieser Ausführungsform werden terminierende Nuk-Makromoleküle eingesetzt, die an definierte Sequenzen der DNA von Tumor-Zellen binden, die sich vom Wild-Typ-DNA-Sequenzen unterscheiden. Während der Reptlikation der wird das Reprlikations-terminierende Nukleotid-Analog sequenzspezifisch eingebaut, was zum Abbruch der Replikation eines Chromosom führt. Auf diese Weise können Chromosom-Schäden sequenzspezifisch in die Tumorzellen eingeführt werden.
• Veränderung (Unterdrückung oder Steigerung) der Genexpression an bestimmten Abschnitten der Chromosomen der Tumor-Zellen. In dieser Ausführungsform werden sequenzspezifische Nuk-Makromoleküle eingesetzt, die an Sequenzen der Tumor-Zellen binden, die sich vom Wild-Typ-Sequenzen unterscheiden. Während der Reptlikation wird das Transcriptionsmodifizierende Nukleotid-Analog sequenzspezifisch eingebaut, was zwar nicht zum Abbruch der Replikation eines Chromosom führen soll, sondern zur Veränderung der Transcription durch eine RNA-Polymerase bzw. durch Änderung der Bindung von Transkriptionsfaktoren.
• Unterdrückung der Verlängerung der DNA bzw. RNA, bzw. Replikation der DNA bzw. RNA bestimmter Abschnitte der Viren-Genomen. In dieser Ausführungsform werden terminierende Nuk-Makromoleküle eingesetzt, die an Sequenzen der Viren binden. Während der Reptlikation der wird das Reprlikations-terminierende Nukleotid-Analog sequenzspezifisch eingebaut, was zum Abbruch der Replikation von Virus führt.

Sequenzspezifische Nukleotid-Analoga gerichtet gegen einen doppelsträngigen Abschnitt der chromosomalen DNA oder einer viralen Nukleinsäure schließen vorzugsweise mindestens ein Oligonukleotid ein, das in der Lage ist, an einen doppelstrang zu binden (Duplex Invasion). Solche Oligonukleotide sind einem Fachmann bekannt. Beispielsweise schließen diese PNA oder LNA-Sequenzabschnitte ein. Folgende Literaturbeispiele zeigen, dass Oligonukleotide suppressive Effekte auf die zelluläre Vorgänge haben können: Chem Biol. 2004 Jun; 11(6): 749–58. Recognition of chromosomal DNA by PNAs. Kaihatsu K, et al: Nucleic Acids Res. 2003 Feb 1; 31(3): 953–62. In vivo tumor growth inhibition and biodistribution studies of locked nucleic acid (LNA) antisense oligonucleotides. Fluiter K, et al; Biochemistry. 2007 Jun 26; 46(25): 7572–80. Epub 2007 May 31. Inhibiting gene expression with locked nucleic acids (LNAs) that target chromosomal DNA. Beane RL, et al; Biochemistry. 2007 Jun 26; 46(25): 7581–9. Epub 2007 May 31. Inhibiting gene expression with peptide nucleic acid (PNA)--peptide conjugates that target chromosomal DNA. Hu J, et al; Biochemistry. 2002 Aug 6; 41(31): 9973–81. Implications of high-affinity hybridization by locked nucleic acid oligomers for inhibition of human telomerase. Elayadi AN, et al; Terminiernde Nukleotid-Analoga können ähnlich wie Antisense-Oligonukleotide mit weiteren Strukturen kovalent oder nicht kovalent modifiziert werden, wie beispielsweise Antikörper, Cell-Penetrating-Peptides, Lipiden, Steroiden, Nucleus-Localizing-Signals (Peptide). Solche Strukturen ermöglichen eine bessere zelluläre Aufnahme oder Lokalisierung des Nukleotid-Analogs innerhalb der Zelle, z. B. im Zellkern oder in Zell-Zytoplasma. Beispiele dafür sind bekannt (Expert Opin Biol Ther. 2007 Jul; 7(7): 1021–34. The versatility of oligonucleotides as potential therapeutics. Eckstein F.; Oligonucleotides. 2011 Mar–Apr; 21(2): 55–75. Epub 2011 Mar 21. Oligo/polynucleotide-based gene modification: strategies and therapeutic potential. Sargent RG, et al; Biochemistry. 2006 Dec 19; 45(50): 14944–54., Structural requirements for cellular uptake and antisense activity of peptide nucleic acids conjugated with various peptides. Wolf Y, et al; Adv Drug Deliv Rev. 2003 Feb 10; 55(2): 295–306. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Escriou V, et al; Int J Mol Sci. 2008 Jun; 9(7): 1276–320. Epub 2008 Jul 16. Recent developments in peptide-based nucleic acid delivery. Veldhoen S, et al; Zur besseren Aufnahme der Nukleotid-Analoga in die Zellen können verschiedene Techniken der sogenannten „gezielten Zustellung” (eng. „targeted delivery”, bzw. „targeted therapy”) verwendet werden. Viele Beispiele sind einem Fachmann aus dem Bereich der gezielten Zustellung von Antisense-Oligonukleotiden bzw. siRNA, bekannt. Dabei können kovalente oder affine Konjugate des Oligonukleotid-Anteils mit einem zellspezifischen Ligangen, z. B. mit einem Antikörper gegen einen Membran-Rezeptor, verwendet werden. Andererseits können Nukleotid-Konjugate in Mikroteilchen verpackt werden, z. B. Liposome, oder Mizellen mit Polymeren bilden, wie z. B. Polykationen. Solche Makrokonjugate können ihrerseits ebenfalls zelltyp-spezifische Liganden tragen z. B. Antikörper, die ihre Aufnahme in die Zelle verstärken, z. B. Immuno-Liposomen. J Pharm Sci. 2011 Jan; 100(1): 38–52. Drug delivery trends in clinical trials and translational medicine: challenges and opportunities in the delivery of nucleic acid-based therapeutics. Xu L, et al; J Control Release. 2003 Feb 21; 87(1-3): 89–105. Cytoplasmic delivery and nuclear targeting of synthetic macromolecules. Jensen KD, et al.; J Control Release. 2009 Mar 4; 134(2): 132–40. Epub 2008 Nov 12. Polymersome delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Kim Y, et al
Nachfolgend werden vorteilhafte Beispiele für Komponente und Methoden zu deren Anwendung bei den Nachweisverfahren bwz. Amplifikationsverfahren dargestellt.
Der Gegenstand dieser Anmeldung schließt Verfahren zum Nachweis einer oder mehrerer Nukleinsäureketten (eine oder mehrere Zielsequenzen) ein, bei denen modifizierte Nukleotide (Nuk-Makromoleküle, 1) mit einer der folgenden Struktur eingesetzt werden:
(Nuk-Linker)_n-Marker
wobei:
Nuk – ein Nukleotid (Nuk-Komponente) ist
Linker – eine Linker-Komponente, die Nuk-Komponente und makromolekulare Marker-Komponente vebindet ist
Marker – eine Marker-Komponente ist, die mindestens eine zur Zielsequenz vollständig oder teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenz einschließt, z. B. ein Oligonukleotid, die sogenannte Target-Domäne
n – eine Zahl von 1 bis 1000 ist.
Ein solches Nuk-Makromolekül ist in der Lage, entsprechend seinen komplementären Eigenschaften sequenzspezifisch an mindestens eine Zielsequenz in einem Assay zu binden. Durch eine solche Bindung der Target-Domäne an die Zielsequenz wird eine spezifische Markierungreaktion der zur Zielsequenz komplementären Stränge durch eine Polymerase stark begünstigt: es wird bevorzugt die Nuk-Komponente des gebundenen Nuk-Makromoleküls eingebaut.
Die erfindungsgemäßen Nuk-Makromoleküle unterscheiden sich von den natürlichen Nukleotiden in mehreren Aspekten:

• In einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens werden Nuk-Makromoleküle eingesetzt, die zumindest einen Oligonukleotid-Anteil einschließen. Dieser Oligonukleotid-Anteil ist erfindungsgemäß in der Lage, an einer Stelle in der Zielsequenz (Matrize) unter Ausbildung eines komplementären Doppelstranges zu binden. Ein solcher Oligonukleotid-Anteil wird als Target-Domäne bezeichnet und abgekürzt „T-Domäne” genannt (1).
• In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens werden Nuk-Makromoleküle eingesetzt, die zumindest eine Target-Domäne einschließen, sowie zumindest eine Anker-Domäne (abgekürzt „A-Domäne”) (1). Über eine Anker-Domäne kann ein Nuk-Makromolekül an eine feste Phase gebunden werden. Beispiele für eine Anker-Domäne stellen Biotin oder Oligonukleotide dar. Über Biotin oder Oligonukleotid kann ein Nuk-Makromolekül an eine feste Phase gebunden werden, wenn diese Phase Streptavidin oder ein komplementäres Oligonukleotid einschließt.
• In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens werden Nuk-Makromoleküle eingesetzt, die zumindest eine Target-Domäne einschließen, sowie zumindest eine Signal-Domäne (abgekürzt „S-Domäne”) (1). Über eine Signal-Domäne kann ein Nuk-Makromolekül eindeutig identifiziert werden. Beispiele für Signal-Domäne stellen Fluoreszenzfarbstoffe dar.

Eine Markierungsreaktion nach einem erfindungsgemäßen Verfahren wird beispielsweise wie folgt durchgeführt (5A): Es werden mindestens eine Zielsequenz (eine Nukleinsäuren-Matrize), mindestens ein Primer, mindestens eine Polymerase, sowie mindestens eine Art der oben genannten Nuk-Makromoleküle vorgelegt und unter Bedingungen inkubiert, die einen enzymatischen Einbau der Nuk-Kompontente des Nuk-Makromoleküls in den wachsenden Strang erlauben. Durch eine spezifische Bindung der Nuk-Makromoleküle an die Zielsequenz wird der komplementäre Strang spezifisch Markiert. Die enzymatische Kopplung eines solchen Nuk-Makromoleküls in den wachsenden Nukleinsäurenstrang führt zur Herstellung einer Bindung zwischen dem verlängerten Strang und unterschiedlichen Domänen eines Nuk-Makromoleküls.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Anmeldung werden Nuk-Makromoleküle verwendet, die mindestens eine Domäne (Target-Domäne) einschließen, die an die Zielsequenz sequenzspezifisch binden kann, und zumindest eine weitere Domäne, die an einen Bindungspartner an einer festen Phase binden kann (Anker-Domäne). Durch den enzymatischen Einbau eines solchen Nuk-Makromoleküls wird auch die Anker-Domäne zielsequenzspezifisch an die Nukleinsäurekette gebunden. Bei einer Inkubation der nun markierten Nukleinsäureketten mit einer festen Phase, die zumindest einen Bindungspartner für die Anker-Domän einschließt, können markierte Nukleinsäureketten spezifisch an die feste Phase binden.
Wie oben dargestellt, kann ein Nuk-Makromolekül Strukturen einschließen, die komplementär zur Zielsequenz sind. Daher ist es vorteilhaft, die Einbaureaktion unter Bedingungen durchzuführen, die eine Bindung dieser Anteile an die komplementäre Position in der Matrize erlauben. Dadurch kann eine selektive Markierung von ausgewählten Zielsequenzen erreicht werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform können Nuk-Makromoleküle mit natürlichen Nukleotiden (z. B. dNTPs oder NTPs) zusammen im Ansatz verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Nuk-Makromoleküle und ensprechend zur Matrize komplementäre dNTPs konkurrieren miteinander um das Einbauereignis durch die Polymerase am 3'-Ende des wachsenden komplementären Stranges. Ein Nuk-Makromolekül kann durch die spezifische Bindung an die Zielsequenz über die Target-Domäne einen Vorteil gegenüber den freien Nukleotiden in der Lösung erzielen: es kann bevorzugt durch die Polymerase eingebaut werden. Dadurch können die Zielsequenen auch in Anwesenheit von natürlichen dNTPs mit Nuk-Makromolekülen spezifisch markiert werden.
Die Kopplung von Nuk-Makromolekülen erfolgt bevorzugt in der Nähe ihrer Bindung an die Matrize. Sequenzbereiche, die von diesem Ort weit entfernt sind. oder andere, in einem Ansatz vorkommende Sequenze („nicht-Zielsequenzen”) werden nicht markiert. In einer vorteilhaften Ausführugnsform der Erfindung, bleiben solche „Nicht-Zielseuenzen” unmarkiert. Dies kann durch die fehlende oder nur schwache Bindung von Nuk-Makromolekülen an diese „nicht Zielsequenzen” erreicht werden: sie werden mit dNTPs verlängert und werden nur schwach oder gar nicht mit Nuk-Makromolekülen markiert.
Durch die vorgegebene Zusammensetzung der Nuk-Makromoleküle kann der verlängerte Nukleinsäurestrang die Affinitätseigenschaften der Anker-Domäne erlangen. Für eine Analyse kann eine feste Phase bereitgestellt werden, die einen zur Anker-Domäne eines Nuk-Makromoleküls einen passenden Bindungspartner einschließt. Durch eine anschließend an die Markierungsreaktion erfogende Bindung von markierten Zielsequenzen an einen spezifischen, an einer festen Phase fixierten Bindungspartner (z. B. Oligonukleotid-Oligonukleotid-Paar oder in einem Biotin-Streptavidin-Paar, oder ein Antikörper-Hapten-Paar), kann der gesamte verlängerte Nukleinsäurestrang an diesen immobilisierten Bindungspartner gebunden werden (6).
Besonders vorteilhaft sind Ausführungsformen, in denen mehrere unterschiedliche Matrizen mit jeweils unterschiedlichen Primern vorliegen und Nuk-Makromoleküle mit entsprechenden für die jeweilige Matrize spezifischen Oligonukleotid-Anteilen (Target-Domänen) und spezifischen Anker-Domänen verwendet werden. Dies erlaubt jeweils einen sequenzspezifischen Einbau von Nuk-Makromolekülen in die komplementäre Stränge zu den jeweiligen Zielsequenzen, sowie eine anschließende selektive Bindung an die feste Phase unter Verwendung unterschiedlicher, aber jeweils spezifischer Anker-Domänen. Besonders vorteilhaft sind Ausführungsformen, in denen spezifische Bindungspartner für Anker-Domäne auf einer festen Phase in einer adressierbaren Anordnung immobilisiert sind. Dies ermöglicht eine spezifische Verteilung von verlängerten Nukleinsäuresträgen auf der festen Phase aufgrund ihrer Sequenzzusammensetzung.
Die Bindungseigenschaften der Anker-Domänen an die Bindungspartner können optimiert werden. Zum einen, können die Anker-Domänen dermassen gestaltet werden, dass sie keine komplementären Bereiche zu Zielsequenz(en) einschließen. Zum anderen, kann ihre Bindungsstärke und Spezifität unabhängig von Zielsequenz(en) optimiert werden.
Nachfolgend sind wichtige Aspekte dieser Erfindung zusammengefasst

1. Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Visualisierung der genetischen Information in vitro von mindestens einer Nukleinsäurekette, wobei sequenzspezifische Nukleotid-Konjugaten in mindestens einem der folgenden Teil-Schritte der Visualisierung eingesetzt werden:
• Positive Selektion während der Herstellung der Nukleinsäureketten oder der Äquivalenten genetischer Information durch Primer-Verlägerung oder Amplifikation
• Negative Selektion der Nukleinsäureketten oder der Äquivalenten genetischer Information durch gezielte Terminierung oder gezielte Unterdrückung
• Positive Selektion der Nukleinsäureketten oder der Äquivalenten genetischer Information durch Markierung
• Positive Selektion der Nukleinsäureketten oder der Äquivalenten genetischer Information durch Isolierung
• Positive Selektion der Nukleinsäureketten oder der Äquivalenten genetischer Information durch Detektion wobei zumindest eines der verwendeten sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugate folgende Struktur aufweist: (Nuk-Linker)_n-Marker wobei: Nuk – eine Nuk-Komponente ist Linker – eine Linker-Komponente, die Nuk-Komponente und makromolekulare Marker-Komponente vebindet Marker – eine Marker-Komponente ist, die mindestens eine zur jeweiligen Zielsequenz komplementäre Nukleinsäuresequenz einschließt, die sogenannte Target-Domäne n – eine Zahl von 1 bis 100 ist
2. Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur enzymatischen zur Herstellung von mindestens einer modifizierten Nukleinsäuerekette nach Aspekt 1, das folgende Schritte einschließt:
• Amplifikation von mindestens einer Nukleinsäurekette
• Markierung dieser Nukleinsäurekette mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten
• Gegebenenfalls verlaufen Amplifikation und Markierung parallel
• Gegebenenfalls Isolierung der markierten Nukleinsäurekette und folgende Komponenten einschließt:
• Mindestens eine zu markierende Nukleinsäurekette als Matrize (Zielsequenz)
• Mindestens eine Polymerase zur enzymatischen Synthese
• Mindestens einen Primer
• Mindestens eine Art von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten
• Mindestens eine Art von weiteren Nukleotiden
3. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von mindestens einer mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten markierten Nukleinsäurekette nach Aspekt 1, das folgende Schritte einschließt:
• Bereitstellung einer mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten markierten Nukleinsäurekette
• Inkubation dieser markierten Nukleinsäurekette mit einer Reaktionslösung mit mindestens einer Nuklease unter Bedingungen, die Degradation von nicht markierten Nukleinsäureketten zulässt
4. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von mindestens einer mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten markierten Nukleinsäuerekette nach Aspekt 1, das folgende Schritte einschließt:
• Bereitstellung von mindestens einer markierten Nukleinsäurekette
• Detektion der Signale von mindestens einer mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten markierten Nukleinsäurekette
• Gegebenenfalls Vergleich dieses Signal mit einem Referenzsignal
5. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 2, wobei mindestens ein sequenzspezifisches Nukleotid-Konjugat im Markierungsschritt folgende Struktur aufweist: (Nuk-Linker)_n-Marker wobei: Nuk – ein Nukleotid (Nuk-Komponente) Linker – eine Linker-Komponente, die Nuk-Komponente und makromolekulare Marker-Komponente verbindet Marker – eine Marker-Komponente ist, die mindestens ein Oligonukleotid mit einer zur jeweiligen zu markierenden Nukleinsäurekette (Zielsequenz) vollständig oder teilweise komplementären Nukleinsäuresequenz einschließt, und dieses Oligonukleotid mindestens eine chemische Nukleotid-Modifikation einschließt, die gegenüber einer Nuklease nach Aspekt 3 resistent ist. n – eine Zahl von 1 bis 1000 ist
6. Aspekt der Erfindung betrifft Nukleotid-Konjugate nach Aspekt 5, deren Marker mindestens ein Oligonukleotid einschließt, das mindestens eine der folgenden chemischen Modifikationen einschließt: PTO, LNA; PNA, Morpholino, 2'-O-Me.
7. Aspekt der Erfindung betrifft sequenzspezifische Nukleotid-Konjugate nach Aspekt 2, deren Marker mindestens ein Oligonukleotid einschließt, das mindestens einen Sequenzbereich einschließt, der innerhalb desselben Oligonukleotids einen Doppelstrang bilden kann.
8. Aspekt der Erfindung betrifft sequenzspezifische Nukleotid-Konjugate nach Aspekt 2, deren Marker mindestens ein Oligonukleotid einschließt, das mit mindestens einem weiteren komplementären Oligonukleotid hybridisiert ist, so dass ein doppelsträngiger Bereich gebildet ist.
9. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 2, bei dem mindestens ein Primer mindestens eine der folgenden Modifikationen einschließt: PTO, LNA; PNA, Morpholino, 2'-O-Me.
10. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 2, wobei weitere Nukleotide aus der Gruppe von natürlichen Nukleotiden (z. B. dATP, dGTP, dCTP, dTTP, dUTP, ATP, GTP, CTP, UTP) und/oder modifizierten Nukleotiden (z. B. Nukleotide markiert mit Biotin, wie beispielsweise dUTP-Biotin, dCTP-Biotin, oder Terminatoren, wie beispielweise ddTTP, ddCTP, ddATP, ddGTP, oder Fluoreszenzfarbstoffmarkierte Nukleotide, wie beispielweise dUTP-Cy3 oder dUTP-TAMRA), oder Alpha-Phosphorothioat-Nukleotiden, z. B. Sp-dATP-a-S, Sp-dCTP-a-S Sp-dGTP-a-S Sp-dUTP-a-S, ausgewählt werden.
11. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 2, wobei das Verfahren zur Amplifikation eine Polymerasen-Ketten-Reaktion (PCR) einschließt
12. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 2, wobei das Verfahren zur Vervielfältigung eine isothermische Amplifikation ist
13. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 3, wobei eine der folgenden Nukleasen verwendet werden: DNase I, Micrococcal nuclease, Exonuclease III (Exo III), Exonuclease I (Exo I), Mung Bean Nuclease, S1 Nuclease, eine sequenzspezifische Endonuklease
14. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Nukleinsäuerekette nach Aspekt 2, wobei Amplifikationsschritt bzw. Markierungsschritt noch mindestens eine der folgenden Komponenten einschließt:
• Ein Oligonucleotid, das Sequenzabschnitte einschließt, die vollständig oder teilweise zu mindestens einer Zielsequenzen komplementär sind, wobei deren Bindungsposition an der Zielsequenz oder zielsequenzähnlichen Nukleinsäureketten vollständig oder teilweise mit der Bindungsposition der Target-Domäne der sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugates nach Aspekt 2 übereinstimmt.
• Ein Oligonucleotid, das Sequenzabschnitte einschließt, die vollständig oder teilweise zu Target-Domäne von mindestens einem sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugates nach Aspekt 2 komplementär sind
15. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion einer modifizierten Nukleinsäuerekette nach Aspekt 4, wobei vor oder während der Detektion mindestens eine Art von Oligonukleotiden an Target-Domäne der sequenzspezifischen Nukletid-Konjugate durch Hybridisierung gebunden wird, so dass Target-Domäne keine Bindung mit weiteren Nukleinsäureketten via Hybridisierung eingehen kann.
16. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten Terminierung einer enzymatischen Synthese von Nukleinsäureketten nach Aspekt 1, bei dem sequenzspezifische Nukleotid-Konjugate in den komplementären Strang zu mindestens einer zu terminierenden Zielsequenz oder deren Äquivalenten enzymatisch inkorporiert werden, wobei zumindest ein der verwendeten Nukleotid-Konjugate (genannt sequenzspezifisch terminierendes Nukleotid-Konjugat) folgende Struktur aufweist: (Nuk-Linker)_n-Marker wobei: Nuk – eine zur Termination der enzymatischen Synthese führende Nuk-Komponente ist, deren 3'-OH-Position modifiziert ist, Linker – eine Linker-Komponente, die Nuk-Komponente und makromolekulare Marker-Komponente verbindet, Marker – eine Marker-Komponente ist, die mindestens eine zur jeweiligen zu terminierenden Zielsequenz komplementäre Nukleinsäuresequenz einschließt, die sogenannte Target-Domäne, n – eine Zahl von 1 bis 100 ist
17. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten Unterdrückung einer enzymatischen Synthese von Nukleinsäureketten nach Aspekt 1, bei dem Nukleotid-Konjugate in den komplementären Strang zu mindestens einer zu unterdrückenden Zielsequenz oder deren Äquivalenten enzymatisch inkorporiert werden, wobei zumindest ein der verwendeten Nukleotid-Konjugate folgende Struktur aufweist: (Nuk-Linker)_n-Marker wobei: Nuk – eine Nuk-Komponente ist, Linker – eine Linker-Komponente, die Nuk-Komponente und makromolekulare Marker-Komponente verbindet Marker – eine Marker-Komponente ist, die mindestens ein Oligonukleotid mit einer zur jeweiligen zu terminierenden Zielsequenz komplementären Nukleinsäuresequenz einschließt, und optional/wahlweise ein zur Unterdrückung der enzymatischen Synthese führendes sterisches Hindernis einschließt n – eine Zahl von 1 bis 100 ist
18. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 1, bei dem mindestens zwei verschiedene Nukleinsäureketten vorliegen und Synthese von mindestens einer Nukleinsäurekette mit Verfahren nach einem der Aspekte 16 oder 17 terminiert bzw. unterdrückt wird.
19. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung nach Aspekt 2, bei dem mindestens zwei verschiedene Nukleinsäureketten (Zielmoleküle) vorliegen und Herstellung und/oder Markierung von mindestens einer Nukleinsäurekette mit Verfahren nach einem der Aspekte 16 oder 17 gezielt terminiert bzw. gezielt unterdrückt wird
20. Aspekt betrifft ein Kit zur Visualisierung der genetischen Information aus Nukleinsäureketten nach dem Verfahren von einem der Aspekte 1 bis 19, das mindestens eine Art von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten (Nuk-Makromolekülen) nach einem der vorherigen Aspekte, sowie mindestens eine der Komponenten aus der folgenden Liste einschließt:
– Eine oder mehrere Arten der Polymerasen
– Kompositionen zur Durchführung von enzymatischen Reaktionen (Amplifikation, Markierung), einschließlich mindestens einer erforderlichen Art von weiteren Nukleosid-Triphosphaten, Primern und Puffer-Substanzen
– Eine oder mehrere der Nukleasen zur Isolierung von markierten Nukleinsäureketten
– Feste Phase zum Nachweis von markierten Nukleinsäureketten
– Komposition für die Bindung von markierten Nukleinsäureketten an die feste Phase
– Komposition für optische Detektion der Signale an der festen Phase
21. Aspekt betrifft ein Kit zur Amplifikation und Markierung von Nukleinsäureketten nach einem der Verfahren der Aspekte von 1 bis 20, das eine oder mehrere Polymerasen aus der folgenden Liste einschließt:
– Reverse Transcriptasen: M-MLV, RSV, AMV, RAV, MAV, HIV
– DNA Polymerasen: Klenow Fragment DNA Polymerase, Klenow Fragment exo minus DNA Polymerase, T7 DNA Polymerase, Sequenase 2, Vent DNA Polymerase, Vent exo minus DNA Polymerase, Deep Vent DNA Polymerase, Deep Vent exo minus DNA Polymerase, Taq DNA Polymerase und deren Modifikationen (z. B. Rotstart-Polymerasen), Tli DNA Polymerase, Pwo DNA Polymerase, Thermosequenase DNA Polymerase, Pfu DNA Polymerase
22. Aspekt betrifft ein Kit zur Isolierung von markierten Nukleinsäureketten nach Verfahren nach Aspekt 1 oder 3 oder 20, das eine oder mehrere Nukleasen aus der folgenden Liste einschließt: DNase I, Micrococcal nuclease, S1 Nuclease, Exonuclease III (Exo III), Exonuclease I (Exo I), Mung Bean Nuclease und einen entsprechenden Puffer.
23. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten Terminierung bzw. Unterdrückung einer enzymatischen Synthese von Nukleinsäureketten eines Virus in vitro oder in vivo, bei dem sequenzspezifische Nukleotid-Konjugate in Kontakt mit Zellen, einschließlich die durch genanntes Virus infizierten Zellen, oder Geweben oder Organismen gebracht werden, wobei die Virusart, verantwortlich für die genannte Infektion, bekannt ist.
24. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 23, wobei zumindest eines der verwendeten Nukleotid-Konjugate folgende Struktur aufweist: (Nuk-Linker)_n-Marker wobei: Nuk – eine Nuk-Komponente ist, Linker – eine Linker-Komponente, die Nuk-Komponente und makromolekulare Marker-Komponente verbindet Marker – eine Marker-Komponente ist, die mindestens ein Oligonukleotid mit einer zur jeweiligen zu terminierenden, bekannten Virusart-Sequenz komplementären Nukleinsäuresequenz einschließt und wahlweise eine Signal-Domäne für zelluläre Aufnahme n – eine Zahl von 1 bis 100 ist
25. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 23, wobei zumindest eines der verwendeten Nukleotid-Konjugate folgende Struktur aufweist: (Nuk-Linker)_n-Marker wobei: Nuk – eine zur Termination der enzymatischen Synthese führende Nuk-Komponente ist, deren 3'-OH-Position modifiziert ist Linker – eine Linker-Komponente, die Nuk-Komponente und makromolekulare Marker-Komponente verbindet Marker – eine Marker-Komponente ist, die mindestens ein Oligonukleotid mit einer zur jeweiligen zu terminierenden, bekannten Virusart-Sequenz komplementären Nukleinsäuresequenz einschließt und wahlweise eine Signal-Domäne für zelluläre Aufnahme n – eine Zahl von 1 bis 100 ist
26. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten Markierung der chromosomalen DNA mindestens einer Zellart einer Spezies während ihrer enzymatischen Synthese in der Zelle (Replikation), bei dem sequenzspezifische Nukleotid-Konjugate in Kontakt mit Zellen oder Geweben oder Organismen gebracht werden.
27. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 26, wobei zumindest eines der verwendeten sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugate folgende Struktur aufweist: (Nuk-Linker)_n-Marker wobei: Nuk – eine Nuk-Komponente ist, Linker – eine Linker-Komponente, die Nuk-Komponente und makromolekulare Marker-Komponente verbindet Marker – eine Marker-Komponente ist, die mindestens ein Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz einschließt, die zur mindestens einer für die Zellart charakteristische Zielsequenz innerhalb der chromosomalen DNA komplementär ist, und wahlweise eine Signal-Domäne für zelluläre Aufnahme n – eine Zahl von 1 bis 100 ist
28. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 26, wobei zumindest eines der verwendeten sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugate folgende Struktur aufweist: (Nuk-Linker)_n-Marker wobei: Nuk – eine zur Termination der enzymatischen Synthese führende Nuk-Komponente ist, deren 3'-OH-Position modifiziert ist Linker – eine Linker-Komponente, die Nuk-Komponente und makromolekulare Marker-Komponente verbindet Marker – eine Marker-Komponente ist, die mindestens ein Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz einschließt, die zur mindestens einer für die Zellart charakteristische Zielsequenz innerhalb der chromosomalen DNA komplementär ist, und wahlweise eine Signal-Domäne für zelluläre Aufnahme einschließt n – eine Zahl von 1 bis 100 ist
29. Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren nach einem der oben beschriebenen Aspekte, wobei die Signal-Domäne für zelluläre Aufnahme eine der folgenden Strukturen einschließt: „Nucleus Localising Sequence” (NLS), Cell-Penetrating-Peptide”, einen Antikörper oder einen Antikörper-Fragment gegen eine Oberlächenstruktur einer Zelle

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
1.3 Begriffe und Definitionen:
1.3.1 Makromolekulare Verbindung – ein Molekül, oder ein Molekülkomplex, oder ein Nanokristall oder ein Nanoteilchen, dessen Masse zwischen 2 kDa und 20 kDa, 2 kDa und 50 kDa, 2 kDa und 100 kDa, 100 kDa und 200 kDa, 200 kDa und 1000 kDa oder 1 MDa und 100 MDa oder 100 MDa und 100 GDa liegt. Beispiele für makromolekulare Verbindungen sind Nukleinsäuren, wie Oligonukleotide mit einer Länge von mehr als 7 Nukleotiden, Polynukleotide, Polypeptide, Proteine oder. Enzyme, Quantum Dots, Polymere wie PEG, Mowiol, Dextran, Polyacrylat, Nanogold-Partikel aber auch Komplexe, die aus mehreren Makromolekülen bestehen.
1.3.2 Niedermolekulare Verbindung – ein Molekül oder ein Molekülkomplex, dessen Masse kleiner 2000 Da (2 kDa) beträgt, z. B. Biotin, natürliche Nukleotide, dATP, dUTP, viele Farbstoffe, wie Cy3, Rhodamine, Fluorescein und konventionell modifizierte Nukleotide, wie Biotin-16-dUTP.
1.3.3 Ein Nuk-Makromolekül im Sinne dieser Anmeldung ist eine chemische Struktur (ein Nukleotid-Analog, ein Nukleotid-Konjugat), die eine oder mehrere Nuk-Komponenten, eine oder mehrere Linker-Komponenten und zumindest eine Marker-Komponente einschließt (1–3):
(Nuk-Linker)_n-Marker
wobei:
Nuk – eine Nuk-Komponente ist
Linker – eine Linker-Komponente ist
Marker – eine Marker-Komponente ist
n – eine Zahl von 1 bis 10000 ist
Nuk – ein Nukleotid- oder ein Nukleosid-Monomer ist (Nuk-Komponente)
Linker – Seine Zusammensetzung ist nicht eingeschränkt, solange die Substrat-Eigenschaften der Nukleotide nicht verloren gehen. Seine Länge liegt zwischen 5 und 10000 Kettenatome.
Marker – eine Marker-Komponente, die eine oder mehrere Domänen einschließen kann. Beisielsweise Target-Domäne, Anker-Domäne, Signal-Domäne.
n – eine Zahl von 1 bis 10000, wobei (n) einen durchschnittlichen Wert darstellen kann.
In einer weiteren Ausführungsform besteht die Linker-Komponente aus einer Kopplungseinheit L für die Kopplung des Linkers an die Nuk-Komponente, aus einem hydrophilen, wasserlöslichen Polymer und aus einer Kopplungseinheit T für die Kopplung des Linkers an die Marker-Komponente. In dieser bevorzugten Ausführungsform hat ein Nuk-Makromolekül folgende Struktur, 1 oder 2:
(Nuk-(L-Polymer-T))_n-Marker wobei:
Nuk – ein Nukleotid- oder ein Nukleosid-Monomer ist (Nuk-Komponente)
Linker – einschließlich der Kopplungseinheit (L), hydrophilem Polymer, und Kopplungseinheit (T). Wobei (L) ein Teil des Linkers ist, das die Verbindung zwischen Nuk und dem Linkerrest darstellt (Kopplungseinheit L), und (T) ein Teil des Linkers ist, das die Verbindung zwischen dem Linkerrest und dem Marker darstellt (Kopplungseinheit T). Polymer ist ein Teil des Linkers, das ein hydrophiles, wasserlösliches Polymer mit einer durchschnittlichen Länge zwischen 5 und 100000 Atome ist (Kopplungseinheit L, Polymerlinker, Kopplungseinheit T sind bei dieser Ausführungsform als Linker-Komponente zusammengefaßt)
Marker – eine Marker-Komponente, die eine oder mehrere Domänen einschließen kann. Beisielsweise Target-Domäne, Anker-Domäne, Signal-Domäne.
n – eine Zahl von 1 bis 10000, wobei (n) einen durchschnittlichen Wert darstellen kann.
Beispiele für Synthesen von Nuk-Makromolekülen sind in Anmeldungen Cherkasov et al WO2011050938 , Cherkasov et al WO 2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 , Cherkasov et al WO 2008043426 , Cherkasov et al DE 10356837 , Cherkasov et al DE 10 2004 009 704 angegeben.
1.3.3.1 Nuk-Komponente
Nuk-Komponente ist ein Substrat für Nukleotid- bzw. Nukleosid-akzeptierendes Enzym. Nuk-Komponente kann sowohl ein Nukleotid als auch ein Nukleosid darstellen. Im Folgenden werden bei der Beschreibung Nukleotide stellvertretend für beide Klassen betrachtet. Nukleotiside können mittels entsprechender Enzyme oder chemischer Methoden in eine Nukleotidform umgewandelt werden.
In einer Ausführungsform ist Nuk-Komponente ein Nukleotid- oder ein Nukleosid-Monomer, das mit der Linker-Komponente gekoppelt ist. Prinzipiell können alle als Substrat für Nukleotid-akzeptierende Enzyme geeigneten konventionellen Nukleotid-Varianten als Nuk-Komponente des Nuk-Makromoleküls dienen, so dass sowohl natürliche als auch modifizierte Nukleotide (Nukleotid-Analoga) für die Nuk-Komponente in Frage kommen. Bei modifizierten Nukleotiden können Base-, Zucker- oder Phosphat-Teile modifiziert werden. Viele Beispiele für Nukleotid-Modifikationen sind dem Fachmann bekannt („Nucleoside Triphosphates and their Analogs", Morteza Vaghefi, 2005, ISBN 1-57444-498-0; "Deoxynucleoside analogs in cancer therapy" Godefridus J. Peters, 2006, ISBN 1-58829-327-0; "Chemistry of nucleosides and nucleotides" Leroy B. Townsend, 1991, ISBN 0-306-43646-9; "Advanced organic chemistry of nucleic acids", 1994, Shabarova, ISBN 3-527-29021-4; "Nucleotide Analogs" Scheit, 1980, ISBN 0-471-04854-2; "Nucleoside and Nucleic Acid Chemistry", Kisakürek 2000, "Anti-HIV Nucleosides" Mitsuya, 1997, "Nucleoside Analogs in cancer therapy", Cheson, 1997) im Text werden auch weitere Beispiele für die Modifikationen der Nukleotide angegeben. Die Nuk-Komponente schließt vorzugsweise eine Base-Komponente (Base), eine Zucker-Komponente (Zucker) und wahlweise eine Phosphat-Komponente (Phosphat) ein. Base, Zucker und Phosphat können modifiziert sein, d. h. die Grundstruktur sieht den natürlichen Nukleotiden oder Nukleosiden ähnlich, trägt aber beispielsweise zusätzliche chemische Gruppen. Beispiele für Kombinationen aus verschiedenen Komponenten sind dem Fachmann bekannt. Solche Nuk-Komponenten können in vielen enzymatischen und chemischen Reaktionen eingesetzt werden (G. Wright et al. Pharmac. Ther. 1990, V. 47, S. 447-).
In einer bevorzugten Ausführungsform, ist die Nuk-Komponente ein Substrat für DNA-Polymerasen. In einer anderen Ausführungsform, ist die Nuk-Komponente ein Substrat für RNA-Polymerasen. Variationen von Nukleotiden, die solche Substrat-Eigenschaften zulassen, können als Nuk-Komponente eingesetzt werden. Beispielsweise, Substrate für Nukleotid-akzeptierende Enzyme, denen ein Bestandteil eines konventionellen Nukleotids fehlt, z. B. azyklische Nukleotid-analoga, können ebenfalls als Nuk-Komponente eingesetzt werden.
1.3.3.1.1 Variationen am Phosphat
In einer Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid dar. In einer anderen Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid-Monophosphat dar. In einer anderen Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid-Diphosphat dar. In einer weiteren Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid-Triphosphat dar. Auch höhere Phosphat-Derivate (Tetraphosphat, Pentaphosphate usw.) können verwendet werden. Die genannten Phosphatmodifikationen können wie bei Nukleosid-Triphosphaten an der 5'-Position oder auch an anderen Positionen des Zucker-Teils des Nukleotides sitzen, beispielsweise an der 3'-Position. Wahlweise kann die Phosphat-Komponente Modifikationen einschließen, solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen Linker ein (D. Jameson et al. Methods in Enzymology 1997, V. 278, S. 363-, A. Draganescu et al. J. Biol.Chem. 2000 v. 275, 4555-). In einer weiteren Ausführungsform schließt die Phosphat-Komponente der Nuk-Komponente Thiotriphosphat-Verbindungen ein (Burges et al. PNAS 1978 v. 75, S. 4798-). In einer weiteren Ausführungsform schließt die Phosphat-Komponente der Nuk-Komponente geschützte Phosphat-Gruppen (z. B. Phosphoroamidite) ein. In einer Ausführungsform stellt die Phosphat-Komponente die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente der Nuk-Makromoleküle dar.
1.3.3.1.2 Variationen an der Base
Die Nuk-Komponente kann ein in der Natur in den Nukleinsäuren vorkommendes Nukleotid oder Nukleosid oder seine Analoga darstellen, vorzugsweise die an Watson-Crick-Paarbildung teilnehnem, beispielsweise Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin, Uracil, Inosin, oder eine modifizierte Base, wie z. B. 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin, 6-Thioadenin, einschließen, Literatur s. oben. Wahlweise kann die Base Modifikationen einschließen, solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen an die Base gekoppelten Linker wie beispielsweise ein Amino-propargyl-Linker oder ein Amino-Allyl-Linker ein, weitere Beispiele für die Linker sind bekannt (Ward et al. US Pat 4711955 , G. Wright et al. Pharmac. Ther. 1990, V. 47, S. 447-, Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z. B. Klevan US Pat. 4,828,979 , Seela US pat. 6211158 , US pat. 4804748 , EP 0286028 , Hanna M. Method in Enzymology 1996 v. 274, S. 403, Zhu et al. NAR 1994 v. 22 S. 3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704 , Odedra WO 0192284 ). In einer Ausführungsform stellt der an die Base gekoppelte Linker die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente der Nuk-Makromoleküle dar. Weitere Modifikationen an der Base sind beispielsweise im Katalog von Trilink Biotechnologies, Inc. San Diego, USA, dargestellt bzw. in "Nucleoside triphosphates and their analogs", Morteza Vaghefi, 2005 ISBN 1-57444-498-0.
1.3.3.1.3 Variationen am Zucker
Dem Fachmann sind verschiedene Variationen der Zucker-Komponente der Nukleotide bekannt, die z. B. in der Diagnostik, Therapie oder Forschung eingesetzt werden. Solche Variationen schließen z. B. Ribose, 2'-Deoxyribose oder 2',3'-Dideoxyribose ein. Wahlweise kann die Zucker-Komponente Modifikationen einschließen (M. Metzger et al. Nucleic Acid Research 1994, V. 22, 4259-, Tsien WO 91/06678 ), solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen Linker ein. Die modifizierende Gruppe oder Linker kann beispielsweise reversibel an die Zucker-Komponente gekoppelt sein (Hovinen et al. J. Chem. Soc. Prking Trans. 1994, S. 211-, Canard US Pat. 5798210 , Kwiatkowski US Pat. 6255475 , Kwiatkowski WO 01/25247 , Ju et al. US Pat.. 6664079 , Fahnestock et al. WO 91066678 , Cheeseman US Pat. 5302509 , Parce et al. WO 0050642 , Milton et al. WO 2004018493 , Milton et al. 2004018497). In einer Ausführungsform stellt der an die Zucker-Komponente gekoppelte Linker die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente der Nuk-Makromoleküle dar.
In einer weiteren Ausführungsform schließt die Zuker-Komponente z. B. folgende Modifikationen ein: wahlweise kann die 3'- oder die 2'-OH-Gruppen durch folgende Atome oder Gruppen ersetzt werden: Halogenatome, Wasserstoff, Amino-, Merkapto- oder Azido-Gruppe (Beabealashvilli et al. Biochem Biophys Acta 1986, v. 868, 136-, Yuzhanov et al. FEBS Lett. 1992 v. 306, 185-).
In einer weiteren Ausführungsform schließt die Nuk-Komponente azyklische Nukleotid- oder Nukleosid-Modifikationen ein (A. Holy Current Pharmaceutical Design 2003 v. 9, 2567-, G. Wright et al. Pharmac. Ther. 1990, V. 47, S. 447-). In einer weiteren Ausführung kann die Zucker-Komponente eine Doppeltbindung einschließen. In der Anmeldung werden 2'-Deoxynukleotide, beispielsweise 2'-Deoxyuridin-Triphosphat, 2'-Deoxycytidin-Triphosphat, 2'-Deoxyadenosin-Triphosphat, 2'-Deoxyguanosin-Triphosphat als dUTP, dCTP, dATP und dGTP bezeichnet.
Anwesenheit oder Abwesenheit der Fähigkeit der Nuk-Komponente zur weiteren Kopplung von Nukleotiden durch eine Polymerase ist entscheidend für die Eigenschaften von Nukleotid-Konjugaten.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden Nukleotid-Analoga als Nuk-Komponte eingesetzt, die als Terminatoren der enzymatischen Synthese auftreten. Ein Beispiel dafür stellen ddNTP-Analoga dar, z. B. 2',3'-dideoxy-UTP. Einem Fachmann sind weitere Beispiele für Terminatoren bekannt.
1.3.3.1.4 Kopplung der Nuk-Komponente und Linker
Die Nuk-Komponente ist an einer Kopplungsstelle mit dem Linker verbunden. Die Kopplungsstelle des Linkers an die Nuk-Komponente liegt vorzugsweise an der Base. Der Linker kann auch am Zucker (Ribose bzw. Deoxyribose), oder am Phosphat-Teil befinden.
Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und der Nuk-Komponente ist vorzugsweise kovalent. Wenn die Kopplungsstelle an der Base liegt, so befindet sie sich vorzugsweise an den Positionen 4 oder 5 bei Pyrimidin-Basen und an den Positionen 6, 7, 8 bei den Purin-Basen (Ward et al. US Pat 4711955 , G. Wright et al. Pharmac. Ther. 1990, V. 47, S. 447-, Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z. B. Klevan US Pat. 4,828,979 , Seela US pat. 6211158 , US pat. 4804748 , EP 0286028 , Hanna M. Method in Enzymology 1996 v. 274, S. 403, Zhu et al. NAR 1994 v. 22 S. 3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704 , Odedra WO 0192284 ). Weitere Beispiele für Modifikationen an der Base sind in "Nucleoside triphosphates and their analogs", Morteza Vaghefi, 2005 ISBN 1-57444-498-0; angegeben. Am Zucker können die Positionen 2', 3', 4' oder 5' die Kopplungsstellen darstellen. Die Kopplung an die Phosphatgruppen kann beispielweise an der alpha, beta, oder gamma-Phosphatgruppe erfolgen. Beispiele für die Kopplungsstelle an der Base sind in Short WO 9949082 , Balasubramanian WO 03048387 , Tcherkassov WO 02088382 (siehe auch kommerziell erhältliche Nukleotide (Amersham, Roche, Trilink Technologies, Jena Bioscience), an der Ribose in Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363, Canard US Pat. 5798210 , Kwiatkowski US Pat. 6255475 , Kwiatkowski WO 01/25247 , Parce WO 0050642 ., an Phosphatgruppen in Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363 beschrieben.
Die Position der Kopplungsstelle hängt vom Einsatzgebiet der Nuk-Makromoleküle ab. So werden beispielsweise für Markierungen von Nukleinsäuren, die am Nukleinsäurestrang verbleiben soll, vorzugsweise Kopplungsstellen am Zucker oder an der Base verwendet.
Die Kopplung an die Gamma- oder Beta-Phosphatgruppen kann beispielsweise dann erfolgen, wenn die Markierung beim Einbau des Nuk-Makromoleküls freigesetzt werden soll.
Die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente erfolgt beispielsweise über eine Kopplungseinheit (L), die ein Teil der Linker-Komponente ist.
Die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein, z. B. bei Temperaturen bis zu 130°C, für pH-Bereiche zwischen 1 und 14, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z. B. Proteasen, Esterasen) sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar.
Diese spaltbare Verbindung ermöglicht die Entfernung der Linker- und der Marker-Komponenten. Dies kann beispielsweise in den Verfahren der Sequenzierung durch die Synthese von Bedeutung sein, wie Pyrosequencing, BASS (Canard et al. US Patent 5.798.210 , Rasolonjatovo Nucleosides & Nucleotides 1999, V. 18 S. 1021, Metzker et al. NAR 1994, V. 22, S. 4259, Welch et al. Nucleosides & Nucleotides 1999, V. 18, S. 19, Milton et al. WO 2004018493 , Odedra at al. WO 0192284 ) oder single molecule sequencing, Tcherkassov WO 02088382 . Ihre Wahl ist nicht eingeschränkt, sofern sie unter den Bedingungen der enzymatischen Reaktion stabil bleibt, keine irreversible Störung der Enzyme (z. B. Polymerase) verursacht und unter milden Bedingungen abgespalten werden kann. Unter ”milden Bedingungen” sind solche Bedingungen zu verstehen, die zum Beispiel Nukleinsäure-Primer-Komplexe nicht zerstören, wobei z. B. der pH-Wert vorzugsweise zwischen 3 und 11 und die Temperatur zwischen 0°C und einem Temperaturwert (x) liegt. Dieser Temperaturwert (x) hängt von der Tm des Nukleinsäure-Primer-Komplexes (Tm ist der Schmelzpunkt) und wird beispielsweise als Tm (Nukleinsäure-Primer-Komplex) minus 5°C errechnet (z. B. Tm ist 47°C, dann liegt die maximale Temperatur bei 42°C; unter diesen Bedingungen eignen sich besonders Ester-, Thioester-, Acetale, Phosphoester-, Disulfid-Verbindungen und photolabile Verbindungen als spaltbare Verbindungen).
Vorzugsweise gehört die genannte spaltbare Verbindung zu chemisch oder enzymatisch spaltbaren oder photolabilen Verbindungen. Als Beispiele von chemisch spaltbaren Gruppen sind Ester-, Thioester-, Tartrat-, Disulfid-, Acetal-Verbindungen bevorzugt (Short WO 9949082 , „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc., Herman et al. Method in Enzymology 1990 V. 184 S. 584, Lomant et al. J. Mol. Biol. 1976 V. 104 243, "Chemistry of carboxylic acid and esters" S. Patai 1969 Interscience Publ., Pierce Katalog). Beispiele für photolabile Verbindungen können in folgenden Literaturstellen gefunden werden: Rothschild WO 9531429 , "Protective groups in organic synthesis" 1991 John Wiley & Sons, Inc., V. Pillai Synthesis 1980 S. 1, V. Pillai Org. Photochem. 1987 V. 9 S. 225, Dissertation „Neue photolabile Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese" H. Giegrich, 1996, Konstanz, Dissertation „Neue photolabile Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese" S. M. Bühler, 1999, Konstanz).
1.3.3.1.5 Zahl der gekoppelten Nuk-Komponenten
In einer Ausführungsform der Erfindung ist pro ein Nuk-Makromolekül nur eine Nuk-Komponente gekoppelt. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind mehrere Nuk-Komponenten pro Nuk-Makromolekül gekoppelt. Mehrere Nuk-Komponenten können einheitlich oder unterschiedlich sein, wobei beispielsweise durchschnittlich 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 25, 25 bis 50, 50 bis 100, Nuk-Komponenten pro ein Nuk-Makromolekül gekoppelt sein können.
1.3.3.2 Linker-Komponente
Die Funktion des Linkers ist, unter anderem, eine Nuk-Komponente und eine Marker-Komponente in Art und Weise zu verbinden, dass die Substrateigenschaften der Nuk-Komponente für nukleotid-akzeptierende Enzyme trotz Kopplung eines makromolekularen Markers nicht verloren gehen. Die Bezeichnung Linker oder Linker-Komponente wird synonym in der Anmeldung verwendet und bezieht sich auf den gesamten strukturellen Abschnitt des Nuk-Makromoleküls zwischen der Nuk-Komponente und der Marker-Komponente. Die genaue Linkerzusammensetzung ist nicht eingeschänkt und kann variieren. In einer Ausführungsform ist der Linker vorzugsweise hydrophil.
1.3.3.2.1 Linker-Länge
Die durchschnittliche Linkerlänge schließt folgende Bereiche ein: zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50, 50 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis 90, 90 bis 100, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10.000, 10000 bis 100000 Atome (gezählt werden Ketten-Atome), somit beträgt die durchschnittliche Linker-Länge zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50, 50 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis 90, 90 bis 100, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10.000, 10000 bis 100000 Angström (gemessen an einem potenziell maximal ausgestrecktem Molekül).
Falls ein Nuk-Makromolekül mehrere Linker-Komponenten einschließt, können diese Linker-Komponenten untereinander gleiche oder auch unterschiedlich lang sein.
Einige Abschnitte des Linkers können rigide Bereiche enthalten und andere Abschnitte können flexible Bereiche enthalten.
1.3.3.2.2 Kurzer Linker
In einer bevorzugten Form haben Nuk-Makromoleküle einen kurzen Linker. Seine Länge schließt Bereiche zwischen 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50 Kettenatomen ein. Solche Linker können funktionelle Gruppen tragen, wie beispielsweise Amino-, Carboxy-, Mercapto-, Hydroxygruppen, Alkyn-, Isothiocyanat-, Aldehyd- oder Azid-Gruppe. Solche Gruppen können in einer reaktiven Form, z. B. NHS-Ester für Carboxy-Gruppe, bereitgestellt werden. An diese Gruppen können weitere Moleküle gekoppelt werden. In einer Ausführungsform werden Cross-Linker an den kurzen Linker der Nuk-Komponente gekoppelt, so dass die resultierende Nuk-Komponente an weitere Substanzen gebunden werden kann, z. B. an makromolekulre Linker-Komponente oder Marker-Komponenten. Beispiele von kurzen Linkern gekoppelt an Nukleotide sind dem Fachmann bekannt ("Nucleoside triphosphates and their analogs", Morteza Vaghefi, 2005 ISBN 1-57444-498-0, Ward et al. US Pat 4711955 , G. Wright et al. Pharmac. Ther. 1990, V. 47, S. 447-, Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z. B. Klevan US Pat. 4,828,979 , Seela US pat. 6211158 , US pat. 4804748 , EP 0286028 , Hanna M. Method in Enzymology 1996 v. 274, S. 403, Zhu et al. NAR 1994 v. 22 S. 3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704 , Odedra WO 0192284 ). Der Linker kann eine oder mehrere Einheiten von Polymeren enthalten, wie beispielsweise Aminosäuren, Zucker, PEG-Einheiten oder Carbonsäuren. Weitere Beispiele für kurze Linker kann die Kopplungseinheit (L) eines langen Linkers dienen s. u. Beispiele für Cross-Linker sind einem Fachmann bekannt („Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993). Viele Cross-Linker sind kommerziell erhältlich, z. B. von Invitrogen (Lifescience Technologies, Pierce Biotech, Iris-Biotech). Beispiele von Kopplungen von verschiedenen Substanzen an Makromoleküle, z. B. an Oligonukleotide sind ebenfalls bekannt (Y. Singh et al Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 2054-). Es ist für einen Fachmann offensichtlich, dass der Linker zwischen der Nuk-Komponente und der Marker-Komponente in mehreren chemischen Schritten aufgebaut werden kann.
Noch weitere Beispiele für kurze Linker zwischen einer Nuk-Komponente und einem Marker sind am Beispiel der Verbindung zwischen einem Nukleosidtriphsophat und einem Oligonukleotid dargestellt.
NUK-NH-OLN, NUK-O-OLN, NUK-S-OLN, NUK-SS-OLN, NUK-CO-NH-OLN, NUK-NH-CO-OLN, NUK-CO-O-OLN, NUK-O-CO-OLN, NUK-CO-S-OLN, NUK-S-CO-OLN, NUK-P(O)₂-OLN, NUK-Si-OLN, NUK-(CH₂)_n-OLN, NUK-(CH₂)_n-OLN, NUK-A-(CH₂)_n-OLN, NUK-(CH₂)_n-B-OLN, NUK-(CH=CH-)_n-OLN, NUK-(A-CH=CH-)_n-OLN, NUK-(CH=CH-B-)_n-OLN, NUK-A-CH=CH-(CH₂-)_n-OLN, NUK-(-CH=CH-CH₂)_n-B-OLN, NUK-(-CH=CH-CH₂-CH₂)_n-B-OLN, NUK-(-O-CH₂-CH₂)_n-B-OLN, NUK-A-(-O-CH₂-CH₂)_n-OLN, NUK-A-(-O-CH₂-CH₂)_n-B-OLN, NUK-(C≡C-)_n-OLN, NUK-(A-C≡C-)_n-OLN, NUK-(C≡C-B-)_n-OLN, NUK-A-C≡C-(CH₂-)n-OLN, NUK-(-C≡C-CH₂)_n-B-OLN, NUK-(-C≡C-CH₂-CH₂)_n-B-OLN,
wobei Nuk – die Nuk-Komponente ist, OLN – ein Oligonukleotid ist und A und B folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH-CO-, -CO-O-, -O-CO-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O)₂-, -Si-, -(CH₂)_n-, eine photolabile Gruppe, wobei n – gleich 1 bis 5 ist
Diese Beispiele sind lediglich zur Anschaulichung dargestellt, ohne die Struktur des Linkers einzuschränken.
1.3.3.2.3 Langer Linker
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein langer Linker eingesetzt, mit einer Länge von mehr als 50 Ketten-Atomen. Die Linker-Komponente hat in ihrer Struktur beispielsweise folgende Bestandteile:

1) Kopplungseinheit L
2) hydrophiles bzw. wasserlösliches Polymer
3) Kopplungseinheit T

