DE69928683T2 - Verfahren zur amplifikation und zur sequenzierung von nukleinsäuren - Google Patents

Verfahren zur amplifikation und zur sequenzierung von nukleinsäuren Download PDF

Info

Publication number
DE69928683T2
DE69928683T2 DE69928683T DE69928683T DE69928683T2 DE 69928683 T2 DE69928683 T2 DE 69928683T2 DE 69928683 T DE69928683 T DE 69928683T DE 69928683 T DE69928683 T DE 69928683T DE 69928683 T2 DE69928683 T2 DE 69928683T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
nucleic acid
colony
sequence
primer
template
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69928683T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69928683D1 (de
Inventor
Celine Adessi
Eric Kawashima
Pascal Mayer
Jean-Jacques Mermod
Gerardo Turcatti
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Solexa Ltd Great Britain
Solexa Inc
Original Assignee
Solexa Ltd Great Britain
Solexa Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Solexa Ltd Great Britain, Solexa Inc filed Critical Solexa Ltd Great Britain
Application granted granted Critical
Publication of DE69928683D1 publication Critical patent/DE69928683D1/de
Publication of DE69928683T2 publication Critical patent/DE69928683T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1068—Template (nucleic acid) mediated chemical library synthesis, e.g. chemical and enzymatical DNA-templated organic molecule synthesis, libraries prepared by non ribosomal polypeptide synthesis [NRPS], DNA/RNA-polymerase mediated polypeptide synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

  • Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Nukleinsäureamplifikation und Sequenzierung. Insbesondere betrifft diese Erfindung Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation und Sequenzierung, und Apparaturen und Kits, welche für eine Amplifikation und Sequenzierung von Nukleinsäuren in großem Umfang und hohem Durchlauf verwendbar sind.
  • Die Nukleinsäuresequenzanalyse ist bei vielen Tätigkeiten der Biologie, Biotechnologie und Medizin zu einem Meilenstein geworden. Die Fähigkeit, Nukleinsäuresequenzen zu bestimmen, hat zunehmend an Bedeutung gewonnen, da Anstrengungen begonnen wurden, die Sequenzen der großen Genome von Menschen und anderen höheren Organismen zu bestimmen, und beispielsweise auch bei einen Nachweis eines Einzelnukleotidpolymorphismus und Screening und Genexpressionsmonitoring. Die durch eine Nukleinsäuresequenzierung bereitgestellte genetische Information besitzt viele Anwendungen in Gebieten wie etwa beispielsweise die Ermittlung und Prüfung von Arzneimittelzielen, die Diagnose und Risikobewertung von Erkrankungen und die Identifizierung und Charakterisierung von Organismen.
  • Der erste Schritt in solchen Anwendungen ist die Bestimmung der tatsächlichen chemischen Zusammensetzung der interessierenden Nukleinsäuren, genauer die Bestimmung der Sequenz des Auftretens der vier Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) oder Uracil (U), welche Nukleinsäuren umfassen. Aber solche Anwendungen erfordern die Sequenzierung von Nukleinsäuren im großen Maßstab, wobei Verfahren der Nukleinsäuresequenzierung mit hohem Durchsatz außerordentlich wünschenswert sind.
  • Im Stand der Technik werden Verfahren zur Nukleinsäuresequenzierung dokumentiert. Die zwei normalerweise verwendeten Verfahren sind das chemische Spaltungsverfahren von Maxam und Gilbert, welches auf einer basenspezifischen Chemie beruht, und das nun gängigere Sanger-Sequenzierungsverfahren, welches auf einem Prinzip der enzymatischen Kettentermination beruht und nun als eine Routinebasis für die Nukleinsäuresequenzierung verwendet wird.
  • Bei der Sanger-Sequenzierung wird jede zu sequenzierende Nukleinsäure in einer Reaktion repliziert, welche DNA-Polymerase, Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) und Didesoxynukleotidtriphosphate (ddNTPs) umfasst. Die DNA-Polymerase kann sowohl dNTPs als auch ddNTPs in den wachsenden DNA-Strang einbauen. Aber wenn ein ddNTP einmal eingebaut ist, fehlt dem 3'-Ende des wachsenden DNA-Strang eine Hydroxylgruppe und sie ist nicht länger ein Substrat für die Kettenverlängerung, wodurch die Nukleinsäurekette terminiert wird. Deshalb wird in einer bestimmten Reaktion, welche einen Typ an ddNTP umfasst, ein Gemisch aus Nukleinsäuren verschiedener Längen erzeugt, welche alle mit dem gleichen ddNTP enden. Normalerweise werden getrennte Reaktionen für jede der vier Arten ddNTP eingesetzt und die Verteilung der Längen der erzeugten Nukleinsäurefragmente wird durch eine denaturierende Gelelektrophorese analysiert (welche die Nukleinsäurefragmente gemäß ihrer Größe auflöst) oder in letzter Zeit durch Massenspektroskopie. Normalerweise ist ein oder sind mehrere der Desoxynukleotidtriphosphate im Reaktionsgemisch markiert, um den Nachweis der Fragmente mit verschiedenen Längen zu ermöglichen.
  • Die oben beschriebenen Verfahren sind nachteilig, da jede zu sequenzierende Nukleinsäure einzeln während der biochemischen Reaktion bearbeitet werden muss. Ein Gelektrophorese ist mühsam, arbeitsintensiv und an sich langsam, sogar wenn eine Kapillarelektrophorese verwendet wird, und sie ist für eine Sequenzierung in großem Ausmaß mit hohem Durchsatz nicht gut geeignet. Außerdem ist die nachfolgende Bestimmung der Sequenz mühsam. Die Massenspektroskopie befindet sich noch immer auf dem Prototypniveau, erfordert eine sehr teure Apparatur und jede Probe muss einzeln analysiert werden.
  • Eine Art und Weise, den Durchsatz zu erhöhen, ist die parallele Bearbeitung vieler Proben. Verfahren unter Verwendung einer DNA-Hybridisierung von Nukleinsäuresonden werden verwendet und ermöglichen eine Multiplex-Verarbeitung des Verfahrens während der biochemischen und elektrophoretischen Verfahren, allerdings auf Kosten von langatmigen weiteren Manipulationen.
  • Kürzlich sind Verfahren verfügbar geworden, welche auf DNA-Chips und DNA-Hybridisierung basieren (Thomas und Burke Exp. Opin. Ther. Patents 8: 503–508 (1998)). Diese Verfahren sind nachteilig, da für jede Anwendung zunächst ein DNA-Chip entworfen und hergestellt werden muss: Dies ist eine langwierige Operation und der Preis eines einzelnen Chips sinkt nur, wenn sehr große Anzahlen des Chips angefordert werden. Die Chips sind auch nicht wiederverwendbar und mit jedem Chip kann nur eine Nukleinsäureprobe, z.B. nur ein zu diagnostizierender Patient, auf einmal bearbeitet werden. Schließlich ist das Ausmaß der Sequenz, welches durch solch einen Chip analysiert werden kann, auf weniger als 100 000 Basen beschränkt, und es ist beschränkt auf einige Anwendungen wie etwa DNA-Genotypisierung und Erstellung von Genexpressionsprofilen.
  • Bei den meisten bekannten Verfahren für eine Nukleinsäuresequenzanalyse ist die Amplifikation der interessierenden Nukleinsäure ein erforderlicher Schritt, um die Nukleinsäure in einer für die Analyse ausreichenden Menge zu erhalten.
  • Mehrere Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation sind im Stand der Technik bekannt und dokumentiert. Beispielsweise können Nukleinsäuren durch Insertion der interessierenden Nukleinsäure in ein Expressionsvektorkonstrukt amplifiziert werden. Solche Vektoren können dann in geeignete biologische Wirtszellen eingebracht werden und die Vektor-DNA, umfassend die interessierende Nukleinsäure, durch Kultivierung des biologischen Wirts unter Verwendung gut etablierter Protokolle amplifiziert werden. Durch solche Verfahren amplifizierte Nukleinsäuren können aus den Wirtszellen isoliert werden durch Verfahren, welche im Stand der Technik bekannt und dokumentiert sind. Aber solche Verfahren besitzen den Nachteil, dass sie im Allgemeinen zeitaufwändig, arbeitsintensiv und schwierig zu automatisieren sind.
  • Das Verfahren der DNA-Amplifikation durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde 1985 offenbart (Saiki et al., Science 230, 1350–1354) und ist nun ein Verfahren, welches im Fachgebiet allgemein bekannt und dokumentiert ist. Ein Zielnukleinsäurefragment von Interesse kann unter Verwendung zweier kurzer Oligonukleotidsequenzen (normalerweise als Primer bezeichnet) amplifiziert werden, welche für die bekannten Sequenzen, welche die zu amplifizierende DNA-Sequenz flankieren, spezifisch sind. Die Primer hybridisieren an entgegengesetzte Stränge des doppelsträngigen DNA-Fragments, nachdem dieses denaturiert wurde, und sind so orientiert, dass die DNA-Synthese durch die DNA-Polymerase durch die Region zwischen den zwei Primern fortschreitet, wobei die Primersequenzen durch das sequenzielle Einbringen von Nukleotiden durch die Polymerase verlängert werden. Die Verlängerungsreaktionen erzeugen zwei doppelsträngige Zielregionen, wobei jede davon erneut denaturiert werden kann, und bereit für einen zweiten Zyklus der Hybridisierung und der Verlängerung ist. Der dritte Zyklus erzeugt zwei doppelsträngige Moleküle, welche die Zielregion präzise in doppelsträngiger Form umfassen. Durch wiederholte Zyklen der Wärmedenaturierung, Primerhybridisierung und Verlängerung ergibt sich eine schnelle exponentielle Anreicherung des spezifischen Ziel-DNA-Fragments. Üblicherweise wird dieses Verfahren in Lösung durchgeführt und das amplifizierte Nukleinsäurefragment wird aus der Lösung gereinigt, durch Verfahren, welche im Fachgebiet bekannt sind, beispielsweise durch Gelektrophorese.
  • Kürzlich sind jedoch Verfahren offenbart worden, welche einen Primer verwenden, welcher auf eine Oberfläche aufgebracht ist, in Verbindung mit freien Primern in Lösung. Diese Verfahren ermöglichen die simultane Amplifikation und Anheftung eines PCR-Produkts an der Oberfläche (Oroskar, A. A. et al., Clinical Chemistry 42: 1547 (1996)).
  • WO 96/04404 und WO 98/36094 (Mosaic Technologies, Inc. et al.) offenbaren ein Verfahren zum Nachweis ein Zielnukleinsäure in einer Probe, welche möglicherweise die Zielnukleinsäure enthält. Das Verfahren betrifft die Induktion einer PCR-bezogenen Amplifikation der Zielnukleinsäure nur dann, wenn die Zielnukleinsäure in der zu testenden Probe vorliegt. Für die Amplifikation der Zielsequenz sind beide Primer an einen festen Träger angeheftet, wodurch die amplifizierten Zielnukleinsäuresequenzen ebenso an den festen Träger angeheftet werden. Das in diesen Dokumenten offenbarte Amplifikationsverfahren wird manchmal als das "Brückenamplifikationsverfahren" bezeichnet. In diesem Verfahren sind die zwei Primer, wie bei einer konventionellen PCR, speziell so gestaltet, dass sie die bestimmte zu amplifizierende Ziel-DNA-Sequenz flankieren. Wenn die bestimmte Zielnukleinsäure in einer Probe vorliegt, kann somit die Zielnukleinsäure an die Primer hybridisieren und durch PCR amplifiziert werden. Der erste Schritt in diesem PCR-Amplifikationsverfahren ist die Hybridisierung der Zielnukleinsäure an den ersten spezifischen Primer, welcher an den Träger angeheftet ist (Primer 1). Ein erstes Amplifikationsprodukt, welches zur Zielnukleinsäure komplementär ist, wird dann durch Verlängerung der Primer 1-Sequenz gebildet. Beim Aussetzen des Trägers gegenüber Denaturierungsbedingungen wird die Zielnukleinsäure freigesetzt und kann dann in weiteren Hybridisierungsreaktionen mit anderen Primer 1-Sequenzen teilnehmen, welche an den Träger angeheftet sein können. Das erste Amplifikationsprodukt, welches an den Träger angeheftet ist, kann dann mit dem zweiten spezifischen Primer (Primer 2) hybridisieren, welcher an den Träger angeheftet ist, und ein zweites Amplifikationsprodukt, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche zu dem ersten Amplifikationsprodukt komplementär ist, kann durch Verlängerung der Primer 2-Sequenz gebildet werden und ist ebenso an den Träger angeheftet. Folglich können die Zielnukleinsäuren und die ersten und zweiten Amplifikationsprodukte an einer Vielzahl von Hybridisierungs- und Verlängerungsverfahren teilnehmen, beschränkt nur durch die anfängliche Anwesenheit der Zielnukleinsäure und der Anzahl an Primer 1- und Primer 2-Sequenzen, welche anfänglich vorliegen, und das Ergebnis ist eine Anzahl von Kopien der Zielsequenz, welche an die Oberfläche angeheftet sind.
  • Da beim Durchführen dieses Verfahrens nur dann Amplifikationsprodukte gebildet werden, wenn die Zielnukleinsäure vorhanden ist, ist eine Beobachtung des Vorliegens oder der Abwesenheit von einem oder mehreren Amplifikationsprodukten ein Hinweis auf das Vorliegen oder die Abwesenheit einer speziellen Zielsequenz.
  • Das Mosaik-Verfahren kann verwendet werden, um ein Ausmaß an Multiplexing zu erreichen, dadurch dass mehrere unterschiedliche Zielnukleinsäuresequenzen gleichzeitig amplifiziert werden können durch Anordnen von unterschiedlichen Gruppen von ersten und zweiten Primern, welche für jede unterschiedliche Zielnukleinsäuresequenz spezifisch sind, an unterschiedlichen Bereichen des festen Trägers.
  • Da die ersten und zweiten Primersequenzen für jede zu amplifizierende Zielnukleinsäure spezifisch sein müssen, ist der Nachteil des Mosaik-Verfahrens ist der, dass es nur verwendet werden kann, um bekannte Sequenzen zu amplifizieren. Außerdem ist der Durchsatz beschränkt durch die Anzahl der unterschiedlichen Gruppen der spezifischen Primer und anschließend amplifizierten Zielnukleinsäuremolekülen, welche in unterschiedlichen Bereichen eines bestimmten festen Trägers angeordnet werden können, und durch die Zeit, die benötigt wird, um die Nukleinsäuren in bestimmten Bereichen anzuordnen. Das Mosaik-Verfahren erfordert auch, dass zwei unterschiedliche Primer homogen durch das 5'-Ende mit dem Träger verbunden sind innerhalb des bestimmten Bereichs, in welchem das Amplifikationsprodukt gebildet wird. Dies kann durch die gegenwärtig verfügbare Technologie der DNA-Chipherstellung nicht erreicht werden, und muss durch einige Mittel der Probenverteilung erreicht werden. Folglich weist die Dichte, welche durch diesen Ansatz erreicht werden kann, die gleiche Beschränkung wie andere klassische Array-Technologien auf. Eine weitere Beschränkung ist die Geschwindigkeit der Überwachung der einzelnen unterschiedlichen Bereiche des Trägers im Hinblick auf das Vorhandensein oder die Abwesenheit der amplifizierten Zielnukleinsäuren.
  • Eine Anordnung von DNA-Proben wird traditionell auf Membranen durchgeführt (z.B. Nylon- oder Nitrocellulosemembranen). Die Verwendung von ge eigneten Robotern (z.B. Q-botTM, Genetix Ltd., Dorset BH23 3TG UK) bedeutet, dass es möglich ist, eine Dichte von bis zu 10 Proben/mm2 zu erhalten. Bei solchen Verfahren ist die DNA durch physiochemische Mittel (z.B. UV-Strahlung) kovalent mit einer Membran verbunden und es ist die Anordnung von großen DNA-Molekülen (z.B. Moleküle mit einer Länge von mehr als 100 Nukleotiden) ebenso wie kleineren DNA-Molekülen wie etwa Oligonukleotidprimer möglich.
  • Es sind andere Verfahren bekannt, wobei Anordnungen mit höherer Dichte der Oligonukleotide erhalten werden können. Ansätze, basierend auf vorgeordneten Glassobjektträgern, worin Anordnungen von reaktiven Regionen durch Tintenstrahltechnologie erhalten werden (Blanchard, A. P. und L. Hood, Microbial and Comparative Genomics, 1: 225 (1996)) oder Anordnungen von reaktiven Polyacrylamidgelen (Yershov, G. et al., Proceedings of the National Academy of Science, USA 93: 4913–4918 (1996)), ermöglichen beispielsweise theoretisch die Anordnung von mehr als 100 Proben/mm2.
  • Noch höhere Probendichten sind durch die Verwendung von DNA-Chips erreichbar (Fodor, S. P. A. et al., Science 251: 767 (1991)). Gegenwärtig werden in Molekularbiologieverfahren Chips mit 625 Oligonukleotidsonden/mm2 verwendet (Lockhart, D. J. et al., Nature Biotechnology 14: 1675 (1996)). Es wird behauptet, dass Probendichten von bis zu 250 000 Proben/cm2 (2500/mm2) erreichbar sind (Chee, M. et al., Science 274: 610 (1996)). Aber gegenwärtig können bis zu 132 000 unterschiedliche Oligonukleotide auf einem einzelnen Chip von ungefähr 2,5 cm2 angeordnet werden. Bedeutend ist, dass diese Chips auf eine solche Art und Weise hergestellt werden, dass das 3'-OH-Ende des Oligonukleotids mit der festen Fläche verbunden ist. Dies bedeutet, dass auf eine solche Art und Weise mit Chips verbundene Oligonukleotide als Primer in einer PCR-Amplifikationsreaktion nicht verwendet werden können.
  • Es ist von Bedeutung, dass die Dichte der resultierenden Anordnung von PCR-Produkten durch das verfügbare Gefäß beschränktist, wenn PCR-Produkte mit dem Gefäß, in welchem die PCR-Amplifikation stattfindet, verbunden sind. Gegenwärtig verfügbare Gefäße liegen nur im 96-Well- Mikrotiterplattenformat vor. Diese ermöglichen ledilich, dass etwa 0,02 Proben von PCR-Produkten/mm2 Oberfläche erhalten werden.
  • Unter Verwendung des kommerziell erhältlichen NucleolinkTM-Systems (Nunc A/S, Roskilde, Dänemark) ist es beispielsweise möglich, eine gleichzeitig Amplifikation und Anordnung der Proben mit einer Dichte von 0,02 Proben/mm2 in Wells zu erreichen, auf deren Oberfläche Oligonukleotidprimer aufgepfropft worden sind. Technische Probleme deuten jedoch an, dass es unwahrscheinlich ist, dass mit diesem Ansatz ein wesentlicher Anstieg dieser Probendichte erreicht werden wird.
  • Folglich ist zu sehen, dass für einen Anstieg des Durchsatzes im Fachgebiet ein Bedarf an neuen Verfahren der Nukleinsäureamplifikation besteht, welche die gleichzeitige Amplifikation und Anordnung von Nukleinsäureproben mit einer höheren Dichte ermöglicht und weiterhin die Kontrolle von Proben mit einer schnelleren Rate, bevorzugt parallel ermöglicht.
  • Außerdem ist es offensichtlich, dass im Fachgebiet ein Bedarf an neuen Verfahren der Sequenzierung besteht, welche es ermöglichen, dass große Mengen an Proben parallel bearbeitet und sequenziert werden, das bedeutet es besteht ein Bedarf an Verfahren der Sequenzierung, welche eine wesentliche Multiplexierung des Verfahrens ermöglichen. Eine wesentliche Multiplexierung des Sequenzierungsverfahrens führt wiederum zu einem höheren Durchsatz als dem, welcher mit den im Fachgebiet bekannten Sequenzierverfahren erreichbar ist. Solche neuen Verfahren wären noch wünschenswerter, wenn sie eine solche Sequenzierung mit hohem Durchsatz bei zumutbaren Kosten und bei einer geringeren Arbeitsintensivität als bei konventionellen Sequenzierverfahren erreichen könnten.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt neue Verfahren der Festphasen-Nukleinsäureamplifikation, welche es ermöglichen, dass eine große Anzahl von unterschiedlichen Nukleinsäuresequenzen gleichzeitig und mit einer hohen Dichte angeordnet und amplifiziert werden. Die Erfindung beschreibt auch Verfahren, durch welche eine große Anzahl von unterschiedlichen amplifizierten Nukleinsäuresequenzen mit einer schnellen Rate und, falls gewünscht, parallel überprüft werden können. Die Erfindung beschreibt auch Verfahren, durch welche die Sequenzen einer großen Anzahl von unterschiedlichen Nukleinsäuren gleichzeitig und innerhalb eines kurzen Zeitraums bestimmt werden können. Die Verfahren sind besonders nützlich bei, aber nicht beschränkt auf die Sequenzierung eines Gesamtgenoms oder Situationenen, bei welchen viele Gene (z.B. 500) von vielen Individuen (z.B. 500) gleichzeitig sequenziert werden sollen oder auf das gleichzeitige Scoring von großen Zahlen (z.B. Millionen) von Polymorphismen oder auf die Kontrolle der Expression einer großen Zahl von Genen (z.B. 100 000) zur gleichen Zeit.
  • Deshalb stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation von mehreren Nukleinsäuren bereit, umfassend die folgenden Schritte:
    • (1) Bilden von mehreren Nukleinsäuretemplaten, welche die zu amplifizierenden Nukleinsäuren umfassen, worin eine Oligonukleotidsequenz Y mit dem 5'-Ende der zu amplifizierenden Nukleinsäure verbunden ist, und eine Oligonukleotidsequenz Z mit dem 3'-Ende der zu amplifizierenden Nukleinsäure verbunden ist, und worin die Nukleinsäuretemplate außerdem am 5'-Ende ein Mittel zum Binden der Nukleinsäuren an einen festen Träger tragen;
    • (2) Mischen der Nukleinsäuretemplate mit einem oder mehreren Colony-Primern X, welche mit der Oligonukleotidsequenz Z hybridisieren können und am 5'-Ende ein Mittel zum Binden der Colony-Primer an einen festen Träger tragen, in Anwesenheit eines festen Trägers, so dass die 5'-Enden sowohl von dem Nukleinsäuretemplat als auch den Colony-Primern an den festen Träger binden;
    • (3) Durchführen von einer oder mehreren Nukleinsäureamplifikationsreaktionen mit den gebundenen Templaten, so dass Nukleinsäurekolonien erzeugt werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden zwei unterschiedliche Colony-Primer X mit dem/den Nukleinsäuretemplat(en) in Schritt (2) des Verfahrens gemischt. Bevorzugt sind die Sequenzen der Colony-Primer X so, dass die Oligonukleotidsequenz Z mit einem der Colony-Primer X hybridisieren kann und die Oligonukleotidsequenz Y die gleiche ist wie die Sequenz von einem der Colony-Primer X.
  • In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung ist die Oligonukleotidsequenz Z komplementär zu der Oligonukleotidsequenz Y, als Y' bezeichnet, und der Colony-Primer X weist die gleiche Sequenz auf wie die Oligonukleotidsequenz Y.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der Colony-Primer X eine degenerierte Primersequenz umfassen, und das/die Nukleinsäuretemplat(e) umfassen die zu amplifizierende Nukleinsäure(n) und enthalten nicht die Nukleotidsequenzen Y oder Z an den 5'- bzw. 3'-Enden.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst das Verfahren den weiteren Schritt Durchführen von mindestens einem Schritt der Sequenzbestimmung von einer oder mehreren der in Schritt (3) erzeugten Nukleinsäurekolonien.
  • Somit stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zum Sequenzieren von mindestens einer Nukleinsäure, umfassend die folgenden Schritte:
    • (1) Bilden von mehreren Nukleinsäuretemplaten, welche die zu amplifizierenden Nukleinsäuren umfassen, worin eine Oligonukleotidsequenz Y mit dem 5'-Ende der zu amplifizierenden Nukleinsäure verbunden ist, und eine Oligonukleotidsequenz Z mit dem 3'-Ende der zu amplifizierenden Nukleinsäure verbunden ist, und worin die Nukleinsäuretemplate außerdem am 5'-Ende ein Mittel zum Binden der Nukleinsäuren an einen festen Träger tragen;
    • (2) Mischen der Nukleinsäuretemplate mit einem oder mehreren Colony-Primern X, welche mit der Oligonukleotidsequenz Z hybridisieren können und am 5'-Ende ein Mittel zum Binden der Colony-Primer an einen festen Träger tragen, in Anwesenheit eines festen Trägers, so dass die 5'-Enden sowohl von dem Nukleinsäuretemplat als auch den Colony-Primern an den festen Träger binden;
    • (3) Durchführen von einer oder mehreren Nukleinsäureamplifikationsreaktionen mit den gebundenen Templaten, so dass Nukleinsäurekolonien erzeugt werden;
    • (4) Durchführen von mindestens einem Schritt der Sequenzbestimmung von mindestens einer der erzeugten Nukleinsäurekolonien.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung tragen die 5'-Enden sowohl des/der Nukleinsäuretemplats(e) als auch der Colony-Primer Mittel zum kovalenten Binden der Nukleinsäuresequenzen an den festen Träger. Bevorzugt ist dieses Mittel zum kovalenten Binden eine chemisch modifizierbare funktionelle Gruppe, wie etwa beispielsweise eine Phosphatgruppe, ein Carboxyl- oder Aldehydrest, eine Thiol-, eine Hydroxyl-, eine Dimethxoytrityl (DMT)- oder eine Aminogruppe, bevorzugt eine Aminogruppe.
  • Nukleinsäuren, welche gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren amplifiziert werden können, umfassen DNA, beispielsweise genomische DNA, cDNA, rekombinante DNA oder eine beliebige Form von synthetischer oder modifizierter DNA, RNA, mRNA oder eine beliebige Form von synthetischer oder modifizierter RNA. Die Nukleinsäuren können in der Länge variieren und können Fragmente oder kleinere Teile von größeren Nukleinsäuremolekülen sein. Bevorzugt beträgt die Länge der zu amplifizierenden Nukleinsäure mindestens 50 Basenpaare und mehr bevorzugt 150 bis 4000 Basenpaare. Die zu amplifizierende Nukleinsäure kann eine bekannte oder unbekannte Sequenz aufweisen und kann in einzel- oder doppelsträngiger Form vorliegen. Die zu amplifizierende Nukleinsäure kann von einer beliebigen Quelle stammen.
  • "Nukleinsäuretemplat" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Einheit, welche die zu amplifizierende oder zu sequenzierende Nukleinsäure in einzelsträngiger Form umfasst. Wie unten kurz dargestellt, kann die zu amplifizierende oder zu sequenzierende Nukleinsäure auch in doppelsträngiger Form bereitgestellt werden. Folglich können "Nukleinsäuretemplate" der Erfindung einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäuren sein. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuretemplate können verschiedene Längen aufweisen. Bevorzugt weisen sie mindestens 50 Basenpaare Länge und mehr bevorzugt 150 bis 4000 Basenpaare Länge auf. Die Nukleotide, welche die Nukleinsäuretemplate bilden, können natürlich vorkommende oder nicht natürlich vorkommende Nukleotide sein. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuretemplate umfassen nicht nur die zu amplifizierende Nukleinsäure, sondern können außerdem am 5'- und 3'-Ende kurze Oligonukleotidsequenzen enthalten. Die am 5'-Ende enthaltene Nukleotidsequenz wird hierin als Y bezeichnet. Die Oligonukleotidsequenz Y ist eine bekannte Sequenz und kann eine unterschiedliche Länge aufweisen. Für eine Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren ist die Oligonukleotidsequenz Y bevorzugt mindestens 5 Nukleotide lang, bevorzugt zwischen 5 und 100 Nukleotide lang und mehr bevorzugt ungefähr 20 Nukleotide lang. In der Oligonukleotidsequenz Y können natürlich vorkommende oder nicht natürlich vorkommende Nukleotide vorliegen. Wie oben gezeigt, ist die Sequenz des Oligonukleotids Y bevorzugt die gleiche wie die Sequenz des Colony-Primers X. Die am 3'-Ende der Nukleinsäuretemplate der Erfindung enthaltene Oligonukleotidsequenz wird hierin als Z bezeichnet. Die Oligonukleotidsequenz Z besitzt eine bekannte Sequenz und kann eine unterschiedliche Länge aufweisen. Zur Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Oligonukleotidsequenz Z bevorzugt mindestens 5 Oligonukleotide lang, bevorzugt zwischen 5 und 100 Nukleotide lang und mehr bevorzugt ungefähr 20 Nukleotie lang. In der Oligonukleotidsequenz Z können natürlich vorkommende oder nicht natürlich vorkommende Nukleotide vorliegen. Die Oligonukleotidsequenz Z ist so aufgebaut, dass sie mit einem der Colony-Primer X hybridisiert und ist bevorzugt so aufgebaut, dass sie komplementär zur Oligonukleotidsequenz Y ist, welche hierin als Y' bezeichnet wird. Die an den 5'- bzw. 3'-Enden enthaltenen Oligonukleotidsequenzen Y und Z eines Nukleinsäuretemplats müssen nicht am äußersten Ende des Templats lokalisiert sind. Obwohl die Oligonukleotidsequenzen Y und Z beispielsweise bevorzugt an oder nahe den 5'- bzw. 3'-Enden (oder Termini) der Nukleinsäuretemplate lokalisiert sind (beispielsweise innerhalb von 0 bis 100 Nukleotiden des 5'- und 3'-Termini) können sie weiter entfernt (z.B. mehr als 100 Nukleotide) von den 5'- oder 3'-Termini des Nukleinsäuretemplats lokalisiert sein. Die Oligonukleotidsequenzen Y und Z können deshalb an einer beliebigen Position innerhalb des Nukleinsäuretemplats lokalisiert sein, vorausgesetzt dass die Sequenzen Y und Z an jeder Seite vorliegen, d.h. die zu amplifizierende Nukleinsäuresequenz flankieren.
  • "Nukleinsäuretemplat" wie hierin verwendet umfasst auch eine Einheit, welche die zu amplifizierende oder zu sequenzierende Nukleinsäure in einer doppelsträngigen Form umfasst. Wenn das Nukleinsäuretemplat in einer doppelsträngigen Form vorliegt, sind die Oligonukleotidsequenzen Y und Z an den 5'- bzw. 3'-Enden eines der Stränge enthalten. Der andere Strang ist aufgrund der Basenpaarungsregeln der DNA komplementär mit dem Strang, welcher die Oligonukleotidsequenzen Y und Z enthält und enthält folglich eine Oligonukleotidsequenz Z' an dem 5'-Ende und eine Oligonukleotidsequenz Y' an dem 3'-Ende.
  • "Colony-Primer" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Einheit, welche eine Oligonukleotidsequenz umfasst, welche mit einer komplementären Sequenz hybridisieren kann und eine spezielle Polymerasereaktion in Gang bringt. Die Sequenz, welche die Colony-Primer umfasst, ist so ausgewählt, dass sie mit ihrer komplementären Sequenz eine maximale Hybridisierungsaktivität aufweist und mit einer beliebigen anderen Sequenz eine sehr geringe nicht spezifische Hybridisierungsaktivität aufweist. Die als Colony-Primer zu verwendende Sequenz kann eine beliebige Sequenz umfassen, umfasst aber bevorzugt 5'-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG oder 5'-CACCAACCCAAACCAACCCAAACC. Der Colony-Primer kann 5 bis 100 Basen lang sein, ist aber bevorzugt 15 bis 25 Basen lang. In dem Primer können natürlich vorkommende oder nicht natürlich vorkommende Nukleotide vorhanden sein. Es können ein oder zwei unterschiedliche Colony-Primer verwendet werden, um in den erfindungsgemäßen Verfahren Nukleinsäurekolonien zu erzeugen. Die Colony-Primer zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können auch degenerierte Primersequenzen enthalten.
  • "Degenerierte Primersequenzen" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine kurze Oligonukleotidsequenz, welche unabhängig von der Sequenz eines Nukleinsäurefragments mit einem beliebigen Nukleinsäurefragment hybridisieren kann. Solche degenerierten Primer benötigen somit nicht das Vorliegen der Oligonukleotidsequenzen Y oder Z in dem/den Nukleinsäuretemplat(en), damit eine Hybridisierung mit dem Templat auftritt, obwohl die Verwendung von degenerierten Primern zur Hybridisierung eines Templats, enthaltend die Oligonukleotidsequenzen X oder Y, nicht ausgenommen ist. Es ist jedoch klar, dass für eine Verwendung bei den Amplifikationsverfahren der vorliegenden Erfindung die degenerierten Primer mit den Nukleinsäuresequenzen in dem Templat an Stellen an jeder Seite, oder an Stellen, welche die zu amplifizierende Nukleinsäuresequenz flankieren, hybridisieren müssen.
  • "Fester Träger" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine beliebige feste Oberfläche, an welche Nukleinsäuren kovalent gebunden werden können, wie etwa beispielsweise Latexbeads, Dextranbeads, Polystyrol, eine Polypropylenfläche, Polyacrylamidgel, Goldflächen, Glasflächen und Silikonwafer. Bevorzugt ist der feste Träger eine Glasfläche.
  • "Mittel zum Binden bzw. Anheften von Nukleinsäuren an einen festen Träger" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein beliebiges chemisches oder nicht chemisches Bindungsverfahren einschließlich chemisch modifizierbarer funktioneller Gruppen. "Anheftung" bzw. „Bindung" bezieht sich auf die Immobilisierung einer Nukleinsäure an feste Träger entweder durch eine kovalente Bindung oder durch eine irreversible passive Adsorption oder durch eine Affinität zwischen Molekülen (beispielsweise Immobilisierung von biotinylierten Molekülen an einer mit Avidin beschichteten Fläche). Die Bindung muss eine ausreichende Festigkeit aufweisen, dass sie nicht durch Waschen mit Wasser oder wässrigem Puffer unter DNA-denaturierenden Bedingungen entfernt werden kann.
  • "Chemisch modifizierbare funktionelle Gruppe" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Gruppe wie etwa beispielsweise eine Phosphatgruppe, einen Carboxyl- oder Aldehydrest, eine Thiol- oder eine Aminogruppe.
  • "Nukleinsäurekolonie" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen getrennten Bereich, umfassend mehrere Kopien eines Nukleinsäurestrangs. In derselben Kolonie können auch mehrere Kopien des komplementären Strangs vorhanden sein. Die mehreren Kopien der Nukleinsäurestränge, welche die Kolonien bilden, sind im Allgemeinen an einem festen Träger immmobilisiert und können in einzel- oder doppelsträngiger Form vorliegen. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekolonien können in unterschiedlichen Größen und Dichten in Abhängigkeit von den verwendeten Bedingungen erzeugt werden. Die Größe der Kolonien beträgt bevorzugt 0,2 μm bis 6 μm, mehr bevorzugt 0,3 μm bis 4 μm. Die Dichte der Nukleinsäurekolonien zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren beträgt normalerweise 10 000/mm2 bis 100 000/mm2. Es wird angenommen, dass höhere Dichten erreicht werden können, beispielsweise 100 000/mm2 bis 1 000 000/mm2 und 1 000 000/mm2 bis 10 000 000/mm2.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können verwendet werden, um Nukleinsäurekolonien zu erzeugen. Folglich stellt ein weiterer Aspekt der Erfindung einen festen Träger bereit, welcher eine oder mehrere Nukleinsäurekolonien umfasst. Eine Nukleinsäurekolonie kann aus einem einzelnen immobilisierten Nukleinsäuretemplat der Erfindung erzeugt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die gleichzeitige Produktion einer Anzahl von solchen Nukleinsäurekolonien, wovon jede unterschiedliche immobilisierte Nukleinsäurestränge enthalten kann.
  • Somit stellt ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Gemisch bereit, umfassend mehrere Nukleinsäuretemplate, welche die zu amplifizierenden Nukleinsäuren umfassen, worin die Nukleinsäuren an deren 5'-Enden eine Oligonukleotidsequenz Y und an dem 3'-Ende eine Oligonukleotidsequenz Z enthalten, und die Nukleinsäure(n) außerdem an dem 5'-Ende ein Mittel zum Binden der Nukleinsäure(n) an einen festen Träger tragen. Bevorzugt sind die mehreren Nukleinsäuretemplate mit mehreren Colony-Primern X gemischt, welche mit der Oligonukleotidsequenz Z hybridisieren können und am 5'-Ende ein Mittel zum Binden der Colony-Primer an einen festen Träger tragen. Bevorzugt sind die mehreren Nukleinsäuretemplate und Colony-Primer kovalent an einen festen Träger gebunden.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind mehrere von zwei unterschiedlichen Colony-Primern X mit den mehreren Nukleinsäuretemplaten gemischt. Bevorzugt sind die Sequenzen der Colony-Primer X so, dass die Oligonukleotidsequenz Z mit einem der Colony-Primer X hybridisieren kann und die Oligonukleotidsequenz Y die gleiche ist wie die Sequenz von einem der Colony-Primer X.
  • In einer alternativen Ausführungsform ist die Oligonukleotidsequenz Z komplementär zu der Oligonukleotidsequenz Y (Y') und die mehreren Colony-Primer X besitzen die gleiche Sequenz wie die Oligonukleotidsequenz Y.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform können die mehreren Colony-Primer X eine degenerierte Primersequenz umfassen und die mehreren Nukleinsäuretemplate umfassen die zu amplifizierenden Nukleinsäuren und enthalten an den 5'- bzw. 3'-Enden keine Oligonukleotidsequenzen Y oder Z.
  • Die in der Erfindung verwendeten Nukleinsäuretemplate können hergestellt werden unter Verwendung von Verfahren, welche im Fachgebiet Standard oder konventionelle Verfahren darstellen. Im Allgemeinen basieren diese auf Gentechnologieverfahren.
  • Die zu amplifizierenden Nukleinsäuren können erhalten werden unter Verwendung von Verfahren, welche im Fachgebiet allgemein bekannt sind. Beispielsweise durch Erhalten einer Nukleinsäureprobe wie etwa Gesamt-DNA, genomische DNA, cDNA, Gesamt-RNA, mRNA usw. durch Verfahren, welche im Fachgebiet allgemein bekannt und dokumentiert sind, und Erzeugung von Fragmenten daraus, beispielsweise durch einen beschränkten Restriktionsenzymverdau oder durch mechanische Mittel.
  • Normalerweise wird die zu amplifizierende Nukleinsäure zuerst in doppelsträngiger Form erhalten. Wenn die Nukleinsäure in einzelsträngiger Form bereitgestellt wird, beispielsweise als mRNA, wird sie zuerst in eine doppelsträngige Form überführt durch Mittel, welche im Fachgebiet allgemein bekannt und dokumentiert sind, beispielsweise unter Verwendung von Oligo-dT-Primern und reverser Transkriptase und DNA-Polymerase. Wenn die zu amplifizierende Nukleinsäure erst einmal in doppelsträngiger Form mit geeigneter Länge erhalten wurde, werden mit jedem Ende Oligonukleotidsequenzen verbunden, welchen den Oligonukleotidsequenzen Y und Z entsprechen, d.h. sowohl mit den 5'- als auch 3'-Enden der Nukleinsäuresequenz, um ein Nukleinsäuretemplat zu bilden. Dies kann durchgeführt werden unter Verwendung von Verfahren, welche im Fachgebiet allgemein bekannt und dokumentiert sind, beispielsweise durch Ligation oder durch Insertion der zu amplifizierenden Nukleinsäure in einen biologischen Vektor an einer Stelle, welche durch die geeigneten Oligonukleotidsequenzen flankiert wird. Wenn zumindest ein Teil der Sequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure bekannt ist, kann das Nukleinsäuretemplat, welches die Oligonukleotidsequenzen Y und Z an den 5'- bzw. 3'-Enden enthält, alternativ durch PCR erzeugt werden, unter Verwendung geeigneter PCR-Primer, welche Sequenzen umfassen, die für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifisch sind. Vor dem Anheften des Nukleinsäuretemplats an den festen Träger kann dieses unter Verwendung von Verfahren, welche im Fachgebiet allgemein bekannt und dokumentiert sind, in eine einzelsträngige Form gebracht werden, beispielsweise durch Erhitzen auf ungefähr 94°C und schnelles Abkühlen auf 0°C auf Eis.
  • Die am 5'-Ende der Nukleinsäure enthaltene Oligonukleotidsequenz kann eine beliebige Sequenz sein und eine beliebige Länge aufweisen und wird hierin als Sequenz Y bezeichnet. Geeignete Längen und Sequenzen eines Oligonukleotids können ausgewählt werden unter Verwendung von Verfahren, welche im Fachgebiet allgemein bekannt und dokumentiert sind. Beispielsweise sind die Oligonukleotidsequenzen, welche an jedes Ende der zu amplifizierenden Nukleinsäure angeheftet sind, normalerweise relativ kurze Nukleotidsequenzen von zwischen 5 und 100 Nukleotiden Länge. Die Oligonukleotidsequenz, welche am 3'-Ende der Nukleinsäure enthalten ist, kann eine beliebige Sequenz und eine beliebige Länge aufweisen und wird hierin als Sequenz Z bezeichnet. Geeignete Längen und Sequenzen eines Oligonukleotids können ausgewählt werden unter Verwendung von Verfahren, welche im Fachgebiet allgemein bekannt und dokumentiert sind. Die Oligonukleotidsequenzen, welche an jedem Ende der zu amplifizierenden Nuklein säure enthalten sind, sind beispielsweise in der Regel relativ kurze Nukleotidsequenzen von zwischen 5 und 100 Nukleotiden Länge.
  • Die Sequenz der Oligonukleotidsequenz Z ist so, dass sie mit einem der Colony-Primer X hybridisieren kann. Bevorzugt ist die Sequenz der Oligonukleotidsequenz Y so, dass sie gleich ist wie die Sequenz von einem der Colony-Primer X. Mehr bevorzugt ist die Oligonukleotidsequenz Z komplementär zur Oligonukleotidsequenz Y (Y') und die Colony-Primer X weisen die gleiche Sequenz wie die Oligonukleotidsequenz Y auf.
  • Die Oligonukleotidsequenzen Y und Z können hergestellt werden unter Verwendung von Verfahren, welche im Fachgebiet Standard oder konventionelle Verfahren darstellen, oder sie können von kommerziellen Quellen bezogen werden.
  • Bei der Herstellung der Nukleinsäuretemplate können außerdem gewünschte Sequenzen eingebracht werden durch Verfahren, welche im Fachgebiet allgemein bekannt und dokumentiert sind. Solche zusätzlichen Sequenzen umfassen beispielsweise Restriktionsenzymstellen oder bestimmte Nukleinsäure-Ttags, um die Identifikation von Amplifikationsprodukten einer bestimmten Nukleinsäuretemplatsequenz zu ermöglichen. Andere wünschenswerte Sequenzen umfassen „zurückgefaltete" DNA-Sequenzen (welche als Einzelstrang Haarnadelschleifen oder andere Sekundärstrukturen bilden), "Kontroll"-DNA-Sequenzen, welche Protein/DNA-Wechselwirkungen lenken, wie etwa beispielsweise eine Promotor-DNA-Sequenz, welche von einer Nukleinsäurepolymerase erkannt wird oder eine Operator-DNA-Sequenz, welche durch ein DNA-Bindeprotein erkannt wird.
  • Wenn mehrere Nukleinsäuresequenzen amplifiziert werden sollen, kann das Anheften der Oligonukleotide Y und Z in der gleichen oder in einer unterschiedlichen Reaktion durchgeführt werden.
  • Wenn ein Nukleinsäuretemplat hergestellt worden ist, kann es amplifiziert werden, ehe es in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird. Solch eine Amplifikation kann durchgeführt werden unter Verwendung von Verfahren, welche im Fachgebiet allgemein bekannt und dokumentiert sind, beispielsweise durch Insertion der Templatnukleinsäure in einen Expressionsvektor und deren Amplifikation in einem geeigneten biologischen Wirt oder deren Amplifikation durch PCR. Dieser Amplifikationsschritt ist aber nicht essentiell, da das erfindungsgemäße Verfahren es ermöglicht, dass mehrere Kopien des Nukleinsäuretemplats in einer Nukleinsäurekolonie, welche aus einer einzelnen Kopie des Nukleinsäuretemplats gebildet wurde, erzeugt werden.
  • Bevorzugt ist das 5'-Ende des Nukleinsäuretemplats, welches wie oben beschrieben hergestellt wird, modifiziert, um ein Mittel zum kovalenten Anheften der Nukleinsäuretemplate an einen festen Träger zu tragen. Solch ein Mittel kann beispielsweise eine chemisch modifizierbare funktionelle Gruppe sein, wie etwa beispielsweise eine Phosphatgruppe, ein Carboxyl- oder Aldehydrest, eine Thiol- oder eine Aminogruppe. Am meisten bevorzugt wird die Thiol-, Phosphat- oder Aminogruppe für eine 5'-Modifikation der Nukleinsäure verwendet.
  • Die Colony-Primer können hergestellt werden unter Verwendung von Verfahren, welche im Fachgebiet Standard oder konventionelle Verfahren darstellen. Im Allgemeinen sind die Colony-Primer synthetische Oligonukleotide, erzeugt durch Verfahren, welche im Fachgebiet allgemein bekannt und dokumentiert sind, oder sie können von kommerziellen Quellen bezogen werden.
  • Gemäß dem Verfahren der Erfindung können ein oder zwei unterschiedliche Colony-Primer X verwendet werden, um eine beliebige Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren. Dies steht im Gegensatz zu vielen der Amplifikationsverfahren und besitzt einen Vorteil gegenüber vielen der Amplifikationsverfahren, welche im Stand der Technik bekannt sind, wie etwa beispielsweise das in WO 96/04404 offenbarte Verfahren, worin unterschiedliche spezifische Primer für jede zu amplifizierende spezifische Nukleinsäuresequenz konstruiert werden müssen.
  • Bevorzugt sind die 5'-Enden der Colony-Primer X der Erfindung modifiziert, um ein Mittel zum kovalenten Anheften der Colony-Primer an den festen Träger zu tragen. Bevorzugt ist dieses Mittel zum kovalenten Anheften eine chemisch modifizierbare, funktionelle Gruppe wie oben beschrieben. Falls erwünscht, können die Colony-Primer so gestaltet sein, dass sie weitere wünschenswerte Sequenzen umfassen, wie etwa beispielsweise Restriktionsendonukleasestellen, oder andere Arten von Spaltungsstellen wie etwa Ribozymspaltungsstellen. Andere wünschenswerte Sequenzen umfassen zurückgefaltete DNA-Sequenzen (welche als Einzelstrang Haarnadelschleifen oder andere Sekundärstrukturen bilden), "Kontroll"-DNA-Sequenzen, welche eine Protein/DNA-Wechselwirkung steuern, wie etwa beispielsweise eine Promotor-DNA-Sequenz, welche durch eine Nukleinsäurepolymerase erkannt wird oder eine Operator-DNA-Sequenz, welche durch ein DNA-Bindeprotein erkannt wird.
  • Die Immobilisierung eines Colony-Primers X an einen Träger durch das 5'-Ende belässt dessen 3'-Ende vom Träger entfernt, so dass der Colony-Primer für eine Kettenverlängerung durch eine Polymerase verfügbar ist, wenn eine Hybridisierung mit einer komplementären Oligonukleotidsequenz, enthalten am 3'-Ende des Nukleinsäuretemplats, stattgefunden hat.
  • Wenn sowohl die Nukleinsäuretemplate als auch Colony-Primer synthetisiert worden sind, werden sie in geeigneten Anteilen zusammengemischt, so dass bei Anheftung an den festen Träger eine geeignete Dichte der angehefteten Nukleinsäuretemplate und Colony-Primer erhalten wird. Bevorzugt ist der Anteil der Colony-Primer in dem Gemisch höher als der Anteil der Nukleinsäuretemplate. Bevorzugt ist das Verhältnis von Colony-Primern und Nukleinsäuretemplaten so, dass bei Immobilisierung der Colony-Primer und Nukleinsäuretemplate an den festen Träger ein "Rasen" von Colony-Primern gebildet wird, welcher mehrere Colony-Primer umfasst, die mit einer ungefähr einheitlichen Dichte über den gesamten oder einen definierten Bereich des festen Trägers lokalisiert sind, wobei ein oder mehrere Nukleinsäuretemplate einzeln mit Abständen innerhalb des Rasens der Colony-Primer immobilisiert sind.
  • Die Nukleinsäuretemplate können in einzelsträngiger Form bereitgestellt werden. Aber sie können auch vollständig oder teilweise in doppelsträngiger Form bereitgestellt werden, wobei entweder ein 5'-Ende oder beide 5'-Enden so modifiziert sind, dass sie eine Anheftung an den Träger ermöglichen. Nach Beendigung des Anheftungsverfahrens kann es in diesem Fall erwünscht sein, die Stränge durch im Fachgebiet bekannte Verfahren zu trennen, z.B. durch Erhitzen auf 94°C, ehe die freigesetzten Stränge weggewaschen werden. Es ist verständlich, dass in dem Fall, in welchem beide Stränge der doppelsträngigen Moleküle mit der Oberfläche reagiert haben und beide angeheftet sind, die Ergebnisse die gleichen sind wie in dem Fall, in dem nur ein Strang angeheftet wird und ein Amplifikationsschritt durchgeführt wurde. Mit anderen Worten, in dem Fall, in dem beide Stränge einer doppelsträngigen Templatnukleinsäure angeheftet wurden, sind beide Stränge notwendigerweise nahe beieinander angeheftet und sind nicht unterscheidbar von dem Ergebnis beim Anheften von nur einem Strang und Durchführen eines Amplifikationsschritts. Folglich können einzelsträngige und doppelsträngige Templatnukleinsäuren verwendet werden zum Bereitstellen von Templatnukleinsäuren, welche an die Oberfläche angeheftet sind und für eine Kolonieerzeugung geeignet sind.
  • Der Abstand zwischen einzelnen Colony-Primern und den einzelnen Nukleinsäuretemplaten (und folglich die Dichte der Colony-Primer und Nukleinsäuretemplate) kann kontrolliert bzw. gesteuert werden durch Veränderung der Konzentration der Colony-Primer und Nukleinsäuretemplate, welche an dem Träger immobilisiert sind. Eine bevorzugte Dichte der Colony-Primer beträgt mindestens 1 fmol/mm2, bevorzugt mindestens 10 fmol/mm2, mehr bevorzugt zwischen 30 bis 60 fmol/mm2. Die Dichte der Nukleinsäuretemplate zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren beträgt normalerweise 10 000/mm2 bis 100 000/mm2. Es wird angenommen, dass höhere Dichten, beispielsweise 100 000/mm2 bis 1 000 000 Million/mm2 und 1 000 000 Million/mm2 bis 10 000 000 Millionen/mm2 erreicht werden können.
  • Die Kontrolle bzw. Steuerung der Dichte der angehefteten Nukleinsäuretemplate und Colony-Primer ermöglicht wiederum die Kontrolle bzw. Steuerung der endgültigen Dichte der Nukleinsäurekolonien auf der Oberfläche des zu untersuchenden Trägers. Dies rührt von der Tatsache her, dass gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Nukleinsäurekolonie aus dem Anheften eines Nukleinsäuretemplats resultieren kann, vorausgesetzt dass die Colony-Primer der Erfindung an einer geeigneten Stelle auf dem festen Träger vorliegen (für mehr Einzelheiten siehe unten). Die Dichte der Nukleinsäuremoleküle innerhalb einer einzelnen Kolonie kann auch durch Kontrollieren bzw. Steuern der Dichte der angehefteten Colony-Primer kontrolliert bzw. gesteuert werden.
  • Wenn die Colony-Primer und Nukleinsäuretemplate auf dem festen Träger mit der geeigneten Dichte immobilisiert wurden, dann können die erfindungsgemäßen Kolonien durch Durchführen einer geeigneten Anzahl von Zyklen der Amplifikation an der kovalent gebundenen Templatnukleinsäure erzeugt werden, so dass jede Kolonie mehrere Kopien des originalen immobilisierten Nukleinsäuretemplats und dessen komplementärer Sequenz umfasst. Ein Amplifikationszyklus besteht aus den Schritten der Hybridisierung, Verlängerung und Denaturierung, und diese Schritte werden im Allgemeinen durchgeführt unter Verwendung von Reagenzien und Bedingungen, welche auf dem Gebiet der PCR allgemein bekannt sind.
  • Eine typische Amplifikationsreaktion umfasst Aussetzen des festen Trägers und des angehefteten Nukleinsäuretemplats und der Colony-Primer Bedingungen, welche eine Primerhybridisierung induzieren, beispielsweise Aussetzen einer Temperatur von ungefähr 65°C. Unter diesen Bedingungen hybridisiert die Oligonukleotidsequenz Z am 3'-Ende des Nukleinsäuretemplats mit dem immobilisierten Colony-Primer X und bei Vorliegen der Bedingungen und Reagenzien zur Förderung der Primerverlängerung, beispielsweise einer Temperatur von ungefähr 72°C, dem Vorhandensein von Nukleinsäurepolymerase, beispielsweise einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase oder einem reversen Transkriptasemolekül (d.h. einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase), oder einer RNA-Polymerase, plus einer Versorgung mit Nukleosidtriphosphatmolekülen oder beliebigen anderen Nukleotidvorläufern, beispielsweise modifizierter Nukleosidtriphosphatmoleküle, wird der Colony-Primer durch Hinzufügen von Nukleotiden, welche mit der Templatnukleinsäuresequenz komplementär sind, verlängert.
  • Beispiele für Nukleinsäurepolymerasen, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind DNA-Polymerase (Klenow-Fragment, T4-DNA-Polymerase), hitzestabile Polymerasen aus einer Vielzahl von thermostabilen Bakterien (wie etwa Taq-, VENT-, Pfu-, Tfl-DNA-Polymerasen), ebenso wie deren genetisch modifizierten Derivate (TagGold, VENTexo, Pfu-exo). Zur Erzeugung der Amplifikation einer DNA-Kolonie kann auch eine Kombination einer RNA-Polymerase und reversen Transkriptase verwendet werden. Bevorzugt ist die für eine Colony-Primerverlängerung verwendete Nukleinsäurepolymerase stabil unter PCR-Reaktionsbedingungen, d.h. wiederholten Zyklen von Erwärmen und Abkühlen, und sie ist stabil bei der verwendeten Denaturierungstemperatur, normalerweise ungefähr 94°C. Bevorzugt ist die verwendete DNA-Polymerase Taq-DNA-Polymerase.
  • Bevorzugt sind die verwendeten Nukleosidtriphosphatmoleküle Desoxyribonukleosidtriphosphate, beispielsweise dATP, dTTP, dCTP, dGTP, oder es sind Ribonukleosidtriphosphate, beispielsweise dATP, dUTP, dCTP, dGTP. Die Nukleosidtriphosphatmoleküle können natürlich oder nicht natürlich vorkommende Nukleosidtriphosphatmoleküle sein.
  • Nach den Hybridisierungs- und Verlängerungsschritten sind beim Aussetzen des Trägers und der angehefteten Nukleinsäuren gegenüber Denaturierungsbedingungen zwei immobilisierte Nukleinsäuren vorhanden, wobei die erste das anfänglich immobilisierte Nukleinsäuretemplat ist und die zweite eine dazu komplementäre Nukleinsäure ist, wobei einer der immobilisierten Colony-Primer X verlängert wurde. Sowohl das originale immobilisierte Nukleinsäuretemplat als auch der gebildete immobilisierte verlängerte Colony-Primer können dann weitere Runden der Amplifikation einleiten durch Aussetzen des Trägers gegenüber weiteren Zyklen der Hybridisierung, Verlängerung und Denaturierung. Solche weiteren Amplifikationsrunden ergeben eine Nukleinsäurekolonie, welche mehrere immobilisierte Kopien der Templatnukleinsäure und deren komplementärer Sequenz umfasst.
  • Die anfängliche Immobilisierung der Templatnukleinsäure bedeutet, dass die Templatnukleinsäure nur mit Colony-Primern hybridisieren kann, welche in einem Abstand innerhalb der Gesamtlänge der Templatnukleinsäure lokalisiert sind. Folglich ist die Grenze der gebildeten Nukleinsäurekolonie beschränkt auf eine relativ lokale Fläche im Hinblick auf die Fläche, in welcher die anfängliche Templatnukleinsäure immobilisiert wurde. Es ist klar, dass wenn einmal mehrere Kopien des Templatmoleküls und dessen Gegenstück durch Durchführen von weiteren Amplifikationsrunden, d.h. weiteren Runden der Hybridisierung, Verlängerung und Denaturierung synthetisiert wurden, dass sich dann die Grenze der erzeugten Nukleinsäurekolonie weiter erstrecken kann, obwohl die Grenze der gebildeten Kolonie noch immer auf eine relativ lokale Fläche im Hinblick auf die Fläche beschränkt ist, in welcher das anfängliche Nukleinsäuretemplat immobilisiert wurde.
