WO2008043426A2 - Komponenten und verfahren zur enzymatischen synthese von nukleinsäuren - Google Patents

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WO2008043426A2
WO2008043426A2 PCT/EP2007/008198 EP2007008198W WO2008043426A2 WO 2008043426 A2 WO2008043426 A2 WO 2008043426A2 EP 2007008198 W EP2007008198 W EP 2007008198W WO 2008043426 A2 WO2008043426 A2 WO 2008043426A2
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids

Definitions

  • the new methods are characterized by the involvement of macromolecular sterically demanding ligands in the control of the enzymatic reaction.
  • the sterically demanding ligands are coupled to the incorporated modified nucleotides, with the mass of these ligands being larger than 2 kDa.
  • macromolecular compounds are nucleic acids such as oligonucleotides of greater than 10 nucleotides in length, polynucleotides, polypeptides, proteins or enzymes, quantum dots, polymers such as PEG, Mowiol, dextran, polyacrylate, nanoparticles with a diameter in the range of 10 to 100 nm , 20 to 200 nm, 30 to 300 nm, 40 to 400 nm, 50 to 500 nm (eg, nanogold particles, polystyrene particles, dextran-based paramagnetic particles), microparticles having a diameter in the range of 0.5 to 1 ⁇ m , 1 to 5 microns, but also complexes that consist of several macromolecules.
  • nucleic acids such as oligonucleotides of greater than 10 nucleotides in length, polynucleotides, polypeptides, proteins or enzymes, quantum dots, polymers such as PEG, Mowiol, dextran
  • a nuc macromolecule includes at least one nuc-component, at least one linker component, at least one marker component.
  • modified nuc-macromolecules are described.
  • a modified nuc macromolecule is a nucleotide analog. It includes at least one nucleotide component (nuc-component), at least one linker component, at least one marker component and at least one macromolecular sterically demanding ligand (hereinafter referred to as "modified nuc-macromolecules"; Examples are shown schematically in FIGS. 1 and 2):
  • Linker - is a linker component where linker 1 or linker 2 or linker 3 may have the same or different structure
  • Marker - is a Makrer component
  • (n) - is a number from 1 to 100,000.
  • (m) - a number from 1 to 1000
  • Other combinations of nuc-macromolecule components will be apparent to one skilled in the art.
  • linker is water-soluble. Its composition is not limited as long as it does not completely inhibit the incorporation reaction. Its length is between 5 and 100,000 chain atoms.
  • the linker component consists of a coupling unit L for the coupling of the linker to the nuc-component, of a water-soluble polymer and of a coupling unit T for the coupling of the linker to the marker component.
  • a modified nuc-macromolecule has the structure:
  • Nuk - is a nucleotide or a nucleoside monomer (nuc-component)
  • T - is a part of the linker that represents the link between the linker residue and the marker (coupling unit T)
  • Linker which is a water-soluble polymer having an average length between 5 and 100,000 atoms
  • Ligand - is a macromolecular sterically demanding ligand n - a number from 1 to 1,000,000, where (n) can represent an average value.
  • Nucleotide Component is a modified nucleotide, is a component of a modified nuc macromolecule, and has substrate properties for polymerases.
  • the nuc-component preferably includes a base component (base), a sugar component (sugar) and a phosphate component (phosphate).
  • Base, sugar and phosphate may be modified, i. the basic structure looks similar to the natural nucleotides or nucleosides, but carries, for example, additional chemical groups. Examples of combinations of different components are known to the person skilled in the art.
  • Such nuc-components can be used in many enzymatic and chemical reactions (Wright, Wright et al., Pharmac.Ther 1990, V. 47, p 447-).
  • nuc-component is a nucleotide monomer coupled to the linker moiety.
  • all conventional nucleotide variants suitable as substrates for nucleotide-accepting enzymes can serve as nuc-components of the modified nuc-macromolecule, so that both natural and modified nucleotides (nucleotide analogues) are suitable for the nuc-component.
  • base, sugar or phosphate moieties may be modified, Figure 3.
  • nucleotide modifications are known to those skilled in the art ("Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids", 1994, Shabarova, ISBN 3-527-29021 -4, “Nucleotide Analogs” Scheit, 1980, ISBN 0-471-04854-2, “Nucleosides and Nucleic Acid Chemistry", Kisakürek 2000, “Anti-HIV Nucleosides” Mitsuya, 1997, “Nucleoside Analogs in Cancer Therapy", Cheson , 1997) in the text also other examples of the modifications of the nucleotides are given.
  • the nuc-component is a nucleoside triphosphate.
  • higher phosphate derivatives tetraphosphate, etc.
  • the phosphate moiety may include modifications, such modifications include, for example, in one embodiment, a linker (Jameson, D., et al., Methods in Enzymology 1997, V. 278, p363, A. Draganescu et al., J. Biol. Chem. 2000, v.275, 4555).
  • the phosphate component of the nuc-component includes thiotriphosphate compounds (Burges et al., PNAS 1978 v. 75, pp. 4798-).
  • the phosphate modifications mentioned can, as with nucleoside triphosphates, be located at the 5 " position or also at other positions of the sugar part of the nucleotide, for example at the 3 ' position.
  • the nuc-component may be a nucleotide or nucleoside or its analogues occurring naturally in the nucleic acids, preferably those participating in Watson-Crick pair formation, for example adenine, guanine, thymine, cytosine, uracil, inosine, or a modified base such as eg 7-deazaadenine, 7-deazaguanine, 6-thio
  • LO adenin include, literature s. above.
  • the base may include modifications, such as, for example, in one embodiment, include a linker coupled to the base, such as an amino-propargyl linker or an amino-allyl linker, further examples of the linkers are known (Ward et al Pat 4711955, G. Wright et al Pharmac.Ther 1990, V. 47, p 447, Hobbs et al
  • the linker coupled to the base is the link between the nuc-component and the linker moiety of the modified nuc-macromolecules. Further modifications to the base are, for example, in the catalog of Trilink Biotechnologies, Inc. San Diego, USA 2003 on page 38.
  • the sugar component may include modifications (Metzger, M., et al., Nucleic Acid Research 1994, V. 22, 4259, Tsien WO 91/06678), such modifications include, for example, in one embodiment, a linker.
  • the modifying group or linker may, for example, be reversibly coupled to the sugar component (WO2007053719, Hovinen et al., J. Chem. Soc.Prking Trans., 1994, pp. 211-, Canard5, US Patent 5,798,210, Kwiatkowski US Pat.
  • the linker coupled to the sugar moiety is the link between the nuc-component and the linker moiety of the modified nuc-macromolecules.
  • the sugar component includes, for example, the following modifications: optionally, the 3 'or the 2 ' -OH groups can be replaced by the following atoms or groups: halogen atoms, hydrogen, amino, mercapto or azido group ( Beabealashvilli et al., Biochem Biophys Acta 1986, v.868, 136-, Yuzhanov et al., FEBS Lett., 1992, v. 306, 185-).
  • the nuc-component includes acyclic nucleotide or nucleoside modifications (Hoiy Current Pharmaceutical Design 2003 v. 9, 2567, G. Wright et al., Pharmac. Thier 1990, V. 47, p. 447-).
  • the sugar component may include a double bond.
  • be 2> -Deoxynukleotide for example 2 "-Deoxyuridin- triphosphate, 2 '-Deoxycytidin triphosphate, 2" -Deoxyadenosin triphosphate, 2 ⁇ - deoxyguanosine triphosphate dUTP, dCTP, dATP and dGTP, respectively.
  • the nuc-component is connected to the linker at a coupling site.
  • the coupling site of the linker to the nuc-component may be located at the base, on the sugar (ribose or deoxyribose), or on the phosphate part.
  • Multiple linkers may be attached to a nucleotide component (see the Linker section below).
  • connection between the linker component and the nuc-component is preferably covalent.
  • the coupling site is at the base, it is preferably located at positions 4 or 5 at pyrimidine bases and at positions 6, 7, 8 at the purine bases (Ward et al., US Patent 4,711,955, G. Wright et Pharmac.Ther 1990, V. 47, p 447, Hobbs et al., US Patent 5,047,519 or other linkers, eg, Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US Pat. Hanna M.
  • the position of the coupling site depends on the field of application of the modified nuc-macromolecules.
  • the modified nuc-macromolecules for example, for the labeling of nucleic acids which is to remain on the nucleic acid strand, preferably coupling sites on the sugar or on the base are used.
  • the coupling to the gamma or beta-phosphate groups can be carried out, for example, if the label is involved in the incorporation of the modified nuclease.
  • L5 macromolecule is to be released.
  • connection between the nuc-component and the linker component takes place, for example, via a coupling unit (L) which is a part of the linker component.
  • connection between the nuc-component and the linker may in one embodiment be resistant, eg at temperatures up to 130 ° C., for pH ranges between 1 and 14, and / or resistant to hydrolytic enzymes (eg proteases, esterases) , In another embodiment of the invention, the connection between the nuc-component and the linker is under mild conditions
  • This fissile connection allows removal of the linker and marker components.
  • the removal of the bulky ligand also allows. This can be done, for example, in the procedures of
  • mild conditions are meant those conditions which, for example, do not include nucleic acid primer complexes destroy, for example, the pH preferably between 3 and 11 and the temperature between 0 0 C and a temperature value (x).
  • This temperature value (x) depends on the Tm of the nucleic acid-primer complex (Tm is the melting point) and is calculated, for example, as Tm (nucleic acid-primer complex) minus 5 ° C (eg Tm is 5 47 ° C, then the maximum temperature at 42 ° C, under these conditions are particularly suitable ester, thioester, acetals, phosphoester, disulfide compounds and photolabile compounds as cleavable compounds).
  • said cleavable compound belongs to chemically or enzymatically LO cleavable or photolabile compounds.
  • chemically cleavable groups ester, thioester, disulfide, acetal compounds are preferred (Short WO9949082, "Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc., Herman et al., Method in Enzymology 1990 V.184 p.584, Lomant et al., J. Mol. Biol., 1976 V.104 243, "Chemistry of carboxylic acids and esters.” S. Patai 1969 Interscience Publ.).
  • nuc-component only one nuc-component is coupled per one modified nuc-macromolecule. In another embodiment of the invention, several nuc-components are coupled per one modified nuc-macromolecule. Several nuc-components may be uniform or different, with 50 being, for example, on average 2 to 5, 5 to 10, 10 to 25, 25 to 50, 50 to 100, 100 to 250, 250 to 500, 500 to 1000, 1000 to 10000, 10,000 to 100,000 or more nuc-components may be coupled per one modified nuc-macromolecule.
  • linker or linker component is used synonymously in the application and refers to structural portions of the modified nuc macromolecule between the nuc-component and either the marker component or the markromolecular sterically demanding ligand or between the macromolecular sterically demanding ligand and the marker.
  • linkers which are connected with nuc-component (linker 1 and linker 2) and linker (3), which contain further constituents of modified nuclides.
  • Macromolecule e.g., sterically demanding ligand (s) and the marker (s)).
  • Linker 3 can be constructed in an analogous manner as linkers 1 and 2 or have a different structure.
  • the composition of the linker 3 is not limited as long as it does not destroy the enzymatic reaction and the properties of the modified nuc-macromolecule.
  • linkers 1 and 2 are discussed in detail, using a general term "linker” because in most applications only one linker component is bound to the nuc-component.
  • the linker is preferably water-soluble.
  • the exact linker composition is not limited and may vary.
  • the linker length is considered to be the shortest distance (theoretically enriched for the stretched presence of the linker) from the nuc-component to the next macromolecular structure (e.g., macromolecular bulky ligand or macromolecular marker).
  • the distance to the marker or to the steric obstacle is calculated.
  • modified nuc-macromolecules have a short linker. Its length is between 2 and 30 chain atoms. Such linkers may carry functional groups, such as amino, carboxy, mercapto and hydroxy groups. Other molecules, eg macromolecules, such as water-soluble polymers, can be coupled to these groups. Examples of short linkers coupled to nucleotides are known to those of skill in the art (Ward et al., US Pat., 4711955, G. Wright et al., Pharmac.Ther 1990, V. 47, p 447, Hobbs et al., US Patent 5,047,519 or other linkers, for example Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US Pat. No.
  • the linker may contain one or more units of water-soluble polymers, such as amino acids, Sugar, PEG units or carboxylic acids.
  • Further examples of short linkers may be the coupling unit (L) of a long linker su linkers of length between 2 and 20 atoms, are preferably used in modified nuc-macromolecules whose marker component comprises linear water-soluble polymers.
  • a long linker is used, with a length of more than 30 chain atoms.
  • Linker Components (Using the example of linker between the nuc-component and the marker component or between the nuc-component and the sterically demanding ligand).
  • the linker component represents a portion of the nucleated medullary molecule that lies between the respective nuc-component and the marker component.
  • the linker component has in its structure, for example, the following components: 1) coupling unit L 2) water-soluble polymer 3) coupling unit T
  • linker component The division of the linker component into individual components is purely functional and is intended only to illustrate the structure. Depending on the perspective, individual structures of the linker can be calculated for one or the other component.
  • the coupling unit L has the function of connecting the linker component and the nuc-component. Preferred are short, unbranched compounds, from 1 to 20 atoms in length.
  • the particular structure of the coupling unit L depends on the coupling site of the linker to the nucleotide or Nuk unit and of the respective polymer of the linker. Some examples of the coupling units L are given in the Examples section.
  • Short WO 9949082 Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382
  • short linkers on the base Short WO 9949082, Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382
  • Short WO 9949082 Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382
  • Nucleotides Amersham, Roche
  • Jon et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, p 363, Canard US Pat. No. 5798210, Kwiatkowski US Pat. No. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Ju et al. US Pat.
  • R 6 is the nuc-component
  • R 7 is the polymer and A and B include the following structural elements: -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH- CO, CO
  • n - is equal to 1 to 5 is
  • the coupling unit L is covalently connected on one side with the nuc-component, on the other with polymer.
  • the type of coupling depends on the type of polymer.
  • the polymer has reactive groups at its ends, for example
  • the water-soluble polymer in a preferred embodiment forms the majority of the linker component. It is a polymer, preferably hydrophilic, consisting of identical or different monomers.
  • suitable polymers include polyethylene glycol (PEG), polyamides (eg polypeptides), polysaccharides and their derivatives, dextran and its derivatives, polyphosphates, polyacetates, poly (alkylene glycols), copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, poly (olefinic alcohols), poly (Vinylpyrrolidones), poly (hydroxyalkylmethacrylamides),
  • This polymer in one embodiment includes branched or further embodiment non-branched polymers.
  • the polymer may consist of several sections of different lengths, each section consisting of identical monomers and monomers differing in different sections. It should be obvious to a person skilled in the art that for a macromolecular linker usually only an average mass can be determined, so that the information on the molecular weights represents an average value ("Macromolecules, Chemical Structure and Syntheses", Volume 1, 4, H. Elias, 1999 , ISBN 3-527-29872-X). For this reason, it is often impossible to give an exact mass specification for modified nuc-macromolecules.
  • the linker component includes a linear, unbranched polymer and does not carry sterically demanding chemical structures, such as dyes, fluorescent dyes, ligands.
  • sterically demanding chemical structures such as dyes, fluorescent dyes, ligands.
  • the polymer of the linker component is linear, but the linker component carries one or more sterically demanding chemical structures, such as low molecular weight dyes. Further examples of sterically demanding groups are given in section 1.3.19.
  • Sterically demanding ligands or structures can be coupled to different linker segments (see also Section 1.3.19 Sterically demanding ligand).
  • the average number of sterically bulky ligands coupled to the linker can vary, for example, between 1 and 3, 3, and 5, 5, and 20, 20, and 50.
  • the coupling of sterically demanding groups should take into account the fact that a bulky structure is required in the Near the nucleotide component can lead to the abrogation of the substrate properties.
  • Sterically demanding ligands may be uniformly or randomly coupled throughout the length of the linker, or coupled to the linker at a certain distance from the nuc-component.
  • the minimum distance between the nuc-component and the macromolecular steric ligand is, for example, 10 to 15, 15 to 20, 20 to 25, 25 to 30, 30 to 35, 35 to 40, 40 to 45, 45 to 50, 50 to 55 , 55 to 60, 60 to 70, 70 to 80, 80 to 90, 90 to 100, 100 to 200, 200 to 1000, 1000 to 5000, 5000 to 10000 chain atoms.
  • the sterically demanding ligand can also be considered as part of the linker or as part of the marker.
  • the consideration may depend on whether or not a sterically demanding group has certain signal properties.
  • Linker length (exemplified by a linker between the nuc-component and the next macromolecular structure, such as sterically demanding ligands or macromolecular markers).
  • the average linker length is between 5 and 10, 10 to 20, 20 to 30, 30 to 40, 40 to 50, 50 to 60, 60 to 70, 70 to 80, 80 to 90, 90 to 100, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 10,000, 10000 to 100000 atoms (chain atoms are counted), thus the average linker length is between 0.5 nm and 1 nm, 1 nm to 2 nm, 2 nm to 3 nm, 3 nm to 4 nm, 4 nm to 5 nm, 5 nm to 6 nm, 6 nm to 7 nm, 7 nm to 8 nm, 8 nm to 9 nm, 9 nm to 10 nm , 5 nm to 10 nm
  • Some sections of the linker may contain rigid areas and other sections may contain flexible areas.
  • the linker is bound to the nuk component on one side and to the marker component on the other side.
  • the linker can have coupling units at its ends, which fulfill this function.
  • the connection with the nuc-component has been discussed above.
  • the link between the linker and the marker components via coupling unit T Preferred are short, unbranched compounds, up to max. 20 atoms in length.
  • the respective structure of the coupling unit T depends on the coupling site on the marker component and on the particular polymer of the linker.
  • the coupling unit T is with the polymer covalently linked.
  • the type of coupling depends on the type of polymer.
  • the polymer has reactive groups at its ends, for example NH 2 (amino), OH (hydroxy), SH (mercapto), COOH (carboxy), CHO (aldehyde), acrylic or maleimide, halogen groups.
  • reactive groups for example NH 2 (amino), OH (hydroxy), SH (mercapto), COOH (carboxy), CHO (aldehyde), acrylic or maleimide, halogen groups.
  • Such polymers are commercially available (eg Fluka).
  • Some examples of the coupling units L are given in the Examples section, Further examples of the chemical and affine couplings s. in the literature: “Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993, “Bioconjugation: protein coupling techniques for biomedical sciences", M. Aslam, 1996.
  • the linker may also contain other functional groups or segments, for example one or more cleavable groups under mild conditions. e.g. WO2005044836.
  • a cleavable linkage within the linker allows removal of a portion of the linker and the label moiety. After cleavage, a linker residue remains on the nuc-component, examples of cleavable compounds are given in section 1.3.3.1.4.
  • the marker component can have different structures.
  • the structures in detail are not limited as long as they do not abrogate the substrate properties of the nuc-components for enzymes.
  • This structure preferably has a signaling or a signal-switching function.
  • the marker may also have other functions, such as structural, antitoxic, or affine function (for example, in drugs or transmissions).
  • the marker in one embodiment includes a low molecular weight marker moiety. In another embodiment, the marker includes a macromolecular marker unit. In a further embodiment, the marker includes several low molecular weight marker moieties. In another embodiment, the marker includes several macromolecular marker units. In another embodiment, the label includes a combination of low molecular weight and macromolecular units.
  • the marker units may have a signaling or signaling function. These units may be molecules of low molecular mass, eg less than 2000 Da, or even macromolecules themselves.
  • the number of signaling or signal-switching units that are combined to form a marker component includes the following ranges: 1 and 2, 2 and 5, 5 and 20, 20 and 50, 50 and 100, 100 and 500, 500 and 1000 1000 and 10000, 10000 and 100000.
  • marker units are combined in one marker, in one embodiment these units are linked to a scaffold, the core component of the marker ( Figure 4b, c).
  • This core component connects the units with each other.
  • the core component can connect to one or more nuc-linker components (FIG. 5).
  • the core component includes low molecular weight or macromolecular compounds.
  • the structural marker units include the following groups:
  • Biotin molecules hapten molecules (eg digoxigenin), radioactive isotopes (eg P 32 , J 131 ), or their compounds, rare earths, dyes, fluorescent dyes, fluorescence
  • Quenchers e.g., dabsyl
  • dabsyl manufactured of these molecules are commercially available, e.g.
  • Thermochromic, photochromic or chemiluminescent substances available from, e.g., Sigma-Aldrich
  • chromogenic substances e.g., as substrates for peptidases described in "Proteolytic enzymes Tools and Targets", E. Sterchi, 1999, ISBN 3-540-61233-5).
  • chemically reactive groups such as amino, carboxy, mercapto, aldehyde, iodoacetate, acrylic, dithio, thioester compounds can serve as signal-transmitting structural units.
  • these reactive groups can be modified with signaling elements such as, for example, dyes having corresponding reactive groups (for example, NHS esters, mercapto, amino groups).
  • signaling elements such as, for example, dyes having corresponding reactive groups (for example, NHS esters, mercapto, amino groups).
  • the combination of a nuc-unit, a markomolecular linker component and a low molecular weight marker already feels the requirements of the present invention.
  • Such compounds are also the subject of this invention. They can be used both as intermediates for the chemical synthesis of modified nuc-macromolecules with a macromolecular marker, eg dUTP-PEG-biotin, as well as independently in the enzymatic reactions, such as nucleotides labeled with only one dye.
  • dyes various fluorescent dyes may occur, their choice is not limited, as long as they do not significantly affect the enzymatic reaction.
  • dyes are rhodamines (Rhodamine 110, tetramethylrhodamine, available from Fluka-Sigma), cyanine dyes (Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 from Amersham Bioscience), coumarins, Bodipy, fluorescein, Al exa - Dyes: eg Alexa 532, Alexa 548, Alexa 555 (Molecular Probes).
  • Molecular Probes are commercially available, for example from Molecular Probes Europe, Leiden, The Netherlands (hereinafter referred to as Molecular Probes) or from Sigma-Aldrich-Fluka (Taufkirchen, Germany). Examples of the synthesis of a nuc macromolecule with a low molecular weight marker is given in WO 2005044836.
  • a marker in one embodiment, includes multiple marker units.
  • the marker units can have the same or different properties among each other.
  • fluorescent dyes with different spectral properties can be used.
  • fluorescent dyes are used which form FRET pairs.
  • Nanocrystals e.g. Quantum dots can appear as marker units. Quantum dots having the same or different spectral properties may be used in a marker component, US Pat. No. 6,322,901, US Pat. No. 6,423,551, US Pat. No. 6,251,303, US Pat. No. 5,990,479).
  • Nanoparticles or micro-particles can occur as marker units, the largest dimensions of these particles being from 1 nm to 2 nm, from 2 nm to 5 nm, from 5 nm to 10 nm, from 10 nm to 20 nm, from 20 nm to 50 nm, from 50 nm to 100 nm, from 100nm to 200nm, from 200nm to 500nm, from 500nm to 100nm, from 1000nm to 5000nm.
  • the material of the particles may be, for example, pure metals such as gold, silver, Aluminum (for example, particles with surface plasmon resonance), - protein-Au conjugates: J. Anal. Chem. 1998, V. 70, p.
  • Protein molecules can occur as marker units, they include the following groups: enzymes (eg peroxidase, alkaline phosphatase, urease, beta-galactosidase, proteinases), - fluorescent proteins (eg from GFP protein family or phycobiliproteins (eg phycoerythrin, phycocyanin) , available, for example, from Molecular Probes Inc.), antigen-binding proteins (eg, antibodies, tetramers, affibodies (Nord et al., AI Nature Biotechnology, V. 15 (p.772-777) or their components (eg, Fab fragments), nucleic acid binding agents Proteins (eg transcription factor)
  • enzymes eg peroxidase, alkaline phosphatase, urease, beta-galactosidase, proteinases
  • - fluorescent proteins eg from GFP protein family or phycobiliproteins (eg phycoerythrin, phycocyan
  • the nucleic acid chains can occur as marker units.
  • the length of the nucleic acid chains is preferably in the following ranges of 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 5000, 5,000 to 10,000, 10,000 up to 100,000 nucleotides.
  • DNA, RNA, PNA molecules can be used.
  • Nucleic acid chains may carry additional modifications, such as, for example, free amino groups, dyes, and other signaling molecules, eg, macromolecular substances, eg, enzymes or nanocrystals ( Figure 6 a, c).
  • marker units such as lectins; Growth factors, hormones, receptor molecules can be used.
  • the core component of the marker component has the function of binding several structural elements of the modified nuc-macromolecules.
  • the core component binds several marker units together.
  • linker components can be attached to the core component.
  • FIG. 5 The concept of the core component is functional and serves to illustrate possible structures of modified nuc-macromolecules. Different chemical structures that hold linker and marker moieties together can be referred to as the core component. The following are examples of components of the core component.
  • the structure is not restricted and is preferably water-soluble ) and (H) independently of each other include: NH 2 (amino), OH (hydroxy), SH (mercapto), COOH (carboxy), CHO (aldehyde), acrylic or maleimide
  • (R) represent water-soluble polymers such as PEG or polypeptide chains or short aliphatic chains.
  • the core component consists of a water-soluble polymer, in which case the polymer can consist of identical or different monomers.
  • the Kern- Kompolage represent the following polymers and derivatives thereof: polyamides (eg polypeptides such as poly (glutamine) or poly (glutamic acid)) and their derivatives, polyacrylic acid and derivatives thereof, natural or synthetic polysaccharides (eg, starch, hydroxy Ethyl starch), dextran and its derivatives (eg, aminodextran, carboxy-dextran), dextrin, polyacrylamides and their derivatives (eg, N- (2-hydroxypropyl) -methacdylamide), polyvinyl alcohols and their derivatives, nucleic acids, proteins , These polymers can be linear, globular, eg streptavidin or avidin, or branched, eg dendrimers.
  • Crosslinked soluble polymers such as, for example, crosslinked polyacrylamides (crosslink
  • polymer 5 may be present in the polymer (e.g., polylysine or polyacrylic acid) or in a separate
  • Step into the polymer are introduced.
  • dextran many variants of the introduction of reactive groups and chemical couplings are known (Molteni L.
  • the core component preferably has multiple coupling sites to which further elements can be attached, e.g. structural marker units or nuc-linker [5 component.
  • poly-lysine molecules have multiple free amino groups to which multiple dye molecules, biotin molecules, hapten molecules or nucleic acid chains can be coupled.
  • Poly-lysines have different molecular weights, e.g. 1000-2000, 2000- 10 10000, 10000-50000 Da can be purchased.
  • the core component serve nucleic acid strands, wherein the nucleic acid chains have a length of 10 to 20, from 20 to 50, from 50 to 100, from 100 to 200, from 200 to 500, from 500 to 1000, 1000 to 5000, of 5000 have up to 10,000 .5 nucleotides.
  • These nucleic acids serve as binding partners for sequence-complementary marker units (FIG. 6b).
  • the core component consists of a dendrimer, e.g. Polypropyleneimines, polyaminoamines. Examples of other dendrimers are known:
  • Marker units can be linked to the core component or to the linker component by a covalent bond, for example via a cross-linker (Chemistry of protein conjugation and cross-linking, S. Wang, Chem. 1993, ISBN 0-8493-5886-8, "Bioconjugation: protein coupling techniques for biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2), or via an affine coupling done, for example, biotin-streptavidin - Connection or hybridization of nucleic acid strands or antigen-antibody interaction ("Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2).
  • the coupling of marker units to the core component takes place in one embodiment already during the synthesis of the modified nuc-macromolecules.
  • the chemical synthesis of modified nuc-macromolecules takes place first, in which case the marker component consists only of the core component.
  • the coupling of marker units to the core component takes place only after the incorporation of modified nuc-macromolecules into the nucleic acid chain. Due to the large number of potential binding sites on the core part, the probability of binding the marker units to the core component and thus to the incorporated nuc-component is much greater compared to conventional nucleotide structures.
  • the coupling chemistry in each case depends on the structure of the marker units and the structure of the core component.
  • the linkage between the label moieties and the core component can be robust, eg, at temperatures up to 100 ° C., for pH ranges between 3 and 12, and / or resistant to hydrolytic enzymes (eg, esterases ) be.
  • the connection between the nuc-component and the linker is cleavable under mild conditions. Examples of the coupling of nucleic acids to dendrimers (corresponds to a coupling of marker units to a core component) are described, for example, in Shchepinov et al. Nucleic Acids Res. 1999 Aug 1; 27 (15): 3035-41, Goh et al. Chem Commun (Camb). 2002 Dec 21; (24): 2954. 1.3.3.3.3.3 Coupling between linker and marker
  • connection between the linker component and the marker depends on the particular structure of the marker units or the structure of the core component.
  • the linker component is bound directly to the signaling or signal-transmitting marker unit, Fig. 4a.
  • the marker may consist of only one or more marker units.
  • one or more linker components are attached to the core component of the marker, Fig. 5d.
  • Binding between the linker moiety and the label can be both covalent and affine.
  • Many examples are known in the art, s. e.g. "Bioconjugation: protein coupling techniques for biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2. “Chemistry of protein conjugation and crosslinking” Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc.).
  • connection between the linker component and the marker can be resistant in one embodiment, eg at temperatures up to 13O 0 C, for pH ranges between 1 and 14, and / or resistant to hydrolytic enzymes (eg proteases, esterases )be .
  • the connection between the nuc-component and the linker is cleavable under mild conditions.
  • the macromolecular compounds used in accordance with the invention to label nucleotides include, in some embodiments, water-soluble polymers (supra).
  • the linkers of nucmacromolecules also include water-soluble polymers (see above). It will be apparent to those skilled in the art that the assignment of individual polymers to the linker or to the label has a descriptive character.
  • a modified nuc-macromolecule can average 1 to 2, 2 to 5, 5 to 10, 10 to 30, 30 to 100, 100 to 1000, 1000 to 10000, 10000 to 1000000 nuc-components. Especially when using nanostructures or nano- or microbeads, very high numbers of nuc-components can be coupled to such a structure.
  • all modified nuc-macromolecules have an equal number of nuc-moieties per one modified nuc-macromolecule. For example, one to a maximum of four biotin molecules can be bound per one strepavidin molecule With a saturating concentration of linker components, a uniform population of modified nuc-macromolecules will be formed.
  • the modified nuc-macromolecules have a
  • nuc-macromolecules with nuc-components.
  • the distribution data of nuc-components per modified nuc-macromolecule represent an average value in this case.
  • the number of marker units in a modified nuc macromolecule includes the following ranges: 1 and 2, 2 and 5, 5 and 20, 20 and 50, 50 and 100, 100 and
  • modified nuc-macromolecules have a fixed number of signaling units per marker.
  • the distribution of marker moieties in a modified nuc-macromolecule population may vary, not necessarily
  • all modified nuc-macromolecules have an equal number of label moieties per one modified nuc-macromolecule. For example, a maximum of 4 biotin molecules can be bound per one strepavidin molecule, 15 Avidin-Biotin Technology, Methods in Enzymology v.184, 1990.
  • the modified nuc-macromolecules of a population have a defined average number of marker units per modified nuc-macromolecule, but in the population itself there is a distribution of the actual occupation of the modified nuc-macromolecules with marker units. At saturating concentrations in the synthesis of marker components, an increasingly uniform occupation of the modified nuc-macromolecules with marker units takes place.
  • the nuc-component (s) forms the basis for the substrate properties of the 10 modified nuc-macromolecules. These properties can be modified by steric hindrance (see section on steric hindrance).
  • the 15 have signaling function. In another embodiment, it has a signal-switching function. In another embodiment, it has a catalytic
  • the marker has an affine function.
  • the marker has more than one function, but e.g. combines both signaling and a signal-switched function.
  • the marker component contains components that are already bound to modified nuc-macromolecules during chemical synthesis.
  • the marker component carries components that only develop their signal properties through a reaction with signaling molecules, s. WO 2005 044836.
  • signaling molecules s. WO 2005 044836.
  • biotin molecules e.g. 100 biotin molecules, the marker
  • amino or mercapto groups for example 50 amino groups per marker, have the signal-mediating function.
  • a chemical modification with reactive components eg with dyes as described, for example, for incorporated allyl-amino-dUTP, Diehl et al. Nucleic Acid Research, 2002, v. 30, no. 16 e79.
  • the macromolecular marker component has a catalytic function (in the form of an enzyme or ribozyme).
  • a catalytic function in the form of an enzyme or ribozyme.
  • Different enzymes can be used, e.g. Peroxidase or alkaline phosphatase. Thanks to the coupling to the nuc-component, the respective enzyme can be covalently bound to the nucleic acid strand by the incorporation of modified nuc-macromolecules. 10
  • the macromolecular marker component has an affinity functionality to another molecule.
  • markers are streptavidin molecules, antibodies or nucleic acid chains.
  • the marker has the function of the macromolecular sterically demanding ligand and represents the macromolecular steric barrier.
  • a conventionally modified nucleotide carries a low molecular weight marker, e.g. a dye or a biotin molecule.
  • the modified nuc-macromolecules can be used as substrates for enzymes.
  • Polymerases are often used in applications enzymes that use nucleotides as substrates. They are further exemplified and representative of other nucleotide-converting enzymes.
  • One of the central capabilities of polymerases is the covalent coupling of nucleotide monomers to a polymer.
  • the synthesis may be both template-dependent (such as DNA or RNA synthesis with DNA- or RNA-dependent polymerases) and template-independent, for example by terminal transferases ("J Sambrook” Molecular Cloning 3rd Ed. CSHL Press 2001).
  • RNA is used as substrate (eg mRNA) in the sequencing reaction
  • commercial RNA-dependent DNA polymerases can be used, eg AMV reverse transcriptase (Sigma), M-MLV reverse transcriptase (Sigma), HIV reverse transcriptase without RNAse- Activity.
  • reverse transcriptases may be largely free of RNAse activity ("Molecular cloning" 1989, Ed. Maniatis, ColD Spring Harbor Laboratory), eg in mRNA migation for hybridization experiments.
  • DNA is used as substrate (eg cDNA), all DNA-dependent DNA polymerases with or without 3'-5 'exonuclease activity (DNA replication "1992 Ed A. Kornberg, Freeman and Company NY ), eg modified T7 "Sequenase Version 2" polymerase (Amersham Pharmacia Biotech), Klenow fragment of DNA polymerase I with or without 3'-5 'exonuclease activity (Amersham Pharmacia Biotech), polymerase beta of various origins (Animal Cell DNA Polymerases "1983, Fry M., CRC Press Inc., commercially available from Chimerx) thermostable polymerases such as Taq polymerase, Vent polymerase, Vent exo minus polymerase, Deep Vent polymerase, Deep Vent exo minus polymerase, Pfu polymerase, Thermosequenase, Pwo polymerase, etc. (the manufacturers are, for example, Promega GmbH, Amersham Biosciences (GE), Roche GmbH
  • DNA-dependent RNA polymerases can also be used, e.g. E. coli RNA polymerase, T7 RNA polymerase, SP6 RNA polymerase.
  • the polymerases can have a 3 ' or a 5 ' exonuclease activity and can be used in certain applications (eg in real-time PCR). In the application, DNA-dependent DNA polymerases are considered as examples of polymerases.
  • Cleavable Compound - A compound cleavable under mild conditions. This connection may be a section in the linker and may be cleavable at one or more locations. In such a case, the linker is cleavable. It may be a chemically cleavable compound, such as a disulfide, an ester, an acetal, a thioester (Short WO 9949082, Tcherkassov WO 02088382). It may also be a photochemically cleavable compound as shown in (Rothschild WO 9531429).
  • a specific enzyme between certain monomers the fissile sites can take place.
  • scissile compounds are known. The coupling of such a compound is described, for example, in (Tcherkassov 02088382, Metzker et al Nucleic Acid Research 1994, V.22, page 4259, Canard et al., Gene, 1994, V.
  • a cleavable compound may be part of the linker or may form the coupling site of the linker to the nucleotide, or the linkage between the linker moiety and the macroser moiety, or the linkage between the label moieties and the core moiety.
  • DNA - deoxyribonucleic acid of different origin and length e.g., oligonucleotides, polynucleotides, plasmids, genomic DNA, cDNA, ssDNA, dsDNA
  • dNTP - 2'-deoxynucleoside triphosphates substrates for DNA polymerases and reverse transcriptases, e.g. dATP, dGTP, dUTP, dTTP, dCTP.
  • NTP - ribonucleoside triphosphates substrates for RNA polymerases, UTP, CTP, ATP, GTP.
  • NT is also used in the length indication of a nucleic acid sequence, e.g. 1,000 NT.
  • NT stands for nucleoside monophosphates.
  • NT stands for “nucleotide”
  • NTs stands for several nucleotides.
  • NSKFs - nucleic acid chain fragments 1.3.15 NSKF nucleic acid chain fragment (DNA or RNA) corresponding to part of the total sequence, NSKFs - nucleic acid chain fragments.
  • the sum of the NSKFs is equivalent to the total sequence.
  • the NSKFs can Fragments of DNA or RNA total sequence arising after a fragmentation step.
  • PBS Primer binding site
  • Reference sequence an already known sequence for which the deviations in the sequence to be investigated or in the sequences to be examined (for example total sequence) are determined.
  • sequences accessible in databases may be used, e.g. from the NCBI database.
  • a group or chemical structure that is part of the modified nuc macromolecule (as a functional part of the modified nuc macromolecule) that creates a space-occupying effect at some distance from the nucleotide is part of the modified nuc macromolecule (as a functional part of the modified nuc macromolecule) that creates a space-occupying effect at some distance from the nucleotide.
  • this chemical structure has the effect of allowing the polymerase to incorporate only a single complementary modified nuc-macromolecule into the primer and incorporation of further complementary modified nuc-macromolecules in direct / unmettelbarer proximity to the first incorporated modified nuc-macromolecule is prevented.
  • polymers e.g., proteins, dendrimers
  • supramolecular structures e.g., nanoparticles or microparticles
  • 3D three-dimensional
  • proteins are examples of sterically demanding ligands within the meaning of this application, eg streptavidin (SA), avidin, phycoerythrin (PE), green fluorescent protein (GFP), antibodies, bovine serum albumine (BSA) or their derivatives and modifications (eg alkylated, acetylated, or forms of the proteins modified with further water-soluble polymerases, or genetically modified proteins having other spectral properties, or protein conjugates, such as streptavidin-alkaline phosphatase, streptavidin-peroxidase, streptavidin-antibody, streptavidin-phycoerhytrin or whole complexes, such as Quantum Dots coated with polyacrylic acid modified with streptavidin, (purchased from Invitrogen).
  • SA streptavidin
  • PE phycoerythrin
  • GFP green fluorescent protein
  • BSA bovine serum albumine
  • protein conjugates such as streptavidin-alkaline phosphatase, streptavidin
  • dendrimers represent the examples of sterically demanding ligands in the context of this application (see section Marker).
  • nano- and microparticles are examples of sterically demanding ligands within the meaning of this application, e.g. paramagnetic particles (see section markers), glass particles (see section markers), plastic particles (see section markers).
  • branched polymers are the examples of sterically demanding ligands within the meaning of this application, e.g. Dextrans (see section Marker).
  • ligands having a mass ranging from 2 to 1000 kDa more specifically, the following steric bulk mass ranges are of interest: between 2 and 10 kDa, 10 and 30 kDa, 30 and 100 kDa, 100 and 300 kDa, 300 and 1000 kDa.
  • ligands are used whose diameter is between 1 and 3 nm, 3 and 10 nm, 10 and 30 nm, 30 and 100 nm, 100 and 300 nm, 300 nm and 1000 nm, 1000 nm and 5000 nm.
  • sterically demanding low molecular weight ligands are coupled to a backbone and act in their entirety (ie, the ligands per se and the backbone) as a macromolecular sterically demanding ligand.
  • the number of low-mass ligands coupled to a scaffold can be, for example, between 2 and 200.
  • the macromolecular sterically demanding ligand is coupled to the linker.
  • the coupling site of the bulky ligand may be inside the linker or at the end of the linker.
  • the label has an independent coupling site on the linker which is different from the coupling site of the sterically bulky ligand.
  • the macromolecular sterically demanding ligand is coupled to the linker.
  • the marker is in turn coupled to this macromolecular sterically demanding ligand.
  • Embodiment serves as a ligand ligand between the linker and the marker.
  • the marker can contribute to the space-occupying effect of the sterically demanding ligand.
  • the sterically demanding ligand is coupled to the marker.
  • the marker can contribute to the space-occupying effect of the sterically demanding ligand.
  • the sterically demanding ligand is a constituent of the marker. Both structures contribute to the space-occupying effect of the bulky ligand.
  • the sterically bulky ligand may occur as the core component within marker.
  • the sterically demanding ligand has the marker function, ie the marker and the sterically demanding ligand are identical.
  • the sterically demanding group can also be considered as part of the linker or as part of the marker.
  • the consideration may depend on whether or not a sterically demanding group has certain signal properties.
  • the number of macromolecular sterically demanding ligands coupled to the modified nuc-macromolecule may vary, for example between 1 and 3, 3 and 5, 5 and 20, 20 and 50, 50 and 1000. This number may be exact or only average Figure number.
  • the minimum distance between the nuc-component and the nearest bulky steric ("steric barrier") ligand can vary between 10 and 10,000 chain atoms, preferably including 10 to 15, 15 to 20, 20 to 25, 25 to 30, 30 to 35, 35 to 40, 40 to 45, 45 to 50, 50 to 55, 55 to
  • the linker creates the distance between the enzymatically active nuc-component and the bulky ligand.
  • the nuc-component can be incorporated by the polymerase into a primer (N) (the primer ( N) has no demanding ligand). Since the primer (N + i) itself carries a sterically demanding ligand at its 3 'OH end, this sterically demanding ligand prevents the incorporation of further modified nuc macromolecules with sterically demanding ligands (see also section on enzymatic properties of modified nucl -Makromolekülen)
  • the linkage between the linker component and the macromolecular sterically demanding ligand can be similar to the coupling between the linker and the label. It can be both covalent and affine. Many examples are known in the art, see, for example, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2. Shan S.
  • the linker-to-label linkage may be resistant to, for example, temperatures up to 130 ° C, for pH - ranges between 1 and 14, and / or be resistant to hydrolytic enzymes (eg, proteases, esterases)
  • the connection between the nuc-component and the linker is cleavable under mild conditions.
  • the substrate properties of the modified nuc-macromolecules compared to primer-template-polymerase complexes have no steric properties challenging ligands
  • the complementary nuc-component of the modified nuc-macromolecule has sufficient range and the steric hindrance does not prevent the incorporation of this nuc-component into the primer ⁇ N) -matrice complex by the polymerase.
  • the steric barrier occupies a space that can not be occupied by another large structure (eg, similarly large or even larger sterically demanding ligand).
  • the effectively occupied space is made up of the volume of the molecule and the influences that arise in the solution (eg solvent shells contributing to a hydrodynamic diameter), so that this space may be larger than the actual volume of the molecular structure.
  • the substrate properties of this complex consisting of template, the extended primer (N + 1) , the polymerase, and the steric barrier attached to the terminal nucleotide can be summarized as follows (ability to incorporate the next complementary nucleotide / nucleus component):
  • Low molecular weight nucleotides and their derivatives also have access to the active site of the polymerases (e.g., other complementary natural nucleotides and their low molecular weight derivatives, e.g., labeled with a dye
  • Nucleotides e.g. dCTP-Cy
  • dCTP-Cy Nucleotides, e.g. dCTP-Cy
  • the effect of steric hindrance decreases, so that further modified nuc-macromolecule is reintegrated can be.
  • the primer-template polymerase complex loses the space-demanding ligand, thus restoring accessibility to another nuc-component of the modified nuc-macromolecule.
  • the composition for carrying out one or more process steps may be a solution of one or more substances or else a dry mixture, which must be treated with a solution before the process step.
  • the nucleic acid chains participating in the reaction are bound to a solid phase.
  • the binding can be covalent or affine.
  • solid phase The terms “solid phase”, “stationary phase”, “reaction surface” are used as synonyms in this context, unless another meaning is pointed out. 2. Description of the invention
  • the invention includes the following aspects:
  • Nucleotide analogs modified nuc macromolecules which include the following components: at least one nucleotide component (nuc-component), at least one macromolecular sterically demanding ligand, at least one marker, at least one linker.
  • nucleotide analogues modified nuc macromolecules which include the following components: at least one nucleotide component (nuc-component), at least one macromolecular sterically demanding ligand, at least one marker, at least one linker, wherein the respective linker, the is coupled to the nucleotide component, is cleavable.
  • a Composition Including at Least One of the Nucleotide Analogs of Aspect 1 or 2 The ratio between the weight fraction of the nucleotide analog and the weight of the composition may include the following ranges: 1: 1000000 to 1: 100000, 1: 100000 to 1: 10,000, 1: 10,000 to 1: 1000, 1: 1000 to 1: 100, 1: 100 to 1:10, 1: 10 to 1.
  • a nucleic acid chain or mixture of nucleic acid chains which includes at least one of the nucleotide analogs of aspect 1 or 2 as the nucleic acid chain monomer, wherein the nucleic acid chains may both be in the solution or be fixed to a solid phase.
  • Aspect 7 Methods for Enzymatic Synthesis of Nucleic Acid Chains Using Nucleotide Analogs According to Aspect 1 or 2.
  • Aspect 8 A Method of Synthesis of Nucleic Acid Chains, Including the following Steps: o Providing Extensible Matrix Primer Complexes o Incubating these complexes in a reaction solution containing one or more polymerase species and at least one type of modified nuc-macromolecule by aspect 2, under conditions involving a primer Allow extension to a modified nuc-macromolecule, wherein the modified nuc-macromolecule is modified in such a way that its incorporation leads to a stop in the further enzymatic reaction.
  • Kit for carrying out the enzymatic synthesis of nucleic acid chains which includes the following elements: o One or more types of polymerases o At least one of the nucleotide analogs, according to aspect 1 or 2
  • Kit for sequencing nucleic acid chains which includes the following elements: o One or more types of polymerases o At least one of the nucleotide analogs, according to aspect 2
  • step (b) incubation of at least one kind of the modified nuc-macromolecules according to aspect 2 together with at least one kind of polymerase with the NSK-primer complexes provided in step (a) under conditions which allow the incorporation of complementary modified nuc-macromolecules each type of modified nuc-macromolecule has a characteristic mark on it.
  • Another aspect 12 of the invention relates to a method according to aspect 11, wherein the nucleic acid chains are coupled to a solid phase in a random arrangement and at least some of these NSK primer complexes are optically individually addressable
  • Another aspect 13 of the invention relates to a method according to aspect 11 for the parallel sequence analysis of nucleic acid sequences (nucleic acid chains, NSKs) in which
  • NSKFs Generates fragments of single-stranded NSKs of about 50 to 1000 nucleotides in length, which can be overlapping partial sequences of an overall sequence;
  • the NSKFs bind in a random array using a single or multiple different primers in the form of NSKF primer complexes on a reaction surface, the density of the surface-engineered NSKF primer complexes providing optical detection of the signals from individual incorporated modified nuclides -Macromolecules allows, one
  • Use of at least two modified nuc-macromolecules each on the marker component fluorescent elements are selected so that the modified nuc-macromolecules used can be distinguished by measuring different fluorescence signals from each other, wherein the modified nuc-macromolecules are structurally modified so that the Polymerase after incorporation of such modified nuclease
  • Macromolecule in a growing complementary strand is unable to incorporate another Nuk nacromolecule in the same strand, the linker component with the marker component and the macromolecular sterisch demanding ligand are cleavable, one
  • step b) the stationary phase obtained in step a) is incubated under conditions suitable for extending the complementary strands, the complementary strands being each extended by a modified nuc-macromolecule;
  • step b) washing the stationary phase obtained in step b) under conditions which are suitable for removing modified nuc-macromolecules not incorporated in a complementary strand;
  • step f) washing the stationary phase obtained in step e) under conditions suitable for removing the marker component; if necessary, the steps a) to f) are repeated several times,
  • a further aspect of the invention relates to a method according to aspect 13, characterized in that the steps a) to f) of the cyclic synthesis reaction are repeated several times, wherein in each cycle only one type of modified nuc-macromolecules is used.
  • a further aspect of the invention relates to a process according to aspect 13, characterized in that the steps a) to f) of the cyclic synthesis reaction are repeated several times, whereby in each cycle two differently labeled types of the modified IMuk macromolecules are used.
  • a further aspect 16 of the invention relates to a process according to aspect 13, characterized in that the steps a) to f) of the cyclic synthesis reaction are repeated several times, whereby in each cycle four differently labeled types of the modified nuc-macromolecules are used.
  • Aspect 17 Nucleic acid chain sequencing kit according to the method of any one of 8 or 11 to 15, which includes: o One or more types of polymerases o At least one of the nucleotide analogs, according to Aspect 2 o Solutions for performing cyclic sequencing steps
  • Kit for sequencing nucleic acid chains according to the method of any of aspects 8 or 11 to 15, comprising one or more of the following compositions - present as a solution in concentrated or diluted form or also as a mixture of dry substances - from the following list includes: o One or more types of polymerases o At least one of the nucleotide analogs, according to Aspect 2 o Solutions for carrying out cyclic sequencing steps o Composition for incorporation reaction / extension reaction o Composition for washing the solid phase after the incorporation reaction o composition for optical detection of the signals on the solid phase o composition for cleavage of the marker and the sterically demanding macromolecular ligand o composition for washing the solid phase after the cleavage of the marker and the sterically demanding macromolecular ligand o composition for blocking the linker residue o Composition for washing the solid phase after the blockade of the linker
  • Aspect 19 Nucleic Acid Chain Sequencing Kit of Aspect 18, which further includes one or more of the following: o Composition with unmodified nucleotides (dNTPs or NTPs) o Composition with irreversible terminators (ddNTPs) o Composition with terminal transferase o Composition with a buffer for transferase reaction o Composition with a ligase o Composition of oligonucleotides which can be ligated to the nucleic acids as a uniform primer binding site. o Composition with a buffer for ligase reaction o Solid phase and reagents for the preparation of nucleic acid chains for
  • a kit for sequencing nucleic acid chains according to any of aspects 9, 10, 17, 18 or 19, which includes one or more polymerases from the following list: o reverse transcriptases: M-MLV, RSV, AMV, RAV, MAV, HIV DNA polymerases: Klenow fragment DNA polymerase, Klenow fragment exo minus DNA polymerase, T7 DNA polymerase, Sequenase 2, Vent DNA polymerase, Vent exo minus DNA polymerase, Deep Vent DNA polymerase, Deep Vent exo minus DNA polymerase, Taq DNA polymerase, TIi DNA Polymerase, Pwo DNA Polymerase, Thermosequenase DNA Polymerase, Pfu DNA Polymerase
  • Aspect 21 Kit for sequencing nucleic acid chains according to any of aspects 9, 10, 5, 17, 18 or 19, in which the constituents of the compositions are already mixed or present as separate substances.
  • Chips are provided o Solid phase in the form of nano- or microspheres
  • a method of synthesizing nucleic acid chains including the following steps: a) providing template-primer complexes capable of extension b) incorporation reaction: incubation of these complexes in a reaction solution containing one or more polymerase species and at least one type of modified one Nuc-macromolecules according to aspect 2 contains, under conditions that a primer
  • a method for synthesizing nucleic acid chains comprising the steps of: a) providing extensioinsatable template-primer complexes having addressable positions b) incorporation reaction: incubation of these complexes in a reaction solution comprising at least one polymerase species and at least one Type of modified nuc-macromolecules according to aspect 24, under conditions that allow primer extension around a modified nuc-macromolecule, wherein the modified nuc-macromolecule is modified in such a way that its incorporation into a reversible stop in the further enzymatic reaction leads.