Die Aufteilung der Linker-Komponente in einzelne Bestandteile ist rein funktionell und soll lediglich der Anschaulichkeit der Struktur dienen. Je nach Betrachtungsweise können einzelne Strukturen des Linkers zum einen oder zum anderen Bestandteil gerechnet werden.
Die Kopplungseinheit L hat die Funktion, die Linker-Komponente und die Nuk-Komponente zu verbinden. Bevorzugt sind kurze, unverzweigte Verbindungen, von 1 bis 20 Atome in der Länge. Die jeweilige Struktur der Kopplungseinheit L hängt von der Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid und von dem jeweiligen Polymer des Linkers ab. Einige Beispiele für die Kopplungseinheiten L sind in Beispielen 1 bis 33 angegeben. Viele konventionell modifizierte Nukleotide tragen einen kurzen Linker, diese kurzen Linker dienen als weitere Beispiele für die Kopplungseinheit L, z. B. kurze Linker an der Base: Short WO 9949082 , Balasubramanian WO 03048387 , Tcherkassov WO 02088382 (siehe auch kommerziell erhältliche Nukleotide (Amersham, Roche), kurze Linker an der Ribose in Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363, Canard US. Pat. 5798210 , Kwiatkowski US Pat. 6255475 , Kwiatkowski WO 01/25247 , Ju et al. US Pat. 6664079 , Parce WO 0050642 ., kurze Linker an Phosphatgruppen in Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363. Noch weitere Beispiele für die Kopplungseinheit L sind nachfolgend angegeben:
R₆-NH-R₇, R₆-O-R₇, R₆-S-R₇, R₆-SS-R₇, R₆-CO-NH-R7, R₆-NH-CO-R₇, R₆-CO-O-R₇, R₆-O-CO-R₇, R₆-CO-S-R₇, R₆-S-CO-R₇, R₆-P(O)₂-R₇, R₆-Si-R₇, R₆-(CH₂)_n-R₇, R₆-(CH₂)_n-R₇, R₆-A-(CH₂)_n-R₇, R₆-(CH₂)_n-B-R₇, R₆-(CH=CH-)_n-R₇, R₆-(A-CH=CH-)_n-R₇, R₆-(CH=CH-B-)_n-R₇, R₆-A-CH=CH-(CH₂-)_n-R₇, R₆-(-CH=CH-CH₂)_n-B-R₇, R₆-(-CH=CH-CH₂-CH₂)_n-B-R₇, R₆-(C≡C-)_n-R₇, R₆-(A-C≡C-)n-R₇, R₆-(C≡C-B-)_n-R₇, R₆-A-C=C-(CH₂-)_n-R₇, R₆-(-C=C-CH₂)_n-B-R₇, R₆-(-C≡C-CH₂-CH₂)_n-B-R₇,
wobei R₆ – die Nuk-Komponente ist, R₇ – de Polymer ist und A und B folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH-CO-, -CO-O-, -O-CO-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O)₂-, -Si-, -(CH₂)_n-, eine photolabile Gruppe, wobei n – gleich 1 bis 5 ist
Die Kopplungseinheit L ist auf einer Seite mit der Nuk-Komponente kovalent verbunden. Auf der anderen Seite können weitere Teile des Linkers, z. B. ein hydrophiles Polymer oder direkt die Kopplungseinheit T oder direkt der Marker gebunden werden.
Im Folgenden, wird die Kopplung eines Polymers, als Bestandteil des Linkers exemplarisch erläutert. Die Art der Kopplung hängt von der Art des Polymers ab. In bevorzugter Form hat das Polymer an seinen Enden reaktive Gruppen, beispielsweise NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid, Halogen-, Alkyn-, Isothiocyanat- oder Azid-Gruppe. Solche Gruppen können in einer reaktiven Form, z. B. NHS-Ester für Carboxy-Gruppe, bereitgestellt werden. Solche Polymere sind käuflich erwerblich (z. B. Fluka, Iris-Biotech, Nanocs inc, Pierce Biotech). Einige Varianten für die Kopplung von Polymeren an die Kopplungseinheiten sind unter Beispielen angegeben.
Das wasserlösliche Polymer bildet in einer bevorzugten Ausführungsform den Hauptanteil der Linker-Komponente. Es ist ein Polymer, vorzugsweise hydrophil, bestehend aus gleichen oder unterschiedlichen Monomeren. Beispiele für geeignete Polymere stellen Polyethylen-glycol (PEG), Polyamide (z. B. Polypeptide), Polysaccharide und deren Derivate, Dextran und seine Derivate, Polyphosphate, Polyacetate, Poly(alkyleneglycole), Kopolymere aus Ethylenglycol und Propylenglycol, Poly(olefinische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(x-Hydroxy-Säuren), Poly-Acrylsäure und ihre Derivate, Poly-Acrylamide in ihre derivate, Poly(Vinylalkohol), Polylactat Säure, polyglycolic Säure, Poly(epsilon-caprolactone), Poly(beta-hydroxybutyrate), Poly(beta-hydroxyvalerate), Polydioxanone, Poly(ethylene terephthalate), Poly(malic Säure), Poly(tartronic Säure), Poly(ortho ester), Polyanhydride, Polycyanoacrylate, Poly(phosphoester), Polyphosphazene, Hyaluronidate, Polysulfones.
Dieses Polymer schließt in einer Ausführungsform verzweigte oder weiteren Ausführungsform nicht verzweigte Polymere ein. Das Polymer kann aus mehreren unterschiedlich langen Abschnitten bestehen, wobei jeder Abschnitt aus gleichen Monomeren besteht und Monomere in unterschiedlichen Abschnitten unterschiedlich sind. Einem Fachmann sollte naheliegend erscheinen, dass für einen makromolekularen Linker meistens nur eine durchschnittliche Masse bestimmt werden kann, so dass die Angaben zu den Molmassen einen Mittelwert darstellen ("Makromoleküle, Chemische Struktur und Synthesen", Band 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X). Aus diesem Grund kann für Nuk-Makromoleküle oft keine exakte Massenangabe gemacht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt die Linker-Komponente ein lineares, nicht verzweigtes Polymer ein und trägt keine sterisch anspruchsvollen chemischen Strukturen, wie beispielsweise Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, Liganden. Solche Linker ermöglichen eine geringe sterische Hinderung der enzymatischen Erkennung der Nuk-Komponenten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Polymer der Linker-Komponente linear, die Linker-Komponente trägt jedoch eine oder mehrere sterisch anspruchsvollen chemischen Strukturen, wie beispielsweise Farbstoffe. Die Einführung der sterisch anspruchsvollen Gruppen erlaubt bei manchen Verfahren eine Kontrolle der enzymatischen Reaktion (Tcherkassov WO 02088382 ). Weitere Beispiele für sterisch anspruchsvolle Gruppen sind im Abschnitt 1.3.19 angegeben.
Sterisch anspruchsvollen Liganden bzw. Strukturen können an unterschiedliche Linker-Abschnitte gekoppelt sein. Die durchschnittliche Zahl der an den Linker gekoppelten sterisch anspruchsvollen Liganden kann variieren und liegt beispielsweise zwischen 1 und 3, 3 und 5, 5 und 20, 20 und 50. Die Kopplung von sterisch anspruchsvollen Gruppen sollte die Tatsache berücksichtigen, dass eine raumfordernde Struktur in der Nähe der Nukleotid-Komponente zur Aufhebung der Substrateigenschaften führen kann. Sterisch anspruchsvolle Liganden können gleichmäßig oder zufällig über die gesamte Länge des Linkers gekoppelt sein, oder in einem bestimmten Abstand von der Nuk-Komponte am Linker gekoppelt sein. Der Abstand zwischen der Nuk-Komponente und dem sterischen Hindernis beträgt beispielsweise 10 bis 15, 15 bis 20, 20 bis 25, 25 bis 30, 30 bis 35, 35 bis 40, 40 bis 45, 45 bis 50, 50 bis 55, 55 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis 90, 90 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 1000, 1000 bis 5000 Kettenatome. Die sterisch anspruchsvolle Gruppe kann als Teil des Linkers oder als Teil des Markers betrachtet werden. Die Betrachtugnsweise kann beispielsweise davon abhängen, ob sterisch anspruchsvolle Gruppe gewisse Signaleigenschaften aufweist oder nicht.
1.3.3.2.4 Linker-Kopplung in einem Nuk-Makromolekül
Der Linker ist an einer Seite an die Nuk-Komponente und auf der anderen Seite an die Marker-Komponente gebunden. Dazu kann der Linker an seinen Enden Kopplungseinheiten haben, die diese Funktion erfüllen. Die Verbindung mit der Nuk-Komponenten wurde oben erörtert. Die Verbindung zwischen dem Linker und der Marker-Komponenten erfolgt über Kopplungseinheit T. Bevorzugt sind kurze, unverzweigte Verbindungen, bis max. 20 Atome in der Länge. Die jeweilige Struktur der Kopplungseinheit T hängt von der Kopplungsstelle an der Marker-Komponente und von dem jeweiligen Polymer des Linkers. Die Kopplungseinheit T ist mit dem Polymer kovalent verbunden. Die Art der Kopplung hängt von der Art des Polymers ab. In bevorzugter Form hat das Polymer an seinen Enden reaktive Gruppen, beispielsweise NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid, Halogen-, Alkyn-, Isothiocyanat- oder Azid-Gruppe. Solche Gruppen können in einer reaktiven Form, z. B. NHS-Ester für Carboxy-Gruppe, bereitgestellt werden. Solche Polymere sind kommerziell erhältlich (z. B. Sigma-Aldrich, Iris-Biotech, Nanocs Inc.,). Einige Beispiele für die Kopplungseinheiten L sind angegeben in Cherkasov et al WO 2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 , Cherkasov et al WO 2008043426 , Cherkasov et al DE 10356837 , Cherkasov et al DE 102004009704 . Weitere Beispiele für die chemische und affine Kopplungen s. in der Literatur: "Nucleoside triphosphates and their analogs", Morteza Vaghefi, 2005 ISBN 1-57444-498-0; „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996.
Der Linker kann auch andere funktionelle Gruppen, bzw. Abschnitte enthalten, beispielsweise eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Gruppen s. Anmeldungen Cherkasov et al WO 2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 , Cherkasov et al WO 2008043426 , Cherkasov et al DE 10356837 , Cherkasov et al DE 10 2004 009 704 .
Eine spaltbare Verbindung innerhalb des Linkers ermöglicht eine Entfernung eines Teils des Linkers und der Marker-Komponente. Nach der Spaltung verbleibt ein Linker-Rest an der Nuk-Komponente, Beispiele für spaltbare Verbindungen sind im Abschnitt 1.3.3.1.4 angegeben.
1.3.3.3 Marker-Komponente
Die Struktur der Marker-Komponente ist vorzugsweise an ihre Funktionen angepasst. In der vorliegenden Anmeldung hat die Marker-Kompontente vorzugsweise eine oder mehrere folgender Funktionen: a) Erkennung einer oder mehrerer Zielsequen, b) Bindung an eine feste Phase, c) Generierung oder Vermittlung eines spezifischen Signals, d) Bindung an eine Struktur der Zelloberfläche, e) Penetration in eine Zelle, f) Steuerung des Transports innerhalb einer Zelle, g) Verankerung des Nuk-Makromoleküls innerhalb eines Trasportvesikels (z. B. eines Liposoms). Diese Funktionen werden von einzelnen Teilen der Marker-Komponetene erfüllt.
In dieser Anmeldung wird Begriff „Domäne” verwendet. Dieser Begriff dient zur Beschreibung eines Teils oder einer Gruppe von Teilen des Nuk-Makromoleküls mit einer gemeinsamen Funktion. Einzelne Teile der Domänen können auch als Marker-Einheiten bezeichnet werden. Dabei kann eine Domäne aus einer oder mehreren Marker-Einheiten mit gleicher Funktion gebildet werden. Die Bezeichnung Domäne soll einem Fachmann eine bessere Übersicht über die möglichen Kombinationen einzelner Strukturen und ihre Funktionen vermitteln. Sie dient nicht zur Einschränkung auf bestimmte Strukturen.
Begriff „Marker-Einheit” wird beschreiben für Strukturen verwendet, die eine Funktion erfüllen und gut mit für einen Fachmann bekannten Strukturen korrelieren, z. B. Biotin, Farbstoff, Fluoreszenzfarbstoff, Oligonukleotid, Quantum-Dot, Nanoteilchen, eine reaktive Gruppe usw.. Beispielsweise ein Farbstoff oder ein Mikroteilchen oder eine Amino-Gruppe stellen für den Fachmann bekannte Elemente dar. Ähnlich wie im Bereich der Polymer-Chemie stellen einzelne Marker-Einheiten die Bausteine einer makromolekularen Struktur dar. Für eine anschauliche Beschreibung, können Marker-Einheiten mit ähnlichen Funktionen zu Domänen zusammengefasst werden. Im einfachsten Fall schließt eine Domäne nur eine Marker-Einheit ein, z. B. eine Anker-Domäne mit einem Biotin. Es können aber mehrere Biotin-Moleküle zu einer Anker-Domäne zusammengefasst werden.
Erfindungsgemäß kann eine Marker-Komponente der Nuk-Makromoleküle folgende Domäne einschließen: eine oder mehrere Target-Domänen, eine oder mehrere Anker-Domänen, eine oder mehrere Signal-Domänen. In einer weiteren Ausführungsform schließen Nuk-Makromoleküle Antagonisten für entsprechende Domäne ein. In einer Ausführungsform schließen Nuk-Makromoleküle mit sequenzspezifischen terminierenden Eigenschaften mindestens eine Target-Domäne ein.
Target-Domäne: Die Erkennung einer Zielsequenz oder mehreren Zielsequenzen wird von einem Teil der Marker-Kompontente gewährleistet, einer sogenannten Target-Domäne. Beispiele für Target-Domäne sind Nukleinsäureketten (z. B. DNA-Oligonukleotide oder RNA-Oligonukleotide) oder deren Analoga (z. B. PNA-Ologonukleotide oder LNA-Oligonukleotide), die an die Zielsequenz binden können. Unterschiedliche Zielsequenzen können durch unterschiedliche, spezifische Target-Domänen oder durch eine Target-Domäne mit breitem Sequenzerkennungsspektum erkannt werden.
Anker-Domäne: Die Bindung an eine feste Phase wird von einem weiteren Teil der Marker-Komponente ermöglicht, einer sogenannten Anker-Domäne. Diese Anker-Domäne kann an eine feste Phase über eine affine oder kovalente Bindung binden. Beispiele für Anker-Domäne stellen ebenfalls Nukleinsäureketten, z. B. Oligonukleotide, die an die komplementäre Partner, fixiert an einer festen Phase, binden können (komplementäre Bindung von Nukleinsäureketten, oder Aptamer-Protein-Bindung). Weitere Beispiele für Anker-Domäne stellen Biotin oder Haptene (z. B. Farbstoffe, Digoxigenin, DNP), oder Proteine mit Fähigkeit, andere Moleküle zu binden (z. B. Streptavidin (SA), Antikörper, Lektine usw.). Einem Fachmann sind viele Bespiele für Bindugnspartner für affine Bindungen bekannt. Generell, ein Partner aus einem solchem Bindungspaar ist ein Bestandteil der Marker-Komponente (Anker-Domäne), ein weiterer Partner – Bestandteil der festen Phase (Bindungspartner).
Signal-Domäne der Markerkompontente vermittelt beispielsweise spezifische Erkennung bzw. Nachweis der Nuk-Makromoleküle. Andererseits kann eine eine Signal-Domäne noch weitere Funktionen einschließen, wie beispielsweise Bindung an eine Struktur der Zelloberfläche, erleichterung einer Penetration in eine Zelle, Steuerung des Transports innerhalb einer Zelle, Mehrere Beispiele sind unten angegeben und sind einem Fachmann bekannt.
Antagonisten einzelner Marker-Domänen
In einer Ausführungsform schließt die Marker-Kompontente Strukturen ein, die Eigenschaften bzw. die Funktion einer Domäne reversibel blockieren kann. Diese Struktur wird als Antagonist zu der jeweiligen Domäne bezeichnet. Die Wirkung des Antagonisten ist reversibel, so dass die Eigenschaften der Domänen wiederhergestellt werden können.
Antagonist der Target-Domäne:
Ein Nuk-Makromolekül schließt in einer Ausführungsform mindestens einen Antagonisten zur Target-Domäne ein (z. B. Filter-2-Oligonukleotid). Es kann beispielsweise ein Oligonukleotid mit Sequenzzusammensetzung sein, das teilweise oder vollständig komplementär zur Sequenz des Oligonukleotids der Target Domäne ist. Die Länge des Antagonisten-Oligonukleotids kann variieren. Vorzugsweise ligt sie zwischen 5 und 7, 7 und 10, 10 und 15, 15 und 20, 20 und 25, 25 und 30, 30 und 40 Nukleotide. Das Antagonist-Oligonukleotid ist vorzugsweise an die Target-Domäne des Nuk-Makromoleküls gekoppelt. Diese Bindung ist in einer Ausführungsform kovalent. Die kovalente Bidung kann beispielsweise am 3'-Ende oder am 5'-Ende des Oligonukleiotids der Target-Domäne erfolgen (32). In einer weiteren Ausführungsform ist eine solche Bindung affine und erfolgt durch die Hybridisierung des Antagonist-Oligonukleotids an das Oligonukleotid der Target-Domäne (33). Durch die Einführung eines Antagonisten kann eine stärkere Diskriminierung von Zielsequenzen erreicht werden.
Antagonist der Anker-Domäne:
Anker-Domäne hat die Aufgabe, Bindung an die feste Phase zu vermitteln. In einigen Ausführungsformen schließt die Anker-Domäne Oligonukleotide ein, die durch Hybridisierung an einen komplementären, immobilisierten Bindungspartner binden. Ein Antagonist für eine solche Anker-Domäne stellt beispielsweise ein komplementäres Oligonukleotid innerhalb des Nuk-Makromoleküls dar, das die Anker-Domäne reversibel binden kann und dadurch die Interaktion mit dem Bindungspartner an der festen Phase verhindert (3i). Die Wirkung des Antagonisten wird beispielsweise bei der Bindung eines Nuk-Makromoleküls an die Zielsequenz und den Einbau der Nuk-Komponente dauerhaft aufgehoben (7). Durch die frei gewordene Anker-Domäne kann nun die Bindung an die feste Phase stattfinden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, kann ein Antagonist der Anker-Domäne vom Nuk-Makromolekül durch chemische oder enzymatische Reaktion abgespalten werden.
Antagonist der Signal-Domäne:
Quencher-Moleküle stellen für Signal-Domäne mit Fluoreszenzeigenschaften Beispiele von Antagonisten dar. Diese Antagonisten können beispielsweise über eine spaltbare chemische Bindung bzw. über eine Harrnadel-ähnliche Struktur der Nukleinsäureketten („molecular beacons”, FRET-Paare) in die Nähe der Marker-Einheiten gebracht werden, die Fluoreszeigenschaften haben. Dadurch wird das Signal gemindert oder aufgehoben. Nach der Abspaltung der Quencher oder durch Zerstörung der Haarnadel-Struktur der Nukleinsäuren, erhöhet sich der Abstand zwischen einem Quencher und dem Fluoreszenzfarbstoff. Es kommt zu Steigerung des Signals.
Bei der Beschreibung werden die Antagonisten zusammen mit Domänen betrachtet, deren Wirkung sie reversibel blockieren.
Die einzelnen Domänen und ihre Antagonisten sind intergriert zu einer Marker-Kompontente. Die Intergration kann durch Kopplung einzelner Domänen aneinander stattfinden oder sie werden mittels Linker verknüpft oder einzelne Domänen sind an eine weitere Struktur gekoppelt, z. B. an eine Kern-Kompontente des Markers.
Einzelne Domänen können aus einer oder mehreren Marker-Einheiten bestehen. In einer Ausführungsform schließt eine Domäne nur eine Marker-Einheit ein. Beispielsweise, eine Target-Domäne schließt nur eine Oligonukleotidsequenz ein, die an eine Zielsequenz binden kann. Beispiel für eine Anker-Domäne mit nur einer Struktur-Einheit ist Biotin oder auch ein Oligonukleotid. Beispiel für eine Signal-Domäne mit nur einer Struktur-Einheit ist ein Fluoreszenzfarbstoff oder ein Quantum-Dot.
In einer weiteren Ausführungsform kann eine Domäne mehrere Marker-Einheiten einschließen. Beispielsweise, mehrere gleiche oder unterschiedliche Oligonukleotidsequenzen können in einem Nuk-Makromolekül gekoppelt werden und an den gleichen Abschnitt in der Zielsequenz binden. In diesem Fall bilden die einzelnen Oligonukleotidsequenzen die Marker-Einheiten und ihre Gesamtheit stellt eine Target-Domäne dar. Ähnlich können auch mehrere Oligonukleotide oder mehrere Biotin-Molelüle zu einer Anker-Domäne zusammengefasst werden.
Ein Nuk-Makromolekül kann auch mehrere Target-Domänen oder mehrere Anker-Domänen oder mehrere Signal-Domänen einschließen. Dies ist dann der Fall, wenn sich die Domänen einer Gruppe in ihrer Funktion unterscheiden. Beispielsweise binden unterschiedliche Target-Domänen eines Nuk-Makromoleküls an unterschiedliche Abschnitte in einer Zielsequenz oder an unterschiedliche Zielsequenzen. Die Funktion der Bindung an die feste Phase kann ebenfalls durch nur eine oder auch mehrere unterschiedliche Anker-Domänen erfüllt werden.
Ein Nuk-Makromolekül kann eine Marker-Komponente einschließen, die nur eine einzelne Funktion oder auch eine Kombination aus zwei oder mehr Funktionenen hat. Je nach Funktion unterscheidet sich auch die Zusammensetzung einzelner Nuk-Makromolekül-Arten.
Die Darstellungsweise für die Zusammensetzung des Markers ist in In Anmeldung Cherkasov et al WO2011050938 dargestellt.
Die einzelnen Domänen können untereinander direkt oder mit Hilfe der Kern-Komponente verbunden sein.
Im Folgenden, werden einige Beispiele für die Strukturen und Funktionen einzelner Domänen der Marker-Kompontente ausführlicher besprochen.
1.3.3.3.1 Target-Domäne.
In einer Ausführungsform schließt eine Target-Domäne ein Oligonukleotid ein. Dieses Oligonukleotid kann DNA, PTO, RNA, PNA, LNA oder auch weitere, zur Basenpaarung fahrige Modifikationen der Nukleinsäureketten einschließen. In einer weiteren Ausführungsform schließt eine Target-Domäne Misch-Oligonukleotide ein, z. B. DNA und PTO. In einer weiteren Ausführungsform schließt eine Target-Domäne ein Peptid oder Protein mit sequenzerkennenden Eigenschaften ein, z. B. ein Transcriptionsfaktor.
Die Target-Domäne hat die Aufgabe, das gesamte Nuk-Makromolekül in einer Ausführungsform vorwiegend sequenzspezifisch in einer weiteren Ausführungsform genau spezifisch an eine Zielsequenz zu binden. Nuk-Makromoleküle können mittels einer Target-Domäne sequenzspezifisch vor oder während der enzymatischen Reaktion an die Zielsequenz binden.
Die Bindung der Target-Domäne erfolgt vorzugsweise an einen Einzelstrang der Zielsequenz. Dieser Einzelstrang kann auf der gesamten Länge der Zielsequenz in einzelsträngiger Form vorliegen oder auch teilweise doppelsträngig sein. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Bindung der Target-Domäne sequenzspezifisch an einen Doppelstrang der Zielsequenz. Dabei kann es zur Stranginvasion durch die Target-Domäne kommen (wie z. B. für PNA beschrieben) oder die Bindung der Target-Domäne erfolgt an den Doppelstrang ohne Strangtrennung, z. B. durch sequenzerkennende Proteine. Je nach Struktur der Zielsequenz (doppelsträngig oder einzelsträngig) können verschiedene Strukturen als Target-Domäne dienen (z. B. Oligonukleotide oder nukleinsäuebindende sequenzspezifische Protein, z. B. Transcriptionsfaktoren).
Im Folgenden wird beispielhaft die Bindung der Target-Domäne an einen Einzelstrang der Zielsequenz als Beispiel betrachtet. Ein zur Zielsequenz komplementäres Oligonukleotid kann in einer solchen Ausführungsform als Target-Domäne-Oligonukleotid verwendet werden. In ähnlicher Weise kann ein Fachmann eine andere Struktur als Taget-Domäne wählen, falls diese sequenzspezifisch an einen Doppelstrang binden soll, Beispiele für solche Strukturen sind einem Fachmann bekann.
In einer Ausführungsform schließt die Target-Domäne als Oligonukleotid verschiedene Nukleobasen ein. Die Nukleobasen wie Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil (abgekürzt als A, C, G, T, U) oder deren Analoga gekoppelt an einen Zucker-Phosphatrückgrad in Form von DNA oder RNA oder deren Analoga, z. B. PNA, LNA, können sequenzspezifisch an die Nukleinsäurestränge binden. Verschiedene Nukleinsäureketten, z. B. DNA, PTO, RNA, Proteinnukleinsäuren (PNA), Morpholino und deren Analoga können den Nukleinsäure-Anteil der Target-Domäne darstellen. Generell gesprochen, eignen sich für Target-Domäne Substanzen, die eine vorwiegend sequenzspezifische oder stark spezifische Bindung mit einer einzelsträngigen oder einer doppelsträngigen Nukleinsäurekette eingehen können. Der Rückgrad kann dabei eine natürliche Zusammensetzung haben (Zucker-Phosphatrückgrad) oder eine Abwandlung davon, z. B. PNA, PTO, 2'-O-Methyl-Modifikation. Einzelne Target-Domänen innerhalb einer Art von Nuk-Makromolekülen können dabei durchgehend aus einer Art der Bausteine bestehen, z. B. nur DNA oder nur PNA, oder auch ein gemischtes, zusammengesetztes Polymer darstellen, wo stellenweise DNA, PTO, RNA, PNA, Morpholino, LNA oder weitere Modifikationen zu einer Kette zusammengefasst sind.
Falls mehrere Target-Domänen innerhalb einer Art von Nuk-Makromolekülen vorkommen, können einzelne Domänen unterschiedliche Arten von Bausteinen vorweisen, z. B. eine Target-Domäne besteht aus DNA, die andere aus PNA, noch eine weitere aus RNA.
Zur Vereinfachung der Darstellung werden Target-Domäne bildende Nukleinsäureketten in Form der DNA in Details besprochen. Andere Arten der Nukleinsäureketten können entsprechend den einem Fachmann bekannten Regeln nach dem Muster der DNA-Oligonukleotide konstruiert und eingesetzt werden.
Die Länge des Abschnittes des Oligonukleotids, der an die Zielsequenz hybridisieren soll, also die Länge der Target-Domäne, muss an die jeweiligen Assay-Bedingungen angepasst werden. Diese Länge schließt folgende Bereiche ein (gemessen in Nukleobasen): 6 bis 8, 8 bis 10, 10 bis 15, 15, bis 20, 20 bis 25, 25 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50, 50 bis 70, 70 bis 100, 100 bis 150, länger als 150. Je nach Natur der Target-Domäne (also z. B. DNA, PTO, RNA, PNA oder LNA) kann die Spezifität der Bindung an die jeweilige Zielsequenz variieren. Einem Fachmann ist beispielsweise bekannt, dass PNA-basierte Oligonukleotide eine stärkere Affinität zu komplementären Bereichen aufweisen, als die DNA-basierte Oligonukleotide der gleichen Zusammensetzung und Länge. Die DNA-basierte Oligonukleotide weisen beispielsweise eine relativ höhere Spezifität, wenn ihre Länge zwischen ca. 15 und 25 Nukleotiden ist. Durch Steigerung der Länge der Target-Domäne kann diese Spezifität abnehmen. Dies bedeutet, dass längere Target-Domäne-Oligonukleotide eher toleranter gegenüber Einzelnukleotid-Variationen in der Zielsequenz sind, als kürzere Target-Domäne-Oligonukleotide. Es kann allerdings auch von Vorteil sein, dass längere Target-Domäne-Oligonukleotide größere Sequenzvarianten tolerieren können (z. B. Insertionen oder Deletionen).
Die Kopplung der Target-Domäne im Nuk-Makromolekül erfolgt in einer Ausführungsform an einem der beiden Enden der Target-Domäne, z. B. am 5'-Ende oder am 3'-Ende. Beispiele für Kopplung eines Oligonukleotides an einem seiner Enden sind einem Fachmann bekannt. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Kopplung von anderen Bestandteilen des Nuk-Makromoleküls (z. B. Nuk-Komponente) im inneren Bereich der Target-Domäne.
Beispielweise kann der jeweilige Linker zwischen einer Nuk-Komponente und einem Oligonukleotid an einer der Basen des Oligonukleotids oder an einem Monomer des Rückgrandes (z. B. am Zucker oder Phosphat bei einem DNA-Rückgrad oder an einer Aminosäure bei einem PNA-Rückgrad, oder an einem Schwefel-Rest des Phosphorothioat-Rückgrades (PTO) gekoppelt werden. Einem Fachmann sind verschiedene Möglichkeit der Kopplung von Substanzen an ein Oligonukleotid an verschiedenen Position bekannt.
Die Target-Domäne kann über einen Linker direkt an die Nuk-Komponente gekoppelt sein oder sie kann an die Kern-Komponente des Nuk-Makromoleküls gekoppelt sein. Eine Kernkomponenten kann. beispielsweise aus einem linearen oder verzweigten Polymer bestehen (s. u.).
Der Abschnitt des Oligonnukleotids, der zur Zielsequenz komplementär ist, also die eigentliche Target-Domäne, kann am 5'-Ende oder am 3'-Ende von weiteren Sequenzabschnitten flankiert sein, die nicht an die Zielsequenz binden. Diese flankierenden Bereiche können aus gleichen Monomenren, wie die Target-Domäne, bestehen (z. B. DNA, PTO, PNA, LNA, RNA) oder sich in der Zusammensetzung von der Target-Domäne unterscheiden. Diese flankierenden Sequenzabshcnitte können in der Länge von 1 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 15, 15 bsi 20, 20 bis 30, 30 bis 100 oder länger als 100 Nukleobasen betragen. Sie können als Abstandhalter dienen oder beispielsweise Funktionen der Marker-Domäne oder Anker-Domäne (s. u.) ausführen.
Ein Linker, der eine Nuk-Komponente mit der Target-Domäne-Oligonukleotid verbindet, kann beispielsweise an einen solchen flankierenden Bereich gekoppelt sein.
Die Target-Domäne-Oligonukleotide können teilweise selbst-komplementäre Abschnitte einschließen, z. B. als Haarnadelstrukturen (engl. Hairpins) oder Schleifen (Engl. Loops). In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Target-Domäne an der Bildung einer Struktur vom Typ des so genannten „Molecular Beacon” beteilgt (zu Eigenschaften von Molecular Beacons: Bonnet et al. PNAS 1999, v96. 6171-). In dieser Ausführungsform ist die eigentliche, der Zielsequenz komplementäre Target-Domäne-Sequenz von flankierenden Nukleinsäuresträngen umgeben, die untereinander komplementär sind. Durch eine solche Struktur kann die Spezifität der Bindung der Target-Domänen-Sequenz an die Zielsequenz gesteigert werden. Die selbstkomplementären Bereiche eines solchen Molecular-Beacons sind in der Regel zwischen 3 bis 6, 6 bis 8, 8 bis 10, 10 bis 15 Nukleotiden lang und die Target-Domäne-Sequenz ist ca. 10 bis 15, 15 bis 20, 20 bsi 30, 30 bis 40 Nukleotide lang.
In einer Ausführungsform ist ein Schenkel des doppesträngigen Abschnitts der Struktur von Typ „Molekularen Beacon” an der Bindung an die Zielsequenz beteiligt (zum Thema „Shared stem molecular beacons”, siehe Tsourkas et al. NAR 2002, v. 30 4208-). In diesem Fall ist die Target-Domäne-Sequenz des Oligonukleotids von einem Bereich flankiert, der zur Target-Domäne-Sequenz komplementär ist.
Selbstkomplementäre Abschnitte zur Target-Domäne können als „Antagonisten” der Target-Domäne aufgefasst werden: sie hindern die Target-Domäne an Ausbildung wenig spezifischen Bindungen, lassen allerdings bei höheren Temperaturen eine stärker spezifische Hybridisierung des Target-Domäne-Oligonukleotids an die Zielsequenz zu.
Einem Fachmann sind weitere Oligonukleotid-Modifikationen bekannt, welche die Bindung an die komplementäre Abschnitte der Zielsequenz beeinflussen können. Zu solchen Modifikationen gehören z. B. „Minor-Groove-Binder”. Solche Modifikationen können an die Target-Domäne gekoppelt sein.
In einer Ausführungsform ist das 3'-OH-Ende des Target-Domäne bildenden Oligonukleotids (oder des flankierenden Oligonukleotids) durch eine chemische Gruppe geblockt. Einem Fachmann sind viele Beispiele von Modifikationen von 3'-OH-Position bei Oligonukleotiden bekannt. Sie schließen beispielsweise folgende Substanzen ein: eine 2'.3'-Dideoxy-Ribose, eine Phosphat-Gruppe, einen Biotin-Rest, einen Amino-Linker, einen Fluoreszenzfarbstoff, eine Peptid-Kette, einen Quencher. Anstelle von 3'-OH Gruppe können verschiedene Modifikationen in ein Oligonukleotid inkorporiert sein, z. B. eine Amino-Gruppe, eine Halogen-Atom, eine Azid-Gruppe usw. In dieser Ausführungsform kann ein solches Oligonukleotid nicht weiter durch eine Polymerase extendiert werden, es hat also keine Primer-Funktion.
In einer anderen Ausführungsform ist das 3'-OH-Ende des Target-Domäne bildenden Oligonukleotids nicht blockiert und kann von einer Polymerase verlängert werden.
In einer Ausführungsform der Anmeldung kann die Target-Domäne durch die 5'-3'-Exonukleasenaktivität einer Polymerase komplett oder teilweise abgebaut werden. Die Struktur der Nuk-Makromolekülen kann dabei dermassen gestaltet werden, dass die eingebaute Nuk-Komponente mit dem Rest des Nuk-Makromoleküls im verlängerten komplementären Strang verbleibt. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Kopplung der Nuk-Komponente über einen Linker am 3'-Ende der Target-Domäne erfolgt oder in seiner Nähe erfolgt.
In einer weiteren Ausführungsform der Anmeldung ist die Target-Domäne resistent gegenüber einer Exonuklease-Aktivität einer Polymerase oder einer Nuklease. Dies kann beispielsweise durch die Einführung von PTO, PNA, 2'-O-Me, oder LNA-Monomeren oder weiterer Modifikationen erreich werden. In einer Ausführungsform schließt die Target-Domäne mindestens eine solche Modifikation an einem der beiden Ende (z. B. am 5'- oder am 3'-Ende) ein. In einer Ausführungsform schließt die Target-Domäne mindestens eine solche Modifikation in internen Bereichen der Sequenz der Target-Domäne, In einer Ausführungsform schließt die Target-Domäne solche Modifikation an einem der beiden Ende und in internen Bereichen der Sequenz der Target-Domäne, wobei sich Modifikationen mit natürliche Nukleotid-Monomeren abwechseln können, z. B. PTO-DNA-Misch-Polymer. In einer Ausführungsform schließt die Target-Domäne solche Modifikation in ihrer gesamten Länge ein. In einer Ausführungsform schließt die Target-Domäne mehr als eine Art der Modifikation in ihrer gesamten Länge ein, es entsteht ein Misch-Polymer, z. B. aus PNA und PTO.
Die Bindung der Target-Domäne an die Zielsequenz kann in einer Ausführungsform unter Ausbildung von Doppelsträngen (nach den Regeln der Watson-Crick Basenpaarung) erfolgen, in einer anderen Ausführungsform werden Triple-Stränge (nach Hoogsteen Regeln) gebildet.
Beispiele für eine sequenzspezifische Bindung von Nukleinsäureketten sind einem Fachmann bekannt. Die Länge und die Zusammensetzung der Target-Domäne wird dermassen angepasst, dass die Target-Domäne an die Zielsequenz unter jeweiligen Reaktionsbedingungen erfolgen kann. Bindung von Primern an die Zielsequenzen oder Bindung von Sonden an die Zielsequenzen stellen bekannte Beispiele der Hybridisierung zwischen Oligonukleotiden und Zielsequenzen dar.
Im Folgenden, wird die Bindung an einen Einzelstrang als Beispiel betrachtet. Die Zusammensetzung einer Target-Domäne kann eine vollständige Komplementarität zur Zielsequenz aufweisen („perfect Match”) oder sich an einigen Stellen unterscheiden („Miss-Match”).
Bei einer gegebenen Zielsequenz können mehrere einem Fachmann bekannte Methoden zur Wahl einer passenden Sequenz für die Target-Domäne verwendet werden. Da die Target-Domäne innerhalb der Zielsequenz binden soll, können beispielsweisen die Regel angewandt werden, die bei der Wahl einer Real-Time-PCR-Sonde eingesetzt werden (Literatur siehe Abschnitt Amplifikationsmethoden) Andererseits sind einem Fachmann auch Regeln bekannt nach denen die Microarray-Oligonukleotide konstruiert werden. Bei einer gewünschten Bindung an eine einzelsträngige Zielsequenz werden beispielsweise koomplementäre Sequenzen einer Target-Domäne in der Länge von ca. 10 bis 50 Nukleobasen oder 15 bis 30 Nukleobasen ausgewählt.
Vorzugsweise schließt eine Target-Domäne von Nuk-Makromolekülen Nukleinsäureketten mit der Länge in folgenden Bereichen ein: von 3 bis 6, 6 bis 9, 9 bis 12, 12 bis 14, 14 bis 16, 16 bis 18, 18 bis 20, 20 bis 25, 25 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50, 50 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 100, 100 bis 200, von 200 bis 500 Nukleobasen. Falls mehrere Target-Domänen innerhalb eines Nuk-Makromoleküls integriert sind, können sie unterschiedliche Längen haben. Einzelne Target-Domänen können innerhalb einer kontinuierlichen Nukleinsäurekette zusammengefasst sein oder auch als einzelstehende Marker-Einheiten in einem Nuk-Makromolekül vorkommen.
In einer Ausführungsform der Anmeldung sind die Sequenzen einer Target-Domäne nur für eine Zielsequenz komplementär und können nur die Zielsequenz binden.
In einer weiteren Ausführungsform der Anmeldung ist die Sequenz einer Target-Domäne in der Lage eine Gruppe von unterschiedlichen Zielsequenzen zu binden. Dies kann beispielsweise durch die größere Länge der Target-Domäne erreicht werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Anmeldung schließt ein Nuk-Makromolekül mehrere Target-Domäne-Oligonukleotide bestehend aus jeweils unterschiedlichen Sequenzen ein, wobei diese Target-Domänen in der Lage sind, unterschiedliche Zielsequenzen zu binden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung werden Sequenzen der Target-Domäne dermassen ausgewählt, dass sie nicht in der Lage sind, unter verwendeten Reaktionsbedinungen an die Anker-Domäne-Sequenzen oder an die auf einer bereitgestellten festen Phase fixierten Bindungspartner-Sequenzen zu binden.
In einer weiteren Ausführungsform der Anmeldung wird die Sequenz der Target-Domäne einer Art von Nuk-Makromolekülen dermassen ausgewählt, dass sie nicht in der Lage ist, unter verwendeten Reaktionsbedingungen an weitere Target-Domäne oder an Anker-Domäne oder weitere Bestandteile innerhalb derselben Art von Nuk-Makromolekülen zu binden.
In einer weiteren Ausführungsform der Anmeldung wird die Sequenz der Target-Domäne einer Art von Nuk-Makromolekülen dermassen ausgewählt, dass sie nicht in der Lage ist, unter verwendeten Reaktionsbedingungen an weitere Target-Domäne oder an Anker-Domäne oder weitere Bestandteile anderer Nuk-Makromoleküle zu binden die im selben Ansatz verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Anmeldung wird die Länge und die Sequenzzusammensetzugn der Target-Domäne einer Art von Nuk-Makromolekülen dermassen gestaltet (sowie die Reaktionsbedingungen, z. B. Reaktionstemperatur, „stringente Bedingungen”), dass sie Abweichungen in der Zielsequenz diskriminieren kann. Diese Abweichungen können beispielsweise Nukleotid-Austausch (z. B. Adenosin statt Guanosin oder statt Cytosin), Nukleotid-Deletionen oder Nukleotid-Additionen sein. Beispielsweise kann die Target-Domäne unter gegebenen Reaktionsbedingungen die Abweichungen in der Zielsequenz unterscheiden, die folgende Bereiche einschließt: von 1 bis 2 Nukleotiden, oder 2 bis 5 Nukleotiden, oder 5 bis 10 Nukleotiden, oder 10 bis 20 Nukleotiden, oder 20 bis 50 Nukleotiden. Diese Abweichungen können an einer Position in der Zielsequenz vokommen oder über mehrere Stellen der Zielsequenz verteilt sein.
In einer weiteren Ausführungsform der Anmeldung wird die Länge und die Sequenz der Target-Domäne einer Art von Nuk-Makromolekülen dermassen gestaltet (sowie die Reaktionsbedingungen, z. B. Reaktionstemperatur, weniger „stringente Bedingungen”), dass sie Abweichungen in der Zielsequenz tolerieren kann. Diese Abweichungen können beispielsweise Nukleotid-Austausch (z. B. Adenosin statt Guanosin oder statt Cytosin), Nukleotid-Deletionen oder Nukleotid-Additionen sein. Beispielsweise kann die Target-Domäne unter gegebenen Reaktionsbedingungen die Abweichungen in der Zielsequenz tolerieren, die folgende Bereiche einschließt: von 1 bis 2 Nukleotiden, oder 2 bis 5 Nukleotiden, oder 5 bis 10 Nukleotiden, oder 10 bis 20 Nukleotiden, oder 20 bis 50 Nukleotiden. Diese Abweichungen können an einer Position in der Zielsequenz vokommen oder über mehrere Stellen der Zielsequenz verteilt sein. In dieser Ausführungsform werden somit nicht nur Zielsequenzen markiert, sonder auch andere, einer zielsequenz-ähnliche Nukleinsäureketten.
Eine Target-Domäne kann aus mehreren einzelnen Oligonukleotiden bestehen, die in einem Nuk-Makromolekül integriert sind. Auch mehrere Target-Domäne können in einem Nuk-Makromolekül vorkommen, dabei werden beispielsweise Oligonukleotide mit unterschiedlichen Sequenzen in einem Nuk-Makromolekül intergriert. Mehrere Target-Domänen können auch innerhalb einer Oligonukleotidkette integriert sein. Dabei können sie unmittelbar ineinander übergehen oder deren Sequenzen können überlappend gestalltet werden oder die Domäne durch eine weitere Sequenz getrennt werden.
Die einzelnen Target-Domänen können innerhalb einer Art von Nuk-Makromolekülen von gleicher oder von unterschiedlicher Nukleinsäureart sein. Beispielsweise können DNA-basierte Target-Domänen mit PNA-basierten Target-Domänen innerhalb einer Art von Nuk-Makromolekülen kombiniert sein. Die Synthese von gemischten Nukleinsäureketten bestehend aus z. B. DNA und PNA ist bekannt.
Eine Target-Domäne kann zusätzliche Modifikationen tragen, wie beispielsweise signalgebende oder signalvermittelnde Moleküle, z. B. Farbstoffe, Fluoresenzfarbstoffe oder Biotin, oder makromolekulare Substanzen, wie Enzyme oder Nanokristalle. Modifizierte Oligonukeotide kann man kommerziell erwerben z. B. MWG-Biotech.
Eine Target-Domäne kann die Funktion einer Kern-Komponente erfüllen und Vebindung zwischen einzelnen Teilen des Markers eines Nuk-Makromoleküls darstellen. Die Linker-Komponente kann direkt an die Target-Domäne gekoppelt sein.
Bezüglich der chemischen Synthese von Oligonukleotiden, die Target-Domäne bilden, und deren Modifikation kann ein Fachmann an folgende Quellen verwiesen werden: Singh et al Chem Soc Rev, 2010, v. 39, 2054-, "oligonucleotide synthesis, methods and applications" Piet Herdewijn, 2004, ISBN 1-58829-233-9, "Protocols for oligonucleotide conjugates, synthesis and analytical techniques" Sudhir Agrawal, 1993, ISBN 0-89603-252-3, "Protocols for oligonucleotide conjugates, synthesis and properties" Sudhir Agrawal, 1993, ISBN 0-89603-247-7, "The aptamer handbook" Sven Klussmann, 2006, ISBN 10: 3-527-31059-2, "Pharmaceutical aspects of oligonucleotides" Patrick Couvreur, 2000, ISBN 0-748-40841-X, "Triple Helix forming Oligonucleotides"Claude Malvy, 1999, ISBN 0-7923-8418-0, "Artificial DNA, methods and applications" Yury E. Khudyakov, ISBN 0-8493-1426-7
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Anmeldung sind die Target-Domäne und weitere Domänen (z. B. Anker-Domänen und/oder Signal-Domänen) innerhalb einer Nukleinsäurekette positioniert. Die Target-Domäne kann beispielsweise den Anteil der Nukleinsäurekette am oder in der Nähe von 5'-Ende bilden und die Anker-Domäne oder Signal-Domäne den Anteil der Nukleinsäurekette am oder in der Nähe von 3'-Ende. Eine solche Anordnung Domänen erlaubt eine gleichzeitige Synthese von beiden Domänen während einer Synthese des Oligonukleotid-Anteils des Nuk-Makromoleküls. In weiteren Ausführungsformen kann beispielsweise eine oder mehrere Target-Domänen von mehreren Anker-Domänen oder Signal-Domänen innerhalb einer Nukleinsäurekette umgeben sein. Als weiteres Beispiel, können eine oder mehrere Signal-Domäne auch mehren Target-Domänen umgeben sein.
In einer vorteilhabten Ausführungsform der Erfindung sind Sequenzen der Target-Domäne und die der Anker-Domäne oder Signal-Domäne überlappend. In dieser Ausführungsform sind einige Nukleobasen Bestandteile von mindestens beiden Domänen. Die Länge der Sequenz, die das gemeinsame Fragment für die Target- und die Anker-Domäne oder die Target- und die Signal-Domäne bildet, kann beispielsweise von 5 bis 80% der Sequenz einer der Domänen einschließen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind Sequenzen der Target-Domäne und die der Anker-Domäne oder die der Signal-Domäne durch eine oder mehrere Spacer-Sequenzen getrennt. In einer Ausführungsform der Erfindung schließt eine solche Spacer-Sequenz die Funktion mit signalvermittelnden Eigenschaften ein. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung schließt eine Spacer-Sequenz Sequenzen ein, die komplementär zu einer Target-Domäne oder zu einer Anker-Domäne oder zu Signal-Domäne sind. Diese Abschnitte innerhalb der Spacer-Sequenz können vollständig oder nur teilweise komplementär zu einer der Domänen sein. In solchen Ausführungsformen hat eine Spacer-Sequenz die Rolle eines Antagonisten.
In einer weiteren Ausführungsform bindet die Target-Domäne des Nuk-Makromoleküs vor oder während der Reaktion an eine Hybridisierungssonde, (Z), statt an die Zielsequenz (5B). Eine solche Sonde schließt vorzugsweise ein Oligonukleotid ein. Dieses Oligonukleotid kann sowohl an die Target-Domäne des Nuk-Makromoleküls spezifisch binden (Sequenzabschnitt Z-1) als auch an die Zielsequenz (Sequenzabschnitt Z-2). Sequenzabschnitt Z-2 ist somit einer für die Zielsequenzspezifische Target-Domäne. In einer weiteren Ausführungsform wird eine Art von Nuk-Makromolekülen mit einer für die Hybridisierungssonde spezifischen Target-Domäne in Kontakt mit mehreren Hybridisierungsonden gebracht, die jeweils gleiche Bindungsstellen (Z-1) für die Target-Domäne eines Nuk-Makromoleküls aber unterschiedliche Bindunsstellen für die Zielsequenz (Z2). Dadurch ist es möglich mit einer einheitlichen Art von Nuk-Makromolekülen unterschiedliche Zielsequenzen zu markieren. Vorzugsweise ist die Bindung zwischen dem Nuk-Makromolekül und der Hybridiserungssonde unter Bedingungen einer Markierungsreaktion stabil. Dies kann beispielsweise durch die Sequenzwahl des Sequenzabschnitts (Z-1) und der Target-Domäne der Nuk-Makromoleküle mit einer höheren Tm erreichen, verglichen mit der Tm des Abschnitts Z-2 der Hybridisierungssonde.
Das gesamte Konstrukt, einschließlich kovalent aneinader gebundenen Nuk-Komponente, des Linkers, des Oligonukletids und der damit durch eine Affinitätsbindung (durch Basenpaarung entstandene Bindung zwischen zwei Nukleinsäuresträngen) gekoppelten Oligonukleotide (Hybridisierungssonde in 5B) kann als Nuk-Makromolekül bezeichnet werden. Die Synthese/die Ausbildung eines reaktionsfähigen Nuk-Makromoleküls im Sinne dieser Anmeldung erfolgt somit unmittelbar vor oder sogar während der Markierungsreaktion. Das Oligonukleotid, das mit der Nuk-Komponente in kovalenter Verbindung steht, kann auch als eine Kern-Komponente bezeichnet werden (s. u.), weils es die Rolle eines Vermittlers zwischen zwei Funktionalitäten, der Nuk-Komponente und der Target-Domäne, erfüllt.
Positionierung der Target-Domäne innerhalb der Zielsequenz
Die Position der Hybridisierung der Target-Domäne innerhalb der Zielsequenz liegt vorzusweise 3'-Abwärts vom einem Primer. Diese Positionierung ermöglicht einer Polymerase den Einbau der Nuk-Komponente, die an die Target-Domäne gebunden ist, während der Synthese eines komplementären Stranges der Zielsequenz. In einer Ausführungsform ist die Positionierung innerhalb der ersten 1–5, 1–10, 1–20, 20–30, 30–50 Nukleotide von Primer-Bindungsstelle, in einer weiteren Ausführungsform ist diese Positionierung innerhalb der ersten 50 bis 200 Nukleotide von der Primer-Bindungsstelle, in einer weiteren Ausführungsform liegt die Bindungsstelle für Target-Domäne weiter als 200 Nukleotide von der Primer-Bindungsstelle entfernt.
Falls mindestens zwei Primer bei einem Assay verwendet werden, z. B. für Amplifikation der Zielsequenz, so liegt die Bindungsstelle der Target-Domäne zwischen den Bindungsstellen beider Primer an der Zielsequenz.
Die Positionierung der Target-Domäne innerhalb einer Zielsequenz kann beispielsweise funktionelle Bedeutung der Zielsequenz berücksichtigen, z. B. in einer Ausführungsform erfolgt die Positionierung innerhalb einer Promoter-Region eines Gens (+/–5000 Nukleotide aufwärts oder abwärts) oder innerhalb eines Exons oder Introns eines Gens.
Die Bindungsstelle für die Target-Domäne-Oligonukleotid innerhalb einer Zielsequenz kann eine potenzielle Mutationsstelle oder eine SNP-Stelle einschließen. In einer solchen Ausführungsform liegt eine solche potenzielle Stelle vorzugsweise zentral innerhalb einer Bindungsstelle für Target-Domäne. Diese Positionierung kann zu einer höheren Diskreminierung der Bindung einer Target-Domäne an die Zielsequenz führen und somit zu einer höheren Spezifität des Assay beitrage.
In einem Assay können mehrere Nuk-Makromoleküle sequenzspezifisch an die gleiche Zielsequenz binden. In einer Ausführungsform ist die Sequenz-Zusammensetzung der Target-Domäne-Oligonukleotide dermassen angepasst, dass die jeweiligen Nuk-Makromoleküle an den gleichen Strand der Zielsequenz binden. Dabei können die Bindungsstellen von unterschiedlichen Nuk-Makromolekülen an einer Zielsequenz überlappend sein oder Nuk-Makromoleküle können hintereinader an einem Strand der Zielsequenz ohne Überlappung binden.
In einer weiteren Ausführungsform binden mindestens zwei Nuk-Makromoleküle mit jeweils unterschiedlichen Target-Domäne-Oligonukleotdie an beide Stränge der Zielsequenz, wobei jedes Nukleotid-Konjugat mit seiner sequenzspezifischen Target-Domäne an einen Strang der Zielsequenz bindet (38–39). Eine solche Bindung ist beispielsweise bei Amplifikationsverfahren vorteilhaft, bei denen beide Stränge der Zielsequenz vervielfältigt werden, z. B. bei PCR, HDA oder LAMP. In einer Ausführungsfrom sind Target-Domäne-Oligonukleotide der beiden Arten von Nuk-Makromolekülen mindestens teilweise einander komplementär (38) und können miteinader einen Doppelstrang ausbilden. Der komplementäre Bereich zwischen zwei Target-Domäne-Oligonukleotdie verschiedener Arten von Nuk-Makromoleküle kann beispielsweise 10 bis 15, 15 bis 20, 25 bis 30, 30 bis 50, oder auch größer als 50 Nukleobasen betragen. In einer weiteren Ausführungsfrom sind Target-Domäne von beiden Arten von Nuk-Makromolekülen einander nicht komplementär.
In einer weiteren Ausführungsfrom werden in einem Assay mehrere Nuk-Makromoleküle verwendet, wobei pro jeweiligen Strang der Zielsequenz mindestens zwei Nuk-Makromoleküle binden. Beispielsweise können 2 bis 4, 4 bis 10, 10 bis 20 Nuk-Makromoleküle an den ersten Strang der Zielsequenz binden und wahlweise 2 bis 4, 4 bis 10, 10 bis 20 Nuk-Makromoleküle an den zweiten, komplementären Strang der Zielsequenz binden. Die jeweiligen Target-Domäne-Sequenzen liegen jeweils in 3'-Richtung von einem an den jeweiligen Strang gebundenen Primer.
Falls solche Nuk-Makromoleküle in einem Amplifikations-Assay eingesetzt werden, die mindestens zwei Primer einschließen, so liegen in einer Ausführungsform die Bindungsstellen von Target-Domäne-Oligonukleotide zwischen den Bindungsstellen der beiden Primer.
Falls mehrere Primer in einem Assay verwendet werden (z. B. Nasted-PCR mit mindestens einem äußeren Primer-Paar und mindestens einem inneren Primer-Paar), so kann die Bindungsstelle von mindestens einem Target-Domäne-Oligonukleotid zwischen den Primer-Bindungsstellen eines äußeren Primers und eines inneren Primer liegen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung liegt die Bindungsstelle von mindestens einem Target-Domäne-Oligonukleotid teilweise oder vollständig überlappend mit einer Primer-Bindungsstelle.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung liegt die Bindungsstelle von mindestens einem Target-Domäne-Oligonukleotid teilweise oder vollständig überlappend mit einer Oligonukleotid-Sonde-Bindungsstelle.
Unterscheidung zwischen mehreren Sequenzen.
In einem Assay besteht oft eine Notwendigkeit, eine Zielsequenz von anderen Zielsequenzen zu unterscheiden. Dabei unterscheiden sich die genannten Zielsequenzen an mindesten einer Stelle z. B. durch einen Einzelnukleotid-Austausch oder Veränderungen über eine Strecke von mehreren Nukleotiden.
Diese Zusammensetzung der jeweiligen Target-Domäne-Oligonukleotide der zu verwendeten Arten von Nuk-Makromolekülen sollte eine spezifische Hybridisierung der jeweiligen Art von Nuk-Makromolekülen an die jeweilige Zielsequenz in einem Assay ermöglichen. Einem Fachmann ist bekannt, dass sogar Einzelnukleotid-Unterschiede durch Oligonukleotide unter entsprechenden stringenten Bedingungen unterschieden werden können. Target-Domäne-Oligonukleotide mit teilweise selbstkomplementären Strukturen vom Typ „Molecular Beacons” (s. o.) ermöglichen beispielsweise eine höhere Differenzierung von Sequenzn.
In folgenden Ausführungsformen sollen einige Beispiele gezeigt werden, die einem Fachmann verdeutlichen, wie sequenzspezifische Ereignisse (z. B. sequenzspezifische Terminierung oder sequenzspezifische Markierung usw.) für einen Nachweis oder Markierung oder Vervielfältigung einer Zielsequenz oder mehreren Zielsequenzen ingesetzt werden können.
In einer Ausführungsform werden mehrere Zielsequenzen unterschiedlich mit den jeweils für sie spezifischen Nuk-Makromolekülen markiert, wobei die Nuk-Makromoleküle jeweils unterschiedliche Marker-Eigenschaften aufweisen, z. B. unterschiedliche Bindungseigenschaften an die feste Phase durch Anker-Domäne (s. u.) oder unterschiedliche spektrale Eigenschaften der Signal-Domäne (s. u.). Durch den sequenzspezifischen Einbau der jeweils unterschiedlich markierten Nuk-Makromoleküle können mehrere Zielsequenzen in einem Assay unterschiedlich markiert und gegebenenfalls detektiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform werden mehrere Zielsequenzen unterschiedlich mit den jeweils für sie spezifischen Nuk-Makromolekülen markiert, wobei mindestens eine Art von Nuk-Makromolekülen mindestens eine Art von terminierenden Nuk-Komponenten einschließt, z. B. ddUTP. Die Target-Domäne-Oligonukleotide werden jeweils spezifisch für die jeweilige Zielsequenz konstruiert. Durch die sequenzspezifsiche Bindung eines terminierenden Nuk-Makromoleküls und Einbau einer terminierenden Nuk-Komponente kommt es zur Terminierung der Synthese einer oder merhere Zielsequenzen. Dadurch kann auch die Markierung/Nachweis dieser Sequenzen verhindert werden. Andere Zielsequenzen, die nicht terminiert wurden können dagegen markiert und detektiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform werden mehrere Zielsequenzen vervielfältigt und gleichzeitig unterschiedlich mit den jeweils für sie spezifischen Nuk-Makromolekülen markiert, wobei mindestens eine Art von Nuk-Makromolekülen terminierende Nuk-Komponenten einschließt, z. B. ddUTP. Die Target-Domäne-Oligonukleotide werden für jeweils spezifisch für die jeweilige Zielsequenz konstruiert. Nach dem Einbau eines terminierenden Nuk-Makromoleküls kommt es zum Abbruch der Amplifikation. Auf diese Weise können bestimmte Zielsequenzen von Amplifikation ausgeschlossen werden. Andere Zielsequenzen im gleichen Ansatz werden dagegen vervielfältigt und können sequenzspezifisch markiert und/oder detektiert werden.
Antagonisten der Target-Domäne (Antagonisten-Oligonukleotide)
In einer Ausführungsform der Erfindung schließen Nukleotid-Konjugate zur Target-Domäne komplementäre Oligonukleotide ein (33). Diese Oligonukleotide sind an die Target-Domäne-Oligonukleotide hybridisiert und blockieren ihre Bindung an die Nukleinsäureketten, u. a. auch an die jeweilige Zielsequenz. Diese Oligonukleotide werden als Antagonisten der Target-Domäne bezeichnet. Ihre Aufgabe ist, die Spezifität der Bindung eines Target-Domäne-Oligonukleotides an die jeweilige Zielsequenz in einem Assay zu erhöhen. Durch den Einsatz von Antagonisten-Oligonukleotiden lassen sich unspezifische Bindung der Target-Domäne an die Nukleinsäuresequenzen bei niedrigen Reaktionstemperaturen verhindern (Gidwani et al. Analyst, 2009, v. 134, 1675-, Huang et al. NAR, 2007, v. 35, e101 „Thermodynamically modulated partially double stranded DNA probe design for homogeneous real time PCR".). Dieses Verhalten kann die Spezifität der Bindung der Target-Domäne an die jeweilige Zielsequenz erhöhen.
Struktur von Antagonisten-Oligonukleotiden
In einer Ausführungsform besteht das Antagonisten-Oligonukleotid aus Nukleobasen. Die Nukleobasen wie Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil (abgekürzt als A, C, G, T, U) oder deren Analoga gekoppelt an einen Zucker-Phosphatrückgrad in Form von DNA oder RNA oder deren Analoga, z. B. PTO, PNA, LNA, können sequenzspezifisch an die Nukleinsäurestränge binden. Verschiedene Arten von Nukleinsäureketten, z. B. DNA, PTO, RNA, Proteinnukleinsäuren (PNA), Morpholino und deren Analoga können den Nukleinsäure-Anteil der Target-Domäne darstellen. Einzelne Abschnitt der Antagonisten-Oligonukleotide können dabei durchgehend aus einer Art der Bausteine bestehen, z. B. nur DNA oder nur PNA, oder auch ein gemischtes, zusammengesetztes Polymer darstellen, wo stellenweise DNA, RNA, PNA, Morpholino, LNA oder weitere Modifikationen zu einer Kette zusammengefasst sind.
Falls mehrere Antagonisten-Oligonukleotide innerhalb einer Art von Nuk-Makromolekülen vorkommen, können einzelne Domänen unterschiedliche Arten von Bausteinen vorweisen, z. B. ein Antagonisten-Oligonukleotid besteht aus DNA, ein anderes aus PNA, usw.
Zur Vereinfachung der Darstellung werden Antagonisten-Oligonukleotide in Form der DNA in Details besprochen. Andere Arten der Nukleinsäureketten können entsprechend den einem Fachmann bekannten Regeln nach dem Muster der DNA-Oligonukleotide konstruiert und eingesetzt werden.
Der Abschnitt des Oligonnukleotids, der zur Target-Domäne komplementär ist, also die eigentliche Antagonisten-Sequenz, kann am 5'-Ende oder am 3'-Ende von weiteren Sequenzabschnitten flankiert sein, die nicht an die Target-Domäne binden. Diese flankierenden Bereiche können aus gleichen Monomenren, wie das Antagonisten-Oligonukleotid, bestehen (z. B. DNA, PTO, PNA, LNA, RNA) oder sich in der Zusammensetzung von des Antagonisten-Oligonukleotids unterscheiden. Diese flankierenden Sequenzabshcnitte können in der Länge von 1 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 15, 15 bsi 20, 20 bis 30 oder länger als 30 Nukleobasen betragen. Sie können als Abstandhalter dienen oder beispielsweise an Marker-Domänen oder Anker-Domänen binden und somit als Antagonisten dieser Domäne auftreten.
Vorzugsweise sind diese Antagonisten-Oligonukleotide dermassen konstruiert, dass die Bindung der jeweiligen Target-Domäne-Oligonukleotide an diese Antagonisten-Oligonukleotide schwächer als Bindung der Target-Domäne an die Zielsequenz unter peferct Match-Hybridisierung ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung sind diese Antagonisten-Oligonukleotide kürzer als die Targert-Domäne. Die jeweilgen Unterschiede in der Länge zwischen Target-Domäne und der Antagonisten-Domäne schließen beispielsweise folgende Bereiche ein (gemessen in Nukleobasen): 1 bis 3, 3 bis 5, 5 bis 7, 7 bis 10, 10 bis 13, 13 bis 15, 15 bis 18, 18 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 40 oder auch grßer als 40. Beispielsweise beträgt die Länger der Target-Domäne-Oligonukleotide 25 Nukleobasen und die Länge der Antagonisten-Oligonukleotide 18 Nukleobasen. Der Längenunterschied beträgt somit 7 Nukleobasen. Bei Targer-Domänen mit der Gesamtlänge größer als 20 Nukleobasen, können auch mehrere Antagonisten-Oligonukleotide an eine solche Target-Domäne hybridisiert werden. Beispielweise bei einer Target-Domäne der Gesamtlänge von 40 Nukleobasen können jeweils zwei Antagonisten-Domäne je 20 Nukleobasen an diese Target-Domäne hybridisiert sein. Beim Design von Antagonisten-Oligonukleotide sind die jeweiligen Hybridisierungsbedingungen der Reaktion (z. B. Temperatur, Puffer etc.) und die Hybridisierungseigenschaften der Target-Domäne an die Zielsequenz zu berücksichtigen. Die genaue Anpassung der Länge und der Zusammensetung der Antagonisten-Oligonukleoide an die jeweilgie Target-Domäne kann ein Fachmann der folgenden Literatur-Stellen entnehmen: Gidwani et al. Analyst, 2009, v. 134, 1675-, Huang et al. NAR, 2007, v. 35, e101 „Thermodynamically modulated partially double stranded DNA probe design for homogeneous real time PCR". Die Zusammensetzung von Antagonisten-Oligonukleotiden kann verschiedene, einem Fachmann bekannte Modifikationen der Nukleobasen einschließen, z. B. DNA, RNA, PNA, LNA usw. Je nach Zusammensetzung des Antagonisten-Oligonukleotids (also z. B. DNA, RNA, PNA oder LNA) kann die Stärke der Bindung an die jeweilige Target-Domäne bei einer gegebenen Länge des Antagonisten-Oligonukleotides variieren. Einem Fachmann ist beispielsweise bekannt, dass PNA-basierte Oligonukleotide eine stärkere Affinität zu komplementären Bereichen aufweisen, als die DNA-basierte Oligonukleotide der gleichen Zusammensetzung und Länge.
Einem Fachmann sind weitere Oligonukleotid-Modifikationen bekannt, welche die Bindung komplementärer Nukleinsäureketten unetreinander beeinflussen können. Zu solchen Modifikationen gehören z. B. „Minor-Groove-Binder”. Solche Modifikationen können an die Antagonisten-Oligonukleotide gekoppelt sein.
In einer Ausführungsform ist das 3'-OH-Ende des Antagonisten-Oligonukleotids (oder des flankierenden Oligonukleotids) durch eine chemische Gruppe geblockt. Einem Fachmann sind viele Beispiele von Modifikationen von 3'-OH-Gruppe bei Oligonukleotiden bekannt. Sie schließen beispielsweise folgende Substanzen ein: eine 2'.3'-Dideoxy-Ribose, eine Phosphat-Gruppe, einen Biotin-Rest, einen Amino-Linker, einen Fluoreszenzfarbstoff, eine Peptid-Kette, einen Quencher. Anstelle von 3'-OH Gruppe können verschiedene Modifikationen in ein Oligonukleotid inkorporiert sein, z. B. eine Amino-Gruppe, eine Halogen-Atom, eine Azid-Gruppe usw. In dieser Ausführungsform kann ein solches Oligonukleotid nicht weiter durch eine Polymerase extendiert werden, es hat also keine Primer-Funktion.
Die Antagonisten-Oligonukleotide können teilweise selbst-komplementäre Abschnitte einschließen, z. B. als Haarnadelstrukturen (engl. Hairpins) oder Schleifen (Engt. Loops). In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Antagonisten-Oligonukleotid an der Bildung einer Struktur vom Typ des so genannten „Molecular Beacon” beteilgt (zu Eigenschaften von Molecular Beacons: Bonnet et al. PNAS 1999, v96. 6171-). In dieser Ausführungsform ist die eigentliche, der Target-Domäne komplementäre Antagonisten-Oligonukleotid-Sequenz von flankierenden Nukleinsäuresträngen umgeben, die untereinander komplementär sind. Durch eine solche Struktur kann die Spezifität der Bindung der Antagonisten-Oligonukleotid-Sequenz an die Target-Domäne-Oligonukleotid gesteigert werden. Die selbstkomplementären Bereiche eines solchen Molecular-Beacons sind in der Regel zwischen 4 bis 6, 6 bis 8, 8 bis 10, 10 bis 15 Nukleotiden lang und die Antagonisten-Oligonukleotid-Sequenz ist ca. 10 bis 15, 15 bis 20, 20 bsi 30, 30 bis 40 Nukleotide lang.
In einer Ausführungsform ist ein Schenkel des doppesträngigen Abschnitts der Struktur von Typ „Molekularen Beacon” an der Bindung an die Target-Domäne-Oligonukleotid beteiligt (zum Thema „Shared stem molecular beacons”, siehe Tsourkas et al. NAR 2002, v. 30 4208-).
Vorzugsweise sind Antagonisten-Oligonukleotide gegenüber Exonnuklease-Aktivitäten von Polymerasen (z. B. 5'-3'-Exonuklease oder 3'-5'-Exonuklease) resistent. Dies kann beispielsweise durch Einführung von PNA-Analoga an beiden Enden der Antagonisten-Oligonukleotide erreicht werden. Einem Fachmann sind weitere Modifikationen von Oligonukleotiden bekannt, die eine solche Resistenz gegenüber Exonukleasen verleihen.
Bindung der Antagonisten-Oligonukleotide an die Target-Domäne-Oligonukleotide von Nuk-Makromolekülen
Die Antagonisten-Oligonukleotide werden bevorzugt an die Target-Domäne der Nuk-Makromoleküle vor einer Markierungs-Reaktion hybridisiert. Eine solche Hybridisierung zwischen Target-Domäne und einem Antagonisten-Oligonukleotid kann unter einem Fachmann bekannten Reaktionsbedigungen erfolgen, die eine spezifische Bindung von Nukleinsäuerektten an einander ermöglichen (z. B. durch Erhitzung und Abkühlung von Nuk-Makromolekülen mit einer Target-Domäne und Antagonisten-Oligonukleotide in einer Puffer-Lösung). In einer weiteren Ausführungsform kann eine solche Bindung erst bei der Zusammensetzung des Assay erfolgen, d. h. Nuk-Makromoleküle mit einer Target-Domäne und Antagonisten-Oligonukleotide werden getrennt zum Assay-Ansatz zugegeben. Die Bindung der Antagonisten-Oligonukleotide an die jeweilige Target-Domäne erfolgt somit erst in einem Assay-Ansatz.
Funktion der Antagonisten
Die Bindung von Antagonisten-Oligonukleotide an die jeweilige Target-Domäne ist nicht kovalent und beispielweise unter höheren Temperaturen reversibel. Bei höheren Temperaturen erfolgt Ablösung der Antagonisten-Oligonukleotide von der Target-Sequenz-Oligonukleotiden, so dass die Target-Domäne für eine Bindung an die Zielsequenz nun freiliegt. In einem Ansatz konkurrieren die Zielsequenz und die Antagonisten-Oligonukleotide um die Bindung an die Target-Domäne. Durch die stärkere Bindung der Target-Domäne an die Zielsequenz (bedingt beispielweise durch Längen-Unterschiede zwischen Target-Domäne und Antagonisten-Oligonukleotid) binden sich Nuk-Makromoleküle bevorzugt an die Zielsequenz. Durch den Einsatz von Antagonisten-Oligonukleotiden lassen sich unspezifische Bindung der Target-Domäne an die Nukleinsäuresequenzen bei niedrigen Reaktionstemperaturen. Nach der Reaktion können Antagonisten an die Target-Domäne erneut binden und verhindern dadurch die unspezifische Bindung an weitere Nukleinsäureketten. Dadurch kann die Spezifität der Detektion erhöht werden.
1.3.3.3.2 Die Anker-Domäne eines Nuk-Makromoleküls und Kombination mit der festen Phase
Die Anker-Domäne hat die Aufgabe, eine Art von Nuk-Makromolekül oder einen Nukleinsäurestrang, was mit einem solchen Molekül markiert ist, spezifisch an eine feste Phase zu binden. Nuk-Makromoleküle oder die mit Nuk-Makromolekülen markierte Nukleinsäurestränge (z. B. Zielsequenzen oder deren Äquivalente) können mittels einer Anker-Domäne vor oder während oder nach der enzymatischen Reaktion an eine feste Phase gebunden werden. In Anmeldung Cherkasov et al WO2011050938 sind Beispiele für Anker-Domäne, deren Funktion und Anbindung innerhalb von Nukleotid-Konujugaten, Antagonisten der Anker-Domäne und verschiedene feste Phasen zur Analyse angegeben.
1.3.3.3.3 Signal-Domäne (Funktionen und Zusammensetzung)
Funktion einer Signal-Domäne
Die Signal-Domäne kann in einer Ausführungsform eine signalgebende Funktion haben. In einer anderen Ausführungsform hat sie eine signalvermittelnde Funktion. In einer weiteren Ausführungsform hat sie eine katalytische Funktion. In einer weiteren Ausführungsform hat die Signal-Domäne mehr als nur eine Funktion, sondern z. B. vereinigt sowohl signalgebende als auch eine signalvermitteldne Funktion. Weitere Kombinationen sind nahe liegend. Weitere Beispiele für Nachweismethoden sind im Kapitel 1.3.25 angegeben.
Bei der signalgebenden Funktion enthält die Signal-Domäne Bestandteile, die bereits während der chemischen Synthese an Nuk-Makromoleküle gebunden werden, s. Beispiele in Anmeldungen Cherkasov et al WO 2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 , Cherkasov et al WO 2008043426 , Cherkasov et al DE 10356837 , Cherkasov et al DE 10 2004 009 704 .
Bei der signalvermittelnden Funktion trägt die Signal-Domäne, die erst durch eine Reaktion mit signalgebenden Molekülen ihre Signaleigenschaften entfalten. Beispielsweise können mehrere Biotin-Moleküle, z. B. 100 Biotin-Moleküle, den Marker-Teil bilden. Nach dem Einbau der Nuk-Makromoleküle erfolgt eine Nachweisreaktion mit modifizierten Streptavidin-Molekülen. In einem anderen Beispiel haben die Nukleinsäureketten die signalvermittelnde Funktion. Nach dem Einbau von Nuk-Makromoleküle, erfolgt eine Hybridisierung von einheitlichen Oligonukleotiden mit detektierbaren Einheiten, z. B. Fluoreszenzfarbstoffen (MWG-Biotech) an die Marker-Komponente. In einem weiteren Beispiel haben Amino- oder Merkapto-Gruppen, beispielsweise 50 Aminogruppen pro Marker, die signalvermittelnde Funktion. Nach dem Einbau der Nuk-Makromoleküle in die Nukleinsäurekette erfolgt eine chemische Modifikation mit reaktiven Komponenten, z. B. mit Farbstoffen, wie beispielsweise für eingebaute Allyl-Amino-dUTP beschrieben, Diehl et al. Nucleic Acid Research, 2002, V. 30, Nr. 16 e79.
In einer anderen Ausführungsform hat die Signal-Domäne eine katalytische Funktion (in Form eines Enzyms oder Ribozyms). Dabei können unterschiedliche Enzyme verwendet werden, z. B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase. Dank der Kopplung an die Nuk-Komponente kann das jeweilige Enzym durch den Einbau von Nuk-Makromolekülen an den Nukleinsäurestrang kovalent gebunden werden.
Eine Signal-Domäne schließt in einer Ausführung eine niedermolekulare Marker-Einheit ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt die Signal-Domäne eine makromolekulare Marker-Einheit ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt die Signal-Domäne mehrere niedermolekulare Marker-Einheiten ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt die Signal-Domäne mehrere makromolekulare Marker-Einheiten ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt die Signal-Domäne eine Kombination aus niedermolekularen und makromolekularen Einheiten ein. Die Signal-Domäne können eine signalgebende oder signalvermittelnde Funktion haben.
Diese Einheiten können Moleküle mit geringer Molekularmasse, z. B. unter 2000 Da, oder auch selbst Makromoleküle sein. Dabei schließt die Zahl der signalgebenden oder signalvermittelnden Einheiten, die zu einer Signal-Domäne zusammengefaßt sind, folgende Bereichen ein: 1 und 2, 2 und 5, 5 und 20, 20 und 50, 50 und 100, 100 und 500, 500 und 1000. 1000 und 10000, 10000 und 100000.
Falls mehrere Marker-Einheiten zu einer Signal-Domäne zusammengefasst sind, sind diese Einheiten in einer Ausführungsform an ein Gerüst gebunden, die Kern-Komponente des Markers (23). Diese Kern-Komponente verbindet die Einheiten untereinander. Die Kern-Komponente kann die Verbindung zu einem oder mehreren Nuk-Linker-Komponenten herstellen (24). Die Kern-Komponente kann niedermolekulare oder makromolekulare Verbindungen einschließen.
1.3.3.3.3.1 Struktur der signalgebenden oder der signalvermittelnden Einheiten der Signal-Domäne
Die strukturellen Marker-Einheiten schließen folgende Gruppen ein:
1.3.3.3.3.1.1 Strukturen mit niedriger Molmasse:
Biotin-Moleküle, Hapten-Moleküle (z. B. Digoxigenin oder Dinitrophenol (DNP)), radioaktive Isotope (z. B. P³², J¹³¹), oder deren Verbindungen, seltene Erden, Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, Fluoreszenz-Quencher (z. B. Dabsyl) (viele dieser Moleküle sind kommerziell erhältlich z. B. von Molecular Probes, Inc., oder Sigma-Aldrich) mit gleichen oder unterschiedlichen spektralen Eigenschaften, Farbstoffe, die untereinander FREI eingehen. Thermochrome, photochrome oder chemolumineszente Substanzen (erhältlich z. B. bei Sigma-Aldrich), Chromogene Substanzen (z. B. als Substrate für Peptidasen beschrieben in „Proteolytic enzymes Tools and Targets", E. Sterchi, 1999, ISBN 3-540-61233-5).
Auch chemisch reaktive Gruppen, wie beispielsweise Amino-, Carboxy-, Merkapto-, Aldehyd-, Jodacetat-, Acryl-, Dithio-, Thioester-Verbindungen können als signalvermittelnde strukturelle Einheiten dienen. Nach dem Einbau können diese reaktiven Gruppen mit signalgebenden Elementen, wie beispielsweise Farbstoffe mit entsprechenden reaktiven Gruppen (beispielsweise NHS-Ester, Merkapto-, Amino-Gruppen) modifiziert werden. Allgemeine Grundlagen für die Wahl eines passenden Paares von reaktiven Gruppen sind in „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 dargestellt.
In einer speziellen Ausführungsform erfühlt die Kombination aus einer Nuk-Einheit, einer markomolekularen Linker-Komponente und einer Signal-Domäne mit niedriger Molmasse bereits die Anforderungen der vorliegenden Erfindung. Solche Verbindungen sind ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung. Sie können sowohl als Zwischenprodukte für die chemische Synthese von Nuk-Makromolekülen mit einem makromolekularen Marker, z. B. dUTP-PEG-Biotin, als auch selbständig in den enzymatischen Reaktionen verwendet werden, wie beispielsweise mit nur einem Farbstoff markierten Nukleotid.
Als Farbstoffe können verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe auftreten, ihre Wahl ist nicht eingeschränkt, solange sie die enzymatische Reaktion nicht wesentlich beeinflußen. Beispiele für Farbstoffe sind Rhodamine (Rhodamin 110, Tetramethylrhodamin, erhältlich bei Fluka-Sigma), Cyanin-Farbstoffe (Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 von Amersham Bioscience), Coumarine, Bodipy, Fluorescein, Alexa-Farbstoffe: z. B. Alexa 532, Alexa 548, Alexa 555 (Molecular Probes). Viele Farbstoffe sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande (im weiteren als Molecucular Probes bezeichnet) oder von Sigma-Aldrich-Fluka (Taufkirchen, Deutschland).
Verschiedene Substanzen (z. B. Zucker, Farbstoffe oder Hormone) können als Liganden für Proteine mit Erkennungseigenschaften (z. B. Antikörper oder deren Fragmetne, Lektine, Rezeptoren) ebenfalls als Marker dienen. Auch mehrere Haptene (Digoxigenin oder Fluorescein), Hormone oder kleine Peptide können als Marker-Einheiten innerhalb des Markers gekoppelt sein. Durch Zugabe eines markierten Proteins, z. B. eines markierten Antikörpers, können solche Strukturen detektiert werden.
„Signal-Domäne für zellulare Aufnahme” mit geringer molekularer Masse
Molekulare Strukturen mit geringer Molekularmasse (z. B. Lipide, Cholesterol, Mono- oder Di-Saccharide) können für zelluräre Aufnahame bzw. gezielten intrazellulären transport geeignet sein. Sie werden hier als „Signal-Domäne für zelluläre Aufnahme” bezeichnet. Beispiele für Modifikation von Oligonukleotiden (z. B. Antisense-Oligonukleotdie oder siRNA) bzw. Proteinen mit solchen Liganden und deren Verwendung an Zellen sind einem Fachmann bekannt (J Biol Chem. 1999 Jul 2; 274(27): 19087–94. Mannose polyethylenimine, conjugates for targeted DNA delivery into dendritic cells. Diebold SS, et al; Carbohydr Res. 2009 Nov 2; 344(16): 2137–43. Epub 2009 Aug 31. Synthesis and characterization of mannosylated oligoribonucleotides. Zhao Y, et al; Expert Opin Drug Deliv. 2008 Jun; 5(6): 703–24. Mannose-targeted systems for the delivery of therapeutics. Irache JM, et al.; Nat Biotechnol. 2007 Oct; 25(10): 1149–57. Epub 2007 Sep 16. Mechanisms and optimization of in vivo delivery of lipophilic siRNAs. Wolfrum C, et al; Bioorg Med Chem Lett. 2004 Oct 4; 14(19): 4975–7. Steroid and lipid conjugates of siRNAs to enhance cellular uptake and gene silencing in liver cells. Lorenz C, et al; J Med Chem. 2008 Aug 14; 51(15): 4374–6. Epub 2008 Jul B. Lipid-conjugated oligonucleotides via "click chemistry" efficiently inhibit hepatitis C virus translation. Godeau G, et al; AAPS J. 2009 Dec; 11(4): 639–52. Epub 2009 Sep 9. Lipidic systems for in vivo siRNA delivery. Wu SY, et al; FASEB J. 2002 Sep; 16(11): 1426–8. Epub 2002 Jul 1. Gene delivery by a steroid-peptide nucleic acid conjugate. Rebuffat AG, et al; Mol Cell Biochem. 2005 Aug; 276(1–2): 61–9. Cholesterol conjugated oligonucleotide and LNA: a comparison of cellular and nuclear uptake by Hep2 cells enhanced by streptolysin-O. Holasová S, et al; Proc Natl Acad Sci USA. 1989 Sep; 86(17): 6553–6. Cholesteryl-conjugated oligonucleotides: synthesis, properties, and activity as inhibitors of replication of human immunodeficiency virus in cell culture. Letsinger RL, et al; J Pharmacol Exp Ther. 2002 Aug; 302(2): 619–26. bis-Cholesteryl-conjugated phosphorothioate oligodeoxynucleotides are highly selectively taken up by the liver. Bijsterbosch MK, et al.; Biochem Pharmacol. 2001 Sep 1; 62(5): 627–33. Delivery of cholesteryl-conjugated phosphorothioate oligodeoxynucleotides to Kupffer cells by lactosylated low-density lipoprotein. Bijsterbosch MK, et al; Bioconjug Chem. 2009 Sep; 20(9): 1729–36. Phospholipid conjugate for intracellular delivery of peptide nucleic acids. Shen G, et al)
In einer Ausführungsform schließt die Signal-Domäne mehrere Marker-Einheiten ein. Dabei können die Marker-Einheiten untereinander gleiche oder verschiedene Eigenschaften haben. Beispielsweise können Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Spektraleigenschaften eingesetzt werden. In einer Ausführungsform werden Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt, die FREI-Paare bilden.
1.3.3.3.3.1.2 Strukturen mit hoher Masse (Makromoleküle)
Nanokristalle
Nanokristalle, z. B. Quantum Dots können als Marker-Einheiten der Signal-Domäne auftreten. Dabei können in einer Marker-Komponente Quantum Dots mit gleichen oder unterschiedlichen spektralen Eigenschaften verwendet werden, US Pat. 6.322.901 , US Pat. 6.423.551 , US Pat. 6.251.303 , US Pat. 5.990.479 ).
Nano oder Mikro-Teilchen.
Nano oder Mikro-Teilchen können als Marker-Einheiten der Signal-Domäne auftreten, wobei die größten Ausmaße dieser Teilchen von 1 nm bis 2 nm, von 2 nm bis 5 nm, von 5 nm bis 10 nm, von 10 nm bis 20 nm, von 20 nm bis 50 nm, von 50 nm bis 100 nm, von 100 nm bis 200 nm, von 200 nm bis 500 nm, von 500 nm bis 1000 nm, von 1000 nm bis 5000 nm betragen. Das Material der Teilchen können beispielsweise reine Metalle wie Gold, Silber, Aluminium (beispielsweise Teilchen mit surface plasmon resonance ), – Protein-Au-Konjugate: J. Anal. Chem. 1998, V. 70, S. 5177, – Nukleinsäure-Au-Konjugaten: J. Am. Chem. Soc. 2001, V. 123, S.5164, J. Am. Chem. Soc. 2000, V. 122, S. 9071, Biochem. Biophys. Res. Commun 2000, V. 274, S. 817, Anal. Chem. 2001, V. 73, S. 4450), – Latex (z. B. Latex-Nanopartikel, Anal. Chem. 2000, V. 72, S. 1979) – Kunststoff (Polystyrene), – paramagnetische Verbindungen/Gemische Zhi ZL et al. Anal Biochem. 2003 Jul 15; 318(2): 236–43, Dressman D et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Jul 22; 100(15): 8817–22, – Metall-Teilchen, – magnetische Verbindungen/Gemische Jain KK. Expert Rev Mol Diagn. 2003 Mar; 3(2): 153–61, Patolsky F et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2003 May 30; 42(21): 2372–2376, Zhao X et al. Anal Chem. 2003 Jul 15; 75(14): 3144–51, Xu H et al. J Biomed Mater Res. 2003 Sep 15; 66A(4): 870–9, JOSEPHSON Lee et al. US Pat. 2003092029 , KLICHE KAY-OLIVER et al. WO0119405 .
Peptide und Proteinmoleküle,
Peptide und Proteinmoleküle können als Marker-Einheiten der Signal-Domäne auftreten, wobei sie folgende Gruppen schließen: Enzyme (z. B. Peroxidase, alkalische Phosphotase, Urease, beta-Galaktosidase, Proteinasen), – fluoreszierenden Proteine (z. B. aus GFP-Protein-Familie oder Phycobiliproteine (z. B. Phycoerythrin, Phycocyanin), erhältlich z. B. von Molecular Probes Inc.), Antigen-bindende Proteine (z. B. Antikörper, Tetramere, Affibodies (Nord et. Al Nature Biotechnology, V. 15 (S. 772–777) oder deren Bestandteile (z. B. Fab-Fragmente), Nukleinsäurebindende Proteine (z. B. Transcriptionsfaktor). Peptide oder Proteine können auch als Ziel-Antigene für Antikörper verwendet werden. Nukleotid-Konjugate mit solchen Antigenen können durch entsprechende Antikörper spezifisch erkannt werden. Diese Eigenschaft kann beispielsweise während der Detektion verwendet werden. Die Kopplung von Proteinen an Oligonukleotide (z. B. Kopplung eines Proteins an ein Oligonukleotid) ist einem Fachmann bekannt: Chem Soc Rev. 2010 Jun; 39(6): 2054–70. Epub 2010 Apr 14. Recent developments in oligonucleotide conjugation. Singh Y, et al; Bioconjug Chem. 2010 Feb 17; 21(2): 187–202. Chemical strategies for the synthesis of peptide-oligonucleotide conjugates. Lu K, et al; Bioconjug Chem. 1992 Jan-Feb; 3(1): 74–9. Selective modification of cytosines in oligodeoxyribonucleotides. Miller PS, et al; Nucleic Acids Res. 1990 Sep 25; 18(18): 5419–23. Site specific functionalization of oligonucleotides for attaching two different reporter groups. Agrawal S, et al; Bioconjug Chem. 1990 Jan–Feb; 1(1): 71–6. Use of maleimide-thiol coupling chemistry for efficient syntheses of oligonucleotideenzyme conjugate hybridization probes. Ghosh SS, et al; Bioconjug Chem. 2000 Sep–Oct; 11(5): 605–18. Preparation and applications of peptide-oligonucleotide conjugates. Tung CH, et al; Chembiochem. 2010 Jul 26; 11(11): 1493–500. Delivery of oligonucleotides and analogues: the oligonucleotide conjugate-based approach. Marlin F, et al; Methods Mol Biol. 2011; 683: 219–30. Characterization of cellular internalization pathways for CPP-mediated oligonucleotide delivery. Guterstam P, et al; Methods Mol Biol. 2011; 683: 453–63. Multifunctional CPP polymer system for tumor-targeted pDNA and siRNA delivery. Dohmen C, et al; Bioconjug Chem. 1999 Jul–Aug; 10(4): 598–606. Peptide-oligonucleotide phosphorothioate conjugates with membrane translocation and nuclear localization properties. Antopolsky M, et al; Bioconjug Chem. 1998 Mar–Apr; 9(2): 168–75. Hybridization characteristics of biomolecular adaptors, covalent DNA--streptavidin conjugates. Niemeyer CM, et al; Bioconjug Chem. 2008 Dec; 19(12): 2304–7. Design of DNA-conjugated polypeptide-based capture probes for the anchoring of proteins to DNA matrices. Schweller RM, et al; Bioconjug Chem. 2010 Sep 15; 21(9): 1642–55. Versatile phosphoramidation reactions for nucleic acid conjugations with peptides, proteins, chromophores, and biotin derivatives. Wang TP, et al; Bioconjug Chem. 2010 May 19; 21(5): 921–7. Conjugation of fluorescent proteins with DNA oligonucleotides. Lapiene V, et al. „Signal-Domäne für zelluläre Aufnahme” mit hoher molekularer Masse Weiterhin können Peptide (z. B. Nukleus Localizing Signals, oder Cell Penetrating Peptides) oder Proteine (z. B. Antikörper, Transferrin) eine verbesserte zelluläre Aufnahme vermitteln, bzw. für einen gezielten intrazellulären Transport unterstützen. Viele Beispiele einer verbesserten zellulären Aufnahme über Membran-Protein bzw. Rezeptor-Abhängige Mechanismen sind einem Fachmann bekannt. Verschiedene Zellmembranrezeptoren können nach Bindung eines passenden Liganden diese in die Zellen einschleusen/aufnehmen. z. B. Fc-Rezeptor und Antikörper-modifizierten SUbstanzen, Folat-Rezeptor und mit Folat modifizierte Substanzen, Lectine (z. B. Mannose-Rezeptor, DC-SIGN-Reczeptor und entsprechende Zucker-Moleküle tragende Substanzen). Zur Kopplung von Oligonukleotiden und Proteinen (z. B. Antikörpern) bietet Firma Solulink (www.solulink.com) eine Reihe von Chemikalien. Nachfolgend sind einige Literaturbeispiele angegeben, die exemplarisch den aktuellen Stand der Technik in diesen Bereichen schildern. Literatur für Kopplung von Oligonukleotiden und Antikörpern und Beispiele für die Anwendungen: Bioconjug Chem. 2010 Dec 15; 21(12): 2190-6. Epub 2010 Nov 24. An approach to multiplexing an immunosorbent assay with antibody-oligonucleotide conjugates. Han KC, et al; Biopolymers. 2004 Apr 5; 73(5): 621–30. Efficient strategies for the conjugation of oligonucleotides to antibodies enabling highly sensitive Protein detection. Kozlov IA, et al; AAPS J. 2009 Mar; 11(1): 195–203. Epub 2009 Mar 19. Targeted delivery systems for oligonucleotide therapeutics. Yu B, et al.; Literatur für Kopplung von Oligonukleotiden und Peptide (cell penetrating peptides) und Beispiele für die Anwendungen: Br J Pharmacol. 2009 May; 157(2): 195–206. Epub 2009 Mar 20. Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Heitz F, et al; Methods Mol Biol. 2011; 764: 75–89. Cell-penetrating peptides-based strategies for the delivery of splice redirecting antisense oligonucleotides. El Andaloussi S, et al.; 3 Mol Biol. 2002 Apr 26; 318(2): 237–43. A biological transporter for the delivery of peptide nucleic acids (PNAs) to the nuclear compartment of living cells. Braun K, et al.; Adv Drug Deliv Rev. 2003 Feb 10; 55(2): 267–80. Cellular delivery of peptide nucleic acid (PNA). Koppelhus U, et al; Biochemistry. 2006 Dec 19; 45(50): 14944–54. Structural requirements for cellular uptake and antisense activity of peptide nucleic acids conjugated with various peptides. Wolf Y, et al; Expert Opin Biol Ther. 2009 Aug; 9(8): 975–89. Prospects for antisense peptide nucleic acid (PNA) therapies for HIV. Pandey VN, et al; Methods Mol Biol. 2005; 298: 131–41. Cellular delivery of peptide nucleic acid by cell-penetrating peptides. Kilk K, et al; Blood Cells Mol Dis. 2007 Jan–Feb; 38(1): 1–7. Epub 2006 Nov 17. RNA targeting with peptide conjugates of oligonucleotides, siRNA and PNA. Turner 33, et al.; Nucleic Acids Res. 2005 Nov 30; 33(21): 6837–49. Print 2005. Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells. Turner 33, et al; Methods Mol Biol. 2009; 480: 85–99. Peptide-based delivery of steric-block PNA oligonucleotides. Abes S, et al; Adv Drug Deliv Rev. 2008 Mar 1; 60(4–5): 517–29. Epub 2007 Oct 22. Cell penetrating peptide conjugates of steric block oligonucleotides. Lebleu B, et al
Eine Kopplung zwischen einem Peptid oder Protein und einer Target-Domäne innerhalb eines Nukleotid-Konjugats kann zusätzliche Eigenschaften dem gesamten Konstrukt des sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugats verleihen.
Beispiele für eine gezielte Applikation (z. B. auf eine spezifielle Zell-art gerichtete Applikation) von nukleinsäure-basierten Therapeutika sind einem Fachmann bekannt. Nachfolgend sind einige Beispiele für eine so genannte „Targeted Delivery” dargestellt. Mol Pharm. 2007 Jan–Feb; 4(1): 58–72. Epub 2007 Jan 17. Receptor-mediated delivery of antigens to dendritic cells: anticancer applications. Proudfoot O, et al; Mol Pharm. 2006 Sep–Oct; 3(5): 579–88. Targeted delivery of antisense oligodeoxynucleotide and small interference RNA into lung cancer cells. Li SD, et al; Trends Pharmacol Sci. 2012 Apr; 33(4): 186–92. Epub 2012 Mar 15. Peptides for cell-selective drug delivery. Svensen N, et al; Nucleic Acids Res. 2008 May; 36(8): 2764–76. Epub 2008 Mar 26. Intracellular delivery of an anionic antisense oligonucleotide via receptor-mediated endocytosis. Alam MR, et al; Bioconjug Chem. 2008 Nov 19; 19(11): 2182–8. Cellular delivery and biological activity of antisense oligonucleotides conjugated to a targeted protein carrier. Kang H, et al; Bioconjug Chem. 2011 Aug 17; 22(8): 1673–81. Epub 2011 Jul 20. Multivalent cyclic RGD conjugates for targeted delivery of small interfering RNA. Alam MR, et al; Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2002 Apr; 12(2): 51–63. Cell-dependent differential cellular uptake of PNA, peptides, and PNA-Peptide conjugates. Koppelhus U, et al. Einige Monographien beschreiben Kopplungen zwischen Nukleinsäuren und Peptiden, sowie deren Verwendung an Zellen, bzw. Geweben bzw. Organismen: „Handbook of Cell-Penetrating Peptides", Seiten 309-ff, Ülo Langel, Taylor&Francis Group, 2007, ISBN-13: 978-0-8493-5090-0; Methods in Molecular Biology v. 208, Peptide Nucleic Acids, ed. P. E. Nielsen 2002.
Ähnlich wie in oben genannten Bespielen können auch sequenzspezifische Nukleotid-Konjugate, die entsprechende Oligonukleaotide und Peptide einschließen, in den Zellen ihre Wirkung entfalten. Für eine bessere Aufnahme in die Zellen schließen Nukleotid-Konjugate in einer vorteilhaften Ausführungsform der Anmeldung eine „Signal-Domäne für zelluläre Aufnahme” ein. Wie oben beschrieben, kann eine solche Domäne durch verschiedene Strukturen repräsentiert werden.
Nukleinsäureketten,
Die Nukleinsäureketten einschließlich der Gruppe, Oligonukleotide, modifizierte Oligonukleotide, können als Marker-Einheiten der Signal-Domäne auftreten. Die Länge der Nukleinsäureketten liegt vorzugsweise in folgenden Bereichen von 10 bis 20, von 20 bis 50, von 50 bis 100, von 100 bis 200, von 200 bis 500, von 500 bis 1000, 1000 bis 5.000, von 5.000 bis 10.000, von 10.000 bis 100.000 Nukleotiden. Es können markierte oder unmarkierte DNA, PTO, RNA, LNA, Morpholino PNA-Moleküle verwendet werden. Nukleinsäureketten können zusäzliche Modifikationen tragen, wie beispielsweise freie Aminogruppen, Farbstoffe und andere signalgebende Moleküle, z. B. makromolekulare Stoffe, Enzyme oder Nanokristalle (25). Modifizierte Nukleinsäureketten sind kommerziell zugänglich, z. B. MWG-Biotech oder TrilLink-Biotechnologies. Weitere Beispiele für Makromoleküle oder Makromolekülkomplexe, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Marker oder Marker-Einheiten in der Marker-Komponente für die Signalverstärkung eingesetzt werden können, sind in US Pat. 4882269 , US Pat. 4687732 , WO 8903849 , US Pat. 6017707 , US Pat. 6627469 beschrieben. Vorzugsweise ist das 3'-Ende der Signal-Domäne blockiert, so dass die Target-Domäne nicht als Primer für eine Polymerase dienen kann.
Vorzugsweise schließt die Signal-Domäne keine komplementären Sequenzen zur Zielsequenz oder zu Target-Domäne oder zu Anker-Domäne oder zu den verwendeten Primern.
1.3.3.3.4 Die Kern-Komponente des Markers. Beispiele für die Kern-Komponente und Kopplungen von einzelnen Marker-Einheiten an die Kern-Komponenten sind in Anmeldungen
In Anmeldung Cherkasov et al WO2011050938 , Cherkasov et al WO2005044836 , Cherkasov et al WO2006097320 beschrieben.
1.3.3.3.5 Kopplung der Marker-Einheiten oder Domänen
Marker-Einheiten oder Domänen können an die Kern-Komponente oder an die Linker-Komponente durch eine kovalente Bindung, beispielsweise über einen Cross-linker (Chemistry of protein conjugation and cross-linking, S. Wang, 1993, ISBN 0-8493-5886-8, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2), oder über eine affine Kopplung erfolgen, beispielsweise Biotin-Streptavidin-Verbindung oder Hybridisierung von Nukleinsäuresträngen oder Antigen-Antikörper-Wechselwirkung (”Bioconjugation: Protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2).
Die Kopplung von Marker-Einheiten an die Kern-Komponente erfolgt in einer Ausführungsform bereits während der Synthese der Nuk-Makromoleküle.
In einer anderen Ausführungsform erfolgt zunächst die chemische Synthese von Nuk-Makromoleküle, bei denen die Markerkomponente nur aus der Kern-Komponente besteht. Die Kopplung von Marker-Einheiten an die Kern-Komponente erfolgt erst nach dem Einbau von Nuk-Makromoleküle in die Nukleinsäurekette. Durch eine große Zahl der potenziellen Bindungsstellen am Kernteil ist die Wahrscheinlichkeit der Bindung der Marker-Einheiten an die Kern-Komponente und somit an die eingebaute Nuk-Komponente wesentlich größer im Vergleich zu konventionellen Nukleotid-Strukturen. Die Kopplungschemie im einzelnen hängt von der Struktur der Marker-Einheiten und der Struktur der Kern-Komponente ab.
Kovalente Kopplung: Die Verbindung zwischen den Marker-Einheiten und der Kern-Komponente kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein, z. B. bei Temperaturen bis zu 100°C, für pH-Bereiche zwischen 3 und 12, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z. B. Esterasen) sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar. Beispiele für die Kopplung von Nukleinsäuren an Dendrimere (entspricht einer Kopplung von Marker-Einheiten an eine Kernkomponente) sind z. B. in Shchepinov et al. Nucleic Acids Res. 1999 Aug 1; 27(15): 3035–41, Goh et al. Chem Commun (Camb). 2002 Dec 21; (24): 2954 dargestellt.
1.3.3.3.6 Kopplung zwischen Linker und Marker
Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker hängt von der jeweiligen Struktur der Marker-Einheiten bzw. der Struktur der Kern-Komponente ab. In einer Ausführungsform ist die Linker-Komponente direkt an die signalgebende oder signalvermittelnde Marker-Einheit gebunden. Dabei kann der Marker aus nur einer oder mehreren Marker-Einheiten bestehen. In einer weiteren Ausführungsform sind ein oder mehrere Linker-Komponenten an die Kern-Komponente des Markers gebunden. Die Bindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker kann sowohl kovalent als auch affine erfolgen. Viele Beispiele sind dem Fachmann bekannt, s. z. B. "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2. „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc.).
Kovalente Kopplung: Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein, z. B. bei Temperaturen bis zu 130°C, für pH-Bereiche zwischen 1 und 14, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z. B. Proteasen, Esterasen) sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar.
Die für die Markierung von Nukeotiden erfindugnsgemäß eingesetzten Makromolekulare Verbidungen schließen in einigen Ausführungsformen wasserlösliche Polymere ein (s. o.). Die Linker der Nukmakromoleküle schließen ebenfalls wasserlösliche Polymere ein (s. o.). Es ist für den Fachmann erkennbar, dass die Zuordung einzelner Polymere zum Linker oder zum Marker einen beschreibenden Charakter hat.
1.3.3.3.7 Das Verhältnis der Nuk-Komponenten in einem Nuk-Makromolekül
Ein Nuk-Makromolekül kann durchschnittlich 1 bis 2, 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 30, 30 bis 100, 100 bis 1000, mehr als 1000 Nuk-Komponenten einschließen.
In einer Ausführungsform haben alle Nuk-Makromoleküle eine gleiche Anzahl an Nuk-Komponenten pro ein Nuk-Makromolekül. Beispielsweise können pro ein Strepavidin-Molekül maximal 4 Biotin-Moleküle gebunden werden, bei sättigender Konzentration von Nuk-Linker-Komponenten, eine einheitliche Population an Nuk-Makromolekülen entsteht.
In einer anderen Ausführungsform haben die Nuk-Makromoleküle einer Population eine definierte durchschnittliche Anzahl von Nuk-Komponenten pro Nuk-Makromolekül, in der Population selbst findet allerdings eine Verteilung der tatsächlichen Besetzung der Nuk-Makromoleküle mit Nuk-Komponenten statt. Die Verteilungsangaben von Nuk-Komponenten pro Nuk-Makromolekül stellen in diesem Fall einen Mittelwert dar.
1.3.3.3.8 Das Verhältnis von Marker-Einheiten in einem Nuk-Makromolekül
Die Zahl der Marker-Einheiten in einem Nuk-Makromolekül schließt folgende Bereiche ein: 1 und 2, 2 und 5, 5 und 20, 20 und 50, 50 und 100, 100 und 500, 500 und 1000. 1000 und 10000, 10000 und 100000, mehr als 100000. In einer Ausführungsform der Erfindung haben Nuk-Makromoleküle eine feste Anzahl von signalgebenden Einheiten pro Marker. In einer anderen Ausführungsform kann die Verteilung von Marker-Einheiten in einer Nuk-Makromolekül-Population schwanken und muß nicht notwendigerweise einen konstanten Wert für jedes einzelne Nuk-Makromolekül darstellen.
In einer Ausführungsform haben alle Nuk-Makromoleküle eine gleiche Anzahl der Marker-Einheiten pro ein Nuk-Makromolekül. Beispielsweise können pro ein Strepavidin-Molekül maximal 4 Biotin-Moleküle gebunden werden, Avidin-Biotin-Technology, Methods in Enzymology v. 184, 1990.
In einer anderen Ausführungsform haben die Nuk-Makromoleküle einer Population eine definierte durchschnittliche Zahl der Marker-Einheiten pro Nuk-Makromolekül. In der Population selbst findet allerdings eine Verteilung der tatsächlichen Besetzung der Nuk-Makromoleküle mit Marker-Einheiten statt. Bei sättigenden Konzentrationen bei der Synthese von Marker-Komponenten findet eine zunehmend einheitlichere Besetzung der Nuk-Makromoleküle mit Marker-Einheiten statt.
So spielt beispielsweise in Bereichen, wo es um den qualitativen Nachweis geht, die exakte Zahl der Marker-Einheiten pro Nuk-Makromolekül eine untergeordnete Rolle. In solchen Fällen ist das Vorhandensein eines stabilen Signals an sich von Bedeutung.
Es sollte einem Fachmann naheliegend erscheinen, dass die angeführten Marker-Komponenten eine beträchtlich größere Molekül-Größe und -Masse haben, als die jeweilige Nuk-Komponente selbst. Weiterhin sollten andere Beispiele für makromolekulare Marker-Komponenten einem Fachmann naheliegend erscheinen.
1.3.3.4 Substrateigenschaften der Nuk-Makromoleküle
1.3.3.4.1 Substrat-Eigenschaften der Nuk-Komponente
Einbau der ersten Nuk-Komponente eines sequenzspezifsichen Nukleotid-Konujugats.
Die Nuk-Komponente integriert in ein Nuk-Makromolekül kann als Substrat für unterschiedliche Enzyme dienen. Beispielsweise dient die Nuk-Komponente, in dieser Ausführungsform als Nukleosid-Triphosphat, als Substrat für Polymerasen, so dass die Nuk-Komponente in einen wachsenden Strang durch eine Polymerase eingebaut werden kann und somit das gesamte Nuk-Makromolekül an den Strang kovalent gekoppelt werden kann.
Zum einen, bestimmen die Substrateigenschaften der Nuk-Komponente(n) die Substrateigenschaften der Nuk-Makromoleküle. Beispielsweise kann die Nuk-Komponente ein 2'-deoxynucleosid-triphosphat sein und ist somit potenzielles Substrat für DNA Polymerasen oder ein ribonucleosid-triphosphat und ist somit ein potenzielels Substrat für RNA Polymerasen. Weiterhin, kann die Nuk-Komponente beispielweise als ein Terminator dienen, so dass nur ein einziges Nuk-Makromolekül eingebaut werden kann. Beispiele für terminierende Nuk-Komponenten stellen Nukleotide mit veränderten Zucker-Komponenten, beschrieben in Abschnitt 1.3.3.1.3 Variationen am Zucker. Nach Einbau solcher Nukleotide wird weitere Verlängerung des gleichen Stranges nicht möglich.
In einer anderen Ausführungsform dient die Nuk-Komponente als ein reversibler Terminator, der die Durchführung einer schrittweise kontrollierten Verlängerungsreaktion erlaubt, wie z. B. in Ju et al. US Pat. 6664079 , Tcherkassov WO 02088382 dargestellt ist.
Durch Kopplung des Markers an die Base der Nuk-Komponente kann der Marker ebenfalls kovalent an den neu synthetisierten Strang gebunden werden. Dadurch können seine Eigenschaften die Eigenschaften der neu synthetisierten Nukleinsäure beeinflussen, beispielsweise Verlängerungsfährigkeit, Spaltbarkeit, affine Eigenschaften etc.
Durch Kopplung des Markers an die Gamma-Phosphat-Gruppe des Nuk-Komponente kann dieser Marker während des Einbau der Nukleotid-Konjugate durch eine Polymerase von dem Rest der eingebauten Nuk-Komponente abgespalten werden. Dadurch kann nur die Nuk-Komponente in den neu synthetisierten Strang eingebaut werden.
Zum anderen, der Marker (z. B. Target-Domäne gebunden an die Zielsequenz) kann einen großen Einfluss auf die Eigenschaften von Nuk-Komponenten ausüben: durch die Bindung der Target-Domäne an die Zielsequenz kann sich die lolake Konzentration der Nuk-Komponente stark erhöhen. Diese Erhöhung in der lokalen Konzentration kann einen Einfluss auf Akzeptanz der Nuk-Kompontente des an die Zielsequenz gebundenen Nuk-Makromoleküls durch die Polymerase haben. Beispielsweise kann die Diskiminierungsfähigkeit der Polymerase bezüglich der Nukleobase der Nuk-Komponente oder weiterer Modifikationen verändert sein. Ebenfalls kann die Wettbewerbssituation zwischen frei in der Lösung befindlichen natürlichen Nukleotiden (z. B. dNTPs) und der Nuk-Kompontente der an die Zielsequenz gebundenen Nuk-Makromolekülen zugunsten des Einbaus der Nuk-Komponente verschoben sein. Diese Verändungen in der lokalen Konzentration der Nuk-Komponente – starke Erhöhung in der Nähe der gebundenen Target-Domäne – machen es möglich, eine viel größere Bandbreite an Nukleotid-Analoga als Nuk-Komponente zu verwenden, beispielsweise auch solche, die unter gewöhnlichen Reaktionsbedingungen eine nur sehr geringe Einbau-Effizienz haben.
Ebenfalls bietet die Target-Domäne die Möglichkeit, einer Selektion eine Ereignisses (z. B. Markierung) zugunsten von Zielsequenzen an. Dies ist insbesondere in Anwesenheit einer starken Kontamination mit fremdartigen Nukleinsäureketten, z. B. störende DNA, von Vorteil: Reaktion kann viel spezifischer Ablaufen, als mit bekannten, konventionell markierten Nukleotiden. Kopplung von antiviralen Nukleotid-Analoga als Nuk-komponente innerhalb des Nuk-Makromoleküls ermöglicht eine selektive Unterdrückung von viralen Polymerasen.
Die Substrat-Eigenschaften von Nuk-Makromolekülen können durch Anwesenheit von natürlichen Nukleotiden stark beeinflußt werden. Falls keine Bindung der Target-Domäne an die Zielsequenz erfolgt, kann die Präsenz von konkurrierenden Nukleotiden in der Reaktion den Einbau von Nuk-Makromolekülen in den wachsenden Strang verhindern oder stark reduzieren. Umgekehrt, falls die Target-Domäne an die Zielsequenz gebunden hat, können Nuk-Komponenten der Nuk-Makromoleküle in den wachsenden Strang auch in Anwesenheit von hoch konzentrierten konkurrierenden Nukleotiden eingebaut werden.
Folgen des Einbaus einer Nuk-Komponente für die nachfolgende Einbaureaktion am gleichen Strang
Einbau einer oder mehrerer Nuk-Komponenten von einem sequenzspezifischen Nukleotide-Konjugaten kann für den nächsten bzw. weitere Schritte der Primer-Verlängerung unterschiedliche Konsequenzen haben. Es können folgende Zustände erreicht werden:

• irreversibler Stop/irreversibler Verlust der Fähigkeit zur weiteren Synthese (Terminierung)
• reversibler Stop/reversibler Verlust der Fähigkeit zur weiteren Synthese (reversible Terminierung)
• Fortsetzung der Primer-Verlängerung mit normaler bzw. leicht reduzierter Geschwindigkeit (keine oder leichte Unterdrückung der Fähigkeit zur weiteren Synthese).
• Fortsetzung der Primer-Verlängerung mit einer stark reduzierten Geschwindigkeit (Unterdrückung der Fähigkeit zur weiteren Synthese).
• Zeitliche Terminierung der Reaktion durch Kombination einer zeitlichen Begrenzung der Primerverlängerung mit Reaktion mit stark reduzierter Geschwindigkeit der Reaktion. Das Ergebnis der Reaktion sind vorzeitig abgebrochene Nukleinsäureketten (50)

Im Einzelnen können diese Ergebnisse durch verschiedene Kombinationen der Nukleotid-Konjugate und/oder Polymerase-Wahl und/oder Reaktionsbedingungen erreicht werden. Einige Beispiele sind nachfolgend angegeben:

• Termination bzw. irreversibler Stop der Primer-Verlängerung
– Verwendung von 3'-Deoxi-Nukleotid-Triphosphaten als Nuk-Komponenten (Modifizierte 3'-OH-Position der Nuk-Komponente)
– Einbau von mehreren Nuk-Komponenten eines Nukleotid-Konjugats hintereinander, beispielsweise zwischen 5 und 10
– Verwendung von Nukleotid-Konjugaten mit einem sterisch anspruchsvollen Marker als sterisches Hindernis für Polymerase, z. B. einem Oligonukleotid mit einem doppelsträngigen Abschnitt, einem Peptid oder Protein
– Verwendung von relativ langen Target-Domänen und Polymerasen ohne Strangverdrängungesaktivität.
– Verwendung von geringen Konzentrationen von natürlichen dNTP, z. B. in Bereichen von unter 50 μmol/l
• Reversible Termination bzw. reversibler Stop der Primer-Verlängerung
– Abspaltung des Linkers zwischen der Nuk-Komponenten und dem Marker
• Fortsetzung der Primer-Verlängerung mit normaler bzw. leicht reduzierter Geschwindigkeit (keine oder leichte Unterdrückung der Fähigkeit zur weiteren Synthese).
– Verwendung von optimalen Bedingungen für eine Einbaureaktion
– Verwendung von Polymerasen mit hoher Strang-Verdrängungs-Aktivität
– Verwendung von hohen Konzentrationen von Polymerasen
– Einbau von nicht mehr als zwei Nuk-Komponenten direkt hintereinander
– Verwendung von relativ hohen Konzentrationen von natürlichen dNTPs, z. B. über 50 μmol/l
– Verwendung von relativ kurzen Target-Domänen
• Fortsetzung der Primer-Verlängerung mit einer stark reduzierten Geschwindigkeit (Unterdrückung der Fähigkeit zur weiteren Synthese).
• Keine oder geringer Strangverdrängungesaktivität von verwendeten Polymerasen
– Verwendung von nicht optimalen Bedingungen für eine Einbaureaktion
– Einbau von 3 bis 5 Nuk-Komponenten hintereinander

Ein Fachmann sollte in der Lage sein, optimale Ergebnisse der Einbaurekation durch Änderung einzelner Parameter zu erreichen.
1.3.4. Niedermolekularer Marker eines konventionell markiertes Nukleotides – eine zum Stand der Technik gehörende Markierung von Nukleotiden beispielsweise mit einem oder zwei Biotin-Molekülen, einem oder zwei Farbstoff-Molekülen, einem oder zwei Hapten-Moleküln (z. B. Digoxigenin).
1.3.5. Konventionell modifiziertes Nukleotid – ein Nukleotid mit einem kurzen Linker (durchschnittliche Länge zwischen 5 und 30 Atomen) und einem niedermolekularem Marker. Üblicherweise trägt ein konventionell modifiziertes Nukleotid einen niedermolekularen Marker, z. B. ein Farbstoff- oder ein Biotinmolekül oder ein Hapten-Molekül (z. B. DNP, oder Digoxigenin). Diese Modifikationen können als Signal-Domäne oder Anker-Domäne verwendet werden. Mittels Biotin können beispielsweise Nukleinsäureketten an die feste Phase gebunden werden (Funktion einer Anker-Domäne), oder ein mit einem Enzym oder mit einem Farbstoff markiertes Streptavidin kann an das Biotin gekoppelt werden (Funktion einer Signal-Domäne).
1.3.6. Enzyme
1.3.6.1 Polymerasen
In einer Ausführungsform können die Nuk-Makromoleküle als Substrate für Enzyme eingesetzt werden. Polymerasen stellen in Anwendungen oft eingesetzte Enzyme, die Nukleotide als Substrate verwerden. Sie werden im weiteren beispielhaft und stellvertretend für andere Nukleotid-umsetzende Enzyme betrachtet. Eine der zentralen Fähigkeit der Polymerasen besteht in kovalenten Kopplung von Nukleotid-Monomeren zu einem Polymer. Dabei kann die Synthese sowohl matrizen-abhängig (wie z. B. DNA- oder RNA-Synthese mit DNA- oder RNA-abhängigen Polymerasen) als auch matrizen-unabhängig, z. B. durch Terminale Transferasen ("J Sambrook "Molecular Cloning" 3. Ed. CSHL Press 2001).
Falls RNA als Substrat (z. B. mRNA) in die Sequenzierungsreaktion eingesetzt wird, können handelsübliche RNA-abhängige DNA-Polymerasen eingesetzt werden, z. B. AMV-Reverse Transcriptase (Sigma), M-MLV Reverse Transcriptase (Sigma), HIV-Reverse Transcriptase ohne RNAse-Aktivität. Auch für Klenow Fragment DNA Polymerase ist die Tätigkeit als Reverse Transcriptase beschrieben. Für bestimmte Anwendungen, können Reverse Transcriptasen von RNAse-Aktivität weitgehend frei sein ("Molecular cloning" 1989, Ed. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory), z. B. bei mRNA-Makrierung für Hybridisierungsexperimente.
Falls DNA als Substrat (z. B. PCR-Fragmente) verwendet wird, eignen sich als Polymerasen prinzipiell alle DNA-abhängigen DNA-Polymerasen mit oder ohne 3'-5' Exonuklease-Aktivität (DNA-Replication" 1992 Ed. A. Kornberg, Freeman and company NY), z. B. modifizierte T7-Polymerase z. B. vom Typ ”Sequenase Version 2” (Amersham Pharmacia Biotech), Klenow Fragment der DNA-Polymerase I mit oder ohne 3'-5' Exonukleaseaktivität (New England Biolabs), T4 DNA Polymerase, phi29 DNA Polymerase, Polymerase Beta verschiedenen Ursprungs (Animal Cell DNA Polymerases" 1983, Fry M., CRC Press Inc., kommerziell erhältlich. bei Chimerx) thermostabile Polymerasen wie beispielsweise Taq-Polymerase (New England Biolabs), Vent Polymerase, Vent exo minus Polymerase, Deep Vent Polymerase, Deep Vent exo minus Polymerase, Pfu Polymerase, Tli Polymerase, Tfl Polymerase, Tth Polymerase, Thermosequenase, Pwo-Polymerase, Terminator, Terminator I, Terminator II, Terminator III, Bst DNA Polymerase, Bst DNA Polymerase, Large Fragment, Phusion^® High-Fidelity DNA Polymerase, Phusion^® High-Fidelity Hot Start DNA Polymerase, Phire^® Hot Start DNA Polymerase, Phire^® Hot Start II DNA Polymerase, Phusion^® Flash High-Fidelity DNA Polymerase, Crimson Taq DNA Polymerase, DyNAzyme^TM EXT DNA Polymerase, DyNAzyme^TM II Hot Start DNA Polymerase, 9°N_m DNA Polymerase usw. (von z. B. New England Biolabs oder von Promega oder von Roche oder von Qiagen).
Durch moderne gentechnische Methoden ist es möglich, Polymerasen zu konstruieren, die sich in ihren Fähigkeiten von in der Natur vorkommenden Enzymen unterscheiden, z. B. durch Fehlen bestimmter Aktititäten oder durch verbesserte enzymatische Parameter, wie z. B. Präzision, Prozessivität usw. Eine zunehmende Anzahl von Firmen stellt solche thermolabile und thermostabile Polymerase her, die als optimierte Enzyme für PCR oder andere Amplifikationsverfahren bzw. Markierungsverfahren vermarktet werden. Die Grundfunktionen der Polymerasen bleiben allerdings beibehalten: sie sind in der Lage, Nukleotide einzubauen und dadurch komplementäre Stränge synthetisieren. Solche Polymerasen können ebenfalls für die beschriebenen Methoden eingesetzt werden. Eine entsprechende Optimierung der Reaktionsbedingungen ist einem Fachmann bekannt.
In einer Ausführungsform der Anmeldung werden Polymerasen ohne eine Strang-Verdrängungs-Aktivität (keine Strand-Displacement) bevorzugt. Solche Polymerasen können vorzugsweise für terminierende Reaktionen verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Anmeldung werden Polymerasen mit einer Strang-Verdrängungs-Aktivität (Strand-Displacement) bevorzugt, z. B. Klenow exo minus, Vent-Polymerase exo minus, Bst-Polymerase großes Fragment, Phi 29 Polymerase. Solche Polymerasen können in Verfahren eingesetzt werden, die eine nicht terminierende Reaktion unterstützen.
In einer Ausführungsform der Anmeldung werden Polymerasen ohne eine 5'-3'-exonuklease-Aktivität bevorzugt, z. B. Vent exo minus, Bst-Polymerase großes Fragment. Diese Polymasen degradieren keine Oligonukleotide, die an die Zielsequnzen gebunden sind. Nuk-Makromoleküle mit Target-Domäne-Oligonukleotiden bestehend aus DNA können mit solchen Polymerasen eingesetzt werden.
In einer Ausführungsform der Anmeldung werden Polymerasen ohne eine 3'-5'-exonuklease-Aktivität bevorzugt, z. B. Taq-Polymerase oder Klenow-Fragment exo minus. Solche Polymerasen können bereits eingebaute Nukleotiden nicht mehr entfernen und werden beispielsweise mit terminierenden Nukleotdien (z. B. ddUTP als Nuk-Komponente) bevorzugt eingesetzt.
In einer Ausführungsform der Anmeldung werden Polymerasen mit einer 5'-3-exonuklease-Aktivität bevorzugt, z. B. Taq-Polymerase, Bst-Polymerase. Eine solche Aktivität kann beispielsweise für den Nachweis von Zielsequenzen durch Abbau von markierten Sonden (Taqman-Sonden) zum Nachweis genützt werden.
Bei der Verwendung von Polymerasen mit 5'-3'-Exonuklease-Aktivität werden in einer Ausführungsform der Erfindung Nukleotide-Konjugate eingesetzt, die durch diese Exonuklease-Aktivität in ihrer Funktion nicht beeinträchtigt werden. In einer Ausführugsform kann dies beispielsweise durch Bindung des Linkers, der die Nuk-Komponente und das Target-Domäne-Oligonukleotid verbindet, an einer internen Position des Oligonukleotids oder am 3'-Position des Oligonukleotids erreicht werden. Dadurch wird die Nuk-Komponente an einen Teil des Oligonukleotids gekoppelt, der nicht durch die Exonuklease-Aktivität der Polymerase abgebaut wird. Die chemische Zusammensetzung des Target-Domäne-Oligonukleotides kann Nukleotid-Analoga oder verschiedene Arten der chemischen Bindung zwischen einzelnen Monomeren im Oligonukleotid einschließen, die gegenüber Exonuklease-Aktivität unempfindlich sind, z. B. Phosphorothioat-Nukleinsäuren (PTO), Peptid-Nukleinsäuren (PNA), oder Locked Nucleic Acids (LNA) oder Phosphorothioat-Rückgrad. Weitere Beispiele von Oligonukleotiden mit Fähigkeiten, einem Exonuklease-Abbau zu widerstehen, sind einem Fachmann bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform werden Polymerasen mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität eingesetzt. Dies kann beispielweise zur Steigerung der Synthese-Genauigkeit beitragen. In einer solchen Ausführungsform werden bevorzugt Nuk-Komponenten verwendet, die nach ihrem Einbau in den wachsenden komplementären Strang durch die Polymerase der 3'-5'-Exonuklease-Aktivität der Polymerase widerstehen können. Dies kann beispielsweise durch den Einsatz von Alpha-Phosphorothioat-Nukleotid-Analoga erreicht werden.
Auch DNA-abhängige RNA-Polymerasen können verwendet werden, z. B. E. coli RNA-Polymerase, T7-RNA-Polymerase, SP6 RNA Polymerase.
RNA-abhängige RNA-Polymerasen (RNA-Replikase) kann zur Vermehrung und Markierung von RNA verwendet werden, phio RNA Polymerase (z. B. Q-beta replicase, Polio-Replicase, 3Dpol, oder Replicase von hepatitis C virus, NS5b).
In der Anmeldung werden DNA-abhängige DNA-Polymerasen als Beispiele für Polymerasen betrachtet.
Weiterführende Literatur mit Beispielen einer Wahl einer richtigen Polymerase, Reaktionsbedingungen usw.. ist im Abschnitt „Amplifikationsmethoden” angegeben.
1.3.7. Spaltbare Verbindung
Eine unter milden Bedingungen spaltbare Verbindung. Diese Verbindung kann einen Abschnitt im Linker darstellen und kann an einer oder an mehreren Stellen spaltbar sein. Es kann sich um eine chemisch spaltbare Verbindung, wie z. B. eine Disulfid-, eine Ester-, eine Acetal-, oxidativ spaltbare Verbindungen (z. B. Linker, die eine Tartrat-Verbindung einschließen) oder eine Thioesterverbindung (Short WO 9949082 , Tcherkassov WO 02088382 ) handeln. Es kann auch eine photochemisch spaltbare Verbindung, wie in (Rothschild WO 9531429 ) dargestellt sein. Es kann auch eine enzymatisch spaltbare Verbindung (beispielsweise eine Peptid- oder Polypeptide-Bindung, Odedra WO 0192284 ), spaltbar durch Peptidasen, eine Poly- oder Oligosaccharid-Bindung, spaltbar durch Disaccharidasen) sein, wobei die Spaltung durch ein spezifisches Enzym zwischen bestimmten Monomeren der spaltbaren Stellen stattfinden kann. Mehrere Beispiele für spaltbare Verbindungen sind bekannt. Die Kopplung einer solchen Verbindung ist beispielsweise beschrieben in (Tcherkassov 02088382, Metzker et al. Nucleic Acid Research 1994, V. 22, S. 4259, Canard et al. Gene, 1994, V. 148, 1, Kwiatkowski US Pat. 6255475 , Kwiatkowski WO 01/25247 , Parce WO 0050642 , Milton et al. WO. 2004018493 , Milton et al. 2004018497 ). Eine Spaltbare Verbindung kann ein Teil des Linkers sein oder die Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid bilden, oder die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und der Makrer-Komponente, oder die Verbindung zwischen den Marker-Einheiten und der Kern-Komponente.

1.3.8 DNA – Deoxyribonukleinsäure verschiedenen Ursprungs und unterschiedlicher Länge (z. B. Oligonukleotide, Polynukleotide, Plasmide, genomische DNA, cDNA, ssDNA, dsDNA)
1.3.9 PTO – Nukleinsäurekette mit Phosphorothioat-Rückgrad
1.3.10 PNA – Peptide Nucleic Acid
1.3.11 LNA – locked nucleic acids

1.3.12 Nukleotide:
Nukleotide dienen als Substrate für Polymerasen in einer matrizenabhängigen Synthese-Reaktion. Sie können in einen komplementären Strang eingebaut werden.

• dNTP – 2'-deoxi-Nucleosid-Triphosphate oder deren Analoga, Substrate für DNA-Polymerasen und Reverse-Transkriptasen, z. B. dATP, dGTP, dUTP, dTTP, dCTP, dITP oder deren Analoga wie 7-Deaza-dATP oder 7-Deaza-dGTP. Auch weitere Analoga von natürlichen 2'-deoxi-Nucleosid-Triphosphaten können von DNA-Polymerasen als Substrate verwendet werden.
• NTP – Ribonukleosid-Triphosphate oder deren Analoga, Substrate für RNA-Polymerasen, UTP, CTP, ATP, GTP.
• Abkürzung ”NT” wird auch bei der Längenangabe einer Nukleinsäuresequenz verwendet, z. B. 1.000 NT. In diesem Fall steht ”NT” für Nukleosid-Monophosphate.

Konzentration von Nukleotiden in einem Assay
Nuk-Makromoleküle können in Abwesenheit von nicht markierten Nukleotiden (z. B. dNTP) derselben Basen-Art sowohl sequenzspezifisch als auch sequenzunspezifisch von einer Polymerase eingebaut werden. Die Zielsequenz-Spezifität wird durch Hybridisierung der Target-Domäne-Oligonukleotids eines Nuk-Makromoleküls an die Zielsequenz unerwartet start begünstigt. Die Anwesenheit der dNTP derselben Basen-Art wie die Basen-Art der Nuk-Komponente führt dazu, dass natürliche Nukleotide und Nuk-Komponente des Nuk-Makromoleküls um den Einbau konkurriert. Bei steigender Konzentration von dNTP wird zunächst der zielsequenz-unspezifische Einbau von Nuk-Makromolekülen durch dNTP kompetitiv unterdrückt. Dies kann beispielseise durch Konzentrationen von 1 bis 100 μmol/l von natürlichen Nukleotiden erreicht werden. Bei noch höherer Konzentration von natürlichen Nukleotiden in einer Reakton wird auch der sequenzspezifische Einbau von an die Zielsequenz gebundenen Nuk-Makromolekülen zunehmend unterdrückt, dies kann beispielsweise durch Konzentrationen von 1 mmol/l bis 100 mmol/l erreicht werden.
Die Konzentration von Substraten für Polymerasen (z. B. dNTP) in einem Assay wird dermassen gewählt, dass der sequenzunspezifische Einbau von Nuk-Makromolekülen mit einer Target-Domäne komplett unterdrückt wird und sequenzspezifischer Einbau nicht wesentlich beeinflüsst wird.
1.3.13 NSK – Nukleinsäurekette. DNA oder RNA, PNA, LNA

1.3.14 Gesamtsequenz – Summe aller Sequenzen zu analysierenden Nukleinsäureketten im Ansatz, sie kann ursprünglich aus einer oder mehreren NSKs bestehen. Dabei kann die Gesamtsequenz Teile oder Äquivalente einer anderen Sequenz oder von Sequenz-Populationen darstellen (z. B. mRNA, cDNA, Plasmid-DNA mit Insert, BAC, YAC) und aus einer oder unterschiedlichen Spezies stammen. Gesamtsequenz kann eine oder mehrere Zielsequenzen einschließen.
1.3.15 NSKF – Nukleinsäurekettenfragment (DNA oder RNA), das einem Teil der Gesamtsequenz entspricht, NSKFs – Nukleinsäurekettenfragmente. Die Summe der NSKFs bildet ein Äquivalent zur Gesamtsequenz. Die NSKFs können beispielsweise Fragmente von DNA- oder RNA-Gesamtsequenz sein, die nach einem Fragmentierungsschritt entstehen.
1.3.16 Primerbindungstelle (PBS) – Teil der Zielsequenz, an den ein Primer binden kann
1.3.17 Referenzsequenz – eine bereits bekannte Sequenz, zu der die Abweichungen in der zu untersuchenden Sequenz bzw. in den zu untersuchenden Sequenzen (z. B. Gesamtsequenz) ermittelt werden. Als Referenzsequenzen können in Datenbanken zugängliche Sequenzen verwendet werden, wie z. B. aus der NCBI-Datenbank.
1.3.18 Tm – Schmelztemperatur
1.3.19 Sterisches Hindernis, sterisch anspruchsvolle Gruppe oder Ligand Sterisch anspruchsvolle Gruppe oder Ligand, die durch ihre chemische Struktur die Eigenschaften der mit dieser Gruppe gekoppelten Nukleotide so verändert, dass diese durch eine Polymerase in einer Extensionsreaktion nicht nacheinander eingebaut werden können. Eine oder mehrere an die Base gekoppelte sterisch anspruchsvolle Gruppen können zur Aufhenung der Synthese oder zu Behinderung der weiteren Synthese führen.