  • Eine schematische Darstellung eines Verfahrens der Erzeugung einer Nukleinsäurekolonie gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist in 1 gezeigt. 1(a) zeigt einen Colony-Primer X (welcher hier mit der Sequenz ATT gezeigt wird) und ein Nukleinsäuretemplat, welches am 5'-Ende eine Oligonukleotidsequenz Y trägt, hier als ATT gezeigt, und am 3'-Ende eine Oligonukleotidsequenz Z trägt, hier als AAT gezeigt, welche mit der Colony-Primersequenz Y hybridisieren kann. In der schematischen Darstellung sind der Colony-Primer X und die Oligonukleotidsequenzen Y und Z mit nur drei Nukleotiden Länge gezeigt. Es ist jedoch verständlich, dass in der Praxis normalerweise längere Sequenzen verwendet werden. Die 5'-Enden sowohl des Colony-Primers als auch des Nukleinsäuretemplats tragen ein Mittel zum Anheften der Nukleinsäure an einen festen Träger. Dieses Mittel ist in 1 als schwarzes Rechteck gezeigt. Dieses Mittel zum Anheften kann eine kovalente oder nicht kovalente Bindung ergeben.
  • In 1(a) ist der Einfachheit halber nur ein Colony-Primer X und eine Templatnukleinsäure gezeigt. Aber in der Praxis sind mehrere Colony-Primer X mit mehreren Nukleinsäuretemplaten vorhanden. Die mehreren Colony-Primer X können zwei unterschiedliche Colony-Primer X umfassen. Aber der Einfachheit halber zeigt die in 1 gezeigte schematische Darstellung nur eine Art des Colony-Primers X, mit der Sequenz ATT. Die mehreren Nukleinsäuretemplate können unterschiedliche Nukleinsäuresequenzen in dem zentralen Teil zwischen den Oligonukleotiden Y und Z umfassen, enthalten aber die gleichen Oligonukleotidsequenzen Y und Z an den 5'- bzw. 3'-Enden. Der Einfachheit halber ist in 1 nur eine Spezies eines Nukleinsäuretemplats gezeigt, bei welchem ein Teil der Sequenz im zentralen Teil als CGG gezeigt ist.
  • Bei Vorhandensein eines festen Trägers binden die 5'-Enden sowohl des Nukleinsäuretemplats als auch des Colony-Primers an den Träger. Dies ist in 1(b) dargestellt. Der Träger und das angeheftete Nukleinsäuretemplat und die Colony-Primer werden dann Bedingungen unterworfen, welche eine Primerhybridisierung induzieren. 1(c) zeigt ein Nukleinsäuretemplat, welches mit einem Colony-Primer hybridisiert wurde. Solch eine Hybridisierung wird ermöglicht aufgrund der Tatsache, dass die Oligonukleotidsequenz Z am 3'-Ende des Nukleinsäuretemplats mit dem Colony-Primer hybridisieren kann. In der schematischen Darstellung ist die Oligonukleotidsequenz Z gezeigt als komplementäre Sequenz zum Colony-Primer, obwohl in der Praxis eine exakte komplementäre Sequenz nicht essentiell ist, vorausgesetzt dass die Hybridisierung unter den Bedingungen erfolgen kann, welchen die Nukleinsäuretemplate und Colony-Primer unterworfen werden.
  • 1(d) zeigt das Stadium der Primerverlängerung. Unter geeigneten Bedingungen der Temperatur und in Gegenwart einer DNA-Polymerase und einem Angebot an Nukleotidvorläufern, beispielsweise dATP, dTTP, dCTP und dGTP, verlängert hier die DNA-Polymerase den Colony-Primer von seinem 3'-Ende unter Verwendung des Nukleinsäuretemplats als Templat. Wenn die Primerverlängerung abgeschlossen ist, siehe 1(e), kann gesehen werden, dass ein zweiter immobilisierter Nukleinsäurestrang erzeugt worden ist, welcher zum dem anfänglichen Nukleinsäuretemplat komplementär ist. Beim Trennen der zwei Nukleinsäurestränge, beispielsweise durch Erhitzen, liegen zwei immobilisierte Nukleinsäuren vor, wobei die erste das anfänglich immobilisierte Nukleinsäuretemplat ist und das zweite eine Nukleinsäure ist, welche komplementär dazu ist, welche aus einem der immobilisierten Colony-Primer X verlängert wurde, siehe 1(f).
  • Sowohl das originale immobilisierte Nukleinsäuretemplat als auch der gebildete immobilisierte verlängerte Colony-Primer können dann mit anderen Colony-Primern hybridisieren, welche vorhanden sind (in der 1(g) als Colony-Primer 2 und 3 dargestellt), und nach einer weiteren Runde der Primerverlängerung (1(h)) und Strangtrennung (1(i)) werden vier einzelsträngige immobilisierte Stränge bereitgestellt. Zwei dieser Stränge enthalten Sequenzen, welche dem originalen Nukleinsäuretemplat entsprechen, und zwei enthalten Sequenzen, welche komplementär dazu sind.
  • Über die in 1 gezeigten Amplifikationsrunden hinaus können weitere Runden durchgeführt werden, um eine Nukleinsäurekolonie zu ergeben, welche mehrere immobilisierte Kopien der Templatnukleinsäure und deren komplementärer Sequenz umfassen.
  • Somit ist ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Verfahren die Erzeugung einer Nukleinsäurekolonie aus einem einzelnen immobilisierten Nukleinsäuretemplat ermöglicht und dass die Größe dieser Kolonien kontrolliert bze. gesteuert werden kann durch Änderung der Anzahl der Amplifikationsrunden, welchen das Nukleinsäuretemplat unterworfen wird. Somit ist die Anzahl der auf der Oberfläche des festen Trägers gebildeten Nukleinsäurekolonien abhängig von der Anzahl der Nukleinsäuretemplate, welche anfänglich mit dem Träger immobilisiert wurden, vorausgesetzt dass eine ausreichende Anzahl von immobilisierten Colony-Primern innerhalb des Bereichs von jedem immobilisierten Nukleinsäuretemplat gegeben ist. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, dass der feste Träger, an welchen die Colony-Primer und Nukleinsäuretemplate immobilisiert wurden, einen Rasen von immobilisierten Colony-Primern mit einer geeigneten Dichte umfasst, wobei Nukleinsäuretemplate in Abständen innerhalb des Primerrasens immobilisiert sind.
  • Eine solches sogenanntes "Autopatterning" von Nukleinsäurekolonien besitzt einen Vorteil gegenüber vielen Verfahren des Standes der Technik darin, dass eine höhere Dichte von Nukleinsäurekolonien erhalten werden kann aufgrund der Tatsache, dass die Dichte durch Regulierung der Dichte kontrolliert bzw. gesteuert werden kann, mit welcher die Nukleinsäuretemplate ursprünglich immobilisiert wurden. Solch ein Verfahren ist somit nicht dadurch beschränkt, dass beispielsweise spezifische Primer an bestimmten lokalen Bereichen des Trägers spezifisch angeordnet werden müssen und dass dann die Koloniebildung durch punktuelles Aufbringen einer bestimmten Probe, welche ein Nukleinsäuretemplat enthält, auf die gleiche lokale Fläche des Primers initiiert werden muss. Die Anzahl der Kolonien, welche unter Verwendung von Verfahren des Standes der Technik angeordnet werden können, beispielsweise der in WO 96/04404 (Mosaic Technologies, Inc.) offenbarten Verfahren, ist somit durch die Dichte/den Abstand beschränkt, mit welchem die spezifischen Primerflächen im anfänglichen Schritt angeordnet werden können.
  • Durch die Möglichkeit der Kontrolle bzw. Steuerung der anfänglichen Dichte der Nukleinsäuretemplate und folglich der Dichte der aus den Nukleinsäuretemplaten resultierenden Nukleinsäurekolonien, zusammen mit der Möglichkeit der Kontrolle bzw. Steuerung der Größe der gebildeten Nukleinsäurekolonien und zusätzlich der Dichte der Nukleinsäuretemplate innerhalb einzelner Kolonien kann eine optimale Situation erreicht werden, wenn eine hohe Dichte an einzelnen Nukleinsäurekolonien auf einem festen Träger erzeugt werden kann mit ausreichend großer Größe, und welche eine ausreichend große Anzahl an amplifizierten Sequenzen enthalten, um eine nachfolgende Analyse oder ein Monitoring mit den Nukleinsäurekolonien durchführen zu können.
  • Wenn Nukleinsäurekolonien erzeugt worden sind, kann es wünschenswert sein, einen weiteren Schritt wie etwa beispielsweise eine Sichtbarmachung der Kolonien oder eine Sequenzbestimmung (siehe später) durchzuführen. Eine Sichtbarmachung der Kolonien kann beispielsweise erforderlich sein, wenn es notwendig ist, die erzeugten Kolonien im Hinblick auf die Anwesenheit oder die Abwesenheit beispielsweise eines ganzen oder eines Teils eines bestimmten Nukleinsäurefragments zu screenen. In diesem Fall können die Kolonie oder Kolonien, welche das bestimmte Nukleinsäurefragment enthalten, nachgewiesen werden durch Gestaltung einer Nukleinsäuresonde, welche speziell mit dem Nukleinsäurefragment von Interesse hybridisiert.
  • Solch eine Nukleinsäuresonde ist bevorzugt markiert mit einem nachweisbaren Anteil wie etwa einer Fluoreszenzgruppe, einem biotinhaltigen Anteil (welcher beispielsweise durch eine Inkubation mit Streptavidin nachgewiesen werden kann, welches mit einer Fluoreszenzgruppe markiert ist), einer Radiomarkierung (welche in eine Nukleinsäuresonde durch Verfahren eingebracht werden kann, welche im Fachgebiet allgemein bekannt und dokumentiert sind, und durch Nachweis der Radioaktivität beispielsweise durch Inkubation mit einer Szintillationsflüssigkeit nachgewiesen werden kann), oder einem Farbstoff oder einem anderen Färbemittel.
  • Alternativ kann solch eine Nukleinsäuresonde nicht markiert sein und so gestaltet sein, dass sie als Primer für das Einbringen einer Anzahl von markierten Nukleotiden mit einer Nukleinsäurepolymerase fungiert. Dann kann der Nachweis der eingebrachten Markierung und folglich der Nukleinsäurekolonien durchgeführt werden.
  • Die Nukleinsäurekolonien werden dann für eine Hybridisierung vorbereitet. Solch eine Vorbereitung betrifft die Behandlung der Kolonien, so dass alle oder ein Teil der Nukleinsäuretemplate, welche die Kolonien bilden, in einer einzelsträngigen Form vorliegen. Dies kann beispielsweise erreicht werden durch Hitzedenaturierung von jeder doppelsträngigen DNA in den Kolonien. Alternativ können die Kolonien mit einer Restriktionsendonuklease behandelt werden, welche für eine doppelsträngige Form einer Sequenz in der Templatnukleinsäure spezifisch sind. Folglich kann die Endonuklease entweder für eine in den Oligonukleotidsequenzen Y oder Z enthaltene Sequenz oder eine andere Sequenz spezifisch sein, welche in der Templatnukleinsäure vorliegt. Nach einem Verdau werden die Kolonien erwärmt, so dass die doppelsträngigen DNA-Moleküle getrennt werden und die Kolonien werden gewaschen, um die nicht immobilisierten Stränge zu entfernen, wobei in den Kolonien angeheftete einzelsträngige DNA verbleibt.
  • Nach der Vorbereitung der Kolonien für die Hybridisierung wird die markierte oder nicht markierte Sonde dann zu den Kolonien zugegeben unter Bedingungen, die für die Hybridisierung der Sonde mit deren spezifischer DNA-Sequenz geeignet sind. Solche Bedingungen können von einem Fachmann unter Verwendung bekannter Verfahren bestimmt werden und hängen beispielsweise von der Sequenz der Sonde ab.
  • Die Sonde kann dann durch Hitzedenaturierung entfernt werden und, falls gewünscht, kann eine Sonde, welche für eine zweite Nukleinsäure spezifisch ist, hybridisiert und nachgewiesen werden. Diese Schritte könne soviele Male wie gewünscht wiederholt werden.
  • Markierte Sonden, welche mit Nukleinsäurekolonien hybridisiert sind, können dann unter Verwendung einer Apparatur nachgewiesen werden, welche eine geeignete Nachweisvorrichtung umfasst. Ein bevorzugtes Nachweissystem für Fluoreszenzmarkierungen ist eine ladungsgekoppelte (CCD, „charge coupled device")-Kamera, welche optional mit einer Vorrichtung zur Vergrößerung verbunden sein kann, beispielsweise einem Mikroskop. Unter Verwendung einer solchen Technologie ist es möglich, viele Kolonien gleichzeitig parallel zu kontrollieren. Unter Verwendung eines Mikroskops mit einer CCD-Kamera und einem 10×- oder 20×-Objektiv ist es beispielsweise möglich, Kolonien über einer Fläche von zwischen 1 mm2 und 4 mm2 zu beobachten, was einer Kontrolle von zwischen 10 000 und 200 000 Kolonien parallel entspricht. Außerdem wird erwartet, dass sich diese Anzahl mit einer verbesserten Optik und größeren Chips erhöht.
  • Ein alternatives Verfahren zur Kontrolle der erzeugten Kolonien ist es, die mit Kolonien bedeckte Oberfläche zu scannen. Es können beispielsweise Systeme verwendet werden, bei welchen bis zu 100 000 000 Kolonien gleichzeitig angeordnet werden können und durch Aufnahme von Bildern kontrolliert werden können, wobei die CCD-Kamera über die gesamte Fläche verwendet werden kann. Es ist ersichtlich, dass auf diese Art bis zu 100 000 000 Kolonien in kurzer Zeit kontrolliert werden können.
  • Zur Kontrolle der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekolonien können beliebige andere Vorrichtungen verwendet werden, welche den Nachweis und bevorzugt die Quantifizierung einer Fluoreszenz auf einer Oberfläche ermöglichen. Es können beispielsweise Fluoreszenz-Imager oder konfokale Mikroskope verwendet werden.
  • Wenn die Markierungen radioaktiv sind, ist ein Nachweissystem für Radioaktivität erforderlich.
  • In den erfindungsgemäßen Verfahren, worin der weitere Schritt Durchführen von mindestens einem Schritt der Sequenzbestimmung von mindestens einer der erzeugten Nukleinsäurekolonien durchgeführt wird, kann diese Sequenzbestimmung durchgeführt werden unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Festphasensequenzverfahrens. Ein Verfahren der Sequenzbestimmung, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, betrifft beispielsweise die Hybridisierung eines geeigneten Primers, hierin manchmal als ein "Sequenzprimer" bezeichnet, mit dem zu sequenzierenden Nukleinsäuretemplat, Verlängerung des Primers und Nachweis der zur Verlängerung des Primers verwendeten Nukleotide. Bevorzugt wird die zur Verlängerung des Primers verwendete Nukleinsäure nachgewiesen, ehe ein weiteres Nukleotid zu der wachsenden Nukleinsäurekette zugefügt wird, was eine in situ-Nukleinsäuresequenzierung von Base zu Base ermöglicht.
  • Der Nachweis der eingefügten Nukleotide wird erleichtert durch Einschließen von einem oder mehreren markierten Nukleotiden in die Primerverlängerungsreaktion. Es kann jede beliebige nachweisbare geeignete Markierung verwendet werden, beispielsweise ein Fluorophor, eine Radiomarkierung usw. Bevorzugt wird eine Fluoreszenzmarkierung verwendet. Für jede unterschiedliche Art von Nukleotid können die gleichen oder unterschiedliche Markierungen verwendet werden. Wenn die Markierung ein Fluorophor ist und die gleichen Markierungen für jede unterschiedliche Art von Nukleotids verwendet werden, kann jeder Nukleotideinbau einen kumulativen Anstieg des Signals, welches bei einer bestimmten Wellenlänge nachgewiesen wird, bewirken. Wenn unterschiedliche Markierungen verwendet werden, dann können diese Signale bei unterschiedlichen geeigneten Wellenlängen nachgewiesen werden. Falls gewünscht, kann ein Gemisch an markierten und nicht markierten Nukleotiden bereitgestellt werden.
  • Um die Hybridisierung eines geeigneten Sequenzprimers mit dem zu sequenzierenden Nukleinsäuretemplat zu ermöglichen, sollte das Nukleinsäuretemplat normalerweise in einzelsträngiger Form vorliegen. Wenn die Nukleinsäuretemplate, welche die Nukleinsäurekolonien bilden, in einer doppelsträngigen Form vorliegen, können diese bearbeitet werden, um einzelsträngige Nukleinsäuretemplate bereitzustellen unter Verwendung von Verfahren, welche im Fachgebiet allgemein bekannt sind, beispielsweise durch Denaturierung, Spaltung usw.
  • Die Sequenzprimer, welche mit dem Nukleinsäuretemplat hybridisiert werden und für eine Primerverlängerung verwendet werden, sind bevorzugt kurze Oligonukleotide, beispielsweise 15 bis 25 Nukleotide lang. Die Sequenz der Primer ist so gestaltet, dass sie mit einem Teil des zu sequenzierenden Nukleinsäuretemplats hybridisieren, bevorzugt unter stringenten Bedingungen. Die Sequenz der für eine Sequenzierung verwendeten Primer kann die gleiche oder ähnlich Sequenzen aufweisen wie die Sequenz der Colony-Primer, welche zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekolonien verwendet werden. Die Sequenzprimer können in Lösung oder in einer immobilisierten Form bereitgestellt werden.
  • Wenn der Sequenzprimer mit dem zu sequenzierenden Nukleinsäuretemplat annealed wurde durch Unterwerfen des Nukleinsäuretemplats und des Sequenzprimers geeigneten Bedingungen, bestimmt durch im Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren, wird eine Primerverlängerung durchgeführt, beispielsweise unter Verwendung einer Nukleinsäurepolymerase und einem Angebot an Nukleotiden, wobei zumindest einige der Nukleotide in markierter Form bereitgestellt werden, und Bedingungen, welche bei Bereitstellung eines geeigneten Nukleotids für eine Primerverlängerung geeignet sind. Beispiele für Nukleinsäurepolymerasen und Nukleotide, welche verwendet werden können, sind oben beschrieben.
  • Bevorzugt ist nach jedem Primerverlängerungsschritt ein Waschschritt enthalten, um nicht eingefügte Nukleotide zu entfernen, welche die nachfolgenden Schritte stören können. Wenn der Primerverlängerungsschritt durchgeführt wurde, wird die Nukleinsäurekolonie kontrolliert, um zu bestimmen, ob ein markiertes Nukleotid in einen verlängerten Primer eingebaut wurde. Der Primerverlängerungsschritt kann dann wiederholt werden, um das nächste und die nachfolgenden Nukleotide, welche in einen verlängerten Primer eingebaut wurden, zu bestimmen.
  • Jede Vorrichtung, welche den Nachweis und bevorzugt Quantifizierung der geeigneten Markierung ermöglicht, beispielsweise Fluoreszenz oder Radioaktivität, kann für eine Sequenzbestimmung verwendet werden. Wenn die Markierung fluoreszent ist, kann eine CCD-Kamera verwendet werden, welche optional mit einer Vorrichtung zur Vergrößerung verbunden ist (wie oben beschrieben). Tatsächlich können die für die Sequenzbestimmungsaspekte der vorliegenden Erfindung verwendeten Vorrichtungen die gleichen sein wie diejenigen, welche oben zur Kontrolle der amplifizierten Nukleinsäurekolonien beschrieben werden.
  • Das Nachweissystem wird bevorzugt in Kombination mit einem Analysesystem verwendet, um die Anzahl und Art der Nukleotide zu bestimmen, welche nach jedem Schritt der Primerverlängerung in jede Kolonie eingebaut wurden. Diese Analyse, welche unmittelbar nach jedem Primerverlängerungsschritt durchgeführt werden kann, oder später unter Verwendung von aufgezeichneten Daten, ermöglicht die Bestimmung der Sequenz des Nukleinsäuretemplats innerhalb einer bestimmten Kolonie.
  • Wenn die zu bestimmende Sequenz nicht bekannt ist, werden die auf eine bestimmte Kolonie aufgebrachten Nukleotide normalerweise in einer ausgewählten Reihenfolge aufgebracht, welche dann während der Analyse wiederholt wird, beispielsweise dATP, dTTP, dCTP, dGTP. Wenn jedoch die zu bestimmende Sequenz bekannt ist und wieder sequenziert wird, beispielsweise um zu analysieren, ob in der Sequenz kleine Unterschiede zu der bekannten Sequenz vorliegen oder nicht, kann das Sequenzbestimmungsverfahren schneller durchgeführt werden durch Zugabe der Nukleotide bei jedem Schritt in der geeigneten Reihenfolge, ausgewählt gemäß der bekannten Sequenz. Unterschiede zu der bestimmten Sequenz werden folglich durch einen fehlenden Einbau bestimmter Nukleotide an bestimmten Stellen der Primerverlängerung nachgewiesen.
  • Somit ist ersichtlich, dass vollständige Sequenzen oder Teilsequenzen der amplifizierten Nukleinsäuretemplate, welche die bestimmten Nukleinsäurekolonien bilden, unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die vollständige Sequenz oder Teilsequenz von mehr als einer Nukleinsäure bestimmt werden, durch Bestimmung der vollständigen Sequenz oder Teilsequenz der amplifizierten Nukleinsäuretemplate, welche in mehr als einer Nukleinsäurekolonie vorliegen. Bevorzugt werden mehrere Sequenzen gleichzeitig bestimmt.
  • Die Durchführung der Sequenzbestimmung von Nukleinsäuren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besitzt den Vorteil, dass es wahrscheinlich sehr verlässlich ist aufgrund der Tatsache, dass große Anzahlen jeder zu sequenzierenden Nukleinsäure innerhalb jeder Nukleinsäurekolonie der Erfindung bereitgestellt werden. Falls erwünscht, können weitere Verbesserungen der Genauigkeit erhalten werden durch Bereitstellen mehrerer Nukleinsäurekolonien, umfassend das gleiche zu sequenzierende Nukleinsäuretemplat, dann Bestimmen der Sequenz für jede der mehreren Kolonien und Vergleichen der so bestimmten Sequenzen.
  • Bevorzugt ist die Anheftung des Colony-Primers und des Nukleinsäuretemplats an einen festen Träger bei der Temperatur, welcher der Träger während der Nukleinsäureamplifikationsreaktion ausgesetzt ist, beispielsweise Temperaturen von bis zu ungefähr 100°C, beispielsweise ungefähr 94°C, thermostabil. Bevorzugt ist die Anheftung kovalenter Natur.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die kovalente Bindung der Colony-Primer und des/der Nukleinsäuretemplats(e) an den festen Träger durch ein Vernetzungsmittel induziert, wie etwa beispielsweise 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid (EDC), Bernsteinsäureanhydrid, Phenyldiisothiocyanat oder Maleinsäureanhydrid, oder ein heterobifunktionelles Vernetzungsmittel wie etwa beispielsweise m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS), N-Succinimidyl-[4-iodacethyl]aminobenzoat (SIAB), Succinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), N-y-Maleimidobutyryloxysuccinimidester (GMBS), Succinimidyl-4-[p-maleimidophenyl]butyrat (SMPB) und die entsprechenden Sulfo-Verbindungen (wasserlöslich). Die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugten Vernetzungsmittel sind s-SIAB, s-MBS und EDC.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung besitzt der feste Träger eine derivatisierte Oberfläche. In noch einer weiteren Ausführungsform ist die derivatisierte Oberfläche des festen Trägers nachfolgend mit bifunktionellen Vernetzungsgruppen modifiziert, um eine funktionalisierte Oberfläche bereitzustellen, bevorzugt mit reaktiven Vernetzungsgruppen.
  • "Derivatisierte Oberfläche" wie hierin vewendet bezieht sich auf eine Oberfläche, welche mit chemisch reaktiven Gruppen modifiziert wurde, beispielsweise Amino-, Thiol- oder Acrylatgruppen.
  • "Funktionalisierte Oberfläche" wie hierin vewendet bezieht sich auf eine derivatisierte Oberfläche, welche mit speziellen funktionellen Gruppen modifiziert wurde, beispielsweise den funktionellen Maleinsäure- oder Bernsteinsäureeinheiten.
  • Um für bestimmte Anwendungen verwendbar zu sein, muss im erfindungsgemäßen Verfahren das Anheften der Colony-Primer und Nukleinsäuretemplate an einen festen Träger mehrere Anforderungen erfüllen. Die ideale Anheftung sollte weder durch eine Exposition gegenüber hohen Temperaturen noch den wiederholten Zyklen von Erhitzen/Abkühlen, welche während des Verfahrens der Nukleinsäureamplifikation angewandt werden, beeinflusst werden. Außerdem sollte der Träger das Erhalten einer Dichte der angehefteten Colony- Primer von mindestens 1 fmol/mm2, bevorzugt mindestens 10 fmol/mm2, mehr bevorzugt zwischen 30 bis 60 fmol/mm2 ermöglichen. Der ideale Träger sollte eine einheitlich glatte Fläche mit einem geringen Fluoreszenzhintergrund aufweisen und sollte auch thermisch stabil (nicht deformierbar) sein. Feste Träger, welche die passive Adsorption von DNA ermöglichen, wie etwa bei bestimmten Arten von Kunststoff und synthetischen Nitrocellulosemembranen, sind nicht geeignet. Schließlich sollte der feste Träger wegwerfbar sein, sollte somit nicht viel kosten.
  • Obwohl der feste Träger eine beliebige feste Fläche sein kann, an welche Nukleinsäuren angeheftet werden können, wie beispielsweise Latexbeads, Dextranbeads, Polystyrol, eine Polypropylenfläche, Polyacrylamidgel, Goldflächen, Glasflächen und Silikonwafer, ist aus diesen Gründen der feste Träger bevorzugt eine Glasfläche und die Anheftung der Nukleinsäuren daran erfolgt durch kovalentes Anheften.
  • Die kovalente Bindung der Colony-Primer und Nukleinsäuretemplate an den festen Träger kann durchgeführt werden unter Verwendung von Verfahren, welche im Fachgebiet allgemein bekannt und dokumentiert sind. Beispielsweise ist eine kovalente Epoxysilan-Amino-Bindung von Oligonukleotiden an feste Träger wie etwa poröse Glasbeads weithin verwendet worden für eine in situ-Festphasensynthese von Oligonukleotiden (über ein Anheften des 3'-Endes), und ist auch für ein Anheften des 5'-Endes des Oligonukleotids angepasst worden. Oligonukleotide, welche am 5'-Ende mit Carboxyl- oder Aldehydresten modifiziert wurden, sind kovalent an mit Hydrazin derivatisierte Latexbeads angeheftet worden (Kremsky et al. 1987).
  • Andere Ansätze für das Anheften von Oligonukleotiden an feste Flächen verwenden Vernetzungsmittel wie etwa Bernsteinsäureanhydrid, Phenyldiisothiocyanat (Guo et al. 1994) oder Maleinsäureanhydrid (Yang et al. 1998). Ein anderes weithin verwendetes Vernetzungsmittel ist 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid (EDC). EDC-Chemie wurde zuerst von Gilham et al. (1968) beschrieben, welcher DNA-Template über das 5'-Ende der terminalen Phosphatgruppe mit Papier (Cellulose) verband. Unter Verwendung der EDC-Chemie sind andere Träger verwendet worden wie etwa Latexbeads (Wolf et al. 1987, Lund et al. 1988), Polystyrolmikrowells (Rasmussen et al. 1991), porenkontrolliertes (Glas (Ghosh et al. 1987) und Dextranmoleküle (Gingeras et al. 1987). Die Kondensation von 5'-Amino-modifizierten Oligonukleotiden mit einem Carbodiimid-vermittelten Reagenz sind von Chu et al. (1983) beschrieben worden, und für eine terminale 5'-Phosphatmodifikationsgruppe von Egan et al. (1982).
  • Die Ausbeute der Oligonukleotidanheftung über die 5'-Termini unter Verwendung von Carbodiimiden kann 60% erreichen, aber der hauptsächliche Nachteil ist das nicht spezifische Anheften über die inneren Nukleotide des Oligonukleotids. Rasmussen et al. (1991) haben die spezifische Anheftung über die 5'-Enden durch Derivatisierung der Oberfläche unter Verwendung von sekundären Aminogruppen auf 85% verbessert.
  • Neuere Veröffentlichungen berichten über die Vorteile der heterobifunktionellen Vernetzungsmittel. Hetero- oder monbifunktionelle Vernetzungsmittel sind weithin verwendet worden zur Herstellung von PeptidCarrier-Konjugatmolekülen (Peptid-Protein), um die Immunogenizität in Tieren zu verstärken (Peeters et al. 1989). Es ist beschrieben worden, dass die meisten dieser Propfreagenzien in wässriger Lösung stabile kovalente Bindungen bilden. Diese Vernetzungsmittel sind verwendet worden, um DNA an nur einem Punkt des Moleküls auf eine feste Fläche zu binden.
  • Chrisey et al. (1996) haben die Effizienz und Stabilität der Festphasenanheftung von DNA unter Verwendung von sechs unterschiedlichen heterobifunktionellen Vernetzungsmitteln untersucht. In diesem Beispiel tritt eine Anheftung nur am 5'-Ende des DNA-Oligomers auf, welches durch eine Thiolgruppe modifiziert ist. Diese Art von Anheftung ist auch von O'Donnell-Maloney et al. (1996) für die Anheftung von DNA-Zielen in einer MALDI-TOF-Sequenzanalyse und von der Firma Hamamatsu Photonics F. K. (EP-A-665 293) zur Bestimmung der Basensequenz einer Nukleinsäure auf einer festen Fläche beschrieben worden.
  • Es sind sehr wenige Untersuchungen durchgeführt worden, welche die thermische Stabilität der Anheftung der Oligonukleotide an den festen Träger betreffen. Chrisey et al. (1996) berichtete davon, dass bei dem Vernetzungsmittel Succinimidyl-4-[p-maleimidophenyl]butyrat (SMPB) fast 60% der Moleküle während einer Wärmebehandlung von der Glasfläche freigesetzt werden. Die thermische Stabilität von anderen Reagenzien ist jedoch nicht beschrieben worden.
  • Um Nukleinsäurekolonien über die Festphaseamplifikationsreaktion zu erzeugen, wie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben, müssen Colony-Primer und Nukleinsäuretemplate spezifisch an deren 5'-Enden an die feste Fläche, bevorzugt Glas, angeheftet werden. Kurz gesagt, die Glasfläche kann mit reaktiven Aminogruppen durch Silanisierung unter Verwendung von Aminoalkoxysilanen derivatisiert werden. Geeignete Silanreagenzien umfassen Aminopropyltrimethoxysilan, Aminopropyltriethoxysilan und 4-Aminobutyltriethoxysilan. Glasflächen können auch mit anderen reaktiven Gruppen derivatisiert werden, wie etwa Acrylat oder Epoxy unter Verwendung von Epoxysilan, Acrylatsilan und Acrylamidsilan. Nach dem Derivatisierungsschritt werden die Nukleinsäuremoleküle (Colony-Primer oder Nukleinsäuretemplate) mit einer chemisch modifizierbaren funktionellen Gruppe an ihrem 5'-Ende, beispielsweise Phosphat-, Thiol- oder Aminogruppen durch ein Vernetzungsmittel, wie etwa die oben beschriebenen, mit der derivatisierten Fläche kovalent verbunden.
  • Alternativ kann nach dem Derivatisierungsschritt ein bifunktionelles Vernetzungsmittelreagenz an die Aminooberflächengruppen angeheftet werden, wobei eine modifizierte funktionalisierte Fläche bereitgestellt wird. Dann werden Nukleinsäuremoleküle (Colony-Primer oder Nukleinsäuretemplate) mit 5'-Phosphat-, Thiol- oder Aminogruppen mit der funktionalisierten Fläche umgesetzt unter Bildung einer kovalenten Bindung zwischen der Nukleinsäure und dem Glas.
  • Mögliche Vernetzungs- und Propfreagenzien, welche für ein kovalentes DNA/Oligonukleotid-Pfropfen auf den festen Träger verwendet werden können, umfassen Bernsteinsäureanhydrid, (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidhydrochlorid (EDC), m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS), N-Succinimidyl[4-iodacetyl]aminobenzoat (SIAB), Succinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), N-y-Maleimidobutyryloxysuccinimidester (GMBS), Succinimidyl-4-[p-maleimidophenyl]butyrat (SMPB) und die entsprechenden Sulfoverbindungen (wasserlöslich). Die bevorzugten Vernetzungsreagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung sind s-SIAB, s-MBS und EDC. s-MBS ist ein heterobifunktionelles Maleimid-Succinimid-Vernetzungsmittel und s-SIAB ist ein heterobifunktionelles Iodacetyl-Succinimid-Vernetzungsmittel. Beide können mit SH-Gruppen und primären Aminogruppen jeweils eine kovalente Bindung bilden. EDC ist ein Carbodiimidreagenz, welches eine kovalente Anheftung von Phosphat- und Aminogruppen vermittelt.
  • Die Colony-Primer und Nukleinsäuretemplate sind im Allgemeinen am 5'-Ende durch eine Phsphatgruppe oder durch eine primäre Aminogruppe (bei EDC-Pfropfreagenzien) oder durch eine Thiolgruppe (bei s-SIAB oder s-MBS-Linkern) modifiziert.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt somit einen festen Träger bereit, an welchen mehrere Colony-Primer X wie oben beschrieben und mindestens ein Nukleinsäuretemplat wie oben beschrieben angeheftet sind, wobei die Nukleinsäuretemplate an deren 5'-Enden eine Oligonukleotidsequenz Y wie oben beschrieben und an deren 3'-Enden eine Oligonukleotidsequenz Z wie oben beschrieben enthalten. Bevorzugt sind mehrere Nukleinsäuretemplate an den festen Träger angeheftet, welcher bevorzugt Glas ist. Bevorzugt ist die Anheftung der Nukleinsäuretemplate und Colony-Primer an den festen Träger kovalent. Unter Durchführung von einer oder mehreren Runden der Nukleinsäureamplifikation mit dem/den immobilisierten Nukleinsäuretemplat(en) unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren können die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekolonien gebildet werden. Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist deshalb ein Träger, umfassend eine oder mehrere Nukleinsäurekolonien der Erfindung. Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt die Verwendung der festen Träger der Erfindung bei Verfahren der Nukleinsäure amplifikation oder Sequenzierung bereit. Solche Verfahren der Nukleinsäureamplifikation oder Sequenzierung umfassen die Verfahren der vorliegenden Erfindung.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt die Verwendung eines derivatisierten oder funktionalisierten Trägers bereit, hergestellt wie oben beschrieben, bei Verfahren der Nukleinsäureamplifikation oder Sequenzierung. Solche Verfahren der Nukleinsäureamplifikation oder Sequenzierung umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren.
  • Die vorliegende Anmeldung stellt eine Lösung bereit für aktuelle und sich entwickelnde Bedürfnisse, welche Wissenschaftler und die Biotechnologieindustrie auf den Gebieten Genomics, Pharmakogenomics, Arzneimittelermittlung, Nahrungsmittelcharakterisierung und Genotypisierung anzugehen versuchen. Folglich besitzt das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine potenzielle Anwendung beispielsweise bei: Nukleinsäuresequenzierung und -resequenzierung, Diagnose und Screening, Genexpressionsmonitoring, Erstellung von Profilen der genetischen Diversität, Ermittlung und Scoring eines Gesamtgenompolymorphismus, Erzeugung von Genompräsentationen (Gesamtgenom eines Patienten auf einem Mikroskop-Objektträger) und Gesamtgenomsequenzierung.
  • Folglich kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um eine Nukleinsäuresequenzierung und -resequenzierung durchzuführen, wobei beispielsweise eine ausgewählte Anzahl von Genen für eine vollständige DNA-Sequenzierung speziell in Kolonien amplifiziert wird. Die Genresequenzierung ermöglicht die Identifizierung von allen bekannten oder neuen genetischen Polymorphismen der untersuchten Gene. Anwendungen liegen in der medizinischen Diagnose und der genetischen Identifizierung von lebenden Organismen.
  • Für eine Verwendung der vorliegenden Erfindung in Diagnostik und Screening können Gesamtgenome oder Teile von Genomen für eine DNA-Sequenzierung eines bekannten Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP, "single nucleotide polymorphisms") in Kolonien amplifiziert werden. Eine SNP- Identifizierung besitzt eine Anwendung in der medizinischen Genforschung, um genetische Risikofaktoren zu identifizieren, welche mit Erkrankungen verbunden sind. Eine SNP-Genotypisierung besitzt auch diagnostische Anwendungen in der Pharmakogenomik für die Identifizierung und Behandlung von Patienten mit speziellen Medikationen.
  • Für eine Verwendung der vorliegenden Erfindung bei der Erstellung von Profilen der genetischen Diversität können Populationen, beispielsweise von Organismen oder Zellen oder Geweben, durch die Amplifikation der Proben-DNA in Kolonien identifiziert werden, gefolgt von der DNA-Sequenzierung der spezifischen "Tags" für jede einzelne genetische Einheit. Auf diese Art kann die genetische Diversität der Probe definiert werden durch Zählen der Anzahl der Tags von jeder einzelnen Einheit.
  • Für eine Verwendung der vorliegenden Erfindung beim Genexpressionsmonitoring werden die exprimierten mRNA-Moleküle eines Gewebes oder Organismus, welches bzw. welcher untersucht wird, in cDNA-Moleküle umgewandelt, welche für eine DNA-Sequenzierung in Gruppen von Kolonien amplifiziert werden. Die Häufigkeit der Kolonien, welche für eine bestimmte mRNA codieren, ist proportional zur Häufigkeit der mRNA-Moleküle, welche im Ausgangsgewebe vorliegen. Anwendungen des Genexpressionsmonitoring liegen in der biomedizinischen Forschung.
  • Ein Gesamtgenom-Objektträger, auf welchem das gesamte Genom eines lebenden Organismus in einer Anzahl von DNA-Kolonien präsentiert wird, welche zahlreich genug sind, um alle Sequenzen dieses Genoms zu umfassen, kann unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden. Der Genom-Objektträger ist die genetische Karte eines beliebigen lebenden Organismus. Genetische Karten besitzen Anwendungen in der medizinischen Forschung und genetischen Identifizierung von lebenden Organismen, welche einen industriellen Wert besitzen.
  • Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um eine Gesamgenomsequenzierung durchzuführen, wobei das gesamte Genom eines lebenden Organismus für eine ausführliche DNA-Sequenzierung als Gruppen von Kolonien amplifiziert werden. Die Gesamtgenomsequenzierung ermöglicht beispielsweise 1) eine präzise Identifizierung des genetischen Stamms eines beliebigen lebenden Organismus, 2) das Auffinden neuer Gene, welche innerhalb des Genoms codiert werden und 3) das Auffinden neuer genetischer Polymorphismen.
  • Die Anwendungen der vorliegenden Erfindung sind nicht beschränkt auf eine Analyse von Nukleinsäureproben aus einem einzelnen Organismus/Patienten. Nukleinsäure-Tags können beispielsweise in die Nukleinsäuretemplate eingebracht und amplifiziert werden, und es können unterschiedliche Nukleinsäure-Tags für jeden Organismus/Patienten verwendet werden. Wenn somit die Sequenz der amplifizierten Nukleinsäure bestimmt wird, kann auch die Sequenz des Tags bestimmt und der Ursprung der Probe identifiziert werden.
  • Folglich stellt ein weiterer Aspekt der Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, oder der Nukleinsäurekolonien der Erfindung, oder der mehreren Nukleinsäuretemplate der Erfindung, oder der festen Träger der Erfindung bereit, zum Bereitstellen von Nukleinsäuremolekülen für Sequenzierung und Resequenzierung, Genexpressionsmonitoring, Erstellen von Profilen der genetischen Diversität, Diagnose, Screening, Gesamtgenomsequenzierung, Ermittlung und Scoring eines Gesamtgenompolymorphismus und für die Präparation von Gesamtgenompräsentationen (d.h. das gesamte Genom eines Individuums auf einem Träger), oder beliebige andere Anwendungen, welche die Amplifikation von Nukleinsäuren oder deren Sequenzierung einbeziehen.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Kit bereit zur Verwendung bei Sequenzierung, Resequenzierung, Genexpressionsmonitoring, Erstellung von Profilen der genetischen Diversität, Diagnose, Screening, Gesamtgenomsequenzierung, Ermittlung und Scoring eines Gesamtgenompolymorphismus oder beliebigen anderen Anwendungen, welche die Amplifikation von Nukleinsäuren oder deren Sequenzierung einbeziehen.
  • Dieses Kit umfasst mehrere Nukleinsäuretemplate und Colony-Primer der Erfindung, gebunden an einen festen Träger, wie oben dargestellt.
  • Die Erfindung wird nun in den folgenden, nicht beschränkenden Beispielen unter Hinweis auf die folgenden Zeichnungen ausführlicher beschrieben, in welchen:
  • 1 eine schematische Darstellung eines Verfahrens der Erzeugung von Nukleinsäurekolonien gemäß einer Ausführungsform der Erfindung zeigt.
  • 2: schematische Darstellung einer Templatpräparation und nachfolgenden Anheftung an die feste Fläche. In 2a ist die Herstellung der Template A, B und B', enthaltend Colony-Primersequenzen, gezeigt. Das Templat mit 3,2 Kb wird aus genomischer DNA unter Verwendung der PCR-Primer TP1 und TP2 erzeugt. Die Template A (854 Basenpaare) und B (927 Basenpaare) werden unter Verwendung der PCR-Primer TPA1/TPA2 bzw. TPB1/TPB2 erzeugt. Die TPA1- und TPB1-Oligonukleotide sind an deren 5'-Termini entweder mit einer Phosphat- oder Thiolgruppe für eine nachfolgende chemische Anheftung modifiziert (★). Es ist anzumerken, dass die erhaltenen Template Sequenzen enthalten, welche den Colony-Primern CP1 und/oder CP2 entsprechen. Die 11 Exons des Gens werden als "E1 bis E11" bezeichnet. In 2b ist die chemische Anheftung der Colony-Primer und Template an eine Glasfläche gezeigt. Die Derivatisierung durch ATS (Aminopropyltriethoxysilan) dient als Beispiel.
  • 3: DNA-Kolonien, welche durch einen Colony-Primer erzeugt wurden. Es wird die Anzahl der Kolonien gezeigt, welche pro 20 × Feld als eine Funktion der Konzentration des an das Well gebundenen Templats beobachtet wird. Die niedrigste Konzentration an nachweisbarem Templat entspricht 10–13 M.
  • 4: Darstellung der Unterscheidung zwischen Kolonien, welche aus zwei unterschiedlichen Templaten stammen. 4a zeigt die Bilder von Kolonien, welche sowohl von Templaten als auch Negativkontrollen gemacht wurden. 4b zeigt die Kolonien von beiden Templaten an der gleichen Position im gleichen Well, welche durch zwei unterschiedlichen Farbensichtbar gemacht wurden, und Negativkontrollen. 4c zeigt die Koordinaten von beiden Koloniearten in einem Unterabschnitt eines Mikroskopiefeldes. 4c zeigt, dass sich Kolonien von unterschiedlichen Templaten nicht überschneiden.
  • 5: Reaktionschemata der Anheftung des Templats oder Oligonukleotids an Glas. Schritt A ist die Derivatisierung der Oberfläche: Glasobjektträger werden mit einer sauren Lösung behandelt, um die freien Hydroxylgruppen an der Oberfläche zu vermehren. Die vorbehandelten Objektträger werden in eine Lösung von Aminosilan eingetaucht. ATS: Aminopropyltriethoxysilan. Schritt B: B1 oder B2 ist die Funktionalisierung der Glasfläche mit Verntzungsmitteln, gefolgt von einer Anheftung des Oligonukleotids. Die Aminogruppe reagiert mit einem Vernetzungsmittel über eine Amidbindung: Schritt B1; s-MBS (Sulfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimidester) Schritt B2; s-SIAB (Sulfo-N-succinimidyl-[4-idoacetyl]aminobenzoat). Die Oligonukleotide (am 5'-Ende mit Thiol modifiziertes Oligonukleotid) werden über die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Thiol und der Doppelbindung des Maleimids an die Oberfläche angeheftet. Mit Phosphat gepufferte Salzlösung: (PBS, 0,1 M NaH2PO4, pH: 6,5, 0,15 M NaCl). B3: Anheftung der Oligonukleotide unter Verwendung von EDC und Imidazol. Das Phosphat am 5'-Ende der modifizierten Oligonukleotide reagiert mit Imidazol in Gegenwart von EDC und ergibt 5'-Phosphorimidazolidderivate (nicht gezeigt). Die Derivate bilden eine Phosphoramidatbindung mit den Aminogruppen der derivatisierten Glasfläche. EDC: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid.
  • 6: Sie zeigt die Anzahl der Kolonien, welche pro 20 × Feld als eine Funktion der Konzentration des an das Well gebundenen Templats beobachtet wurde. Das DNA-Templat war mit unterschiedlicher Konzentration gebunden, entweder über das vermittelnde Kopplungsmittel (EDC) auf einer mit Amino derivatisierten Glasfläche (A) oder auf einer mit s-MBS funktionalisierten Glasfläche (B). Doppelsträngige DNA-Kolonien wurden einem Restriktionsenzym unterworfen und die rückgewonnenen Einzelstränge mit einem komplementären Oligonukleotid hybridisiert, welches mit cy5 fluoreszenzmarkiert war.
  • 7 zeigt ein Beispiel einer in situ-Sequenzierung aus DNA-Kolonien, erzeugt auf Glas. 7A zeigt das Ergebnis nach einer Inkubation mit Cy5TM-dCTP auf einer Probe, welche nicht mit dem Primer p181 inkubiert wurde. Man wird schätzen, dass nur 5 verschwommene Punkte beobachtet werden können, was zeigt, dass kein dramatischer Störeffekt stattfindet (wie etwa eine Cy5TM-dCTP-Aggregatpräzipitation, Adsorption oder einfach ein nicht spezifisches Einbauen in die DNA in die Kolonien oder auf der Fläche). 7B zeigt das Ergebnis nach einer Inkubation mit Cy5TM-dUTP auf einer Probe, welche mit dem Primer p181 inkubiert worden war. Man wird schätzen, dass kein fluoreszierender Punkt beobachtet werden kann, was zeigt, dass der Einbau einer fluoreszierenden Base nicht in nachweisbaren Mengen stattfinden kann, wenn das für den Einbau vorgesehenr Nukleotid nicht der Sequenz des Templats nach dem hybridisierten Primer entspricht. 7C zeigt das Ergebnis nach einer Inkubation mit Cy5TM-dCTP auf einer Probe, welche mit dem Primer p181 inkubiert worden war. Man wird schätzen, dass viele fluoreszierende Punkte beobachtet werden können, was zeigt, dass der Einbau einer fluoreszierenden Base tatsächlich in nachweisbaren Mengen stattfinden kann, wenn das für einen Einbau vorgesehene Nukleotid der Sequenz des Templats nach dem hybridisierten Primer entspricht.
  • 8: zeigt eine Hybridisierung von Sonden mit Oligonukleotiden, welche mit Nukleolink angeheftet wurden, vor und nach einem PCR-Zyklus. Die Figur zeigt eine R58-Hybridisierung an CP2 (5'-(Phosphat)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) als gefüllte Kreise, CP8 (5'-Amino-hexamethylen)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) als gefüllte Dreiecke, P9 (5'-Hydroxyl)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) als Rauten, CP10 (5'-Dimethoxytrityl)-TTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) als offene Kreise und CP11 (5'(Biotin)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) als offene Dreiecke.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Herstellung von DNA-Templaten, welche für die Erzeugung von DNA-Kolonien geeignet sind
  • Es sind DNA-Kolonien aus DNA-Templaten und Colony-Primern erzeugt worden. Der Begriff "Colony-Primersequenz" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Sequenz, welche der Sequenz eines Colony-Primers entspricht und an anderer Stelle manchmal als "Oligonukleotidsequenz Y" oder "Oligonukleotidsequenz Z" bezeichnet wird.
  • Die Eigenschaften der Colony-Primer werden ausgewählt basierend auf einer Selektion für Oligonukleotidprimer, welche einen geringen unspezifischen Nukleotideinbau in Gegenwart einer wärmestabilen DNA-Polymerase zeigen. Die Colony-Primer CPα (5'-p CACCAACCCAAACCAACCCAAACC) und CPβ (5'-p AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) sind ausgewählt worden aufgrund ihres niedrigen Einbaus von radiomarkiertem [α32P-dCTP] in Gegenwart einer stabilen DNA-Polymerase (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA) in Standardpuffer und unter Thermozyklusbedingungen (94°C für 30 sek, 65°C für 1 min, 72°C für 2 min, 50 Zyklen).
  • Als ein Modellsystem wurde ein DNA-Fragment mit 3,2 Kb genommen, um die Ausführbarkeit der Kolonieerzeugung unter Verwendung von Colony-Primern und DNA-Templaten zu demonstrieren. Das ausgewählte Templat umfasst das humane Gen für den Rezeptor für verbesserte Glykosylierungsendprodukte (HUMOXRAGE, Genbank Signatur D28769). Die RAGE-spezifischen Primer sind in Tabelle 1 dargestellt. Das Templat mit 3,2 Kb wurde durch PCR-Amplifikation aus 0,1 μg humaner genomischer DNA mit 1 μM der Primer TP1 und TP2 mit 1 Unit DNA-Polymerase (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA) im Standardpuffer und unter Thermozyklusbedingungen (94°C für 30 sek, 65°C für 1 min, 72°C für 5 min, 40 Zyklen) erzeugt. Dieses DNA-Fragment mit 3,2 Kb wurde als ein Templat für eine sekundäre PCR verwendet, um zwei kürzere Template für die Kolonieerzeugung (Template A und B) zu erzeugen. Die zur Erzeugung der kürzeren Template verwendeten Primer enthalten sowohl Sequenzen, welche für das Templat spezifisch sind, als auch Sequenzen der Colony-Primer CP1 und CP2, um die DNA auf einer festen Fläche zu amplifizieren. Im Allgemeinen wird der zur Erzeugung eines DNA-Templats verwendete PCR-Primer am 5'-Terminus entweder mit einer Phosphat- oder Thiolgruppe modifiziert. Nach der PCR-Amplifikation werden somit DNA-Fragmente erzeugt, welche an einem oder beiden Termini die Colony-Primersequenzen enthalten, angrenzend an das RAGE-DNA-Fragment von Interesse (siehe 2a).
  • Das Templat A (doppelsträngiges Templat, welches die Colony-Primersequenz CPβ an beiden Termini enthält) wurde mit 0,1 ng des Templats mit 3,2 Kb mit 1 μM der Primer TPA1 und 1 μM TPA2 mit 1 Unit DNA-Polymerase (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA) in dem Standardpuffer und unter Thermozyklusbedingungen (94°C für 30 sek, 65°C für 1 min, 72°C für 1 min, 30 Zyklen) erzeugt. Die Produkte wurden dann über Qiagen Qia-quick-Säulen (Qiagen GbmH, Hilden, Deutschland) gereinigt.
  • Das Templat B (doppelsträngiges Templat, welches Colony-Primersequenzen entsprechend CPβ enthält) wurde erzeugt mit 0,1 ng des Templats mit 3,2 Kb, mit 1 μM der Primer TPB1 und 1 μM TPB2 mit 1 Unit DNA-Polymerase (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA) in dem Standardpuffer und unter Thermozyklusbedingungen (94°C für 30 sek, 65°C für 1 min, 72°C für 1 min, 30 Zyklen). Die Produkte wurden dann über Qiagen Qia-quick-Säulen (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) gereinigt.
  • Das Templat B' (doppelsträngiges Templat, welches die Colony-Primersequenzen entsprechend CPα und CPβ an jedem Ende enthält) wurde erzeugt mit 0,1 ng des 3,2 Kb-Templats, mit 1 μM der Primer TPB3 und 1 μM TPB4 mit 1 Unit Polymerase (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA) in dem Standardpuffer und unter Thermozyklusbedingungen (94°C für 30 sek, 65°C für 1 min, 72°C für 1 min, 30 Zyklen). Die Produkte wurden dann über Qiagen Qia-quick-Säulen (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) gereinigt.
  • Alle die für die Präparation der DNA-Template und für die DNA-Kolonieerzeugung verwendeten spezifischen Oligonukleotide sind zusammen mit jeder chemischen Modifikation in Tabelle 1 wiedergegeben.
  • Ein allgemeines Schema, welches die chemische Anheftung von Colony-Primern und Templaten an die Glasfläche zeigt, wird in 2B wiedergegeben, wobei die Derivatisierung mittels ATS (Aminopropyltriethoxysilan) als ein nicht beschränkendes Beispiel beschrieben wird. Tabelle 1 Liste der Oligonukleotide, welche für die Präparation der Template und die Kolonieerzeugung verwendet werden:
    Figure 00470001
    Figure 00480001
    Koordinaten von HUMOXRAGE-Gen Signatur D28769
    • (R)
    bedeutet "revers" und
    (F)
    bedeutet "vorwärts"
  • Beispiel 1a: Herstellung eines statistischen („random") DNA-Templats, flankiert von einem degenerierten Primer
  • Als Modellsystem zur Demonstration der Ausführbarkeit der Koloniebildung durch eine statistische Primer-PCR-Amplifikation wurde ein DNA-Fragment von 3,2 Kb genommen. Diese Strategie kann für die Sequenzierung von DNA-Fragmenten von ungefähr 100 Kb Länge, und durch Kombination von Fragmenten für Gesamtgenome vergewendet werden. Ein DNA-Fragment mit 3,2 Kb wurde durch PCR aus humaner genomischer DNA gebildet, unter Verwendung der PCR-Primer TP1 5'-pGAGGCCAGAACAGTTCAAGG und TP2 5'-pCCTGTCACAAGACGACTGAA wie in Beispiel 1 beschrieben. Das 3,2 Kb-Fragment wurde durch eine Kombination von Restriktionsenzymen (EcoR1 und Hha1, welche 4 Fragmente von ungefähr 800 Basenpaare ergeben) in kleinere Fragmente geschnitten. Die geschnittenen oder nicht geschnittenen DNA-Fragmente wurden dann mit dem degenerierten Primer p252 (5'-P TTTTTTTTTTISISISISISIS gemischt, wobei I für Inosin steht (welches sich mit A, T und C paart) und S für G oder C steht, und kovalent an die Nucleolink-Wells (Nunc, Dänemark) gekoppelt. Die Röhrchen wurden dann einer statistischen Festphasen-PCR-Amplifikation unterworfen und durch Hybridisierung mit markierten DNA-Sonden sichtbar gemacht, wie in Beispiel 2a beschrieben wird.