  • template-primer complex purification steps c) Optionally, using template-primer complex purification steps. d) Optionally, identify the type of incorporated nucleotide analog by detecting marker properties, allowing local assignment of primer-template complexes. e) Removal of the template f) If necessary, use template-primer complex purification steps g) Alternatively, repeat steps (b) through (f) and then analyze the identified signals from built-in nucleotide analogues.
  • the cyclic steps may be repeated several times, for example 2 to 10 times, 10 to 20 times, 20 to 100 times, 100 to 500 times.
  • the identification of the incorporated nucleotide analogues is carried out by the marker.
  • Aspect 25 of the invention relates to nucleotide analogues (modified nuc-macromolecules) having the composition of aspect 1 or 2, wherein the following arrangements of the components are included:
  • Nuk - a Nuk component is a linker - a linker component is where linker 1 or linker 2 or linker 3 may have the same or different structure Marker - a Makrer component
  • Ligand - is a macromolecular sterically demanding ligand
  • Marker / ligand - a structure that has both marker properties and properties of a macromolecular sterically demanding ligand
  • (n) - is a number from 1 to 100,000.
  • the ratios in the molecule are distributed as follows: (n)> (m)> (k), wherein the individual numbers can be varied independently of one another.
  • nuc-component includes the following structures ( Figure 3A):
  • Base - is independently selected from the group of adenine, or 7-deazaadenine, or guanine, or 7-deazaguanine, or thymine, or cytosine, or uracil, or their modifications, where L is the link between the nuc-component and the linker Component represents (coupling unit L) and X is the coupling point of the coupling unit L at the base
  • Ri - is H
  • R 2 - is independently selected from the group H, OH, halogen, NH 2 , SH or protected OH group
  • R 4 - is H or OH
  • R 5 - is independently selected from the group OH, or a protected OH group, a monophosphate group, or a diphosphate group, or a triphosphate group, or an alpha thiotriphosphate group.
  • Eiter Aspect 27 of the invention relates to nucleotide analogs according to any of the aspects of Figure 25, wherein the nuc-component includes the following structures ( Figure 3B):
  • Base - is independently selected from the group of adenine, or 7-deazaadenine, or guanine, or 7-deazaguanine, or thymine, or cytosine, or uracil, or their modifications capable of enzymatic reactions
  • R 1 - is H
  • R 2 - is independently selected from the group H, OH, Hal, NH 2 , SH or protected OH group
  • R 3 - is independently selected from the group O-R 3-2 -L, P (0) m - R 3-2 -L, where m is 1 or 2, NH-R 3-2 -L, SR 3- 2 -L, Si-R 3-2 -L or, where R 3-2 is the coupling site of the linker to the nucleotide or nuc-component and L - is the coupling unit of the linker (L).
  • R 4 - is H or OH
  • R 5 - is independently selected from the group OH, or a protected OH group, a monophosphate group, or a diphosphate group, or a triphosphate
  • the second aspect of the invention relates to nucleotide analogs according to one of the aspects of Figure 25, wherein the nuc-component includes the following structures (Figure 3B):
  • Base - is independently selected from the group of adenine, or 7-deazaadenine, or guanine, or 7-deazaguanine, or thymine, or cytosine, or uracil, or their modifications capable of enzymatic reactions
  • R 5 - is independently selected from the group O-R 5 - 1 -L, or P- (O) 3 - R 5 - 1 -L (modified monophosphate group), or P- (O) 3 -P- ( O) 3 -R 5-I- L (modified
  • the second aspect 29 of the invention relates to nucleotide analogs according to one of the aspects 28, wherein coupling unit L includes the following structural elements:
  • R 6 - (- C ⁇ C-CH 2 -CH 2) n -BR 7 wherein R 6 - is the nuc-component, R 7 - is the linker radical and A and B independently include the following structural elements: -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH - CO-, -CO-O-, -O-C0-, -CO-S-, -S-CO-, -P (O) 2 -, -Si-, - (CH 2 ) n -, a photolabile Group, where n - is 1 to 5
  • Another aspect of the invention pertains to nucleotide analogs of any one of aspects 25 to 28, wherein the linker component includes a water-soluble polymer.
  • a further aspect 31 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspect 30, wherein the linker component includes water-soluble polymers independently selected from the following group:
  • Another aspect 32 of the invention relates to nucleotide analogs according to any one of aspects 1, 2, 25 to 31, wherein the linker component has an average length of between 5 and 10, 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200 , 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 10000, 10000 to 100000, 100000 to 500000 atoms.
  • Another aspect of the invention relates to nucleotide analogs according to any one of aspects 1,2, 25 to 32, wherein the marker or a marker component has a signaling, signal-mediating, catalytic or affine function, or has the function of the macromolecular sterically demanding ligand
  • nucleotide analogs of any one of aspects 25 to 33 wherein a structural marker moiety independently includes one or more of the following structural elements:
  • nucleotide analogs according to any one of aspects 25 to 33, wherein a structural marker moiety independently includes one or more of the following elements: Nanocrystals or their modifications, proteins or their modifications, nucleic acid chains or their modifications, particles or their modifications.
  • a structural marker unit includes one of the following proteins:
  • Enzymes or their conjugates or modifications antibodies or their conjugates or modifications, streptavidin or its conjugates or modifications, avidin or its conjugates or modifications
  • Aspect 37 of the invention relates to nucleotide analogs according to any one of aspects 1, 2 to 25, wherein the macromolecular sterically demanding ligand includes the following structures: proteins, dendrimers, nanoparticles, microparticles or their modifications.
  • the above-mentioned methods may, in particular embodiments, be used to identify nucleic acids or to identify the composition, i. Sequence of the nucleotides, the nucleic acids are used.
  • the processes can be carried out by repeating the steps of the incorporation reaction, step (b), several times, wherein a) in each step only one labeled modified nuc-macromolecule, b) two in each step c) different modified modified nuc-macromolecules or c) four differently labeled modified nuc-macromolecules in each step
  • each type of modified nuc-macromolecule carries a label specific to it.
  • the template can be DNA or RNA molecules.
  • the matize may be a uniform population of nucleic acid molecules or a mixture of nucleic acids having different sequences.
  • the template is in single-stranded form. If a double-stranded template is present, template-primer complexes can be made by denaturing the template and then hybridizing the primer.
  • the template includes, among others, the following nucleic acid: defined amplicons (e.g., PCR products), cDNA, fragments of genomic DNA, or RNA (including products of the
  • LO amplification reactions LO amplification reactions
  • mRNA LO amplification reactions
  • Viral, bacterial or eukaryotic nucleic acid chains can be used.
  • the template is exposed in the solution.
  • the template is bound to a solid phase (by covalent, affine, or other type of coupling).
  • the fixation on the solid phase can be in one
  • the primer is an oligodeoxinucleotide or an oligoribonucleotide. In one embodiment of the method, uniform primers are used. In another embodiment, primers with different sequences are used. The composition and length of the primer are not limited. In addition to the start function, the primer can also perform other functions, e.g. to create a connection to the reaction surface.
  • the primer can, for example, sections
  • SO contain nucleic acids that are not complementary to template and serve, for example, to bind the primer to a solid phase.
  • Primers should be adapted to the length and composition of the primer binding sites in the templates so that the primer allows for the start of the sequencing reaction with the particular polymerase. In one embodiment of the invention, the primer binds to the complementary
  • the primer has at least one non-complementary site to the primer binding site in the template.
  • the sequence-specific primers for each primer binding site are used.
  • a uniform primer can be used.
  • the length of the primer is between 6 and 100 NTs, optimally between 10 and 50 NTs.
  • the primer may carry a functional group which serves to immobilize the prim or template primer, for example, such a functional group is a biotin group.
  • a functional group is a biotin group.
  • the synthesis of such a primer can e.g. with the DNA synthesizer 380 A Applied Biosystems or as a custom synthesis with a commercial supplier, e.g. MWG-Biotech GmbH, Germany).
  • the oligonucleotides can be fixed by various techniques or synthesized directly on the surface, for example according to (McGaII et al., US Patent 5412087, Barrett et al., US Patent 5482867, Mirzabekov et al., US Patent 5981734, "Microarray biochip technology” 2000 M. Schena Eaton Publishing, “DNA Microarrays” 1999 M.
  • the primers may be attached to 1,000,000 per lOO ⁇ m 2 on the surface, for example, in a density of between 10 to 100 microns per 100 2, 100 to 10,000 per 100 microns 2 or 10,000.
  • the primer or primer mix is incubated with template under hybridization conditions that selectively bind it to the primer binding site of the template.
  • the optimization of the hybridization conditions depends on the exact structure of the primer binding site and the primer and can be according to Rychlik et al. Calculate NAR 1990 v.18 p.6409. Hereinafter, these hybridization conditions are referred to as standardized hybridization conditions.
  • reaction mixtures in the incorporation step / extension step may include the following components:
  • buffer substances eg Tris buffer, phosphate buffer, acetate buffer, HEPES buffer, MOPS buffer, borate buffer
  • concentration of Substances are preferably between 10 mM and 200 mM
  • pH of the solution is preferably between 5 and 10.
  • divalent metal ions eg Mg 2+, Mn 2+ or Co 2+
  • organic solvents eg DMF, DMSO
  • glycerol, Tween 20 further details see manufacturer's instructions
  • nucleotides e.g., dCTP, dATP, dGTP, dTTP, dUTP, ATP, CTP, GTP, UTP
  • conventionally modified nucleotides e.g., dCTP, dATP, dGTP, dTTP, dUTP, ATP, CTP, GTP, UTP
  • conventionally modified nucleotides e.g.
  • Biotin-16-dUTP, Cy3-dCTP or digoxigenin-dUTP are Biotin-16-dUTP, Cy3-dCTP or digoxigenin-dUTP
  • polymerase species that can couple a nucleotide in a template-dependent enzymatic reaction to the primer in the primer-template complex.
  • the polymerases may have processive or distributive properties in the synthesis.
  • modified nuc-macromolecules wherein o only one labeled modified nuc-macromolecule each, o two differently labeled modified nuc-macromolecules or o four differently labeled modified nuc-macromolecules * are present.
  • one or more other proteins capable of binding to one of the reaction components e.g. Signle Strand binding protein, e.g. Elongation factors.
  • Temperature conditions may remain the same or differ between individual steps of the methods of the invention. They are preferably between 10 0 C and 95 ° C.
  • steps represent optional purification of template-primer complexes with incorporated modified nuc-macromolecules from the free modified nuc-macromolecules in the solution.
  • This purification can be accomplished by, for example, washing the solid-phase-bound template-primer complexes shown in FIG Modified nuc-macromolecules take place. The washing can be done, for example, with a buffer solution.
  • modified nucleotide analogs (modified nuc-macromolecules) used in step (b) in the above-mentioned methods are modified nuc-macromolecules which include at least one macromolecular sterically demanding ligand which, after incorporation of a modified nuc-macromolecule, further enzymatic incorporation of such modified nuc macromolecules stops or significantly hinders.
  • the efficiency of preventing the further progress of the incorporation reaction is preferably higher than 70%.
  • reversible terminators with termination efficiencies are preferred, including the following ranges: 80-100%, 90-100%. Particularly preferred are reversible terminators with termination efficiencies in ranges of 95-100%, 97-100%, 99-100%.
  • the goal of the separation may be the analysis of incorporation events of modified nuc-macromolecules onto primers.
  • oligonucleotides with primer function
  • a separation medium can serve, for example, a solid phase with immobilized oligonucleotides, the specific sequences in the oligonucleotide
  • Such a solid phase may be present, for example, as a one- or two-dimensional array (e.g., microarray).
  • the solid phase is thus purified by washing the array.
  • gels e.g., agarose or polyacrylamide gels
  • agarose or polyacrylamide gels may occur.
  • Another way to control enzymatic reaction is to use modified substrates, for example dideoxy nucleotides.
  • modified substrates for example dideoxy nucleotides.
  • the use of labeled dideoxy nucleotides results in the incorporation of only one nucleotide since the 3 " OH group necessary for further synthesis is absent
  • the major disadvantage of this method of reaction control is irreversible blockade of the synthesis at the given strand of the nucleic acid
  • the obvious consideration of coupling an easily cleavable group to the 3 " -hydroxyl group and thereby achieving a reversal in termination did not lead to the desired success in many groups. Many such modified nucleotides lost their substrate properties for the polymerases.
  • the distance between the marker (sterically demanding group) and the enzymatically active part of the molecule (the nucleotide unit) is only a few angstroms, since usually Unker be used from 5 to 20 chain atoms.
  • the small molecule markers are in direct contact with, or in close proximity to, the active site.
  • the direct contact or the proximity may lead to impairment of the enzymatic process, in the case of polymerases to hinder further synthesis.
  • the direct contact or proximity of the small molecule markers also explains the influence of marker molecules on the enzymatic process (Tcherkassov WO 02088382).
  • the invention in one embodiment, is to provide a method of controlling the enzymatic synthesis reaction.
  • This method is characterized by the use of modified nuc-macromolecules bearing macromolecular sterically demanding ligands in the enzymatic synthesis reaction.
  • the macromolecular sterically demanding ligands according to the invention have a mass that is more than 2 kDa.
  • the enzymatic synthesis is controlled by a sterically demanding macromolecular ligand which is located after incorporation of the nucleotide component outside the polymerase molecule.
  • the incorporated modified nuc macromolecule carries a macromolecular sterically demanding ligand. This sterically demanding ligand does not leave any other ligand near the polymerase. With a suitably selected linker length, no further modified nuc-macromolecule can be incorporated.
  • the linker is shown schematically in a full-length expanded state. With others The space-occupying properties of the sterically demanding ligand (due, for example, to its size) prevent further modified nuc-macromolecules with similarly sized ligands from reaching the active site of the polymerase. The further reaction is blocked.
  • the following rule can be applied to the spatial potential for the linker length: the greater the linker length between the nucleotide component and the sterically bulky ligand, the larger sterically bulky ligand is needed to hinder further synthesis.
  • the smaller ligands may lose their effect with increasing linker length between the nucleotide component and steric ligand.
  • primer extension reaction • The following components are involved in the primer extension reaction: o template-primer complex (primer (N) ) o DNA polymerase o nucleotides (unmodified or modified with a sterically demanding ligand). o Solution with buffer substances and divalent metal ions
  • Strategy I The starting parameter is the sterically demanding ligand. o For a given challenging ligand, should be different
  • linker If the linker is too short, the incorporation is completely inhibited. ⁇ If the linker is too long, several nucleotide analogues with sterically demanding groups can be incorporated.
  • nucleotide analogues with sterically demanding groups can be incorporated.
  • all modified nuc-macromolecules can carry the same or different sterically demanding ligands.
  • the decisive factor for the reaction control is the effectiveness of the blocking effect of the ligands with each other.
  • the control of the reaction in one embodiment includes the possibility of reversibility of the blockade of the reaction.
  • the reversibility of the blockade of the further reaction can be achieved.
  • the method according to the invention for the step-by-step enzymatic synthesis reaction of nucleic acids can be used, for example, in technologies for analyzing the genetic information (WO 02088382, DE 10 2004 025 696, DE 101 20 798, DE 102 14 395).
  • This analysis proceeds to single-molecule eights, i. Sequences of single molecules of nucleic acids are identified.
  • the method according to the invention is used in the method for the parallel sequence analysis of nucleic acid sequences or nucleic acid chains, NSKs, which includes the following steps:
  • the cyclic steps may be repeated several times, for example 2 to 10 times, 10 to 20 times, 20 to 100 times, 100 to 500 times.
  • the identification of the incorporated modified nuc-macromolecules is carried out by the marker.
  • step (3) in one cycle are chosen such that the polymerases bind to more than 50% of the NSKFs involved in the sequencing reaction (Extensible NSKF primer complexes) can incorporate a modified nuc-macromolecule in one cycle, preferably more than 80% or more than 90% of the expandable complement.
  • time and / or buffer or temperature conditions and / or concentrations of reagents can be varied
  • polymerases and modified nuc-macromolecules are in the same solution or composition that is added to the complex-phase complexes bound to the solid phase.
  • polymerases and modified nuc-macromolecules are provided in separate solutions or compositions.
  • the solutions or compositions are added separately to the extendable complexes bound to the solid phase.
  • a solution or composition with polymerase is first added and then a solution or composition with a modified nuc macromolecule (see Example 15).
  • composition with one or more polymerase species may be added in one step, and in further steps, co-cultures with modified nuc-macromolecules are added.
  • NSKs nucleic acid chains
  • NSKFs Generates fragments of single-stranded NSKs of about 50 to 1000 nucleotides in length, which can be overlapping partial sequences of an overall sequence;
  • the NSKFs bind in a random array using a single or multiple different primers in the form of NSKF primer complexes on a reaction surface;
  • nucleotide analogues include a macromolecular sterisch demanding ligands that the Polymerase after incorporation of such a modified nuc macromolecule in a growing complementary strand is not able to incorporate another modified nuc-macromolecule in the same strand, the marker is cleavable and the structural modification is a cleavable macromolecular sterically demanding ligand, one
  • step b) the stationary phase obtained in step a) is incubated under conditions suitable for extending the complementary strands, the complementary strands being each extended by a modified nuc-macromolecule;
  • step b) washing the stationary phase obtained in step b) under conditions which are suitable for the removal of non-complementary nucleotide analogues;
  • Detected signal which simultaneously determines the relative position of the individual fluorescence signals on the reaction surface, one
  • step f) washing the stationary phase obtained in step e) under conditions suitable for the removal of the markers and the ligands;
  • the relative position of individual NSKF primer complexes on the reaction surface and the sequence of these NSKFs are determined by specific assignment of the fluorescence signals to the NTs detected in step d) in successive cycles at the respective positions.
  • the cyclic steps may be repeated several times, for example 2 to 10 times, 10 to 20 times, 20 to 100 times, 100 to 500, 500 to 2000 times.
  • the identification of the incorporated modified nuc-macromolecules is carried out by the marker.
  • a suitable surface for such processes can be prepared according to DE 101 49 786 or DE 10 2004 025 744.
  • the material preparation and the detection can be carried out according to WO 02088382, DE 10 2004 025 696, DE 101 20 798, DE 102 14 395, DE 102 46 005.
  • the modified nuc-macromolecules according to the invention can be synthesized in different ways.
  • the order of the coupling steps can be synthesized in different ways.
  • the order of the coupling steps can be synthesized in different ways.
  • L5 vary.
  • a linker component can be coupled to the nuc-component, then the marker component is coupled together with a macromolecular sterically demanding ligand.
  • one or more linkers can be coupled to the sterically bulky ligand followed by the nuk component (s) and then thereafter
  • the coupling between individual components of the modified nuc-macromolecules can be covalent or affine. Whereby both chemical and enzymatic coupling can be used to link individual components. couplings
  • Amino and thiol groups serve as examples of covalent linkages (Jameson, D., et al., Methods in Enzymology 1997, V. 278, pp. 363-, "The chemistry of the amino group," S. Patai, 1968, “The chemistry of the thiol group “S. Patai, 1974). Biotin-streptavidin binding or hybridization between complementary
  • Nucleic acid strands or antigen-antibody interactions provide examples of
  • a macromolecular sterically demanding ligand and a macromolecular marker often offer a variety of coupling possibilities.
  • a macromolecular ligand can have multiple coupling sites for linkers, for example multiple binding sites for 5 biotin, as is the case with streptavidin.
  • a macromolecular marker or a macromolecular sterically demanding ligand may also contain several amino or thiol groups.
  • the core component of the marker can be modified with different numbers of signaling or signal-transmitting units. The exact ratios between marker units can vary. Examples of the modification of polymers with dyes are known (Huff et al., US Patent 5661040, D. Brigati US Pat. If nucleic acids are used as macromolecular markers, they can have different sections for coupling other macromolecules. Other macromolecules can be bound to a macromolecular marker, eg enzymes.
  • a modified nuc-macromolecule may carry macromolecular markers having different detection properties, for example, a modified nuc-macromolecule may carry both multiple dye molecules and sites for affinity binding (e.g., by hybridization) of other macromolecules.
  • the coupling between the nuc-components and the linker components is preferably covalent.
  • Many examples of covalent coupling to nucleotides or their analogs are known (Jameson et al., Methodology in Enzymology, 1997, v. 278, pp. 363-, Held et al., Nucleic acid research, 2002, v. 30, 3857, Short US Pat. No. 6579704, Odedra WO 0192284).
  • the coupling can be carried out, for example, on phosphate, amino, hydroxyl or mercapto groups.
  • the linker component can be built in several steps.
  • a short linker having a reactive group is coupled to the nucleotide or nucleoside, e.g. Propargylamine Linker to Pyrimidines Hobbs et al. U.S. Patent 5,047,519 or other linkers e.g. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028, Hanna M. Method in Enzymology 1996, v.274, p.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 p.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, p.
  • short linkers serve as coupling units L or their parts, and are a component of the linker component in the final modified nuc-macromolecule.
  • the coupling of the nucleotide or nucleoside can be done with a short linker to the linker polymer.
  • Polymers with reactive functional groups can be purchased (Fluka).
  • the marker component can now be coupled as the last step.
  • precursors for modified nucleosides can be obtained commercially from Trilink Biotechnologies (San Diego, Calif., USA) or from Chembiotech (Münster, Germany).
  • Coupling of macromolecular sterically demanding ligands can take place in different ways. For example, macromolecular sterically demanding ligands are first coupled to the structure consisting of nuc-linkers and only then is the coupling to the marker. Another approach is the primary coupling of sterically susceptible ligand to the marker (e.g., coupling of streptavidin to phycoerhytrin) and subsequent to the structure of nuc-linker.
  • the macromolecular sterically demanding ligand may also be included as a component of the label, e.g. occur as a core component.
  • low molecular weight substances e.g., dyes, e.g., Cy3
  • the coupling between the linker component and the marker component may, for example, take place between reactive groups on the linker component and the marker component.
  • Reagents for such couplings are detailed in “Chemistry of protein conjugation and cross-linking", S. Wang, 1993, ISBN 0-8493-5886-8.
  • the methods for handling and coupling a plurality of macromolecules are illustrated for different types of macromolecules also in the above patents. Further examples of couplings to and between the macromolecules are useful for proteins in "Bioconjugation: protein coupling techniques for biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2; "Reactive Dyes in Protein to Enzyme Technology", D.
  • the marker component usually has many coupling sites, further modifications to complete modified nuc-macromolecules can be made. For example, excess amino groups can be blocked or altered by further modifications.
  • modified nuc macromolecules are indicated with polyethylene glycol (PEG) as the linker component.
  • PEG polyethylene glycol
  • Examples of the coupling of PEG to other molecules are described in "Poly (ethylene glycol): chemistry and biological applications", 1997.
  • very different reactive groups can be used for coupling: N-succinimidyl carbonate (US Pat. No. 5,281,698, US Pat.
  • polymers can be coupled in a similar manner.
  • examples of such polymers are other poly (alkylene glycols), copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, poly (olefinic alcohols), poly (vinylpyrrolidones), poly (hydroxyalkylmethacrylamides), poly (hydroxyalkyl methacrylates), poly (saccharides), poly (x-hydroxy acids ), Poly (acrylic acid), poly (vinyl alcohol).
  • nucleotide chemistry for example, silica gel chromatography in a water-ethanol mixture, ion exchange chromatography in a salt gradient and reverse-phase chromatography in a water-methanol gradients.
  • nucleotide purification optimized chromatography columns are used e.g. offered by Sigma-Aldrich.
  • the purification of macromolecular linker components and marker components can be carried out by ultrafiltration, gel electrophoresis, gel filtration and dialysis, see "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375- second
  • the mass of the modified nuc-macromolecules differs significantly from the mass of the nucleotides. For this reason, it is advantageous to use ultrafiltration in the final purification steps. Since only an average mass is enriched for the modified nuc-macromolecules, ultrafiltration is also suitable as an analytical method for the separation of synthesis products.
  • TLC Thin layer chromatography
  • Analytical "TLC aluminum foils 20 ⁇ 20 cm silica gel 60 F 254" (VWR), coated with fluorescent indicator visualization by means of UV light mobile phase ethanol-water mixture (70:30) (mobile phase, LM 1 ) or ethanol-water mixture (90:10) (LM 2)
  • Preparative Silica gel glass plates with collecting layer (VWR), LM 1 or LM 2.
  • ImI were collected and analyzed by UV-Vis spectrometer. Fractions with similar spectra were pooled and lyophilized.
  • UV / Vis control collected and pooled on the same spectra.
  • modified nuc-macromolecules can be used, for example, if modified nuc-macromolecules are oligonucleotides of the marker component. By hybridizing to a complementary, fixed on a solid phase nucleic acid, they can be selectively isolated.
  • the completeness of the coupling to strepavidin was carried out by a control titration with a biotin dye (biotin-4-fluorescein, Sigma) 100 ⁇ mol / l in 50 mmol / l borate, pH 8, 5 min at RT. In a complete occupation of biotin-binding sites on strepavidin during the synthesis is no labeling of streptavidin. If the reaction is insufficient, binding to SA occurs. Analysis with UV-Vis.
  • dUTP-AA (dUTP allylic amine, Jena Bioscience), dCTP-PA (dCTP-propargyl-amine, Jena Bioscience), dATP-PA (7- (3-amino-1-propynyl) -2 * deoxy-7 -deazaadenosin-5 'triphosphate) (custom synthesis of JenaBioscience), dGTP-PA (7- (3-amino-l-propynyl) -2 * deoxy-7-deazaguanosine-5' triphosphate, (custom synthesis of JenaBioscience) PDTP (3- (2-pyridinyl-dithio) propionic acid, Fluka), 7- (3-phthalimido-l-propynyl) -2 '-deoxy-7- deazaguanosine and 7- (3-phthalimido-l-propynyl) -2 '-deoxy-7-deazaadenosine
  • nucleotide analogs such as e.g. 7-deaza-aminopropargyl-deoxy-guanosine triphosphate and 7-deaza-aminopropargyl-deoxy-adenosine triphosphate, 5-amino-propargyl-deoxy-uridine triphosphate, 5-amino-allyl-deoxy-uridine triphosphate, 5-amino Propargyl-deoxy-cytidine triphosphates may also be modified as indicated above.
  • This dUTP analog carries a reactive SH group that can be easily modified, for example, to form disulfide bond.
  • the product carries a reactive SH group that can be easily modified, for example, to form disulfide bond.
  • This product can be coupled to another molecule by thiol exchange.
  • a free SH group By cleavage of the SS bond, a free SH group can be provided.
  • linkers with reactive groups such as carboxy, thiol or disulfide groups and a PEG spacer (e.g., biotin-PEG (8) -SS-PEG (8) -biotin) can be obtained from IRIS-Biotech
  • This compound carries a nucleotide functionality and a macromolecular
  • Biotin serves as a coupling unit T.
  • Macromolecular structures can be coupled to this coupling unit T, for example streptavidin or streptavidin-modified proteins or beads.
  • the product of the reaction is an intermediate of a modified nuc macromolecule.
  • This example shows a general possibility to further modify nucleotides.
  • Other base-modified nucleotide analogs such as 5-propargylamino-dCTP, 7-deaza-aminopropargyl-dGTP, 5-amino-propargyl-dUTP and 7-deaza-aminopropargyl-dATP may also be modified as indicated above.
  • Both ribonucleotides, 2- t- deoxyribonucleotides and 2 V , 3 * -deoxyribonucleotides can be used ( Figures 16, 21-24).
  • This compound carries a nucleotide functionality and a macromolecular linker.
  • Biotin serves as the coupling unit T.
  • macromolecular structures can be coupled, e.g. Streptavidin.
  • Other macromolecules, for example enzymes or nucleic acid genes can also be coupled via streptavidin.
  • the linker component can be cleaved off the nuc-component with the marker component under mild conditions. This can be advantageous, for example, if sequencing is carried out by synthesis (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Quake WO0132930, Kartalov WO02072892), wherein removal of the markers is necessary after each detection step.
  • Step 1 First, dCTP-PA was modified with PDTP-NHS to give dCTP-PA-PDTP.
  • the synthesis was carried out similarly as for dUTP, see example 1.
  • Step 2 An aqueous TCEP solution (10 ⁇ l, 300 mmol / l, pH 7, adjusted with NaOH) was added to an aqueous solution of biotin-PEG (8) -SS -PEG (8) -biotin (50 ⁇ l, 100 mmol / l, pH6, Iris Biotech GmbH). About half of the disulfide bridges are split.
  • Aqueous solution of dCTP-PA-PDTP (20 ⁇ l, 20 mmol / l, pH 9.5, adjusted with NaOH) was added to the solution obtained in step 2 and incubated for 1 hour at RT.
  • the product was isolated by thin layer chromatography in LM 1. The nucleotides were eluted from the plate with water and concentrated.
  • the starting substances used were streptavidin (Promega Inc.) and BOC-PEG-NHS (3000 Da, nectar), Fmoc-PEG-NHS (5000 Da, nectar) and fluorescein-PEG-NHS (5000 Da, nectar).
  • streptavidin Promega Inc.
  • BOC-PEG-NHS 3000 Da, nectar
  • Fmoc-PEG-NHS 5000 Da, nectar
  • fluorescein-PEG-NHS 5000 Da, nectar.
  • streptavidin 5 mg / ml in 50 mmol / l borate buffer, pH 9
  • PEG derivatives were added to the concentration of 10% (w / v) and incubated at RT for about 2 hr.
  • the modified streptavidin was purified by ultrafiltration from excess PEG derivatives.
  • other protein conjugates can be scaled up in size, with higher molecular weight PEG
  • Nucleotide analogues with a macromolecular sterically demanding ligand The controlled enzymatic synthesis of nucleic acids (incremental primer extension) involves a controlled stop, optionally purification of the nucleic acids, termination of the stop and the continuation of the synthesis. The halt in synthesis is caused by incorporation of nucleotide analogs of the invention with macromolecular sterically demanding ligands. The relationships between linker length and extent of steric hindrance are demonstrated in some examples of nukeotide analogs.
  • (dUTP-16-biotin) 4 -SA To 200 ⁇ l of a solution of biotin-16-dUTP (linker length 16 atoms) 200 ⁇ mol / l in 50mM Tris-HCl, pH 8.0, was added 200 ⁇ l of a streptavidin solution, lmg / ml , in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0. After 1 hour at RT, the (dUTP-16-biotin) 4-SA was separated from unreacted biotin-16-dUTP by ultrafiltration, 50,000 MWCO. A compound was obtained which carries a nucleotide functionality and a macromolecular sterically demanding ligand. This ligand can also be considered as a marker. This compound is not accepted as a substrate by polymerases (eg Klenow exo minus polymerase and terminal transferase). The modification leads to the loss of the substrate properties.
  • polymerases eg Klenow exo minus polymerase and terminal transfera
  • this linker is too short for this macromolecular structure (streptavidin).
  • streptavidin as a macromolecular ligand, does not allow the nucleotide component close enough to the active site of the Klenow fragment.
  • the compound is obtained from dUTP-AA-PEG-biotin-SA * PE.
  • nucleotide-SA modified streptavidin
  • dNTP modified streptavidin
  • compounds for dCTP derivatives are synthesized.
  • the compound dUTP-AA-PEG-biotin-SA- (PEG (5,000-fluorescein)) n has a macromolecular ligand modified with dyes (fluorescein).
  • Other dyes can be coupled either to streptavidin directly or through the linkers.
  • SA- (PEG (5.000-Fmoc)) n can be modified with NHS derivatives of dyes after cleavage of Fmoc protecting groups on vacant amino groups. In this way, the macromolecular sterically demanding ligand can also have marker function.
  • polymerases e.g. Klenow exo minus polymerase, Sequenase, VentExo minus, Taq polymerase, Pwo polymerase, Reverse Transcriptase (MMLV (Promega), ImProm II TM (Promega)), accepted as a substrate.
  • the effectiveness of hindering enzymatic synthesis is exemplified by homopolymeric regions in the template and polymerase Vent exo minus polymerase: during enzymatic synthesis at complementary template positions where potentially multiple incorporation of these nucleotide analogs could occur (eg -AAA routes, homopolymers), the incorporation of up to three sequentially modified nucleotide analogues dUTP-AA-PEG-biotin-SA- (PEG (3.00O) -BOC) n can be detected. However, the proportion of primers on which a multiple extension has taken place is small (termination efficiency in homopolymeric areas above 90%).
  • a complete stop can be achieved for a given linker length by enlarging the sterically demanding ligand.
  • the analogues dUTP-AA-PEG-biotin-SA- (PEG (5,000-fluorescein)) n and dUTP-AA-PEG-SA * PE are incorporated by Vent exo minus only once at homopolymeric distances.
  • the incorporation of a next complementary nucleotide analogue is completely blocked by the sterically demanding ligand of the already incorporated nucleotide analog (termination efficiency in homopolymeric regions greater than 99%).
  • the resulting nucleotide-modified beads can be incorporated / coupled by Klenow fragment to a nucleic acid chain.
  • a steric barrier differs from the effect of sterically demanding ligands with a mass of between 20,000 Da and 10,000,000 Da (e.g., proteins and their complexes). Since the bulking of a nanoparticle / nanoparticle may involve hundreds of nanometers, such a bulky ligand may render inaccessible not only immediately adjacent regions of the nucleic acid, but also substantially larger regions of the nucleic acid for the coupling of another similarly sized modified molecule.
  • dCTP-PA-SS- (PEG) 8 -biotin was performed similarly as described for dUTP-AA-PEG-biotin.
  • One equivalent of dCTP-PA-SS- (PEG) 8- biotin was added to 1.5 equivalents of streptavidin (aqueous solution, 5 mg / ml, in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0).
  • streptavidin aqueous solution, 5 mg / ml, in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0.
  • streptavidin aqueous solution, 5 mg / ml, in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
  • dCTP-PA-SS- (PEG) 8 -biotin-SA was modified with Cy3-NHS in borate buffer (50 mmol / l, pH 8.5) so that an average of 3 to 5 Cy3 molecules per one streptavidin-1 Molecule were coupled (Fig. 18).
  • the result is a mixture of several modifications of dCTP-PA-SS- (PEG) 8 -biotin-SA-Cy3. This mixture was not further separated.
  • This nucleotide analog is accepted as a substrate by several polymerases (e.g., Klenow fragment exo minus polymerase, Sequenase 2, Vent exo minus, Taq polymerase, Pwo polymerase).
  • polymerases e.g., Klenow fragment exo minus polymerase, Sequenase 2, Vent exo minus, Taq polymerase, Pwo polymerase.
  • nucleotide analogues eg, -GGG routes, homopolymeric regions in the template
  • incorporation of only one nucleotide analog could be demonstrated (s. Example 15).
  • the sterically demanding macromolecular ligand streptavidin in this example
  • further nucleotide analogues in this case dCTP-PA-SS- (PEG) 8- biotin-SA
  • streptavidin can be coupled to the streptavidin.
  • streptavidin commercially available streptavidin conjugates can be used in the abovementioned synthesis, for example streptavidin-PE (Molecular Probes Inc. Invitrogen), streptavidin-AP, streptavidin-HRP or fluorescent dye conjugates (FIG. 19).
  • dCTP-PA-SS- (PEG) 8- biotin SA-PE was synthesized analogously to dCTP-PA-SS- (PEG) 8- biotin SA:
  • One equivalent of dCTP-PA-SS- (PEG ) 8 - Biotin was added to one equivalent of streptavidin-PE, Molecular Probes, (aqueous solution, lmg / ml, in manufacturer buffer).
  • streptavidin-PE Molecular Probes
  • streptavidin-PE streptavidin-PE
  • streptavidin-PE Molecular Probes
  • streptavidin-PE streptavidin-PE
  • streptavidin-PE Molecular Probes
  • This nucleotide analogue is likewise accepted by many polymerases (see above) and, after incorporation (for example in homopolymeric regions), leads to the inhibition of the incorporation of a further dCTP-PA-SS- (PEG) 8- biotin-SA * PE in the in close proximity to.
  • (Left 43 atoms), (n) is between 1 and 4.
  • a 50 ⁇ M streptavidin solution in 50 mM borate buffer, pH 9 is added 5 equivalents of biotin-PEG-PDTP (PEG-linker 30 atoms; Synthesis see Example 3) was added and incubated for 10 minutes.
  • Streptavidin (biotin-PEG-PDTP) n is separated from low molecular weight components by ultrafiltration on MWCO 30000 by repeated washing with borate buffer.
  • To 200 ⁇ l of 50 ⁇ M streptavidin (biotin-PEG-PDTP) n solution in borate buffer is added with 100 ⁇ l of 10 mM solution of TCEP, pH 8. After 30 minutes, streptavidin (biotin-PEG-R-SH) n is again separated from low molecular weight components by ultrafiltration on MWCO 30000 by washing with borate buffer several times.
  • dGTP-PA is modified with PDTP-NHS, similar to that shown in Example 1, the product is dGTP-PA-PDTP.
  • 50 ⁇ l of a 100 mM solution of dGTP-PA-PDTP in 50 mM borate buffer, pH 9, are added to 200 ⁇ l of 50 ⁇ M streptavidin (biotin-PEG-R-SH) 4 in 50 mM borate buffer.
  • streptavidin biotin-PEG-R-SH
  • the resulting product SA- (dGTP-PA-SS-PEG-biotin) n has a linker of 43 atoms between the nuc-component and the biotin.
  • This modified nuc-macromolecule has a cleavable SS bond in its linker and can be incorporated by Klenow fragment into a nucleic acid chain.
  • nucleotide analogues During enzymatic synthesis (Klenow exo minus polymerase) at complementary template positions, where potentially multiple incorporation of these nucleotide analogues could occur (eg, -CCC stretches in the template), incorporation of only one nucleotide analog could be detected .
  • the sterically demanding macromolecular ligand streptavidin
  • further nucleotide analogues in this case SA- (dGTP-PA-SS-PEG-biotin) n
  • SA- dGTP-PA-SS-PEG-biotin
  • streptavidin To the 'streptavidin additional molecules can be coupled.
  • streptavidin commercially available streptavidin conjugates can be used in the abovementioned synthesis, for example streptavidin-AP, streptavidin-HRP or fluorescent dye conjugates (similar to those in FIG. 18 or 19). These conjugates, coupled to a modified nuc-macromolecule, have a similar behavior to streptavidin itself.
  • dUTP-AA-SS-PEG-biotin (synthesis see Example 5) and similarly synthesized dCTP-PA-SS-PEG-biotin, dATP-PA-SS-PEG-biotin and dGTP-PA-SS-PEG-biotin can be combined with different variants of steric hindrance and markers:
  • N 3-12 and and (X) includes, for example, a dye, e.g. FITC, Cy3, Cy5 Rhodamine (examples of further dyes see catalog of Dyomics GmbH, Jena, Germany or Molecular Probes, Invitrogen), or a protective group, e.g. Fmoc, or an amino group.
  • a dye e.g. FITC, Cy3, Cy5 Rhodamine (examples of further dyes see catalog of Dyomics GmbH, Jena, Germany or Molecular Probes, Invitrogen), or a protective group, e.g. Fmoc, or an amino group.
  • the dyes may be coupled via PEG as well as directly to the streptavidin.
  • SA modifications can be obtained by modification with polymers (such as PEG, various PEG derivatives commercially available, eg Sigma-Aldrich-Fluka, Iris Biotech, their sizes may vary, for example between 500 and 10,000 Da) in their size can be varied, as well as further modifications, eg be coupled by coupling of dyes.
  • polymers such as PEG, various PEG derivatives commercially available, eg Sigma-Aldrich-Fluka, Iris Biotech, their sizes may vary, for example between 500 and 10,000 Da
  • further modifications eg be coupled by coupling of dyes.
  • polymerases eg, Klenow exo minus polymerase, Sequenase, Vent exo minus polymerase, Taq polymerase, Pwo polymerase, reverse transcriptase (M-MLV, (Promega), ImProm II TM (Promega)
  • Klenow exo minus polymerase Sequenase
  • Vent exo minus polymerase Taq polymerase
  • Pwo polymerase reverse transcriptase
  • M-MLV (Promega), ImProm II TM (Promega)
  • the mixture of, for example, dATP-PA-SS-PEG-biotin-SA- (PEG-X) N and SA- (PEG-X) N resulting in the synthesis can be used as a whole in the sequencing reaction.
  • modified nucleotide analogs include a cleavable linker, a macromolecular sterically demanding ligand (modified streptavidin molecule), and a marker wherein the label is selected from a number of low molecular weight dyes (eg, Cy3, FITC, Cy5) or from a macromolecular marker, such as PE (phycoerhytrin), can exist.
  • a marker wherein the label is selected from a number of low molecular weight dyes (eg, Cy3, FITC, Cy5) or from a macromolecular marker, such as PE (phycoerhytrin)
  • Possibility to disclose different dyes to streptavidin or its modifications e.g., PEG-modified streptavidin, SA-PE conjugate
  • modified nuc-macromolecules are examples of reversible terminators with macromolecular sterically demanding ligands and can be used in sequencing methods such as (WO02088382).
  • reversible terminators with termination efficiencies are preferred, including the following ranges: 80-100%, 90-100%. Particularly preferred are reversible terminators with termination efficiencies in ranges of 95-100%, 97-100%, 99-100%.
  • the enzymatic incorporation reactions are carried out under customary conditions for the incorporation reactions of modified nuc-macromolecules.
  • the following conditions can be used: Buffer solutions:
  • DNA polymerases (Klenow fragment, Taq polymerase, Vent polymerase, Vent exo minus polymerase, Deep Vent exo minus polymerase, Pwo polymerase, Sequenase II, reverse transcriptases, AMV, M-MLV, RAV, HIV, ImProm II (TM) reverse transcriptase)
  • Modified nuc macromolecules are used in concentrations preferably between 0.1 ⁇ M to 50 ⁇ M.
  • suitable are microtiter plates, beads (e.g., streptavidin-coated polysterene beads or paramagnetic dextran-based particles, e.g., from Promega), or DNA chips from various manufacturers.
  • the fixation of the nucleic acids on the solid phases takes place depending on the experiment by affinity coupling or covalent. Detection is according to the marker used: e.g. Fluorescence or enzymatic color development.
  • separation media and methods e.g. Gel electrophoresis, gel filtration, ultrafiltration, affinity isolation used.
  • Enzymatic reactions were carried out at RT to 60 ° C. for about 2 to 60 minutes.
  • the cleavage reaction of the disulfide bond is carried out, for example, under the following conditions: 50 mM borate buffer, pH 8.5-9.0, + 50 mM NaCl
  • Example 15 Reversible termination by means of dCTP-PA-SS (PEG) 8- biotin-SA-Cy3 Demonstration of the reversible termination by the example of the synthesis of a homopolymeric region in an artificial sequence. Detection takes place by means of fluorescence measurement of the signals of modified nuc-macromolecules after GeI electrophoresis of extended primers.
  • Buffer 1 50 mmol / l Tris HCl, pH 8.5; 50 mmol / l NaCl, 5 mmol / l MgCl 2 , glycerol 10% v / v
  • Buffer 2 borate buffer 50 mmol / l pH 9.0; 100 mmol / l NaCl, 5 mmol / l MgCl 2
  • Nucleotides and nucleotide analogs dATP (purchased from Roth) and diluted as a solution of 1 mmol / L. dCTP-PA-SS- (PEG) 8 -biotin-SA-Cy3 (hereinafter referred to as dC analog).
  • dC analog an aqueous solution, 100 ⁇ mol / l
  • the mixture was obtained as shown in Example 11 except that the dC-analog was not separated from unconjugated SA-Cy3.
  • Solid Phase Streptavidin Magnesphere Paramagnetic particles (Cat.No. Z5481) Promega. Can be isolated from solution using a magnet (see manufacturer's instructions). The washing of the solid phase was carried out by replacing a solution several times (one-time volume of the solution 200 ⁇ l).
  • solid phase refers to: beads themselves and all elements attached thereto, e.g., nucleic acids, nucleotides, etc.
  • Vent exo minus polymerase (New England Biolabs), is called a polymerase.
  • oligonucleotide 1 biotin (T) 48 oligonucleotide 2: (template)
  • oligonucleotide-3 (primer) 5 ' TAATACG ACTCACTATAG G 3 ' All oligonucleotides were obtained from MWG Biotech, Germany.
  • the primer Extentionsretress is performed at 37 0 C for 15 min in the buffer. 1 Under these conditions, with indicated polymerase and nucleotide concentrations 5, more than 95% of all extendible primer-template complexes are extended in a cycle of 15 minutes.
  • oligonucleotide-1 is bound to the solid phase: a solution with oligonucleotide-1 (7 .mu.l 100 .mu.M in water) is added to the solid phase and stirred for 10 min at RT. Subsequently, solid phase is washed with buffer 1.
  • oligonucleotide-2 (5 .mu.l 100 .mu.M in water) together with a solution with L5 oligonucleotide-3 (5 .mu.l 100 .mu.M in water) was added to the solid phase and incubated at 37.degree. C. for 10 min. Subsequently, the solid phase is washed in buffer 1.
  • a solid phase can be used in enzymatic reactions, including a template (oligonucleotide-2) and a primer (oligonucleotide-3).
  • sample 10 ES is taken from an aliquot of this solid phase (15% of the total solid phase) (Sample 1). To this aliquot, buffer 1 is added to the volume of 90 ⁇ l. Subsequently, a mixture with dC analog (10 .mu.l 100 .mu.mol / l nucleotide portion in buffer 1) was added and incubated at 37 0 C for 15 min. Subsequently, the solid phase is washed with buffer 1 several times. This sample 1 serves as a control of
  • a solution with polymerase (5 .mu.l in the manufacturer buffer) is added to the solid phase and incubated for 5 min at RT. Subsequently, the solid phase is washed with buffer 1. Polymerases remain bound to the nucleic acids. The solid phase is suspended in 100 ⁇ l of buffer 1.
  • nucleotides and nucleotide analogs A solution of dATP (5 ⁇ l 1 mmol / l) and dC analog (10 ⁇ l 100 ⁇ mol / l) in buffer 1 is added to the solid phase. The solid phase is incubated with said components at 37 ° C for 15 min. Subsequently, the solid phase is washed with buffer 1 and an aliquot removed (sample 2). Sample 2 contains primers (N + 2 ) coupled dC analogs. Only a single dC anaiog is incorporated because the markomolecular sterically demanding ligand inhibits further synthesis progression.
  • step 1 is repeated: another 5 ⁇ l Vent exo minus polymerase in the manufacturer buffer are added. After 5 min at RT, the solid phase is washed several times with buffer 1.
  • sample 5 contains the primer (N + 3) with linker residue on the incorporated dC analog, the sterically bulky ligand was cleaved, and the mercapto free group was modified.
  • step 1 is repeated: another 5 ⁇ l Vent exo minus polymerase in the manufacturer buffer are added. After 5 min at RT, the solid phase is washed several times with buffer 1. 8. Addition of nucleotide analogs:
  • Lane 1 ladder (dC analog (upper band) and oligonucleotide-3 labeled with Cy3
  • Lane 2 sample 1 (control of nonspecific binding of dC analog to the solid phase)
  • Lane 3 sample 2 (incorporation of the l.dC analog)
  • Lane 4 cleavage of sterically demanding ligands with markers
  • Lane 5 sample 2 (incorporation of the 2.dC analogue)
  • Such methods involve formation of extension primer-template complexes on a solid phase, the primers of which are extended in cyclic steps, and signals of incorporated modified nuc-macromolecules are detected.
  • the solid phase may be in the form of a planar surface or in the form of nano- or microparticles (e.g., beads).
  • the beads may also be distributed on a flat surface to form a two-dimensional array.
  • Such solid phases are preferably components of kits for sequencing.
  • the individual extresible primer-template complexes are preferably bound to the solid phase in one density, the optical assignment of incorporation events (eg, fluorescence signals from incorporated modified nuc-macromolecules) to individual primer-template complexes allowed (WO02088382, DE 102004025746,).
  • incorporation events eg, fluorescence signals from incorporated modified nuc-macromolecules
  • DE 102004025746 e.g, fluorescence microscopes can serve as a detection pre-treatment (DE 10246005).
  • the solid phase prepared in this way enables calculation of cyclic reactions on the solid phase at the level of single molecules (eg DE 102004025746).
  • each extesible primer-template complex obtains its characteristic position with coordinates (X, Y) on the surface.
  • signals can be assigned to the respective primer-template complexes.
  • Various nucleic acid chains can be used as the material: both preselected DNA sequences (eg isolated PCR fragments, in YAC, PAC or BAC vectors (Anand, R., et al., NAR 1989, v. 17, S.3425, H Shizuya et al PNAS 1992.
  • the aim of the material preparation is to obtain bound single-stranded NSKFs with a length of preferably 50-1000 NTs, a single primer binding site and a hybridized primer (bound NSKF-primer complexes).
  • bound NSKF-primer complexes a hybridized primer
  • very variable constructions can be derived from this general structure. To improve the clarity, some examples now follow, the methods given may be used individually or in combination.
  • the production of the nucleic acid chain fragments can be carried out by several methods, for example by fragmentation of the starting material with ultrasound or by endonucleases or by the action of acids (eg HCL) ("Molecular cloning" 1989 J. Sambrook et al., Col. Spring Harbor Laboratory Press), such as by unspecific Endonukleasegemische.
  • the ultrasonic fragmentation is preferred. You can set the conditions so that fragments with an average length of 100 bp to 1 kb arise. These fragments are then filled in at their ends by the Klenow fragment (E. coli polymerase I) or by the T4 DNA polymerase ("Molecular cloning" 1989 J.
  • complementary short NSKFs can be synthesized from a long NSK using randomized primers. This method is particularly preferred in the analysis of the gene sequences.
  • Single-stranded DNA fragments are formed on the mRNA using randomized primers and a reverse transcriptase (Zhang-J et al., Biochem J. 1999, v.337, p.231, Ledbetter et al., J. Biol. Chem., 1994, v.269 p. 31544, KoIIs et al., Anal.Biochem 1993, p.208 p.264, Decraene et al., Biotechniques 1999 v.27 p.962).
  • the primer binding site is a sequence segment designed to allow selective binding of the primer to the NSKF.
  • the primer binding sites may be different so that multiple different primers must be used.
  • certain sequence segments of the whole queen may serve as natural PBSs for specific primers. This embodiment is particularly suitable for the study of already known SNP sites.
  • the primer binding sites are extra introduced into the NSKFs. In this way, primers with a uniform structure can be used for the reaction.
  • the composition of the primer binding site is not restricted. Their length is preferably between 20 and 50 NTs.
  • the primer binding site may carry a functional group for the immobilization of the NSKF. This functional group may e.g. to be a biotin group.
  • a double-stranded oligonucleotide complex with a primer binding site is used.
  • This is ligated with commercially available ligases to the DNA fragments ("Molecular cloning" 1989 J. Sambrook et al., CoId Spring Harbor Laboratory Press). It is important that only a single primer binding site is ligated to the DNA fragment. This can be achieved, e.g. by modifying one side of the oligonucleotide complex on both strands.
  • the modifying groups on the oligonucleotide complex can serve for immobilization.
  • the synthesis and the modification of such an oligonucleotide complex can be carried out according to standardized instructions. For synthesis, e.g.
  • the DNA Synthesizer 380 A Applied Biosystems can be used. However, oligonucleotides of a particular composition, with or without modifications, are also commercially available as a custom synthesis, e.g. from MWG-Biotech GmbH, Germany.