Viele in der modernen Forschung eingesetzten Marker stellen ein sterisches Hindernis für die Enzyme dar. Biotin, Digoxigenin und Fluoreszenzfarbstoffe wie Fluoreszein, Tetramethylrhodamine, Cy3-Farbstoff stellen Beispiele einer solchen sterisch anspruchsvollen Gruppe dar (Zhu et al. Cytometry 1997, v. 28, S. 206, Zhu et al. NAR 1994, v. 22, S. 3418, Gebeyehu et al., NAR 1987, v. 15, S. 4513, Wiemann et al. Analytical Biochemistry 1996, v. 234, S. 166, Heer et al. BioTechniques 1994 v. 16 S. 54). Weitere sterisch anspruchsvollen Gruppen können beispielsweise lineare oder verzweigte Polymere mit einer kompakten drei-dimensionalen Struktur, wie z. B. Proteine, Nukleinsäueketten, Nanoteilchen oder Dendrimere darstellen. Andere Beispiele für sterisches Hindernis und seine Applikationen siehe Cherkasov et al WO 2008043426 .
1.3.20 Feste Phase zur Analyse
Es wird feste Phase zur Bindung von markierten Zielsequenzen bereitgestellt. Es wird zwischen einer direkten und einer indirekten, d. h. vermittelten Bindung von Zielsequenen an die feste Phase unterschieden. Beispiele für feste Phase sind in Anmeldung Cherkasov et al WO2011050938 angegeben.
1.3.21 Zielsequenzen oder „Targetsequenzen”
Zielsequenez (Targetsequenz) ist eine Sequenz einer Nukleinsäurekette, die vervielfältigt oder detektiert oder analysiert werden soll. In der modernen Biotechnologie und Medizin sind viele Beispiele für die Analyse von ausgewählten Sequenzen bekannt. In einer Ausführungsform, besteht die Analyse im Nachweis der Präsenz einer bestimmten oder mehrer Zielsequenzen. In einer anderen Ausführungsform besteht die Analyse in der Detektion der Basenabfolge in der Zielsequenz, wobei diese Abfolge vom Interesse ist. In einer anderen Ausführungsform besteht die Analyse in der Bestimmung der Menge der Zielsequenz,
Die Zielsequenz von Organismen kann als DNA oder RNA vorliegen. In der modernen Forschung und Industrie werden auch modifizierte Nukleinsäureketten eingesetzt, so dass eine Zielsequenz auch eine künstliche Sequenz mit oder ohne Modifikationen sein kann.
In einem analytischen Ansatz können auch mehrere Zielsequenzen vorkommen. Beispiele für komplexe Gemische von Zielsequenzen stellen mRNA oder cDNA Gemische, oder Zielsequenzen, die in einer Multiplex-PCR generiert wurden, oder Gemische von Fragmenten einer genomischen DNA. Virale Nukleinsäureketten, die ein Gemisch von Virusvarianten, z. B. HIV-Sequenzen, können ebenfalls ein Gemisch an Zielsequenzen darstellen. Isolate vom Patienten bieten oft ein Gemisch an Nukleinsäureketten, in denen mehrere Zielsequenzen vorkommen können, z. B. virale und bakterielle Zielsequenzen.
Oft wird für einen Nachweis oder eine Analyse einer Zielsequenz oder mehrerer Zielsequenzen eine Vervielfältigung dieser Sequenzen durchgeführt (z. B. mittels einer Polymerase-Chain-Reaction, PCR, Ligase-Chain-Reaction, LCR, oder isothermische Amplifikation wie HDA oder LAMP). Dadurch werden Äquivalente einer Zielsequenz generiert, z. B. als PCR-Fragmente, oder LCR-Fragmente. Diese Vervielfältigungsmethoden sind dermassen konstruiert, dass die Äquivalente dieselbe Information einschließen, wie auch die ursprünglichen Zielsequenzen. Dies erlaubt in späteren Analyseschritten die Rückschlüsse auf die Zielsequenzen zu ziehen. Aus diesem Grund werden die vervielfältigten Nukleinsäureketten, abgeleitet von einer Zielsequenz, als auch Zielsequenzen oder Zielsequenzäquivalente bezeichnet.
Wegen einer großen Länge kann eine Zielsequenz in mehreren Abschnitten vervielfältig werden. In einer Ausführungsform kann die Summe von einzelnen Abschnitten kann auch als Zielsequenz bezeichnet werden. In einer weiteren Ausführungsform können einzelne Abschnitte als unabhängige Zielsequenzen betrachtet werden.
Ähnliche Situation kennt ein Fachmann auch mit der Umschreibung einer Zielsequenz aus einem Format, z. B. DNA, in ein anderes Format, z. B. RNA (Transcription) oder umgekehrt, wie im Beispiel von Generierung von cDNA aus mRNA mittels Reversen Transcriptase. Solche Sequenzen, die als Folge einer Umschreibung entstanden sind, werden auch als Zielsequenzen oder deren Äquivalente bezeichnet.
Zusammenfassend kann man als Zielsequenzen oder deren Äquivalente alle Sequenzen bezeichnen, die von der Ausgangszielsequenz abgeleitet worden sind oder ursprüngliche Information der Ausgangszielsequenz beibehalten haben und daher Rückschlüsse auf diese Ausgangszielsequenz erlauben.
Die Zielsequenzen (Target-Sequenzen) können aus verschiedenen Spezies abstammen, bzw. unterschiedliche genetische Bereiche erfassen. Viele Organismen wurden in den letzten Jahren intensiv untersucht. Die daraus abgeleiteten Zielsequenzen können beispielsweise PCR Produkte darstellen oder mRNA-Gemische oder small-RNA oder Plasmide usw. Viele Amplifikationstechniken und Isolierungsmethoden sind etabliert worden, um spezifische. genetische Bereiche anzureichern. Die Länge der Targetsequenzen kann varieren. So können beispielswiese ganze Genome eine Zielsequenz darstellen (z. B. HIV-Genom), oder mehrere mRNA in einem Transcriptionsprofil. Andererseits können auch einzelne Basenvariationen an einer Stelle im Genom vom Interesse sein (SNP-Analyse). In einem solchen Fall wird oft ein Abschnitt der Sequenz um die interessierte Stelle (SNP) ausgewählt und amplifiziert. Dieser Abschnitt kann dann als Zielsequenz bezeichnet werden.
Oft besteht ein Bedarf in der Analyse mehrerer Zielsequenzen, z. B. bei der Suche nach einem Krankheiterreger. In einem solchen Fall sucht man nach Vorkommen einzelner Zielsequenzen in einem Material.
Die Wahl der Zielsequenz hängt von der Aufgabenstellung ab. Wie oben erwähnt, können Sequenzen unterschiedlichen Ursprungs als Targetzequenzen dienen. Nachfolgend sind einige Beispiele für Organismen angegeben, von denen die Zielsequenzen ausgewählt werden können.
Ursprung der Zielsequenz kann jeder beliebige Organismus sein, z. B. Viren, Prokarionten, Archea, Eukarionen. Bei Eukarionen können Einzeller, Mehrzeller, wie Tiere, Pflanzen, Fische usw. als Ursprung für eine Zielsequenz dienen. In einer vorteilhaften Ausführungsform der Anmeldung sind Zielsequenzen aus folgenden Organismen ausgewählt: Mensch, darunter beispielsweise Sequenzen von proteinkodierenden und/oder regulatorischen Bereichen des Genoms, beispielsweise für Rezeptoren, Onkogenen, MHC, Blutgruppen. Weiterhin als Ursprung für Zielsequenzen sind Nutztiere, Forschungstiere und Haustiere wichtig, z. B. Ring, Schwein, Pferd, Hund, Katze, Maus, Ratte, Kaninchen, Affen. Fische können als Ursprung der Zielsequenzen dienen. Sequenzen von Bäumen und Pflanzen wie in der natürlichen Form als auch gentechnisch modifizierte können als Zielsequenzen vom Interesse sein, z. B. Reis, Mais, Weizen, Raabs. Pilze und Bakterien, die von humanmedizinischer, veterinärer, landwirtschaftlicher, industrielle oder militärischer Bedeutung sind, können den Ursprung der Zielsequenzen darstellen. Beispiele für Bakterien stellen Staphylokokkus aureus, Streptokokkus pyogenes, Streptokokkus pneumoniae, Pseudomonaden, Salmonellen, Shigellen, Yersinien, Campylobacter, Helicobacer, Legionellen, Mykobakterien, Chlamydien, Gonokokken, Yersinien, Francisella tularensis, B. antracis, Aspergillus fumigatus. Beispiele für Viren stellen Humanpathogen: HIV, HSV, HPV, CMV, HBV, HCV, Influenza, SARS, FSME. Beispiele für Parasiten stellen Erreger der Malaria (Plasmodien), Leishmanien, Toxoplasmen. Die Zielsequenzen können aus einem genomischen Abschnitt abstammen oder von Plasmiden oder von mobilen genetischen Elementen. In einer Ausführungsform werden Sequenzen aus Genen ausgewählt, die für Antibiotikaresistenz verantwortlich sind. Beispiele dafür stellen Organismen wie MRSA, VRE oder Träger von ESBL-Resistenzen, Chinolon-Resistenzen, In einer weiteren Ausführungsform werden Gene als Zielsequenzen ausgewählt, die für Pathogenitästfaktoren, wie Toxin-Kodierung zuständig sind, oder Invasine oder Adhesine, z. B. Diphterotoxin, Shiga-Toxin, TSST.
In einer weiteren Ausführungsform werden Sequenzen aus Organismen als Zielsequenzen ausgewählt, die in der Nahrungsmittelindustrie eine Rolle spielen, z. B. Bierhefen oder bei Milchprodukten, wie Joghurt-Kulturen oder Käsekulturen.
In vielen Ansätzen werden Kontrollsequenzen mitgeführt. Dies dient der Qualitätssicherung der Reaktion. Solche Kontrollsequenzen können auch als Zielsequenzen bezeichnet werden.
Für Beispiele für Anwendungen, Aufbau von diagnostischen Assay, wo die erfindungsgemäßen Nukleotide und Methoden von Vorteil sein können, wird ein Fachmann an folgende Literatur verwiesen:
"PCR Protocols for emerging infectious Diseases", 1996, ISBN 1-55581-108-6
"Molecular Diagnostic PCR Handbook" Gerrit J. Viljoen, 2005 ISBN 1-4020-3403-2
"PCR Detection of microbial Pathogens" Konrad Sachse, 2003, ISBN 1-58829-049-2
"Clinical Applications of PCR" Y. M. Dennis 10, 2006, ISBN 1-58829-348-3
"Microarrays in Clinical Diagnostics" Thomas O. Joos, 2005, ISBN 1-58829-394-7
"Molecular Diagnostics" William B. Coleman, 2006, ISBN 1-58829-356-4
"Single nucleotide polymorphisms, methods and protocols" Pui-Yan Kwok, 2003, ISBN 0-89603-968-4
"Molecular Microbiology, diagnostic principles and practice" Fred C. Tenover, 2004, ISBN 1-55581-221-X
"Rapid detection of infectious Agents", Steven Specter, 1998, ISBN 0-306-45848-9
"Nucleic acid amplification technologies, applications to disease diagnosis" H. Lee, 1997, ISBN 1-881299-04-X
"PCR Primers, a laboratory manual" Carl W. Dieffenbach, 2003, ISBN 0-87969-653-2
"Real-Time PCR, current technology and applications" Julie Logan, 2009, ISBN 978-1-904455-39-4
"Rapid cycle Real-Time PCR, methods and applications" S. Meuer, 2001, ISBN 3-540-66736-9
"PCR Primer Design" Anton Yuryev, 2004, ISBN 978-1-58829-725-9
"PCR Troubleshooting, the essential guide" Michael L. Altshuler, 2006, ISBN 1-904455-07-7
"PCR in Bioanalysis" Stephen J. Meltzer, 1998, ISBN 0-89603-497-6
„PCR Protocols" John M. S. Bartlett, ISBN 0-89603-642-1
"PCR Technology current innovations" Thomas Weissensteiner, 2004, ISBN 0-8493-1184-5
1.3.21.1 Positiv zu selektierende Zielsequenzen vs. negativ zu selektierende Zielsequenzen
Zielsequenzen können in einem Gemisch von Nukleinsäureketten vorliegen, die Varianten einer Zielsequenz einschließen oder Sequenzen mit einer großen Ähnlichkeit zu Zielsequenzen einschließen. Die Zielsequenzen liegen im biologischen Material oft in einer deutlich geringeren Kopienzahl als Sequenzen, die eine große Ähnlichkeit mit diesen Zielsequenzen aufweisen.
Beispiele solcher Nukleinsäueketten-Gemische schließen ein: Nukleinsäuereketten mit mutierten Abschnitten aus einem Tumor und nicht mutierte, so genannte wild-typ Nukleinsäureketten des normalen, umgebenden Gewebes; mutierte Genomabshcnitte eines Virus (z. B. HIV-Virus) und vorherschende Sequenz-Variantene eines Virus-Genoms, zierkulierende fetale DNA im mütterlichen Kreislauf, Nukleinsäiureketten eines bakteriellen oder viralen oder fungalen Erregers sind oft durch Nukleinsäuereketten der Normalflora kontaminiert.
In vielen Situationen kennt ein Fachmann die Zusammensetzung der störenden Sequenzen. Beispiele für bekannte Sequenzen sind Wild-Typ-Sequenz eines Organismus von welchem ein Tumor abstammt, dessen Nukleinsäureketten analysiert werden müssen. Ebenfalls ist oft auch ein Abschnitt der Zielsequenz bekannt, in dem eine Sequenzvariante vermutet wird, die nachgewiesen werden soll, z. B. Sequenz eines Rezeptors in einem Tumorgewebe. Ein anderes Beispiele stellen vorherschende Sequenzvariante des HIV-Viruses dar. Ein noch weiteres Beispiel stellen Sequenzen der mütterlichen DNA im mütterlichen Kreislauf, wobei die fetalen Zellen das Zielobjekt darstellen. Keime der Normalflora können ebenfalls störende, aber bekannte Sequenzzusammensetzung darstellen. Solche bekannte Sequenzen können die Sensitivität der Analyse erheblich stören.
Es besteht somit Bedarf nicht nur in einer gezielten, positiven Selektion von Zielsequenzen (z. B. Amplifikation, Markierung, Nachweis, Sequenzanalyse), sondern auch in einer gezielten, negativen Selektion (z. B. Unterdrückung einer Amplifikation oder einer Markierung oder eines Nachweises) von bestimmten Nukleinsäureketten mit bekannter Zusammensetzung.
Definitionsgemäß können in einem Assay, bei dem Nukleinsäureketten ein solches Gemisch bilden, zwei Gruppen von Zielsequenzen definiert werden: eine Gruppe schließt eine oder mehrere Sequenzen ein, die positiv selektiert werden müssen, und eine andere Gruppe schließt eine oder mehrere Sequenzen ein, die negativ selektiert werden sollen.
Die einem Fachmann bekannten Methoden zur spezifischen Selektion von Zielsequenzen reichen oft nicht aus, um aus einem solchen Gemisch die Zielsequenz selektiv anzureichen. Besonders dann, wenn es nicht gelingt, durch die sequenzspezifischen Primer die Zielsequenz zu isolieren, besteht ein großer Bedarf in Mitteln zu Unterdrückung einer Amplifikation oder einer Markierung oder eines Nachweises dieser begleitenden, zielsequenzähnlichen Nukleinsäureketten.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden terminierende sequenzspezifische Nuk-Makromoleküle zu Unterdrückung einer Amplifikation von negativ zu selektierenden Zielmolekülen eingesetzt.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden terminierende Nuk-Makromoleküle zu Unterdrückung einer Markierung von negativ zu selektierenden Zielmolekülen eingesetzt.
1.3.22 Primer
Als Primer wird oft ein Oligonukleotid verwendet, der an die komplementäre Position in der Zielsequenz binden kann und von einer Polymerase erkannt werden kann. An das 3'-Ende eines solchen Primers werden Nukleotide angeknüpft. Einem Fachmann sind viele Beispiele für Primer bekannt. Sie werden für Amplifikationsreaktionen von Nukleinsäureketten und für Markierungsreaktenen eingesetzt. Sie können sequenzspezifisch an die Nukleinsäureketten binden. Durch Einführung einheitlicher Primer-Bindungsstellen und Verwendung entsprechender einheitlicher Primer können viele verschiedene Nukleinsäureketten in einem Ansatz amplifiziert oder markiert werden. Hexamer-Primer stellen Beispiel für unspezifische Markierung dar. Weitere Beispiele sind einem Fachmann bekannt (siehe Literatur zu PCR und Microarrays). Die Primer können mehr oder weniger spezifisch an die Zielsequenzen binden. In einer Ausführungsform ist ein Primer vollständig komplementär zur Zielsequenz und bindet nur an eine solche Zielsequenz. In einer anderen Ausführungsform schließt Primer Sequenzen ein, die an mehrere Zielsequenzen binden können.
Ein einer Ausführungsform ist der Primer gegenüber eine oder mehreren Arten von Nukleasen resistent. Ein solche Primer kann verschiedene Modifikationen einschliepen, z. B. PTO, PNA, 2'-O-Me, oder LNA-Monomeren oder weiterer Modifikationen. Einem Fachmann sind solche Modifikationen bekannt. In einer Ausführungsform schließt Primer mindestens eine solche Modifikation an einem der beiden Ende (z. B. am 5'- oder am 3'-Ende) ein. In einer Ausführungsform schließt Primer mindestens eine solche Modifikation in internen Bereichen der Sequenz der Target-Domäne, In einer Ausführungsform schließt Primer solche Modifikation an einem der beiden Ende und in internen Bereichen seiner Sequenz, wobei sich Modifikationen mit natürliche Nukleotid-Monomeren abwechseln können, z. B. PTO-DNA-Misch-Polymer. In einer Ausführungsform schließt Primer solche Modifikation in seiner gesamten Länge ein. In einer Ausführungsform schließt Primer mehr als eine Art der Modifikation in seiner gesamten Länge ein, es entsteht ein Misch-Polymer, z. B. aus PNA und PTO.
In dieser Anmeldung können Primer für die Markierungsreaktion und für die Amplifikation verwendet werden. Je nach Anwendung können Primer nur für eine Aufgabe (z. B. entweder Markierung oder Amplifikation) oder für beide eingesetzt werden. Einem Fachmann sollte es naheliegend erscheinen, in welchen Situationen welche Primer eingesetzt werden sollten.
Ein Primer kann durch Kopplung weiterer Strukturen modifiziert werden. Diese Strukturen können beispielsweise für die Signalgebung bzw. für die Bindung an die feste Phase eingesetzt werden. Ein solcher modifizierter Primer schließt beispielsweise mindestens eine Signal-Domäne oder mindestens eine Anker-Domäne. Die Strukturen der Anker-Domänen bzw. der Signal-Domänen eines modifizierten Primers können nach selben Prinzipien zusammengesetzt werden, wie für Domänen eines Nuk-Makromoleküls beschrieben (siehe Abschnitt zu Anker-Domäne und Signal-Domäne).
In einer Ausführungsform kann beispielsweise eine Anker-Domäne, gestalltet als eine Nukleinsäurekette (z. B. als DNA, PNA, LNA), an das 5'-Ende vom Primer gekoppelt werden. In einer anderen Ausführungsform kann beispielseise ein Biotin-Molekül oder ein Farbstoff-Molekül (als Signal- oder Anker-Domäne) an den Primer gekoppelt werden.
Durch Verwendung von modifizierten Primern lassen sich die Nukleinsäuketten beispielsweise an die feste Phase binden. Mit einer Signal-Domäne markierte Primer können für die Detektion verwendet werden. Einige Beispiele werden unten angegeben.
Für Beispiele für Primer-Design wird ein Fachmann an folgende Literaur-Quellen verwiesen:
"Nucleic acid amplification technologies, applications to disease diagnosis" H. Lee, 1997, ISBN 1-881299-04-X
"PCR Primers, a laboratory manual" Carl W. Dieffenbach, 2003, ISBN 0-87969-653-2
"Real-Time PCR, current technology and applications" Julie Logan, 2009, ISBN 978-1-904455-39-4
"Rapid cycle Real-Time PCR, methods and applications" S. Meuer, 2001, ISBN 3-540-66736-9
"PCR Primer Design" Anton Yuryev, 2004, ISBN 978-1-58829-725-9
"PCR Troubleshooting, the essential guide" Michael L. Altshuler, 2006, ISBN 1-904455-07-7
"PCR in Bioanalysis" Stephen J. Meltzer, 1998, ISBN 0-89603-497-6
„PCR Protocols" John M. S. Bartlett, ISBN 0-89603-642-1
"PCR Technology current innovations" Thomas Weissensteiner, 2004, ISBN 0-8493-1184-5
"PCR Protocols for emerging infectious Diseases", 1996, ISBN 1-55581-108-6
"Molecular Diagnostic PCR Handbook" Gerrit J. Viljoen, 2005 ISBN 1-4020-3403-2
"PCR Detection of microbial Pathogens" Konrad Sachse, 2003, ISBN 1-58829-049-2
"Clinical Applications of PCR" Y. M. Dennis Lo, 2006, ISBN 1-58829-348-3
"Microarrays in Clinical Diagnostics" Thomas O. Joos, 2005, ISBN 1-58829-394-7
"Molecular Diagnostics" William B. Coleman, 2006, ISBN 1-58829-356-4
"Single nucleotide polymorphisms, methods and protocols" Pui-Yan Kwok, 2003, ISBN 0-89603-968-4
"Molecular Microbiology, diagnostic principles and practice" Fred C. Tenover, 2004, ISBN 1-55581-221-X
"Rapid detection of infectious Agents", Steven Specter, 1998, ISBN 0-306-45848-9
Beispiele für modifizierten Oligonukleotide, die als Primer verwendet werden oder an Primer angekoppelt werden sind in folgenden Quellen zu finden:
"Oligonucleotide synthesis, methods and applications" Piet Herdewijn, 2004, ISBN 1-58829-233-9
"Protocols for oligonucleotide conjugates, synthesis and analytical techniques" Sudhir Agrawal, 1993, ISBN 0-89603-252-3
"Protocols for oligonucleotide conjugates, synthesis and properties" Sudhir Agrawal, 1993, ISBN 0-89603-247-7
"The aptamer handbook" Sven Klussmann, 2006, ISBN 10: 3-527-31059-2
"Pharmaceutical aspects of oligonucleotides" Patrick Couvreur, 2000, ISBN 0-748-40841-X
"Triple Helix forming Oligonucleotides" Claude Malvy, 1999, ISBN 0-7923-8418-0
"Artificial DNA, methods and applications" Yury E. Khudyakov, ISBN 0-8493-1426-7
1.3.23 Amplifikationsmethoden für Nukleinsäureketten
In der modernen Analytik der Nukleinsäuren sind viele Verfahren bekannt, wie man Nukleinsäureketten vervielfältigen kann. Beispiele stellen isothermale Amplifikation oder PCR und ihre verschiedene Modifikationen wie Notstart-PCR, Multiplex PCR usw. Zielsequenzen können als solche oder in Form von Zielsequenzequivalenten (s. o.) oder in Form von Amplifikaten (Äquivalente der Zielsequenzen) in einem analytischen Ansatz bereitgestellt werden. In dieser Anmeldung werden einige Methoden genannt. Sie dienen lediglich zur Veranschaulichung der Erfindung und nicht zu einer Einschränkung.
Beispiele für Amplifikationstechniken von Zielsequenzen oder deren Äquivalenten sind einem Fachmann bekannt. Mehrere wissenschaftliche Artikel beschreiben Amplifikation von Zielsequenzen mittels einer PCR oder einer isothermischen Amplifikation (wie beispielsweise SDA (Strand-Displacement-Amplifikation), HDA (Helicase-Dependend-Amplification) oder LAMP (Loop Mediated isothermal amplication). Bedingungen einer solchen Amplifikation für eine bestimmte Zielsequenz können in Datenbanken gefunden werden. Beispielweise in der NCBI-Datenbank, PubMed. Dabei sind sowohl die Primer-Sequenzen, als auch Amplifikationsbedingungen angegeben. Viele Zielsequenzen werden mit kommerziell erhältlichen Kits amplifiziert. Am Beispiel der Real-Time-PCR können auch Sondensequenzen ausgewählt werden. Viele Beispiele für potenzielle Amplifikationsmethoden, die für Vermehrung von Zielsequenzen verwendet werden können, bzw. mit einer Markierungsreaktion kombiniert werden können sind in nachfolgenden Quellen dargestellt.
"Nucleic acid amplification technologies, applications to disease diagnosis" H. Lee, 1997, ISBN 1-881299-04-X
"PCR Primers, a laboratory manual" Carl W. Dieffenbach, 2003, ISBN 0-87969-653-2
"Real-Time PCR, current technology and applications" Julie Logan, 2009, ISBN 978-1-904455-39-4
"Rapid cycle Real-Time PCR, methods and applications" S. Meuer, 2001, ISBN 3-540-66736-9
"PCR Primer Design" Anton Yuryev, 2004, ISBN 978-1-58829-725-9
"PCR Troubleshooting, the essential guide" Michael L. Altshuler, 2006, ISBN 1-904455-07-7
"PCR in Bioanalysis" Stephen J. Meltzer, 1998, ISBN 0-89603-497-6
„PCR Protocols" John M. S. Bartlett, ISBN 0-89603-642-1
"PCR Technology current innovations" Thomas Weissensteiner, 2004, ISBN 0-8493-1184-5
"PCR Protocols for emerging infectious Diseases", 1996, ISBN 1-55581-108-6
"Molecular Diagnostic PCR Handbook" Gerrit J. Viljoen, 2005 ISBN 1-4020-3403-2
"PCR Detection of microbial Pathogens" Konrad Sachse, 2003, ISBN 1-58829-049-2
"Clinical Applications of PCR" Y. M. Dennis Lo, 2006, ISBN 1-58829-348-3
"Microarrays in Clinical Diagnostics" Thomas O. Joos, 2005, ISBN 1-58829-394-7
"Molecular Diagnostics" William B. Coleman, 2006, ISBN 1-58829-356-4
"Single nucleotide polymorphisms, methods and protocols" Pui-Yan Kwok, 2003, ISBN 0-89603-968-4
"Molecular Microbiology, diagnostic principles and practice" Fred C. Tenover, 2004, ISBN 1-55581-221-X
"Rapid detection of infectious Agents", Steven Specter, 1998, ISBN 0-306-45848-9
Erfindungsgemäß kann Einbau von sewquenzspezifischen Nuk-Makromolekülen in den komplementären Strang einer oder mehrerer Zielsequnez mit Amplifikation von mindestens einer Zielsequenz nach einer bekannten Amplifikationsmethoden kombiniert werden.
Ein vorteilhaftes Beispiel ist Verwendung von minestens einer Art von Nuk-Makromolekülen (Nukleotid-Konjugat) mit mindesten einem für die Zielsequenz komplementären Target-Domäne-Oligonukleotid in einer PCR-Reaktion, bei der diese Zielsequenz vervielfältigt wird. Einbau des Nukleotid-Konjugates erfolgt während der Verlängerung der komplementären Stränge in einem Schritt der PCR. Es resultiert eine vervielfältigte mit einer Art von Nukleotid-Konjugaten markierte Zielsequenz.
Ein weiteres vorteilhaftes Beispiel ist Verwendung von minestens zwei verschiedenen Arten von Nuk-Makromolekülen (Nukleotid-Konjugate) mit jeweils unterschiedlichen für eine Zielsequenz komplementären Target-Domäne-Oligonukleotiden in einer PCR-Reaktion, bei der diese Zielsequenz vervielfältigt wird. Einbau der Nukleotid-Konjugate erfolgt während der Verlängerung der komplementären Stränge in einem Schritt der PCR. Es resultiert eine vervielfältigte mit mindestens zwei Arten von Nukleotid-Konjugaten markierte Zielsequenz.
Ein weiteres vorteilhaftes Beispiel ist Verwendung von minestens zwei verschiedenen Arten von Nuk-Makromolekülen (Nukleotid-Konjugate) mit jeweils unterschiedlichen Target-Domäne-Oligonukleotiden für verschiedene Zielsequenzen in einer multiplex PCR-Reaktion, bei der mindestens zwei verschiedene Zielsequenzen vervielfältigt werden. Einbau der Nukleotid-Konjugate erfolgt während der Verlängerung der komplementären Stränge in einem Schritt der PCR. Es resultieren mindestens zwei vervielfältigte Zielsequenzen, markiert mit jeweils für sie spezifischen Nukleotid-Konjugaten.
Ein weiteres vorteilhaftes Beispiel ist Verwendung einer Art von Nuk-Makromolekülen (Nukleotid-Konjugate) mit terminierenden Eigenschaften (z. B. mit ddUTP als Nuk-Komponente) und einem Target-Domäne-Oligonukleotid in einer PCR, bei der mindestens eine bekannte Zielsequenz in ihrer Amplifikation unterdrückt werden soll (Unterdrückung einer Co-Amplifikation). Beim gleichzeigiten Vorliegen von Zielsequenz (A) und Zielsequenz (B) soll nur Zielsequenz (A) vervielfältigt werden. Zielsequenzen (A) und (B) unterscheiden sich ausreichend von einander, so dass Target-Domäne-Oligonukleotid an die beiden Sequenzen unterschiedlich binden kann. Die Sequenz des Target-Domäne-Oligonukleotids wird komplementär zu Zielsequenz (B) konstruiert. Einbau der sequenzspezifisch terminierenden Nukleotid-Konjugate erfolgt während der Verlängerung der komplementären Stränge in einem Schritt der PCR. Durch den Einbau kommt es zum Synthese-Abbruch der Kettenverlängerung. Die Zielsequenz (B) wird in ihrer Vervielfältigung unterdrückt. Das Ergebnis der PCR ist nur die Amplifikation der Zielsequenz (A)
Anstatt der PCR können auch andere Amplifikationstechniken, z. B. Helicase abhängige Amplifikation (HDA) oder Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) oder SDA (Strand displacement amplification) oder ihre Modifikationen wie Real-Time PCR, COLD-PCR (coamplification at lower denaturation temperature PCR), SMART 2 Amplifikation,
Bei diesen Amplifikations-Methoden können Nukleotid-Konjugate dank ihrer Target-Domäne an die jeweilge Zielsequenzen binden und durch die Polymerasen während der Verlängerung eines komplementären Stranges eingebaut werden. Bei Verwendung von terminierenden Nuk-Makromolekülen kann es zur sequenzspezifischen Unterdrückung der Amplifikation einer oder mehreren Zielsequenzen kommen. Bei der Verwendung von nicht-terminierenden Nuk-Makromolekülen kommt es zu einer sequenzspezifischen Markierung der amplifizierten Zielsequenz. Die sequenzunspezifische Markierung von Nukleinsäuereketten mit sequenzspezifischen Nuk-Makromolekülen wird durch Anwesenheit ausreichend hoher Konzentrationen von weiteren Substraten für Polymerasen (z. B. dNTPs wie dATP, dGTP, dCTP, dTTP) unterdrückt (s. u.).
Das Ergebniss der Amplifikation kann als Endpunkt-Analyse (z. B. mittels Gel-Elektrophorese oder einer Sequenzierung) oder auch in Real-Time-Verfahren (z. B. mit Sybregreen) analysiert werden.
1.3.25 Nachweismethoden
Einem Fachmann sind viele Nachweismethoden bekannt, die heute in der Analytik von Nukleinsäureketten eingesetzt werden. Dabei können direkte Nachweismethoden (Signalgebende Verfahren) und indirekte (signalvermittelnde Verfahren), einstufige oder mehrstufige Methoden, physikalische, enzymatische, chemische oder elektrochemische Methoden verwendet werden. Viele Signal-Amplifikaitons-Methoden sind ebenfalls bekannt. Einem Fachmann steht frei zu wählen, welche Nachweismethode für eine bestimmte Anwendung besser geeignet ist. In dieser Anmeldung werden einige Beispiele angegeben. Diese Beispiele sollen lediglich zu Demonstration dienen, nicht zur Einschränkung der potenziellen Vielfalt der Nachweismethoden, die mit beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren und Strukturen der Nuk-Makromoleküle vereinbar sind. Es können beispielsweise fluoreszenzbasierte Methoden, Methoden mit Farbgenerierung basierend auf enzymatischen Verfahren (ähnlich wie ELISA) oder Teilchen-basiere Verfahren (z. B. kolloidales Gold, Agglutination) verwendet werden. Weitere Beispiele sind im Abschnitt Signal-Domäne des Markers von Nuk-Makromolekülen angegeben.
Viele Nachweismethoden sind in der Literaur zur festen Phase (s. dort) und Amplifikationstechniken (s. dort) angeführt.
1.3.26 Hybridisierungssonde
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird eine Kombination aus mindestens einem sequenzspezifischen Nuk-Makromolekül und mindesten einem weiteren Oligonukleotid, einer Hybridisierungssonde, in einer Reaktion verwendet.
Eine Hybridisierungssonde ist ein Oligonukleotid, das in der Lage ist, an die Zielsequenz sequenzspezifisch zu binden. Beispiele für Anwendung solcher Sonden sind einem Fachmann bekannt, z. B. genannt auch als „Taqman-Sonden” oder „Light-Cycler Sonden”. Einige Beispiele für Nachweis von Nukleinsäureketten unter Verwendung sequenzspezifischer Oligonukleotid-Sonden sind in folgenden Literaturstellen beschrieben:
"Nucleic acid amplification technologies, applications to disease diagnosis" H. Lee, 1997, ISBN 1-881299-04-X
"Real-Time PCR, current technology and applications" Julie Logan, 2009, ISBN 978-1-904455-39-4
"Rapid cycle Real-Time PCR, methods and applications" S. Meuer, 2001, ISBN 3-540-66736-9
"PCR Troubleshooting, the essential guide" Michael L. Altshuler, 2006, ISBN 1-904455-07-7
"PCR in Bioanalysis" Stephen J. Meltzer, 1998, ISBN 0-89603-497-6
„PCR Protocols" John M. S. Bartlett, ISBN 0-89603-642-1
"PCR Technology current innovations" Thomas Weissensteiner, 2004, ISBN 0-8493-1184-5
"PCR Protocols for emerging infectious Diseases", 1996, ISBN 1-55581-108-6
"Molecular Diagnostic PCR Handbook" Gerrit J. Viljoen, 2005 ISBN 1-4020-3403-2
"PCR Detection of microbial Pathogens" Konrad Sachse, 2003, ISBN 1-58829-049-2
"Clinical Applications of PCR" Y. M. Dennis Lo, 2006, ISBN 1-58829-348-3
"Molecular Diagnostics" William B. Coleman, 2006, ISBN 1-58829-356-4
"Single nucleotide polymorphisms, methods and protocols" Pui-Yan Kwok, 2003, ISBN 0-89603-968-4
"Molecular Microbiology, diagnostic principles and practice" Fred C. Tenover, 2004, ISBN 1-55581-221-X
"Rapid detection of infectious Agents", Steven Specter, 1998, ISBN 0-306-45848-9
„Nucleic acid amplification technologies" Lee et al 1997, ISBN 0-8176-3921-7
"Advanced technologies in diagnostic microbiology" Tang et al. 2006, ISBN 10: 0-387-29741-3,
"Molecular diagnostics for the clinical laboratories" Coleman, 2006, ISBN 1-58829-356-4
"Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes" Vladimir V. Didenko, 2006, ISBN 1-58829-380-7
"Protocols for nucleic acid analysis by nonradioactive probes" Elena Hilario, 2006, ISBN 1-58829-430-7
"Nonisotopic DNA Probe Techniques" Larry J. Kricka, 1992, ISBN 0-12-426295-3
"Handbuch Immunchemische Färbemethoden", 2003, DakoCytomation, ISBN 3-00-011868-3
Eine Hybridisierungssonde kann in einer Ausführungsform der Erfindung als Mittel für eine Nachweisreaktion verwendet werden (beispielsweise Sonden für 5'-3'-Exonuklease-Assay). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Hybridisierunssonden für die Kopplung der markierten Nukleinsäureketten an die feste Phase eingesetzt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Hybridisierunssonden eingesetzt, die mit mindestens einer Target-Domäne eines Nukleotid-Konjugates um die Bindung an die Zielsequenz konkurrieren.
Eine Hybridisierunssonde kann ähnlich wie ein Nuk-Makromolekül aufgebaut sein, allerdings ohne eine Nuk-Komponente. Eine solche Hybridisierungssonde kann folglich durch eine Polymerase nicht in den komplementären wachsenden Strang eingebaut werden. Eine Hybridisierungssonde schließt mindestens eine zu einer Zielsequenz komplementäre Target-Domäne (z. B. ein Oligonukleotid). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung schließt eine Hybridisierungssonde mindestens eine zu einer Zielsequenz komplementäre Target-Domäne (z. B. ein Oligonukleotid) und wahlweise mindestens eine Signal-Domäne (z. B. ein Fluoreszenzfarbstoff) und/oder mindestens eine Anker-Domäne (z. B. ein weiteres Oligonukleotid).
Die Strukturen (z. B. Sequenzlänge, Beschaffenheit, Modifikationen am 3'-Ende und am 5'-Ende) der Target-Domänen, der Anker-Domänen und der Signal-Domänen von einer Hybridisierungssonde können nach selben Prinzipien zusammengesetzt werden, wie für Domänen eines Nuk-Makromoleküls beschrieben (siehe entsprechende Abschnitte zu Nuk-Makromolekülen). Entscheidender Unterschied besteht darin, dass eine Hybridisierungssonde keine Nuk-Komponente einschließt und kann somit von keiner Polymerase kovalent an den wachsenden Strang gekoppelt werden.
Die Struktur einer Oligonukleotid-Sonde kann über die Zusammensetzung ihrer Domäne beschrieben werden, z. B. [T1; A1] steht für eine Sonde mit einer Target-Domäne-Oligonukleotid gerichtet gegen Zielsequenz (1) und einer Anker-Domäne (z. B. ein Oligonukleotid oder ein Biotin-Rest). In einem weiteren Beispiel besteht die Hybridisierungssonde aus einer Target-Domäne-Oligonukleotid und einem Marker (z. B. Fluoreszenzfarbstoff). Eine solche Hybridisierungssonde kann als [T1; S1] beschrieben werden.
Ein Beispiel für eine sequenzspezifische Detektion der Zielsequenzen stellt eine Kombination aus markierten Hybridisierunssonden dar. Hybridisierunssonden in einer solchen Kombination können beispielsweise folgende Strukturen haben Hybridisierungssonde 1[T1; S1] in Kombination mit Hybridisierungssonde 2[T2; S2], wobei beide Target-Domäne-Oligonukleotide [T1] und [T2] an benachbarten, nicht überlappenden Positionen einer Zielsequenz binden können und ihre Signal-Domänen (S1 und S2) Fluoreszenzfarbstoffe darstellen können, die unter einander ein FRET-Paar bilden. Bei der Bindung beider Sonden [T1; S1] und [T2; S2] an eine Zielsequenz kann es zu Fluoreszenzsignal kommen. Dieses Signal wird detektiert und deutet auf Präsenz der Zielsequenz in einem Assay. Es können auch mehrere Sondenpaare verwendet werden, so dass eine Multiplex-Analyse möglich ist.
Ein weiteres Beispiel für eine sequenzspezifische Detektion der Zielsequenzen stellt eine Kombination aus einer markierten Hybridisierunssonde (1) [T1; S1] und einer Hybridisierunngssonde (2) [T2; A1] dar. Die Anker-Domäne [A1] der Hybridisierungssonde (2) vermittelt eine Bindung an die feste Phase (siehe Abschnitt Anker-Domäne der Nuk-Makromoleküle). Die Target-Domäne-Oligonukleotide beider Sonden binden an die einen Strang einer Zielsequenz, die Anker-Domäne [A1] vermittelt die Bindung die feste Phase und Signal-Domäne [S1] ermöglicht die Detektion, z. B. durch Bindung von Gold-Nanoteilchen. Es können auch mehrere Sondenpaare verwendet werden, so dass eine Multiplex-Analyse möglich ist.
Noch ein weiteres Beispiel für eine sequenzspezifische Detektion der Zielsequenzen stellen Hybridisierungsonden vom Typ „Molecular Beacons” dar.
Noch ein weiteres Beispiel für eine sequenzspezifische Detektion der Zielsequenzen stellen Hybridisierungssonden vom Typ „teilweise doppelsträngige lineare DNA Proben” dar („Thermodynamically modulated partially double stranded linear DNA probe design for homogeneous real time PCR" Huang et al. NAR, 2007, v. 35 e101).
Noch ein weiteres Beispiel für eine sequenzspezifische Detektion der Zielsequenzen stellt das 5'-3'-Exonuklease-Assay dar (auch genannt als Taqman-Assay). Eine Polymerase mit-Exonuklease 5'-3' Aktivität kann einzelne Nukleosidmonophosphate vom 5'-Ende eines Nukleinsäurefragment abspalten. Das Assay wird folgendermaßen aufgebaut: es wird eine zur Zielsequenz komplementäre Hybridisierungssonde (ein Oligonukleotid) mit einem Reporter-Farbstoff an einem Ende und einem Quencher-Molekül an einem anderen Ende verwendet. Der Reporter-Farbstoff und Quencher-Molekül bilden ein FRET-Paar und die Distanz zwischen beiden Modifikationen ist so gewählt, dass das Signal vom Reporter-Farbstoff teilweise oder vollständig unterdrückt ist (Quenching). Bei der Bindung an die Zielsequenz kann die Polymerase die Sonde abbauen, so dass es zur räumlichen Trennung zwischen Reporter-Farbstoff und Quencher-Molekül kommt. Das Signal vom Reporter-Farbstoff wird detektiert. Bei Strangverlängerung durch die Polymerase und gegebener Bindung zwischen Sonde und der Zielsequenz kommt es zum Signal-Anstieg.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden oben genannte Hybridisierungssonden zusammen mit Nuk-Makromolekülen in einem Assay eingesetzt. Ein entscheidender Vorteil der Verwendung von Nuk-Makromolekülen in Kombination mit bekannten Hybridisierungssonden ist die kovalente Bindung von Nuk-Makromolekülen in den wachsenden Strang der Zielsequenzen und die damit verbundene Stabilität der Ereignisse (z. B. Markierung, Terminierung, Einführung einer Anker-Domäne).
Beispielsweise werden sequenzspezifische terminierende Nukleotid-Konjugate eingesetzt, um Amplifikation einer Zielsequenz zu verhindern. In dieser vorteilhanften Ausführungsform schließt eine solche Kombination mindestens eine Art von Hybridisierungssonden gerichtet gegen eine Zielsequenz und mindestens eine Art von terminierenden Nuk-Makromolekülen (z. B. mit ddUTP als Nuk-Komponente) gerichtet gegen eine andere Zielsequenz. Durch Einsatz einer solchen Kombination in einem Amplifikations-Assay (z. B. mit gleichzeitiger Detetkion der Amplifikation wie bei Real-Time PCR) kann die Vervielfältigung sowie Detektion einer Zielsequenz gewährleistet werden, während Amplifikaion einer weiteren Zielsequenz gezielt unterdrückt werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform werden Hybridisierungssonden zusammen mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten zur Detektion verwendet. In einer solchen Kombination kann das Nuk-Makromolekül wahlweise die Funktion einer Markierung (z. B. Nuk-Makromoleküle mit folgender Struktur: Nuk-Linker-[T1; S1]) oder Vermittlung der Bindung an eine feste Phase (z. B. Nuk-Makromoleküle mit folgender Struktur: Nuk-Linker-[T1; A1]) ausführen.
Bei der Verwendung von Polymerasen mit 5'-3'-Exonuklease-Aktivität werden in einer Ausführungsform der Erfindung Nukleotide-Konjugate eingesetzt, die durch diese Exonuklease-Aktivität in ihrer Funktion nicht beeinträchtigt werden. Dies kann beispielsweise durch Bindung des Linkers, der die Nuk-Komponente und das Oligonukleotid verbindet, an einer internen Position des Oligonukleotids oder am 5'-Position des Oligonukleotids erreicht werden. Dadurch wird die Nuk-Komponente an einen Teil des Oligonukleotids gekoppelt, der nicht durch die Exonuklease-Aktivität der Polymerase abgebaut wird. Die chemische Zusammensetzung der Target-Domäne (das zur Zielsequenz komplementäres Oligonukleotid) kann Nukleotid-Analoga oder verschiedene Arten der chemischen Bindung zwischen einzelnen Monomeren im Oligonukleotid einschließen, die gegenüber Exonuklease-Aktivität unempfindlich sind, z. B. Phosphorothioat-Rückgrad (PTO), Peptid-Nukleinsäuren (PNA), oder Locked Nucleic Acids (LNA). Weitere Beispiele von Oligonukleotiden mit Fähigkeiten, einem Exonuklease-Abbau zu widerstehen, sind einem Fachmann bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform werden Hybridisierungssonden zusammen mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten eingesetzt, wobei die Hybridisierungssonde mit der Bindung der Nukleotid-Konjugaten an mindestens eine Zielsequenz konkurrieren kann. In einer solchen Ausführungsform unterscheiden sich die Hybridisierunssonden und die Target-Domäne des Nukleotid-Konjugats beispielsweise in einer Position der jeweiligen Sequenz. Eine solche Hybridisierungssonde kann dabei die Miss-Match Bindung der Target-Domäne an eine der Zielsequenz ähnliche Sequenz verringern oder verhindern. Einsatz solcher Hybridisierungssonden ist im Abschnitt Beispiele darstellt (Filter-1-Oligonukleotide).
1.3.27 Weitere Enzyme:
In der modernen Diagnostik und Forschung werden noch weitere Enzyme mit Markierungs- bzw. Amplifikationsreaktionen verwendet. Diese Enzyme und deren Wirkungen auf die Reaktionen sind einem Fachmann bekannt. Deren Einsatz kann auch mit in dieser Anmeldung beschriebenen Methoden von Vorteil sein. Hier sind einige Beispiele.
Uracil-N-Glycosidase wird oft zur Vermeidung von Cross-Kontaminationen verwendet. Das Enzym ist thermolabil und wird durch PCR-Bedingungen inaktiviert.
Ligasen werden zur Verknüpfung von Nukleinsäuresträngen verwendet. Ligasen können als thermolabile oder thermostabile Varianten zur Reaktion zugegeben werden.
Pyrophosphatasen wirken unterstützend durch die Hydrolyse des Reaktionsproduktes beim Einbau von Nukleotiden-Phyrophosphat. Thermolabile oder thermophile Formen können kommerziel erworben werden.
Helicase entfalten den Doppelstrang. Deren Einsatz wird bei Amplifikationsmethoden unter isothermischen Bedingungen bevorzugt.
Single Strand Bindung Protein bindet die einzelsträngige DNA und verhindert die Ausbildung von Sekundärstrukturen
Manche von diesen Proteinen bzw. Enzymen benötigen Kofaktoren bzw. energieliefernde Moleküle, z. B. ATP. Einem Fachmann ist es naheliegend, dass solche Stoffe in die entsprechende Reaktion zugegeben werden müssen. Bei Optimierung der Reaktionen können diese Proteine bzw. Enzyme und deren Substrate/Co-Faktoren eingesetzt werden.
In einer Ausführungsform schließen die Kits für die Markierungsreaktionen diese Enzyme und deren Substrate/Co-Faktoren ein.
1.3.28 Nukleasen
Verschiedene Arten von Nukleasen sind einem Fachmann bekannt („Nucleases, Molecular Biology and Application" (published by, N. C. Mishra, Wiley Interscience 2002, ISBN 0-471-39461-0).
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden Nukleasen zur Isolierung der mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten markierten Nukleinsäuren verwendet. Die Nutzung von Nukleasen in Kombination mit bestimmten Eigenschaften von Nukleotid-Konjugaten (wie beispielsweise Resistenz zu Nuklease-Degradation) kann einem Fachmann eine Steigerung der Spezifität der Analysen oder auch eine höhere Geschwindigkeit der Isolierung oder Vereinfachung der Isolierung ermöglichen.
Durch sequenzspezifische Markierung von Nukleinsäureketten mit Nukleotid-Konjugaten, die einer Nukleasen-Degradation vollständig oder teilweise wiederstehen können, können Eigenschaften einer entsprechend markierten DNA verändert werden. Einführung von nuclease-resistenten Nukleotid-Konjugaten (z. B. Target-Domäne schließt ein: PTO und/oder LNA und/oder PNA) in die neu synthetisierte DNA kann zum Schutz der neu-synthetisierten DNA gegenüber Nukleasen führen.
Da sequenzspezifische Nukleotid-Konjugate ausschließlich oder zumindest bevorzugt Zielsequenzen markierten, werden nur diese Sequenzen vor Nuklease-Abbau geschützt. Die restlichen, nicht-Zielsequenzen können durch Nukleasen abgebaut werden, da sie nicht geschützt sind. Dadurch kann ein auf Zielsequenz beschränkter sequenzspezifischer Schutz vor Nukleasen-Abbau erreicht werden.
Diese Eigenschaft, der Protektion bestimmter Nukleinsäureketten vor Nukleasen-Angriff kann beispielsweise zu einer vereinfachten Isolierung der markierten DNA von restlichen Komponenten des Reaktionsgemischs genützt werden. Nutzung von Nuklease-Degradation kann z. B. zur Isolierung von markierten, geschutzten Nukleinsäuren von nicht markierten Nukleinsäuren genutzt werden. Dies ist beispielsweise in Anwendungen vorteilhaft, in denen ein hohes Potenzial für unspezifische Amplifikation von Nukleinsäuereketten besteht (z. B. Multiplex-Analysen) oder eine hohe Spezifität der Analyse erforderlich ist (z. B. Differenzierung der Sequenz bis auf ein Nukleotid). Die Zielsequenzen sind durch die kovalent eingebauten, protektiven sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugate geschützt und überstehen den Nuklease-Degradationsschritt. Die unspezifisch amplifizierten Nukleinsäuren haben abweichende Sequenzen und werden nicht mit protektiven Nukleotid-Konjugaten geschützt. Dadurch werden sie im Nuklease-Degradationschritt abgebaut.
Eine solche Isolierung von markierten Nukleinsäureketten ist schnell (beispielsweise dauert der Nuklease-Schritt nur 5 sec bis 30 sec, 30 sec bis 2 min, 2 min bis bis 10 min, oder länger als 10 min), unkompliziert (Zugabe eines Enzyms) und kann unter einfachen Feldbedingungen durchgeführt werden (viele Nukleasen sind tolerant zu Schwankungen in Temperatur- und Puffer-Bedingungen). Eine solche Art der Isolierung von markierten Nukleinsäureketten ist daher besonders gut geeignet für Point-Of-Care Verfahren.
Vorzugsweise werden folgende Parameter der Primerverlägenrung bzw. Amplifikation mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten und Nutzung von Nukleasen zur Isolierung von markierten Nukleinsäureketten kombiniert:

• Primer-Verlängerung bzw. Vervielfältigung und sequenzspezifische Markierung von Nukleinsäureketten durch Nukleotid-Konjugate mit einer Target-Domäne
• Chemischen Zusammensetzung einzelner Komponenten der Nukleotid-Konjugate (z. B. Wahl der Chemie der Target-Domäne und/oder Anker-Domäne und/oder Signal-Domäne, z. B. PTO, LNA, PNA, 2'-O-Me usw.) wird an die jeweilige Nuklease angepasst
• Nukleasen mit einem speziellen Profil ihrer Substrateigenschaften (z. B. DNA-Nukleasen, RNA-Nukleasen, Exo-Nukleasen, Endo-Nukleasen, Doppelstrang (ds-Nukleasen) und Single-Strang (ss-Nukleasen) werden für eine bestimtme Isolierung ausgewählt
• Es können Kombinationen von Primern bzw. dNTP mit Nuklease-Protektiven-Eigenschaften für Herstellung längerer Abschnitte von markierten Nukleinsäureketten genützt werden
• In vorteilhaften Ausführungsformen werden bestimmte Abschnitte der markierten Nukleinsäuerekette isoliert durch Auswahl von passenden Kombinationen zwischen protektiven Nukleotid-Konjugaten, protektiven Primern, natürlichen oder protektiven dNTP und Nukleasen mit entsprechenden Substrat-Eigenschaften
• Degradation von nicht markierten Abschnitten von DNA (z. B. nicht markierte Abschnitte der Zielsequenz oder unspezifisch amplifizierte Nukleinsäureketten-Fragmente während einer PCR) wird vorzugsweise vor einem Detetkionsschritt durchgeführt.

In einer Ausführungsform werden beispielsweise folgende Kombinationen der Komponenten für sequenzspezifische Primer-Verlängerung bzw. Amplifikation und sequenzspezifische Markierung bevorzugt eingesetzt:

• Mindestens eine Zielsequenz: z. B. DNA
• Mindestens ein Primer, der mindestens eine Nuklease-protektive Modifikationen einschließt, z. B. PTO
• Mindestens ein sequenzspezifisches Nukleotid-Konjugat mit einer Target-Domäne, wobei die Target-Domäne mindestens eine folgende Varianten des Nukleinsäurerückgrades einschließt:
– PTO, LNA, PNA, Morpholino, 2'-O-Me. Diese Modifikationen könne einzeln oder als Misch-Polymere in Kombination mit DNA oder RNA verwendet werden
• Mindestens ein Alpha-Phorsphoro-Thioate-dNTP
• Mindestens ein natürliches dNTP
• Mindestens eine DNA-Polymerase mit Fähigkeit, nuklease-geschützte Primer zu verlängern

Die resultierenden markierten Nukleinsäureketten werden in Kontakt mit mindestens einer Nukleasen gebracht, die folgende Merkmale besitzen:

• Abbau von nicht markierten Fragmenten (z. B. Dnase I oder Mikrococcal nuclease)
• Fehlender Abbau an markierten Abschnitten der Nukleinsäurekette

Nach der Abbaureaktion kann das Gemisch mit markierten Nukleinsäureketten nun analysiert werden, beispielsweise mittels Immunchromatographie.
In einer vorteilhaften Ausführungsform werden Nukleasen zur Dekontamination des Reaktionsgemisches verwendet durch eine vollständige Vernichtung von nicht markierten Nukleinsäureketten. Durch diesen Schritt wird sichergestellt, dass, alle amplifikationsfähige Matrizen nach einer Amplifikationsreaktion vernicht sind.
In einer Ausführungsform werden bevorzugt ds- und ss-DNA-spezifische Nukleasen verwendet (z. B. DNase I). In einer weiteren Ausführungsform werden vorzugsweise ss-spezifische Nucleasen verwendet (z. B. In einer weiteren Ausführungsform werden vorzugsweise unspezifische Nukleasen verwendet (z. B. micrococcal Nuclease). In einer weiteren Ausführungsform werden vorzugsweise Exonukleasen verwendet, z. B. 3'-Exonuklease oder 5'-Exonuklease). In einer weiteren Ausführungsform werden vorzugsweise sequenzspezifische Endonucleasen verwendet.
Viele Nukleasen sind kommerziell erhältlich, beispielsweise bei New England Biolabs (NEB) oder bei Fermentas. Im Einzelnen können beispielsweise folgende Nukleasen aus verschiedenen Organismen verwendet werden: Deoxiribonucleasen (z. B. DNase I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII), Ribonukleasen, Restriktionsendonucleasen vom Typ II (z. B. EcoRI, BamH1, HindIII), Exonukleasen (z. B. Exonuclease I, II, III, IV, V, VI, VII,), Endonucleasen (z. B. Endonuclease I bis VII). Diese und weitere Beispiele für Nukleasen sind beschrieben in „Nucleases, Molecular Biology and Application" (published by, N. C. Mishra, Wiley Interscience 2002, ISBN 0-471-39461-0.
Die Nukleasen werden bevorzugt mit ensprechenden Puffern und den für ihre Funktion notwendigen Co-Faktoren (z. B. Metal-Ionen) zur Isolierung von markierten Fragmenten eingesetzt.
Beispiele
1.5.1 Allgemeiner Ablauf der Einbaureaktion:
Als Beispiel für Einbaureaktion kann Markierung einer einzelsträngigen DNA mit Nuk-Makromolekülen betrachtet werden. Die zu markierenden Nukleinsäureketten werden bereitgestellt und mit einem Primer und einer Polymerase und mindesten einer Art von Nuk-Makromolekülen in Kontakt gebracht und unter Bedingungen inkubiert, die es zulassen, dass der Primer mittels Polymerase verlängert wird. Durch den Einbau von Nuk-Makromolekülen in den wachsenden Strand werden Domäne der Nuk-Makromoleküle an die wachsenden Stränge der Nukleinsäureketten gebunden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Anmeldung werden Nukleinsäureketten mit Nuk-Makromolekülen markiert, die mindestens eine zielsequenzspezifische Target-Domäne einschließen. Diese Target-Domäne bindet an die zu markierende Nukleinsäurekette auf der 3'-Seite des Primers und erlaubt den Nuk-Makromolekülen, an die zu markierende Nukleinsäurekette sequenzspezifisch zu binden. Die Nuk-Komponente des Nuk-Makromoleküls ist vorzugsweise so gewählt, dass sie mindestens ein komplementäres Basenpaar mit einem Nukleotid in der Zielsequenz bilden kann. Ein solches Nukleotid liegt vorzugsweise auf der 3'-Seite des hybridisierten Primers, so dass eine Polymerase währed der Verlängerung des 3'-Endes des Primers in der Lage ist diese Nuk-Komponente in den wachsenden Strang einzubauen.
Wegen hoher lokaler Konzentrationen der Nuk-Komponente in der Nähe der Target-Domäne ist es allerdings auch möglich, eine Nuk-Komponente einzusetzen, die kein Basenpaar mit einem Nukleotid in der Zielsequenz bildet und trotzdem durch eine Polymerase unter Mißachtung einer korrekten Basenpaarung eingebaut wird.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Anmeldung werden Nukleinsäureketten mit Nuk-Makromolekülen markiert, die mindestens eine Target-Domäne und mindestens eine Anker-Domäne einschließen. Die Anker-Domäne kann an einen Bindungspartner an einer festen Phase binden. Nach einer Markierungsreaktion wird eine feste bereitgestellt, die solche Bindungspartner einschließt. Durch Inkubation mit einer solchen festen Phase können markierte Nukleinsäureketten an diese feste Phase spezifisch gebunden werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Anmeldung werden Nukleinsäureketten mit Nuk-Makromolekülen markiert, die mindestens eine Target-Domäne und mindestens eine Signal-Domäne einschließen. Nach einer Markierungsreaktion kann die markierte Nukleinsäurekette anhand des spezifischen Signals der Signal-Domäne detektiert werden.
Im Folgenden werden einzelne Komponenten der Markierungsreaktion und Beispiele für deren Kombinationen einzeln besprochen.
1.5.2 Beispiele Nukleinsäurekette/Ausgangsmaterial/Zielsequenzen:
Es können unterschiedliche Nukleinsäuren als Matrize für die Synthese von komplementären Strängen verwendet werden. Viele Methoden sind einem Fachmann bekannt, wie man aus einem Material Nukleinsäuren isoliert und daraus eine Zielsequenz bereitstellt.
Es können sowohl DNA oder RNA als Matrize dienen. Durch Verwendung entsprechender Amplifikationstechniken, können Zielsequenzen in ausreichend hohen Konzentrationen bereitgestellt werden (siehe Abschnitt „Amplifikation”).
Die Länge der Zielsequenzen liegt beispielsweise in Bereichen zwischen 20 und 50, 50 und 200, 200 und 500, 500 und 2000, 2000 und 10000, 10000 und 1000000 Nukleotiden, größer 1000000 Nukleotide. Es können einzelne Abschnitte eines Gens oder ein komplettes Genom als Zielsequenz definiert werden.
Es können sowohl doppelsträngige Nukleinsäureketten als auch einzelsträngige Nukleinsäureketten oder auch Gemische aus doppel- und einzelsträngigen Nukleinsäurekette vorliegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, wird nur eine Zielsequenz bereitgestellt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden mehrere Zielsequenzen bereitgestellt. Die Anzahl an unterschiedlichen Zielsequenzen liegt vorzugsweise in Bereichen zwischen 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 10000, mehr als 10000.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden zusätzlich zu Zielsequenzen noch weitere Kontrollsequenzen zugegeben, um beispielsweise Qualitäs der Analyse zu kontrollieren. Einsatz solcher Kontrollsequenzen ist einem Fachmann bekannt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden mehrere Zielsequenzen bereitgestellt, deren Anzahl größer 1000 ist. Ein solches Gemisch kann beispielsweise ein mRNA-Gemisch oder ein cDNA-Gemisch darstellen.
Die Zielsequenzen können mit verschiedenen Techniken vervielfältig werden (z. B. durch PCR, LCR, Isothermische Amplifikation oder durch TMA (transcription mediated amplification). Die Vervielfältigung der Zielsequenzen kann dabei in der Lösung erfolgen oder an einer festen Phase. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Zielsequenzen für eine Markierungsreaktion bereits in einer amplifizierten Form bereitgestellt, z. B. Produkte einer PCR Reaktion oder einer LCR-Reaktion oder einer isothermischen Amplifikation oder als Plasmide. Die bereitgestellen zu markierenden Nukleinsäureketten können in einzelsträngiger oder auch doppelsträngiger Form bereitgestellt werden. Weitere Beispiele für die Vermehrung von Nukleinsäuren sind einem Fachmann bekannt.
In einer Ausführungsform erfolgt die Vervielfältigung und die Markierung von Zielsequenzen mit Nuk-Makromolekülen in getrennten Ansätzen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Vervielfältigung und die Markierung von Zielsequenzen mit Nuk-Makromolekülen im gleichen Ansatz.
Vor der Analyse können Zielsequenzen mittels weiterer Techniken, z. B. durch Hybridisierung an Microarrays, vorselektiert werden.
Die Zielsequenzen können in einer Lösung oder auch an einer festen Phase fixiert bereitgestellt werden. Die Fixierung an einer festen Phase kann dabei kovalent oder affine sein. Die feste Phase kann beispielseise in Form von planen Oberflächen oder Kügelchen oder Nanoteilchen oder Gelen vorliegen. Die fixierten Zielsequenzen können mit fester Phase in bestimmen Kombinationen eingesetzt werden, beispielsweise sie können in einer bestimmen Anordnung an der festen Phase fixiert sein, oder die feste Phase kann Kodierungselemente einschließen, die eine spätere Zuordnung der festen Phase und Zielsequenz erlauben. Die Kodierung kann bespielsweise farblich erfolgen.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Zielsequenzen in gereinigter Form bereitgestellt. Mehrere Verfahren und Techniken sind einem Fachmann bekannt, wie man Nukleinsäureketten reinigt (siehe Abschnitt „Amplifikation”). In einer weiteren Ausführungsform werden Zielsequenzen als Teil eines Untersuchungsmaterial, z. B.
Blut, Sekrete, Reaktionsgemisches usw. bereitgestellt. Solche Materialien werden oft als biologische Matrix bezeichnet, in welche die zu untersuchenden Zielsequenzen integriert sind. Solche biologische Matrix kann außer Zielsequenzen auch weitere Nukleinsäureketten einschließen. Durch Isolierung von Zielsequenzen werden oft auch diese, Nicht-Zielsequenzen mitisoliert. Solche Nukleinsäureketten (Nicht-Zielsequenzen) können auch als begleitende Nukleinsäureketten oder Kontamination betrachtet werden. Auch Nebenprodukte einer Amplifikationsreaktion können eine solche Kontamination darstellen.
In einer Ausführungsform der Erfindung schließt ein Ansatz zur Markierung von Zielsequenzen auch weitere Nukleinsäureketten (begleitende Nukleinsäureketten), die nicht markiert bzw. nicht detektiert werden sollen. Als solche Nukleinsäureketten kann z. B. DNA oder RNA aus einem biologischen Material sein.
Die unterschiedlichen Kombinationen von Komponenten werden unten ausführlicher dargestellt.
1.5.3 Beispiele für Lösungen
Die verwendbaren Lösungen sollten einen enzymatischen Einbau von Nukleotiden in den wachsenden Strang von Nukleinsäureketten ermöglichen. Als Lösungen für die Markierungsreaktion werden wässrige Puffer-Lösungen bevorzugt. Viele Puffer sind in konzentrierter Form, z. B. 10×, kommerziell erhältlich (z. B. von Nue England Biolabs, Roche Molecular Diagnostics, Abbott, Qiagen usw.). Als Puffer Substanzen kommen werden beispielsweise Tris, Phosphat und HEPES eingesetzt. Der pH-Wert liegt üblicherweise zwischen 7 und 9, wobei viele Polymerasen können auch unter pH 5 und 10 arbeiten. Weitere monovalente Kationen, wie Li+, Na+, K+, NH4+ in Kombination mit Anionen, wie Cl-, SO4^2– werden oft zugegeben. Divalente Kationen, wie Mg2+ oder Mn2+ werden zusammen mit Anionen zugegeben. Organische Zusätze, wie DMSO, Glycerol, Detergentien (z. b. Tween), Betaine, PEG, antioxidanten (wie z. B. DTT) werden ebenfalls oft zu Reaktionen zugegeben. Zur Bindung von Schwermetallen wird oft auch EDTA in geringen Konzentrationen eingesetzt.
Die Zusammensetzungen der Lösungen können variieren, so beispielseise die Konzentraionen einzelner Komponenten kann oft durch Titrierung optimal eingestellt werden.
Die entsprechenden Puffer sind vorzugsweise Bestandteil eines Kits zur Markierung von Zielsequenzen mit Nuk-Makromolekülen. Sie werden vorzugsweise in konzentrierer Form bereitgestellt oder in trockener Zubereitung bereitgestellt.
1.5.4 Polymerasen für Markierungsreaktion:
Zur Markierungsreaktion können DNA-abhängige DNA Polymerasen, RNA-Abhängige DNA Polymerasen (reverse Transcriptasen), DNA-abhängige RNA Polymerasen und RNA-abhängige RNA Polymerasen verwendet werden. Beispiele für Polymerasen sind im Abschnitt Begriffe und Definitionen angegeben.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Polymerasen ohne 3'-5'Exonuklease Aktivität verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Polymerasen mit 3'-5'Exonuklease Aktivität verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform werden Polymerasen mit einer 5'-3'Exonuklease-Aktivität verwendet. In einer weiteren Ausführungsform werden Polymerasen ohne eine 5'-3'Exonuklease-Aktivität verwendet.
In einer Ausführungsform werden thermolabile Polymerase, z. B. Klenow Fragment eingesetzt, In einer weiteren Ausführungsform werden thermostabile Polymerasen, z. B. Taq Polymerase oder Vent exo minus Polymerase eingesetzt.
Es können sogenannte Hotstart-Polymerasen verwendet werden. Es handelt sich um Polymerasen, deren Aktivität durch einen Antikörper oder eine chemische Modifikation reversibel inaktiviert ist. Die Polymerasen werden beispielsweise durch Erhitzen aktiviert.
Es können auch Gemische aus mehreren Polymerasen verwendet werden. Beispielseise schließt ein solches Gemisch Polymerasen mit unterschiedlichen Substrat-Eigenschaften, z. B. eine reverse Transcriptase und eine DNA-Abhängige Polymerase oder es werden thermilabile und thermostabile Enzyme kombiniert.
Die Polymerasen können in gelöster Form oder in trockener Form bereitgestellt werden. Sie können in mit anderen Substanzen als Kompositionen bereitgestellt werden, z. B. zwecks Aufbewahrung kombiniert mit stabilisierenden Substanzen, z. B. Glycerol oder PEG. Es können auch Zugebereitungen von Polymerasen verwendet werden, die für Aufbewahrung bei 4°C oder bei Raumtemperatur vorgesehen sind, solche Zubereitungen sind kommerziell erhältlich, z. B. von GE Healthcare.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung werden Polymerasen eingesetzt, die Bestandteil einer Zubereitung sind, wobei diese Zubereitung im trockenen Zustand bereitgestellt wird. Die Aktivierung der Polymerasen kann dabei durch Zugabe von Flüssigkeit erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung sind eine oder mehrere Polymerasen oder deren Zubereitungen ein Bestandteil des Kits und werden vorzugsweise in konzentrierer Form bereitgestellt.
In einer Ausführungsform werden für die Amplifikation und für die Markierungsreaktion von Zielsequenzen dieselben Polymerasen verwendet.
Die entsprechenden Polymerasen sind vorzugsweise Bestandteil eines Kits zur Markierung von Zielsequenzen mit Nuk-Makromolekülen.
1.5.5 Primer für die Markierungsreaktion
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird zumindest ein Oligonukleotid als Primer für die enzymatische Markierungsreaktion von Zielsequenzen eingesetzt. Der Primer muss von der verwendeten Polymerase akzeptiert werden. Beispiele für Oligonukleotide mit einer Primerfunktion sind einem Fachmann bekannt.
Ein Primer für die Markierungsreaktion wird vorzugswise in Form von DNA bereitgestellt. In einer weiteren Ausführugnform wird Primer in Form von RNA bereitgestellt.
Die Länge des Primers liegt vorzugsweise zwischen 6 und 10, 10 und 15, 15 und 20, 20 und 25, 25 und 30, 30 und 40, 40 und 50, 50 und 100, oder auch länger als 100 Nukleotiden. Ein Primer schließt zumindest ein Teil in seiner Sequenz ein, der an die Zielsequenz unter Ausbildung eines Doppelstranges unter Berücksichtigung von Watson-Crick Basenpaarung binden kann. Vorzugsweise liegt dieser Teil des Primer am 3'-Ende des Primers, so dass nach der Bindung des Primers an die Zielsequenz eine enzymatische Einbaureaktion stattfinden kann.
In einer Ausführungsform ist ein Primer vollständig koomplementär zu der Zielsequenz.
Da Sequenzvarianten in der Natur oft vorkommen, ist es in manchen Anwendungen sinnvoll, wenn man mit dem Primer die Sequenzvarianten unterscheiden kann. In einer weiteren Ausführungsform kann die Zusammensetzung des Primers von der ideal komplementären Zusammensetzung der Zielsequenz abweichen, so dass ein Miss-Match in der Nähe des 3'-Endes des Primers auftreten kann (z. B. ein oder mehrere Basenpaare sind im Primer nicht komplementär zu einer Zielsequenzvariante). Ein solcher Miss-Matsch kann zur Differenzierung zwischen Sequenzvarianten herangezogen werden.
Die Positionierung des Primers innerhalb der Zielsequenz kann variabel gestalltet werden. In einer Ausführungsform liegt der Primer an einem Ende der Zielsequenz. In einer weiteren Ausführungsform liegt der Primer innerhalb der Zielsequenz. In einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein zielsequenzspezifisches Primer-Paar zur Amplifikation und zur Markierung eingesetzt. In einer weiteren Ausführungsform wird in einem solchen Primer-Paar mindestens ein Primer mit einer Signal-Domäne markiert. In einer weiteren Ausführungsform wird in einem solchen Primer-Paar mindestens ein Primer mit einer Anker-Domäne versehen.
Bei Analyse mehrerer Zielsequenzen kann ein gemeinsamer Primer oder auch mehrere unterschiedliche Primer verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungform werden mehrere Primer pro eine Zielsequenz für die Markierungsreaktion eingesetzt, wobei mehrere Primer an einen Strang oder an beide Stränge der Zielsequenz binden können. In einer Ausführungsform schließt ein solches Primergemisch Primer-Sequenzen, die ähnliche Bindungsstelle in der Zielsequenz haben und durch Basen-Unterschiede in Primern verschiedene Varianten der Zielsequenz binden können. Solche Primer können z. B. für SNP-Analysen verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform schließt ein solches Primergemisch Primer-Sequenzen, die unterschiedliche Bindungsstellen entlang der Zielsquenz haben. Solche Primer können z. B. für multiple Markierung von Zielsequenzen eingesetzt werden.
In einer weiteren Ausführungform werden mehrere Zielsequenzen in einer Markierungsreaktion mit Nuk-Makromolekülen markiert, wobei jede Zielsequenz mindestens mit einem für spezifischen Primer kombiniert wird.
In einer weiteren Ausführungform werden mehrere Zielsequenzen in einer Markierungsreaktion mit Nuk-Makromolekülen markiert, wobei mindestens ein Primer an zwei oder mehr Zielsequenzen binden kann.
In einer weiteren Ausführungsform werden für unterschiedliche Zielsequenzen einheitliche Primer verwendet. Beispiele für solche Primer stellen Oligo-dT-Sequenzen bei einer cDNA-Synthese. Ein weiteres Beispiel stellt die Einführung einer einheitlichen Primer-Bindungsstelle an alle Zielsequenzen beispielsweise mittels Ligation dar und eine anschließende Markierungsreaktion mit einem einheitlichen Primer.
Die Tm des Primers und die Tm von Target-Domäne der verwendeten Nuk-Makromolekülen werden in einer Ausführungsform aneinader angepaßt, so dass beispielsweise Unterschiede in Tm liegen nicht weiter auseinaner als +/–5°C.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Sequenz des Primers (oder eines Primer-Paars oder eines Sets von Primern) dermassen gestalltet, dass Primer-Tm über der Tm der Target-Domäne des zu verwendenden Nuk-Makromoleküls liegt, wobei der Unterschied beispielsweise größer als 5° bis größer als 50°C beträgt.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Sequenz des Primers (oder eines Primer-Paars oder eines Sets von Primern) dermassen gestalltet, dass Primer-Tm unter der Tm der Target-Domäne des zu verwendenden Nuk-Makromoleküls liegt, wobei der Unterschied beispielsweise größer als 5° bis größer als 50°C beträgt.
Durch Variationen in Tm von Primer und Target-Domänen der Nuk-Makromoleküle können die einzelnen Bindungsereignisse (Primer-Bindung und Nuk-Makromolekül-Bindung) durch Temperatur-Veränderungen gesteuert werden. Da die DNA-Polymerasen nur gebunde Primer verlängern, können somit auch die Prozesse der Primer-Verlängerung gesteuert werden. Die Bindung der Target-Domäne eines Nuk-Makromoleküls an die Zielsequenz begünstigt sein Einbau in den Primer. Durch Anpassung der Tm der Target-Domäne an die Reaktionsbedinungen können auch Einbauereignisse der Nuk-Makromoleküle gesteuert werden.
Modifikatinen In einer weiteren Ausführungsform schließen Oligonukleotide mit Primerfunktion eine oder mehrere Modifikationen ein. Beispiele für Modifikationen stellen Farbstoffe, Haptene (Antigene), Biotin, Peptid-Sequenzen, weitere Oligonukleotidsequenzen mit abweichenden Rückgrad-Strkturen, z. B. PTO, LNA, PNA dar.
In einer weiteren Ausführungsform schließt ein Primer mindestens eine Anker-Domäne ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt ein Primer mindestens eine Signal-Domäne ein. Die verwendbaren Strukturen der Anker-Domäne und Signal-Domäne der Primer können mit denen der Nuk-Makromoleküle identisch sein oder sich auch unterscheiden. Beispiele für modifizierte Primer sind einem Fachmann bekannt.
In einer Ausführungsform werden die Primer für die Markierungsreaktion in einer Lösung bereitgestellt. In einer weiteren Ausführungsform werden die Primer bereitgestellt, wobei die Primer an einer festen Phase immobilisiert sind. Die fixierten Primer können in Kombinationen mit der festen Phase bereitgestellt werden, bei denen eine eindeutige Zuordnung der Primersequenzen zu einer bestimmen Eigenschaft der festen Phase möglich ist, beispielsweise zu einer Position an der festen Phase, z. B. bei einer planen festen Phase, oder zu einer Farbe oder einem Durchmesser, z. B. bei Kügelchen.
In einer Ausführungsform unterscheiden sich die Primer für die Markierungsreaktion von denen, die für die Amplifikation von Zielsequenzen verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform werden für die Markierungsreaktion dieselben Primer verwendet, wie für die Amplifikation von Zielsequenzen.
Die entsprechenden Primer sind vorzugsweise Bestandteil eines Kits zur Markierung von Zielsequenzen mit Nuk-Makromolekülen.
1.5.6 Zielsequenzspezifische Hybridisierungssonden
Eine Hybridisierungssonde ist ein Oligonukleotid, das in der Lage ist, an die Zielsequenz sequenzspezifisch zu binden. In einer Ausführungsform der Erfindung können Hybridisierungssonden mit einer Signal-Domäne verwendet werden. Durch eine spezifische Hybridisierung dieser markierten Oligonukleotide an die jeweilige mit Nuk-Makromolekülen markierte Zielsequenz kann ein signalgebendes oder signalvermittelndes Molekül gebunden werden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Hybridisierunssonden eingesetzt, die eine Anker-Domäne einschließen. Mit dieser Anker-Domäne, z. B. Hapten, Biotin, Oligonukleotid, können sie an die feste Phase spezifisch binden. Durch solche Oligonukleotide können auch mit Nuk-Makromolekülen markierte Zielsequenzen an die feste Phase spezifisch gebunden werden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Hybridisierunssonden eingesetzt, die mit mindestens einer Target-Domäne eines Nukleotid-Konjugates um die Bindung an die Zielsequenz und zielsequenzähnliche Nukleinsäureketten konkurrieren. Durch unterschiedliche Bindungsaffinitäten (bedingt beispielsweise durch unterschiedliche Sequenz-Zusammensetzung der Hybridisierungssonden und Target-Domänen) können unspezifische Bindungsereignisse der Target-Domänen an zielsequenzähnliche Nukleinsäureketten durch solche Hybridisierungssonden unterdrückt werden.
1.5.7 Nukleotide
In einer bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung werden Nuk-Makromoleküle bei enzymatischen Markierungsreaktion eingesetzt, die folgende Komponenten (Domäne) einschließen:
Nuk-Linker-(Target-Domäne-1)-(Anker-Domäne-1)

• Nuk – ist eine Nuk-Komponente
• Linker – ist eine Linker-Komponente
• Target-Domäne-1 kann spezifisch an einen Sequenzabschnitt in der Zielsequenz unter Berücksichtigung der Watson-Crick Basenpaarung binden/hybridisieren. Beispiele für Target-Domäne-1 stellen Oligonucleotide. Die Struktur der Oligonukleotide kann dabei DNA, RNA, PNA, Morpholino oder LNA sein.
• Anker-Domäne-1 kann spezifisch an einen Bindungspartner binden. Dieser Bindungspartner ist vorzugsweise an einer festen Phase gebunden. Beispiele für Affinitäts-Doman-1 stellen Oligonucleotide (als DNA, PTO, RNA, PNA, Morpholino oder LNA) oder Haptene (z. B. Farbstoffe) oder Biotin. Die ensprechenden Bindungspartner, gebunden an die feste Phase, können beispielsweise Oligonukleotide, Antikörper oder Streptavaidin sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung werden mehrere unterschiedliche Arten von Nuk-Makromolekülen bei enzymatischen Markierungsreaktion eingesetzt, die folgende Komponenten (Domäne) einschließen:
Nuk-Linker-(Target-Domäne-n)-(Anker-Domäne-n)

• Nuk – ist eine Nuk-Komponente
• Linker – ist eine Linker-Komponente
• Target-Domäne-n können spezifisch an den jeweiligen Sequenzabschnitt in der entsprechenden Zielsequenzen unter Berücksichtigung der Watson-Crick Basenpaarung binden/hybridisieren. Die Anzahl der Target-Domänen (n) entspricht der Anzahl der zu markierenden Zielsequenzen.
• Anker-Domäne-n können spezifisch an den jeweiligen Bindungspartner binden.
Diese Bindungspartner sind vorzugsweise an einer festen Phase gebunden. Die Anzahl der Anker-Domänen (n) entspricht der Anzahl der zu markierenden Zielsequenzen.
• Die jeweiligen Anker-Domänen sind spezifisch für die jeweiligen Target-Domänen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung werden mehrere unterschiedliche Arten von Nuk-Makromolekülen bei enzymatischen Markierungsreaktion eingesetzt, die folgende Komponenten (Domäne) einschließen:
Nuk-Linker-(Target-Domäne-1)-(Anker-Domäne-n)

• Nuk – ist eine Nuk-Komponente
• Linker – ist eine Linker-Komponente
• Target-Domäne-1 kann spezifisch an einen Sequenzabschnitt in der Zielsequenz unter Berücksichtigung der Watson-Crick Basenpaarung binden/hybridisieren.
• Anker-Domäne-n können spezifisch an den jeweiligen Bindungspartner binden.
Diese Bindungspartner sind vorzugsweise an einer festen Phase gebunden. Die Anzahl der Anker-Domänen (n) kann beispielsweise zwischen 2 und 100 liegen.
• Die Target-Domäne ist einheitlich und ist mit jeweils spezifischen Anker-Domänen kombiniert.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung werden mehrere unterschiedliche Arten von Nuk-Makromolekülen bei enzymatischen Markierungsreaktion eingesetzt, die folgende Komponenten (Domäne) einschließen:
Nuk-Linker-(Target-Domäne-n)-(Anker-Domäne-1)

• Nuk – ist eine Nuk-Komponente
• Linker – ist eine Linker-Komponente
• Target-Domäne-n können spezifisch an den jeweiligen Sequenzabschnitt in der entsprechenden Zielsequenzen unter Berücksichtigung der Watson-Crick Basenpaarung binden/hybridisieren. Die Anzahl der Target-Domänen (n) entspricht der Anzahl der zu markierenden Zielsequenzen.
• Anker-Domäne-1 kann spezifisch an einen Bindungspartner binden. Dieser Bindungspartner ist vorzugsweise an einer festen Phase gebunden.
• Die Anker-Domäne ist einheitlich und ist mit jeweils spezifischen Target-Domänen kombiniert.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung werden mehrere unterschiedliche Arten von Nuk-Makromolekülen bei enzymatischen Markierungsreaktion in einem Ansatz eingesetzt, die mindestens zwei Nuk-Makromoleküle aus der folgenden Gruppe einschließen:

• Nuk-Linker-(Target-Domäne-1)-(Anker-Domäne-1)
• Nuk-Linker-(Target-Domäne-n)-(Anker-Domäne-n)
• Nuk-Linker-(Target-Domäne-1)-(Anker-Domäne-n)
• Nuk-Linker-(Target-Domäne-n)-(Anker-Domäne-1)

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung werden mehrere unterschiedliche Arten von Nuk-Makromolekülen bei enzymatischen Markierungsreaktion in einem Ansatz eingesetzt, die mindestens zwei Nuk-Makromoleküle aus der folgenden Gruppe einschließen:

• Nuk-Linker-(Target-Domäne-1)-(Anker-Domäne-1)
• Nuk-Linker-(Target-Domäne-2)-(Anker-Domäne-2)
• Nuk-Linker-(Target-Domäne-3)-(Anker-Domäne-3)
• Nuk-Linker-(Target-Domäne-4)-(Anker-Domäne-4)

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung werden Nuk-Makromoleküle eingesetzt, die folgende Komponenten einschließen:
Nuk-Linker-(Target-Domäne-1)-(Signal-Domäne-1)

• Nuk – ist eine Nuk-Komponente
• Linker – ist eine Linker-Komponente
• Target-Domäne-1 kann spezifisch an einen Sequenzabschnitt in der Zielsequenz unter Berücksichtigung der Watson-Crick Basenpaarung binden/hybridisieren. Beispiele für Target-Domäne-1 stellen Oligonucleotide. Die Struktur der Oligonukleotide kann dabei DNA, RNA, PNA, Morpholino oder LNA sein.
• Signal-Domäne-1 kann durch ein spezifisches Signal identifiziert werden (z. B. ein Fluoreszenzsignal) oder vermittelt Bindung eines weiteren signalgebenden Partner (z. B. durch Oligonucleotide oder Haptene oder Biotin). Die entsprechenden signalgebende Bindungspartner, können beispielsweise markierte Oligonukleotide, markierte Antikörper oder markiertes Streptavaidin sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung werden mehrere unterschiedliche Arten von Nuk-Makromolekülen bei enzymatischen Markierungsreaktion eingesetzt, die folgende Komponenten (Domäne) einschließen:
Nuk-Linker-(Target-Domäne-n)-(Signal-Domäne-n)

• Nuk – ist eine Nuk-Komponente
• Linker – ist eine Linker-Komponente
• Target-Domäne-n können spezifisch an den jeweiligen Sequenzabschnitt in der entsprechenden Zielsequenzen unter Berücksichtigung der Watson-Crick Basenpaarung binden/hybridisieren. Die Anzahl der Target-Domänen (n) entspricht der Anzahl der zu markierenden Zielsequenzen.
• Signal-Domäne-n können druch eine jeweils spezifische Signal-Eigenschaft unterschieden werden. Die Anzahl der Signal-Domänen (n) entspricht der Anzahl der zu markierenden Zielsequenzen.
• Die jeweiligen Signal-Domänen sind spezifisch für die jeweiligen Target-Domänen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung werden mehrere unterschiedliche Arten von Nuk-Makromolekülen bei enzymatischen Markierungsreaktion eingesetzt, die folgende Komponenten (Domäne) einschließen:
Nuk-Linker-(Target-Domäne-1)-(Signal-Domäne-n)

• Nuk – ist eine Nuk-Komponente
• Linker – ist eine Linker-Komponente
• Target-Domäne-1 kann spezifisch an einen Sequenzabschnitt in der Zielsequenz unter Berücksichtigung der Watson-Crick Basenpaarung binden/hybridisieren.
• Signal-Domäne-n können durch eine jeweils spezifische Signal-Eigenschaft unterschieden werden. Die Anzahl der Signal-Domänen (n) kann beispielsweise zwischen 2 und 100 liegen.
• Die Target-Domäne ist einheitlich und ist mit jeweils spezifischen Signal-Domänen kombiniert.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung werden mehrere unterschiedliche Arten von Nuk-Makromolekülen bei enzymatischen Markierungsreaktion eingesetzt, die folgende Komponenten (Domäne) einschließen:
Nuk-Linker-(Target-Domäne-n)-(Signal-Domäne-1)

• Nuk – ist eine Nuk-Komponente
• Linker – ist eine Linker-Komponente
• Target-Domäne-n können spezifisch an den jeweiligen Sequenzabschnitt in der entsprechenden Zielsequenzen unter Berücksichtigung der Watson-Crick Basenpaarung binden/hybridisieren. Die Anzahl der Target-Domänen (n) entspricht der Anzahl der zu markierenden Zielsequenzen.
• Signal-Domäne-1 kann durch ein spezifisches Signal identifiziert werden (z. B.
ein Fluoreszenzsignal) oder vermittelt Bindung eines weiteren signalgebenden Partners.
• Die Signal-Domäne ist einheitlich und ist mit jeweils spezifischen Target-Domänen kombiniert.