  • Beispiel 2: Kovalente Bindung von DNA-Templaten und Colony-Primern an einen festen Träger (Kunststoff) und Koloniebildung mit einem Colony-Primer
  • Kovalente Bindung von Temglat und Colony-Primer an den festen Träger (Kunststoff)
  • Ein Colony-Primer (CP2, 5'-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGGAAAGGGAAAGGG), an seinem 5'-Terminus phosphoryliert (Microsynth GmbH, Schweiz), wurde auf Nucleolink-Kunststoff-Mikrotiterwells (Nunc, Dänemark) in Gegenwart von verschiedenen Dosen des Templats A (hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben) angeheftet. 8 Wells wurden 2-fach mit sieben 1/10-Verdünnungen des Templats mit CP2 angeordnet, wobei mit der höchsten Konzentration von 1 nM begonnen wurde.
  • Mikrotiterwells, an welche der CP2-Colony-Primer und das Templat kovalent gebunden wurden, wurden wie folgt präpariert. In jedes Nucleolink-Well wurden 30 μl einer 1 μM Lösung des Colony-Primers mit unterschiedlichen Konzentrationen des Templats, herunterverdünnt von 1 nM, in 10 mM 1-Methylimidazol (pH 7,0) (Sigma Chemicals) zugegeben. Zu jedem Well wurden 10 μl von 40 mM 1-Ethyl-3-{3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (pH 7,0) (Sigma Chemicals) in 10 mM 1-Methylimidazol zu der Lösung von Colony-Primer und Templat zugegeben. Dann wurden die Wells verschlossen und bei 50°C über Nacht inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Wells zweimal mit 200 μl RS (0,4 N NaOH, 0,25% Tween 20) gespült, für 15 min mit 200 μl RS inkubiert, zweimal mit 200 μl RS und zweimal mit 200 μl TNT (100 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,15 Tween 20) gewaschen. Die Röhrchen wurden bei 50°C getrocknet und wurden in einem verschlossenen Kunststoffbeutel bei 4°C gelagert.
  • Koloniebildung
  • Das Koloniewachstum wurde in jedem Well mit 20 μl eines PCR-Mix eingeleitet: vier dNTPs (0,2 mM), 0,1% BSA (Rinderserumalbumin), 0,1% Tween 20, 8% DMSO (Dimethylsulfoxid, Fluka, Schweiz), 1 × PCR-Puffer und 0,025 Unit/μl AmpliTaq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Foster City, CA). Die Wells wurden dann in den Thermocycler gestellt und das Wachstum wurde durchgeführt durch Inkubation der verschlossenen Wells für 5 min bei 94°C und einem Zyklus mit 50 Wiederholungen unter folgenden Bedingungen: 94°C für 30 sek, 65°C für 2 min, 72°C für 2 min. Nach Beendigung dieses Programms wurden die Wells bei 8°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Vor der Hybridisierung wurden die Wells mit 50 μl TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,4) gefüllt, für 5 min auf 95°C erwärmt und vor der Zugabe der Sonde bei 45°C auf Eis gekühlt.
  • Visualisierung der Kolonien
  • Sonde: Die Sonde war ein DNA-Fragment mit 1405 Basenpaaren, welches die Sequenz des Templats an ihrem 3'-Ende (Nukleotidpositionen 8405 bis 9259) umfasst. Die DNA-Sonde wurde synthetisiert durch PCR unter Verwendung von zwei Primern: p47 (5'-GGCTAGGAGCTGAGGAGGAA), welcher von Base 8405 amplifiziert, und TP2, am 5'-Ende biotinyliert, welcher von Base 9876 des Antisense-Strangs amplifiziert.
  • Hybridisierung und Nachweis:
  • Die Sonde wurde in "easyhyb" (Boehringer Mannheim, Deutschland) auf 1 nM verdünnt und zu jedem Well wurden 20 μl zugegeben. Die Sonde und die Kolonien wurden bei 94°C für 5 min denaturiert und dann für 6 h bei 50°C inkubiert. Überschüssige Sonden wurden bei 50°C in 2 × SSC mit 0,1% Tween gewaschen. Die DNA-Sonden wurden gebunden an mit Avidin beschichtete grüne Fluoreszenzfluorospheren mit einem Durchmesser von 0,04 μm (Molecular Probes) in TNT für 1 h bei Raumtemperatur. Überschüssige Beads wurden mit TNT gewaschen. Die Kolonien wurden durch eine Mikroskopanalyse und Imageanalyse sichtbar gemacht, wie in Beispiel 2a beschrieben. 3 zeigt die Anzahl der Kolonien, welche pro 20 × Feld als eine Funktion der Konzentration des an das Well gebundenen Templats beobachtet wurde. Die geringste Konzentration des nachweisbarem Templats entspricht 10–13 M.
  • Beispiel 2a: Kovalente Bindung von DNA-Templaten und Colony-Primern an einen festen Träger (Kunststoff) und Koloniebildung mit einem degenerierten Primer
  • Kovalente Bindung von Templat und Colony-Primer an den festen Träger (Kunststoff)
  • Mikrotiterwells mit p252 und Templat-DNA-Fragmenten wurden wie folgt hergestellt:
    In jedes Nucleolink-Well wurden 30 μl einer 1 μM-Lösung des Colony-Primers p252 mit unterschiedlichen Konzentrationen an Templat, herunterverdünnt von 0,5 nM, in 10 mM 1-Methylimidazol (pH 7,0) (Sigma Chemicals) zugegeben. Zu jedem Well wurden 10 μl 40 mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (pH 7,0) (Sigma Chemicals) in 10 mM 1-Methylimidazol zu der Lösung von Colony-Primer und Templat zugegeben. Die Wells wurden dann verschlossen und bei 50°C über Nacht inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Wells zweimal mit 200 μl RS (0,4 N NaOH, 0,25% Tween 20) gespült, 15 min mit 200 μl RS inkubiert, zweimal mit 200 μl RS und zweimal mit 200 μl TNT (100 mM Tris HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) gewaschen. Die Röhrchen wurden bei 50°C getrocknet und wurden in einem verschlossenen Kunststoffbeutel bei 4°C gelagert.
  • Koloniebildung
  • Die DNA-Koloniebildung wurde mit einem modifizierten Protokoll durchgeführt, um ein statistisches Priming zu ermöglichen, in jedem Well mit 20 μl des PCR-Mix: vier dNTPs (jeweils 0,2 mM), 0,1% BSA, 0,1% Tween 20, 8% DMSO (Dimethylsulfoxid, Fluka, Schweiz), 1 × PCR-Puffer und 0,025 Unit/μl AmpliTaq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Foster City, CA). Dann wurden die Wells in den Thermocycler gestellt und eine Amplifikation wurde durchgeführt durch Inkubation der verschlossenen Wells für 5 min bei 94°C und einem Zyklus mit 50 Wiederholungen unter den folgenden Bedingungen: 94°C für 30 sek, 65°C für 2 min, 72°C für 2 min. Nach Beendigung dieses Programms wurden die Wells bis zur weiteren Verwendung bei 8°C aufbewahrt. Vor der Hybridisierung wurden die Wells mit 50 μl TE (10 mM Tris 1 mM EDTA pH 7,4) gefüllt, für 5 min auf 94°C erwärmt und vor der Zugabe der Sonde bei 45°C auf Eis gekühlt.
  • Visualisierung der Kolonien
  • Sonden: Zwei DNA-Fragmente mit 546 und 1405 Basenpaaren, welche die Sequenzen von beiden Extremitäten des originalen Templats umfassen, wurden durch PCR amplifiziert. Der Antisense-Strang der Sonde wurde mit Biotin markiert, durch die Verwendung eines 5'-biotinylierten PCR-Primers. Die Basenpaarkoordinaten der Sonden waren 6550 bis 7113 und 6734 bis 9805.
  • Hybridisierung und Nachweis: Die Sonden wurden in "easyhyb" (Boehringer Mannheim, Deutschland) auf 1 nM verdünnt und zu jedem Well wurden 20 μl zugegeben. Die Sonde und die Kolonien wurden bei 94°C für 5 min denaturiert und dann für 6 h bei 50°C inkubiert. Überschüssige Sonden wurden bei 50°C in 2 × SSC mit 0,1% Tween abgewaschen. Die DNA-Sonden wurden gebunden an mit Avidin beschichteten Fluorospheren mit grüner Fluoreszenz mit einem Durchmesser von 40 nm (Molecular Probes, Portland OR) in TNT für 1 h bei Raumtemperatur. Überschüssige Beads wurden mit TNT abgewaschen. Die Fluoreszenz wurde nachgewiesen unter Verwendung eines inversen Mikroskops (unter Verwendung des Achroplan-Objektivs 20×/0,400 LD, auf dem Axiovert S100TV, mit einer Quecksilberbogenlampe HBO 100W/2, Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland), welches mit einer CCD-Kamera mit 768(H) × 512(V) Pixel (Princeton Instruments Inc. Trenton, NJ, USA) gekoppelt war. Die Exposition betrug 20 sek durch die Filtersätze XF22 (Ex: 485DF22, dichromatisch: 505DRLPO2 Em: 530DF30) und XF47 (Ex: 640DF20, dichromatisch: 670DRLPO2 Em: 682DF22) von Omega Optical (Brattleboro VT) für FITC bzw. Cy5. Die Daten wurden unter Verwendung einer Winwiew-Software (Princeton Instruments Inc., Trenton NJ, USA) analysiert. Es wurde die Anzahl der Kolonien pro Feld in zweifachen Wells mit einer Bildanalyse gezählt, welche im Haus entwickelt wurde.
  • Beispiel 3: Sequenzunterscheidung in unterschiedlichen Kolonien, welche von unterschiedlichen Verhältnissen von zwei verschiedenen, kovalent gebundenen Templaten und einem Colony-Primer stammen
  • Kovalente Bindung von Templaten und Colony-Primern an den festen Träger (Kunststoff)
  • Ein Colony-Primer (CP2: 5'pTTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), welcher an seinen 5'-Termini phosphoryliert war (Microsynth GmbH, Schweiz) wurde auf Nucleolink-Kunststoffmikrotiterwells (Nunc, Dänemark) in Anwesenheit von unterschiedlichen Dosen der zwei Template A und B (hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben) gepfropft. Es wurden Reihen von 8 Wells dreifach angeordnet mit sieben 1/10-Verdünnungen von beiden Templaten, beginnend mit der höchsten Konzentration von 1 nM. Die Templatverdünnungen wurden in entgegengesetzten Richtungen angeordnet, so dass die höchste Konzentration eines Templats mit der niedrigsten Konzentration des anderen zusammenfällt.
  • Mikrotiterwells, an welche CP2-Primer und beide Template kovalent gebunden sind, wurden wie folgt hergestellt. Zu jedem Nucleolink-Well wurden 30 μl einer 1 μM-Lösung des CP2-Primers mit unterschiedlichen Konzentrationen von beiden Templaten, herunterverdünnt von 1 nM, in 10 mM 1-Methylimidazol (pH 7,0) (Sigma Chemicals) zugegeben. In jedes Well wurden 10 μl 40 mM 1- Methyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (pH 7,0) (Sigma Chemicals) in 10 mM 1-Methylimidazol (pH 7,0) zu der Lösung von Colony-Primer und Templaten zugegeben. Dann wurden die Wells verschlossen und bei 50°C für 4 h inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Wells dreimal mit 50 μl RS (0,4 N NaOH, 0,25% Tween 20) gespült, 15 min mit 50 μl RS inkubiert, dreimal mit 50 μl RS und dreimal mit 50 μl TNT (100 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 Tween 20) gewaschen. Die Röhrchen wurden in TNT bei 4°C gelagert.
  • Koloniebildung
  • Das Koloniewachstum wurde in jedem Well mit 20 μl eines PCR-Mix eingeleitet: die vier dNTPs (0,2 mM), 0,1% BSA, 0,1% Tween 20, 8% DMSO (Dimethylsulfoxid, Fluka, Schweiz), 1 × PCR-Puffer und 0,025 Unit/μl AmpliTaq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Foster City, CA).
  • Dann wurden die Wells in den Thermocycler gestellt und das Wachstum wurde durchgeführt durch Inkubation der verschlossenen Wells für 5 min bei 94°C und einem Zyklus mit 50 Wiederholungen unter folgenden Bedingungen: 94°C für 30 sek, 65°C für 5 min, 72°C für 5 min. Nach Beendigung dieses Programms wurden die Wells bei 8°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Vor der Hybridisierung wurden die Wells mit 50 μl TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,4) gefüllt, bei 94°C für 5 min erwärmt und vor der Zugabe der Sonde bei 50°C auf Eis gekühlt.
  • Visualisierung der Kolonien
  • Sonde: Zwei DNA-Fragmente mit 546 und 1405 Basenpaaren, entsprechend den Sequenzen des 3,2 Kb-DNA-Fragments an den 5'- und 3'-Termini, wurden durch PCR amplifiziert unter Verwendung eines biotinylierten Primers (siehe Beispiel 2). Die zwei DNA-Sonden wurden durch Erhitzen bei 94°C für 5 min denaturiert, schnell in 1 M NaCl, 10 mM Tris pH 7,4 abgekühlt und an mit Streptavidin beschichteten Fluorospheren mit einem Durchmesser von 0,04 μm, welche mit unterschiedlichen Farben markiert waren, für 2 h bei 4°C gebunden. Die an Beads gebundenen Sonden wurden 20-fach in "easyhyb"-Lösung ver dünnt, welche auf 50°C vorgewärmt war. Zu jedem Well, welches denaturierte Kolonien enthielt, wurde 20 μl der Sonden zugegeben.
  • Hybridisierung und Nachweis: Die Hybridisierung wurde bei 50°C für 5 h durchgeführt. Überschüssige Sonden wurden bei 50°C in 2 × SSC mit 0,1% SDS abgewaschen. Die Kolonien wurden durch ein Mikroskop mit einem 20×-Objektiv sichtbar gemacht, 20 sek Exposition und einer Bildanalyse wie in Beispiel 2a beschrieben. 4a zeigt die Bilder der Kolonien, welche aus sowohl von den Templaten als auch den Negativkontrollen gemacht wurden. 4b zeigt die Kolonien von beiden Templaten an der gleichen Position im gleichen Well, mit zwei unterschiedlichen Farben sichtbar gemacht, und die Negativkontrollen. 4c zeigt die Koordinaten von beiden Koloniearten in einem Unterabschnitt eines Mikroskopiefeldes. 4c zeigt, dass sich Kolonien von unterschiedlichen Templaten nicht überschneiden.
  • Beispiel 4: Kovalente Bindung von DNA-Templaten und Oligonukleotiden an feste Glasträger
  • Mit Aminosilan derivatisierte Glasobjektträger sind als fester Träger verwendet worden, um Thiol-modifizierte Oligonunkleotidsonden unter Verwendung von heterobifunktionellen Vernetzungsmitteln kovalent anzuheften. Die ausgewählten Reagenzien besitzen Thiol-reaktive (Maleimid) und Amino-reaktive Gruppen (Succinimidylester). Die Ausbeuten der Oligonukleotidanheftung und Stabilität der immobilisierten Moleküle ist stark von der Stabilität des Vernetzungsmittels gegenüber den Bedingungen der unterschiedlichen durchgeführten Behandlungen abhängig. Die Reaktionsschemata der Anheftung der DNA-Template oder Oligonukleotide auf Glas sind in 5 beschrieben.
  • Die Lagerstabilität von Glasobjektträgern, welche mit den Vernetzungsmitteln s-MBS und s-SIAB hergestellt wurden und deren thermische Stabilität sind beurteilt worden. Ein wichtiger Faktor, welcher das Ausmaß der Hybridisierung der immobilisierten Oligonukleotidsonden beeinflusst, ist die Dichte der angehefteten Sonden (Beattie et al., 1995; Joss et al., 1997). Wir haben diesen Effekt untersucht durch Variation der Konzentration der Oligonukleotide während der Immobilisierung und Untersuchen der Dichte der angehefteten Oligos durch Hybridisierung.
  • Materialien und Methoden
  • Saure Vorbehandlung der Mikroskopglasobjektträger – Mikroskopglasobjektträger (Knittel, Merck ABS) wurden in einer basischen Helmanex-Lösung über 1 h (Helmanex IIR 0,25%, 1 N NaOH) eingeweicht. Die Objektträger wurden mit Wasser gespült, über Nacht in 1 N HCl eingetaucht, erneut mit Wasser gespült und 1 h in Schwefelsäurelösung (H2SO4/H2O, 1/1, v/v, wobei eine kleine Menge frisches Ammoniumpersulfat zugegeben war) behandelt. Die Objektträger wurden in Wasser, in Ethanol und schließlich mit reinem Aceton gespült. Die Glasobjektträger wurden getrocknet und für die weitere Verwendung unter Vakuum gelagert.
  • Silanisierung der Oberfläche – Die vorbehandelten Objektträger wurden in eine 5%-ige Lösung von ATS (Aminopropyltriethoxysilan, Aldrich) in Aceton eingetaucht. Die Silanisierung wurde bei Raumtemperatur für 2 h durchgeführt. Nach drei Wäschen in Aceton (5 min/Wäsche) wurden die Objektträger einmal mit Ethanol gespült, getrocknet und unter Vakuum gelagert.
  • Anheftung des Vernetzungsmittel – Die Vernetzungsmittel s-MBS und s-SIAB (beziehunsweise Sulfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, Sulfo-N-succinimidyl-[4-iodacetyl]aminobenzoat, Pierce, Rockford IL) werden als 20 mM Lösungen in PBS (phosphatgepufferte Saline, 0,1 M, NaH2PO4, pH 7,2, 0,15 M NaCl) hergestellt. Silanisierte Glasobjektträger, auf welche 80 μl der Vernetzungsmittellösung aufgetragen wurde, wurden mit einem gereinigten Mikrodeckglas bedeckt und für 5 h bei 20°C umgesetzt. Die Glasobjektträger wurden in PBS gespült, kurz in Wasser eingetaucht und in Ethanol gespült. Die Objektträger wurden dann getrocknet und unter Vakuum im Dunkeln für die weitere Verwendung gelagert.
  • Oligonukleotidbindung – Die Oligonukleotide wurden unter Verwendung einer Standardphosphoramiditchemie mit 5'-Modifikationen eines Thiols (CP3 und CP4 Eurogentec, Brüssel) oder einer Phosphatgruppe (CP1 und CP2, Eurogentec, Brüssel) synthetisiert.
  • -5'-Thio-Oligonukleotidprimer (CP3 und CP4) wurden als 100 μM Lösungen in einem Salinephosphatpuffer (NaPi: 0,1 M NaH2PO4 pH: 6,6, 0,15 M NaCl) hergestellt und Tropfen von 1 μl wurden auf dem funktionalisierten Glasobjektträger (funktionalisiert mit Vernetzungsmittel) für 5 h bei Raumtemperatur aufgetragen. Die Glasobjektträger wurden unter einer gesättigen feuchten Atmosphäre gehalten, um eine Verdampfung zu vermeiden. Die Glasobjektträger wurden auf einem Schüttler in NaPi-Puffer gewaschen. Für eine Untersuchung der thermischen Stabilität wurden die Glasobjektträger zweimal für 5 min bei 100°C in Tris-Puffer (10 mM, pH 8) eingetaucht und bei 4°C für 5 min direkt in 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat, pH 7) eingetaucht. Die Objektträger wurden für die weitere Verwendung bei 4°C in 5 × SSC gelagert.
  • -5'-Phosphat-Oligonukleotidprimer (CP1 und CP2) wurden für 5 h bei Raumtemperatur auf das mit Amino-derivatisiertes Glas aufgetragen (1 μl Tropfen) als eine 1 μM Lösung in 10 mM 1-Methylimidazol (pH 7,0) (Sigma Chemicals), enthaltend 40 mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC, Pierce, Rockford IL). Die Objektträger wurden zweimal bei 100°C in Tris-Puffer (10 mM, pH 8) gewaschen und bei 4°C für 5 min direkt in 5 × SSC eingetaucht. Die Objektträger wurden für die weitere Verwendung in 5 × SSC bei 4°C gelagert.
  • Anheftung von Oligonukleotid- und DNA-Templat
  • Die 5'-Thio-Oligonukleotidprimer (CP3 und CP4) und das 5'-Thio-Templat B' wurden in einem Salinephosphatpuffer (NaPi: 0,1 M NaH2PO4 pH: 6,6, 0,15 M NaCl) gemischt. Die Konzentration des DNA-Templats variierte von 0,01 bis 1 μM und von 0,1 bis 100 μM für die Primer, wurde aber bei 1 μM bzw. 100 μM für Templat und Primer optimiert. Dann wurde das oben beschriebene Verfahren für die Anheftung von CP3 und CP4 auf einer funktionalisierten Glasfläche befolgt.
  • Die 5'-Phosphat-Oligonukleotidprimer (CP1 und CP2) und das 5'-Phosphat-Templat B wurden gemischt in einer 10 mM 1-Methylimidazol (pH 7,0) (Sigma Chemicals)-Lösung, enthaltend 40 mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC, Pierce, Rockford IL). Die Konzentration des DNA-Templats variierte von 0,001 bis 10 nM und von 0,1 bis 1 μM für die Primer, wurde aber schließlich bei 10 nM bzw. 1 μM für Templat und Primer optimiert. Es wurde das oben beschriebene Verfahren für die Anheftung von CP1 und CP2 auf eine Amino-derivatisierte Glasfläche befolgt.
  • Hybridisierung mit fluoreszierenden Sonden – Oligonukleotidsonden, welche an ihrem 5'-Ende mit Cy5 oder FITC fluoreszenzmarkiert waren, wurden von Eurogentec (Brüssel) synthetisiert. Um eine unspezifische Hybridisierung zu verhindern, wurden die Glasobjektträger für 1 h mit einer Blocklösung (5 × SSC, Tween 0,1%, BSA 0,1%) inkubiert und auf einem Schüttler in 5 × SSC (2 × 5 min) gewaschen. Die Oligonukleotidsonden wurden bei 0,5 μM in 5 × SSC, Tween 0,1% verdünnt und für 2 h bei Raumtemperatur auf die Glasfläche aufgetragen. Die Glasobjektträger wurden auf einem Schüttler bei 37°C gespült, einmal in 5 × SSC für 5 min und zweimal in 2 × SSC mit 0,1% SDS für 5 min.
  • Hybridisierung mit radiomarkierten Sonden – Radiomarkierte Oligonukleotide, welche komplementär sind zu kovalent gebundenen Oligonukleotiden, wurden als Hybridisierungssonden verwendet, um die Ausbeuten der Hybridisierung zu quantifizieren. Die Oligonukleotide wurden enzymatisch mit [γ-32P]dATP (Amersham, UK) an deren Terminus am 5'-Ende markiert, unter Verwendung von Bakteriophagen-T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs, Beverly, MA). Überschüssiges [γ-32P]dATP wurde mit einer Chroma-Spin-Säule TE-10 (Clontech, Palo Alto CA) entfernt. Radiomarkierte Oligonukleotide (0,5 μM in 5 × SSC, Tween 0,1%) wurden dann für 2 h bei Raumtemperatur auf derivatisierte Objektträger aufgetragen. Die Glasobjektträger wurden auf einem Schüttler einmal für 5 min in 5 × SSC und zweimal für 5 min bei 37°C in 2 × SSC, SDS 0,1% gespült. Nach der Hybridisierung wurde die spezifische Aktivität durch Szintillationszählung bestimmt.
  • Mikroskopische Beobachtung – Die Glasobjektträger wurden mit 5 × SSC-Lösung und einem Mikrodeckglas überschichtet. Die Fluoreszenz wurde nach gewiesen unter Verwendung eines inversen Mikroskops Modell Axiovert S100TV, mit einer Quecksilberbogenlampe HBO 100W/2 (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland), gekoppelt mit einer CCD-Kamera, welche mit einem CCD-Array Kodak mit einem Format 768(H) × 512(V) Pixel; 6,91 × 4,6 mm gesamt, Pixelgröße 9 × 9 μm2 (Princeton Instruments Inc. Trenton, NJ, USA) ausgestattet war. Die Expositionszeiten betrugen zwischen 1 und 50 sek unter Verwendung des Objektivs LD Achroplan 20×/0,400 (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland) und der Filtersätze XF22 (Ex: 485DF22, dichromatisch: 505DRLPO2 Em: 530DF30) und XF47 (Ex: 640DF20, dichromatisch: 670DRLPO2 Em: 682DF22) von Omega Optical (Brattleboro VT) für FITC- bzw. Cy5-Fluorophore. Die Daten wurden unter Verwendung einer Winwiew-Software (Princeton Instruments Inc., Trenton NJ, USA) analysiert.
  • Ergebnisse
  • Bewertung der Lagerstabilität, der Bindung und der thermischen Stabilität
  • Wir bewerteten die Lagerstabilität von Glasplatten, welche mit s-MBS und s-SIAB hergestellt wurden. Da diese Reagenzien gegenüber einer Hydrolyse empfindlich sind, hängen die Ausbeuten der Oligonukleotidbindung von deren Stabilität ab. Amino-derivatisierte Glasplatten wurden mit den frisch hergestellten Vernetzungsmitteln s-MBS und s-SIAB funktionalisiert. Die funktionalisierten Objektträger wurden nach der Anheftung des Vernetzungsmittels für 10 Tage unter Vakuum im Dunkeln bei Raumtemperatur in einem Exsikkator gelagert. Nach dieser Zeit wurden die gelagerten Objektträger (t = 10 Tage) und frisch mit den Vernetzungsmitteln umgesetzte Objektträger (t = 0) untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse nach einer Reaktion eines Thiol-Oligonukleotids und einer Hybridisierung mit einer komplementären Fluoreszenzsonde wurden für beiden Chemien bei t = 0 und Zeit = 10 Tage verglichen.
  • Wenn sie einmal immobilisiert sind, sind die mit s-SIAB funktionalisierten Objektträger nach 10 Tagen Lagerung vollständig stabil, wie durch die gleichen Auseuten der Hybridisierung, welche bei t = 0 und t = 10 Tagen erhalten wurden, gezeigt wird. Im Gegensatz dazu wurde gefunden, dass an Glas gekoppeltes s-MBS weniger stabil war mit einem 30%-igen Verlust der Ausbeute der Oligonukleotidbindung und Hybridisierung nach 10 Tagen Lagerung. Als Folge wurden mit s-SIAB funktionalisierte Objektträger bevorzugt, da sie im Voraus hergestellt werden können und unter Vakuum im Dunkeln für mindestens 10 Tage ohne Verringerung der Ausbeute bei der Sondenanheftung gelagert werden können.
  • Um die thermische Stabilität der an das Glas angehefteten Oligonukleotide zu bewerten, wurden die Objektträger zwei fünfminütigen Behandlungen bei 100°C in 10 mM Tris HCl pH 8 unterzogen. Es wurde das verbleibende noch immer immobilisierte Oligonukleotid nach den Wäschen durch Hybridisierung mit einem komplementären fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid untersucht. Nach den ersten 5 min Waschen wurden ungefähr 14% der angehefteten Moleküle von s-SIAB-Glasobjektträgern freigesetzt und 17% von s-MBS-Glasobjektträgern, aber beim zweiten Waschen wurde für beide Chemien keine weitere Freisetzung nachgewiesen (Tabelle 1A). Diese Ergebnisse sind ermutigend im Vergleich zu denjenigen, welche von Chrisey et al., 1996, erhalten wurden, worin nach 10 min Behandlung in PBS bei 80°C eine Freisetzung von mehr als 62% der Oligonukleotide gemessen wurde, welche an verschmolzene Silica-Objektträger über das Vernetzungsmittel SMPB (Succinimidyl 4-[p-maleimidophenyl]butyrat) angeheftet waren.
  • Tabelle 1A
    Figure 00600001
    Tabelle 1A: Untersuchung der thermischen Stabilität
  • Die Oligonukleotide wurden an Glasobjektträger angeheftet, welche entweder mit s-MBS oder s-SIAB funktionalisiert waren. Die angehefteten Oligonukleotide wurden durch Hybridisierung mit einem fluoreszenzmarkierten komplementären Oligonukleotid untersucht. Das Fluoreszenzsignal wird für das höchste erhaltene Signal bei 100 normalisiert. Es werden die gemittelten Werte von Dreifach-Analysen werden wiedergegeben.
  • Hybridisierung als eine Funktion der Sondenanheftung
  • Wir haben das Ausmaß der Hybridisierung von kovalent gebundenen Oligonukleotidsonden als Funktion der Oberflächenbedeckung der angehefteten Oligonukleotide unter Verwendung der Vernetzungsmittel s-MBS, s-SIAB und von EDC-vermittelten Reaktionen untersucht. Die Konzentration der für die Immobilisierung aufgetragenen Oligonukleotide betrug 1 μM für EDC und ist für die Vernetzungsmittel zwischen 1 und 800 μM variiert worden, die Oberflächendichte wurde durch Hybridisierung mit 32P-markierten Sonden untersucht. Die optimale Konzentration für eine Primeranheftung unter Verwendung von heterobifunktionellen Vernetzungsmitteln betrug 500 μM, welches mit einer Oberflächendichte der hybridisierten Moleküle von 60 fmol/mm2 für s-MBS und 270 fmol/mm2 für s-SIAB gleichzusetzen ist. Eine ähnliche Belegungsdichte wie bei s-MBS wurde erhalten unter Verwendung einer EDC/Imidizal-vermittelten Anheftung von 5'-Phosphat-Oligonukleotiden an aminosilanisiertes Glas. Aber es waren nur 1 μM-Oligonukleotidlösungen notwendig, um die gleiche Ausbeute der Anheftung zu erreichen, dies stellt bei der s-MBS-Chemie im Vergleich zu der EDC/Imidazol-Kopplungsstrategie einen 500-fachen Überschuss an anzuheftendem Oligonukleotid dar (Tabelle 1B).
  • Tabelle 1B
    Figure 00610001
    Tabelle 1B: Hybridisierung als eine Funktion der Sondenbindung
  • Die Oligonukleotide wurden an Glasobjektträger angeheftet, welche entweder mit s-MBS oder s-SIAB angeheftet waren, oder durch das vermittelnde Aktivierungsreagenz EDC. Die angehefteten Oligonukleotide wurden durch Hybridisierung mit einem komplementären radiomarkierten Oligonukleotid untersucht. Die spezifische Aktivität und deshalb die Dichte der hybridisierten Moleküle wurde durch eine Szintillationsflüssigkeit bestimmt. NT: nicht untersucht.
  • Die Oberflächendichte von 60 fmol/cm2 entspricht einem durchschnittlichen Molekülabstand zwischen den gebundenen Oligonukleotiden von 8 nm. Nach unseren Ergebnissen ist eine Belegungsdichte von 30 fmol/mm2 (Abstand von 20 nm) ausreichend, um DNA-Kolonien zu erhalten. Diese Ausbeute kann erhalten werden durch Immobilisierung von Primern mit 100 μM unter Verwendung der heterobifunktionellen Vernetzungsmittel s-SIAB oder mit 1 μM Sonden unter Verwendung des EDC-vermittelten Ansatzes. Die von uns erhaltenen Hybridisierungsdichten liegen im Bereich der höchsten auf Glasobjektträgern oder anderen zuvor beschriebenen Anheftungsprotokollen erhaltenen Dichten (Guo et al., 1994, Joss et al., 1997, Beattie et al., 1995).
  • DNA-Koloniebildung auf Glas: Die Bildung der Kolonien ist abhängig von der Länge, der Konzentration des Templats und der Konzentration der Primer
  • Theoretisch erfordert die DNA-Koloniebildung eine geeignete Dichte der angehefteten Primer auf der Oberfläche, entsprechend einer geeigneten Länge des DNA-Templats. Für eine optimale DNA-Koloniebildung ist es wichtig, den Dichtebereich der gebundenen Primer und Template ebenso wie das stöichiometrische Verhältnis zwischen Templat und Primer zu definieren.
  • Materialien und Methoden
  • Präperation der Glasobjektträger
  • Die Glasobjektträger wurden wie oben beschrieben derivatisiert und funktionalisiert (Materialien und Methoden). Die DNA-Colony-Primer waren CP1 und CP2. Die Colony-Template wurden wie in Beispiel 1 für das Templat B' hergestellt, aber unter Verwendung der Primer TPB3 und TPB2. Die modifizierten Colony-Primer und Template wurden auf einer Glasfläche bei unterschiedlichen Konzentrationen sowohl der Colony-Primer als auch des Colony-Templats aufgetragen.
  • Bildung der Kolonien
  • Glasobjektträger, welche in 5 × SSC gelagert waren, wurden in mikrofiltriertem Wasser gewaschen, um Salzen zu entfernen. Das Koloniewachstum wurde auf einer Glasfläche mit einem PCR-Mix eingeleitet: die vier dNTPs (0,2 mM), 0,1% BSA, 0,1% Tween 20, 1 × PCR-Puffer und 0,04 Unit/μl AmpliTaq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Foster City, CA). Der PCR-Mix wird in einer Kammer mit abgedichtetem Rahmen platziert (MJ Research, Watertown, MA). Die Objektträger wurden in dem Thermocycler (The DNA Engine, MJ Research, Watertown, MA) gestellt und die Thermozyklen wurden wie folgt durchgeführt: Schritt 1 bei 94°C für 1 min, Schritt 2 bei 65°C für 3 min, Schritt 3 bei 74°C für 6 min, und dieses Programm wird 50× wiederholt. Nach einer Beendigung dieses Programms werden die Objektträger bis zur weiteren Verwendung bei 6°C gelagert.
  • Verdau der doppelsträngigen DNA-Kolonien
  • Die Glasfläche mit der DNA wurde mit einer Restriktionsnuklease geschnitten durch Überschichten mit dem Restriktionsenzym in einem 1×-Verdauungspuffer. Die Reaktion wurde zweimal für 1 h 30 bei 37°C durchgeführt. Doppelsträngige DNA-Kolonien wurden durch zweimaliges Eintauchen der Objektträger in Tris-Puffer (10 mM, pH 8) bei 100°C für 5 min denaturiert, gefolgt von einem Spülen in 5 × SSC bei 4°C. Die Objektträger wurden in 5 × SSC für die weitere Verwendung gelagert.
  • Hybridisierung von Einzelstrang-DNA-Kolonien
  • Um eine unspezifische Hybridisierung zu verhindern, wurden die Glasobjektträger mit einer Blocklösung (5 × SSC, 0,1% Tween, 0,1 BSA) für 1 h inkubiert und die Objektträger wurden in 5 × SSC (zweimal, 5 min) gespült. Die mit Cy5 am 5'-Ende markierten Oligonukleotide (Eurogentec, Brüssel) wurden in SSC 5×, Tween 0,1% auf 0,5 μM verdünnt und für mindestens 2 h auf die Glasfläche aufgetragen. Die Glasobjektträger wurden auf einem Schüttler einmal für 5 min in SSC 5× und zweimal für 5 min bei 37°C in SSC 5×, SDS 0,1% gespült.
  • Die Glasobjektträger wurden wie zuvor beschrieben sichtbar gemacht.
  • Wir haben zuvor beobachtet, dass das Ausmaß der Hybridisierung eine Funktion der Dichte der Oligonukleotidanheftung ist. Eine ähnliche Untersuchung mit gebundenen DNA-Templaten hat gezeigt, dass die Koloniebildung auch eine Funktion der Konzentration des auf einem Glasobjektträger angehefteten Templats ist. In Abhängigkeit von der für die Anheftung von Oligonukleotid und Templat verwendeten Chemie beträgt die optimale Konzentration des Templats 1 μM für das bifunktionelle Vernetzungsmittel s-MBS (6B) und 1 nM für EDC-Carbodiimid (6A). Bei der EDC-Chemie verbessert interessanterweise eine höhere Konzentration des Templats nicht die Anzahl der Kolonien, und es scheint ein Plateau erreicht zu werden, entsprechend einer maximalen Anzahl an Kolonien.
  • Wir haben die Koloniebildung (Anzahl) als eine Funktion der Konzentration der Primer, der Konzentration des auf die Fläche aufgetragenen DNA-Templats und der Länge des DNA-Templats untersucht.
  • Wir haben auch die Anzahl der Templatkopien in jeder Kolonie ausgewertet. Die Quantifizierung basierte auf einem Fluoreszenznachweis mit Cy5-, Cy3- oder Fluorescein-markierten Fluorophoren, ergänzt durch ein Antibleichmittel (Prolong, Molecular Probes, Portland OR). Die Kalibrierung wurde durchgeführt durch Hybridisierungsexperimente mit Primern, welche an der Fläche angeheftet waren, da die entsprechende exakte Dichte durch Radioaktivität bestimmt wurde.
  • Beispiel 5: In situ-DNA-Sequenzierung der Kolonien
  • Glasobjektträger (5 mm Durchmesser, Verrerie de Carouge, Schweiz) wurden zuerst in ein Bad aus Helmanex 0,2% (in H2O) 1 N NaOH für 1 h bei Raumtemperatur gelegt, mit destilliertem Wasser gespült, in reinem Hexan gespült, erneut 2× mit destilliertem Wasser gespült und mit 1 M HCl über Nacht bei Raumtemperatur behandelt. Dann wurden sie zweimal in destilliertem Wasser gespült und mit H2SO4(50%) + K2S2O8 für 1 h bei Raumtemperatur behandelt. Sie wurden in destilliertem Wasser, dann zweimal in Ethanol gespült. Die Glasobjektträger wurden mit ATS (wie in Beispiel 4 beschrieben) derivatisiert.
  • Die Colony-Primer CP1 (5'-pTTTTTTTTTTCACCAACCCAAACCAACCCAAACC) und CP2 (5'-pTTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), welche 5'-phosphoryliert waren (Microsynth GmbH, Schweiz) und das DNA-Templat B (hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben) wurden am 5'-Ende kovalent auf Glasobjektträgern mit 5 mm Durchmesser (Verrerie de Carouge, Schweiz) mit Endkonzentrationen von 1 μM bzw. 10 nM, wie folgt angeheftet: 2 nM jedes Primers wurden zu 0,2 nM Templat in 1 ml Lösung A (41 μl Methylimidazol (Sigma #M-8878) in 50 ml H2O, pH mit HCl auf 7 eingestellt) zugegeben und dann 1:1 mit Lösung D (0,2 mM EDC in 10 ml Lösung A) gemischt. Auf beiden Seiten der Glasobjektträger wurden 3,5 μl des Gemischs geladen und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden die Glasobjektträger kurz mit 5 × SSC-Puffer gespült und für 2 × 5 min bei 100°C in 10 mM Tris-Puffer pH 8,0 gestellt.
  • Nicht spezifische Stellen auf dem Glas wurden mit Rinderserumalbumin (BSA, Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland, #238040) mit 1 mg/ml in 5 × SSC-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur blockiert und dann mit destilliertem Wasser gespült.
  • Dann wurden die Glasobjektträger einzeln auf ein MicroampTM-Reaktionsgefäß (Perkin Elmer) platziert, welches 170 μl PCR-Mix enthielt, und die DNA-Kolonien wurden dann unter Verwendung von Taq-Polymerase (AmpliTaq, PE-Applied Biosystems, Inc., Foster City CA) mit 50 Zyklen (94°C/60 sek, 60°C/3 min, 72°C/6 min) in einem MTC 200-Thermocycler (MJ Research, Watertown, MA) erzeugt. Jeder Objektträger wurde 2× unter Verwendung von 1,3 Unit Pvu II (Stratagene) in NEB 2-Puffer (New England Biolabs) für 45 min bei 37°C verdaut. Nach dem Verdau wurden die Gefäße für 2 × 5 min bei 100°C in 10 mM Tris-Puffer pH 8,0 platziert, dann mit filtriertem (Millex GV4, Millipore) 1 mg/ml BSA in 2 × SSC-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur blockiert und zuerst in 2 × SSC, 0,1% SDS-Puffer, dann in 5 × SSC-Puffer gespült. Jeder Objektträger wurde über Nacht bei Raumtemperatur mit einem 5 × SSC/0,1 Tween 20-Puffer gespült, welcher 1 μM des Sequenzprimers p181 (CGACAGCCGGAAGGAAGAGGGAGC) enthielt. Kontrollen ohne Primer wurden in 5 × SSC, 0,1% Tween 20-Puffer gelagert. Die Glasobjektträger wurden 2 × in 5 × SSC, 0,1% SDS bei 37°C für 5 min gewaschen und in 5 × SSC gespült. Der Primer p181 kann mit dem Templat B' hybridisieren und die Sequenz nach p181 ist CAGCT .... Um die Fokussierung zu erleichtern, sind grüne Fluoreszenzbanden am unteren Teil des Wells durch Inkubation jedes Wells in 5 × SSC für 20 sek bei Raumtemperatur mit 20 μl einer 1:2000-Verdünnung von 200 nm gelb/grün fluoreszierenden, mit Streptavidin beschichteten FluoSpheren(R) (Molecular Probes, Eugene, OR) adsorbiert worden.
  • Nach der Hybridisierung mit dem Primer werden 2 μl einer Lösung mit 0,1 BSA, 6 mM Dithiothreitol (Sigma Chemicals), 5 μM Cy5TM-dCTP oder 5 μM Cy5TM-dUTP (Amersham UK) und 1 × Sequenase-Reaktionspuffer zu jedem Objektträger zugegeben. Die Zugabe des Cy5TM-Nukleotids wird durch die Zugabe von 1,3 Unit T7-SequenaseTM-DNA-Polymerase (Amersham, UK) für 2 min bei Raumtemperatur eingeleitet. Die Wells werden zweimal für 15 sek in einem 5 × SSC/0,1% SDS-Bad gewaschen und mit einem 5 × SSC-Puffer gespült.
  • Die Proben werden beobachtet unter Verwendung eines inversen Mikroskops (Axiovert S100TV, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland), ausgestattet mit einer CCD-Kamera Micromax 512 × 768 und einer Winwiew-Software (Princeton Instruments, Trenton, NJ). Zur Fokussierung wurden ein 20×-Objektiv und ein XF 22-Filtersatz (Omega Optical, Brattleboro, VT) verwendet, und zur Beobachtung des Cy5TM-Einbaus in die Proben ein 20×-Objektiv und ein XF 47-Filtersatz (Omega Optical) mit einer Exposition von 50 sek unter Verwendung einer 2 × 2 Pixeleinteilung). Die gelb/grünen FluoSpheren (R) (ungefähr 100/Gesichtsfeld) ergeben unter Verwendung des XF 47-Filtersatzes und einer Exposition von 50 sek kein nachweisbares Signal (Daten nicht gezeigt). Die Fotos werden durch das Programm Winwiew (Princeton Instruments) erzeugt.
  • 7A zeigt das Ergebnis nach einer Inkubation mit Cy5TM-dCTP mit einer Probe, welche nicht mit dem Primer p181 inkubiert worden war. Man wird schätzen, dass nur 5 verschwommene Punkte beobachtet werden können, was anzeigt, dass kein dramatischer Störeffekt stattfindet (wie etwa eine Cy5TM-dCTP-Aggregatpräzipitation, Adsorption oder einfach ein nicht spezifischer Einbau in die DNA der Kolonien oder an der Oberfläche). 7B zeigt das Ergebnis nach einer Inkubation mit Cy5TM-dUTP bei einer Probe, welche mit dem Primer p181 inkubiert wurde. Man wird schätzen, dass kein fluoreszierender Punkt beobachtet werden kann, was zeigt, dass der Einbau einer fluoreszierenden Base nicht in nachweisbaren Mengen stattfinden kann, wenn das für den Einbau bereitgestellt Nukleotid nicht der Sequenz des Templats nach dem hybridisierten Primer entspricht. 7C zeigt das Ergebnis nach einer Inkubation mit Cy5TM-dCTP bei einer Probe, welche mit dem Primer p181 inkubiert wurde. Man wird schätzen, dass viele fluoreszierende Punkte beobachtet werden können, was zeigt, dass der Einbau einer fluoreszierenden Base in der Tat in nachweisbaren Mengen stattfinden kann, wenn das für den Einbau bereitgestellte Nukleotid der Sequenz des Templats nach dem hybridisierten Primer entspricht. Zusammenfassend zeigten wir, dass es möglich ist, auf sequenzspezifische Art und Weise fluoreszierende Nukleotide in die in den Kolonien enthaltene DNA einzubauen und diesen Einbau mit der beschriebenen Apparatur und dem beschriebenen Verfahren zu überwachen. Aber dies stellt nur ein Beispiel dar. Man wird schätzen, dass, falls erwünscht, der Einbau einer fluoreszierenden Base mehrere Male wiederholt werden kann. Wenn dies auf sequenzspezifische Art und Weise durchgeführt wird, ist es somit möglich, einen Teil der Sequenz der in den Kolonien enthaltenen DNA abzuleiten.
  • Beispiel 6: 5'-mRNA-Sequenz-Tag-Analyse
  • Der genaueste Weg zur Überwachung der Genexpression in Zellen oder Geweben ist die Verringerung der Anzahl der Schritt zwischen dem Sammeln der Probe und dem Scoring der mRNA. Neue Verfahren zur schnellen Isolierung von mRNA sind kommerziell erhältlich. Die effizientesten Verfahren betreffen die schnelle Isolierung der Probe und den umittelbaren Zellaufschluss in eine Lösung von Guanidiniumhydrochlorid, welches Proteine vollständig zerstört und RNAsen inaktiviert. Dies wird gefolgt von der Reinigung der mRNA aus dem Überstand der aufgeschlossenen Zellen durch Oligo-dT-Affinitätschromatographie. Schließlich kann 5'-capping mRNA spezifisch angesteuert werden und in cDNA transformiert werden unter Verwendung einer einfachen Strategie (SMART-cDNA-Synthese, Clontech, Palo Alto).
  • Dieses Verfahren ermöglicht die Synthese von cDNA-Kopien nur von der translationsaktiven 5'-capping mRNA. Durch Kombination der obigen schnellen Verfahren der mRNA-Isolierung und mRNA-Präparation mit dem Pfropf-Templat-Verfahren der DNA-Koloniebildung, welches in der vorliegenden Anmeldung beschrieben ist, haben wir einen Ansatz für die Identifizierung einer großen Anzahl von 5'-mRNA-Sequenztags in hohem Durchsatz. Der Vorteil unserer Erfindung ist die Möglichkeit, eine große Anzahl von cDNA durch direktes Pfropfen des Produkts der cDNA-Synthesereaktion zu sequenzieren, wobei die cDNA in tausende von Kopien amplifiziert wird, gefolgt von der gleichzeitigen in situ-Sequenzierung der cDNAs.
  • Materialien und Methoden:
  • Synthetische Oligonukleotide und Plasmide – Die Oligonukleotide wurden mit 5'-Phosphaten durch Eurogentec oder Microsynth synthetisiert. Plasmide mit teilweise codierenden und 3'-nichttranslatierten Sequenzen des murinen Kaliumkanalgens mSlo nach dem T3-RNA-Polymerasepromotor wurden durch Standardverfahren erzeugt.
  • mRNA-Synthese – mSlo-Plasmide wurde mit einer sungulären SalI- oder SacI-Restriktionsnukleasestelle linearisiert, welche nach der Poly A+-Sequenz in dem Plasmid vorliegt. Nach der Behandlung des geschnittenen Plasmids mit Proteinase K wurde die lineare Plasmid-DNA einmal mit Phenol/CH3Cl/Isoamylalkohol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Das DNA-Präzipitat wurde in H2O mit einer Konzentration von 10 μg/μl wieder gelöst. Synthetische mRNA, mit dem 5'-Methylguanosin-capping wurden durch das mMessage mMachine in vitro mRNA-Synthesekit synthetisiert gemäß den Anweisungen des Herstellers (Ambion, Austin TX). Die synthetische mRNA wurde bei 80°C gelagert.
  • Enzyme – Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs (Beverly, MA) erhalten.
  • cDNA-Synthese – Synthetische mRNA wurde mit Mausleber-Poly A+-mRNA mit unterschiedlichen Molverhältnissen (1:1, 1:10, 1:100) gemischt und es wurde eine cDNA-Synthese mit dem Gemisch der synthetischen und Mausleber-mRNA unter Verwendung des "SMART PCR cDNA-Synthesekits" (Clontech, Palo Alto CA) mit einigen kleineren Modifikationen durchgeführt. In einer cDNA-Reaktion wurde ungefähr 1 μg des mRNA-Gemischs mit dem Primer CP5 gemischt, welcher am 5'-Ende die Sequenz von CPβ (5' p-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTTNN) aufweist. Dieser Primer wurde verwendet, um den ersten Strang bei der cDNA-Synthese herzustellen. Für die Synthese des zweiten Strangs ist die "SMART"-Technik verwendet worden. Die Basis der SMART-Synthese ist die Eigenschaft der reversen Transkriptase des Moloney Murine Virus, drei bis fünf Desoxycytosinreste an die 3'-Termini der Erststrang-cDNA hinzuzufügen, wenn die mRNA ein 5'-Methylguanosin-capping enthält (SMART-Benutzerhandbuch, Clontech, Palo Alto CA). Ein CP6-Primer, welcher die Sequenz von CPβ plus (AAAGGGGG am 3'-Ende, (5' p-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGG) enthält, ist für die Synthese des zweiten Strangs der cDNA verwendet worden. Puffer und SUPERSCRIPTTM II-RNase H – reverse Transkriptase des Moloney Murine Leucemia Virus (Life Technologies, Ltd.) wurden verwendet, wie in den Anweisungen beschrieben, und die Reaktion wurde bei 42°C für 1 h durchgeführt. Die cDNA wurde untersucht durch PCR unter Verwendung des Primers p251, welcher ein Fragment der CPβ-Sequenz (5'-GAGAAGGAAAGGGAAAGG) enthält, mit Taq-DNA-Polymerase (Platinum Taq, Life Technologies, Ltd.).
  • Herstellung der DNA-Kolonien – Die 5'-p-cDNA wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen des FestphasenColony-Primers CP2 (5' p-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) gemischt und chemisch an Nucleolink-PCR-Röhrchen (NUNC) gebunden, wobei die Anweisungen des Herstellers befolgt wurden. Dann wurden DNA-Kolonien erzeugt unter Verwendung von Taq-Polymerase (AmpliTaq Gold, PE-Applied Biosystems Inc., Foster City CA) mit 30 Zyklen (94°C/30 sek, 65°C/1 min, 72°C/1,5 min) in einem MTC 200-Thermocycler (MJ Research, Watertown, MA).
  • DNA-Sonden und Hybridisierung – 32Biotinylierte und 32P-radiomarkierte DNA-Sonden, spezifisch für die mSlo-DNA-Sequenz, wurden mit einem 5'-biotinylierten Primer und einem normalen Stromabwärts-Primer durch PCR mit dem Templat (mSlo-Plasmid-DNA) synthetisiert. Die Sonde baute α[32P]-dCTP (Amersham, Amersham UK) mit einem Verhältnis von 300:1 (α[32P]-dCTP zu dCTP) in die PCR-Reaktion ein, mit einer Endkonzentration der vier Desoxynukleosidtriphosphate von 50 μM. Die erhaltene biotinylierte und radiomarkierte DNA-Sonde wurde über einer Chromaspin-1000-Säule (Clontech, Palo Alto, CA) entsalzt. Die DNA-Sonden wurden mit den Proben in "easyhyb"-Puffer (Boehringer Mannheim, Deutschland) hybridisiert unter Verwendung des folgenden Temperaturschemas (in dem MTC200-Thermocycler): 94°C für 5 min, gefolgt von 68 Schritten mit einer Abnahme der Temperatur um 0,5°C jede 30 sek (in anderen Worten, die Temperatur wird in 34 min auf 60°C abgesenkt), unter Verwendung versiegelter Wells. Die Proben werden dann dreimal mit 200 μl TNT bei Raumtemperatur gewaschen. Dann werden die Wells für 30 min mit 50 μl TNT mit 0,1 mg/ml BSA (New England Biolabs, Beverly, MA) gewaschen. Dann werden die Wells 5 min mit 15 μl einer Lösung von rot fluoreszierenden, mit Streptavidin beschichteten Mikrospheren mit 40 nm (Molecular Probes, Portland, OR) inkubiert. Die Lösung der Mikrospheren wird aus 2 μl der Stammlösung der Mikrospheren hergestellt, welche für 5 min in einem 50 W-Ultraschallwasserbad (Elgasonic, Bienne, Schweiz) beschallt wurden, in 1 ml TNT-Lösung mit 0,1 mg/ml BSA verdünnt wurden und mit einem Millex GV4-Filter mit 0,22 μm Porengröße (Millipore, Bedford, MA) filtriert wurden.
  • Sichtbarmachung von DNA-Kolonien – Die gefärbten Proben wurden beobachtet unter Verwendung eines invertierten Axiovert 10-Mikroskops unter Verwendung eines 20×-Objektivs (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland), ausgestattet mit einer Micromax 512 × 768 CCD-Kamera (Princeton Instruments, Trenton, NJ), unter Verwendung eines PB546/FT580/LP590-Filtersatzes und 10 sek Lichtsammlung („light collection"). Die Dateien werden in ein TIFF-Format umgewandelt und mit der geeigneten Software (PhotoPaint, Corel Corp. Ltd., Dublin, Irland) bearbeitet. Die Bearbeitung bestand in einer Inversion und einer linearen Kontrastverstärkung, um ein Bild zu erhalten, welches für einen Schwarzweißausdruck auf einem Laserdrucker geeignet ist.
  • Ergebnisse
  • Synthetische mRNA und cDNA-Synthese – Nach einer cDNA-Synthese wurde die cDNA in einer PCR unter Verwendung des p251-Primers (erzeugt an jedem Ende de Erststrang-cDNA) im Hinblick auf die korrekten Längen der Produkte kontrolliert, wie durch Agarosegelelektrophorese untersucht. Die synthetische mSlo-mRNA war in der Leber-mRNA verdünnt, was durch die abnehmende Intensität der mSlo-spezifischen Bande und dem Anstieg eines nicht spezifischen Schmiers von Leber-cDNA nachgewiesen wurde.
  • Nachweis und Quantifizierung der DNA-Kolonien – DNA-Kolonien wurden untersucht unter Verwendung einer Fluoreszenz-Imaging-CCD-Mikroskopie oder Szintillationszählung. Die Zahlen der durch Fluoreszenz nachweisbaren Kolonien stiegen an als Funktion der Menge des Pfropf-Templats, wie in 6 gezeigt ist. Dieser Anstieg wurde durch die Menge der nachgewiesenen 32P-Radiomarkierung widergespiegelt. Es ist möglich, mit radiomarkierten Sonden mRNA-Kopien mit etwa 1:100 nachzuweisen. Aber mit der Technologie des Fluoreszenzmikroskop-CCD-Imaging kann man mRNA bis zu einer Verdünnung von 1:10 000 nachweisen.
  • Beispiel 7: Kovalente Bindung eines Primers an den festen Träger (Kunststoff)
  • Oligonukleotidprimer wurden mit Nucleolink-Kunststoffmikrotiterwells (Nunc, Dänemark) verbunden, um die optimalen Kopplungszeiten und Chemien zu bestimmen. Die Oligonukleotide; CP2 (5'-(Phosphat)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), CP8 (5'-(Amino-hexamethylen)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), CP9 (5'-Hydroxyl)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), CP10 (5'-(Dimethoxytrityl)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) und CP11 (5'-(Biotin)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) (Mircosynth GmbH, Schweiz) wurden wie folgt mit den Nucleolink-Mikrotiterwells verbunden (jeweils 8 Wells); zu jedem Well wurden 20 μl einer Lösung mit 0,1 μM Oligonukleotid, 10 mM 1-Methylimidazol (pH 7,0) (Sigma Chemicals) und 10 mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (pH 7,0) (Sigma Chemicals) in 10 mM 1-Methylimidazol zugegeben. Die Wells wurden dann verschlossen und bei 50°C für unterschiedliche Zeiträume inkubiert. Die Kopplungsreaktion wurde durch zweimaliges Spülen mit 200 μl RS (0,4 N NaOH, 0,25% Tween 20) und zweimaliges Spülen mit 200 μl TNT (100 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) zu bestimmten Zeitpunkten beendet. Die Röhrchen wurden bei 50°C für 30 min getrocknet und wurden in einem verschlossenen Kunststoffbehälter bei 4°C gelagert.
  • Stabilität von gebundenen Oligonukleotiden unter Bedingungen einer PCR-Koloniebildung
  • Die Stabilität wurde unter Koloniewachstumsbedingungen durch Zugabe eines PCR-Mix (20 μl der vier dNTPs (0,2 mM), 0,1% BSA, 0,1% Tween 20, 8% DMSO (Dimethylsulfoxid, Fluka, Schweiz), IX PCR-Puffer) untersucht. Dann wurden die Wells in den Thermozykler gestellt und für 33 Wiederholungen unter den folgenden Bedingungen gehalten: 94°C für 45 sek, 60°C für 4 min, 72°C für 4 min. Nach Beendigung dieses Programms wurden die Wells mit 5 × SSC, 0,1% Tween 20 gespült und bis zur weiteren Verwendung bei 8°C gelagert. Vor der Hybridisierung werden die Wells mit 50 μl 5 × SSC, 0,1% Tween 20 gefüllt, bei 94°C für 5 min erwärmt und bei Raumtemperatur gelagert.
  • Sonde: Die Oligonukleotidsonden R57 (5'-(Phosphat)-GTTTGGGTTGGTTTGGGTTGGTG), Kontrollsonde) und R58 (5'-(Phosphat)-CCCTTTCCCTTTCCTTCTCCTTCT, welche komplementär ist zu CP2, CP8, CP9, CP10 und CP11) wurden enzymatisch an deren 5'-Endterminus mit [γ-32P]dATP (Amersham, UK) markiert unter Verwendung der Bakteriophagen-T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs, Beverly, MA). Überschüssiges 32P dATP wurde mit einer Chroma-Spin-Säule TE-10 (Clontech, Palo Alto CA) entfernt. Die radiomarkierten Oligonukleotide (0,5 μM in 5 × SSC, 0,1% Tween 20) wurden dann mit den Oligonukleotid-derivatisierten Nucleolinkwells für 2 h bei 37°C hybridisiert. Die Wells wurden viermal mit 5 × SSC, 0,1% Tween 20 bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von einem Waschen mit 0,5 × SSC, 0,1% Tween 20 für 15 min bei 37°C. Dann wurden die Wells im Hinblick auf gebundene Sonde durch Szintillationszählung untersucht.
  • Ergebnisse
  • Es gibt einen deutlichen Unterschied in der Rate und Spezifität der Oligonukleotidkopplung in Abhängigkeit von der Art der 5'-funktionellen Gruppe an dem Oligonukleotid. Oligonukleotide, welche die 5'-Aminogruppe tragen, koppelten ungefähr zweimal so schnell wie Oligonukleotide, welche mit einer 5'-Phosphatgruppe funktionalisiert waren (siehe Tabelle 2 und 8). Außerdem koppelten die mit 5'-Hydroxyl, 5'-DMT oder 5'-Biotin funktionalisierten Kontrolloligonukleotide alle mit Raten, welche ähnlich waren wie die des 5'-Phosphats, was die 5'-spezifische Natur der chemischen Verbindung unter Verwendung der 5'-Phosphatgruppe in Frage stellt.
  • Tabelle 2
    Figure 00730001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00740001
  • Figure 00750001
  • Figure 00760001
  • Figure 00770001
  • Figure 00780001
  • Figure 00790001
  • Figure 00800001