  • a terminal deoxynucleotidyltransferase can be used to link several (eg, between 10 and 20) nucleoside monophosphates to the 3 'end of an ss DNA fragment ("Molecular cloning" 1989, J. Sambrook et al., CoId Spring Harbor Laboratory Press, "Method in Enzymology” 1999 v.303, pp. 37-38), eg several guanosine monophosphates (called (G) n-tailing).
  • the resulting fragment is used to bind the primer, in this example a (C) n primer.
  • Single-stranded NSKFs are needed for the sequencing reaction. If the starting material is in double-stranded form, there are several ways to generate a single-stranded form from double-stranded DNA (e.g., heat denaturation or alkali denaturation) ("Molecular cloning" 1989, J. Sambrook et al., CoId Spring Harbor Laboratory Press).
  • the composition and the length of the primer are not limited. Apart from the start function, the primer can also perform other functions, such as creating a connection to the reaction surface. Primers should be adapted to the length and composition of the primer binding site be that the primer allows the start of the sequencing reaction with the respective polymerase.
  • the sequence-specific primers for each primer binding site are used.
  • a primer mixture is used for the sequencing.
  • a uniform primer is used in a uniform primer binding site, for example linked by ligation to the NSKFs.
  • the length of the primer is between 6 and 100 NTs, optimally between 15 and 30 NTs.
  • the primer can carry a functional group which serves to immobilize the NSKF, for example, such a functional group is a biotin group (see section Immobilization). It should not disturb the sequencing.
  • the synthesis of such a primer can e.g. with the DNA synthesizer 380 A Applied Biosystems or as a custom synthesis with a commercial supplier, e.g. MWG-Biotech GmbH, Germany).
  • the primer is fixed in one embodiment on the surface as described in this application.
  • the primer or primer mix is incubated with NSKFs under hybridization conditions that selectively bind it to the primer binding site of the NSKF.
  • This primer annealing can occur before (1), during (2) or after (3) the binding of the NSKFs to the surface.
  • the optimization of the hybridization conditions depends on the exact structure of the primer binding site and the primer and can be according to Rychlik et al. Calculate NAR 1990 v.18 p.6409. Hereinafter, these hybridization conditions are referred to as standardized hybridization conditions.
  • primer binding site may carry at its 3 'end a functional group which serves, for example, for immobilization.
  • this group is a biotin group.
  • the primer has a structure complementary to the primer binding site. Fixation of NSKF primer complexes to the surface (binding or immobilization of NSKFs). The aim of fixation (immobilization) is to fix NSKF primer complexes on a suitable planar surface in such a way that a cyclic enzymatic sequencing reaction can proceed. This can be done, for example, by binding the primer (see above) or the NSKF to the surface.
  • the sequence of steps in the fixation of NSKF primer complexes may be variable: l)
  • the NSKF primer complexes may be first in solution by hybridization
  • NSKFs (Annealing) are formed and then bonded to the surface. 2)
  • Primers can first be bound to a surface and NSKFs subsequently hybridized to the bound primers to form NSKF primer complexes (NSKFs indirectly bound to the surface).
  • the NSKFs can first be bound to the surface (NSKFs directly to the surface is bound) and in the subsequent step the primers are hybridized to the bound NSKFs resulting in NSKF primer complexes.
  • the immobilization of the NSKFs to the surface can therefore take place by direct or indirect binding.
  • fixation of the NSKF primer complexes on the surface via the NSKFs this can be done for example by the binding of the NSKFs at one of the two ends of the chain. This can be achieved by appropriate covalent, affine or other bonds. Examples of fixation of nucleic acid chains are known (McGaII et al., US Pat.
  • a cyclic reaction is started.
  • the modified nuc-macromolecules are used.
  • the reaction proceeds in several cycles: Incubation of at least one type of modified nuc-macromolecule of aspects 1 to 25 together with a type of polymerase of aspect 31 with the NSK-primer complexes provided in steps a and b under conditions involving the incorporation of complementary modified nuc-macromolecules each type of modified nuc-macromolecule being characteristic of them
  • steps can be repeated several times, so that from the sequence of detected signals from incorporated nucleotide analogs, the complementary sequence of the template can be reconstructed.
  • the repetition can be carried out, for example, 1 to 2, 2 to 5, 5 to 10, 10 to 20, 20 to 30, 30 to 50, 50 to 100, 100 to 2000 times.
  • the incubation times in one cycle are selected such that the polymerases can incorporate into more than 50% of the NSKFs (extensible NSKF primer complexes that can participate in the sequencing reaction) in one cycle a labeled modified nuc macromolecule, preferably more than 90%.
  • the colored coding scheme for modified nuc-macromolecules can be different:
  • One cycle can be carried out with:
  • a label with two dyes can be selected.
  • 2 pairs of modified IMuk macromolecules are formed, each of which is labeled differently, eg A and G carry the label "X", C and U carry the label "Y".
  • 2 differently labeled nucleotide analogues are used simultaneously, eg C * in combination with A * , and in the next cycle (n + 1) then U * and G * are added.
  • Cycles employing modified nuc-macromolecules may alternate with cycles employing unmodified nucleotides.
  • first 5 to 500 cyclic steps are carried out with modified nuc-macromolecules, followed by 1 to 500 cyclic steps with unmodified nucleotides (eg with naturally occurring nucleotides, dATP, dGTP, dTTP, dCTP or their analogues, such as dUTP, dITP or with other nucleotide analogs that do not carry a macromolecular sterically demanding ligand), then 10 to 500 steps with modified nuc-macromolecules, etc.
  • unmodified nucleotides eg with naturally occurring nucleotides, dATP, dGTP, dTTP, dCTP or their analogues, such as dUTP, dITP or with other nucleotide analogs that do not carry a macromolecular sterically demanding ligand
  • the order of the number of nucleotides added and the number of cycles may vary.
  • the possible combinations for the use of modified nuc-macromolecules and the cycle numbers have already been discussed above (see Colored Coding Scheme).
  • the unmodified nucleotides may also be added individually, in tandem or in combination with a corresponding polymerase under conditions that allow extension of primer-template complexes. By limited Substrazzussel a gradual running primer extension is possible.
  • the number of alternating cycles between modified and unmodified nucleotides ranges from 2 to 500.
  • the number of cyclic steps employing reversibly terminating 2.0 nucleotide analogues with a macromolecular steric barrier includes the range between 2 and 10,000.
  • such a method includes the following characteristics: The incorporation reaction of NT macromolecules takes place simultaneously on a population
  • nucleic acid molecules are bound in a random arrangement to the solid phase (Tcherkassov WO 02088382).
  • sequences of individual nucleic acid chain molecules are determined.
  • the primer-nucleic acid complexes participating in the enzymatic reaction are fixed in a density which is the density of the
  • the density of the primer-nucleic acid complexes participating in the incorporation reaction is from 1 to 10 complexes to 10 ⁇ m 2 , from 1 to 10 complexes to 100 ⁇ m 2 , from 1 to 10 complexes
  • the number of individual nucleic acid molecules to be analyzed in parallel is, for example, between 1000 and 100,000, 10,000 to 1,000,000, 100,000 to
  • NSKs nucleic acid chains
  • NSKFs Generates fragments (NSKFs) of single-stranded NSKs with a length of about 50 to 1000 nucleotides, which can represent overlapping partial sequences of an overall sequence;
  • the NSKFs bind in a random array using one or more different primers in the form of NSKF primer complexes on a reaction surface, the density of the surface-built NSKF-primer complexes modifying an optical detection of the signals from single incorporated ones Nuc-macromolecules allowed, one
  • Component located fluorescent dyes are selected so that the modified nuc-macromolecules used can be distinguished by measuring different fluorescence signals from each other, wherein the modified nuc-macromolecules include a macromolecular sterisch demanding ligand, wherein the linker component with the
  • step b) the stationary phase obtained in step a) is incubated under conditions suitable for extending the complementary strands, the complementary strands being each extended by a modified nuc-macromolecule;
  • step b) washing the stationary phase obtained in step b) under conditions which are suitable for removing modified nuc-macromolecules not incorporated in a complementary strand;
  • the individual nucleated macromolecules incorporated in complementary strands are detected by measuring the signal characteristic of the respective fluorescent dye, at the same time determining the relative position of the individual fluorescence signals on the reaction surface
  • step f) washing the stationary phase obtained in step e) under conditions suitable for removing the marker component;
  • steps a) to f) are repeated several times, whereby the relative position of individual NSKF primer complexes on the reaction surface and the sequence of these NSKFs are determined by specific assignment of the fluorescence signals detected in step d) in successive cycles at the respective positions to the modified nuc macromolecules.
  • the surface and the reaction surface are to be understood here as equivalent terms, unless explicitly stated otherwise.
  • the reaction surface is the surface of a solid phase of any material. This material is preferably inert to enzymatic reactions and does not cause interference with detection. Silicone, glass, ceramic, plastic (e.g., polycarbonates or polystyrenes),
  • Metal gold, silver, or aluminum
  • any other material that meets these functional requirements may be used.
  • the metal gold, silver, or aluminum
  • the various cycle steps require an exchange of the different reaction solutions above the surface.
  • the reaction surface is preferably part of a reaction vessel.
  • the reaction vessel is again preferably part of a reaction apparatus with a flow device.
  • the flow device allows an exchange of the solutions in the reaction vessel.
  • the replacement can be done with a computer-controlled pumping device or manually. It is important that the surface does not dry out.
  • the volume of the reaction vessel is preferably less than 50 ⁇ l. Ideally, its volume is less than 5 ⁇ l.
  • fixation of the NSKF primer complexes on the surface via the NSKFs this can be done for example by the binding of the NSKFs at one of the two ends of the chain. This can be achieved by appropriate covalent, affine or other bonds (DE 102004025745).
  • immobilization of nucleic acids are known (McGaII et al., U.S. Patent 5,421,887, Nikiforov et al., U.S. Patent 5,610,287, Barrett et al., U.S. Patent 5,482,867, Mirzabekov et al., U.S.
  • Patent 5,981,834 Microarray biochip technology, 2000M Schenna Eaton Publishing, "DNA Microarrays” 1999 M. Schena Oxford University Press, Rasmussen et al., Analytical Biochemistry, v.198, p.138, Allemand et al., Biophysical Journal 1997, v.73, p.2064, Trabesinger et al Analytical Chemistry 1999, v.71, p.279, Osborne et al., Analytical Chemistry 2000, v.72, p.3678, Timofeev et al., Nucleic Acid Research (NAR) 1996, v.24 p.3142, Ghosh et NAR 1987 v.15 p.5353, Gingeras et al NAR 1987 v.15 p.5373, Maskos et al NAR 1992 v.20 p.1679).
  • the fixation can also be achieved by a nonspecific binding, such as by dehydration
  • the NACFs be bound to the surface, for example, at a density between 10 and 100 microns 5 NACFs per 100 2, 100 to 10,000 per 100 micron 2, 10,000 to 1,000,000 per lOO ⁇ m. 2
  • the density of advanced NSKF primer complexes necessary for detection in one embodiment is about 1 to 100 per 100 ⁇ m 2 . It can be achieved before, during, or after hybridization of the primers to the NSKFs.
  • immobilization of the NSKFs takes place via biotin-avidin or biotin-streptavidin binding. It is avidin or
  • the 5 'end of the primer contains biotin.
  • the concentration of the biotin-labeled hybridization products and the time of incubation of this solution with the surface are chosen so that a suitable for sequencing density already in
  • the primers suitable for the sequencing reaction are fixed on the surface by suitable methods before the sequencing reaction (see above).
  • the single-stranded NSKFs each with a primer binding site are fixed on the surface by suitable methods before the sequencing reaction (see above).
  • NSKF 15 per NSKF are thus incubated under hybridization conditions (annealing). They bind to the fixed primers and are thereby bound (indirect binding), resulting in primer-NSKF complexes.
  • concentration of the single-stranded NSKFs and the hybridization conditions are selected such that a suitable immobilization density of 1 to 100 NSKF primers capable of sequencing is obtained.
  • a surface having a high primer density is preferred, eg, about 1,000,000 primers per 100 ⁇ m 2 or higher because the desired density of NSKF primer complexes is achieved more rapidly, with the NSKFs binding to only a portion of the primers ,
  • the NSKFs are directly bound to the surface (see above) and subsequently incubated with primers under hybridization conditions.
  • a density of about 1 to 100 NSKFs per 100 ⁇ m 2 you will try all available NSKFs with a primer and make available for the Sequenzierugnsretress. This can be achieved, for example, by high primer concentration, for example 1 to 100 mmol / l.
  • high primer concentration for example 1 to 100 mmol / l.
  • the density of NSKF primer complexes necessary for optical detection can be achieved during primer hybridization.
  • the hybridization conditions eg temperature, time, buffer, primer concentration
  • this gel may be e.g. an agarose or polyacrylamide gel (DE 101 49 786).
  • This solid support may be silicone, glass, ceramic, plastic (e.g., polycarbonates or polystyrenes), metal (gold, silver, or aluminum), or any other material.
  • This solid support may be silicone, glass, ceramic, plastic (e.g., polycarbonates or polystyrenes), metal (gold, silver, or aluminum), or any other material.
  • the reaction surface may be prepared as a continuous surface or as a discontinuous surface composed of discrete minor components (eg, primer-template complexes may be bound to agarose beads or dextran beads).
  • the density of the beads on the surface is, for example, in the following ranges between 1 and 10 per 100 ⁇ m 2 , 10 and 100 per 100 ⁇ m 2 , 100 to 10,000 per 100 ⁇ m 2 , 10,000 to 1,000,000 per 100 ⁇ m 2 .
  • the reaction surface must be large enough to be able to immobilize the necessary number of NSKFs with appropriate density.
  • the reaction surface should preferably be no larger than 20 cm 2 .
  • a solid phase e.g., silicone or glass
  • it may be prepared according to, for example, DE 102004025745.
  • the detection can be carried out as described in WO02088382 or DE10246005.
  • the analysis of nucleic acids can include different questions: (Using the example of sequence analysis with four identically labeled modified nuc-macromolecules)
  • the sequencing of a long IMb DNA piece will schematically illustrate the sequencing of long nucleic acid chains.
  • the sequencing is based on the shotgun principle ("Automated DNA sequencing and analysis", page 231 et seq., 1994, M. Adams et al., Academic Press, Huang et al., Genome Res., 1999, v.9, p.688, Huang Genomics, 1996, p .33 p.21, Bonfield et al NAR 1995 v.23 p.4992, Miller et al., J. Comput. Biol. 1994, v. P.257).
  • the material to be analyzed is prepared for the sequencing reaction by breaking it down into fragments of preferably 50 to 1000 bp in length.
  • Each fragment is then provided with a primer binding site and a primer.
  • This mixture of different DNA fragments is now fixed on a flat surface.
  • the unbound DNA fragments are removed by a washing step. Thereafter, the sequencing reaction is carried out on the entire reaction surface. To reconstruct a 1 Mb DNA sequence, the sequences of
  • NSKFs are on average about 100 NTs long.
  • the detected NSKF sequences represent a population of overlapping
  • NSKFs are generated.
  • One can e.g. Convert mRNA into a double-stranded cDNA and fragment this cDNA with ultrasound.
  • these NSKFs are provided with a primer binding site, denatured, immobilized and hybridized with a primer.
  • the cDNA molecules can represent incomplete mRNA sequences (Method in Enzymology 1999, v.303, p.19 and other articles in this volume, "cDNA library protocols" 1997 Humana Press).
  • NSKFs single-stranded NSKFs of mRNA
  • Another possibility in the generation of single-stranded NSKFs of mRNA is the reverse transcription of the mRNA with randomized primers.
  • Many relatively short antisense DNA fragments are formed (Zhang-J et al., Biochem., 1999, v.337, p.231, Ledbetter, et al., J. Biol. Chem., 1994, v.269, S.31544, Koels et al Anal.Biochem 1993, p.208 p.264, Decraene et al Biotechniques 1999 v.27 p.962).
  • These fragments can then be provided with a primer binding site (see above). Further steps correspond to the procedures described above.
  • the number of NSKFs that need to be analyzed is calculated using the same principles as a shotgun reconstruction of a long sequence.
  • This method allows the simultaneous sequencing of many mRNAs without prior cloning.
  • Such a program may e.g. BLAST or FASTA algorithm ("Introduction to Computational Biology” 1995 M. S. Waterman Chapman & Hall).
  • NSKFs The sequence to be analyzed is converted to NSKFs using one of the above methods. These NSKFs are sequenced using the method according to the invention, whereby both a single primer and a single primer binding site as well as different, sequence-specific primers and natural occurring in the overall sequence under investigation
  • Sequences of NSKFs are not collated by the shotgun method, but compared to the reference sequence and thus assigned to their positions in the full sequence. These may be genomic or cDNA sequences.
  • the analysis of a sequence variant requires considerably less raw sequence data.
  • the 5- to 10-fold raw sequence set may be sufficient for the restoration of a new variant of a full sequence.
  • the length of the determined NSKF sequences should be sufficient for unambiguous assignment to a specific position in the reference sequence, for example sequences already with a length of 20 NTs (for example from non-repetitive sections in the human genome) can already be uniquely identified. For the comparative analysis of the repetitive sections, longer sequences are needed. The exact length of the
  • the length of the detected NSKF sequences in the analysis of non-repetitive sections is more than 20 NTs.
  • the length of the detected NSKF sequences in the analysis of non-repetitive sections is more than 20 NTs.
  • the repetitive sections it is preferably more than 500 NTs.
  • the determined total sequence length can consist of sections in which each nucleotide has been sequenced and sections, where unlabeled nucleotides were added in known combinations, so that a calculated primer extension has taken place.
  • the objectives in the sequencing of new variants of an already known full sequence can be very different. In most cases a comparison of the newly determined sequence with the known full sequence / reference sequence is sought.
  • the two sequences can originate from evolutionarily different species. Various parameters of the composition of these two sequences can be compared. Examples of such analysis are: mutational or polymorphism analyzes and the analysis of alternatively spliced gene products.
  • a long sequence to be analyzed e.g. 1 Mb, is shared in NSKFs using one of the above methods. These NSKFs are sequenced using standard primers with the method of the invention. The determined
  • Sequences from each individual NSKF are compared directly with the reference sequence.
  • the reference sequence serves as the basis for the assignment of determined NSKF sequences, so that the complex reconstruction according to the shotgun method is omitted.
  • the length of the detected NSKF sequences in the analysis of non-repetitive sections is more than 20 NTs.
  • the repetitive sections it is preferably more than 500 NTs.
  • the number of NSKFs to be analyzed depends on the total length of the sequence to be investigated, the average length of the NSKF sequences and the necessary accuracy of the sequencing. At an average length of the determined NSKF sequence of 100 NTs, a total length of the examined
  • NSKF sequences are assigned to the full sequence using a commercially available program and possible deviations detected.
  • a program may e.g. BLAST or FASTA algorithm ("Introduction to Computational Biology” 1995, M.S. Waterman Chapman & Hall).
  • composition of kit for sequencing of nucleic acids Composition of kit for sequencing of nucleic acids.
  • kits include components (e.g., individual substances,
  • composition of the kits may vary upon application, with applications ranging from simple primer extension reaction to cyclic sequencing ranging at single molecule level.
  • kits used for cyclic sequencing may include polymerases, modified nuc-macromolecules, as well as solutions to the cyclic steps.
  • kits may optionally include positive and / or negative controls,
  • kits may include materials and reagents for preparing components of the biochemical reaction kit or genetic material, e.g. solid phase for material preparation, solid phase for polymerase application,
  • kit components are usually provided in commercially available reaction vessels, wherein the volume of the vessels can vary between 0.2 ml and 1 l.
  • Vascular arrays e.g. Microtiter plates loaded with components, allowing automatic supply of reagents.
  • a kit may include the following components: • One or more polymerases from the list below: Klenow fragment polymerase,
  • Klenow exo minus fragment T7 DNA polymerase, Sequenase 2 TM, Taq polymerase, Vent TM polymerase, Deep Vent TM polymerase, Vent TM exo minus DNA polymerase, Deep Vent TM exo minus DNA polymerase, Pwo DNA polymerase, reverse Transcriptases such as Moloney Murine Lekemia Virus (M-MLV), Rous Sarcoma Virus (RSV), Avian Myeloblastosis Virus (AMV), Rous Associated Virus (RAV), Myeloblastosis Associated Virus (MAV), Human Immunodeficiency Virus (HIV).
  • M-MLV Moloney Murine Lekemia Virus
  • RSV Rous Sarcoma Virus
  • AMV Avian Myeloblastosis Virus
  • RAV Rous Associated Virus
  • MAV Human Immunodeficiency Virus
  • HAV Human Immunodeficiency Virus
  • the polymerases are preferably provided in
  • This storage solution may include, for example, the following substances: Buffer Tris-HCl, HEPES, borate, phosphate, acetate (concentration is for example between 10 mM and 200 mM) o salts, eg NaCl, KCl, NH 4 Cl for example, the concentrations are between 10 mM and 500 mM. o PEG or other inert polymer, eg Mowiol in concentration from 1 to
  • modified nuc-macromolecules nucleotide analogues
  • the modified nuc-macromolecules may be provided in dry form or in the form of a solution, e.g. in water or in a buffer, e.g.
  • Washing steps Cleavage reagents provided, for example, as a concentrated buffered solution.
  • DTT or TCEP in embodiments in which the linker includes a cleavable disulfide bridge.
  • modified nuc-macromolecules include one or more biotin molecules.
  • biotin molecules e.g. Signaling streptavidin conjugates (see section Signaling
  • modified nuc-macromolecules include streptavidin, which still has free valencies for the binding of biotin.
  • biotin-bearing structures (see section Signaling Marker Units) to the modified nuc-macromolecule may also be bound prior to the detection step.
  • Blocking reagents to suppress the non-specific adsorption of modified nuc-macromolecules to the surfaces of the solid phase, optionally various substances, e.g. acetylated BSA or PEG 2000 to PEG 10,000 or Mowiol or similar polymers (behave neutral to the enzymatic reaction) may be included in the kit.
  • various substances e.g. acetylated BSA or PEG 2000 to PEG 10,000 or Mowiol or similar polymers (behave neutral to the enzymatic reaction) may be included in the kit.
  • the nucleotide analogs containing macromolecular sterically demanding ligands can be purified from the storage buffer by ultrafiltration before use.
  • ultrafiltration preparations with MWCO of 50,000 Da are suitable for this (available, for example, from Millipore or Sigma-Aldrich).
  • MWCO 50,000 Da
  • the modified nuc-macromolecules dissolved in the freshly prepared mounting buffer.
  • polymerases can be freed from the manufacturer's solution.
  • purification of the polymerases may be by absorption to the paramagnetic particles loaded with nucleic acids (e.g., oligonucleotides bound to streptavidin-loaded paramagnetic beads, Promega). After binding of polymerases to the nucleic acids, the solid phase with nucleic acids (e.g., oligonucleotides bound to streptavidin-loaded paramagnetic beads, Promega). After binding of polymerases to the nucleic acids, the solid phase with nucleic acids.
  • nucleic acids e.g., oligonucleotides bound to streptavidin-loaded paramagnetic beads, Promega.
  • the application of the polymerases in the reaction can either be done directly with the solid phase or the polymerases can be released from the solid phase at higher salt concentration.
  • binding to the nucleic acids binding to an anion exchanger, e.g. DEAE cellulose (batch isolation method for rebuffering of
  • Nucleotides without macromolecular steric hindrance e.g., dATP, dGTP, dCTP, 2.O dTTP, dUTP, dITP
  • irreversible terminators e.g., ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP, ddUTP
  • the invention furthermore relates to a kit for carrying out the method of sequencing nucleic acid chains which has a reaction surface to which
  • Polymerases and modified nuc-macromolecules, of which one to four are labeled with fluorescent dyes, wherein the modified nuc-macromolecules are further structurally modified such that the polymerase does not integrate into such a growing nucleated macromolecule in a growing complementary strand
  • nucleotides are preferably the abovementioned modified nuc-macromolecules according to the invention.
  • the kit further comprises reagents required for the generation of single strands from double strands, single-stranded nucleic acid molecules which are introduced into the NSKFs as PBS, Oligonucleotide primers, reagents and / or washing solutions required for cleaving the fluorescent dyes and sterically demanding ligands.
  • DNA-binding region (1) of the polymerase binding of primer and template
  • the incorporated nucleotide carries no modification. Free nucleotides have unrestricted access to the nucleotide binding region of the polymerase 15 Fig. 9
  • nuc-macromolecules • free modified nuc-macromolecules (8) (schematic representation of the 10 nucleotide component, the linker and the sterically demanding ligand).
  • the incorporated modified nuc macromolecule carries a macromolecular sterically demanding ligand. Free modified nuc-macromolecules do not have free access to the nucleotide-binding center of the polymerase. The sterically demanding ligand does not leave any other ligand near this> 5 center of the polymerase. With a correspondingly chosen linker length between the nucleotide unit and the steric ligand, no further modified nuc-macromolecule can be incorporated. The linker is shown schematically in the extended state in full length. Fig. 10
  • the sterically demanding ligand of the modified nuc-macromolecule claims a space in the immediate vicinity of the polymerase.
  • the lines (9) show schematically the claimed space.
  • FIG. 11 Schematic representation of the primer-template complex with a built-in
  • Lane 1 ladder (dC analog (upper band) and oligonucleotide-3 labeled with Cy3
  • Lane 3 sample 2 (incorporation of the 1 dC analogue)
  • Lane 4 cleavage of sterically demanding ligands with markers
  • Lane 5 Sample 2 (incorporation of the 2.dC analog)
  • Lane 6 Cleavage of bulky ligands with labels
  • Lane 7 sample 2 (incorporation of the 3.dC analogue)

Landscapes

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Abstract

Die Anmeldung betrifft Nukleotid-Analoga, die einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden und einen Marker enthalten. Die Nukleotid-Analoga der Erfindung können zur enzymatischen Synthese und Sequenzierung von Nukleinsäuren verwendet werden.

Description

Komponenten und Verfahren zur enzymatischen Synthese von Nukleinsäuren
Beschreibung
1.1 Einordnung in das technologische Feld
Enzymatische Synthese von Nukleinsäuren hat einen wichtigen Platz in der modernen Industrie eingenommen. Für die Zukunft werden noch weitere Einsatzfelder antizipiert, z.B. in der Nanobiotechnologie.
Neben seit langem eingesetzten Verfahren zu einfacher Vervielfältigung der Nukleinsäureketten, wie PCR, werden zur Zeit Verfahren und Produkte entwickelt, die eine stufenweise erfolgende enzymatische Synthesereaktion als Grundlage haben, s. beispielsweise (www.genovoxx.com; www.illumina.com; www.helicosbio.com). Einsatz der Nukleinsäuren als Matrizen für die Synthese von nanobiologischen Komplexen mit multiplen Funktionen verspricht Fortschritte in Bereichen wie Nanomedizin und ultrastarke Speichersysteme. Die Fähigkeit, die enzymatische Synthese von Nukleinsäuren effektiv zu steuern, bildet eine Voraussetzung für die Qualität solcher Prozesse. Daher besteht nachhaltiger Bedarf für Mittel und Verfahren, die eine solche Steuerung ermöglichen.
In den letzten 20-30 Jahren wurde eine Fülle von chemischen Schutzgruppen für Nukleotide und deren Analoga entwickelt, die eine stufenweise erfolgende, gesteuerte chemische Synthese erlauben. Die darauf basierenden Verfahren beispielsweise für Oligonukleotidsynthesen sind seit langem bekannt. Im Gegensatz dazu, können Verfahren, die enzymatische Synthese als Grundlage haben, kaum von solchen Schutzgruppen profitieren. Die Aktualität dieses Themas wird durch die starke Förderung der Entwicklungen auf diesem Gebiet im Jahr 2004 und 2005 durch NIH (The National Institute of Health) hingewiesen. Dabei werden Vorhaben unterstützt, die weitere Entwicklung von modifizierten Bausteinen für enzymatische Nukleinsäuresynthesen anstreben.
1.2 Aufgabe der Erfindung
• Bereitstellung von Reagenzien, Kits und Verfahren zur Steuerung des Fortschretens der enzymatischen Synthese-Reaktion von Nukleinsäureketten.
• Bereitstellung von Reagenzien, Kits und Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten. Die neuen Verfahren sind dadurch charakterisiert, dass makromolekulare sterisch anspruchsvolle Liganden an der Steuerung der enzymatischen Reaktion beteiligt sind. Die sterisch anspruchsvollen Liganden sind an die eingebauten modifizierten Nukleotide gekoppelt, wobei die Masse dieser Liganden größer als 2 kDa ist.
Detaillierte Beschreibung:
1.3 Begriffe / Definitionen:
1.3.1. Makromolekulare Verbindung - ein Molekül, oder ein Molekülkomplex, oder ein Nanokristall oder ein Nanoteilchen, dessen Masse zwischen 2kDa und 100 GDa liegt, insbesondere in Bereichen von 2kDa und 2OkDa, 2kDa und 5OkDa, 2kDa und 10OkDa, 10OkDa und 20OkDa, 20OkDa und 100OkDa oder IMDa und 100MDa oder 100 MDa und 100GDa liegt. Beispiele für makromolekulare Verbindungen sind Nukleinsäuren, wie Oligonukleotide mit einer Länge von mehr als 10 Nukleotiden, Polynukleotide, Polypeptide, Proteine oder Enzyme, Quantum Dots, Polymere wie PEG, Mowiol, Dextran, Polyacrylat, Nanoteilchen mit einem Durchmesser im Bereich von 10 bis 100 nm, 20 bis 200 nm, 30 bis 300 nm, 40 bis 400 nm, 50 bis 500 nm (z.B. Nanogold-Partikel, Polystyrene teilchen, paramagnetischen Teilchen auf Dextran-Basis), Mikroteilchen mit einem Durchmesser im Bereich von 0,5 bis 1 μm, 1 bis 5 μm, aber auch Komplexe, die aus mehreren Makromolekülen bestehen.
1.3.2. Niedermolekulare Verbindung - ein Molekül oder ein Molekülkomplex, dessen Masse kleiner 2000 Da (2kDa) beträgt, z.B. Biotin, natürliche Nukleotide, dATP, dUTP, viele Farbstoffe, wie Cy3, Rhodamine, Fluorescein und konventionell modifizierte Nukleotide, wie Biotin-16-dUTP. 1.3.3 Ein Nuk-Makromolekül und ein modifiziertes Nuk-Makromolekül
Ein Nuk-Makromolekül (siehe WO2005044836 und WO2006097320, der Inhalt dieser Anmeldungen ist eingeschlossen als Referenz (incorporated by reference im Sinne USPTO für die USA)) schließt zumindest eine Nuk-Komponente, zumindest eine Linker- Komponente, zumindest eine Marker-Komponente ein.
In dieser vorliegenden Erfindung werden modifizierte Nuk-Makromoleküle beschrieben. Ein modifiziertes Nuk-Makromolekül ist ein Nukleotid-Analog. Es schließt zumindest eine Nukleotid-Komponente (Nuk-Komponente), zumindest eine Linker-Komponente, zumindest eine Marker-Komponente und zumindest einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden ein (im weiteren Verlauf der Beschreibung werden sie als "modifizierte Nuk-Makromoleküle" genannt; einige Beispiele sind in Fig. 1 und 2 schematisch abgebildet):
A) (Nuk-Linker l)n-(Ligand)k-(Marker)m oder
B) (Nuk-Linker l)n-(Ligand-Linker 3)k -(Marker)m oder
C) (Nuk-Linker l)n-(Ligand)k -(Linker 3-Marker)m oder
D) (Nuk-Linker l)n-(Marker)m-(Ligand)k oder
E) (Nuk-Linker l-Ligand)n-(Marker)m oder F) (Ligand-Linker 2-Nuk-Linker l)n-(Marker)m oder G) (Nuk-Linker l)n-(Marker/Ligand)m
wobei: Nuk - eine Nuk-Komponente ist
Linker - eine Linker-Komponente ist, wobei Linker 1 oder Linker 2 oder Linker 3 gleiche oder auch unterschiedliche Struktur haben können
Marker - eine Makrer-Komponente ist
Ligand - ein makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand ist Marker/Ligand - eine Struktur, die sowohl Marker-Eigenschaften als auch Eigenschaften eines makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden hat
(n) - eine Zahl von 1 bis 100000 ist. (m) - eine Zahl von 1 bis 1000
(k) - eine Zahl von 1 bis 1000
Wobei in einer Ausführungsform der Struktur die Verhältnisse im Molekül folgendermassen verteilt sind: (n)> = (m)> = (k), wobei die einzelnen Zahlen unabhängig von einander variiert werden können. In einer weiteren Ausführungsform der Struktur die Verhältnisse im Molekül folgendermassen verteilt sind: (n)>(m)>(k), wobei die einzelnen Zahlen unabhängig von einander variiert werden können. Weitere Kombinationen der Komponenten der Nuk-Makromoleküle sind für einen Fachmann nahe liegend.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist Linker wasserlöslich. Seine Zusammensetzung ist nicht eingeschränkt, solange er die Einbaureaktion nicht komplett inhibiert. Seine Länge liegt zwischen 5 und 100.000 Kettenatome.
In einer weiteren Ausführungsform besteht die Linker-Komponente aus einer Kopplungseinheit L für die Kopplung des Linkers an die Nuk-Komponente, aus einem wasserlöslichen Polymer und aus einer Kopplungseinheit T für die Kopplung des Linkers an die Marker-Komponente. In dieser bevorzugten Ausführungsform hat ein modifiziertes Nuk-Makromolekül folgende Struktur:
(Nuk-L- Polymer-T)n-Ligand-Marker oder
(Nuk-L- Polymer-T)n- Marker-Ligand
wobei :
Nuk - ein Nukleotid- oder ein Nukleosid-Monomer ist (Nuk-Komponente)
L - ein Teil des Linkers ist, das die Verbindung zwischen Nuk und dem
Linkerrest darstellt (Kopplungseinheit L)
T - ein Teil des Linkers ist, das die Verbindung zwischen dem Linkerrest und dem Marker darstellt (Kopplungseinheit T)
Polymer - ein Teil des Linkers ist, das ein wasserlösliches Polymer mit einer durchschnittlichen Länge zwischen 5 und 100.000 Atome ist (Kopplungseinheit L, Polymerlinker, Kopplungseinheit T sind bei dieser Ausführungsform als Linker-Komponente zusammengefaßt) Marker - eine Marker-Komponente
Ligand - ein makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand ist n - eine Zahl von 1 bis 1000000, wobei (n) einen durchschnittlichen Wert darstellen kann.
1.3.3.1 Nukleotid-Komponente oder Nuk-Komponente Die Nuk-Komponente ist ein modifiziertes Nukleotid, ist ein Bestandteil eines modifizierten Nuk-Makromoleküls und hat Substrateigenschaften für Polymerasen.
Die Nuk-Komponente schließt vorzugsweise eine Base-Komponente (Base), eine Zucker- Komponente (Zucker) und eine Phosphat-Komponente (Phosphat) ein. Base, Zucker und Phosphat können modifiziert sein, d.h. die Grundstruktur sieht den natürlichen Nukleotiden oder Nukleosiden ähnlich, trägt aber beispielsweise zusätzliche chemische Gruppen. Beispiele für Kombinationen aus verschiedenen Komponenten sind dem Fachmann bekannt. Solche Nuk-Komponenten können in vielen enzymatischen und chemischen Reaktionen eingesetzt werden (G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-).
In einer Ausführungsform ist Nuk-Komponente ein Nukleotid-Monomer, das mit der Linker-Komponente gekoppelt ist. Prinzipiell können alle als Substrat für Nukleotid- akzeptierende Enzyme geeigneten konventionellen Nukleotid-Varianten als Nuk- Komponente des modifizierten Nuk-Makromoleküls dienen, so dass sowohl natürliche als auch modifizierte Nukleotide (Nukleotid-Analoga) für die Nuk- Komponente in Frage kommen. Bei modifizierten Nukleotiden können Base-, Zucker- oder Phosphat-Teile modifiziert sein, Fig. 3. Viele Beispiele für Nukleotid-Modifikationen sind dem Fachmann bekannt ("Advanced organic chemistry of nucleic acids", 1994, Shabarova, ISBN 3-527- 29021-4, "Nucleotide Analogs" Scheit, 1980, ISBN 0-471-04854-2, "Nucleoside and Nucleic Acid Chemistry", Kisakürek 2000, "Anti-HIV Nucleosides" Mitsuya, 1997, "Nucleoside Analogs in Cancer therapy", Cheson, 1997) im Text werden auch weitere Beispiele für die Modifikationen der Nukleotide angegeben.
1.3.3.1.1 Variationen am Phosphat
In einer Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid-Triphosphat dar. Auch höhere Phosphat-Derivate (Tetraphosphat usw.) können verwendet werden. Wahlweise kann die Phosphat-Komponente Modifikationen einschließen, solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen Linker ein (D. Jameson et al. Methods in Enzymology 1997, V. 278, S. 363-, A. Draganescu et al. J. Biol.Chem. 2000 v.275, 4555-). In einer werteren Ausführungsform schließt die Phosphat-Komponente der Nuk-Komponente Thiotriphosphat-Verbindungen ein (Burges et al. PNAS 1978 v. 75, S. 4798-). Die genannten Phosphatmodifikationen können wie bei Nukleosid-Triphosphaten an der 5 " -Position oder auch an anderen Positionen des Zucker-Teils des Nukleotides sitzen, beispielsweise an der 3 ' -Position.
5 1.3.3.1.2 Variationen an der Base
Die Nuk-Komponente kann ein in der Natur in den Nukleinsäuren vorkommendes Nukleotid oder Nukleosid oder seine Analoga darstellen, vorzugsweise die an Watson- Crick-Paarbildung teilnehnem, beispielsweise Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin, Uracil, Inosin, oder eine modifizierte Base, wie z.B. 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin, 6-Thio-
LO adenin, einschließen, Literatur s. oben. Wahlweise kann die Base Modifikationen einschließen, solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen an die Base gekoppelten Linker wie beispielsweise ein Amino-propargyl-Linker oder ein Amino-Allyl-Linker ein, weitere Beispiele für die Linker sind bekannt (Ward et al. US Pat 4711955, G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-, Hobbs et al. US
L5 Patent 5.047.519 oder andere Linker z.B. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028, Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nnucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704,
10 Odedra WO 0192284). In einer Ausführungsform stellt der an die Base gekoppelte Linker die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente der modifizierten Nuk-Makromoleküle dar. Weitere Modifikationen an der Base sind beispielsweise im Katalog von Trilink Biotechnologies, Inc. San Diego, USA, Ausgabe 2003 auf Seite 38 aufgeführt.
15
1.3.3.1.3 Variationen am Zucker
Dem Fachmann sind verschiedene Variationen der Zucker-Komponente der Nukleotide bekannt, die z.B. in der Diagnostik, Therapie oder Forschung eingesetzt werden. Solche Variationen schließen z.B. Ribose, 2> -Deoxyribose oder 2 ',3V -Dideoxyribose ein.
50 Wahlweise kann die Zucker-Komponente Modifikationen einschließen (M. Metzger et al. Nucleic Acid Research 1994, V. 22, 4259-, Tsien WO 91/06678), solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen Linker ein. Die modifizierende Gruppe oder Linker kann beispielsweise reversibel an die Zucker-Komponente gekoppelt sein (WO2007053719, Hovinen et al. J.Chem.Soc.Prking Trans. 1994, S. 211-, Canard5 US Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Ju et al. US Pat. 6664079, Fahnestock et al. WO 91066678, Cheeseman US Pat. 5302509, Parce et al. WO 0050642, Milton et al. WO 2004018493, Milton et al. 2004018497, an der 2 '- Position (WO2007075967). Diese Anmeldungen sind hier eingebaut als Literaturquellen (incorporated by reference).
In einer Ausführungsform stellt der an die Zucker-Komponente gekoppelte Linker die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente der modifizierten Nuk-Makromoleküle dar.
In einer weiteren Ausführungsform schließt die Zuker-Komponente z.B. folgende Modifikationen ein: wahlweise kann die 3 ' - oder die 2 '-OH-Gruppen durch folgende Atome oder Gruppen ersetzt werden: Halogenatome, Wasserstoff, Amino-, Merkapto- oder Azido-Gruppe (Beabealashvilli et al. Biochem Biophys Acta 1986, v.868, 136-, Yuzhanov et al. FEBS Lett. 1992 v. 306, 185-).
In einer weiteren Ausführungsform schließt die Nuk-Komponente azyklische Nukleotid- oder Nukleosid-Modifikationen ein (A. HoIy Current Pharmaceutical Design 2003 v. 9, 2567-, G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-). In einer weiteren Ausführung kann die Zucker-Komponente eine Doppeltbindung einschließen. In der Anmeldung werden 2> -Deoxynukleotide, beispielsweise 2" -Deoxyuridin- Triphosphat, 2' -Deoxycytidin-Triphosphat, 2" -Deoxyadenosin-Triphosphat, 2λ - Deoxyguanosin-Triphosphat als dUTP, dCTP, dATP und dGTP bezeichnet.
1.3.3.1.4 Kopplung von Nuk-Komopente und Linker
Die Nuk-Komponente ist an einer Kopplungsstelle mit dem Linker verbunden. Die Kopplungsstelle des Linkers an die Nuk-Komponente kann sich an der Base, am Zucker (Ribose bzw. Deoxyribose), oder am Phosphat-Teil befinden. Es können mehrere Linker an eine Nukleotid-Komponente gebunden sein (siehe unten Abschnitt Linker).
Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und der Nuk-Komponente ist vorzugsweise kovalent. Wenn die Kopplungsstelle an der Base liegt, so befindet sie sich vorzugsweise an den Positionen 4 oder 5 bei Pyrimidin-Basen und an den Positionen 6,7,8 bei den Purin-Basen (Ward et al. US Pat 4711955, G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-, Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z.B. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028, Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). Am Zucker können die Positionen T , 3 \ 4' oder 5' die Kopplungsstellen darstellen. Die Kopplung an die Phosphatgruppen kann an der alpha, beta, oder gamma-Phosphatgruppe erfolgen. Beispiele für die Kopplungsstelle an der Base sind in Short WO 9949082, Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382 (siehe auch kommerziell erhältliche Nukleotide (Amersham, Roche), an der 5 Ribose in Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363, Canard US Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642., an Phosphatgruppen in Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363 beschrieben.
LO Die Position der Kopplungsstelle hängt vom Einsatzgebiet der modifizierten Nuk- Makromoleküle ab. So werden beispielsweise für die Markierung von Nukleinsäuren, die am Nukleinsäurestrang verbleiben soll, vorzugsweise Kopplungsstellen am Zucker oder an der Base verwendet. Die Kopplung an die Gamma- oder Beta-Phosphatgruppen kann beispielsweise dann erfolgen, wenn die Markierung beim Einbau des modifizierten Nuk-
L5 Makromoleküls freigesetzt werden soll.
Die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente erfolgt beispielsweise über eine Kopplungseinheit (L), die ein Teil der Linker-Komponente ist.
JO Die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein, z.B. bei Temperaturen bis zu 1300C, für pH- Bereiche zwischen 1 und 14, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z.B. Proteasen, Esterasen) sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen
£ spaltbar. Eine solche Gruppe kann auch innerhalb des Linkes vorliegen.
Diese spaltbare Verbindung ermöglicht die Entfernung der Linker- und der Marker- Komponenten. In einer Ausführungsform der Erfindung ermöglicht sich die Entfernung des sterisch anspruchsvollen Liganden ebenfalls. Dies kann beispielsweise in den Verfahren der
10 Sequenzierung durch die Synthese von Bedeutung sein, wie Pyrosequencing, BASS (Canard et al. US Patent 5.798.210, Rasolonjatovo Nucleosides & Nucleotides 1999, V.18 S.1021, Metzker et al. NAR 1994, V.22, S.4259, Welch et al. Nucleosides & Nucleotides 1999, V.18, S.19, Milton et al. WO 2004018493, Odedra at al. WO 0192284) oder Single molecule sequencing, Tcherkassov WO 02088382. Ihre Wahl ist nicht eingeschränkt,
5 sofern sie unter den Bedingungen der enzymatischen Reaktion stabil bleibt, keine irreversible Störung der Enzyme (z.B. Polymerase) verursacht und unter milden Bedingungen abgespalten werden kann. Unter "milden Bedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, die zum Beispiel Nukleinsäure-Primer-Komplexe nicht zerstören, wobei z.B. der pH-Wert vorzugsweise zwischen 3 und 11 und die Temperatur zwischen O0C und einem Temperaturwert (x) liegt. Dieser Temperaturwert (x) hängt von der Tm des Nukleinsäure-Primer-Komplexes (Tm ist der Schmelzpunkt) und wird beispielsweise als Tm (Nukleinsäure-Primer-Komplex) minus 5°C errechnet (z.B. Tm ist 5 47°C, dann liegt die maximale Temperatur bei 42°C; unter diesen Bedingungen eignen sich besonders Ester-, Thioester-, Acetale, Phosphoester-, Disulfid-Verbindungen und photolabile Verbindungen als spaltbare Verbindungen).
Vorzugsweise gehört die genannte spaltbare Verbindung zu chemisch oder enzymatisch LO spaltbaren oder photolabilen Verbindungen. Als Beispiele von chemisch spaltbaren Gruppen sind Ester-, Thioester-, Disulfid-, Acetal-Verbindungen bevorzugt (Short WO 9949082, „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc., Herman et al. Method in Enzymology 1990 V.184 S.584, Lomant et al. J.Mol.Biol. 1976 V.104 243, "Chemistry of carboxylic acid and esters" S.Patai 1969 Interscience Publ.). L5 Beispiele für photolabile Verbindungen können in folgenden Literaturstellen gefunden werden: Rothschild WO 9531429, "Protective groups in organic synthesis" 1991 John Wiley & Sons, Inc., V. Pillai Synthesis 1980 S.l, V. Pillai Org. Photochem. 1987 V.9 S.225, Dissertation „Neue photolabile Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese" H.Giegrich, 1996, Konstanz, Dissertation „Neue photolabile 10 Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese" S. M. Bühler, 1999, Konstanz). Noch weitere spaltbare chemische Gruppen, die in der Nukleotid-Chemie realsiert wurden, sind in Milton et al. WO2004018493, Milton et al. WO2004018497 beschrieben.
15 1.3.3.1.5 Zahl der gekoppelten Nuk-Komponenten
In einer Ausführungsform der Erfindung ist pro ein modifiziertes Nuk-Makromolekül nur eine Nuk-Komponente gekoppelt. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind mehrere Nuk- Komponenten pro ein modifiziertes Nuk-Makromolekül gekoppelt. Mehrere Nuk-Komponenten können einheitlich oder unterschiedlich sein, wobei beispielsweise 50 durchschnittlich 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 25, 25 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 250, 250 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 10000, 10000 bis 100000 oder mehr Nuk-Komponenten pro ein modifiziertes Nuk-Makromolekül gekoppelt sein können.
1.3.3.2 Linker-Komponenten 5
Die Bezeichnung Linker oder Linker-Komponente wird synonym in der Anmeldung verwendet und bezieht sich auf strukturelle Abschnitte des modifizierten Nuk- Makromoleküls zwischen der Nuk-Komponente und entweder der Marker-Komponente oder dem markromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden oder zwischen dem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden und dem Marker.
Es wird unterschieden nach Linkern, die mit Nuk-Komponente in Verbindung stehen (Linker 1 und Linker 2) und Linker (3), der weitere Bestandteile von modifizierten Nuk-
Makromolekül verbinden (z.B. sterisch anspruchsvollen Ligand(en) und den/ die Marker).
Linker 3 kann in analoger Weise wie Linker 1 und 2 aufgebaut sein oder eine andere Struktur haben. Die Zusammensetzung des Linkers 3 ist nicht eingeschränkt, solange er die enzymatische Reaktion und die Eigenschaften des modifizierten Nuk-Makromoleküls nicht zerstört.
Im weiteren werden Linker 1 und 2 detailiert besprochen, dabei wird ein genereller Begriff „Linker" verwendet, da in den meisten Anwendungen nur eine Linker- Komponente an der Nuk-Komponente gebunden ist.
Der Linker ist vorzugsweise wasserlöslich. Die genaue Linkerzusammensetzung ist nicht eingeschänkt und kann variieren.
Die Linker-Länge wird betrachtet als die kürzeste Distanz (theoretisch bereichnete auf den ausgestreckten Zusand des Linkers) von der Nuk-Komponene bis zur nächsten makromolekularen Struktur (z.B. makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand oder auch makromolekularer Marker). Beispielhaft wird die Distanz zum Marker oder zum sterischen Hindernis berechnet.
In einer bevorzugten Form haben modifizierte Nuk-Makromoleküle einen kurzen Linker. Seine Länge beträgt zwischen 2 und 30 Kettenatomen. Solche Linker können funktionelle Gruppen tragen, wie beispielsweise Amino-, Carboxy-, Mercapto- und Hydroxygruppen. An diese Gruppen können weitere Moleküle, z.B. Makromoleküle, wie wasserlösliche Polymere, gekoppelt werden. Beispiele von kurzen Linkern gekoppelt an Nukleotide sind dem Fachmann bekannt (Ward et al. US Pat 4711955, G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-, Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z.B. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028, Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). Der Linker kann eine oder mehrere Einheiten von wasserlöslichen Polymeren enthalten, wie beispielsweise Aminosäuren, Zucker, PEG-Einheiten oder Carbonsäuren. Weitere Beispiele für kurze Linker kann die Kopplungseinheit (L) eines langen Linkers dienen s.u. Linker mit der Länge zwischen 2 und 20 Atome, werden vorzugsweise in modifizierten Nuk-Makromolekülen eingesetzt, deren Marker-Komponente lineare wasserlösliche Polymere aufweist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein langer Linker eingesetzt, mit einer Länge von mehr als 30 Ketten-Atomen.
Nachfolgend werden Beispiele für die Zusammensetzung der Linker angeführt.
1.3.3.2.1 Linker-Bestandteile (Am Beispiel von Linker zwischen der Nuk-Komponente und der Marker-Komponente oder zwischen der Nuk-Komponente und dem sterisch anspruchsvollen Liganden).
Die Linker-Komponente stellt einen Teil des Nuk-Markromoleküls dar, der zwischen der jeweiligen Nuk-Komponente und der Marker-Komponente liegt.
Die Linker-Komponente hat in ihrer Struktur beispielsweise folgende Bestandteile: 1) Kopplungseinheit L 2) wasserlösliches Polymer 3) Kopplungseinheit T
Die Aufteilung der Linker-Komponente in einzelne Bestandteile ist rein funktionell und soll lediglich der Anschaulichkeit der Struktur dienen. Je nach Betrachtungsweise können einzelne Strukturen des Linkers zum einen oder zum anderen Bestandteil gerechnet werden.
Die Kopplungseinheit L hat die Funktion, die Linker-Komponente und die Nuk- Komponente zu verbinden. Bevorzugt sind kurze, unverzweigte Verbindungen, von 1 bis 20 Atome in der Länge. Die jeweilige Struktur der Kopplungseinheit L hängt von der Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid bzw. Nuk-Einheit und von dem jeweiligen Polymer des Linkers ab. Einige Beispiele für die Kopplungseinheiten L sind im Abschnitt Beispiele angegeben. Viele konventionell modifizierte Nukleotide tragen einen kurzen Linker, diese kurzen Linker dienen als weitere Beispiele für die Kopplungseinheit L, z.B. kurze Linker an der Base: Short WO 9949082, Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382(siehe auch kommerziell erhältliche Nukleotide (Amersham, Roche), kurze Linker an der Ribose in Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363, Canard US. Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Ju et al. US Pat.