• Nuk-Linker-(Target-Domäne-1)-(Signal-Domäne-1)
• Nuk-Linker-(Target-Domäne-n)-(Signal-Domäne-n)
• Nuk-Linker-(Target-Domäne-1)-(Signal-Domäne-n)
• Nuk-Linker-(Target-Domäne-n)-(Signal-Domäne-1)

• Nuk-Linker-(Target-Domäne-1)-(Signal-Domäne-1)
• Nuk-Linker-(Target-Domäne-2)-(Signal-Domäne-2)
• Nuk-Linker-(Target-Domäne-3)-(Signal-Domäne-3)
• Nuk-Linker-(Target-Domäne-4)-(Signal-Domäne-4)

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung werden Nuk-Makromoleküle eingesetzt, die folgende Komponenten (Domäne) einschließen:
Nuk-Linker-(Target-Domäne-1)-(Anker-Domane-1)-(Signal-Domäne-1)

• Nuk – ist eine Nuk-Komponente
• Linker – ist eine Linker-Komponente
• Target-Domäne-1 kann spezifisch an einen Sequenzabschnitt in der Zielsequenz unter Berücksichtigung der Watson-Crick Basenpaarung binden/hybridisieren. Beispiele für Target-Domäne-1 stellen Oligonucleotide. Die Struktur der Oligonukleotide kann dabei DNA, RNA, PNA, Morpholino oder LNA sein.
• Signal-Domäne-1 kann durch ein spezifisches Signal identifiziert werden (z. B. ein Fluoreszenzsignal) oder vermittelt Bindung eines weiteren signalgebenden Partner (z. B. durch Oligonucleotide oder Haptene oder Biotin). Die entsprechenden signalgebenden Bindungspartner, können beispielsweise markierte Oligonukleotide, markierte Antikörper oder markiertes Streptavaidin sein.
• Anker-Domäne-1 kann spezifisch an einen Bindungspartner binden. Dieser Bindungspartner ist vorzugsweise an einer festen Phase gebunden. Beispiele für Anker-Doman-1 stellen Oligonucleotide (als DNA, RNA, PNA, Morpholino oder LNA) oder Haptene (z. B. Farbstoffe) oder Biotin. Die ensprechenden Bindungspartner, gebunden an die feste Phase, können beispielsweise Oligonukleotide, Antikörper oder Streptavaidin sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung werden mehrere unterschiedliche Arten von Nuk-Makromolekülen bei enzymatischen Markierungsreaktion eingesetzt, die folgende Komponenten (Domäne) einschließen:
Nuk-Linker-(Target-Domäne-n)-(Anker-Domane-n)-(Signal-Domäne-n)

• Nuk – ist eine Nuk-Komponente
• Linker – ist eine Linker-Komponente
• Target-Domäne-n können spezifisch an den jeweiligen Sequenzabschnitt in der entsprechenden Zielsequenzen unter Berücksichtigung der Watson-Crick Basenpaarung binden/hybridisieren. Die Anzahl der Target-Domänen (n) entspricht der Anzahl der zu markierenden Zielsequenzen.
• Anker-Domäne-n können spezifisch an den jeweiligen Bindungspartner binden. Diese Bindungspartner sind vorzugsweise an einer festen Phase gebunden. Die Anzahl der Anker-Domänen (n) entspricht der Anzahl der zu markierenden Zielsequenzen.
• Signal-Domäne-n können haben eine jeweils eine spezifische Signal-Eigenschaft. Die Anzahl der Signal-Domänen (n) entspricht der Anzahl der zu markierenden Zielsequenzen.
• Die jeweiligen Signal-Domänen und Anker-Domänen sind spezifisch für die jeweiligen Target-Domänen.

In einer Ausführungsform werden in einer Makierungsreaktion zusätzlich zu Nuk-Makromolekülen auch nicht markierte Nukleotide, beispielsweise dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP oder deren Analoga, wie z. B. 7-Deaza-dATP), NTP (ATP, GTP, CTP, UTP oder deren Analoga) zur Verlagerung des wachsenden Nukleinsäurestranges eingesetzt.
In einer weiteren Ausführungsform werden zusätzlich zu Nuk-Makromolekülen konventionell markierte Nukleotide, beispielsweise dUTP-Biotin, dUTP-Fluorescein, dCTP-Cy3 zur Markierugn des wachsenden Nukleinsäurestranges eingesetzt.
In einer weiteren Ausführungsform werden zusätzlich zu Nuk-Makromolekülen nuklease-resistente Nukleotide, z. B. Alpha-thio-dNTP eingesetzt.
Die Nuk-Makromoleküle, die dNTPs und konventionell modifizierte Nukleotide können in unterschiedlichen Kombinationen und Kompositionen eingesetzt werden. Diese Kompositionen sind vorzugsweise Bestandteile von Kits. Nachfolgend sind einige von vorteilhaften Kompositionen vorgestellt.
1.5.8 Nukleotidkompositionen:

• Kompositonen, aus einer oder mehreren unterschiedlichen Arten von Nuk-Makromolekülen ohne weitere Nukleotide (z. B. ohne dNTP, NTP). Durch den Einbau von Nuk-Komponenten von Nuk-Makromolekülen am 3'-Ende des Primers gegenüber komplementären Basen in der Zielsequenz erfolgt eine Markierung von Nukleinsäureketten.
• Kompositonen, aus einer oder mehreren unterschiedlichen Arten von Nuk-Makromolekülen und einem Satz von Nukleotiden, der eine vollständige Synthese von Nukleinsäureketten erlauben, z. B. 4 × dNTP oder 4 × NTP. Es können dabei sowohl natürliche Substrate für Polymerasen wie dNTP (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) als auch deren Analoga verwendet werden. In Frage kommen dabei sowohl Basenmodifikationen, wie z. B. dITP, dUTP, 7-Deaza-dATP oder 7-Deaza-dGTP als auch Zuckermodifikationen, wie z. B. ddNTP oder 3'-Amino-3'deoxy-NTP, oder auch Phosphatmodifikationen, wie z. B. alpha-thio-dNTPs oder Tetraphosphate. Durch Verwendung von dNTP kann eine Primerverlängerung stattfinden, so dass ein zur Zielsequenz komplementärer Strang synthetisiert werden kann. Gleichzeitig erfolgt der Einbau von Nuk-Komponenten von Nuk-Makromolekülen am 3'-Ende des wachsenden Stranges gegenüber komplementären Basen in der Zielsequenz, so dass eine Markierung von Nukleinsäureketten erfolgt. Durch Variationen der Konzentrationen und Verhältnissen zwischen Nuk-Makromolekülen und dNTPs kann das Ausmass und Spezifität der Modifizierung von Nukleinsäureketten beeinflusst werden, s. u.
• Kompositionen, aus einer oder mehreren unterschiedlichen Arten von NukMakromolekülen und einem Satz von Nukleotiden, der nur eine unvollständige, limitierte Primerverlängerung erlaubt (z. B. nur ein oder zwei oder drei dNTPs oder NTPs). Es können dabei sowohl natürliche Substrate für Polymerasen wie dNTP (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) als auch deren Analoga verwendet werden. In Frage kommen dabei sowohl Basenmodifikationen, wie z. B. dITP, dUTP, als auch Zuckermodifikationen, wie z. B. ddNTP oder 3'-Amino-3'deoxy-NTP, oder auch Phosphatmodifikationen, wie z. B. alpha-thio-dNTPs oder Tetraphosphate. Durch Verwendung von dNTP kann eine Primerverlängerung stattfinden, so dass ein zur Zielsequenz komplementärer Strang synthetisiert werden kann. Gleichzeitig erfolgt der Einbau von Nuc-Komponenten von Nuk-Makromolekülen am 3'-Ende des wachsenden Stranges gegenüber komplementären Basen in der Zielsequenz, so dass eine Markierung von Nukleinsäureketten stattfindet. Durch Variationen der Konzentrationen und Verhältnissen zwischen Nuk-Makromolekülen und dNTPs kann das Ausmass und Spezifität der Modifizierung von Nukleinsäureketten beeinflusst werden, s. u. Durch Limitierung der Zusammensetzung des dNTP-Satzes, kann die Länge des synthetisierten komplementären Stranges gesteuer werden.
• Kompositonen, aus einer oder mehreren unterschiedlichen Arten von Nuk-Makromolekülen, einem Satz von Nukleotiden, der eine vollständige Synthese erlauben, z. B. 4 × dNTP oder 4 × NTP und einem oder mehreren weiteren konventionell modifizierten Nukleotiden. Es können dabei sowohl natürliche Substrate für Polymerasen wie dNTP (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) als auch deren Analoga verwendet werden. In Frage kommen dabei sowohl Basenmodifikationen, wie z. B. dITP, dUTP, als auch Zuckermodifikationen, wie z. B. ddNTP oder 3'-Amino-3'deoxy-NTP, oder auch Phosphatmodifikationen, wie z. B. alpha-thio-dNTPs oder Tetraphosphate. Als modifizierte Nukleotide können beispielsweise konventionell modifizierte Nukleotide eingesetzt werden, die z. B. einen Farbstoff oder Fluoresezenzfarbstoff oder einen Affinitätsmarkert tragen, z. B. Cy3, Rhodamine, Alexa-Farbstoffe oder Atto-Farbstoffe oder Biotin oder Digoxigenin. Durch Verwendung von dNTP kann eine Primerverlängerung stattfinden, so dass ein zur Zielsequenz komplementärer Strang synthetisiert werden kann. Gleichzeitig erfolgt der Einbau von Nuc-Komponenten von Nuk-Makromolekülen am 3'-Ende des wachsenden Stranges gegenüber komplementären Basen in der Zielsequenz, so dass eine Markierung von Nukleinsäureketten stattfindet. Durch Variationen der Konzentrationen und Verhältnissen zwischen Nuk-Makromolekülen und dNTPs kann das Ausmass und Spezifität der Modifizierung von Nukleinsäureketten beeinflusst werden, s. u. Durch Verwendung von modifizierten Nukleotiden kann während der Synthese auch eine unspezifische Markierung von Nukleinsäureketten mit Farbstoffen, FLuoreszenzfarbstoffen oder Affinitätsmarker stattfinden.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden Nuk-Makromoleküle alleine oder zusammen mit anderen Nukleotiden (s. o.) in einer wässrigen Puffer-Lösung eingesetzt. Nuk-Makromoleküle können als Bestandteile von Kits in Form einer Lösung (z. B. als eine konzentrierte Lösung) oder auch in trockener Form bereitgestellt werden. Die getrockneten Substanzen können unmittelbar vor dem Test mit einer wässrigen Lösung oder einer organischen Lösung, z. B. DMSO, für den Reaktionsansatz gelöst werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Nuk-Makromoleküle an einer festen Phase fixiert. Die Fixierung erfolgt dabei in Art und Weise, dass die Target-Domäne der Nuk-Makromoleküle ihre Fähigkeit zur spezifischen Hybridisierung an die Zielsequenzen, sowie die Fähigkeit als Substrate für Polymerasen nicht verlieren. In einer Ausführungsform erfolgt die Fixierung in einer Art und Weise, dass einzelne Arten von Nuk-Makromolekülen an einer festen Phase spezifisch identifiziert werden können. Beispielsweise kann diese Identifizierung durch eine räumliche Anordnung an der festen Phase erfolgen, ähnlich wie bei einem DNA Microarray.
Im Weiteren werden zunächt Ausführungsformen betrachtet, bei denen Nuk-Makromoleküle in einer wässrigen Puffer-Lösung vorliegen. Die Verhältnisse in Konzentrationen zwischen Nuk-Makromolekülen und nicht markierten Nukleotiden (z. B. dNTP) können angepasst werden, so dass Nuk-Makromoleküle von den Polymerasen eingebaut werden. Vorteilhafte Ausführungsformen der Verfahren schließen folgende Verhältnisse und Bereiche zwischen diesen ein:
Verhältnisse in Konzentration von Nuk-Makromolekül zu nicht markierten Nukleotiden (z. B. dNTP) schließen beispielsweise folgende Bereiche ein:
1:100.000.000 bis 1:10.000.000; 1:10.000.000 bis 1:1.000.000; 1:1.000.000 bis 1:100.000; 1:100.000 bis 1:10.000; 1:10.000 bis 1:1.000; 1:1.000 bis 1:100; 1:100 bis 1:10; 1:10 bis 1:1; 1:1 bis 10:1; 10:1 bis 100:1; 100:1 bis 1.000:1; 1.000:1 bis 10.000:1.
Durch Variationen in den Verhältnissen in Konzentrationen kann man steuern, welcher Anteil der Nukleinsäureketten in einem Ansatz markiert wird und welcher unmarkiert verbleibt, da anstatt von Nuk-Makromolekül ein nicht markiertes Nukleotid (z. B. dNTP) eingebaut wurde.
Nuk-Makromoleküle können in Abwesenheit von nicht markierten Nukleotiden (z. B. dNTP) derselben Art sowohl sequenzspezifisch als auch sequenzunspezifisch von einer Polymerase eingebaut werden. Die Zielsequenz-Spezifität wird durch Target-Domäne eines Nuk-Makromoleküls massiv begünstigt. Die Anwesenheit der dNTP derselben Basen-Art wie die Basen-Art der Nuk-Komponente führt dazu, dass natürliche Nukleotide und Nuk-Komponente des Nuk-Makromoleküls um den Einbau konkurriert. Bei steigender Konzentration von dNTP wird zunächt der zielsequenz-unspezifische Einbau von Nuk-Makromolekülen durch dNTP kompetitiv unterdrückt. Dies kann beispielseise durch Konzentrationen von 1 bis 100 μmol/l von natürlichen Nukleotiden erreicht werden. Bei noch höherer Konzentration von natürlichen Nukleotiden wird auch der sequenzspezifische Einbau von an die Zielsequenz gebundenen Nuk-Makromolekülen zunehmend unterdrückt, dies kann beispielsweise durch Konzentrationen von 1 mmol/l bis 100 mmol/l erreicht werden.
In absoluten Konzentrationen können die Konzentrationen von Nuk-Makromolekülen und nicht markierten Nukleotiden zwischen 100 pmol/l und 10 mmol/l liegen. Besonders bevorzug sind Bereichen zwischen 100 nmol/l und 1 mmol/l.
Die absoluten Konzentrationen von Nuk-Makromolekülen bei einer Reaktion liegen vorzugsweise in folgenden Bereichen: Konzentrationen für Nuk-Makromolekülen: 10 nmol/l bis 100 nmol/l, 100 nmol/l bis 1 μmol/l, 1 μmol/l bis 10 μmol/l, Konzentrationen für unmarkierte Nukleotide: 1 μmol/l bis 10 μmol/l, 10 μmol/l bis 100 μmol/l, 100 μmol/l bis 1 mmol/l, 1 mmol/l bis 10 mmol/. höher als 10 mmol/l.
Da auch weitere natürliche Nukleotide oder modifizierte Nukleiotide (z. B. markiert mit einem Farbstoff oder einem Biotin) eingesetzt werden können, liegt deren Konzentration vorzugsweise in folgenden Bereichen: 10 nmol/l bis 100 nmol/l, 100 nmol/l bis 1 μmol/l, 1 μmol/l bis 10 μmol/l, 10 μmol/l bis 100 μmol/l, 100 μmol/l bis 1 mmol/l, 1 mmol/l bis 100 mmol/l. Im Einzelnen, sollten Titrierungsreihen für eine optimale Markierung durchgeführt werden.
Konzentrationen einzelner Nukleotidarten (Nuk-Makromoleküle, dNTP, konventionell markierter Nukleotide und weiterer Nuk-Makromoleküle) können in einem Reaktionsgemisch individuell angepasst werden. Bei Verwendung mehrere Nuk-Makromoleküle können auch deren Konzentrationen und Konzentrationsverhältnisse je nach Bedarf der Analyse variabel gestaltet werden.
In einer Ausführungsform wird eine Komposition von Nuk-Makromolekülen mit anderen Kompontenten des Systems (z. B. Primer und dNTPs) zusammengestellt, dass bei einer stattfindenen Markierungsreaktion Nuk-Makromoleküle möglichst vollständig aufgebraucht werden. Dabei liegt die Konzentration von Nuk-Makromolekülen in der Reaktionslösung beispielsweise zwischen 10 pmol/l bis 1 nmol/l, 1 nmol/l bis 10 nmol/l, 10 nmol/l bis 100 nmol/l, 100 nmol/l bis 300 nmol/l, 300 nmol/l bis 1 μmol/l, 1 μmol/l bis 10 μmol/l.
Die Zugabe einzelner Reagenzien (Primer, Nukleotiden, Polymerase und gegebenenfalls auch weiterer Reagenzien) kann in einem Schritt erfolgen oder über mehrere einzelne Schritte verteilt werden. Beispielsweise können Nuk-Makromoleküle bereits von am Start der Markierungsreaktion im Ansatz bereitgestellt/enthaltend sein. Die einzelnen Reagenzien können auch in getrockneter oder Konzentrierter Form als eine Komposition vorgemischt bereitgestellt werden, beispielsweise können Nuk-Makromoleküle und dNTP in einem festen Verhältnis vorgesmischt werden. Durch Zugabe einer Lösung mit Zielsequenzen zu einem solchen bereitgestellten Gemisch erfolgt die Auflösung von Reaktionskomponenten in der Lösugn, so dass eine Markierungsreaktion stattfinden kann.
Die Nukleotid-Kompositionen mit Nuk-Makromolekülen sind vorzugsweise Bestandteile eines Kits.
1.5.9 Bindung von markierten Nukleinsäuren an die feste Phase und Detektion
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung folgt nach einer Markierungsreaktion von Zielsequenzen mit Nuk-Makromolekülen die Bindung von markierten Zielsequenzen an eine feste Phase. Anschließend erfolgt ein Nachweis der Bindung der Zielsequenzen an die feste Phase. Beispiele dafür sind in Anmeldung Cherkasov et al WO2011050938 angegeben.
Einige Beispiele für die Verfahren zur Markierung von Zielsequenzen und ihrer anschließenden Bindung an die feste Phase sind in 6 bis 15 vorgestellt.
Ein Beispiel für Markierungsverfahren einer Zielsequenz bzw. deren Äquivalente mit einer anschließenden Bindung an der festen Phase ist in 6 dargestellt. Es werden folgende Kompontenten eingesetzt (6A): eine Art von Nuk-Makromolekülen (1–4 in 6) mit einer Target-Domäne und einer Anker-Domäne, einzelsträngige Zielsequenz (7 in 6), ein mit einer Signal-Domäne markierter Primer (6 und 9 in 6), eine DNA Polymerase, weitere Nukleotide, z. B. dNTPs. Diese Komponenten werden unter Bedingungen inkubiert, die es der Polymerase ermöglichen, dNTPs und Nuk-Makromoleküle in den wachsenden Strang einzubauen (6B). Es wird eine feste Phase bereitgestellt (12 in 6), die einen Bindungspartner für die Anker-Domäne (11 in 6) einschließt. Die Markierungsreaktion wird vorzugsweise dermassen gestaltet, dass Nuk-Makromoleküle möglichst vollständig eingebaut werden. Falls ein Überschuß an Nuk-Makromolekülen verwendet werden sollte, können markierte Nukleinsäureketten von überschüssigen freien Nuk-Makromolekülen mit einer bekannten Methode gereinigt werden. Die markierten Zielsequenzen bzw. deren Äquivalente werden mit der festen Phase unter Bedingungen inkubiert, die eine spezifische Bindung der Anker-Domäne an den immobilisierten Bindungspartner zulassen. Die markierte Zielsequenz bindet an die feste Phase über die Anker-Domäne des eingebauten Nuk-Makromoleküls (13 in 6). Die Nachweisreaktion erfolgt mittels Signal-Domäne des Primers.
Ein weiteres Beispiel für Markierungsverfahren einer Zielsequenz bzw. deren Äquivalente mit einer anschließenden Bindung an der festen Phase ist in 7 dargestellt. Es werden folgende Kompontenten eingesetzt: eine Art von Nuk-Makromolekülen (1–4 in 7A, 7B) mit einer Target-Domäne, einer Anker-Domäne (4a in 7A) und einem Antagonist der Anker-Domäne (4b in 7B). Weiterhin werden einzelsträngige Zielsequenz, ein mit einer Signal-Domäne markierter Primer, eine DNA Polymerase, weitere Nukleotide, z. B. dNTPs, eingesetzt (7B). Durch die Bindung der Target-Domäne an die Zielsequenz werden Anker-Domäne und ihr Antagonist separiert. Nach dem Einbau der Nuk-Komponente in den wachsenden Strang wird dieser Zustand verfestigt. Vorzugsweise werden bei dieser Ausführungsform des Verfahrens Polymerasen eingesetzt, die keine oder nur geringe Exonuklease-Aktivität und keine oder sehr geringe „strand-displacement”-Aktivität vorweisen. In einer weiteren Ausführungsform wird eine Nuk-Komponente verwendet, die zu einer Termination in der Synthese führt, z. B. eine Nuk-Komponente, die ddNTP einschließt (z. B. ddUTP der ddCTP). Diese Komponenten werden unter Bedingungen inkubiert, die es der Polymerase ermöglichen, dNTPs und Nuk-Makromolekül in den wachsenden Strang einzubauen (7C). Es wird eine feste Phase bereitgestellt, die einen Bindungspartner für die Anker-Domäne einschließt. Nach der Einbaureaktion erfolgt eine Inkubation der markierten Zielsequenzen bzw. deren Äquivalente mit der festen Phase unter Bedingungen, die eine spezifische Bindung der Anker-Domäne von eingebauten Nuk-Makromolekülen an den immobilisierten Bindungspartner zulassen. Vorzugsweise bleiben die Anker-Domänen der nicht eingebauten Nuk-Makromoleküle unter diesen Bedingungen von ihren Antagonisten blockiert. Die markierte Zielsequenz bindet an die feste Phase über die Anker-Domäne des eingebauten Nuk-Makromoleküls. Die Nachweisreaktion erfolgt mittels Signal-Domäne des Primers. Die nicht eingebauten, freien Nuk-Makromoleküle interferieren nicht mit der Bindung von markierten Zielsequenzen, da ihre Anker-Domäne durch die Antagonisten blockiert sind.
Ein weiteres Beispiel für Markierungsverfahren einer Zielsequenz bzw. deren Äquivalente mit einer anschließenden Bindung an der festen Phase ist in 8 dargestellt. Es werden folgende Kompontenten eingesetzt: eine Art von NukMakromolekülen mit einer Target-Domäne und einer Anker-Domäne, einzelsträngige Zielsequenz, ein mit einer Signal-Domäne markierter Primer, eine DNA Polymerase, weitere Nukleotide, z. B. dNTPs. Diese Komponenten werden unter Bedingungen inkubiert, die es der Polymerase ermöglichen, dNTPs und Nuk-Makromoleküle in den wachsenden Strang einzubauen. Es wird Polymerase verwendet, die eine „strand-displacement”-Aktivität aufweist. Es wird eine feste Phase bereitgestellt, die einen Bindungspartner für die Anker-Domäne einschließt. Die Markierungsreaktion wird vorzugsweise dermassen gestaltet, dass Nuk-Makromoleküle möglichst vollständig eingebaut werden. Falls ein Überschuß an Nuk-Makromolekülen verwendet werden sollte, können markierte Nukleinsäureketten von Nuk-Makromolekülen mit einer bekannten Methode gereinigt werden. Die markierten Zielsequenzen bzw. deren Äquivalente werden mit der festen Phase unter Bedingungen inkubiert, die eine spezifische Bindung der Anker-Domäne an den immobilisierten Bindungspartner zulassen. Die markierte Zielsequenz bindet an die feste Phase über die Anker-Domäne des eingebauten Nuk-Makromoleküls. Da die verwendete Polymerase in der Lage ist, die Target-Domäne der Nuk-Makromoleküle zu verdrängen, können mehrere Nuk-Makromoleküle in denselben wachsenden Strang eingebaut werden. Die Nachweisreaktion erfolgt mittels Signal-Domäne des Primers.
Ein weiteres Beispiel für Markierungsverfahren einer Zielsequenz bzw. deren Äquivalente mit einer anschließenden Bindung an der festen Phase ist in 9 dargestellt. Es werden folgende Kompontenten eingesetzt: eine Art von Nuk-Makromolekülen mit einer Target-Domäne und einer Anker-Domäne, einzelsträngige Zielsequenz, ein Primer, eine DNA Polymerase, weitere Nukleotide, z. B. dNTPs und eine Art von markierten Nukleotiden, z. B. Nuk-Makromoleküle mit einer Signal-Domäne oder konventionell markierte Nukleotide, z. B. dUTP-16-Biotin oder Cy3-dCTP. Diese Komponenten werden unter Bedingungen inkubiert, die es der Polymerase ermöglichen, dNTPs und Nuk-Makromoleküle in den wachsenden Strang einzubauen. Es wird Polymerase verwendet, die eine „strand-displacement”-Aktivität aufweist. Es wird eine feste Phase bereitgestellt, die einen Bindungspartner für die Anker-Domäne einschließt. Die Markierungsreaktion wird vorzugsweise dermassen gestaltet, dass Nuk-Makromoleküle möglichst vollständig eingebaut werden. Falls ein Überschuß an Nuk-Makromolekülen verwendet werden sollte, können markierte Nukleinsäureketten von Nuk-Makromolekülen mit einer bekannten Methode gereinigt werden. Die markierten Zielsequenzen bzw. deren Äquivalente werden mit der festen Phase unter Bedingungen inkubiert, die eine spezifische Bindung der Anker-Domäne an den immobilisierten Bindungspartner zulassen. Die markierte Zielsequenz bindet an die feste Phase über die Anker-Domäne des eingebauten Nuk-Makromoleküls. Da die verwendete Polymerase in der Lage ist, die Target-Domäne der Nuk-Makromoleküle zu verdrängen, können mehrere Nuk-Makromoleküle und mehrere mit der Signal-Domäne markierten Nukleotide in denselben wachsenden Strang eingebaut werden.
Ein weiteres Beispiel für Markierungsverfahren einer Zielsequenz bzw. deren Äquivalente mit einer anschließenden Bindung an der festen Phase ist in 10 dargestellt. Es werden folgende Kompontenten eingesetzt: eine Art von Nuk-Makromolekülen mit einer Target-Domäne und einer Anker-Domäne, einzelsträngige Zielsequenz, ein mit einer Signal-Domäne markierter Primer, eine DNA Polymerase mit 5'-3'-Exonuklease-Aktivität, weitere Nukleotide, z. B. dNTPs. Die Linker-Kompontente ist nicht an die Target-Domäne gekoppelt, sondern an einen andren Teil des Markers, z. B. an die Anker-Domäne des Markers gekoppelt. Diese Komponenten werden unter Bedingungen inkubiert, die es der Polymerase ermöglichen, dNTPs und Nuk-Makromoleküle in den wachsenden Strang einzubauen. Dabei kommt es während der Reaktion zu einem Abbau der Target-Domäne der an die Zielsequenz gebundenen Nuk-Makromolekülenan während die Reaktion fortschreitet (10). Es wird eine feste Phase bereitgestellt, die einen Bindungspartner für die Anker-Domäne einschließt. Die Markierungsreaktion wird vorzugsweise dermassen gestaltet, dass Nuk-Makromoleküle möglichst vollständig eingebaut werden. Falls ein Überschuß an Nuk-Makromolekülen verwendet werden sollte, können markierte Nukleinsäureketten von Nuk-Makromolekülen mit einer bekannten Methode gereinigt werden. Die markierten Zielsequenzen bzw. deren Äquivalente werden mit der festen Phase unter Bedingungen inkubiert, die eine spezifische Bindung der Anker-Domäne an den immobilisierten Bindungspartner zulassen. Die markierte Zielsequenz bindet an die feste Phase über die Anker-Domäne des eingebauten Nuk-Makromoleküls. Da die verwendete Polymerase in der Lage ist, die Target-Domäne der Nuk-Makromoleküle abzubauen, können mehrere Nuk-Makromoleküle in denselben wachsenden Strang eingebaut werden. Die Nachweisreaktion erfolgt mittels Signal-Domäne des Primers.
Die 11 und 12 zeigen einen möglichen Assay-Aufbau für die Kontrolle einer Lösung auf Präsenz einer Zielsequenz. In Verfahren wird in 11 dargestellt, bei dem Zielsequenz mit dem frisch synthetisierten komplementären Strang direkt an die feste Phase gebunden wird. In 12 wird ein Verfahren dargestellt, bei dem erst eine Trennung von Doppelsträngen stattfindet. Eine Strangseparation kann eine weitere Steigerung in der Spezifität der Analyse bringen.
Ein weiteres Beispiel für Markierungsverfahren einer Zielsequenz bzw. deren Äquivalente mit einer anschließenden Bindung an der festen Phase ist in 13 dargestellt. Es werden folgende Kompontenten eingesetzt: eine Art von Nuk-Makromolekülen mit einer Target-Domäne, einer Anker-Domäne und einer Signal-Domäne, einzelsträngige Zielsequenz, ein Primer, eine DNA Polymerase, weitere Nukleotide, z. B. dNTPs. Diese Komponenten werden unter Bedingungen inkubiert, die es der Polymerase ermöglichen, dNTPs und Nuk-Makromoleküle in den wachsenden Strang einzubauen (13B). Es wird eine feste Phase bereitgestellt, die einen Bindungspartner für die Anker-Domäne einschließt. Die Markierungsreaktion wird vorzugsweise dermassen gestaltet, dass Nuk-Makromoleküle möglichst vollständig eingebaut werden. Falls ein Überschuß an Nuk-Makromolekülen verwendet werden sollte, können markierte Nukleinsäureketten von Nuk-Makromolekülen mit einer bekannten Methode gereinigt werden. Die markierten Zielsequenzen bzw. deren Äquivalente werden mit der festen Phase unter Bedingungen inkubiert, die eine spezifische Bindung der Anker-Domäne an den immobilisierten Bindungspartner zulassen. Die markierte Zielsequenz bindet an die feste Phase über die Anker-Domäne des eingebauten Nuk-Makromoleküls. Die Nachweisreaktion erfolgt mittels Signal-Domäne des Nuk-Makromoleküls.
Ein weiteres Beispiel für Markierungsverfahren einer Zielsequenz bzw. deren Äquivalente mit einer anschließenden Bindung an die festen Phase ist in 14 dargestellt. Es werden folgende Kompontenten eingesetzt: eine Art von Nuk-Makromolekülen mit einer Target-Domäne und einer Signal-Domäne, einzelsträngige Zielsequenz, ein Primer mit einer Anker-Domäne, eine DNA Polymerase, weitere Nukleotide, z. B. dNTPs. Diese Komponenten werden unter Bedingungen inkubiert, die es der Polymerase ermöglichen, dNTPs und Nuk-Makromoleküle in den wachsenden Strang einzubauen (14B). Es wird eine feste Phase bereitgestellt, die einen Bindungspartner für die Anker-Domäne einschließt. Die Markierungsreaktion wird vorzugsweise dermassen gestaltet, dass. Nuk-Makromoleküle möglichst vollständig eingebaut werden. Falls ein Überschuß an Nuk-Makromolekülen verwendet werden sollte, können markierte Nukleinsäureketten von Nuk-Makromolekülen und markierten Primern mit einer bekannten Methode gereinigt werden. Die markierten Zielsequenzen bzw. deren Äquivalente werden mit der festen Phase unter Bedingungen inkubiert, die eine spezifische Bindung der Anker-Domäne an den immobilisierten Bindungspartner zulassen. Die markierte Zielsequenz bindet an die feste Phase über die Anker-Domäne des Primers. Die Nachweisreaktion erfolgt mittels Signal-Domäne des Nuk-Makromoleküls.
Ein weiteres Beispiel für Markierungsverfahren einer Zielsequenz bzw. deren Äquivalente mit einer anschließenden Bindung an der festen Phase ist in. 15 dargestellt. Es werden folgende Kompontenten eingesetzt: eine Art von Nuk-Makromolekülen mit einer Target-Domäne und einer Anker-Domäne-1, einzelsträngige Zielsequenz, ein Primer mit einer Anker-Domäne-2, eine DNA Polymerase, weitere Nukleotide, z. B. dNTPs. Diese Komponenten werden unter Bedingungen inkubiert, die es der Polymerase ermöglichen, dNTPs und Nuk-Makromoleküle in den wachsenden Strang einzubauen (15B). Es wird eine feste Phase-1 bereitgestellt, die einen Bindungspartner für die Anker-Domäne-1 des Nuk-Makromoleküls einschließt, sowie eine feste Phase-2, die einen Bindungspartner für die Anker-Domäne-2 des Primers einschließt. Die beiden festen Phasen sind beispielsweise als Teilchen in einer wässrigen Suspension bereitgestellt. Die Markierungsreaktion wird vorzugsweise dermassen gestaltet, dass Nuk-Makromoleküle möglichst vollständig eingebaut werden. Falls ein Überschuß an Nuk-Makromolekülen verwendet werden sollte, können markierte Nukleinsäureketten von Nuk-Makromolekülen und markierten Primern mit einer bekannten Methode gereinigt werden. Die markierten Zielsequenzen bzw. deren Äquivalente werden mit beiden festen Phasen unter Bedingungen inkubiert, die spezifische Bindungen von beiden Anker-Domänen an den immobilisierten Bindungspartner zulassen. Die markierte Zielsequenz bindet an beide Phase über die Anker-Domänen. Die Nachweisreaktion kommt durch optische Wahrnehmung der Vernetzung der beiden festen Phasen, z. B. als Agglutination sichtbar.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind mehrere Bindungspartner in einer räumlichen Anordung fixiert, so dass eine Zuordnung eines bestimmen Bindungsparner zu einer bestimmen Position auf der festen Phase erfolgen kann. Dabei können einzelne Komponenten einer festen Phase zusammengefasst werden zu einem Array. Beispiele dafür stellen Mikrotiter-Platten oder deren Analoga, Bead-Arrays. Beispiele für solche, feste Phasen stellen Microarray, Bead-arrays, Western-Blot-Streifen, „Lateral Flow Devices”, Membran-Array mit mehreren Reaktionsfeldern. Einige Beispiele für feste Phase mit einem oder mehreren Bindungspartnern sind im Abschnitt „Begriffe und Definitionen” angegeben und sind einem Fachmann bekannt.
Durch die Bindung von markierten Zielsequenzen mit jeweils zielsequenzspezifischen Anker-Domänen an eine feste Phase mit räumlich angeordneten Bindungspartnern für die jeweiligen Anker-Domänen, kann auch eine räumliche Zuordnung der markierten Nukleinsäureketten erfolgen (16, 17, 19).
Die an die feste Phase gebundenen mit Nuk-Makromolekülen markierten Zielsequenzen können mit einer der bekannten Nachweismethode detektiert werden.
Es wird ein weiteres Beispiel für Markierungsverfahren einer Zielsequenz bzw. deren Äquivalente mit einer anschließenden Bindung an die feste Phase vorgestellt. Es werden folgende Kompontenten eingesetzt: eine Art von Nuk-Makromolekülen mit einer Target-Domäne und einer Signal-Domäne, einzelsträngige Zielsequenz, ein Primer, eine DNA Polymerase, weitere Nukleotide, z. B. dNTPs. Diese Komponenten werden unter Bedingungen inkubiert, die es der Polymerase ermöglichen, dNTPs und Nuk-Makromoleküle in den wachsenden Strang einzubauen. Es wird eine feste Phase bereitgestellt, welche mindestens eine Nukleinsäuekette (z. B. mindestens ein Oligonukleotid), komplementär zu der Zielsequenz bzw. zu deren Äquivalenten einschließt. Diese Nukleinsäureketten sind vorzugsweise an der festen Phase immobilisiert. Falls feste Phase mehrere komplementäre Nukleinsäureketten einschließt, sind sie in einer räumlichen Anordnugn angeordnet, d. h. bilden einen adressierbaren Array. Einem Fachmann sind solche feste Phasen bekannt, z. B. DNA Microarray. Die Markierungsreaktion wird vorzugsweise dermassen gestaltet, dass Nuk-Makromoleküle möglichst vollständig eingebaut werden. Falls ein Überschuß an Nuk-Makromolekülen verwendet werden sollte, können markierte Nukleinsäureketten von Nuk-Makromolekülen und Primern bei Bedarf mit einer bekannten Methode gereinigt werden. Die markierten Zielsequenzen bzw. deren Äquivalente werden mit der festen Phase unter Bedingungen inkubiert, die eine spezifische Bindung der markierten Zielsequenz bzw. deren Äquivalenten an die immobilisierten Nukleinsäuereketten zulassen. Die markierte Zielsequenz bindet an die feste Phase direkt, über die Ausbildung von doppelsträngen mit komplementären immobilisierten Nukleinsäureketten. Die Nachweisreaktion erfolgt mittels Signal-Domäne des eingebauten Nuk-Makromoleküls.
Nachfolgend werden Beispiele von Kombinationen der festen Phase und Anker-Domänen betrachtet. Die Anker-Domänen können als Bestandteile von Nuk-Makromolekülen, von modifizierten Primer, von Hybridisierungssonden auftreten.
1.5.9.1 Verwendung von Nuk-Makromolekülen mit einer einheitlichen Anker-Domäne.
Es werden Nuk-Makromoleküle für eine Markierungsreaktion bereitgestellt, die mindestens eine einheitliche Anker-Domäne einschließen. Es wird eine feste Phase mt einem Bindungspartner bereitgestellt, die in der Lage ist, diese einheitliche Anker-Domäne spezifisch zu binden.
Bei Verwendung von Nuk-Makromolekülen mit nur einer Art von Anker-Domänen erfolgt die Bindung von markierten Zielsequenzen an die feste Phase über einen Bindungspartner, fixiert an der festen Phase. Die Nuk-Kompontente und Target-Sequenzen können einheitlich oder unterschiedlich sein.
Beispielsweise wird nur eine Art von Nuk-Makromolekülen in der Reaktion eingesetzt. Beim Einbau von diesem Nuk-Makromolekül in die Zielsequenz oder deren Äquivalent und einer anschließenden Inkubation mit der festen Phase kommt es zu Bindung an die feste Phase.
Beispielsweise können mehrere Nuk-Makromoleküle mit unterschiedlichen Target-Domänen und einer einheitlichen Anker-Domänen bei der Suche nach einer Gruppe von Zielsequenzen verwendet werden. Falls eine von den gesuchten Zielsequenzen im Reaktionsansatz vorkommt, kommt es zum Einbau eines Nuk-Makromoleküls in den wachsenden Strand und bei einer anschließendern Inkubation mit fester Phase zu Bindung der markierten Zielsequenz oder deren Äquivalenten an die feste Phase.
Der Nachweis bzw. die Detektion der Bindung der Zielsequenz an die feste Phase kann beispielsweise über eine Signal-Domäne eines eingebauten Nuk-Makromoleküls oder eines verwendeten Primers oder einer Hybridisierungssonde erfolgen.
1.5.9.2 Verwendung von Nuk-Makromolekülen mit unterschiedlichen Anker-Domänen.
Es werden Nuk-Makromoleküle mit unterschiedlichen Anker-Domänen in der Markierungsreaktion eingesetzt. Es wird eine feste Phase mt mehreren Bindungspartnern bereitgestellt, die in der Lage ist, diese unterschiedlichen Anker-Domänen jeweils spezifisch zu binden. Vorzugsweise werden Bindungspartner in einer bestimmten räumlichen Anordnung fixiert. Durch die Bindung von markierten Zielsequenzen an einer solche feste Phase, erfolgt auch eine Verteilung markierten Nukleinsäuren anhand eingebauten spezifischen Anker-Domänen und Bindungspartner auf der festen Phase. Nach einer anschließenden Detektion anhand des entstandenen Signalmuster läßt sich feststellen, welche Zielsequenzen vorhanden waren. Dadurch können mehrere Parameter (z. B. Präsenz von unterschiedlichen Zielsequenzen) festgestellt werden.
Der Nachweis bzw. die Detektion der Bindung der Zielsequenz an die feste Phase kann beispielsweise über eine Signal-Domäne eines eingebauten Nuk-Makromoleküls oder eines verwendeten Primers oder einer Hybridisierungssonde erfolgen.
1.5.9.2.1 In einer Ausführungsform können mehrere verschiedene Nuk-Makromoleküle mit unterschiedlichen spezifischen Kombinationen von Target-Anker-Domänen zur Markierung verwendet werden. Die Nuk-Kompontenten, sowie Signal-Domäne dieser Nuk-Makromoleküle können einheitlich oder unterschiedlich sein. In einer Ausführungsform werden Nuk-Makromoleküle verwendet, die Target-, Anker- und Signal-Domäne einschließen. In einer weiteren Ausführungsform werden Nuk-Makromoleküle verwendet, die Target- und Anker-Domäne einschließen.
Durch spezifische Kombination von Target-Domänen und Anker-Domänen innerhalb eines Nuk-Makromoleüls kann eine Zuordnung von Anker-Domänen zu bestimmten Zielsequenzen erreicht werden. Nach dem Einbau von Nuk-Komponente in den wachsenden Strang durch die Polymerase ist auch die Anker-Domäne zielsequenzspezifisch gebunden.
Beispielsweise, es soll nach mehreren Zielsequenzen gesucht werden. Die Target-Domänen [T] einzelner Arten von Nuk-Makromolekülen sind komplementär zu den gesuchten Zielsequenzen. Die jeweiligen Anker-Domäne von Nuk-Makromolekülen sind spezifisch für jeweilige die Zielsequenzen ausgewählt (d. h. die Anker-Domäne [A] sind zielsequenzzugeordnet, z. B. Nuk1-[T1; A1], Nuk1-[T2; A2], Nuk1-[Tn; An] usw.). Durch die Markierung erhälrt jede einzelne Zielsequenz eine für sie spezifische Anker-Domäne. Nach der Markierungsreaktion können markierte Zielsequenzen an die feste Phase spezifisch über die Anker-Domänen binden. Nach dem Detektionschritt läßt sich feststellen, welche von den Zielsequenzen an welche Position an der festen Phase gebunden hat.
1.5.9.2.2 In einer anderen Ausführungsform können mehrere Nuk-Makromolküle mit unterschiedlichen spezifischen Kombinationen Nuk-Komponente – Anker-Domäne zur Markierung verwendet werden. Dabei können die Target- bzw. Signal-Domänen eiheitlich oder auch unterschiedlich oder gar abwesend sein.
Vorzugsweise werden bei einer solchen Ausführungsform mindestens vier unterschiedliche spezifische Anker-Domäne verwendet, jeweils für eine spezifische Base der Nuk-Kompontente, beispielsweise dATP wird mit der Anker-Domäne 1, dCTP wird mit Anker-Domäne 2, dGTP mit Anker-Domäne 3 und dUTP mit der Anker-Domäne 4 kombiniert.
1.5.9.3 Bindung an die feste Phase durch einen sequenzspefischen modifizierten Primer
In einer Ausführungsform werden in die Markierungsreaktion einer Zielsequenz mindestens eine Polymerase, mindestens ein Primer, der eine Anker-Domäne einschließt, zusammen mit mindestens einer Art von Nuk-Makromoleküle, die mindestens eine Target-Domane und mindestens eine Signal-Domäne einschließen, sowie wahlweise weitere Nukleotide. Nach der Bindung der markierten Zielsequenz an die feste Phase über die Anker-Domäne des Primers kann diese Zielsequenz durch Signal von eingebauten Nuk-Makromolekülen detektiiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform werden in die Markierungsreaktion Primer eingesetzt, die eine Anker-Domäne-1 einschließen, zusammen mit mindestens einer Art von Nuk-Makromoleküle, die mindestens eine Target-Domane und mindestens eine Anker-Domäne-2 einschließen. Die Anker-Domäne von Primer unterscheide sich von der Anker-Domäne der Nuk-Makromoleküle. Nach der Bindung der markierten Zielsequenz an die feste Phase über die Anker-Domäne des Primers kann die zweite feste Phase an die Anker-Domäne des Nuk-Makromoleküls binden. Bei Verwendung von Mikroteilchen beispiesweise kann die Bindung der beiden festen Phasen aneinander durch Agglutination detektiert werden. Die Agglutination findet nur stat, falls die Markierung der Zielsequenzen oder deren Äquivalente erfolgreich war. Durch Verwendung eines Lateral-Flow-Devices (19) kann die Bindung der beiden festen Phase durch Ausbildung eines sichtbaren Steifens detektiert werden (z. B. bei Verwendung von gefärbten Mikro-Teilchen oder des kolloidalen Goldes).
Falls mehrere Zielsequenzen nachgewiesen werden sollten, können mehrere verschiedene Primer, mit jeweils spezifischen Anker-Domänen, in Kombinatin mit mehreren Nuk-Makromolekülen verwendet, die jeweils spezifische Target-Domäne und mindestens eine Signal-Domäne oder mindestens eine Anker-Domäne einschließen. Die Signal-Domänen und Anker-Domänen von verwendeten Nuk-Makromolekülen können einheitlich oder unterschiedlich sein.
1.5.9.4 Bindung an die feste Phase durch eine modifizierte Hybridisierungssonde
In die Markierungsreaktion werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die eine Target-Domäne und eine Anker-Domäne einschließen, zusammen mit mindestens einer Art von Nuk-Makromoleküle, die mindestens eine Target-Domane und mindestens eine Signal-Domäne einschließen. Die verwendeten Target-Domäne sind zielsequenzspezifisch. Nach der Bindung der markierten Zielsequenz an die feste Phase über die Anker-Domäne-1 der Hybridisierungssonde kann diese Zielsequenz durch Signal von eingebauten Nuk-Makromolekülen detektiiert werden. Falls mehrere Zielsequenzen nachgewiesen werden sollten, können mehrere verschiedene Hybridisierungssonden, mit jeweils spezifischen Anker-Domänen, in Kombinatin mit mehreren Nuk-Makromolekülen verwendet, die jeweils spezifische Target-Domäne und beispielsweise mindestens eine Signal-Domäne einschließen. Die Signal-Domänen von verwendeten Nuk-Makromolekülen können einheitlich oder unterschiedlich sein.
1.5.9.5 Bindung an die feste Phase durch ein modifiziertes Nukleotid
In die Markierungsreaktion werden modifizierte Nukleotide mit niedriger molekularer Masse (z. B. dUTP-16-Biotin oder dUTP-Digoxigenin oder dUTP-Fluorescein) eingesetzt, die eine Anker-Domäne einschließen, zusammen mit mindestens einer Art von Nuk-Makromoleküle, die mindestens eine Target-Domane und mindestens eine Signal-Domäne einschließen. Es wird eine feste Phase bereitgestellt, die den niedermolekularen Marker von konventionellen Nukleotiden binden kann, z. B. Streptavidin oder Antikörper gegen Digoxigenin oder gegen Fluorescein. Nach der Bindung der markierten Zielsequenz an die feste Phase über die nidermolekulare Marker des modifizierten Nukleotids kann diese Zielsequenz durch Signal von eingebauten Nuk-Makromolekülen detektiiert werden.
1.5.9.6 Direkte Bindung der markierten Zielsequenz oder deren Äquivalente an die feste Phase mit fixierten, adressierbaren, der Zielsequenz komplementären Nukleinsäureketten
In einer Ausführungsform werden in die Markierungsreaktion einer Zielsequenz mindestens eine Polymerase, mindestens ein Primer zusammen mit mindestens einer Art von Nuk-Makromolekülen, die mindestens eine Target-Domane und mindestens eine Signal-Domäne einschließen, und wahlweise weitere Nukleotide eingesetzt. Nach der Markierung der Zielsequenzen mit den Nuk-Makromolekülen erfolgt die Trennung der Stränge, beispielsweise durch Temperatur oder Einwirkung von Alkali, z. b. NaOH-Lösung. Es wird eine feste Phase bereitgestellt, die adressierbare zu einer jeweiligen Zielsequenz komplementäre Oligonukleotide schließt. Das Gemisch wird in Verbindung mit der bereitgestellen festen Phase gebracht, so dass die markierten Nukleinsäueketten an die komplementären, auf der festen Phase gebundenen Nukleinsäureketten binden können. Die Nachweisreaktion erfolgt über die Signal-Domäne der eingebauten Nuk-Makromoleküle.
In einer Ausführungsform werden in die Markierungsreaktion einer Zielsequenz mindestens eine Polymerase, mindestens ein Primer zusammen mit mindestens einer Art von Nuk-Makromolekülen, die mindestens eine Target-Domane und mindestens eine Anker-Domäne einschließen, und wahlweise weitere Nukleotide eingesetzt. Nach der Markierung der Zielsequenzen mit den Nuk-Makromolekülen erfolgt die Trennung der Stränge, beispielsweise durch Temperatur oder Einwirkung von Alkali, z. b. NaOH-Lösung. Das Gemisch wird in Verbindung mit der bereitgestellen festen Phase (1) gebracht, so dass die markierten Nukleinsäueketten an die komplementären, auf der festen Phase gebundenen Nukleinsäureketten binden können. Nach der Bindung der markierten Zielsequenz an die feste Phase (1) über die Ausbildung von Doppelsträngen mit den auf der festen Phase fixierten Nukleinsäuesträngen kann eine zweite feste Phase (2) an die Anker-Domäne des Nuk-Makromoleküls binden. Bei Verwendung von Mikroteilchen beispiesweise kann die Bindung der beiden festen Phasen aneinander durch Agglutination detektiert werden. Die Agglutination findet nur stat, falls die Markierung der Zielsequenzen oder deren Äquivalente erfolgreich war. Durch Verwendung eines Lateral-Flow-Devices kann die Bindung der beiden festen Phase durch Ausbildung eines sichtbaren Steifens detektiert werden (z. B. bei Verwendung von gefärbten Mikro-Teilchen oder des kolloidalen Goldes).
Eine solche Art der Bindung von markierten Nukleinsäureketten an die feste Phase ist einem Fachmann bekannt z. B. als DNA Microarray-Technolgie (für Beispiele siehe Literatur im Abschnitt 1.3.20).
Falls mehrere Zielsequenzen analysiert werden sollen, kann eine feste Phase mit adresssierbaren, fixierten Nukleinsäuereketten verwendet werden. Entsprechend werden die Nuk-Makromoleküle an die zu untersuchenden Zielsequenzen angepasst.
1.5.10 Nachweis von gebundenen markierten Nukleinsäureketten
Viele bestehende Methoden können zum Nachweis von mit Nuk-Makromolekülen markierten Nukleinsäuren verwendet werden. Zum einen, können eingebaute Nuk-Makromoleküle eine oder mehrere Signaldomänen mit signalgebenden oder signalvermittelnden Einheiten einschließen, zum anderen, können weitere Komponenten des Systems signalgebende oder signalvermittelnde Elemente einschließen. Solche Elemente sind beispielweise markierte Primer, markierte Nukleotide, Hybridisierungssonde, interkallierende Farbstoffe.
Zur Detektion können beispielseise charakteristische Signale von Farbstoffen, chromogenen Substanzen, fluoreszenten Farbstoffen, elektrochemischen Markern oder Teilchen (z. B. Nano- oder Microkügelchen) verwendet werden. Beispiele für einzelne Komponenten sind im Abschnitt Signal-Domäne und Nachweismethoden ausführlicher dargestellt. In Abhängigkeit von der Signalgebung können auch unterschiedliche Systeme zum Nachweis des Signals verwendet werden. Beispiele dafür sind einem Fachmann bekannt.
In einer Ausführugnsform dient die Signalgebung beispielsweise zum Nachweis der Bindung von markierten Nukleinsäureketten an die feste Phase. In einer anderen Ausführungsform dient die Signalgebung beispielsweise dem Nachweis unterschiedlicher Sequenzvarianten innerhalb der Zielsequenz.
Die Signalgebung kann verschiedene Methoden der Signalvermehrung bzw. Signalverstärkung einschließen, Einem Fachmann sind Beispiele für Signalverstärkung bekannt.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden Intensitäten der erhaltenen Signale gemessen. Signalintensitäten von Zielsequenzen können mit Signal-Intensitäten der Kontrollsequenzen oder auch untereinander verglichen werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform werden diese intensitäten in digitaler Form erfasst, gespeichert und wiedergegeben.
Nachfolgend werden einige Beispiele für Nachweisreaktionen von Nukleinsäureketten an einer festen Phase benannt. Verschiedene Nachweismethoden können dabei mit verschiedenen Stukturen der Nuk-Makromoleküle kombiniert werden.
1.5.10.1 Nuk-Makromoleküle mit T-A-S-Domänen
Bei der Verwendung von mindestens einer Art von Nuk-Makromolekülen mit T-A-S-Domänen kann der Nachweis von gebundenen markierten Nukleinsäureketten mittels Signal-Domäne (S-Domäne der Nuk-Makromoleküle) erfolgen.
1.5.10.2 Nuk-Makromoleküle mit T-S-Domänen bzw. S-Domänen
Bei der Verwendung von mindestens einer Art von Nuk-Makromolekülen mit Target-Signal-Domänen bzw. Signal-Domänen erfolgt der Nachweis von gebundenen Zielsequenzen bzw. deren Äquivalenten vorzugsweise über die Signal-Domäne der eingebauten Nuk-Makromoleküle. Die Bindung von markierten Nukleinsäureketten an die feste Phase kann mittels anderer Reaktionspartner erfolgen. Beispielsweise können modifizierte Primer, Hybridisierungssonden oder modifizierte Nukleotide mit einer Anker-Domäne eingesetzt werden (siehe oben).
1.5.10.3 Signalgebung durch einen sequenzspefischen modifizierten Primer
Es werden zielsequenzspezifische Primer mit einer Signal-Domäne bei der Markierungsreaktion eingesetzt. Bei dieser Ausführungsform erfolgt der Nachweis von gebundenen Zielsequenzen bzw. deren Äquivalenten über die Signal-Domäne dieser markierten Primer. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung von markierten Nukleinsäureketten an die feste Phase über die eingebauten Nuk-Makromoleküle, die mitndestens eine Anker-Domäne einschließen. In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Bindung von markierten Nukleinsäureketten an die feste Phase über die eingebauten Nuk-Makromoleküle, die mitndestens eine Anker-Domäne sowie eine Target-Domäne einschließen.
1.5.10.4 Signalgebung durch eine modifizierten Hybridisierungssonde
Es werden zielsequenzspezifische Hybridisierungssonden mit einer Signal-Domäne bei der Markierungsreaktion eingesetzt. Bei dieser Ausführungsform erfolgt der Nachweis von gebundenen Zielsequenzen bzw. deren Äquivalenten über die Signal-Domäne dieser Hybridisierungssonden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung von markierten Nukleinsäureketten an die feste Phase über die eingebauten Nuk-Makromoleküle, die mitndestens eine Anker-Domäne einschließen. In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Bindung von markierten Nukleinsäureketten an die feste Phase über die eingebauten Nuk-Makromoleküle, die mitndestens eine Anker-Domäne sowie eine Target-Domäne einschließen.
1.5.10.5 Signalgebung durch ein modifiziertes Nukleotid
Es werden modifizierte Nukleotide mit einer Signal-Domäne (z. B. Flureszenzfarbstoff-Markierte Nukleotide oder Biotin-markierte Nukleotide, z. B. dUTP-16-Biotin) bei der Markierungsreaktion eingesetzt. Bei dieser Ausführungsform erfolgt der Nachweis von gebundenen Zielsequenzen bzw. deren Äquivalenten über die Signal-Domäne dieser modifizierten Nukleotide. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung von markierten Nukleinsäureketten an die feste Phase über die eingebauten Nuk-Makromoleküle, die mitndestens eine Anker-Domäne einschließen. In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Bindung von markierten Nukleinsäureketten an die feste Phase über die eingebauten Nuk-Makromoleküle, die mitndestens eine Anker-Domäne sowie eine Target-Domäne einschließen.
Im Folgenden werden weitere Beispiele für vorteilhafte Kombinationen dargestellt.
1.5.11 Verfahrensvarianten: Verwendung von Nuk-Makromolekülen zur Markierung
1.5.11.1 Markierungsreaktion durch Primerextension
In einer Ausführungsform der Anmeldung werden Zielsequenzen in einer einzelsträngigen Form vorgelegt. In einer weiteren Ausführungsform werden zunächst doppelsträngige Zielsequenzen bereitgestellt. In diesem Fall kann ein Denaturierungsschritt des Doppelstranges, z. B. mittels erhöherter Temperatur, vor dem oder während des Markierungsschritts eingeschlossen werden oder die Auftrennung von Doppelsträngen mittels eines Enzyms erfolgen, z. B. mittels Helicase. Typischerweise, werden die Zielsequenz in einer gepufferten wässrigen Lösung vorgelegt.
Zu der bereitgestellten einzelstränigen Zielsequenz wird ein Oligonukleotid mit Primerfunktion zugegeben (im Weiteren als Primer genannt). Das Gemisch wird unter Bedingungen inkubiert, die eine sequenzspezifische Hybridisierung des Primers an die Bindungsstelle innerhalb der Zielsequenz zulassen. Solche Bedingungen sind einem Fachmann bekannt und sind in der Literatur mehrmals beschrieben. Es kommt dabei zur Ausbildung eines extensionsfähigen Primer-Zielsequenz-Komplexes. Zu diesen Komplexen werden mindestens eine Polymerase-Art, mindestens eine Art von Nuk-Makromoleküle, sowie wahlweise weitere Kompontenten (z. B. natürliche Nukleotide, modifizierte Nukleotide oder Hybridisierungssonden) zugegeben. Die Lösung wird unter Bedingungen inkubiert, unter denen die Polymerase eine Primerverlängerung durchführen kann. Während dieses Schrittes werden Nuk-Komponente der Nuk-Makromoleküle in den wachsenden Nukleinsäurestrang durch die zugegebe Polymerase eingebaut. Dadurch wird die Zielsequenz bzw. ein zur Zielsequenz komplementärer Strang (ein Äquivalent zu Zielsequenz) mit einem Nuk-Makromolekül markiert.
In einer Ausführungsform werden Nuk-Makromoleküle eingesetzt, die mindestens eine Target-Domäne einschießen (z. B. Kombinationen aus mindestens einer Target-Domäne und einer Anker-Domäne, oder mindestens einer Target-Domäne und einer Signal-Domäne, oder einer Target-Domäne und einer Anker-Domäne und einer Signal-Domäne). Die zielsequenzspezifischen Target-Domäne der Nuk-Makromoleküle können an die bereitgestelle Zielsequenz von der 3'-Position des Primers binden. Dabei werden die Reaktionsbedingugnen dermassen gewählt, dass die Target-Domäne der Nuk-Makromoleküle an ihre entsprechende Bindungsstelle innerhalb der Zielsequenz binden kann. Dabei sollten beispielsweise die Schmelztemperaturen bei gegebenen Reaktionsbedingungen für Primer and Target-Domäne berücksichtigt werden. Die Temperatur der Reaktion wird vorzugsweise so gewählt, dass sowohl der Primer als auch die Target-Domäne der Nuk-Makromoleküle an die Zielsequenz binden kann. Das Ausmass der Bindung kann variiert werden. Das kann in einer Ausführungsform durch die Verwendung von Reaktionstemperaturen erreicht werden, die unter der Tm des Primers und unter der Tm der Target-Domäne liegen. In einer weiteren Ausführungsform der Anmeldung wird Temperatur gewählt, die höher als die Tm des Primers und als die Tm der Target-Domäne liegt, z. B. im Bereich Tm + 5°C, oder im Bereich Tm + 10°C. Dadurch bindet nur ein geringer Teil der Target-Domänen die Zielsequenzen. In einer weiteren Ausführungsform wird die Reaktionstemperatur unter der Tm des Primers aber über der Tm der Targert-Domäne des Nuk-Makromoleküls verwendet. In einer weiteren Ausführungsform wird die Reaktionstemperatur über der Tm des Primers aber unter der Tm der Targert-Domäne des Nuk-Makromoleküls verwendet. In einer weiteren Ausführungsform wird ein Temperatur-Gradient während der Reaktion verwendet, wobei die Temperatur stufenweise angepasst wird, so dass Hybridisierung von Primer und Target-Domäne nicht gleichzeitig, sondern nach einander erfolgen kann.
In einer Ausführungsform der Erfindung, liegt die Tm der zielsequenzspezifischen Target-Domänen eines Nuk-Makromoleküls höher als die Tm eines entsprechenden zielsequenzspezifischen Primers. Die Nuk-Makromoleküle können dadurch bei höheren Temperaturen an die Zielsequenzen binden als die Primer. Dadurch kann sichergestellt werden, dass der verlängerte Primer stetts Nuk-Makromoleküle vorfinden, die bereits an die Zielsequenz gebunden haben.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Tm der Target-Domäne der Nuk-Makromoleküle niederiger als die der verwendeten Primer. Dadurch kann eine Primer-Verlängerung bei höheren Temperaturen stattfinden, ohne dass die Nuk-Makromolküle mit der Einbaureaktion interferrieren.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Tm der Target-Domäne der Nuk-Makromoleküle und die Tm der Primer etwa gleich. Dadurch ist das Bindungsverhalten der Nuk-Makromoleküle und der Primer etwa gleich.
Die Reihenfolge der Zugabe der Komponenten kann variieren. Beispielweise, können die einzelnen Komponenten der Markierungsreaktion einzeln nacheinander oder auch in Kombinatinen (Kompositionen) zugegeben werden. Beispielsweise, können die erforderlichen Nukleotide in bestimmten Verhältnissen vorgemischt werden. Auch Puffer und Salze können in bestimmten Proportionen vorgemischt vorgelegt werden. Weitere Kombinationen sind einem Fachmann offensichtlich. Solche Kompositionen können als Bestandteile von Kits bereitgestellt werden.
Nach diesem Markierungsschritt kann die nun markierte Nukleinsäurekette (Zielseqenz oder deren Äquivalente) von überschüssigen nicht eingebauten Nukleotiden isoliert werden. Isolierung und Reinigung von Nukleinsäureketten ist einem Fachmann bekannt. Anschließend werden Nukleinsäureketten in Kotankt mit fester Phase gebracht und detektiert, wie im Abschnitt Amplifikationsmethoden geschrieben.
Makrierte Nukleinsäureketten können auch direkt nach der Markierungsreaktion, ohne Isolierung und Reinigung, in Kontakt mit fester Phase gebracht und nachgewiesen werden.
Die Bindung der Nukleinsäureketten an die feste Phase kann dabei direkt über komplementäre, immobilisierte Nukleinsäuerekette oder indirekt, vermittelt über eine Anker-Domäne erfolgen. In einer solchen Reaktion können auch andere Kompontenten, z. B. markierte Primer, Hybridisierungssonden, markierte Nukleotide eingesetzt werden, wie in anderen Abschnitten beschriben. Es können eine oder mehrere Arten von Nuk-Makromolekülen an einer solchen Reaktion teilnehmen, wie in anderen Abschnitten beschriben. Es können einzelne oder mehrere Zielsequenzen amplifiziert und markiert werden. Die Detektion der Zielsequenz kann durch die Bindung an die feste Phase mit einer anschließenden Nachweisreaktion erfolgen, wie in anderen Abschnitten beschriben.
Beispiele für Markierung einer Zielsequenzen oder mehrerer Nukleinsäureketten sind in Anmeldung Cherkasov et al WO2011050938 angeführt.
1.5.11.2 Amplifikation mit Markierung
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Anmeldung erfolgt die Markierungsreaktion im gleichen Ansatz wie auch die Vervielfältigung, wobei die Amplifikationsschritte und Markierungsschritte nacheinader erfolgen. In einer anderen Ausführungsform erfolgt die Markierung parallel zu Vervielfältigung der Zielsequen. In dieser Ausführungsform werden Amplifikationsprimer als Markierungsprimer verwendet. Es sind verschiedene Beispiele für Amplifikationen von Nukleinsäureketten bekannt. Wie in diesen Verfahren beschrieben, wird ein Abschnitt aus der Zielsequnz oder die komplette Zielsequenz mit Hilfe von Primern, oft als Primer-Paare bereitgestellt, vervielfältigt. Die Amplifikation kann exponentiell erfolgen, wie in PCR oder linear. Die Reaktion kann durch zyklische Schritte mit Temperatur-Änderung gekennzeichnet sein oder bei einer konstanten Temperatur (Isothermal) durchgeführt werden. Durch die Wahl der Temperatur, Puffer und Konzentrationen erfolgt ein Prozess, bei dem Zielsequenzen in einzelsträngige Form überführt werden, Primer hybridisiert und verlängert werden. Wobei dieser Prozess mehrmals wiederholt werden kann. Die Durchführung einer PCR sollte einem Fachmann bekannt sein.
In einer Ausführungsform werden für die Markierungsreaktion derselber/dieselben Primer verwendet, wie für die Vervielfältigungsreaktion. In einer weiteren Ausführungsform wird für die Markierungsreaktion ein zusätzlicher Primer verwendet.
Bei der Durchführung einer PCR werden typischerweise in einem Reaktionsansatz folgende Komponenten bereitgestellt: mindestens eine Zielsequenz, mindestens ein zu dieser Zielsequenz passendes Primer-Paar, mindestens eine entsprechende Polymerase, z. B. eine thermostabile Polymerase, mindestens eine Art von Nuk-Makromolekülen mit einer zur Zielsequenz passenden Target-Domäne, weitere natürliche Nukleotide (z. B. dATP, dGTP, dCTP, dTTP), sowie eine entsprechende Puffer-Lösung. Die Vervielfältigungsreaktion erfolgt durch zyklische Änderungen der Temperatur, bei folgende zyklische Schritte wiederholt werden: Annealing, Primer-Extension und Denaturierung neu entstandener Stränge. Durch Zugabe von Nuk-Makromolekülen, die mindestens eine Target-Domäne einschließen, die an die Zielsequenz hybridisiert werden kann (die Target-Domäne bindet an die Zielsequenz von der 3'-Seite eines entsprechenden Primers), können auch Nuk-Makromoleküle an die einzelsträngige Zielsequenzen binden (18-21). Dies erfogt ähnlich wie bei Real-Time-PCR-Verfahren mit einer Sonde. Nach der Bindung der Primer und der Nuk-Makromolekülen an die Zielsequenz (Hybridisierunsschritt/Annealing in der PCR) erfolgt eine Primer-Extensionsreaktion mit dem Einbau von Nuk-Makromolekülen. Nach Abschluss eines Zyklus mit der Primerverlägerung, werden die entstandenen Doppelstränge beispielsweise durch einen Termeratur-Anstieg denaturiert. Anschließend folgt dann ein neuer Zyklus mit einer Primer-Hybridisierung und Nuk-Makromolekül-Hybridisierung und einer entsprechenden Primer-Verlägerung. Diese Zyklen können mehrmals wiederholt werden, so dass es zu Ansammlung von extendierten Primern kommt. Die neu synthetisierten Stränge enthalten auch Nuk-Makromoleküle. Durch den Einbau von Nuk-Makromolekülen in die wachsenden Stränge werden spezifisch markierte Nukleinsäureketten generiert. Die Reaktionsbedingungen (z. B. Puffer und Temperatur) sowie die Tm des Primers und die Tm der Target-Domäne der Nuk-Makromoleküle sind so gewählt, dass während des Hybridiserungsschritts beide an die Zielsequenzen binden können. In dieser Ausführngsform kann die Amplifikation parallel zur Markierung stattfinden.
In einer Ausführungsform beträgt der Abstand zwischen dem 3'-Ende des Primers und dem 5'-Ende der Target-Domäne mindestens 10 Nukleotide, in einer weiteren Ausführungsform mindestens 50 Nukleotide, in einer weiteren Ausführungsform mindestens 100 Nukleotide, in einer weiteren Ausführungsform mindestens 200 Nukleotide.
Vorzugsweise ist das 3'-Ende der Target-Domäne blockiert, so dass die Target-Domäne nicht als Primer dient.
Typischerweise wird ein Gemisch aus Nuk-Makromolekülen sowie natürlichen Nukleotiden für die Reaktion bereitgestellt. Die Konzentrationsverhältnisse bei einem solchen Gemisch können variieren. Beispielsweise liegen die Konzentrationen von natürlichen Nukleotiden zwischen 50 und 500 μmol/l und die Konzentration der Nuk-Makromoleküle zwischen 0,1 und 2 μmol/l. Weitere Beispiele für Konzentrationen von Nukleotiden sind im Abschnitt 1.5.8 beschrieben. Die Konzentration der Primer liegt beispielsweise zwischen 0,1 und 2 μmol/l.
Die Bedingungen der Reaktion (Temperatur), sowie die Struktur und Konzentration einzelner Kompontenten können dermassen angepasst werden, dass am Anfang des Prozesses die Amplifikation der Fragemtne der Zielsequenzen oder deren Äquivelaten überwiegt. Durch die Zunahme der Konzentraiton von amplifizierten Fragmenten (Äquivalente der Zielsequenz) in späteren Stadien des Vervielfältigungsprozesses erfolgt auch Markierungsreaktion von amplifizierten Strängen. Bei sehr geringen Konzentrationen von Zielsequenzen am Anfang des Vervielfältigungsprozesses ist die Wahrscheinlichkeit der Bindung und des Einbau von Nuk-Makromolekülen in die Zielsequenz oder deren Äquivaltente gering. Mit steigender Konzentraiton von Zielsequenzen während des Amplifikationsvorganges, erhöht sich die Frequenz der Bindungs- und Einbauereignisse von Nuk-Makromolekülen in die wachsenden Nukleinsäureketten.
Es folgend einige Beispiele für Kombinationen aus PCR und Markierungsreaktion. Zur Signal-Generierung werden in diesen Beispiele markierte Primer eingesetzt, die eine Signal-Domäne einschließen. Dabei wird ein Primer aus einem zielsequenzspezifischen Primer-Paar markiert.
In einer Ausführungsform wird PCR als Amplifikationsreaktion verwendet (18). Es werden Nuk-Makromoleküle verwendet, die eine zu dem potenziellen PCR-Fragment der DNA komplementäre Target-Domäne, sowie eine zielsequenzzugeordnete Anker-Domäne einschließen. Die Tm der Target-Domäne liegt beispielsweise im gleichen Bereich, wie die Tm von verwendeten Primern +/–5°C. Die PCR-Primer dienen auch als Markierungsprimer und schließen beispielsweise entweder eine Signal-Domäne oder eine Anker-Domäne ein. Die passenden Kombinationen von markierten Primern und Nuk-Makromolekülen sind in vorherigen Abschnitten beschrieben. Die Konzentration von Primern liegen nach den bekannten Regeln einer PCR beispielswiese in fogenden Bereichen: zwischen 10 nmol/l und 100 nmol/l, 100 nmol/l und 300 nmol/l, 300 nmol/l und 1 μmol/l, 1 μmol/l und 10 μmol/l. Die Konzentration der Nuk-Makromolekülen in der Reaktionslösung liegt beispielsweise zwischen 1 nmol/l bis 10 nmol/l, 10 nmol/l bis 100 nmol/l, 100 nmol/l bis 300 nmol/l, 300 nmol/l bis 1 μmol/l, 1 μmol/l und 10 μmol/l. Die Verhältnisse der Konzentrationen von den PCR-Primern und Nuk-Makromolekülen liegen beispielsweise in folgenden Bereichen (Konzentraiton von PCR-Primern: Nuk-Makromoleküle): 1:100 bis 1:10, 1:10 bis 1:1, 1:1 bis 10:1, 10:1 bis 100:1, 100:1 bis 1000:1. Die Konzentration von dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) liegt beispielsweise zwischen 10 μmol/l und 1 mmol/l von jedem einzelnen. Die Zeiten für jeden Temperatur-Schritt liegen beispielsweise zwischen 1 sec und 10 min.
In einigen Ausführugnsformen können die Unterschiede zwischen der Tm der Primer und der Tm der Target-Domäne der verwendeten Nuk-Makromoleküle mehr als 5°C betragen, z. B. Unterschiede können bis 50°C betragen. Diese Unterschiede können bei der Steuerung der Amplifikations- und Markierungsreaktion verdendet werden. In einer Ausführungsform liegt die Tm des Primers beispielsweise um 15 bis 20°C höher als die der Tm der Target-Domäne der Nuk-Makromoleküle. Die Nuk-Makromoleküle werden in Konzentrationen eingesetzt, die deutlich geringer sind, als die Konzentrationen von dNTPs. Bei einer PCR werden in den anfänglichen Zyklen Reaktionstemperaturen während eines Annealing-Schrittes um die Tm des Primers gewählt (z. B. Tm des Primers minus 5–10°C), dabei kann eine Verlängerung des Primers und des komplementären Stranges mit natürlichen Nukleotiden stattfinden. Die Target-Domänen der Nuk-Makromoleküle dagegen können nicht an die Zielsequenzen binden, da ihre Tm viel tiefer liegt, als die verwendete Hybridisierungs-Temperatur. Da die Target-Domäne an die Zielsequenz unter diesen Bedingungen nicht bindet und ihre Konzentration deutlich geringer ist als die der dNTP, werden bevorzugt die dNTPs eingebaut. Anschließend werden weitere Zyklen gefahren mit einer Reaktionstemperatur beim Annealingschritt unter der Tm der Target-Domäne des Nuk-Makromoleküls. Durch die Änderung der Temperatur (Temperatur wurde von Tm des Primers auf die Tm der Target-Domäne herabgesetzt) können nun sowohl Primer als auch die Target-Domänen der Nuk-Makromoleküle an die Zielsequenz binden. Durch hohe lokale Konzentrationen von Nuk-Komponenten der an die Zielsequenz gebundenen Nuk-Makromoleküle können nun die Nuk-Makromoleküle trotz Anwesenheit der dNTPs in die wachsenden Stränge eingebaut werden und die Zielsequenzen werden markiert. Vorzugsweise wird die Target-Domäne in dieser Ausführungsform weiter in Richtung 3' vom Primer platziert. Vorzugsweise beträgt der Abstand zwischen dem 3'-Ende des Primers und dem 5'-Ende der Target-Domäne mindestens 2 bis 10 Nukleotide, in einer weiteren Ausführungsform mindestens 10 bis 50 Nukleotide, in einer weiteren Ausführungsform mindestens 50 bis 100 Nukleotide, in einer weiteren Ausführungsform mindestens 100 bis 200, in einer weiteren Ausführungsform mindestens 200, Nukleotide. Durch Steuerung der Reaktionstemperaturen kann die Bindung von Primern und von Target-Domänen variabel gestaltet werden und dadurch entweder nur die Amplifikationsreaktion oder Amplifikationsreaktion und Markierungsreaktion erfolgen.
In einer weiteren Ausführungsform wird zusätzlich zu Amplifikationsprimer ein weiterer Primer (Markierungsprimer) für die Markierung der Zielsequenz verwendet. Dieser Primer kann die Zielsequenz spezifisch am gleichen Strang binden, wie die Target-Domäne eines Nuk-Makromoleküls. Der Markierungsprimer liegt vorzugsweise innerhalb der Zielsequenz und auf der 5'-Seite der gebundenen Target-Domäne eines Nuk-Makromoleküls. In der Amplifikation werden PCR-Fragmente der Zielsequenz mit Amplifikationsprimers generiert. Der Markierungsprimer bindet vorzugsweise zwischen einem Amplifikationsprimer und der Target-Domäne eines gebundenen Nuk-Makromoleküls. Die Tm des Markierungsprimers liegt vorzugsweise im gleichen Temperatur-Bereich wie die Tm der Target-Domäne des Nuk-Makromoleküls. Beispielsweise, kann die Tm des Markierungsprimer die Tm von Amplifikationsprimern sich unterscheiden (die Tm von Markierungsprimer ist geringer als die Tm von Amplifikationsprimern), so dass während einer PCR zunächst die PCR-Fragmente generiert werden und erst anschließend eine Markierungsreaktion mit einem Markierungsprimer ablaufen kann. In einer Reaktion kann die Konzentration eines Markierungsprimers höher liegen als die Konzentration von PCR-Primern.
In einer weiteren Ausführungsform werden mehr als ein Markierungsprimer mit unterschiedlichen Bindungsstellen innerhalb einer Zielsequenz zusammen mit mehreren entsprechenden spezifischen Nuk-Makromolekülen eingesetzt. Die Markierungsprimer binden an die Zielsequenz jeweils auf der 5'-Seite einer Bindungsstelle einer Target-Domäne eines Nuk-Makromoleküls, so dass eine Einbaureaktion stattfinden kann. Vorzugsweise sind solche Markierungsprimer mit einer Signal-Domäne oder einer Anker-Domäne versehen.
In einer weiteren Ausführungsform werden zusätzliche Oligonukleotide eingesetzt, die mit der Target-Domäne eines Nuk-Makromoleküls um die Bindungsposition innerhalb der Zielsequenz konkurrieren. In einer Ausführungsform haben solche Oligonukleotide gleiche Sequenzzusammensetzung wie die Target-Domäne der Nuk-Makromoleküle. In einer weiteren Ausführungsform unterscheidet sich ihre die Sequenzzusammensetzung von der Target-Domäne in mindesten einem Nukleotid. In einer weiteren Ausführungsform werden mehrere Oligonukletode verwendet, die sich in ihrer Sequenzzusammensetzung von der Target-Domäne in mindesten einem Nukleotid unterscheiden. Durch Anwesenheit solche Oligonukletide im Ansatz konkurrieren die Target-Domäne um die Bindungsstelle innerhalb der Zielsequenz. Dadurch werden weniger spezifische Bindung der Target-Domäne an die Zielsequenz unterdrückt, was zu höheren Spezifität der Analyse beitragen kann.
Nach der PCR können PCR-Fragmente von überschüßigen Primern bzw. Nuk-Makromolekülen gereinigt werden oder direkt analysiert werden. Die Analyse erfolgt beispielsweise durch Bindung an eine feste Phase mit adressierbaren Bindungspartnern.
In einer Ausführungsform werden die Konzentrationen der Nuk-Makromoleküle vorzugsweise dermassen gewählt, dass nach der Markierungsreaktion die meisten Nuk-Makromoleküle in die Zielsequenzen eingebaut sind, so dass keine zusätzliche Reinigung von markierten Nukleinsäureketten für die anschließende Bindung an die feste Phase notwendig ist.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Konzentration eines PCR-Primers höher sein, als die des anderen Primers. Dadurch kann eine gewisse Assymetrie in der Generierung der PCR-Fragmente erreicht werden: die Konzentration eines Stranges kann damit erhöhet werden.
In einer weiteren Ausführungsform können unterschiedliche Primer für die Markierungsreaktion und für die Amplifikationsreaktion in einem Ansatz kombiniert werden. Beispielsweise Primer-Paar mit höheren Tm wird für die Amplifikation verwendet und mindestens ein Primer mit geringerer Tm für die Markierungsreaktion von neu generierten PCR-Produkte. Die Tm der Primers für die Markierungsreaktion liegt beispielsweise im gleichen Bereich wie die Tm der Target-Domäne von Nuk-Makromolekülen.
In einer weiteren Ausführungsform werden multiple Zielsequenzen mittels PCR amplifiziert (19). Eine Multiplex-PCR ist einem Fachmann bekannt. Es werden beispielsweise mehrere Primer-Paare für die Vervielfältigung verwendet, so dass mehrere PCR-Fragmente entstehen. In die Reaktion werden Nuk-Makromoleküle eingesetzt, die jeweils eine spezifische Target-Domäne und eine jeweils passende spezifische Anker-Domäne einschließen. Die Target-Domänen der Nuk-Makromoleküle sind dermassen gewählt, dass sie an die entstehenden PCR-Fragmente spezifisch binden können. Die Anker-Domänen der Nuk-Makromoleküle sind zusammen mit den jeweiligen Target-Domänen spezifisch kombiniert, so dass jeweilige Anker-Domäne mit der jeweiligen Target-Domäne eines Nuk-Makromoleküls ein spezifisches Paar bildet. Beispielsweise, es wird erwartet, dass vier Zielsequenzen in einem Gemisch vorkommen können. Es wird eine Multiplex-PCR mit vier spezifischen Primer-Paaren und vier spezifischen Nuk-Makromolekülen (19) durchgeführt. Die Nuk-Makromoleküle können folgende Zusammensetzung haben: (Nuk1-Linker)-[T1; A1], (Nuk1-Linker)-[T2; A2], (Nuk1-Linker)-[T3; A3], (Nuk1-Linker)-[T4; A4] (in der Abbildung ist die Benennung des Linker ausgelassen). Die Anwesenheit von drei von vier zu erwartenden Zielsequenzen wird mittels Bindung an die feste Phase und Visualisierung erreicht. Die Bindung erfolgt an die Bindungspartner erreicht, die adressierbare Positionen an der festen Phase haben.
In einer weiteren Ausführungsform werden Nuk-Makromoleküle bei einer PCR verwendet, die eine Target-Domäne, eine Anker-Domäne und einen Antagosnisten zur Anker-Domäne einschließen (20). Die Struktur des Nuk-Makromoleküls und die zyklischen Reaktioinsbedingungen werden dermassen gewählt, dass während der Reaktion die Target-Domäne der Nuk-Makromoleküle an die Zielsequenz binden kann. Die Bedingungen der Reaktion werden so gewählt, dass die Anker-Domäne der frei in der Lösung befindlichen Nuk-Makromoleküle während der Reaktion im offenen oder blockierten Zustand vorliegen kann, bevorzugt aber im offenen Zustand. Nach dem Einbau von Nuk-Makromolekülen liegt die Anker-Domäne im offenen zustand. Dies wird beispielsweise durch die räumliche Separation der Anker-Domäne und des Antagonisten durch die hybridisierte Target-Domäne erreicht. Nach der Markierungsreaktion wird die Temperatur herabgesetzt, so dass bei nicht eingebauten Nuk-Makromolekülen der Antagonist die Anker-Domäne binden und somit blockieren kann. Die Anker-Domänen der eingebauten Nuk-Makromoleküle bleiben offen und fähig zur Bindung an die feste Phase. Dieses Gemisch wird in Kontakt mit fester Phase gebracht und unter Bedingungen inkubiert, die eine Bindung von Anker-Domänen der eingebauten Nuk-Makromoleküle an die immobilisierten. Bindungspartner zulassen. Da die Anker-Domänen der nicht eingebauten Nuk-Moleküle blockiert sind, interferrieren sie nicht mit der Bindung der markierten Zielsequenzen.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Polymerase in der PCR-Reaktion eingesetzt, die eine Strangverdrängung (engl.: „strand-displacement”) durchführen kann (21). Es werden Nuk-Makromoleküle eingesetzt, die eine Target-Domäne und eine Anker-Domäne einschließen. Während der PCR erfolgt die Bindung und Einbau von Nuk-Makromolekülen in die PCR-Fragmente der Zielsequenz. Da die Polymerase in der Lage ist, die Target-Domäne von der Zielsequenz zu verdrängen, werden weitere natürliche dNTPs eingebaut, bzw. weitere Nuk-Makromoleküle. Die markierten PCR-Fragmente können entsprechend an eine feste Phase gebunden werden. In einer solchen Reaktion kann beispielsweise eine Art Nuk-Makromoleküle eine Target-Domäne [T1] und eine Anker-Domäne [A1] und eine andere Art der Nuk-Makromoleküle eine andere Target-Domäne [T2] und eine Signal-Domäne [S1] einschließen. Durch den Einbau beider Arten von Nuk-Makromoleküle werden PCR-Fragmente spezifisch mit einer Signal- und eine Anker-Domäne markiert.
In einer solchen Reaktion können auch andere Kompontenten, z. B. markierte Primer, Hybridisierungssonden, markierte Nukleotide eingesetzt werden, wie in anderen Abschnitten beschriben. Es können eine oder mehrere Arten von Nuk-Makromolekülen an einer solchen Reaktion teilnehmen, wie in anderen Abschnitten beschriben. Es können einzelne oder mehrere Zielsequenzen amplifiziert und markiert werden. Die Detektion der Zielsequenz kann durch die Bindung an die feste Phase mit einer anschließenden Nachweisreaktion erfolgen, wie in anderen Abschnitten beschriben.
Nachweis einer spezifischen Zielsequenz in einem Material
Bei einem Testverfahren, bei dem ein Nachweis einer oder mehrerer spezifischen Sequenzen aus einem Organismus in einem Untersuchungsmateial im Vordergrund steht, ist es üblich, dass interne Kontrollen, z. B. Amplifikationskontrollen, Bindungs- und Detektionskontrollen mitgeführt werden. Viele Beispiele für diagnostische Tests sind einem Fachmann bekannt. Die Strukturen der Nuk-Makromoleküle werden beispielsweise auf die Zielsequenzen der gesuchten Organismen, sowie auf die der Kontrollsequenzen nach Regeln angepasst, wie in anderen Abschnitten I beschrieben. Es wird eine Markierungsreaktion durchgeführt, wie oben beschrieben. Eine solche Markierungsreaktion schließt beispielweise mehrere Nuk-Maromoleküle mit Target-Domänen, die zu testenden Zielsequenzen komplementär sind. Die Zielsequenzen können mit verschiedenen Techniken vervielfältigt werden, beispielsweise mit einer Multiplex-PCR. In einer weiteren Ausführngsform schließt eine solche Reaktion entsprechend mehrere zielsequenzspezifische Primer oder Primer-Paare, die eine Vervielfältigung der gesuchten Zielsequenzen ermöglichen. Nach der Amplifikation und Markierungsreaktion erfolgt die Detektion der markierten Zielsequenzen. Falls im Material eine Zielsequenz vorhanden war, wird sie über spezifische Markierung mit Nuk-Makromolekülen detektiert. In einer Ausführungsform wird die Stärke des generierten Signals gemessen. Durch Korrelation dieser Stärke zu internen Kontrollen lassen sich Schlußfolgerungen auf die Menge der im Ausgangsmaterial vorliegenden Zielsequenzen ziehen. Die einzelnen Reagenzien werden vorzugsweise in vorgemischter Form bereitgestellt, so dass lediglich die Zugabe des Materials zum Reaktionsstart notwendig ist. Die bereitgestellten Reagenzien werden vorzugsweise als ein Kit bereitgestellt.
Beispiele für Nachweis von Sequenzvarianten in einer spezifischen Zielsequenz (Unterscheidung von verwandten Zielsequenzen, z. B. SNP-Nachweis
Es müssen Sequenzvarianten einer Zielsequenz differenziert werden, die sich durch ein bzw. wenige Nukleotide unterscheiden. Ein Assay dafür kann in unterschiedlicher Weise konstruiert werden.
In einer Ausführungsform kann die Differenzierung durch einen Primer erfogen: es werden Primer in der Raktion verwendet, die nur bei einer bestimmten Sequenzvariante die Extension zulassen. Beispielsweise hat ein Primer ein diskriminierendes Nuklotid am 3'-Ende, das nur eine Variante der Sequenz bindet. Eine andere Variante der Sequenz würde ein Miss-Match bilden, und somit sehr schlecht oder gar nicht verlängert werden können. Die Nuk-Makromoleküle können dabei zur Bindung an die feste Phase (d. h. Nuk-Makromoleküle schließen mindestens eine Anker-Domäne ein) oder zum Nachweis (d. h. Nuk-Makromoleküle schließen mindestens eine Signal-Domäne ein) verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt eine sequenzspezifische bzw. sequenzselektive Amplifikation mit selektiven Primern, beispielsweise mittels einer PCR-Reaktion. Die Nuk-Makromoleküle können dabei zur Bindung an die feste Phase (d. h. Nuk-Makromoleküle schließen mindestens eine Anker-Domäne ein) oder zum Nachweis (d. h. Nuk-Makromoleküle schließen mindestens eine Signal-Domäne ein) verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Differenzierung durch die Target-Domäne der Nuk-Makromoleküle erfolgen. Dabei können mehrere Nuk-Makromoleküle verwendet werden, deren Target-Domänen den unterschiedlichen Varianten der Zielsequenz komplementär sind (16). Da die Bindung der perfekt komplementären Target-Domäne bevorzugt wird, werden solche Nuk-Makromoleküle bevorzugt in den wachsenden Strang eingebaut. Die Target-Domäne werden innerhalb einer Art von Nuk-Makromoleküle beispielswiese als Kombinationen aus mindestens einer Target-Domäne und einer Anker-Domäne, oder mindestens einer Target-Domäne und einer Signal-Domäne, oder einer Target-Domäne und einer Anker-Domäne und einer Signal-Domäne verwendet.
Durch Bindung an die feste Phase und eine Nachweisreaktion kann eine entsprechende Variante der Zielsequenz identifiziert werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Differenzierung durch den Einbau einer Nuk-Kompontente eines Nuk-Makromoleküls erfolgen. Dabei wird die Nuk-Komponente mit einer spezifischen Anker-Domäne (17) oder Signal-Domäne kombiniert, die nach einer Bindung an die feste Phase eine spezifische Zuordnung der eingebauten Nuk-Kompontente ermöglicht. Beispielseise wird dATP mit Anker-Domäne 1, dCTP mit Anker-Domäne 2, dGTP mit Anker-Domäne 3, dUTP mit Anker-Domäne 4 kombiniert. In einer Ausführungsform schließen die verwendeten Nuk-Makromoleküle nur eine Anker-Domäne ein. In einer anderen Ausführungsform schließen sie mindestens eine Target-Domäne und eine Anker-Domäne ein. Die Signal-Domäne kann am verwendeten Primer gebunden sein. Nach einer Markierungsreaktion erfolgt eine Bindung an die feste Phase mit adressierbaren Bindungspartnern. Durch bekannte Kodierung der Nuk-Komponente mittels Anker-Domäne/Bindungspartner an der festen Phase, kann die Art der Nuk-Komponente bestimmt werden.
Auch Kombinationen aus einzelnen Verfahren sind möglich.
In einer vorteilhanften Ausführungsform schließen die Nuk-Makromoleküle mindestens eine Target-Domäne und mindestens eine Anker-Domäne ein. Die Detektion erfolgt durch den Einsatz von Nuk-Makromolekülen mit Signal-Domänen oder modifizierten Primern mit Signal-Domänen, oder Hybridisierungssonden mit Signal-Domänen oder konventionell markierten Nukleotiden. In einer weiteren vorteilhanften Ausführungsform schließen die Nuk-Makromoleküle mindestens eine Target-Domäne und mindestens eine Signal-Domäne ein. Die Bindung an die feste Phase erfolgt durch den Einsatz von Nuk-Makromolekülen mit Anker-Domänen oder modifizierten Primern mit Anker-Domänen, oder Hybridisierungssonden mit Anker-Domänen, oder durch direkte Hybridisierung von markierten Zielsequenzen an die auf der festen Phase immobilisierten, komplementären Nukleinsäurestränge.
Inkubation von markierten Nukleinsäureketten mit der festen Phase führt zu Bindung von Anker-Domänen an die auf der festen Phase fixierten Bindungspartner. Dadurch. werden auch die markierten Zielsequenzen bzw. deren Äquivalente an der festen Phase fixiert. Nach einer Nachweisreaktion kann eine optische Zurdnung der gebundenen Nukleinsäureketten zu den jeweiligen Positionen der Bindungspartner vorgenommen werden. Dadurch ist ein Rückschluß auf Vorliegen von bestimmten Zielsequenzen im Reaktionsansatz möglich.
Die Bindung der Nukleinsäureketten an die feste Phase kann dabei direkt über komplementäre, immobilisierte Nukleinsäuerekette oder indirekt, vermittelt über eine Anker-Domäne erfolgen. In einer solchen Reaktion können auch andere Kompontenten, z. B. markierte Primer, Hybridisierungssonden, markierte Nukleotide eingesetzt werden, wie in anderen Abschnitten beschriben. Es können eine oder mehrere Arten von Nuk-Makromolekülen an einer solchen Reaktion teilnehmen, wie in anderen Abschnitten beschriben. Es können einzelne oder mehrere Zielsequenzen amplifiziert und markiert werden. Die Detektion der Zielsequenz kann durch die Bindung an die feste Phase mit einer anschließenden Nachweisreaktion erfolgen, wie in anderen Abschnitten beschriben.
1.5.12 Zusammensetzung von Kit für Markierung und/oder Amplifikation von Nukleinsäuren.
Generell, ein oder mehrere Kits schließen Komponenten (z. B. Einzelsubstanzen, wie Nuk-Makromoleküle, Polymerase, dNTPs und Primer, oder deren Kompositionen, Reaktionsgemische, feste Phase) ein, die für die Durchführung von enzymatischen Einbaureaktionen mit erfindungsgemäßen Nuk-Makromolekülen notwendig sind und eine gegebenenfalls anschließende Analyse. Die Zusammensetzung der Kits kann nach Anwendung variieren, wobei die Anwendugen können von einfacher Primer-Extensionsreaktion bis zu Amplifikation mit Markiertung, sowie einer anschließenden Analyse mittels fester Phase reichen.
Die Kits können wahlweise positive und/oder negative Kontrollen einschließen, Anleitungen zur Durchführung von Verfahren.
Optional können Kits Materialien und Reagentien zur Vorbereitung von Bestandteilen des Kits zur biochemischen Reaktionen oder des genetischen Materials einschließen, z. B. Komponenten für Zielsequenz-Präparation. Auch Vorrichtungegen für eine Reinigung von markierten Nukleinsäureketten von überschüssigen Nuk-Makromolekülen können Bestandteile von Kits sein.
Die Kit-Komponenten sind üblicherweise in handelsüblichen Reaktionsgefäßen bereitgestellt, wobei das Volumen der Gefäße zwischen 0,2 ml und 1 l variieren kann. Es können auch Gefäßarrays, z. B. Mikrotiter-Platten mit Komponenten beladen sein, was eine automatische Zufuhr von Reagentien unterstützt.
Ein Kit zur Markierung von Nukleinsäureketten (Zielsequenzen) kann wahlweise mehrere in der Beschreibung offenbarte Komponenten zur Ausführung der Erfindung einschließen.
Einige Beispiele sind nachfolgend nochmals aufgefürt:

• Vorrichtung und Lösungen zur Isolierung von Zielsequenzen aus einem biologischen Material
• Eine oder mehrere Vorrichtungen zur Handhabung der Lösungen
• Ein oder mehrere Primer zur Amplifikation und Markierung von Zielsequenzen. Diese Primer können wahlweise mindestens eine Anker-Domäne und oder eine Signal-Domäne einschließen.
• Eine oder mehrere DNA Polymerasen oder RNA-Polymerasen oder reverse Transcriptasen. Beispielsweise Klenow Fragment Polymerase, Klenow exo minus Fragment, phi29 DNA Polymerase, T7 DNA Polymerase, Sequenase 2^TM, Taq Polymerase, Vent^TM Polymerase, Deep Vent^TM Polymerase, Vent^TM exo minus DNA Polymerase, Deep Vent^TM exo minus DNA Polymerase, Pwo DNA Polymerase, Tli DNA Polymerase, Tth DNA Polymerase, so genannte Hot-Start-Polymerasen, T7 RNA Polymerase, T4 RNA Polymerase, reverse Transcriptasen, z. B. Moloney Murine Lekemia Virus (M-MLV), Rous Sarcoma Virus (RSV), Avian Myeloblastosis Virus (AMV), Rous Assocciated Virus (RAV), Myeloblastosis Assocciated Virus (MAV), Human Immunodeficiency Virus (HIV). Die Polymerasen werden vorzugsweise in einer Aufbewahrungslösung bereitgestellt, Diese Aufbewahrungslösung kann beispielsweise folgende Substanzen einschließen:
– Puffer Tris-HCl, HEPES, Borat, Phosphat, Acetat (Konzentration liegen beispielsweise zwischen 10 mM und 200 mM)
– Salze, z. B. NaCl, KCl, NH4Cl, die Konzentrationen liegen beispielsweise zwischen 10 mM und 500 mM.
– PEG oder anderes inertes Polymer, z. B. Mowiol in Konzentration von 1 bis 50% (w/v)
– Glycerin in Konzentration zwischen 1% und 70%
– Reduzierende Agentien, z. B. DTT in Konzentration zwischen 0,1 und 50 mM
– Weitere Substanzen können in einer Aufbewahrungslösung enthalten sein, die zur Stabilität des Enzyms beitragen. Bespiele für solche Substanzen sind bekannt, siehe Beschriebung von Produkten von Enzym-Herstellern, z. B. Promega, Invitrogen, Roche usw.
• Eine oder mehrere Arten von Nuk-Makromolekülen (Nukleotid-Analoga), die als Säure oder als Salze vorliegen können (beispielsweise Natrium, Kalium, Ammonium oder Litium können als Ionen verwendet werden). Die Nuk-Makromoleküle können beispielsweise in trockender Form oder in Form einer Lösung bereitgestellt werden, z. B. im Wasser oder in einem Puffer, z. B. Tris-HCl, HEPES, Borat, Phosphat, Acetat, oder in einer Aufbewahrungslösung, die folgende Komponenten einzeln oder in Kombination einschließen kann:
– Puffer Tris-HCl, HEPES, Borat, Phosphat, Acetat (in Konzentration die beispielsweise zwischen 10 mM und 200 mM liegt)
– Salze, z. B. NaCl, KCl, NH4Cl, MgCl2,
– PEG oder anderes inertes Polymer, z. B. Mowiol in Konzentration von 1 bis 20% (w/v)
– Glycerin in Konzentration zwischen 1% und 50%
– Marker oder Marker-Einheiten von modifizierten Nuk-Makromolekülen, insbesondere in den Ausführungsformen, in denen zwischen Linker und Marker oder Marker und Kore-Komponente affine Kopplung besteht.
– DMSO
• Ein oder mehrere Reaktions-Puffer zur Durchführung von Amplifikation und/oder Markierungsreaktion und/oder Bindung an die feste Phase und/oder Detektion der Bindungsereignisse an der festen Phase
• Ein oder mehrere Sets von natürlichen Nukeltiden oder deren Analoga (z. B. dATP, dGTP, dCTP, dTTP, dUTP, dITP oder ATP, CTP, GTP, UTP)
• Ein oder mehrere Sets von Terminatoren (z. B. ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP, ddUTP)
• Ein oder mehrere Arten von konventionell markierten Nukleotiden, z. B.
Fluoreszenzmarkierte oder Biotin-markierte dUTP- oder dCTP-Analoga
• Eine oder mehrere zielsequenz-spezifische Hybridisierunssonden mit einer Anker-Domäne oder einer Signal-Domäne
• Weitere Enzyme, die Amplifikationsverfahren oder Markierungsverfahren unterstützen, Proteine und Cofaktoren, z. B. Helicase und ATP, Single Strand Binding Protein
• Ein oder mehrere Reaktionsgefäße zur Durchführung einzelner Reaktionen
• Feste Phase zur Bindung von markierten Zielsequenzen, z. B. ein Lateral-Flow-Device oder ein Array. Eine solche feste Phase kann beispielsweise Bindungspartner für Anker-Domänen der Nuk-Makromoleküle oder der Primer oder der Hybridisierungssonden einschließen. Eine solche feste Phase kann auch Oligonukleotide einschließen, die an die Zielsequenz binden können.
• Ein oder mehrere Reagenzien (z. B. Enzyme und chromogene Substrate oder Nanoteilchen) zur Detektion der Bindungsereignisse der markierten Zielsequenzen an der festen Phase
• Gegebenfalls Kontroll-Sequenzen zur Überprüfung der Durchführung einzelner Verfahrensschritte
• Eine Anleitung zur Durchführung und Auswertung von Reaktionen

1.5.13 Hinweise für die Synthesen von Nuk-Makromolekülen
Die erfindungsgemäßen Nuk-Makromoleküle können auf unterschiedliche Art und Weise synthetisiert werden. Einige Beispiele für die Synthesen von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten sind in Anmeldung Cherkasov et al WO2011050938 angegeben. Synthesen von Nuk-Makromolekülen allgemein sind in folgenden Anmeldungen beschrieben Cherkasov et al WO2005044836 und Cherkasov et al WO2006097320 . Nuk-Makromoleküle werden von der Firma Genovoxx GmbH als Auftragssynthese entwickelt und vermarktet.
1.5.14 Beispiele von Synthesen von Nuk-Makromolekülen
Nachfolgend sind Synthesen von Nuk-Makromolekülen beschrieben, bei den die Target-Domäne aus DNA besteht. Es sind viele Methoden für die kovalente Kopplung an die DNA bekannt. Die Kopplung kann an verschiedene Positionen in der Nukleinsäurekette (5'-Position, 3'-Position, innere Abschnitte) erfolgen. Mehrere Markierungen pro eine sind ebenfalls möglich. Die Modifikation kann durch chemische oder auch enzymatische Reaktionen erfolgen. Einerseits, kann kann die Kopplung einer Substanz bereits während der chemischen/enzymatischen Synthese von Nukleinsäuren durchgeführt werden (z. B. durch Nutzung von Phosphoroamiditen oder durch Nutzung modifizierter Nukleotide und einer Polymerase oder durch Nutzung von Ligase-Reaktion). Andererseits, kann die Kopplung über einen oder mehrere Zwischenschritte, z. B. durch Einführung einer reaktiven Gruppe, erst nach der Synthese erfolgen.
Nachfolgend werden einige Beispiele vorgestellt, die zur Demonstrationszwecken einige dieser Varianten beschreiben.
Synthese von Nuk-Linker-Komponenten mit reaktiven Gruppen.
Die Kopplung von Nuk-Komponenten und Marker-Komponenten, z. B. Oligonukleotiden, kann durch viele Methoden erreicht werden. Beispielsweise, sind viele Methoden bekannt, wie man zwei Strukturen, die reaktive Amino-Gruppen vorweisen, mittels eines Cross-Linkers koppelt. Mit einer oder mehreren Amino-Gruppen modifizierte Oligonukleotide können kommerziell erworben werden. Die Amino-Gruppe kann wahlweise am 5'-Ende, 3'-End, oder auch im internen Bereich eines Oligonukleotides vorkommen. In folgenden Beispielen sind amino-reaktive Nuk-Komponenten beschrieben, die als Vorstufen bereitgestellt werden. Solche amino-reaktive Nukleotide können an die Oligonukleotide gekoppelt werden.
1.5.14.1 Synthese von dUTP-PEG(8)-NH2
5 mg dUTP-AA (Aminoallyl-dUTP, von Jena Biosciences) wurde in Phosphat-Puffer, pH 8.0, gelöst bis zur Konzentration von 50 mmol/l. Fmoc-PEG(8)-NHS (erhalten von Iris-Biotech GmbH) wurde in DMSO bis zur Konzentration von 100 mmol/l gelöst. Die Lösung mit Fmoc-PEG(8)-NHS (ca. 8 Äquivalente) wurde zur Lösung von dUTP-AA zugegeben, bis dUTP-AA komplett umgesetz wurde (DC-Kontrolle), die Kopplung erfolgt an der Aminogruppe des Linkers. Die Aufreinigung von dUTP-PEG(8)-Fmoc erfolgte über DEAE-HPLC in einem Tris-HCl Puffer und NaCl-Gradient. Die Fraktionen mit Produkt wurden gesammelt und über RPC-18 Säule mit Wasser-Ethanol-Gradient weiter gereinigt. Das Eluat mit dUTP-PEG(8)-Fmoc wurde einrotiert, getrocknet und in wasserfreiem DMF gelöst. Zur Lösung von mit dUTP-PEG(8)-Fmoc in DMF wurde Pipiridin bis zur Konzentration von 1% zugegeben. Das Produkt, dUTP-PEG(8)-NH2 wurde präzipitiert und getrocknet.
Auch dUTP-PEG3400-NH2 und dUTP-PEG5000-NH2 wurden in ähnlicherweise erhalten, wobei Fmoc-PEG-3400-NHS und Fmoc-PEG-5000-NHS (erhalten von Iris-Biotech GmbH) verwendet wurden. Materialien und Methoden siehe Cherkasov et al. WO 2005 044836 .
An die Amino-Gruppe am Linker können nun weitere reaktive Gruppe gekoppelt werden. Zur Herstellung eines Amino-Reaktiven-Derivates können nun verschiedene Cross-Linker verwendet werden. Einem Fachmann sind viele Beispiele von Cross-Linkern bekannt.
1.5.14.2 Synthese von dUTP-PEG(8)-NHS
Eine Lösung von dUTP-PEG(8)-NH2 (5 mmol/l) in DMF wird mit einem Überschuß von Glutarat-(NHS)2 (gelöst in DMF) versetzt. Das Produkt, dUTP-PEG(8)-NHS, wurde präzipitiert, mit DMF gewaschen und getrocknet. Die Aminogruppe am Linker wird modifiziert. In ähnlicher Weise wurden dUTP-PEG(3400)-NHS, dUTP-PEG(5000)-NHS erhalten. Phenyl-di-Isothiocyanate kann in einer anderen Ausführungsform dieses Beispiels anstatt von Glutarat-(NHS)2 verwendet werden, wobei dUTP-(PEG)8-ITC oder dUTP-PEG(3400)-ITC resultierten, entsprechend.
Ein Fachmann erkennt, dass auch weitere Cross-Linker mit anderen Funktionalitäten, wie z. B. andere Linker-Längen, andre amino-reaktive Gruppen können verwerdet werden. Ebenso können weitere Funktionalitäten, wie Spaltbarkeit des Linkers durch entsprechende Wahl des Cross-Linkers eingeführt werden, z. B. bei Verwendung von reduktiv oder oxidativ spaltbaren Linkern (z. B. Dithiobispropionsäure-(NHS)2 (DTBP), Tartrate-(NHS)2). Viele Cross-Linker sind kommerziell erhältlich, z. B. von Thermo Scientific oder Sigma-Aldrich oder IRIS GmbH.
1.5.14.3 (A) Synthese von dUTP-Glutarat-NHS und dUTP-PEG(5)-NHS und dUTP-PEG(9)-NHS
5 mg dUTP-AA (Aminoallyl-dUTP, von Trilink Biotechnologies), pH 7.0 wurden getrocknet und im trockenen DMSO bis zur berechneten Konzentration von 50 mmol/l suspendiert. Glutarat-(NHS)2 (erhalten von Thermo Scientific Deutschland) wurde in DMSO bis zur Konzentration von 300 mmol/l gelöst. Die dUTP-AA Suspension wurde zur Glutarat-(NHS)2 Lösung zugegeben und 2 h bei 37°C unter kräftigem Rühren inkubiert, bis die Lösung durchsichtig wurde. Die Umsetzung von dUTP-AA wurde mittels DC-Kontrolle kontrolliert. Die Aufreinigung von dUTP-Glutarat-NHS erfolgte mittels Präzipitation durch Diethyläther/DMF-Gemisches (v:v 90:10). Das Pellet enthält das Produkt. Das Produkt wurde in DMSO gelöst und eingefroren.
In änlicher Art und Weise können weitere dUTP-R-X Analoga synthetisiert werden, wobei (R) einen beliebigen Linker und (X) eine beliebige reaktive Gruppe darstellen kann. Die reaktive Gruppe kann beispielsweise mit Amino-Gruppen oder Thio-Gruppen oder Carboxy-Gruppen reagieren. Beispiele für weitere käuflich erhältliche kurze Linker (Cross-Linker) sind im Cross-Linker Guide von Thermo Scientific (www.piercenet.com) präsentiert.
dUTP-PEG(5)-NHS und dUTP-PEG(9)-NHS wurden analog zu dUTP-Glutarat-NHS synthetisiert und gereinigt. Diese Analoga enthalten eine PEG-Linker mit 5 oder 9 PEG-monomeren (Crosslinker wurden von Thermo Scientific erworben: BS(PEG)5 oder BS(PEG)9).
Linker können auch eine spaltbare Verbindung einschließen, z. B. eine reduktiv spaltbare Bindung (z. B. Dithiobispropionsäure-(NHS)2) oder eine oxidativ spaltbare Bindung (z. B. Tartrat-(NHS)2).
Auch andere Nukleotidanaloga (z. B. N-(6-Aminohexyl)-dCTP (erhältlich von AmpliChem), N6 (6-Amino)hehyl-dATP, 5-Propargylamino-dCTP, 7-Propargylamino-7-deaza dATP, 7-Propargylamino-7-deaza dGTP, erhältlich von Jena Biosience) können in ähnlicher Weise modifiziert werden.
NHS-Gruppe am Linker kann nun an Amino-Gruppe eines anderen Moleküls, z. B. eines Oligonukleotids gekoppelt werden.
1.5.14.3 (B) Synthese von ddUTP-PEG(9)-NHS und ddUTP-PEG(5)-NHS
1 mg ddUTP-PA (5-Propargylamino-ddUTP, von Jena Bioscience, Deutschland), wurden im trockenen DMSO aufgelöst (3 mmol/l). PEG(9)-(NHS)2 (Thermo Scientific Deutschland) wurde im trockenen DMSO gelöst (100 mmol/l). Die Lösung mit ddUTP-PA wurde zur Lösung mit PEG(9)-(NHS)2 zugegeben und 12 h bei RT inkubiert. Die Umsetzung von ddUTP-PA wurde mittels DC-Kontrolle kontrolliert. Die Aufreinigung von ddUTP-PEG(9)-NHS erfolgte mittels Präzipitation im Diethyläther/DMF-Gemisches (v/v 90:10). Das Pellet enthält das Produkt. Das Produkt wurde in DMSO gelöst und eingefroren.
ddUTP-PEG(5)-NHS wurde in analoger Weise synthetisiert.
In änlicher Art und Weise können beispielsweise weitere ddNTP-R-X Analoga synthetisiert werden, wobei (R) einen Linker und (X) eine reaktive Gruppe darstellen kann. Der Linker kann beispielsweise an der Nukleobase oder am Zucker-Rest des Nukleotid gekopplt sein. Die reaktive Gruppe kann beispielsweise mit Amino-Gruppen oder Thio-Gruppen oder Carboxy-Gruppen reagieren. Beispiele für weitere käuflich erhältliche kurze Linker (Cross-Linker) sind im Cross-Linker Guide von Thermo Scientific (www.piercenet.com) präsentiert. Solche Cross-Linker können auch eine spaltbare Verbindung einschließen, z. B. eine reduktiv spaltbare Bindung (z. B. Dithiobispropionsäure-(NHS)2) oder eine oxidativ spaltbare Bindung (z. B. Tartrat(NHS)2).
NHS-Gruppe am Linker kann nun an Amino-Gruppe eines anderen Moleküls, z. B. eines Oligonukleotids gekoppelt werden.
Kopplung von amino-reaktiven Nuc-Komponenten an das Oligonukleotid.
Eine solche Kopplung ist einem Fachmann bekannt: Oligonukleotide mit einer oder mehreren Aminogruppen werden mit einem Überschuß von amino-reaktiven Komponenten, z. B. mit NHS-Derivaten oder Isothiocyanat-Derivaten in einer Lösung zusammengebracht. Die Aufreinigung des modifizierten Oligonukleotides kann beispielsweise mittels HPCL (DEAE und RP) erfolgen und ist ebenfalls einem Fachmann bekannt. Nachfolgend werden einige Beispiele der Herstellung von Nuk-Makromolekülen beschrieben, die eine Nuk-Komponente, einen Linker und ein Oligonukleotid enthalten. Alle Oligonukleotide wurden von MWG-Operon Deutschland synthetisiert.
1.5.14.4 (A): dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA
Dieses Beispiel zeigt die Kopplung von Nuc-Komponente am 5'-Ende eines sequenzspezifischen Oligonukleotides mit einer Target-Domäne und einer Anker-Domäne. Das Oligonukleotid, Target-Domäne-1, Anker-Domäne 1-TAMRA, abgekürzt als [T1, A1]-TAMRA, wurden von MWG synthetisiert (siehe Liste der Sequenzen):
Diese Sequenz enthält eine Target-Sequenz: cgtattaccgcggctgctggcac und eine Anker-Sequenz AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA. Am 5'-Ende enthält dieses Oligonukleotid eine Amino-Gruppe, die über einen Spacer-C6 gekoppelt ist. Am 3'-Ende ist TAMRA-Reporter als Fluoreszenz-Marker gekoppelt.
Das Oligonukleotid wurde in einem Phosphat-Puffer, pH 8.0, gelöst. Zu dieser Lösung wurde Überschuß von dUTP-PEG(8)-NHS (5 mmol/l, in DMF) zugegeben. Die Reaktion verlief bei RT in guten Ausbeuten. Die anschließende Reinigung des Produktes erfolgte über DEAE-Säule und RP-C18 Säule. Das Produkt (dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA) wurde getrocknet und anschließend in Wasser in 50 μmol/l Konzentrationen gelöst und eingefroren.
In ählicher Art und Weise wurden auch andere Nuk-Makromoleküle synthetisiert (Tabelle 1).
1.5.14.4 (B): ddUTP-PEG(9)-[T4, S4] (terminierendes Nukleotid-Konjugat)
Dieses Beispiel zeigt Synthese eines sequenzspezifisch terminiereden Nuk-Makromoleküls.
Die Nuk-Komponente wird am 5'-Ende eines sequenzspezifischen Oligonukleotides mit einer Target-Domäne gekoppelt. Das Oligonukleotid besteht aus einer Target-Domäne-4 (Sequenz: cgt att acc gcg gct gct gg cac) und einem Spacer dA(10). Am 5'-Ende ist eine NH2-Gruppe über C6-Linker gekoppelt und am 3'-Ende ist ein Farbstoff (Fluorescein) gekoppelt (siehe Liste der Sequenzen):
Das Oligonukleotid wurde in einem Phosphat-Puffer, pH 8.0, gelöst (1 mmol/l). Zu dieser Lösung wurde 5× Überschuß von ddUTP-PEG(9)-NHS gelöst in DMSO zugegeben. Die Reaktion verlief bei RT in guten Ausbeuten. Die anschließende Reinigung des Produktes erfolgte über DEAE-Säule und RP-C18 Säule. Das Produkt (ddUTP-PEG(9)-[T4; S4] wurde getrocknet und anschließend in Wasser in 50 μmol/l Konzentrationen gelöst und eingefroren.
In ählicher Art und Weise können auch andere sequenzspezifisch terminierende Nuk-Makromoleküle synthetisiert werden. Anstatt von ddUTP können andere terminierende Nukleotide eingesetzt werden. Beispielsweise 3'-OH gruppe kann durch Amino oder Azid-Gruppe oder andere zur Termination führende Gruppen ersetzt werden. Beispiele dafür sind einem Fachmann bekannt. Es können auch reversibel terminierende Gruppen eingesetzt werden. Die Kopplung der Nuk-Komponenten kann am 5'-Ende des Oligonukleotids oder an einem internen Position erfolgen oder am 3'-Ende.
1.5.14.5: dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA
Synthese von Nuk-Makromoleküls mit „Click-Chemie”. (Komponenten erhalten von BaseClick GmbH, Deutschland). Dieses Beispiel zeigt die Kopplung von Nuc-Komponente am 5'-Ende eines sequenzspezifischen Oligonukleotides mit einer Anker-Funktionalität am 3'Ende. Das Oligonukleotid [T1, A1]-TAMRA, Sequenz siehe Beispiel 1.5.14.4 und in der Liste der Sequenzen.
Das Oligonukleotid wurde in einem Phosphat-Puffer, pH 8.0, gelöst. Zu dieser Lösung wurde Überschuß von NHS-PEG4-N3 (10 mmol/l, in DMSO, erworbein bei BaseClick GmbH, Germany) zugegeben. Die Reaktion verlief bei RT in guten Ausbeuten. Die anschließende Reinigung des Produktes erfolgte über DEAE-Säule und RP-C18 Säule.
Das Produkt wurde getrocknet und anschließend in Wasser in 1 mmol/l Konzentrationen gelöst. Das Oligonukleotid trägt nun eine Azid-Gruppe, die über einen kurzen PEG-Linker gekoppelt ist N3-PEG4-Oligonukleotid.
Nun erfolgt die Kopplung der Nuk-Komponente:
5 μl dU-Alkyne-C8 (10 mmol/l erworbein bei BaseClick GmbH, Germany) in Wasser gelöst wurde zu 5 μl 1 mmol/l N3-PEG4-Oligonukleotid zugegeben und anschließend 10 μl DMSO/t-Butanol dazu gegeben. Anschließend wurden 6 μl frisch vorbereiteten Click-Lösung (1 V 0.1 M CuBr in DMSO/t-Butanol und 2 V 0.1 M TBTA in DMSO/t-Butanol) zugegeben. Die Reaktion verlief 24 hr bei RT. Die anschließende Reinigung des Produktes erfolgte über DEAE und RP-C18. Das Produkt wurde getrocknet und anschließend in Wasser in 100 μmol/l Konzentrationen gelöst. Das Produkt (dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA) enthält eine Nuk-Koomponente, die über einen kurzen Linker an das Oligonukleotid gekoppelt ist.
Eine Azid-Funktionalität oder Alkyne-Funktionalität kann an verschiedenen Stellen in einem Nukleotid (z. B. an der Base oder am Zucker) oder einem Oligonukleotid (z. B. in der Mitte oder am 3'-Ende oder am 5'-Ende) eingeführt werden,. Auch mehrere Funktionalitäten können eingefügt werden. Durch die Kopplung einer entsprechenden Nuk-Komponente können Nuk-Makromoleküle mit einer oder mehreren Nuk-Komponenten erhalten werden.
Beispiele für die Kopplung von Nukleinsäuremolekülen mittels Click-Chemie sind in folgender Literatur angegeben:
A. H. El-Sagheer, T. Brown, Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 1388–1405. Click Chemistry with DNA.
J. Lahann, Wiley VCH 2009. Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science.
F. Morvan, A. Meyer, G. Pourceau, S. Vidal, Y. Chevolot, E. Souteyrand, J.-J. Vasseur Nucleic Acids Symposium Series 2008, 52, 47–48. Click Chemistry and Oligonucleotides: How a simple reaction can do so much.
1.5.14.6 Synthese von dUTP-PEG(5)-(T5-MB; S5] und dUTP-PEG(9)-(T5-MB; S5] mit einer Target-Domäne vom Typ „Molecular Beacon”
Es wurde ein modifiziertes Oligonukleotid synthetisiert (Eurofin MWG, Deutschland), bei dem ein Sequenzabschnitt zu einer Zielsequenz (M2) komplementär ist (Target-Domäne-Sequenz). An diesen Abschnitt grenzt ein weiterer Sequenzabschnitt, der zu einem Teil dieser Target-Domäne komplementär ist. Eine solche Struktur kann in Lösung vollständig oder teilweise als doppelsträngiges Oligonukleotid vorliegen, genannt auch „Molecular Beacon”. Einem Fachmann ist bekannt, dass solche strukturierte Oligonukleotide eine bessere Diskriminierung der Sequenzen ermöglichen können.
Als Nuk-Komponente mit einem Linker wurden dUTP-PEG(5)-NHS und dUTP-PEG(9)-NHS verwendet (Synthese sieht oben). Das Oligonukleotid hat folgende Struktur:
Das Oligonukleotid wurde in einer Phosphat-Puffer-Lösung, pH 8, aufgelöst und zu dUTP-PEG(5)-NHS bzw. dUTP-PEG(9)-NHS zugegeben. Die Reaktion läuft an NH2-Gruppe am 5'-Ende in guten Ausbeuten ab. Die Reinigung des Produktes erfolgte über DEAE-Säule und RP-18-Säule.
In ähnlicher Weise wurden auch andere Nuk-Makromoleküle mit Target-Domäne-Oligonukleotiden vom Typ „molecular beacon” synthetisiert.
1.5.14.7 Synthese von dUTP-PEG(9)-[T4; aT1; S4] mit einer Target-Domäne und einem zur Target-Domäne komplementären Oligonukleotid (Antagonist)
Zunächst wurde dUTP-PEG(9)-[T4; S4] synthetisiert. Es wurden dUTP-PEG(9)-NHS und ein Oligonukleotid mit der folgenden Struktur verwendet:
[T4]-FAM oder [T4, S4]: Target-Domäne-4, Spacer, Fluorescein, 5'NH2-cgt att acc gcg gct gct gg cac AAAAAAAAAA FAM
Es wurden ähnliche Synthesebedingungen verwendet, wie in anderen Beispielen der Kopplung eines Nukleotid-Linker-NHS an eine endständige Aminogruppe eines Oligonukleotids. Nach der Reinigung mit DEAE und RP-18 wurde dUTP-PEG(9)-[T4; S4] in einer Puffer-Lösung (Einbaupuffer 1) aufgelöst. Zu dieser Lösung wurde ein Äquivalent eines komplementären Oligonukleotids mit der folgenden Struktur gegeben:
Dieses Oligonukleotid kann an die Sequenz der Target-Domäne komplementär binden und blockiert somit einen Teil der Target-Sequenz am 5'-Ende der Target-Domäne (hier unterstrichen)
Die Lösung mit dUTP-PEG(9)-[T4; S4] und Antagonisten-Oligonukleotid [aT1] wurde auf 90°C für 1 min erhitzt und dann auf RT abgekühlt. Durch die Abkühlung bindet das komplementäre Antagonisten-Oligonukleotid an die entsprechende Position des Target-Domäne-Oligonukleotid, es resultiert dUTP-PEG(9)-(T4; aT1; S4]. Die Target-Domäne des Nuk-Makromoleküls hat nun einen einzelsträngigen als auch einen doppelsträngigen Abschnitt. Das Antagonisten-Oligonukleotid kann beispielsweise durch höhere Temperatur von der Target-Domäne abgelöst werden. Die Tm des Antagonisten-Oligonukleotids (62°C) ist geringer als die Tm der gesamten Target-Domäne (73°C) (gemessen im Einbaupuffer 1).
In ähnlicher Weise wurden auch andere Nuk-Makromoleküle mit Antagonisten der Target-Domäne-Oligonukleotiden synthetisiert.
Beispiele von synthetisierten Nuk-Makromolekülen

Tabelle 1

Name des makro-Nukleotides (Konjugat)	Nuk-Komponente	Position der Nuk-Komponente	Linker-Komponente	Target-Domäne [Tn]	Anker-Domäne [An]
dU-P4-[T1, A1]	dU	5'-Ende	PEG 4	Target-Domäne 1	Anker-Domäne 1
dU-P8-[T1, A1]	dU	5'-Ende	PEG 8	Target-Domäne 1	Anker-Domäne 1
dU-P3000-[T1, A1]	dU	5'-Ende	PEG 3000	Target-Domäne 1	Anker-Domäne 1
dU-P8-SS-P8-[T2]	dU	5'-Ende	PEG8-SS-PEG8	Target-Domäne 2
dU-P3000-[T2]	dU	5'-Ende	PEG 3000	Target-Domäne 2
dU-P3000-[T2]	dU	5'-Ende	PEG 5000	Target-Domäne 2
dU-P3000-[T2]-3'	dU	3'-Ende	PEG 3000	Target-Domäne 2
dU-P5000-[T2]-3'	dU	3'-Ende	PEG 5000	Target-Domäne 2
dU-Glut-[T3, A3]	dU	5'-Ende	Glutarat	Target-Domäne 3	Anker-Domäne 3
dC-Glut-[T3, A3]	dC	5'-Ende	Glutarat	Target-Domäne 3	Anker-Domäne 3
dU-Tart-[T1, A1]	dU	5'-Ende	Tartrat	Target-Domäne 1	Anker-Domäne 1
dU-DTBP-[T1, A1]	dU	5'-Ende	Dithiobispropionat	Target-Domäne 1	Anker-Domäne 1
dU-P8-[T3, A3]-FAM	dU	5'-Ende	PEG 8	Target-Domäne 3	Anker-Domäne 3 mit Fluorescein
ddU-P5-[T4; S4]	ddU	5'-Ende	PEG 5	Target-Domäne 4
ddU-P9-[T4; S4]	ddU	5'-Ende	PEG 9	Target-Domäne 4
dU-P5-[T5-MB; S5]	dU	5'-Ende	PEG 5	Target-Domäne 5 als molecular Beacon
dU-P9-[T5-MB; S5]	dU	5'-Ende	PEG 9	Target-Domäne 5 als molecular Beacon
dU-P9-[T4; aT1; S4]	dU	5'-Ende	PEG 9	Target-Domäne 4 + Antagonist-Oligo 1