Claims (32)

  1. δαVerfahren zur Amplifikation von mehreren Nukleinsäuren, umfassend die folgenden Schritte: (1) Bilden von mehreren Nukleinsäuretemplaten, welche die zu amplifizierenden Nukleinsäuren umfassen, worin eine Oligonukleotidsequenz Y mit dem 5'-Ende der zu amplifizierenden Nukleinsären verbunden ist, und eine Oligonukleotidsequenz Z mit dem 3'-Ende der zu amplifizierenden Nukleinsäuren verbunden ist, und worin die Nukleinsäretemplate außerdem am 5'-Ende ein Mittel zum Anheften der Nukleinsäuren an einen festen Träger tragen; (2) Mischen der Nukleinsäuretemplate mit einem oder mehreren Colony-Primern X, welche an die Oligonukleotidsequenz Z hybridisieren können und am 5'-Ende ein Mittel zum Anheften der Colony-Primer an einen festen Träger tragen, in Anwesenheit eines festen Trägers, so dass die 5'-Enden sowohl von dem Nukleinsäuretemplat als auch von den Colony-Primiern an den festen Träger binden; (3) Durchführen von einer oder mehreren Nukleinsäureamplifikationsreaktionen mit den gebundenen Templaten, so dass Nukleinsäurekolonien erzeugt werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Oligonukleotidsequenz Z komplementär zur Oligonukleotidsequenz Y ist, und der Colony-Primer X die gleiche Sequenz wie die Oligonukleotidsequenz Y aufweist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin in Schritt (2) zwei unterschiedliche Colony-Primer mit den Templaten gemischt werden, und worin die Sequenzen der Colony-Primer X so sind, dass die Oligonukleotidsequenz Z mit einem der Colony-Primer X hybridisieren kann und die Oligonukleotidsequenz Y die gleiche Sequenz wie die von einem der Colony-Primer X ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend den weiteren Schritt Durchführen von mindestens einem Schritt der Sequenzbestimmung von einer oder mehreren der erzeugten Nukleinsäurekolonien.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, worin der Sequenzbestimmungsschritt (die Sequenzbestimmungsschritte) das Einbringen und den Nachweis von markierten Oligonukleotiden umfasst (umfassen).
  6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, worin die vollständigen Sequenzen oder Teilsequenzen der amplifizierten Nukleinsäuretemplate, welche in mehr als einer Nukleinsäurekolonie vorliegen, gleichzeitig bestimmt werden.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend den weiteren Schritt Visualisieren der erzeugten Kolonien.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Visualisierungsschritt die Verwendung einer markierten oder nicht markierten Nukleinsäuresonde umfasst.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Mittel zum Anheften der Nukleinsäuretemplate und der Colony-Primer an den festen Träger ein Mittel zum kovalenten Anheften der Nukleinsäuresequenzen an den Träger umfasst.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Mittel zum kovalenten Anheften der Nukleinsäuresequenzen an den festen Träger eine chemisch modifizierbare funktionelle Gruppe ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die chemisch modifizierbare funktionelle Gruppe ein Carboxyl- oder Aldehydrest, eine Thiol-, eine Hydroxyl-, eine Dimethoxytrityl-(DMT) oder eine Aminogruppe ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die chemisch modifizierbare funktionelle Gruppe eine Aminogruppe ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin der teste Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Latexbeads, Dextranbeads, Polystyrol, einer Polystyrolfläche, Polyacrylamidgel, Goldflächen, Glasflächen und Siliconwafern.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, worin der feste Träger Glas ist.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin die Dichte der erzeugten Nukleinsäurekolonien 10 000/mm2 bis 100 000/mm2 beträgt.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin die Dichte der Colony-Primer X, welche an den festen Träger angeheftet sind, mindestens 1 fmol/mm2 beträgt.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, worin die Dichte der Nukleinsäuretemplate 10 000/mm2 bis 100 000/mm2 beträgt.
  18. Mehrere Nukleinsäuretemplate, umfassend die zu amplifizierenden Nukleinsäuren, worin jede der Nukleinsäuren am 5'-Ende eine bekannte Oligonukleotidsequenz Y und am 3'-Ende eine bekannte Oligonukleotidsequenz Z trägt, und außerdem die Nukleinsäuren am 5'-Ende ein Mittel zum Anheften der Nukleinsäuren an einen festen Träger tragen, worin das Mittel zum Anheften keine Phosphatgruppe ist.
  19. Mehrere Nukleinsäuretemplate nach Anspruch 18, worin das Mittel zum Anheften chemisch modifizierte Gruppen für ein kovalentes Anheften sind, ausgewählt aus einem Carboxyl- oder Aldehydrest, einer Thiol-, einer Hydroxyl-, einer Dimethoxyltrityl-(DMT) oder einer Aminogruppe.
  20. Mehrere Nukleinsäuretemplate nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, worin die Oligonukleotidsequenz Z komplementär zur Oligonukleotidsequenz Y ist.
  21. Gemisch aus Nukleinsäuren, umfassend mehrere Nukleinsäuretemplate nach einem der Ansprüche 18 bis 20 und mehrere Colony-Primer X, welche mit der Oligo nukleotidsequenz Z hybridisieren können und an ihren 5'-Enden ein Mittel zum Anheften der Colony-Primer an einen festen Träger tragen.
  22. Gemisch aus Nukleinsäuren nach Anspruch 21, worin die Oligonukleotidsequenz Z komplementär zur Oligonukleotidsequenz Y ist, und der Colony-Primer X die gleiche Sequenz wie die Oligonukleotidsequenz Y aufweist.
  23. Gemisch aus Nukleinsäuren, umfassend mehrere Nukleinsäuretemplate nach einem der Ansprüche 18 bis 20 und mehrere von zwei unterschiedlichen Colony-Primern X, welche an ihrem 5'-Ende ein Mittel zum Anheften der Colony-Primer an einen festen Träger tragen, und worin die Sequenzen der Colony-Primer X so sind, dass die Oligonukleotidsequenz Z mit einem der Colony-Primer X hybridisieren kann, und die Oligonukleotidsequenz Y die gleiche Sequenz ist wie die Sequenz von einem der Colony-Primer X.
  24. Fester Träger, an welchen mehrere Colony-Primer X und mehrere Nukleinsäuretemplate sind, wie in der Ansprüche 21 bis 23 definiert.
  25. Fester Träger nach Anspruch 24, worin das Anheften der Nukleinsäuretemplate und Colony-Primer an den festen Träger kovalent ist.
  26. Fester Träger nach Anspruch 24 oder Anspruch 25, umfassend eine oder mehrere Nukleinsäurekolonien, welche durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17 erzeugt wurden.
  27. Fester Träger nach einem der Ansprüche 24 bis 26, worin der feste Träger wie in einem der Ansprüche 13 oder 14 definiert ist.
  28. Verwendung eines festen Trägers nach einem der Ansprüche 24 bis 27 in einem Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation oder -sequenzierung.
  29. Verwendung nach Anspruch 28, worin das Verfahren ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17 ist.
  30. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17, oder mehrerer Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, oder des Gemischs von Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, oder der festen Träger nach einem der Ansprüche 24 bis 27 zum Bereitstellen von Nukleinsäuremolekülen für eine Sequenzierung und Resequenzierung, Genexpressionsmonitoring, Erstellung von Profilen der genetischen Diversität, Diagnose, Screening, Gesamtgenomsequenzierung, Ermittlung und Scoring eines Gesamtgenompolymorphismus und zur Präparation von Gesamtgenompräsentationen („whole genome slides"), oder Anwendungen, welche die Amplifikation von Nukleinsäuren oder deren Squenzierung betreffen.
  31. Kit zur Verwendung bei einer Nukleinsäureamplifikation oder -sequenzierung, umfassend mehrere Nukleinsäuretemplate und mehrere Colony-Primer nach einem der Ansprüche 21 bis 23, worin die Nukleinsäuretemplate und Colony-Primer kovalent an einen festen Träger nach Anspruch 24 gebunden sind.
  32. Kit nach Anspruch 31 zur Verwendung bei einer Sequenzierung, Resequenzierung, Genexpressionsmonitoring, Erstellung von Profilen der genetischen Diversität, Diagnose, Screening, Gesamtgenomsequenzierung, Ermittlung und Scoring eines Gesamtgenompolymorphismus oder anderen Anwendungen, welche die Amplifikation von Nukleinsäuren oder deren Sequenzierung betreffen.
DE69928683T 1998-09-30 1999-09-30 Verfahren zur amplifikation und zur sequenzierung von nukleinsäuren Expired - Lifetime DE69928683T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98307985 1998-09-30
EP98307985 1998-09-30
PCT/GB1999/003248 WO2000018957A1 (en) 1998-09-30 1999-09-30 Methods of nucleic acid amplification and sequencing