6664079, Parce WO 0050642., kurze Linker an Phosphatgruppen in Jameson et al.
Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363 .
Noch weitere Beispiele für die Kopplungseinheit L sind nachfolgend angegeben:
R6-NH-R7, R5-O-R7, R6-S-R7, R6-SS-R7, R6-CO-NH-R7, R6-NH-CO-R7, R6-CO-O-R7, R6-O-CO-R7, R6-CO-S-R7, R6-S-CO-R7, R6-P(O)2-R7, R5-Si-R7, R5-(CH2)n-R7, FV(CH2VR7, R6-A-(CH2)n-R7, R6-(CH2Jn-B-R7, R6-(CH=CH-VR7, R5-(A-CH=CH-VR7, R6-(CH = CH-B-)n-R7, R6-A-CH=CH-(CH2-VR7, R6-(-CH=CH-CH2)n-B-R7, R6-(-CH=CH-CH2-CH2)n-B-R7,
R6-(C≡C-)n-R7/ R6-(A-C≡C-)n-R7, R6-(C≡C-B-)n-R7, R6-A-C≡C-(CH2-VR7, R5-C-CsC-CH2VB-R7, R6-(-C≡C-CH2-CH2)n-B-R7,
wobei R6 - die Nuk-Komponente ist, R7 - de Polymer ist und A und B folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -0-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH-CO-, -CO-
0-, -0-C0-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O)2-, -Si-, -(CH2V, eine photolabile Gruppe, wobei n - gleich 1 bis 5 ist
Die Kopplungseinheit L ist auf einer Seite mit der Nuk-Komponente, auf der anderen mit Polymer kovalent verbunden. Die Art der Kopplung hängt von der Art des Polymers ab.
In bevorzugter Form hat das Polymer an seinen Enden reaktive Gruppen, beispielsweise
NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid, Halogen-Gruppen. Solche Polymere sind käuflich erwerblich (z.B. Fluka).
Einige Varianten für die Kopplung von Polymeren an die Kopplungseinheiten sind im Abschnitt Beispiele angegeben.
Das wasserlösliche Polymer bildet in einer bevorzugten Ausführungsform den Hauptanteil der Linker-Komponente. Es ist ein Polymer, vorzugsweise hydrophil, bestehend aus gleichen oder unterschiedlichen Monomeren. Beispiele für geeignete Polymere stellen Polyethylen-glycol (PEG), Polyamide (z.B. Polypeptide), Polysaccharide und deren Derivate, Dextran und seine Derivate, Polyphosphate, Polyacetate, Poly(alkyleneglycole), Kopolymere aus Ethylenglycol und Propylenglycol, Poly(olefinische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide),
Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(x-Hydroxy-Säuren), Poly-Acrylsäure und ihre Derivate, Poly-Acrylamide in ihre derivate, Poly(Vinylalkohol), Polylactat Säure, polyglycolic Säure, Poly(epsilon-caprolactone), Poly(beta-hydroxybutyrate), Poly(beta- hydroxyvalerate), Polydioxanone, Poly(ethylene terephthalate), Poly(malic Säure), Poly(tartronic Säure), Poly(ortho ester), Polyanhydride, Polycyanoacrylate, Poly(phosphoester), Polyphosphazene, Hyaluronidate, Polysulfones.
Dieses Polymer schließt in einer Ausführungsform verzweigte oder weiteren Ausführungsform nicht verzweigte Polymere ein. Das Polymer kann aus mehreren unterschiedlich langen Abschnitten bestehen, wobei jeder Abschnitt aus gleichen Monomeren besteht und Monomere in unterschiedlichen Abschnitten unterschiedlich sind. Einem Fachmann sollte naheliegend erscheinen, dass für einen makromolekularen Linker meistens nur eine durchschnittliche Masse bestimmt werden kann, so dass die Angaben zu den Molmassen einen Mittelwert darstellen ("Makromoleküle, Chemische Struktur und Synthesen", Band 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X). Aus diesem Grund kann für modifizierte Nuk-Makromoleküle oft keine exakte Massenangabe gemacht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt die Linker-Komponente ein lineares, nicht verzweigtes Polymer ein und trägt keine sterisch anspruchsvollen chemischen Strukturen, wie beispielsweise Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, Liganden. Solche Linker ermöglichen eine geringe sterische Hinderung der enzymatischen Erkennung der Nuk-Komponenten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Polymer der Linker-Komponente linear, die Linker-Komponente trägt jedoch eine oder mehrere sterisch anspruchsvollen chemischen Strukturen, wie beispielsweise niedermolekulare Farbstoffe. Weitere Beispiele für sterisch anspruchsvolle Gruppen sind im Abschnitt 1.3.19 angegeben.
Sterisch anspruchsvollen Liganden bzw. Strukturen können an unterschiedliche Linker- Abschnitte gekoppelt sein (s. auch Abschnitt 1.3.19 Sterisch anspruchsvoller Ligand). Die durchschnittliche Zahl der an den Linker gekoppelten sterisch anspruchsvollen Liganden kann variieren und liegt beispielsweise zwischen 1 und 3, 3 und 5, 5 und 20, 20 und 50. Die Kopplung von sterisch anspruchsvollen Gruppen sollte die Tatsache berücksichtigen, dass eine raumfordernde Struktur in der Nähe der Nukleotid- Komponente zur Aufhebung der Substrateigenschaften führen kann. Sterisch anspruchsvolle Liganden können gleichmäßig oder zufällig über die gesamte Länge des Linkers gekoppelt sein, oder in einem bestimmten Abstand von der Nuk-Komponte am Linker gekoppelt sein. Der minimale Abstand zwischen der Nuk-Komponente und dem makromolekularen sterischen Liganden beträgt beispielsweise 10 bis 15, 15 bis 20, 20 bis 25, 25 bis 30, 30 bis 35, 35 bis 40, 40 bis 45, 45 bis 50, 50 bis 55, 55 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis 90, 90 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 1000, 1000 bis 5000, 5000 bis 10000 Kettenatome.
Der sterisch anspruchsvolle Ligand kann auch als Teil des Linkers oder als Teil des Markers betrachtet werden. Die Betrachtugnsweise kann beispielsweise davon abhängen, ob sterisch anspruchsvolle Gruppe gewisse Signaleigenschaften aufweist oder nicht.
1.3.3.2.2 Linker-Länge (am Beispiel für einen Linker zwischen der Nuk-Komponente und der nächsten makromolekularen Struktur, wie sterisch anspruchsvoller Ligand oder makromolekularer Marker). Die durchschnittliche Linkerlänge beträgt zwischen 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50, 50 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis 90, 90 bis 100, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10.000, 10000 bis 100000 Atome (gezählt werden Ketten-Atome), somit beträgt die durchschnittliche Linker-Länge zwischen 0,5 nm und 1 nm, 1 nm bis 2 nm, 2 nm bis 3 nm, 3 nm bis 4 nm, 4 nm bis 5 nm, 5 nm bis 6 nm, 6 nm bis 7 nm, 7 nm bis 8 nm, 8 nm bis 9 nm, 9 nm bis 10 nm, 5 nm bis 10 nm, 10 nm bis 20 nm, 20 nm bis 50 nm, 50 nm bis 100 nm, 100 nm bis 200 nm, 200 nm bis 1000 nm (gemessen an einem potenziell maximal ausgestrecktem Molekül).
Da ein modifiziertes Nuk-Makromolekül mehrere Nuk-Komponenten und somit auch mehrere Linker einschließen kann, können diese Linker (d.h. Varianten von Linker 1) untereinander gleich oder auch unterschiedlich lang sein. Die oben angeführten Angaben zur Linker-Länge zeigen den kürzesten Linker im ganzen modifizierten Nuk- Makromolekül an.
Einige Abschnitte des Linkers können rigide Bereiche enthalten und andere Abschnitte können flexible Bereiche enthalten.
1.3.3.2.3 Linker-Kopplung in einem modifizierten Nuk-Makromolekül (am Beispiel der Kopplung zwischen der Nuk-Komponente und der Marker-Komponente)
Der Linker ist an einer Seite an die Nuk-Komponente und auf der anderen Seite an die Marker-Komponente gebunden. Dazu kann der Linker an seinen Enden Kopplungseinheiten haben, die diese Funktion erfüllen. Die Verbindung mit der Nuk- Komponenten wurde oben erörtert. Die Verbindung zwischen dem Linker und der Marker-Komponenten erfolgt über Kopplungseinheit T. Bevorzugt sind kurze, unverzweigte Verbindungen, bis max. 20 Atome in der Länge. Die jeweilige Struktur der Kopplungseinheit T hängt von der Kopplungsstelle an der Marker-Komponente und von dem jeweiligen Polymer des Linkers. Die Kopplungseinheit T ist mit dem Polymer kovalent verbunden. Die Art der Kopplung hängt von der Art des Polymers ab. In bevorzugter Form hat das Polymer an seinen Enden reaktive Gruppen, beispielsweise NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid, Halogen-Gruppen. Solche Polymere sind kommerziell erhältlich (z.B. Fluka). Einige Beispiele für die Kopplungseinheiten L sind im Abschnitt Beispiele angegeben, Weitere Beispiele für die chemische und affine Kopplungen s. in der Literatur: „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996.
Der Linker kann auch andere funktionelle Gruppen, bzw. Abschnitte enthalten, beispielsweise eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Gruppen s. z.B. WO2005044836.
Eine spaltbare Verbindung innerhalb des Linkers ermöglicht eine Entfernung eines Teils des Linkers und der Marker-Komponente. Nach der Spaltung verbleibt ein Linker-Rest an der Nuk-Komponente, Beispiele für spaltbare Verbindungen sind im Abschnitt 1.3.3.1.4 angegeben.
1.3.3.3 Marker-Komponente
Die Marker-Komponente kann unterschiedliche Strukturen haben. Die Strukturen im einzelnen sind nicht eingeschränkt, solange sie die Substrateigenschaften der Nuk- Komponenten für Enzyme nicht aufheben. Diese Struktur hat vorzugsweise eine signalgebende oder eine signalvermittelnde Funktion. Der Marker kann auch andere Funktionen haben, beispielsweise strukturturelle, antitoxische oder affine Funktion (beispielsweise in Arzneimittel oder Zuberetungen).
1.3.3.3.1 Die Zusammensetzung der Marker-Komponente (Marker)
Der Marker schließt in einer Ausführung eine niedermolekulare Marker-Einheit ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt der Marker eine makromolekulare Marker- Einheit ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt der Marker mehrere niedermolekulare Marker-Einheiten ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt der Marker mehrere makromolekulare Marker-Einheiten ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt der Marker eine Kombination aus niedermolekularen und makromolekularen Einheiten ein. Die Marker-Einheiten können eine signalgebende oder signalvermittelnde Funktion haben. Diese Einheiten können Moleküle mit geringer Molekularmasse, z.B. unter 2000 Da, oder auch selbst Makromoleküle sein. Dabei schließt die Zahl der signalgebenden oder signalvermittelnden Einheiten, die zu einer Marker-Komponenten zusammengefaßt sind, folgende Bereichen ein: 1 und 2, 2 und 5, 5 und 20, 20 und 50, 50 und 100, 100 und 500, 500 und 1000. 1000 und 10000, 10000 und 100000.
Falls mehrere Marker-Einheiten in einem Marker zusammengefasst sind, sind diese Einheiten in einer Ausführungsform an ein Gerüst gebunden, die Kern-Komponente des Markers (Fig. 4b, c). Diese Kern-Komponente verbindet die Einheiten untereinander. Die Kern-Komponente kann die Verbindung zu einem oder mehreren Nuk-Linker- Komponenten herstellen (Fig 5). Die Kern-Komponente schließt niedermolekulare oder makromolekulare Verbindungen ein.
1.3.3.3.2 Struktur der signalgebenden oder der signalvermittelnden Einheiten des Markers
Die strukturellen Marker-Einheiten schließen folgende Gruppen ein:
1.3.3.3.2.1 Strukturen mit niedriger Molmasse:
Biotin-Moleküle, Hapten-Moleküle (z.B. Digoxigenin), radioaktive Isotope (z.B. P32, J131), oder deren Verbindungen, seltene Erden , Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, Fluoreszenz-
Quencher (z.B. Dabsyl) (viele dieser Moleküle sind kommerziell erhältlich z.B. von
Molecular Probes, Inc., oder Sigma-Aldrich) mit gleichen oder unterschiedlichen spektralen Eigenschaften, Farbstoffe, die untereinander FRET eingehen. Thermochrome, photochrome oder chemolumineszente Substanzen (erhältlich z.B. bei Sigma-Aldrich), Chromogene Substanzen (z.B. als Substrate für Peptidasen beschrieben in „Proteolyse enzymes Tools and Targets", E. Sterchi, 1999, ISBN 3-540-61233-5).
Auch chemisch reaktive Gruppen, wie beispielsweise Amino-, Carboxy-, Merkapto-, Aldehyd-, Jodacetat-, Acryl-, Dithio-, Thioester-Verbindungen können als signalvermittelnde strukturelle Einheiten dienen. Nach dem Einbau können diese reaktiven Gruppen mit signalgebenden Elementen, wie beispielsweise Farbstoffe mit entsprechenden reaktiven Gruppen (beispielsweise NHS-Ester, Merkapto-, Amino- Gruppen) modifiziert werden. Allgemeine Grundlagen für die Wahl eines passenden Paares von reaktiven Gruppen sind in „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 dargestellt.
In einer speziellen Ausführungsform erfühlt die Kombination aus einer Nuk-Einheit, einer markomolekularen Linker-Komponente und einem Marker mit niedriger Molmasse bereits die Anforderungen der vorliegenden Erfindung. Solche Verbindungen sind ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung. Sie können sowohl als Zwischenprodukte für die chemische Synthese von modifizierten Nuk-Makromolekülen mit einem makromolekularen Marker, z.B. dUTP-PEG-Biotin, als auch selbständig in den enzymatischen Reaktionen verwendet werden, wie beispielsweise mit nur einem Farbstoff markierte Nukleotide.
Als Farbstoffe können verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe auftreten, ihre Wahl ist nicht eingeschränkt, solange sie die enzymatische Reaktion nicht wesentlich beeinflußen. Beispiele für Farbstoffe sind Rhodamine (Rhodamin 110, Tetramethylrhodamin, erhältlich bei Fluka-Sigma), Cyanin-Farbstoffe (Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 von Amersham Bioscience), Coumarine, Bodipy, Fluorescein, AI exa- Farbstoffe: z.B. Alexa 532, Alexa 548, Alexa 555 (Molecular Probes). Viele Farbstoffe sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande (im weiteren als Molecucular Probes bezeichnet) oder von Sigma-Aldrich-Fluka (Taufkirchen, Deutschland). Beispiele für die Synthese eines Nuk-Makromoleküls mit einem niedermolekularem Marker ist in WO 2005044836 angegeben.
In einer Ausführungsform schließt ein Marker mehrere Marker-Einheiten ein. Dabei können die Marker-Einheiten untereinander gleiche oder verschiedene Eigenschaften haben. Beispielsweise können Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Spektraleigenschaften eingesetzt werden. In einer Ausführungsform werden Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt, die FRET-Paare bilden.
1.3.3.3.2.2 Strukturen mit hoher Masse (Makromoleküle)
1.3.3.3.2.2.1 Nanokristalle
Nanokristalle, z.B. Quantum Dots können als Marker-Einheiten auftreten. Dabei können in einer Marker-Komponente Quantum Dots mit gleichen oder unterschiedlichen spektralen Eigenschaften verwendet werden, US Pat. 6.322.901, US Pat. 6.423.551, US Pat. 6.251.303, US Pat. 5.990.479).
1.3.3.3.2.2.2 Nano oder Mikro-Teilchen.
Nano oder Mikro-Teilchen können als Marker-Einheiten auftreten, wobei die größten Ausmaße dieser Teilchen von lnm bis 2nm, von 2nm bis 5nm, von 5nm bis lOnm, von lOnm bis 20 nm, von 20nm bis 50nm, von 50nm bis lOOnm, von 100 nm bis 200nm, von 200nm bis 500nm, von 500nm bis lOOOnm, von 1000 nm bis 5000 nm betragen. Das Material der Teilchen können beispielsweise reine Metalle wie Gold, Silber, Aluminium (beispielsweise Teilchen mit surface plasmon resonance ), - Protein-Au- Konjugate: J. Anal.Chem. 1998, V. 70, S. 5177, - Nukleinsäure-Au-Konjugaten: J. Am. Chem. Soc. 2001, V. 123, S.5164, J. Am. Chem. Soc. 2000, V. 122, S. 9071 , Biochem. Biophys. Res. Commun 2000, V. 274, S. 817, Anal. Chem. 2001, V. 73, S. 4450), - Latex (z.B. Latex-Nanopartikel, Anal. Chem. 2000,V. 72, S. 1979) - Kunststoff (Polystyrene), - paramagnetische Verbindungen / Gemische Zhi ZL et al. Anal Biochem. 2003 JuI 15;318(2): 236-43, Dressman D et al. Proc Natl Acad Sei U S A. 2003 JuI 22; 100(15) :8817-22,, - Metall-Teilchen, - magnetische Verbindungen / Gemische Jain KK. Expert Rev Mol Diagn. 2003 Mar;3(2): 153-61, Patolsky F et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2003 May 30;42(21) :2372-2376, Zhao X et al. Anal Chem. 2003 JuI 15;75(14) : 3144-51, Xu H et al. J Biomed Mater Res. 2003 Sep 15;66A(4):870-9, JOSEPHSON Lee et al. US Pat. 2003092029, KLICHE KAY-OLIVER et al. WO0119405. Mehrere solche Komponenten (z.B. funktionalisierte Beads) sind kommerziell erhältlich, z.B. von Miltenyi Biotech (z.B. paramagnetischen Teilchen, Streptavidin Microbeads) oder von Sigma-Aldrich oder BD Biosciences.
1.3.3.3.2.2.3 Proteinmoleküle,
Proteinmoleküle können als Marker-Einheiten auftreten, wobei sie folgende Gruppen schließen: Enzyme (z.B. Peroxidase, alkalische Phosphotase, Urease, beta- Galaktosidase, Proteinasen), - fluoreszierenden Proteine (z.B. aus GFP-Protein-Familie oder Phycobiliproteine (z.B. Phycoerythrin, Phycocyanin), erhältlich z.B. von Molecular Probes Inc.), Antigen-bindende Proteine (z.B. Antikörper, Tetramere, Affibodies (Nord et. AI Nature Biotechnology, V. 15 (S.772-777) oder deren Bestandteile (z.B. Fab- Fragmente), Nukleinsäurebindende Proteine (z.B. Transcriptionsfaktor)
1.3.3.3.2.2.4 Nukleinsäureketten,
Die Nukleinsäureketten einschließlich der Gruppe, Oligonukleotide, modifizierte Oligonukleotide, können als Marker-Einheiten auftreten. Die Länge der Nukleinsäureketten liegt vorzugsweise in folgenden Bereichen von 10 bis 20, von 20 bis 50, von 50 bis 100, von 100 bis 200, von 200 bis 500, von 500 bis 1000, 1000 bis 5.000, von 5.000 bis 10.000, von 10.000 bis 100.000 Nukleotiden. Es können DNA, RNA, PNA-Moleküle verwendet werden. Nukleinsäureketten können zusäzliche Modifikationen tragen, wie beispielsweise freie Aminogruppen, Farbstoffe und andere signalgebende Moleküle, z.B. makromolekulare Substanzen, z.B. Enzyme oder Nanokristalle (Fig. 6 a,c). Diese makromolekulare Susbtanzen können sterisch anspruchsvolle Liganden darstellen (Fig. 7) (s. Abschnitt „sterisches Hindersnis"). Modifizierte Nukleinsäureketten sind kommerziell zugängig, z.B. MWG-Biotech. Weitere Beispiele für Makromoleküle oder Makromolekülkomplexe, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Marker oder Marker-Einheiten in der Marker-Komponente für die Signalverstärkung eingesetzt werden können, sind in US Pat. 4882269, US Pat. 4687732, WO 8903849, US Pat. 6017707, US Pat. 6627469 beschrieben.
Auch anderen Marker-Einheiten, wie Lektine; Wachstumsfaktoren, Hormone, Rezeptor- Moleküle können eingesetzt werden.
1.3.3.3.3 Die Kern-Komponente der Marker-Komponente Die Kernkomponente hat die Funktion mehrere strukturelle Elemente der modifizierten Nuk-Makromoleküle zu binden. Beispielsweise bindet die Kern-Komponente mehrere Marker-Einheiten zusammen. In einer weiteren Ausführungsform können Linker- Komponenten an die Kern-Komponente gebunden werden s. Fig. 5. Der Begriff der Kern- Komponente ist funktionell und dient zur Erläuterung von möglichen Strukturen von modifizierten Nuk-Makromolekülen. Unterschiedliche chemische Strukturen, die Linker und Marker-Einheiten zusammenhalten, können als Kern-Komponente bezeichnet werden. Im Folgenden sind Beispiele für Bestandteile der Kernkomponente angegeben.
1.3.3.3.3.1 Bestandteile der Kernkomponente
In einer Ausführungsform besteht die Kern-Komponente aus einer oder mehreren niedermolekularen Verbindungen. Sie haben die Funktion, die Marker-Einheiten untereinander zu verbinden. Die Verbindung zwischen der Kern-Komponente und den Marker-Einheiten kann kovalent oder affin sein. Bei kovalenter Bindung können beispielsweise Verbindungen mit allgemeiner Struktur-Formel (F)m-R-(H)n als Ausgangsmateriel dienen, wo (F) und (H) - reaktive Gruppen darstellen, und R - eine Verbindungskomponente, wobei Zahl solcher Gruppen und ihre Anordnung stark variieren kann. Viele Beispiele sind dem Fachmann bekannt, z.B. Verbindungen aus der Gruppe Cross-Linker („Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc.). Die Struktur ist nicht eingeschränkt. Sie ist vorzugsweise wasserlöslich. Beispielsweise schließen (F) und (H) unabhängig von einander folgende Gruppen ein : NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid. Beispiele für (R) stellen wasserlösliche Polymere wie PEG oder Polypeptid-Ketten oder kurze aliphatische Ketten dar.
In einer weiteren Ausführungsform besteht die Kern-Komponente aus einem wasserlöslichen Polymer, dabei kann das Polymer aus gleichen oder unterschiedlichen Monomeren bestehen. Beispiele für den Kern-Komponennte stellen folgende Polymere und deren Derivate dar: Polyamide (z.B. Polypeptide wie Poly(glutamin) oder Poly(Glutamin säure)) und deren Derivate, Poly-Acrylsäure und deren Derivate, natürliche oder synthetische Polysaccharide (z.B. Stärke, Hydroxy-Ethyl-Strärke), Dextran und seine Derivate (z.B. Aminodextran, Carboxy-Dextran), Dextrin, Poly-Acrylamide und deren Derivate (z.B. N- (2-hydroxypropyl)-methacdylamid) , Poly-Vinylalkohole und deren Derivate, Nukleinsäuren, Proteine. Diese Polymere können linear, globulär, z.B. Streptavidin oder Avidin, oder verzweigt sein, z.B. Dendrimere. Auch vernetzte lösliche Polymere, wie beispielswiese vernetzte Poly-Acrylamide (Crosslinker Bisacrylamid in Kombination mit Poly-Acrylamid), eingesetzt werden.
Da sowohl die Linker-Komponente als auch die Marker-Komponente wasserlösliche Polymere enthalten können, kann in einer Ausführungsform ein solches Polymer sowohl als Linker als auch als Kern-Komponente dienen. In diesem Fall kann ein Abschnitt eines solchen Polymers als Linker, ein anderer Abschnitt als Kern-Komponente betrachtet werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden lineare oder wenig verzweigte Polymere als Kernkomponenten eingesetzt, beispielsweise Polyamide (z.B. Polypeptide), Poly-Acrylsäure, Polysaccharide, Dextran, Poly-Acrylamide, Poly- Vinylalkohole. Das Polymer kann aus einheitlichen oder unterschiedlichen Monomeren bestehen. Insbesondere in dieser Ausführungsform kann die Linker-Komponente weniger als 50 Kettenatome aufweisen. So können auch Linker-Längen von ca. 5 bis 10, 10 bis 20 oder 20 bis 50 Kettenatome ausreichend sein, um die Substrateigenschaften der modifizierten Nuk-Makromoleküle für Enzyme zu bewahren. Eine solche Kern- Komponente des Markers erfüllt die Funktion der Linker-Komponente: sie schafft räumlichen Abstand zwischen sterisch anspruchsvollen Marker-Einheiten und aktiven Zentren der jeweiligen Enzyme.
Die wasserlöslichen Polymere haben vorzugsweise eine durchschnittliche Ketten-Länge von 20 bis 1.000.000 Kettenatomen. Beispielsweise liegt die durchschnittliche Kettenlänge zwischen 20 und 100, 100 und 500, 500 und 5000, 5000 und 100000, 100000 und 1000000 Kettenatome. In einer Ausführungsform liegt das Polymer in wässriger Phase bei pH zwischen 4 und 10 vorwiegend in einer neutralen Form vor (z.B. Dextran oder Polyacrylamid). In einer anderen Ausführungsform liegt das Polymer in einer wässrigen Phase bei pH zwischen 4 und 10 in einer geladen Form vor. Es kann sowohl positive (z.B. Polylysin) oder negative Ladungen (z.B. Polyacrylsäure) tragen.
Die Kopplung von Marker-Einheiten an ein wasserlösliches Polymer hängt von der Art des Polymers ab. Die für die Kopplung notwendigen reaktiven Gruppen können bereits
5 im Polymer vorhanden sein (z.B. Polylysin oder Polyacrylsäure) oder in einem getrennten
Schritt in das Polymer eingeführt werden. Beispielsweise bei Dextran sind viele Varianten der Einführung von reaktiven Gruppen und chemischen Kopplungen bekannt (Molteni L.
Methods in Enzymology 1985, v.112, 285, Rogovin A.Z. et al. J.Macromol Sei. 1972, A6,
569, Axen R. et al. Nature 1967, v. 214, 1302, Bethell G. S. et al. J. Biol.Chem. 1979,
10 v.254, 2572, Lahm O. et al. Carbohydrate Res. 1977, v. 58, 249, WO 93/01498, WO
98/22620, WO 00/07019 ) .
Die Kern-Komponennte hat vorzugsweise mehrere Kopplungsstellen, an die weitere Elemente gebunden werden können, z.B. strukturelle Marker-Einheiten oder Nuk-Linker- [5 Komponente.
Beispielsweise Poly-Lysin-Moleküle haben multiple freie Aminogruppen, an die mehrere Farbstoffmoleküle, Biotinmoleküle, Haptenmoleküle oder Nukleinsäureketten gekoppelt werden können. Poly-Lysine haben unterschiedliche Molmasse, z.B. 1000-2000, 2000- 10 10000, 10000-50000 Da können käuflich erworben werden.
Als weiteres Beispiel für die Kernkomponente dienen Nukleinsäurenstränge, wobei die Nukleinsäureketten eine Länge von 10 bis 20, von 20 bis 50, von 50 bis 100, von 100 bis 200, von 200 bis 500, von 500 bis 1000, 1000 bis 5000, von 5000 bis 10000 .5 Nukleotiden haben. Diese Nukleinsäuren dienen als Bindungspartner für sequenzkomplementäre Markereinheiten (Fig. 6b).
In einer weiteren Ausführungsform besteht die Kern-Komponente aus einem Dendrimer, z.B. Polypropylenimine, Polyaminoamine. Beispiele für andere Dendrimere sind bekannt:
50 Cientifica "Dendrimers", 2003, Technology white papers Nr. 6, Klajnert et al. Acta Biochimica Polonica, 2001, v. 48, S. 199, Manduchi et al. Physiol. Genomics 2002, V.10, S.169, Sharma et al. Electrophoresis. 2003, V. 24, S. 2733, Morgan et al. Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 Nov;5(6):966-73, Benters et al. Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2) : E10, Nilsen et al. J Theor Biol. 1997 JuI 21; 187(2) :273-84. Viele Dendrimere
35 sind kommerziell erwerblich (Genisphere, www.genisphere.com, Chimera Biotech GmbH). Weitere Kombinationen für die Kern-Komponennte aus den oben dargestellten Bestandteilen sind einem Fachmann naheliegend.
1.3.3.3.3.2 Kopplung der Marker-Einheiten Marker-Einheiten können an die Kern-Komponente oder an die Linker-Komponente durch eine kovalente Bindung, beispielsweise über einen Cross-Iinker (Chemistry of protein conjugation and cross-linking, S. Wang,1993, ISBN 0-8493-5886-8, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333- 58375-2), oder über eine affine Kopplung erfolgen, beispielsweise Biotin-Streptavidin- Verbindung oder Hybridisierung von Nukleinsäuresträngen oder Antigen-Antikörper- Wechselwirkung ("Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2).
Die Kopplung von Marker-Einheiten an die Kern-Komponente erfolgt in einer Ausführungsform bereits während der Synthese der modifizierten Nuk-Makromoleküle.
In einer anderen Ausführungsform erfolgt zunächst die chemische Synthese von modifizierten Nuk-Makromoleküle, bei denen die Markerkomponente nur aus der Kern- Komponente besteht. Die Kopplung von Marker-Einheiten an die Kern-Komponente erfolgt erst nach dem Einbau von modifizierten Nuk-Makromoleküle in die Nukleinsäurekette. Durch eine große Zahl der potenziellen Bindungsstellen am Kernteil ist die Wahrscheinlichkeit der Bindung der Marker-Einheiten an die Kern-Komponente und somit an die eingebaute Nuk-Komponente wesentlich größer im Vergleich zu konventionellen Nukleotid-Strukturen. Die Kopplungschemie im einzelnen hängt von der Struktur der Marker-Einheiten und der Struktur der Kern-Komponente ab.
Kovalente Kopplung: Die Verbindung zwischen den Marker-Einheiten und der Kern- Komponente kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein, z.B. bei Temperaturen bis zu 1000C, für pH-Bereiche zwischen 3 und 12, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z.B. Esterasen) sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar. Beispiele für die Kopplung von Nukleinsäuren an Dendrimere (entspricht einer Kopplung von Marker-Einheiten an eine Kernkomponente) sind z.B. in Shchepinov et al. Nucleic Acids Res. 1999 Aug l ;27(15) : 3035-41, Goh et al. Chem Commun (Camb). 2002 Dec 21;(24) :2954 dargestellt. 1.3.3.3.3.3 Kopplung zwischen Linker und Marker
Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker hängt von der jeweiligen Struktur der Marker-Einheiten bzw. der Struktur der Kern-Komponente ab. In einer Ausfϋhrungsform ist die Linker-Komponente direkt an die signalgebende oder signalvermittelnde Marker-Einheit gebunden, Fig. 4a . Dabei kann der Marker aus nur einer oder mehreren Marker-Einheiten bestehen.
In einer weiteren Ausführungsform sind ein oder mehrere Linker-Komponenten an die Kern- Komponente des Markers gebunden, Fig. 5d.
Die Bindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker kann sowohl kovalent als auch affine erfolgen. Viele Beispiele sind dem Fachmann bekannt, s. z.B. "Bioconjugation : protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2. „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc.).
Kovalente Kopplung: Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker kann in einer Ausfϋhrungsform widerstandsfähig sein, z.B. bei Temperaturen bis zu 13O0C, für pH-Bereiche zwischen 1 und 14, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z.B. Proteasen, Esterasen)sein . In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar.
Die für die Markierung von Nukeotiden erfindugnsgemäß eingesetzten Makromolekulare Verbidungen schließen in einigen Ausführungsformen wasserlösliche Polymere ein (s.o.). Die Linker der Nukmakromoleküle schließen ebenfalls wasserlösliche Polymere ein (s.o.). Es ist für den Fachmann erkennbar, dass die Zuordung einzelner Polymere zum Linker oder zum Marker einen beschreibenden Charakter hat.
1.3.3.3.4 Das Verhältnis der Nuk- Komponenten in einem modifizierten Nuk- Makromolekül Ein modifiziertes Nuk-Makromolekül kann durchschnittlich 1 bis 2, 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 30, 30 bis 100, 100 bis 1000, 1000 bis 10000, 10000 bis 1000000 Nuk- Komponenten einschließen. Insbesondere bei Verwendung von Nanostrukturen bzw. Nano- oder Mirkokügelchen können sehr hohe Zahlen von Nuk-Komponenten an eine solche Struktur gekoppelt sein.
In einer Ausführungsform haben alle modifizierten Nuk-Makromoleküle eine gleiche Anzahl an Nuk- Komponenten pro ein modifiziertes Nuk-Makromolekül. Beispielsweise können pro ein Strepavidin-Molekül eins bis maximal vier Biotin-Moleküle gebunden werden, bei sättigender Konzentration von N uk- Linker- Komponenten, eine einheitliche Population an modifizierten Nuk-Makromolekülen entsteht.
In einer anderen Ausführungsform haben die modifizierten Nuk-Makromoleküle einer
5 Population eine gleiche durchschnittliche Anzahl von Nuk- Komponenten pro modifiziertes Nuk-Makromolekül, in der Population selbst findet allerdings eine Verteilung der tatsächlichen Besetzung der Nuk-Makromoleküle mit Nuk- Komponenten statt. Die Verteilungsangaben von Nuk- Komponenten pro modifiziertes Nuk-Makromolekül stellen in diesem Fall einen Mittelwert dar.
10
1.3.3.3.5 Das Verhältnis von Marker-Einheiten in einem modifizierten Nuk- Makromolekül
Die Zahl der Marker-Einheiten in einem modifizierten Nuk-Makromolekül schließt folgende Bereiche ein: 1 und 2, 2 und 5, 5 und 20, 20 und 50, 50 und 100, 100 und
15 500, 500 und 1000. 1000 und 10000, 10000 und 100000.
In einer Ausführungsform der Erfindung haben modifizierte Nuk-Makromoleküle eine feste Anzal von signalgebenden Einheiten pro Marker.
In einer anderen Ausführunsform kann die Verteilung von Marker-Einheiten in einer modifizierten Nuk-Makromolekül-Population schwanken und muß nicht notwendigerweise
10 einen konstanten Wert für jedes einzelne modifizierte Nuk-Makromolekül darstellen.
In einer Ausführungsform haben alle modifizierten Nuk-Makromoleküle eine gleiche Anzahl der Marker-Einheiten pro ein modifiziertes Nuk-Makromolekül. Beispielsweise können pro ein Strepavidin-Molekül maximal 4 Biotin-Moleküle gebunden werden, 15 Avidin-Biotin-Technology, Methods in Enzymology v.184, 1990..
In einer anderen Ausführungsform haben die modifizierten Nuk-Makromoleküle einer Population eine definierte durchschnittliche Zahl der Marker-Einheiten pro modifiziertes Nuk-Makromolekül, in der Population selbst findet allerdings eine Verteilung der 50 tatsächlichen Besetzung der modifizierten Nuk-Makromoleküle mit Marker-Einheiten statt. Bei sättigenden Konzentrationen bei der Synthese von Marker-Komponenten findet eine zunehmend einheitlichere Besetzung der modifizierten Nuk-Makromoleküle mit Marker-Einheiten statt.
S5 So spielt beispielsweise in Bereichen, wo es um den qualitativen Nachweis geht, die exakte Zahl der Marker-Einheiten pro modifiziertes Nuk-Makromolekül eine untergeordnete Rolle. In solchen Fällen ist das Vorhandensein eines stabilen Signals an sich von Bedeutung. Es sollte einem Fachmann naheliegend erscheinen, dass die angeführten Marker- Komponenten eine beträchtlich größere Molekül-Größe und -Masse haben, als die jeweilige Nuk-Komponente selbst. Weiterhin sollten andere Beispiele für 5 makromolekulare Marker-Komponenten einem Fachmann naheliegend erscheinen.
1.3.3.3.6 Substrateigenschaften der modifizierten Nuk-Makromoleküle
Die Nuk-Komponente(n) bildet die Grundlage für die Substrateigenschaften der 10 modifizierten Nuk-Makromoleküle. Diese Eigenschaften können durch sterisches Hindernis modifiziert werden (s. Abschnitt sterisches Hindernis).
1.3.3.3.7 Funktion der Marker
Die makromolekulare Marker-Komponente kann in einer Ausführungsform eine
15 signalgebende Funktion haben. In einer anderen Ausführungsform hat sie eine signalvermittelnde Funktion. In einer weiteren Ausführungsform hat sie eine katalytische
Funktion. In einer weiteren Ausführungsform hat sie eine affine Funktion. In einer weiteren Ausführungsform hat der Marker mehr als nur eine Funktion, sondern z.B. vereinigt sowohl signalgebende als auch eine signalvermitteldne Funktion. Weitere
10 Kombinationen sind nahe liegend.
Bei der signalgebenden Funktion enthält die Marker-Komponente Bestandteile, die bereits während der chemischen Synthese an modifizierten Nuk-Makromoleküle gebunden werden.
>5
Bei der signalvermittelnden Funktion trägt die Marker-Komponente Bestandteile, die erst durch eine Reaktion mit signalgebenden Molekülen ihre Signaleigenschaften entfalten, s. WO 2005 044836. Beispielsweise können mehrere Biotin-Moleküle, z.B. 100 Biotin-Moleküle, den Marker-
SO Teil bilden. Nach dem Einbau der modifizierten Nuk-Makromoleküle erfolgt eine Nachweisreaktion mit modifizierten Streptavidin-Molekülen. In einem anderen Beispiel haben die Nukleinsäureketten die signalvermittelnde Funktion. Nach dem Einbau von modifizierten Nuk-Makromoleküle, erfolgt eine Hybridisierung von einheitlichen Oligonukleotiden mit detektierbaren Einheiten, z.B. Fluoreszenzfarbstoffen (MWG-
15 Biotech) an die Marker-Komponente. In einem weiteren Beispiel haben Amino- oder Merkapto-Gruppen, beispielsweise 50 Aminogruppen pro Marker, die signalvermittelnde Funktion. Nach dem Einbau der modifizierten Nuk-Makromoleküle in die Nukleinsäurekette erfolgt eine chemische Modifikation mit reaktiven Komponenten, z.B. mit Farbstoffen, wie beispielsweise für eingebaute Allyl-Amino-dUTP beschrieben, Diehl et al. Nucleic Acid Research, 2002, V. 30, Nr. 16 e79.
In einer anderen Ausführungsform hat die makromolekulare Marker-Komponente eine 5 katalytische Funktion (in Form eines Enzyms oder Ribozyms). Dabei können unterschiedliche Enzyme verwendet werden, z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase. Dank der Kopplung an die Nuk-Komponente kann das jeweilige Enzym durch den Einbau von modifizierten Nuk-Makromolekülen an den Nukleinsäurestrang kovalent gebunden werden. 10
In einer weiteren Ausführungsform hat die makromolekularer Marker-Komponente eine Affinitätsfunktionalität zu einem anderen Molekül. Beispiele für solche Marker bilden Streptavidin-Moleküle, Antikörper oder Nukleinsäureketten.
15 In einer weiteren Ausführungsform hat der Marker die Funtion des makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden und stellt das makromolekulare sterische Hindernis dar.
1.3.4. Niedermolekularer Marker - zum Stand der Technik gehörende Markierung von ZO Nukleotiden beispielsweise mit ein oder zwei Biotin-Molekülen, ein oder zwei Farbstoff- Molekülen, ein oder zwei Hapten-Moleküln (z.B. Digoxigenin).
1.3.5. Konventionell modifiziertes Nukleotid - ein Nukleotid mit einem Linker (durchschnittliche Länge zwischen 5 und 30 Atomen) und einem Marker. Üblicherweise
15 trägt ein konventionell modifiziertes Nukleotid einen niedermolekularen Marker, z.B. ein Farbstoff- oder ein Biotinmolekül.
1.3.6. Enzyme (Polymerasen)
In einer Ausführungsform können die modifizierten Nuk-Makromoleküle als Substrate für 50 Enzyme eingesetzt werden. Polymerasen stellen in Anwendungen oft eingesetzte Enzyme, die Nukleotide als Substrate verwerden. Sie werden im weiteren beispielhaft und stellvertretend für andere Nukleotid-umsetzende Enzyme betrachtet. Eine der zentralen Fähigkeit der Polymerasen besteht in kovalenten Kopplung von Nukleotid-Monomeren zu einem Polymer. Dabei kann die Synthese sowohl matrizen-abhängig (wie z.B. DNA-oder >5 RNA-Synthese mit DNA- oder RNA-abhängigen Polymerasen) als auch matrizenunabhängig, z.B. durch Terminale Transferasen ("J Sambrook "Molecular Cloning" 3. Ed. CSHL Press 2001). Falls RNA als Substrat (z.B. mRNA) in die Sequenzierungsreaktion eingesetzt wird, können handelsübliche RNA-abhängige DNA-Polymerasen eingesetzt werden, z.B. AMV-Reverse Transcriptase (Sigma), M-MLV Reverse Transcriptase (Sigma), HIV-Reverse Transcriptase ohne RNAse-Aktivität. Für bestimmte Anwendungen, können Reverse Transcriptasen von RNAse-Aktivität weitgehend frei sein ("Molecular cloning" 1989, Ed. Maniatis, CoId Spring Harbor Laboratory), z.B. bei mRNA-Makrierung für Hybridisierungsexperimente.
Falls DNA als Substrat (z.B. cDNA) verwendet wird, eignen sich als Polymerasen prinzipiell alle DNA-abhängigen DNA-Polymerasen mit oder ohne 3'-5' Exonuklease-Aktivität (DNA- Replication" 1992 Ed. A. Kornberg, Freeman and Company NY), z.B. modifizierte T7- Polymerase vom Typ "Sequenase Version 2" (Amersham Pharmacia Biotech), Klenow Fragment der DNA-Polymerase I mit oder ohne 3'-5' Exonukleaseaktivität (Amersham Pharmacia Biotech), Polymerase Beta verschiedenen Ursprungs (Animal Cell DNA Polymerases" 1983, Fry M., CRC Press Inc., kommerziell erhältlich bei Chimerx) thermostabile Polymerasen wie beispielsweise Taq-Polymerase, Vent-Polymerase, Vent exo minus Polymerase, Deep Vent -Polymerase, Deep Vent exo minus Polymerase, Pfu- Polymerase, Thermosequenase, Pwo-Polymerase usw. (die Herrsteller sind beispielsweise Promega GmbH, Amersham Biosciences (GE), Roche GmbH, New England Biolabs).
Auch DNA-abhängige RNA- Polymerasen können verwendet werden, z.B. E. coli RNA- Polymerase, T7-RNA-Polymerase, SP6 RNA Polymerase.
Die Polymerasen können eine 3 '- oder eine 5 '-Exonuklease-Aktivität aufweisen und in bestimmten Anwendungen eingesetzt werden (z.B. bei real-time PCR). In der Anmeldung werden DNA-abhängige DNA-Polymerasen als Beispiele für Polymerasen betrachtet.
1.3.7. Spaltbare Verbindung - Eine unter milden Bedingungen spaltbare Verbindung. Diese Verbindung kann einen Abschnitt im Linker darstellen und kann an einer oder an mehreren Stellen spaltbar sein. In einem solchen Fall ist der Linker spaltbar. Es kann sich um eine chemisch spaltbare Verbindung, wie z.B. eine Disulfid-, eine Ester-, eine Acetal-, eine Thioesterverbindung (Short WO 9949082, Tcherkassov WO 02088382) handeln. Es kann auch eine photochemisch spaltbare Verbindung, wie in (Rothschild WO 9531429) dargestellt sein. Es kann auch eine enzymatisch spaltbare Verbindung (beispielsweise eine Peptid- oder Polypeptide-Bindung, Odedra WO 0192284), spaltbar durch Peptidasen, eine PoIy- oder Oligosaccharid-Bindung, spaltbar durch Disaccharidasen) sein, wobei die Spaltung durch ein spezifisches Enzym zwischen bestimmten Monomeren der spaltbaren Stellen stattfinden kann. Mehrere Beispiele für spaltbare Verbindungen sind bekannt. Die Kopplung einer solchen Verbindung ist beispielsweise beschrieben in (Tcherkassov 02088382, Metzker et al. Nucleic Acid Research 1994, V.22, S. 4259, Canard et al. Gene, 1994, V. 148, 1, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Milton et al. WO 2004018493, Milton et al. 2004018497, WO2007053719). Eine Spaltbare Verbindung kann ein Teil des Linkers sein oder die Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid bilden, oder die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und der Makrer- Komponente, oder die Verbindung zwischen den Marker-Einheiten und der Kern- Komponente.
1.3.8 DNA - Deoxyribonukleinsäure verschiedenen Ursprungs und unterschiedlicher Länge (z.B. Oligonukleotide, Polynukleotide, Plasmide, genomische DNA, cDNA, ssDNA, dsDNA)
1.3.9 RNA - Ribonukleinsäure
1.3.10 dNTP - 2'-deoxi-Nucleosid-Triphosphate, Substrate für DNA-Polymerasen und Reverse-Transkriptasen, z.B. dATP, dGTP, dUTP, dTTP, dCTP.
1.3.11 NTP - Ribonukleosid-Triphosphate, Substrate für RNA-Polymerasen, UTP, CTP, ATP, GTP.
1.3.12 Abkürzung "NT" wird auch bei der Längenangabe einer Nukleinsäuresequenz verwendet, z.B. 1.000 NT. In diesem Fall steht "NT" für Nukleosid-Monophosphate.
Im Text wird bei Abkürzungen die Mehrzahl durch Verwendung des Suffixes "s" gebildet, "NT" steht zum Beispiel für "Nukleotid", "NTs" steht für mehrere Nukleotide.
1.3.13 NSK - Nukleinsäurekette. DNA oder RNA
1.3.14 Gesamtsequenz - Summe aller Sequenzen im Ansatz, sie kann ursprünglich aus einer oder mehreren NSKs bestehen. Dabei kann die Gesamtsequenz Teile oder Äquivalente einer anderen Sequenz oder von Sequenz-Populationen darstellen (z.B. mRNA, cDNA, Plasmid-DNA mit Insert, BAC, YAC) und aus einer oder unterschiedlichen Spezies stammen.
1.3.15 NSKF - Nukleinsäurekettenfragment (DNA oder RNA), das einem Teil der Gesamtsequenz entspricht, NSKFs - Nukleinsäurekettenfragmente. Die Summe der NSKFs bildet ein Äquivalent zur Gesamtsequenz. Die NSKFs können beispielsweise Fragmente von DNA- oder RNA-Gesamtsequenz sein, die nach einem Fragmentierungsschritt entstehen.
1.3.16 Primerbindungstelle (PBS) - Teil der Sequenz in der NSK oder NSKF, an den der Primer bindet.
1.3.17 Referenzsequenz - eine bereits bekannte Sequenz, zu der die Abweichungen in der zu untersuchenden Sequenz bzw. in den zu untersuchenden Sequenzen (z.B. Gesamtsequenz) ermittelt werden. Als Referenzsequenzen können in Datenbanken zugängliche Sequenzen verwendet werden, wie z.B. aus der NCBI-Datenbank.
1.3.18 Tm - Schmelztemperatur
1.3.19 Sterisches Hindernis (sterisch anspruchsvolle Gruppe oder Ligand oder Struktur)
Eine Gruppe oder eine chemische Struktur, die als Bestandteil des modifizierten Nuk- Makromolekül (als funktioneller Teil des modifizierten Nuk-Makromoleküls), die einen raumfordernden Effekt in einem gewissen Abstand vom Nukleiotid schafft. Diese chemische Struktur hat beispielsweise in einer bevorzugten Ausführungsform den Effekt, dass die Polymerase nur ein einziges komplementäres modifiziertes Nuk-Makromolekül in den Primer einbauen kann und der Einbau von weiteren komplementären modifizierten Nuk-Makromolekülen in direkter / unmettelbarer Nachbarschaft zum ersten eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekül gehindert wird.
1.3.19.1 Natur und Struktur des sterisch anspruchsvollen Liganden
Vorzugsweise werden Polymere (z.B. Proteine, Dendrimere) oder supramolekulare Strukturen (z.B. Nanoteilchen oder Mikroteilchen) mit einer kompakten dreidimensionalen (3D) Struktur als makromolekulare, sterisch anspruchsvolle Liganden eingesetzt. Für die Beschreibung der makromolekularen, sterisch anspruchsvollen Liganden sind die raumforderenden Eigenschaften von Bedeutung. Idealerweise nimmt ein solcher makromolekularer Ligand ein gewisses Volumen ein, wobei die Anwesenheit eines anderen makromolekularen Moleküls in diesem Volumen ausgeschlossen oder sehr unwahrscheinlich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsrom der Anmeldung, stellen Proteine die Beispiele für sterisch anspruchsvolle Liganden im Sinne dieser Anmeldung dar, z.B. Streptavidin (SA), Avidin, Phycoerythrin (PE), Green Fluorescent Protein (GFP), Antiköper, Bovine serum albumine (BSA) oder ihre Derivate und Modifikationen (z.B. alkylierte, acetylierte, oder mit weiteren wasserlöslichen Polymerasen modifizierte Formen der Proteine, oder gentechnisch veränderte Proteine, die andere spektrale Eigenschaften haben, oder Protein-Konjugate, wie z.B. Strepavidin-alkalische Phosphatase, Streptavidin-Peroxidase, Streptavidin-Antikörper, Streptavidin-Phycoerhytrin oder ganze Komplexe, wie z.B. Quantum-Dots mit Hülle aus polyacrylsäure modifiziert mit Streptavidin, (erwerblich bei Invitrogen).
In einer weiteren Ausführungsform der Anmeldung, stellen Dendrimere die Beispiele für sterisch anspruchsvolle Liganden im Sinne dieser Anmeldung dar (s. Abschnitt Marker)
In einer weiteren Ausführungsform der Anmeldung, stellen Nano- und Mikroteilchen die Beispiele für sterisch anspruchsvolle Liganden im Sinne dieser Anmeldung dar, z.B. paramagnetische Teilchen (s. Abschnitt Marker), Glas-Teilchen (s. Abschnitt Marker), Kunststoff-Teilchen (s. Abschnitt Marker).
In einer weiteren Ausführungsform der Anmeldung, stellen verzweigte Polymere die Beispiele für sterisch anspruchsvolle Liganden im Sinne dieser Anmeldung dar , z.B. Dextrane (s. Abschnitt Marker).
Masse / Abmessung / Durchmesser
Zur Vereinfachung der Klassifizierung der sterisch anspruchsvollen Liganden wird die Angabe der Masse (z.B. für Proteine) bzw. des druchschnittlichen Durchmessers (z.B. für Nanostrukturen) herangezogen. Diese Angabe dient als grobes Maß für die Differenzierung von sterisch anspruchsvollen Liganden nach ihrer Größe. Dabei werden kleinmolekulare sterisch anspruchsvolle Liganden (Molekulare Masse weniger als 2 kDa) und makromolekulare sterisch anspruchsvolle Liganden (Molekulare Masse größer als 2 kDa) unterschieden.
In einer Ausführungsform werden vorzugsweise Liganden mit einer Masse verwendet, die zwischen 2 und 1000 kDa liegt, im einzelnen sind folgende Bereiche für die Masse des sterischen Hindernisses vom Interesse: zwischen 2 und 10 kDa, 10 und 30 kDa, 30 und 100 kDa, 100 und 300 kDa, 300 und 1000 kDa.
