KR20010085860A - 핵산 증폭과 서열분석 방법 - Google Patents

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셀린 아데씨
에릭 가와시마
파스칼 메이어
진-야퀘스 메르모드
게라르도 투르카티
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레지날드 쇼트버그 에스. 안토니우스-소도
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Abstract

본 발명은 하나이상 핵산의 증폭 및 서열분석을 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다:
(1) 증폭할 또는 서열분석할 핵산으로 구성되는 한가지이상의 핵산 주형을 만들고, 여기서 상기 핵산은 5'말단에서 올리고뉴클레오티드 서열 Y 및 3'말단에서 올리고뉴클레오티드 서열 Z를 보유하고, 또한 핵산은 상기 핵산을 고체 지지체에 부착하기 위한 수단을 5'말단에 보유하고;
(2) 하나 또는 복수의 콜로니 프라이머 X와 상기 핵산 주형을 혼합하고, 상기 콜로니 프라이머 X는 올리고뉴클레오티드 서열 Z와 하이브리드를 형성하고 고체 지지체의 존재하에 고체 지지체와 콜로니 프라이머를 부착시킬 수 있는 수단을 5'말단에 보유하여, 양 핵산 주형의 5'말단과 콜로니 프라이머는 고형 지지체와 결합하게 되고;
(3) 결합된 주형에서 하나 또는 복수의 핵산 증폭 반응을 실시하여 핵산 콜로니를 만들고, 만들어진 하나 또는 복수의 핵산 콜로니의 서열 분석 단계를 1회이상 선별적으로 실시한다. 본 발명은 또한, 이들 방법에 사용되는 고형 지지체, 키트, 장치를 제공한다.

Description

핵산 증폭과 서열분석 방법{METHODS OF NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND SEQUENCING}
핵산 서열분석은 생물학, 생물공학, 의학분야의 다양한 활동의 기초가 되고 있다. 가령, 단일 염기 변이 탐지, 선별, 유전자 발현 모니터링에서 사람과 다른 고등생물의 게놈 서열을 결정하기 위한 노력이 시작됨에 따라, 핵산서열을 결정하는 능력이 더욱 중요해지고 있다. 핵산 서열분석으로 제공된 유전자 정보는 다양한 용도, 예를 들면, 약물 표적 개발과 확인, 질병 진단과 위험 스코어링, 미생물 동정과 특성화에 적용할 수 있다.
이런 적용의 제 1 단계는 관심있는 핵산의 실제 화학조성의 결정, 좀더 정확하게는 핵산을 구성하는 4가지 염기 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T) 또는 우라실(U)의 서열빈도의 결정이다. 하지만, 이런 적용은 대규모의 핵산 서열분석을 필요로 하기 때문에, 높은 작업처리능력의 핵산 서열분석 방법이 극히 바람직하다.
핵산 서열분석 방법은 당분야에 공지된 것이다. 일반적으로 사용되는 2가지 기술은 염기-특이적 화학적 성상에 의존하는 Maxim과 Gilbert 의 화학 절단 기술 및 효소 사슬 종결 원리에 의존하고 현재 핵산서열분석을 위한 기초로서 사용되는 상거(Sanger) 서열분석 기술이다.
상거 서열분석에서, 서열분석할 각 핵산은 DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오티드 삼인산염(dNTPs)과 디데옥시뉴클레오티드(ddNTPs)와 관계하는 반응동안 복제된다. DNA 중합효소는 dNTP와 ddNTP를 성장중인 DNA 가닥으로 통합시킬 수 있다. 하지만, ddNTP가 통합되면 성장중인 DNA 가닥의 3'말단에 하이드록실기가 결핍되어 사슬 신장을 위한 기질이 더 이상 존재하지 않아, 핵산사슬이 종결되게 된다. 따라서, ddNTP 형을 포함하는 특정 반응에서는 동일한 ddNTP로 종결되는 상이한 길이의 핵산 혼합물이 만들어진다. 4가지형의 ddNTP 각각에 대하여 개별적인 반응이 이루어지고, 만들어진 핵산 단편의 길이 분포는 변성 겔 전기영동(크기에 따라 핵산 단편을 분해한다) 또는 질량-분광광도법으로 분석한다. 일반적으로, 반응혼합물에서 하나 또는 복수의 데옥시리보뉴클레오티드 삼인산염은 표지하여 상이한 길이의 단편을 검출할 수 있도록 한다.
전술한 방법은 서열분석할 각 핵산이 생화학 반응동안 개별적으로 처리되어야 하기 때문에, 불편하다. 겔 전기영동은 수고스럽고 노동집중적이고, 특히 모세관 전기영동을 사용하는 경우 본질적으로 속도가 느리기 때문에 대규모 처리능력 서열분석에는 부적합하다. 이후의 서열분석 또한, 수고를 필요로 한다. 질량-분광광도법은 여전히 초보수준이어서, 값비싼 장치를 필요로 하고, 각 시료는 개별적으로 분석해야 한다.
처리능력을 증가시키는 방법은 다수의 시료를 동시에 처리하는 것이다. 핵산 프로브의 DNA 하이브리형성을 이용한 방법이 사용중에 있는데, 이 방법으로 생화학적 과정과 전기영동 처리동안 여러 과정을 처리할 수 있지만 장기간의 추가적 조작을 필요로 한다.
최근에는 DNA 칩과 DNA 하이브리드형성에 기초한 방법을 사용하고 있다(Thomas and Burke Exp. Opin. Ther. Patents 8: 503-508(1998). 이들 방법은 먼저 각각의 용도에 맞는 DNA 칩을 고안하고 제조해야 한다는 점에서 불편하다: 이것은 장기간을 요하고, 개별 칩의 가격은 대량의 수요가 있을 경우에만 낮출 수 있다. 또한, 칩은 재활용이 불가능하고, 각 칩은 하나의 핵산시료, 예를 들면 한사람의 진단 환자만 각 시점에서 처리할 수 있다. 최종적으로, 이런 칩으로 분석할 수 있는 서열의 양은 100,000미만의 염기로 한정되고, DNA 유전자형 확정과 유전자 정보 프로파일링과 같은 일부 용도에 국한된다.
몇몇 핵산 증폭 방법이 당분야에 공지되어 있다. 가령, 핵산은 관심있는 핵산을 발현 벡터 구조체에 삽입하여 증폭시킬 수 있다. 이후, 이런 벡터는 적당한 생물숙주 세포에 도입하고, 관심있는 핵산을 포함하는 벡터 DNA는 공지된 프로토콜을 이용하여 생물숙주를 배양하여 증폭시킨다.
이런 방법으로 증폭된 핵산은 당분야에 공지된 방법으로 숙주세포로부터 분리할 수 있다. 하지만, 이런 방법은 시간이 많이 소요되고, 노동집중적이고, 자동화가 어렵다는 단점이 있다.
중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 DNA 증폭기술은 1985년에 공개된 것으로1985(Saiki et al. Science 230, 1350-1354), 현재는 당분야의 공지기술중의 하나다. 관심있는 표적 핵산 단편은 증폭할 DNA 서열의 측면에 위치한 공지된 서열에 특이적인 2개의 짧은 올리고뉴클레오티드 서열(프라이머로 지칭)을 이용하여 증폭할 수 있다. 프라이머는 변형된 이중-가닥 DNA 단편의 반대 가닥과 하이브리드를 형성하고 앞으로 진행하여, 상기 2개의 프라이머사이의 영역을 통해 DNA 중합효소에 의한 DNA 합성이 진행되는데, 프라이머 서열은 중합효소에 의해 뉴클레오티드가 순차적으로 통합되어 신장된다. 신장 반응으로 2개의 이중 가닥 표적 영역이 만들어지는데, 이들 각각은 제 2주기의 하이브리드형성과 신장을 위해 다시 한번 변성시킬 수 있다. 제 3 주기에는 이중-가닥 형태의 표적 영역으로 정확하게 구성된 2개의 이중-가닥 분자가 만들어진다. 열변성, 프라이머 하이브리드형성, 신장의 반복 주기후, DNA의 특이적 표적 단편이 기하급수적으로 축적된다. 통상적으로, 이 방법은 용액에서 실시하는데, 증폭된 표적 핵산 단편을 용액으로부터 정제하는 방법, 예를 들면, 겔 전기영동은 당분야에 공지된 것이다.
하지만, 최근에는 용액내 자유 프라이머가 공액된 표면에 융합된 1개의 프라이머를 이용하는 방법이 공개되었다. 이들 방법은 동시 증폭 및 PCR 산물의 표면 유착을 가능하게 한다(Oroskar, A.A.. et al., Clinical Chemistry 42:1547(1996).
WO96/04404(Mosaic Technologies, Inc. et al.)는 잠재적으로 표적 핵산을 함유한 시료에서 표적 핵산의 탐지방법을 공개한다. 상기 방법에는 표적 핵산이 시험 시료에 존재하는 경우에 한하여 표적 핵산의 PCR 기초한 증폭을 유도하는 것이 포함된다. 표적 서열의 증폭을 위해, 양 프라이머는 고체 지지체에 부착시키는데, 이로써 증폭된 핵산 서열은 고체 지지체에 부착되게 된다. 상기 문서에서 공개된 증폭 기술은 "가교 증폭"기술로 칭한다. 이 기술에서 2개의 프라이머는 통상적인 PCR에서와 같이, 이들이 증폭할 특정 표적 DNA 서열의 측면에 위치하도록 특이적으로 고안한다. 따라서, 특정 표적 핵산이 시료에 존재하는 경우, 표적 핵산 서열은 프라이머와 하이브리드를 형성할 수 있고, PCR로 증폭할 수 있다. PCR 증폭 과정에서 제 1 단계는 지지체에 부착된 제 1 특정 프라이머("프라이머 1)와 표적 핵산의 하이브리드형성이다. 이후, 표적 핵산과 상보적인 제 1 증폭 산물은 프라이머 1 서열을 신장하여 만든다. 지지체에 변형 조건을 가하는 즉시, 표적 핵산은 방출되고, 이후 지지체에 부착되는 다른 프라이머 1 서열과의 추가적인 하이브리드형성에 참가할 수 있다. 이후, 지지체에 부착된 제 1 증폭산물은 지지체에 부착된 제 2 특정 프라이머("프라이머 2")와 하이브리드를 형성하고, 제 1 증폭 산물에 상보적인 핵산 서열로 구성되는 제 2 증폭 산물은 프라이머 2 서열을 신장하여 만들 수 있는데, 이것 또한 지지체에 부착된다. 따라서, 표적 핵산 및 제1과 제2 증폭 산물은 복수의 하이브리드형성과 신장과정에 참여할 수 있고, 표적 핵산의 초기 존재 및 초기에 존재하는 제1과 제2 프라이머의 수의 한정을 받는데, 결과는 표면에 부착된 표적 서열의 사본 수로 나타난다.
이런 과정의 실시에서 표적 핵산이 존재하는 경우에만 증폭 산물이 형성되기 때문에, 하나 또는 복수의 증폭산물의 존재 또는 부재에 대한 지지체를 모니터하면 특이적 표적 서열의 존재 또는 부재를 알 수 있다.
고체 지지체의 다른 영역에 각각 상이한 표적 핵산서열에 특이적인 상이한 제1과 제2 프라이머 세트를 배열하여 몇몇 상이한 표적 핵산 서열을 동시에 증폭할 수 있다는 점에서, 복합량을 얻기 위해 모자이크 기술을 사용할 수 있다.
모자이크 과정의 단점은 제1과 제2 프라이머 서열이 증폭할 각 표적 핵산에 대하여 특이적이어야 하기 때문에 공지된 서열의 증폭에만 사용할 수 있다는 점이다. 또한, 처리능력은 상이한 특정 프라이머 세트와 이후의 임의 고체 지지체의 상이한 영역에 배열할 수 있는 증폭된 표적 핵산 분자의 개수 및 상이한 영역에서 핵산을 배열하는데 걸리는 시간의 제한을 받는다. 또한, 모자이크 과정에서 2개의 상이한 프라이머는 증폭 산물이 형성되는 상이한 영역내 지지체의 5' 말단에 균일하게 부착되어야 한다. 이것은 현재 이용가능한 DNA 칩 제조기술로 달성할 수 없고 일부 시료 제조 방법으로 달성해야 한다. 따라서, 이런 방식으로 성취할 수 있는 밀도는 다른 고식적인 배열 기술과 동일한 한계를 갖는다. 다른 단점은 증폭된 표적 핵산의 존재 또는 부재에 대하여 지지체의 개별적인 상이한 영역을 모니터하는 속도다.
DNA 샘플의 배열은 막(예, 나일론 또는 니트로-셀룰로오스 막)에서 통상적으로 실시한다. 적당한 로봇(예, Q-botTM, Genetix Ltd, Dorset BH23 3TG UK)을 이용하면, 최대 100 시료/㎟의 밀도를 얻을 수 있다. 이런 방법에서, DNA는 물리화학적 수단(예, UV 방사)으로 막에 공유부착시키는데, 대형 DNA 분자(예, 100개 뉴클레오티드이상의 분자) 및 소형 DNA 분자(예, 올리고뉴클레오티드 프라이머)를 배열하는 것이 가능하다.
더 높은 밀도 배열의 올리고뉴클레오티드를 얻을 수 있는 다른 기술이 공지되어 있다. 가령, 인크-젯 기술로 반응 부위의 배열을 수득할 수 있는 사전-배열된 유리 슬라이드에 기초한 방식(Blanchard, A.P. and L. Hood, Microbial and Comparative Genomics, 1:225(1996) 또는 반응성 폴리아크릴아마이드 겔 배열(Yershov, G. et al., Proceeding of the National Academy of Science, USA, 93:4913-4918(1996))로, 이론적으로 최대 100 시료/㎟까지 배열할 수 있다.
더 높은 시료 밀도는 DNA 칩을 사용하여 달성할 수 있다(Fodor, S.P.A. et al., Science 251:767(1991)). 현재, 분자 생물학 기술에는 625개 올리고뉴클레오티드 프로브/㎟가 사용되고 있다. 최대 250,000 시료/㎠ (2500/㎟)의 프로브 밀도는 달성가능한 것으로 주장되고 있다(Chee, M. et al., Science 274:610(1996)). 하지만, 대략 2.5㎠의 단일 칩에 최대 132000개의 상이한 올리고뉴클레오티드를 배열할 수 있다.
중요한 점은 올리고뉴클레오티드의 3'OH 말단을 고체 표면에 부착시키는 방식으로 이들 칩이 제조된다는 것이다. 이것은 이런 방식으로 칩에 부착된 올리고뉴클레오티드가 PCR 증폭반응에서 프라이머로 사용될 수 없다는 것을 의미한다.
중요한 점은 PCR 산물이 PCR 증폭이 일어나는 용기에 결합될 때, PCR 산물의 생성 배열의 밀도가 용기의 제한을 받게 된다는 것이다. 현재 이용가능한 용기는 96 웰 미소역가 평판 형태뿐이다. 여기에서 표면 ㎟당 0.02 PCR 산물 시료정도를 수득할 수 있다.
가령, 상업적으로 이용가능한 NucleolinkTM시스템(Nunc A/S, Roskilde, Denmark)을 이용하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 접합된 웰의 표면상에 0.02 시료/㎟ 밀도로 시료를 동시 증폭하고 배열할 수 있다. 하지만, 기술적인 문제로 인해, 이런 방식으로 시료 밀도를 현저하게 증가시키는 것을 불가능해 보인다.
따라서, 처리능력을 증가시키기 위하여 더 높은 밀도로 핵산 시료의 동시 증폭과 배열을 가능하게 하고, 또한 더 빠른 속도로, 가급적 동시에 시료를 모니터할 수 있는 신규한 핵산 증폭 방법이 필요하다.
게다가, 다수의 시료를 동시에 처리하고 서열분석할 수 있는 신규한 서열분석 방법이 필요하다, 다시 말하면, 상기 과정의 현저한 복합화를 가능하게 하는 서열분석 방법이 필요하다. 서열분석 과정의 현저한 복합화는 당분야에 공지된 서열분석 방법으로 달성할 수 있는 것보다 더 많은 처리능력을 가능하게 한다. 이런 신규한 방법은 고식적인 서열분석 기술에 비하여 저렴하고 적은 노동강도로 고도 처리능력 서열분석을 달성할 수 있다는 점에서 훨씬 바람직하다.
본 발명은 다수의 개별 핵산을 동시에 높은 밀도로 배열하고 증폭할 수 있는 신규한 고체상 핵산 증폭 방법을 제시한다. 본 발명은 또한, 다수의 증폭된 개별 핵산서열을 빠른 속도로, 원하는 경우 동시에 모니터할 수 있는 방법을 제시한다. 본 발명은 또한, 다수의 개별 핵산을 짧은 시간내 동시에 측정할 수 있는 방법을 제시한다. 이들 방법은 전체 게놈의 서열화, 다수 개체(예, 500명)의 유전자(예, 500개)를 동시에 서열분석하는 경우, 다수(예, 수백만개) 다형성의 동시 기입, 또는 다수 유전자(예, 100,000개)의 동시 발현의 모니터링등에 특히 유용하다.
본 발명은 따라서, 하나이상 핵산의 증폭을 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다:
(1) 증폭할 핵산으로 구성되는 한가지이상의 핵산 주형을 만들고, 여기서 상기 핵산은 5'말단에서 올리고뉴클레오티드 서열 Y 및 3'말단에서 올리고뉴클레오티드 서열 Z를 보유하고, 또한 핵산은 상기 핵산을 고체 지지체에 부착하기 위한 수단을 5'말단에 보유하고;
(2) 하나 또는 복수의 콜로니 프라이머 X와 상기 핵산 주형을 혼합하고, 상기 콜로니 프라이머 X는 올리고뉴클레오티드 서열 Z와 하이브리드를 형성하고 고체 지지체와 콜로니 프라이머를 부착시킬 수 있는 수단을 5'말단에 보유하여, 양 핵산 주형의 5'말단과 콜로니 프라이머는 고형 지지체와 결합하게 되고;
(3) 결합된 주형에서 하나 또는 복수의 핵산 증폭 반응을 실시하여 핵산 콜로니를 만든다.
본 발명의 다른 구체예에서, 2가지 상이한 콜로니 프라이머 X는 본 방법의 단계(2)에서 핵산 주형과 혼합한다. 가급적, 콜로니 프라이머 X의 서열에서, 올리고뉴클레오티드 서열 Z가 콜로니 프라이머 X중 하나와 결합하고, 올리고뉴클레오티드 서열 Y가 콜로니 프라이머 X중 하나와 동일한 서열이 된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 서열 Z는 올리고뉴클레오티드 Y와 상보적인 서열로 Y'로 칭하고, 콜로니 프라이머 X는 올리고뉴클레오티드 서열과 동일한 서열이 된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 콜로니 프라이머 X는 축중 프라이머 서열로 구성되고, 핵산 주형은 증폭할 서열로 구성되고 각각 5'와 3'말단에서 올리고뉴클레오티드 서열 Y 또는 Z를 보유하지 않는다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 방법은 단계(3)에서 만들어진 하나 또는 복수의 핵산 콜로니의 서열 결정단계를 한번이상 실시하는 추가 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 적어도 한 핵산의 서열분석을 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다:
(1) 서열분석할 핵산으로 구성되는 한가지이상의 핵산 주형을 만들고, 여기서 상기 핵산은 5'말단에서 올리고뉴클레오티드 서열 Y 및 3'말단에서 올리고뉴클레오티드 서열 Z를 보유하고, 또한 핵산은 상기 핵산을 고체 지지체에 부착하기 위한 수단을 5'말단에 보유하고;
(2) 하나 또는 복수의 콜로니 프라이머 X와 상기 핵산 주형을 혼합하고, 상기 콜로니 프라이머 X는 올리고뉴클레오티드 서열 Z와 하이브리드를 형성하고 고체 지지체와 콜로니 프라이머를 부착시킬 수 있는 수단을 5'말단에 보유하여, 양 핵산 주형의 5'말단과 콜로니 프라이머는 고체 지지체와 결합하게 되고;
(3) 결합된 주형에서 하나 또는 복수의 핵산 증폭 반응을 실시하여 핵산 콜로니를 만들고;
(4) 만들어진 하나이상 핵산 콜로니의 서열 결정단계를 한번이상 실시한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 양 핵산 주형의 5'말단은 핵산 서열을 고형 지지체에 공유부착시키는 수단을 보유한다. 가급적, 이런 공유부착 수단은 화학적으로 변형가능한 기능기, 예를 들면, 인산염기, 카르복실기 또는 알데히드기, 티올기, 하이드록실기, 디메톡시트리틸(DMT) 또는 아미노기가 된다.