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69928683D1 DE69928683D1 (de) 2006-01-05
DE69928683T2 true DE69928683T2 (de) 2006-08-24

Family

ID=8235083

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69928683T Expired - Lifetime DE69928683T2 (de) 1998-09-30 1999-09-30 Verfahren zur amplifikation und zur sequenzierung von nukleinsäuren

Country Status (25)

Country Link
US (4) US7115400B1 (de)
EP (2) EP1634963B1 (de)
JP (1) JP2002525125A (de)
KR (1) KR20010085860A (de)
CN (1) CN1325458A (de)
AR (1) AR021833A1 (de)
AT (1) ATE311474T1 (de)
AU (1) AU771073B2 (de)
BG (1) BG105363A (de)
BR (1) BR9914159A (de)
CA (1) CA2344575A1 (de)
CZ (1) CZ20011183A3 (de)
DE (1) DE69928683T2 (de)
EA (1) EA004271B1 (de)
EE (1) EE200100195A (de)
HK (1) HK1042525A1 (de)
HU (1) HUP0105052A3 (de)
IL (1) IL142178A0 (de)
NO (1) NO20011303L (de)
NZ (1) NZ510599A (de)
PL (1) PL347125A1 (de)
SK (1) SK4292001A3 (de)
TR (1) TR200100911T2 (de)
WO (1) WO2000018957A1 (de)
ZA (1) ZA200102420B (de)