Die für die Synthesen verwendeten Oligonukleotide mit einer Target-Domäne und optionsweise einer Anker-Domäne sind in der Liste der Sequenzen angeführt.
1.5.15 Beispiele von enzymatischen Markierungsreaktionen von Zielsequenzen mit Nuk-Makromolekülen
Alle Polymerasen wurden von kommerziellen Anbietern bezogen (z. B. New England Biolabs oder Promega).
Einbau von Nuk-Makromolekülen in einer Primer-abhängigen Reaktion:
Die Substrateigentschaften von synthetisierten Nuk-Makromolekülen für mehrere Polymerasen wurden in Einbaureaktionen getestet. Eine Einbauraktion wurde durchgeführt in einem Einbaupuffer 1 (50 mmol/l Tris-HCL, 50 mmol/l NaCl, 5 mmol/l MgCl2, 10% Glycerin) oder Einbaupuffer 2 (1 × Reaktionspuffer (1 × ThermoPol für thermophile Polymerasen) von New England Biolabs). Es wurden verschiedene Polymerasen getestet (z. B. Klenow exo minus, Taq Polymerase, Vent exo minus Polymerase, Termonator, Terminator II, Deep-Vent exo minus, Sequenase, Tth-Polymerase, Tli-Polymerase). Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 10 bis 20 μl durchgeführt. Folgende Konzentrationen von Komponenten wurden typischerweise verwendet: Primer (markiert mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder unmarkiert) 0,1 bis 1,5 μmol/l/atrize (M1–M10) von 1 nmol/l bis 1,5 μmol/l, Nuk-Makromoleküle 0,1 bis 10 μmol/l, natürliche Nukleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) wurden in Konzentrationen von 0,1 μmol/l bis 10 mmol/l (die verwendeten Konzentrationen sind in jeweiligem Experiment angegeben).
Die Konzentrationen von Polymerasen erhalten von kommerziellen Anbietern wurden willkürlich als 1 × Konzentration bezeichnet. Die davon angefertigten Verdünnungsstufen von Polymerasen (z. B. 1:10 bis 1:1000) beziehen sich auf diese Ausgangskonzentration und sind im jeweiligen Experiment angegeben. Die feste Phase wurde durch Streptavidin-Magnetic-Beads repräsentiert, die einen Bindungspartner für die jeweilige Anker-Domäne einschließen, z. B. dP48 für eine dA25-Anker-Domäne. Die Analyse der verlängerten Fragmente erfolgte mittels Gel-Elektrophorese in einem 10% Polyacrylamid-Gel unter denaturierenden Bedingungen (ca. 85–90°C). Die Gel-Abbildungen wurden mittels einer Gel-Dokumentationsanlage gemacht.
Zusammenfassen wurden folgende Eigenschaften von Nuk-Makromolekülen ermittelt:

• Die synthetisierten Nuk-Makromoleküle (einschließlich mindestens einer Nuk-Komponente, eines Linkers, mindestens einer Target-Domäne, mindestens einer Anker-Domäne, mindestens einer Signal-Domäne) dienen als Substrate für DNA Polymerasen und können in einer Primer-Extension-Reaktion an den Primer in einer matrizenabhängigen Reaktion an entsprechenden, für die jeweilige Nuk-Koomponente komplementären Stellen gekoppelt werden.
• Nuk-Makromoleküle können von thermolabilen und thermostabilen Polymerasen als Substrate akzeptiert werden.
• Die erfindungsgemäßen Nuk-Makromoleküle können in einer primer-abhängigen Markierungsreaktion, z. B. bei einer Primer-Extension, eingesetzt werden.
• Nuk-Makromoleküle konkurrieren mit entsprechenden natürlichen Nukleotiden um den Einbau in den wachsenden Strang an den jeweiligen komplementären Stellen der Matrize. In Abhängigkeit davon, ob die Target-Domäne der Nuk-Makromoleküle an die jeweilige Matrize hybridisert ist oder nicht unterscheidet sich die Fähigkeit der Nuk-Makromoleküle um den Einbau zu konkurrieren:
– Der Einbau von an die jeweilige Matrize hybridisierten Nuk-Makromolekülen ist deutlich begünstig. Es bedarf bis zur 10 mmol/l Konzentration an natürlichen Nukleotiden, um den Einbau von einem hybridisierten Nuk-Makromolekül zu unterdrücken.
– Der Einbau von nicht an die Matrize hybridisierten Nuk-Makromolekülen wird durch natürliche Nukleotide gleicher Art wie die Nuk-Komponente des entsprechenden Nuk-Makromoleküls stark unterdrückt
• Für die Markierungsreaktionen in Anwesenheit von natürlichen Nukleotiden gleicher Art wie die Nuk-Komponente der Nuk-Makromoleküle (z. B. in Anwesenheit von dTTP bei einer Markierung mit einem dUTP einschließenden Nuk-Makromolekül), werden Strukturen von Nuk-Makromolekülen bevorzugt, die einen relativ kurzen Linker (z. B. bis zu 200 Kettenatome, noch bevorzugter bis zu 100 Kettenatome, noch bevorzugter bis zu 50 Kettenatome, noch bevorzugter bis zu 20 Kettenatome) zwischen der Nuk-Komponente und der Marker-Komponente einschließen.
• Für die Markierungsreaktionen in Anwesenheit von natürlichen Nukleotiden gleicher Art wie die Nuk-Komponente der Nuk-Makromoleküle (z. B. in Anwesenheit von dTTP bei einer Markierung mit einem dUTP einschließenden Nuk-Makromolekül), werden Strukturen von Nuk-Makromolekülen bevorzugt, die einen relativ kurzen Linker (siehe oben) einschließen, sowie die Position zumindest einer Nuk-Komponente innerhalb des Nuk-Makromoleküls am 5'-Ende einer Target-Domäne oder in der Nähe des 5'-Endes einer Target-Domäne haben.
• Die erfindungsgemäßen Nuk-Makromoleküle können in einer zyklisch ablaufenden Markierungsreaktion eingesetzt werden. Die zyklische Markierungsreaktion schließt mindestens einen Zyklus, wobei eine Änderung der Reaktionstemperatur durchgeführt wird. Beispielsweise schließt ein solcher Zyklus mindestens einen Denaturierungsschritt (z. B. bei 95°C) bei dem die Zielsequenzen aus einer doppelsträngigen Form in eine einzelsträngige Form überführt werden. Weiterhin, schließt ein solcher Zyklus mindestens einen Hybridisierungsschritt für Primer und Target-Domäne eines Nuk-Makromoleküls. Weiterhin schließt ein solcher Zyklus mindestens einen Schritt für die Verlängerung des Primers und Einbau von Nuk-Makromolekül. Die Schritte der Hybridisierung und der Verlängerung können bei gleichen oder unterschiedlichen Temperaturen stattfinden. Diese Schritte können mindestens zwei mal wiederholt werden.
• Die Markierung kann an Nukleinsäureketten erfolgen, die an einer festen Phase immobilisiert sind.
• Die an eine feste Phase gebundenen Nuk-Makromoleküle können Zielsequenzen markieren.
• Bei entsprechenden Reaktionsbedingungen (z. B. Hybridisierungstemperatur) können Nuk-Makromoleküle durch ihre Target-Domänen Zielsequenzen unterscheiden und nur spezifische Zielsequenzen markieren.
• Bei entsprechenden Reaktionsbedingungen (z. B. Hybridisierungstemperatur) können Nuk-Makromoleküle durch ihre Target-Domänen Zielsequenzen unterscheiden, wobei eine Gruppe von Zielsequenzen mit ähnlichen Bindungsstellen für die Target-Domäne eines Nuk-Makromoleküls markiert wird.
• Mehrere Nuk-Makromoleküle können in einer Markierungsreaktion bereitgestellt sein und bei entsprechenden Reaktionsbedingungen (z. B. Hybridisierungstemperatur) ihre spezifischen Zielsequenzen markieren.
• Nuk-Makromoleküle können in ihre spezifischen Zielsequenzen in Anwesenheit einer anderen Art von Nukleinsäureketten (z. B. genomische DNA) bei entsprechenden Reaktionsbedinungen selektiv markieren.
• Nuk-Makromoleküle können einzelsträngige Form der Zielsequenz markieren.
• Nuk-Makromoleküle können doppelstängige Form der Zielsequenz (z. B. PCR-Fragmente) markieren, wenn Doppelstränge von einander separiert werden und während der zyklsich ablaufenden Markierungsreaktion Hybridisierunsschritt für die entsprechende Target-Domäne des Nuk-Makromoleküls enthaltend ist.
• Nuk-Makromoleküle können während einer PCR die Zielsequenzen markieren.
• Die mit Nuk-Makromolekülen markierten Zielsequenzen können über Anker-Domäne der eingebauten Nuk-Makromoleküle an eine feste Phase gebunden werden.
• Das Ausmass der Markierung von Zielsequenzen und somit die Signal-Intensität der markierten Zielsequenzen kann durch die Reaktionsbedinungen beeinflusst werden. Beispielsweise durch Änderung der Konzentartion von konkurrierenden natürlichen Nukleotide gleicher Art wie die Nuk-Komponente der Nuk-Makromoleküle oder durch Anzahl der Zyklen in einer zyklischen Markierungsreaktion oder durch die Ausgangsmenge an Zielsequenzen oder durch Hybridisierungstemperatur für die Target-Domäne oder Primer.
• Teile von Nuk-Makromolekülen (z. B. Target-Domäne von Nuk-Makromolekülen) kann durch eine 5'-3'Exonuklease einer Polymerase (z. B. von Taq-Polymerase) abgebaut werden.
• Die „Strand-Displacement”-Aktivität der Polymerasen kann die Target-Domäne eines Nuk-Makromoleküls von der Bindung an die Zielsequenz verdrängen und die Synthese des markierten Strangs fortsetzen.

Nachfolgend sind einige Beispiele angegeben, die Substrat-Eigenschaften von Nuk-Makromolekülen demonstrieren.
1.5.15.1 Enzymatischer Einbau von dU-PEG(8)-(T1, A1]-TAMRA (I)
In diesem Experiment wird Einbau von dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA in den Primer in Anwesenheit unterschiedlicher Sets von weiteren natürlichen Nukleotiden getestet. Komponenten:
Primer, Matrizen, natürliche Nukleotide und Nuk-Makromolekül (dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA) wurden durch Erhitzung der Reaktionslösung auf 90°C und anschließende Abkühlung auf RT hybridisiert, so dass Primer und die Target-Domäne des Nuk-Makromoleküls an die Matrize (Zielsequenz) binden können. Zu dieser Lösung wurde Polymerase zugegeben und die Reaktion bei RT 10 min inkubiert. Anschließend wird die Reaktion direkt auf ein Geld geladen und die Reaktionsprodukte wurden aufgetrennt. Das Ergebnis ist in 26 abgebildet. Die Zusammensetzung einzelner Reaktionen ist in der Legende angegeben.
Es ist zu sehen, dass dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA als Substrat für Klenow exo minus verwendet werden kann (lane 1). Es kann in den Primer in Anwesenheit von dTTP in steigenden Konzentrationen (bis 1 mmol/l) eingebaut werden (Lane 2 bis 7), sowie in Anwesenheit von weiteren Nukleotiden (dATP, dGTP, dCTP, Lane 7).
Dank der Bindung an die Matrize kann dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA um den Einbau in den Primer durch die Polymerase mit freien dTTP (1 mmol/l) konkurrieren.
In Kontroll-Experimenten (hier nicht abgebildet) wurde ermittelt, dass dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA in den Primer eingebaut werden kann, auch wenn es nicht an die Matrize hybridisiert ist. Allerdings kann die Anwesenheit von dTTP zu einer Unterdrückung dieser Reaktion führen. Bereits 5 μmol/l Konzentration von dTTP kann den Einbau von nicht an die Matrize gebundenen dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA deutlich reduzieren. Anwesenheit von konkurrierenden Nukleotiden in Konzentraion von 100 μmol/l führt zu einer vollständigen Unterdrückung des Einbau von dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA, wenn diese nicht an die Matrize hybridisiert sind.
Zusammenfassen kann festgestellt werden, dass die spezifische Bindung von dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA an die Matrize zu einer deutlichen Begünstigung bei dem Einbau dieses Nuk-Makromoleküls in Anwesenheit von konkurrierenden Nukleotiden führt. Dieser Effekt wird dahingehend interpretiert, dass sich die lokale Konzentration der Nuk-Komponente durch die Bindung an die Matrize um ein vielfaches erhöht, so dass Polymerase dieses Nukleotid bevorzugt einbaun kann.
1.5.15.2 Enzymatischer Einbau von dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA (II)
In diesem Experiment wird Einbau von dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA in den Primer in Anwesenheit von weiteren natürlichen Nukleotiden und mehreren Polymerasen getestet. Komponenten:
Matrize 2:
Die Bindungsstelle für Nuk-Makromoleküle ist unterstrichen
Die Reaktionslösung wurde ähnlich wie in 1.5.15.1 vorbereitet. Primer, Matrizen und Nuk-Makromoleküle wurden hybridisiert durch Erhitzung der Reaktionslösung auf 90°C und anschließende Abkühlung auf RT. Zu dieser Lösung wurden dATP, dGTP, dCTP bis zur Endkonzentration von 100 μmol/l und dTTP von 0 bis 10 mmol/l (siehe Angaben in der Legende zu 27) zugegeben. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer entsprechenden Polymerase (Klenow exo minus in Verdünnung 1:10, 1:100, 1:1000, Taq 1:100 und Vent exo minus, 1:100) gestartet. Die Markierungsreaktion wurde 12 hr bei 37°C durchgeführt. Die Reaktionsansätze wurden mittels einer Gelelektrophorese analysiert. Das Ergebnis ist in 27 abgebildet. Die Zusammensetzung einzelner Reaktionen ist in der Legende angegeben.
Ergebnisse:
• Akzeptanz von dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA.
Alle verwendeten Polymerasen akzeptierten dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA als Substrat in der Primer-Extension-Reaktion (27, Lane 1, 4, 7, 10, 15). Die Anwesenheit von dATP, dCTP, dGTP störte den Einbau nicht. Der Primer wird nur teilweise verlngert (27, Pfeil A2), da die Abwesenheit von dTTP keine vollständige Primerverlägerung zulässt.
• Konkurrenz mit dTTP
Der Einbau von dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA findet durch alle Polymerasen auch in Anwesenheit von dTTP bis zur 100 μmol/l Konzentration statt (Lane 2, 5, 8, 11, 14). In Anwesenheit von dTTP 10 mmol/l wird der Einbau von dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA durch Vent exo minus und Taq-Polymese unter verwendeten Reaktionsbedingungen stark bis komplett unterdrückt (Lane 12 für Taq, Lane 13 für Vent exo minus). Dagegen kann Klenow exo minus auch bei dieser hohen Konzentration von konkurrierenden Nukleotiden das an die Matrize hybridisierte dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA einbauen (Lane 3, 6, 9).
• Strand-Displacement-Aktivität der Polymerasen
Die Fähigkeit des Klenow exo minus zum Strand-Displacement führte dazu, dass in Anwesenheit von dTTP eine komplette Synthese des komplementären Stranges zu Matrize M2 stattfand (Lane 2, 3, 5). Taq-Polymerase und Vent exo minus waren unfähig unter gleichen Bedingungen, die hybridisierte Target-Domäne des Nuk-Makromoleküls von der Matrize abzulösen, diese Polymerase haben keine strand displacement Aktivität. Der Einbau durch Vent exo minus und Taq erfolgte nur bis zur Target-Domäne, komplette Synthese des komplementären Stranges hat unter verwendeten Bedingungen nicht stattgefunden. Komplette Synthese des komplementären Strandes konnte allerdings unter zyklischen Markierungsbedingungen erreicht werden (siehe unten).
• 5'-3'-Exonuklease-Aktivität von Taq
Taq Polymerase hat eine 5'-3'-Exonuklease Aktivität. Trotz dieser Aktivität wurde der Primer mit den efindungsgemäßen Nukleotiden markiert.
• Effekt der Konzentration der Polymerase
Klenow-Fragment wurde in unterschiedlichen Konzentrationen verwendet: von 1:10 bis 1:1000. Bei höheren Konzentrationen von Klenow-Exo minus gelang die Strand-Diskplacement Reaktion am besten.
1.5.15.3 Wahl von Nuk-Makromolekülen und Polymerasen für eine Markierungsreaktion.
Für die zielsequenz-spezifische Markierungsreaktion von Nukleinsäureketten ist es entscheidend, dass Nuk-Makromoleküle in Abhängigkeit von ihrer Bindung an diese Zielsequenzen eingebaut werden. Mehrere Reaktions-Parameter haben Einfluss auf diese Eigenschaften. Sowohl die Wahl von Polymerasen, von Reaktionsbedingungen (z. B. Konzentration von konkurrierenden natürlichen Nukleotiden), als auch die Struktur von Nuk-Makromoleküle können diesen Einfluss ausüben. Zu Darstellungszwecken wurden einige dieser Paramter variiert (Polymerasen, Konzentration von konkurrierenden Nukleotdien, Struktur der Nuk-Makromoleküle).
Nachfolgend ist ein Vergleich über die Fähigkeit verschiedener Polymerasen angegeben, die an die Matrize hybridisierten Nuk-Makromoleküle in Anwesenheit von konkurrierenden Nukleotiden (in diesen Beispielen dTTP) einzubauen:

• Sehr guter Einbau: Klenow exo minus, Taq, Terminator Polymerase, Terminator II Polymerase (alle Enzyme von New England Biolabs)
• Guter Einbau: Vent exo minus, Tth Polymerase
• Mäßiger Einbau: Sequenase 2, Deep Vent exo minus

Die Struktur der Nuk-Makromoleküle kann Einfluss auf ihre Fähigkeit haben, in Anwesenheit von konkurrierenden Nukleotiden durch die Polymerase eingebaut zu werden. Die besten Einbauergebnisse in Anwesenheit von konkurrierenden Nukleotiden haben Strukturen von Nuk-Makromolekülen mit einer Nuk-Komponente, die über einen relativ kurzen Linker am 5'-Ende der Targer-Domäne gekoppelt ist.
Die Rolle der Bindung und der Position der Target-Domäne auf einer Zielsequenz. Vergleich der Einbaufähigkeit der Nuk-Makromoleküle MIT und OHNE Bindung an die Matrize zeigte, dass die Anwesenheit von dTTP (100 μmol/l) den Einbau von Nuk-Makromolekülen mit einer dUTP-Nuk-Komponente ohne Bindung der Targer-Domäne an die Matrize komplett unterdrücken kann. Die Anwesentheit von geringeren Mengen von dTTP (1 bis 10 μmol/l kann zu einer deutlichen Reduktion des Einbaus von Nuk-Makromolekülen führen.
Diese Situation ändert sich radikal mit der Bindung der Target-Domänen an die entsprechend komplementäre Position der Matrize in 3'-Richtung vom Primer (wobei zwischen dem 5'-Ende der Target-Domäne und dem 3'-Ende des Primers mindestens ein Nukleotid in der Zielsequenz vorkommt, das in der Lage ist, mit der Nuk-Komponente des hybridisierten Nuk-Makromoleküls ein Basenpaar zu bilden): die an die Matrize gebundenen Nuk-Makromoleküle werden bevorzugt eingebaut. Auch Konzentrationen der natürlichen Nukleotide in der Lösung von bis zu 100 μmol/l oder auch bis 10 mmol können den Einbau nicht komplett unterdrücken.
Die Position der Bindung einer Target-Domäne an die Zielsequenz kann variabel je nach Experiment gestaltet werden. Typischerweise wird die Target-Domäne dermassen gewählt, dass ihre potenzielle Bindungsstelle in 3'-Richtung vom Markierungsprimer liegt. Vorzugsweise ist die Position der Target-Domäne innerhalb der Zielsequenz dermassen ausgewählt, dass zwischen dem gebundenen Primer und der gebundenen Target-Domäne mindestens ein Nukleotid in der Zielsequenz vokommt, das mit der Nuk-Komponente des Nuk-Makromoleküls ein komlementäres Basenpaar bilden kann.
Das Grad der Markierung einer Zielsequenz kann entsprechend einem Reaktionsaufbau an die jeweiligen Konzentrationen der natürlichen Nukleotide, die Polymerase und die Reaktionsbedingungen angepasst werden: Bindung der Nuk-Komponente an das 5'-Ende der Target-Domäne oder an die Abschnitte, die nah am 5'-Ende der Target-Domäne lokalisiert sind, mit kürzeren Linkern (z. B. mit nur 10 bis 100 Kettenatome) ermöglicht den Einbau des an die Matrize gebundenen Nuk-Makromoleküle in Anwesenheit von hohen Konzentrationen natürlicher Nukleotide.
1.5.15.4 Zyklische Primer-Extension Reaktion
Die Markierung von Zielsequenzen kann in einem einzelnen Schritt der Primer-Extension oder auch in mehreren Zyklen der Primer-Extension erfolgen. Hier wird ein Beispiel für die Markierung von Zielsequenzen in mehreren zyklsichen Schritten dargestellt.
Zur Anschaulichkeit der Bedeutung der Hybridisierung einer Target-Domäne an die Zielsequenz für die Markierung werden mehrere unterschiedliche Zielsequenzen mit gleicher Primer-Bindungsstelle verwendet. Der verwendete Primer ist am 5'-Ende mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert (T7-19-Cy3). Das für die Markierung verwendete Nuk-Makromolekül (dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA) hat dUTP als Nuk-Komponente, die über einen kurzen Linker am 5'-Ende der Target-Domäne gekoppelt ist. Diese Nuk-Makromolekül hat weiterhin eine Anker-Domäne und eine Signal-Domäne (TAMRA) am 3'-Ende. Komponenten:

(Die potenziellen Bindungsstellen für die Target-Domäne sind unterstrichen)
Matrize M2 und die Target-Domäne haben eine komplett komplementäre Sequenz über die Gesamtlänge der Target-Domäne (komplementärer Bereich ist unterstrichen)
Matrize M4 hat komplementäre Sequenzen nur für beide Enden der Target-Domäne (komplementärer Bereich ist unterstrichen)
Matrize 8 hat komplementäre Sequenzen nur für das 3'-Ende der Target-Domäne (komplementärer Bereich ist unterstrichen). Das 5'-Ende der Target-Domäne ist nicht an die Zielsequenz hybridisert
Matrize 9 hat komplementäre Sequenzen nur für das 5'-Ende der Target-Domäne (komplementärer Bereich ist unterstrichen). Das 3'-Ende der Target-Domäne ist nicht an die Zielsequenz hybridisert.
Solche Sequenzen können als Beispiele für Abweichungen von der Zielsequenz betrachtet werden (z. B. Mutationen in der Zielsequenz). Ebenfalls können solche Sequenzen als Paare von Ziel-Sequenz/Target-Domänen betrachtet werden, wobei die Target-Domäne zur Zielsequenz (Matrize 4) nicht vollständig komplementär ist. Ebenfalls dient dieses Experiment zur Darstellung von Reaktionsabläufen bei dem die Tm von Target-Domäne geringer ist als die Tm von Primer. Ebenfalls stellt dieses Experiment den Fall dar, wenn das 5'-Ende der Targer-Domäne nicht an die Zielsequenz hybridisiert ist.
Die Reaktionslösung wurde ähnlich wie in 1.5.15.1 vorbereitet. Primer, Matrizen, natürliche Nukleotide (dNTP's) und Nuk-Makromoleküle wurden in einer Puffer-Lösung bereitgestellt. Die Lösungen wurden anfänglich unter 95°C 15 min lang inkubiert. Während dieser Zeit wurde die Taq-Polymerase in die Reaktion gegeben (Hot-Start der Reaktion, um Nebenmarkierungen zu vermeiden). Nach dem Ende der Reaktion wurde EDTA bis zur Endkonzentration von 10 mmol/l zugegeben. Die Reaktionsansätze wurden anschliend auf einem Gel aufgetrennt.
Die zyklische Markierungsreaktionen wurden unter unterschiedlichen Temperaturen in mehreren zyklischen Schritten durchgeführt.
Ein Zyklus schließt ein Hybridisierungsschritt, ein Extensionsschritt und ein Denaturierungsschritt ein. Der Extensions-Schritt (70°C 1 min) und der Denaturierungsschritt (95°C 30 sec) wurden bei allen Matrizen gleich durchgeführt.
Wegen Unterschiede in komplementären Bereichen zwischen der gegeben Target-Domäne und zu markierenden Zielsequenzen was es interessant zu prüfen, bei welcher Hybridisierungstemperatur die Einbaureaktion von Nuk-Makromolekülen stattfindet. Folglich, wurden unterschiedliche Hybridisierungstemperaturen getestet.
Da in vorläufigen Experimenten die Fähigkeit zum Einbau des Nuk-Makromoleküls an der Zielsequenz (M2) mit vollständig komplementärem Bereich zu Target-Domäne bereits getestet wurde, diente diese Reaktion als positive Kontrolle (Hybridisierung bei 55°C).
Folgende Temperaturen wurden als Hybridisierungstemperaturen gewählt: 35°C, 45°C und 55°C.
Zyklischen Reaktionen (jeweils 20 Zyklen) wurden in einem PCR-Gerät unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

Cycler-Programm: Hybridisierung bei 35°C

Denaturierung: 95°C 30 sec

Hybridisierung: 45°C 1 min

Extension: 70°C 1 min

Cycler-Programm: Hybridisierung bei 45°C

Denaturierung: 95°C 30 sec

Hybridisierung: 45°C 1 min

Extension: 70°C 1 min

Cycler-Programm: Hybridisierung bei 55°C

Denaturierung: 95°C 30 sec

Hybridisierung: 55°C 1 min

Extension: 70°C 1 min
Als Kontrolle der Signal-Intensität und der Position des verlängerten Produkts im Gel diente Primer-Extensions (1 × Zyklus) der jeweiligen Matrize ohne Nuk-Makromolekül (37°C 12 h). Die Konzentration einzelner Komponenten (Primer, Matrize, Polymerase, dNTPs waren die gleichen, wie bei der zyklischen Markierung). Bei dieser Reaktion wurde Primer mit natürlichen Nukleotiden verlängert.
Das Ergebnis der Reaktion ist in 28 zusammengefasst.
Man sieht, dass die Primer-Verlängerung stattgefunden hat: während der zyklischen Primer-Extension die Menge an verlängerten Primern zunimmt (vergleiche die Intensität der Banden bei zyklischen Reaktionen und einer einfachen Primer-Extension). Die Markierung der neu synthetisierten Stränge hängt entscheidend davon ab, ob das Nuk-Makromolekül über seine Target-Domäne unter jeweiligen Reaktionsbedingungen an die Matrize gebunden hat. Die Reaktion an M2-Matrize mit Taq-Polymerase bei 55°C Hybridisierungstemperatur verlief in guten Ausbeuten: das markierte Produkt ist deutlich zu sehen (28, M2, Lane 1, Pfeil A1). Ebenfalls ist eine Markierung mit Matrize (M8) bei allen Hybridisierungstemperaturen (35°C, 45°C, 55°C) zu sehen (28, M8, Lane 2–4, Pfeil A2). In der Reaktion mit Matrize 4 (M4) ist eine nur sehr schwache Markierung bei Hybridisierungstemperatur von 35°C und 45°C zu sehen (28, M4, Lane 1, 2, Pfeil A2). Bei 55°C konnte keine Markierung mehr nachgewiesen werden. In der Reaktion an der Matrize 9 wurde bei keiner Hybridisierungstemperatur eine Markierung gesehen, der Einbau von dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA wurde durch natürliche Nukleotide komplett unterdrückt.
An diesem Beispiel kann man erkennen, dass die Bindung der Target-Domäne eines Nuk-Makromoleküls für eine spezifische Erkennung einer Zielsequenz genutzt werden kann: unter stringenten Hybridisierungsbedingungen werden lediglich Nuk-Makromoleküle in den wachsenden Strang eingebaut, die an die Zielsequenz gebunden sind. Veränderungen in der Bindungsstelle in der Zielsequenz können zum Verlust bzw. Minderung in der Markierung dienen. Andererseits kann die Target-Domäne dennoch an die veränderte Position in der Zielsequenz binden, wenn weniger stringente Bedingungen (z. B. niedrigere Temperaturen) verwendet werden.
Am Beispiel mit der Markierung von Matrize 8 ist zu sehen, dass Polymerase auch Nuk-Makromoleküle akzeptiert, bei denen das 5'-Ende nicht an die Matrize hybridisiert ist.
1.5.15.5 Markierung von Zielsequenzen während bzw. parallel zu ihrer Amplifikation in der PCR, sowie anschließende Bindung und Isolierung von markierten Zielsequenzen mit einer festen Phase über die Anker-Domäne der eingebauten Nuk-Makromoleküle.
Die Markierung von Zielsequenzen kann parallel zu deren Amplifikation stattfinden. PCR ist eine der üblichen Methoden zu Vervielfältigung der Nukleinsäureketten. Hier wird ein Beispiel für die Markierung von Zielsequenzen parallel zu deren Amplifikation angegeben. Nach der PCR werden markierte DNA-Fragmente durch eine spezifische Bidnung an eine feste Phase isoliert. Diese Isolierung wird durch eine spezifische Bindung der Anker-Domäne von eingebauten Nuk-Makromolekülen an die an einer festen Phase immobilisierten Bindungspartner vermittelt. Komponenten:
Ein PCR-Primer ist am 5'-Ende mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert (Cy3). Ein zweiter PCR-Primer ist unmarkiert. Die für die Markierung verwendeten Nuk-Makromolekül (dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA und dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA) haben dUTP als Nuk-Komponente, die über einen kurzen Linker (PEG 4 oder PEG 8) am 5'-Ende der Target-Domäne gekoppelt ist. Diese Nuk-Makromolekül hat weiterhin eine Anker-Domäne und eine Signal-Domäne (TAMRA) am 3'-Ende. Die Bindungsstelle in der Matrize 2 für die Target-Domäne ist vollständig komplementär.
Beide PCR-Primer, Matrize (M2), natürliche Nukleotide (dNTP's) und Nuk-Makromoleküle wurden in einer Puffer-Lösung bereitgestellt. Die Lösungen wurden anfänglich unter 95°C 15 min lang inkubiert. Während dieser Zeit wurde Taq-Polymerase oder Vent-exo minus Polymerase in die Reaktion gegeben (Hot-Start der Reaktion, um Nebenmarkierungen zu vermeiden). Nach dem Ende der Reaktion wurde EDTA bis zur Endkonzentration von 10 mmol/l zugegeben. Die Reaktionsansätze wurden anschliend auf einem Gel aufgetrennt.
Es wurden folgende PCR-Bedingungen verwendet:

Cycler-Programm:

Denaturierung: 95°C 30 sec

Hybridisierung: 55°C 1 min

Extension: 70°C 1 min

Insgesamt 20 Zyklen

Halten: 4°C
Anschließend wurde ein Teil der Reaktion mit einer Suspension von dT48 Magnetic Beads in Kontakt gebraucht. Nach einer Inkubationszeit von 5 min im Thermo-Pol1x Buffer wurden die Beads mit Einbaupuffer 1 gewaschen. Die Beads wurden direkt auf das Gel geladen. Die Ablösung der PCR-Fragmente von Beads erfolgte unter erhöhter Temperatur von ca. 85°C.
Die feste Phase wurde vor dem Experiment wie folgt vorbereitet: Streptavidin-Magnetic Beads (von Promega) wurden mit einem Oligonukleotid, dT48 mit einem Biotin-Rest am 3'-Ende beladen und gewaschen. Das dT48-Oligonukleotid stellt ein Beispiel für einen Bindungspartner einer Anker-Domäne dar. Solche Beads sind in der Lage die mit Nuk-Makromolekülen markierte Nukleinsäureketten zu binden.
Das Ergebnis der Reaktion ist in 29 zusammengefasst. Man sieht deutliche Binldung von PCR Fragmenten: mit Nuk-Makromolekülen markierte PCR-Produkte (Pfeil A1 und A2 29A) und nicht PCR-Produkte ohne Nuk-Makromolekülen (Pfeil B1, 29A). Interessanterweise kann die Taq-Polymerase nur wenige markierte PCR-Fragmente komplett extendieren (Pfeil A1) vs. (Pfeil A2). Dagegen kann Vent exo minus Polymerase durch ihre Strand-Displacement-Aktivität unter gegebenen Reaktionsbedingungen deutlich mehr vollständig verlängerten Fragmenten generieren. (Pfeil A2).
Die spezifische Isolierung der mit Nuk-Makromolekülen modifizierten PCR-Fragmente durch feste Phase ist in 29(B) gezeigt. Man sieht, dass nur die PCR-Fragmente, die ein Nuk-Makromolekül mit einer Anker-Domäne eingebaut haben, isoliert werden können (Pfeil A1, Lane 3). PCR-Produkte ohne eingebaute Nuk-Makromoleküle binden nicht an die feste Phase und werden daher nicht isoliert (Lane 4 hat keine Signale).
1.5.15.6 Nachweis einer bakteriellen DNA mittels PCR Amplifikaiton und Markierung mit Nuk-Makromolekülen
Einem Fachmann sind viele Messungen bekannt, die auf Real-Time PCR Methode basieren. Dabei wird beispielweise eine markierte Sonde (auch Probe genannt)n, die komplementär an die Zielsequenz binden kann, in die Reaktion zugegeben und die Menge an Produkt während der Reaktion gemessen. Das Signal oder Signal-Anstieg entsteht dann, wenn die Sonde an die jeweilige Zielsequenz hybridisiert hat und beispielsweise durch 5'-3'-Aktivität einer thermostabilen Polymerase teilweise abgebaut wird (z. B. US Pat No 5,538,848 , 5,723,591 , 5,876,930 , 6,030,787 , 6,171,785 , 5,487,972 ).
Solche Methoden zum Nachweis von bestimmten DNA-Abschnitten in einem biologischen Material wurden in einer sehr großen Anzahl an Publikationen dargestellt. Die jeweiligen Autoren beschreiben die Isolierungsbedingungen für die Nukleinsäureketten, die spezifischen Primer, die Sondenzusammensetzung und die entsprechenden Reaktionsbedingungen zur Vervielfältigung und Nachweis von Zielsequenzen. Unzählige Varianten dieser Methode, inklusive Multiplex-PCR, diagnostische Real-Time PCR, Kombinationen mit Reversen Transcriptasen (RT-PCR) usw. wurden seit der Einführung der Real-Time PCR in den 90er Jahren veröffentlich.
Die vorliegende Anmeldung macht Gebrauch von dieser Lehre. Ähnlich wie bei Real-Time PCR liegt in einer vorteilhaften Ausführungsform dieser Anmeldung die spezifische Bindung einer Target-Domäne eines Nuk-Makromoleküls an die Zielsequenz unter Bedingungen, die eine Vervielfältigung von Nukleinsäuereketten zulassen (z. B. PCR). Ein Fachmann kann daher auf die bestehenden Erkenntnisse aus der Real-Time PCR zurückgreifen. Insbesondere betrifft dies die Zusammensetzung von PCR-Primern, der Target-Domäne und Reaktionsbedingungen, sowie weitere Kombinationen, z. B. Multiplexing, Kombination mit Reversen Transcriptasen usw.
Zur Anschaulichung werden Primer und die Sondenzusammensetzung, die in einer Veröffentlichung publiziert waren (Nadkarni M. A. et al, Microbiology, 2002, v. 148 257- ), bei einer Markierung mit Nuk-Makromolekülen während einer PCR-Reaktion demonstriert.
Die Primer (forward und reverse Primer, siehe Liste der Sequenzen) wurden ohne Veränderungen übernommen. Die Sequenz-Zusammensetzung der beschriebenen doppelt-markiertnen Probe (FAM/TAMRA) wurde für die Sequenz-Zusammensetzung der Target-Domäne des Nuk-Makromoleküls mit folgenden Veränderungen übernommen. Statt Fluorescein wurde an das 5'-Ende der Target-Domäne eine Nuk-Komponente über einen kurzen Linker gekoppelt und am 3'-Ende der Target-Domäne wurde eine Anker-Domäne, bestehend aus 25 dA-Resten angefügt. Das 3'-Ende der Anker-Domäne trägt ein Fluorescenzfarbstoff (TAMRA). Es resultierte das Oligonukleotid[T1, A1]-TAMRA, das zur Synthese von Nuk-Makromolekülen als eine Variante des Markers verwendet wurde.
Einige Eigenschaften des resultierten Nuk-Makromoleküls (z. B. dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA oder dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA) mit diesem Oligonukleotid wurden bereits in vorangehenden Beispielen demonstriert, siehe Beispiele 1.5.15.1 bis 1.5.15.5.
In diesem Beispiel soll die Anwendung dieses Nuk-Makromoleküls für den Nachweis der Präsenz einer bakteriellen DNA gezeigt werden. Es wurde eine Real-Time PCR gewählt die den 16 S ribosomalen genomischen Abschnitt von Bakterien nachweisen soll. Die Primer und die Probe sind innerhalb von konservierten Bereichen der 16 S Sequenz gelegt. Komponenten:

Die Zusammensetzung der Primer und der Probe (FAM/TAMRA) entsprach der in der genannten Literaturstelle (siehe Liste der Sequenzen). Die Vorbereitung von dT48 Beads wurde im vorherigen Beispiel beschrieben. Reagenzien wurden bei RT zusammenpipettiert und auf 95°C erhitzt, dann wurde Taq-Polymerase zugegeben. Im Anschluß darauf wurden PCR-Zyklen durchgeführt nach dem folgenden Schema:

Die ersten 25 Zyklen:
Denaturierung:	95°C	30 sec
Hybridisierung:	55°C	1 min
Extension:	70°C	1 min
Die darauf folgend	en Zyklen (2	5 Zyklen):
Denaturierung:	95°C	30 sec
Hybridisierung:	55°C	1 min
Extension 1:	60°C	1 min
Extension 2:	70°C	1 min
Halten:	4°C

Die PCR Fragmente wurden zum Teil via Ultrafiltration und/oder via Bindung an die dT48 Magnetische Beads gereinigt.
Die Analyse erfolgte mittels Gel-Elektrophorese (10% Acrylamid-Gel, Acrylamid/Bisacrylamid-Mischung, Rotiphorese Firma Roth) unter denaturierenden Bedingungen bei 90°C bei 150 V. Die Detektion der Signale erfolgte mittels TAMRA-Farbstoffe am Nuk-Makromolekül oder durch Färbung der Nukleinsäureketten mit Ethidium-Bromid nach der Elektrophorese.
Das Ergebnis der Markierung ist in der 31 dargestellt.
Die PCR hat unter verwendeten Bedingungen stattgefunden (Banden in Höhe von ca. 500 bp). Die Nuk-Makromoleküle (dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA) wurden in die PCR Produkte eingebaut (Pfeil A1, Lane 5 und 6, 31B). Dies erfolgte trotz einer relativ hohen Konzentration von dTTP (200 μmol/l am Start der Reaktion). Das zugegebene DMSO 5% hat bei dieser Reaktion keinen Einfluss gehabt (Intensität der Banden in Lane 5 und 6 ist etwa gleich). Zwei Banden mit hoher Molekularmasse entsprechen am ehesten einem vollständigen (höhere Bande) und einem nicht vollständigen markierten PCR-Produkt.
Die als Kontrolle mitgeführte real-time PCR Probe (FAM/TAMRA) wurde nicht eingebaut (lane 4), da sie kein Nuk-Makromolekül ist. Die PCR-Produkte in diesem Ansatz tragen keine fluoreszente Markierung. Die Probe wurde allerding durch die 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der Taq Polymerase teilweise abgebaut, da sie während der Reaktion an die Zielsequenz hybridisiert war, wie es für eine Real-Time PCR Probe zu erwarten war.
Die markierten PCR-Produkte können mittels Ultrafiltration MWCO 100 kDa von Primern und nicht eingebauten Nuk-Makromolekülen gereinigt werden (Lane 7 und 8)
Die markierten PCR-Fragmente konnten direkt nach der PCR an die magnetische dT48-Beads über die mit Nuk-Makromolekülen eingeführten Anker-Domäne gebunden werden. Die nicht markierten PCR-Fragmente binden nicht an die dT48 Beads, da sie über keine Anker-Domäne verfügen. Da der Ansatz auch noch nicht verbrauchte Nuk-Makromoleküle enthiet, wurden diese ebenfalls an die Beads gebunden (Lane 11). Die mit Ultrafiltration gereinigten markierten PCR-Fragmente sind frei von Nuk-Makromolekülen und können in sauberer Form durch die Beads isoliert werden (lane 12).
Dieses Beispiel zeigt, wie die für die Real-Time PCR entwickelte Reagenzien und Methoden in Kombination mit Nuk-Makromolekülen eingesetzt werden können.
1.5.15.7 Einbau von Nuk-Makromolekülen mit einer Target-Domäne, die einen doppelsträngigen Abschnitt einschließt.
Es wurden zwei Typen von Doppelstrangbildung innerhalb eines Target-Domäne-Oligonukleotids getestet. Erstens, es wurde ein Oligonukleotid vom Typ „Molecular Beacon” synthetisiert und als Target-Domäne eines Nuk-Makromoleküls verwendet (dU-PEG(9)-[T5-MB; S5] siehe Synthesebeispiel 1.5.14.6). Zweitens, es wurde ein Nuk-Makromolekül mit einer einzelsträngigen Target-Domäne synthetisiert. An dieses Oligonukleotid wurde ein weiteres, kürzeres Oligonukleotid durch eine Hybridisierung komplementär gebunden, so dass die Target-Domäne sowohl einen einzelsträngigen Abschnitt aufwies als auch einen doppelsträngigen Abschnitt mit diesem Oligonukleotid gebildet hat (dU-PEG(9)-[T4; aT1; S4) siehe Synthesebeispiel 1.5.14.7). Bei niedrigen Temperaturen liegt das Target-Domäne-Oligonukleotid dieser Nuk-Makromoleküle teilweise als Doppelstrang vor. Dies hindert die Target-Domäne-Sequenz des Nuk-Makromoleküls, an weitere Nukleinsäureketten zu binden (sowohl spezifische als auch unspezifische Bindung wird verhindert). Mit steigender Temperatur öffnet sich der Doppelstrang, so dass die Target-Domäne einzelsträngige Form annehmen und an Zielsequenzen binden kann. Dieses Prinzip ermöglicht Steigerung der Spezifität in einem Assay, da eine Interaktion zwischen der Zielsequenz und einer Target-Domäne erst bei höheren Temperaturen stattfindet. Komponenten:
Matrize 2:
Die Bindungsstelle für dU-P9-[T4, S4] ist unterstrichen
Die Reaktionslösung wurde ähnlich wie in 1.5.15.1 vorbereitet. Primer, Matrizen und Nuk-Makromoleküle wurden durch Erhitzung der Reaktionslösung auf 90°C und anschließende Abkühlung auf RT hybridisiert. Zu dieser Lösung wurden dATP, dGTP, dCTP, dTTP bis zur Endkonzentration von 300 μmol/l zugegeben. Die Reaktion wurde durch die Zugabe der Polymerase gestartet. Die Markierungsreaktion wurde bei 55°C 10 min durchgeführt. Die Reaktionsansätze wurden mittels einer Gelelektrophorese analysiert. Das Ergebnis ist in 46 abgebildet. Die Zusammensetzung einzelner Reaktionen ist in der Legende angegeben.
Ergebnisse:

• Bst-Polymerase Large Fragment akzeptierte die eingesetzten Nukleotid-Konjugate als Substrate in der Primer-Extension-Reaktion.
• Die Bst-Polymerase Large Fragment war in der Lage, Nukleotid-Konjugate unter dTTP-Konzentrationen von 300 μmol/l in den komplementären Strang einzubauen.
• Die Fähigkeit der Bst-Polymerase large fragment zum Strand-Displacement führte dazu, dass in Anwesenheit von dTTP eine vollständige Synthese des komplementären Stranges zu Matrize M2 stattfand.

1.5.15.8 Amplifikaiton und Markierung einer DNA mit Nuk-Makromolekülen in einer thermostabilen Helicase-Abhängigen Amplifikation (tHDA) unter isothermischen Bedingungen und Nachweis der Amplifikation mittels eines Streifentest (lateral flow device).
Es wurde eine Amplifikation und eine Markierung einer Zielsequenz mittels tHDA durchgeführt. Die Kit-Komponenten (Bst-DNA Polymerase large fragment und thermostabile Helicase) zusammen mit spezifischen Primern ermöglichen eine Vervielfältigung von DNA-Fragmenten. In einem getrennten Assay wurde der sequenzspezifische Einbau von dU-PEG(8)-(T3, A3]-FAM an M8-Matrize mit T7-19 Primer vorher überprüft. Es wurde festgestellt, dass großes Fragment der Bst-DNA Polymerase (Bst Polymerase Large Fragment) ein solches Nuk-Makromolekül gut sequenzspezifisch einbauen kann und einen komplementären Nukleinsäurestrang zu M8 vollständig synthetisieren kann. Nun wurde ein sequenzspezifischer Einbau von dU-PEG(8)-[T3, A3]-FAM in einem tHDA-Assay getestet. Zum Nachweis des amplifizierten Produktes wurden kommerziel erhältliche Streifentest verwendet, die in der Lage sind, mit Fluoresein und Biotin markierte Moleküle zu detektieren (z. B. PCR-Fragmente). Das im Assay eingesetzte dU-PEG(8)-[T3, A3]-FAM enthält ein Fluoresein-Rest am 3'-Ende. Ein in die Reaktion eingesetzter Primer wurde mit einem Biotin-Rest am 5'-Ende versehen. Im Fall einer Amplifikation und Markierung ist ein Streifen an einer bestimmten Position auf dem Streifentest zu erwarten.
Reagenzien: IsoAmp II Universal tHDA Kit (Biohelix Corporation, Vertrieb in Deutschland von New England Biolabs, NEB), Milenia GenLine HybriDetect 2T (Streifentest zum Nachweis von PCR-Fragmenten, Milenia Biotec, Deutschland). Komponenten:
Der Reaktionsansatz (50 μl) wurde nach Anleitung des Herstellers pipettiert (One Step tHDA, Biohelix Corporation product information). Die Reaktion wurde für 1 h bei 60°C inkubiert. Anschließend wurde ein Streifen (Milenia GenLine HybriDetect 2T) in die Reaktionlösung eingetaucht. Nach ca. 2 min wurde ein spezifisches Streifensignal an der zu erwartenden Position auf dem Streifentest sichtbar (Nachweis eines DNA-Fragmentes mit Fluorescein und Biotin). Korrekter Einbau von Nuk-Makromolekül wurde mittels Gelelektrophorese bestätigt.
Einem Fachmann sind verschiedene Ausführungen von HDA-Reaktionen bekannt (Tong et al. Biotechniques, 2008, 45, 543-; Jeong et al. Cell Mol life Science 2009 v. 66, 3325-, Vincent et al. EMBO Reports 2004 v. 5 795-) bei welchen erfindungsgemäße Nuk-Makromoleküle (sowohl terminierende als auch nicht terminierende) zu Einsatz kommen können. Kombination mit verschiedenen Nachweis-Methoden sind einem Fachmann naheliegend.
1.5.15.9 Beispiele für Synthesen von DNA mit Nuklease-Resistenten sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten und deren Isolierung mittels Nuklease-Behandlung (Fig. 47–Fig. 56)
Ein Beispiel der Erfindung beschreibt Komponenten und Verfahren zur Herstellung eines gegenüber Nukleasen stabilen Informationsträgers („Smart-DNA”), 47, sowie Verfahren zu seinem Nachweis. Der Informationsträger („Smart-DNA”) wird während einer enzymatischen Primer-Verlängerungsreaktion oder einer Amplifikationsreaktion erzeugt.
In einer Ausführungsform werden für die Herstellung Kompositionen verwendet, die folgende Komponenten einschließen:

• Mindestens eine Zielsequenz
• Mindestens eine Art von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten (Smart-Nukleotiden) mit nuklease-resistenten Oligonukleotid-Anteilen und mindestens einer nukleotid-spezifischen Signal-Domäne bzw. Anker-Domäne
• mindestens ein nuklease-resistenter, mit Biotin markierter Primer,
• vier dNTP oder ein Gemisch aus natürlichen und Alpha-Thio-dNTPs in Konzentration, die einen unspezifischen Einbau von Smart-Nukleotiden unterdrückt
• mindestens eine Polymerase

Die Herstellung erfolgt vorzugsweise unter Bedingungen, die eine sequenzspezifische Markierung der Zielsequenzen durch Nukleotid-Konjugate zulassen.
Als Ergebnis der Synthese-Reaktion (Primer-Verlängerungs bzw. Amplifikation) entsteht eine modifizierte DNA, die sequenzspezifische nuklease resistente Smart-Nukleotide einschließt und durch spezifische Signal-Domäne bzw. Anker-Domäne markiert ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt eine anschließende Isolierung des markierten DNA-Abshcnitts. Die Isolierung kann durch verschiedene Techniken durchgeführt werden, z. B. durch affine Aufreinigung des markierten Fragments, oder durch Isolierung mittels einer Gel-Elektrophorese, oder durch HPLC (reverse-Phase oder Ionenaustauscher).
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird die neu synthetisierte, markierte DNA mittels Nukleasen isoliert. In einer solchen Ausführungsform ist die mit sequenzspezifischen, nucleaseresistenten Nukleotid-Konjugaten markierte DNA wiederstandsfähiger gegenüber DNA-abbauenden bzw. DNA-spaltenden Enzymen, Nukleasen, als die nicht markierte DNA. Eine solche DNA kann eine Behandlung mit bestimmten Nukleasen überstehen, während restliche DNA ohne Markierung durch eine solche Behandlung vollständig oder teilweise zerstört wird.
In einer Ausführung werden vorzugsweise Einzelstränge der nicht markierten Nukleinsäuren abgebaut. Doppelsträngige Abschnitte verbleiben in der Reaktion. Solche Abschnitte sind normalerweise niicht zu einer Interaktion mit anderen Nukleinsäureketten via Hybridisierung fähig In einer weiteren Ausführung werden vorzugsweise sowohl Einzelstränge als auch Doppelstränge der nicht markierten Nukleinsäuren abgebaut.
Nach dem Abbauschritt durch Nukleasen liegt die markierte DNA und Spaltfragmente der nicht markierten DNA in einem Gemisch vor. Vorzugsweise interagieren solche Spaltfragmente nicht mit der markierten DNA durch Hybridisierung, z. B. mono-, di- und trinukleotid-Fragmente, und interferieren nicht mit Detektion. In einem solchen Fall kann markierte DNA in Anwesenheit von Spaltungsfragmenten detektiert werden.
Durch Isolierung eines Fragmenten der markierten DNA und Beseitigung der restlichen Sequenzen, beispielsweise durch Nuklease, erreicht man folgende Vorteile in den anschließenden Verfahrenschritten, z. B. Detektion:

A. Gefahr einer unspezifischen Interaktion zwischen verschiedenen Sequenzen und der zu detektierenden DNA wird deutlich reduziert, da sämtliche nicht markierte Sequenzen enzymatisch abgebaut sind.
B. Gefahr einer unspezifischen Interaktion zwischen verschiedenen Sequenzen und einezelnen Komponenten des Detektions-Systems z. B. zwischen markierten Oligonukleotiden und nicht-markierten DNA-Fragmenten wird deutlich reduziert, da sämtliche nicht markierte Sequenzen enzymatisch abgebaut sind.
C. Analyse ist nicht auf die Aufrechterhaltung des doppelsträngigen Zustands der markierten DNA angewiesen (alle Fragmente des zu detektierenden Moleküls sind aneinader kovalent in einem Strang gekoppelt)
D. Analyse ist nicht auf stringente Bedingungen zur spezifischen Hybridisierung von markierten Sonden (z. B. Oligonukleotid) an den Einzelstrang der Zielsequenz angewiesen: alle Fragmente des zu detektierenden Moleküls sind bereits spezifisch aneinader kovalent in einem Strang gekoppelt

Insgesamt wird durch eine Nuklease-Isolierung der markierten DNA-Fragmente die Durchführung der Detektion erheblich vereinfacht, bei gleichzeitiger potenzieller Steigerung der Speifität der Analyse. Das Signal-Rauschen-Verhältnis kann dadurch signifikant verbessert werden: Beispielsweise stören die eventuell unspezifisch amplifizierten, aber nicht markierten DNA-Fragmente die Detektion nicht.
Ein weiterer Vorteil der Nuklease-Isolierung ist Beseitigung der Amplifikationsfähigkeit der markierten Nukleinsäureketten. In dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Informationsträger nach Isolierung mit Nukleasen nicht mit gleichen Primern amplifizierbar, wie die Ziel-Sequenz während einer Amplifikationsreaktion.
In einer solchen Ausführungsform wird Abbau-Schritt durch Nukleasen so gestaltet, dass keine vollständigen Amplifikationsfragmente der Ziel-Sequenz im Ansatz verbleiben, die ihrerseits in einer weiteren Amplifikationsreaktion als Matrizen dienen könnten. Dies kann beispielsweise durch ausreichende Dauer der Nuklease-Behandlung erzielt werden.
Durch Kompbination einer zielsequenz-spezifischen Markierung während einer Amplifikation mit einer Isolierung der markierten DNA-Fragmente können DNA-äquivalente Informationsträger erzeugt werden, die vorwiegend folgende Eigenschaften aufweisen

• Der Informationsträger wurde während einer Amplifikationsreaktion der Ziel-Sequenz erzeugt: amplifizierte Fragmente der Nukleinsäureketten bilden Matrizen für die Synthese des Informationsträger. Dadurch können Sensitivität-Bereiche von beispielweise PCR-basierten Methoden erreicht werden.
• Der Informationsträger schließt vorzugsweise mindestens einen spezifischen Marker ein, der einen Nuklease-Abbau überstehen kann (z. B. Haptene, Proteine, Nukleinsäureanaloga).
• Sämtliche Komponenten innerhalb eines Informationsträge sind vorzugsweise kovalent miteinander verbunden.
• Der Informationsträger hat einen äqivalenter Informationgehalt wie ein Teil der Zielsequenz oder die gesamte Zielsequenz dank der Fähigkeit von bestimmten sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten (z. B. mit Target-Domäne als Molecular Beacon) bis auf ein Nukleotid genau die Zielsequenz von anderen Sequenzen zu unterscheiden
• Nach Isolierung ist der Informationsträger vorzugsweise nicht mit gleichen Primern wie die Ziel-Sequenz amplifizierbar
• Nach Isolierung liegt der Informationsträge vorzugsweise in einer Komposition vor, die keine weiteren Nukleinsäureketten beinhaltet.
• Der Detektionsschritt/Der Nachweis des Informationsträger ist vorzugsweise weder auf Einhaltung spezifischer stringenter Bedingungen, noch auf Bedingungen zur Aufrechterhaltung der DNA-Doppelsträngigkeit der DNA angewiesen: Da alle Bestandteile des Informationsträger kovalent aneinander gebunden sind, können Bedingungen verwendet werden, die normalerweise mit DNA-Nachweis nicht kompatibel sind, z. B. ds-denaturierende pH-Bereiche, Temperatur oder Präsenz von Nukleasen.

Nachfolgend wird die Herstellung, Isolierung und die Detektion einer sequenzspezifisch markierter DNA (nuklease-resistenter Informationsträger) bescrhieben.
In diesem Beispiel wird sequenzspezifische Markierung von Zielsequenzen mit Auflösung bis auf 1 × Nukleotid der Zielsequenz demonstriert. Einem Fachmann ist bekannt, dass Sonden mit gewissen Strukturen Nukleinsäuresequenzen bis auf ein Nukleotid unterscheiden können. Beispielsweise Sonden mit teilweise doppelsträngigen Bereichen (z. B. Molecular beacons) können eine solche Differenzierung bei Real-Time-PCR Verfahren leisten. Weitere Beispiele wären LNA oder PNA-basierte Sonden. Im vorliegenden Beispiel werden Oligonukleotide mit Molecular-Beacon Struktur zur Differenzierung von Zielsequenzen verwendet. Diese Sequenzen stellen Bestandteile der Target-Domäne des jeweiligen Nukleotid-Konjugates dar. Die Sequenzen der Target-Domäne des sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugats und der Zielsequenz wurden teilweise der folgenden Literatur-Stelle entnommen: Marras et al. „Multiplex detection of single-nucleotide variantions using molecular beacons" Genetic Analysis: Biomedical Engineering, 1999, v. 14, 151-. In diesem Artikel wird die Fähigkeit von teilweise doppelsträngigen Oligonukleotid-Sonden (Molecular Beacons) genutzt, um vier Sequenzen mit 1 × Nukleoid-Varianten zu unterscheiden.
Material und Methoden:
Die Sequenzen sind in der Tabelle 2 zu finden. Alle Sequenzen wurden von Eurofin-Operon-MWG (Germany) synthetisiert. Tabelle 2 Sequenzen für Oligonukleotide der Target-Domänen für Nukleotid-Konjugate des Beispiel 1.5.15.9
Anmerkung zur Tabelle 2: In großen Buchstaben sind Nukleotide mit Phospho-Diester-Verbindung gezeigt, in kleinen Buchstaben sind Nukleotide mit PTO-Vebindung dargestellt (Eurofin-Operon-MWG)
Synthese von sequenzpezifischen Nukleotid-Konjugaten mit Nuklease-Resistenz mit Signal-Domänen bzw. Anker-Domänen.
Oligonukleotide (Tabelle 2) wurden mit dUTP-PEG(9)-NHS (Herstellung siehe Beispiel 1.5.14.3) an der NH2-C6-Linker am 5'-Ende des jeweiligen Oligonukleotides gekoppelt. Die Endkonzentrationen von dUTP-PEG9-NHS und Oligonukleotiden im Ansatz betrugen: ca. 4 mmol/l und ca. 0,3 mmol/l entsprechend. Die Reaktion verlief bei RT im Phosphat-Puffer pH 7,5 für 1 hr. Bei solchen Bedingungen erfolgt eine fast vollständige selektive Modifikation der terminalen Amino-Gruppe ohne Modifikation des PTO-Rückgrades des Oligonukleotids. Die Aufreinigung erfolgte anschließend mittels Ultrafiltration MWCO 10 kDa und Trip-HCl-Puffer pH 8, 100 mmol/l. Bei Bedarf erfolgte Reinigung mit RP-HPLC und DEAE-HPLC. Nukleotid-Konjugate wurden bis zu 50 μmol/l Konzentraiton verdünnt und eingefroren.
Primer-Verlängerung
Einbaupuffer (50 mmol/l Tris-HCL, 50 mmol/l NaCl, 5 mmol/l MgCl2, 10% Glycerin, 0,2 mmol/l EDTA) für Klenow-Fragment Exo minus oder ein vom Hersteller mitgelieferter Puffer zu der jeweiligen Polymerase.
dNTP: dATP, dCTP, dTTP, dGTP (Konzentration für dATP, dCTP, dGTP wurde standardmäßig bei 200 μmol/l verwendet, für dTTP bei 100 μmol/l). Abweichungen von diesen Bedingungen sind vermerkt.
Alpha-Phosphorohioat-dNTP: Sp-dATP-a-S, Sp-dCTP-a-S Sp-dGTP-a-S Sp-dUTP-a-S (BIOLOG Life Science Institute, Germany) wurden in ähnlichen Konzentrationen wie dNTP eingesetzt.
Polymerasen:
Klenow Fragment Exo minus (NEB), Taq-Polymerase (Omni-Lab), Apto-Taq-Polymerase (Roche), HotStarTaq DNA-Polymerase (Qiagen), OneTaq-Hot Start Polymerase (NEB), Vent-Polymerase exo minus (NEB), Bst-Polymerase und Bst-Polymerase Large Fragment (NEB), phi29 DNA Polymerase (NEB) AMV-Reverse Transcriptase (NEB), MMLV-Reverse-Transcriptase (NEB) Polymerasen wurden eingesetzt in die Reaktion in Verdünnung der jeweiligen Stocklösung 1:50.
Unterschiedliche Hot-Start-Polymerase wurden verwendet:
Apto-Taq-Polymerase (Roche) und OneTaq-Polymerase (NEB) sind mit einem Aptamer inaktiviert und entwickeln ihre vollständige Synthesefähigkeit erst ab ca. 45°C. Sie benötigen keine Voraktivierung. Die Synthesefähigkeit wird reversibel unterdrückt, sobald die Temperatur unter 45°C absinkt.
HotStarTaq DNA-Polymerase (Qiagen) wird bei 95°C aktiviert und behält danach ihre Aktivität auch wenn die Temperatur unter 45°C absinkt.
Matrizen, Primer, Sonden und Filter-Oligonukleotide
Tabelle 3-1 Matrizen für Primer-Verlängerung und PCR
Anmerkung zur Tabelle 3-1: Matrizen bestehen aus DNA, Primer-Bindungsstelle für T7-19-Primer ist in Kleinbuchstaben markiert, Bindungsstelle für Target-Domäne der Nukleotid-Konjugate ist in kursiv gezeigt. Die Sequenzen unterscheiden sich an einer einzigen Stelle, die unterstrichen ist. Tabelle 3-2
Anmerkung zur Tabelle 3-2: Für Testung von Reversen Transcriptasen wurde außerdem folgende Matrize verwendet. Tabelle 4 Primer für Primer-Verlagerung und PCR
Anmerkung zur Tabelle 4: In großen Buchstaben sind Nukleotide mit Phospho-Diester-Verbindung gezeigt, in kleinen Buchstaben sind Nukleotide mit PTO-Vebindung dargestellt (Eurofin-Operon-MWG)
Verwendung von Filter-1-Oligonukleotide (Hybridisierungssonden) während der Amplifikation.
Als Filter-1-Oligonukleotide wurden Oligonukleotide bezeichnet, die Bindung einer Target-Domäne eines Nukleotid-Konjugats an zielsequenzähnliche Nukleinsäureketten während einer Markierungsreaktion oder einer Aplifikation kompetetiv verhindern. Tabelle 5 Filter-1-Oligonukleotide
Anmerkung zur Tabelle 5: Alle Filter-Oligos bestehen aus DNA. Die Sequenzen unterscheiden sich an einer einzigen Stelle, die unterstrichen ist. Ihre Konzentration in der Lösung betrug 0,5 μmol/l.
Verwendung von Filter-2-Oligonukleotide (Antagonisten zu Target-Domäne) vor oder während der Detektion.
Zur Unterdrückung der Bindungsfähigkeit der Target-Domäne der Nukleotid-Konjugate nach einer abgeschlossenen Einbaureaktion wurden Filger-2-Oligonukleotide eingesetzt. Tabelle 6 Filter-2-Oligonukleotide für Bindung an die Target-Domäne vor oder während einer Detektion (Antagonisten der Target-Domäne)
Anmerkung zur Tabelle 6: Alle Filter-Oligos bestehen aus DNA. Die Sequenzen unterscheiden sich an einer einzigen Stelle, die unterstrichen ist. Ihre Konzentration in der Lösung betrug 5 μmol/l.
Reaktionsbedingungen:
Primer wurden in variablen Konzentraitonen von jeweils 0,1 μmol/l bis 1 μmol/l und sequenzspezifische Nukleotdie-Konjugate wurden in variablen Konzentraitonen von jeweils 0,01 μmol/l bis 5 μmol/l verwendet.
Primer-Verlägerung (Fig. 48)
Bei einer Primer-Verlägerung wurden die jeweiligen Nukleinsäure-Komponenten in einer entsprechenden Puffer-Lösung vorgelegt und kurzfristig bis auf 80°C erhitzt und anschließend auf RT abgekühlt (Prähybridiseirung von sequenzspezifischen Nukleotid-Analoga). Anschließend wurde die jeweilige Einbau-Reaktionen durch Zugabe der Polymerase und Termperatur-Anstieg gestartet (RT: Klenow-Fragment Exo minus, 37°C: Klenow Fragment exo minus, Taq-Polymedrase, phi29 DNA Polymerase, AMV-RT, MMLV-RT, Vent-exo minus Polymerase 50°C: Apto-Taq-Polymerase, OneTaq-Hot Start Polymerase, Bst-Polymerase, Vent Polymerase, HotStarTaq DNA-Polymerase). Die Reaktionen verliefen für ca. 10–20 min bei jeweiligen Temperatur-Bedingungen. Bei HotStarTaq DNA-Polymerase (Qiagen) wurde das Reaktionsgemisch vorher für 15 min bei 95°C erhitzt, danach auf die entsprechende Temperatur abgekühlt.
Amplifikationsreaktion (Fig. 48–Fig. 50)
Die Ausgangs-Konzentration der jeweiligen Matrize (Tabelle 2) in der Reaktion wurde variiert in Konzentrationsbereichen von ca. 1 fmol/l bis 10 pmol/l. Konzentration von Primern und anderen Reagenzien wurde ähnlich wie bei Primer-Verlängerung verwendet. Es wurden mindestens zwei Primer (Forward- und Reverse-Primer) verwendet. Auch Kombinationen aus mehreren Primern innerhalb einer Reaktion wurden verwendet. Die PCR wurde in einem konventionellen PCR-Gerät durchgeführt. Es wurden mindestens 20 Zyklen bei einer PCR Amplifikation vewendet:
Denaturierung, 95°C (15 sec),
Annealing-Temperatur, X°C (z. B. 1 min)
Verlägerung-Temperatur, 65°C (z. B. 1 min)
Abschließend wurde der Ansatz auf 4°C abgekühlt.
Bei Konzentrationen der Matrizen unter 1 fmol/l wurden 45 Zyklen durchgeführt. Die Annealing-Temperatur wurde variiert zwischen 40 und 60°C. Der Einfluss der jeweiligen Annealing-Temperatur auf Ergebnis der Markierungsreaktion ist im Teil Ergebnisse angegeben.
In einer weiteren Aufsführungsform wurden zu Primer-Verlängerungs-Reaktion oder zu Amplifikationsreaktion zusätzliche Hybridisierungssonden (Filter-1-Oligonukleotide) zugegeben. Die Filter-1-Oligonukleotide wurden in Konzentraiton von 0,5 μmol/l eingesetzt. Die 3'-OH-Gruppe an diesen Oligonukleotiden wurde durch ein Phosphat-Rest blockiert. Diese Filter-Oligonukleotide dienen deshalb nicht als Primer innerhalb der Reaktion. Sie binden an die Matrizen während des Annealing-Schritts und kompetieren mit Target-Domänen der Nukleotid-Konjugate um die Bindung an die Matrizen. Dadurch kann die Effizienz der Bindung von Target-Domänen der Nukleotid-Analoga beeinflusst werden. Ebenfalls wird dadurch auch die Effizienz des Einbaus von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten beeinflusst.
Nuklease-Degradation (Fig. 51)
Der Nuklease-Abbau erfolgte nach einem ähnlichen Schema: 10 μl des Gemischs mit markierter DNA (z. B. nach Primer-Verlängerung oder nach Amplifikation) wurde direkt zu 90 μl einer Lösung mit Nuklease in einem vom Hersteller mitgelieferten Puffer gegeben. Es wurden folgende Nukleasen gestetet (erworben bei NEB oder Fermentas): DNase I, Micrococcal nuclease, Uracil-DNA Glycosylase, 51 Nuclease, Exonuclease III (Exo III), Exonuclease I (Exo I), Mung Bean Nuclease. Es wurden die vom Hersteller empfohlenen Reaktionsbedingungen für Degradation verwendet.
Isolierung und Detektion (Fig. 51–Fig. 55):
Isolierung von markierten DNA-Fragmente erfolgte optional mit verschiedenen Methoden, z. B. Ultrafiltration, Affinitätsbindung an feste Phase oder durch Nukleasen.
Nach der jeweilgen Reaktion wurde markierte DNA mittels verschiedener Techniken analysiert. Es wurden sowohl Gel-Electrophorese (Flatgel oder Capillar-Elektrophorese) als auch immunchromatographische Technik (Lateral-Flow-Device, auch Dip-Stick-Verfahren genannt) (Milenia GenLine HybriDetect 2T, Milenia Biotec GmbH) zur Analyse und Nachweis verwendet.
Die Capillar-Electrophorese erfolgte unter doppelstrang-denaturierenden Bedingungen (ABI 310-Sequencer, POP6-Gel, 50°C). Der Dipstick-Nachweis erfolgte bei RT bis 37°C.
In einer Ausführungsform (Verfahren 1) wurden mit Biotin/Fluorescein markierten Nukleinsäuren direkt nach der Markierungs-Reaktion (Primer-Verlängerung/Amplifikation) mit Dip-Stick analysiert.
In einer Ausführungsform (Verfahren 2) wurden mit Biotin/Fluorescein markierten Nukleinsäuren direkt nach der Nuklease-Reaktion (Primer-Verlängerung/Amplifikation) mit Dip-Stick analysiert.
In einer Ausführungsform (Verfahren 3) wurden mit Biotin/Fluorescein markierten Nukleinsäuren nach der Markierungs-Reaktion (Primer-Verlängerung/Amplifikation) erst in eine Lösung mit ca. 5 μmol/l von Filter-2-Oligonukleotiden (Target-Domäne-Antagonisten) auf 90°C erhitzt, dann auf RT abgekühlt und erst danach mit Dip-Stick analysiert.
Ergebnisse und Bewertung:

Für die Sequenzspezifische Bindung zwischen der Target-Domäne und der Zielsequenz sind Kenntnisse der Schmelztemperaturen ihrer Komplexe von Bedeutung. Während Einbaureaktion werden nur solche Nukleotid-Konjugate eingebaut, die an die Zielsequenz unter den jeweiligen Bedingungen binden können. Deshalb wurden zunächst die Schmelztemperaturen (Tm) für Komplexe bestehend aus Matrizen/Target-Domänen bestimmt. Dabei wurden sowohl Perfect-Match als auch Miss-Matche getestet. Die Messung erfolgte mittels interkallierendes Farbstoffs Sybregreen bei Konzentrationen von Oligonukleotiden von ca. 0,5 μmol/l. Nachfolgend sind einige dieser Ergebnisse für ausgewählte Paare zusammengefasst (Tabelle 7) Tabelle 7 Vergleich von Tm bei Match vs. Miss-Match Hybridisierung

Matrize Miss-Match	Oligos	Match vs.	Tm,°C	Anmerkung
M40-MBTbc	MB-1Tbc1-P	1 × Miss-Match	50	DNA/DNA
M41-MBTbc	MB-1Tbc1-P	Match	60	DNA/DNA
M51-MBTbc	MB-1Tbc1-P	1 × Miss-Match	50	DNA/DNA
M52-MBTbc	MB-1Tbc1-P	1 × Miss-Match	50	DNA/DNA
M40-MBTbc	MB-Tbc1 PTO	1 × Miss-Match	42	DNA/PTO
M41-MBTbc	MB-Tbc1 PTO	Match	52	DNA/PTO
M51-MBTbc	MB-Tbc1 PTO	1 × Miss-Match	42	DNA/PTO
M52-MBTbc	MB-Tbc1 PTO	1 × Miss-Match	42	DNA/PTO
M40-MBTbc	MB-Tbc1 PTO/DNA-Mix3	1 × Miss-Match	44	DNA/PTO/DNA-Mix3
M41-MBTbc	MB-Tbc1 PTO/DNA-Mix3	Match	54	DNA/PTO/DNA-Mix3
M51-MBTbc	MB-Tbc1 PTO/DNA-Mix3	1 × Miss-Match	44	DNA/PTO/DNA-Mix3
M52-MBTbc	MB-Tbc1 PTO/DNA-Mix3	1 × Miss-Match	44	DNA/PTO/DNA-Mix3

Nach Angaben von Marras et al. liegt die berechnente Tm von Hairpin-Struktur des Molecular-Beacons liegen bei ca. 64°C, im gleichen Bereich wie die Tm der perfekt gebundenen Sonde. Die Missmatches haben Tm um ca. 13°C geringer als perfekt Match. Trotz gewisser Abweichungen, stimmten unsere Daten mit denen von Marras et al. gut überein. In Marras et al. Wird vorgeschlagen, die Annealings- und Detektionstemperatur so zu wählen, dass die perfekt hybridisierte Sonden sicher binden, im Fall von DNA/DNA-Hybriden entspricht diese Detektionstemperatur von ca. 56°C. Das Absinken der Tm für DNA/PTO-Hybride wurde ebenfalls erwartet.
Für die Amplifikation und Markierung von Zielsequenzen wurden unterschiedliche Annealing-Temperaturen ausgetestet. Diese wurde so gewählt, dass die Annealing-Temperaturen um die Schmelztemperatur +/–10°C liegen. Die Spezifität des Einbaus wurde anschließend mittels unterschiedlicher Detektionsmethoden (s. o.) beurteilt. Nachfolgend sind die wichtigsten Ergebnisse zusammengefasst.
Markierung während der Primer-Verlängerung (Fig. 48)
Der Einbau von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten wurde zunächst während einer Primer-Verlängerung untersucht.
Es wurde festgestellt, dass alle synthetisierten Nukleotid-Konjugate mit Struktur dU-PEG(9)-Oligonukleotid erfolgreich von verwendeten Polymerasen in den Primer eingebaut werden können und konkurrieren erfolgreich mit 100 μmol/l dTTP um den Einbau in den wachsenden Strang. Erst bei 1 mmol/l konnte komplette Suppression des Einbaus von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten beispielsweise durch Taq-Polymerasen beobachtet werden.
Es wurde festgestellt, dass bei 3 oder 6 Nukleotid-Mutationen eine sehr gute Sequenz-Differenzierung und sequenzabhängiger Einbau in einem weiten Temperatur-Bereich erfolgen kann. Daher wurden weiterhin Perfekt-Match-Komplexe (Matrize-Target-Domäne) und Ein-Nukleotid-Miss-Match-Komplexe (Matrize-Target-Domäne) genauer untersucht.
Wie erwartet, war die Sequenz-Spezifität des Einbaus von der Inkubationstemperatur während der Einbaureaktion abhängig. In Reaktionen mit nur einem sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugat im Ansatz und Temperaturen signifikant unter Tm des Miss-Match-Komplexes (z. B. bei RT oder 37°C) konnte keine Differenzierung von einzelnen Nukleotid-Unterschieden festgestellt werden. Die Target-Domäne des Nukleotid-Konjugats bindet sowohl an perfect match als auch an Miss-Match, die Nuk-Komponente wird von Polymerasen eingebaut.
Bei Temperaturen um Tm des Miss-Matches war die Ausbeute des Einbaus an der Matrize mit einem Nukleotid-Miss-Match wesentlich geringer als an der Matrize mit einem Pefekt-Match Hybridiserungsverhalten.
Bei Anhebung der Verlängerungstemperatur bis auf Tm des Perfect-Match-Komplexes (z. B. ca. 50°C bei Target-Domänen MB-Tbc1 PTO oder MB-Tbc4 PTO) wird das Nukleotid-Konjugat nur dann eingebaut, wenn Zielsequenz mit einer perfekten Übereinstimmung im Ansatz vorliegt (48). Bereits Ein-Nukleotid-Unterschied kann in einem solchen System zum Verlust der Markierung führen. Ein solches System kann also Sequenzen bis auf ein Nukleotid im Bereich der Bindung der Target-Domäne unterscheiden.
Weitere Steigerung der Reaktionstemperatur führt zu Verringerung der Ausbeuten beim Einbau. Bei Reaktionstemperaturen im Bereich Tm + 15°C (bezugen auf Perfekt-Match-Komplex) findet keine Markierung mehr statt auch wenn Taget-Domäne theoretisch in der Lage wäre, einen Perfekt-Match-Komplex mit der Matrize zu bilden.
Dieses Verhalten konnte für alle synthetisierten sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugate beobachtet werden. Durch Änderung der Tm der Target-Domäne (z. B. von PTO auf PTO-DNA-Mix) änderten sich auch die optimalen Bedingungen, bei denen Ein-Nukleotid-Unterschied nachweisbar war.
Primer-Verlängerung in Anwesenheit von Filter-1-Oligonukleotiden
Es wurde untersucht, ob zusätzliche, die Bindung der Target-Domäne beeinflussende Oligonukleotide die Spezifität der Einbaureaktion ändern können. Ein sequenzspezifischer Nukleotid-Konjugat (z. B. dU-PEG(9)-MB-Tbc1-PTO) bildet ein Perfekt-Match-Komplex mit Matrize (M41-MBTbc) mit Tm ca. 52°C. Das gleiche Nukleotid-Konjugat kann ein Miss-Match-Komplex mit Matrize (M40-MBTbc) mit Tm bei ca. 42°C bilden. Weiterhin wurde getestet, dass Filter-1-Oligonukleotid MB-1Tbc 4-P mit Matrize (M40-MBTbc) einen Perfekt-Match-Komplex mit Tm um 60°C bildet und einen Miss-Match-Komplex mit (M41-MBTbc) mit Tm um 50°C. Bei gleichzeitiger Inkubation von beiden Matrizen (M40-MBTbc) und (M41-MBTbc) mit dU-PEG(9)-MB-Tbc1-PTO und Filter-1-Oligonukleotid MB-1Tbc4-P konkurrieren Matrizen und Perfekt-Match-Komplexe. Das Oligonukleotid verhindert weitgehend die Ausbildung eines Miss-Match-Komplexes zwischen (M40-MBTbc) und dU-PEG(9)-MB-Tbc1 PTO. Eine Primer-Verlägerungsreaktion in einer solchen Komposition ergibt, dass Nukleotid-Konjugat weiterhin sequenzspezifisch eingebaut werden kann, wobei der Temperatur-Bereich in dem ein sequenzspezifischer Einbau stattfindet deutlich größer ist. Zusammenfassen konnte festgestellt werden: Durch Filter-1-Oligonukleotiden, die mit einer Sequenz einen Perfekt-Match-Komplex ausbilden können, wird der Einbau von ebenfalls Perfekt-Match-Komplex bildenden Nukleotid-Konjugaten nicht wesentlich gestört, aber der Einbau von Miss-Match-Komplex bildenden Nukleotid-Konjugaten stark reduziert.
Ähnlichen Effekt konnte erreicht werden, wenn in der Reaktion sämtliche Perfekt-Match-komplex bildenden Varianten von Nukleotid-Konjugaten vorliegen. Sie konkurrieren miteinander um Perfekt-Match und verhindern die Mis-Match-Ausbildung. Dies ist beispielsweise der Fall in einer Komposition mit Matrizen (M40-MBTbc) und (M41-MBTbc) sowie mit Nukleotid-Konjugaten dU-PEG(9)-MB-Tbc1-PTO und dU-PEG(9)-MB-Tbc4-PTO.
Die Struktur der Filter-1-Oligonukleotiden kann nicht nur DNA, sondern auch andere Varianten von Oligonukleotiden einschließen, z. B. PNA, LNA usw. Die Spezifität der Bindung kann durch einen partiellen Doppelstrang gesteigert werden, z. B. durch Molecular-Beacon-Bildung.
Es können mehrere Filter-1-Oligonukleotide gleichzeitig in einer Komposition vorliegen.
Synthese von Nuklease-Resistenten DNA-Fragmenten
Durch Verwendung von PTO-Modifikationen können Oligonukleotide resistente Eigenschaften gegenüber Nukleasen erwerben. Weitere Modifikationen, wie PNA, LNA oder 2'-O-Me-Modifikationensind einem Fachmann bekannt.
Es wurden mehrere Nukleasen untersucht. Der Einsatz von Dnase I und Micrococcal Nuclease ermöglichte Beseitigung von nicht markierten DNA-Fragmenten nach einer Reaktion. Dieses Beispiel wird ausführlicher dargestellt. Es wurden DNA-Primer (T7-19-Biotin-DNA) und verschiedene PTO-haltige Primer (s. o.), sowie Nukleotid-Konjugate mit PTO-haltigen Target-Domänen verwendet (s. o.). Während der Primer-Verlängerungsreaktion an (M41-MBTbc) wurden Biotin-markierte Primer und Fluorescein-markierte Nukleotid-Konjugate kovalent verknüpft. Eine anschließende Behandlung mit Dnase I führte dazu, dass Sequenzen mit längeren Abschnitten der nicht durch PTO-geschützten DNA, z. B. T7-19-Biotin-DNA, sowie Matrizen (M41-MBTbc) innerhalb von wenigen Minuten durch Dnase I abgebaut wurden. Dagegen konnte einige Varianten der modifizierten DNA der Degradation durch Dnase I wiederstehen. Solche Varianten resultierten aus Reaktionen, die folgende Komponenten einschließen: einen von den folgenden Primern (T7-19-PTO-Biot, T719-PTO2-Biot, T719-PTO3-Biot), einen von dUTP-Konjugaten mit einer der folgenden Target-Domäne (MB-Tbc1-PTO, MB-Tbc1 PTO/DNA-Mix2, MB-Tbc1 PTO/DNA-Mix3) und vier dNTPs. Eine Degradation mittels Micrococcal Nuclease führte dazu, dass lediglich markierte DNA aus der Reaktion von T7-19-PTO-Biot und dU-PEG(9)-MB-Tbc1-PTO die Degradation überstehen konnte. Andere Varianten der markierten DNA wurden innerhalb weniger Minuten degradiert.
Durch die Modifikation der Primer und der Bestandteile von Nukleotid-Konjugaten konnte eine erhöhte Wiederstandsfähigkeit gegenüber Nukleasen sequenzspezifisch auf die neu synthetisierten DNA-Stränge übertragen werden.
Durch Auswahl der Nukleasen können unterschiedliche Teile der DNA abgebaut werden. Beispielsweise können sämtliche nicht markierte Nukleinsäureketten aus der Reaktion beseitigt werden.
Die Synthese einer Nuklease-wiederstandsfähigen markierten DNA kann beispielsweise auch durch Einsatz von Alpha-Phosphorothioat-dNTPs erfolgen. Es können beispielsweise Kompositionen verwendet werden, die sowohl Alpha-Phosphorothioat-dNTPs als auch natürliche dNTPs einschließen.
Selektiver Schutz der markierten DNA-Fragmente kann auch in Kombination mit weiteren Varianten der Nukleasen-Degradation komnbiniert werden. Es können beispielsweise Kompositionen aus mehreren Nukleasen verwendet werden. Durch verschiedene Restriktionsendonukleasen können in einer anderen Auführungsform Sequenzen auch sequenzspezifisch gespalten werden.
Detektion mit DipStick (Fig. 53–Fig. 54)
Markierte Nukleinsäurefragmente können schnell mit einem immunchromatographischen Verfahren nachgewiesen werden. Viele solche Verfahren sind einem Fachmann bekannt. Je nach Ausstattung und Design können mehrere Analyte gleichzeitig analysiert werden, bzw. kann die Intensität einzelner Signale beurteilt werden. Es können fluoreszierende, chromogene, elektrochemische oder auch weitere Signale zur Detektion verwendet werden. Das Nachweisverfahren mit einem Streifentest, Dipstick, von Milenia GenLine HybriDetect 2T detektiert Moleküle, die gleichzeitig Biotin und Fluorescein-Markierung aufweisen. Im vorliegenden Beispiel trugen Primer einen Biotin-Rest und sequenzspezifische Nukleotid-Konjugate einen Fluorescein-Rest. Biotin wird durch an der Membran gekoppeltes Streptavidin gebunden und Fluorescein wird durch Nanogold-Teilchen detekliert, die mit Anti-Fluorescein konjugiert sind. Ein spezifisches Signal entsteht, wenn ein Molekül beide Markierungen gleichzeitig aufweist: Biotin und Fluorescein. Bei ausreichender Konzentration von solchen doppelt markierten Molekülen kann man das spezifische Signal mit bloßem Auge als eine sichtbare Bande am Streifen sehen. Das Detektionslimit eines solchen Streifens lag in unserem Experiment bei einer Konzentration von ca. 100 pmol/l doppelt markierter Nukleinsäuremoleküle. Entstehung einer spezifischen Bande wurde als ausreichend für eine qualitative Detetkion eines spezifischen Signals erachtet. In jedem Experiment wurden entsprechende Positiv- und Negativkontrollen mitgeführt.
Einem Fachmann ist Anwendung solcher Streifentest bekannt. Üblicherweise werden markierte Sonden an einen Einzelstrang einer Nukleinsäure via Hybridisierung gebunden. Die Spezifität der Analyse hängt von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen und Komplexität des Gemischs ab. Die Bedingungen des Assays werden dermassen optimiert, dass die Sonden mit spezifischer Markierung nur dann detektiert werden, wenn sie ausreichend spezifisch an die Zielsequenzen hybridisiert sind. Oft werden mehrmalige Wasch-Schritte unter zunehmend stringenteren Bedingungen durchgeführt, um Spezifität der Analyse zu erreichen und unspezifisch gebundene Fragmente zu eliminieren.
Kombination der Isolierung durch Nukleasen-Degradation mit Detetion mittels eines Steifentests.
In dem von uns beschriebenen Beispiel sind die beiden Markierungen (Biotin und Fluorescein) nach dem Einbau des sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugats kovalent innerhalb eines DNA-Moleküls gebunden. Durch Verwendung von PTO-Analoga sind bestimmte Bereiche der neu synthetisierten, mit Nukleotid-Konjugaten markierten DNA vor Nukleasen geschützt.
Die kovalente Kopplung ermöglicht Einsatz von Isolierungsverfahren und Detektionsbedingungen, die beispielsweise zur Zerstörung eines ungeschützten DNA-Doppelstrangs, bzw. eines ungeschützten Einzelstrangs führen können. Durch Beseitigung nicht markierter Nukleinsäureketten kann unspezifische Bindung der markierten Nukleinsäuren an weitere Nukleinsäureketten deutlich gesenkt werden, was zu einer Steigerung der Spezifität führen kann oder zur Steigerung der Robustheit des Assays.
In einer Ausführung wird markierte DNA nach einer Isolierung mittels Nuklease-Degradation (z. B. Dnase I oder Micrococcal nuclease s. o.) mit einem Streifentest detektiert. Die durch kovalenten Einbau von sequenzspezifsichen Nukleotid-Konjugaten markierten Fragmente der DNA werden dabei detektiert. Folgende Komponenten werden beispielsweise durch Nukleasen abgebaut: Einzelsträngige DNA-Matrizen, doppelsträngige Bereiche und die nicht durch PTO geschützt sind. Die degradierten Elemente (Mono-, Di-, Trinukleotide) bieten keine Möglichkeit für eine unspezifische Hybridisierung von markierten Komponenten des Systems und stören deswegen die Detektion mit einem DipStick nicht.
Während der Detektion von markierten DNA-Fragmenten müssen keine stringente Bedingungen aufrechterhalten werden: sämtliche unmarkierten DNA-Bereiche sind degradiert, so dass keine Interferenzen durch unspezifische Hybridisierung entstehen können. Markierte DNA kann unter diskriminierenden Bedingungen synthetisiert werden (z. B. bei Reaktionstemperatur um Tm von Perfekt-Match-Komplex zwischen Matrizen-DNA und sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten, s. o.). In einem solchen Beispiel können Nukleotid-Konjugate die Zielsequenz bis auf ein Nukleotid genau unterscheiden (s. o.). Eine anschließende Degradation von nicht markierten Fragmenten beseitigt sämtliche Matrizen, so dass keine unspezifische Bindung zwischen Nukleotid-Konjugaten und DNA mehr stattfinden kann. Aus dem Signal der Detektion der sequenzspezifisch markierten DNA kann folglich die Sequenz der Ziel-Sequenz abgeleitet werden.
Kombination einer selektiven Absättigung der Target-Domäne durch Antagonisten mit Detektion mittels eines Steifentests.
In einer weiteren Ausführung des Nachweises von markierten DNA mit einem Steifentest werden Target-Domänen der Smart-Nukleotdie durch spezifische Antagonisten der Target-Domäne (Filter-2-Oligonukleotide) vor der Detektion abgesättigt. Beispiele für Filter-2-Oligonukloeide sind in der Tabelle 6 abgebildet. Diese Filter-2-Oligonukloeide werden in hoher Konzentration nach der Markierungsreaktion zur markierten DNA zugegeben. Durch anschließende Erhitzung kommt es zur Destabilisierung der Bindung von Target-Domänen an die DNA und bei einer folgenden Abkühlung werden die Target-Domänen der Nukleotid-Konjugate mit Filter-2-Oligonukleotiden besetzt.
Durch die Filter-2-Nukleotdie kann Diskriminierungsfähigkeit des Assays auch ohne Isolierung der markierten DNA, z. B. ohne Nuklease-Abbau, gesteiger werden. Da sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugate kovalent gebunden sind, besteht nach dem Einbau kein zwingender Bedarf mehr in einer Target-Domäne. Sie kann daher während der Einbaureaktion oder nach dem Einbauereignis abgespalten oder beispielsweise ihre Fähigkeit zur Bindung an die Sequenzen durch einen Antagonisten (in diesem Beispiel Filter-2-Oligonukloeide) inaktiviert werden.
In dieser Ausführungsform des Beispiels werden Filter-2-Oligonukleotide (z. B. MB-1Tbc 6) an die Target-Domäne der Nukleotid-Konjugate (z. B. dU-PEG(9)-MB-Tbc1-PTO) nach der Einbaureaktion hybridisiert. Die Hybridisierung ergibt einen Perfekt-Match zwischen Target-Domäne und Filter-2-Oligonukleotid. Dadurch wird spezifische oder unspezifische Interkation mit komplementären oder nicht-Komplementären Matrizen verhindert. Das Filter-2-Oligonukleotid unterdrückt kompetetiv die Bindung. Durch einen signifikanten Überschuß an Filter-2-Oligonukleotiden (5 μmol/l) über den eingesetzten Konzentrationen von Nukleotid-Konjugaten werden vorzugsweise sämtliche Target-Domänen abgesättigt. Filter-2-Oligonukleotide können nicht nur für Absättigung der Target-Domäne von Nukleotid-Konjugaten dienen. Es können verschiedene andere Bereiche der Zielsequenzen durch solche Oligonukleotide blockiert werden.
Die Struktur der Filter-2-Oligonukleotiden kann nicht nur DNA, sondern auch andere Varianten von Oligonukleotiden einschließen, z. B. PNA, LNA usw. Die Spezifität der Bindung an die Target-Domäne kann durch einen partiellen Doppelstrang gesteigert werden, z. B. durch Molecular-Beacon-Bildung.
Es können mehrere Filter-2-Oligonukleotide in einer Komposition vorliegen.
Zusammenfassend kann man feststellen, dass verschiedene Methoden zur Steigerung der Spezifität der Analyse während der Synthese, der Markierung, der Isolierung oder der Detektion mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten kombiniert werden können. Dank der sequenzspezifischen kovalenten Markierung durch sequenzspezifische Nukleotid-Konjugate können neuartige Kombinationen während einzelner Schritte eingesetzt werden. Ohne Einsatz solcher sequenzspezifischer Nukleotid-Konjugate wäre der Einsatz solcher Methoden nicht möglich.
Die hier beschriebenen einzelnen Beispiele zur Steigerung der Spezifität können von einem Fachmann auch kombiniert werden. Beispielsweise kann Einsatz von Filter-1-Oligonukleotiden während der Markierung mit einer Nuklease-Degradation nach der Markierung kombiniert werden.
Markierung während der Amplifikation mittels PCR
Es wurden verschiedene thermostabile Polymerasen in Einbaureaktionen von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten verwendet. Es wurden sowohl Hotstart-Polymerasen als auch nicht Hotstart-Polymerasen verwendet. Mit verschiedenen Varianten von Matrizen und Primern (s. o.) konnten Amplifikationsreaktion in Anwesenheit von synthetisierten Nukleotid-Konjugaten durchgeführt. Durch Variationen in Annealing-Temperaturen konnten unterschiedliche Diskriminierungsgrade erreicht werden. Bei Verwendung von dU-PEG(9)-MB-Tbc1-PTO (0,1 μmol/l) und Primer T719-PTO3-Biot (0,5 μmol/l) konnte beispielsweise Differenzierung der Sequenzen bis auf Ein-Nukleotid-Unterschied bei Annealing-Temperaturen zwischen 48°C und 54°C erreicht werden. Die Miss-Match-Diskriminierung konnte durch Zugabe von dU-PEG(9)-MB-Tbc1-PTO in Kombination mit entsprechenden Filter-1-Oligonukleotiden (0,5 μmol/l) weiterhin verbessert: beispielsweise konnte die Annealing-Temperatur noch weiter abgesenkt werden. Auch in Reaktionen mit multplen Matrizen (vier Varianten der Matrize waren gleich bis auf eine Nukleotid-Position) konnte die korrekte Matrize sequenzspezifisch markiert werden dank Ausbildung eines Perfekt-Match zwischen der Zielsequenz und der Target-Domäne des Nukleotid-Konjugats und darauf folgendem Einbau der Nukleotid-Komponente.
In einer Ausführungsform wurden Nukleasen zur Isolierung der mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten markierten DNA Fragmente verwendet. Dnase I konnte innerhalb weniger Minuten PTO-geschützte Bereiche der DNA isolieren. In einer Ausführungsfrom erfolgte die Detektion der isolierten PTO-geschützten-Fragmente der markierten DNA mittels Steifentests (s. o.).
Durch Kombination der oben genannten Methoden konnten bei Bedarf eine Diskriminierung bis auf ein Nukleotid in der Zielsequenz erreicht werden. Dabei wurden folgende Ergebnisse erreicht:

• Markierte DNA wurde während einer Amplifikationsreaktion synthetisiert
• Die Amplifikation lieferte ausreichend viel markierte DNA zur Detektion mittels eines Streifentests
• Die Synthese-Bedingungen konnten dermassen gestaltet werden, dass eine Diskriminierung der Zielsequenz bis auf ein Nukleotid durch die Target-Domäbe der Nukleotid-Konjugate möglich war.
• Diese Spezifität konnte sowohl durch sequenzspezifische Nukleotid-Konjugate als auch durch zusätzliche Filter-1-Oligonukleotide noch weiter verstärkt werden.
• Markierte DNA konnte isoliert werden.
• Die Isolierung des markierten Fragmenten der DNA konnte beispielsweise durch Nukleasen erreicht werden.
• Eine große Auswahl der Nukleasen mit unterschiedlichen Substratspezifitäten steht einem Fachmann zur Verfügung und ermöglicht individuelle Anpassung der Struktur der markierten DNA an die jeweiligen Bedingungen der Isolierung mit Nukleasen. Sowohl die Wahl der Nuklease als auch die Zusammensetzung der markierten DNA spielen dabei eine Rolle.
• Eine große Auswahl an möglichen Modifikationen am Oligonukleotiden (z. B.
PTO, LNA, PNA, Morpholino, 2'-O-Me usw.) bietet großes Spektrum für Anpassung der Primer und Target-Domänen für eine bestimmte Nuklease.
• Durch die Wahl der entsprechenden Target-Domäne und Reaktionsbedingungen können multiple, im gleichen Ansatz vorliegende Sequenzen bis auf ein Nukleotid genau unterschieden werden.
• Der Nachweis der markierten DNA kann mittels unterschiedlicher Methoden erfolgen. Unter anderem können einfache Detektionsbedingungen eines Streifentests verwendet werden.
• Unterschiedliche weitere Komponenten (z. B. Filter-1-Oligonukleotide, Filter-2-Oligonukleotide, Alpha-Phorsphorothioat-dNTPs, Notstart-Polymerasen, Nukleasen) können die Spezifität eines Assay mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten verstärken.

Aufrund ähnlicher Prinzipien bei anderen Vervielfältigungsreaktionen (z. B. HDA, SDA) können ähnliche Bedingungen in solchen Reaktionen auch eingesetzt werden.
In Anmeldung Cherkasov et al WO2011050938 sind viele Literaturquellen die Amplifikation von Nukleinsäureketten und Detektion mit spezifischen Sonden beschreiben. Die Zusammensetzung von Primern und Reaktionsbedingungen für die Markierung mit Nuk-Makrmolekülen können aus dieser Literatur entnommen werden. Die zielsequenzspezifsiche Zusammensetzung der Target-Domäne einer jeweiligen Art von Nuk-Makromolekülen kann von der Zusammensetzung der für Real-Time PCR beschriebenen Sonden ähnlich wie im oben beschriebenen Beispiel übernommen bzw. abgeleitet werden.
1.5.15.7 Markierung von Zielsequenzen durch an einer festen Phase gebundenen Nuk-Makromoleküle
Diese Reaktion wurde ähnlich wie im Beispiel 1.5.15.1 durchgeführt. Die Zielsequenz (Matrize 2, M2) wurde mit einem Primer und Nuk-Makromolekül (dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA) hybridisiert und anschließend spezifisch über die Anker-Domäne der Nuk-Makromoleküle an die feste Phase gebunden. Dieses Nuk-Makromolekül hat dUTP als Nuk-Komponente, eine Target-Domäne, die an die Zielsequenz binden kann, eine Anker-Domäne (dA25), sowie einen Fluorescenzfarbstoff (TAMRA) am 3'-Ende der Anker-Domäne, der als Signal-Domäne dient. Es wurde eine feste Phase verwendet, die diese Anker-Domäne binden kann (dT48-Magnetische Beads, Vorbereitung siehe Abschnitt 1.5.15.5). Nach der Bindung wurde die feste Phase mit Einbaupuffer 1 gewaschen und im Einbaupuffer 1 suspendiert.
Zu dieser festen Phase mit gebundenen Reaktionskomponenten wurden natürliche Nukleotide (dATP, dCTP, dGTP jeweils 100 μmol/l) zugegeben. Das dTTP wurde in Reaktion 1 (Lane 1) weggelassen und in Reaktion 2 (lane 2) bis 100 μmol/l zugegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Klenow Fragment exo minus (1:50) gestartet und verlief bei RT für 30 min. Nach der Reaktion wurde die feste Phase direkt auf das Gel geladen und Produkte wurden mittels denaturierender Elektrophorese getrennt unter 85°C.
Das Ergebnis ist in der 30 abgebildet.
Man sieht den Einbau von Nuk-Makromolekülen in den verlagerten Primer, wobei bei fehlendem dTTP keine vollständige Synthese des komplementären Stranges erfolgte (Pfeil A1.1 und A1.2, Lane 1). In Anwesenheit von dTTP konnte Klenow Fragment exo minus die Strandsynthese in voller Länge ausführen (Pfeil A2, Lane 2). Da in diesem Experiment das Nuk-Makromolekül einen Fluoresezenzfarbstoff trägt, sieht man das nicht in der Reaktion vebrauchte Nukleotid (Pfeil C1). Die Unvollständigkeit des Verbrauchs von Nuk-Makromolekül wird auf die sterischen Einflüsse der Oberfläche zurückgeführt.
Beispiele für Anwendung von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten mit terminierenden Eigenschaften
Die Verhindung der Verlängerung des komplementären Stranges von bestimmten Sequenzen bei einer Amplifikationsreaktion kann beispielsweise in folgenden Fragestellungen von Bedeutung sein:
Anwendung bei In Vitro Analysen:

• In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann eine oder mehrere Sequenzen (Population N1–Nx) in Anwesenheit einer oder meherer Sequenzen (Population Z1–Zx) vermehrt werden.
• In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die Population N1–Nx Sequenzen abstammend von einem Tumor, während Sequenzen der Population (Z1–Zx) unveränderte, wild-Typ-Sequenzen der Spezies darstellen. Sequenzen des Tumors (Population N1–Nx) unterscheiden sich dabei von Sequenzen des Willd-Typs (Population Z1–Zx).
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform schließt die Population N1–Nx mutierte Sequenzen abstammend von einem Virus, während Sequenzen der Population (Z1–Zx) unveränderte, wild-Typ-Sequenzen des Virus darstellen.
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform schließt die Population N1–Nx Sequenzen abstammend von einem Fetus, während Sequenzen der Population (Z1–Zx) Sequenzen des mütterlichen Organismus darstellen.

Zielsequenzen aus einem biologischen Materiel liegen oft nicht in reiner Form vor, sondern sind von Sequenzen mit ähnlicher Zusammensetzung kontaminiert. In einem Assay sollen allerdings bevorzugt nur einer Art von Zielsequenzen nachgewiesen werden und das Signal von anderen potenziellen Zielsequenzen unterdrückt werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform werden erfindungsgemäße Nukleotid-Konjugate mit sequenzspezifischen terminierenden Nuk-Komponenten (z. B. 2',3'-Dideoxy-nukleosid-triphosphate) in konventionellen Assays eingesetzt. Durch Einsatz von sequenzspezifischen Terminatoren können beispielsweise Amplifikation und/oder Markierung und/oder Nachweis von bestimmten Sequenzvarianten (negativ selektierte Zielsequenzen) unterdrückt werden. Dies führt zu einem verbesserten Signal-Rauschen-Verhältnis des Assays. Ein solches Beispiel stellt die Unterdrückung der Vervielfältigung von Wild-Typ-Sequenzen und Nachweis von mutierten Sequenzen dar. Mutierte Sequenzen kommen oft nur in geringen Mengen in einem Material vor. Die Wild-Typ Sequenzvariante liegt dagegen in großer Anzahl vor. Durch die Unterdrückung der Amplifikation von Wild-Typ-Sequenzen können mutierte Sequenzen für weitere Analysen mittels einer Amplifikation angereichert werden.
Liste mit verwendeten Sequenzen:

Bezeichnung, Modifikationen, Sequenz

Primer und Proben/Sonden/Anker
Oligonukleotid-Komponente der Nuk-Makromoleküle
Antagonisten-Oligonukleotide [aT(n)]
Verwendete Matrizen:
Alle Publikationen, Patente und Patentanmeldungen, die hier zitiert wurden, sind eingebaut in diese Anmeldung in vollem Umfang (auch wenn dies bei jeweiliger Publikation nicht expliziert genannt wurde) und unterliegen laut USPTO den Regelungen für „incorporated by reference” für alle Zwecke in den USA.
Einzelne Ausführungsformen sollten zur Veranschaulichung der Erfindung dienen und können vom Fachmann weiter miteinander kombiniert werden. Die Kombinationen aus einzelnen Ausführungsformen stellen ebenfalls gegenstand der vorliegenden Erfindung da r.
Legenden für Figuren
Fig. 26 zum Beispiel 1.5.15.1 Einbau in Anwesenheit von konkurrierenden Nukleotiden
Abbildung eines Gels nach elektrophoretischer Auftrennung der Reaktionsprodukte. Nachfolgend sind Komponenten einzelner Reaktionen angegeben, die außer der Matrize, Primer und Polymerase zugegeben wurden. Einzelne Lanes entsprechen einzelnen Reaktionen.

1. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA
2. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA + dTTP 10 μmol/l
3. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA + dTTP 100 μmol/l
4. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA + dTTP 1 mmol/l
5. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA + dTTP 100 μmol/l + dGTP 100 μmol/l
6. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA + dTTP 1 mmol/l + dGTP 100 μmol/l
7. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA + dTTP + dATP + dCTP + dGTP je 100 μmol/l
8. Kontroll: nur dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA, keine Polymerase

Pfeil (A) zeigt die Position des verlängerten Primers mit dem eingebauten dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA, Pfeil (B) zeigt die Position des dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA im Gel.
Fig. 27 zum Beispiel 1.5.15.2 Konkurrenz mit 10 mmol/l dTTP

Abbildung eines Gels nach elektrophoretischer Auftrennung der Reaktionsprodukte. Nachfolgend sind Komponenten einzelner Reaktionen angegeben, die außer der Matrize, Primer, dATP, dGTP, dCTP (je 100 μmol/l) und Polymerase (einzelne Konzentrationen siehe unten) zugegeben wurden, sowie die Bewertung der Einbaureaktion (Einbau/kaum Einbau/Kein Einbau usw.). Einzelne Lanes entsprechen einzelnen Reaktionen.

Klenow 1:10
1. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA	Einbau
2. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA + dTTP 100 μmol/l	Einbau
3. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA + dTTP 10 mmol/l	Einbau
Klenow 1:100
4. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA	Einbau
5. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA + dTTP 100 μmol/l	Einbau
6. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA + dTTP 10 mmol/l	Einbau
Klenow 1:1000
7. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA	Einbau
B. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA + dTTP 100 μmol/l	Einbau
9. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA + dTTP 10 mmol/l	kaum Einbau
Taq 1:100
10. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA	Einbau
11. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA + dTTP 100 μmol/l	Einbau
12. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA + dTTP 10 mmol/l	kaum Einbau
Vent exo – 1:100
13. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA + dTTP 10 mmol/l	kein Einbau
14. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA + dTTP 100 μmol/l	Einbau
15. + dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA	Einbau

Pfeil (A1) zeigt die Position des vollständig verlängerten Primers mit dem eingebauten dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA. Pfeil (A2) zeigt die Position des teilweise verlängerten Primers mit dem eingebauten dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA. Pfeil (B) zeigt die Position des dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA im Gel.
Fig. 28 zum Beispiel 1.5.15.4 Zyklische Markierungsreaktion, Unterschiedliche Zielsequenzen, Unterschiedliche Temperaturen
Abbildung eines Gels nach elektrophoretischer Auftrennung der Reaktionsprodukte. Einzelne Lanes entsprechen einzelnen Reaktionen.
Fig. 28, M2
(Reaktionen mit Matrize 2, M2)

1. Zyklische (20 Zyklen) Primer-Verlängerung mit Taq-Polymerase und folgenden Komponenten: M2, Primer, vier dNTPs, dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA;
2. Primer-Verlängerung mit Taq-Polymerase und folgenden Komponenten: M2, Primer, vier dNTPs, ohne dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA;
3. Leiter: dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA, markierter Primer
Pfeil A1: das mit dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA markierte Produkt der Primer-Extension (keine vollständige Strangverlängerung)
Pfeil B1: das Produkt der Primer-extension ohne dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA (Markierung durch Primer-Cy3)
Pfeil C1: dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA (Nuk-Makromolekül)
Pfeil D1: das Produkt des Abbau von dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA durch 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase
Pfeil E1: der markierte Primer (T7-19-Cy3)

Fig. 28, M4
(Reaktionen mit Matrize 4, M4)

1. Zyklische (20 Zyklen) Primer-Verlängerung mit Taq-Polymerase bei 35°C und folgenden Komponenten: M4, Primer, vier dNTPs, dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA;
2. Zyklische (20 Zyklen) Primer-Verlängerung mit Taq-Polymerase bei 45°C und folgenden Komponenten: M4, Primer, vier dNTPs, dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA;
3. Zyklische (20 Zyklen) Primer-Verlängerung mit Taq-Polymerase bei 55°C und folgenden Komponenten: M4, Primer, vier dNTPs, dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA;
4. Primer-Verlängerung mit Taq-Polymerase und folgenden Komponenten: M4, Primer, vier dNTPs, ohne dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA;
5. Leiter: dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA, markierter Primer
Pfeil A2: das mit dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA markierte Produkt der Primer-Extension (vollständige Strangverlängerung)
Pfeil B1: das Produkt der Primer-extension ohne dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA (Markierung durch Primer-Cy3)
Pfeil C1: dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA (Nuk-Makromolekül)
Pfeil E1: der markierte Primer (T7-19-Cy3)

Fig. 28, M8
(Reaktionen mit Matrize 8, M8)

1. Leiter: dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA, markierter Primer
2. Zyklische (20 Zyklen) Primer-Verlängerung mit Taq-Polymerase bei 35°C und folgenden Komponenten: M8, Primer, vier dNTPs, dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA;
3. Zyklische (20 Zyklen) Primer-Verlängerung mit Taq-Polymerase bei 45°C und folgenden Komponenten: M8, Primer, vier dNTPs, dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA;
4. Zyklische (20 Zyklen) Primer-Verlängerung mit Taq-Polymerase bei 55°C und folgenden Komponenten: M8, Primer, vier dNTPs, dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA;
5. Primer-Verlängerung mit Taq-Polymerase und folgenden Komponenten: M8, Primer, vier dNTPs, ohne dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA;
Pfeil A2: das mit dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA markierte Produkt der Primer-Extension (vollständige Strangverlängerung)
Pfeil B1: das Produkt der Primer-extension ohne dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA (Markierung durch Primer-Cy3)
Pfeil C1: dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA (Nuk-Makromolekül)
Pfeil D1: das Produkt des Abbau von dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA durch 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase
Pfeil E1: der markierte Primer (T7-19-Cy3)

Fig. 28, M9
(Reaktionen mit Matrize 9, M9)

1. Zyklische (20 Zyklen) Primer-Verlängerung mit Taq-Polymerase bei 35°C und folgenden Komponenten: M9, Primer, vier dNTPs, dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA;
2. Zyklische (20 Zyklen) Primer-Verlängerung mit Taq-Polymerase bei 45°C und folgenden Komponenten: M9, Primer, vier dNTPs, dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA;
3. Zyklische (20 Zyklen) Primer-Verlängerung mit Taq-Polymerase bei 55°C und folgenden Komponenten: M9, Primer, vier dNTPs, dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA;
4. Primer-Verlängerung mit Taq-Polymerase und folgenden Komponenten: M4, Primer, vier dNTPs, ohne dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA;
Pfeil B1: das Produkt der Primer-extension ohne dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA (Markierung durch Primer-Cy3)
Pfeil C1: dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA (Nuk-Makromolekül)
Pfeil E1: der markierte Primer (T7-19-Cy3)

Fig. 29 zum Beispiel 1.5.15.5 Markierung während der PCR
Abbildung eines Gels nach elektrophoretischer Auftrennung der Reaktionsprodukte.
Fig. 29 Teil A
Ergebnis von PCR-Reaktionen mit einem Markierten Primer. Einzelne Lanes entsprechen einzelnen Reaktionen. Die Bestandteile der Reaktionen sind unten aufgeführt. Als Zielsequenz wurde Matrize 2, M2, verwendet.

1. PCR (20 Zyklen) mit Taq-Polymerase: M2, beide PCR-Primer, vier dNTPs, dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA;
2 PCR (20 Zyklen) mit Vent exo minus Polymerase: M2, beide PCR-Primer, vier dNTPs, dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA;
3. Leiter: dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA, markierter Primer
4. PCR (20 Zyklen) mit Taq-Polymerase: M2, beide PCR-Primer, vier dNTPs, dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA;
5. PCR (20 Zyklen) mit Vent exo minus Polymerase: M2, beide PCR-Primer, vier dNTPs, dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA;
6. PCR (20 Zyklen) mit Taq-Polymerase: M2, beide PCR-Primer, vier dNTPs (Kontrolle ohne Nuk-Makromolekül)
7. PCR (20 Zyklen) mit Vent exo minus Polymerase: M2, beide PCR-Primer, vier dNTPs (Kontrolle ohne Nuk-Makromolekül)
Pfeil A1: das mit dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA oder mit dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA markierte PCR-Produkt (unvollständige Strangverlängerung)
Pfeil A2: das mit dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA oder mit dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA markierte PCR-Produkt (vollständige Strangverlängerung)
Pfeil B1: das PCR-Produkt ohne dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA oder ohne dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA (Markierung durch Primer-Cy3)
Pfeil C1: dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA (Nuk-Makromolekül)
Pfeil D1: das Produkt des Abbaus von dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA oder dU-PEG(8)-[T1, A1]-TAMRA durch 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase
Pfeil E1: markierter PCR-Primer (T7-19-Cy3)

Fig. 29 Teil B
Vergleich zwischen PCR-Produkten ohne und mit spezifischer Isolation durch feste Phase (dT48-Anker-Beads). Einzelne Lanes entsprechen einzelnen Reaktionen. Die Bestandteile der Reaktionen sind unten aufgeführt.

1. PCR (20 Zyklen) mit Taq-Polymerase: M2, beide PCR-Primer, vier dNTPs, dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA;
2. PCR (20 Zyklen) mit Taq-Polymerase: M2, beide PCR-Primer, vier dNTPs (Kontrolle ohne Nuk-Makromolekül)
3. Markiertes isoliertes PCR Produkt (entspricht PCR-Reaktion in Lane 1) durch die Bindung an die feste Phase über Anker-Domäne des Eingebautes Nuk-Makromolekül (zu sind ebenfalls noch Reste von nicht verbrauchten Nuk-Makromolekülen und die durch die Exonuklease abgebaute Nuk-Makromoleküle, die noch eine Anker-Domäne enthalten).
4. Fehlende Isolation eines nicht mit einem Nuk-Makromolekül markierten PCR Produkts (entspricht PCR Reaktion in Lane 2). Das Produkt bindet nicht an die feste Phase da es keine Anker-Domäne hat.

Die mit Beads gereinigten Reaktionsteilnehmer wurden durch den Temperatur-Anstieg von den Beads während der Elektrophorese gelöst. Dieser Vorgang erfolgte mit einer Verspätung, so dass die Laufstrecke im Gel etwas geringer ist als diejenige der direkt auf das Gel gelandenen PCR-Produkte. Pfeile von der linken Seite zeigen die Positionen für Lane 1 und 2, Pfeile auf der rechten Seite betreffen die Lanes 3 und 4.

Pfeil A1: das mit dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA markierte PCR-Produkt (unvollständige Strangverlängerung)
Pfeil A2: das mit dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA markierte PCR-Produkt (vollständige Strangverlängerung)
Pfeil B1: das PCR-Produkt ohne dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA (Markierung durch Primer-Cy3)
Pfeil C1: dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA (Nuk-Makromolekül)
Pfeil D1: das Produkt des Abbau von dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA durch 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase
Pfeil E1: markierter PCR-Primer (T7-19-Cy3)

Fig. 31 zum Beispiel 1.5.15.6 PCR und Markierung, bakterielle DNA
Abbildung eines Gels nach elektrophoretischer Auftrennung der Reaktionsprodukte. 31 Teil A und B (zunächst wurde Abbildung von Fluoreszenzsignalen von Nuk-Makromolekülen (Teil B) gemacht, danach das Gel mit EtBr gefärbt und weitere Abbildung (A) gemacht). Elektophorese bei 85–90°C.

1. Leiter 100 bp
2. dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA, + T7-19-Cy3 Primer, + PCR-Produkt (von Lane 3, 1:10 verdünnt)
3. PCR Reaktion ohne Probe und ohne Nuk-Makromoleküle
4. PCR Reaktion mit Probe(FAM/TAMRA) aber ohne Nuk-Makromoleküle
5. PCR Reaktion mit Nuk-Makromolekülen dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA
6. PCR Reaktion mit Nuk-Makromolekülen dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA + DMSO 5%
7. PCR wie in Lane 4, PCR-Produkt mit Ultrafiltration MWCO 100 kDa gereinigt
8. PCR wie in Lane 5, PCR-Produkt mit Ultrafiltration MWCO 100 kDa gereinigt
9. PCR wie in Lane 4, Inkubation mit dT48-Beads, Waschen mit Einbaupuffer 1
10. PCR und Reinigung wie in Lane 7, dann Inkubation mit dT48 Beads, Waschen mit Einbaupuffer 1
11. PCR wie in Lane 5, danach Bindung an dT48 Beads, Waschen mit Einbaupuffer 1
12. PCR und Reinigung wir in Lane 8, danach Bindung an dT48 Beads, Waschen mit Einbaupuffer 1
Pfeil A1: das mit dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA markierte PCR-Produkt (unvollständig und vollständig verlängerte Stränge)
Pfeil C1: dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA (Nuk-Makromolekül)
Pfeil D1: das Produkt von Abbau von dU-PEG(4)-[T1, A1]-TAMRA durch 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase
Pfeil F1: Probe (FAM/TAMRA), Lane 4
Pfeil G1: durch 5'-3'-Exonuklease abgebaute Probe (FAM/TAMRA), Lane 4

Fig. 46 Verwendung von Nuk-Makromolekülen mit doppelsträngigen Abschnitten durch Bst-Polymerase large Fragment. (Beispiel 1.5.15.7)
Es ist ein Abbildung eines Gels nach elektrophoretischer Auftrennung der Reaktionsprodukte. Nachfolgend sind Komponenten einzelner Reaktionen angegeben, die außer der Matrize, Primer und dATP, dGTP, dCTP, dTTP zugegeben wurden. Einzelne Lanes entsprechen einzelnen Reaktionen.

1. + dU-P9-[T4; S4] + Bst-Polymerase large fragment
2. + dU-P9-[T4; aT1; S4] + Bst-Polymerase large fragment
3. + dU-P9-[T5-MB; S5] + Bst-Polymerase large fragment
4. + dU-P9-[T4; S4] ohne Polymerase
5. + dU-P9-[T5-MB; S5] ohne Polymerase

Pfeil (A) zeigt die Position des vollständig synthetisierten, komplementären Stranges mit dem eingebauten dU-P9-[T4; S4] oder dU-P9-[T5-MB; S5]. Pfeil (B) zeigt die Position des vollständig verlängerten komplementären Stranges ohne Einbau von Nuk-Makromolelülen, Pfeil (C) zeigt die Position von freien, nicht eingebauten dU-P9-[T4; S4] oder dU-P9-[T5-MB; S5], Pfeil (D) zeigt die Position von freien, nicht verwendeten T7-19-Cy3 (Es wurde eine höhere Konzentration von T7-19-Cy und dU-P9-[T4; S4] oder dU-P9-[T5-MB; S5] in die Kontroll-Reaktionen 4 und 5 zugegeben).
Fig. 47 Struktur eines markierten Fragments einer Nukleinsäure nach Einbau eines sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugats und einer anschließenden Dnase I-Verdaung.
Primer und Bestandteile des Nuk-Makromoleküls sind durch PTO-modifikationen geschützt. Ungeschützte Abschnitte der DNA wurden durch Dnase I abgebaut.
Fig. 48 und Fig. 49 Vergleich der Bindung und Einbau von Nuk-Makromolekülen mit komplementären und nicht-komplementären Target-Domänen (perfect Match und Mismatch) unter diskriminierenden Reaktionsbedingungen, z. B. bei einer Reaktionstemperatur wie Tm für perfect Match
Die Struktur von Molekularen Beaconen ermöglicht eine gute Differenzierung zwische perfect hybridisierten und nicht perfect hybridisierten Target-Domänen der Nuk-Makromoleküle. Nur die gebundenen Nukleotid-Konjugate werden in den wachsenden Strang eingebaut.
Fig. 50 Verlangsamung der Synthese an markierten Fragmenten.
Nach. Einbau von Nuk-Komponenten der Nuk-Makromoleküle kann die Synthese weiter verlaufen. Die Geschwindigkeit der Synthese kann allerdings abnehmen. Die Verlängerungsreaktion an markierten Strängen kann somit verlangsamt bzw. unterdrückt sein (50A). Durch verschiedene Parameter, z. B. längere Inkubationszeiten oder durch Verwendung von Polymerasen mit Strang-Verdrängernden Aktivität oder durch Höhere Temperaturen, kann die Synthese nach dem eingebauten Nukleotid-Konjugat fortgesetzt werden (50B). Bei einer vorzeitiger Terminierung der Synthese stehen diese Stränge nicht für eine Polymerase-Ketten-Reaktion zur Verfügung, da ihnen die zweite Primer-Bindungsstelle fehlt. Auf diese Weise können bestimmte Fragmente während einer PCR in ihrer Amplifikation spezifisch unterdrückt werden.
Fig. 51 Isolierung von markierten Fragmenten mittels Nuklease und Degradation von nicht-markierten Fragmenten.
Durch sequenzspezifische Nukleotid-Konjugate können bestimmte Abschnitte der markierten Nukleinsäureketten vor Nuklease geschützt werden. Die nicht markierten Abschnitte können durch Nuklease abgebaut werden.
52 Absättigung der Target-Domänen nach einer Einbaureaktion Durch Bindung von komplementären Oligonukleotiden an Target-Domäne können diese in ihrer Fähigkeit zu Bindung unspezifischer Abschnitte der Nukleinsäureketten behindert werden
Fig. 53–Fig. 55 Nachweis von markierten Fragmenten der DNA mittels eines Streifentests.
Am Streifen sind Reaktionspartner (Streptavidin) für die entsprechende Anker-Domäne (Biotin) fixiert. Bei einer erfolgreichen Markierung wird das markierte Fragment (trägt Biotin und Fluorescein) am entsprechenden Ort am Streifen binden. Nur bei einer erfolgreichen sequenzspezifischen Markierung werden Fluoreszein und Biotin an einem Molekül co-lokalisiert. Die unspezifisch gebundenen Fragmente wurden beispielsweise durch Dnase beseitigt und stören die spezifische Detektion nicht:

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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”Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes” Vladimir V. Didenko, 2006, ISBN 1-58829-380-7 [0319]
”Protocols for nucleic acid analysis by nonradioactive probes” Elena Hilario, 2006, ISBN 1-58829-430-7 [0319]
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Claims

Anspruch der Erfindung betrifft Verfahren zur Visualisierung der genetischen Information in vitro von mindestens einer Nukleinsäurekette, wobei sequenzspezifische Nukleotid-Konjugaten in mindestens einem der folgenden Teil-Schritte der Visualisierung eingesetzt werden: • Positive Selektion während der Herstellung der Nukleinsäureketten oder der Äquivalenten genetischer Information durch Primer-Verlägerung oder Amplifikation • Negative Selektion der Nukleinsäureketten oder der Äquivalenten genetischer Information durch gezielte Terminierung oder gezielte Unterdrückung • Positive Selektion der Nukleinsäureketten oder der Äquivalenten genetischer Information durch Markierung • Positive Selektion der Nukleinsäureketten oder der Äquivalenten genetischer Information durch Isolierung • Positive Selektion der Nukleinsäureketten oder der Äquivalenten genetischer Information durch Detektion wobei zumindest eines der verwendeten sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugate folgende Struktur aufweist: (Nuk-Linker)_n-Marker wobei: Nuk – eine Nuk-Komponente ist Linker – eine Linker-Komponente, die Nuk-Komponente und makromolekulare Marker-Komponente vebindet Marker – eine Marker-Komponente ist, die mindestens eine zur jeweiligen Zielsequenz komplementäre Nukleinsäuresequenz einschließt, die sogenannte Target-Domäne n – eine Zahl von 1 bis 100 ist
Anspruch der Erfindung betrifft Verfahren zur enzymatischen zur Herstellung von mindestens einer modifizierten Nukleinsäuerekette nach Anspruch 1, das folgende Schritte einschließt: • Amplifikation von mindestens einer Nukleinsäurekette • Markierung dieser Nukleinsäurekette mit sequenzspezifischen NukleotidKonjugaten • Gegebenenfalls verlaufen Amplifikation und Markierung parallel • Gegebenenfalls Isolierung der markierten Nukleinsäurekette und folgende Komponenten einschließt: • Mindestens eine zu markierende Nukleinsäurekette als Matrize (Zielsequenz) • Mindestens eine Polymerase zur enzymatischen Synthese • Mindestens einen Primer • Mindestens eine Art von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten • Mindestens eine Art von weiteren Nukleotiden
Anspruch der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von mindestens einer mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten markierten Nukleinsäurekette nach Anspruch 1, das folgende Schritte einschließt: • Bereitstellung einer mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten markierten Nukleinsäurekette • Inkubation dieser markierten Nukleinsäurekette mit einer Reaktionslösung mit mindestens einer Nuklease unter Bedingungen, die Degradation von nicht markierten Nukleinsäureketten zulässt
Anspruch der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von mindestens einer mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten markierten Nukleinsäuerekette nach Anspruch 1, das folgende Schritte einschließt: • Bereitstellung von mindestens einer markierten Nukleinsäurekette • Detektion der Signale von mindestens einer mit sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten markierten Nukleinsäurekette • Gegebenenfalls Vergleich dieses Signal mit einem Referenzsignal
Anspruch der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Anspruch 2, wobei mindestens ein sequenzspezifisches Nukleotid-Konjugat im Markierungsschritt folgende Struktur aufweist: (Nuk-Linker)_n-Marker wobei: Nuk – ein Nukleotid (Nuk-Komponente) Linker – eine Linker-Komponente, die Nuk-Komponente und makromolekulare Marker-Komponente verbindet Marker – eine Marker-Komponente ist, die mindestens ein Oligonukleotid mit einer zur jeweiligen zu markierenden Nukleinsäurekette (Zielsequenz) vollständig oder teilweise komplementären Nukleinsäuresequenz einschließt, und dieses Oligonukleotid mindestens eine chemische Nukleotid-Modifikation einschließt, die gegenüber einer Nuklease nach Anspruch 3 resistent ist. n – eine Zahl von 1 bis 1000 ist
Anspruch der Erfindung betrifft Nukleotid-Konjugate nach Anspruch 5, deren Marker mindestens ein Oligonukleotid einschließt, das mindestens eine der folgenden chemischen Modifikationen einschließt: PTO, LNA; PNA, Morpholino, 2'-O-Me.
Anspruch der Erfindung betrifft sequenzspezifische Nukleotid-Konjugate nach Anspruch 2, deren Marker mindestens ein Oligonukleotid einschließt, das mindestens einen Sequenzbereich einschließt, der innerhalb des selben Oligonukleotids einen Doppelstrang bilden kann.
Anspruch der Erfindung betrifft sequenzspezifische Nukleotid-Konjugate nach Anspruch 2, deren Marker mindestens ein Oligonukleotid einschließt, das mit mindestens einem weiteren komplementären Oligonukleotid hybridisiert ist, so dass ein doppelsträngiger Bereich gebildet ist.
Anspruch der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Anspruch 2, bei dem mindestens ein Primer mindestens eine der folgenden Modifikationen einschließt: PTO, LNA; PNA, Morpholino, 2'-O-Me.
Anspruch der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Anspruch 2, wobei weitere Nukleotide aus der Gruppe von natürlichen Nukleotiden (z. B. dATP, dGTP, dCTP, dTTP, dUTP, ATP, GTP, CTP, UTP) und/oder modifizierten Nukleotiden (z. B. Nukleotide markiert mit Biotin, wie beispielsweise dUTP-Biotin, dCTP-Biotin, oder Terminatoren, wie beispielweise ddTTP, ddCTP, ddATP, ddGTP, oder Fluoreszenzfarbstoffmarkierte Nukleotide, wie beispielweise dUTP-Cy3 oder dUTP-TAMRA), oder Alpha-Phosphorothioat-Nukleotiden, z. B. Sp-dATP-a-S, Sp-dCTP-a-S Sp-dGTP-a-S Sp-dUTP-a-S, ausgewählt werden.
Anspruch der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Verfahren zur Amplifikation eine Polymerasen-Ketten-Reaktion (PCR) einschließt
Anspruch der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Verfahren zur Vervielfältigung eine isothermische Amplifikation ist
Anspruch der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Anspruch 3, wobei eine der folgenden Nukleasen verwendet werden: DNase I, Micrococcal nuclease, Exonuclease III (Exo III), Exonuclease I (Exo I), Mung Bean Nuclease, S1 Nuclease, eine sequenzspezifische Endonuklease
Anspruch der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Nukleinsäuerekette nach Anspruch 2, wobei Amplifikationsschritt bzw. Markierungsschritt noch mindestens eine der folgenden Komponenten einschließt: • Ein Oligonucleotid, das Sequenzabschnitte einschließt, die vollständig oder teilweise zu mindestens einer Zielsequenzen komplementär sind, wobei deren Bindungsposition an der Zielsequenz oder zielsequenzähnlichen Nukleinsäureketten vollständig oder teilweise mit der Bindungsposition der Target-Domäne der sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugates nach Anspruch 2 übereinstimmt. • Ein Oligonucleotid, das Sequenzabschnitte einschließt, die vollständig oder teilweise zu Target-Domäne von mindestens einem sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugates nach Anspruch 2 komplementär sind
Anspruch der Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten Terminierung einer enzymatischen Synthese von Nukleinsäureketten nach Anspruch 1, bei dem sequenzspezifische Nukleotid-Konjugate in den komplementären Strang zu mindestens einer zu terminierenden Zielsequenz oder deren Äquivalenten enzymatisch inkorporiert werden, wobei zumindest ein der verwendeten Nukleotid-Konjugate (genannt sequenzspezifisch terminierendes Nukleotid-Konjugat) folgende Struktur aufweist: (Nuk-Linker)_n-Marker wobei: Nuk – eine zur Termination der enzymatischen Synthese führende Nuk-Komponente ist, deren 3'-OH-Position modifiziert ist, Linker – eine Linker-Komponente, die Nuk-Komponente und makromolekulare Marker-Komponente verbindet, Marker – eine Marker-Komponente ist, die mindestens eine zur jeweiligen zu terminierenden Zielsequenz komplementäre Nukleinsäuresequenz einschließt, die sogenannte Target-Domäne, n – eine Zahl von 1 bis 100 ist
Anspruch der Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten Unterdrückung einer enzymatischen Synthese von Nukleinsäureketten nach Anspruch 1, bei dem Nukleotid-Konjugate in den komplementären Strang zu mindestens einer zu unterdrückenden Zielsequenz oder deren Äquivalenten enzymatisch inkorporiert werden, wobei zumindest ein der verwendeten Nukleotid-Konjugate folgende Struktur aufweist: (Nuk-Linker)_n-Marker wobei: Nuk – eine Nuk-Komponente ist, Linker – eine Linker-Komponente, die Nuk-Komponente und makromolekulare Marker-Komponente verbindet Marker – eine Marker-Komponente ist, die mindestens ein Oligonukleotid mit einer zur jeweiligen zu terminierenden Zielsequenz komplementären Nukleinsäuresequenz einschließt, und optional/wahlweise ein zur Unterdrückung der enzymatischen Synthese führendes sterisches Hindernis einschließt n – eine Zahl von 1 bis 100 ist
Anspruch der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Anspruch 2, bei dem mindestens zwei verschiedene Nukleinsäureketten vorliegen und Herstellung bzw. Markierung von mindestens einer Nukleinsäurekette mit Verfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 16 terminiert bzw. unterdrückt wird.
Anspruch betrifft ein Kit zur Visualisierung der genetischen Information aus Nukleinsäureketten nach dem Verfahren von einem der Ansprüche 1 bis 17, das mindestens eine Art von sequenzspezifischen Nukleotid-Konjugaten (Nuk-Makromolekülen) nach einem der vorherigen Ansprüche, sowie mindestens eine der Komponenten aus der folgenden Liste einschließt: – Eine oder mehrere Arten der Polymerasen – Kompositionen zur Durchführung von enzymatischen Reaktionen (Amplifikation, Markierung), einschließlich mindestens einer erforderlichen Art von weiteren Nukleosid-Triphosphaten, Primern und Puffer-Substanzen – Eine oder mehrere der Nukleasen zur Isolierung von markierten Nukleinsäureketten – Feste Phase zum Nachweis von markierten Nukleinsäureketten – Komposition für die Bindung von markierten Nukleinsäureketten an die feste Phase – Komposition für optische Detektion der Signale an der festen Phase
Anspruch der Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten Terminierung bzw. Unterdrückung einer enzymatischen Synthese von Nukleinsäureketten eines Virus in vitro oder in vivo, bei dem sequenzspezifische Nukleotid-Konjugate in Kontakt mit Zellen, einschließlich die durch genanntes Virus infizierten Zellen, oder Geweben oder Organismen gebracht werden, wobei die Virusart, verantwortlich für die genannte Infektion, bekannt ist.
Anspruch der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Anspruch 19, wobei zumindest eines der verwendeten Nukleotid-Konjugate folgende Struktur aufweist: (Nuk-Linker)_n-Marker wobei: Nuk – eine Nuk-Komponente ist, Linker – eine Linker-Komponente, die Nuk-Komponente und makromolekulare Marker-Komponente verbindet Marker – eine Marker-Komponente ist, die mindestens ein Oligonukleotid mit einer zur jeweiligen zu terminierenden, bekannten Virusart-Sequenz komplementären Nukleinsäuresequenz einschließt n – eine Zahl von 1 bis 100 ist