본 발명의 방법에 따라 증폭시킬 수 있는 핵산에는 DNA(예, 게놈 DNA, cDNA, 재조합 DNA 또는 임의 형태의 합성 또는 변형 DNA) 또는 RNA(예, mRNA 또는 임의 형태의 합성 또는 변형 RNA)가 포함된다. 상기 핵산은 길이가 상이하고, 대형 핵산 분자의 단편 또는 일부일 수 있다. 가급적, 증폭하는 핵산은 적어도 50개 염기쌍, 좀더 바람직하게는 150 내지 4000개 염기쌍을 보유한다. 증폭하는 핵산은 공지된 또는 미지의 서열일 수 있고, 단일 또는 이중-가닥 형태일 수 있다. 증폭하는 핵산은 임의의 출처로부터 유래할 수 있다.
이 글에서 "핵산 주형"은 단일-가닥 형태로 증폭 또는 서열분석할 핵산으로 구성되는 존재를 의미한다. 하기에서 밝힌 바와 같이, 증폭 또는 서열분석할 핵산은 이중 가닥형태로 제공할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 "핵산 주형"은 다양한 길이를 가질 수 있다. 가급적, 이들은 적어도 50개 염기쌍, 좀더 바람직하게는 150 내지 4000개 염기쌍을 갖는다. 핵산 주형을 구성하는 뉴클레오티드는 자연 발생 또는 비-자연발생 뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 핵산 주형은 증폭할 핵산을 포함할 뿐만 아니라, 5'와 3'말단에 짧은 올리고뉴클레오티드 서열을 보유한다. 이 글에서 5'말단에 위치하는 올리고뉴클레오티드 서열은 Y로 칭한다. 올리고뉴클레오티드 서열 Y는 공지된 서열로 다양한 길이를 가질 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 올리고뉴클레오티드 서열 Y는 적어도 5개 뉴클레오티드, 바람직하게는 5 내지 100개 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 20개 뉴클레오티드를 보유한다. 자연발생 또는 비-자연발생 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 서열 Y내에 위치할 수 있다. 전술한 바와 같이, 가급적 올리고뉴클레오티드 Y 서열은 콜로니 프라이머 X와 동일하다. 본 발명에 따른 핵산 주형의 3'말단에 위치하는 올리고뉴클레오티드 서열은 Z로 칭한다. 올리고뉴클레오티드 서열 Z는 공지된 서열로 다양한 길이를 가질 수 있다. 본 발명에 방법에서 사용되는 올리고뉴클레오티드 Z는 적어도 5개 뉴클레오티드, 바람직하게는 5 내지 100개 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 20개 뉴클레오티드를 보유한다. 자연발생 또는 비-자연발생 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 서열 Z내에 위치할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 서열 Z는 콜로니 프라이머 X중 하나와 하이브리드를 형성하도록, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 상보적인 서열로 고안하고 Y'라 칭한다. 각각, 핵산 주형의 5'와 3'말단에 위치하는 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 Z는 주형의 최말단에 위치할 필요가 없다. 가령, 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 Z가 각각, 핵산 주형의 5'와 3' 근처(예, 5'와 3'말단의 0 내지 100개 뉴클레오티드 범위이내)에 위치하는 것이 바람직하지만, 핵산 주형의 5' 또는 3'말단으로부터 좀더 멀리 떨어져(예, 100개 뉴클레오티드 이상) 위치할 수도 있다. 따라서, 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 Z는 핵산 주형내 임의의 위치할 수 있는데, 단 서열 Y와 Z는 증폭할 핵산 서열의 한 쪽, 다시 말하면, 측면에 위치해야 한다.
이 글에서 "핵산 주형"에는 또한, 이중-가닥형태로 증폭 또는 서열분석될 존재가 포함된다. 핵산 주형이 이중-가닥 형태인 경우, 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 Z는 가닥중 하나의 5'와 3'말단에 각각 위치한다. DNA의 염기쌍 규칙에 따라,다른 가닥은 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 Z를 보유한 가닥과 상보적이고, 따라서 5'말단에 올리고뉴클레오티드 서열 Z'와 3'말단에 올리고뉴클레오티드 서열 Y'를 보유한다.
이 글에서 "콜로니 프라이머"는 상보서열과 하이브리드를 형성하여 특이적인 중합효소 반응을 개시할 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열로 구성되는 존재를 의미한다. 콜로니 프라이머로 구성되는 서열은 상보성 서열과 최대 하이브리드형성 활성 및 임의의 다른 서열에 대한 매우 낮은 비-특이적 하이브리드형성 활성을 보유하도록 선택한다. 콜로니 프라이머로 사용되는 서열에는 임의의 서열이 포함되지만, 가급적 5'-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG 또는 5'-CACCAACCCAAACCAACCCAAACC가 된다. 콜로니 프라이머는 5 내지 100개 염기, 바람직하게는 15 내지 25개 염기를 보유한다. 자연발생 또는 비-자연발생 뉴클레오티드는 프로이머내에 위치할 수 있다. 1개 또는 2개의 상이한 콜로니 프라이머는 본 발명의 방법에서 핵산 콜로니를 만드는데 사용할 수 있다. 본 발명에 사용되는 콜로니 프라이머에는 또한, 축중 프라이머 서열이 포함된다.
이 글에서 "축중 프라이머 서열"은 상기 핵산 단편 서열과 무관한 임의의 핵산 단편과 하이브리드를 형성할 수 있는 짧은 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다. 따라서, 이런 축중 프라이머는 주형과의 하이브리드형성을 위해 핵산 주형내 올리고뉴클레오티드 서열 X 또는 Z의 존재를 필요로 하지는 않지만, 올리고뉴클레오티드 서열 X 또는 Y를 보유한 주형과 하이브리드를 형성하는 축중 프라이머를 사용하여도 무방하다. 하지만, 본 발명의 방법에 사용되는 축중 프라이머는 증폭되는 핵산 서열의 한 쪽, 또는 측면에서 주형상의 핵산 서열과 하이브리드를 형성해야 한다.
이 글에서 "고형 지지체"에는 핵산이 공유부착할 수 있는 임의의 고형 표면, 예를 들면, 라텍스 비드, 덱스트란 비드, 폴리스티렌, 폴리프로필렌 표면, 폴리아크릴아마이드 겔, 금 표면, 유리 표면, 실리콘 와이퍼를 의미한다. 바람직한 고형 지지체는 유리표면이다.
이 글에서 "핵산을 고형 지지체에 부착시키는 수단"에는 화학적으로 변형가능한 기능기를 비롯한 임의의 화학적 또는 비-화학적 부착수단을 의미한다. "부착"은 공유 결합에 의한 핵산의 고형 지지체 고착, 또는 비가역적 수동흡수 또는 분자사이의 친화도를 통한 핵산의 고형 지지체 고착(예, 비오틴화된 분자에 의한 아비딘-피복된 표면에 고착)을 의미한다. 부착은 DNA-변성 조건하에 물 또는 수용성 완충용액 세척에 의해 제거되지 않을 만큼 강하게 이루어져야 한다.
이 글에서 "화학적으로-변형가능한 기능기"는 임의의 기(基), 예를 들면, 인산염기, 카르복실기 또는 알데히드기, 티올기, 하이드록실기, 디메톡시트리틸(DMT) 또는 아미노기를 의미한다.
이 글에서 "핵산 콜로니"는 핵산 가닥의 다중 사본으로 구성된 분리 영역을 의미한다. 핵산 가닥에 대한 상보적 가닥의 다중 사본은 또한, 동일 콜로니에 존재할 수 있다. 콜로니를 구성하는 핵산 가닥의 다중 사본은 일반적으로, 고형 지지체에 고착되고, 단일 또는 이중가닥 형태를 취한다. 본 발명의 핵산 콜로니는 사용한 조건에 따라, 다양한 크기와 밀도로 만들 수 있다. 콜로니의 크기는 0.2㎛내지 6㎛, 좀더 바람직하게는 0.3㎛ 내지 4㎛이다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 핵산 콜로니의 밀도는 일반적으로, 10,000/㎟ 내지 100,000/㎟이다. 더 높은 밀도, 예를 들면, 100,000/㎟ 내지 1,000,000/㎟ 및 1,000,000/㎟ 내지 10,000,000/㎟를 달성할 수 있을 것으로 생각되다.
본 발명의 방법은 핵산 콜로니를 만드는데 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 측면은 하나 또는 복수의 핵산 콜로니를 제공한다. 본 발명의 핵산 콜로니는 본 발명의 단일 고착된 핵산 주형으로부터 만들 수 있다. 본 발명의 방법으로, 이런 핵산 콜로니를 대량으로 동시에 생산할 수 있는데, 이들 각각은 고착된 상이한 핵산 가닥을 보유하다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 증폭할 핵산으로 구성되는 복수의 핵산 주형을 제공하는 것인데, 여기서 상기 핵산은 5'말단에 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 3'말단에 올리고뉴클레오티드 서열 Y를 보유하고, 또한 핵산을 고형 지지체에 부착시키기 위한 수단을 5'말단에 보유한다. 가급적, 이런 복수의 핵산 주형은 콜로니 프라이머 X와 혼합하는데, 상기 콜로니 프라이머는 올리고뉴클레오티드 서열 Z와 하이브리드를 형성할 수 있고 콜로니 프라이머를 고형 지지체에 부착하기 위한 수단을 5'말단에 보유한다. 가급적, 상기 복수의 핵산 주형과 콜로니 프라이머는 고형 지지체에 공유부착시킨다.
본 발명의 다른 구체예에서, 복수의 상이한 콜로니 프라이머 X는 복수의 핵산 주형과 혼합한다. 가급적, 콜로니 프라이머 X의 서열에서, 올리고뉴클레오티드 서열 Z가 콜로니 프라이머 X중 하나와 결합하고, 올리고뉴클레오티드 서열 Y가 콜로니 프라이머 X중 하나와 동일한 서열이 된다.
다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 서열 Z는 올리고뉴클레오티드 Y와 상보적이고(서열 Y'), 복수의 콜로니 프라이머 X는 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 동일한 서열이 된다.
또 다른 구체예에서, 복수의 콜로니 프라이머 X는 축중 프라이머 서열로 구성되고, 복수의 핵산 주형은 증폭할 서열로 구성되고 각각 5'와 3'말단에서 올리고뉴클레오티드 서열 Y 또는 Z를 보유하지 않는다.
본 발명의 핵산 주형은 당분야의 표준 또는 통상적인 기술을 이용하여 만들 수 있다. 일반적으로, 이들은 유전자조작 기술에 기초한다.
증폭할 핵산은 당분야에 공지된 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 가령, 당분야에 공지된 방법으로 핵산 시료, 예를 들면, DNA, cDNA, 전체 RNA, mRNA등을 수득하고, 제한 위치 효소 절단 또는 기계적 방법으로 이들의 단편을 만든다.
일반적으로, 증폭할 핵산은 먼저 이중 가닥 형태로 얻어진다. 핵산이 단일 가닥 형태(예, mRNA)로 제공되는 경우, 당분야에 공지된 기술, 예를 들면, 올리고-dT 프라이머, 역전사효소, DNA 중합효소를 이용하여 먼저 이중 가닥 형태로 만든다. 일단 증폭할 핵산이 적당한 크기의 이중 가닥 형태로 수득되면, 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 Z에 상응하는 올리고뉴클레오티드 서열을 핵산 서열의 각 말단, 다시 말하면, 5'와 3'말단에 결합시켜 핵산 주형을 만든다. 이것은 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 결찰 또는 적당한 올리고뉴클레오티드 서열이 측면에 위치하는 생물 벡터상의 한 위치에 증폭할 핵산을 삽입하여 실시할 수 있다. 대안으로,증폭할 핵산 서열의 적어도 일부가 공지된 경우, 각각 5'와 3'말단에 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 Z를 보유한 핵산 주형은 증폭할 핵산에 특이적인 서열을 포함하는 적당한 PCR 프라이머를 이용한 PCR로 생산할 수 있다. 핵산 주형을 고체 지지체에 부착하기 전에, 핵산 주형은 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 대략 94℃까지 가열하고 얼음위에서 0℃까지 냉각하여 단일 가닥형태로 만들 수 있다.
핵산의 5'말단에 위치한 올리고뉴클레오티드 서열은 임의의 서열과 임의의 길이를 보유할 수 있는데, 이 글에서 서열 Y로 칭한다. 올리고뉴클레오티드의 적당한 길이와 서열은 당분야에 공지된 방법을 이용하여 선택할 수 있다. 가령, 핵산의 각 말단에 부착될 올리고뉴클레오티드 서열은 5 내지 100개 뉴클레오티드 길이의 상대적으로 짧은 뉴클레오티드 서열이다. 핵산의 3'말단에 위치하는 올리고뉴클레오티드 서열은 임의의 서열 및 임의의 길이를 보유할 수 있는데, 이 글에서 서열 Z로 칭한다. 올리고뉴클레오티드의 적당한 길이와 서열은 당분야에 공지된 방법을 이용하여 선택할 수 있다. 가령, 핵산의 각 말단에 부착될 올리고뉴클레오티드 서열은 5 내지 100개 뉴클레오티드 길이의 상대적으로 짧은 뉴클레오티드 서열이다.
올리고뉴클레오티드 서열 Z의 서열은 콜로니 프라이머 X중의 하나와 하이브리드를 형성할 수 있다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 서열 Y의 서열은 콜로니 프라이머 X와 동일한 서열이 된다. 좀더 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 서열 Z는 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 상보적이고(Y'), 콜로니 프라이머 X는 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 동일한 서열이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 Z는 당분야에서 표준 또는 통상적인 기술을 이용하여 만들거나, 또는 상업적으로 구매할 수 있다.
본 발명의 핵산 주형을 만드는 경우, 당분야에 공지된 방법으로 원하는 서열을 추가로 도입할 수 있다. 이런 추가 서열에는 임의의 핵산 주형 서열의 증폭 산물을 확인할 수 있는 제한 효소 위치 또는 특정 핵산 태그가 포함된다. 다른 적절한 서열에는 폴드-백(fold-back)) DNA 서열(단일-가닥으로 되면 헤어핀 루프 또는 다른 이차구조를 형성하는 서열), 단백질/DNA 상호작용을 통제하는 '컨트롤' DNA 서열(예, 핵산 중합효소에 의해 인식되는 프로모터 DNA 서열) 또는 DNA-결합 단백질에 의해 인식되는 오프레이터 DNA 서열이 포함된다.
증폭할 핵산 서열이 복수로 존재하는 경우, 올리고뉴클레오티드 Y와 Z의 부착은 동일 또는 상이한 반응으로 실시할 수 있다.
한 핵산 주형이 만들어지면, 이를 본 발명의 방법에 사용하기 전에 증폭한다. 이런 증폭은 당분에 공지된 방법, 예를 들면, 주형 핵산을 발현벡터로 삽입하고 이를 적당한 생물 숙주에서 증폭하거나 또는 PCR로 증폭하여, 실시할 수 있다. 하지만, 이런 증폭 단계가 반드시 필요한 것은 아닌데, 그 이유는 본 발명의 방법을 이용하여, 핵산 주형의 단일 사본으로부터 만들어진 핵산 콜로니 형태로 핵산 주형의 다수 사본을 생산할 수 있기 때문이다.
바람직하게는, 전술한 바와 같이 준비된 핵산 주형의 5'말단은 핵산 주형을 고형 지지체에 공유부착시키기 위한 수단을 보유하도록 수식한다. 이런 수단은 화학적으로 변형가능한 기능기, 예를 들면, 인산염기, 카르복실기 또는 알데히드기,티올기, 하이드록실기, 디메톡시트리틸(DMT) 또는 아미노기일 수 있다. 좀더 바람직하게는, 핵산의 5'-수식에 티올기, 인산염기 또는 아미노기를 사용한다.
본 발명의 콜로니 프라이머는 당분야에 표준 또는 통상적인 기술을 이용하여 만들 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 콜로니 프라이머는 당분야에 공지된 방법으로 만들어진 합성 올리고뉴클레오티드이거나 또는 상업적으로 구매할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라, 핵산 서열을 증폭하기 위하여 1개 또는 2개의 상이한 콜로니 프라이머 X를 사용할 수 있다. 이것은 WO 96/04404에서 공개한 것과 같은 당분야에 공지된 기존의 증폭 방법과 대조를 이루는데, 기존의 방법에서는 증폭할 각 특정 핵산 서열에 대하여 상이한 특이적인 프라이머를 고안해야 했다.
가급적, 본 발명의 콜로니 프라이머 X의 5'말단은 콜로니 프라이머를 고형 지지체에 공유부착시키기 위한 수단을 보유하도록 수식한다. 가급적, 이런 공유 결합 수단은 전술한 바와 같은 화학적으로 변형된 기능기가 된다. 원하는 경우, 콜로니 프라이머는 리보자임 절단 부위로 제한 엔도뉴클레아제 부위 또는 다른 적절한 서열과 같은 원하는 추가 서열을 보유하도록 고안할 수 있다. 다른 적절한 서열에는 폴드-백 DNA 서열(단일-가닥으로 되면 헤어핀 루프 또는 다른 이차구조를 형성하는 서열), 단백질/DNA 상호작용을 통제하는 '컨트롤' DNA 서열(예, 핵산 중합효소에 의해 인식되는 프로모터 DNA 서열) 또는 DNA-결합 단백질에 의해 인식되는 오퍼레이터 DNA 서열이 포함된다. 콜로니 프라이머 X의 5'말단이 지지체에 고착되면 3'말단은 지지체로부터 멀리 위치하게 되고, 따라서 콜로니 프라이머는 핵산 주형의 3'말단에 위치하는 상보성 올리고뉴클레오티드 서열과 하이브리드를 형성한 후 중합효소에 의해 사슬 신장이 가능하다.
일단 본 발명의 핵산 주형과 콜로니 프라이머가 합성되면 이들을 적당한 비율로 함께 혼합하는데, 이들이 고형 지지체에 부착되면 적당한 밀도의 핵산 주형과 콜로니 프라이머를 수득하게 된다. 바람직하게는, 혼합물상의 콜로니 프라이머의 비율은 핵산 주형의 비율보다 높다. 바람직하게는, 콜로니 프라이머 대 핵산 주형의 비율은 콜로니 프라이머와 핵산 주형이 고형 지지체에 고착되면 고형 지지체의 전체 또는 한정된 영역에서 대략 균일한 밀도로 위치하는 복수의 콜로니 프라이머로 구성된 콜로니 프라이머의 "잔디"주형이 구성되도록 하는 비율이 되는데, 여기서 하나 또는 복수의 핵산 주형은 콜로니 프라이머의 잔디내에 일정 간격으로 개별적으로 고착된다.
핵산 주형은 단일 가닥 형태로 제공할 수 있다. 하지만, 이들은 또한, 전체 또는 부분적인 이중 가닥 형태로 제공할 수 있는데, 여기서 하나의 5'말단 또는 양 5'말단은 지지체에 부착되도록 변형시킨다. 이런 경우, 부착 과정의 완성후 방출된 가닥을 세척하여 없애기 전에, 당분야에 공지된 방법(예, 94℃로 가열)으로 가닥을 분리시킬 수도 있다. 양 가닥 분자의 양 가닥이 표면과 반응하여 부착되는 경우는 한 가닥을 부착하고 증폭 단계를 한번 실시하는 경우와 결과가 동일하게 나타난다. 다시 말하면, 이중 가닥 주형 핵산의 양 가닥이 부착되는 경우, 양 가닥은 서로 인접 부착되기 때문에 한 가닥을 부착하고 증폭 단계를 1회 실시할 때의 결과와 구분할 수 없다. 따라서, 단일 가닥과 이중 가닥 주형 핵산은 표면에 부착된 주형 핵산을 제공하는데 사용할 수 있어, 콜로니 생산에 적합하다.
개별 콜로니 프라이머와 개별 핵산 주형사이의 거리(이에 따른 콜로니 프라이머와 핵산 주형의 밀도)는 지지체에 고착되는 콜로니 프라이머와 핵산 주형의 농도를 변형하여 조절할 수 있다. 콜로니 프라이머의 적절한 밀도는 적어도 A fmol/㎟, 바람직하게는 적어도 10fmol/㎟, 좀더 바람직하게는 30 내지 60 fmol/㎟이 된다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 핵산 주형의 밀도는 일반적으로, 10,000/㎟ 내지 100,000/㎟가 된다. 더 높은 밀도, 예를 들면, 100,000㎟ 내지 1,000,000/㎟ 및 1,000,000/㎟ 내지 10,000,000/㎟를 달성할 수 있을 것으로 생각된다.
부착된 핵산 주형과 콜로니 프라이머의 밀도를 조절하면, 지지체의 표면에서 핵산 콜로니의 최종 밀도를 조절할 수 있다. 이것은 본 발명의 방법에 따라, 하나의 핵산 콜로니를 하나의 핵산 주형을 부착시켜 만들 수 있다는 사실에 기초하는데, 여기서 본 발명의 콜로니 프라이머는 고형 지지체(하기에 상술)의 적당한 위치에 존재해야 한다. 단일 콜로니상의 핵산 분자의 밀도는 부착된 콜로니 프라이머의 밀도를 조절하여 통제할 수 있다.
일단 본 발명의 콜로니 프라이머와 핵산 주형이 적당한 밀도로 고형 지지체 부착되면, 이후 본 발명의 핵산 콜로니는 공유부착된 주형 핵산을 수회 증폭하여 만들 수 있는데, 여기서 각 콜로니는 최초 고착된 핵산 주형과 이의 상보적 서열의 다중 사본으로 구성된다. 증폭 1 주기는 하이브리드형성, 신장, 변성 단계로 구성되는데, 이들 단계는 당분야에 공지된 PCR용 시약과 조건을 이용하여 실시한다.
전형적인 증폭 반응은 고형 지지체 및 부착된 핵산과 콜로니 프라이머를 프라이머 하이브리드형성 조건(예, 65℃ 온도)에 처리하는 것으로 구성된다. 이런조건하에서 핵산 주형 3'말단의 올리고뉴클레오티드 서열 Z는 고착된 콜로니 프라이머 X와 하이브리드를 형성시키고, 또한 프라이머 신장을 뒷받침하는 조건과 시약, 예를 들면, 72℃ 온도와 핵산 중합효소[가령, DNA 의존성 DNA 중합효소, 역전사분자(즉, RNA 의존성 DNA 중합효소) 또는 RNA 중합효소]+뉴클레오시드 삼인산염 분자와 임의 다른 뉴클레오티드 전구물질의 공급하에, 콜로니 프라이머는 핵산 주형 서열과 상보적인 뉴클레오티드를 첨가하여 신장시킨다.
본 발명에 사용할 수 있는 핵산 중합효소에는 DNA 중합효소(Klenow 단편, T4 DNA 중합효소), 다양한 열안정성 박테리아의 열-안정성 DNA 중합효소(예, Taq, VENT, Pfu, Tfl DNA 중합효소), 이들의 유전적으로 변형된 유도체(TaqGold, VENTexo, Pfu exo)가 포함된다. RNA 중합효소와 역전사효소를 병용하여 DNA 콜리니를 증폭시킬 수 있다. 가급적, 콜로니 프라이머 신장에 사용되는 핵산 중합효소는 PCR 반응 조건, 다시 말하면 가열과 냉각의 반복에서 안정하고, 대략 94℃의 변성 온도에서 안정하다. 가급적, 사용하는 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소다.
가급적, 사용된 뉴클레오시드 삼인산염 분자는 데옥시리보뉴클레오티드 삼인산염(예, dATP, dTTP, dCTP, dGTP)이고, 리보뉴클레오시드 삼인산염(예, dATP, dUTP, dCTP, dGTP)이다. 뉴클레오시드 삼인산염 분자는 자연적으로 또는 비-자연적으로 생성된다.
하이브리드형성과 신장 단계후, 지지체에 부착된 핵산을 변성 조건에 처리하면 2개의 고착된 핵산이 존재하게 되는데, 제 1 핵산은 초기 고착된 핵산이고 제 2 핵산은 고착된 콜로니 프라이머 X중 하나로부터 신장된 이의 상보성 핵산이다. 이후, 초기 고착된 핵산 주형과 확장생성된 콜로니 프라이머는 지지체를 추가적으로 하이브리드형성, 신장, 변성 처리하여 추가 증폭할 수 있다. 이렇게 추가적으로 증폭하면, 주형 핵산의 고착된 다중 사본과 이의 상보성 서열로 구성된 핵산 콜로니가 만들어진다.
주형 핵산의 초기 고착은 주형 핵산이 유일하게 핵산의 전장에 존재하는 콜로니 프라이머와 하이브리드를 형성할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 생성되는 핵산 콜로니의 경계는 초기 주형 핵산이 고착된 영역에만 한정된다. 분명히, 추가 증폭(즉, 추가적인 하이브리드변성, 신장, 변성)으로 주형 분자와 이의 보체의 다중 사본이 합성되는 경우에도, 생성되는 핵산 콜로니의 경계는 여전히 초기 핵산 주형이 고착된 영역에 한정된다.
본 발명의 구체예에 따른 핵산 콜로니 생산 방법의 개요도는 도1에 제시한다. 도1(a)은 본 발명의 콜로니 프라이머 X(서열 ATT 보유) 및 5'말단에 올리고뉴클레오티드 서열 Y(여기서, ATT)와 3'말단에 올리고뉴클레오티드 서열 Z(여기서, AAT)를 보유하고 콜로니 프라이머 X와 하이브리드를 형성할 수 있는 핵산주형을 보여준다. 개요도에서, 콜로니 프라이머 X와 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 Z는 단지 3개 뉴클레오티드를 보유하는 것으로 보인다. 하지만 실제적으로 이보다 긴 서열을 사용할 수도 있다. 콜로니 프라이머와 핵산 주형의 5'말단은 핵산을 고형 지지체에 부착시키기 위한 수단을 보유한다. 이런 수단은 도1에서 검은색 사각형으로 표시한다. 이런 부착 수단은 공유 또는 비-공유 결합을 야기한다.
단순화시키기 위하여 도1(a)에는 하나의 콜로니 프라이머 X와 하나의 주형핵산만을 제시한다. 하지만, 실제적으로 복수의 콜로니 프라이머 X와 복수의 핵산 주형이 존재한다. 복수의 콜로니 프라이머는 2가지 상이한 콜로니 프라이머 X로 구성될 수 있다. 하지만, 단순화시키기 위하여 도1에서 보인 개요도에서는 ATT 서열을 보유한 한가지 형태의 프라이머만 제시한다. 복수의 핵산 주형은 올리고뉴클레오티드 Y와 Z사이의 중심 영역내에 상이한 핵산 서열로 구성될 수 있지만, 5'와 3'말단 각각에 동일한 올리고뉴클레오티드 Y와 Z를 보유할 수도 있다. 단순화시키기 위하여 도1에는 한가지 종류의 핵산 주형만을 제시하는데, 여기서 중심 영역상의 서열은 CGG이다.
고형 지지체의 존재하에, 핵산 주형과 콜로니 프라이머의 5'말단은 지지체에 결합한다. 이것은 도1(b)에 제시한다. 이후, 지지체 및 부착된 핵산 주형과 콜로니 프라이머는 프라이머 하이브리드형성을 유도하는 조건에 처리한다. 도1(c)은 콜로니 프라이머와 하이브리드를 형성한 핵산 주형을 보여준다. 이런 하이브리드형성은 핵산 주형의 3'말단에 위치한 올리고뉴클레오티드 서열 Z가 콜로니 프라이머와 하이브리드를 형성할 수 있기 때문에 가능하다. 개요도에서 올리고뉴클레오티드 서열 Z가 콜로니 프라이머와 상보적임을 알 수 있는데, 핵산 주형과 콜로니 프라이머가 처리 조건하에서 하이브리드형성만 이루어질 수 있다면 정확한 상보성 서열이 필요하지는 않다.
도1(d)은 프라이머 신장의 상태를 보여준다. 적당한 온도 및 DNA 중합효소 존재와 뉴클레오티드 전구물질(예, dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 공급하에, DNA 중합효소는 핵산 주형을 주형으로 하여 3'말단으로부터 콜로니 프라이머를 신장시킨다.프라이머 신장이 종결되면(도1(e) 참조), 초기 핵산 주형과 상보적인 고착된 제 2핵산 가닥이 만들어짐을 볼 수 있다. 가열하여 2개의 핵산 가닥을 분리시킨 직후, 2개의 고착된 핵산이 존재하게 되는데, 제 1 가닥은 초기 고착된 핵산 주형이고 제 2 가닥은 고착된 콜로니 프라이머 X중 하나로부터 신장된 이의 상보성 핵산이다(도1(f) 참조).
초기 고착된 핵산 주형과 확장형성된 콜로니 프라이머는 이후, 다른 콜로니 프라이머(도1(g)에서 콜로니 프라이머 2와 3)와 하이브리드를 형성할 수 있는데, 추가적인 프라이머 신장(도1(h))과 가닥 분리(도1(i))후 4개의 고착된 단일 가닥이 만들어진다. 이들 중 2개는 초기 핵산 주형에 상응하는 서열을 보유하고, 다른 2개는 이의 상보성 서열을 보유한다.
도1에서 보인 이상으로 추가 증폭하면, 주형 핵산과 이의 상보적 서열의 고착된 다중 사본으로 구성된 핵산 서열을 만들 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법으로 고착된 단일 핵산 주형으로부터 핵산 콜로니를 만들 수 있고, 핵산 주형의 증폭 수를 변경하여 이들 콜로니의 크기를 조절할 수 있다는 것을 알 수 있다. 따라서, 고착된 각 핵산 주형내에 충분한 수의 고착된 콜로니 프라이머가 존재하는 경우, 고형 지지체의 표면에 형성되는 핵산 콜로니의 수는 지지체에 고착된 초기 핵산 주형의 수에 따라 달라지게 된다. 이런 이유로, 콜로니 프라이머와 핵산 주형이 고착되는 고형 지지체는 적당한 밀도의 고착된 콜로니 프라이머의 잔디로 구성되어야 하는데, 여기서 핵산 주형은 프라이머의 잔디내에 일정한 간격으로 고착된다.
핵산 콜로니의 이런 "자가패턴(autopatterning)"은 핵산의 초기 고착 밀도를 조절하여 밀도를 통제함으로써 더 높은 핵산 콜로니 밀도를 수득할 수 있다는 점에서 기존의 방법에 비하여 유리하다. 따라서, 이런 방법은 지지체의 국소적인 특정 영역에 특정 프라이머를 배열하고, 핵산 주형을 보유한 특정 시료를 프라이머의 동일 국소 영역에 스팟팅(spotting)하여 콜로니 형성을 개시할 필요성이 없다. 기존의 방법, 예를 들면 WO96/04404(Mosaic Technologies, Inc.)에서 공개한 방법을 이용하여 배열할 수 있는 콜로니의 수는 초기 단계에서 특정 프라이머 영역을 배열시킬 수 있는 밀도/간격의 제한을 받는다.
만들어진 핵산 콜로니의 크기와 개별 콜로니상의 핵산 주형의 밀도를 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 핵산 주형의 초기 밀도와 이에 따른 핵산 주형으로부터 만들어진 핵산 콜로니의 밀도를 조절할 수 있음으로 해서, 최적 상황을 달성할 수 있는데, 여기서 핵산 콜로니에서 이후 분석과 모니터링을 실시할 수 있을 만큼 충분한 수의 증폭된 서열을 보유하는 높은 밀도의 개별 핵산 콜로니를 충분한 크기의 고형 지지체에 만들 수 있다.
일단 핵산 콜로니가 만들어지면, 추가적인 단계(예, 콜로니 가시화 또는 서열 결정)를 실시하는 것이 바람직하다. 콜로니 가시화는 특정 핵산 단편의 전체 또는 부분의 존재 또는 부재에 대하여 생성된 콜로니를 선별하는데 필요할 수 있다. 이런 경우에, 특정 핵산 단편을 보유하는 콜로니는 관심있는 핵산 단편과 특이적으로 하이브리드를 형성할 수 있는 핵산 프로브를 지정하여 탐지할 수 있다.
이런 핵산 프로브는 가급적, 형광기, 비오틴 포함 존재(형광기로 표지된 스트렙타비딘과 함께 배양하여 탐지), 방사성표지(당분야에 공지된 방법으로 핵산 프로브내에 통합하고 신틸레이션액 배양으로 방사활성을 검출하여 탐지) 또는 염료나 다른 염색제와 같은 탐지가능 존재로 표지한다.
대안으로, 이런 핵산 프로브는 표지하지 않고, 핵산 중합효소를 이용한 다수의 표지된 뉴클레오티드 통합을 위한 프라이머로 고안한다. 이후, 통합된 표지 및 이에 따른 핵산 콜로니의 검출을 실시할 수 있다.
그 다음, 하이브리드형성을 위한 본 발명의 핵산 콜로니를 준비한다. 이런 준비에는 콜로니를 처리하여 콜로니를 구성하는 핵산 주형의 전부 또는 일부가 단일 가닥 형태로 존재하도록 하는 것이 포함된다. 이것은 콜로니내 임의 이중 가닥 DNA의 열변성으로 달성할 수 있다. 대안으로, 콜로니는 주형 핵산내 이중 가닥 형태의 서열에 특이적인 제한 엔도뉴클레아제로 처리한다. 따라서, 엔도뉴클레아제는 올리고뉴클레오티드 서열 Y 또는 Z에 위치하는 서열 또는 주형 핵산에 존재하는 다른 서열에 특이적이다. 절단후, 콜로니는 가열하여 이중 가닥 DNA 분자를 분리하고, 상기 콜로니는 세척하여 비-고착된 가닥을 제거하고, 따라서 콜로니에는 부착된 단일 가닥 DNA만이 남게 된다.
하이브리드형성을 위한 콜로니 준비후, 표지된 또는 표지되지 않은 프로브는 프로브와 이의 특이적 DNA 서열과의 하이브리드형성에 적합한 조건하에 콜로니에 첨가한다. 이런 조건은 당업자가 결정하게 되는데, 프로브 서열등에 따라 달라지게 된다.
이후, 프로브는 열변성하여 제거하고, 원하는 경우 제 2 핵산에 특이적인 프로브를 하이브리드형성시키고 탐지한다. 이들 단계는 원하는 회수만큼 반복할 수 있다.
핵산 콜로니와 하이브리드를 형성하는 표지된 프로브는 이후, 적당한 탐지 장치를 포함하는 기구를 이용하여 탐지할 수 있다. 형광표지에 적합한 탐지시스템은 고체촬상소자(CCD) 카메라로, 이것은 확대경 장치, 예를 들면, 현미경과 결합시킬 수 있다. 이런 기술을 이용하여, 다수의 콜로니를 병렬식으로 동시에 모니터하는 것이 가능하다. 가령, CCD 카메라가 달린 현미경과 10x 또는 20x 대물렌즈를 이용하여, 1㎟ 내지 4㎟ 표면상의 콜로니를 관찰할 수 있는데, 이것은 10,000 내지 200,000 콜로니를 동시에 모니터하는 것과 동일하다. 또한, 광학의 향상과 칩의 대형화로 이런 수량은 증가할 것으로 예상된다.
만들어진 콜로니를 모니터하는 다른 방법은 콜로니로 덮인 표면을 스캔하는 것이다. 가령, 최대 100,000,000 콜로니를 배열할 수 있는 시스템은 동시에 배열하고, 전체 표면의 사진을 CCD 카메라로 사진을 동시에 모니터할 수 있다. 이런 방식으로, 최대 100,000,000 콜로니를 짧은 시간내에 모니터할 수 있을 것으로 보인다.
표면상의 형광의 탐지와 정량을 가능하게 하는 임의의 다른 장치를 사용하여, 본 발명의 핵산 콜로니를 모니터할 수 있다. 가령, 형광 화상분석기 또는 공초점 현미경을 사용할 수 있다.
표지가 방사활성인 경우, 방사활성 탐지시스템이 필요하다.
만들어진 하나이상의 핵산 콜로니의 서열 결정 단계를 한번이상 실시하는 추가 단계를 실시하는 본 발명의 방법에서, 상기 서열 결정은 임의의 적당한 고형상 서열분석 기술을 이용하여 실시할 수 있다. 가령, 본 발명에 사용할 수 있는 서열 측정 기술에는 "서열분석 프라이머"라고 하는 적당한 프라이머와 서열분석할 핵산 주형의 하이브리드를 형성시키고, 프라이머를 신장하고, 프라이머를 신장하기 위하여 사용된 뉴클레오티드를 탐지하는 것이 포함된다. 가급적, 프라이머를 신장하는데 사용되는 핵산은 추가 뉴클레오티드를 신장하는 핵산 사슬에 첨가하기 전에 탐지하여, 염기단위의in situ핵산 서열분석을 가능하게 한다.
통합된 뉴클레오티드의 탐지는 프라이머 신장 반응에 하나 또는 복수의 표지된 뉴클레오티드를 포함시켜 용이하게 한다. 임의 적당한 탐지가능 표지, 예를 들면, 형광단, 방사표지등을 사용할 수 있다. 가급적, 형광표지를 사용한다. 상이한 각 유형의 뉴클레오티드에 대하여 동일한 또는 상이한 표지를 사용할 수 있다. 표지가 형광단이고 상이한 각 유형의 뉴클레오티드에 대하여 동일한 표지를 사용하는 경우, 각 뉴클레오티드 통합은 특정 파장에서 탐지되는 신호를 점진적으로 증가시킬 수 있다. 상이한 표지를 사용하는 경우, 이들 신호는 상이한 파장에서 탐지할 수 있다. 원하는 경우, 표지된 뉴클레오티드와 표지되지 않은 뉴클레오티드를 혼합하여 제공한다.
적당한 서열분석 프라이머와 서열분석할 핵산 주형의 하이브리드형성을 가능하게 하기 위하여, 핵산 주형은 일반적으로 단일 가닥 형태가 된다. 핵산 콜로니를 구성하는 핵산 주형이 이중 가닥 형태로 존재하는 경우, 이들은 당분야에 공지된 기술, 예를 들면, 변성, 절단등을 이용하여 단일 가닥 핵산 주형으로 가공할 수있다.
핵산 주형과 하이브리드를 형성하고 프라이머 신장에 사용되는 서열분석 프라이머는 가급적 짧은 올리고뉴클레오티드, 예를 들면 15 내지 25개 뉴클레오티드를 보유한다. 프라이머 서열은 가급적 스트리젼트 조건하에, 서열분석할 핵산 주형의 일부와 하이브리드를 형성하도록 고안한다. 서열분석에 사용하는 프라이머 서열은 본 발명의 핵산과 콜로니를 만드는데 사용되는 콜로니 프라이머의 서열과 유사한 또는 동일한 서열을 보유할 수 있다. 서열분석 프라이머는 용액 형태로 또는 고착된 형태로 제공할 수 있다.
당분야에 공지된 방법으로 핵산 주형과 서열분석 프라이머를 적당한 조건에 처리하여 서열분석 프라이머가 핵산 주형에 어닐링되면, 예로써 핵산 중합효소와 뉴클레오티드(상기 뉴클레오티드중 적어도 일부는 표지된다) 및 제공된 뉴클레오티드가 적절한 경우 프라이머 신장에 적합한 조건을 이용한 프라이머 신장을 실시한다. 핵산 중합효소와 사용할 수 있는 뉴클레오티드의 예는 전술하였다.
가급적, 각 프라이머 신장단계후 세척 단계를 포함시켜, 이후 단계를 간섭하는 통합되지 않은 뉴클레오티드를 제거한다. 일단 프라이머 신장 단계가 종결되면, 표지된 뉴클레오티드가 신장된 프라이머에 통합되었는 지를 측정하기 위하여 핵산 콜로니를 모니터한다. 이후, 프라이머 신장 단계를 반복하여 신장된 프라이머로 통합된 이후의 뉴클레오티드를 결정한다.
적당한 표지, 예를 들면, 형광 또는 방사활성의 탐지와 정량을 가능하게 하는 임의의 장치를 서열 결정에 사용할 수 있다. 표지가 형광인 경우, 확대경장치(전술함)에 부착된 CCD 카메라를 사용할 수 있다. 실제로 본 발명의 측면을 결정하는 서열에 사용하는 장치는 증폭된 핵산 콜로니를 모니터하기 위하여 전술한 것들과 동일하다.
탐지 시스템은 각 프라이머 신장후 각 콜로니에 통합된 뉴클레오티드의 수와 성격을 측정하기 위하여 분석시스템과 병용한다. 각 프라이머 신장 단계직후 또는 이후 기록된 데이터를 사용하여 실시할 수 있는 이런 분석은 임의 콜로니내 핵산 주형 서열의 결정을 가능하게 한다.
결정할 서열이 미지인 경우, 임의 콜로니에 적용할 수 있는 임의 뉴클레오티드는 일반적으로 분석동안 반복되는 순서, 예를 들면, dATP, dTTP, dCTP, dGTP로 첨가한다. 하지만, 결정할 서열이 공지이고, 예로써 공지된 서열사이의 차이가 존재하는 지를 분석하기 위하여 재서열분석하는 경우, 서열분석 결정 과정은 적당한 순서로 공지된 서열에서 선택된 뉴클레오티드를 각 단계에서 첨가하여 가속화시킬 수 있다. 따라서, 임의 서열과의 차이는 프라이머의 특정 단계에서 특정 뉴클레오티드의 결핍으로 탐지한다.
따라서, 특정 핵산 콜로니를 구성하는 증폭된 핵산 주형의 전장 또는 부분 서열은 본 발명의 방법을 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 하나이상 핵산의 전장 또는 부분 서열은 하나이상의 핵산 콜로니에 존재하는 증폭된 핵산 주형의 전장 또는 부분 서열을 측정하여 결정할 수 있다. 가급적, 복수의 서열은 동시에 측정한다.
본 발명의 방법을 사용하여 핵산의 서열 결정을 실시하는 것은 서열분석할다수의 각 핵산이 본 발명의 각 핵산 콜로니로 제공되기 때문에 신뢰할 수 있다는 점에서 유리하다. 원하는 경우, 서열분석할 동일 핵산 주형으로 구성된 복수의 핵산 콜로니를 제공하고, 복수의 각 콜로니에 대한 서열을 결정하고, 이렇게 결정된 서열을 비교하여 신뢰도의 추가적인 향상을 꾀할 수 있다.
가급적, 고형 지지체에 대한 콜로니 프라이머와 핵산 주형의 부착은 핵산 증폭 반응동안 지지체의 처리 온도, 예를 들면, 최대 100℃, 대략 94℃ 온도에서 열안정성을 보인다. 가급적, 공유결합시켜 부착시킨다.
본 발명의 다른 구체예에서, 고형 지지체에 대한 콜로니 프라이머와 핵산 주형의 공유부착은 교차결합제(예, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산(EDC), 무수호박산, 페닐디이소티오시아네이트 또는 무수말레산), 또는 헤테로-이중기능 교차연결제(예, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니미드 에스테르(MBS), N-숙시니미딜[4-요오도아세틸]아미노벤조에이트(SIAB), 숙시니미딜 4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥사-1-카라븍실레이트(SMCC), N-Y-말레이미도부틸일옥시-숙시니미드 에스테르(GMBS), 숙시니미딜-4-[P-말레이미도페닐]부틸레이트(SMPB), 설포(수용성)상응 화합물)로 유도한다. 본 발명에서 사용하기 적절한 교차결합제는 s-SIAB, s-MBS, EDC이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 고형 지지체는 유도면을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 고형 지지체의 유도면은 이중기능 교차결합기로 이후 변형하여, 가급적 반응성 교차연결기를 보유하는 기능화된 표면을 제공한다.
이 글에서 "유도면(Derivatised surface)"는 특정 기능기, 예를 들면 말레산기능성분 또는 호박산 기능성분로 변형시킨 유도면을 의미한다.
특정 용도에 적합한 본 발명의 방법에서, 고형 지지체에 대한 콜로니 프라이머와 핵산 주형의 부착은 몇 가지 요구사항을 충족시켜야 한다. 이상적인 부착은 핵산 증폭 과정동안 동원되는 고온 노출과 반복적인 가열/냉각의 영향을 받지 않아야 한다. 또한, 지지체는 적어도 1 fmol/㎟, 바람직하게는 적어도 10 fmol/㎟, 좀더 바람직하게는 30 내지 60 fmol/㎟의 밀도로 부착된 콜로니 프라이머를 보유할 있어야 한다. 이상적인 지지체는 낮은 형광 배경을 갖는 균일하게 편평한 표면을 보유하고, 또한 열에 안정해야 한다(비-변형가능). 특정 형태의 인공 니트로셀룰로오스 막과 합성 니트로셀룰로오스 막과 같은 DNA를 수동 흡수할 수 있는 고형 지지체는 바람직하지 않다. 최종적으로, 고형 지지체는 분해가능해야 하고, 따라서 가격이 저렴해야 한다.
이런 이유로, 고형 지지체는 핵산이 부착될 수 있는 임의의 고형 표면, 예를 들면, 락테스 비드, 덱스트란 비드, 폴리스틸렌, 폴리프로필렌 표면, 폴리아크릴아마이드 겔, 금 표면, 유리 표면, 실리콘 와이퍼가 가능하지만, 가급적 고형 지지체는 유리 표면이고 이에 대한 핵산의 부착은 공유부착이 된다.
고형 지지체에 대한 콜로니 프라이머와 핵산 주형의 공유결합은 당분야에 공지된 기술을 이용하여 실시할 수 있다. 가령, 세공성 유리 비드와 같은 고형 지지체에서 올리고뉴클레오티드의 에폭시실란-아미노 공유결합은 올리고뉴클레오티드의in situ합성(3'말단 부착을 통해)에서 고형상에 대하여 광범위하게 사용되고 있고, 또한 5'말단 올리고뉴클레오티드 부착에도 응용되고 있다. 카르복실성분 또는알데하이드성분으로 5'말단을 수식한 올리고뉴클레오티드는 하이드라진-유도된 라텍스 비드에 공유부착시켰다(Kremsky et al. 1987).
고체 표면에 올리고뉴클레오티드를 부착하기 위한 다른 방식은 교차결합제, 예를 들면, 무수호박산, 페닐디이소티오시아네이트(Guo 3t al 1994) 또는 무수말레산(Yang et al 1998)을 이용하는 것이다. 광범위하게 사용되는 다른 교차결합제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디미이드 염산(EDC)이다. EDC의 화학적 성상은 5'말단 인산기를 통해 DNA 주형을 종이(셀룰로오스)에 부착시켰던 Gilham et al(1968)이 최초로 제시하였다. EDC의 화학적 성상을 이용하여, 락테스 비드(Wolf et al 1987, Lund et al 1988), 폴리스틸렌 미소웰(Rasmussen et al 1991), 조절된-세공 유리(Ghosh et al 1987), 덱스트란 분자(Gingeras et al 987)와 같은 다른 지지체를 사용하였다. 카르보디미이드 매개된 시약으로 5'아미노-변형된 올리고뉴클레오티드의 축합은 5'말단 인산 변형기에 대하여 Chu et al(1983)과 Egan et al(1982)이 제시하였다.
카르보디이미드를 이용하는 5'말단을 통한 올리고뉴클레오티드 부착의 수율은 60%까지 달성할 수 있지만, 올리고뉴클레오티드의 내부 뉴클레오티드를 통한 비-특이적 부착이 주요 단점이다. Rasmussen et al(1991)은 2차 아미노기를 이용하여 표면을 유도함으로써, 5'말단을 통한 특이적 부착을 85%까지 향상시켰다.
좀더 최근에는, 헤테로-이중기능 교차결합제의 장점이 보고되고 있다. 헤테로-또는 모노-이중기능 교차-결합제는 동물에서 면역원성을 향상시키기 위한 펩티드 담체 공액된 분자를 준비하는데 광범위하게 사용되고 있다(Peeters et al1989). 이들 부착 시약 대부분은 수용액에서 안정적인 공유결합을 형성하는 것으로 알려지고 있다. 이들 교차결합 시약은 고체 표면 분자의 임의 지점에 DNA를 결합시키는데 사용되고 있다.
Chrisey et al (1996)은 6개의 상이한 헤테로-이중기능 교차결합제를 이용한 DNA 고형상 부착의 효율과 안정성을 조사하였다. 이런 경우, 부착은 티올기로 변형된 DNA 저량체의 5'말단에서만 일어난다. 이런 형태의 부착은 MALDI-TOF 서열 분석에서 DNA 표적의 부착에 대하여 O'Donnell-Maloney et al(1996)이 제시하고 있고, 고체 표면에서 핵산의 염기 서열을 결정하는데 대하여 Hamamatsu Photonics F.K. company(EP-A-665293)가 제시하였다.
고형 지지체에 대한 올리고뉴클레오티드 부착의 열안정성에 관한 연구는 거의 이루어지지 않고 있다. Chrisey et al(1996)은 숙시니미딜-4-[p-말레이미도페닐]부틸레이트(SMPB) 교차결합제의 경우, 열처리동안 유리 표면으로부터 거의 60%의 분자가 방출된다고 보고하였다. 하지만, 다른 시약의 열안정성은 제시되지 않고 있다.
본원에서 제시한 고형상 증폭 반응을 통해 핵산 콜로니를 만들려면, 콜로니 프라이머와 핵산 주형은 5'말단에서 고체 표면(가급적, 유리)과 특이적으로 부착되어야 한다. 간단히 말하면, 유리 표면은 아미노-알콕시 시레인을 이용한 실리콘화에 의해 반응성 아미노기로 유도할 수 있다. 적절한 시레인 시약에는 아미노프리필트리메톡시-시레인, 아미노프로필트리에톡시시레인, 4-아미노부틸트리에톡시레인이 포함된다. 유리 표면은 다른 반응성 기, 예를 들면, 에폭시시레인을 이용한 아클릴레이트 또는 에폭시, 아크릴아테시레인, 아크릴아미드시레인으로 유도할 수 있다. 유도 단계후, 5'말단에 화학적으로 변형가능한 기능기(예, 인산염기, 티올기 또는 아미노기)를 보유한 핵산 분자(콜로니 프라이머 또는 핵산 주형)는 전술한 바와 같이 교차결합제로 유도된 표면에 공유부착시킨다.
대안으로, 유도 단계후 표면 아미노기에 이중기능 교차결합제를 부착시켜 변형기능화된 표면을 제공한다. 이후, 5'-인산염기, 티올기 또는 아미노기를 보유한 핵산 분자(콜로니 프라이머 또는 핵산 주형)는 기능화된 표면과 반응시켜 핵산과 유리사이에 공유결합을 형성시킨다.
고페 표면에 공유 DNA/올리고뉴클레오티드 부착에 사용할 수 있는 잠재적 교차결합과 접합 시약에는 무수호박산, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산(EDC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니미드 에스테르(MBS), N-숙시니미딜[4-요오도아세틸]아미노벤조에이트(SIAB), 숙시니미딜 4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥사-1-카라븍실레이트(SMCC), N-Y-말레이미도부틸일옥시-숙시니미드 에스테르(GMBS), 숙시니미딜-4-[P-말레이미도페닐]부틸레이트(SMPB), 설포(수용성)상응 화합물)로 유도한다. 본 발명에서 적절한 교차결합제는 s-SIAB, s-MBS, EDC이다. s-MBS는 말레이미드-숙시니미드 헤테로-이중기능 교차결합체이고, s-SIAB는 요오도아세틸-숙시니미드 헤테로-이중기능 교차결합제다. 이들은 각각 SH기와 일차 아미노기와 공유결합을 형성할 수 있다. EDC는 인산염기와 아미노기의 공유부착을 매개하는 카르보디이미드-시약이다.
콜로니 프라이머와 핵산 주형은 일반적으로 인산염기 또는 일차아미노기(EDC 접합시약의 경우)로, 또는 티올기(s-SIAB 또는 s-MBS 결합제의 경우)로 5'말단에서 변형시킨다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 전술한 바와 같이 복수의 콜로니 프라이머 X와 하나이상의 핵산 주형이 부착되는 고형 지지체를 제공하는데, 여기서 상기 핵산 주형은 전술한 바와 같이 5'말단에 올리고뉴클레오티드 서열 Y를, 3'말단에 올리고뉴클레오티드 서열 Z를 보유한다. 가급적, 복수의 핵산 주형을 상기 고형 지지체(주로, 유리)에 부착시킨다. 가급적, 고형 지지체에 대한 핵산 주형과 콜로니 프라이머의 부착은 공유결합이다. 전술한 방법으로 고착된 핵산주형에서 1회 또는 수회의 핵산 증폭을 실시하여, 본 발명의 핵산 콜로니를 만들 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 하나 또는 복수의 핵산 콜로니로 구성되는 지지체가 된다. 본 발명의 또 다른 측면은 핵산 증폭 또는 서열분석의 방법에서 본 발명에 따른 고형 지지체의 용도를 제공한다. 이런 핵산 증폭 또는 서열분석 방법에는 본 발명의 방법이 포함된다.
본 발명의 또 다른 측면은 핵산 증폭 또는 서열분석의 방법으로 전술한 바와 같이 만들어진 유도된 또는 기능화된 지지체의 용도를 제공한다. 이런 핵산 증폭 또는 서열분석 방법에는 본 발명의 방법이 포함된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 방법을 실행하기 위한 장치 또는 본 발명에 따른 핵산 콜로니로 구성되는 고형 지지체를 생산하기 위한 장치를 제공한다. 이런 장치는 전술한 바와 같이 핵산 중합효소, 복수의 뉴클레오티드 전구물질, 온도를 조절하기 위한 수단과 함께, 고형 지지체에 공유결합된 본 발명에 따른복수의 핵산 주형과 콜로니 프라이머로 구성될 수 있는데, 여기서 상기 뉴클레오티드 전구물질중 일부는 표지한다. 대안으로, 상기 장치는 본 발명에 따른 하나 또는 복수의 핵산 콜로니로 구성되는 지지체로 구성될 수도 있다. 가급적, 상기 장치는 본 발명의 방법에 따라 고형 지지체에 배열되어 있는 개별 핵산 콜로니로부터 신호를 탐지하고 구분하기 위한 탐지 수단을 포함한다. 가령, 이런 탐지 수단은 전술한 바와 같이 현미경과 같은 확대경 장치에 연결되어 작동하는 고체촬상소자로 구성된다.
가급적, 본 발명의 임의 장치는 자동화형태로 제공한다.
본원은 유전체학, 약물유전체학, 약물 발견, 식품 특성화, 유전자형 확정 분야에서 연자와 생물공학업계가 해결하기 위해 노력하고 있는 요구사항에 대한 해결방안을 제공한다. 따라서, 본 발명의 방법은 다음과 같은 분야에 응용할 수 있다: 핵산 서열분석과 재-서열분석, 진단과 스크리닝, 유전자 발현 모니터링, 유전적 다양성 프로파일링, 전체 게놈 다형성 발견과 기록, 게놈 슬라이드(현미경 슬라이드상의 환자의 전체 게놈) 제작, 전체 게놈 서열분석.
본 발명은 핵산 서열분석과 재-서열분석을 실행하는데 사용할 수 있는데, 여기서 다수의 선택된 유전자는 전체 DNA 서열분석을 위해 콜로니로 특이적으로 증폭된다. 유전자 재-서열분석은 조사한 유전자의 모든 공지된 또는 신규한 유전자 다형성의 동정을 가능하게 한다. 본원은 살아있는 미생물의 의학적 진단과 유전자 동정에 응용한다.
본 발명의 진단과 스크리닝 용도에서, 전체 게놈 또는 게놈의 일부는 공지된단일 뉴클레오티드 변이(SNP)의 DNA 서열분석을 위해 콜로니로 증폭시킬 수 있다. SNP 동정은 질병과 관련된 유전적 위험 요소를 동정하기 위한 의학적 유전연구에 응용한다. SNP 유전자형 확정 또한, 특정 약물을 이용한 환자의 동정과 치료를 위한 약물유전체학에서 진단목적으로 응용한다.
본 발명의 유전적 다양성 프로파일링 용도에서, 미생물, 세포 또는 조직의 개체군은 동일 DNA를 콜로니로 증폭시키고, 이후 개별 유전자 존재에 대한 특이적인 "태그(tag)"의 DNA를 서열분석하여 동정할 수 있다. 이런 방식에서, 시료의 유전적 다양성은 각 개별 존재로부터 태그 수를 계수하여 밝힐 수 있다.
본 발명의 유전자 발현 모니터링 용도에서, 조사중인 조직 또는 미생물의 발현된 mRNA 분자는 cDNA로 전환하고, 이는 DNA 서열분석을 위해 콜로니 세트로 증폭시킨다. 임의의 mRNA를 코딩하는 콜로니의 빈도는 초기 조직에 존재하는 mRNA 분자의 빈도에 비례한다. 유전자 발현 모니터링의 생물 의학 연구에 적용한다.
살아있는 미생물의 전체 게놈 서열을 포함할 수 있을 만큼 충분한 수의 DNA 콜로니로 전체 게놈 미생물을 나타내는 전체 게놈 슬라이드는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 준비할 수 있다. 게놈 슬라이드는 임의 살아있는 미생물의 유전자 카드다. 유전자 카드는 산업적으로 유용한 살아있는 미생물의 의학 연구와 유전자 동정에 응용한다.
본 발명은 또한, 전체 게놈 서열분석을 실시하는데 사용할 수 있는데, 여기서 살아있는 미생물의 전체 게놈은 광범위한 DNA 서열분석을 위한 콜로니 세트로 증폭된다. 전체 게놈 서열분석은 예를 들면, 1) 임의 살아있는 미생물의 유전자계통의 정확한 동정; 2) 게놈내에 인코드된 신규한 유전자의 발견; 3) 신규한 유전적 다형의 발견을 가능하게 한다.
본 발명의 응용은 단일 미생물/환자의 핵산 시료의 분석에 한정하지 않는다. 가령, 핵산 태그는 핵산 주형에 통합하여 증폭할 수 있고, 각 미생물/환자에 대하여 상이한 핵산 태그를 사용할 수 있다. 따라서, 증폭된 핵산 서열이 결정할 때 태그 서열과 동정한 시료의 출처를 결정할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 서열분석과 재-서열분석, 진단과 스크리닝, 유전자 발현 모니터링, 유전적 다양성 프로파일링, 전체 게놈 다형성 발견과 기록, 게놈 슬라이드(현미경 슬라이드상의 환자의 전체 게놈) 제조, 전체 게놈 서열분석 또는 핵산의 증폭이나 이의 서열분석에서 다른 임의 응용 목적의 핵산 분자를 제공하기 위한 본 발명에 따른 방법, 본 발명에 따른 핵산 콜로니, 본 발명에 따른 고형 지지체의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 서열분석과 재-서열분석, 진단과 스크리닝, 유전자 발현 모니터링, 유전적 다양성 프로파일링, 전체 게놈 다형성 발견과 기록, 게놈 슬라이드(현미경 슬라이드상의 환자의 전체 게놈) 제조, 전체 게놈 서열분석 또는 핵산의 증폭이나 이의 서열분석에서 다른 임의 응용에서 사용하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 전술한 바와 같이 고형 지지체에 결합된 본 발명에 따른 복수의 핵산 주형과 콜로니 프라이머로 구성된다.
본 발명은 아래와 같은 도면을 참고로 하여 다음의 무제한적 실시예에서 좀더 자세하게 상술한다.
본 발명은 핵산 증폭과 서열분석에 관한다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 핵산 증폭과 서열분석 방법 및 핵산의 대규모 고성능 증폭과 서열분석에 적합한 장치와 키트에 관한다.
도1은 본 발명의 구체예에 따른 핵산 콜로니 제조 방법의 개요도를 보여준다.
도2는 주형 제조 및 이후 고형 지지체에 대한 부착의 개요도를 보여준다. 도2a에서 콜로니 프라이머 서열을 보유한 주형 A, B, B'의 제조를 보인다. 3.2Kb 주형은 PCR 프라이머 TP1과 TP2를 이용하여 게놈 DNA로부터 만든다. 주형 A(854 bp)와 B(927 bp)는 각각 PCR 프라이머 TPA1/TPA2 또는 TPB1/TPB2를 이용하여 만든다. TPA1와 TPB1 올리고뉴클레오티드는 이후의 화학적 부착(*)을 위해, 5'말단을 인산염기 또는 티올기로 변형한다. 수득된 주형은 콜로니 프라이머 CP1 및/또는 CP2에 상응하는 서열을 보유하게 된다. 유전자의 11개 엑손은 "E1 내지 E11"로 표시한다. 도2b에서 유리 표면에 대한 콜로니 프라이머와 주형의 화학적 부착을 보인다. ATS(아미노프로필-트리에톡시시레인)에 의한 유도를 예시한다.
도3은 콜로니 프라이머로부터 만들어진 DNA 콜로니를 보여준다. 여기에서 20X 필드당 관찰된 콜로니 수는 웰에 결합된 주형의 농도 함수로 나타낸다. 탐지가능한 주형의 가장 낮은 농도는 10-13M에 해당한다.
도4는 2가지 상이한 주형으로부터 유래된 콜로니사이의 차이를 보여준다. 도4a는 양 주형과 네거티브 대조군으로부터 만들어진 콜로니의 영상을 보여준다. 도4b는 2가지 상이한 색깔로 가시화시킨 동일 웰내 동일 위치상의 양 주형 및 네거티브 대조군의 콜로니를 보여준다. 도4c는 현미경 필드의 서브-섹션에서 양 콜로니 유형의 좌표를 보여준다. 도4c는 상이한 주형의 콜로니가 일치하지 않는다는 것을 입증한다.
도5는 유리에서 주형 또는 올리고뉴클레오티드 부착의 반응식을 보여준다. 단계 A는 표면의 유도다: 유리 슬라이드는 표면에서 자유 하이드록실기를 강화하기 위하여 산성용액으로 처리한다. 사전처리된 슬라이드는 아미노시레인 용액에 담근다. ATS: 아미노프로필 트리에톡시시레인. 단계 B: 단계 B1 또는 B2는 교차결합제를 이용한 유리 표면의 기능화 및 이후의 올리고뉴클레오티드 부착이다. 아미노기는 아마이드 결합을 통하여 교차결합제와 상호작용한다: 단계 B1; s-MBS(설포 m-말레이미도벤조일-N-하이드록시-숙시니미드 에스테르) 단계 B2; s-SIAB(설포 N-숙시니미딜[4-요오도아세틸]아미노벤조에이트). 올리고뉴클레오티드(5'말단 티올변형된 올리고뉴클레오티드)는 티올사이의 공유결합과 말레이미드의 공유결합 형성을 통하여 표면에 부착된다. 인산염 완충식염수: (PBS, 0.1M NaH2PO4, pH:6.5, 0.15M NaCl). B3: EDC와 이미다졸을 이용한 올리고뉴클레오티드의 부착. 변형된 올리고뉴클레오티드의 5'말단 인산염은 EDC 존재하에 이미다졸과 반응시켜, 5'-인산염-이미다졸 유도체(나타내지 않음)를 만든다. 상기 유도체는 유도된 유리 표면의 아미노기와 포스포아미데이트 결합을 형성한다. EDC: 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)-카르보디이미드 염산.
도6은 20X 필드당 관찰된 콜로니의 수를 웰에 결합된 주형의 농도함수로 보여준다. DNA 주형은 아미노 유도된 유리 표면(A) 또는 s-MBS 기능화된 유리표면(B)에서 매개된 결합시약(EDC)을 통하여 상이한 농도로 결합한다. 이중 가닥 DNA 콜로니는 제한 효소에 처리하고, 회수된 단일 가닥은 cy5 형광표지된 상보성 올리고뉴클레오티드와 하이브리드를 형성시켰다.
도7은 유리에 만들어진 DNA 콜로니로부터in situ서열분석의 실례를 보여준다. 도7A는 프라이머 p181과 함께 배양하지 않은 시료에서, Cy5TM-dCTP 배양한 후의 결과를 보여준다. 5개의 흐릿한 점을 관찰할 수 있는데, 이것은 급격한 가성(假性) 효과(예, Cy5TM-dCTP 응집침전, 흡수 또는 콜로니 또는 표면상의 DNA에 대한 비-특이적 통합)가 발생하지 않는다는 것을 시사한다. 도7B는 프라이머 p181과 함께 배양한 시료에서, Cy5TM-dCTP 배양한 후의 결과를 보여준다. 형광 점은 관찰되지 않는데, 이것은 통합되는 뉴클레오티드가 하이브리드형성된 프라이머 다음에 오는 주형의 서열과 일치하지 않는 경우 형광염기의 통합이 탐지가능한 양으로 발생하지 않는다는 것을 시사한다. 도7C는 프라이머 p181과 함께 배양한 시료에서, Cy5TM-dCTP 배양한 후의 결과를 보여준다. 다수의 형광 점을 관찰할 수 있는데, 이것은 통합되는 뉴클레오티드가 하이브리드형성된 프라이머 다음에 오는 주형의 서열과 일치하는 경우 형광염기의 통합이 탐지가능한 양으로 발생한다는 것을 시사한다.
도8은 PCR 주기전후에, Nucleolink에 부착된 올리고뉴클레오티드에 대한 프로브의 하이브리드 형성을 보여준다. 도면은 CP2(5'-(인산염)-TTTTTTTTTTGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)(닫힌 원), CP8(5'-(아미노-헥사메틸렌)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAG GAAAGGGAAAGGG(닫힌 삼각형), CP9(5'(하이드록시)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGA AAGGG(다이아몬드), CP10(5'(디메톡시트리틸)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG (열린 원), CP11(5'(비오틴)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)(열린 삼각형)에 대한 R58 하이브리드형성을 보여준다.
실시예 1: DNA 콜로니를 만드는데 적합한 DNA 주형 준비
DNA 주형 및 콜로니 프라이머에서 DNA 콜로니를 만들었다. 여기에서 "콜로니 프라이머 서열"이란 콜로니 프라이머의 서열에 상응하는 서열로써, "올리고뉴클레오티드 서열 Y" 또는 "올리고뉴클레오티드 서열 Z"라고 한다.
콜로니 프라이머의 성질은 열에 안정한 DNA 중합효소 존재하에, 비-특이적인 뉴클레오티드 결합이 거의 없는 올리고뉴클레오티드 프라이머 선별에 기초한다. 콜로니 프라이머 CPα(5'-p CACCAACCCAAACCAACCCAAACC) 및 CPβ(5-p' AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)를 선택하였는데, 표준 완충액 및 온도 변환 과정(94℃에서 30초, 65℃에서 1분, 72℃에서 2분, 총 50회)조건에서 안정한 DNA 중합효소(AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA) 존재하에 방사능 표지된 [α32p-dCTP]가 적게 결합하기 때문이다.
콜로니 프라이머 및 DNA 주형을 이용한 콜로니 발생 가능성을 설명하기 위한 모델 시스템으로 3.2Kb DNA 단편을 취한다. 선택된 주형은 진행된 글리코실화 최종 생성물에 대한 수용체용 사람 유전자(HUMOXRAGE, GenBank Acc. No. D28769)로 구성된다. 표 1에서는 RAGE-특정 프라이머를 나타내고 있다. 표준 완충액 및 온도 변환 과정(94℃에서 30초, 65℃에서 1분, 72℃에서 2분, 총 40회)조건에서, 0.1㎍ 사람 게놈 DNA 및 1μM 프라이머 TP1 및 TP2, 1Unit DNA 중합효소(AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA)를 이용한 PCR 증폭실험에 의해 3.2kb 주형을 얻었다. 이와 같은 3.2kb DNA 주형을 2차 PCR의 주형으로 이용하여, 콜로니 발생의 두 개 짧은 주형(주형 A 및 B)을 만든다. 짧은 주형을 만드는데 이용된 프라이머에는 고형상에서 DNA를 증폭시키기 위해 주형에 특이적인 서열 및 콜로니 프라이머 CP1 및 CP2의 서열 모두를 가지고 있다. 일반적으로, DNA 주형을 만드는데 이용되는 PCR 프라이머는 인산 또는 티올 부분이 있는 5' 말단에서 변형된다. 따라서, PCR 증폭후에, DNA 단편은 원하는 RAGE DNA 단편에 인접하고 있는 한쪽 또는 양쪽의 말단에 있는 콜로니 프라이머 서열을 포함하도록 만들어진다(도 2a 참고).
주형 A(이중 가닥 주형은 양 말단에 콜로니 프라이머 서열 CPβ을 포함한다)는 표준 완충액 및 온도 변환 과정(94℃에서 30초, 65℃에서 1분, 72℃에서 2분, 총 30회)조건에서, 0.1ng 3.2Kb 주형과 1μM 프라이머 TPA1 및 1μM TPA2 그리고 1 unit DNA 중합효소(AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA)를 이용하여 만든다. 생성물은 그 다음 Quagen Qia-quick 컬럼(Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 상에서 정제하였다.
주형 B(CPβ에 상응하는 콜로니 프라이머 서열을 포함하는 이중 가닥 주형)는 표준 완충액 및 온도 변환 과정(94℃에서 30초, 65℃에서 1분, 72℃에서 2분,총 30회)조건에서, 0.1ng 3.2Kb 주형과 1μM 프라이머 TPB1 및 1μM TPB2 그리고 1 unit DNA 중합효소(AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA)를 이용하여 만든다. 생성물은 그 다음 Quagen Qia-quick 컬럼(Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 상에서 정제하였다.
주형 B'(양단에서 CPα 및 CPβ에 상응하는 콜로니 프라이머 서열을 포함하는 이중 가닥 주형)는 표준 완충액 및 온도 변환 과정(94℃에서 30초, 65℃에서 1분, 72℃에서 2분, 총 30회)조건에서, 0.1ng 3.2Kb 주형과 1μM 프라이머 TPB3 및 1μM TPB4 그리고 1 unit DNA 중합효소(AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA)를 이용하여 만든다. 생성물은 그 다음 Quagen Qia-quick 컬럼(Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 상에서 정제하였다.
DNA 주형 준비 및 DNA 콜로니 발생에 이용되는 모든 특정 올리고뉴클레오티드는 표 1에 나타내었고, 임의 화학적 변형부분에 대해서도 설명을 하고 있다.
도 2b에서는 표리 표면에 콜로니 프라이머 및 주형을 화학적으로 부착시키는 일반적인 과정에 대해 보고하고 있고, 이때, ATS(아미노프로필트리에톡시실란)에 의한 유도를 설명하고 있으나, 이에 한정시키지는 않는다.
표 1a
표 1b
실시예 1a; 축중 프라이머가 인접해있는 무작위 DNA 주형 준비
3.2Kb DNA 단편을 모델 시스템으로 취하여, 무작위 프라이머 PCR 증폭으로부터 콜로니 발생 가능성을 설명하였다. 이와 같은 전략은 전체 게놈에 단편을 복합시켜, 길이가 약 100Kb인 DNA 단편을 서열분석에 이용할 수 있다. 3.2Kb DNA 단편은 다음의 PCR 프라이머를 이용하여 사람의 게놈 DNA에서 얻을 수 있다; 실시예 1에서 설명한 PCR 프라이머 TP1 5'-pGAGGCCAGAACAGTTCAAGG; TP2 5'-pCCTGTGACAAGACGACTGAA. 3.2Kb 단편을 제한 효소(EcoR1 및 HhaI을 이용하여 대략 800bp인 4개 단편)로 복합 절단하여 작은 단편을 만든다. 그 다음 절단된 단편 및절단안된 단편을 축중 프라이머인 p252(5'-P TTTTTTTTTTISISISISISISIS, 이때 I는 이노신(즉, A, T, C와 짝을 이루는)을 나타내고, S는 G 또는 C를 나타낸다)와 혼합하고, Nucleolink 웰(Nunc, Denmark)에 공유부착시킨다. 그 다음 튜브는 무작위 고형상 PCR 증폭을 하게 하여, 표지된 DNA 프로브로 하이브리드 반응으로 볼 수 있다(이는 실시예 2a에서 설명함).
실시예 2: 고형상 지지체(플라스틱)상에서 DNA 주형 및 콜로니 프라이머의 공유 결합 및 콜로니 프라이머와 콜로니 형성
고형상 지지체(플라스틱)에 주형 및 콜로니 프라이머의 공유 결합
5'말단에 포스포릴화된 콜로니 프라이머(Microsynth GmbH, Switzerland)인 (CP2, 5'-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)를 Nucleolink 플라스틱 미소역가 웰(Nunc, Denmark)상에 부착시키는데, 이때 다양한 양의 주형 A(실시예 1에서 설명한 것과 같이 준비한)를 이용한다. 8개 웰이 한 세트가 이중 반복되어 구성되고, 주형을 CP2로 7회 1/10 희석한 것으로, 최고 농도 1nM에서 시작한다.
CP2 콜로니 프라이머 및 주형이 공유부착하게 되는 미소역가 웰은 다음과 같이 준비한다. 각 Nucleolink 웰에서 1μM 콜로니 프라이머 용액 30㎕(이는 10mM 1-메틸-이미다졸(pH 7.0)(Sigma Chemicals)에서 1nM에서 주형의 농도를 다양하게 희석한 것)을 첨가한다. 각 웰에서, 40mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(pH 7.0)(Sigma Chemicals)/10mM 1-메틸-이미다졸 용액10㎕를 콜로니 프라이머 및 주형 용액에 첨가하였다. 그 다음 웰을 봉하고, 50℃에서 하룻밤동안 배양시킨다. 배양 후에, 웰은 200㎕ RS(0.4 N NaOH, 0.25% Tween 20)으로 2회 세척하고, 200㎕ RS로 15분간 배양시키고, 200㎕ RS로 2회 씻은 후에, 200㎕ TNT(100mM TrisHCl pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)로 2회 씻어낸다. 튜브는 50℃상에서 건조시키고, 4℃에서 봉해진 플라스틱 봉지에 보관한다.
콜로니 생성
각 웰에서 콜로니 생장은 20㎕ PCR 혼합물; 4개 dNTPs(0.2mM), 0.1% BSA(소 혈청 알부민), 0.1% Tween 20, 8% DMSO(디메틸설폭시드, Fluka, Switzerland), 1X PCR 완충액, 0.025 units/㎕ AmpliTaq DNA 중합효소(Perkin Elmer, Foster City, CA)를 이용하여 시작된다. 그 다음 웰을 터모사이클러에 넣고, 94℃에서 5분간 봉해진 웰을 배양하고, 다음의 조건에서 50외 과정을 반복하여 실시하였다(94℃에서 30초, 65℃에서 2분, 72℃에서 2분). 이와 같은 과정이 끝난 후에, 웰은 사용할 때까지 8℃에 보관한다. 하이브리드반응 전에, 웰에 50㎕ TE(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 7.4)를 넣어 채우고, 5분간 94℃에서 가열한후에, 45℃에서 프로브를 첨가하기 전에 얼음상에서 냉각시킨다.
콜로니 가시화
프로브: 프로브는 3'말단(뉴클레오티드 위치 8405에서 9259까지)에 주형 서열을 가지는 1405 염기쌍으로 된 DNA 단편이 된다. PCR에서 두 개의 프라이머 즉, 염기 8405에서 증폭된 p47(5'-GGCTAGGAGCTGAGGAGGAA)과 TP2 즉, 5' 말단이 비오틴화되고, 안티센스 가닥의 염기 9876에서 증폭된 프라이머를 이용하여, DNA 프로브를 합성한다.
하이브리드반응 및 감지
프로브는 "easyhyb"(Boehringer-Mannheim, Germany)에서 1nM로 희석시키고, 각 웰에 20㎕씩 첨가한다. 프로브 및 콜로니는 94℃에서 5분간 변성시키고, 그 다음 50℃에서 6시간동안 배양한다. 과량의 프로브는 50℃에서 2xSSC 및 0.1% Tween으로 씻어낸다. DNA 프로브를 실온에서 1시간동안 TNT상에서 아비딘이 피복된 직경 0.04μ(Molecular Probes) 그린 형광 플로로스페어에 결합시킨다. 과량의 비드는 TNT로 씻어낸다. 콜로니는 현미경으로 볼 수 있고, 상 분석은 실시예 2a에서 설명한 것과 같이 실시한다. 도 3에서는 20X 상에서 웰에 결합된 주형의 농도에 대한 함수로 관찰된 콜로니의 수를 나타내는 것이다. 감지가능한 주형의 최저 농도는 10-13M에 해당된다.
실시예 2a; 고형상 지지체(플라스틱)상에서 DNA 주형 및 콜로니 프라이머의 공유부착 및 축중 프라이머를 이용한 콜로니 형성
p252 콜로니 프라이머 및 주형 단편이 결합된 미소역가 웰은 다음과 같이 준비한다.
각 Nucleolink 웰에서 1μM 콜로니 프라이머 p252 용액 30㎕(이는 10mM 1-메틸-이미다졸(pH 7.0)(Sigma Chemicals)에서 0.5nM에서 주형의 농도를 다양하게 희석한 것)을 첨가한다. 각 웰에서, 40mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(pH 7.0)(Sigma Chemicals)/10mM 1-메틸-이미다졸 용액10㎕를 콜로니 프라이머 및 주형 용액에 첨가하였다. 그 다음 웰을 봉하고, 50℃에서 하룻밤동안 배양시킨다. 배양 후에, 웰은 200㎕ RS(0.4 N NaOH, 0.25% Tween 20)으로 2회 세척하고, 200㎕ RS로 15분간 배양시키고, 200㎕ RS로 2회 씻은 후에, 200㎕ TNT(100mM TrisHCl pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)로 2회 씻어낸다. 튜브는 50℃상에서 건조시키고, 4℃에서 봉해진 플라스틱 봉지에 보관한다.
콜로니 생성
변형된 프로토콜을 이용하여, 각 웰에서 콜로니 생성은 20㎕ PCR 혼합물로 무작위 프라이밍을 시킨다; 4개 dNTPs(각 0.2mM), 0.1% BSA(소 혈청 알부민), 0.1% Tween 20, 8% DMSO(디메틸설폭시드, Fluka, Switzerland), 1X PCR 완충액, 0.025 units/㎕ AmpliTaq DNA 중합효소(Perkin Elmer, Foster City, CA)를 이용하여 시작된다. 그 다음 웰을 터모사이클러에 넣고, 94℃에서 5분간 봉해진 웰을 배양하고, 다음의 조건에서 50외 과정을 반복하여 실시하였다(94℃에서 30초, 65℃에서 2분, 72℃에서 2분). 이와 같은 과정이 끝난 후에, 웰은 사용할 때까지 8℃에 보관한다. 하이브리드반응 전에, 웰에 50㎕ TE(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 7.4)를 넣어 채우고, 5분간 94℃에서 가열한후에, 45℃에서 프로브를 첨가하기 전에 얼음상에서 냉각시킨다.
콜로니 가시화
프로브: 두 개 DNA 단편(고유 주형의 양 단 서열로 구성된 각 546개 염기쌍 및 1405개 염기쌍)을 PCR을 이용하여 증폭시킨다. 프로브의 안티센스 가닥은 5'-비오틴화된 PCR 프라이머를 이용하여 비오틴으로 표지시킨다. 프로브의 염기쌍은 6550 내지 7113과 6734 내지 9805에 상응한다.
하이브리드반응 및 감지
프로브는 "easyhyb"(Boehringer-Mannheim, Germany)에서 1nM로 희석시키고, 각 웰에 20㎕씩 첨가한다. 프로브 및 콜로니는 94℃에서 5분간 변성시키고, 그 다음 50℃에서 6시간동안 배양한다. 과량의 프로브는 50℃에서 2xSSC 및 0.1% Tween으로 씻어낸다. DNA 프로브를 실온에서 1시간동안 TNT상에서 아비딘이 피복된 직경 40나노메터(Molecular Probes) 그린 형광 플로로스페어에 결합시킨다. 과량의 비드는 TNT로 씻어낸다. 형광은 역상 현미경(아크 수은 램프 HBO 100W/2, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany 및 768(H)x512(V)pixel-CCD 카메라(Princeton Instruments Inc. Trenton, NJ, USA)가 있는 Axiovert S100TV에서 20x/0.400 LD Achroplan를 이용하여)에서 볼 수 있다. 노출은 FITC 및 Cy5 각각에서 Omerga Optical(Brattleboro VT)을 이용하여, 필터 세트 XF22(Ex: 485DF22, Dichroic: 505DRLPO2 Em: 53-DF30) 및 XF47(Ex: 640DF20.670DRLPO2 Em: 682DF22)에서 20초간 실시한다. Winwiew 소프트웨어(Princeto Instruments Inc., Trenton NJ, USA)를 이용하여 데이터를 분석하였다. 개발된 상 분석 소프트웨러를 이용하여 이중 반복 웰에서 필드당 콜로니의 수를 헤아린다.
실시예 3: 다른 콜로니상에 있는 서열 구별은 2개의 다른 공유부착된 주형 및 콜로니 프라이머의 비율로 인한 것이다.
고형 지지체(플라스틱)에 주형 및 콜로니 프라이머의 공유 결합
5'말단에 포스포릴화된 콜로니 프라이머(Microsynth GmbH, Switzerland)인 (CP2:5'-pTTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)를 Nucleolink 플라스틱 미소역가 웰(Nunc, Denmark)상에 부착시키는데, 이때 다양한 양의 두 개 주형 A와 B(실시예1에서 설명한 것과 같이 준비한)를 이용한다. 8개 웰이 한 세트가 삼중 반복시켜는데, 주형을 CP2로 7회 1/10 희석한 것으로, 최고 농도 1nM에서 시작한다. 주형 희석은 반대 방향에서 세트업시켜, 한 개 주형의 최대 농도는 다른 것은 최저 농도가 되게 한다.
CP2 콜로니 프라이머 및 두 개 주형이 공유부착하게 되는 미소역가 웰은 다음과 같이 준비한다. 각 Nucleolink 웰에서 1μM 콜로니 프라이머 용액 30㎕(이는 10mM 1-메틸-이미다졸(pH 7.0)(Sigma Chemicals)에서 1nM에서 두 개 주형의 농도를 다양하게 희석한 것)을 첨가한다. 각 웰에서, 40mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(pH 7.0)(Sigma Chemicals)/10mM 1-메틸-이미다졸 용액10㎕를 콜로니 프라이머 및 주형 용액에 첨가하였다. 그 다음 웰을 봉하고, 50℃에서 하룻밤동안 배양시킨다. 배양 후에, 웰은 200㎕ RS(0.4 N NaOH, 0.25% Tween 20)으로 2회 세척하고, 200㎕ RS로 15분간 배양시키고, 200㎕ RS로 2회 씻은 후에, 200㎕ TNT(100mM TrisHCl pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)로 2회 씻어낸다. 튜브는 50℃상에서 건조시키고, 4℃에서 봉해진 플라스틱 봉지에 보관한다.
콜로니 생성
각 웰에서 콜로니 생장은 20㎕ PCR 혼합물; 4개 dNTPs(0.2mM), 0.1% BSA(소 혈청 알부민), 0.1% Tween 20, 8% DMSO(디메틸설폭시드, Fluka, Switzerland), 1X PCR 완충액, 0.025 units/㎕ AmpliTaq DNA 중합효소(Perkin Elmer, Foster City, CA)를 이용하여 시작된다.
그 다음 웰을 터모사이클러에 넣고, 94℃에서 5분간 봉해진 웰을 배양하고,다음의 조건에서 50회 과정을 반복하여 실시하였다(94℃에서 30초, 65℃에서 2분, 72℃에서 2분). 이와 같은 과정이 끝난 후에, 웰은 사용할 때까지 8℃에 보관한다. 하이브리드반응 전에, 웰에 50㎕ TE(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 7.4)를 넣어 채우고, 5분간 94℃에서 가열한후에, 45℃에서 프로브를 첨가하기 전에 얼음상에서 냉각시킨다.
콜로니 가시화
프로브; 5' 및 3' 말단에서 3.2kb DNA 단편 서열에 상응하는 두 개 DNA 단편 546개 염기쌍 및 1405개 염기쌍은 비오틴화된 프라이머(실시예 2)를 이용하여 PCR로 증폭시켰다. 두 개 프로브는 94℃에서 5분간 가열시키고, 1M NaCl, 10mM Tris, pH7.4에서 신속하게 냉각시켜 변성시키고, 4℃에서 2시간동안 다른 색으로 표지된 스트렙타아비딘 피복된 플로오르스페어(직경 0.04㎛)에 결합시킨다. 비드에 결합된 프로브는 50℃로 미리 예열시킨, "easyhyb" 용액에서 20배 희석시킨다. 20㎕ 프로브를 변성된 콜로니를 포함하고 있는 각 웰에 첨가시킨다.
하이브리드반응 및 감지
하이브리드 반응은 50℃에서 5시간동안 실시한다. 과량의 프로브는 50℃에서 2xSSC 및 0.1% SDS로 씻어낸다. 콜로니는 20X 확대 상에서, 20초간 노출시켜 볼 수 있고, 상 분석은 실시예 2a에서 설명한 것과 같이 실시한다. 도 4a에서는 주형 및 네거티브 대조군에서 얻은 콜로니 상을 볼 수 있다. 도 4b에서는 두 개의 다른 색과 네거티브 대조군으로 볼 수 있는 동일한 웰에서 동일한 위치의 두 개 주형의 콜로니를 나타낸다. 도 4c는 현미경상의 서브-섹션에 있는 콜로니 형의 좌표를 나타낸 것이다. 도 4c는 다른 주형에서 취한 콜로니는 일치하지 않는다는 것을 보여준다.
실시예 4; 유리 고형상 지지체상에 DNA 주형 및 올리고뉴클레오티드의 공유 결합
고형 지지체로 아미노시레인-유도된 유리 슬라이드를 이용하여, 이형-이중기능을 하는 교차결합제를 이용하여 티올-변형된 올리고뉴클레오티드를 공유부착시킨다. 선택된 시약은 티올-반응기(말레이미드) 및 아미노-반응기(숙시니미딜 에스테르)을 가진다. 올리고뉴클레오티드 부착수득율 및 고정된 분자의 안정성은 실행되는 다른 처리 조건에 대한 교차결합제의 안정성에 강하게 영향을 받는다. 도 5에서는 유리상에서 DNA 주형 또는 올리고뉴클레오티드 부착 반응 과정을 나타낸다.
교차결합제 s-MBS 및 s-SIAB으로 준비한 유리 슬라이드의 저장 안정성 및 열 안정성에 대해 평가하였다. 고정된 올리고뉴클레오티드 프로브의 하이브리드 반응 정도에 영향을 주는 주요 인자는 부착된 프로브의 밀도가 된다(Beattie et al., 1995; Joss et al., 1997). 우리는 고정동안에 올리고뉴클레오티드의 농도를 다양하게 하고, 하이브리드 반응에 의해 부착된 올리고뉴클레오티드의 밀도를 측정하여 이 효과를 연구하였다.
재료 및 방법
현미경 유리 슬라이드 산 전-처리- 현미경 유리 슬라이드(Knittel, Merck ABS)는 1시간동안 염기성 Helmanex 용액에 담근다(HelmanexIIR0.25%, 1N NaOH).슬라이드는 물로 헹구고, 하룻밤동안 1N NCl에 담군후에, 다시 물로 헹구고, 황산용액으로 1시간 처리한다(H2SO4/H2O, 1/1, v/v, 소량의 새로 만든 과황화암모늄을 첨가함). 슬라이드는 물, 에탄올, 최종적으로 순수 아세톤으로 헹군다. 유리 슬라이드를 건조시키고, 추가 사용을 위해 진공하에 보관한다.
표면의 시레인처리- 선-처리된 슬라이드는 5% ATS(아미노프로필트리에톡시실란, Aldrich) 아세톤 용액에 담근다. 시레인처리는 2시간동안 실온에서 실행하였다. 아세톤(1회 5분)에서 3회 세척한 후에, 슬라이드는 1회 에탄올로 행구고, 건조시킨후에 진공상에 보관한다.
교차결합제 부착- 교차결합제, s-MBS 및 s-SIAD(각각 설포 m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니미드 에스테르, 설포 N-숙시니미딜[4-요오드아세틸]아미노벤조에이트, Pierce, Rockford IL)는 20mM PBS(인산 완충염, 0.1M NaH2PO4, pH7.2, 0.15M NaCl) 용액으로 준비한다. 80㎕ 교차결합제 용액이 제공된 시레인처리된 유리 슬라이드는 깨끗한 작은 덮개유리로 덮고, 20℃에서 5시간동안 반응을 시킨다. 유리 슬라이드는 PBS로 헹군 다음, 간단하게 물에 담근 후에, 에탄올로 헹구어낸다. 그 다음 슬라이드를 건조시키고, 추가 사용을 위해 어두운 상태의 진공에 보관한다.
올리고뉴클레오티드 부착-올리고뉴클레오티드는 표준 포스포아미디트 화학을 이용하여 티올(CP3, CP4, Eurogentec, Brussels) 또는 인산 부분(CP1, CP2, Eurogentec, Brussels)의 5' 변형으로 합성할 수 있다.
-5'-티올 올리고뉴클레오티드 프라이머(CP3 및 CP4)는 인산염 완충액(NaPi: 0.1M NaH2PO4pH: 6.6, 0.15M NaCl) 100μM 용액으로 준비하여, 기능화된 유리 슬라이드상에 1㎕를 얹고, 실온에서 5시간동안 반응을 시킨다. 유리 슬라이드는 기화를 방지하기 위해 포화된 습기하에 보관한다. 유리 슬라이드는 NaPi 완충액으로 쉐이크상에서 세척한다. 열 안정성 연구를 위해, 유리 슬라이드는 100℃에서 5분간 Tris 완충액(10mM, pH 8)에 2회 담근 후에, 5분간 4℃에서 5xSSC(0.75M NaCl, 0.075M Nacitrate pH 7)에 바로 담근다. 슬라이드는 추가 사용을 위해, 4℃상에서 5XSSC에 보관한다.
-5'- 올리고뉴클레오티드 프라이머 인산염(CP1 및 CP2)은 실온에서 5시간동안 1㎕ 방울씩 아미노-유도화된 유리에 제공되는데, 이때 용액은 40mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필)카르보네이트(EDC, Pierce, Rockford IL)를 포함하는 10mM 1-메틸-이미다졸(ph 7.0)(Sigma Chemicals) 1μM 용액으로 제공된다. 슬라이드는 Tris 완충액(10mM, pH 8)으로 100℃에서 2회 세척하고, 5분간 4℃에서 5XSSC에 바로 담근다. 슬라이드는 추가 사용을 위해 4℃에서 5XSSC에 보관한다.
올리고뉴클레오티드 및 DNA 주형 부착
5'-티올 올리고뉴클레오티드 프라이머(CP3 및 CP4) 및 5'티올 주형 B'를 인산염 완충액(NaPi: 0.1M NaH2PO4pH:6.6, 0.15M NaCl)에서 혼합하였다. DNA 주형의 농도는 0.001 내지 1μM로 다양하게 하고, 프라이머의 경우는 1μM 내지 100μM까지로 다양하게 하나, 주형 및 프라이머의 최적 농도는 1μM 및 100μM가 된다. 기능화된 유리 표면상에 CP3 및 CP4 부착을 위한 상기 설명한 과정을 따른다.
5'-인산염 올리고뉴클레오티드 프라이머(CP1 및 CP2)와 5'-인산염 주형 B는 40mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필) 카르보디이미드(EDC, Pierce, Rockford IL)를 포함하는 10mM 1-메틸-이미다졸(pH 7.0)(Sigma Chemicals) 용액상에서 혼합하였다. DNA 주형의 농도는 0.001 내지 1μM로 다양하게 하고, 프라이머의 경우는 1μM 내지 100μM까지로 다양하게 하나, 주형 및 프라이머의 최적 농도는 1μM 및 100μM 가 된다. 기능화된 유리 표면상에 CP1 및 CP2 부착을 위한 상기 설명한 과정을 따른다.
형광 프로브를 이용한 하이브리드반응-5'말단에 Cy5 또는 FITC로 형광 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브는 Eurogentic(Brussels)에 의해 합성하였다. 비-특이적인 하이브리드 반응을 피하기 위해, 유리 슬라이드는 1시간동안 차단 용액(5xSSC, Tween 0.1%, BSA 0.1%)으로 배양하고, 쉐이크에서 5xSSC(2회, 5분)로 씻어낸다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 0.5μM에서 5xSSC, Tween 0.1%로 희석하고, 실온에서 2시간동안 유리 표면상에 제공한다. 그 다음 유리 슬라이드는 쉐이크상에서 37℃에서 헹구고, 5분간 5xSSC상에서, 5분간 0.1% SDS를 포함하는 2xSSC에서 2회 헹군다.
방사능표지된 프로브를 이용한 하이브리드형성-공유결합된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 방사능표지된 올리고뉴클레오티드를 하이브리드형성 프로브로 이용하여 하이브리드반응 수득율을 정량화하였다. 올리고뉴클레오티드는 이들의 5'말단에서 박테리오파아지 T4 폴리뉴클레오티드 카이나제(New England Biolabs,Beverly, MA)를 이용하여, [Y-32P]dATP(Amersham, UK)로 말단 표지시킨다. 과량의 [Y-32P]dATP는 Chroma Spin 컬럼 TE-10(Clontech, Palo Alto CA)을 이용하여 제거한다. 방사능표지된 올리고뉴클레오티드(0.5μM, 5xSSC, Tween 0.1%)를 실온에서 2시간동안 유도화된 슬라이드상에 제공한다. 유리 슬라이드는 5분간 쉐이크상에서 5xSSC로 헹구고, 37℃에서 5분간 2xSSC, SDS 0.1%로 세척한다. 하이브리드 반응 후에, 특이 활성은 신틸레이션 카운터를 이용하여 결정한다.
현미경 관찰-유리 슬라이드는 5xSSC용액 및 마이크로 덮개유리로 덮는다. 형광은 역상 현미경(아크 수은 램프 HBO 100W/2, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany 및 768(H)x512(V)pixel-CCD 카메라 배열 Kodak, 포맷 768(H)x512(V) 픽셀; 6.91x4.6㎜, 펙셀 크기 9x9㎛2(Princeto Instruments Inc. Trenton, NJ, USA)(Princeton Instruments Inc. Trenton, NJ, USA)가 있는 Axiovert S100TV에서 20x/0.400 LD Achroplan를 이용하여)에서 볼 수 있다. 노출은 FITC 및 Cy5 각각에서 Omerga Optical(Brattleboro VT)을 이용하여, 필터 세트 XF22(Ex: 485DF22, Dichroic: 505DRLPO2 Em: 53-DF30) 및 XF47(Ex: 640DF20.670DRLPO2 Em: 682DF22)에서 1초 내지 20초간 실시한다. Winwiew 소프트웨어(Princeto Instruments Inc., Trenton NJ, USA)를 이용하여 데이터를 분석하였다.
결과
저장 안정성 부착 및 열 안정성 평가
우리는 s-MBS 및 s-SIAB으로 준비한 유리 플레이트의 저장 안정성을 평가하였다. 이와 같은 시약들은 가수분해에 대해 민감하기 때문에, 올리고뉴클레오티드 부착 수득율은 이들의 안정성에 따라 달라질 수 있다.
아미노-유도된 유리 플레이트는 새로 준비한 교차 결합 시약 s-MBS 및 s-SIAB으로 기능을 제공한다. 기능을 갖게된 슬라이드는 실온, 암실에서 진공하에 데시케이트에 10일간 교차결합제 연결후에 보관한다. 이 시기후에, 저장된 슬라이드(t=10days) 및 교차 결합 시약으로 새로 반응한 슬라이드(t=0)를 검사하였다. 티올-올리고뉴클레오티드의 반응후에 수득된 결과와 상보적인 형광 프로브의 하이브리드 반응후에 결과를 t=0 및 t=10일에 대해 비교하였다.
일단 고정된 후에, s-SIAB 기능화된 슬라이드는 t=0 및 t=10일에 수득한 하이브리드 수득율이 동일하기 때문에 10일이 경과하여도 충분히 안정하다는 것을 알 수 있다. 대조적으로, 유리에 결합된 s-MBS는 올리고뉴클레오티드 부착 및 10일 저장뒤에 하이브리드 반응의 수득율에서 30% 손실이 있어 안정성이 덜하다는 것을 알 수 있다. 결론적으로, 미리 준비하여, 암실에서, 진공상태로 적어도 10일간 보관한 경우에 프로브 부착 수득율에서 임의 감소분없이, s-SIAB로 기능화된 슬라이드가 바람직한 것으로 보인다.
유리에 부착된 올리고뉴클레오티드의 열 안정성을 평가하기 위해, 슬라이드는 100℃에서 10mM Tris-HCl, pH 8상에서 5분간 2회 실시하였다. 세척후에 남아있는 올리고뉴클레오티드는 형광 표지된 상보 올리고뉴클레오티드를 이용한 하이브리드 검사를 이용하여 검사하였다. 부착된 분자의 약 14%가 s-SIAB 유리 슬라이드에서 유리되었고, 처음 5분간 세척한 후에 S-MBS 유리 슬라이드의 경우에는 17%가유리되었으나, 두 화학물질에서 2차 세척후에는 추가 유리가 없는 것으로 나타났다(표 1A). 이 결과는 Chrisey et al., 1996에서 얻은 결과와 비교하였는데, Chrisey의 결과에서는 PBS에서 80℃상에서 10분간 처리한 후에 교차결합제 SMPB(숙시니미딜-4-[p-말레이미도페닐] 부티레이트)를 통하여 융합된 실리카 슬라이드에 부착된 올리고뉴클레오티드의 62%이상이 유리되었다는 것이다.
열 안정성 연구
하이브리드 반응 결과(100%로 표준화시킨 상수 단위)
새로 부착됨 100℃에서 5분간세척후 100℃에서 5분간 2회 세척 후
s-MBS 80 ±6 69 ±4 73 ±4
s-SIAB 100 ±9 84 ±8 87 ±3
s-MBS 또는 s-SIAB으로 기능화시킨 유리 슬라이드에 올리고뉴클레오티드가 부착되었다. 부착된 올리고뉴클레오티드를 형광이 표지된 상보 올리고뉴클레오티드를 이용하여 하이브리드 반응으로 검사하였다. 형광 신호는 수득된 최대 신호를 100으로 하여 표준화시켰다. 3회 반복 실험에 대한 평균값을 나타낸 것이다.
프로브 부착에 대한 함수로써의 하이브리드 반응
s-MBS, s-SIAB 교차 결합체 및 EDC-중개된 반응을 이용하여 부착된 올리고뉴클레오티드의 표면 범위에 대한 함수로써 공유 결합된 올리고뉴클레오티드 프로브의 하이브리드 반응 정도에 대해 연구하였다. 고정에 이용되는 올리고뉴클레오티드의 농도는 1μM EDC와 1 내지 800μM 범위의 교차 결합체가 되고,32P-표지된 프로브를 이용한 하이브리드 반응으로 표면 밀도를 검사하였다. 이형이중 기능을 가지는 교차 결합에를 이용한 프라이머 부착에 적절한 농도는 500μM로써, s-MBS의 경우 하이브리드형성된 분자의 표면 밀도 60fmol/㎟ 및 s-SiAB의 경우 270 fmol/㎟와 균등하게 하였다. s-MBS의 경우 아미노실란화된 유리에 5'-인산염 올리고뉴클레오티드를 EDC/이미다졸-이용하여 부착시켜 유사한 범위의 밀도를 얻을 수 있다. 그러나, 올리고뉴클레오티드 1μM 용액만으로도 동일한 부착 수득율을 얻을 수 있는데, 이는 EDC/이미다졸 결합 과정과 비교하였을 경우에, s-MBS를 이용한 경우 부착되는 올리고뉴클레오티드가 500배 많다는 것을 나타낸다.
프로브 부착에 대한 함수로써 하이브리드 반응
하이브리드된 올리고(fmol/㎟)
부착에 이용되는 올리고뉴클레오티드의 농도(μM) s-MBS s-SIAB EDC
1 NT NT 50
100 10 100 NT
500 60 270 NT
s-MBS 또는 s-SIAB로 기능화된 또는 중개 활성 시약 EDC로 기능을 갖춘 유리 슬라이드에 올리고뉴클레오티드가 부착되었다. 부착된 올리고뉴클레오티드는 방사능표지된 상보 올리고뉴클레오티드와 하이브리드 반응을 이용하여 검사할 수 있다. 특이 활성 및 하이브리드형성된 분자의 밀도는 액체 신틸레이션으로 결정할 수 있다; NT는 테스트를 하지 않았다는 것을 말한다.
60fmol/㎠ 표면 밀도는 결합된 올리고뉴클레오티드사이의 평균 분자 거리가 8nm에 상응한다. 우리 결과에 따르면, 30 fmol/㎟ 평균 밀도(20nm 공간 거리)는 DNA 콜로니를 얻는데 충분하다. 이형이중 기능 교차결합제 s-SIAB를 이용하면,100μM 농도에서 고정하거나 EDC-중개된 방식을 이용하는 경우에는 1μM 프로브를 이용하면, 이와 같은 수득율을 얻을 수 있다. 우리가 수득한 하이브리드 반응 밀도는 기존에 보고된 다른 접합 프로토콜을 이용한 유리 슬라이드에서 얻을 수 있는 최고 범위 밀도에 속한다(Guo et al-1994, Joss et al-1997, Beattie et al-1995).
유리에서 DNA 콜로니 생성; 콜로니 생성은 주형의 길이, 농도 및 프라이머의 농도에 따라 달라진다.
이론상으로, DNA 콜로니 형성에는 적절한 길이의 DNA에 상응하는 표면에 부착된 적절한 밀도의 프라이머를 요구한다. 적절한 DNA 콜로니 생성을 위해서는, 결합된 프라이머 및 주형의 밀도 범위뿐만 아니라 주형 및 프라이머의 공간적인 비율도 중요하다.
재료 및 방법
유리 슬라이드 준비
유리 슬라이드는 상기(재료 및 방법)에서 설명한 것과 같이 유도하여, 기능을 할 수 있다. DNA 콜로니 프라이머는 CP1 및 CP2이다. 콜로니 주형은 주형 B'의 경우에 실시예 1에서 설명한 것과 같이 콜로니 주형을 준비할 수 있으나, 프라이머 TPB3 및 TPB2를 이용한다. 변형된 콜로니 프라이머 및 주형을 유리 표면에 얹는데, 이때 콜로니 프라이머 및 콜로니 주형의 농도를 다양하게 변화시키면서 제공한다.
콜로니 생성
5XSSC에 보관된 유리 슬라이드는 염을 제거하기 위해 마이크로-여과된 물로씻는다. 콜로니 생장이 PCR 혼합물을 이용하여 유리 표면에서 시작된다: PCR 혼합물이란, 4종의 dNTP(0.2mM, 0.1% BSA, 0.1% Tween 20, 1X PCR 완충액, 0.5U/㎕ AmpliTaq DNA 중합효소(Perkin Elmer, Foster City, CA)가 된다. PCR 혼합물은 프레임 씨일 챔버(MJ Research, Watertown, MA)에 넣어둔다. 슬라이드는 터모사이클러(The DNA Engine, MJ Research Watertown, MA)에 넣고, 열 순환 과정은 다음과 같이 실행하였다; 단계 1-94℃에서 1분간, 단계 2-65℃에서 3분간, 단계 3-74℃에서 6분간, 이와 같은 일련의 단계를 50회 반복한다. 이 프로그램 종료후에, 사용할 때까지 슬라이드는 6℃에 유지시킨다.
이중 가닥 DNA 콜로니의 처리
DNA를 포함하는 유리 표면을 처리 1X 완충액에 있는 제한 효소를 덮어서 제한 효소로 절단한다. 반응은 37℃, 1시간 30분간 2회 실시하였다. 이중 가닥 DNA 콜로니는 100℃에서 5분간 트리스 완충액(10mM, pH 8)으로 슬라이드를 2회 담구어 변성시키고, 이어서, 5XSSC에서 헹군다. 슬라이드는 추가 사용을 위해 5XSSC에 저장하였다.
한 가닥 DNA 콜로니의 하이브리드 반응
비-특이적인 하이브리드 반응을 피하기 위해, 유리 슬라이드는 1시간동안 차단 용액(5XSSC, 0.1% Tween, 0.1% BSA)으로 배양하고, 슬라이드는 5XSSC에서 헹군다(2회, 5분간). 형광으로 표지된 Cy5 5'올리고뉴클레오티드(Eurogentec, Brussels)는 SSC 5X, Tween 0.1%에서 0.5μM 농도로 희석시키고, 적어도 2시간동안 유리 표면에 제공한다. 유리 슬라이드는 쉐이크에서 5XSSC에서 5분간 헹구고, 37℃에서 SSC 5X, SDS 0.1% TWEEN에서 5분간 2회 헹군다.
유리 슬라이드는 전술한 것과 같이 가시화시킨다.
우리는 하이브리드 정도는 올리고뉴클레오티드 부착 밀도에 따라 달라진다는 것을 관찰한 바 있다. 결합된 DNA 주형을 이용한 유사 연구에서 콜로니 형성은 유리 슬라이드상에 부착된 주형의 농도에 따라서도 달라진다는 것을 나타낸 바 있다. 올리고뉴클레오티드 및 주형 부착에 이용되는 화학적 성상에 따라, 주형의 최적 농도는 이중 기능을 하는 교차결합제인 s-MBS의 경우에 1μM가 되고(도 6B), EDC 카르보디이미드의 경우에는 1nM 정도가 된다(도 6A). 흥미로운 것은 고농도의 주형이 EDC의 경우에 콜로니의 수를 증가시키지는 않고, 콜로니의 최대 수에 상응하는 고지에 도달하는 것으로 보인다.
우리는 프라이머의 농도에 대한 함수, 표면에 제공되는 DNA 주형의 농도 및 DNA 주형의 길이에 대한 함수로써 콜로니 형성(수)을 연구하였다.
우리는 또한 각 콜로니에서 주형의 복제 수를 평가하였다. 정량화는 항-표백 시약(Prolong, Molecular Probes, Portland, OR)이 보충된 Cy5-, Cy3- EH는 플로레신-표지된 플로오르포어로 형광 감지를 하여 실시하였다. 표면에 부착된 프라이머상에서 하이브리드 실험을 하여 계산하고, 정확한 밀도는 방사능활성으로 결정하였다.
실시예 5: in-situ DNA 서열분석에서 콜로니
유리 슬라이드(5mm 직경, Verrerie de Carouge, Switzerland)을 실온에서 1시간 동안 Helmanex 0.2%(H2O), NaOH 1N 조에 넣고, 증류수로 씻어낸 다음, 순수한 헥산으로 헹군후에, 증류수로 다시 2회 헹구고, 실온에서 하룻밤동안 HCl 1M으로 처리하였다. 그 다음, 이들을 다시 증류수를 이용하여 2회 헹구고, 1시간동안 실온에서 H2SO4(50%) + K2S2O8로 처리하였다. 다시 물로 헹구고, 에탄올로 2회 헹군다. 유리 슬라이드는 ATS(실시예 4에서 설명하는 것과 같은)로 유도하였다.
5'포스포릴화된(Microsynth GmbH, Switzerland) 콜로니 프라이머 CP1 (5'-pTTTTTTTTTTCACCAACCCAAACCAACCCAAACC) 및 CP2(5'-pTTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGG AAAGGGAAAGGG), DNA 주형 B(실시예 1에서 설명한 것과 같이 준비한)는 5mm 직경 유리 슬라이드(Verrerie de Carouge, Switzerland)상에 공유 결합시켜, 최종 농도가 각각 1μM 및 10nM이 되도록 한다; 즉, 각 프라이머 2nmoles를 0.2nmoles 주형/1㎖ 용액 A(41㎕ 메틸이미다졸(Sigma, #M-8878)/50㎖ H2O에 첨가시키고, pH를 HCl을 이용하여 7로 조정하고, 그 다음 용액 D(0.2mM EDC/10㎖ 용액 A)와 1:1로 혼합하였다. 유리 슬라이드 모두에, 혼합물 3.5㎕를 얹고, 실온에서 하룻밤동안 배양시킨다. 유리 슬라이드는 간단하게 5xSSC 완충액으로 헹구고, 100℃에서 10mM Tris 완충액 pH 8.0 for 2x5'에 둔다.
유리상에 비-특이적인 부위는 소 혈청 알부민(BSA, Boehringer Mannheim GmbH, Germany, #238040) 1㎎/㎖농도/5xSSC 완충액을 이용하여 실온에서 1시간 동안 차단시키고, 증류수로 헹군다.
그 다음 유리 슬라이드는 170㎕ PCR 혼합물을 포함하는 MicroampTM반응튜브(Perkin Elmer)상에 개별적으로 두고, Taq 중합효소(AmpliTaq, PE-Applied Biosystems Inc., Foster City CA)를 이용하여 MTC 200 터모-싸이클러(MJ Research, Watertown, MA)상에서 50회 과정(94C/60", 60C/3', 72C/6')으로 DNA 콜로니를 만들 수 있다. 각 슬라이드는 NEB 2 완충액(New England Biolabs)을 이용하여, 37℃에서 45분간 1.3unit Pvu II(stratagene)로 2회 처리한다. 처리후에, 튜브는 100℃에서 2X5'동안에 10mM Tris 완충액(pH 8.0)에 두고, 그 다음 실온에서 30'간 2xSSC에서 여과된(Millex GV4, Millipore) 1㎎/㎖ BSA로 차단시킨 다음, 2xSSC 0.1% SDS 완충액에 우선 헹군 다음 5xSSC 완충액에 헹군다. 각 슬라이드는 실온에서, 하룻밤동안 서열과 프라이머 p181(CGACAGCCGGAAGGAAGAGGGAGC) 1μM를 함유한 5xSSC/0.1% Tween 20 완충액으로 실온에서 배양하였다. 프라이머 없는 대조군은 5xSSC 0.1% Tween 20 완충액에 유지시킨다. 유리 슬라이드는 5분간 37℃에서 5xSSC 0.1% SDS로 2회 세척하고, 5xSSC로 헹군다. 프라이머 p181은 주형 B'에 하이브리드 할 수 있고 p181에 이어지는 서열은 CAGCT...이다. 포커싱을 실시하기 위해, 그린 형광 비드를 웰의 바닥에 흡착시키는데, 이는 각 웰을 실온에서 20초간 20㎕ 1/2000 희석한 200nm 노란색/그린 형광, 스트렙트아비딘 피복된 FluoSpheres(R)(Molecular Probes, Eugene, OR)으로 배양하면 된다.
프라이머와 하이브리드형성시킨 후에, 각 슬라이드에 0.1% BSA, 6mM 디티오트레티올(Sigma Chemicals), 5μM Cy5TM-dCTP, 5μM Cy5TM-dUTP(Amersham, UK) 및 1X 서열과 반응 완충액을 포함하는 용액 2㎕을 첨가한다. 실온에서 2분간 1.3unit T7SquenaseTMDNA 중합효소(Amersham, UK)를 첨가하면서 Cy5TM-뉴클레오티드를 첨가하기 시작한다. 웰은 15분간 5X SSC/0.1% SDS 조에 2회 세척하고, 5xSSC 완충액으로 헹군다.
샘플은 Micromax 512x768 CCD 카메라, Winview 소프트웨어(Princeton Instruments, Trenton, NJ)가 장치된 역 현미경(Axiovert S100TV, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)을 이용하여 관찰할 수 있다. 포커싱을 위해서, 20X 대물렌즈, XF 22 여과 세트(Omega Optical, Barattleboro, VT)를 이용하고, 샘플상에 있는 Cy5TM 결합을 관찰하기 위해서는 2X2 픽셀을 이용한 50초간 노출시키는 20X 대물렌즈 및 XF47 필터 세트(Omerga Optical)를 이용한다. 노란/그린 FluoSpheres(R)(약, 100/시야)는 XF47 필터 세트 및 50초간 노출을 이용한 경우에는 감지가능한 신호를 제공하지 않는다(데이터는 나타내지 않음). Winview(Princeton Instruments)으로 사진을 만든다.
도 7A는 프라이머 p181로 배양하지 않은 샘플상에서의 Cy5TM-dCTP로 배양한 후의 결과를 나타낸다. 5개의 흐릿한 점만 관찰할 수 있는데, 이는 상당한 허위 효과(콜로니 또는 표면에서 DNA에 Cy5TM-dCTP 응집 침전, 흡착 또는 단순한 비-특이적인 결합)가 발생하지 않았다는 것을 말하는 것이다. 도 7B에서는 프라이머 p181로 배양한 샘플상에 Cy5TM-dUTP으로 배양한 후에 결과를 나타낸다. 형광 점은 관찰할 수 없는데, 이는 결합을 위해 제공된 뉴클레오티드가 하이브리드형성된 프라이머에 이어있는 주형의 서열에 상응하지 않을 경우에 형광 결합이 감지할 수 있는 수준으로 일어나지 않는다는 것을 말한다. 도 7C에서는 프라이머 p181로 배양한 샘플에서 Cy5TM-dCTP 배양후의 결과를 나타낸다. 많은 형광 점을 관찰할 수 있는데, 이는 결합을 위해 제공된 뉴클레오티드가 하이브리드된 프라이머에 이어있는 주형의 서열에 상응하는 경우에 형광 결합이 감지할 수 있는 수준으로 일어난다는 것을 말한다. 요약하면, 콜로니에 포함된 DNA로 서열 특이적인 방식으로 형광 뉴클레오티드가 결합하는 것이 가능하고, 여기에서 설명하는 방법 및 장치로 이와 같은 결합을 모니터할 수 있다는 것을 말하는 것이다. 그러나, 이는 단순한 예시일 뿐이다. 원하는 경우에, 형광 염기 결합을 수회 반복할 수 있다. 서열 특이적인 방식으로 실시되었기 때문에, 콜로니에 포함된 DNA 서열의 일부를 유추할 수 있다.
실시예 6: 5'mRNA 서열 tag 분석
세포 또는 조직에서 유전자 발현을 모니터하는 가장 정확한 방법은 샘플 수집과 mRNA 보관사이에 필요 단계를 줄이는 것이다. 신속하게 mRNA를 분리하는 새로운 방법이 이용되고 있다. 가장 효과적인 방법은 샘플을 신속하게 분리해내고, 세포의 분쇄물을 바로 염화수소 구아니디움 용액에 넣어, 단백질을 완전하게 파괴시키고, RNAses를 비활성화시키는 것이다. 그 다음 파괴된 세포의 상층액에서 올리고-dT 친화력 크로마토그래피를 이용하여 mRNA를 순수분리하는 것이다. 마지막으로, 5'-capped-mRNA를 표적으로 하여, 간단한 과정(SMART cDNA synthesis, Clotech, Palo Alto)으로 cDNA에 형질도입시키는 것이다.
이와 같은 방법으로 해독에만 활성을 가지는 5'-capped mRNA로 cDNA를 합성할 수 있다. 상기에서 설명한 것과 같이, mRNA 분리 및 본 출원에서 설명한 DNA 콜로니 생성을 위한 그래프트-주형 방법을 이용한 cDNA 준비 방법을 복합시켜, 상당한 수의 5'mRNA 서열 tag를 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 장점은 cDNA 합성 반응 생성물을 직접 접합시키고, cDNA를 수천개로 복제하고 동시에 cDNA를 서열분석할 수 있다는 것이다.
재료 및 방법
올리고뉴클레오티드 및 프라이머의 합성- 올리고뉴클레오티드는 Eurogentec 또는 Microsynth으로 5' 인산염을 가지도록 합성할 수 있다. 표준 방법을 이용하여, 뮤린 칼슘 채널 유전자 mSlo의 부분 코딩 서열 및 3'해독안된 서열에 이어 T3 RNA 중합효소 프로모터를 포함하는 플라스미드를 만들 수 있다.
mRNA 합성- mSlo 플라스미드는 플라스미드내에 폴리 A+ 서열 다음에 있는 단일 SalI 또는 SacI 제한효소 뉴클레아제를 이용하여 선형화시킬 수 있다. 절단된 플라스미드를 프로테나제 K로 처리한 후에, 선형 플라스미드 DNA를 페놀/CH3Cl/이소아밀 알코올로 추출시키고, 에탄올로 침전시킨다. DNA 침전물은 H2O에 10㎍/㎕농도로 대시 용해시킨다. 5'-메틸구아노신으로 캡이 씌워진 합성 mRNA는 제조업자의 지시(Ambion, Austin TX)에 따라 in vitro mRNA 합성 키트에서 mMessage mMachine으로 합성할 수 있다. 합성 mRNA는 80℃에 저장한다.
효소-제한효소는 New England Biolabs(Beverly, MA)에서 구하였다.
cDNA 합성-합성된 mRNA는 서로 다른 몰 비율(1:1, 1:10, 1:100)로 생쥐 간 폴리A+ mRNA와 혼합하고, 합성된 mRNA 및 생쥐 간 mRNA 혼합물에서 cDNA 합성은 약간 변형시켜 "SMART PCR cDNA 합성 키트(Clontech, Palo Alto CA)를 이용하여 만든다. cDNA 반응에서, 약 1㎍ mRNA 혼합물은 CPβ 서열의 5' 말단을 가지는 프라이머 CP5(5'p-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTTNN)와 혼합한다. 이 프라이머는 첫째 가닥 cDNA 합성을 하는데 이용된다. 두 번째 가닥 합성을 위해서, "SMART"기술이 이용된다. SMART 합성의 원리는 mRNA가 5'메틸구아노신-cap를 포함하고 있을 때(SMART user manual, Clontech, Palo Alto CA), 제1가닥 cDNA의 3'말단에 3 내지 5개의 데옥시시토신 잔기를 첨가하기 위한 Moloney 뮤린 바이러스성 역전사 효소에 있다. 3' 말단에 CPβ서열과 AAAGGGGG를 포함하는 CP6 프라이머 (5'p-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGG)은 두 번째 가닥 cDNA 합성에 이용된다. Moloney 뮤린 루키미아 바이러스(Life Technologies, Ltd.)의 완충액 및 SUPERSCRIPTTMII RNase H-역 전사효소는 지시한 것과 같이 이용하였고, 반응은 1시간동안 42℃에서 실시하였다. CPβ서열의 단편(5'-GAGAAGGAAAGGGAAAGG) 및 Taq DNA 중합효소(Platinum Taq, Life Technologies, Ltd.)를 포함하는 프라이머 p251를 이용하여 cDNA를 검사하였다.
DNA 콜로니 준비- 5'p-cDNA는 제조업자의 지시에 따라 고형상 콜로니 프라이머, CP2(5'p-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)와 여러 농도에서 혼합시키고, Nucleolink PCR 튜브(NUNC)에 화학적으로 결합시킨다. Taq 중합효소(AmpliTaqGold, PE-Applied Biosystems Inc., Foster City CA)를 이용하여, MTC 200 터모-싸이클러(MJ Research, Watertown, MA)에서 30회(94C/30", 65C/1', 72C/1.5')과정으로 DNA 콜로니를 만든다.
DNA 프로브 및 하이브리드 반응- mSlo DNA 서열에 특이적인32-비오틴화된 그리고32P-방사능표지된 DNA 프로브는 주형(mSlo 플라스미드 DNA)상에서 PCR을 이용하여 5'-비오틴화된 프라이머 및 정상적인 하류 프라이머를 이용하여 합성할 수 있다. 프로브는 PCR 반응에서 4개 데옥시뉴클레오시드 삼인산염의 농도가 50μM이 되도록 α[32p]-dCTP(Amersham, Amersham UK)에 300:1(α[32p]-dCTP에 대해 dCTP) 비율로 결합된다. 생성된 비오틴화된 그리고 방사능표지된 DNA 프로브는 Chromaspin-1000 컬럼(Clontech, Palo Alto CA)상에서 염을 제거한다. DNA 프로브는 "easyhyb" 완충액상에서 샘플에 하이브리드시키는데(Boehringer-Mannheim, Germany), 다음의 온도 과정에 따른다(MTC200 터모싸이클러); 94℃에서 5분간, 그리고 봉해진 웰을 이용하여 매 30초마다 온도를 0.5℃씩 감소시키는 과정을 68회 즉, 온도는 34분 동안 60℃가 내려간다. 샘플은 실온에서 200㎕ TNT로 3회 세척한다. 그 다음 웰은 30분간 0.1㎎/㎖ BSA(New England Biolabs, Beverly, MA)를 포함하는 50㎕ TNT로 배양시킨다. 그 다음 웰은 붉은 색, 형광, 스트렙트아비딘-피복된 40나노메터 미소구(Molecular Probes, Portland, OR) 15㎕ 용액으로 5분간 배양시킨다. 미소구 용액은 미소구 원액 2㎕로 만드는데, 5분간 50W 초음파 수조(Elgasonic, Bienne, Switzerland)에서 초음파분쇄시키고, 0.1㎎/㎖ BSA를 포함하는 1㎖ TNT 용액으로 희석시킨 다음, Millex GV4 0.22㎛ 세공 크기 필터(Millipore, Bedford, MA)를 이용하여 여과시킨다.
DNA 콜로니 보기- 착색된 샘플은 역상 Axiovert 10 현미경에서 20X 대물렌즈(Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany), Micromax 512x768 CCD 카메라(Princeton instruments, Trenton, NJ)를 이용하여, PB546/FT580/LP590 필터 세트 및 10초간 노출을 이용하여 관찰할 수 있다. 파일은 TIFF 포맷으로 변환되어, 적절한 소프트웨어에서 처리한다(PhotoPaint, Corel Corp. Ltd, Dublin, Ireland). 처리과정은 역위 선형 대조 과정으로 레이져 프린터상에서 흑백으로 인쇄하기에 적합한 사진을 얻을 수 있다.
결과
합성 mRNA 및 cDNA 합성- cDNA 합성에 이어서, 아가로즈 겔 전기영동을 이용하여 검사하는 것과 같이 PCR에서 p251 프라이머(제1가닥 cDNA의 각 말단에서 생성된)를 이용하여, cDNA를 검사하였다. 합성된 mSlo mRNA를 간 mRNA로 희석한 후에, 이는 비특이적으로 손상된 간 cDNA가 증가하고, mSlo-특이적인 밴드의 강도가 감소되면 알 수 있다.
DNA 콜로니의 감지 및 정량화- DNA 콜로니는 형광 상 CCD 현미경 또는 신틸레이션 카운트를 이용하여 검사하였다. 도 6에서 볼 수 있는 것과 같이, 접합된 샘플의 양에 대한 함수로써 형광으로 감지가능한 콜로니의 수가 증가되었다. 이와 같은 증가는 감지된32P-방사능표지의 양으로 반영된다.
방사능표지된 프로브를 이용하여, 약 mRNA 복사체를 약 1:100 수준에서도 감지할 수 있다. 그러나, 형광 현미경 CCD 상 기술을 이용하는 경우에는 mRNA를 1:10000 희석비에서도 감지할 수 있다.
실시예 7; 고형 지지체(플라스틱)에 프라이머의 공유 결합
올리고뉴클레오티드 프라이머를 Nucleolink 플라스틱 미소역가 웰(Nunc. Denmark)에 부착시켜, 적절한 결합 시간 및 화학물질을 결정할 수 있다. 올리고뉴클레오티드: CP2(5'-인산염-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), CP8(5'-(아미노-헥사메틸렌)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), CP9(5'-(하이드록실)-TTTTTT TTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), CP10(5'-(디메톡시트리틸)-TTTTTTTTTTAGAAGGA GAAGGAAAGGGAAAGGG), CP11(5'-(바이오틴)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) (Microsynth GmbH, Switzerland)는 다음과 같이 Nucleolink 미소역가 웰에 고정시킨다(각 8개 웰); 각 웰에는 0.1μM 올리고뉴클레오티드, 10mM 1-메틸-이미다졸(pH 7.0)(Sigma Chemicals), 10mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보이미드(pH 7.0)(Sigma Chemicals)/10mM 1-메틸-이미다졸을 포함하는 20㎕ 용액을 가지고 있다. 그 다음 웰을 봉하고, 다양한 시간동안 50℃에서 배양시킨다. 결합 반응은 200㎕ RS(0.4N NaOH, 0.25% Tween 20)으로 2회 헹구고, 200㎕ TNT(100mM TrisHCl pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)으로 2회 헹구어서, 특정 시간대에 종료시킨다. 튜브는 50℃에서 30'간 건조시키고, 4℃에서 봉해진 플라스틱 백에 저장하였다.
PCR 콜로니 발생 조건하에서 결합된 올리고뉴클레오티드의 안정성
콜로니 생장 조건하에서 PCR 혼합물(20㎕ 각 dNTPs (0.2mM) 0.1% BSA, 0.1% Tween 20, 8% DMSO(디메틸설폭시드, Fluka Switzerland, IX PCR 완충액)을 첨가하여, 안정성을 테스트한다. 그 다음 웰은 터모사이클러에 넣고, 다음의 조건을 33회 반복한다; 94℃에서 45초간, 60℃에서 4분, 72℃에서 4분. 이와 같은 프로그램을 완료한 후에, 웰은 5xSSC, 0.1% Tween 20으로 헹구고, 추가 사용할 때까지 8℃에 유지시킨다. 하이브리드 반응 전에 웰에는 94℃에서 가열시킨 50㎕ 5xSSC 0.1% Tween 20 용액으로 채우고, RT에서 보관한다.
프로브;
올리고뉴클레오티드 프로브, R57 (5'(인산염)-GTTTGGGTTGGTTTGGGTTGGTG, 기준 프로브) 및 R58(5'-(인산염)-CCCTTTCCCTTTCCTTCTCCTTCT)은 CP2, CP8, CP9, CP10, CP11에 상보적인 것으로 이들의 5'말단에 박테리오파아지 T4 폴리뉴클레오티드 카이나제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 [Y-32p]dATP(Amersham, UK)로 효소 표지시킨다. 과량의32p dATP는 Chroma Spin 컬럼 TE-10(Clontech, Palo Alto CA)으로 제거한다. 방사능표지된 올리고뉴클레오티드(0.5μM in 5xSSC, 0.1% Tween 20)는 2시간동안 37℃에서 올리고뉴클레오티드 유도화된 Nucleolink에 하이브리드시킨다. 웰은 실온에서 5xSSC, 0.1% Tween 20으로 4회 세척시키고, 그 다음 37℃에서 15'분동안 0.5xSSC, 0.1% Tween 20으로 세척한다. 그 다음 웰을 실틸레이션 카운팅을 이용하여 결합 프로브를 검사하였다.
결과
올리고뉴클레오티드상의 5'기능기의 성질에 따라 올리고뉴클레오티드 결합 속도 및 특이성이 상당하게 차이가 있었다. 5'-아미노기를 가지는 올리고뉴클레오티드는 5'인산염 기로 기능화된 올리고뉴클레오티드보다는 약 2배 빠르게 결합하였다(표 2와 도 8 참고). 또한, 5'하이드록실, 5'-DMT 또는 5'비오틴으로 기능화된 기준 올리고뉴클레오티드는 모두 5'-인산염의 경우와 비슷한 속도로 결합하였다. 5' 인산염 기를 이용한 화학물질의 결합에 5'특이적인 성질을 연구하게 한다.
표 2
5'-인산염 5'-아미노 5'-하이드록실 5'-DMT 5'-비오틴
Ka(min-1) 0.0068 0.0135 0.0063 0.0070 0.0068
부착된 올리고뉴클레오티드(fmol/웰) 608 1344 542 602 650
PCR 안정성(유지%) 56 69 66 66 62

Claims (34)

  1. 적어도 한 개의 핵산을 증폭시키는 방법에 있어서,
    (1) 증폭시킬 핵산으로 구성된 적어도 한 개의 핵산 주형을 만드는데, 이때 핵산에는 5'말단에 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 3'말단에 올리고뉴클레오티드 서열 Z을 포함하고, 또한 핵산에는 5'말단에 고형 지지체에 핵산을 부착시키기 위한 수단이 포함되고;
    (2) 한 개 이상의 콜로니 프라이머 X와 핵산 주형을 혼합시켜, 올리고뉴클레오티드 서열 Z에 하이브리드 할 수 있고, 고형 지지체에 콜로니 프라이머를 부착시키는 수단을 가지고, 핵산 주형 및 콜리니 프라이머의 5'말단이 고형 지지체에 결합되고;
    (3) 결합된 주형에 한 개 이상의 핵산 증폭 반응을 실행시켜, 핵산 콜로니를 만드는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 서열 Z는 올리고뉴클레오티드 서열 Y에 상보적이고, 콜로니 프라이머 X는 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 같은 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 두 개의 다른 콜로니 프라이머 X를 (2)단계의 주형과 혼합시키고, 콜로니 프라이머 X의 서열은 올리고뉴클레오티드 서열 X다 콜로니 프라이머 X중 하나와 하이브리드할 수 있도록 하고, 올리고뉴클레오티드 서열 Y는 콜로니 프라이머 X중 하나와 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 콜로니 프라이머 X는 축중 프라이머 서열로 구성되어, 핵산 주형에는 올리고뉴클레오티드 서열 Y 또는 Z를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서, 생성된 핵산 콜로니중 한 개이상의 서열을 결정하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 서열 결정 단계는 표지된 올리고뉴클레오티드의 결합 및 감지하는 것과 관련된 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 한 개 이상의 콜로니에 있는 증폭된 핵산 주형의 부분 또는 전부 서열이 동시에 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 있어서, 생성된 콜로니를 눈으로 확인하는 단계가 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 눈으로 확인하는 단계는 표지된 또는 표지안된 핵산 프로브를 이용하는 단계가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 있어서, 고형 지지체상에 콜로니 프라이머 및 핵산 주형을 부착시키는 수단은 고형 지지체상에 핵산 서열을 공유 결합시키는 수단이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 고형 지지체상에 핵산 서열을 공유부착시키는 수단은 화학적으로 변형가능한 기능기가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 화학적으로 변형가능한 기능기는 인산염기, 카르복실기 또는 알데히드기, 티올기, 하이드록실기, 디메톡시트리틸(DMT) 또는 아미노기가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 화학적으로 변형가능한 기능기는 아미노기가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항중 어느 한 항에 있어서, 고형 지지체는 라텍스 비드, 덱스트란 비드, 폴리스티렌, 폴리프로필렌 표면, 폴리아크릴아마이드 겔, 금 표면, 유리 표면 및 실리콘 와이퍼에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 고형 지지체는 유리가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15항중 어느 한 항에 있어서, 생성된 핵산 콜로니의 밀도는 10,000/㎟ 내지 100,000/㎟가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16항중 어느 한 항에 있어서, 고형 지지체상에 부착된 콜로니 프라이머 X의 밀도는 적어도 1fmol/㎟이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 16항중 어느 한 항에 있어서, 고형 지지체상에 부착된 콜로니 프라이머 X의 밀도는 적어도 1fmol/㎟이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 증폭시킬 핵산으로 구성된 다수의 핵산 주형에 있어서, 핵산에는 5'말단에 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 3'말단에 올리고뉴클레오티드 서열 Z를 포함하고, 또한 핵산에는 5'말단에 고형 지지체에 핵산을 부착시키기 위한 수단이 포함되는 것을 특징으로 하는 다수의 핵산 주형.
  20. 제 19 항에 있어서, 주형은 다수의 콜로니 프라이머 X와 혼합시키는 것을 특징으로 하는 다수의 핵산 주형.
  21. 제 19 항 또는 제 20항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 서열 Z는 올리고뉴클레오티드 서열 Y에 상보적이고, 콜로니 프라이머 X는 올리고뉴클레오티드 서열 Y와 같은 서열인 것을 특징으로 하는 다수의 핵산 주형.
  22. 제 19 항 또는 제 20항에 있어서, 두 개의 다른 콜로니 프라이머 X를 주형과 혼합시키고, 콜로니 프라이머 X의 서열은 올리고뉴클레오티드 서열 X다 콜로니 프라이머 X중 하나와 하이브리드할 수 있도록 하고, 올리고뉴클레오티드 서열 Y는 콜로니 프라이머 X중 하나와 동일한 것을 특징으로 하는 다수의 핵산주형.
  23. 제 19 항 또는 제 20항에 있어서, 콜로니 프라이머 X는 축중 프라이머 서열로 구성되어, 핵산 주형에는 올리고뉴클레오티드 서열 Y 또는 Z를 포함하지 않는 것을 특징으로 다수의 핵산주형.
  24. 다수의 콜로니 프라이머 X와 적어도 한 개의 핵산 주형이 부착되는 고형 지지체에 있어서, 핵산 주형 및 콜로니 프라이머는 전술한 어느 한 항에 따라 정의된 것과 같은 것을 특징으로 하는 고형 지지체.
  25. 제 24 항에 있어서, 다수의 핵산 주형은 고형 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는 고형 지지체.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 고형 지지체는 제 14 항 및 제 15 항에정의된 것과 동일한 것이 되는 것을 특징으로 하는 고형 지지체.
  27. 제 24 항 내지 제 26 항에 있어서, 고형 지지체에 핵산 주형 및 콜로니 프라이머는 공유부착을 이용하여 부착시키는 것을 특징으로 하는 고형 지지체.
  28. 제 1 항 내지 제 18 항에 정의된 방법을 이용하여 생성된 한 개 이상의 핵산 콜로니를 가지는 것을 특징으로 하는 고형 지지체.
  29. 제 24 항 내지 제 28 항중 어느 한 항의 고형 지지체에 있어서, 핵산 증폭 또는 서열분석 과정에 이용되는 것을 특징으로 하는 고형 지지체.
  30. 제 29 항에 있어서, 방법은 제 1 항 내지 제 18 항중 어느 한 항에서 청구한 바와 같은 방법이 되는 것을 특징으로 하는 고형 지지체.
  31. 제 1 항 내지 제 18 항에 따른 방법은 핵산 증폭 또는 서열분석 과정에 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 1 항 내지 제 18항중 어느 한 항에 따라 정의된 방법의 용도 또는 이 방법에 의해 생성된 핵산 콜로니의 용도 또는 제 19 항 내지 제 23 항의 다수의 핵산 주형의 용도 또는 제 24 항 내지 제 28항의 고형 지지체의 용도에 있어서, 서열화,재서열화, 유전자 발현 모니터, 유전자 다양성 프로파일, 진단. 스크리닝, 전체 게놈 스크리닝, 전체 게놈 다양성 발견, 전체 게놈 슬라이드의 기록 및 준비를 위한 핵산 분자를 제공할 때 또는 핵산 또는 핵산 서열의 증폭과 관련된 다른 용도에 이용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  33. 핵산 증폭 또는 서열분석에 이용되는 키트에 있어서, 고형 지지체에 결합된 상기 항에서 정의된 바와 같은 다수의 핵산 주형 및 콜로니 프라이머로 구성된 것을 특징으로 하는 키트.
  34. 제 33 항에 있어서, 키트는 서열화, 재서열화, 유전자 발현 모니터, 유전자 다양성 프로파일, 진단, 스크리닝, 전체 게놈 스크리닝, 전체 게놈 다양성 발견, 및 기록 또는 핵산 또는 핵산 서열의 증폭과 관련된 다른 용도에 이용되는 것을 특징으로 하는 키트.
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