In einer weiteren Ausführungsform werden Liganden verwendet, deren Durchmesser zwischen 1 und 3 nm, 3 und 10 nm, 10 und 30 nm, 30 und 100 nm, 100 und 300 nm, 300 nm und 1000 nm, 1000 nm und 5000 nm liegt. In einer weiteren Ausführungsform werden sterisch anspruchsvolle Liganden mit niedriger Molekularer Masse an ein Gerüst gekoppelt und wirken in ihrer Gesamtheit (d.h. die Liganden an sich und das Gerüst) als makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand. Dabei kann die Anzahl der Liganden mit niedriger Masse, gekoppelt an ein Gerüst, beispielsweise zwischen 2 und 200 liegen.
Es ist einem Fachmann naheliegend, dass auch andere Klassifikationen, z.B. die Angabe der chemischen Struktur, Gesamtladung, Beschreibung der Oberflächeneigenschaften, Form, oder geometrischen Abmessungen, bzw. Volumens usw., zur Klassifizierung der Liganden verwendet werden können. Ebenfalls wird als bekannt vorausgesetzt, dass die Moleküle bzw. Nanostrukturen unterschiedliche chemische Gruppen einschließen können.
1.3.19.2.1 Position im des sterischen Hidernisses im modifizierten Nuk-Makromolekül und Kopplung
• In einer bevorzugten Ausführungsform ist der makromolekulare sterisch anspruchsvolle Ligand an den Linker gekoppelt. Die Kopplungsstelle des sterisch anspruchsvollen Liganden kann im Inneren des Linkers liegen oder am Ende des Linkers. In dieser Ausführungsform hat der Marker eine selbständige Kopplungsstelle am Linker, die abweichend von der Kopplungsstelle des sterisch anspruchsvollen Liganden ist.
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der makromolekulare sterisch anspruchsvolle Ligand an den Linker gekoppelt. Der Marker ist seinerseits an diesen makromolekulare sterisch anspruchsvolle Ligand gekoppelt. In dieser
Ausführungsform dient der Ligand als Verbindungsglied zwischen dem Linker und dem Marker. Der Marker kann zum raumfordernden Effekt des sterisch anspruchsvollen Liganden beitragen.
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der sterisch anspruchsvolle Ligand an den Marker gekoppelt. Der Marker kann zum raumfordernden Effekt des sterisch anspruchsvollen Liganden beitragen.
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der sterisch anspruchsvolle Ligand ein Bestandteil des Markers. Beide Strukturen tragen zum raumfordernden Effekt des sterisch anspruchsvollen Liganden bei. Beispielsweise, kann der sterisch anspruchsvolle Ligand als der Kern-Komponente innerhalb von Marker auftreten. • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat der sterisch anspruchsvolle Ligand die Markerfunktion, d.h. der Marker und der sterisch anspruchsvolle Ligand sind identisch.
Die sterisch anspruchsvolle Gruppe kann auch als Teil des Linkers oder als Teil des Markers betrachtet werden. Die Betrachtugnsweise kann beispielsweise davon abhängen, ob sterisch anspruchsvolle Gruppe gewisse Signaleigenschaften aufweist oder nicht.
Die Zahl der an das modifizierte Nuk-Makromolekül gekoppelten makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden kann variieren und liegt beispielsweise zwischen 1 und 3, 3 und 5, 5 und 20, 20 und 50, 50 und 1000. Dabei kann diese Zahl eine exakte oder nur eine durchschnittliche Zahl darstellen.
Der minimale Abstand zwischen der Nuk-Komponente und dem am nächsten liegenden sterisch anspruchsvollen Liganden („sterischen Hindernis") kann variieren zwischen 10 und 10000 Kettenatome und schließt vorzugsweise folgende Bereiche ein: 10 bis 15, 15 bis 20, 20 bis 25, 25 bis 30, 30 bis 35, 35 bis 40, 40 bis 45, 45 bis 50, 50 bis 55, 55 bis
60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis 90, 90 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 1000, 1000 bis
5000, 5000 bis 10000 Kettenatome, bzw. 10 bis 15, 15 bis 20, 20 bis 25, 25 bis 30, 30 bis 35, 35 bis 40, 40 bis 45, 45 bis 50, 50 bis 55, 55 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis
90, 90 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 1000, 1000 bis 5000, 5000 bis 10000 Angström
(berechnet auf maximal gestreckten Zustand des Moleküls).
Allgemeine Bedeutung der Entfernung zwischen dem NT und sterischen Hindernis:
Der Linker schafft den Abstand zwischen der enzymatisch aktiven Nuk-Komponente und dem sterisch anspruchsvollen Liganden. Bei genügendem Abstand, kann die Nuk- Komponente durch die Polymerase in einen Primer(N) (der Primer(N) hat keinen anspruchsvollen Liganden) eingebaut werden. Da nun der Primer(N+i) selbst einen sterisch anspruchsvollen Liganden an seinem 3 '-OH-Ende trägt, hindert dieser sterisch anspruchsvolle Ligand den Einbau von weiteren modifizierten Nuk-Makromolekülen mit sterisch anspruchsvollen Liganden (näheres s. Abschnitt enzymatische Eigenschaften von modifizierten Nuk-Makromolekülen)
1.3.19.2.2 Kopplung eines makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden an den Linker Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und dem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden kann ähnlich zur Kopplung zwischen dem Linker und dem Marker erfolgen. Sie kann sowohl kovalent als auch affine erfolgen. Viele Beispiele sind dem Fachmann bekannt, s. z.B. "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2. „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc.). Kovalente Kopplung : Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein, z.B. bei Temperaturen bis zu 1300C, für pH- Bereiche zwischen 1 und 14, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z.B. Proteasen, Esterasen)sein . In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar.
Beispiele für Ausführungsformen, in denen der makromolekulare sterisch anspruchsvolle Ligand an den Linker gekoppelt ist und der Marker ist seinerseits an den Liganden gekoppelt bzw. der Ligand als Kern-Komponente des Markers auftritt, sind im Abschnitt Beispiele dargestellt.
1.3.19.2.3 Substrateigenschaften der modifizierten Nuk-Makromoleküle: Die Eigenschaften von Nuk-Komponenten gegenüber von Polymerasen können durch sterisch anspruchsvolle Liganden modifiziert werden.
Zur Anschaulichkeit (die Auffassung der Erfinder hat keinen Anspruch auf Vollständigkeit und soll lediglich schematisch die Grundprinzipien der raumfordenen Eigenschaften schildern) kann man die Substrateigenschaften der modifizierten Nuk-Makromoleküle gegenüber den Primer^-Matrize-Polymerase-Komplexen (Primer(N) hat keinen sterisch anspruchsvollen Liganden) dadurch erklären, dass die komplementäre Nuk-Komponente des modifizierten Nuk-Makromoleküls ausreichende Reichweite besitzt und das sterische Hindernis den Einbau dieser Nuk-Komponente in den Primer{N)-Matrize-Komplex durch die Polymerase nicht verhindert.
Nach dem Einbau des ersten modifizierten Nuk-Makromoleküls ändert sich die Situation
(Primer(N+1)):
Das sterische Hindernis nimmt einen Raum in Anspruch, der nicht von einem anderen großen Struktur (z.B. ähnlich großer oder noch größerer sterisch anspruchsvoller Ligand) in Anspruch genommen werden kann. Der effektiv eingenommene Raum setzt sich aus dem Volumen des Moleküls und Einflüssen, die in der Lösung entstehen (z.B. Lösungsmittelhüllen die zu einem hydrodynamischer Durchmesser beitragen), so dass dieser Raum u.U. größer als das tatsächliche Volumen der molekularen Struktur sein kann. Durch die Kopplung des sterischen Hindernisses an das modifizierte Nuk-Makromolekül wird der sterisch anspruchsvolle Ligand in der Nähe der 3 '-OH Gruppe platziert.
Die Substrateigenschaften dieses Komplexes, bestehend aus Matrize, dem verlängerten Primer(N+1), der Polymerase und dem an das endständige Nukleotid gebundene sterische Hindernis kann man folgenderweise zusammenfassen (Fähigkeit, das nächste komplementäre Nukleotid / die nächste komplementäre Nuk-Komponente einzubauen):
• niedermolekulare Nukleotide und deren Derivate haben weiterhin den Zugang zum aktiven Zentrum der Polymerasen (z.B. weitere komplementäre natürliche Nukleotide und deren niedermolekulare Derivate, z.B. mit einem Farbstoff markierte
Nukleotide, z.B. dCTP-Cy) und können eingebaut werden.
• komplementäre Nuk-Komponente der modifizierten Nuk-Makromoleküle haben keinen Zugang zum aktiven Zentrum der Polymerase, da der makromolekulare sterisch anspruchsvolle Ligand des modifizierten Nuk-Makromoleküls nicht in die Nähe der Polymerase gelangen kann weil die Reichweite der Nuk-Komponente durch die Linker-Länge begrenzt ist.
Mit steigenden Abstand vom sterisch anspruchsvollen Liganden, z.B. nach wiederholtem Einbau von natürlichen Nukleotiden in den Primer nach dem modifizierten Nuk- Makromolekül (Primer(N+X)), verringert sich die Wirkung vom sterischen Hindernis, so dass weiteres modifizierten Nuk-Makromolekül erneut eingebaut werden kann. Nach Abspaltung des sterischen Hindernisses von der eingebauten Nuk-Komponente verliert der Primer-Matrize-Polymerase-Komplex (Primer(N+i)) den raumfordenden Liganden, so dass die Zugängigkeit für eine weitere Nuk-Komponente des modifizierten Nuk-Makromoleküls wiederhergestellt wird.
1.3.20 Kompositionen
Als Bestandteil eines Kits, kann die Komposition zur Durchführung eines oder mehreren Verfahrensschritte eine Lösung von einer oder mehreren Substanzen oder auch ein trockes Gemisch sein, was vor dem Verfahrensschritt mit einer Lösung versetzt werden muss.
1.3.21 Feste Phase / Stationäre Phase /Reaktionsoberfläche
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind die an der Reaktion teilnehmende Nukleinsäureketten an einer festen Phase gebunden. Die Bindung kann kovalent oder affin erfolgen. Begriffe „Feste Phase", „Stationäre Phase", "Reaktionsoberfläche" werden in diesem Zusammenhang als Synonyme verwendet, es sei denn, auf eine andere Bedeutung wird hingewiesen. 2. Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung schließt folgende Aspekte ein:
Aspekt 1: Nukleotid-Analoga (modifizierte Nuk-Makromoleküle), die folgende Komponenten einschließen: zumindest eine Nukleotid-Komponente (Nuk-Komponente), zumindest einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden, zumindest einen Marker, zumindest einen Linker.
Aspekt 2: Nukleotid-Analoga (modifizierte Nuk-Makromoleküle), die folgende Komponenten einschließen : zumindest eine Nukleotid-Komponente (Nuk-Komponente), zumindest einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden, zumindest einen Marker, zumindest einen Linker, wobei der jeweilige Linker, der an die Nukleotid- Komponente gekoppelt ist, spaltbar ist.
Aspekt 3: Ein Reaktionsgemisch, das mindestens eines der Nukleotid-Analoga nach Aspekt 1 oder 2 einschließt
Aspekt 4: Eine Komposition, die mindestens eines der Nukleotid-Analoga nach Aspekt 1 oder 2 einschließt: Das Verhältnis zwischen dem Gewichtsanteil des Nukleotid-Analogs und dem Gewicht der Komposition kann folgende Bereiche einschließen: 1: 1000000 bis 1: 100000, 1 : 100000 bis 1: 10000, 1: 10000 bis 1: 1000, 1 : 1000 bis 1:100, 1: 100 bis 1:10, 1 : 10 bis 1.
Aspekt 5: Eine Nukleinsäurekette oder ein Gemisch von Nukleinsäureketten, die mindestens eines der Nukleotid-Analoga nach Aspekt 1 oder 2 als Monomer der Nukeinsäurekette einschließen, wobei sich die Nukleinsäureketten sowohl in der Lösung befinden können oder an einer festen Phase fixiert sein.
Aspekt 6: Eine Nukleinsäurekette oder ein ein Gemisch von Nukleinsäureketten nach Aspekt 5, wobei diese Nukleinsäureketten eine Primer funktion haben.
Aspekt 7: Verfahren zur enzymatischen Synthese von Nukleinsäureketten, bei dem Nukleotid-Analoga nach Aspekt 1 oder 2 eingesetzt werden.
Aspekt 8: Ein Verfahren zur Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Schritte einschließt: o Bereitstellung von extensionsfähigen Matrize-Primer-Komplexen o Inkubation dieser Komplexe in einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Polymerase-Arten und zumindest eine Art der modifizierten Nuk- Makromoleküle nach Aspekt 2 enthält, unter Bedingungen, die eine Primer- Verlängerung um ein modifiziertes Nuk-Makromolekül erlauben, wobei das modifizierte Nuk-Makromolekül in Art und Weise modifiziert ist, dass sein Einbau zu einem Stopp in der weiteren enzymatischen Reaktion führt.
Aspekt 9: Kit zur Durchführung der enzymatischen Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Elemente einschließt: o Eine oder mehrere Arten der Polymerasen o Zumindes eins der Nukleotid-Analoga, nach Aspekt 1 oder 2
Aspekt 10: Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten, das folgende Elemente einschließt: o Eine oder mehrere Arten der Polymerasen o Zumindes eins der Nukleotid-Analoga, nach Aspekt 2
Aspekt 11 : Ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleisäureketten, das folgende Schritte einschließt:
a) Bereitstellung von mindestens einer Population an extensionsfähigen Nukleinsäureketten-Primer-Komplexen (NSK-Primer-Komplexe)
b) Inkubation von mindestens einer Art der modifizierten Nuk-Makromoleküle nach Aspekt 2 zusammen mit zumindest einer Art der Polymerase mit den im Schritt (a) bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären modifizierten Nuk-Makromolekülen zulassen, wobei jede Art der modifizierten Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt.
c) Entfernung der nicht eingebauten modifizierten Nuk-Makromoleküle von den NSK-Primer-Komplexen
d) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen
e) Abspaltung der Linker-Komponente sowie der Marker-Komponente und des makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden von den in die NSK- Primer-Komplexe eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen
f) Waschen der NSK-Primer-Komplexe gegebenenfalls Wiederholung der Schritte (b) bis (f),
Ein weiterer Aspekt 12 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 11, wobei die Nukleinsäureketten an eine feste Phase in zufälliger Anordnung gekoppelt sind und zumindes ein Teil dieser NSK-Primer-Komplexen optisch einzeln adressierbar ist
Ein weiterer Aspekt 13 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 11 zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukleinsäureketten, NSKs), bei dem man
Fragmente (NSKFs) einzelsträngiger NSKs mit einer Länge von etwa 50 bis 1000 Nukleotiden erzeugt, die überlappende Teilsequenzen einer Gesamtsequenz darstellen können, man
die NSKFs unter Verwendung eines einheitlichen oder mehrerer unterschiedlichen Primer in Form von NSKF-Primer-Komplexen auf einer Reaktionsoberfläche in einer zufälligen Anordnung bindet, wobei die Dichte der an die Oberfläche gebudenen NSKF-Primer-Komplexen eine optische Detektion der Signale von einzelnen eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen zuläßt, man
eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der NSKFs unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man
a) zu den auf der Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier modifizierte Nuk-Makromoleküle nach Aspekt 2 enthält, die eine mit fluoreszierenden Elementen markierte Marker-Komponente haben, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei modifizierte Nuk-Makromoleküle jeweils an die Marker-Komponente befindlichen fluoreszierenden Elementen so gewählt sind, dass sich die verwendeten modifizierten Nuk-Makromoleküle durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die modifizierten Nuk-Makromoleküle strukturell so modifiziert sind, dass die Polymerase nach Einbau eines solchen modifizierten Nuk-
Makromoleküls in einen wachsenden komplementären Strang nicht in der Lage ist, ein weiteres Nuk-Nakromolekül in denselben Strang einzubauen, wobei die Linker-Komponente mit der Marker-Komponente und dem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden abspaltbar sind, man
b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein modifiziertes Nuk-Makromolekül verlängert werden, man
c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter modifizierter Nuk-Makromoleküle geeignet sind, man
d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten modifizierten
Nuk-Makromoleküle durch Messen des für den jeweiligen fluoreszierenden Elementen charakteristischen Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man
e) zur Erzeugung unmarkierter NSKFs die Linker-Komponente und die Marker-Komponente, sowie den makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden von den am komplementären Strang angefügten modifizierten Nuk- Komponenten abspaltet, man
f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Marker-Komponente geeignet sind, man die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,
wobei man die relative Position einzelner NSKF-Primer-Komplexe auf der Reaktions- Oberfläche und die Sequenz dieser NSKFs durch spezifische Zuordnung der in Stufe d) in aufeinanderfolgenden Zyklen an den jeweiligen Positionen detektierten Fluoreszenzsignale zu den modifizierten Nuk-Makromolekülen bestimmt.
Ein weiterer Aspekt 14 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 13, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus nur jeweils eine Art der modifizierten Nuk- Makromoleküle einsetzt.
Ein weiterer Aspekt 15 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 13, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils zwei unterschiedlich markierte Arten der modifizierten IMuk-Makromoleküle einsetzt.
Ein weiterer Aspekt 16 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 13, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils vier unterschiedlich markierte Arten der modifizierten Nuk-Makromoleküle einsetzt.
Aspekt 17 : Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach dem Verfahren nach einem der Aspekte 8 oder 11 bis 15, das folgende Elemente einschließt: o Eine oder mehrere Arten der Polymerasen o Zumindes eins der Nukleotid-Analoga, nach Aspekt 2 o Lösungen zur Durchführung von zyklischen Sequenzierungsschritten
Aspekt 18 : Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach dem Verfahren von einem der Aspekte 8 oder 11 bis 15, das einer oder mehrere der folgenden Kompositionen - vorliegend als Lösung in konzentrierter oder in verdünter Form oder auch als Gemisch von trockenen Substanzen - aus der folgenden Liste einschließt: o Eine oder mehrere Arten der Polymerasen o Zumindes eins der Nukleotid-Analoga, nach Aspekt 2 o Lösungen zur Durchführung von zyklischen Sequenzierungsschritten o Komposition für Einbaureaktion / Extensionsreaktion o Komposition für Waschen der festen Phase nach der Einbaureaktion o Komposition für optische Detektion der Signale an der festen Phase o Komposition für Abspaltung des Markers und des sterisch anspruchsvollen makromolekularen Liganden o Komposition für Waschen der festen Phase nach der Abspaltung des Markers und des sterisch anspruchsvollen makromolekularen Liganden o Komposition für Blockade des Linker-Rests o Komposition für Waschen der festen Phase nach der Blockade des Linker
Rests o Komposition zur Bindung von signalgebenden Marker-Einheiten an den Marker o Komposition mit signalgebenen Marker-Einheiten
Aspekt 19 : Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach Aspekt 18, das weiterhin eine oder mehrere Elemente aus der folgende Liste einschließt: o Komposition mit nicht modifizierten Nukleotiden (dNTPs oder NTPs) o Komposition mit irreversibel Terminatoren (ddNTPs) o Komposition mit Terminaler Transferase o Komposition mit einem Puffer für Transferasen-Reaktion o Komposition mit einer Ligase o Komposition von Oligonukleotiden, die als einheitliche Primer-Bindungsstelle an die Nukleinsäuren ligiert werden können. o Komposition mit einem Puffer für Ligsereaktion-Reaktion o Feste Phase und Reagenzien zur Preparation von Nukleinsäureketten zur
Sequenzierung, o Feste Phase und Reagenzien zur Präparation von Polymerase zur Sequenzierung o Vorrichgung und Reagenzien zur Vorbereitung von Nukleotid-Analoga nach
Aspekt 2 zur Sequenzierung. o Komposition mit Blockierungsreagezien zur Unterdrückung von unspezifischen
Adsorption von markierten Molekülen o Feste Phase zur Durchführung von zyklischen Einbaureaktionen
Aspekt 20 : Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach einem der Aspekte 9, 10, 17, 18 oder 19, das eine oder mehrere Polymerasen aus der folgenden Liste einschließt: o Reverse Transcriptasen : M-MLV, RSV, AMV, RAV, MAV, HIV o DNA Polymerasen : Klenow Fragment DNA Polymerase, Klenow Fragment exo minus DNA Polymerase, T7 DNA Polymerase, Sequenase 2, Vent DNA Polymerase, Vent exo minus DNA Polymerase, Deep Vent DNA Polymerase, Deep Vent exo minus DNA Polymerase, Taq DNA Polymerase, TIi DNA Polymerase, Pwo DNA Polymerase, Thermosequenase DNA Polymerase, Pfu DNA Polymerase
Aspekt 21 : Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach einem der Aspekte 9, 10, 5 17, 18 oder 19, in dem die Bestandteile der Kompositionen breits gemischt sind oder als getrennte Substanzen vorliegen.
Aspekt 22: Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach einem der Aspekte 9, 10, 17, 18 oder 19, das eine oder mehrere feste Phasen zur Durchführung von zyklischen LO Sequenzierungsschritten aus der folgenden Liste einschließt: o Plane, transparente feste Phase o Plane, transparente feste Phase, die als Bestandteil einer Flow-Cell oder eines
Chips bereitgestellt ist o Feste Phase in Form von Nano- oder Mikrokügelchen
L5 o Feste Phase in Form von Nano- oder Mikrokügelchen, die paramagnetisch sind o Feste Phase vorbereitet nach DE 101 49 786 o Feste Phase vorbereitet nach DE 10 2004 025 744
Aspekt 23: Ein Verfahren zur Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Schritte 10 einschließt: a) Bereitstellung von extensionsfähigen Matrize-Primer-Komplexen b) Einbaureaktion: Inkubation dieser Komplexe in einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Polymerase-Arten und zumindest eine Art der modifizierten Nuk- Makromoleküle nach Aspekt 2 enthält, unter Bedingungen, die eine Primer-
.5 Verlängerung um ein modifiziertes ein Nuk-Makromolekül erlauben, wobei das modifizierte Nuk-Makromolekül in Art und Weise modifiziert ist, dass sein Einbau zu einem Stopp in der weiteren enzymatischen Reaktion führt. c) Inkubation der Matrize-Primer-Komplexe unter den Bedingungen die zur Trennung der oben genannten Primer mit eingebauten Nukleotid-Analoga von den Matrizen
50 führen. d) Optionelle Wiederholung der Schritte (b) und (c) e) Applikation der erhaltenen markierten Primer auf ein Trennmedium oder in ein Trennverfahren f) Gegebenenfalls Identifizierung der Art des eingebauten Nukleotid-Analoges 55
Die zyklischen Schritte können mehrmals wiederholt werden, beispielsweise 2 bis 10 mal, 10 bis 20 mal, 20 bis 100 mal, 100 bis 500 mal. Die Identifizierung der eingebauten Nukleotid-Analoga erfolgt durch den Marker. Aspekt 24: Ein Verfahren zur Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Schritte einschließt: a) Bereitstellung von extensioinsfähigen Matrize-Primer-Komplexen, die adressierbare Positionen haben b) Einbaureaktion : Inkubation dieser Komplexe in einer Reaktionslösung, die zumindes eine Polymerase-Art und zumindest eine Art der modifizierten Nuk-Makromoleküle nach Aspekt 24 enthält, unter Bedingungen, die eine Primer-Verlängerung um ein modifiziertes Nuk-Makromolekül erlauben, wobei das modifizierte Nuk- Makromolekül in Art und Weise modifiziert ist, dass sein Einbau zu einem reversiblen Stopp in der weiteren enzymatischen Reaktion führt. c) Gegebenenfalls Verwendung von Reinigungsschritten von Matrize-Primer- Komplexen d) Gegebenenfalls Identifizierung der Art des eingebauten Nukleotid-Analoges durch Erfassung der Markereigenschaften, wobei eine örtliche Zuordnung der Signale zu bestimmen Primer-Matrize-Komplexen erfolgen kann e) Entfernung des zur Termination führenden makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden und gegebenenfalls des Markers f) Falls erforderlich Verwendung von Reinigungsschritten von Matrize-Primer- Komplexen g) Gegenebenfalls Wiederholung der Schritte (b) bis (f) und anschließende Analyse der identifizierten Signale von eigebauten Nukleotid-Analoga.
Die zyklischen Schritte können mehrmals wiederholt werden, beispielsweise 2 bis 10 mal, 10 bis 20 mal, 20 bis 100 mal, 100 bis 500 mal. Die Identifizierung der eingebauten Nukleotid-Analoge erfolgt durch den Marker.
Aspekt 25 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga (modifizierte Nuk-Makromoleküle) mit der Zusammensetzung nach Aspekt 1 oder 2, wobei folgende Anordnungen der Komponenten eingeschlossen werden:
(N u k- Linker l)n-(Ligand)k-(Marker)m (Nuk-Linker l)n-(Ligand-Linker 3)k -(Marker)m (Nuk-Linker l)n-(Ligand)k -(Linker 3-Marker)m (Nuk-Linker l)n-(Marker)m-(Ligand)k (Nuk-Linker l-Ligand)n-(Marker)m (Ligand-Linker 2-Nuk-Linker l)n-(Marker)m (Nuk-Linker l)n-(Marker/Ligand)m (Nuk-Linker l-Ligand)n-(Marker)m-(Linker 1-Nuk)n
wobei:
Nuk - eine Nuk-Komponente ist Linker - eine Linker-Komponente ist, wobei Linker 1 oder Linker 2 oder Linker 3 gleiche oder auch unterschiedliche Struktur haben können Marker - eine Makrer-Komponente ist
Ligand - ein makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand ist
Marker/Ligand - eine Struktur, die sowohl Marker-Eigenschaften als auch Eigenschaften eines makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden hat
(n) - eine Zahl von 1 bis 100000 ist.
(m) - eine Zahl von 1 bis 1000
(k) - eine Zahl von 1 bis 1000
Wobei in einer Ausführungsform der Strukturen, die Verhältnisse im Molekül folgendermassen verteilt sind: (n)> = (m)> = (k), wobei die einzelnen Zahlen unabhängig von einander variiert werden können.
In einer weiteren Ausführungsform der Struktur, die Verhältnisse im Molekül folgendermassen verteilt sind : (n)>(m)>(k), wobei die einzelnen Zahlen unabhängig von einander variiert werden können.
In einer weiteren Ausführungsform der Struktur, die Verhältnisse im Molekül folgendermassen verteilt sind: (n) = <(m)>(k), wobei die einzelnen Zahlen unabhängig von einander variiert werden können.
Ein weiterer Aspekt 26 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte 1, 2 oder 25, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (Fig. 3A) :
Wobei:
Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren Modifikationen, wobei L die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente darstellt (Kopplungseinheit L) und X die Kopplungsstelle der Kopplungseinheit L an der Base ist
Ri - ist H R2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe
R3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, PO3, SH, N3, NH2, 0-R3-1, P(O)m-R3-i (m ist 1 oder 2 ist), NH-R3-1, S-R3-1, Si-R3-I wobei R3-1 eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist, oder eine der folgenden Modifikationen einschließt: -CO-Y, -CH2-O-Y, -CH2-S-Y, -CH2-N3, -CO-O- Y, -CO-S-Y, -CO-NH-Y, -CH2-CH=CH2, wobei Y ein Alkyl ist, beispielsweise (CH2)n- CH3 wobei n zwischen O und 4 liegt, oder ein substituiertes Alkyl ist, beispielsweise mit Halogen, Hydroxy, Amino, Carboxy-Gruppen). R4 - ist H oder OH
R5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH-Gruppe, eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine Triphosphat- Gruppe, oder eine Alpha-Thiotriphosphat-Gruppe ist. eiterer Aspekt 27 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekteder 25, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (Fig. 3B) :
Wobei :
Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen
R1 - ist H
R2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, HaI, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe
R3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O- R3-2-L, P(0)m- R3-2-L, wobei m 1 oder 2 ist, NH-R3-2-L, S-R3-2-L, Si-R3-2-L oder, wobei R3-2 die Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid bzw. Nuk-Komponente ist und L - die Kopplungseinheit des Linkers (L) ist.
R4 - ist H oder OH
R5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH-Gruppe, eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine Triphosphat-
Gruppe, oder eine Alpha-Thiotriphosphat-Gruppe ist. eiterer Aspekt 28 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekteder 25, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (Fig. 3B) :
Wobei : Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen
R1 - ist H R2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, HaI, NH2, SH oder geschützte
OH-Gruppe
R3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, HaI, PO3, SH7 NH2, O- R3-I, P(0)m- R3-i, NH-R3-I, S-R3-I, Si-R3-I wobei R3-I eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist und m 1 oder 2 ist.
R4 - ist H oder OH
R5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O- R5-1-L, oder P-(O)3- R5-1-L (modifizierte Monophosphat-Gruppe), oder P-(O)3-P-(O)3-R5-I-L (modifizierte
Diphosphat-Gruppe) oder P-(O)3-P-(O)3-P-(O)3- R5-I-L (modifizierte Triphosphat-Gruppe), wobei R5-I die Kopplungsstelle der Kopplungseinheit L an das Nukleotid bzw. Nuk-Komponente ist und Kopplungseinheit L die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente ist. eiterer Aspekt 29 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte 28, wobei Kopplungseinheit L folgende strukturelle Elemente einschließt:
R6-NH-R7, R6-O-R7, R6-S-R7, R6-SS-R7, R6-CO-NH-R7, R6-NH-CO-R7, R6-CO-O-R7, R6-O-CO-R7, R5-CO-S-R7, R6-S-CO-R7, R6-P(O)2-R7, R6-Si-R7, R6-(CH2)n-R7,
R6-(CH2)n-R7, R6-A-(CH2)n-R7, R6-(CH2)n-B-R7,
R6-(CH=CH-VR7, R6-(A-CH=CH-)n-R7, R6-(CH = CH-B-)n-R7, R6-(CH=CH-CH2-B-V
R7, R6-A-CH=CH-(CH2-VR7, R6-(-CH = CH-CH2)n-B-R7,
R6-(C≡C-)n-R7, R6-(A-C≡C-)n-R7, R6-(A-C^C-CH2VR7, R6-(C≡C-B-)n-R7, R6-(C≡C-CHz-B-)n-R7, R6-A-C≡C-(CH2-)n-R7, R6-(-C≡C-CH2)n-B-R7,
R6-(-C≡C-CH2-CH2)n-B-R7 wobei R6 - die Nuk-Komponente ist, R7 - der Linkerrest ist und A und B unabhängig folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -0-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH- CO-, -CO-O-, -0-C0-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O)2-, -Si-, -(CH2)n-, eine photolabile Gruppe, wobei n - gleich 1 bis 5 ist
Ein weiterer Aspekt 30 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte 25 bis 28, wobei die Linker-Komponente ein wasserlösliches Polymer einschließt.
Ein weiterer Aspekt 31 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekt 30, wobei die Linker-Komponente wasserlösliche Polymere unabhängig ausgewählt aus folgender Gruppe einschließt:
Polyethylen-glycol (PEG), Polysaccharide, Dextran, Polyamide, Polypeptide, Polyphosphate, Polyacetate, Poly(alkyleneglycole), Kopolymere aus Ethylenglycol und Propylenglycol, Poly(olefinische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone),
Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(x- Hydroxy-Säuren), Poly-Acrylsäure, Poly-Acrylamid, Poly(Vinylalkohol).
Ein weiterer Aspekt 32 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte 1, 2, 25 bis 31, wobei die Linker-Komponente eine durchschnittliche Länge zwischen 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10000, 10000 bis 100000, 100000 bis 500000 Atomen hat.
Ein weiterer Aspekt 33 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte 1,2, 25 bis 32, wobei der Marker oder eine Marker-Komponente eine signalgebende, signalvermittelnde, katalytische oder affine Funktion hat, oder die Funktion des makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden hat
Ein weiterer Aspekt 34 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte 25 bis 33, wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines oder mehrere der folgenden strukturellen Elemente einschließt:
Biotin, Hapten, radioaktives Isotop, seltenes Erdenelement, Farbstoff, Fluoreszenzfarbstoff.
Ein weiterer Aspekt 35 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte 25 bis 33, wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines oder mehrere der folgenden Elemente einschließt: Nanokristalle oder deren Modifikationen, Proteine oder deren Modifikationen, Nukleinsäureketten oder deren Modifikationen, Teilchen oder deren Modifikationen.
Ein weiterer Aspekt 36 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekt 35, wobei eine strukturelle Marker-Einheit eines der folgenden Proteine einschließt:
Enzyme oder deren Konjugate oder Modifikationen, Antikörper oder deren Konjugate oder Modifikationen, Streptavidin oder seine Konjugate oder Modifikationen, Avidin oder seine Konjugate oder Modifikationen
Aspekt 37 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte 1, 2 25 bis 36, bei dem als makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand folgende Strukturen einschließet: Proteine, Dendrimere, Nanoteilchen, Mikroteilchen oder deren Modifikationen.
Oben angeführte Verfahren können in besonderen Ausführungsformen zur Identifizierung von Nukleinsäuren oder zur Identifizierung der Zusammensetzung, d.h. Abfolge der Nukleotide, der Nukleinsäuren eingesetzt werden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung können die Verfahren durchgeführt werden, indem man die Stufen der Einbaureaktion, Schritt (b), mehrfach wiederholt, wobei man a) in jedem Schritt nur jeweils ein markiertes modifiziertes Nuk-Makromoleküls, b) in jedem Schritt jeweils zwei unterschiedlich markierte modifizierte Nuk- Makromoleküle oder c) in jedem Schritt jeweils vier unterschiedlich markierte modifizierte Nuk- Makromoleküle
verwendet. Bei mehrfachen Kombinationen von modifizierten Nuk-Makromolekülen, trägt jede Art der modifizierten Nuk-Makromolekülen eine für sie spezifische Markierung.
Die Aufteilung der Verfahren in einzelne Schritte ist funktionell und soll anschaulich die Struktur des Verfahrens abbilden. Jeder von den oben genannten Schritten kann als einzelner selbständiger Schritt im Verfahren durchgeführt werden oder in weitere Schritte zerlegt werden. Matrize:
Die Matrize kann DNA oder RNA Moleküle darstellen. Die Matize kann eine einheitliche Population von Nukleinsäuremolekülen darstellen oder ein Gemisch von Nukleinsäuren mit unterschiedlichen Sequenzen sein.
5 Vorzugsweise liegt die Matrize in einzelsträngiger Form vor. Falls eine doppelsträngige Matrize vorliegt, können Matrizen-Primer-Komplexe durch Denaturierung der Matrize und eins anschließende Hybridisierung des Primers erfolgen.
Die Matrize schließt unter anderem folgende Nukleinsäure ein: definierte Amplifikate (z.B. PCR- Produkte), cDNA, Fragmente der genomischen DNA oder RNA (auch Produkte der
LO Amplifikationsreaktionen), mRNA. Es können virale, bakterielle oder eukaryontische Nukleinsäureketten verwendet werden.
In einer Ausführugsform liegt die Matrize frei in der Lösung vor. In einer andren Ausführungsform ist die Matrize an einer festen Phase gebunden (durch kovalente, affine oder eine andere Art der Kopplung). Die Fixierung an der festen Phase kann dabei in einer
L5 bestimmten Anordnung wie z.B. bei Microarray oder unter Verwendung von Beads mit spezieller Kodierung erfolgen ("Microarray biochip technology" 2000 M.Schena Eaton Publishing, "DNA Microarrays" 1999 M. Schena Oxford University Press, Fodor et al. Science 1991 v.285 S.767, Timofeev et al. Nucleic Acid Research (NAR) 1996, v.24 S.3142, Ghosh et al. NAR 1987 v.15 S.5353, Gingeras et al. NAR 1987 v.15 S.5373, Maskos et al. NAR
10 1992 v.20 S.1679), oder in zufälliger Anordnung erfolgen, wie z.B. in WO 02088382, DE 10 2004 025 696, DE 101 20 798, DE 102 14 395.
Primer bzw. Oligonukleotide mit der Primer-Funktion:
Der Primer stellt ein Oligodeoxinukelotid oder ein Oligoribonukleotid dar. i5 In einer Ausführungsform des Verfahrens werden einheitliche Primer verwendet. In einer anderen Ausführungsform werden Primer mit unterschiedlichen Sequenzen verwendet. Die Zusammensetzung und die Länge des Primers sind nicht eingeschränkt. Außer der Startfunktion kann der Primer auch andere Funktionen übernehmen, wie z.B. eine Verbindung zur Reaktionsoberfläche zu schaffen. Der Primer kann beispiesweise Abschnitte
SO der Nukleinsäuren enthalten, die nicht zu Matrize komplementär sind und beispielsweise zu Bindung des Primers an einer feste Phase dienen. Primer sollten so an die Länge und Zusammensetzung den Primerbindungsstellen in den Matrizen angepaßt werden, dass der Primer den Start der Sequenzierungsreaktion mit der jeweiligen Polymerase ermöglicht. In einer Ausführungsfrom der Erfidung bindet der Primer komplementär an die
55 entsprechende Primerbindungsstelle in der Matrize. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung hat der Primer zumindest eine nicht komplementäre Stelle zu der Primerbindungsstelle in der Matrize. Bei der Verwendung unterschiedlicher, beispielsweise natürlich in der ursprünglichen Gesamtsequenz vorkommender Primerbindungsstellen, werden die für die jeweilige Primerbindungsstelle sequenzspezifischen Primer verwendet. Bei einer einheitlichen, beispielsweise durch die Ligation an die NSKFs angekoppelten Primerbindungsstelle kann ein einheitlicher Primer verwendet werden.
Vorzugsweise beträgt die Länge des Primers zwischen 6 und 100 NTs, optimalerweise zwischen 10 und 50 NTs. Der Primer kann eine Funktionsgruppe tragen, die zur Immobilisierung des Primes oder Primer-Matrize dient, beispielsweise ist eine solche Funktionsgruppe eine Biotingruppe. Die Synthese eines solchen Primers kann z.B. mit dem DNA-Synthesizer 380 A Applied Biosystems ausgeführt werden oder aber als Auftragssynthese bei einem kommerziellen Anbieter, z.B. MWG-Biotech GmbH, Germany erstellt werden).
Die Oligonukleotide können mit verschiedenen Techniken fixiert oder direkt auf der Oberfläche synthetisiert werden, beispielsweise nach (McGaII et al. US Patent 5412087, Barrett et al. US Patent 5482867, Mirzabekov et al. US Patent 5981734, "Microarray biochip technology" 2000 M.Schena Eaton Publishing, "DNA Microarrays" 1999 M. Schena Oxford University Press, Fodor et al. Science 1991 v.285 S.767, Timofeev et al. Nucleic Acid Research (NAR) 1996, v.24 S.3142, Ghosh et al. NAR 1987 v.15 S.5353, Gingeras et al. NAR 1987 v.15 S.5373, Maskos et al. NAR 1992 v.20 S.1679).
Die Primer können auf der Oberfläche beispielsweise in einer Dichte zwischen 10 bis 100 pro 100 μm2, 100 bis 10.000 pro 100 μm2 oder 10.000 bis 1.000.000 pro lOOμm2 gebunden werden.
Der Primer oder das Primergemisch wird mit Matrize unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert, die ihn selektiv an die Primerbindungsstelle des Matrize binden lassen. Die Optimierung der Hybridisierungsbedingungen hängt von der genauen Struktur der Primerbindungsstelle und des Primers ab und läßt sich nach Rychlik et al. NAR 1990 v.18 S.6409 berechnen. Im folgenden werden diese Hybridisierungsbedingungen als standardisierte Hybridisierungsbedingungen bezeichnet.
Die Reaktionsgemische im Einbauschritt / Extensionsschritt können folgende Komponenten einschließen:
• eine wässrige Lösung,
• optionales Vorliegen geeigneter Puffersubstanzen (z.B. Tris-Puffer, Phosphat-Puffer, Acetat-Puffer, HEPES-Puffer, MOPS-Puffer, Borat-Puffer); Die Konzentration der Substanzen liegt vorzugsweise zwischen 10 mM und 200 mM, der pH-Wert der Lösung liegt vorzugsweise zwischen 5 und 10.
• optionales Vorliegen von monovalenten Metallionen (Na+, K+, Li+)
• optionales Vorliegen von divalenten Metallionen (z.B. Mg2+, Mn2+ oder Co2+) • optionales Vorliegen von organischen Lösungsmittel (z.B. DMF, DMSO) oder weiteren organischen Substanzen die üblicherweise bei Einbaureaktionen eingetzt werden, wie Glycerin, Tween 20, (weitere Angaben s. Hersteller-Hinweise für einzelne Polymerasen).
• optionales Vorliegen von nicht modifizierten Nukleotiden (z.B. dCTP, dATP, dGTP, dTTP, dUTP, ATP, CTP, GTP, UTP) oder konventionell modifizierten Nukleotide (z.B.
Biotin-16-dUTP, Cy3-dCTP oder Digoxigenin-dUTP)
• optionales Vorliegen einer oder mehreren Polymerase-Arten, die ein Nukleotid in einer matrizenabhängigen enzymatischen Reaktion an den Primer im Primer- Matrizen-Komplex ankoppeln können. Die Polymerasen können prozessive oder distributive Eigenschaften bei der Synthese aufweisen.
• Vorliegen von modifizierten Nuk-Makromolekülen, wobei o nur jeweils ein markiertes modifiziertes Nuk-Makromoleküls, o jeweils zwei unterschiedlich markierte modifizierte Nuk-Makromoleküle oder o jeweils vier unterschiedlich markierte modifizierte Nuk-Makromoleküle * vorliegen.
• Optionales Vorliegen eines oder mehreren weiteren Proteine, die an einen von den Reaktionkomponenten binden können, z.B. Signle Strand binding Protein, z.B. Elongationsfaktoren.
• Optionales Vorliegen von Marker-Einheiten oder Marker-Komponenten.
Temperatur-Bedingungen können zwischen einzelnen Schritten der erfindungsgemäßen Verfahren gleich bleiben oder sich unterscheiden. Sie liegen vorzugsweise zwischen 100C und 95°C.
Reinigungsschritte
Diese Schritte stellen eine optionale Reinigung von Matrize-Primer-Komplexen mit eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen von den freien modifizierten Nuk- Makromolekülen in der Lösung dar. Diese Reinigung kann beispielsweise durch Waschen der an einer festen Phase gebundenen genannten Matrize-Primer-Komplexen mit eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen erfolgen. Das Waschen kann beispielsweise mit einer Pufferlösung erfolgen. Die im Schritt (b) eingesetzten modifizierten Nukleotid-Analoga (modifizierten Nuk- Makromolekülen) in den oben genannten Verfahren sind modifizierten Nuk-Makromoleküle, die zumindest einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden einschließen, der nach dem Einbau eines modifizierten Nuk-Makromoleküls den weiteren enzymatischen Einbau von solchen modifizierten Nuk-Makromolekiilen stoppt oder maßgeblich behindert. Die Effeizienz der Hinderung des weiteren Fortschreitens der Einbaureaktion ist vorzugsweise höher als 70%.
Für Sequenzierungsverfahren werden reversible Terminatoren mit Terminationseffizienzen bevorzugt, die folgende Bereiche einschließen: 80 - 100%, 90 - 100%. Besonders bevorzugt sind reversible Terminatoren mit Terminationseffizienzen in Bereichen von 95 - 100%, 97-100%, 99-100%.
Trennmedium oder Trennverfahren (Aspekt 23)
Das Ziel der Trennung kann beispielsweise die Analyse von Einbauereignissen von modifizierten Nuk-Makromolekülen an Primern darstellen. Bei Vorliegen mehrerer unterschiedlicher Oligonukleotide (mit Primerfunktion) in der Reaktion ist eine gleichzeigite
Analyse der Ergebnisse angestrebt. Als Trennmedium kann beispielsweise eine feste Phase mit immobilisierten Oligonukleotiden dienen, die spezifische Sequenzen im Oligonukleotid
(das als Primer aufgetreten ist) erkennen können. Eine solche feste Phase kann beispielsweise als ein- oder zweidimensionales Array (z.B. Microarray) vorliegen. Die
Reinigung der festen Phase erfolgt somit durch Waschen des Arrays.
Als weiteres Trennmedium können Gele (z.B. Agarose oder Polyacrylamid-Gele) auftreten.
Als Trenverfahren können Ultrafiltraiton, unterschiedliche Arten der Chromatographie (z.B.
Affinitätschromatographie) oder Spektroskopie (z.B. Massenspektroskopie).
Stand der Technik zu Möglichkeiten der Reaktionskontrolle von Polymerasen:
1. Blockade der 3 '-Position
Eine weitere Möglichkeit, enzymatische Reaktion zu kontrollieren, besteht in der Verwendung von modifizierten Substraten, beispielsweise Dideoxy-Nukleotiden. Die Verwendung von markierten Dideoxy-Nukleotiden führt zu einem Einbau von nur einem Nukleotid, da die für eine weitere Synthese notwendige 3" -OH-Gruppe fehlt. Der größte Nachteil dieser Methode der Reaktionskontrolle besteht in einer irreversiblen Blockade der Synthese am gegebenen Strang der Nukleinsäure. Die naheliegende Überlegung, an die 3 " -Hydroxylgruppe eine leicht abspaltbare Gruppe zu koppeln und dadurch eine Umkehr in der Termination zu verwirklichen, führte bei vielen Arbeitsgruppen nicht zum gewünschten Erfolg. Viele derart modifizierten Nukleotide verloren ihre Substrateigenschaften für die Polymerasen. Andere modifizierte Nukleotide überstanden die Bedingungen der enzymatischen Reaktion nicht und verloren ihre Marker während der Synthese (Canard et al. PNAS 1995 v.92 S.10859). Die engen räumlichen Verhältnisse im aktiven Zentrum von Polymerasen stellen sehr hohe Ansprüche an die modifizierte Nukleotide.
2. Sterisches Hindernis Viele in der modernen Forschung eingesetzten kleinmolekulare Marker stellen ein sterisches Hindernis für die Enzyme dar. Biotin, Digoxigenin und Fluoreszenzfarbstoffe wie Fluoreszein, Tetramethylrhodamine, Cy3-Farbstoff stellen Beispiele einer sterisch anspruchsvollen Gruppe dar (Zhu et al. Cytometry 1997, v.28, S.206, Zhu et al. NAR 1994, v.22, S.3418, Gebeyehu et al., NAR 1987, v.15, S.4513, Wiemann et al. Analytical Biochemistry 1996, v.234, S.166, Heer et al. BioTechniques 1994 v.16 S.54). Die Distanz zwischen dem Marker (sterisch anspruchsvollen Gruppe) und dem enzymatisch aktiven Teil des Moleküls (die Nukleotid-Einheit) beträgt dabei nur wenige Angström, da üblicherweise Unker von 5 bis 20 Kettenatomen verwendet werden. Je nach Position und Zugängigkeit des aktiven enzymatischen Zentrums des Enzyms (das aktive Zentrum kann tief im Inneren des Enzyms oder an seiner Oberfläche liegen) haben die kleinmolekularen Marker einen direkten Kontakt zum aktiven Zentrum oder stehen in unmittelbarer Nähe zu ihm. Der direkte Kontakt oder auch die Nähe kann zur Beeinträchtigung des enzymatischen Prozesses führen, im Falle von Polymerasen zur Behinderung der weiteren Synthese. Durch den direkten Kontakt bzw. die Nähe der kleinmolekularen Marker kann auch der Einfluss von Marker-Molekülen auf den enzymatischen Prozess erklärt werden (Tcherkassov WO 02088382). Zusammenfassend kann man feststellen, dass bisher nur die Möglichkeiten der Steuerung der Reaktion innerhalb der Polymerase (entweder durch Modifizierung von Nukleotid- Bestandteilen am Zucker (z.B. an der 3 '-Positioin) oder an der Basen durch niedermolekulare Liganden ausgetestet wurde: terminierenden Gruppen waren entweder direkt im aktiven Zentrum der Polymerase oder in ihrer unmittelbaren Nähe. Dabei haben diese chemischen Gruppen ein niedriges Molekulargewicht.
Einzelne molekulare Strukturen haben ihre Abmessungen (z.B. Länge, Breite, Höhe, Volumen usw.) im Bereich von einzelnen Nanometern bzw. Bruchteilen davon. Daher können sogar Unterschiede von wenigen Angström bzw. Nanometer einen deutlichen Effekt hervorrufen. Zur differenzierten Betrachtung von potenziellen Mechanismen zur Steuerung von biologisch aktiven Molekülen (im gegebenen Fall können Polymerasen als molekulare Kopiermaschienen betrachtet werden) müssen diese Dimensionen herangezogen werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es gelungen, den Prozess der enzymatischen Einbaureaktion durch makromolekulare Liganden kontrolliert zu beeinflussen, wobei die Makromoleküle nicht in unmittelbaren Umgebung des aktiven Zentrums der Polymerase liegen. Insbesondere im neuen Bereich der Bionanotechnologie und der Arbeit mit einzelnen Molekülen erscheint der Einsatz der vorliegenden Erfindung besonders wichtig.
Die Erfindung besteht in einer Ausführungsform darin, dass ein Verfahren zur Steuerung der enzymatischen Synthese-Reaktion bereitgestellt wird. Dieses Verfahren ist charakterisiert durch die Anwendung von modifizierten Nuk-Makromolekülen, die makromolekulare sterisch anspruchsvolle Liganden tragen, in der enzymatischen Synthese-Reaktion. Die makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden haben erfindungsgemäß eine Masse, die mehr als 2 kDa beträgt. In dieser Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Kontrolle der enzymatischen Synthese durch einen sterisch anspruchsvollen makromolekularen Liganden, der sich nach dem Einbau der Nukleotid- Komponente außerhalb des Polymerase-Moleküls befindet.
Schematisch sind diese Verhältnisse in Fig. 8 bis 11 dargestellt.
Die Zeichnungen sollen lediglich schematisch den erfinderischen Gedanken illustrieren und erheben keinen Anspruch auf Vollständigkeit der Angaben.
Das eingebaute modifizierte Nuk-Makromolekülenträgt einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden. Dieser sterisch anspruchsvolle Ligand lässt keinen weiteren Liganden in die Nähe der Polymerase. Bei einer entsprechend gewählten Linker-Länge kann kein weiteres modifiziertes Nuk-Makromolekül eingebaut werden. Der Linker ist schematisch in einem ausgedehnten Zustand in voller Länge gezeigt. Mit anderen Worten die raumforderenden Eigenschffen des sterisch anspruchsvollen Liganden (bedingt beispielsweise durch seine Größe) hindert weitere modifizierte Nuk- Makromoleküle mit ähnlich großen Liganden daran, in die Nähe des aktiven Zentrums der Polymerase zu gelangen. Die weitere Reaktion wird blockiert.
Änderung der räumlichen Verhätnisse um die Polymerase herum, beispielsweise durch Bindung weiterer Proteinen an die DNA oder Polymerase, kann eventuell zu notwendigen Änderungen in der Linker-Länge zwischen der Nukleotid-Komponente und dem sterischen Hindernis führen.
In vielen Fällen kann folgende Regel für das räumliche Potenzial für die Linker-Länge angewendet werden: je größer die Linker-Länge zwischen der Nukleotid-Komponente und dem sterisch anspruchsvollen Liganden, desto größerer sterisch anspruchsvoller Ligand wird für die Hinderung der weiteren Synthese benötigt. Die kleineren Liganden können ihre Wirkung mit der zunehmenden Linker-Länge zwischen der Nukleotid- Komponente und sterischem Liganden verlieren.
Das Prinzip des Verfahrens zur Steuerung des enzymatischen Einbaus durch modifizierte Nuk-Makromoleküle wird am Beispiel eines Models für die Primer-Extension-Reaktion erklärt. Dieses Model wird schematisch dargestellt und dient lediglich der Anschaulichkeit.
• An der Primer-Extensions-Reaktion sind folgende Komponenten beteiligt: o Matrize-Primer-Komplex (Primer(N)) o DNA-Polymerase o Nukleotide (nicht modifiziert oder modifiziert mit einem sterisch anspruchsvollen Liganden). o Lösung mit Puffer-Substanzen und divalenten Metallionen
• Die Steuerung des Fortschrittes der enzymatischen Reaktion erfolgt durch den Einsatz von modifizierten Nuk-Makromolekülen. • Nach dem Einbau eines solchen Nukleotid-Analogs verhindert der sterisch anspruchsvolle Ligand die Annäherung eines anderen sterisch anspruchsvollen Liganden an das nukleotidbindende Zentrum der Polymerase. Da aber ein weitere Nuk-Komponente mit einem solchen Liganden über einen relativ kurzen Linker gekoppelt ist, wird gleich auch die Annäherung des Nukleotides gehindert. Dadurch wird der Einbau eines weiteren modifizierten Nuk-Makromoleküls unmöglich.
• Dabei ist die Kombination der Linker-Länge und der sterischen Eigenschaften des Liganden wichtig. Die genaue Kombination kann variieren, wobei als Richtlinien für die Wahl der passenden Kombination folgende Optimierungsstrategien dienen können. Sowohl der sterisch anspruchsvolle Ligand als auch Linker können angepasst werden:
• Strategie I: Ausgangsparameter ist der sterisch anspruchsvolle Ligand. o Bei einem gegebenen anspruchsvollen Liganden, sollten unterschiedliche
Linker-Längen ausgetestet werden:
■ Bei einem geeigneten Linker wird nur ein solches Nukleotid-Analog eingebaut
■ Bei einem zu kurzem Linker ist der Einbau komplett gehemmt ■ Bei einem zu langem Linker können mehrere Nukleotid-Analoge mit sterisch anspruchsvollen Gruppen eingebaut werden.
• Strategie II: Ausgangsparameter ist der Linker. o Bei einem gegebenen Linker, sollten unterschiedliche Größen des sterisch anspruchsvollen Liganden ausgetestet werden: ■ Bei einem geeigneten Liganden wird nur ein solches Nukleotid-
Analog eingebaut
Bei einem zu kleinem Liganden können mehrere Nukleotid-Analoge mit sterisch anspruchsvollen Gruppen eingebaut werden.
Im Rahmen einer Reaktion können alle modifizierten Nuk-Makromoleküle gleiche oder auch unterschiedliche sterisch anspruchsvolle Liganden tragen. Das Entscheidende für die Reaktionskontrolle ist dabei die Effektivität der blockierenden Wirkung der Liganden untereinander.
Die Kontrolle der Reaktion beinhaltet in einer Ausführungsform die Möglichkeit der Reversibilität der Blockade der Reaktion. Unter Verwendung von bekannten spaltbaren Gruppen zwischen dem Linker und dem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden, kann die Reversibilität der Blockade der weiteren Reaktion erreicht werden.
Anwendungen
Das erfindungsgemäße Verfahren zur schrittweise ablaufenden enzymatischen Synthesereaktion von Nukleinsäuren kann beispielsweise in Technologien zur Analyse der genetischen Information eingesetzt werden (WO 02088382, DE 10 2004 025 696, DE 101 20 798, DE 102 14 395). Diese Analyse verläuft in einer bevorzugten Ausführungsform auf Einzelmolekülabene, d.h. Sequenzen von einzelnen Molekülen von Nukleinsäuren werden identifiziert.
In einer besonderen Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren beim Verfahren zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen bzw. Nu- kleinsäureketten, NSKs verwendet, das folgende Schritte einschließt:
1. Bereitstellung einer festen Phase
2. Bindung von zu analysierenden Nukleinsäureketten an die feste Phase unter Ausbildung extensionsfähiger Primer-Matrize-Komplexe,
3. Durchführung einer zyklischen Reaktion mit den auf der festen Phase fixierten Primer-Matrize-Komplexen, die folgende Schritte einschließt:
3.1 enzymatischer Einbau von modifizierten Nuk-Makromoleküle an den gebildeten Primer-Matrize-Komplexen mittels einer Polymerase,
3.2 Waschen der festen Phase
3.3 Detektion der Markierung von eingebauten markierten modifizierten Nuk-Makromolekülen, wobei relative Koordinaten einzelner Signale identifiziert werden 3.4 Entfernung der Signale von eingebauten modifizierten Nuk-
Makromolekülen,
3.5 Waschen der festen Phase
3.6 gegebenenfalls Wiederholung der Schritte 3.1 bis 3.5
4. Rekonstruktion der Sequenzen von einzelnen Nukleinsäureketten aus den unter Schritt 3.3 erhaltenen Signalen
Die zyklischen Schritte können mehrmals wiederholt werden, beispielsweise 2 bis 10 mal, 10 bis 20 mal, 20 bis 100 mal, 100 bis 500 mal. Die Identifizierung der eingebauten modifizierten Nuk-Makromoleküle erfolgt durch den Marker.
Die Reaktionsbedingungen des Schrittes (3) in einem Zyklus werden so gewählt, dass die Polymerasen an mehr als 50% der an der Sequenzierungsreaktion beteiligten NSKFs (extensionsfähige NSKF-Primer-Komplexe) in einem Zyklus ein modifiziertes Nuk- Makromolekül einbauen können, vorzugsweise an mehr als 80% oder an mehr als 90% der extenstionsfähigen Komplese. Dabei können Zeit und / oder Puffer- oder Temperaturbedingungen und / oder Konzentrationen von Reagentien variert werden
In einer Ausführungsform des Verfahrens befinden sich Polymerasen und modifizierten Nuk-Makromoleküle in derselben Lösung oder Komposition, die zu den an die feste Phase gebundenen extensionsfähigen Komplexen zugegeben wird.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens werden Polymerasen und modifizierten Nuk-Makromoleküle in getrennten Lösungen oder Kompositionen bereitgestelt. Die Lösungen oder Kompositionen werden getrennt zu den an die feste Phase gebundenen extensionsfähigen Komplexen zugegeben. Dabei wird vorzugsweise zunächt eine Lösung oder Komposition mit Polymerase zugegeben und anschließend eine Lösung oder Komposition mit einem modifizierten Nuk-Makromolekül (s. Beispiel 15).
In einigen Anwendungen kann eine Komposition mit einer oder mehreren Polymerase- Arten in einem Schritt zugegeben werden und in weiteren Schritten werden Kopositionen mit modifizierten Nuk-Makromolekülen zugegeben.
In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Verfahrens zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukleinsäureketten, NSKs) bereitgestellt, bei dem man
Fragmente (NSKFs) einzelsträngiger NSKs mit einer Länge von etwa 50 bis 1000 Nukleotiden erzeugt, die überlappende Teilsequenzen einer Gesamtsequenz darstellen können, man
die NSKFs unter Verwendung eines einheitlichen oder mehrerer unterschiedlichen Primer in Form von NSKF-Primer-Komplexen auf einer Reaktionsoberfläche in einer zufälligen Anordnung bindet, man
eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der NSKFs unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man
a) zu den auf der Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier modifizierte Nuk- Makromoleküle enthält, die mit Markern (Fluoreszenzmarker) markiert sind, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei Nukleotid-Analoga jeweils an den Nukleotid-Analoga befindlichen Marker so gewählt sind, dass sich die verwendeten Nukleotid-Analoga durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die Nukleotid-Analoga einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden einschließen, dass die Polymerase nach Einbau eines solchen modifizierten Nuk-Makromoleküls in einen wachsenden komplementären Strang nicht in der Lage ist, ein weiteres modifiziertes Nuk-Makromolekϋl in denselben Strang einzubauen, wobei der Marker abspaltbar ist und die strukturelle Modifikation ein abspaltbarer makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand ist, man
b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein modifiziertes Nuk-Makromolekül verlängert werden, man
c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter Nukleotid-Analoga geeignet sind, man
d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten Nukleotid-Analoga durch Messen des für den jeweiligen Marker (Fluoreszenzmarker) charakteristischen
Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man
e) zur Erzeugung unmarkierter (NTs oder) NSKFs die Marker und die makromolekulare sterisch anspruchsvollen Liganden von den am komplementären
Strang angefügten Nukleotid-Analoga abspaltet, man
f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Marker und der Liganden geeignet sind, man
die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,
wobei man die relative Position einzelner NSKF-Primer-Komplexe auf der Reaktionsoberfläche und die Sequenz dieser NSKFs durch spezifische Zuordnung der in Stufe d) in auf- einanderfolgenden Zyklen an den jeweiligen Positionen detektierten Fluoreszenzsignale zu den NTs bestimmt. Die zyklischen Schritte können mehrmals wiederholt werden, beispielsweise 2 bis 10 mal, 10 bis 20 mal, 20 bis 100 mal, 100 bis 500, 500 bis 2000 mal. Die Identifizierung der eingebauten modifizierten Nuk-Makromoleküle erfolgt durch den Marker.
Eine passenden Oberfläche für solche Verfahren kann nach DE 101 49 786 oder DE 10 2004 025 744 hergestellt werden. Die Materialvorbereitung und die Detektion können nach WO 02088382, DE 10 2004 025 696, DE 101 20 798, DE 102 14 395, DE 102 46 005 durchgeführt werden.
Beispiele
Die angeführten Beispiele und Ausführungsformen hatten den Zweck, die Erfindung zu erklären. Die vorliegende Erfindung ist nicht limitiert auf die hier beschiriebenen 5 Ausführungsformen und Beispiele. Viele verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hier beschriebenen werden einem Fachmann nahe liegend erscheinen. Solche Modifikationen sind ebenfalls dieser Erfindung anzurechnen.
Die dargestellten einzelnen Ausführungsformen sollten in ihrer Gesamtheit betrachtet 10 werden und können untereinander und miteinader kombiniert werden.
Allgemeine Hinweise für die Synthesen von modifizierten Nuk-Makromolekülen
Die erfindungsgemäßen modifizierten Nuk-Makromoleküle können auf unterschiedliche Art und Weise synthetisiert werden. Die Reihenfolge der Kopplungsschritte kann
L5 variieren. Beispielsweise kann zunächst eine Linker-Komponente an die Nuk- Komponente gekoppelt werden, anschließend wird die Marker-Komponente zusammen mit einem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden gekoppelt. Andererseits können ein oder mehrere Linker an den sterisch anspruchsvollen Liganden gekoppelt werden und anschließend der / die Nuk-Komponenten und erst danach wird
10 der Marker gekoppelt.
Die Kopplung zwischen einzelnen Komponenten der modifizierten Nuk-Makromoleküle kann kovalent oder affin erfolgen. Wobei sowohl chemische als auch enzymatische Kopplung zur Verknüpfung einzelner Komponenten eingesetzt werden kann. Kopplungen
.5 an Amino- und Thiolgruppen dienen als Beispiele für kovalente Kopplungen (D. Jameson et al. Methods in Enzymology 1997, V. 278, S. 363-, "The chemistry of the amino group" S. Patai, 1968, "The chemistry of the thiol group" S. Patai, 1974). Biotin- Streptavidin-Bindung oder Hybridisierung zwischen komplementären
Nukleinsäuresträngen oder Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen stellen Beispiele für
50 affine Kopplungen dar.
Ein makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand und ein makromolekularer Marker bieten oft eine Vielfalt an Kopplungsmöglichkeiten. Ein makromolekularer Ligand kann mehrere Kopplungsstellen für Linker haben, beispielsweise mehrere Bindungsstellen für )5 Biotin, wie es bei Streptavidin der Fall ist. Ein makromolekularer Marker oder ein makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand kann auch mehrere Amino- bzw. Thiol-Gruppen aufweisen. Die Kern-Komponente des Markers kann mit unterschiedlicher Zahl von signalgebenden oder signalvermittelnden Einheiten modifiziert werden. Die genauen Verhältnisse zwischen Marker-Einheiten können variieren. Beispiele für die Modifikation von Polymeren mit Farbstoffen sind bekannt (Huff et al. US Pat. 5661040, D. Brigati US Pat. 4687732). Falls Nukleinsäuren als makromolekulare Marker eingesetzt werden, so können diese unterschiedliche Abschnitte zur Kopplung anderer Makromoleküle besitzen. An einen makromolekularen Marker können andere Makromoleküle gebunden werden, z.B. Enzyme.
Ein modifiziertes Nuk-Makromolekül kann makromolekulare Marker mit unterschiedlichen Detektionseigenschaften tragen, beispielsweise kann ein modifiziertes Nuk-Makromolekül sowohl mehrere Farbstoffmoleküle als auch Stellen zur affinen Bindung (z.B. durch Hybridisierung) weiterer Makromoleküle tragen.
Die Kopplung zwischen der Nuk-Komponenten und der Linker-Komponenten erfolgt vorzugsweise kovalent. Viele Beispiele für eine kovalente Kopplung an Nukleotide oder deren Analoga sind bekannt (Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). Dabei kann die Kopplung beispielsweise an Phosphat, Amino-, Hydroxy- oder Mercaptogruppen erfolgen.
Oft kann die Linker-Komponente in mehreren Schritten aufgebaut werden. Beispielsweise wird im ersten Schritt ein kurzer Linker mit einer reaktiven Gruppe an das Nukleotid oder Nucleosid angekoppelt, z.B. Propargylamin-Linker an Pyrimidine Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z.B. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028, Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704, Ward et al. US Pat 4711955, Engelhardt et al. US Pat 5241060 Taing et al. US Pat 6811979, Odedra WO 0192284, Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Canard US. Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Faulstich et al. DE 4418691, Phosphoroamidite (Glen Research Laboratories, http://www.glenres.com/, Trilink Biotechnologies, S. Agrawal "Protocols for oligonucleotide conjugation", Humana Press 1994, M.Gait "Oligonucleotide synthesis: a practical approach" IRL Press, 1990), Dissertation "Synthese basenmodifizierter Nukleosidtriphosphate und ihre enzymatische Polymerisation zu funktionalierter DNA", Oliver Thum, Bonn 2002. Einige Verbindungen kann man käuflich erwerben, z.B. bei Trilink Biotechnologies, Eurogentec, Jena Bioscience.
Diese kurzen Linker dienen als Kopplungseinheiten L oder deren Teile, und sind ein Bestandteil der Linker-Komponente im fertigen modifizierten Nuk-Makromolekül. Im zweiten Schritt kann die Kopplung des Nukleotides oder Nucleosides mit einem kurzen Linker an das Linker-Polymer erfolgen. Polymere mit reaktiven funktionellen Gruppen können käuflich erworben werden (Fluka).
Nach der Kopplung des Nukleotids an das Polymer kann nun die Marker-Komponente als letzter Schritt gekoppelt werden.
Oft ist es vorteilhaft, an ein Nukleosid einen kurzen Linker zu koppeln, dann, falls erforderlich, dieses modifizierte Nucleosid in ein Nucleosid-Triphosphat umzuwandeln (Synthesen von Triphosphaten können beispielsweise in folgenden Literaturstellen gefunden werden : Held et al. Nucleosides, nucleotides & nnucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Faulstich et al. DE 4418691, T. Kovacs, L. Ötvös, Tetrahedron Letters, VoI 29, 4525-4588 (1988) oder Dissertation "Synthese basenmodifizierter Nukleosidtriphosphate und ihre enzymatische Polymerisation zu funktionalierter DNA", Oliver Thum, Bonn 2002). Weitere Modifikationen können am Nukleosid-Triphosphat-Analog durchgeführt werden.
Vorstufen für modifizierte Nukleoside können sind beispielsweise bei Trilink Biotechnologies (San Diego, CA, USA) oder bei Chembiotech (Münster, Deutschland) kommerziel erhältlich.
Kopplung von makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden kann auf unterschiedliche Art und Weise erfolgen. Beispielsweise werden makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden zunächst an die Struktur bestehend aus Nuk-Linker gekoppelt und erst anschließend erfolgt die Kopplung an den Marker. Ein anderer Ansatz ist die primäre Kopplung von sterisch ansoruchsvollen Liganden an den Marker (z.B. Kopplung von Streptavidin an Phycoerhytrin) und anschließend an die Struktur bestehend aus Nuk-Linker. Der makromolekulare sterisch anspruchsvolle Ligand kann auch als Bestandteil des Markers, z.B. als Kern-Komponente auftreten. In diesem Fall können niedermolekulare Substanzen (z.B. Farbstoffe, z.B. Cy3) an den Liganden direkt oder indirekt (z.B. über einen weiteren Linker) gekoppelt werden, siehe Beispiele.
Die Kopplung zwischen der Linker-Komponente und der Marker-Komponente kann beispielsweise zwischen reaktiven Gruppen an der Linker-Komponente und der Marker- Komponente erfolgen. Reagenzien für solche Kopplungen sind in "Chemistry of protein conjugation and cross-linking", S. Wang,1993, ISBN 0-8493-5886-8, ausführlich dargestellt. Die Verfahren zur Handhabung und zur Kopplung von mehreren Makromolekülen sind für unterschiedliche Typen von Makromolekülen auch in oben genannten Patenten dargestellt. Weitere Beispiele für Kopplungen an die und zwischen den Makromolekülen sind für Proteine in "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2; "Reactive dyes in protein an enzyme technology", D. Clonis, 1987, ISBN 0-333-34500-2; "Biophysical labeling methods in molecular biology" G. Likhtenshtein, 1993, 1993, ISBN 0-521- 43132-8; "Techniques in protein modification" R. Lundblad, 1995, ISBN 0-8493-2606-0; "Chemical reagents for protein modification" R. Lundblad, 1991, ISBN 0-8493-5097-2; für Nukleinsäuren in "Molecular-Cloning", J. Sambrook, band 1-3, 2001, ISBN 0-87969- 576-5, für andere Polymerarten "Makromoleküle, Chemische Struktur und Synthesen", Band 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X beschrieben.
Da die Marker-Komponente meistens viele Kopplungsstellen aufweist, können weitere Modifikationen an kompletten modifizierten Nuk-Makromolekülen vorgenommen werden. Beispielsweise können überschüssige Amino-Gruppen abgeblockt werden oder durch weiterführende Modifikationen verändert werden.
Je nach Einsatzgebiet und Reaktionsbedingungen, unter denen modifizierten Nuk- Makromoleküle verwendet werden, können unterschiedliche chemische Bindungsarten zwischen einzelnen Teilen der Makromoleküle von Vorteil sein.
Nachfolgend sollen beispielhaft einige Möglichkeiten zur Synthese von modifizierten Nuk- Makromolekülen dargestellt werden. Diese dienen nicht zur Einschränkung der möglichen Synthesewege und nicht zur Einschränkung der möglichen modifizierten Nuk- Ma kromolekü strukturen. In folgenden Beispielen werden modifizierte Nuk-Makromoleküle mit Polyethylenglycol (PEG) als Linker-Komponente angegeben. Beispiele für die Kopplungen von PEG an andere Moleküle sind in "Poly(ethylene glycol) : chemistry and biological applications", 1997 beschrieben. Im einzelnen können sehr unterschiedliche reaktive Gruppen zur Kopplung eingesetzt werden: N-succinimidyl carbonate ( US Pat.. 5,281,698, US Pat. 5,468,478), Amine (Buckmann et al. Makromol. Chem. V.182, S.1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polym. J. V.19, S. 1177 (1983)), succinimidyl propionate und succinimidyl butanoate (Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, 170- 181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D. C, 1997; U.S. Pat. No. 5,672,662), Succinimidyl succinate (Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. v. 7, S.175 (1984), Joppich et al., Makromol. Chem. Iv. 80, S.1381 (1979), Benzotriazole carbonate (U.S. Pat. No. 5,650,234), Glycidylether (Pitha et al. Eur. J. Biochem. v. 94, S.11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. v.13, S. 354 (1991), Oxycarbonylimidazole (Beauchamp, et al., Anal. Biochem. v.131, S. 25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release v. l, S.251 (1985)), p-nitrophenyl carbonate (Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., v.ll, S.141 (1985); and Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., v.27, S.45 (1991)), Aldehyde (Harris et al. J. Polym. Sei. Chem. Ed. v.22, S. 341 (1984), US. Pat. 5824784, US. Pat. 5252714), Maleimide (Goodson et al. Bio/Technology v.8, S. 343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins v.2, S.29 (1984)), and Kogan, Synthetic Comm. v.22, S.2417 (1992)), Orthopyridyl-disulfide (Woghiren, et al. Bioconj. Chem. v. 4, S. 314 (1993)), Acrylol (Sawhney et al., Macromolecules, v. 26, S.581 (1993)), Vinylsulfone (U.S. Pat. No. 5,900,461). Weitere Beispiele für Kopplungen von PEG an andere Moleküle sind in Roberts et al. Adv. Drug Deliv. Reviews v. 54, S. 459 (2002), US Pat. 2003124086, US Pat. 2003143185, WO 03037385, US Pat. 6541543, US Pat. 2003158333, WO 0126692 zu finden.
Andere ähnliche Polymere können in ähnlicher Art gekoppelt werden. Beispiele für solche Polymere stellen andere Poly(Alkylenglykole), Copolymere aus Ethylenglykol und Propyleneglykol, Poly(olefiniische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(saccharide), Poly(x-Hydroxy-Säuren), Poly(Acrylsäure), Poly(Vinylalkohol).
Die Aufreinigung der Nuk-Komponenten der modifizierten Nuk-Makromoleküle erfolgt mit konventionellen Mitteln der Nukleotidchemie: beispielsweise mit Kieselgel- Chromatographie in einem Wasser-Ethanol-Gemisch, Ionenaustausch-Chromatographie in einem Salz-Gradienten und Reverse-Phase-Chromatographie in einem Wasser- Methanol-Gradienten. Für die Nukleotid-Aufreinigung optimierte Chromatographie- Säulen werden z.B. von der Firma Sigma-Aldrich angeboten. Die Aufreinigung von makromolekularen Linker-Komponenten und Marker- Komponenten kann durch Ultrafiltration, Gel-Elektrophorese, Gelfiltration und Dialyse erfolgen, siehe "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2.
Die Masse der modifizierten Nuk-Makromoleküle unterscheidet sich wesentlich von der Masse der Nukleotide. Aus diesem Grund ist es vorteilhaft, bei den Endreinigungsschritten die Ultrafiltration einzusetzen. Da für die modifizierten Nuk- Makromoleküle nur eine durchschnittliche Masse bereichnet wird, eignet sich Ultrafiltration auch als analytische Methode zu Trennung von Syntheseprodukten.
Zur Charakterisierung der modifizierten Nuk-Makromoleküle können unterschiedliche Methoden der makromolekularen Chemie angewendet werden, z.B. UV-Vis- Spektroskopie, Fluoreszenzmessung, Massenspektroskopie, Fraktionierung,
Größenausschlußchromatographie, Ultrazentrifugation und elektrophoretische Techniken, wie IEF, denaturierende und nicht denaturierende Gel-Elektrophorese ("Makromoleküle, Chemische Struktur und Synthesen", Band 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2).
Eigenschaften der Biotin-Streptavidin-Bindung sind z.B. in Gonzalez et al. Journal Biolog. Chem. 1997, v. 272, S. 11288 beschrieben.
Synthesen von modifizierten Nukleotiden
Trennungsmethoden:
Dünnschichtchromatographie, DC: Analytisch : „DC-Alufolien 20 x 20 cm Kieselgel 60 F 254" (VWR), beschichtet mit Fluoreszenzindikator. Visualisierung erfolgt mittels UV-Licht. Laufmittel Ethanol-Wasser- Gemisch (70:30) (Laufmittel, LM 1) oder Ethanol-Wasser-Gemisch (90: 10) (LM 2). Präparativ: Kieselgel-Glasplatten mit Sammelschicht (VWR). LM 1 oder LM 2.
Umkehrphasen-Chromatographie (RP-Chromatographie), RP-18:
C-18 Material (Fluka), Säulenvolumen 10ml, Wasser-Methanol-Gradient. Fraktionen je
ImI wurden gesammelt und mit UV-Vis-Spektrometer analysiert. Fraktionen mit ähnlichen Spektren wurden vereinigt und lyophilisiert.
HPLC-Säulen mit ähnlichem Material können verwendet werden (Sigma).
Ionenaustausch-Chromatographie
DEAE-Zellulose (VWR), Gradient NH4HCO3 20mmol/l - lmol/l, Fraktionen wurden unter
UV/Vis -Kontrolle gesammelt und auf Grundlage gleicher Spektren vereinigt.
Die Affinitätsisolierung von modifizierten Nuk-Makromolekϋlen kann beispielsweise eingesetzt werden, wenn modifizierte Nuk-Makromoleküle Oligonukleotide Bestandteil der Marker-Komponente sind. Durch die Hybridisierung an eine komplementäre, auf einer festen Phase fixierte Nukleinsäure können sie selektiv isoliert werden.
Die Bestimmung der Ausbeuten für farbstoffmarkierte Produkte erfolgte an UV-Vis- Spektrometer.
Die Vollständigkeit der Kopplung an Strepavidin wurde durch eine Kontrolltitration mit einem Biotin -Farbstoff (Biotin-4-Fluoreszein, Sigma) 100 μmol/l in 50 mmol/l Borat, pH 8, 5 min bei RT durchgeführt. Bei einer kompletten Besetzung von Biotin-Bindungsstellen an Strepavidin während der Synthese erfolgt keine Markierung von Streptavidin. Bei einer nicht ausreichenden Reaktion erfolgt eine Bindung an SA. Analyse mit UV-Vis. Material: dUTP-AA (dUTP-Allylamine, Jena-Bioscience), dCTP-PA (dCTP-Propargyl-Amin, Jena Bioscience), dATP-PA (7-(3-Amino-l-propynyl)-2* deoxy-7-deazaadenosin-5 '-Triphosphat) (Auftragssynthese von JenaBioscience), dGTP-PA (7-(3-Amino-l-propynyl)-2* deoxy-7- deazaguanosin-5 '-Triphosphat, (Auftragssynthese von JenaBioscience), PDTP (3-(2- Pyridinyl-dithio)-propionsäure, Fluka), 7-(3-Phthalimido-l-propynyl)-2 '-desoxy-7- deazaguanosin und 7-(3-Phthalimido-l-propynyl)-2 '-desoxy-7-deazaadenosin
(Chembiotech), Streptavidin-beschichtete Polystyrene-Beads mit einem Durchmesser von 0,86 μm 1% w/v (Kisker GbR, Germany), PDTP-NHS (3-(2-Pyridinyl-dithio)-propionsäure-N- hydroxysuccinimidyl-ester, Sigma), Cy3-I\IHS (CyS-N-hydroxysuccinimidyl-ester,
Amerscham Bioscience), MEA ( Mercaptoethylamine, Sigma), DTT (1,4-Dithio-DL-threit, Sigma), CA (Cystamine, Sigma), TCEP - (Tris-(2-carboxyethyl)phosphine, Sigma), Biotin- NHS (Biotin-N-hydroxysuccinimidyl-ester, Sigma). J-Ac (Iodoacetat, Sigma), Iodacetamid (Sigma), EDA (Ethylendiamin, Sigma), CDI (1,1 '-Carbonyldiimidazol, Sigma), EDC N-(3- Dimethylaminopropyl)-N-Ethylenecarbodiimide (Sigma), NH2-PEG-Biotin (Länge: 30 Atome, Sigma), Biotin-PEG-NHS (Masse: 5000 Da, Nektar), SA ( Streptavidin, Promega), SA-PE (Streptavidin-Phycoerythrin, Molecular Probes Inc.), Biotin-PEG(8)-SS-PEG(8)-Biotin (Kat.No.PEG1064, IRIS Biotech GmbH), Fluorescein-PEG-NHS (5000 Da, Nektar), BOC-PEG- NHS (3000 Da, Nektar), Fmoc-PEG-NHS (5000 Da, Nektar), d UTP- 16- Biotin (Roche), nicht modifizierte, natürliche Nukleotide (Roth)
Lieferanten und Firmenverzeichnis:
Aldrich - s. Sigma
Amersham - Amerscham Bioscience, Freiburg, Deutschland Chembiotech - Chembiotech, Münster, Deutschland
Fluka - s. Sigma
Jena-Bioscience - Jena-Bioscience, Jena, Deutschland
Molecular Probes - Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande
MWG - MWG-Biotech, Ebersberg bei München, Deutschland, Nektar - Nektar Molecular engineering, früher Shearwater Corporation,
Huntsville, AL, USA
Quantum Dot - Quantum Dot Hayward, CA, USA
Roche - Roche, Mannheim, Deutschland
Sigma - Sigma-Aldrich-Fluka, Taufkirchen, Deutschland, Trilink - Trilink Biotechnologies Inc. San Diego, CA, USA, Lösungsmittel wurden, wenn nötig, absolutiert verwendet (Fluka) oder nach Standardverfahren getrocknet. Bei Lösungsmittelgemischen beziehen sich die angegebenen Mischungsverhältnisse auf die eingesetzten Volumina (v/v).
Synthesen einzelner Komponenten
Beispiel 1 dUTP-AA-PDTP, Fig. 12
(Synthese erfolgte ähnlich wie in WO 2005 044836 beschrieben) 20 mg dUTP-AA wurden in ImI Wasser gelöst und der pH-Wert mit NaOH auf 8.5 eingestellt. Zur dUTP-AA - Lösung wurde PDTP-NHS 60 mg in 0.5 ml Methanol, tropfenweise unter Rühren zugegeben. Reaktion wurde 2 h bei 400C durchgeführt. DC- Kontrolle: dUTP-AA-PDTP ( in LM 1 Rf 0.45). Die Trennung von überschüssigem PDTP-NHS und PDTP erfolgte auf präparativen Kieselgel-Platten, LM 2. Das Produkt, dUTP-AA-PDTP, und dUTP-AA bleiben auf der Startlinie. Die Nukleotide wurden von der Platte mit Wasser eluiert und eingeengt. Dieses dUTP-Analog trägt nun eine Disulfid-Bindung, die in einer Thiolaustauschreaktion mit anderen Thiolen reagieren kann und eine unter milden Bedingungen spaltbare Verbindung darstellt.
Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 7-Deaza- Aminopropargyl-Desoxy-Guanosin-Triphosphat und 7-Deaza-Aminopropargyl Desoxy- Adenosin-triphosphate, 5-Amino-Propargyl-Desoxy-Uridin-Triphosphate, 5-Amino-Allyl- Desoxy-Uridin-Triphosphate, 5-Amino-Propargyl-Desoxy-Cytidin-Triphosphate können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden.
Beispiel 2 dUTP-AA-Propionat-SH, Fig. 13 (Synthese erfolgte ähnlich wie in WO 2005 044836 beschrieben)
Zu 200μl 40 mmol/l Lösung von dUTP-AA-PDTP wurde ImI TCEP-Lösung 250mmol/l, pH
8, eingestellt mit NaOH, zugegeben und 10 min bei RT gerührt.
Die Trennung der Nukleotide von anderen Reagenzien erfolgte auf präparativen
Kieselgel-Platten, LM 2. Produkt, dUTP-AA-Propionat-SH, bleibt auf der Startlinie. Die modifizierten Nukleotide wurden von der Platte mit Wasser eluiert und eingeengt.
Dieses dUTP-Analog trägt eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung. Beispiel 3
Biotin-PEG-Ethyl-SH, Fig. 14
Zu 200 μl wässriger CA-Lösung (lOOmmol/l), pH 8.5, eingestellt mit NaOH, wurden 10 mg Biotin-PEG-NHS (5000 Da, Nektar) zugegeben und bei 40°C 18 Stunden gerührt. Anschließend wurde 200 μl TCEP-Lösung (0.5 mol/l), pH 8.0, zugegeben und weitere 10 min bei RT gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration auf 3.000 MWCO (Molecular weight cut off) von anderen Reagenzien getrennt.
Das Produkt trägt eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung.
Ein weiteres Beispiel für die Einführung von SS-Bindung bzw. Kopplung einer Mercaptogruppe an PEG :
NH2-PEG-Biotin, 10 mg, (PEG-Linker hat 30 Atome, Sigma-Aldrich) wurden in 280 μl 50 mM Borat-Puffer aufgelöst und pH auf 9 eingestellt. Zu dieser Lösung wurden zwei
Äquivalente von PDTP-NHS in 100 μl DMF zugegeben. Nach 1 Stunde bei RT wurde der
Überschuss von PDTP-NHS mit Überschuss von NH4HCO3 abreagiert. Das Produkt stellt folgende Verbindung dar: Biotin-PEG-PDTP.
Dieses Produkt kann durch Thiolaustausch an ein weiteres Molekül gekoppelt werden. Durch Spaltung der SS-Bindung kann eine freie SH-Gruppe bereitgestellt werden.
Weitere Linker mit reaktiven Gruppen wie Carboxy-, Thiol- oder Disulfid-Gruppen und einem PEG-Spacer (z.B. Biotin-PEG(8)-SS-PEG(8)-Biotin) können von IRIS-Biotech
GmbH (Germany) erhalten werden.
Beispiel 4 dUTP-AA-PEG-Biotin, Fig. 15
(Synthese erfolgte ähnlich wie in WO 2005044836 beschrieben)
Zu lOOμl wässriger Lösung dUTP-AA, 50mmol/l, pH 8.0, wurden 10mg Biotin-PEG-NHS (5000 Da, Nektar) gegeben und bei 400C 18 Stunden gerührt. Anschließend wurde das nicht umgesetzte Nukleotid durch Ultrafiltration, 3.000 MWCO, abgetrennt und das
Produkt der Reaktion, das dUTP-AA-PEG-Biotin, mehrmals mit Wasser gewaschen.
Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen
Linker. Biotin dient als Kopplungseinheit T. An diese Kopplungseinheit T können makromolekulare Strukturen gekoppelt werden, z.B. Streptavidin oder mit Streptavidin modifizierte Proteine oder Beads. Das Produkt der Reaktion ist eine Zwischenstufe eines modifizierten Nuk-Makromoleküls. Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Propargylamino- dCTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP, 5-Amino-Propargyl-dUTP und 7-Deaza- Aminopropargyl-dATP können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2t -Deoxyribonukleotide als auch 2 V ,3* - Deoxyribonukletide verwendet werden (Fig. 16, 21 - 24).
Beispiel 5 dUTP-AA-SS-PEG-Biotin, Fig. 17
Zu lOOμl, lOmmol/l Biotin-PEG-Ethyl-SH (5000 Da) in 5OmM Borat, pH 9.5, wurde 50μl 30mmol/l dUTP-AA-PDTP in 5OmM Borat, pH 9.5 zugegeben. Reaktion wurde 18 Stunden bei RT gerührt. Die Trennung erfolgt ähnlich wie für die Synthese von dUTP-AA-PEG- Biotin, Beispiel 4 beschrieben.
Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen Linker. Biotin dient als Kopplungseinheit T. An diese Kopplungseinheit T können makromolekulare Strukturen gekoppelt werden, z.B. Streptavidin. Über Streptavidin können auch weitere makromoleküle, beispielsweise Enzyme oder Nukleinsäurenge koppelt werden.
Die Linker-Komponente kann zusammen mit der Marker-Komponente von der Nuk- Komponente unter milden Bedingungen abgespalten werden. Dies kann beispielsweise von Vorteil sein, wenn eine Sequenzierung durch Synthese (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Quake WO0132930, Kartalov WO02072892 ) durchgeführt wird, wobei nach jedem Detektionsschritt eine Entfernung der Marker notwendig ist.
Beispiel 6 dCTP-PA-SS-(PEG)8-Botin
Schritt 1 : Zunächst wurde dCTP-PA mit PDTP-NHS modifiziert, so dass dCTP-PA-PDTP resulierte. Die Synthese wurde ähnlich wie für dUTP durchgeführt, siehe Beispiel 1. Schritt 2: Eine wässrige TCEP Lösung (10 μl, 300 mmol/l, pH 7, eingestellt mit NaOH) wurde zu einer wässrigen Lösung von Biotin-PEG(8)-SS-PEG(8)-Biotin (50 μl, 100 mmol/l, pH6, Iris Biotech GmbH) zugegeben. Dabei wird etwa die Hälfte der Disulfid- Brücken gespalten.
Wässrige Lösung von dCTP-PA-PDTP (20 μl, 20 mmol/l, pH 9.5, eingestellt mit NaOH) wurde zu der in Schritt 2 erhaltenen Lösung zugegeben und 1 Stunde bei RT inkubiert. Das Produkt wurde mitttels Dünnschichtchromatographie in LM 1 isoliert. Die Nukleotide wurden von der Platte mit Wasser eluiert und eingeengt.
Beispiel 7 Synthese von makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden
In diesem Beispiel soll zur Demonstrationszwecken die Variierung der Größe und der Markierung des makromolekualren sterisch anspruchsvollen Liganden demonstriert werden. Es werden folgende Modifikationen von Streptavidin synthetisiert: SA-(PEG(B-OOO-BOC)n, SA-(PEG(5.000-Fmoc))n,
SA-(PEG(5.000-Fluorescein))n
Als Ausgangssubstanzen dienten Streptavidin (Promega Inc.) und BOC-PEG-NHS (3000 Da, Nektar), Fmoc-PEG-NHS (5000 Da, Nektar) und Fluorescein-PEG-NHS (5000 Da, Nektar). Zur einer Streptavidin (5 mg/ml in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9) wurden PEG- Derivaten bis zur Konzentration von 10% (w/v) zugegeben und ca. 2 hr bei RT inkubiert. Das modifizierte Streptavidin wurde mittels Ultrafiltration vom Überschuß PEG-Derivaten gereinigt. Durchschnittlich wurde jedes SA-Molekül mit 10 PEG-Molekülen modifiziert (n=10). In ähnlicher Weise können auch andere Protein-Konjugate in ihrer Größe abgestuft geändert werden, wobei höhermolekulare PEG-Derivate verwendet werden können.
Nukleotid-Analoga mit einem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden. Die kontrollierte enzymatische Synthese von Nukleinsäuren (schrittweise Primer- Verlängerung) beinhaltet einen kontrollierten Stop, gegebenenfalls Reinigung der Nukleinsäuren, Auhebung des Stops und die Fortsetzung der Synthese. Der Stop in der Synthese wird durch den Einbau von erfindungsgemäßen Nukleotid-Analoga mit makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden verursacht: Die Zusammgenhänge zwischen der Linker-Länge und dem Ausmaß der sterischen Hinderung sollen an einigen Bespielen der Nukeotid-Analoga demonstriert werden.
Beispiel 8
(dUTP-16-Biotin)4-SA, Zu 200μl einer Lösung von Biotin-16-dUTP (Linker-Länge 16 Atome) 200μmol/l in 5OmM Tris-HCI, pH 8.0, wurden 200μl einer Streptavidin-Lösung, lmg/ml, in 5OmM Tris-HCI, pH 8.0, zugegeben. Nach 1 Stunde bei RT wurde das (dUTP-16-Biotin)4-SA vom nicht umgesezten Biotin-16-dUTP durch Ultrafiltration, 50.000 MWCO, abgetrennt. Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden trägt. Dieser Ligand kann auch als Marker betrachtet werden. Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat nicht akzeptiert. Die Modifikation führt zum Verlust der Substrateigenschaften.
Bei der Beurteilung der Nukleotid-Struktur hat dieser Linker für diese makromolekulare Struktur (Streptavidin) eine zu geringe Länge. In dieser Kombination lässt das Streptavidin, als makromolekularer Ligand, die Nukleotid-Komponente nicht genug nah an das aktive Zentrum des Klenow-Fragments heran.
Beispiel 9
Synthese von dUTP-AA-PEG-Biotin-SA-Derivate In der Synthese wurden folgende Streptavidin-Derivate (SA-Derivate) verwendet: SA- (PEG(3.000-BOC)n , SA-(PEG(5.000-Fmoc))n, SA-(PEG(5.000-Fluorescein))n Zu einer Lösung von dUTP-AA-PEG-Biotin (lOOμl, ca. 150 μmol/l) wird eine Lösung mit zwei Äquivalenten von einem Streptavidin-Derivaten zugegeben und bei RT 1 h gerührt. Danach wird das Produkt durch Ultrafiltration, 50.000 MWCO, gereinigt und zwei mal mit Wasser gewaschen. Es werden Verbindungen erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität, einen langen makromolekularen Linker und einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Ligand einschließen.
In einer ähnlichen Weise wird die Verbindung von dUTP-AA-PEG-Biotin-SA*PE erhalten.
(Es ist vorteilhaft, eine einzige Nuk-Komponente an SA-Derivate zu koppeln. Dies kann bespielsweise durch Überschuß an SA-Derivaten erreicht werden. Die Population stellt dabei ein Gemisch von SA-Derivaten, Nukleotid-SA-Derivaten, und (Nukleotid)n-SA- Derivaten dar, wobei bei entsprechender Wahl der molaren Verhältnisse die Form von Nukleotid-SA über (Nukleotid)n-SA prävaliert. Das Verhältnis zwischen dem Nukleotid- Anteil und dem modifizierten Streptavidin (dNTP:SA) kann beispielsweise in folgenden Bereichen liegen: von 0,01 : 1 bis 0,1 : 1; von 0,1 : 1 bis 0,5: 1; von 0,5: 1 bis 1 : 1; von 1 : 1 bis 2: 1, von 2: 1 bis 3: 1; von 3: 1 bis 4: 1. Da solche Nukleotidverbindungen noch freie Biotin-bindende Valenzen für Biotin haben, können weitere Strukturen, z.B. Biotin tragende signalgebende Strukturen, wie beispielsweise Farbstoffe oder Quantumdots, darüber gekoppelt werden.)
Es resultieren Verbindungen: OUTP-AA-PEG-BiOtJn-SA-(PEG(B-OOO-BOC)n dUTP-AA-PEG-Biotin-SA-(PEG(5.000-Fmoc))n dUTP-AA-PEG-Biotin-SA-(PEG(5.000-Fluorescein))n d(JTP-AA-PEG-Biotin-SA*PE
In ähnlicher Weise werden die Verbindungen für dCTP-Derivaten synthetisiert. Die Verbindung dUTP-AA-PEG-Biotin-SA-(PEG(5.000-Fluorescein))n hat einen makromolekularen Liganden, der mit Farbstoffen (Fluorescein) modifiziert ist. Auch andere Farbstoffe können gekoppelt werden entweder an as Streptavidin direkt oder über die Linker. SA-(PEG(5.000-Fmoc))n kann beispielsweise nach Abspaltung von Fmoc- Schutzgruppen an frei gewordenen Amino-Gruppen mit NHS-Derivaten von Farbstoffen modifiziert werden. Auf diese Weise kann der makromolekulare sterisch anspruchsvolle Ligand auch Marker-Funktion haben.
Diese Verbindungen werden von Polymerasen, z.B. Klenow-Exo minus Polymerase, Sequenase, Vent Exo minus, Taq-Polymerase, Pwo Polymerase, Reverse Transcriptase (MMLV (Promega), ImProm II ™ (Promega)), als Substrat akzeptiert.
Die Effektivität des Hinderung der enzymatischen Synthese wird am Beispiel mit homopolymeren Bereichen in der Matrize und mit der Polymerase Vent exo minus Polymerase getestet: Während der enzymatischen Synthese an komplementären Matrizen-Positionen, wo ein potenziell mehrfacher Einbau von diesen Nukleotid-Analoga erfolgen könnte (z.B. -AAA- Strecken, Homopolymere), kann der Einbau von bis zu drei nacheinander folgenden modifizierten Nukleotid-Analoga dUTP-AA-PEG-Biotin-SA- (PEG(3.00O)-BOC)n nachgewiesen werden. Der Anteil der Primer, an denen eine mehrfache Verlängerung stattgefunden hat, ist allerdings geringfüg (Terminieungseffizienz in homopolymeren Bereichen über 90%).
Ein kompletter Stop kann bei gegebener Linker-Länge durch Vergrößerung des sterisch Anspruchsvollen Liganden erzielt werden. Die Analoga dUTP-AA-PEG-Biotin-SA- (PEG(5.000-Fluorescein))n und dUTP-AA-PEG-SA*PE werden von Vent exo minus nur einmal an homopolymeren Strecken eingebaut. Der Einbau eines nächsten komplementären Nukleotid-Analogs wird durch den sterisch anspruchsvollen Liganden des bereits eingebauten Nukleotid-Analogs komplett blockiert (Terminierungseffizienz in homopolymeren Bereichen größer 99%).
Nicht nur gleiche makromolekulare sterisch anspruchsvolle Liganden, sondern auch ähnlich große führen zur Hinderung des Einbaus von modifizierten Nukleotid-Analoga. Bei gleichzeitiger Verfügbarkeit von dUTP-AA-PEG-Biotin-SA-(PEG(3.00O)-BOC)n und OCTP-AA-PEG-BiOtJn-SA-(PEG(S. O00-Fluorescein))n in einer Reaktionslösung, führt das dUTP-Analog zur Hinderung des Einbaus vom dCTP-Analogs an Strecken, wo an den Primer zunächt ein dU und dann ein dC eingebaut werden sollte. Dies zeigt, dass mehrere modifizierten Nuk-Makromoleküle gleichzeitig im Reaktionsansatz vorliegen können und trotzdem nur ein komplementäres modifiziertes Nuk-Makromolekül in den Primer eingebaut wird.
Beispiel 10 Bead-(SA-(dUTP-AA-PEG-Biotin))n
1000 μl einer 1% Suspension von Streptavidin-beschichteten Polystyrene-Beads mit einem Durchmesser von 0,86 μm werden mit 10 μl 1 mM Lösung von dUTP-AA-PEG- Biotin 10 min bei RT inkubiert. Die Reinigung der Beads erfolt durch Zentrifugation für 5 min bei 10000 rpm und einen Puffer-Austausch (10 x mit 200 μl Tris-HCI 50 mM, pH 8,5).
Die resultierten Nukleotid-modifizierten Beads können von Klenow Fragment an eine Nukleinsäurekette eingebaut / gekoppelt werden.
Der Einfluß eines solchen sterischen Hindernisses unterscheidet sich von der Wirkung der sterisch anspruchsvollen Liganden mit einer Masse zwichen 20.000 Da und 10.000.000 Da (z.B. Proteine und ihre Komplexe). Da die Raumforderung eines Nano-Kügelchen / oder eines Nanoteilchen mehrer Hundert Nanometer betreffen kann, kann ein solcher sterisch anspruchsvoller Ligand nicht nur unmittelbar anschließende Bereiche der Nukleinsäure, sondern auch wesentlich größere Bereiche der Nukleinsäure für die Kopplung eines weiteren ähnlich großen modifizierten Moleküls unzugängig machen.
Beispiel 11
Herstellung eines Nukleotid-Analogs mit einem makromolekularen sterischen Hindernis (Linker 43 Atome). dCTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA-Cy3, dCTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA-PE
Die Kopplung von dCTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin an Streptavidin wurde ähnlich wie für dUTP- AA-PEG-Biotin beschrieben durchgeführt. Ein Äquivalent von dCTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin wurde zu 1,5 Äquivalenten von Streptavidin (wässrige Lösung, 5mg/ml, in 5OmM Tris- HCI, pH 8.0) zugegeben. Nach 1 Std. bei RT wurde das resultierte dCTP-PA-SS-(PEG)8- Biotin-SA von niedermolekularen Substanzen durch Ultrafiltration mit MWCO 50.000 gereinigt.
Anschließend wurde das dCTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA mit Cy3-NHS im Borat Puffer (50 mmol/l, pH 8,5) modifiziert, so dass durchschnittlich 3 bis 5 Cy3-Moleküle pro ein Streptavidin-Molekül gekoppelt wurden (Fig. 18). Es resultiert ein Gemisch von mehreren Modifikationen von dCTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA-Cy3. Dieses Gemisch wurde nicht weiter getrennt.
Dieses Nukleotid-Analogs wird von mehreren Polymerasen (z.B. von Klenow Fragment exo minus Polymerase, Sequenase 2, Vent exo minus, Taq Polymerase, Pwo Polymerase) als Substrat akzeptiert.
Während der enzymatischen Synthese an komplementären Matrizen-Positionen, wo ein potenziell mehrfacher Einbau von diesen Nukleotid-Analoga erfolgen könnte (z.B. -GGG- Strecken, homopolymere Bereiche in der Matrize), konnte der Einbau von nur einem Nukleotid-Analog nachgewiesen werden (s. Beispiel 15). In diesem Fall übt der sterisch anspruchsvolle makromolekulare Ligand (in diesem Beispiel Streptavidin) auf die weitere enzymatische Reaktion eine hemmende Wirkung aus: weitere Nukleotid-Analoga (in diesem Fall dCTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA) konnten nicht in der anschließenden Position am Primer(N+2) eingebaut werden. Nach der Spaltung des Linkers durch Reduktion der Disulfid-Bindung und anschließender Blockade der SH-Gruppe mit Iodacetamid konnte ein weiteres dCTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA eingebaut werden. Beispiel für die Durchführung einer solchen Reaktion siehe Beispiel 15.
An das Streptavidin können weitere Moleküle gekoppelt werden. Statt Streptavidin können in der oben genannten Synthese käufliche Streptavidin-Konkugate eingesetzt werden, beispielsweise Streptavidin-PE (Molecular Probes Inc. Invitrogen) , Streptavidin- AP, Streptavidin-HRP oder Fluoreszenzfarbstoff-Konjugate (Fig. 19).
Beispielsweise die Synthese von dCTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA-PE wurde Analog zu dCTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA durchgeführt: Ein Äquivalent von dCTP-PA-SS-(PEG)8- Biotin wurde zu einem Äquivalenten von Streptavidin-PE, Molecular Probes, (wässrige Lösung, lmg/ml, im Hersteller-Puffer) zugegeben. Nach 1 Std. bei RT wurde das resultierte dCTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA*PE von niedermolekularen Substanzen durch Ultrafiltration mit MWCO 100.000 gereinigt. Dieses Nukleotid-Analog wird ebenfalls von vielen Polymerasen (s. oben) akzeptiert und führt nach einem Einbau (z.B. in homopolymeren Bereichen) zur Hinderung des Einbaus eines weiteren dCTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA*PE in der unmittelbarer Nähe.
Beispiel 12
Weiteres Beispiel für die Synthese von modifizierten Nuk-Makromolekülen
SA-(dGTP-PA-SS-PEG-Biotin)n
Herstellung eines Nukleotid-Analogs mit einem makromolekularen sterischen Hindernis
(Linker 43 Atome), (n) liegt zwischen 1 und 4. Zu 200 μl einer 50 μM Streptavidin-Lösung in 50 mM Borat-Puffer, pH 9, werden 5 Äquivalente von Biotin-PEG-PDTP (PEG-Linker 30 Atome; Synthese s. Beispiel 3) zugegeben und 10 Minuten inkubiert. Streptavidin-(Biotin-PEG-PDTP)n wird durch Ultrafiltration an MWCO 30000 von niedermolekularen Komponenten durch mehrmaliges Waschen mit Borat-Puffer getrennt. Zu 200 μl 50 μM Streptavidin-(Biotin-PEG-PDTP)n Lösung in Borat-Puffer werden mit 100 μl 10 mM Lösung von TCEP, pH 8, zugegeben. Nach 30 min wird Streptavidin-(Biotin-PEG-R-SH)n erneut durch Ultrafiltration an MWCO 30000 von niedermolekularen Komponenten durch mehrmaliges Waschen mit Borat- Puffer getrennt.
dGTP-PA wird mit PDTP-NHS modifiziert, ähnlich wie im Beispiel 1 dargestellt, das Produkt ist dGTP-PA-PDTP. 50 μl einer 100 mM Lösung von dGTP-PA-PDTP in 50 mM Borat-Puffer, pH 9, werden zu 200 μl 50 μM Streptavidin-(Biotin-PEG-R-SH)4 in 50 mM Borat Puffer zugegeben. Nach 30 min RT werden makromolekulare Produkte u.a. SA-(dGTP-PA-SS-PEG-Biotin)n durch Ultrafiltration an MWCO 30000 von niedermolekularen Komponenten durch mehrmaliges Waschen mit Borat-Puffer getrennt.
Das resultierende Produkt SA-(dGTP-PA-SS-PEG-Biotin)n hat einen Linker von 43 Atomen zwischen Nuk-Komponente und dem Biotin. Dieses modifizierten Nuk-Makromolekül hat eine spaltbare SS-Bidung in seinem Linker und kann von Klenow Fragment in eine Nukleinsäurekette eingebaut werden.
Während der enzymatischen Synthese (Klenow Exo minus Polymerase) an komplementären Matrizen-Positionen, wo ein potenziell mehrfacher Einbau von diesen Nukleotid-Analoga erfolgen könnte (z.B. -CCC- Strecken in der Matrize), konnte der Einbau von nur einem Nukleotid-Analog nachgewiesen werden. In diesem Fall übt der sterisch anspruchsvolle makromolekulare Ligand (Streptavidin) auf die weitere enzymatische Reaktion eine hemmende Wirkung aus: weitere Nukleotid-Analoga (in diesem Fall SA-(dGTP-PA-SS-PEG-Biotin)n ) konnten nicht in unmittelbarer Nähe eingebaut werden. Die Linker-Komponente und der sterisch ansruchsvoller Ligand können von der Nuk-Komponente unter milden Bedingungen abgespalten werden.
An das' Streptavidin können weitere Moleküle gekoppelt werden. Statt Streptavidin können in der oben genannten Synthese käufliche Streptavidin-Konkugate eingesetzt werden, beispielsweise Streptavidin-AP, Streptavidin-HRP oder Fluoreszenzfarbstoff- Konjugate (ähnlich wie in Fig. 18 oder 19). Diese Konkugate, gekoppelt an ein modifizierte Nuk-Makromolekül, haben ein ähnliches Verhalten, wie Streptavidin selbst.
Beispiel 13
Die Kombination von Biotin tragenden modifizierten Linkern und modifizierten Streptavidinen als sterisch anspruchsvollen Liganden stellt ein Beispiel für Synthese weiterer modifizierter Nukleltide dar:
dUTP-AA-SS-PEG-Biotin (Synthese s. Beispiel 5) und in ähnlicher Weise synthetisierte dCTP-PA-SS-PEG-Biotin, dATP-PA-SS-PEG-Biotin und dGTP-PA-SS-PEG-Biotin können mit verschiedenen Varianten des sterischen Hindernisses und Markern kombiniert werden :
Modifikation mit SA-(PEG-X)N:
Wo N = 3-12 und und (X) schließt beispielsweise einen Farbstoff, z.B. FITC, Cy3, Cy5 Rhodamine (Beispiele für weitere Farbstoffe siehe Katalog von Dyomics GmbH, Jena, Germany oder Molecular Probes, Invitrogen), oder eine Schutzgruppe, z.B. Fmoc, oder eine Aminogruppe ein. Die Farbstoffe können sowohl über PEG als auch direkt an das Streptavidin gekoppelt sein. Auch weitere SA-Modifikationen (z.B. SA*PE) können durch Modifikation mit Polymeren (wie z.B. PEG, verschiedene PEG-Derivate kommerziell erhältlich, z.B. Sigma-Aldrich-Fluka, Iris Biotech, ihre Größen könne variieren z.B. zwischen 500 und 10000 Da) in ihrer Größe abgestufft verändert werden, sowie durch weitere Modifikationen, z.B. durch Kopplung von Farbstoffen, erweitert werden.
Folgende Verbindungen stellen Beispiel für reversible Terminatoren mit makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden dar:
dUTP-AA-SS-PEG-Biotin-SA-(PEG-X)N, dCTP-PA-SS-PEG-Biotin-SA-(PEG-X)N, dATP-PA-SS-PEG-Biotin-SA-(PEG-X)N, dGTP-PA-SS-PEG-Biotin-SA-(PEG-X)N, Modifikation mit SA*PE dUTP-AA-SS-PEG-Biotin-SA*PE dCTP-PA-SS-PEG-Biotin-SA*PE dATP-PA-SS-PEG-Biotin-SA*PE dGTP-PA-SS-PEG-Biotin-SA*PE
Diese Verbindungen werden von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase, Sequenase, Vent Exo minus Polymerase, Taq-Polymerase, Pwo Polymerase, Reverse Transcriptase (M-MLV, (Promega), ImProm II ™ (Promega)) als Substrat akzeptiert und können in der Sequenzierungsreaktion eingesetzt werden.
Das bei der Synthese resultierende Gemisch von beispielsweise dATP-PA-SS-PEG-Biotin- SA-(PEG-X)N und SA-(PEG-X)N kann als ganzes in die Sequenzierungsreaktion eingesetzt werden.
Solche modifizierte Nukleotid-Analoga schließen einen spaltbaren Linker, einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden (modifiziertes Streptavidin- Molekül) und einen Marker, wobei der Marker aus mehreren Farbstoffen mit geringer molekularer Masse (z.B. Cy3, FITC, Cy5) oder aus einem makromolekularen Marker, wie PE (phycoerhytrin), bestehen kann. Möglichkeit, unterschieliche Farbstoffe an das Streptavidin oder seine Modifikationen (z.B. PEG-modifiziertes Streptavidin, SA-PE- Konjugat) erlaubt unterschiedliche Farbkodierungen für einzelne modifizierte Nuk- Makromoleküle vorzunehmen.
Solche modifizierten Nuk-Makromoleküle (Nukleotid-Analoga) stellen Beispiele für reversible Terminatoren mit makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden dar und können in Sequenzierungsverfahren wie (WO02088382) eingesetzt werden. Für Sequenzierungsverfahren werden reversible Terminatoren mit Terminationseffizienzen bevorzugt, die folgende Bereiche einschließen: 80 - 100%, 90 - 100%. Besonders bevorzugt sind reversible Terminatoren mit Terminationseffizienzen in Bereichen von 95 - 100%, 97-100%, 99-100%. Nach dem Einbau eines solchen modifizierten Nuk- Makromoleküls kann kein weiteres modifiziertes Nuk-Makromolekül eingebaut werden. Nach der Spaltung des Linkers mit reduzierenden Substanzen (z.B. TCEP) und der Blockade der Mercapto-Gruppe (z.B. mit Iodacetamid), kann ein weiteres komplementäres modifiziertes Nuk-Makromolekül eingebaut werden, das ebenfalls zu einem reversiblen Stopp führt. Beispiel 14
Die enzymatischen Einbaureaktionen werden bei üblichen Bedingungen für die Einbaureaktionen von modifizierten Nuk-Makromolekülen durchgeführt. Beispielsweise können folgende Bedingnugen eingesetzt werden : Puffer-Lösungen:
Tris-HCI (20 mM - 100 mM), pH 7-8,5
(Als Puffer können auch Phosphat, MOPS, HEPES, Acetat, Borat-Puffer verwendet werden) MgCI2 z.B. 1,5 bis 10 mM (oder auch Mn 0,2 - 1 mM)
NaCI 20 bis 100 mM
Glycerin ca. 10 - 30 %
• Primer (Oligonukleotide) mit einer Länge von 17 bis 50 Nukleotide, die eine ausreichende spezifische Hybridisierung an die Matrize aufweisen. Konzentration ca . von 0,02 bis 2 μM
• Matrizen (PCR- Produkte, Oligonukleotide)
• DNA-Polymerasen (Klenow-Fragment, Taq-Polymerase, Vent-Polymerase, Vent exo minus Polymerase, Deep Vent exo minus Polymerase, Pwo-Polymerase, Sequenase II, Reverse Transcriptasen, AMV, M-MLV, RAV, HIV, ImProm II (TM) Reverse Transcriptase)
• modifizierten Nuk-Makromoleküle werden in Konzentrationen vorzugsweise zwischen 0,1 μM bis 50 μM verwendet.
Für die Reaktionen an der festen Phase sind geeignet Mikrotiter-Platten, Beads (z.B. Streptavidin beschichtete Polysterene Beads oder paramagnesiche Teilchen auf Dextran- Basis, z.B. von Promega) oder DNA-Chips von verschiedenen Herstellern. Die Fixierung der Nukleinsäuren an den festen Phasen erfolgt je nach Experiment durch Affinitätskopplung oder Kovalent. Der Nachweis erfolgt entsprechend dem eingesetzten Marker: z.B. Fluoreszenz oder enzymatische Farbentwicklung. Als Trennmedien und Verfahren werden z.B. Gel-Elektrophorese, Gel-Filtration, Ultrafiltration, Affinitätsisolierung verwendet.
Enzymatische Reaktionen wurden für ca. 2 bis 60 min bei RT bis 600C durchgeführt. Die Spaltungsreaktion der Disulfid-Bindung werden beispielswiese bei folgenden Bedingungen durchgeführt: • 50 mM Borat Puffer, pH 8.5-9.0, + 50 mM NaCI
• Als reduzierende Substanzen werden TCEP, Beta-Merkaptoethanol oder DTT verwendet.
• Die Reaktionsdauer kann zwischen 5 und 60 min bei RT variieren. Beispiel 15: Reversible Terminierung mittels dCTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA-Cy3 Demonstration der reversiblen Terminierung am Beispiel der Synthese eines homopolymeren Bereichs in einer künstlichen Sequenz. Detektion erfolgt mittels Fluoreszenzmessung der Signale von modifizierten Nuk-Makromoleküle nach einer GeI- Elektrophorese von verlängerten Primern.
Materialien: Lösungen:
Puffer l : 50 mmol/l Tris HCl, pH 8,5; 50 mmol/l NaCI, 5 mmol/l MgCI2, Glycerin 10 % v/v
Puffer 2: Borat Puffer 50 mmol/l pH 9,0; 100 mmol/l NaCI, 5 mmol/l MgCI2
Nukleotide und Nukleotid-Analoga: dATP (wurde bei Firma Roth erworben) und als Lösung von lmmol/l verdünnt. dCTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA-Cy3 (im Weiteren als dC-Analog bezeichnet). dC-Analog (eine wässrige Lösung, 100 μmol/l) ist in diesem Beispiel Bestandteil eines Gemisches. Das Gemisch wurde erhalten wie in Beispiel 11 dargestellt, wobei das dC- Analog von nicht konjugierten SA-Cy3 nicht getrennt wurde.
Feste Phase: Streptavidin Magnesphere Paramagnetic particles (Kat.No. Z5481) Promega. Können mit Hilfe eines Magneten aus der Lösung isoliert werden (siehe Anleitung des Herstellers). Das Waschen der festen Phase wurde durch mehrmaligen Austausch einer Lösung durchgeführt (einmaliges Volumen der Lösung 200 μl). Zur Vereinfachung der Beschreibung wird als „feste Phase" Folgendes bezeichnet: Beads selbst und alle daran gebundenen Elemente, z.B. Nukleinsäuren, Nukleotide usw.
Während der zyklischen Reaktion werden zu verschiedenen Zeitpunkten (wie indiziert im Text) Aliquoten aus dem Hauptansatz entnommen.
Polymerase: Vent exo minus Polymerase (New England Biolabs), wird als Polymerase bezeichnet.
Nukleinsäuren:
Künstliches Oligonukleotide mit folgenden Sequenzen: Oligonukleotid-1 : Biotin-(T)48 Oligonukleotid-2: (Matrize)
5 ' (A)5OTCCCGTTTCGTCTCGTTCCGCAGGGTCCTATAGTGAGTCGTATTA 3 ' Oligonukleotid-3: (Primer) 5 ' TAATACG ACTCACTATAG G 3 ' Alle Oligonukleotide wurden bei MWG Biotech, Deutschland, erhalten. Allgemeine Reaktionsbedinungen:
Die Primer-Extentionsreaktion wird bei 370C für 15 min im Puffer 1 durchgeführt. Unter diesen Bedingungen bei angezeigten Polymerase- und Nukleotid-Konzentrationen 5 werden in einem Zyklus von 15 min über 95% aller extensionsfähigen Primer-Matrize- Komplexe verlängert.
Vorbereitung der festen Phase für die zyklischen Reaktionen:
Drei Violen mit paramagnetischen Teilchen werden vereinigt und in Puffer 1 gewaschen, LO danach wird feste Phase in 200 μl Puffer 1 als Suspension aufgelöst. Anschließend wird Oligonukleotid-1 an die feste Phase gebunden : eine Lösung mit Oligonukleotid-1 (7 μl 100 μM in Wasser) wird zu der festen Phase zugegeben und für 10 min bei RT gerührt. Anschließend wird feste Phase mit Puffer 1 gewaschen. Anschließend wird eine Lösung mit Oligonukleotid-2 (5 μl 100 μM in Wasser) zusammen mit einer Lösung mit L5 Oligonukleotid-3 (5 μl 100 μM in Wasser) zur festen Phase zugegeben und bei 37°C für 10 min inkubiert. Anschließend wird die feste Phase in Puffer 1 gewaschen. Eine solche feste Phase kann in enzymatischen Reaktionen verwendet werden, sie schließt eine Matrize (Oligonukleotid-2) und einen Primer (Oligonukleotid-3) ein.
10 ES wird ein Aliquot dieser festen Phase (15% von der Gesamtmenge der festen Phase) entnommen (Probe 1). Zu diesem Aliquot wird Puffer 1 bis zum Volumen von 90 μl zugegeben. Anschließend wird ein Gemisch mit dC-Analog (10 μl 100 μmol/l Nukleotid- Anteil im Puffer 1) zugegeben und 15 min bei 370C inkubiert. Anschließend, wird die feste Phase mit Puffer 1 mehrmals gewaschen. Diese Probe 1 dient als Kontrolle der
15 unspezifischen Bindung von dC-Analog an die feste Phase.
Zyklische Reaktionen:
Alle Inkubationsschritte mit Polymerasen und Nukleotid-Analoga werden in einem Volumen von 100 μl im Puffer 1 durchgeführt. 10
1. Bindung der Polymerase:
Eine Lösung mit Polymerase (5 μl im Herstellerpuffer) wird zur festen Phase zugegeben und 5 min bei RT inkubiert. Anschließend wird die feste Phase mit Puffer 1 gewaschen. Polymerasen bleiben dabei an den Nukleinsäuren gebunden. Die feste Phase wird in 100 15 μl Puffer 1 suspendiert.
2. Zugabe von Nukleotiden und Nukleotid-Analoga: Es wird eine Lösung von dATP (5 μl 1 mmol/l) sowie dC-Analog (10 μl 100 μmol/l) im Puffer 1 zur festen Phase zugegeben. Die feste Phase wird mit genannten Komponenten bei 37°C für 15 min inkubiert. Anschließend wird die feste Phase mit Puffer 1 gewaschen und ein Aliquot entnommen (Probe 2). Die Probe 2 enthält an die Primer(N+2) gekoppelten dC-Analoga. Es ist nur ein einziges dC-Anaiog eingebaut, da der markomolekulare sterisch anspruchsvolle Ligand, den weiteren Synthesefortschreiten inhibiert.
3. Abspaltung des makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden und Modifikation des Linker- Rest: Die feste Phase wird nun mit Puffer 2 gewaschen. Anschließend wird die feste Phase zunächst mit einer Lösung mit DTT (100 μl 50 mmol/l in Puffer 2) für 10 min bei RT und danach mit einer Lösung mit Iodacetamid (100 μl 0,2 mol/l in Puffer 2) für 10 min bei RT inkubiert. Es wird ein weiteres Aliquot entnommen (Probe 3). Die Probe 3 enthält die Primer(N+2) mit Linker-Rest am eingebauten dC-Analog, der sterisch anspruchsvolle Ligand wurde abgespalten und die freie Merkaptogruppe wurde modifiziert.
4. Bindung der Polymerase:
Anschließend wird die feste Phase mit Puffer 1 gewaschen und es wird Schritt 1 wiederholt: weitere 5 μl Vent exo minus Polymerase im Herstellerpuffer werden zugegeben. Nach 5 min bei RT wird die feste Phase mehrmals mit Puffer 1 gewaschen.
5. Zugabe von Nukleotid-Analoga:
Es wird dC-Analog (10 μl 100 μmol/l) im Puffer 1 zur festen Phase zugegeben. Die feste Phase wird bei 37°C für 15 min inkubiert. Anschließend wird die feste Phase mit Puffer 1 gewaschen und ein Aliquot entnommen (Probe 4). Die Probe 4 enthält an die Primer(N+3) gekoppelten dC-Analoga. Es ist nun ein weiteres dC-Analog eingebaut.
6. Abspaltung des makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden und Modifikation des Linker-Rest (s.oben). Es wird ein Aliquot entnommen (Probe 5). Die Probe 5 enthält die Primer(N+3) mit Linker-Rest am eingebauten dC-Analog, der sterisch anspruchsvolle Ligand wurde abgespalten und die freie Merkaptogruppe wurde modifiziert.
7. Bindung der Polymerase:
Anschließend wird die feste Phase mit Puffer 1 gewaschen und es wird Schritt 1 wiederholt: weitere 5 μl Vent exo minus Polymerase im Herstellerpuffer werden zugegeben. Nach 5 min bei RT wird die feste Phase mehrmals mit Puffer 1 gewaschen. 8. Zugabe von Nukleotid-Analoga :
Es wird dC-Analog (10 μl 100 μmol/l) im Puffer 1 zur festen Phase zugegeben. Die feste Phase wird bei 37°C für 15 min inkubiert. Anschließend wird die feste Phase mit Puffer 1 gewaschen und ein Aliquot entnommen (Probe 6). Die Probe 6 enthält an die Primer(N+4) gekoppelten dC-Analoga. Es ist nun ein weiteres dC-Analog eingebaut.
Die elektrophoretische Trennung von Proben 1 bis 6 erfolgte mittels 6% (w/v)
Polyacrylamid-Gel in 50 mmol/l Tris-HCI, pH 8,5, bei 200 V auf Apparatur Miniprotean
(Biorad, Deutschland). Die Elektrophorese erfolgte bei 600C.
Legende zur Fig. 20:
Spur 1 : Leiter (dC-Analog (obere Bande) und Oligonukleotid-3, markiert mit Cy3-
Farbstoff am 3 '-Ende (untere Bande)
Spur 2 = Probe 1 (Kontrolle der unspezifischen Bindung von dC-Analog an die feste Phase)
Spur 3 = Probe 2 (Einbau des l.dC-Analogs)
Spur 4 = Abspaltung von sterisch anspruchsvollen Liganden mit Markern
Spur 5 = Probe 2 (Einbau des 2.dC-Analogs)
Spur 6 = Abspaltung von sterisch anspruchsvollen Liganden mit Markern Spur 7 = Probe 2 (Einbau des 3.dC-Analogs)
In diesem Beispiel ist die reversible Terminierung der Synthese mittels erfindungsgemößen modifizierten Nuk-Makromolekülen mit einem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden demonstriert.
Ähnlich zu dCTP-AA-SS-(PEG)8-Biotin-SA-Cy3 und dCTP-AA-SS-(PEG)8-Biotin-SA*PE
(siehe Beispiel 11) können auch andere Nukleotide modifiziert werden. Folgende
Verbindungen stellen Beispiele für reversible Terminatoren mit makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden dar: dUTP-AA-SS-(PEG)8-Biotin-SA dCTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA dATP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA dGTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA
dUTP-AA-SS-(PEG)8-Biotin-SA*PE dCTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA*PE dATP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA*PE dGTP-PA-SS-(PEG)8-Biotin-SA*PE Diese Verbindungen werden von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase, Sequenase, Vent Exo minus Polymerase, Taq-Polymerase, Pwo Polymerase) als Substrat akzeptiert und können als reversible Terminatoren in Sequenzierungsreaktionen eingesetzt werden.
Beispiel 16
Beispiele für Anwendungen von modifizierten Nuk-Makromolekülen bei der
Sequenzierung auf Einzelmolekülebene. Es sind mehrere Patentanmeldungen veröffentlicht, die verschiedene Anwendungen und Ausführungsformen der Sequenzierung durch die Synthese beschreiben (WO02088382, DE 102004025746, DE 10120798, DE 10246005, EP1692312, EP1766090, WO2007100637). Diese Dokumente sind hier zitiert und eingebaut in vollem Umfang als Literaturstellen (im Sinne „incorporated by reference" in vollem Umfang). Nachfolgend, sollen einige beispielhafte Ausführungsformen beschrieben werden, in denen modifizierte Nuk-Makromoleküle mit sterisch anspruchsvollen makromolekularen Liganden eingesetzt werden können.
Bei solchen Verfahren geht es um Ausbildung von extensionfährigen Primer-Matrize- Komplexen an einer festen Phase, deren Primer in zyklischen Schritten verlängert werden und Signale von eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen detektiert werden. Die feste Phase kann in Form einer planen Oberfläche oder in Form von Nano- oder Mikroteilchen (z.B. Kügelchen) vorliegen. Die Kügelchen können auch an einer planen Oberfläche verteilt sein, so dass ein zweidimensionales Array entsteht. Solche feste Phasen sind vorzugsweise Bestandteile von Kits zur Sequenzierung.
Die einzelnen extesionsfähige Primer-Matrize-Komplexe (ein Matrizenmolekül bindet ein Primer-Molekül) sind vorzugsweise an die feste Phase in einer Dichte gebunden, die optische Zuordnung von Einbauereignissen (z.B. Fluoreszenzsignale von eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen) an einzelnen Primer-Matrize-Komplexen erlaubt (WO02088382, DE 102004025746,). Als Detektionsvorreichtug können beispielsweise Fluoreszenzmikroskope dienen (DE 10246005). Die auf diese Weise vorbereitete feste Phase ermöglicht Betrachnung von zyklischen Reaktionen an der festen Phase auf dem Niveau von einzelnen Molekülen (z.B. DE 102004025746). Dabei wird die Oberfläche abgescannt und die Position einzelner Signale auf der Oberfläche detektiert, so dass jeder extesionsfähige Primer-Matrize-Komplex die für ihn charakteristische Position mit Koordiaten (X, Y) auf der Oberfläche erhält. Bei wiederholten Scann-Zyklen können Signale den jeweiligen Primer-Matrize-Komplexen zugewiesen werden. Als Material können verschiedene Nukleinsäureketten verwendet werden: Es können sowohl vorselektionierte DNA-Sequenzen (z.B. isolierte PCR-Fragmente, in YAC-, PAC-, oder BAC-Vektoren (R. Anand et al. NAR 1989 v.17 S.3425, H. Shizuya et al. PNAS 1992 v.89 S.8794, "Construction of bacterial artificial chromosome libraries using the modified PAC System" in "Current Protocols in Human genetics" 1996 John Wiley & Sons Inc.) klonierte Abschnitte eines Genoms) als auch nicht vorselektionierte DNA (z.B. genomische DNA, cDNA-Gemische, PCR-Fragmenten Gemische, mRNA Gemische, Oligonucleotid- Bibiotheken) verwendet werden. Durch eine Vorselektion ist es möglich, im Vorfeld relevante Informationen, wie z.B. Sequenz-Abschnitte aus einem Genom oder Populationen an Genprodukten, aus der große Menge genetischer Informationen herauszufiltern und damit die Menge der zu analysierenden Sequenzen einzuschränken.
Vorbereitung des Materials Ziel der Materialvorbereitung ist es, gebundene einzelsträngige NSKFs mit einer Länge von vorzugsweise 50-1000 NTs, einer einzelnen Primerbindungsstelle und einem hybridisierten Primer (gebundene NSKF-Primer-Komplexe) zu erhalten. Im einzelnen können sehr variable Konstruktionen aus dieser allgemeinen Struktur abgeleitet werden. Zur Verbesserung der Anschaulichkeit folgen nun einige Beispiele, wobei die angeführten Methoden einzeln oder in Kombination eingesetzt werden können.
Erzeugung kurzer Nukleinsäurekettenfragmente (50-1000 NTs) (Fragmentierungsschritt) Wichtig ist, dass die Fragmentierung der NSKs so erfolgt, dass Fragmente erhalten werden, die überlappende Teilsequenzen der Gesamtsequenzen darstellen. Dies wird durch Verfahren erreicht, bei denen unterschiedlich lange Fragmente als Spaltprodukte in zufallsmäßiger Verteilung entstehen.
Erfindungsgemäß kann die Erzeugung der Nukleinsäurekettenfragmente (NSKFs) durch mehrere Methoden erfolgen, z.B. durch die Fragmentierung des Ausgangsmaterials mit Ultraschall oder durch Endonukleasen oder durch Einwirkung von Säuren (z.B. HCL) ("Molecular cloning" 1989 J.Sambrook et al. CoId Spring Harbor Laborotary Press), wie z.B. durch unspezifische Endonukleasegemische. Erfindungsgemäß wird die Ultraschall-Fragmentierung bevorzugt. Man kann die Bedingungen so einstellen, dass Fragmente mit einer durchschnittlichen Länge von 100 bp bis 1 kb entstehen. Diese Fragmente werden an- schließend an ihren Enden durch das Klenow-Fragment (E.coli-Polymerase I) oder durch die T4-DNA-Polymerase aufgefüllt ("Molecular cloning" 1989 J.Sambrook et al. CoId Spring Harbor Laborotary Press). Ausserdem können aus einer langen NSK unter Verwendung randomisierter Primer komplementäre kurze NSKFs synthetisiert werden. Besonders bevorzugt wird diese Methode bei der Analyse der Gen-Sequenzen. Dabei werden an der mRNA einzelsträngige DNA-Fragmente mit randomisierten Primern und einer reversen Transkriptase gebildet (Zhang-J et al. BiochemJ. 1999 v.337 S.231, Ledbetter et al. J.Biol.Chem. 1994 v.269 S.31544, KoIIs et al. Anal.Biochem. 1993 v.208 S.264, Decraene et al. Biotechniques 1999 v.27 S.962).
Einführung einer Primerbindungsstelle in das NSKF.
Die Primerbindungsstelle (PBS) ist ein Sequenzabschnitt, der eine selektive Bindung des Primers an das NSKF ermöglichen soll.
In einer Ausführungsform können die Primerbindungsstellen unterschiedlich sein, so dass mehrere unterschiedlche Primer verwendet werden müssen. In diesem Fall können bestimmte Sequenzabschnitte der Gesamtsequez als natürliche PBSs für spezifische Primer dienen. Diese Ausführungsform ist besonders für die Untersuchung bereits bekannter SNP- Stellen geeignet.
In einer anderen Ausführungsform ist es aus Gründen der Vereinfachung der Analyse günstig, wenn eine einheitliche Primerbindungsstelle in allen NSKFs vorhanden ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Primerbindungsstellen daher in die NSKFs extra eingeführt. Auf diese Weise können Primer mit einheitlicher Struktur für die Reaktion eingesetzt werden.
Im folgenden wird diese Ausführungsform detailliert beschrieben.
Die Zusammensetzung der Primerbindungsstelle ist nicht eingeschränkt. Ihre Länge beträgt vorzugsweise zwischen 20 und 50 NTs. Die Primerbindungsstelle kann eine funktionelle Gruppe zur Immobilisation des NSKF tragen. Diese funktionelle Gruppe kann z.B. eine Biotingruppe sein.
Als Beispiel für die Einführung einer einheitlichen Primerbindungsstelle werden im folgenden die Ligation und das Nukleotid-Tailing an DNA-Fragmente beschrieben. a) Ligation:
Dabei wird ein doppelsträngiger Oligonukleotidkomplex mit einer Primerbindungsstelle verwendet. Dieser wird mit kommerziell erhältlichen Ligasen an die DNA-Fragmente ligiert ("Molecular cloning" 1989 J.Sambrook et al. CoId Spring Harbor Laborotary Press). Es ist wichtig, dass nur eine einzige Primerbindungsstelle an das DNA-Fragment ligiert wird. Das erreicht man z.B. durch eine Modifikation einer Seite des Oligonukleotidkomplexes an beiden Strängen. Die modifizierenden Gruppen am Oligonukleotidkompex können zur Immobilisation dienen. Die Synthese und die Modifikation eines solchen Oligonukleotidkomplexes kann nach standardisierten Vorschriften durchgeführt werden. Zur Synthese kann z.B. der DNA-Synthesizer 380 A Applied Biosystems verwendet werden. Oligonucleotide mit einer bestimmten Zusammensetzung mit oder ohne Modifikationen sind aber auch als Auftragssynthese kommerziell erhältlich, z.B. von MWG-Biotech GmbH, Germany.
b) Nukleotid-Tailing:
Statt der Ligation mit einem Oligonukleotid kann man mit einer terminalen Deoxynucleotidyltransferase mehrere (z.B. zwischen 10 und 20) Nukleosid-monophosphate an das 3'-Ende eines ss-DNA-Fragments anknüpfen ("Molecular cloning" 1989 J.Sambrook et al. CoId Spring Harbor Laborotary Press, "Method in Enzymology" 1999 v.303, S.37-38), z.B. mehrere Guanosin-Monophosphate ((G)n-Tailing genannt). Das entstehende Fragment wird zur Bindung des Primers, in diesem Beispiel eines (C)n-Primers, verwendet.
Einzelstrang-Vorbereitung
Für die Sequenzierungsreaktion werden einzelsträngige NSKFs benötigt. Falls das Ausgangsmaterial in doppelsträngiger Form vorliegt, gibt es mehrere Möglichkeiten, aus doppelsträngiger DNA eine einzelsträngige Form zu erzeugen (z.B. Hitze-Denaturierung oder Alkali-Denaturierung) ("Molecular cloning" 1989 J.Sambrook et al. CoId Spring Harbor Laborotary Press).
Primer für die Sequenzierungsreaktion
Dieser hat die Funktion, den Start an einer einzigen Stelle des NSKF zu ermöglichen. Er bindet an die Primerbindungsstelle im NSKF. Die Zusammensetzung und die Länge des Pri- mers sind nicht eingeschränkt. Außer der Startfunktion kann der Primer auch andere Funktionen übernehmen, wie z.B. eine Verbindung zur Reaktionsoberfläche zu schaffen. Primer sollten so an die Länge und Zusammensetzung der Primerbindungsstelle angepaßt werden, dass der Primer den Start der Sequenzierungsreaktion mit der jeweiligen Polymerase ermöglicht.
Bei der Verwendung unterschiedlicher, beispielsweise natürlich in der ursprünglichen Gesamtsequenz vorkommender Primerbindungsstellen, werden die für die jeweilige Primerbindungsstelle sequenzspezifischen Primer verwendet. In diesem Fall wird für die Sequenzierung ein Primergemisch eingesetzt.
Bei einer einheitlichen, beispielsweise durch die Ligation an die NSKFs angekoppelten Primerbindungsstelle wird ein einheitlicher Primer verwendet.
Vorzugsweise beträgt die Länge des Primers zwischen 6 und 100 NTs, optimalerweise zwischen 15 und 30 NTs. Der Primer kann eine Funktionsgruppe tragen, die zur Immobilisierung des NSKF dient, beispielsweise ist eine solche Funktionsgruppe eine Biotingruppe (s. Abschnitt Immobilisierung). Sie soll die Sequenzierung nicht stören. Die Synthese eines solchen Primers kann z.B. mit dem DNA-Synthesizer 380 A Applied Biosystems ausgeführt werden oder aber als Auftragssynthese bei einem kommerziellen Anbieter, z.B. MWG-Biotech GmbH, Germany erstellt werden).
Der Primer wird in einer Ausführungsform auf der Oberfläche fixiert, wie in dieser Anmeldung beschrieben ist. Der Primer oder das Primergemisch wird mit NSKFs unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert, die ihn selektiv an die Primerbindungsstelle des NSKF binden lassen. Diese Primer-Hybridisierung (Annealing) kann vor (1), während (2) oder nach (3) der Bindung der NSKFs an die Oberfläche erfolgen. Die Optimierung der Hybridisierungsbedingungen hängt von der genauen Struktur der Primerbindungsstelle und des Primers ab und läßt sich nach Rychlik et al. NAR 1990 v.18 S.6409 berechnen. Im folgenden werden diese Hybridisierungsbedingungen als standardisierte Hybridisierungsbedingungen bezeichnet.
Falls eine für alle NSKFs gemeinsame Primerbindungsstelle mit bekannter Struktur beispielsweise durch Ligation eigeführt wird, können Primer mit einheitlicher Struktur eingesetzt werden. Die Primerbindungsstelle kann an ihrem 3'-Ende eine funktionelle Gruppe tragen, die z.B. zur Immobilisation dient. Beispielsweise ist diese Gruppe eine Biotin-Gruppe. Der Primer hat eine zur Primerbindungsstelle komplementäre Struktur. Fixierung von NSKF-Primer-Komplexe an die Oberfläche (Bindung bzw. Immobilisierung von NSKFs). Ziel der Fixierung (Immobilisierung) ist es, NSKF-Primer-Komplexe auf einer geeigneten planen Oberfläche in einer Art und Weise zu fixieren, dass eine zyklische enzymatische Sequenzierungsreaktion ablaufen kann. Dies kann beispielsweise durch Bindung des Primers (s.o.) oder des NSKF an die Oberfläche erfolgen.
Die Reihenfolge der Schritte bei der Fixierung von NSKF-Primer-Komplexen kann variabel sein: l)Die NSKF-Primer-Komplexe können zunächst in einer Lösung durch Hybridisierung
(Annealing) gebildet und anschließend an die Oberfläche gebunden werden. 2)Primer können zunächst auf einer Oberfläche gebunden werden und NSKFs anschließend an die gebundenen Primer hybridisiert werden, wobei NSKF-Primer- Komplexe entstehen (NSKFs indirekt an die Oberfläche gebunden) 3)Die NSKFs können zunächst an die Oberfläche gebunden werden (NSKFs direkt an die Oberfläche gebunden) und im anschließenden Schritt die Primer an die gebundenen NSKFs hybridisiert werden, wobei NSKF-Primer-Komplexe enstehen.
Die Immobilisierung der NSKFs an die Oberfläche kann daher durch direkte oder indirekte Bindung erfolgen.
Falls die Fixierung der NSKF-Primer-Komplexe auf der Oberfläche über die NSKFs erfolgt, kann dies beispielsweise durch die Bindung der NSKFs an einem der beiden Ketten-Enden erfolgen. Dies kann durch entsprechende kovalente, affine oder andere Bindungen erreicht werden. Beispiele für Fixierung von Nukleinsäureketten sind bekannt (McGaII et al. US Pat.
Nr. 5412087, Nikiforov et al. US Pat. Nr. 5610287, Barrett et al. US Pat. Nr. 5482867,
Mirzabekov et al. US Patent 5981734, "Microarray biochip technology" 2000 M.Schena Eaton Publishing, "DNA Microarrays" 1999 M. Schena Oxford University Press, Rasmussen et al. Analytical Biochemistry v.198, S.138, Allemand et al. Biophysical Journal 1997, v.73,
S.2064, Trabesinger et al. Analytical Chemistry 1999, v.71, S.279, Osborne et al. Analytical
Chemistry 2000, v.72, S.3678, Timofeev et al. Nucleic Acid Research (NAR) 1996, v.24
S.3142, Ghosh et al. NAR 1987 v.15 S.5353, Gingeras et al. NAR 1987 v.15 S.5373, Maskos et al. NAR 1992 v.20 S.1679).
Nachdem die Primer-Matrize-Komplexe vorbereitet sind, wird eine zyklische Reaktion gestartet. Dabei werden die modifizierten Nuk-Makromoleküle eingesetzt. Die Reaktion verläuft in mehreren Zyklen: • Inkubation von mindestens einer Art der modifizierten Nuk-Makromoleküle nach Aspekten 1 bis 25 zusammen mit einer Art der Polymerase nach Aspekt 31 mit den in Schritten a und b bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären modifizierten Nuk-Makromolekülen zulassen, wobei jede Art der modifizierten Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische
Markierung besitzt.
• Entfernung der nicht eingebauten modifizierten Nuk-Makromoleküle von den NSK- Primer-Komplexen
• Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen
• Entfernung der Linker-Komponente, des sterisch anspruchsvollen Liganden sowie der Marker-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen
• Waschen der NSK-Primer-Komplexe
Diese Schritte können mehrmals wiederholt werden, so dass aus der Reihenfolge der detektierten Signale von eingebauten Nukleotid-Analoga die komplementäre Sequenz der Matrize rekonstruiert werden kann. Die Wiederholung kann beispielsweise 1 bis 2, 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 2000 mal durchgeführt werden.
Die Inkubationszeiten in einem Zyklus werden so gewählt, dass die Polymerasen an mehr als 50% der an der Sequenzierungsreaktion beteiligten NSKFs (extensionsfähige NSKF- Primer-Komplexe) in einem Zyklus ein markiertes modifiziertes Nuk-Makromolekül einbauen können, vorzugsweise an mehr als 90%.
Die farbigen Kodierungsschema für modifizierte Nuk-Makromoleküle können unterschiedlich sein : Einen Zyklus kann man durchführen mit:
a) vier verschieden markierten modifizierten Nuk-Makromolekülen b) zwei verschieden markierten modifizierten Nuk-Makromolekülen c) einem markierten modifizierten Nuk-Makromolekülen d) zwei verschieden markierten modifizierten Nuk-Makromolekülen und zwei unmarkierten modifizierten Nuk-Makromolekülen,
d.h. a) Man kann alle 4 modifizierte Nuk-Makromoleküle mit verschiedenen Farbstoffen markieren und alle 4 gleichzeitig in die Reaktion einsetzten. Dabei erreicht man die Sequenzierung einer Nukleinsäurekette mit einer minimalen Anzahl von Zyklen. Diese Variante der Erfindung stellt allerdings hohe Anforderungen an das Detektionssystem : 4 verschiedene Farbstoffsignale müssen in jedem Zyklus identifiziert werden.
b) Zur Vereinfachung der Detektion kann eine Markierung mit zwei Farbstoffen gewählt werden. Dabei werden 2 Paare von modifizierten IMuk-Makromolekülen gebildet, die jeweils verschieden markiert sind, z.B. A und G tragen die Markierung "X", C und U tragen die Markierung "Y". In die Reaktion in einem Zyklus (n) werden 2 unterschiedlich markierte Nukleotid-Analoga gleichzeitig eingesetzt, z.B. C* in Kombination mit A*, und im darauffolgenden Zyklus (n+1) werden dann U* und G* zugegeben.
c) Man kann auch nur einen einzigen Farbstoff zur Markierung aller 4 modifizierte Nuk-Makromoleküle verwenden und pro Zyklus nur ein modifiziertes Nuk-Makromolekül einsetzen.
Zyklen, in denen modifizierte Nuk-Makromoleküle (im Sinne dieser Anmeldung) eingesetzt werden, können sich mit Zyklen abwechseln, in denen nicht modifizierte Nukleotide eingesetzt werden.
Beispielsweise werden zunächst 5 bis 500 zyklische Schritte mit modifizierten Nuk- Makromolekülen durchgeführt, anschließend 1 bis 500 zyklische Schritte mit nicht modifizierten Nukleotiden (z.B. mit natürlich vorkommenden Nukleotiden, dATP, dGTP, dTTP, dCTP oder mit deren Analoga, wie dUTP, dITP oder mit anderen Nukleotid- Analoga, die keinen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden tragen), daraufhin wiederum 10 bis 500 Schritte mit modifizierten Nuk-Makromolekülen usw.
Die Reihnfolge der zugegebenen Nukleotide und die Zykluszahl können variieren. Die Kombinationsmöglichkeiten für Einsatz von modifizierten Nuk-Makromolekülen und die Zykluszahlen wurden oben bereits besprochen (s. Farbiges Kodierungsschema). Die nicht modifizierten Nukleotide können ebenfalls jeweils einzeln, zu zweit oder zudritt zusammen mit einer entsprechenden Polymerase unter Bedingungen, die Extension von Primer-Matrize-Komplexen erlauben, zugegeben werden. Durch limitierte Substrazzufuhr wird eine schrittweise ablaufende Primer-Verlängerung ermöglicht. Es können mehrere Zyklen mit jeweils unterschiedlicher Zusammensetzung von natürlichen Nukleotiden durchgeführt werden, beispielsweise in einem Zyklus werden dATP, dGTP und dCTP zugegeben, im weiteren Zyklus werden dATP, dGTP und dTTP zugegeben, im noch weiteren Zyklus werden dCTP, dGTP und dTTP zugegeben. Weitere Kombinationen sind nahe liegend. Auch alle 4 natürliche Nukleotide können eingesetzt werden, vorausgesetzt, eins davon wird in einer limitierten oder stark verringerten Konzentration zugegeben.
5 Die Zahl der Abwechselungen zwischen den einzelnen Zyklen mit modifizierten und nicht modifizierten Nukleotiden schließt Bereiche von 2 bis 500.
Der Einsatz von Kombinationen aus Schritten mit modifizierten Nuk-Makromolekülen und nicht modifizierten Nukleotiden bietet die Möglichkeit, längere Bereiche der Matrize ohne
10 Verbrauch von reversibel terminierenden Nukleotiden zu überwinden. Dies kann, z.B. von Vorteil sein, wenn ein Primer aus technischen Gründen (z.B. wegen höherer Spezifität) relativ weit von dem zu sequenzierenden Bereich der Matrize hybridisiert wird. Ein weiteres Beispiel für die Einsatzmöglichkeit dieser Ausführungsform des Sequenzierverfahrens ist ein Screening von mRNA- oder cDNA-Molekülen auf
15 Vollständigkeit: die Identifizierung von Exons kann durch die Sequenzierung von relativ kurzen Fragmenten erreicht werden, die Überwindung von für die Analyse irrelevanten Abschnitten kann durch Einbau von natürlichen Nukleotiden erfolgen.
Insgesamt schließt die Anzahl der zyklischen Schritte, in denen reversibel terminierende 2.0 Nukleotid-Analoga mit einem makromolekularen sterischen Hindernis eingesetzt werden, den Bereich zwischen 2 und 10000 ein.
In einer Ausführungsform schließt ein solchen Verfahren folgende Chrakteristika ein: Die Einbaureaktion von NT-Makromolekülen erfolgt gleichzeitig an einer Population
.5 unterschiedlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle, wobei diese Nukleinsäuremoleküle in einer zufälligen Anordnung an die feste Phase gebunden sind (Tcherkassov WO 02088382). Bei diesem Verfahren werden Sequenzen von einzelnen Nukleinsäurekettenmolekülen ermittelt. Die an der enzymatischen Reaktion teilnehmende Primer-Nukleinsäurekomplexe sind in einer Dichte fixiert, die die
50 Detektion der Signale von einzelnen modifizierten Nuk-Makromolekülen ermöglicht, die an ein einzelnes Nukleinsäure-Molekül gekoppelt sind, wobei die Dichte der fixierten Primer oder Nukleinsäuren wesentlich höher liegen kann. Beispielsweise beträgt die Dichte der an der Einbaureaktion teilnehmenden Primer-Nukleinsäurekomplexe von 1 bis 10 Komplexe auf 10μm2, von 1 bis 10 Komplexe auf lOOμm2, von 1 bis 10 Komplexe auf
55 lOOOμm2, von 1 bis 10 Komplexe auf lO.OOOμm2.
Beispiele der Fixierung der Nukleinsäuren an die feste Phase mit einer Auflösung, die Analysen an einzelnen Molekülen erlaubt sind in WO0157248, US Pat. 2003064398, US Pat.2003013101 und WO 02088382 dargestellt. Eine passende Detektionsapparatur ist in der Anmeldung WO 03031947 beschrieben.
Die Zahl der parallel zu analysierenden einzelnen Nukleinsäuremoleküle liegt beispielsweise zwischen 1000 und 100.000, 10.000 bis 1.000.000, 100.000 bis
100.000.000 Moleküle. Wobei die Marker-Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker- Komponente des modifizierten Nuk-Makromoleküls während der Einbaureaktion oder nach der Einbaureaktion von der Nuk- Komponente abgetrennt wird.. Dieses Verfahren zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukleinsäureketten, NSKs) schließt folgende Schritte ein, man :
- Fragmente (NSKFs) einzelsträngiger NSKs mit einer Länge von etwa 50 bis 1000 Nukleotiden erzeugt, die überlappende Teilsequenzen einer Gesamtsequenz darstellen können, man
- die NSKFs unter Verwendung eines einheitlichen oder mehrerer unterschiedlichen Primer in Form von NSKF-Primer-Komplexen auf einer Reaktionsoberfläche in einer zufälligen Anordnung bindet, wobei die Dichte der an die Oberfläche gebudenen NSKF-Primer-Komplexen eine optische Detektion der Signale von einzelnen eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen zuläßt, man
- eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der NSKFs unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man
a) zu den auf der Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die zumindest eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier modifizierte Nuk-Makromoleküle enthält, die eine mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Marker-Komponente haben, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei modifizierte Nuk-Makromoleküle jeweils an die Marker-
Komponente befindlichen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt sind, dass sich die verwendeten modifizierten Nuk-Makromoleküle durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die modifizierten Nuk-Makromoleküle einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden einschließen, wobei die Linker-Komponente mit der
Marker-Komponente und dem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden abspaltbar sind, man
b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein modifiziertes Nuk-Makromolekül verlängert werden, man
c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter modifizierter Nuk-Makromoleküle geeignet sind, man
d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten modifizierten Nuk-Makromoleküle durch Messen des für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff charakteristischen Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man
e) zur Erzeugung unmarkierter (NTs oder) NSKFs die Linker-Komponente und die Marker-Komponente von den am komplementären Strang angefügten
Nuk-Komponenten abspaltet, man
f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Marker-Komponente geeignet sind, man
die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt, wobei man die relative Position einzelner NSKF-Primer-Komplexe auf der Reaktionsoberfläche und die Sequenz dieser NSKFs durch spezifische Zuordnung der in Stufe d) in aufeinanderfolgenden Zyklen an den jeweiligen Positionen detektierten Fluoreszenzsignale zu den modifizierten Nuk-Makromolekülen bestimmt.
Beispiel 17 Vorbereitung der Reaktionsoberfläche
Oberfläche und Reaktionsoberfläche sind vorliegend als gleichwertige Begriffe aufzufassen, außer wenn explizit auf eine andere Bedeutung hingewiesen wird. Als Reaktionsoberfläche dient die Oberfläche einer festen Phase eines beliebigen Materials. Dieses Material ist vorzugsweise enzymatischen Reaktionen gegenüber inert und verursacht keine Störungen der Detektion. Silicon, Glas, Keramik, Kunststoff (z.B. Polycarbonate oder Polystyrole),
Metall (Gold, Silber, oder Alluminium) oder beliebiges anderes Material, das diesen funktionellen Anforderungen genügt, kann verwendet werden. Vorzugsweise ist die
Oberfläche nicht verformbar, denn sonst ist mit einer Verzerrung der Signale bei der wiederholten Detektion zu rechnen.
Die verschiedenen Zyklusschritte erfordern einen Austausch der unterschiedlichen Reaktionslösungen über der Oberfläche. Die Reaktionsoberfläche ist vorzugsweise Bestandteil eines Reaktionsgefäßes. Das Reaktionsgefäß ist wiederum vorzugsweise Bestandteil einer Reaktionsapparatur mit Durchflußvorrichtung. Die Durchflußvorrichtung ermöglicht einen Austausch der Lösungen im Reaktionsgefäß. Der Austausch kann mit einer durch einen Computer gesteuerten Pumpvorrichtung oder manuell erfolgen. Wichtig dabei ist, dass die Oberfläche nicht austrocknet. Vorzugsweise beträgt das Volumen des Reaktionsgefäßes weniger als 50 μl. Idealerweise beträgt sein Volumen weniger als 5 μl.
Falls die Fixierung der NSKF-Primer-Komplexe auf der Oberfläche über die NSKFs erfolgt, kann dies beispielsweise durch die Bindung der NSKFs an einem der beiden Ketten-Enden erfolgen. Dies kann durch entsprechende kovalente, affine oder andere Bindungen erreicht werden (DE 102004025745). Es sind viele weitere Beispiele der Immobilisierung von Nukleinsäuren bekannt (McGaII et al. US Patent 5412087, Nikiforov et al. US Patent 5610287, Barrett et al. US Patent 5482867, Mirzabekov et al. US Patent 5981734, "Microarray biochip technology" 2000 M.Schena Eaton Publishing, "DNA Microarrays" 1999 M. Schena Oxford University Press, Rasmussen et al. Analytical Biochemistry v.198, S.138, Allemand et al. Biophysical Journal 1997, v.73, S.2064, Trabesinger et al. Analytical Chemistry 1999, v.71, S.279, Osborne et al. Analytical Chemistry 2000, v.72, S.3678, Timofeev et al. Nucleic Acid Research (NAR) 1996, v.24 S.3142, Ghosh et al. NAR 1987 v.15 S.5353, Gingeras et al. NAR 1987 v.15 S.5373, Maskos et al. NAR 1992 v.20 S.1679). Die Fixierung kann auch durch eine unspezifische Bindung, wie z.B. durch Austrocknung der NSKFs enthaltenden Probe auf der planen Oberfläche erreicht werden.
Die NSKFs werden auf der Oberfläche beispielsweise in einer Dichte zwischen 10 und 100 5 NSKFs pro 100 μm2, 100 bis 10.000 pro 100 μm2, 10.000 bis 1.000.000 pro lOOμm2 gebunden.
Die für die Detektion notwendige Dichte von extensionsfähigen NSKF-Primer-Komplexen beträgt in einer Ausführungsform ca. 1 bis 100 pro 100 μm2. Sie kann vor, während oder 10 nach der Hybridisierung der Primer an die NSKFs erreicht werden.
Beispielhaft werden im folgenden einige Methoden zur Bindung von NSKF-Primer- Komplexen näher dargestellt: In einer Ausführungsform erfolgt die Immobilisierung der NSKFs über Biotin-Avidin oder Biotin-Streptavidin-Bindung. Dabei wird Avidin oder
15 Streptavidin auf der Oberfläche kovalent gebunden, das 5'-Ende des Primers enthält Biotin. Nach der Hybridisierung der markierten Primer mit den NSKFs (in Lösung) werden diese auf der mit Avidin/Streptavidin beschichteten Oberfläche fixiert. Die Konzentration der mit Biotin markierten Hybridisierungs-Produkte sowie die Zeit der Inkubation dieser Lösung mit der Oberfläche wird so gewählt, dass eine für die Sequenzierung geeignete Dichte bereits in
ZO diesem Schritt erreicht wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die für die Sequenzierungsreaktion geeigneten Primer vor der Sequenzierungsreaktion auf der Oberfläche mit geeigneten Methoden fixiert (s.o.). Die einzelsträngigen NSKFs mit jeweils einer Primerbindungsstelle
15 pro NSKF werden damit unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert (Annealing). Dabei binden sie an die fixierten Primer und werden dadurch gebunden (indirekte Bindung), wobei Primer-NSKF-Komplexe entstehen. Die Konzentration der einzelsträngigen NSKFs und die Hybridisierungsbedingungen werden so gewählt, dass man eine für die Sequenzierung geeignete Immobilisationsdichte von 1 bis 100 extensionsfähigen NSKF-Primer-
50 Komplexen pro 100 μm2 erreicht. Nach der Hybridisierung werden ungebundene NSKFs durch einen Waschschritt entfernt. Bei dieser Ausführungsform wird eine Oberfläche mit einer hohen Primerdichte bevorzugt, z.B. ca. 1.000.000 Primer pro lOOμm2 oder noch höher, da die gewünschte Dichte an NSKF-Primer-Komplexen schneller erreicht wird, wobei die NSKFs nur an einen Teil der Primer binden.