Families Citing this family (770)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2327797B1 (de) * 1997-04-01 2015-11-25 Illumina Cambridge Limited Verfahren zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren
US20100130368A1 (en) * 1998-07-30 2010-05-27 Shankar Balasubramanian Method and system for sequencing polynucleotides
AR021833A1 (es) * 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
DE10027040A1 (de) * 2000-06-02 2001-12-06 Basf Lynx Bioscience Ag Verfahren zur Herstellung von DNA-Arrays
AR031640A1 (es) * 2000-12-08 2003-09-24 Applied Research Systems Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido
US6929915B2 (en) 2001-04-20 2005-08-16 The Penn State Research Foundation Methods for nucleic acid manipulation
US7195908B2 (en) * 2002-10-31 2007-03-27 Corning Incorporated Supports treated with triamine for immobilizing biomolecules
WO2004083443A1 (en) 2002-12-20 2004-09-30 Caliper Life Sciences, Inc. Single molecule amplification and detection of dna
JP4480715B2 (ja) 2003-01-29 2010-06-16 ４５４ コーポレーション 二重末端シーケンシング
WO2005065814A1 (en) 2004-01-07 2005-07-21 Solexa Limited Modified molecular arrays
US7311794B2 (en) 2004-05-28 2007-12-25 Wafergen, Inc. Methods of sealing micro wells
GB0427236D0 (en) 2004-12-13 2005-01-12 Solexa Ltd Improved method of nucleotide detection
WO2006064199A1 (en) * 2004-12-13 2006-06-22 Solexa Limited Improved method of nucleotide detection
EP2239342A3 (de) 2005-02-01 2010-11-03 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Reagentien, Verfahren und Bibliotheken zur Sequenzierung mit Kügelchen
EP2241637A1 (de) 2005-02-01 2010-10-20 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Nukleinsäuresequenzierung durch schrittweise Duplexverlängerung
GB0514935D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Methods for sequencing a polynucleotide template
GB0514936D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Preparation of templates for nucleic acid sequencing
GB0514910D0 (en) * 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Method for sequencing a polynucleotide template
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
GB0522310D0 (en) 2005-11-01 2005-12-07 Solexa Ltd Methods of preparing libraries of template polynucleotides
GB0524069D0 (en) * 2005-11-25 2006-01-04 Solexa Ltd Preparation of templates for solid phase amplification
ATE518010T1 (de) * 2005-12-22 2011-08-15 Pacific Biosciences California Aktive oberflächengekoppelte polymerasen
CN101415839B (zh) 2006-02-08 2012-06-27 亿明达剑桥有限公司 对多核苷酸模板进行测序的方法
US20080009420A1 (en) * 2006-03-17 2008-01-10 Schroth Gary P Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays
US20070231823A1 (en) 2006-03-23 2007-10-04 Mckernan Kevin J Directed enrichment of genomic DNA for high-throughput sequencing
US8921073B2 (en) 2006-06-23 2014-12-30 Illumina, Inc. Devices and systems for creation of DNA cluster arrays
ATE538216T1 (de) * 2006-07-31 2012-01-15 Wanli Bi Nukleinsäureverstärkung mithilfe eines reversibel modifizierten oligonukleotids
EP2049682A2 (de) * 2006-07-31 2009-04-22 Illumina Cambridge Limited Verfahren zur herstellung von bibliotheken unter vermeidung der bildung von adaptordimeren
JPWO2008018355A1 (ja) * 2006-08-08 2009-12-24 シャープ株式会社 バイオセンサ及びその製造方法並びに当該バイオセンサを用いた検出方法
EP2520935A3 (de) 2006-08-09 2013-02-13 Homestead Clinical Corporation Organspezifische Proteine und Verfahren zu deren Verwendung
US7754429B2 (en) * 2006-10-06 2010-07-13 Illumina Cambridge Limited Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides
EP2076609A1 (de) 2006-10-10 2009-07-08 Illumina Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur repräsentativen auswahl von nukleinsäuren aus komplexen gemischen mittels hybridisierung
WO2008069906A2 (en) * 2006-11-14 2008-06-12 The Regents Of The University Of California Digital expression of gene analysis
US8315817B2 (en) 2007-01-26 2012-11-20 Illumina, Inc. Independently removable nucleic acid sequencing system and method
CA2676570C (en) * 2007-01-26 2016-05-03 Illumina, Inc. Nucleic acid sequencing system and method
WO2008093098A2 (en) * 2007-02-02 2008-08-07 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
WO2008096146A1 (en) 2007-02-07 2008-08-14 Solexa Limited Preparation of templates for methylation analysis
WO2008151023A2 (en) 2007-06-01 2008-12-11 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
WO2008157515A1 (en) * 2007-06-16 2008-12-24 Sacrab Genomics Nucleic acid packaging system
US20110105366A1 (en) * 2007-06-18 2011-05-05 Illumina, Inc. Microfabrication methods for the optimal patterning of substrates
JP2009000070A (ja) * 2007-06-22 2009-01-08 Hitachi Ltd 大規模並列核酸分析方法
US8759077B2 (en) * 2007-08-28 2014-06-24 Lightspeed Genomics, Inc. Apparatus for selective excitation of microparticles
US8222040B2 (en) * 2007-08-28 2012-07-17 Lightspeed Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing by selective excitation of microparticles
WO2009029728A1 (en) 2007-08-29 2009-03-05 Applied Biosystems Inc. Alternative nucleic acid sequencing methods
US20090093378A1 (en) * 2007-08-29 2009-04-09 Helen Bignell Method for sequencing a polynucleotide template
US9388457B2 (en) 2007-09-14 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Locus specific amplification using array probes
US8716190B2 (en) 2007-09-14 2014-05-06 Affymetrix, Inc. Amplification and analysis of selected targets on solid supports
US7811810B2 (en) 2007-10-25 2010-10-12 Industrial Technology Research Institute Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules
US7767441B2 (en) * 2007-10-25 2010-08-03 Industrial Technology Research Institute Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules
JP2009178159A (ja) 2007-11-05 2009-08-13 Hitachi Plant Technologies Ltd 核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板
US8202691B2 (en) 2008-01-25 2012-06-19 Illumina, Inc. Uniform fragmentation of DNA using binding proteins
US8039817B2 (en) 2008-05-05 2011-10-18 Illumina, Inc. Compensator for multiple surface imaging
EP2294214A2 (de) * 2008-05-07 2011-03-16 Illumina, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur bereitstellung von substanzen an und aus einem array
US8407012B2 (en) * 2008-07-03 2013-03-26 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and systems of DNA sequencing
EP2302028B1 (de) * 2008-07-09 2013-09-11 Panasonic Corporation Sequenzer
WO2010021936A1 (en) * 2008-08-16 2010-02-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Digital pcr calibration for high throughput sequencing
US8583380B2 (en) 2008-09-05 2013-11-12 Aueon, Inc. Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options
US8383345B2 (en) 2008-09-12 2013-02-26 University Of Washington Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
US8728764B2 (en) * 2008-10-02 2014-05-20 Illumina Cambridge Limited Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications
US20100087325A1 (en) * 2008-10-07 2010-04-08 Illumina, Inc. Biological sample temperature control system and method
AU2009319907B2 (en) 2008-11-03 2015-10-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting modification resistant nucleic acids
US9394567B2 (en) 2008-11-07 2016-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Detection and quantification of sample contamination in immune repertoire analysis
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
US9506119B2 (en) 2008-11-07 2016-11-29 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of sequence determination using sequence tags
US9528160B2 (en) 2008-11-07 2016-12-27 Adaptive Biotechnolgies Corp. Rare clonotypes and uses thereof
EP2364368B1 (de) 2008-11-07 2014-01-15 Sequenta, Inc. Verfahren zur überwachung von krankheitszuständen mittels sequenzanalyse
US8628927B2 (en) 2008-11-07 2014-01-14 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
WO2010068702A2 (en) * 2008-12-10 2010-06-17 Illumina, Inc. Methods and compositions for hybridizing nucleic acids
EP2607496B1 (de) * 2008-12-23 2014-07-16 Illumina, Inc. Für Nukleinsäuresequenzierungsprotokolle geeignete Verfahren
DK2387627T3 (en) 2009-01-15 2016-07-04 Adaptive Biotechnologies Corp Adaptive immunity profiling and methods for producing monoclonal antibodies
WO2010094772A1 (en) 2009-02-20 2010-08-26 Febit Holding Gmbh Synthesis of sequence-verified nucleic acids
JP5600880B2 (ja) * 2009-03-03 2014-10-08 東洋紡株式会社 改良された増幅試薬
JP5239978B2 (ja) * 2009-03-23 2013-07-17 パナソニック株式会社 センサおよびシーケンサー
US20100285970A1 (en) * 2009-03-31 2010-11-11 Rose Floyd D Methods of sequencing nucleic acids
WO2010115100A1 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 L&C Diagment, Inc. Multiplex nucleic acid detection methods and systems
CA2760439A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Good Start Genetics, Inc. Methods and compositions for evaluating genetic markers
US9085798B2 (en) 2009-04-30 2015-07-21 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
EP2248914A1 (de) 2009-05-05 2010-11-10 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Die Verwendung von IIB-Restriktionsendonukleasen in Sequenzierungsanwendungen der zweiten Generation
US9334531B2 (en) 2010-12-17 2016-05-10 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
US9309557B2 (en) 2010-12-17 2016-04-12 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
US9309566B2 (en) 2010-12-17 2016-04-12 Life Technologies Corporation Methods, compositions, systems, apparatuses and kits for nucleic acid amplification
EP2446052B1 (de) 2009-06-25 2018-08-08 Fred Hutchinson Cancer Research Center Verfahren zur messung der adaptiven immunität
DK2456892T3 (en) 2009-07-24 2014-12-08 Illumina Inc Procedure for sequencing of a polynukleotidskabelon
US9416409B2 (en) 2009-07-31 2016-08-16 Ibis Biosciences, Inc. Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests
DK2816111T3 (en) 2009-08-14 2016-06-06 Epicentre Tech Corp Methods, compositions, and kits for the generation of rRNA-depleted samples or isolation of rRNA from samples
HUE030765T2 (en) 2009-08-25 2017-05-29 Illumina Inc A method for selecting and amplifying polynucleotides
US8182994B2 (en) 2009-09-15 2012-05-22 Illumina Cambridge Limited Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing
WO2011037990A1 (en) * 2009-09-22 2011-03-31 President And Fellows Of Harvard College Entangled mate sequencing
US9890408B2 (en) 2009-10-15 2018-02-13 Ibis Biosciences, Inc. Multiple displacement amplification
WO2011053845A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Illumina, Inc. Microvessels, microparticles, and methods of manufacturing and using the same
CN102648295B (zh) 2009-12-07 2017-08-08 伊鲁米那股份有限公司 用于多重基因分型的多样品索引
US9323888B2 (en) 2010-01-19 2016-04-26 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
US20120010085A1 (en) 2010-01-19 2012-01-12 Rava Richard P Methods for determining fraction of fetal nucleic acids in maternal samples
US9260745B2 (en) 2010-01-19 2016-02-16 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
GB2485645B (en) 2010-01-19 2012-11-21 Verinata Health Inc Improved identification of partial aneuploidies using a normalising sequence
US10388403B2 (en) 2010-01-19 2019-08-20 Verinata Health, Inc. Analyzing copy number variation in the detection of cancer
AU2011207561B2 (en) 2010-01-19 2014-02-20 Verinata Health, Inc. Partition defined detection methods
US20120100548A1 (en) 2010-10-26 2012-04-26 Verinata Health, Inc. Method for determining copy number variations
WO2011091046A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Verinata Health, Inc. Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic dna by whole genome sequencing
EP2526207A4 (de) * 2010-01-22 2013-10-09 Univ California Zusammensetzungen und verfahren für chemisches screening auf gensignaturbasis
US20110312503A1 (en) 2010-01-23 2011-12-22 Artemis Health, Inc. Methods of fetal abnormality detection
EP2539464B1 (de) 2010-02-23 2016-11-16 Illumina, Inc. Verfahren zur minimierung sequenzabhängiger amplifikationsunterschiede
WO2011112465A1 (en) 2010-03-06 2011-09-15 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses for detecting optical signals from a sample
US8502867B2 (en) 2010-03-19 2013-08-06 Lightspeed Genomics, Inc. Synthetic aperture optics imaging method using minimum selective excitation patterns
US9465228B2 (en) 2010-03-19 2016-10-11 Optical Biosystems, Inc. Illumination apparatus optimized for synthetic aperture optics imaging using minimum selective excitation patterns
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
CA2794522C (en) 2010-04-05 2019-11-26 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
EP2566985A4 (de) 2010-05-06 2014-08-06 Ibis Biosciences Inc Integrierte probenpräparationssysteme und stabilisierte enzymmischungen
ES2593614T3 (es) 2010-05-06 2016-12-12 Adaptive Biotechnologies Corporation Monitorización de estados de salud y enfermedad usando perfiles de clonotipos
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
EP2854057B1 (de) 2010-05-18 2018-03-07 Natera, Inc. Verfahren zur nichtinvasiven pränatalen Ploidiezuordnung
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
CA2801039A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Esoterix Genetic Laboratories, Llc Enumeration of nucleic acids
US9353412B2 (en) 2010-06-18 2016-05-31 Illumina, Inc. Conformational probes and methods for sequencing nucleic acids
US20120021919A1 (en) 2010-07-23 2012-01-26 Thomas Scholl Identification of Differentially Represented Fetal or Maternal Genomic Regions and Uses Thereof
US9029103B2 (en) 2010-08-27 2015-05-12 Illumina Cambridge Limited Methods for sequencing polynucleotides
EP2426214A1 (de) 2010-09-01 2012-03-07 Koninklijke Philips Electronics N.V. Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren
WO2012037394A1 (en) 2010-09-16 2012-03-22 Ibis Biosciences, Inc. Stabilization of ozone-labile fluorescent dyes by thiourea
IN2013MN00522A (de) 2010-09-24 2015-05-29 Univ Leland Stanford Junior
US8759038B2 (en) 2010-09-29 2014-06-24 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for sequencing nucleic acids
EA022475B1 (ru) * 2010-10-19 2016-01-29 Ооо "Центр Инновационных Технологий-Нано" Способ секвенирования днк
US20150225792A1 (en) 2014-01-17 2015-08-13 Northwestern University Compositions and methods for identifying depressive disorders
US10233501B2 (en) 2010-10-19 2019-03-19 Northwestern University Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment
US20150218639A1 (en) 2014-01-17 2015-08-06 Northwestern University Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment
US10093981B2 (en) 2010-10-19 2018-10-09 Northwestern University Compositions and methods for identifying depressive disorders
WO2012055929A1 (en) 2010-10-26 2012-05-03 Illumina, Inc. Sequencing methods
EP3928867A1 (de) 2010-10-27 2021-12-29 Illumina, Inc. Mikrobauelemente und biosensorkassetten zur biologischen oder chemischen analyse sowie systeme und verfahren dafür
US8575071B2 (en) 2010-11-03 2013-11-05 Illumina, Inc. Reducing adapter dimer formation
US9074251B2 (en) 2011-02-10 2015-07-07 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
WO2012074855A2 (en) 2010-11-22 2012-06-07 The Regents Of The University Of California Methods of identifying a cellular nascent rna transcript
CN103370425B (zh) 2010-12-17 2019-03-19 生命技术公司 用于核酸扩增的方法、组合物、系统、仪器和试剂盒
US20120152743A1 (en) * 2010-12-17 2012-06-21 General Electric Company Method for electroeluting genetic material from dried samples
JP5616773B2 (ja) 2010-12-21 2014-10-29 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸分析用反応デバイス、及び核酸分析装置
US9163281B2 (en) 2010-12-23 2015-10-20 Good Start Genetics, Inc. Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
WO2012092265A1 (en) 2010-12-27 2012-07-05 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid sample preparation methods and compositions
US8951781B2 (en) 2011-01-10 2015-02-10 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis
WO2012100194A1 (en) 2011-01-20 2012-07-26 Ibis Biosciences, Inc. Microfluidic transducer
EP2670894B1 (de) 2011-02-02 2017-11-29 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Massiv parallele nachbarschaftsabbildung
US20130344540A1 (en) * 2011-02-03 2013-12-26 Mark T. Reed Methods for minimizing sequence specific bias
AU2012225310B2 (en) 2011-03-09 2017-08-03 Cell Signaling Technology, Inc. Methods and reagents for creating monoclonal antibodies
JP5863946B2 (ja) 2011-04-12 2016-02-17 ベリナタ ヘルス インコーポレイテッド 多型カウントを用いたゲノム画分の分析
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
GB2484764B (en) 2011-04-14 2012-09-05 Verinata Health Inc Normalizing chromosomes for the determination and verification of common and rare chromosomal aneuploidies
US9411937B2 (en) 2011-04-15 2016-08-09 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
EP2697397B1 (de) 2011-04-15 2017-04-05 The Johns Hopkins University Sicheres sortierungssystem
US8778848B2 (en) 2011-06-09 2014-07-15 Illumina, Inc. Patterned flow-cells useful for nucleic acid analysis
AU2012281152B2 (en) 2011-07-13 2017-09-07 The Multiple Myeloma Research Foundation, Inc. Methods for data collection and distribution
US9670538B2 (en) 2011-08-05 2017-06-06 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid sequencing by electrochemical detection
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
CA3104322C (en) 2011-09-23 2023-06-13 Illumina, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sequencing
WO2013049135A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Gen-Probe Incorporated Algorithms for sequence determinations
WO2013058907A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Good Start Genetics, Inc. Analysis methods
US9206418B2 (en) 2011-10-19 2015-12-08 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing
US9279159B2 (en) 2011-10-21 2016-03-08 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
WO2013063308A1 (en) 2011-10-25 2013-05-02 University Of Massachusetts An enzymatic method to enrich for capped rna, kits for performing same, and compositions derived therefrom
CA2856163C (en) 2011-10-28 2019-05-07 Illumina, Inc. Microarray fabrication system and method
CN103890161A (zh) 2011-10-31 2014-06-25 株式会社日立高新技术 核酸扩增方法、核酸基板、核酸分析方法及核酸分析装置
CA2858070C (en) 2011-12-09 2018-07-10 Adaptive Biotechnologies Corporation Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection
US9499865B2 (en) 2011-12-13 2016-11-22 Adaptive Biotechnologies Corp. Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes
US20130189679A1 (en) 2011-12-20 2013-07-25 The Regents Of The University Of Michigan Pseudogenes and uses thereof
US9334491B2 (en) 2011-12-22 2016-05-10 Ibis Biosciences, Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids from cellular samples
US20150329855A1 (en) 2011-12-22 2015-11-19 Ibis Biosciences, Inc. Amplification primers and methods
US10150993B2 (en) 2011-12-22 2018-12-11 Ibis Biosciences, Inc. Macromolecule positioning by electrical potential
WO2013096838A2 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Ibis Biosciences, Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids
EP3269820A1 (de) 2011-12-22 2018-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Kit für die amplifizierung einer sequenz aus einer ribonukleinsäure
WO2013102091A1 (en) 2011-12-28 2013-07-04 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid ligation systems and methods
US9823246B2 (en) 2011-12-28 2017-11-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescence enhancing plasmonic nanoscopic gold films and assays based thereon
WO2013102081A2 (en) 2011-12-29 2013-07-04 Ibis Biosciences, Inc. Macromolecule delivery to nanowells
US9222115B2 (en) 2011-12-30 2015-12-29 Abbott Molecular, Inc. Channels with cross-sectional thermal gradients
US9822417B2 (en) 2012-01-09 2017-11-21 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer
EP2802666B1 (de) 2012-01-13 2018-09-19 Data2Bio Genotypisierung durch eine sequenzierung der nächsten generation
CN105861487B (zh) 2012-01-26 2020-05-05 纽亘技术公司 用于靶向核酸序列富集和高效文库产生的组合物和方法
WO2013117595A2 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Illumina Cambridge Limited Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support
RS61631B1 (sr) 2012-02-17 2021-04-29 Hutchinson Fred Cancer Res Kompozicije i postupci za preciznu identifikaciju mutacija
EP2817627A2 (de) 2012-02-21 2014-12-31 Oslo Universitetssykehus HF Verfahren und biomarker zur erkennung und prognose von gebärmutterhalskrebs
DK2823060T3 (en) 2012-03-05 2018-05-28 Adaptive Biotechnologies Corp Determination of associated immune receptor chains from frequency-matched subunits
NO2694769T3 (de) 2012-03-06 2018-03-03
AU2013229151A1 (en) 2012-03-06 2014-09-25 Aarhus University Gene signatures associated with efficacy of postmastectomy radiotherapy in breast cancer
US9803239B2 (en) 2012-03-29 2017-10-31 Complete Genomics, Inc. Flow cells for high density array chips
US20130261984A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Illumina, Inc. Methods and systems for determining fetal chromosomal abnormalities
CA3138752C (en) 2012-04-03 2024-02-06 Illumina, Inc. Integrated optoelectronic read head and fluidic cartridge useful for nucleic acid sequencing
US9732387B2 (en) 2012-04-03 2017-08-15 The Regents Of The University Of Michigan Biomarker associated with irritable bowel syndrome and Crohn's disease
US8209130B1 (en) 2012-04-04 2012-06-26 Good Start Genetics, Inc. Sequence assembly
US8812422B2 (en) 2012-04-09 2014-08-19 Good Start Genetics, Inc. Variant database
US20130274148A1 (en) 2012-04-11 2013-10-17 Illumina, Inc. Portable genetic detection and analysis system and method
US10227635B2 (en) 2012-04-16 2019-03-12 Molecular Loop Biosolutions, Llc Capture reactions
EP2844767A4 (de) 2012-05-02 2015-11-18 Ibis Biosciences Inc Systeme und verfahren für nukleinsäuresequenzierung
EP2844772B1 (de) 2012-05-02 2018-07-11 Ibis Biosciences, Inc. Dna-sequenzierung
EP2844775B1 (de) 2012-05-02 2018-07-18 Ibis Biosciences, Inc. Dna-sequenzierung
EP2844774B1 (de) 2012-05-02 2018-07-18 Ibis Biosciences, Inc. Dna-sequenzierung
ES2582554T3 (es) 2012-05-08 2016-09-13 Adaptive Biotechnologies Corporation Composiciones y método para medir y calibrar el sesgo de la amplificación en reacciones de PCR multiplexadas
US9012022B2 (en) 2012-06-08 2015-04-21 Illumina, Inc. Polymer coatings
US8895249B2 (en) 2012-06-15 2014-11-25 Illumina, Inc. Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
SG11201408478QA (en) 2012-06-18 2015-02-27 Nugen Technologies Inc Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences
WO2014005076A2 (en) 2012-06-29 2014-01-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods and biomarkers for detection of kidney disorders
WO2014008448A1 (en) 2012-07-03 2014-01-09 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Quantitative assessment of human t-cell repertoire recovery after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
CA2876505A1 (en) 2012-07-17 2014-01-23 Counsyl, Inc. System and methods for detecting genetic variation
US9092401B2 (en) 2012-10-31 2015-07-28 Counsyl, Inc. System and methods for detecting genetic variation
US9977861B2 (en) 2012-07-18 2018-05-22 Illumina Cambridge Limited Methods and systems for determining haplotypes and phasing of haplotypes
US10584381B2 (en) 2012-08-14 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9567631B2 (en) 2012-12-14 2017-02-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CA3216609C (en) 2012-08-14 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Microcapsule compositions and methods
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9422602B2 (en) 2012-08-15 2016-08-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for determining nucleic acid degradation
NL2017959B1 (en) 2016-12-08 2018-06-19 Illumina Inc Cartridge assembly
AU2013306373B2 (en) 2012-08-20 2017-09-07 Illumina, Inc. Method and system for fluorescence lifetime based sequencing
SG11201502094TA (en) 2012-09-19 2015-04-29 Abbvie Biotherapeutics Inc Methods for identifying antibodies with reduced immunogenicity
DK2904111T3 (en) 2012-10-01 2018-03-12 Adaptive Biotechnologies Corp Immune competence evaluation of adaptive immune receptor diversity and clonality characterization
ES2701750T3 (es) 2012-10-16 2019-02-25 Abbott Molecular Inc Procedimientos para secuenciar un ácido nucleico
US9365896B2 (en) 2012-10-19 2016-06-14 Agilent Technologies, Inc. Addition of an adaptor by invasive cleavage
WO2014066179A1 (en) 2012-10-24 2014-05-01 Clontech Laboratories, Inc. Template switch-based methods for producing a product nucleic acid
ES2886507T3 (es) 2012-10-29 2021-12-20 Univ Johns Hopkins Prueba de Papanicolaou para cánceres de ovario y de endometrio
CA3140836A1 (en) 2012-11-21 2014-05-30 Courtagen Life Sciences Inc. A method of removing amplicons of a non-target nucleic acid having one or more methylated cytosines from a sample
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
EP2946345B1 (de) 2013-01-17 2024-04-03 Personalis, Inc. Verfahren und system zur phylogenetischen analyse
CA2900543C (en) 2013-02-08 2023-01-31 10X Genomics, Inc. Partitioning and processing of analytes and other species
US9512422B2 (en) 2013-02-26 2016-12-06 Illumina, Inc. Gel patterned surfaces
WO2014135221A1 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Illumina Cambridge Ltd Polymethine compounds and their use as fluorescent labels
WO2014135223A1 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Illumina Cambridge Ltd Rhodamine compounds and their use as fluorescent labels
ES2887177T3 (es) 2013-03-13 2021-12-22 Illumina Inc Método de preparación de una biblioteca de secuenciación de ácidos nucleicos
DK2969479T3 (da) 2013-03-13 2021-08-02 Illumina Inc Væskeanordninger i flere lag og fremgangsmåder til deres fremstilling
US20140272967A1 (en) 2013-03-13 2014-09-18 Abbott Molecular Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids
US20140287946A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid control panels
CA2905429A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Abbott Molecular Inc. Minimizing errors using uracil-dna-n-glycosylase
US9701999B2 (en) 2013-03-14 2017-07-11 Abbott Molecular, Inc. Multiplex methylation-specific amplification systems and methods
WO2014152421A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Good Start Genetics, Inc. Methods for analyzing nucleic acids
WO2014142981A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Illumina, Inc. Enzyme-linked nucleotides
US9255265B2 (en) 2013-03-15 2016-02-09 Illumina, Inc. Methods for producing stranded cDNA libraries
US9890425B2 (en) 2013-03-15 2018-02-13 Abbott Molecular Inc. Systems and methods for detection of genomic copy number changes
WO2014150851A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Ibis Biosciences, Inc. Nucleotide analogs for sequencing
WO2014150910A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Ibis Biosciences, Inc. Dna sequences to assess contamination in dna sequencing
US9822408B2 (en) 2013-03-15 2017-11-21 Nugen Technologies, Inc. Sequential sequencing
EP3597772A1 (de) 2013-04-17 2020-01-22 Agency For Science, Technology And Research Verfahren zur erzeugung erweiterter sequenzauslesungen
WO2014172288A2 (en) 2013-04-19 2014-10-23 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
EP3005200A2 (de) 2013-06-03 2016-04-13 Good Start Genetics, Inc. Verfahren und systeme zur speicherung von sequenzlesedaten
US9879313B2 (en) 2013-06-25 2018-01-30 Prognosys Biosciences, Inc. Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
TR201816438T4 (tr) 2013-07-01 2018-11-21 Illumina Inc Katalizörsüz yüzey işlevselleştirme ve polimer aşılama.
CN109112193A (zh) 2013-07-03 2019-01-01 伊鲁米那股份有限公司 正交合成测序
US10392670B2 (en) 2013-07-25 2019-08-27 Dch Molecular Diagnostics, Inc. Methods and compositions for detecting bacterial contamination
TWI646230B (zh) 2013-08-05 2019-01-01 扭轉生物科技有限公司 重新合成之基因庫
CA3091557C (en) 2013-08-08 2022-10-18 Illumina, Inc. Fluidic system for reagent delivery to a flow cell
CA2921620C (en) 2013-08-19 2021-01-19 Abbott Molecular Inc. Next-generation sequencing libraries
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
CN105916689A (zh) 2013-08-30 2016-08-31 Illumina公司 在亲水性或斑驳亲水性表面上的微滴操纵
EP3039161B1 (de) 2013-08-30 2021-10-06 Personalis, Inc. Verfahren und system zur genomanalyse
US9352315B2 (en) 2013-09-27 2016-05-31 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. Method to produce chemical pattern in micro-fluidic structure
GB2535066A (en) 2013-10-03 2016-08-10 Personalis Inc Methods for analyzing genotypes
EP4389888A2 (de) 2013-10-17 2024-06-26 Takara Bio USA, Inc. Verfahren zum hinzufügen von adaptern zu nukleinsäuren und zusammensetzungen zur durchführung davon
EP3058092B1 (de) 2013-10-17 2019-05-22 Illumina, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur herstellung von nukleinsäure-bibliotheken
US10851414B2 (en) 2013-10-18 2020-12-01 Good Start Genetics, Inc. Methods for determining carrier status
WO2015057565A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Good Start Genetics, Inc. Methods for assessing a genomic region of a subject
US10415083B2 (en) 2013-10-28 2019-09-17 The Translational Genomics Research Institute Long insert-based whole genome sequencing
CA2929596C (en) 2013-11-13 2022-07-05 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read
EP3080268A1 (de) 2013-12-09 2016-10-19 Illumina, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur gezielten nukleinsäuresequenzierung
US10254225B2 (en) 2013-12-10 2019-04-09 Illumina, Inc. Biosensors for biological or chemical analysis and methods of manufacturing the same
US9909181B2 (en) 2013-12-13 2018-03-06 Northwestern University Biomarkers for post-traumatic stress states
US9719136B2 (en) 2013-12-17 2017-08-01 Takara Bio Usa, Inc. Methods for adding adapters to nucleic acids and compositions for practicing the same
EP3083700B1 (de) 2013-12-17 2023-10-11 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Bestimmung eines antikörpers gegen ein pathogen
CA3171807A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Illumina, Inc. Substrates comprising nano-patterning surfaces and methods of preparing thereof
EP3957750A1 (de) 2013-12-20 2022-02-23 Illumina, Inc. Konservierung von genomverbindungsinformationen in fragmentierten genomischen dna-proben
US10537889B2 (en) 2013-12-31 2020-01-21 Illumina, Inc. Addressable flow cell using patterned electrodes
US9677132B2 (en) 2014-01-16 2017-06-13 Illumina, Inc. Polynucleotide modification on solid support
AU2014377537B2 (en) 2014-01-16 2021-02-25 Illumina, Inc. Amplicon preparation and sequencing on solid supports
WO2015107430A2 (en) 2014-01-16 2015-07-23 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer
NZ723399A (en) 2014-02-18 2020-08-28 Illumina Inc Methods and compositions for dna profiling
US9745614B2 (en) 2014-02-28 2017-08-29 Nugen Technologies, Inc. Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors
AU2015227054A1 (en) 2014-03-05 2016-09-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
US11390921B2 (en) 2014-04-01 2022-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Determining WT-1 specific T cells and WT-1 specific T cell receptors (TCRs)
WO2015157567A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 10X Genomics, Inc. Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same
EP3132059B1 (de) 2014-04-17 2020-01-08 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantifizierung von adaptiven immunzellgenomen in einer komplexen mischung von zellen
CN113774132A (zh) 2014-04-21 2021-12-10 纳特拉公司 检测染色体片段中的突变和倍性
US11053548B2 (en) 2014-05-12 2021-07-06 Good Start Genetics, Inc. Methods for detecting aneuploidy
WO2015175832A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Illumina, Inc. Nucleic acid synthesis techniques
AU2015267189B2 (en) 2014-05-27 2019-12-05 Illumina, Inc. Systems and methods for biochemical analysis including a base instrument and a removable cartridge
ES2912084T3 (es) 2014-06-05 2022-05-24 Illumina Inc Sistemas que incluyen una válvula rotatoria para al menos uno de preparación de muestras o análisis de muestras
GB201410022D0 (en) 2014-06-05 2014-07-16 Orion Diagnostica Oy Method
EP3151733B1 (de) 2014-06-06 2020-04-15 The Regents Of The University Of Michigan Zusammensetzungen und verfahren zur charakterisierung und diagnose von parodontaler erkrankung
US20150353989A1 (en) 2014-06-09 2015-12-10 Illumina Cambridge Limited Sample preparation for nucleic acid amplification
GB201410420D0 (en) 2014-06-11 2014-07-23 Illumina Cambridge Ltd Methods for estimating cluster numbers
CA3172086A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for preparing sequencing libraries
GB201410646D0 (en) 2014-06-14 2014-07-30 Illumina Cambridge Ltd Methods of increasing sequencing accuracy
EP3919621A1 (de) 2014-06-23 2021-12-08 The General Hospital Corporation Genomweite unbeeinflusste, durch sequenzierung (guide-seq) beurteilte identifizierung von dsbs
CN114214314A (zh) 2014-06-24 2022-03-22 生物辐射实验室股份有限公司 数字式pcr条码化
EP3161700B1 (de) 2014-06-26 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Verfahren und systeme zur nukleinsäuresequenzanordnung
US10017759B2 (en) 2014-06-26 2018-07-10 Illumina, Inc. Library preparation of tagged nucleic acid
EP4053292A1 (de) 2014-06-26 2022-09-07 10X Genomics, Inc. Verfahren zur analyse von nukleinsäuren aus einzelzellen oder zellpopulationen
WO2015200833A2 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Abbott Laboratories COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING HUMAN PEGIVIRUS 2 (HPgV-2)
DK3161152T3 (en) 2014-06-30 2019-03-25 Illumina Inc Methods and compositions using one-sided transposition
BR112017001500A2 (pt) 2014-07-24 2018-02-20 Abbott Molecular Inc composições e métodos para a detecção e análise de tuberculose por micobactéria
CA2956925C (en) 2014-08-01 2024-02-13 Dovetail Genomics, Llc Tagging nucleic acids for sequence assembly
US10102337B2 (en) 2014-08-06 2018-10-16 Nugen Technologies, Inc. Digital measurements from targeted sequencing
CN106796212A (zh) 2014-08-12 2017-05-31 新生代吉恩公司 用于基于收集的体液而监测健康的系统和方法
US10174383B2 (en) 2014-08-13 2019-01-08 Vanadis Diagnostics Method of estimating the amount of a methylated locus in a sample
CN107076739B (zh) 2014-08-21 2018-12-25 伊卢米纳剑桥有限公司 可逆表面官能化
WO2016040446A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Good Start Genetics, Inc. Methods for selectively suppressing non-target sequences
WO2016040602A1 (en) 2014-09-11 2016-03-17 Epicentre Technologies Corporation Reduced representation bisulfite sequencing using uracil n-glycosylase (ung) and endonuclease iv
ES2788692T3 (es) 2014-09-17 2020-10-22 Ibis Biosciences Inc Secuenciación por síntesis usando óptica de lectura por pulsos
JP6802154B2 (ja) 2014-09-18 2020-12-16 イラミーナ インコーポレーテッド 核酸シーケンシングデータを解析するための方法およびシステム
CA2999708A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 Good Start Genetics, Inc. Process control for increased robustness of genetic assays
US10040048B1 (en) 2014-09-25 2018-08-07 Synthego Corporation Automated modular system and method for production of biopolymers
KR20170066540A (ko) 2014-10-09 2017-06-14 일루미나, 인코포레이티드 액체 중 적어도 하나를 효과적으로 격리시키기 위해 비혼화성 액체를 분리하기 위한 방법 및 디바이스
BR112017007912A2 (pt) 2014-10-17 2018-01-23 Illumina Cambridge Limited transposon de preservação de contiguidade
ES2784343T3 (es) 2014-10-29 2020-09-24 Adaptive Biotechnologies Corp Detección simultánea altamente multiplexada de ácidos nucleicos que codifican heterodímeros de receptores inmunes adaptativos emparejados de muchas muestras
CN114807307A (zh) 2014-10-29 2022-07-29 10X 基因组学有限公司 用于靶核酸测序的方法和组合物
EP3212808B1 (de) 2014-10-30 2022-03-02 Personalis, Inc. Verfahren zur verwendung von mosaizismus in nukleinsäuren, die distal zu ihrem ursprung entnommen wurden
WO2016066586A1 (en) 2014-10-31 2016-05-06 Illumina Cambridge Limited Novel polymers and dna copolymer coatings
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
CN111024936A (zh) 2014-11-05 2020-04-17 纳迈达斯生物科技中心 用于增强成像的金属复合物
GB201419731D0 (en) 2014-11-05 2014-12-17 Illumina Cambridge Ltd Sequencing from multiple primers to increase data rate and density
CN107208091A (zh) 2014-11-11 2017-09-26 雅培分子公司 杂交探针和方法
CA2967351A1 (en) 2014-11-11 2016-05-19 Illumina, Inc. Polynucleotide amplification using crispr-cas systems
US10246701B2 (en) 2014-11-14 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture
WO2016081712A1 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Bigdatabio, Llc Systems and methods for genomic manipulations and analysis
US10233490B2 (en) 2014-11-21 2019-03-19 Metabiotech Corporation Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations
AU2015353581A1 (en) 2014-11-25 2017-06-15 Adaptive Biotechnologies Corporation Characterization of adaptive immune response to vaccination or infection using immune repertoire sequencing
EP3227461A1 (de) 2014-12-05 2017-10-11 Amyris, Inc. Hochdurchsatz-sequenzierung von polynukleotiden
CA3010579A1 (en) 2015-01-06 2016-07-14 Good Start Genetics, Inc. Screening for structural variants
BR112017014902A2 (pt) 2015-01-12 2018-03-13 10X Genomics Inc processos e sistemas para a preparação de bibliotecas de sequenciamento de ácido nucleico e bibliotecas preparadas usando os mesmos
CA2968417A1 (en) 2015-01-13 2016-07-21 10X Genomics, Inc. Systems and methods for visualizing structural variation and phasing information
CA2975855A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Compositions and methods for synthetic gene assembly
CA2975852A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
EP3256606B1 (de) 2015-02-09 2019-05-22 10X Genomics, Inc. Systeme und verfahren zur bestimmung struktureller varianten
AU2016220404B2 (en) 2015-02-17 2021-05-27 Mgi Tech Co., Ltd. DNA sequencing using controlled strand displacement
US10208339B2 (en) 2015-02-19 2019-02-19 Takara Bio Usa, Inc. Systems and methods for whole genome amplification
EP3822361A1 (de) 2015-02-20 2021-05-19 Takara Bio USA, Inc. Verfahren zur schnellen präzisen abgabe, visualisierung und analyse von einzelzellen
EP3262196B1 (de) 2015-02-24 2020-12-09 Adaptive Biotechnologies Corp. Verfahren zur bestimmung des hla-status mittels immunrepertoiresequenzierung
US11274343B2 (en) 2015-02-24 2022-03-15 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for targeted nucleic acid sequence coverage
WO2016137973A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 10X Genomics Inc Partition processing methods and systems
CN112326557A (zh) 2015-03-24 2021-02-05 伊鲁米那股份有限公司 对样品成像用于生物或化学分析的方法、载体组件和系统
ES2846730T3 (es) 2015-03-31 2021-07-29 Illumina Cambridge Ltd Concatemerización en superficie de moldes
EP3277294B1 (de) 2015-04-01 2024-05-15 Adaptive Biotechnologies Corp. Verfahren zur identifizierung von menschlichen kompatiblen t-zell-rezeptoren spezifisch für ein antigen-ziel
EP4119677B1 (de) 2015-04-10 2023-06-28 Spatial Transcriptomics AB Räumlich getrennte multiplex-nukleinsäureanalyse von biologischen proben
EP3283627B1 (de) 2015-04-15 2021-12-01 The General Hospital Corporation Assays der nächsten generation zur sequenzierung der anreicherung lna-basierter mutanten
US9981239B2 (en) 2015-04-21 2018-05-29 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
US11085073B2 (en) 2015-04-24 2021-08-10 Qiagen Gmbh Method for immobilizing a nucleic acid molecule on a solid support
US11220705B2 (en) 2015-04-24 2022-01-11 Qiagen Gmbh Method for immobilizing a nucleic acid molecule on solid support
AU2016252998B2 (en) * 2015-04-24 2021-11-04 Atila Biosystems Incorporated Amplification with primers of limited nucleotide composition
US10844428B2 (en) 2015-04-28 2020-11-24 Illumina, Inc. Error suppression in sequenced DNA fragments using redundant reads with unique molecular indices (UMIS)
WO2016183106A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
KR102333255B1 (ko) 2015-05-11 2021-12-01 일루미나, 인코포레이티드 치료제의 발견 및 분석을 위한 플랫폼
EP3298168A4 (de) * 2015-05-18 2019-02-20 10X Genomics, Inc. Stabilisierte reduktionsmittel und verfahren zu deren verwendung
US10395759B2 (en) * 2015-05-18 2019-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for copy number variant detection
GB201508858D0 (en) 2015-05-22 2015-07-01 Illumina Cambridge Ltd Polymethine compounds with long stokes shifts and their use as fluorescent labels
CA2985545C (en) 2015-05-29 2021-02-09 Illumina Cambridge Limited Enhanced utilization of surface primers in clusters
AU2016271049B9 (en) 2015-05-29 2019-07-18 Illumina, Inc. Sample carrier and assay system for conducting designated reactions
US11274333B2 (en) 2015-05-29 2022-03-15 Molecular Cloning Laboratories (MCLAB) LLC Compositions and methods for preparing sequencing libraries
CN107924121B (zh) 2015-07-07 2021-06-08 亿明达股份有限公司 经由纳米压印的选择性表面图案化
WO2017011538A1 (en) 2015-07-14 2017-01-19 Abbott Molecular Inc. Purification of nucleic acids using copper-titanium oxides
EP3322483A4 (de) 2015-07-14 2019-01-02 Abbott Molecular Inc. Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis von wirkstoffresistenter tuberkulose
WO2017015018A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 Illumina, Inc. Polymer sheets for sequencing applications
US11214829B2 (en) 2015-07-23 2022-01-04 Asuragen, Inc. Methods, compositions, kits, and uses for analysis of nucleic acids comprising repeating A/T-rich segments
IL305561A (en) 2015-07-30 2023-10-01 Illumina Inc Removal of orthogonal blocking of nucleotides
WO2017024138A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Arc Bio, Llc Systems and methods for genomic analysis
WO2017027653A1 (en) 2015-08-11 2017-02-16 The Johns Hopkins University Assaying ovarian cyst fluid
CN108474805A (zh) 2015-08-24 2018-08-31 亿明达股份有限公司 用于生物和化学测定的线路内蓄压器和流量控制系统
EP3344389B1 (de) 2015-09-02 2020-06-10 Illumina Cambridge Limited Verfahren zur reparatur von defekten in einer hydrophobischen oberfläche eines tröpfchen-aktuators
EP4006150A1 (de) 2015-09-09 2022-06-01 QIAGEN GmbH Polymeraseenzym
WO2017044843A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 The General Hospital Corporation Full interrogation of nuclease dsbs and sequencing (find-seq)
CA2998169A1 (en) 2015-09-18 2017-03-23 Twist Bioscience Corporation Oligonucleic acid variant libraries and synthesis thereof
CN108698012A (zh) 2015-09-22 2018-10-23 特韦斯特生物科学公司 用于核酸合成的柔性基底
GB201516987D0 (en) 2015-09-25 2015-11-11 Illumina Cambridge Ltd Polymethine compounds and their use as fluorescent labels
US9850484B2 (en) 2015-09-30 2017-12-26 The General Hospital Corporation Comprehensive in vitro reporting of cleavage events by sequencing (Circle-seq)
US10253352B2 (en) 2015-11-17 2019-04-09 Omniome, Inc. Methods for determining sequence profiles
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
EP3384077A4 (de) 2015-12-01 2019-05-08 Twist Bioscience Corporation Funktionalisierte oberflächen und herstellung davon
CN115369161A (zh) 2015-12-04 2022-11-22 10X 基因组学有限公司 用于核酸分析的方法和组合物
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
KR20180084756A (ko) 2015-12-07 2018-07-25 지머젠 인코포레이티드 코리네박테리움 글루타미컴으로부터의 프로모터
CA3007840C (en) 2015-12-07 2020-09-15 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a htp genomic engineering platform
US10730030B2 (en) 2016-01-08 2020-08-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiple beads per droplet resolution
JP2019508669A (ja) 2016-01-11 2019-03-28 イラミーナ インコーポレーテッド マイクロフルオロメータ、流体システム、およびフローセルラッチクランプモジュールを有する検出装置
CA3013916A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 RGENE, Inc. Multiple ligase compositions, systems, and methods
EP3414341A4 (de) 2016-02-11 2019-10-09 10X Genomics, Inc. Systeme, verfahren und medien zur de-novo-anordnung von ganzen genomsequenzdaten
CN109477127A (zh) 2016-03-14 2019-03-15 R基因股份有限公司 超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶
EP4071250A1 (de) 2016-03-22 2022-10-12 Myriad Women's Health, Inc. Kombinatorisches dna-screening
EP3377226B1 (de) 2016-03-28 2021-02-17 Illumina, Inc. Mikroarrays in mehreren ebenen
WO2017180909A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Nextgen Jane, Inc. Sample collection and preservation devices, systems and methods
WO2017197027A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Illumina, Inc. Polynucleotide enrichment and amplification using argonaute systems
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
US11118233B2 (en) 2016-05-18 2021-09-14 The University Of Chicago BTK mutation and ibrutinib resistance
ES2861478T3 (es) 2016-05-18 2021-10-06 Illumina Inc Estampación de autoensamblado que utiliza superficies hidrófobas estampadas
US11299783B2 (en) 2016-05-27 2022-04-12 Personalis, Inc. Methods and systems for genetic analysis
US11299769B2 (en) 2016-06-06 2022-04-12 Redvault Biosciences, Lp Target reporter constructs and uses thereof
WO2017214557A1 (en) 2016-06-10 2017-12-14 Counsyl, Inc. Nucleic acid sequencing adapters and uses thereof
CN109642252A (zh) 2016-06-17 2019-04-16 加州理工学院 核酸反应及相关方法和组合物
JP2019519241A (ja) 2016-06-30 2019-07-11 ザイマージェン インコーポレイテッド グルコース透過酵素ライブラリーを生成するための方法およびその使用
JP2019519242A (ja) 2016-06-30 2019-07-11 ザイマージェン インコーポレイテッド 細菌ヘモグロビンライブラリーを生成するための方法およびその使用
WO2018013509A1 (en) 2016-07-11 2018-01-18 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Compositions and methods for diagnosing and treating arrhythmias
CN106086203A (zh) * 2016-07-12 2016-11-09 深圳绿倍生态科技有限公司 一种小球藻核酸模板的制备方法及其应用
EP3485032B1 (de) 2016-07-12 2021-02-17 Life Technologies Corporation Zusammensetzungen und verfahren zur detektion von nukleinsäureregionen
EP3487616B1 (de) 2016-07-21 2023-08-09 Takara Bio USA, Inc. Multi-z-bildgebung von wells von multi-well-geräten und flüssigkeitsabgabe in die wells
EP3488002B1 (de) 2016-07-22 2021-03-31 Oregon Health & Science University Einzellige gesamtgenombibliotheken und kombinatorische indexierungsverfahren zur herstellung davon
CN109890198A (zh) 2016-08-22 2019-06-14 拜欧卢米克有限公司 种子处理系统、装置和方法
KR102212257B1 (ko) 2016-08-22 2021-02-04 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 드 노보 합성된 핵산 라이브러리
WO2018042251A1 (en) 2016-08-29 2018-03-08 Oslo Universitetssykehus Hf Chip-seq assays
US10417457B2 (en) 2016-09-21 2019-09-17 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
US10428325B1 (en) 2016-09-21 2019-10-01 Adaptive Biotechnologies Corporation Identification of antigen-specific B cell receptors
WO2018064116A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Illumina, Inc. Methods and systems for data compression
US10385214B2 (en) 2016-09-30 2019-08-20 Illumina Cambridge Limited Fluorescent dyes and their uses as biomarkers
CN109688817B (zh) * 2016-10-03 2022-02-22 Illumina公司 胺和肼的荧光检测及其分析方法
US11485996B2 (en) 2016-10-04 2022-11-01 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
IL290157B2 (en) 2016-10-14 2023-09-01 Illumina Inc cartridge kit
CA3044231A1 (en) 2016-11-16 2018-05-24 Illumina, Inc. Validation methods and systems for sequence variant calls
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
US10907274B2 (en) 2016-12-16 2021-02-02 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
US11021738B2 (en) 2016-12-19 2021-06-01 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet tagging contiguity preserved tagmented DNA
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CN109476674B (zh) 2016-12-22 2021-12-10 伊鲁米纳剑桥有限公司 香豆素化合物及其作为荧光标记物的用途
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
HUE059673T2 (hu) 2017-01-04 2022-12-28 Mgi Tech Co Ltd Nukleinsav-szekvenálás affinitási reagensek felhasználásával
GB201704754D0 (en) 2017-01-05 2017-05-10 Illumina Inc Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
JP7051900B2 (ja) 2017-01-18 2022-04-11 イルミナ インコーポレイテッド 不均一分子長を有するユニーク分子インデックスセットの生成およびエラー補正のための方法およびシステム
EP4029939B1 (de) 2017-01-30 2023-06-28 10X Genomics, Inc. Verfahren und systeme für eine einzelzellbarcodierung auf tröpfchenbasis
EP3354746B1 (de) 2017-01-30 2019-05-29 Gregor Mendel Institute of Molecular Plant Biology GmbH Neuartige spike-in-oligonukleotide zur normalisierung von sequenzdaten
US10752946B2 (en) 2017-01-31 2020-08-25 Myriad Women's Health, Inc. Methods and compositions for enrichment of target polynucleotides
WO2018144216A1 (en) 2017-01-31 2018-08-09 Counsyl, Inc. Methods and compositions for enrichment of target polynucleotides
US10995333B2 (en) 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
WO2018148724A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from pyrococcus furiosus
WO2018148727A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from 9°n
WO2018148723A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from pyrococcus abyssi
WO2018148726A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from phage t4
US20200002689A1 (en) 2017-02-13 2020-01-02 Qiagen Sciences, Llc Polymerase enzyme from 9°n
US11492666B2 (en) 2017-02-15 2022-11-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Distinguishing sequences by detecting polymerase dissociation
US11550939B2 (en) 2017-02-22 2023-01-10 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage using enzymatic bioencryption
US10894959B2 (en) 2017-03-15 2021-01-19 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
WO2018175399A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Universal hairpin primers
WO2018183942A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Grail, Inc. Improved library preparation and use thereof for sequencing-based error correction and/or variant identification
EP3607087A4 (de) 2017-04-04 2020-12-30 Omniome, Inc. Fluidische vorrichtung und verfahren für chemische und biologische reaktionen
FI3872187T3 (fi) 2017-04-23 2022-12-15 Koostumuksia ja menetelmiä näytteiden identifioinnin parantamiseksi indeksoiduissa nukleiinihappokirjastoissa
ES2937929T3 (es) 2017-04-23 2023-04-03 Illumina Inc Composiciones y métodos para mejorar la identificación de muestras en bibliotecas de ácido nucleico indexadas
US10975430B2 (en) 2017-04-23 2021-04-13 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
CN110785492B (zh) 2017-04-23 2024-04-30 伊鲁米纳剑桥有限公司 用于改进编索引的核酸文库中的样品鉴定的组合物和方法
US10161003B2 (en) 2017-04-25 2018-12-25 Omniome, Inc. Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency
SG11201909697TA (en) 2017-05-01 2019-11-28 Illumina Inc Optimal index sequences for multiplex massively parallel sequencing
EP3622089A1 (de) 2017-05-08 2020-03-18 Illumina, Inc. Universelle kurzadapter zum indizieren von polynukleotidproben
WO2018213803A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 Neon Therapeutics, Inc. Immunogenic neoantigen identification
CA3061731A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 Zymergen Inc. Genomic engineering of biosynthetic pathways leading to increased nadph
WO2018213774A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 10X Genomics, Inc. Systems and methods for analyzing datasets
US20180340169A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
SG11201901822QA (en) 2017-05-26 2019-03-28 10X Genomics Inc Single cell analysis of transposase accessible chromatin
CN110719956A (zh) 2017-06-06 2020-01-21 齐默尔根公司 用于改良真菌菌株的高通量基因组工程改造平台
JP7350659B2 (ja) 2017-06-06 2023-09-26 ザイマージェン インコーポレイテッド Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａの改良のためのハイスループット（ＨＴＰ）ゲノム操作プラットフォーム
US20200102554A1 (en) 2017-06-06 2020-04-02 Zymergen Inc. High throughput transposon mutagenesis
CA3064612A1 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Zymergen Inc. A htp genomic engineering platform for improving escherichia coli
CN110997932B (zh) 2017-06-07 2024-06-04 俄勒冈健康科学大学 用于甲基化测序的单细胞全基因组文库
EP3634992B1 (de) 2017-06-08 2024-03-27 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur identifizierung von epitopen
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
EP3638782A4 (de) 2017-06-12 2021-03-17 Twist Bioscience Corporation Verfahren für nahtlose nukleinsäureanordnung
WO2018236918A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. MDA USING A BALL OLIGONUCLEOTIDE
EP3645745B1 (de) 2017-06-26 2023-08-30 Universität für Bodenkultur Wien Neue biomarker zur detektion von seneszenten zellen
GB201711219D0 (en) 2017-07-12 2017-08-23 Illumina Cambridge Ltd Short pendant arm linkers for nucleotides in sequencing applications
WO2019018366A1 (en) 2017-07-18 2019-01-24 Omniome, Inc. METHOD OF CHEMICAL MODIFICATION OF PLASTIC SURFACES
EP3662482A1 (de) 2017-07-31 2020-06-10 Illumina Inc. Sequenzierungssystem mit multiplexierter aggregation biologischer proben
KR102480894B1 (ko) 2017-08-01 2022-12-23 일루미나, 인코포레이티드 뉴클레오티드 서열분석용 하이드로겔 비드
SG11201911869XA (en) 2017-08-01 2020-01-30 Illumina Inc Spatial indexing of genetic material and library preparation using hydrogel beads and flow cells
HUE061474T2 (hu) * 2017-08-01 2023-07-28 Mgi Tech Co Ltd Nukleinsav-szekvenálási eljárás
US11739375B2 (en) 2017-08-11 2023-08-29 Atila Biosystems Incorporated Digital amplification with primers of limited nucleotide composition
AU2018317826B2 (en) 2017-08-15 2022-11-24 Pacific Biosciences Of California, Inc. Scanning apparatus and methods useful for detection of chemical and biological analytes
WO2019038594A2 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Biolumic Limited TRANSGENIC PLANTS WITH HIGH GROWTH AND HIGH RUSTICITY
CN111566125A (zh) 2017-09-11 2020-08-21 特韦斯特生物科学公司 Gpcr结合蛋白及其合成
US11447818B2 (en) 2017-09-15 2022-09-20 Illumina, Inc. Universal short adapters with variable length non-random unique molecular identifiers
KR20200057024A (ko) 2017-09-20 2020-05-25 가던트 헬쓰, 인크. 체세포 및 생식세포계열 변이체를 구별하기 위한 방법 및 시스템
US10837047B2 (en) 2017-10-04 2020-11-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
WO2019071164A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 The University Of Chicago SCREENING OF LYMPHOCYTES T FOR ANTIGENS SPECIFIC TO CANCER
GB201716931D0 (en) 2017-10-16 2017-11-29 Illumina Cambridge Ltd New fluorescent compounds and their use as biomarkers
SG11201912745WA (en) 2017-10-16 2020-01-30 Illumina Inc Deep learning-based splice site classification
KR102416048B1 (ko) 2017-10-16 2022-07-04 일루미나, 인코포레이티드 변이체 분류를 위한 심층 컨볼루션 신경망
CA3079411C (en) 2017-10-19 2023-12-05 Omniome, Inc. Simultaneous background reduction and complex stabilization in binding assay workflows
US11099202B2 (en) 2017-10-20 2021-08-24 Tecan Genomics, Inc. Reagent delivery system
KR20240024357A (ko) 2017-10-20 2024-02-23 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 가열된 나노웰
WO2019084043A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS
EP3700672B1 (de) 2017-10-27 2022-12-28 10X Genomics, Inc. Verfahren zur probenvorbereitung und -analyse
US10907205B2 (en) 2017-11-02 2021-02-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Transposase-based genomic analysis
EP3513280A4 (de) 2017-11-13 2020-07-22 The Multiple Myeloma Research Foundation, Inc. Integrierte, molekulare, omics-, immuntherapeutische, metabolische, epigenetische und klinische datenbank
CN111051523B (zh) 2017-11-15 2024-03-19 10X基因组学有限公司 功能化凝胶珠
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
CA3083183A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating cancer
US11254980B1 (en) 2017-11-29 2022-02-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements
WO2019108851A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis
US11701656B2 (en) 2018-01-02 2023-07-18 The Regents Of The University Of Michigan Multi-droplet capture
US10936953B2 (en) 2018-01-04 2021-03-02 Twist Bioscience Corporation DNA-based digital information storage with sidewall electrodes
US11561196B2 (en) 2018-01-08 2023-01-24 Illumina, Inc. Systems and devices for high-throughput sequencing with semiconductor-based detection
KR102370055B1 (ko) 2018-01-08 2022-03-03 일루미나, 인코포레이티드 반도체-기반 검출을 사용하는 고-처리율 서열분석용 시스템 및 디바이스
EP3901833A1 (de) 2018-01-15 2021-10-27 Illumina, Inc. Auf tiefenlernen basierender variantenklassifikator
CN111801937B8 (zh) 2018-01-30 2022-10-14 瑞巴斯生物系统 用于使用结构化照射检测颗粒的方法和系统
WO2019152543A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Dovetail Genomics, Llc Sample prep for dna linkage recovery
EP3746552B1 (de) 2018-01-31 2023-12-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur dekonvolution von partitionsbarcodes
EP3752832A1 (de) 2018-02-12 2020-12-23 10X Genomics, Inc. Verfahren zur charakterisierung mehrerer analyten aus einzelnen zellen oder zellpopulationen
WO2019160820A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Illumina, Inc. Dna sequencing using hydrogel beads
US11639928B2 (en) 2018-02-22 2023-05-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
JP2021518128A (ja) 2018-03-20 2021-08-02 ザイマージェン インコーポレイテッド チャイニーズハムスター卵巣細胞の遺伝子操作のためのｈｔｐプラットフォーム
EP3768857A1 (de) 2018-03-22 2021-01-27 Illumina, Inc. Herstellung von nukleinsäurebibliotheken aus rna und dna
KR102383799B1 (ko) 2018-04-02 2022-04-05 일루미나, 인코포레이티드 서열-기반의 유전 검사용 대조군을 제조하기 위한 조성물 및 방법
EP3775272A4 (de) 2018-04-02 2021-12-29 Progenity, Inc. Verfahren, systeme und zusammensetzungen zum zählen von nukleinsäuremolekülen
SG11202009889VA (en) 2018-04-06 2020-11-27 10X Genomics Inc Systems and methods for quality control in single cell processing
EP3553182A1 (de) 2018-04-11 2019-10-16 Université de Bourgogne Verfahren zum nachweis von somatischen genetischen anomalien, kombination von fangsonden und nachweiskit
WO2019200338A1 (en) 2018-04-12 2019-10-17 Illumina, Inc. Variant classifier based on deep neural networks
US11512002B2 (en) 2018-04-18 2022-11-29 University Of Virginia Patent Foundation Silica materials and methods of making thereof
US20190338352A1 (en) 2018-04-19 2019-11-07 Omniome, Inc. Accuracy of base calls in nucleic acid sequencing methods
BR112019028109A2 (pt) 2018-04-20 2020-07-28 Illumina, Inc. métodos de encapsular células individuais, as células encapsuladas e seus usos
JP2021521820A (ja) 2018-04-26 2021-08-30 オムニオム インコーポレイテッドＯｍｎｉｏｍｅ， Ｉｎｃ． 核酸−ヌクレオチド−ポリメラーゼ複合体を安定化するための方法及び組成物
US20210239700A1 (en) 2018-05-04 2021-08-05 Abbott Laboratories Hbv diagnostic, prognostic, and therapeutic methods and products
EP4306532A3 (de) 2018-05-15 2024-04-10 Illumina, Inc. Chemische spaltung und entschützung
KR102640255B1 (ko) 2018-05-17 2024-02-27 일루미나, 인코포레이티드 감소된 증폭 편향을 갖는 고속-대량 단일 세포 서열분석
EP3814497A4 (de) 2018-05-18 2022-03-02 Twist Bioscience Corporation Polynukleotide, reagenzien und verfahren zur nukleinsäurehybridisierung
US10801064B2 (en) 2018-05-31 2020-10-13 Personalis, Inc. Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples
US11814750B2 (en) 2018-05-31 2023-11-14 Personalis, Inc. Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples
AU2019276719A1 (en) 2018-05-31 2020-11-26 Pacific Biosciences Of California, Inc. Increased signal to noise in nucleic acid sequencing
KR102393414B1 (ko) 2018-06-04 2022-05-02 일루미나, 인코포레이티드 고속 대량 단일 세포 전사체 라이브러리 그리고 이의 제조 및 사용 방법
EP3802878A1 (de) 2018-06-04 2021-04-14 Guardant Health, Inc. Verfahren und systeme zur bestimmung des zellulären ursprungs zellfreier nukleinsäuren
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
US11525159B2 (en) 2018-07-03 2022-12-13 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
CN110684829A (zh) * 2018-07-05 2020-01-14 深圳华大智造科技有限公司 一种高通量的单细胞转录组测序方法和试剂盒
US20200251183A1 (en) 2018-07-11 2020-08-06 Illumina, Inc. Deep Learning-Based Framework for Identifying Sequence Patterns that Cause Sequence-Specific Errors (SSEs)
CN112752854A (zh) 2018-07-23 2021-05-04 夸登特健康公司 用于通过肿瘤分数和覆盖率调整肿瘤突变负荷的方法和系统
CA3107165A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Omniome, Inc. Serial formation of ternary complex species
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
KR20210043634A (ko) 2018-08-15 2021-04-21 일루미나, 인코포레이티드 라이브러리 인리치먼트를 개선하기 위한 조성물 및 방법
EP4249651A3 (de) 2018-08-20 2023-10-18 Bio-Rad Laboratories, Inc. Generierung von nukleotidsequenzen durch barcode-kügelchen-co-lokalisierung in partitionen
CN113286893A (zh) 2018-08-28 2021-08-20 10X基因组学股份有限公司 生成阵列的方法
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
CN112970068A (zh) 2018-08-30 2021-06-15 夸登特健康公司 用于检测样品之间的污染的方法和系统
AU2019328344A1 (en) 2018-08-31 2021-04-08 Guardant Health, Inc. Microsatellite instability detection in cell-free DNA
EP3847276A2 (de) 2018-09-04 2021-07-14 Guardant Health, Inc. Verfahren und systeme zur detektion von allelischem ungleichgewicht in zellfreien nukleinsäureproben
PL3814533T3 (pl) 2018-09-20 2022-01-31 Tamirna Gmbh Sygnatury mikro-rna do przewidywania dysfunkcji wątroby
SG10202108013QA (en) 2018-10-15 2021-09-29 Illumina Inc Deep learning-based techniques for pre-training deep convolutional neural networks
MX2021003768A (es) 2018-10-25 2021-05-27 Illumina Inc Metodos y composiciones para identificar ligandos en arreglos usando indices y codigos de barra.
SG11202102703VA (en) 2018-10-26 2021-04-29 Illumina Inc Modulating polymer beads for dna processing
WO2020092807A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Guardant Health, Inc. Methods, compositions and systems for calibrating epigenetic partitioning assays
US10876148B2 (en) 2018-11-14 2020-12-29 Element Biosciences, Inc. De novo surface preparation and uses thereof
US10704094B1 (en) 2018-11-14 2020-07-07 Element Biosciences, Inc. Multipart reagents having increased avidity for polymerase binding
US10768173B1 (en) * 2019-09-06 2020-09-08 Element Biosciences, Inc. Multivalent binding composition for nucleic acid analysis
WO2020101795A1 (en) 2018-11-15 2020-05-22 Omniome, Inc. Electronic detection of nucleic acid structure
CN112867801A (zh) 2018-11-30 2021-05-28 Illumina公司 使用单一测定分析多种分析物
CN211311438U (zh) 2018-12-04 2020-08-21 欧姆尼欧美公司 流动池
WO2020114918A1 (en) 2018-12-05 2020-06-11 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for cluster generation by bridge amplification
CN113366120B (zh) * 2018-12-07 2024-05-14 深圳华大生命科学研究院 纳米孔测序方法
US11459607B1 (en) 2018-12-10 2022-10-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes
KR20210103931A (ko) 2018-12-14 2021-08-24 일루미나 케임브리지 리미티드 서열분석 동안 비표지된 뉴클레오타이드에 의한 페이싱 감소
SG11202012758WA (en) 2018-12-17 2021-01-28 Illumina Cambridge Ltd Primer oligonucleotide for sequencing
EP3899040A1 (de) 2018-12-17 2021-10-27 Illumina Cambridge Limited Zusammensetzungen zur verwendung in der polynukleotidsequenzierung
SG11202012807YA (en) 2018-12-18 2021-01-28 Illumina Cambridge Ltd Methods and compositions for paired end sequencing using a single surface primer
PT3899037T (pt) 2018-12-19 2023-12-22 Illumina Inc Métodos para melhorar a prioridade de clonalidade de agrupamento polinucleotídico
JP2022514010A (ja) 2018-12-20 2022-02-09 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド 核酸分子の回収率を改善するための方法、組成物、およびシステム
US11041199B2 (en) 2018-12-20 2021-06-22 Omniome, Inc. Temperature control for analysis of nucleic acids and other analytes
US11293061B2 (en) 2018-12-26 2022-04-05 Illumina Cambridge Limited Sequencing methods using nucleotides with 3′ AOM blocking group
US20220081714A1 (en) 2019-01-04 2022-03-17 Northwestern University Storing temporal data into dna
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
US20220112557A1 (en) 2019-01-10 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. System and methods for monitoring adoptive cell therapy clonality and persistence
EP3918089A1 (de) 2019-01-31 2021-12-08 Guardant Health, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur isolierung zellfreier dna
US11467153B2 (en) 2019-02-12 2022-10-11 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
SG11202108788TA (en) 2019-02-12 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for processing nucleic acid molecules
US11499189B2 (en) 2019-02-14 2022-11-15 Pacific Biosciences Of California, Inc. Mitigating adverse impacts of detection systems on nucleic acids and other biological analytes
US11680950B2 (en) 2019-02-20 2023-06-20 Pacific Biosciences Of California, Inc. Scanning apparatus and methods for detecting chemical and biological analytes
US11655499B1 (en) 2019-02-25 2023-05-23 10X Genomics, Inc. Detection of sequence elements in nucleic acid molecules
US11492727B2 (en) 2019-02-26 2022-11-08 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for GLP1 receptor
SG11202109283UA (en) 2019-02-26 2021-09-29 Twist Bioscience Corp Variant nucleic acid libraries for antibody optimization
WO2020176659A1 (en) 2019-02-27 2020-09-03 Guardant Health, Inc. Methods and systems for determining the cellular origin of cell-free dna
NL2023327B1 (en) 2019-03-01 2020-09-17 Illumina Inc Multiplexed fluorescent detection of analytes
WO2020178231A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Illumina, Inc. Multiplexed fluorescent detection of analytes
BR112021006234A2 (pt) 2019-03-01 2021-09-28 Illumina, Inc. Bibliotecas de células únicas e núcleos únicos de alto rendimento e métodos de preparo e uso
US20200277670A1 (en) 2019-03-01 2020-09-03 Illumina Cambridge Limited Tertiary amine substituted coumarin compounds and uses as fluorescent labels
CA3103900A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Illumina Cambridge Limited Exocyclic amine substituted coumarin compounds and their uses as fluorescent labels
SG11202111242PA (en) 2019-03-11 2021-11-29 10X Genomics Inc Systems and methods for processing optically tagged beads
WO2020191387A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based base calling
US11783917B2 (en) 2019-03-21 2023-10-10 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based base calling
NL2023310B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Training data generation for artificial intelligence-based sequencing
NL2023316B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Artificial intelligence-based sequencing
NL2023311B9 (en) 2019-03-21 2021-03-12 Illumina Inc Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata
US11210554B2 (en) 2019-03-21 2021-12-28 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata
US11421271B2 (en) 2019-03-28 2022-08-23 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for nucleic acid sequencing using photoswitchable labels
WO2020206170A1 (en) 2019-04-02 2020-10-08 Progenity, Inc. Methods, systems, and compositions for counting nucleic acid molecules
US11609208B2 (en) 2019-04-12 2023-03-21 Western Digital Technologies, Inc. Devices and methods for molecule detection based on thermal stabilities of magnetic nanoparticles
US11327073B2 (en) 2019-04-12 2022-05-10 Western Digital Technologies, Inc. Thermal sensor array for molecule detection and related detection schemes
US11112468B2 (en) 2019-04-12 2021-09-07 Western Digital Technologies, Inc. Magnetoresistive sensor array for molecule detection and related detection schemes
US11579217B2 (en) 2019-04-12 2023-02-14 Western Digital Technologies, Inc. Devices and methods for frequency- and phase-based detection of magnetically-labeled molecules using spin torque oscillator (STO) sensors
US11738336B2 (en) 2019-04-12 2023-08-29 Western Digital Technologies, Inc. Spin torque oscillator (STO) sensors used in nucleic acid sequencing arrays and detection schemes for nucleic acid sequencing
US11593649B2 (en) 2019-05-16 2023-02-28 Illumina, Inc. Base calling using convolutions
US11423306B2 (en) 2019-05-16 2022-08-23 Illumina, Inc. Systems and devices for characterization and performance analysis of pixel-based sequencing
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
US11939636B2 (en) 2019-05-31 2024-03-26 Guardant Health, Inc. Methods and systems for improving patient monitoring after surgery
US11644406B2 (en) 2019-06-11 2023-05-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Calibrated focus sensing
EP3987019A4 (de) 2019-06-21 2023-04-19 Twist Bioscience Corporation Barcode-basierte nukleinsäuresequenzanordnung
EP3997223A1 (de) 2019-07-12 2022-05-18 Illumina Cambridge Limited Zusammensetzungen und verfahren zur herstellung von nukleinsäuresequenzierungsbibliotheken unter verwendung von auf einem festen träger immobilisiertem crispr/cas9
US11377655B2 (en) 2019-07-16 2022-07-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Synthetic nucleic acids having non-natural structures
US10656368B1 (en) 2019-07-24 2020-05-19 Omniome, Inc. Method and system for biological imaging using a wide field objective lens
WO2021050681A1 (en) 2019-09-10 2021-03-18 Omniome, Inc. Reversible modification of nucleotides
US11208682B2 (en) 2019-09-13 2021-12-28 Western Digital Technologies, Inc. Enhanced optical detection for nucleic acid sequencing using thermally-dependent fluorophore tags
US20210087613A1 (en) 2019-09-20 2021-03-25 Illumina, Inc. Methods and compositions for identifying ligands on arrays using indexes and barcodes
US11287422B2 (en) 2019-09-23 2022-03-29 Element Biosciences, Inc. Multivalent binding composition for nucleic acid analysis
WO2021061694A1 (en) 2019-09-23 2021-04-01 Zymergen Inc. Method for counterselection in microorganisms
EP3798319A1 (de) 2019-09-30 2021-03-31 Diagenode S.A. Verbessertes diagnose- und/oder sequenzierungsverfahren und kit
WO2021076152A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 Omniome, Inc. Methods and compositions for capping nucleic acids
ES2938896T3 (es) 2019-10-21 2023-04-17 Univ Freiburg Albert Ludwigs Un ensayo in vitro verdaderamente imparcial para perfilar la actividad fuera de objetivo de una o más nucleasas programables específicas de objetivo en células (ABNOBA-SEQ)
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
EP4055185A1 (de) 2019-11-08 2022-09-14 10X Genomics, Inc. Räumlich markierte analytfänger für analyt-multiplexing
US11747329B2 (en) 2019-11-22 2023-09-05 Western Digital Technologies, Inc. Magnetic gradient concentrator/reluctance detector for molecule detection
CN114746560A (zh) 2019-11-26 2022-07-12 夸登特健康公司 改进甲基化多核苷酸结合的方法、组合物和系统
CN114829369A (zh) 2019-11-27 2022-07-29 伊鲁米纳剑桥有限公司 含环辛四烯的染料和组合物
JP2023508792A (ja) 2019-12-19 2023-03-06 イルミナ インコーポレイテッド ハイスループット単一細胞ライブラリー、並びに製造方法及び使用方法
US11498078B2 (en) 2019-12-23 2022-11-15 Singular Genomics Systems, Inc. Flow cell receiver and methods of use
EP3891300B1 (de) 2019-12-23 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Verfahren zur räumlichen analyse mittels rna-template-ligation
US20210189483A1 (en) 2019-12-23 2021-06-24 Mgi Tech Co. Ltd. Controlled strand-displacement for paired end sequencing
US11747262B2 (en) 2019-12-23 2023-09-05 Singular Genomics Systems, Inc. Flow cell carrier and methods of use
CA3166578A1 (en) 2019-12-31 2021-07-08 Singular Genomics Systems, Inc. Polynucleotide barcodes for long read sequencing
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
WO2021152586A1 (en) 2020-01-30 2021-08-05 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of analyzing microbiome, immunoglobulin profile and physiological state
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
EP4100161A1 (de) 2020-02-04 2022-12-14 Pacific Biosciences of California, Inc. Durchflusszellen und verfahren zu deren herstellung und verwendung
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
IL294909A (en) 2020-02-13 2022-09-01 Zymergen Inc A metagenomic library and natural product discovery platform
WO2021162028A1 (ja) * 2020-02-14 2021-08-19 東レ株式会社 バイオチップの製造方法
AU2021224871A1 (en) 2020-02-20 2022-09-08 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based many-to-many base calling
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
CA3145466A1 (en) 2020-03-09 2021-09-16 Illumina, Inc. Improvements in nucleic acid sequencing
WO2021180733A1 (en) 2020-03-09 2021-09-16 Illumina, Inc. Methods for sequencing polynucleotides
WO2021185320A1 (en) 2020-03-18 2021-09-23 Mgi Tech Co., Ltd. Restoring phase in massively parallel sequencing
WO2021214766A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of diagnosing viral infections and vaccines thereto
ES2965354T3 (es) 2020-04-22 2024-04-12 10X Genomics Inc Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana
CA3177127A1 (en) 2020-04-30 2021-11-04 Guardant Health, Inc. Methods for sequence determination using partitioned nucleic acids
US20230183798A1 (en) 2020-05-05 2023-06-15 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for modifying polymerase-nucleic acid complexes
US20230203592A1 (en) 2020-05-05 2023-06-29 Akershus Universitetssykehus Hf Compositions and methods for characterizing bowel cancer
US11188778B1 (en) 2020-05-05 2021-11-30 Illumina, Inc. Equalization-based image processing and spatial crosstalk attenuator
US20210355518A1 (en) 2020-05-12 2021-11-18 Illumina, Inc. Generating nucleic acids with modified bases using recombinant terminal deoxynucleotidyl transferase
US11851700B1 (en) 2020-05-13 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules
US20220025468A1 (en) 2020-05-14 2022-01-27 Guardant Health, Inc. Homologous recombination repair deficiency detection
WO2021237087A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
EP4153775A1 (de) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Simultane räumlich-zeitliche messung der genexpression und der zellaktivität
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
CN116249785A (zh) 2020-06-02 2023-06-09 10X基因组学有限公司 用于抗原-受体的空间转录组学
AU2021283174A1 (en) 2020-06-02 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
EP4162074B1 (de) 2020-06-08 2024-04-24 10X Genomics, Inc. Verfahren zur bestimmung eines chirurgischen randes und verfahren zur verwendung davon
WO2021252617A1 (en) 2020-06-09 2021-12-16 Illumina, Inc. Methods for increasing yield of sequencing libraries
EP4165207A1 (de) 2020-06-10 2023-04-19 10X Genomics, Inc. Verfahren zur bestimmung einer position eines analyten in einer biologischen probe
BR112022026056A2 (pt) 2020-06-22 2023-03-07 Illumina Cambridge Ltd Nucleosídeos e nucleotídeos com grupo bloqueador 3? acetal
AU2021294334A1 (en) 2020-06-25 2023-02-02 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of DNA methylation
JP2023532231A (ja) 2020-06-30 2023-07-27 イルミナ インコーポレイテッド 傷なしｄｎａを生成するための触媒的に制御された合成による配列決定
CA3182091A1 (en) 2020-07-02 2022-01-06 Yir-Shyuan WU A method to calibrate nucleic acid library seeding efficiency in flowcells
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
WO2022010965A1 (en) 2020-07-08 2022-01-13 Illumina, Inc. Beads as transposome carriers
WO2023282916A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Guardant Health, Inc. Methods of detecting genomic rearrangements using cell free nucleic acids
WO2022015600A2 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Singular Genomics Systems, Inc. Methods of sequencing complementary polynucleotides
US11981964B2 (en) 2020-07-28 2024-05-14 Illumina Cambridge Limited Substituted coumarin dyes and uses as fluorescent labels
WO2022026761A1 (en) 2020-07-30 2022-02-03 Guardant Health, Inc. Methods for isolating cell-free dna
CA3190588A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Illumina, Inc. Preparation of rna and dna sequencing libraries using bead-linked transposomes
WO2022029449A1 (en) 2020-08-07 2022-02-10 Oxford Nanopore Technologies Limited Methods of identifying nucleic acid barcodes
CN116323971A (zh) 2020-08-18 2023-06-23 Illumina公司 核酸的序列特异性靶向转座和选择以及分选
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
EP4205126A1 (de) 2020-08-25 2023-07-05 Guardant Health, Inc. Verfahren und systeme zur vorhersage des ursprungs einer variante
MX2023001400A (es) 2020-09-11 2023-04-25 Illumina Cambridge Ltd Metodos para enriquecer una secuencia diana a partir de una genoteca de secuenciación usando adaptadores de horquilla.
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
CA3193183A1 (en) 2020-09-30 2022-04-07 Andrew Kennedy Compositions and methods for analyzing dna using partitioning and a methylation-dependent nuclease
MX2023004461A (es) 2020-10-21 2023-05-03 Illumina Inc Plantillas de secuenciacion que comprenden multiples insertos y composiciones y metodos para mejorar la productividad de secuenciacion.
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
US20220195516A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Methods, systems and compositions for nucleic acid sequencing
EP4121555A1 (de) 2020-12-21 2023-01-25 10X Genomics, Inc. Verfahren, zusammensetzungen und systeme zur erfassung von sonden und/oder barcodes
US20220195518A1 (en) 2020-12-22 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for nucleic acid sequencing
WO2022140629A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Guardant Health, Inc. Methods and systems for analyzing methylated polynucleotides
CN117043352A (zh) 2021-01-29 2023-11-10 伊鲁米纳公司 使用多核苷酸改善流通池的接种效率的方法、组合物和试剂盒
CN116829731A (zh) 2021-02-04 2023-09-29 Illumina公司 转座体结合珠粒上的长带索引连接的读段生成
WO2022170212A1 (en) 2021-02-08 2022-08-11 Singular Genomics Systems, Inc. Methods and compositions for sequencing complementary polynucleotides
US20240043915A1 (en) 2021-02-13 2024-02-08 The General Hospital Corporation Methods and compositions for in situ macromolecule detection and uses thereof
WO2022182682A1 (en) 2021-02-23 2022-09-01 10X Genomics, Inc. Probe-based analysis of nucleic acids and proteins
WO2022187862A1 (en) 2021-03-05 2022-09-09 Guardant Health, Inc. Methods and related aspects for analyzing molecular response
WO2022192889A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Guardant Health, Inc. Detecting the presence of a tumor based on off-target polynucleotide sequencing data
WO2022197754A1 (en) 2021-03-16 2022-09-22 Illumina Software, Inc. Neural network parameter quantization for base calling
AU2022238446A1 (en) 2021-03-18 2023-09-07 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
US20220333178A1 (en) 2021-03-22 2022-10-20 Illumina Cambridge Limited Methods for improving nucleic acid cluster clonality
EP4314328A1 (de) 2021-03-29 2024-02-07 Illumina, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur beurteilung von dna-schäden in einer bibliothek und zur normalisierung des amplicongrössenbias
MX2023010814A (es) 2021-03-29 2023-09-27 Illumina Inc Metodos mejorados de preparacion de genotecas.
MX2023010495A (es) 2021-03-30 2023-09-18 Illumina Inc Metodos mejorados de preparacion de genoteca y adn complementarios isotermicos.
CA3211172A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Illumina, Inc. Methods of preparing directional tagmentation sequencing libraries using transposon-based technology with unique molecular identifiers for error correction
US20220336054A1 (en) 2021-04-15 2022-10-20 Illumina, Inc. Deep Convolutional Neural Networks to Predict Variant Pathogenicity using Three-Dimensional (3D) Protein Structures
JP2024519372A (ja) 2021-05-20 2024-05-10 イルミナ インコーポレイテッド 合成によって配列決定するための組成物及び方法
EP4355476A1 (de) 2021-06-15 2024-04-24 Illumina, Inc. Hydrogelfreie oberflächenfunktionalisierung zur sequenzierung
US11859241B2 (en) 2021-06-17 2024-01-02 Element Biosciences, Inc. Compositions and methods for pairwise sequencing
US11535892B1 (en) 2021-06-17 2022-12-27 Element Biosciences, Inc. Compositions and methods for pairwise sequencing
US20220411864A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Illumina, Inc. Compositions, methods, kits, cartridges, and systems for sequencing reagents
EP4364150A1 (de) 2021-06-29 2024-05-08 Illumina, Inc. Selbsterlernter, unter verwendung von organismussequenzen trainierter basisanrufer
WO2023278184A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Illumina, Inc. Methods and systems to correct crosstalk in illumination emitted from reaction sites
WO2023287617A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 Illumina, Inc. Methods and systems for real time extraction of crosstalk in illumination emitted from reaction sites
US11455487B1 (en) 2021-10-26 2022-09-27 Illumina Software, Inc. Intensity extraction and crosstalk attenuation using interpolation and adaptation for base calling
WO2023003757A1 (en) 2021-07-19 2023-01-26 Illumina Software, Inc. Intensity extraction with interpolation and adaptation for base calling
GB202110485D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
GB202110479D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
EP4373965A1 (de) 2021-07-21 2024-05-29 DNAe Diagnostics Limited Verfahren und system mit einer kartusche zur sequenzierung von zielpolynukleotiden
US20230116852A1 (en) 2021-07-23 2023-04-13 Illumina, Inc. Methods for preparing substrate surface for dna sequencing
AU2022319125A1 (en) 2021-07-28 2024-01-18 Illumina, Inc. Quality score calibration of basecalling systems
KR20240035413A (ko) 2021-08-03 2024-03-15 일루미나, 인코포레이티드 다중 염기 호출자 모델을 사용한 염기 호출
EP4196605A1 (de) 2021-09-01 2023-06-21 10X Genomics, Inc. Verfahren, zusammensetzungen und kits zur blockierung einer erfassungssonde auf einer räumlichen anordnung
WO2023035003A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Elegen Corp. Multi-way bead-sorting devices, systems, and methods of use thereof using pressure sources
US20230096386A1 (en) 2021-09-30 2023-03-30 Illumina Cambridge Limited Polynucleotide sequencing
WO2023056328A2 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Illumina, Inc. Solid supports and methods for depleting and/or enriching library fragments prepared from biosamples
WO2023069927A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 Illumina, Inc. Methods for capturing library dna for sequencing
US11753677B2 (en) 2021-11-10 2023-09-12 Encodia, Inc. Methods for barcoding macromolecules in individual cells
WO2023086635A1 (en) 2021-11-15 2023-05-19 Vir Biotechnology, Inc. Virological and molecular surrogates of response to sars-cov-2 neutralizing antibody sotrovimab
CA3223595A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Xiaoyu Ma Hybrid clustering
CA3222829A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Gabriele CANZI Methods for metal directed cleavage of surface-bound polynucleotides
AU2022413263A1 (en) 2021-12-17 2024-01-18 Illumina, Inc. Orthogonal hybridization
CN117940577A (zh) 2021-12-20 2024-04-26 因美纳有限公司 用于化学裂解表面结合的多核苷酸的高碘酸盐组合物和方法
AU2022421156A1 (en) 2021-12-20 2024-01-18 Illumina, Inc. Periodate compositions and methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides
US20230212667A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Illumina Cambridge Limited Methods of nucleic acid sequencing using surface-bound primers
WO2023135485A1 (en) 2022-01-13 2023-07-20 Oslo Universitetssykehus Hf Prostate cancer markers and uses thereof
AU2023208743A1 (en) 2022-01-20 2024-01-04 Illumina, Inc. Methods of detecting methylcytosine and hydroxymethylcytosine by sequencing
WO2023152568A2 (en) 2022-02-10 2023-08-17 Oslo Universitetssykehus Hf Compositions and methods for characterizing lung cancer
EP4341426A2 (de) 2022-03-15 2024-03-27 Illumina, Inc. Gleichzeitige sequenzierung von vorwärts- und rückwärtskomplementsträngen auf separaten polynukleotiden zum nachweis von methylierung
WO2023175021A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Illumina, Inc. Methods of preparing loop fork libraries
AU2023246676A1 (en) 2022-03-28 2024-01-18 Illumina Inc. Labeled avidin and methods for sequencing
WO2023192163A1 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Illumina Cambridge Limited Systems and methods of sequencing polynucleotides
WO2023186872A1 (en) 2022-03-30 2023-10-05 Illumina Cambridge Limited Methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides
AU2023244497A1 (en) 2022-03-31 2024-01-18 Illumina, Inc. Paired-end re-synthesis using blocked p5 primers
WO2023186982A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Illumina, Inc. Compositions and methods for improving sequencing signals
AU2023244351A1 (en) 2022-03-31 2024-01-18 Illumina, Inc. Nucleosides and nucleotides with 3' vinyl blocking group useful in sequencing by synthesis
CA3223722A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Illumina, Inc. Altered cytidine deaminases and methods of use
US20230348967A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Illumina Cambridge Limited Methods and systems for encapsulating lyophilised microspheres
WO2023220602A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Guardant Health, Inc. Detecting degradation based on strand bias
WO2023232829A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Illumina, Inc Compositions and methods for nucleic acid sequencing
US20230392201A1 (en) 2022-06-06 2023-12-07 Element Biosciences, Inc. Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations
WO2024003087A1 (en) 2022-06-28 2024-01-04 Illumina, Inc. Fluorescent dyes containing fused tetracyclic bis-boron heterocycle and uses in sequencing
WO2024039516A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Illumina, Inc. Third dna base pair site-specific dna detection
US20240124916A1 (en) 2022-09-16 2024-04-18 Illumina Cambridge Limited Nanoparticle with polynucleotide binding site and method of making thereof
WO2024061799A1 (en) 2022-09-19 2024-03-28 Illumina, Inc. Deformable polymers comprising immobilised primers
US20240102067A1 (en) 2022-09-26 2024-03-28 Illumina, Inc. Resynthesis Kits and Methods
WO2024073047A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Cytidine deaminases and methods of use in mapping modified cytosine nucleotides
WO2024073043A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Methods of using cpg binding proteins in mapping modified cytosine nucleotides
US20240110234A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Amplification Compositions and Methods
US20240110221A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Methods of modulating clustering kinetics
US20240124914A1 (en) 2022-09-30 2024-04-18 Illumina, Inc. Thermophilic compositions for nucleic acid amplification
US20240124929A1 (en) 2022-09-30 2024-04-18 Illumina, Inc. Mesophilic compositions for nucleic acid amplification
US20240140939A1 (en) 2022-09-30 2024-05-02 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for reducing photo damage during sequencing
WO2024069581A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina Singapore Pte. Ltd. Helicase-cytidine deaminase complexes and methods of use
GB202215624D0 (en) 2022-10-21 2022-12-07 Dnae Diagnostics Ltd Clonal amplification
WO2024107599A1 (en) 2022-11-15 2024-05-23 Guardant Health, Inc. Method of predicting non-small cell lung cancer (nsclc) patient drug response or time until death or cancer progression from circulating tumor dna (ctdna) utilizing signals from both baseline ctdna level and longitudinal change of ctdna level over time
WO2024118903A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Illumina, Inc. Chemoenzymatic correction of false positive uracil transformations
WO2024123917A1 (en) 2022-12-07 2024-06-13 Illumina, Inc. Monoclonal clustering using double stranded dna size exclusion with patterned seeding
WO2024123866A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Illumina, Inc. Nucleosides and nucleotides with 3´ blocking groups and cleavable linkers