)5
In einer anderen Ausführungsform werden die NSKFs an die Oberfläche direkt gebunden (s.o.) und anschließend mit Primern unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert. Bei einer Dichte von ca. 1 bis 100 NSKFs pro lOOμm2 wird man versuchen alle verfügbaren NSKFs mit einem Primer zu versehen und für die Sequenzierugnsreaktion verfügbar zu machen. Dies kann z.B. durch hohe Primerkonzentration, beispielsweise 1 bis 100 mmol/l, erreicht werden. Bei einer höheren Dichte der fixierten NSKFs auf der Oberfläche, beispielsweise 10.000 bis 1.000.000 pro lOOμm2, kann die für die optische Detektion notwendige Dichte der NSKF-Primer-Komplexe während der Primer-Hybridisierung erreicht werden. Dabei sind die Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Zeit, Puffer, Primerkonzentration) so zu wählen, dass die Primer nur an einen Teil der immobilisierten NSKFs binden.
Falls eine gelartige feste Phase (Oberfläche eines Gels) verwendet wird, so kann dieses Gel z.B. ein Agarose- oder Polyacrylamidgei sein (DE 101 49 786). Durch die Bindung der NSKF-Primer-Komplexe auf der Oberfläche ist die Detektion der Fluoreszenzsignale von eingebauten Nukleotid-Analoga möglich. Das Gel ist vorzugsweise auf einer festen Unterlage befestigt. Diese feste Unterlage kann Silicon, Glas, Keramik, Kunststoff (z.B. Polycarbonate oder Polystyrole), Metall (Gold, Silber, oder Alluminium) oder beliebiges anderes Material sein. Für Beispiele der Vorbereitung der festen Unterlage siehe DE 102004025746 .
Weitere Beispiele für Herstellung einer Reaktionsoberfläche sind bekannt (US2005244863, EP1105529)
Die Reatkionsoberfläche kann als eine kontinuierliche Oberfläche oder als diskontinuierliche, aus einzelnen kleinen Bestandteilen zusammengesetzte Oberfläche hergestellt werden(z.B. Primer-Matrizenkomplexe können an Agarose-Kügelchen oder Dextran-Kügelchen gebunden werden). Die Dichte der Kügelchen auf der Oberfläche liegt beispielsweise in folgenden Bereichen zwischen 1 und 10 pro 100 μm2 , 10 und 100 pro 100 μm2, 100 bis 10.000 pro 100 μm2, 10.000 bis 1.000.000 pro lOOμm2.
Die Reaktionsoberfläche muß groß genug sein, um die notwendige Anzahl der NSKFs bei entsprechender Dichte immobilisieren zu können. Die Reaktionsoberfläche sollte vorzugsweise nicht größer als 20 cm2 sein.
Falls die Oberfläche einer festen Phase (z.B. Silikon oder Glas) zur Immobilisation verwendet wird, kann sie beispielsweise nach DE 102004025745 vorbereitet werden.
Die Detektion kann erfolgen wie in WO02088382 oder DE10246005 beschrieben.
Die Analyse von Nukleinsäuren kann unterschiedliche Fragestellungen einschließen : (Am Beispiel der Sequenzanalyse mit vier gleich markierten modifizierten Nuk- Makromolekülen)
3A. Rekonstruktion der ursprünglichen Sequenzen nach dem Schrotschuß-Prinzip ("Automated DNA sequencing and analysis" S. 231 ff. 1994 M. Adams et al. Academic
Press, Huang et al. Genom Res. 1999 v.9 S.868, Huang Genomics 1996 v.33 S.21, Bonfield et al. NAR 1995 v.23 S.4992, Miller et al. J.Comput.Biol. 1994 v.l S.257). (Dieses Prinzip ist insbesondere bei der Analyse neuer, unbekannter Sequenzen geeignet.)
3A-1 Sequenzierung eines langen DNA-Stücks
Im folgenden soll anhand der Sequenzierung eines IMb langen DNA-Stückes schematisch die Sequenzierung langer Nukleinsäureketten dargestellt werden. Der Sequenzierung liegt das Shotgun-Prinzip zugrunde ("Automated DNA sequencing and analysis" S. 231 ff. 1994 M. Adams et al. Academic Press, Huang et al. Genom Res. 1999 v.9 S.868, Huang Genomics 1996 v.33 S.21, Bonfield et al. NAR 1995 v.23 S.4992, Miller et al. J.Comput.Biol. 1994 v.l S.257). Das zu analysierende Material wird für die Sequenzierungsreaktion vorbereitet, indem es in Fragmente von vorzugsweise 50 bis 1000 bp Länge zerlegt wird. Jedes Fragment wird anschließend mit einer Primerbindungsstelle und einem Primer versehen. Dieses Gemisch aus verschiedenen DNA-Fragmenten wird nun auf einer planen Oberfläche fixiert. Die nicht gebundenen DNA-Fragmente werden durch einen Waschschritt entfernt. Danach wird die Sequenzierungsreaktion an der gesamten Reaktionsoberfläche durchgeführt. Zur Rekonstruktion einer 1 Mb langen DNA-Sequenz sollten die Sequenzen von
NSKFs durchschnittlich von etwa 100 NTs lang sein.
Insgesamt ist zur Rekonstruktion der ursprünglichen Sequenz die etwa 10- bis 100- fache Menge an Rohsequenzen erforderlich. Die ermittelten NSKF-Sequenzen stellen eine Population von überlappenden
Teilsequenzen dar, die sich mit kommerziell erhältlichen Programmen zur Gesamtsequenz der NSK zusammenfügen lassen ("Automated DNA sequencing and analysis" S. 231 ff. 1994 M. Adams et al. Academic Press , Huang et al. Genom Res. 1999 v.9 S.868, Huang Genomics 1996 v.33 S.21, Bonfield et al. NAR 1995 v.23 S.4992, Miller et al. J.Comput.Biol. 1994 v. l S.257). A-2 Sequenzierung der Genprodukte am Beispiel der cDNA-Sequenzierung In einer bevorzugten Ausführungsform können statt einer Sequenz mehrere Sequenzen in einem Ansatz analysiert werden. Die ursprünglichen Sequenzen können aus den gewonnen Rohdaten z.B. nach dem Schrotschuß-Prinzip rekonstruiert werden.
Zunächst werden NSKFs erzeugt. Man kann z.B. mRNA in eine doppelsträngige cDNA überführen und diese cDNA mit Ultraschall fragmentieren. Anschließend werden diese NSKFs mit einer Primerbindungsstelle versehen, denaturiert, immobilisiert und mit einem Primer hybridisiert. Zu beachten ist bei dieser Variante der Probenvorbereitung, dass die cDNA-Moleküle unvollständige mRNA-Sequenzen darstellen können (Method in Enzymology 1999, v.303, S.19 und andere Artikel in diesem Band, "cDNA library protocols" 1997 Humana Press).
Eine andere Möglichkeit bei der Generierung einzelsträngiger NSKFs von mRNA besteht in der reversen Transkription der mRNA mit randomisierten Primern. Dabei werden viele relativ kurze antisense DNA-Fragmente gebildet (Zhang-J et al. Biochem.J. 1999 v.337 S.231, Ledbetter et al. J.Biol.Chem. 1994 v.269 S.31544, KoIIs et al. Anal.Biochem. 1993 v.208 S.264, Decraene et al. Biotechniques 1999 v.27 S.962). Diese Fragmente können anschließend mit einer Primerbindungstelle versehen werden (s.o). Weitere Schritte entsprechen oben beschriebenen Vorgängen.
Mit dieser Methode können komplette mRNA-Sequenzen (vom 51- bis zum 3'-Ende) analysiert werden, da die randomisierten Primer über die gesamte Länge der mRNA binden.
Immobilisierte NSKFs werden mit einer der oben angeführten Ausführungsformen der
Sequenzierung analysiert.
Die Anzahl der NSKFs, die analysiert werden müssen, errechnet sich nach denselben Prinzipien wie bei einer Schrotschuß-Rekonstruktion einer langen Sequenz.
Aus NSKF-Sequenzen werden nach den Prinzipien des Schrotschuß-Verfahrens die ursprünglichen Gensequenzen rekonstruiert.
Diese Methode erlaubt die gleichzeitige Sequenzierung von vielen mRNAs ohne vorherige Klonierung.
Analyse von Sequenzvarianten Die Bestätigung einer bereits bekannten Sequenz oder der Nachweis von Varianten dieser Sequenz stellt sehr viel geringere Ansprüche an die Länge und Redundanz der ermittelten NSKF-Sequenzen. Auch die Sequenzbearbeitung ist in diesem Fall einfacher. Die Vollsequenz braucht nicht neu rekonstruiert zu werden. Die NSKF- 5 Sequenzen werden vielmehr mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Programms der
Vollsequenz zugeordnet und eventuelle Abweichungen detektiert. Einem solchen Programm kann z.B. BLAST oder FASTA Algorithmus zugrunde liegen ("Introduction to computational Biology" 1995 M. S. Waterman Chapman & Hall).
10 Die zu analysierende Sequenz wird mit einer der oben genannten Methoden in NSKFs überführt. Diese NSKFs werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sequenziert, wobei man sowohl einen einheitlichen Primer und eine einheitlihe Primerbindungsstelle als auch unterschiedliche, sequenzspezifische Primer und natürliche, in der zu untersuchenden Gesamtsequenz vorkommende
L5 Primerbindngsstellen verwenden kann. Anschließend werden die ermittelten
Sequenzen von NSKFs nicht nach dem Schrotschuß-Verfahren zusammengestzt, sondern mit der Referenzsequenz verglichen und auf diese Weise ihren Positionen in der Vollsequenz zugeordnet. Dabei kann es sich um genomische oder cDNA- Sequenzen handeln.
>0
Im Gegensatz zu einer Rekonstruktion nach dem Schrotschuß-Verfahren braucht man für die Analyse einer Sequenzvariante erheblich weniger Rohsequenzdaten. So kann die 5- bis 10- fache Rohsequenzmenge ausreichend für die Wiederherstellung einer neuen Variante einer Vollsequenz sein. Mit dem Schrotschuß-Verfahren wird für eine
15 Wiederherstellung eine 10- bis 100-fache Menge an Rohsequenzen benötigt
("Automated DNA sequencing and analysis" S. 231 ff. 1994 M. Adams et al. Academic Press, Huang et al. Genom Res. 1999 v.9 S.868, Huang Genomics 1996 v.33 S.21, Bonfield et al. NAR 1995 v.23 S.4992, Miller et al. J.Comput.Biol. 1994 v.l S.257).
iθ Die Länge der ermittelten NSKF-Sequenzen soll für eine eindeutige Zuordnung zu einer bestimmten Position in der Referenzsequenz ausreichend sein, so können z.B bereits Sequenzen mit einer Länge von 20 NTs (z.B. aus nicht repetitiven Abschnitten im menschlichen Genom) eindeutig identifiziert werden. Für die Vergleichsanalyse der repetitiven Abschnitte werden längere Sequenzen benötigt. Die genaue Länge der
>5 Sequenzen hängt dabei von der Aufgabenstellung ab. Vorzugsweise beträgt die Länge der ermittelten NSKF-Sequenzen bei der Analyse von nicht repetitiven Abschnitten mehr als 20 NTs. Für die Analyse der repetitiven Abschnitte liegt sie vorzugsweise über 500 NTs. Die ermittelte Gesamtsequenzlänge kann dabei aus Abschnitten bestehen, in denen jedes Nukleotid sequenziert wurde und Abschnitten, wo nicht markierte Nukleotide in bekannten Kombinationen zugegeben wurden, so dass eine kalkulierte Primer- Extension stattgefunden hat.
Die Zielsetzungen bei der Sequenzierung neuer Varianten einer bereits bekannten Vollsequenz können sehr unterschiedlich sein. Meist wird ein Vergleich der neu ermittelten Sequenz mit der bekannten Vollsequenz/Referenzsequenz angestrebt. Dabei können die beiden Sequenzen aus evolutionär unterschiedlich weit auseinanderliegenden Spezies stammen. Verschiedene Parameter der Zusammensetzung dieser beiden Sequenzen können verglichen werden. Als Beispiele für eine solche Analyse dienen: Mutations- oder Polymorphismusanalysen und die Analyse von alternativ gespleißten Genprodukten.
Nachfolgend soll schematisch und beispielhaft ein Vergleich der zu untersuchenden Sequenz mit einer Referenzsequenz ohne vorherige Rekonstruktion der zu analysierenden Sequenz betrachtet werden. Ein solcher Vergleich kann z.B. zur Mutations- oder SNP-Analyse dienen. B-1
Eine lange, zu analysierende Sequenz, z.B. 1 Mb, wird in NSKFs mit einer der oben genannten Methode geteilt. Diese NSKFs werden unter Verwendung einheitlicher Primer mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sequenziert. Die ermittelten
Sequenzen von jedem einzelnen NSKF werden direkt mit der Referenzsequenz verglichen. Die Referenzsequenz dient dabei als Grundlage für die Zuordnung ermittelter NSKF-Sequenzen, so dass die aufwendige Rekonstruktion nach dem Schrotschuß-Verfahren entfällt. Vorzugsweise beträgt die Länge der ermittelten NSKF-Sequenzen bei der Analyse von nicht-repetitiven Abschnitten mehr als 20 NTs.
Für die Analyse der repetitiven Abschnitte liegt sie vorzugsweise über 500 NTs. Die Anzahl der zu analysierenden NSKFs richtet sich dabei nach der Gesamtlänge der zu untersuchenden Sequenz, der durchschnittlichen Länge der NSKF-Sequenzen und der notwendigen Genauigkeit der Sequenzierung . Bei einer durchschnittlichen Länge der ermittelten NSKF-Sequenz von 100 NTs, einer Gesamtlänge der zu untersuchenden
Sequenz von 1 Mb und einer Genauigkeit, die der Rohsequenzermittlung entspricht (d.h. jede Stelle soll möglichst nur einmal sequenziert werden) benötigt man z.B. die ca. 5-fache Menge an Rohsequenzen, d.h. 5 Mb, weil die Verteilung der NSKFs über die Gesamtsequenz zufällig erfolgt. Insgesamt müssen 50.000 NSKFs analysiert werden, um mehr als 99% der Gesamtstrecke abzudecken.
Anschließend werden die ermittelten NSKF-Sequenzen mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Programms der Vollsequenz zugeordnet und eventuelle Abweichungen detektiert. Einem solchen Programm kann z.B. BLAST oder FASTA Algorithmus zugrunde liegen ("Introduction to computational Biology" 1995 M. S. Waterman Chapman &. Hall).
Beispiel 18
Zusammensetzung von Kit für Sequenzierung von Nukleinsäuren.
Generell, ein oder mehrere Kits schließen Komponenten (z.B. Einzelsubstanzen,
Kompositionen, Reaktionsgemische) ein, die für die Durchführung von enzymatischen
Einbaureaktionen mit erfindungsgemäßen modifizierten Nuk-Makromolekülen notwendig sind.
Die Zusammensetzung der Kits kann nach Anwendung variieren, wobei die Anwendugen können von einfacher Primer-Extensionsreaktion bis zu zyklischen Sequenzierung reichen auf Einzelmolekülebene reichen.
Beispielsweise Kits, die für zyklische Sequenzierung verwendet werden, können Polymerasen, modifizierte Nuk-Makromoleküle sowie Lösungen für die zyklischen Schritte einschließen.
Die Kits können wahlweise positive und / oder negative Kontrollen einschließen,
Anleitungen zur Durchführung von Verfahren.
Optional können Kits Materialien und Reagentien zur Vorbereitung von Bestandteilen des Kits zur biochemischen Reaktionen oder des genetischen Materials einschließen, z.B. feste Phase für Material-Präparation, feste Phase für Polymerase-Applikation,
Ultrafiltrationsmembran für Umpufferung von modifizierten Nuk-Makromolekülen.
Die Kit-Komponenten sind üblicherweise in handelsüblichen Reaktionsgefäßen bereitgestellt, wobei das Volumen der Gefäße zwischen 0,2 ml und 1 I variieren kann. Es können auch Gefäßarrays, z.B. Mikrotiter-Platten mit Komponenten beladen sein, was eine automatische Zufuhr von Reagentien ermöglicht.
Ein Kit kann folgende Komponenten einschließen: • Eine oder mehrere Polymerasen aus folgender Liste: Klenow Fragment Polymerase,
Klenow exo minus Fragment, T7 DNA Polymerase, Sequenase 2™, Taq Polymerase, Vent™ Polymerase, Deep Vent™ Polymerase, Vent™ exo minus DNA Polymerase, Deep Vent™ exo minus DNA Polymerase, Pwo DNA Polymerase, reverse Transcriptasen, z.B. Moloney Murine Lekemia Virus (M-MLV), Rous Sarcoma Virus (RSV), Avian Myeloblastosis Virus (AMV), Rous Assocciated Virus (RAV), Myeloblastosis Assocciated Virus (MAV), Human Immunodeficiency Virus (HIV). Die Polymerasen werden vorzugsweise in einer Aufbewahrungslösung bereitgestellt, Diese Aufbewahrungslösung kann beispielsweise folgende Substanzen einschließen: o Puffer Tris-HCI, HEPES, Borat, Phosphat, Acetat (Konzentration liegen beispielsweise zwischen 10 mM und 200 mM) o Salze, z.B. NaCI, KCl, NH4CI, die Konzentrationen liegen beispielsweise zwischen 10 mM und 500 mM. o PEG oder anderes inertes Polymer, z.B. Mowiol in Konzentration von 1 bis
50% (w/v) o Glycerin in Konzentration zwischen 1% und 70% o Reduzierende Agentien, z.B, DTT in Konzentration zwischen 0,1 und 50 mM o Weitere Substanzen können in einer Aufbewahrungslösung enthalten sein, die zur Stabilität des Enzyms beitragen. Bespiele für solche Substanzen sind bekannt, siehe Beschriebung von Produkten von Enzym-Herstellern, z.B. Promega, Invitrogen, Roche usw.
• modifizierten Nuk-Makromoleküle (Nukleotid-Analoga), die als Säure oder als Salze vorliegen können (beisielsweise Natrium, Kalium, Ammonium oder Litium können als Ionen verwendet werden). Die modifizierten Nuk-Makromoleküle können in trockender Form oder in Form einer Lösung bereitgestellt werden, z.B. im Wasser oder in einem Puffer, z.B. Tris-HCI, HEPES, Borat, Phosphat, Acetat, oder in einer Aufbewahrungslösung, die folgende Komponenten einzeln oder in Kombination einschließen kann: o Puffer Tris-HCI, HEPES, Borat, Phosphat, Acetat (in Konzentration die beispielsweise zwischen 10 mM und 200 mM liegt) o Salze, z.B. NaCI, KCl, NH4CI, MgCI2, o PEG oder anderes inertes Polymer, z.B. Mowiol in Konzentration von 1 bis
20% (w/v) o Glycerin in Konzentration zwischen 1% und 50% o Marker oder Marker-Einheiten von modifizierten Nuk-Makromolekülen, insbesondere in den Ausführungsformen, in denen zwischen Linker und Marker oder Marker und Kore-Komponente affine Kopplung besteht.
• Buffer-Kompositionen für enzymatische Reaktion, Spaltung, Blockade, Detektion,
Waschschritte: o Spaltungsreagentien, bereitgestellt z.B. als Konzentrierte gepufferte Lösung. Z.B. DTT oder TCEP in Ausführungsformen, in denen der Linker eine spaltbare Disulfid-Brücke einschließt.
o Modifizierende Reagentien bereitgestellt z.B. als Konzentrierte gepufferte
Lösung. Z.B. Iodacetamid oder Iodacetat für Ausführungsformen, in denen der Linker eine Mercaptogruppe nach der Spaltung hat.
o Detektionsreagentien, Signalgebende Marker-Einheiten (für Ausführungsform, in der Marker von modifizierten Nuk-Makromolekülen eine signalvermittelnde
Funktion hat),
■ Beispielsweise schließen modifizierte Nuk-Makromoleküle ein oder mehrere Biotinmoleküle ein. In diesem Fall können z.B. signalgebende Streptavidin-Konjugate (siehe Abschnitt signalgebende
Marker-Einheiten) an solche modifizierten Nuk-Makromoleküle vor dem Detektionsschritt gebunden werden.
■ Beispielsweise schließen modifizierte Nuk-Makromoleküle Streptavidin ein, das noch freie Valenzen für die Bindung von Biotin aufweist. In diesem Fall können biotin-tragende Strukturen (siehe Abschnitt signalgebende Marker-Einheiten) an das modifizierte Nuk- Makromolekül ebenfalls vor dem Detektionsschritt gebunden werden.
o Blockierungsreagentien: zur Unterdrückung von unsepzifischen Adsorption von modifizierten Nuk-Makromolekülen an die Oberflächen der festen Phase, können wahlweise verschiedene Substanzen, z.B. acetyliertes BSA oder PEG 2000 bis PEG 10.000 oder Mowiol oder ähnliche Polymere (verhalten sich gegenüber der enzymatischen Reaktion neutral) im Kit enthalten sein.
• Vorrichtung und Mittel zur Vorbereitung von modifizierten Nuk-Makromolekülen für die Sequenzierungsreaktion. Die Nukleotidanaloga mit makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden können vor dem Gebrauch durch Ultrafiltration vom Aufbewahrungspuffer gereinigt werden. Dafür eignen sich z.B. Ultrafiltrationsvorreichtungen mit MWCO von 50.000 Da (erhältlich z.B. von Millipore oder Sigma-Aldrich). Damit kann nicht nur der Aufbewahrungspuffer sondern auch die eventuell vorliegenden Zerfallsprodukte entfernt werden. Nach der einmaligen Zentrifugation werden die modifizierten Nuk-Makromoleküle im frisch angesetzten Einbaupuffer aufgelöst.
• Mittel zur Vorbereitung von Polymerasen für die Sequenzierungsreaktion.
5 Optionall können Polymerasen von der Hersteller-Lösung befreit werden.
Beispielsweise, kann die Reinigung der Polymerasen durch Absorption an die mit Nukleinsäuren belandenen paramagnetischen Teilchen erfolgen (z.B. Oligonucleotide gebunden an Streptavidin belandene paramagnetische Kügelchen, Promega). Nach der Bindung von Polymerasen an die Nukleinsäuren wird die feste Phase mit
10 Einbaupuffer gewaschen. Die Applikation der Polymerasen in die Reaktion kann entweder direkt mit der festen Phase erfolgen oder die Polymerasen können von der festen Phase bei höherer Salzkonzentration freigesetzt werden. Anstatt fon Bindung an die Nukleinsäuren kann auch die Bindung an einen Anionenaustauscher, z.B. DEAE-Zellulose erfolgen (Batch-Isolierungsmethode zur Umpufferung von
15 Proteinen). Auch eine Gel-filtration (z.B. mit Sephadex 25) oder eine Ultrafiltration kann zur Umpufferung eingesetzt werden. Einem Fachmann sollten weitere Methoden zum Pufferwechsel nahe liegend erscheinen.
• Nukeltide ohne makromolekularen sterischen Hindernis (z.B. dATP, dGTP, dCTP, 2.O dTTP, dUTP, dITP) oder irreversible Terminatoren (z.B. ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP, ddUTP)
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Kit zur Durchführung des Verfahrens der Sequenzierung von Nukleinsäureketten, das eine Reaktionsoberfläche, zur
-5 Durchführung des Verfahrens erforderliche Reaktionslösungen, eine oder mehrere
Polymerasen, und modifizierte Nuk-Makromoleküle enthält, von denen ein bis vier mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, wobei die modifizierten Nuk-Makromoleküle ferner strukturell so modifiziert sind , dass die Polymerase nach Einbau eines solchen modifizierten Nuk-Makromoleküls in einen wachsenden komplementären Strang nicht in
50 der Lage ist, ein weiteres modifiziertes Nuk-Makromolekül in denselben Strang einzubauen, wobei der Marker abspaltbar ist und die strukturelle Modifikation ein abspaltbarer makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand ist. Bei den Nukleotiden handelt es sich vorzugsweise um die oben genannten erfindungsgemäßen modifizierten Nuk-Makromoleküle.
$5
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung enthält das Kit ferner zur Erzeugung von Einzelsträngen aus Doppelsträngen erforderliche Reagenzien, einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle, die als PBS in die NSKFs eingeführt werden, Oligonukleotid-Primer, zur Abspaltung der Fluoreszenzfarbstoffe und sterisch anspruchsvollen Liganden erforderliche Reagenzien und/oder Waschlösungen.
Alle Publikationen, Patente und Patentanmeldungen, die hier zitiert wurden, sind 5 eingebaut in diese Anmeldung in vollem Umfang (auch wenn dies bei jeweiliger Publikation nicht expliziert genannt wurde) und unterliegen laut USPTO den Regelungen für „incorporated by reference" für alle Zwecke in den USA.
Legenden für Figuren:
10 Fig. 8
A) schematische Darstellung einer Polymerase
• DNA-bindender Bereich (1) der Polymerase (Bindung von Primer und Matrize)
• Das aktive Zentrum der Polymerase zur Kopplung von Nukleotiden an den Primer
• Nukleotidbindender Bereich der Polymerase L5
B) Schematische Darstellung eines extensionsfähigen Komplexes aus Polymerase- Primer-Matrize: Matrize-Primer (4)
C) Schematische Darstellung des Komplexes mit einem eingebauten Nukleotid im 10 aktiven Zentrum
• Ein an den Primer gekoppeltes nicht modifiziertes Nukleosid-Monophosphat (5)
• Freie nicht modifizierte Nukleosidtriphosphate (6)
Das eingebaute Nukleotid trägt keine Modifizierung. Freie Nukleotide haben einen ungehinderten Zugang zum nukleotidbindenden Bereich der Polymerase 15 Fig. 9
Schematische Darstellung des Komplexes mit einem eingebauten Nukleotid im aktiven Zentrum
• Ein an den Primer gekoppeltes modifiziertes Nuk-Makromolekül (7).
• freie modifizierte Nuk-Makromoleküle (8) (schematische Darstellung der 10 Nukleiotid-Komponente, des Linkers und des sterisch anspruchsvollen Liganden).
Das eingebaute modifizierte Nuk-Makromolekül trägt einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Ligand. Freie modifizierte Nuk-Makromoleküle haben keinen freien Zugang zum nukleotidbindenen Zentrum der Polymerase. Der sterisch anspruchsvolle Ligand lässt keinen weiteren Liganden in die Nähe dieses >5 Zentrums der Polymerase. Bei einer entsprechend gewählten Linker-Länge zwischen der Nukleotid-Einheit und dem sterischen Liganden kann kein weiteres modifiziertes Nuk-Makromolekül eingebaut werden. Der Linker ist schematisch im gestreckten Zustand in voller Länge gezeigt. Fig. 10
A) Schematische Darstellung des Primer-Matrize-Komplexes mit einer eingebauten Nukleotid-Komponente im aktiven Zentrum • Der sterisch anspruchsvolle Ligand des modifizierten Nuk-Makromoleküls beansprucht einen Raum in unmittelbarer Nähe der Polymerase. Die Linien (9) zeigen schematisch den beanspruchten Raum.
B) Änderung der räumlichen Verhätnisse um die Polymerase herum, beispielsweise durch Bindung weiterer Proteine an die DNA oder Polymerase, kann eventuell zu notwendigen Änderungen in der Linker-Länge zwischen der Nukleotid- Komponente und dem sterischen Hindernis führen.
Fig. 11 Schematische Darstellung des Primer-Matrize-Komplexes mit einer eingebauten
Nukleotid-Komponente im aktiven Zentrum
• Je länger der Linker zwischen der Nukleotid-Komponente und dem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden ist, desto größerer sterisch anspruchsvolle Ligand für die Hinderung der weiteren Synthese sein sollte. Die kleineren Liganden können ihre Wirkung mit der zunehmenden Linker-Länge zwischen der Nukleotid-Komponente und dem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden verlieren.
• Potenzieller sterisch anspruchsvoller Ligand (10), der einen hemmenden Effekt auf die Synthese hat.
Fig. 20
Abbildung von Signalen von zyklischen Schritten in Beispiel 15
Spur 1 : Leiter (dC-Analog (obere Bande) und Oligonukleotid-3, markiert mit Cy3-
Farbstoff am 3 ' -Ende (untere Bande) Spur 2 = Probe 1 (Kontrolle der unspezifischen Bindung von dC-Analog an die feste Phase)
Spur 3 = Probe 2 (Einbau des l .dC-Analogs)
Spur 4 = Abspaltung von sterisch anspruchsvollen Liganden mit Markern
Spur 5 = Probe 2 (Einbau des 2.dC-Analogs) Spur 6 = Abspaltung von sterisch anspruchsvollen Liganden mit Markern
Spur 7 = Probe 2 (Einbau des 3.dC-Analogs)

Claims

Komponenten und Verfahren zur enzymatischen Synthese von Nukleinsäuren
Ansprüche
Anspruch 1: Nukleotid-Analoga (modifizierte Nuk-Makromoleküle), die folgende Komponenten einschließen: zumindest eine Nukleotid-Komponente (Nuk-Komponente), zumindest einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden, zumindest einen Marker, zumindest einen Linker.
Anspruch 2: Nukleotid-Analoga nach Anspruch 1, wobei der jeweilige Linker, der an die Nukleotid-Komponente gekoppelt ist, spaltbar ist.
Anspruch 3: Ein Reaktionsgemisch, das mindestens eines der Nukleotid-Analoga nach Anspruch 1 oder 2 einschließt
Anspruch 4: Eine Komposition, die mindestens eines der Nukleotid-Analoga nach Anspruch 1 oder 2 einschließt
Anspruch 5: Eine Nukleinsäurekette oder ein Gemisch von Nukleinsäureketten, die mindestens eines der Nukleotid-Analoga nach Anspruch 1 oder 2 als Monomer der Nukeinsäurekette einschließen, wobei sich die Nukleinsäureketten sowohl in der Lösung befinden können oder an einer festen Phase fixiert sein.
Anspruch 6: Eine Nukleinsäurekette oder ein Ein Gemisch von Nukleinsäureketten nach Anspruch 5, wobei diese Nukleinsäureketten eine Primerfunktion haben
Anspruch 7: Verfahren zur enzymatischen Synthese von Nukleinsäureketten, bei dem Nukleotid-Analoga nach Anspruch 1 oder 2 eingesetzt werden.
Anspruch 8: Ein Verfahren zur Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Schritte einschließt: o Bereitstellung von extensionsfähigen Matrize-Primer-Komplexen o Inkubation dieser Komplexe in einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Polymerase-Arten und zumindest eine Art der modifizierten
Nuk-Makromoleküle nach Anspruch 2 enthält, unter Bedingungen, die eine Primer-Verlängerung um ein modifiziertes Nuk-Makromolekül erlauben, wobei das modifizierte Nuk-Makromolekül in Art und Weise modifiziert ist, dass sein Einbau zu einem Stopp in der weiteren enzymatischen Reaktion führt.
Anspruch 9: Kit zur Durchführung der enzymatischen Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Elemente einschließt: o Eine oder mehrere Arten der Polymerasen o Zumindes eins der Nukleotid-Analoga, nach Anspruch 1 oder 2
Anspruch 10: Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten, das folgende Elemente einschließt: o Eine oder mehrere Arten der Polymerasen o Zumindes eins der Nukleotid-Analoga, nach Anspruch 2
Anspruch 11: Ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleisäureketten, das folgende Schritte einschließt:
a) Bereitstellung von mindestens einer Population an extensionsfähigen Nukleinsäureketten-Primer-Komplexen (NSK-Primer-Komplexe)
b) Inkubation von mindestens einer Art der modifizierten Nuk-
Makromoleküle nach Anspruch 2 zusammen mit zumindest einer Art der Polymerase mit den im Schritt (a) bereitgestellten NSK-Primer- Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären modifizierten Nuk-Makromolekülen zulassen, wobei jede Art der modifizierten Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische
Markierung besitzt.
c) Entfernung der nicht eingebauten modifizierten Nuk-Makromoleküle von den NSK-Primer-Komplexen
d) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen
e) Abspaltung der Linker-Komponente sowie der Marker-Komponente und des makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden von den in die
NSK-Primer-Komplexe eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen
f) Waschen der NSK-Primer-Komplexe gegebenenfalls Wiederholung der Schritte (b) bis (f),
Anspruch 12: Ein Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Nukleinsäureketten an eine feste Phase in zufälliger Anordnung gekoppelt sind und zumindes ein Teil dieser NSK- Primer-Komplexen optisch einzeln adressierbar ist
Anspruch 13: Ein Verfahren nach Anspruch 11 zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukleinsäureketten, NSKs), bei dem man
Fragmente (NSKFs) einzelsträngiger NSKs mit einer Länge von etwa 50 bis 1000 Nukleotiden erzeugt, die überlappende Teilsequenzen einer Gesamtsequenz darstellen können, man
die NSKFs unter Verwendung eines einheitlichen oder mehrerer unterschiedlichen Primer in Form von NSKF-Primer-Komplexen auf einer
Reaktionsoberfläche in einer zufälligen Anordnung bindet, wobei die Dichte der an die Oberfläche gebudenen NSKF-Primer-Komplexen eine optische Detektion der Signale von einzelnen eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen zuläßt, man
eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der NSKFs unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man a) zu den auf der Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier modifizierte Nuk-Makromoleküle nach Anspruch 2 enthält, die eine mit fluoreszierenden Elementen markierte Marker-Komponente haben, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei modifizierte Nuk- Makromoleküle jeweils an die Marker-Komponente befindlichen fluoreszierenden Elementen so gewählt sind, dass sich die verwendeten modifizierten Nuk-Makromoleküle durch Messung unterschiedlicher Fluo- reszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die modifizierten Nuk-Makromoleküle strukturell so modifiziert sind, dass die Polymerase nach Einbau eines solchen modifizierten Nuk-Makromoleküls in einen wachsenden komplementären Strang nicht in der Lage ist, ein weiteres Nuk-Nakromolekül in denselben Strang einzubauen, wobei die Linker-
Komponente mit der Marker-Komponente und dem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden abspaltbar sind, man b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein modifiziertes Nuk- Makromolekül verlängert werden, man
c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter modifizierter Nuk-Makromoleküle geeignet sind, man
d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten modifizierten Nuk-Makromoleküle durch Messen des für den jeweiligen fluoreszierenden Elementen charakteristischen Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man
e) zur Erzeugung unmarkierter NSKFs die Linker-Komponente und die Marker-Komponente, sowie den makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden von den am komplementären Strang angefügten modifizierten Nuk-Komponenten abspaltet, man
f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Marker-Komponente geeignet sind, man
die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,
wobei man die relative Position einzelner NSKF-Primer-Komplexe auf der Reaktionsoberfläche und die Sequenz dieser NSKFs durch spezifische Zuordnung der in Stufe d) in aufeinanderfolgenden Zyklen an den jeweiligen Positionen detektierten Fluoreszenzsignale zu den modifizierten Nuk-Makromolekülen bestimmt.
Anspruch 14: Ein Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus nur jeweils eine Art der modifizierten Nuk-Makromoleküle einsetzt.
Anspruch 15: Ein Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils zwei unterschiedlich markierte Arten der modifizierten Nuk- Makromoleküle einsetzt. Anspruch 16: Ein Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils vier unterschiedlich markierte Arten der modifizierten Nuk- Makromoleküle einsetzt.
Anspruch 17: Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 11 bis 15, das folgende Elemente einschließt: o Eine oder mehrere Arten der Polymerasen o Zumindes eins der Nukleotid-Analoga, nach Anspruch 2 o Lösungen zur Durchführung von zyklischen Sequenzierungsschritten
Anspruch 18: Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach dem Verfahren von einem der Ansprüche 8 oder 11 bis 15, das einer oder mehrere der folgenden Kompositionen - vorliegend als Lösung in konzentrierter oder in verdünter Form oder auch als Gemisch von trockenen Substanzen - aus der folgenden Liste einschließt: o Eine oder mehrere Arten der Polymerasen o Zumindes eins der Nukleotid-Analoga, nach Anspruch 2 o Lösungen zur Durchführung von zyklischen Sequenzierungsschritten o Komposition für Einbaureaktion / Extensionsreaktion o Komposition für Waschen der festen Phase nach der Einbaureaktion o Komposition für optische Detektion der Signale an der festen Phase o Komposition für Abspaltung des Markers und des sterisch anspruchsvollen makromolekularen Liganden o Komposition für Waschen der festen Phase nach der Abspaltung des Markers und des sterisch anspruchsvollen makromolekularen Liganden o Komposition für Blockade des Linker-Rests o Komposition für Waschen der festen Phase nach der Blockade des Linker
Rests o Komposition zur Bindung von signalgebenden Marker-Einheiten an den Marker o Komposition mit signalgebenen Marker-Einheiten
Anspruch 19: Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach Anspruch 18, das weiterhin eine oder mehrere Elemente aus der folgende Liste einschließt: o Komposition mit nicht modifizierten Nukleotiden (dNTPs oder NTPs) o Komposition mit irreversibel Terminatoren (ddNTPs) o Komposition mit Terminaler Transferase o Komposition mit einem Puffer für Transferasen-Reaktion o Komposition mit einer Ligase o Komposition von Oligonukleotiden, die als einheitliche Primer- Bindungsstelle an die Nukleinsäuren ligiert werden können. o Komposition mit einem Puffer für Ligsereaktion-Reaktion o Feste Phase und Reagenzien zur Preparation von Nukleinsäureketten zur Sequenzierung, o Feste Phase und Reagenzien zur Präparation von Polymerase zur Sequenzierung o Vorrichgung und Reagenzien zur Vorbereitung von Nukleotid-Analoga nach
Anspruch 2 zur Sequenzierung. o Komposition mit Blockierungsreagezien zur Unterdrückung von unspezifischen Adsorption von markierten Molekülen o Feste Phase zur Durchführung von zyklischen Einbaureaktionen
Anspruch 20: Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach einem der Ansprüche 9, 10, 17, 18 oder 19, das eine oder mehrere Polymerasen aus der folgenden Liste einschließt: o Reverse Transcriptasen: M-MLV, RSV, AMV, RAV, MAV, HIV o DNA Polymerasen: Klenow Fragment DNA Polymerase, Klenow Fragment exo minus DNA Polymerase, T7 DNA Polymerase, Sequenase 2, Vent DNA Polymerase, Vent exo minus DNA Polymerase, Deep Vent DNA
Polymerase, Deep Vent exo minus DNA Polymerase, Taq DNA Polymerase, TIi DNA Polymerase, Pwo DNA Polymerase, Thermosequenase DNA Polymerase, Pfu DNA Polymerase
Anspruch 21 : Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach einem der Ansprüche 9, 10, 17, 18 oder 19, in dem die Bestandteile der Kompositionen breits gemischt sind oder als getrennte Substanzen vorliegen.
Anspruch 22: Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach einem der Ansprüche 9, 10, 17, 18 oder 19, das eine oder mehrere feste Phasen zur Durchführung von zyklischen Sequenzierungsschritten aus der folgenden Liste einschließt: o Plane, transparente feste Phase o Plane, transparente feste Phase, die als Bestandteil einer Flow-Cell oder eines Chips bereitgestellt ist o Feste Phase in Form von Nano- oder Mikrokügelchen o Feste Phase in Form von Nano- oder Mikrokügelchen, die paramagnetisch sind o Feste Phase vorbereitet nach DE 101 49 786 o Feste Phase vorbereitet nach DE 10 2004 025 744 Anspruch 23: Ein Verfahren zur Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Schritte einschließt: a) Bereitstellung von extensionsfähigen Matrize-Primer-Komplexen b) Einbaureaktion: Inkubation dieser Komplexe in einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Polymerase-Arten und zumindest eine Art der modifizierten Nuk- Makromoleküle nach Anspruch 2 enthält, unter Bedingungen, die eine Primer- Verlängerung um ein modifiziertes ein Nuk-Makromolekül erlauben, wobei das modifizierte Nuk-Makromolekül in Art und Weise modifiziert ist, dass sein Einbau zu einem Stopp in der weiteren enzymatischen Reaktion führt. c) Inkubation der Matrize-Primer-Komplexe unter den Bedingungen die zur Trennung der oben genannten Primer mit eingebauten Nukleotid-Analoga von den Matrizen führen. d) Optionelle Wiederholung der Schritte (b) und (c) e) Applikation der erhaltenen markierten Primer auf ein Trennmedium oder in ein
Trennverfahren f) Gegebenenfalls Identifizierung der Art des eingebauten Nukleotid-Analoges
Die zyklischen Schritte können mehrmals wiederholt werden, beispielsweise 2 bis 10 mal, 10 bis 20 mal, 20 bis 100 mal, 100 bis 500 mal. Die Identifizierung der eingebauten Nukleotid-Analoga erfolgt durch den Marker.
Anspruch 24: Ein Verfahren zur Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Schritte einschließt: a) Bereitstellung von extensioinsfähigen Matrize-Primer-Komplexen, die adressierbare Positionen haben b) Einbaureaktion: Inkubation dieser Komplexe in einer Reaktionslösung, die zumindes eine Polymerase-Art und zumindest eine Art der modifizierten Nuk- Makromoleküle nach Anspruch 24 enthält, unter Bedingungen, die eine Primer- Verlängerung um ein modifiziertes Nuk-Makromolekül erlauben, wobei das modifizierte Nuk-Makromolekül in Art und Weise modifiziert ist, dass sein Einbau zu einem reversiblen Stopp in der weiteren enzymatischen Reaktion führt. c) Gegebenenfalls Verwendung von Reinigungsschritten von Matrize-Primer- Komplexen d) Gegebenenfalls Identifizierung der Art des eingebauten Nukleotid-Analoges durch Erfassung der Markereigenschaften, wobei eine örtliche Zuordnung der Signale zu bestimmen Primer-Matrize-Komplexen erfolgen kann e) Entfernung des zur Termination führenden makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden und gegebenenfalls des Markers f) Falls erforderlich Verwendung von Reinigungsschritten von Matrize-Primer- Komplexen g) Gegenebenfalls Wiederholung der Schritte (b) bis (f) und anschließende Analyse der identifizierten Signale von eigebauten Nukleotid-Analoga.
Die zyklischen Schritte können mehrmals wiederholt werden, beispielsweise 2 bis 10 mal, 10 bis 20 mal, 20 bis 100 mal, 100 bis 500 mal. Die Identifizierung der eingebauten Nukleotid-Analoge erfolgt durch den Marker.
Anspruch 25: Nukleotid-Analoga (modifizierte Nuk-Makromoleküle) mit der Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei folgende Anordnungen der Komponenten eingeschlossen werden:
(Nuk-Linker l)n-(Ligand)k-(Marker)m (Nuk-Linker l)n-(Ligand-Linker 3)k -(Marker)m
(Nuk-Linker l)n-(Ligand)k -(Linker 3-Marker)m
(Nuk-Linker l)n-(Marker)m-(Ligand)k
(Nuk-Linker l-Ligand)n-(Marker)m
(Ligand-Linker 2-Nuk-Linker l)n-(Marker)m (Nuk-Linker l)n-(Marker/ügand)m
(Nuk-Linker l-Ligand)n-(Marker)m-(Linker 1-Nuk)n
wobei :
Nuk - eine Nuk-Komponente ist Linker - eine Linker-Komponente ist, wobei Linker 1 oder Linker 2 oder Linker
3 gleiche oder auch unterschiedliche Struktur haben können
Marker - eine Makrer-Komponente ist
Ligand - ein makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand ist
Marker/Ligand - eine Struktur, die sowohl Marker-Eigenschaften als auch Eigenschaften eines makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden hat
(n) - eine Zahl von 1 bis 100000 ist.
(m) - eine Zahl von 1 bis 1000
(k) - eine Zahl von 1 bis 1000
Wobei in einer Ausführungsform der Strukturen, die Verhältnisse im Molekül folgendermassen verteilt sind : (n)>=(m)>=(k), wobei die einzelnen Zahlen unabhängig von einander variiert werden können. In einer weiteren Ausführungsform der Struktur, die Verhältnisse im Molekül folgendermassen verteilt sind : (n)>(m)>(k), wobei die einzelnen Zahlen unabhängig von einander variiert werden können.
In einer weiteren Ausführungsform der Struktur, die Verhältnisse im Molekül folgendermassen verteilt sind : (n) = <(m)>(k), wobei die einzelnen Zahlen unabhängig von einander variiert werden können.
Anspruch 26: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 25, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (Fig. 3A):
Wobei:
Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7- Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren Modifikationen, wobei L die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente darstellt (Kopplungseinheit L) und X die Kopplungsstelle der Kopplungseinheit L an der Base ist
R1 - ist H
R2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe
R3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, PO3, SH, N3, NH2, 0-R3-1, P(O)m-R3-1 (m ist 1 oder 2 ist), NH-R3-1, S-R3-1, Si-R3-1 wobei R3-1 eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist, oder eine der folgenden Modifikationen einschließt: -CO-Y, -CH2-O-Y, -CH2-S-Y, -CH2-N3, - CO-O-Y, -CO-S-Y, -CO-NH-Y, -CH2-CH=CH2, wobei Y ein Alkyl ist, beispielsweise (CH2)n-CH3 wobei n zwischen O und 4 liegt, oder ein substituiertes Alkyl ist, beispielsweise mit Halogen, Hydroxy, Amino, Carboxy- Gruppen). R4 - ist H oder OH R5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH-
Gruppe, eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine Triphosphat-Gruppe, oder eine Alpha-Thiotriphosphat-Gruppe ist.
Anspruch 27: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 25, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (Fig. 3B) :
Wobei : Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7- Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen
R1 - ist H
R2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, HaI, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe
R3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O- R3-2-L/ P(O)m- R3-2-L, wobei m 1 oder 2 ist, NH-R3-2-L, S-R3-2-L, Si-R3-2-L oder, wobei R3-2 die Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid bzw. Nuk-Komponente ist und L - die Kopplungseinheit des Linkers (L) ist.
R4 - ist H oder OH
R5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH- Gruppe, eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine Triphosphat-Gruppe, oder eine Alpha-Thiotriphosphat-Gruppe ist.
Anspruch 28: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 25, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (Fig. 3B):
Wobei :
Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7- Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen
Ri - ist H
R2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, HaI, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe
R3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, HaI, PO3, SH, NH2, O- R3-i, P(0)m- R3-I, NH-R3-I, S-R3-I, Si-R3-I wobei R3-I eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist und m 1 oder 2 ist.
R4 - ist H oder OH R5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O- R5-I-L, oder P-(O)3- R5-I-L (modifizierte Monophosphat-Gruppe), oder P-(O)3-P-(O)3-R5.i-L (modifizierte Diphosphat-Gruppe) oder P-(O)3-P-(O)3-P-(O)3- R5-I-L (modifizierte Triphosphat-Gruppe), wobei R5-I die Kopplungsstelle der Kopplungseinheit L an das Nukleotid bzw. Nuk-
Komponente ist und Kopplungseinheit L die Verbindung zwischen der Nuk- Komponente und der Linker-Komponente ist.
Anspruch 29: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei Kopplungseinheit L folgende strukturelle Elemente einschließt:
R6-NH-R7, R6-O-R7, R6-S-R7, R6-SS-R7, R6-CO-NH-R7, R6-NH-CO-R7, R6-CO-O-
R7, R6-O-CO-R7, R6-CO-S-R7, R6-S-CO-R7, R6-P(O)2-R7, R6-Si-R7, R6-(CH2)n-R7,
R5-(CH2)n-R7, R6-A-(CH2)n-R7, R6-(CH2)n-B-R7,
R6-(CH=CH-)n-R7/ R6-(A-CH = CH-)n-R7, R6-(CH = CH-B-)n-R7, R6-(CH = CH-CH2-B- Jn-R7, R6-A-CH = CH-(CH2-VR7, R6-(-CH=CH-CH2)n-B-R7,
R6-(C=C-) n-R7, R6-(A-CsO)n-R7, R6-(A-C≡C-CH2)n-R7, R6-(CsC-B-Jn-R7,
R6-(C≡C-CH2-B-)n-R7, R6-A-C≡C-(CH2-)n-R7, R6-(-C≡C-CH2)n-B-R7,
R6-(-C≡C-CH2-CH2)n-B-R7
wobei R6 - die Nuk-Komponente ist, R7 - der Linkerrest ist und A und B unabhängig folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -O-, -S-, -SS-, - CO-NH-, -NH-CO-, -CO-O-, -0-C0-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O)2-, -Si-, -(CH2)n-, eine photolabile Gruppe, wobei n - gleich 1 bis 5 ist
Anspruch 30: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 25 bis 28, wobei die Linker-Komponente ein wasserlösliches Polymer einschließt.
Anspruch 31 : Nukleotid-Analoga nach Anspruch 30, wobei die Linker-Komponente wasserlösliche Polymere unabhängig ausgewählt aus folgender Gruppe einschließt:
Polyethylen-glycol (PEG), Polysaccharide, Dextran, Polyamide, Polypeptide, Polyphosphate, Polyacetate, Poly(alkyleneglycole), Kopolymere aus Ethylenglycol und Propylenglycol, Poly(olefinische Alkohole),
Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(x-Hydroxy-Säuren), PoIy- Acrylsäure,
PoIy- Acrylamid, Poly(Vinylalkohol). Anspruch 32: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 1, 2, 25 bis 31, wobei die Linker-Komponente eine durchschnittliche Länge zwischen 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10000, 10000 bis 100000, 100000 bis 500000 Atomen hat.
Anspruch 33: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 1, 2, 25 bis 32, wobei der Marker oder eine Marker-Komponente eine signalgebende, signalvermittelnde, katalytische oder affine Funktion hat, oder die Funktion des makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden hat
Anspruch 34: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 25 bis 33, wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines oder mehrere der folgenden strukturellen Elemente einschließt:
Biotin, Hapten, radioaktives Isotop, seltenes Erdenelement, Farbstoff, Fluoreszenzfarbstoff, fluoreszierende oder phosphoreszierende Substanz
Anspruch 35: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 25 bis 33, wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines oder mehrere der folgenden Elemente einschließt: Nanokristalle oder deren Modifikationen, Proteine oder deren Modifikationen,
Nukleinsäureketten oder deren Modifikationen, Teilchen oder deren
Modifikationen.
Anspruch 36: Nukleotid-Analoga nach Anspruch 35, wobei eine strukturelle Marker- Einheit eines der folgenden Proteine einschließt:
Enzyme oder deren Konjugate oder Modifikationen,
Antikörper oder deren Konjugate oder Modifikationen,
Streptavidin oder seine Konjugate oder Modifikationen,
Avidin oder seine Konjugate oder Modifikationen
Anspruch 37: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 1, 2, 25 bis 36, bei dem als makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand folgende Strukturen einschließet: Proteine, Dendrimere, Nanoteilchen, Mikroteilchen oder deren Modifikationen.
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