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4957858A (en) 1986-04-16 1990-09-18 The Salk Instute For Biological Studies Replicative RNA reporter systems
EP0224126A3 (de) 1985-11-25 1989-02-01 The University of Calgary Kovalent gekoppelte komplementäre Oligodeoxynukleotide zur Verwendung als "Primer Linkers" bei Sequenzierung von Nukleinsäuren
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
CA1340843C (en) 1987-07-31 1999-12-07 J. Lawrence Burg Selective amplification of target polynucleotide sequences
SE8801070D0 (sv) 1988-03-23 1988-03-23 Pharmacia Ab Method for immobilizing a dna sequence on a solid support
US6107023A (en) 1988-06-17 2000-08-22 Genelabs Technologies, Inc. DNA amplification and subtraction techniques
GB8818020D0 (en) 1988-07-28 1988-09-01 Ici Plc Method for amplification of nucleotide sequences
CA2004326A1 (en) 1988-12-23 1990-06-23 Nanibushan Dattagupta Assay of sequences using amplified genes
US5629158A (en) * 1989-03-22 1997-05-13 Cemu Bitecknik Ab Solid phase diagnosis of medical conditions
US5547839A (en) 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
US5800992A (en) * 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
EP0450060A1 (de) 1989-10-26 1991-10-09 Sri International Dns-sequenzierung
CA2036946C (en) 1990-04-06 2001-10-16 Kenneth V. Deugau Indexing linkers
US5326692B1 (en) 1992-05-13 1996-04-30 Molecular Probes Inc Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift
US5645994A (en) * 1990-07-05 1997-07-08 University Of Utah Research Foundation Method and compositions for identification of species in a sample using type II topoisomerase sequences
ATE175997T1 (de) 1991-08-10 1999-02-15 Medical Res Council Behandlung von zellpopulationen
WO1993004199A2 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Scientific Generics Limited Methods of detecting or quantitating nucleic acids and of producing labelled immobilised nucleic acids
EP0543484B1 (de) * 1991-08-30 2001-01-31 Research Development Corporation of Japan Verfahren zur Amplifikation von DNA
EP1382386A3 (de) 1992-02-19 2004-12-01 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Neue Ordnungen für Oligonukleotide und ihr Nutzen zum Sortieren, Isolieren, Sequenzierung und Manipulieren von Nukleinsäuren
CA2140877C (en) * 1992-07-24 2008-11-18 Raymond J. Harris Amplification and detection process
RU2048522C1 (ru) 1992-10-14 1995-11-20 Институт белка РАН Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления
US5436142A (en) * 1992-11-12 1995-07-25 Cold Spring Harbor Laboratory Methods for producing probes capable of distingushing variant genomic sequences
US5514539A (en) * 1993-06-29 1996-05-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 gene of 51 isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines
JPH07203998A (ja) * 1994-01-26 1995-08-08 Hamamatsu Photonics Kk 核酸塩基配列決定方法
DE69527355T2 (de) * 1994-05-28 2003-03-06 Tepnel Medical Ltd Herstellung von nukleinsaeurekopien
US6060288A (en) * 1994-08-03 2000-05-09 Mosaic Technologies Method for performing amplification of nucleic acid on supports
US5641658A (en) * 1994-08-03 1997-06-24 Mosaic Technologies, Inc. Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support
CA2218188A1 (en) 1995-04-11 1996-10-17 Trustees Of Boston University Solid phase sequencing of biopolymers
US5753439A (en) * 1995-05-19 1998-05-19 Trustees Of Boston University Nucleic acid detection methods
DK0862656T3 (da) 1995-11-21 2001-04-09 Univ Yale Unimolekylær segmentamplifikation og -detektering
US5939291A (en) 1996-06-14 1999-08-17 Sarnoff Corporation Microfluidic method for nucleic acid amplification
US6218142B1 (en) * 1997-03-05 2001-04-17 Michael Wassenegger Nucleic acid molecules encoding polypeptides having the enzymatic activity of an RNA-directed RNA polymerase (RDRP)
EP2327797B1 (de) * 1997-04-01 2015-11-25 Illumina Cambridge Limited Verfahren zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren
EP1498494A3 (de) * 1997-04-01 2007-06-20 Solexa Ltd. Methode zur Sequenzierung von Nukleinsäuren
US6235471B1 (en) 1997-04-04 2001-05-22 Caliper Technologies Corp. Closed-loop biochemical analyzers
WO1998045474A1 (en) 1997-04-04 1998-10-15 Innogenetics N.V. Isothermal polymerase chain reaction by cycling the concentration of divalent metal ions
ES2283936T3 (es) 1997-07-07 2007-11-01 Medical Research Council Procedimiento de clasificacion in vitro.
US6326489B1 (en) 1997-08-05 2001-12-04 Howard Hughes Medical Institute Surface-bound, bimolecular, double-stranded DNA arrays
US6124120A (en) 1997-10-08 2000-09-26 Yale University Multiple displacement amplification
US6511803B1 (en) 1997-10-10 2003-01-28 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6248558B1 (en) 1998-03-31 2001-06-19 Vanderbilt University Sequence and method for genetic engineering of proteins with cell membrane translocating activity
US6316229B1 (en) 1998-07-20 2001-11-13 Yale University Single molecule analysis target-mediated ligation of bipartite primers
AR021833A1 (es) * 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
EP1149175A2 (de) 1999-01-11 2001-10-31 President And Fellows Of Harvard College Isothermische dns-amplifizierung
US6300070B1 (en) * 1999-06-04 2001-10-09 Mosaic Technologies, Inc. Solid phase methods for amplifying multiple nucleic acids
JP6049051B2 (ja) 2011-07-29 2016-12-21 日東電工株式会社 両面真空成膜方法

Also Published As

Publication number Publication date
AR021833A1 (es) 2002-08-07
EA200100402A1 (ru) 2001-10-22
US20160319274A1 (en) 2016-11-03
ZA200102420B (en) 2001-09-26
BG105363A (bg) 2001-12-31
CZ20011183A3 (cs) 2001-09-12
CN1325458A (zh) 2001-12-05
EP1117827A1 (de) 2001-07-25
EP1117827B1 (de) 2005-11-30
US10370652B2 (en) 2019-08-06
EP1634963A1 (de) 2006-03-15
NO20011303D0 (no) 2001-03-14
AU771073B2 (en) 2004-03-11
ATE311474T1 (de) 2005-12-15
HUP0105052A3 (en) 2003-12-29
IL142178A0 (en) 2002-03-10
TR200100911T2 (tr) 2001-07-23
JP2002525125A (ja) 2002-08-13
DE69928683D1 (de) 2006-01-05
PL347125A1 (en) 2002-03-25
US9297006B2 (en) 2016-03-29
EP1117827B8 (de) 2010-06-02
EE200100195A (et) 2002-06-17
US20080160580A1 (en) 2008-07-03
NO20011303L (no) 2001-05-22
WO2000018957A1 (en) 2000-04-06
HUP0105052A2 (hu) 2002-04-29
AU6108899A (en) 2000-04-17
EP1634963B1 (de) 2013-06-19
US7115400B1 (en) 2006-10-03
EA004271B1 (ru) 2004-02-26
SK4292001A3 (en) 2001-12-03
CA2344575A1 (en) 2000-04-06
KR20010085860A (ko) 2001-09-07
NZ510599A (en) 2003-06-30
BR9914159A (pt) 2001-06-26
HK1042525A1 (zh) 2002-08-16
US20140228254A1 (en) 2014-08-14
US8652810B2 (en) 2014-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69928683T2 (de) Verfahren zur amplifikation und zur sequenzierung von nukleinsäuren
DE69233458T2 (de) Nukleinsäuretypisierung durch polymeraseverlängerung von oligonukleotiden unter verwendung von terminator-mischungen
DE69837913T2 (de) Verfahren zur vervielfältigung von nukleinsäure
DE10120797B4 (de) Verfahren zur Analyse von Nukleinsäureketten
EP1204765B1 (de) Verfahren zur relativen quantifizierung der methylierung von cytosin basen in dna-proben
DE10239504A1 (de) Verfahren zur Analyse von Nukleinsäurekettensequenzen und der Genexpression
DE10120798B4 (de) Verfahren zur Bestimmung der Genexpression
EP2494073B1 (de) Konjugate von nukleotiden und methoden zu deren anwendung
DE10214395A1 (de) Verfahren zur Analyse von Einzelnukleotidpolymorphismen
DE102004025745A1 (de) Oberfläche für die Analysen an einzelnen Molekülen
DE102004025695A1 (de) Verfahren und Oberfläche zur parallelen Sequenzierung von Nukleinsäureketten
DE102004025696A1 (de) Verfahren, Oberfläche und Substrate zu hochparallelen Analysen von Nukleinsäureketten
DE102004025694A1 (de) Verfahren und Oberfläche zu hochparallelen Analysen von Nukleinsäureketten
DE102004025744A1 (de) Oberfläche für die Analysen an einzelnen Nukleinsäuremolekülen
DE102004025746A1 (de) Verfahren, Oberfläche und Substrate zur hochparallelen Sequenzierung von Nukleinsäureketten
DE60213002T2 (de) Normalisierung von microanordnung-daten auf der basis von hybridisierung mit internem standard
EP1366195A2 (de) Verfahren zur detektion von nukleinsäuremolekülen
WO2010043418A2 (de) Integrierte amplifikation, prozessierung und analyse von biomolekülen in einem mikrofluidischen reaktionsträger
DE10215367B4 (de) Verbessertes Verfahren zur Bestimmung von Nukleotidsequenzen

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition