CN1325458A - 核酸扩增和测序方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供扩增和测序至少一种核酸的方法,包括以下步骤:(1)形成至少一种含待扩增或待测序的核酸的核酸模板,其中所述的核酸在5′端含有寡核苷酸序列Y,在3′端含有寡核苷酸序列Z,另外在5′端核酸带有将该核酸附着于固相支持物的装置;(2)将所述的核酸模板与一种或多种集落引物X混合,集落引物X可与寡核苷酸序列Z杂交,且在其5′端还携带了将该集落引物附着于固相支持物的装置,在存在固相支持物时,可使核酸模板和集落引物二者的5′端结合于固相支持物;(3)在结合的模板上进行一种或多种核酸的扩增反应,从而产生核酸集落,且任选地对产生的一个或多个核酸集落进行一测序步骤。本发明还提供用于这些方法的固相支持物、试剂盒和装置。

Description

核酸扩增和测序方法
本发明涉及核酸扩增和测序领域。更具体地说，本发明涉及核酸扩增和测序方法，以及用于核酸大规模高产率扩增和测序的装置和试剂盒。
核酸测序分析在生物、生物技术和医药的许多领域中已成为奠基石。测定核酸序列的能力随着开始尝试测定人和其它高等生物大基因组序列以及例如单个核苷酸多态性的测定和筛选以及基因表达的监测而变得日益重要。核酸测序提供的遗传信息可应用于许多领域，如药物靶标的发现和确认、疾病的诊断和危险性评分，以及生物鉴定和特性分析。
这些运用的第一步是确定感兴趣核酸的确切化学成分，更确切地说是测定组成核酸的四种碱基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)的存在序列。但这些运用需要大规模核酸测序，从而极其需要高产率的核酸测序方法。
本领域中已有了核酸测序方法。两种最常用的方法是依赖于碱基特异性化学性质的Maxam和Gilbert提出的化学切割技术，和目前更常用的Sanger测序技术，它依赖于酶促链终止原理且现已用作核酸测序的常规方法。
在Sanger测序中，每种待测序的核酸在反应中被复制，参与反应的有DNA聚合酶、脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)和二脱氧核苷酸三磷酸(ddNTPs)。DNA聚合酶可将dNTPs和ddNTPs掺入到生长的DNA链中。但一旦掺入ddNTP，生长的DNA链的3’端将缺少羟基，从而不再是链延伸的底物，而终止核酸链。所以，在含一种类型ddNTP的具体反应中，产生一种不同长度核酸组成的混合物，全都是以相同的ddNTP结束。通常是用这四种类型ddNTP的每一种ddNTP进行分离反应的，产生的核酸片段的长度分布用变性凝胶电泳(按核酸片段的大小分辨核酸)分析，或最近更常用质谱分析。通常标记反应混合物中一种或多种脱氧核苷三磷酸，从而能检测不同长度的片段。
上述方法的缺点是待测序的每个核酸都要在生化反应中分别进行加工。凝胶电泳繁重、费力，即使采用毛细管电泳速度也慢，且不适合于大规模高产率测序。另外，随后的测序也是繁重的。质谱分析仍旧处在原型水平，需要非常昂贵的装置，而且每个样品必须单独分析。
增加生产率的一个方法将是同时分析多个样品。已使用了采用核酸探针进行DNA杂交的方法，可在生化和电泳过程中进行多个分析，但代价是冗长的附加操作。
最近可采用的方法是基于DNA芯片和DNA杂交的方法(Thomas和BurkeExp.Opin Ther.Patents 8:503-508(1998))。这些方法有缺点，因为每种应用必须先设计和制造DNA芯片：其操作冗长，且只有当芯片需求量很大时才能降低单个芯片的价格。还有，这些芯片不可重复使用，每个芯片只适用于一个核酸样品，如每次只能诊断一个患者。最后，可用这种芯片分析的序列长度限制在小于100,000个碱基，而且这对一些运用如DNA基因分型和基因表达概况分析受到限制。
在核酸测序分析的大多数已知方法中，为了得到分析所需的足够量核酸，扩增感兴趣核酸是先决步骤。
本领域熟知并发表了好几种核酸扩增方法。例如，扩增磺酸可将感兴趣的核酸插入到一表达载体构建物中，然后将这些载体引入适合的生物宿主细胞中，采用已建立的方法培养生物宿主来扩增载体DNA，包括感兴趣核酸。
可用本领域熟知的和发表的方法从宿主细胞分离出用这些方法扩增的核酸。但这些方法的缺点是费时、劳动强度高和难以自动化。
1985年(Saiki等人，Science 230,1350-1354)公开了用聚合酶链式反应扩增DNA的技术，目前它已是本领域熟知公开的方法。可用两个短的核苷酸序列(通常称为引物)，它们对待扩增的DNA序列的已知侧翼序列是特异性的，来扩增感兴趣靶核酸片段。引物与变性后的双链DNA片段的相反链杂交并定向，从而在两引物之间的区域由DNA聚合酶进行DNA合成，聚合酶将核苷酸依次加入而延伸引物序列。这种延伸反应产生了两个双链靶区域，每个区域都可再次变性而进行第二轮杂交和延伸。第三轮产生的两个双链分子，精确地包含了双链形式的靶区域。重复热变性、引物扩增和延伸的循环，迅速指数式积累了DNA的特异性靶片段。通常，这种方法是在溶液中进行的，通过本领域熟知的方法(如凝胶电泳)从溶液中纯化出扩增的靶核酸片段。
最近，公开了用一移植到表面的引物与溶液中游离的引物相结合的方法。这些方法使得可以同时进行扩增并将PCR产物附着到表面上(Oroskar,A.A.等人，Clinical Chemistry 42:1547(1996))。
WO96/04404和(Mosaci Technologies,Inc等人)公开了检测可能含靶核酸的样品中靶核酸的方法。这种方法包括只在测试的样品中存在靶核酸时，才诱发靶核酸的PCR扩增。在靶序列扩增中，使两种引物附着于固相支持物，从而使扩增的靶核酸序列也附着于该固相支持物。该文献所公开的扩增技术有时也称为″桥式扩增″技术。在该方法中，对常规PCR而言两种引物是特异性设计的，它们可侧接于待扩增的具体靶DNA序列。所以，如果样品中存在该具体的靶核酸，此靶核酸可与引物杂交，并用PCR扩增。PCR扩增的第一步，是靶核酸与附着于支持物的第一特异性引物(″引物″1)杂交。然后通过延伸引物1序列，形成与靶核酸互补的第一扩增产物。在使支持物变性的条件下，释放此靶核酸，其可与附着于支持物的引物1的其他序列进行进一步的杂交反应。随后附着在支持物上的第一扩增产物可与附着在支持物上的第二特异性引物(″引物″2)杂交，通过引物2序列的延伸可形成含与第一扩增产物互补的核酸序列的第二扩增产物，它也附着于支持物。所以，靶核酸、第一和第二扩增产物能参与多个杂交和扩增反应，仅受初期存在的靶核酸和初期存在的引物1和引物2序列的数量的限制，结果是附着于表面靶序列产生大量的拷贝。
由于在该反应过程中，只有存在靶核酸时才形成扩增产物，监测支持物上一种或多种扩增产物存在与否就可表明特异性靶序列的存在与否。
可用Mosaic方法，通过对每种不同靶核酸序列特异性的第一和第二引物在固相支持物上不同区域进行不同设置的陈列安排，可同时扩增几种不同靶核酸序列，来实现多重扩增的量。
Mosaic方法的缺点是，第一和第二引物序列必须对每种待扩增的核酸是特异性的，所以它只可用于扩增已知序列。另外，它的产率受以下因素的限制：特异性引物的不同设置的数目，和随后扩增的靶核酸分子数目(可在给定的固相支持物的不同区域排成陈列)，和在特定区域设置核酸陈列所需的时间。而且，Mosaic方法还需要两种不同引物通过5′端均匀附着于支持物的不同区域(在那儿形成扩增产物)。这不能用已有的DNA芯片制造技术来实现，而必须用样品分配的一些方法进行。所以，用这种方法实现的密度也与其它常规陈列安排技术具有相同的限制性。另一限制是监测支持物各不同区域是否存在扩增的靶核酸的速度。
通常在膜(如尼龙或硝酸纤维素膜)上进行DNA样品的陈列安排。用适合的机器人(如Q-botTM,Genetix Ltd,Dorset BH23 3TG UK)意味着可能得到高达10个样品/mm2的密度。在这些方法中，用物理化学方法(如，UV辐射)将DNA共价连接于膜，DNA大分子(如大于100个核苷酸长度)以及较小的DNA分子(如寡核苷酸引物)的陈列安排是可能的。
用其它已知的方法可得到寡核苷酸的较高密度陈列。例如，基于预先排布好陈列的载玻片方法，其上用喷墨技术(Blanchard,A.P.和L.Hood,Microbial andComparative Genomics,1:225(1996))获得反应区域的陈列，或反应性聚丙烯酰胺凝胶陈列(Yershov,G.等人，Proceeding of the National Academy of Science,USA,93:4913-4918(1996))，理论上可以得到至多100个样品/mm2的陈列排布。
也可用DNA芯片实现较高样品密度(Fodor,S.P.A.等人，Science 251:767(1991))。最近，分子生物技术中用了带625个寡核苷酸探针/mm2的芯片(Lockhart,D.J.等人，Nature Biotechnology 14:1675(1996))。公开了可实现高达250000个样品/cm2(2500/mm2)密度的探针(Chee,M.等人，Science 274:610(1996))。然而，至今在约2.5cm2的单个芯片上可安排至多132000个不同寡核苷酸的陈列。重要的是，这些芯片是将寡核苷酸的3′OH端连接于固体表面的方式制造的。这意味着以这种方式连接于芯片的寡核苷酸不能用作PCR扩增反应中的引物。
重要的是，当PCR产物连接于发生PCR扩增的容器时，产生的PCR产物陈列的密度受限于可用的容器。至今可用的容器仅为96孔微量滴定板形式。这使得只能得到约0.02个PCR产物样品/mm2表面。
例如，用可购得的NucleolinkTM(Nunc A/S,Roskilde,Denmark)，可能实现同时扩增和密度为0.02个样品/mm2孔表面的样品陈列(其上已移植有寡核苷酸引物)。但技术问题是用这种方法不能实现样品密度的显著增加。
所以，可见为了增加生产率，本领域需要一种新的核酸扩增方法，它可以同时进行核酸样品的扩增和陈列排布，且密度较高，另外，还可以较快的速率监测样品(较佳的是平行的)。
另外，显然本领域需要一种新方法来进行大量样品的加工和平行测序，即需要一种测序方法，使这种过程明显多路化。测序过程的明显多路化将使产率比本领域已知的测序方法实现的产率高。如果新方法能费用合理、劳动强度较低(与常规测序方法相比)来实现这种高产率测序，则这种新方法甚至更为理想。
本发明描述了一种固相核酸扩增新方法，其能同时设置大量不同的核酸序列陈列并扩增，且密度高。本发明还描述了快速(如果需要以平行方式)监测大量扩增的不同核酸序列的方法。本发明描述的方法还可在短时间内同时测定大量不同的核酸序列。这些方法特别适用于(但不限于)全基因组的测序，或需要同时测定许多个体(如500)的许多基因(如500)等情况，或同时为大量基因(如上百万)的多态性评分，或同时监测大量基因(如100,000)的表达。
所以本发明提供扩增至少一种核酸的方法，包括以下步骤：
(1)形成至少一种含待扩增核酸的核酸模板，其中所述的核酸在5′端含有寡核苷酸序列Y，在3′端含有寡核苷酸序列Z，另外该核酸在5′端带有将其附着于固相支持物的装置；
(2)将所述的核酸模板与一种或多种集落引物X混合，此集落引物X能与寡核苷酸序列Z杂交，其5’端携带有将集落引物附着于固相支持物的装置，存在固相支持物时，可使核酸模板和集落引物二者的5′端可结合于固相支持物；
(3)在结合的模板上进行一种或多种核酸的扩增反应，从而产生核酸集落。
在本发明的另一实例中，在该方法的步骤(2)中将两种不同的集落引物X与核酸模板混合。较佳的是，集落引物X的序列是使寡核苷酸序列Z能与集落引物X中的一种杂交，且寡核苷酸序列Y与集落引物中的一个是相同的。
在本发明的另一实例中，寡核苷酸序列Z与寡核苷酸序列Y互补，称为Y′，且集落引物X与寡核苷酸序列Y的序列相同。
在本发明的另一实例中，集落引物X可含有简并引物序列和含待扩增核酸的核酸模板，但在5′和3′分别不含寡核苷酸序列Y或Z。
在本发明的另一方面，所述的方法包括另一步骤，即进行至少一步对步骤(3)生成的一种或多种核酸集落的序列测定。
所以本发明还提供测定至少一种核酸序列的方法，包括以下步骤：
(1)形成至少一种含待测定核酸的核酸模板，其中所述的核酸在5′端含有寡核苷酸序列Y，在3′端含有寡核苷酸序列Z，另外该核酸在5′端带有将其附着于固相支持物的装置；
(2)将所述的核酸模板与一种或多种集落引物X混合，此集落引物X能与寡核苷酸序列Z杂交，其5′端携带有将集落引物附着于固相支持物的装置，存在固相支持物时，可使核酸模板和集落引物二者的5′端可结合于固相支持物；
(3)在结合的模板上进行一种或多种核酸的扩增反应，从而产生核酸集落；和
(4)进行至少一步对至少一种生成的核酸集落的序列测定。
本发明的另一实例中，核酸模板和集落引物二者的5’端携带将该核酸序列共价附着于固相支持物的装置。较佳的是，这种用于共价附着的装置是化学修饰的官能团，如磷酸基团、羧酸或醛分子、硫醇、羟基、二甲氧基三苯甲基(DMT)或氨基，较佳的是氨基。
可用本发明方法扩增的核酸包括DNA，如基因组DNA、cDNA、重组DNA或任何形式合成的或修饰的DNA、RNA、mRNA或任何形式合成的或修饰的RNA。所述的核酸长度可各异，且可以是较大核酸分子的片段或较小部分。较佳的是，待扩增的核酸长度至少为50个碱基对，更佳的是长度为150-4000个碱基对。待扩增的核酸可以是已知的或未知的序列，可以是单链或双链形式。可从任何来源衍生待扩增的核酸。
本文所用的“核酸模板”指含有以单链形式待扩增或测序的核酸的实体。如下所述，待扩增或测序的核酸也可以双链形式提供。所以，本发明的“核酸模板”可以是单链或双链核酸。本发明方法中可用的核酸模板可以是各种长度。较佳的是，它们的长度至少为50个碱基对，更佳的是长度为150-4000个碱基对。组成核酸模板的核苷酸可以是天然形成的或非天然形成的核苷酸。本发明的核酸模板不仅含有待扩增的核酸，还可含有短寡核苷酸序列的5′和3′端。在5’端含的寡核苷酸序列本文称为Y。寡核苷酸序列Y是已知的序列，且长度可以各异。用于本发明方法的寡核苷酸序序列Y优选的长度至少为5个核苷酸，较佳的长度介于5-100个核苷酸之间，更佳的长度是约20个核苷酸。在寡核苷酸序列Y中可存在天然或非天然形成的核苷酸。如上所述，寡核苷酸Y优选的序列是与集落引物X相同的序列。本发明核酸模板在3′端含有的寡核苷酸序列称为Z寡核苷酸序列，Z是已知的序列，且长度可各异。用于本发明方法中所用的寡核苷酸序列Z的长度优选为至少5个核苷酸，较佳的长度介于5-100个核苷酸之间，更佳的长度是约20个核苷酸。在寡核苷酸序列Z中可存在天然或非天然形成的核苷酸。将核苷酸序列Z设计成能与集落引物X中的一个杂交，较佳地被设计成与寡核苷酸序列Y互补(本文称为Y′)。分别在核酸模板5′和3′含有的寡核苷酸序列Y和Z无需位于模板的最末端。例如，虽然较佳地寡核苷酸序列Y和Z分别位于或邻近于核酸模板的5′和3′端(或末端)(如在5′和3′末端的有0-100个核苷酸内)，它们也可离核酸模板5′或3′末端更远(如大于100个核苷酸)。所以，寡核苷酸序列Y和Z可以位于核酸模板的任何位置，只要序列Y和Z各居一边，即侧接于待扩增的核酸序列。
本文所用的“核酸模板”指含有以双链形式待扩增或测序核酸的实体。当核酸模板是双链形式时，在双链的一条链的5′和3′端分别含有寡核苷酸序列Y和Z。由于DNA的碱基配对原则，另一链是互补于含有寡核苷酸序列Y和Z的链，从而在5′端含有寡核苷酸序列Z′，在3′端含有寡核苷酸序列Y′。
本文所用的“集落引物”指含有能与互补序列杂交并引发特异性聚合酶反应的寡核苷酸序列的实体。选择含集落引物的序列，使其对互补序列具有最大杂交活性，对其它序列的非特异性杂交活性非常低。用作集落引物的序列可以包括任何序列，但较佳地包括5’-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG或5’-CACCAACCCAAACCAACCCAAACC。集落引物的长度可以是5-100个碱基，但较佳的长度是15-25个碱基。引物中可存在天然或非天然形成的核苷酸。本发明方法中可用一种或两种不同的集落引物产生核酸集落。用于本发明的集落引物还可包括简并引物序列。
本文所用的“简并引物序列”指能与任何独立于所述核酸片段序列的核酸片段杂交的短寡核苷酸序列。所以虽然不排斥用简并引物与含寡核苷酸序列X或Y的模板杂交，这些简并引物并不需要核酸模板中存在待杂交于模板的寡核苷酸序列Y或Z。显然，在用于本发明的扩增方法中，简并引物必须与模板中的核酸序列杂交(在待扩增的核酸序列两边中的一个位置或侧接)。
本文所用的“固相支持物”指核酸可共价附着的任何固体表面，如乳胶珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、金表面、玻璃表面和硅片。优选的固相支持物是玻璃表面。
本文所用的“将核酸附着于固相支持物的装置”指任何化学或非化学附着方法，包括化学修饰的官能团。“附着”指将核酸固定在固相支持物上，通过共价附着，或通过不可逆的被动吸附，或通过分子间的亲和力(如生物素酰化的分子固定于涂有亲和素的表面)。这种附着的强度必须足以在DNA变性条件下，不会因用水或缓冲水溶液洗涤而除去。
本文所用的“化学修饰的官能团”指基团，如磷酸基团、羧酸或醛部分、硫醇或氨基。
本文所用的“核酸集落”指含核酸链多个拷贝的不连续区域。在同一集落中也可能存在核酸链互补链的多个拷贝。组成集落的核酸链的多个拷贝通常被固定在固相支持物上，可以是单链或双链形式。产生的本发明的核酸集落可大小各异，密度取决于所用的条件。集落优选的大小为0.2μm到6μm，较佳的是0.3μm到4μm。用于本发明方法的核酸集落的密度通常为10,000/mm2到100,000/mm2。据信可实现较高的密度，如100,000/mm2到1,000,000/mm2和1,000,000/mm2到10,000,000/mm2。
可用本发明方法产生核酸集落。所以本发明的另一方面内容是提供一种或多种核酸集落。可从本发明的单个固定的核酸模板产生本发明的核酸集落。用本发明的方法也可同时产生许多这样的核酸集落，每个集落可含有不同的固定核酸链。
所以，本发明的另一方面内容是提供多种含待扩增核酸的核酸模板，所述的核酸在5′端含有寡核苷酸序列Y，在3′端含有寡核苷酸序列Z，另外该核酸在5′端还携带将其附着于固相支持物的装置。较佳地，将这种多重核酸模板与多重集落引物X混合(集落引物能与寡核苷酸序列Z杂交，且在5′端携带将集落引物附着于固相支持物的装置)。较佳地，所述的多重核酸模板和集落引物共价连接于固相支持物。
在本发明的另一实例中，将多重两种不同集落引物X与多重核酸模板混合。较佳地，集落引物X的序列是使寡核苷酸序列Z能与集落引物X中的一种杂交，而寡核苷酸序列Y与另一种集落引物X具有相同的序列。
在本发明的另一实例中，寡核苷酸序列Z与寡核苷酸序列Y互补(Y′)，且多重集落引物X具有与寡核苷酸序列Y相同的序列。
在另一实例中，多重集落引物X可含有简并引物序列，多重核酸模板可含有待扩增的核酸，但在5′和3′端分别不含有寡核苷酸序列Y或Z。
可用本领域标准或常规技术制备本发明的核酸模板。通常这些技术是以基因工程技术为基础的。
可用本领域熟知和发表的方法得到待扩增的核酸。例如，可以用本领域熟知或发表的方法(如限制性内切酶消化或机械方法)得到核酸样品，如总DNA、基因组DNA、cDNA、总RNA、mRNA等，并从其中产生片段。
通常，首先得到双链形式待扩增的核酸。当以单链形式提供核酸时(如mRNA)，先用本领域熟知或发表的方法(如用寡-dT引物和逆转录酶和DNA聚合酶)将它制成双链形式。一旦得到适当长度双链形式的待扩增核酸，将相应于寡核苷酸序列Y和Z的寡核苷酸序列与各末端相连，即与该核酸序列的5′和3′端相连形成核酸模板。这可用本领域熟知和发表的方法进行，如用连接反应，或在侧接于适当寡核苷酸序列的某位置上，将待扩增的核酸插入到生物载体。另外，如果待扩增的核酸序列至少一部分已知，可用适当的PCR引物(含有对待扩增核酸特异性的序列)用PCR产生在5′和3′分别含寡核苷酸序列Y和Z的核酸模板。将该核酸模板附着于固相支持物之前，可用本领域熟知和发表的方法(如加热至约94℃，然后在冰上迅速冷却到0℃)。将它制成单链形式。
核酸5′端所含的寡核苷酸序列可以是任何序列，任意长度，本文以序列Y表示。可用本领域熟知和发表的方法选择适合长度和序列的寡核苷酸。例如，附着于待扩增核酸两端的寡核苷酸通常是长度为5-100个核苷酸之间的相对较短的核苷酸序列。核酸3′端所含的寡核苷酸序列可以是任何序列，任意长度，本文以序列Z表示。可用本领域熟知和发表的方法选择适合长度和序列的寡核苷酸。例如，在待扩增核酸两端所含的寡核苷酸通常是长度为5-100个核苷酸之间的相对较短的核苷酸序列。
寡核苷酸序列Z的序列是能与一种集落引物X杂交的序列。较佳地，寡核苷酸序列Y的序列具有与一种集落引物X相同的序列。更佳的是，寡核苷酸序列Z与寡核苷酸序列Y互补(Y′)，集落引物X具有与寡核苷酸序列Y相同的序列。
可用本领域标准或常规技术制备本发明的寡核苷酸序列Y和Z，或也可购得。
当产生本发明的核酸模板时，也可用本领域熟知和发表的方法插入其它所需的序列。所述的其它序列包括，如限制性内切位点或某些核酸标记物，从而可以鉴定出某给定核酸模板序列的扩增产物。其它所需的序列包括折回DNA序列(当变成单链时，形成发夹环或其它二级结构)、指导蛋白质/DNA相互作用的“调控”DNA序列，如启动子DNA序列(由核酸聚合酶识别)或操纵子DNA序列(由DNA结合蛋白识别)。
如果存在多重待扩增核酸序列，可在相同或不同反应中进行寡核苷酸Y和Z的附着。
一旦制备好核酸模板，可在用于本发明方法前扩增。这些扩增可用本领域熟知和发表的方法进行，例如将模板核酸插入到表达载体中，并在适当的生物宿主中扩增，或用PCR扩增。然而这种扩增步骤不是必须的，因为本发明方法能在由核酸模板单个拷贝产生的核酸集落中产生该核酸模板的多个拷贝。
较佳地，修饰上述制备的核酸模板的5′端以携带使该核酸模板能共价附着于固相支持物的装置。这种装置可以是，如化学修饰的官能团，如磷酸基团、羧酸或醛部分、硫醇或氨基。最佳的是用硫醇、磷酸或氨基基团对该核酸作5’修饰。
可用本领域的标准或常规方法制备本发明的集落引物。通常，本发明的集落引物是用本领域熟知或发表的方法产生的合成寡核苷酸，或者可购置。
按本发明的方法，可用一种或二种不同的集落引物X来扩增任何核酸序列。这有别于且优于本领域已知的许多扩增方法，如WO 96/04404中公开的，其中对于待扩增的每种特定核酸序列都要设计不同的特异性引物。
较佳地，修饰本发明集落引物X的5′端以携带使该集落引物能共价附着于固相支持物的装置。较佳地，共价附着的装置是上述化学修饰的官能团。如果需要，可将集落引物设计成含有其它所需序列的，如限制性内切酶位点或其它类型切割位点，如核酶切割位点。其它理想的序列包括折回DNA序列(当变成单链时，形成发夹环或其它二级结构)、指导蛋白质/DNA相互作用的“调控”DNA序列，如启动子DNA序列(由核酸聚合酶识别)或操纵子DNA序列(由DNA结合蛋白识别)。
通过5′端将集落引物X固定于支持物，使它的3′端远离支持物，从而一旦发生与核酸模板3’端所含互补寡核苷酸序列的杂交，可得到集落引物用于聚合酶进行链延伸。
一旦合成本发明的核酸模板和集落引物，就将它们以适当的比例混合在一起，从而当它们附着于固相支持物时，可得到适当密度的附着核酸模板和集落引物。较佳地，混合物中集落引物的比例高于核酸模板的比例。较佳地，集落引物与核酸模板的比例如下，当集落引物和核酸模板固定于固相支持物时，形成集落引物“苔”，在整个固相支持物或其一确定区域上以适当的均匀密度分布着多重集落引物，在集落引物苔中独立地间隔固定着一种或多种核酸模板。
可以单链形式提供核酸模板。但它们也可以完全或部分双链形式提供，一个5′端或两个5′端都被修饰，从而能附着于支持物。在这种情况中，当完成附着过程后，可用本领域熟知的方法(如在洗去释放的链之前，加热到94℃)来分离链。可以理解当双链分子的两条链都与表面反应并都附着时，其结果与一条链附着并进行一步扩增时的结果相同。换而言之，当双链模板核酸的两条链均附着时，两条链必然彼此靠近地附着，这与仅附着一条链和进行一步扩增的结果没有差异。所以，可用单链或双链模板核酸来提供附着于表面和适合于集落生成的模板核酸。
通过改变固定在支持物上的集落引物和核酸模板的浓度，可以控制单个集落引物和单个核酸模板之间的距离(并因而控制集落引物和核酸模板的密度)。集落引物的优选密度是至少1fmol/mm2，较佳的是10fmol/mm2，更佳的是在30-60fmol/mm2之间。用于本发明方法的核酸模板的密度通常为10,000/mm2到100,000/mm2。据信可实现较高的密度，如100,00/mm2到1,000,000/mm2和1,000,000/mm2到10,000,000/mm2。
控制附着的核酸模板和集落引物的密度，从而可控制支持物表面上核酸集落的最终密度。这是因为以下事实：按本发明的方法，一个核酸集落是由一个核酸模板附着而产生的，只要在固相支持物的适当部位上存在本发明的集落引物(见以下更详尽的描述)。也可通过控制附着的集落引物的密度来控制单个集落中核酸分子的密度。
一旦以适当的密度将本发明的集落引物和核酸模板固定在固相支持物上，可通过在共价连接的模板核酸上进行适当轮数的扩增，产生本发明的核酸集落，从而每个集落含有初始固定的核酸模板和其互补序列的多个拷贝。一轮扩增包括以下步骤：杂交、延伸和变性，这些步骤通常用本领域熟知的PCR试剂和条件进行。
通常扩增反应包括将固相支持物、附着的核酸模板和集落引物置于诱导引物杂交的条件下，如将它们置于65℃左右的温度。在这些条件下，核酸模板3′端的寡核苷酸序列Z将与固定的集落引物X杂交，在存在支持引物延伸的条件和试剂下，如72℃左右的温度，存在核酸聚合酶，如依赖于DNA的DNA聚合酶或逆转录酶分子(即依赖于RNA的DNA聚合酶)、或存在RNA聚合酶，加上存在一些核苷三磷酸分子或其他核苷酸前体分子(如修饰的核苷三磷酸分子)，加入互补于模板核酸序列的核苷酸，集落引物就会延伸。
可用于本发明的核酸聚合酶的例子是DNA聚合酶(克列诺片段，T4 DNA聚合酶)、各种耐热细菌的热稳定DNA聚合酶(如Taq、VENT、Pfu、Tfl DNA聚合酶)以及它们遗传修饰的衍生物(TaqGold,VENTexo,Pfu exo)。也可联用RNA聚合酶和逆转录酶来产生DNA集落的扩增。较佳地，用于集落引物延伸的核酸聚合酶在PCR反应条件(即反复循环加热和冷却)下是稳定的，且在所用的变性温度(通常约为94℃)下也是稳定的。优选的DNA聚合酶是TaqDNA聚合酶。
较佳地，所用的核苷三磷酸分子是脱氧核糖核苷三磷酸，如dATP、dTTP、dCTP、dGTP，或核糖核苷三磷酸，如ATP、UTP、CTP、GTP。核苷三磷酸可以是天然或非天然形成的。
杂交和延伸步骤后，将支持物与固定的核酸置于变性条件下，将存在两种固定的核酸，第一种为初始固定的核酸模板，第二种是它的互补核酸，系从一种固定的集落引物X延伸而得。然后初始固定的核酸模板和形成的固定的延伸集落引物都能引发进一步的扩增，支持进一步杂交、延伸和变性的循环。这种扩增的进一步循环将产生含模板核酸和其互补序列的多个固定拷贝的核酸集落。
模板核酸的初始固定意味着模板核酸只能与在全长模板核酸内隔开一定距离的集落引物杂交。所以，形成的核酸集落的边界被限于相当于初始核酸模板被固定区域的局部区域内。显然，一旦通过下几轮的扩增(即下几轮的杂交、延伸和变性)合成了模板分子和其互补物的更多拷贝，则生成的核酸集落的边界线能进一步延伸，虽然形成的集落边界线仍被限于相当于初期核酸模板被固定的区域的局部区域内。
图1显示了按本发明实例产生核酸集落方法的示意图。图1(a)显示本发明的集落引物X(此处所示的带有序列ATT)，和本发明的核酸模板，在5′端含有寡核苷酸序列Y(此处所示的为ATT)，在3′端含有寡核苷酸序列Z(此处所示的为AAT)，它能与集落引物序列X杂交。在示意图中，显示的集落引物X和寡核苷酸序列Y和Z长度仅三个核苷酸。然而实际上可理解通常采用更长的序列。集落引物和核酸模板二者的5′端都携带有使核酸附着子固相支持物的装置。图1中以黑色方框表示此装置。这种附着装置可产生共价或非共价附着。
为简单起便，图1(a)中仅显示了一种集落引物X和一种模板核酸。然而实际上存在多重集落引物X和多重核酸模板。多重集落引物X可由两种不同的集落引物X组成。但为了简化示意图，图1中仅显示了一种类型的集落引物X，其序列为ATT。多重核酸模板可包含寡核苷酸Y和Z之间中心部分的不同核酸序列，但5′和3′端分别含有相同的寡核苷酸序列Y和Z。在图1中只简单显示了一种类型的核酸模板，其中心部分的序列显示为CGG。
存在固相支持物时，核酸模板和集落引物二者的5′端都结合于支持物。图1(b)中对此进行了描述。将支持物、附着的核酸模板和集落引物置于诱导引物杂交的条件下。图1(c)显示了杂交于集落引物的核酸模板。依靠核酸模板3′端的寡核苷酸序列Z能与集落引物杂交的事实，而能进行这种杂交。在示意图中，显示的寡核苷酸序列Z互补于集落引物，虽然在实际运用中不需要精确互补的序列，只要核酸模板和集落引物在所处的条件下能发生杂交。
图1(d)显示了引物延伸期。在适当温度条件下，存在DNA聚合酶和大量核苷酸前体(如dATP、dTTP、dCTP和dGTP)时，DNA聚合酶将集落引物从其3′端延伸，以核酸模板为模板。当引物延伸完成时，见图1(e)，可以看到产生了第二条固定的核酸链，它互补于初始的核酸模板。在分离两条核酸链(如用加热)时，将存在两条固定的核酸，第一条为初始固定的核酸模板，第二条是它的互补核酸，系从固定的集落引物X延伸而得，见图1(f)。
两条初始固定的核酸模板和所形成的固定的延伸集落引物二者都能与其它存在的集落引物(在图1(g)中以集落引物2和3表示)杂交，在另一轮引物延伸(图1(h)和链分离(图1(i))后，有四条固定的单链。其中有两条含有相应于初始核酸模板的序列，两条含有与其互补的序列。
可进行图1所示进一步的扩增，得到含多个拷贝的固定的模板核酸和其互补序列的核酸集落。
可以看出本发明的方法能从单条固定的核酸模板产生一个核酸集落，且通过改变核酸模板经历的扩增轮数，可控制这些集落的大小。所以在固相支持物表面形成的核酸集落的数量取决于初始固定在支持物上的核酸模板的数量，只要在每个固定的核酸模板部位内有足够量的固定的集落引物。出于这种原因，较佳的固定集落引物和核酸模板的固相支持物，包含有适当密度的固定的集落引物苔，和在引物苔中间隔固定的核酸模板。
被称为核酸集落的“自动模式”优于先前本领域的许多方法，在于因为可通过调节初始固定的核酸模板的密度，而控制密度从而获得较高密度的核酸集落。这种方法不受以下情况的特异性限制，如在支持物的特定局部区域上特异性引物的陈列排布，和将含有核酸模板的具体样品点样到引物的同一局部区域所引发集落形成。用先前本领域的方法可设置陈列的集落数量(如WO96/04404(Mosaic Technologies,Inc.)中所公开的方法)，受限于在初始步骤中可设置陈列的特异性引物区的密度/间距。
由于能控制核酸模板的初始密度因而控制核酸模板所产生的核酸集落的密度，加上能控制形成的核酸集落的大小和单个集落中核酸模板的密度，就可能达到最佳状况，即在足够大尺寸且含有足够多数量的扩增序列(使得能在核酸集落上进行随后的分析或监测)的固相支持物上可能产生高密度的单个核酸集落。
一旦产生核酸集落，就可进行其它步骤，如集落的目测或测序(见下文)。例如若需要筛选产生的克隆是否存在或缺少某特定核酸片段的整体或部分，可能要求目测集落。在这种情况下，可通过设计一核酸探针(其能与感兴趣核酸片段特异性杂交)，来检测含该特定核酸片段的集落。
较佳地，将这种核酸探针以可探测的标记如荧光基团、含生物素标记(可通过与例如荧光基团标记的链霉亲和素一起培育)、放射性同位素标记(可用本领域熟知和记载的方法将它掺入核酸探针，并通过与闪液一起培育检测放射性来测定)、或染料或其它染色试剂来标记。
另外，这些核酸探针也可以是无标记的，并设计用核酸聚合酶掺入大量标记的核苷酸的引物。然后可进行掺入标记的核酸集落的检测。
然后制备用于杂交的本发明的核酸集落。这种制备包括处理集落，使所有或部分组成集落的核酸模板以单链形式存在。这可通过，如加热变性集落中的双链DNA来实现。另外，可用对模板核酸中双链形式序列特异性的限制性内切核酸酶处理集落。这样内切核酸酶可以是对寡核苷酸序列Y或Z中所含的序列或模板核酸中存在的其它序列特异性的。消化后，加热集落，使双链DNA分子分开，洗涤集落除去未固定的链，从而在集落中留下附着的单链DNA。
制备好用于杂交的集落后，在适宜于探针与其特异性DNA序列杂交的条件下，将标记的或无标记的探针加入到集落中。可用已知的方法，由本领域熟练技术人员确定这些条件，且这些条件取决于例如探针的序列。
然后通过加热变性除去探针，如果需要可与对第二种核酸特异性的探针杂交并检测。如果需要这些步骤可重复多次。
然后可用装置(包括适当的检测仪器)检测杂交于核酸集落的标记探针。荧光标记优选的检测系统是电荷耦合仪(CCD)照相机，它可任选地与放大装置(如显微镜)连接。用这种技术可同时平行监测许多集落。例如，用带CCD照相机的显微镜以10x或20x物镜，可观察到在1mm2到4mm2之间表面上的集落，这相应于平行监测10000至200000之间的集落。而且可以预计随着镜片的改进和较大芯片的采用，此数目还将增加。
监测生成的集落的另一方法是扫描覆盖有集落的表面。例如，可以用那些系统，其能同时随着多至100000000个集落的陈列，并用CCD照相机拍摄整个表面进行监测。用这种方法，可以在短时间内监测多至100000000个集落。
本发明核酸集落的监测中可用其它装置，来检测和较佳地定量测定表面上的荧光。例如，可用荧光成像器或共聚焦显微镜。
如果标记是放射性的，要求用放射性检测系统。
在本发明的方法中，其中进行了至少一步对至少一种产生的核酸集落测序的步骤，所述的测序可用任何合适的固相测序技术进行。例如，一种可用于本发明的测序方法包括，将合适的引物(有时本文称为“测序引物”)与待测序的核酸模板杂交，延伸引物，检测用于延伸引物的核苷酸。较佳地，在将下一核苷酸加入到生长的核酸链之前，检测用于延伸引物的核酸，从而在原位核酸测序中使得能碱基对碱基。
在引物延伸反应中加入一种或多种标记的核苷酸，可便利于掺入的核苷酸的检测。可用任何适合的可检测标记，如荧光、放射性标记等。优选用荧光标记。对每种不同类型的核苷酸可用相同或不同的标记。但用荧光标记，且对每种不同类型的核苷酸用相同的标记时，掺入各核苷酸能累积性增加特定波长测得的信号。如果用不同的标记，则可在不同的适当波长测得这些信号。如果需要，也可用标记的和无标记的核苷酸混合物。
为了使适合的测序引物与待测序的核酸模板杂交，该核酸模板通常应为单链形式。如果组成核酸集落的核酸模板以双链形式存在，可用本领域熟知的方法(如变性、切割等)处理它们以提供单链核酸模板。
与核酸模板杂交并用于引物延伸的测序引物较佳地是短寡核苷酸，如长度为15-25个核苷酸。设计引物的序列使它们能与待测序的核酸模板的一部分杂交(宜在严谨条件下)。用于测序的引物序列可与用于产生本发明核酸集落的集落引物的序列相同或相似。可以溶液或固定的形式提供测序引物。
一旦将核酸模板和测序引物置于适当的条件下，将测序引物与待测序核酸模板退火(用本领域熟知的方法监测)，即进行引物延伸，如用核酸聚合酶和大量核苷酸，其中至少一些是以标记形式提供的，且条件适合于引物延伸(如果提供适当的核酸聚合酶)。可用的核酸聚合酶和核苷酸的例子如上所述。
较佳地，在每次引物延伸步骤后，包括一洗涤步骤，以除去未掺入的核苷酸(其可能干扰后续的步骤)。一旦进行了引物延伸步骤，就监测核酸集落，以确定标记的核苷酸是否掺入到延伸的引物中。可重复引物延伸步骤，以确定下一个和后续核苷酸掺入到延伸引物中。
测序可采用任何能检测和宜定量测定适当标记(如荧光或放射性标记)的装置。如果标记是荧光，可任选采用连接有放大装置(如上所述)的CCD照相机。事实上，用于本发明测序的装置可与上述监测扩增的核酸集落的装置相同。
较佳地，将检测系统与分析系统联合使用，来测定引物延伸各步后掺入各集落的核苷酸的数量和性质。这种分析可紧接在各引物延伸步骤后进行，或随后用记录的数据来测定某给定集落中核酸模板的序列。
如果待测定的序列是未知的，通常以选定的顺序使用给予某给定集落的核苷酸，然后在整个分析中重复该顺序，如dATP、dTTP、dCTP、dGTP。如果待测定的序列是已知的并要再测序，例如分析该序列与已知的序列是否有小的差异，可在各步中以适当的按已知序列选择的顺序加入核苷酸，更迅速进行序列测定。在引物延伸的特定阶段发现某些核苷酸掺入的缺失，表明检测到与给定的序列的不同。
所以，可用本发明的方法来测定组成特定核酸集落的被扩增核酸模板的全或部分序列。
在本发明的另一实例中，通过测定一个以上核酸集落中存在的被扩增的核酸模板的全或部分序列，来确定一种以上核酸的全或部分序列。较佳地，可同时测定多个序列。
用本发明方法进行核酸测序的优点为，它是非常可靠的，因为在本发明各核酸集落中提供了大量待测序的各种核酸。如果需要，可进一步改进可靠性，即通过提供含待测序同一核酸模板的多个核酸集落，然后测定多个集落每一个的序列并作比较。
较佳地，集落引物和核酸模板与固相支持物的附着，在核酸扩增反应支持物所处的温度中是耐热的，如温度高达约100℃，如94℃左右。较佳地这种附着是天然共价的。
在本发明的另一实例中，通过交联剂介导集落引物和核酸模板与固相支持物的共价结合，如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)、琥珀酰酐、苯基二异硫氰酸盐或马来酸酐、或异双官能团交联剂，如间-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-琥珀酰亚胺[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸(SIAB)、琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物(SMCC)、N-y-马来酰亚胺丁酰氧-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、琥珀酰亚胺-4-[对-马来酰亚胺苯基]丁酸盐(SMPB)和相应的硫代化合物(水溶性的)。用于本发明的优选交联剂是s-SIAB、s-MBS和EDC。
在本发明的另一实例中，固相支持物具有衍生(derivatised)化的表面。在另一实例中，固相支持物的衍生表面随后用双官能团交联剂修饰，以得到功能化的表面，较佳地带有反应性交联基团。
本文所用的“衍生化表面”指被化学反应基团(如氨基、硫代或丙烯酸基团)修饰的表面。
本文所用的“功能化的表面”指已被特异性官能团(如马来酸或丁二酸官能部分)修饰的衍生表面。
本发明的方法中，为了能用于一些运用，集落引物和核酸模板与固相支持物的连接必须满足若干要求。理想的附着应不受核酸扩增过程中所用的重复加热/冷却循环和暴露于高温的影响。另外，应使支持物上附着的集落引物的密度至少为1fmol/mm2，较佳地为至少10foml/mm2，更佳的是在30-60foml/mm2之间。理想的支持物应具有均匀平坦的表面，低荧光背景，而且耐热(不变形)。某些塑料和合成的硝基纤维素膜类型固相支持物(被动吸附DNA)不适用。最后，固相支持物应是一次性使用的，因而成本应不高。
出于这些原因，虽然固相支持物可以是核酸能附着的任何固相表面，如乳胶珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、金表面、玻璃表面和硅片，优选的固相支持物是玻璃表面，且其上核酸的附着是共价附着。
可用本领域已知和发表的方法，进行集落引物和核酸模板与固相支持物的共价结合。例如将寡核苷酸经环氧硅烷-氨基共价连接键附着在固相支持物(如多孔玻璃珠)上，已广泛用于固相原位寡核苷酸合成(通过3′端附着)，也适合于寡核苷酸的5′端附着。用羧酸或醛基修饰的5′端寡核苷酸可共价附着于肼-衍生的乳胶珠上(Kremsky等人，1987)。
其它将寡核苷酸附着于固相表面的方法采用交联剂，如琥珀酰酐、苯基二异硫氰酸盐(Guo等人，1994)，或马来酸酐(Yang等人，1998)。其它广泛使用的交联剂是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)。Gilham等人(1968)首先描述了EDC的化学性质，它通过5′末端的磷酸基团将DNA模板附着于纸(纤维素)上。利用EDC的化学性质，可使用其它支持物，如乳胶珠(Wolf等人，1987,Lund等人，1988)、聚苯乙烯微孔(Rasmussen等人，1991)、孔隙大小控制的玻璃(Ghosh等人，1987)和葡聚糖分子(Gingeras等人，1987)。Chu等人(1983)已描述了碳二亚胺介导试剂与5’氨基修饰的寡核苷酸的缩合，Egan等人(1982)描述了5’末端磷酸基团的修饰。
用碳二亚胺通过5′末端使寡核苷酸附着的产率可达到60％，但通过寡核苷酸内核苷酸的非特异性附着是一主要缺点。Rasmussen等人(1991)采用仲氨基团衍生的表面使通过5′端的特异性附着提高到85％。
最近，许多文献报道了异双功能交联剂的优点。异或同双功能交联剂已被广泛用于制备肽载体偶联分子(肽-蛋白质)以提高在动物中的免疫原性(Peeters等人，1989)。已报道这些移植试剂大都能在水溶液中形成稳定的共价键。已用这些交联剂将DNA结合到固相表面上(仅在分子的一个点上)。
Chrisey等人(1996)研究了用6种不同的异双功能交联剂使DNA固相附着的效果和稳定性。在该实例中，仅在由硫醇基团修饰的DNA低聚物的5′端发生附着。O′Donnell-Maloney等人(1996)也描述了这种类型的附着，用于MALDI-TOF测序分析中DNA靶附着，Hamamatsu Photonics P.K.company(EP-A-665293)则描述了用于固相表面上核酸碱基序列的测定。
极少有研究涉及寡核苷酸吸附于固相支持物的热稳定性。Chrisey等人(1996)报道了琥珀酰亚胺-4-[对-马来酰亚胺苯基]丁酸盐(SMPB)交联剂，在热处理过程中从玻璃表面释放出约60％分子。但没有描述其它试剂的热稳定性。
为了通过固相扩增反应产生核酸集落(如本申请所述)，需将集落引物和核酸模板在它们的5′端特异性附着到固相表面(较佳地是玻璃)。简单地说，可用氨基-烷氧基硅烷通过硅烷化衍生出具有反应性氨基的玻璃表面。合适的硅烷试剂包括氨基丙基三甲氧基硅烷、氨基丙基三乙氧基硅烷和4-氨基丁基三乙氧基硅烷。也可用其它反应基团衍生玻璃表面，如用环氧硅烷、丙烯酸硅烷和丙烯酰胺硅烷等丙烯酸基或环氧基。衍生步骤后，用交联剂(如上所述)将在5′端具有化学修饰官能团(如磷酸、硫醇或氨基基团)的核酸分子(集落引物或核酸模板)共价附着于衍生的表面。
另外，衍生步骤后可将双功能交联剂附着于表面氨基，从而提供修饰的功能化表面。具有5′-磷酸、硫醇或氨基基团的核酸分子(集落引物或核酸模板)与功能化表面作用，形成核酸和玻璃之间的共价键连接。
可用于将DNA/寡核苷酸共价连接移植到固相支持物上的可能交联剂和移植试剂包括琥珀酰酐、(1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)、间-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-琥珀酰亚胺[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸(SIAB)、琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物(SMCC)、N-y-马来酰亚胺丁酰氧-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、琥珀酰亚胺-4-[对-马来酰亚胺苯基]丁酸盐(SMPB)和相应的硫代化合物(水溶性的)。对本发明而言优选的交联剂是s-SIAB、s-MBS和EDC。s-MBS是马来酰亚胺-琥珀酰亚胺异双功能交联剂，s-SIAB是碘乙酰基-琥珀酰亚胺异双功能交联剂。两者分别能与SH基团和伯氨基形成共价键。EDC是碳二亚胺试剂，其介导磷酸和氨基基团的共价连接。
通常用磷酸基团或伯氨基(对EDC移植试剂)或硫醇基团(对s-SIAB或s-MBS交联剂)在5′端修饰集落引物和核酸模板。
所以，本发明的另一方面内容是提供一种固相支持物，其上附着有多个上述集落引物X和至少一种上述核酸模板，其中所述的核酸模板在5′端含有上述的寡核苷酸序列Y，其3′端含有上述的寡核苷酸序列Z。较佳地，多个核酸模板附着于上述的固相支持物(优选的是玻璃)。较佳地，核酸模板和集落引物与固相支持物的附着是共价的。通过用上述方法在固定的核酸模板上进行一轮或几轮核酸扩增后，形成本发明的核酸集落。本发明的另一方面是含一个或多个本发明核酸集落的支持物。本发明的还有一方面提供了在核酸扩增和测序方法中使用的本发明固相支持物。这些核酸扩增或测序方法中包括了本发明的方法。
本发明的另一方面提供在核酸扩增或测序方法中如上所述制备的衍生的或功能化的支持物的用途。这些核酸扩增或测序方法包括了本发明的方法。
本发明的另一方面内容是提供实施本发明方法的装置或制造含本发明核酸集落的固相支持物的装置。这些装置可包括，例如本发明的多个核酸模板和集落引物(它们较佳地共价结合于以上所列出的固相支持物)、以及核酸聚合酶、上述多个核苷酸前体(其中一部分是有标记的)、和控制温度的装置。另外，这些装置可能还包括，例如含一种或多种本发明核酸集落的支持物。较佳地，这些装置还包括检测装置，用于检测和区分按本发明方法在固相支持物上排布的单个核酸集落的信号。例如，这种检测装置可包括操作性连接于放大装置(如上述的显微镜)的电荷耦合仪。
较佳地，本发明的装置是以自动化形式提供的。
本申请提供了对当前和新兴需求的解决方案：即科学家和生物技术产业在基因组学、药物基因组学(pharmacogenomics)、药物开发、食品特性分析和基因分型领域中正在致力解决的需求。所以本发明的方法，在例如：核酸测序和重测序、诊断和筛选、基因表达的监测、遗传多样性分布图、全基因组多态性的发现和评分，基因组玻片的制造(在显微镜载玻片上某患者的全基因组)和全基因组的测序中具有潜在用途。
所以可用本发明进行核酸的测序和重测序，如将选定数量的基因特异性扩增成集落，用于全DNA测序。基因重测序使得能对所研究基因的所有已知的或新的遗传多态性进行鉴定。也可用于活生物的医学诊断和基因鉴定。
在将本发明运用于诊断和筛选时，可将全基因组或基因组组分扩增成集落，用于已知单个核苷酸多态性(SNP)的DNA测序。SNP鉴定已用于医学遗传研究，来鉴定与疾病相关的遗传危险因素。SNP基因分型也可诊断性运用于药物基因组学中，来鉴定和用特异性药物治疗患者。
对于本发明在遗传多样性分布研究中的运用，可通过将样品DNA扩增成集落，然后对各独立遗传实体的特异性“标记”作DNA测序，来鉴定生物或细胞或组织群体。在这种方法中，样品的遗传多样性可通过各独立实体标记的计数来确定。
对于本发明在基因表达监测中的运用，将研究的组织或生物表达的mRNA转化成cDNA分子，再扩增成集落用于DNA测序。编码某给定mRNA的集落的频率与初始组织中存在的mRNA分子的频率成正比。基因表达监测运用在生物医学研究中。
可用本发明的方法制备全基因组的玻片，其上存在的活生物的全基因组的DNA集落数量足以包括该基因组的所有序列。这种基因组玻片是活生物的遗传身份卡。这种遗传身份卡可用于医学研究和具有产业价值的活生物的遗传鉴定。
本发明也可用于进行全基因组的测序，其中将活生物的全基因组扩增为许多集落用于大规模的DNA测序。全基因组测序使得可以，例如1)对活生物的遗传品系进行精确的鉴定；2)发现基因组中编码的新基因和3)发现新的遗传多态性。
本发明的运用并不限于分析单个生物/患者的核酸样品。例如，可将核酸标记掺入核酸模板中并扩增，可将不同的核酸标记用于各生物/患者。所以，当测定扩增的核酸序列时，也可测定标记的序列和所鉴定样品的起源。
所以，本发明的另一方面内容是提供本发明方法的用途，或本发明核酸集落，或本发明多个核酸模板，或本发明固相支持物的用途，用于提供测序和重测序、基因表达监测、遗传多样性分布图、诊断、筛选、全基因组测序、全基因组多态性的发现和评分、和制备全基因组玻片(即在一支持物上某个体的全基因组)的核酸分子，或其它包括核酸扩增或其测序的用途。
本发明的另一方面是提供一种试剂盒，用于测序、重测序、基因表达监测、遗传多样性分布图、诊断、筛选、全基因组测序、全基因组多态性的发现和评分、或其它包括核酸扩增和测序的用途。这种试剂盒包含有结合于固相支持物(以上列出的)的本发明的多个核酸模板和集落引物。
本发明将在以下非限制性实施例和附图中作更详尽的描述：
图1：显示了本发明实例产生核酸集落的方法示意图。
图2：是模板制备和随后附着于固相表面的示意图。图2a显示了模板A、B和B′(含有集落引物序列)的制备。用PCR引物TP1和TP2从基因组DNA中产生3.2Kb的模板。分别用PCR引物TPA1/TPA2或TPB1/TPB2产生模板A(854bp)和B(927bp)。用磷酸或硫醇基团在TPA1和TPB1寡核苷酸的5′端进行修饰，用于随后的化学附着(★)。注意：得到的模板含有相应于集落引物CP1和/或CP2的序列。该基因的11个外显子以“E1到E11”表示。图2b显示了集落引物和模板与玻璃表面的化学附着。例举了ATS(氨基丙基三乙氧基硅烷)的衍生。
图3：由集落引物生成的DNA集落。它显示了每个20X视野观察到的集落数是结合于孔的模板浓度的函数。可测得的模板最低浓度为10-13M。
图4：两种不同模板产生的集落之间的区别。图4a显示了由两种模板阴性对照产生的集落的图像。图4b显示了在同一孔的相同位置用两种不同颜色显影的两种模板形成的集落和阴性对照。图4c显示了显微镜视野的分段中两种集落类型的配位。图4c证明了不同模板生成的集落互不一致。
图5：附着在玻璃上的模板或寡核苷酸的反应图解。步骤A是表面的衍生：用酸溶液处理载玻片，以提高表面上游离的羟基。将预处理的载玻片浸入氨基硅烷溶液中。ATS(氨基丙基三乙氧基硅烷)：B1或B2是用交联剂功能化的玻璃表面，然后附着寡核苷酸。通过酰胺键，氨基与交联剂相互作用：步骤B1；s-MBS(硫代间-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯)。步骤B2:s-SIAB(硫代N-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰]氨基苯甲酸)通过在马来酰亚胺的硫醇和双键之间形成的共价键，寡核苷酸(5′端硫醇修饰的寡核苷酸)附着于表面。磷酸盐缓冲液：(PBS,0.1M NaH2PO4,pH:6.5,0.15M NaCl)。B3：用EDC和咪唑附着寡核苷酸。存在EDC时，将修饰的寡核苷酸的5’端磷酸与咪唑反应，产生5′-磷-咪唑衍生物(未显示)。氨基磷酸酯的衍生物与衍生的玻璃表面氨基结合。EDC:1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐。
图6：显示作为结合于孔的模板浓度的函数，观察到的每个20X视野集落的数量。通过偶联剂(EDC)中介DNA模板以不同浓度结合于氨基衍生的玻璃表面(A)s-MBS功能化的玻璃表面(B)。用限制性内切酶处理双链DNA集落，将回收的单链与互补的寡核苷酸(cy5荧光标记)杂交。
图7：显示了在玻璃上产生的DNA集落原位测序的实例。图7A显示了在未与引物p181培育的样品上用Cy5TM-dCTP培育后的结果。只能观察到5个模糊的点，表明没有发生明显的干扰作用(如Cy5TM-dCTP凝集沉淀，吸附或简单的非特异性掺入集落中的DNA或表面上的DNA)。图7B显示了在与引物p181培育的样品上用Cy5TM-dUTP培育后的结果。没有观察到荧光斑点，表明当用于掺入的核苷酸与杂交的引物产生的模板序列不相应时，不产生可检测量的荧光碱基的掺入。图7C显示了在与引物p181培育的样品上用Cy5TM-dCTP培育后的结果。可以观察到许多荧光斑点，表明当用于掺入的核苷酸与杂交的引物产生的模板序列相对应时，确实可产生可检测量的荧光碱基的掺入。
图8：显示了PCR循环之前和之后，附着于Nucleolink的寡核苷酸与探针的杂交。此图显示了R58与CP2(5′-(磷酸)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)的杂交，空心环，与CP8(5′-(氨基-1,6亚己基)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)的杂交，实心三角形，与CP9(5′(羟基)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)的杂交，菱形，与CP10(5′(二甲氧基三苯甲基)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)的杂交，实心环，及与CP11(5′(生物素)-TTTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)的杂交，空心三角形。
实施例
实施例1：制备适用于产生DNA集落的DNA模板
已从DNA模板和集落引物产生了DNA集落。本文所用的术语“集落引物序列”指相应于集落引物序列的序列，有时也称为“寡核苷酸序列Y”或“寡核苷酸序列Z′”。
根据选择的寡核苷酸引物来选择集落引物的性能，选择的寡核苷酸引物应在存在耐热DNA聚合酶时表现出极小的非特异性核苷酸掺入。选出集落引物CPα(5′-pCACCAACCCAAACCAACCCAAACC)和CPβ(5′-pAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)，因为存在稳定的DNA聚合酶(AmpliTaq,PerkinElmer,Foster City,CA)时，在标准缓冲液中和热循环条件下(94℃30秒，65℃1分钟，72℃2分钟，50轮)它们的放射标记的α32p-dCTP掺入低。
将3.2Kb DNA片段作为模型系统来证明用集落引物和DNA模板产生集落的可行性。选择的模板含有前述糖基化终产物受体的人基因(HUMOXRAGE,GenBank Acc.No.D28769)。表1中列出了RAGE-特异性引物。用PCR扩增在标准缓冲液和热循环条件(94℃30秒，65℃1分钟，72℃5分钟，40轮)下，从0.1μg人基因组DNA和1μM引物TP1和TP2，以及1单位DNA聚合酶(AmpliTaq,Perkin Elmer,Foster City,CA)，产生了3.2Kb模板。将此3.2Kb的DNA片段用作模板进行第二次PCR，产生两个较短的模板用于产生集落(模板A和B)。用于产生较短模板的引物含有对模板和集落引物CP1和CP2的序列特异性的序列，来扩增固相表面上的DNA。通常，用磷酸或硫醇基因在5′端修饰用于产生DNA模板的PCR引物。所以，PCR扩增后，产生的DNA片段在连接于感兴趣RAGE DNA片段的一个末端或两个末端上含有集落引物序列(见图2a)。
在标准缓冲液和热循环条件(94℃30秒，65℃1分钟，72℃1分钟，30轮)下，用0.1ng 3.2Kb模板和1μM引物TPA1和TPA2，以及1单位DNA聚合酶(AmpliTaq,Perkin Elmer,Foster City,CA)，产生模板A(在两个末端含集落引物序列、CPβ的双链模板)。然后将产物在Qiagen Qia-快速柱(QiagenGmbH,Hilden,Germany)上纯化。
在标准缓冲液和热循环条件(94℃30秒，65℃1分钟，72℃1分钟，30轮)下，用0.1ng 3.2Kb模板和1μM引物TPB1和TPB2，以及1单位DNA聚合酶(AmpliTaq,Perkin Elmer,Foster City,CA)，产生模板B(含相应于CPβ的集落引物序列的双链模板)。然后将产物在Qiagen Qia-快速柱(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)上纯化。
在标准缓冲液和热循环条件(94℃30秒，65℃1分钟，72℃1分钟，30轮)下，用0.1ng 3.2Kb模板和1μM引物TPB3和TPB4，以及1单位DNA聚合酶(AmpliTaq,Perkin Elmer,Foster City,CA)，产生模板B′(在两个末端之一含相应于CPα和CPβ的集落引物序列的双链模板)。然后将产物在Qiagen Qia-快速柱(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)上纯化。
表1中列出了所有用于DNA模板制备和生成DNA集落的特异性寡核苷酸以及化学修饰。
图2b中列出了将集落引物和模板化学附着于玻璃表面的常规流程，其中显示了用ATS来衍生作为非限制性实例。
                          表1
用于制备模板和产生集落的寡核苷酸目录
名称     DNA序列  座标(方向) 寡核苷酸的修饰 用途
 TP1 GAGGCCAGAACAGTTCAAGG 9810(R) 模板3.2Kb
 TP2 CCTGTGACAAGACGACTGAA 6550(F) 模板3.2Kb
 CP1 TTTTTTTTTTCACCAACCCAAACCAACCCAAACC 无     5′P 生成集落
 CP2 TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG 无     5′P 生成集落
 CP3 TTTTTTTTTTCACCAACCCAAACCAACCCAAACC 无     5′SH 生成集落
 CP4 TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG 无     5′SH 生成集落
 CP5 AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTTNN 无     5′P 生成集落
 CP6 AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGG  无 5′P 生成集落
 CP7 TTTTTTTTTTCACCAACCCAAACCAACCCAAACC  无 5′(NH2) 生成集落
 CP8 TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG  无 5′(NH2) 生成集落
 CP9 TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG  无 5′(OH) 对照寡核苷酸
 CP10 TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG  无 5′(DMT) 对照寡核苷酸
 CP11 TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG  无 5′(生物素) 对照寡核苷酸
 TPA1 AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGCCTGTGACAAGACGACTGAA  6550(F) 5′P 模板A
 TPA2 TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGCGGCCGCTGAGGCCAGTGGAAGTCAGA  7403(R) 5′P 模板A
 TPB3 TTTTTTTTTTCACCAACCCAAACCAACCCAAACGAGCTCAGGCTGAGGCAGGAGAATTG  9049(F) 无 模板B
 TPB1 AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGGAGCTGAGGAGGAAGAGAGG  9265(F) 无 模板B
 TPB2 AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGCGGCCGCTCGCCTGGTTCTGGAAGACA  8411(R) 无 模板B
 TPB4 AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGCGGCCGCTCGCCTGGTTCTGGAAGACA  9265(R) 无 模板B′
HUMOXRAGE基因登录号D28769的座标(R)表示“反向”(F)表示“正向”。
实施例1a：制备侧接简并引物的随机DNA模板
将3.2Kb DNA片段作为模型系统来证明从随机引物PCR扩增生成集落的可行性。这种策略也可用于长度约为100Kb的DNA片段的测序(将片段与全基因组结合)。用PCR约为从人基因组DNA生成3.2Kb的DNA片段PCR引物为；TP1 5′-pGAGGCCAGAACAGTTCAAGG和TP2 5′-pCCTGTGACAAGACGACTGAA(如实施例1所述)。用组合的限制性内切酶将3.2Kb的片段切割成较小的片段(EcoR1和HhaⅠ产生约800bp的4个片段)。然后将切开的或未切开的片段DNA与简并引物，p252(5′-P TTTTTTTTTTISISISISISIS，其中I代表肌苷(与A、T和C配对)，S代表G或C)混合，并共价偶联于Nucleolink孔(Nunc,Denmark)。然后将管作随机固相PCR扩增，与标记的DNA探针杂交来观察(如实施例2a所述)。
实施例2：将DNA模板和集落引物共价结合于固相支持物(塑料)上并与集落引物形成集落
将模板和集落引物共价结合于固相支持物(塑料)上
在存在不同剂量的模板A(如实施例1所述制备)时，将5′末端磷酸化的集落引物(CP2,5′-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)(Microsynth GmBH,Switzerland)附着于Nucleolink塑料微量滴定孔(Nunc,Denmark)中。用CP2设置了8个孔，一式两份，7种模板的1/10稀释度，以最高浓度1nM起始。
如下制备共价结合了CP2集落引物和模板的微量滴定孔。在每个Nucleolink孔中加入30μl以10mM1-甲基-咪唑(pH7.0)(Sigma Chemical)配制的1μM集落引物溶液和从1nM开始稀释的不同浓度的模板。在每个孔中，将10μl用10mM1-甲基-咪唑配制的40mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(pH7.0)(Sigma Chemicals)加入到集落引物和模板的溶液中。然后将孔密封，50℃培育过夜。培育后，用200μl RS(0.4N NaOH,0.25％Tween20)漂洗诸孔两次，与200μl RS培育15分钟，用200μl RS漂洗两次，用200μlTNT(100mM TrisHCl pH7.5,150mM NaCl,0.1％Tween 20)漂洗两次。50℃干燥管，4℃储存在密封的塑料袋中。
生成集落
在每个孔中加入20μl PCR混合物；四种dNTP(0.2mM)、0.1％BSA(牛血清白蛋白)、0.1％Tween 20、8％DMSO(二甲基亚砜，Fluka,Switzerland)、1X PCR缓冲液和0.025单位/μl AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer,Foster City,CA)，来引发集落生长。然后将诸孔置于热循环仪中，94℃培育密封的孔5分钟，并进行50次下述条件的循环：94℃30秒，65℃2分钟，72℃2分钟，使其生长。完成这一过程后，将诸孔保持在8℃直至下一步使用。杂交前，将50μl TE(10mM Tris,1mM EDTA,pH7.4)加入各孔，94℃加热5分钟，冰上冷却，然后在45℃加入探针。
集落的观察
探针：探针是1405个碱基对的DNA片段，含有3′端的模板序列(核苷酸位置8405到9259)。DNA探针是用PCR扩增合成的，两个引物为：p47(5′-GGCTAGGAGCTGAGGAGGAA)，从碱基8405开始扩增，和TP2(在5’端生物素酰化)，从反义链的碱基9876开始扩增。
杂交和检测：以“easyhyb”(Boehringer-Mannheim,Germany)将探针稀释到1nM，并在每个孔中加入20μl。将探针和集落94℃变性5分钟，然后50℃培养6小时。50℃以含0.1％Tween的2x SSC洗去过量的探针。室温，将DNA探针结合于TNF中的直径0.04μ(Molcular Probes)的包被亲和素的绿荧光球1小时。用TNT洗涤过量的小珠。用显微镜观察集落，如实施例2a所述作影像分析。图3显示了作为结合于孔的模板浓度的函数所观察到的每20X视野的集落数。可测得模板的最低浓度为10-13M。
实施例2a:DNA模板和集落引物共价附着于固相支持物(塑料)并与简并引物形成集落
模板和集落引物共价附着于固相支持物(塑料)
如下用p252和模板DNA片段制备微量滴定孔：在每个Nucleolink孔中加入30μl以10mM 1-甲基-咪唑(pH7.0)(Sigma Chemical)配制的1μM集落引物p252溶液和从0.5nM开始稀释的不同浓度的模板。在每个孔中，将用10mM1-甲基-咪唑配制的10μl,40mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(pH7.0)(Sigma Chemicals)加入到集落引物和模板的溶液中。然后将诸孔密封，50℃培育过夜。培育后，用200μl RS(0.4N NaOH,0.25％Tween 20)漂洗诸孔两次，与200μl RS培育15分钟，用200μl RS漂洗两次，用200μlTNT(100mM TrisHCl pH7.5,150mM NaCl,0.1％Tween 20)漂洗两次。50℃干燥管，4℃储存在密封的塑料袋中。
生成集落
DNA集落生成是用改进的方案进行的以便随机引导，在每个孔中加入20μlPCR混合物；四种dNTP(各0.2mM)、0.1％BSA、0.1％Tween 20、8％DMSO(二甲亚砜，Fluka,Switzerland)、1X PCR缓冲液和0.025单位/μl AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer,Foster City,CA)。然后将诸孔置于热循环仪中，通过94℃培育密封的孔5分钟，并进行50次下述条件的循环：94℃30秒，65℃2分钟，72℃2分钟，进行扩增。完成这一过程后，将诸孔保持在8℃直至进一步使用。杂交前，将50μl TE(10mM Tris,1mM EDTA,pH7.4)加入各孔，94℃加热5分钟，冰上冷却，然后在45℃加入探针。
集落的观察
探针：两个546个碱基对和1405个碱基对的DNA片段，含有待PCR扩增的初始模板的两末端之一的序列。通过用5′-生物素酰化PCR引物，用生物素标记该探针的反义链。探针的碱基对座标是6550到7113和6734到9805。
杂交和检测：以“easyhyb”(Boehringer-Mannheim,Germany)将探针稀释到1nM，并在每个孔中加入20μl。94℃使探针和集落变性5分钟，然后50℃培育6小时。50℃以含0.1％Tween的2x SSC洗去过量的探针。室温，将DNA探针结合于TNF中的直径0.04μm(Molcular Probes,Portland OR)的包被亲和素的绿荧光球1小时。用TNT洗涤过量的小珠。用连接于768(H)×512(V)像素-CCD照相机(Princeton Instruments Inc.Trenton,NJ,USA)的倒置显微镜(用Axiovert S100TV上的20x/0.400LD Achroplan物镜，和电弧汞灯HBO100W/2,Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)检测荧光。对FITC和Cy5分别通过Omega Optical的滤色装置XF22(Ex:485DF22,Dichroic:505DRLPO2 Em:530DF30)和XF47(Ex:640DF20,Dichroie:670DRLPO2 Em:682DF22)曝光20秒。用Winwiew软件(Princeton Instruments Inc.,Trenton NJ,USA)分析数据。用内部开发的图像分析软件计算一式二孔中每视野的集落数。
实施例3：对由各种比例的2种不同共价结合的模板和集落引物产生的不同集落的序列区别
将模板和集落引物共价结合于固相支持物(塑料)上
在存在不同剂量的两模板A和B(如实施例1所述制备)时，将5′末端磷酸化的集落引物(CP2:5′-pTTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)(Microsynth GmBH,Switzerland)移植到Nueleolink塑料微量滴定孔(Nunc,Denmark)中。设置8个孔为一系列一式二孔两种模板，各7种1/10稀释度，以最高浓度1nM起始。模板稀释是以相反的方向设置的，一种模板的最高浓度与另一种模板的最低浓度恰好重合。
如下制备CP2引物和两种模板共价结合的微量滴定孔。在每个Nucleolink孔中加入301μl以10mM 1-甲基-咪唑(pH7.0)(Sigma Chemical)配制的1μM集落引物溶液和从1nM开始稀释的不同浓度的两种模板。在每个孔中，将10μl用10mM 1-甲基-咪唑(pH7.0)配制的40mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(pH7.0)(Sigma Chemicals)加入到集落引物和模板的溶液中。然后将孔密封，50℃培育4小时。培育后，用50μl RS(0.4N NaOH,0.25％Tween20)漂洗诸孔3次，与50μl RS培育15分钟，用50μl RS漂洗3次，用50μl TNT(100mM TrisHCl pH7.5,150mM NaCl,0.1％Tween 20)漂洗3次。将管4℃保藏在TNT中。
生成集落
在每个孔中加入20μl PCR混合物；四种dNTP(0.2mM)、0.1％BSA、0.1％Tween 20、8％DMSO(二甲基亚砜，Fluka,Switzerland)、1X PCR缓冲液和0.025单位/μl AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer,Foster City,CA)，来引发集落生长。
然后将诸孔置于热循环仪中，94℃培育密封的孔5分钟，并进行50次以下条件的循环：94℃30秒，65℃5分钟，72℃5分钟，使其生长。完成这一过程后，将诸孔保持在8℃直至下一步使用。杂交前，将50μl TE(10mMTris,1mM EDTA,pH7.4)加入各孔，94℃加热5分钟，冰上冷却，然后在45℃加入探针。
集落的观察
探针：相应于3.2Kb DNA片段的5′-和3′-端序列的两个546个碱基对和1405个碱基对的DNA片段，用一种生物素酰化的引物(见实施例2)进行PCR扩增。94℃加热5分钟使这两种探针变性，然后在1M NaCl、10mM Tris(pH7.4)中迅速冷却，并让它们结合于包被链霉亲和素的标记有不同颜色的直径0.04μm的荧光球上。将结合于小珠的探针以预热到50℃的″easyhyb″溶液稀释20倍。在每个含变性集落的孔中加入20μl探针。
杂交和检测：50℃进行杂交5小时。50℃以含0.1％SDS的2x SSC洗涤过量的探针。用20X物镜的显微镜观察集落，20秒曝光，如实施例2a所述作成像分析。图4a显示了由两种模板和阴性对照产生的集落的图像。图4b显示了用两种不同颜色和负对照观察到的同一孔中相同位置由两种模板产生的集落。图4c显示了显微镜视野的分段中两种集落类型的座标。图4c显示了不同模板生成的集落不恰好重合。
实施例4:DNA模板和寡核苷酸共价结合于玻璃固相表面
用异-双功能交联剂，以氨基硅烷衍生的载玻片为固相支持物，来共价结合硫醇修饰的寡核苷酸探针。选择的试剂具有硫醇反应活性(马来酰亚胺)和氨基反应活性基团(琥珀酰亚胺酯)。寡核苷酸附着率和固定分子的稳定性主要取决于交联剂对所进行的不同处理条件的稳定性。图5显示了DNA模板或寡核苷酸附着于玻璃的反应流程。
已评估了由交联剂s-MBS和s-SIAB制备的载玻片的储存稳定性和其热稳定性。影响固定的寡核苷酸探针杂交程度的重要因素是附着的探针的密度(Beattie等人，1995；Joss等人，1997)。我们研究了改变固定期间寡核苷酸浓度和分析经杂交而附着的寡核苷酸密度的这种影响。
材料和方法
将酸预处理的显微镜载玻片-Microscope glass slides(Knittel,MerckABS)浸泡在碱性Helmanex溶液(HelmanexⅡ0.25％,1N NaOH)中1小时。用水漂洗载玻片，在1N HCl中浸泡过夜，再用水漂洗，在硫酸溶液(H2SO4/H2O,1/1,v/v，加入少量新鲜高硫酸铵)中处理1小时。在水、乙醇中漂洗载玻片，最后用纯丙酮漂洗。干燥载玻片，真空下储存至进一步使用。
硅烷化表面-将预处理过的载玻片浸入用丙酮配制的5％ATS(氨基丙基三乙氧基硅烷，Aldrich)中。室温进行硅烷化2小时。在丙酮中洗涤3次后，用乙醇漂洗载玻片1次，干燥，真空储存。
交联剂附着-将交联剂s-MBS和s-SIAB(分别为硫代间-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、硫代N-琥珀酰亚胺[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸，Pierce,Rockford IL)，制备成以PBS(磷酸盐缓冲液，0.1M NaH2PO4,pH7.2,0.15M NaCl)配的20mM溶液。将80μL交联剂溶液加到硅烷化载玻片上，覆盖洁净的微型盖玻片，20℃反应5小时。以PBS淋洗载玻片，以水简单漂洗一下，然后以乙醇淋洗。随后干燥载玻片，暗处真空储存至下一步使用。
寡核苷酸附着-利用标准亚磷酰胺的化学性能，合成含有5′硫醇修饰(CP3和CP4 Eurogentec,Brussels)或磷酸基团修饰(CP1和CP2,Eurogentec,Brussels)的寡核苷酸。
制备-5′-硫醇寡核苷酸引物(CP3和CP4)成为以磷酸盐缓冲液(NaPi:0.1M NaH2PO4 pH:6.6,0.15M NaCl)配的100μM溶液，并以1μl滴加到功能化的载玻片(用交联剂功能化)上，室温5小时。将载玻片置于饱和湿润的气氛中，以避免蒸发。摇床上在NaPi缓冲液中洗涤载玻片。在热稳定性研究中，将载玻片浸入Tris缓冲液(10mM,pH8)中100℃5分钟，2次，4℃直接浸入5xSSC(0.75M NaCl,0.075M柠檬酸钠pH7)5分钟。将载玻片储存在4℃ 5XSSC中以备后用。
室温以含40mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺(EDC,Pierce,Rockfore IL)的10mM 1-甲基-咪唑(pH7.0)(Sigma Chemicals)的1μM溶液，将-5′-磷酸寡核苷酸引物(CP1和CP2)加到(1μl滴加)氨基衍生的玻璃上5小时。100℃在Tris缓冲液(10mM,pH8)中洗涤载玻片2次，直接浸泡在4℃5XSSC中5分钟。4℃将载玻片储存在5XSSC中以备后用。
寡核苷酸和DNA模板附着
在磷酸盐缓冲液(NaPi:0.1M NaH2PO4 pH:6.6,0.15m NaCl)中将5′-硫醇寡核苷酸引物(CP3和CP4)和5′-硫醇模板B′混合。DNA模板的浓度从0.001到1μM不同，引物浓度从0.1到100μM不同，但模板和引物分别以1μM和100μM为最佳浓度。然后如上所述进行使CP3和CP4在功能化玻璃表面附着的步骤。
在含40mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺(EDC,Pierce,Rockford IL)的10mM 1-甲基-咪唑(pH7.0)(Sigma Chemicals)溶液中，将5’-磷酸寡核苷酸引物(CP1和CP2)和5’-磷酸模板B混合。DNA模板的浓度从0.001到10nM不同，引物浓度从0.1到1μM不同，但模板和引物分别以10nM和1uM为最佳浓度。然后如上所述进行使CP1和CP2在氨基衍生的玻璃表面附着的步骤。
在荧光探针-寡核苷酸探针杂交中，由Eurogentec(Brussels)合成了5’端荧光标记有Cy5或FITC的探针。为了防止非特异性杂交，在封闭溶液(5xSSC,Tween 0.1％,BSA 0.1％)中培育载玻片1小时，置于5xSSC中在摇床上洗涤(2次，5分钟)。在5xSSC,Tween 0.1％中将寡核苷酸探针稀释到0.5μM，室温加样到玻璃表面2小时。37℃在摇床上漂洗载玻片，一次用5xSSC洗5分钟，两次用含1％SDS的2xSSC洗5分钟。
用放射标记的探针-放射标记的寡核苷酸(互补于共价连接的寡核苷酸)的杂交作为杂交探针，来定量测定杂交率。用噬菌体T4多聚核苷酸激酶(NewEngland Biolabs,Beverly,MA)，在寡核苷酸的5’端用[γ-32P]dATP(Amersham,UK)进行酶促标记。用Chroma Spin柱TE-10(Clontech,Palo Alto CA)除去过量的[γ-32P]dATP。然后室温将放射标记的寡核苷酸(0.5μM以5xSSC,Tween0.1％配)加样到衍生的载玻片上2小时。然后将载玻片置于摇床上，37℃以5xSSC漂洗5分钟，以2xSSC SDS 0.1％漂洗2次，5分钟。杂交后，用闪烁计数测定特异性活性。
显微镜观察-用5xSSC溶液和微型盖玻片覆盖载玻片。用氩汞灯HBO100W/2(Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)倒置显微镜Axiovert S100TV，其连接了装备有CCD陈列的Kodak CCD照相机，模式为768(H)×512(V)像素；6.91×4.6mm总尺寸，像素尺寸9×9μm2(Princeton Instruments Inc.Treton,NJ,USA)，来测定荧光。用物镜LD Achroplan 20x/0.400(Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)和滤光装置XF22(Ex:485DF22，二向色：505DRLPO2 EM:530DF30)和XF47(Ex:640DF20，二向色：670DRLPO2 EM:682DF22)(Omega Optical(Brattleboro VT)，分别用于FITC和Cy5荧光)，曝光时间在1和50秒之间。用Winwiew软件(Princeton Instruments Inc.,Trenton NJ,USA)来分析数据。
结果
评估附着储存稳定性和热稳定性
我们评估了用s-MBS和s-SIAB制备的玻璃板的储存稳定性。由于这些试剂对水解敏感，寡核苷酸附着率将取决于它们的稳定性。用新鲜制备的交联剂s-MBS和s-SIAB功能化氨基衍生的玻璃板。交联剂附着后，将功能化的载玻片储存于室温、暗处真空干燥器中10天。然后分析储存的载玻片(t=10天)和用交联剂新鲜制备的载玻片(t=0)。比较二化学试剂在硫醇-寡核苷酸反应后和互补荧光探针杂交后，在t=0和t=10天得到的数据。
如t=0和t=10天得到相同杂交率所证明：一旦固定，10天储存后s-SIAB-功能化的载玻片完全稳定。相反，发现偶联s-MBS的玻璃稳定性较差，10天储存后寡核苷酸附着率和杂交率减少30％。结论是s-SIAB功能化的载玻片在暗处真空干燥储存至少10天，如同其先前制备的那样，探针附着率无任何降低。
为了评估附着于玻璃的寡核苷酸的热稳定性，将载玻片在10mM Tris-HCl(pH8)中100℃处理5分钟，2次。洗涤后将残留的仍固定的寡核苷酸与荧光标记的互补寡核苷酸杂交进行分析。在第一次5分钟洗涤后，从s-SIAB载玻片释放出约14％附着的分子，从s-MBS载玻片释放出约17％附着的分子，但第二次洗涤后就这两种化学物而言，都未测得进一步的释放(表1A)。这些结果可与Chrisey等人(1996)得到的结果相比，他们测得80℃在PBS中处理10分钟后，通过交联剂SMPB(琥珀酰亚胺4-[对-马来酰亚胺苯基]丁酸酯)附着于熔凝硅石载玻片上的寡核苷酸有62％以上的释放。
表1A
 杂交结果(任意单位，标准化到100％)
 新鲜附着的  100℃洗涤5分钟后  100℃洗涤2×5分钟后
 s-MBS  80±6  69±4  73±4
 s-SIAB  100±9  84±8  87±3
表1A：热稳定性研究
寡核苷酸附着于s-MBS或s-SIAB功能化的载玻片。通过与荧光标记的互补寡核苷酸杂交来分析附着的寡核苷酸。将得到的最高荧光信号标准化成100。列出了重复3次分析的平均值。
作为探针附着函数的杂交
我们研究了作为附着的寡核苷酸(用s-MBS、s-SIAB交联剂和EDC-介导的反应)表面覆盖的函数，共价结合的寡核苷酸探针的杂交程度。用于固定的寡核苷酸的浓度为1μM(对EDC)，对交联剂则可在1到800μM之间变化，通过与32P-标记探针的杂交来分析表面密度。用异双功能交联剂引物附着的最佳浓度为500μM，这与60fmol/mm2(s-MBS)和270fmol/mm2(s-SIAB)杂交分子附着的表面密度相等。用EDC/咪唑-介导的5’磷酸寡核苷酸附着于氨基硅烷化的玻璃获得了与s-MBS类似的覆盖密度。但得到相同附着率仅需要1μM寡核苷酸溶液，这就表示与EDC/咪唑偶联策略相比，对于s-MBS化学试剂附着的寡核苷酸需要过量500倍(表1B)。
表1B
    寡核苷酸杂交(fmol/mm2)
 用于附着的寡核苷酸的浓度(μM)  s-MBS  s-SIAB
 EDC
 1  NT  NT  50
 100  10  100  NT
 500  60  270  NT
表1B：作为探针附着函数的杂交
使寡核苷酸附着于用s-MBS或s-SIAB或通过介导的活性试剂EDC功能化的载玻片。通过与放射标记的互补寡核苷酸杂交来分析附着的寡核苷酸。通过闪液来测定杂交的分子的特异活性和密度。NT：没有测试。
60fmol/cm2表面密度相应于8nm结合寡核苷酸之间的平均分子间距。按我们的结果，30foml/mm2覆盖密度(间隔20nm)足以得到DNA集落。这种产率可用EDC介导的方法，用异双功能交联剂s-SIAB或1μM探针100μM固定引物获得。我们得到的杂交密度在先前报道的其他移植方法在载玻片使得到的最高密度范围中(Guo等人，1994,Joss等人，1997,Beattie等人，1995)。
在玻璃上生成DNA集落：集落的形成取决于模板的长度、浓度和引物的浓度
理论上，DNA集落的形成要求相应于DNA模板适当长度的附着于表面的引物的适当密度。对于最佳DNA集落生成而言，重要的是确定结合的引物和模板的密度范围，以及模板和引物的化学计量比。
材料和方法
制备载玻片
如上所述(材料和方法)，衍生和功能化载玻片。DNA集落引物为CP1和CP2。如实施例1对模板B′所述，制备了集落模板，但用引物TPB3和TPB2。将不同浓度的修饰的集落引物和集落模板加样到玻璃表面。
产生集落
将储存在5XSSC中的载玻片以微过滤水洗涤除去盐。在玻璃表面用PCR混合物(四种dNTP(0.2mM),0.1％BSA,0.1％Tween 20,1XPCR缓冲液和0.05U/μl AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer Foster City,CA))引发集落的生长。将PCR混合物置于一框架密封室中(MJ Research,Watertown,MA)。将载玻片置于热循环仪(The DNA Engine,MJ Research Watertown,MA)中，如下进行热循环：步骤1在94℃1分钟，步骤2在65℃3分钟，步骤3在74℃6分钟，并将此程序重复50次。完成这程序后，将载玻片置于6℃以备后用。
双链DNA集落的消化
通过覆盖以1X消化缓冲液配制的限制性内切酶，用限制性内切酶切割含DNA的玻璃表面。37℃将此反应进行2次为时1小时30分钟。将载玻片浸入100℃ tris缓冲液(10mM,pH8)中2次5分钟，然后4℃在5XSSC中漂洗，使双链DNA集落变性。将载玻片储存在5XSSC中以备后用。
单链DNA集落的杂交
为了防止非特异性杂交，在封闭溶液(5XSSC,0.1％Tween,0.1％BSA)中培育载玻片1小时，然后在5XSSC中漂洗载玻片(2次，5分钟)。以SSC5X,Tween 0.1％将5’端有荧光Cy5标记的寡核苷酸(Eurogntec Brussels)稀释到0.5μM，并加样到玻璃表面至少2小时。37℃在摇床上漂洗载玻片，在SSC5X中漂洗5分钟，在SSC 5X,SDS 0.1％中漂洗2次5分钟。
如上所述观察载玻片。
我们先前观察到杂交程度是寡核苷酸附着密度的函数。对用结合的DNA模板作的类似研究表明，集落的形成也是附着于载玻片模板浓度的函数。根据用于寡核苷酸和模板附着的化学试剂，对双功能交联剂s-MBS(图6B)而言模板的最佳浓度为1μM，对EDC碳二亚胺而言(图6A)，最佳浓度为1nM。令人感兴趣的是，对EDC化学试剂而言，较高浓度的模板不增加集落的数量，且似乎达到相应于最大集落数的平台。
我们研究了作为加样到表面的引物浓度和DNA模板浓度以及DNA模板长度函数的集落形成(数)。
我们也评估了各集落中模板的拷贝数。定量测定是基于用Cy5-,Cy3-作的荧光测定或添加了抗漂白剂(Prolong,Molecular Probes,Portland OR)的荧光标记的荧光团测定。通过在附着于表面的引物上作杂交试验进行标定，作为通过放射性测定的确切相应的密度。
实施例5：集落原位DNA测序
首先室温将载玻片(5mm直径，Verrerie de Carouge,Switzerland)置于Helmanex 0.2％(在水中)、NaOH 1N浴中1小时，然后用蒸馏水漂洗，在纯己烷中漂洗，用蒸馏水漂洗2次，用HCl 1M处理过夜(室温)。然后，用蒸馏水漂洗它们2次，室温用H2SO4(50％)+K2S2O8处理1小时。将它们在蒸馏水中漂洗，然后在乙醇中漂洗2次。用ATS衍生载玻片(如实施例4所述)。
将5’磷酸化(Microsynth GmbH,Switzerland)的集落引物CP1(5’-pTTTTTTTTTTCACCAACCCAAACCAACCCAAACC)和CP2(5’-pTTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)和DNA模板B(如实施例1所述制备)5’共价附着于5mm直径的载玻片(Verrerie de Carouge,Switzerland)使，使得终浓度分别为1μM和10nM，过程如下：将两种引物各2nmol加入到0.2nmol模板中，该模板以1ml溶液A(用50ml水配制的41μl甲基咪唑(Sigma,#M-8878)，用HCl将pH调节到7)配，然后1∶1与溶液D(用10ml溶液A配制的0.2mM EDC)混合。在载玻片的两边加3.5μl混合物，并室温培育过夜。然后用5xSSC缓冲液简单漂洗载玻片，置于100℃10mM Tris缓冲液(pH8.0)中，2次5分钟。
室温以5xSSC缓冲液配的1mg/ml牛血清白蛋白(BSA,BoehringerMannheim GmbH,Germany,#238040)封闭玻璃非特异性位点1小时，然后用蒸馏水漂洗。
然后将各载玻片单独置于含170μl PCR混合物的MicroampTM反应管(Perkin Elmer)中，用Taq聚合酶(AmpliTaq,PE-Applied Biosystems Inc.,FosterCity CA)生成DNA集落，在MTC200热循环仪(MJ Research,Watertown,MA)中进行50轮(94C/60″,60C/3′,72C/6′)。37℃，用以NEB2缓冲液(NewEngland Biolabs)配制的1.3单位的PvuⅡ(Stratagene)消化各载玻片2次，45分钟。消化后，将管置于100℃10mM Tris缓冲液pH8.0中(2×5′)，然后室温用过滤过的(Millex GV4,Millipore)用2xSSC缓冲液配制的1mg/ml BSA封闭30分钟，在2xSSC 0.1％SDS缓冲液中漂洗，然后在5xSSC缓冲液中漂洗。室温，将各载玻片与含1μM测序引物p181(CGACAGCCGGAAGGAAGAGGGAGC)的5xSSC/0.1％Tween 20缓冲液培育过夜。将无引物的对照置于5xSSC0.1％Tween 20缓冲液中。37℃将载玻片用5xSSC 0.1％SDS洗涤2次，5分钟，然后在5xSSC中漂洗。引物p181可与模板B’杂交，p181后面的序列是CAGCT……为了便于聚焦，通过室温与用5X SSC配制的20μl 1/2000稀释的200nm黄/绿荧光、包被有链霉亲和素的FluoSpheres(R)珠(Molecular Probes,Eugene,OR)培育20秒，将绿色荧光珠吸附到孔的底部。
与引物杂交后，在每个载玻片上加入2μl含0.1％BSA、6mM二硫苏糖醇(Sigma Chemicals)、5μM Cy5TM-dCTP或5μM Cy5TM-dUTP(Amersham,UK)和1X测序酶缓冲液的溶液。Cy5TM-核苷酸的加入是以室温加入1.3单位T7测序酶TMDNA聚合酶(Amersham,UK)2分钟开始的。在5X SSC/0.1％SDS浴中洗涤各孔15分钟，并用5xSSc缓冲液漂洗。
用带Micromax 512×768 CCD照相机和Winview软件(PrincetonInstruments,Trenton,NJ)的倒置显微镜(Axiovert S100TV,Carl Zeiss AG,Oberkochen,Germany)观察样品。对聚焦而言，用20X物镜和XF 22滤光装置(Omega Optical,Brattleboro,VT)，对观察Cy5TM渗入样品而言，用20X物镜和XF47滤光装置(Omega Optical)并用2×2像素重新分级(pixel binning)曝光50秒。用XF47滤光装置和50秒曝光，黄/绿FluoSpheres(R)(约100/视野区域)没有得到可检测的信号(数据没有显示)。用该程序Winview(PrincetonInstruments)得到照像。
图7A显示了在未与引物p181培育的样品上用Cy5TM-dCTP培育后的结果。只能观察到5个模糊的斑点，表明没有发生明显的不合逻辑作用(如Cy5TM-dCTP凝集沉淀，吸收或简单的非特异性掺入集落中的DNA或表面上的DNA)。图7B显示了在与引物p181培育的样品上用Cy5TM-dUTP培育后的结果。没有观察到荧光斑点，表明当用于掺入的核苷酸与杂交的引物后面的模板序列不相应时，不产生可检测量的荧光碱基的掺入。图7C显示了在与引物p181培育的样品上用Cy5TM-dCTP培育后的结果。可以观察到许多荧光斑点，表明当用于掺入的核苷酸与杂交的引物后面的模板序列相应时，确实可产生可检测量的荧光碱基的掺入。总之，我们证实可将序列特异性形式荧光核苷酸渗入集落所含的DNA中，可用上述方法和装置监测这种渗入。但这仅是一个例子。也可以理解如果需要，可将荧光碱基的渗入重复多次。由于这是以序列特异性方式进行的，所以可以推论出集落中所含的DNA部分序列。
实施例6:5’mRNA序列标记分析
监测细胞或组织中基因表达的最精确方法是减少样品收集和mRNA评分之间的步骤数目。可从商业上得到快速分离mRNA的新方法。最有效的方法包括快速分离样品、即刻将细胞破裂到盐酸胍溶液中，完全裂解成蛋白质并使RNAses失活。然后用寡核苷酸-dT亲和层析纯化裂解细胞上清液中的mRNA。最后，可用简单的方法特异性导向5’-加帽的mRNA将其转化入cDNA(SMART cDNA synthesis,Clontech,Palo Alto)。
这种方法可以合成仅有翻译活性的5’-加帽mRNA的cDNA拷贝。通过将上述迅速分离mRNA的方法与本申请所述的产生DNA集落的移植模板法制备的cDNA相结合，就有了高产率鉴定大量5’mRNA序列标记的方法。本发明的优点是通过直接移植cDNA合成反应的产物、将cDNA扩增成千上万的拷贝，然后同时原位测定cDAN的序列，而能够来测定大量cDNA的序列。
材料和方法：
合成的寡核苷酸和质粒-由Eurogentec或Microsynth用5’-磷酸合成了寡核苷酸。用标准方法产生了在T3 RNA聚合酶启动子后含小鼠钾通道基因mSlo的3′-非翻译和部分编码序列的质粒。
mRNA的合成-在此质粒聚A+序列后的单个SalⅠ或SacⅠ限制性内切酶位点将mSlo质粒线化。用蛋白酶K处理切割好的质粒后，用苯酚/CH3Cl/异戊醇提取一次线性质粒DNA，并用乙醇沉淀。将DNA沉淀重溶解在H2O中，浓度为10μg/μl。按制造说明书(Ambion,Austin TX)，在体外用mRNA合成试剂盒中mMessage mMachine合成了5′-甲基鸟苷加帽的合成的mRNA。将合成的mRNA储存于80℃。
酶-从New England Biolabs(Beverly,MA)得到限制性内切酶。
cDNA的合成-以不同摩尔比例(1∶1,1∶10,1∶100)将合成的mRNA与小鼠肝聚A+mRNA混合，并用有某些改进的“SMART PCR cDNA合成试剂盒”(Clontech,Palo Alto CA)在合成的和小鼠肝mRNA的混合物上进行cDNA的合成。在cDNA反应中，将约1μg mRNA混合物与引物CP5混合，该引物具有CPβ的序列的5’端(5′p-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTTNN)。该引物可用于制造第一条链cDNA合成。对第二条链的合成，可用“SMART”技术。SMART合成的基础是：当mRNA含有5’-甲基鸟苷-加帽时，利用Moloney鼠病毒逆转录酶的特性在第一条cDNA链的3’末端添加3到5个脱氧胞嘧啶残基(SMART user manual,Clontech,Palo AltoCA)。用在3’端含有CPβ序列和AAAGGGGG的CP6引物(5′-pAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGG)，来合成第二条cDNA。如说明书所述使用Moloney鼠白血病毒的SUPERSCRIPTTM Ⅱ RNase H-逆转录酶和缓冲液(LifeTechnologies,Ltd.)，并在42℃下进行反应1小时。通过PCR分析cDNA，所用的引物p251含有CPβ序列的片断，(5’-GAGAAGGAAAGGGAAAGG)和Taq DNA聚合酶(Platinum Taq,Life Technologies,Ltd.)。
制备DNA集落-将5’p-cDNA与不同浓度的固相集落引物CP2(5’p-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)混合，并按制造商说明用化学方法结合于Nucleolink PCR管(NUNC)上。然后在MTC 200热-循环仪(MJ Research,Watertown,MA)中用Taq聚合酶(AmpliTaq Gold,PE-Applied Biosystems Inc.,Foster City CA)进行30轮(94C/30″,65C/1′,72C/1.5′)生成DNA集落。
DNA探针和杂交-用5’-生物素酰化的引物和常规的下游引物，通过PCR在模板(mSlo质粒DNA)上合成对mSlo DNA序列特异性的32生物素酰化的和32P-放射标记的DNA探针。在PCR反应中以300∶1(α〔32P〕-dCTP对dCTP)的比例，将探针掺入α〔32P〕-dCTP(Amersham,Amersham UK)，四种三磷酸脱氧核苷的终浓度为50μM。将得到的生物素酰化的和放射标记的DNA探针在Chromaspin-1000柱(Clontech,Palo Alto CA)上脱盐。用以下温度方案(在MTC200热循环仪中)使DNA探针与“easyhyb”缓冲液(Boehringer-Mannheim,Germany)中的样品杂交：94℃5分钟，随后每30秒温度降低0.5℃共68次(换而言之，即在34分钟中将温度降至60℃)，用密封的孔。然后室温用200μl TNT洗涤样品3次。再用含0.1mg/ml BSA(New England Biolabs,Beverly,MA)的50μl TNT培育这些孔30分钟。然后用15μl红色荧光包被有链霉亲和素的40纳米微型小球(Molecular Probes,Portland,OR)的溶液培育这些孔。这种微型小球的溶液是由2μl微型小球的母液制备的，该母液在50W超声波水浴(Elgasonic,Bienne,Switzerland)中超声处理5分钟，以含0.1mg/mlBSA的1ml TNT溶液稀释，用Millex GV40.22μm孔径滤膜(Millipore,Bedford,MA)过滤。
DNA集落的观察-用Axiovert 10倒置显微镜、装备有Micromax 512×768CCD照相机(Princeton instruments,Trenton,NJ)的20X物镜(Carl Zeiss AG,Oberkochen,Germany)、PB546/FT580/LP590滤光装置和10秒光聚焦，来观察着色的样品。将文件转化成TIFF格式，用适合的软件(PhotoPaint,Corel Corp.Ltd,Dublin,Ireland)处理。这种处理包括倒置(inversion)和线性反差增强，以提供在激光打印机上打印出黑白适当的图像。
结果
合成的mRNA和cDNA的合成-cDNA合成后，用p251引物(在cDNA第一条链的两端生成的)来检验PCR中的cDNA，是否为如琼脂糖凝胶电泳分析那样能产生正确长度的产物。将合成的mSlo mRNA稀释入肝mRNA中，这可用mSlo-特异性条带密度的降低和肝cDNA非特异性印迹的增加证明。
DNA集落的检测和定量-用荧光成像CCD显微镜检查或闪烁计数分析DNA集落。如图6所示，可检测到荧光的集落的数量为移植的模板数量的函数而递增。这种增加可用检测到的32P-放射标记量来反映。
有了放射标记的探针就可以约1∶100检测mRNA拷贝。但用荧光显微镜CCD成像技术，可以1∶10000稀释度检测mRNA。
实施例7：引物共价结合于固相支持物(塑料)
将寡核苷酸引物附着于Nucleolink塑料微量滴定孔(Nunc,Denmark)，以确定最佳偶联次数和化学性质。如下将寡核苷酸、CP2(5′-(磷酸)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)、CP8(5′-(氨基-1,6亚己基)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)、CP9(5′(羟基)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)、CP10(5′-(二甲氧基三苯甲基)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)和CP11(5′(生物素)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)(Microsynth GmbH,Switzerland)附着于Nucleolink微量滴定孔(每种8个孔)：在每个孔中加入20μl用10mM 1-甲基-咪唑配制的含0.1μM寡核苷酸、10mM 1-甲基-咪唑(pH7.0)(Sigma Chemicals)和10mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(pH7.0(Sigma Chemicals)溶液。然后将这些孔密封，50℃培育不同的时间。在特定时间用200μl RS(0.4N NaOH,0.25％Tween 20)漂洗2次，用20μl TNT(100mM TrisHCl pH7.5,150mMNaCl,0.1％Tween 20)漂洗2次，终止偶联反应。50℃干燥这些管30分钟，4℃将它们储存在密封的塑料袋中。
在生成PCR集落条件下结合的寡核苷酸的稳定性
通过加入PCR混合物(20μl四种dNTP(0.2mM)、0.1％BSA、0.1％Tween20、8％DMSO(二甲基亚砜，Fluka,Switzerland)、1X PCR缓冲液)，来测试在集落生长条件下的稳定性。然后将这些孔置于热循环仪中，在以下条件进行33轮重复：94℃45秒，60℃4分钟，72℃4分钟。完成此程序后，用5xSSC、0.1％Tween 20漂洗这些孔，将它们置于8℃以备后用。杂交前，将50μl 5xSSC、0.1％Tween 20(在94℃加热5分钟)加入各孔，并在室温保存。
探针：寡核苷酸探针、R57(5′(磷酸)-GTTTGGGTTGGTTTGGGTTGGTG、对照探针)和R58(5′-磷酸)-CCCTTTCCCTTTCCTTCTCCTTCT，互补于CP2、CP8、CP9、CP10和CP11)，用噬菌体T4多聚核苷酸激酶(New Englandbiolabs,Beverly,MA)，在它们的5’端用[γ-32P]dATP(Amersham,UK)进行酶促标记。用Chroma Spin柱TE-10(Clontech,Palo Alto CA)除去过量的32PdATP。然后将放射标记的寡核苷酸(0.5μM以5xSSC,0.1％Tween 20配)与寡核苷酸衍生的Nucleolink孔37℃杂交2小时。室温，用5xSSC、0.1％Tween20洗涤这些孔，再用0.5xSSC、0.1％Tween 20洗涤15分钟(37℃)。随后用闪烁计数分析各孔的结合探针。
结果
取决于寡核苷酸上5′功能基团的特性，寡核苷酸偶联的速率和特异性有明显差异。具有5′-氨基偶联的寡核苷酸比5′磷酸基团功能化的寡核苷酸的速度快约2倍(见表2和图8)。另外，由5’羟基、5′-DMT或5′-生物素功能化的对照寡核苷酸偶联的速度都与5′磷酸功能化的寡核苷酸的速度相似，这就提出了用5′磷酸基团化学附着的5′特异性性质的问题。
表2
5′-磷酸  5′-氨基  5′-羟基  5′-DMT  5′-生物素
Ka(min-1) 0.0068  0.0135  0.0063  0.0070  0.0068
附着的寡核苷酸(fmol/孔) 608  1344  542  602  650
PCR稳定性(％残留的) 56  69  66  66  62
序列表(1)总说明：(ⅰ)申请人：
(A)名称：应用研究系统ARS股份公司
(B)地址：14 John B.Gorsiraweg
(C)城市：库拉索市
(E)国家：荷兰属安的列斯
(F)邮政编码(ZIP)：无(ⅱ)发明名称：核酸扩增和测序方法(ⅲ)序列数量：19(ⅳ)计算机可读形式：
(A)媒体类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0,#1.30版本(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息：(ⅰ)序列特征：
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(A)长度：62个碱基对
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(A)长度：60个碱基对
(B)类型：核酸
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(A)长度：44个碱基对
(B)类型：核酸
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Claims (34)

1．一种扩增至少一种核酸的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)形成至少一种含待扩增核酸的核酸模板，其中所述的核酸在5′端含有寡核苷酸序列Y，在3′端含有寡核苷酸序列Z，另外在5′端该核酸带有将其附着于固相支持物的装置；
(2)在存在固相支持物时，将所述的核酸模板与一种或多种集落引物X混合，集落引物X可与寡核苷酸序列Z杂交，且在其5′端还携带了将集落引物附着于固相支持物的装置，从而使核酸模板和集落引物的5′端结合于固相支持物；
(3)在结合模板上进行一种或多种核酸的扩增反应，从而产生核酸集落。
2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的寡核苷酸序列Z互补于寡核苷酸序列Y，且集落引物X与寡核苷酸序列Y的序列相同。
3．如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中两种不同的集落引物X与所述的模板混合，且集落引物X的序列是使寡核苷酸序列Z能与集落引物X中的一种杂交，寡核苷酸序列Y与一种集落引物X的序列相同。
4．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的集落引物X包含简并引物序列，所述的核酸模板不含有寡核苷酸序列Y或Z。
5．如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括其他步骤，即对产生的一个或多个核酸集落进行至少一个测序步骤。
6．如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的测序步骤(5)包括掺入和测定标记的寡核苷酸。
7．如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，同时测定一种以上核酸集落中存在的扩增核酸模板的全部序列或部分序列。
8．如权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括观察产生的集落步骤。
9．如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的观察步骤包括使用标记的或未标记的核酸探针。
10．如权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述的将核酸模板和集落引物附着于固相支持物的装置包括将这些核酸序列共价附着于所述的支持物的装置。
11．如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的将核酸序列共价附着于固相支持物的装置是化学修饰的功能基团。
12．如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的化学修饰的功能基团是磷酸基团、羧酸或醛基、硫醇、羟基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、或氨基。
13．如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的化学修饰的功能基团是氨基。
14．如权利要求1-13任一所述的方法，其特征在于，所述的固相支持物选自：乳胶珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、金表面、玻璃表面和硅片。
15．如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的固相支持物是玻璃。
16．如权利要求1-15任一所述的方法，其特征在于，产生的核酸集落的密度是10,000/mm2到100,000/mm2。
17．如权利要求1-16任一所述的方法，其特征在于，所述的集落引物X附着于所述的固相支持物的密度至少是1fmol/mm2。
18．如权利要求1-17任一所述的方法，其特征在于，所述的核酸模板的密度是10,000/mm2到100,000/mm2。
19．一种含待扩增核酸的多重核酸模板，其特征在于，所述的核酸在它们的5’端含有寡核苷酸序列Y，在3′端含有寡核苷酸序列Z，另外在5’端还携带将该核酸附着于固相支持物的装置。
20．如权利要求19所述的多重核酸模板，其特征在于，所述的模板与多重集落引物X混合。
21．如权利要求19或20所述的多重核酸模板，其特征在于，所述的寡核苷酸序列Z互补于寡核苷酸序列Y，集落引物X与寡核苷酸序列Y的序列相同。
22．如权利要求19或20所述的多重核酸模板，其特征在于，其中将两种不同的集落引物X与所述的模板混合，集落引物X的序列使寡核苷酸序列Z能与一种集落引物X杂交，寡核苷酸序列Y与一种集落引物X的序列相同。
23．如权利要求19或20所述的多重核酸模板，其特征在于，所述的集落引物X包含简并引物序列，而核酸模板不含有寡核苷酸序列Y或Z。
24．一种固相支持物，其上附着多重集落引物X和至少一种核酸模板，其特征在于，所述的核酸模板和集落引物的定义如上述任一权利要求所述。
25．如权利要求24所述的固相支持物，其特征在于，所述的多重核酸模板附着于所述的固相支持物。
26．如权利要求24或25所述的固相支持物，其特征在于，所述的固相支持物的定义如权利要求14和15所述。
27．如权利要求24-26任一所述的固相支持物，其特征在于，所述的核酸模板和集落引物与固相支持物的附着是共价的。
28．一种固相支持物，其特征在于，它含有由权利要求1-18任一所述的方法产生的一种或多种核酸集落。
29．如权利要求24-28任一所述的固相支持物的用途，其特征在于，可用于核酸扩增或测序的方法中。
30．如权利要求29所述的用途，其特征在于，所述的方法是权利要求1-18任一所述的方法。
31．如权利要求1-18所述的方法的用途，其特征在于，可用于核酸扩增或测序。
32．如权利要求1-18任一所述的方法，或由所述的方法产生的核酸集落，或如权利要求19-23任一所述的多重核酸模板，或权利要求24-28任一所述的固相支持物的用途，其特征在于，用于提供以下所需的核酸分子：测序和重测序、基因表达监控、遗传多样性分布图、诊断、筛选、全基因组测序、全基因组多态性的发现和评分、和制备全基因组玻片、或包括核酸扩增或测序的其他运用。
33．一种用于核酸扩增或测序的试剂盒，其特征在于，它包括如上述任一权利要求所定义的结合于固相支持物的多重核酸模板和集落引物。
34．如权利要求33所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒可用于测序和重测序、基因表达监控、遗传多样性分布图、诊断、筛选、全基因组测序、全基因组多态性的发现和评分、或包括核酸扩增或测序的其他运用。
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ZA (1) ZA200102420B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106086203A (zh) * 2016-07-12 2016-11-09 深圳绿倍生态科技有限公司 一种小球藻核酸模板的制备方法及其应用
CN106566855A (zh) * 2006-07-31 2017-04-19 毕万里 使用可逆修饰寡核苷酸扩增核酸
CN109688817A (zh) * 2016-10-03 2019-04-26 Illumina公司 胺和肼的荧光检测及其分析方法
CN110684829A (zh) * 2018-07-05 2020-01-14 深圳华大智造科技有限公司 一种高通量的单细胞转录组测序方法和试剂盒

Families Citing this family (756)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2563643T3 (es) * 1997-04-01 2016-03-15 Illumina Cambridge Limited Método de secuenciación de ácido nucleico
US20100130368A1 (en) * 1998-07-30 2010-05-27 Shankar Balasubramanian Method and system for sequencing polynucleotides
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
DE10027040A1 (de) * 2000-06-02 2001-12-06 Basf Lynx Bioscience Ag Verfahren zur Herstellung von DNA-Arrays
AR031640A1 (es) * 2000-12-08 2003-09-24 Applied Research Systems Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido
EP1386006B1 (en) 2001-04-20 2008-05-28 The Penn State Research Foundation Methods for nucleic acid manipulation
US7195908B2 (en) * 2002-10-31 2007-03-27 Corning Incorporated Supports treated with triamine for immobilizing biomolecules
CA2510166A1 (en) 2002-12-20 2004-09-30 Caliper Life Sciences, Inc. Single molecule amplification and detection of dna
ES2338654T5 (es) 2003-01-29 2017-12-11 454 Life Sciences Corporation Amplificación de ácidos nucleicos en emulsión de perlas
JP2007525571A (ja) 2004-01-07 2007-09-06 ソレクサ リミテッド 修飾分子アレイ
US7622296B2 (en) 2004-05-28 2009-11-24 Wafergen, Inc. Apparatus and method for multiplex analysis
WO2006064199A1 (en) * 2004-12-13 2006-06-22 Solexa Limited Improved method of nucleotide detection
GB0427236D0 (en) 2004-12-13 2005-01-12 Solexa Ltd Improved method of nucleotide detection
EP2233582A1 (en) 2005-02-01 2010-09-29 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Nucleic acid sequencing by performing successive cycles of duplex extension
AU2006210553A1 (en) 2005-02-01 2006-08-10 Ab Advanced Genetic Analysis Corporation Reagents, methods and libraries for bead-based sequencing
GB0514935D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Methods for sequencing a polynucleotide template
GB0514936D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Preparation of templates for nucleic acid sequencing
GB0514910D0 (en) * 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Method for sequencing a polynucleotide template
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
GB0522310D0 (en) 2005-11-01 2005-12-07 Solexa Ltd Methods of preparing libraries of template polynucleotides
GB0524069D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Solexa Ltd Preparation of templates for solid phase amplification
CA2633476C (en) * 2005-12-22 2015-04-21 Pacific Biosciences Of California, Inc. Active surface coupled polymerases
WO2007091077A1 (en) 2006-02-08 2007-08-16 Solexa Limited Method for sequencing a polynucleotide template
EP2021503A1 (en) * 2006-03-17 2009-02-11 Solexa Ltd. Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays
US20070231823A1 (en) 2006-03-23 2007-10-04 Mckernan Kevin J Directed enrichment of genomic DNA for high-throughput sequencing
US8921073B2 (en) 2006-06-23 2014-12-30 Illumina, Inc. Devices and systems for creation of DNA cluster arrays
WO2008015396A2 (en) * 2006-07-31 2008-02-07 Solexa Limited Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers
WO2008018355A1 (fr) * 2006-08-08 2008-02-14 Sharp Kabushiki Kaisha biodétecteur, son procédé de fabrication et procédé de détection utilisant le biodétecteur
US8586006B2 (en) 2006-08-09 2013-11-19 Institute For Systems Biology Organ-specific proteins and methods of their use
US7754429B2 (en) 2006-10-06 2010-07-13 Illumina Cambridge Limited Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides
EP2076609A1 (en) 2006-10-10 2009-07-08 Illumina Inc. Compositions and methods for representational selection of nucleic acids fro complex mixtures using hybridization
US20110045462A1 (en) * 2006-11-14 2011-02-24 The Regents Of The University Of California Digital analysis of gene expression
US8315817B2 (en) 2007-01-26 2012-11-20 Illumina, Inc. Independently removable nucleic acid sequencing system and method
CA2676570C (en) 2007-01-26 2016-05-03 Illumina, Inc. Nucleic acid sequencing system and method
WO2008093098A2 (en) 2007-02-02 2008-08-07 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
WO2008096146A1 (en) 2007-02-07 2008-08-14 Solexa Limited Preparation of templates for methylation analysis
US9598724B2 (en) 2007-06-01 2017-03-21 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
WO2008157515A1 (en) * 2007-06-16 2008-12-24 Sacrab Genomics Nucleic acid packaging system
WO2008157640A2 (en) 2007-06-18 2008-12-24 Illumina, Inc. Microfabrication methods for the optimal patterning of substrates
JP2009000070A (ja) * 2007-06-22 2009-01-08 Hitachi Ltd 大規模並列核酸分析方法
US8222040B2 (en) * 2007-08-28 2012-07-17 Lightspeed Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing by selective excitation of microparticles
US8759077B2 (en) 2007-08-28 2014-06-24 Lightspeed Genomics, Inc. Apparatus for selective excitation of microparticles
US20090062132A1 (en) 2007-08-29 2009-03-05 Borner Scott R Alternative nucleic acid sequencing methods
WO2009032167A1 (en) * 2007-08-29 2009-03-12 Illumina Cambridge Method for sequencing a polynucleotide template
US9388457B2 (en) 2007-09-14 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Locus specific amplification using array probes
US8716190B2 (en) 2007-09-14 2014-05-06 Affymetrix, Inc. Amplification and analysis of selected targets on solid supports
US7811810B2 (en) 2007-10-25 2010-10-12 Industrial Technology Research Institute Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules
US7767441B2 (en) * 2007-10-25 2010-08-03 Industrial Technology Research Institute Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules
JP2009178159A (ja) * 2007-11-05 2009-08-13 Hitachi Plant Technologies Ltd 核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板
US8202691B2 (en) * 2008-01-25 2012-06-19 Illumina, Inc. Uniform fragmentation of DNA using binding proteins
US8039817B2 (en) 2008-05-05 2011-10-18 Illumina, Inc. Compensator for multiple surface imaging
EP2294214A2 (en) * 2008-05-07 2011-03-16 Illumina, Inc. Compositions and methods for providing substances to and from an array
US8407012B2 (en) * 2008-07-03 2013-03-26 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and systems of DNA sequencing
EP2653530B1 (en) 2008-07-09 2015-10-14 Panasonic Intellectual Property Management Co., Ltd. Sensor
US20100069250A1 (en) * 2008-08-16 2010-03-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Digital PCR Calibration for High Throughput Sequencing
WO2010028288A2 (en) 2008-09-05 2010-03-11 Aueon, Inc. Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options
US8383345B2 (en) 2008-09-12 2013-02-26 University Of Washington Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
WO2010038042A1 (en) 2008-10-02 2010-04-08 Illumina Cambridge Ltd. Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications
US20100087325A1 (en) * 2008-10-07 2010-04-08 Illumina, Inc. Biological sample temperature control system and method
CA2742298C (en) 2008-11-03 2019-09-10 The Regents Of The University Of California Methods for detecting modification resistant nucleic acids
US9394567B2 (en) 2008-11-07 2016-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Detection and quantification of sample contamination in immune repertoire analysis
US9528160B2 (en) 2008-11-07 2016-12-27 Adaptive Biotechnolgies Corp. Rare clonotypes and uses thereof
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US8628927B2 (en) 2008-11-07 2014-01-14 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
GB2467704B (en) 2008-11-07 2011-08-24 Mlc Dx Inc A method for determining a profile of recombined DNA sequences in T-cells and/or B-cells
US9506119B2 (en) 2008-11-07 2016-11-29 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of sequence determination using sequence tags
WO2010068702A2 (en) * 2008-12-10 2010-06-17 Illumina, Inc. Methods and compositions for hybridizing nucleic acids
EP2379748A4 (en) 2008-12-23 2012-08-29 Illumina Inc MULTIBASE RELEASE FOR LONG READINGS IN SEQUENCING BY SYNTHESIS PROTOCOLS
PT2387627E (pt) 2009-01-15 2016-06-03 Adaptive Biotechnologies Corp Determinação do perfil de imunidade adaptativa e métodos de geração de anticorpos monoclonais
WO2010094772A1 (en) 2009-02-20 2010-08-26 Febit Holding Gmbh Synthesis of sequence-verified nucleic acids
JP5600880B2 (ja) * 2009-03-03 2014-10-08 東洋紡株式会社 改良された増幅試薬
JP5239978B2 (ja) * 2009-03-23 2013-07-17 パナソニック株式会社 センサおよびシーケンサー
US20100285970A1 (en) * 2009-03-31 2010-11-11 Rose Floyd D Methods of sequencing nucleic acids
CN104404134B (zh) * 2009-04-03 2017-05-10 莱弗斯基因股份有限公司 多重核酸检测方法和系统
WO2010127186A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
JP2012525147A (ja) 2009-04-30 2012-10-22 グッド スタート ジェネティクス， インコーポレイテッド 遺伝マーカーを評価するための方法および組成物
EP2248914A1 (en) 2009-05-05 2010-11-10 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. The use of class IIB restriction endonucleases in 2nd generation sequencing applications
US9334531B2 (en) 2010-12-17 2016-05-10 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
US9309566B2 (en) 2010-12-17 2016-04-12 Life Technologies Corporation Methods, compositions, systems, apparatuses and kits for nucleic acid amplification
US9309557B2 (en) 2010-12-17 2016-04-12 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
US20100330571A1 (en) 2009-06-25 2010-12-30 Robins Harlan S Method of measuring adaptive immunity
US10036063B2 (en) 2009-07-24 2018-07-31 Illumina, Inc. Method for sequencing a polynucleotide template
WO2011014811A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Ibis Biosciences, Inc. Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests
DK2816111T3 (en) 2009-08-14 2016-06-06 Epicentre Tech Corp Methods, compositions, and kits for the generation of rRNA-depleted samples or isolation of rRNA from samples
ES2595055T3 (es) 2009-08-25 2016-12-27 Illumina, Inc. Métodos para seleccionar y amplificar polinucleótidos
US8182994B2 (en) 2009-09-15 2012-05-22 Illumina Cambridge Limited Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing
WO2011037990A1 (en) * 2009-09-22 2011-03-31 President And Fellows Of Harvard College Entangled mate sequencing
EP2957641B1 (en) 2009-10-15 2017-05-17 Ibis Biosciences, Inc. Multiple displacement amplification
US8524450B2 (en) 2009-10-30 2013-09-03 Illumina, Inc. Microvessels, microparticles, and methods of manufacturing and using the same
SG10201407883PA (en) 2009-12-07 2015-01-29 Illumina Inc Multi-sample indexing for multiplex genotyping
US9323888B2 (en) 2010-01-19 2016-04-26 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
US10388403B2 (en) 2010-01-19 2019-08-20 Verinata Health, Inc. Analyzing copy number variation in the detection of cancer
US9260745B2 (en) 2010-01-19 2016-02-16 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
US8700341B2 (en) 2010-01-19 2014-04-15 Verinata Health, Inc. Partition defined detection methods
WO2011091046A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Verinata Health, Inc. Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic dna by whole genome sequencing
EP2366031B1 (en) 2010-01-19 2015-01-21 Verinata Health, Inc Sequencing methods in prenatal diagnoses
WO2011090556A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Verinata Health, Inc. Methods for determining fraction of fetal nucleic acid in maternal samples
US20120100548A1 (en) 2010-10-26 2012-04-26 Verinata Health, Inc. Method for determining copy number variations
US9499814B2 (en) * 2010-01-22 2016-11-22 The Regents Of The University Of California Methods for identifying drug effects on a cell by determining changes in the cell's spliced message profile
US20110312503A1 (en) 2010-01-23 2011-12-22 Artemis Health, Inc. Methods of fetal abnormality detection
US8759037B2 (en) 2010-02-23 2014-06-24 Illumina Cambridge Limited Amplification methods to minimise sequence specific bias
WO2011112465A1 (en) 2010-03-06 2011-09-15 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses for detecting optical signals from a sample
US9465228B2 (en) 2010-03-19 2016-10-11 Optical Biosystems, Inc. Illumination apparatus optimized for synthetic aperture optics imaging using minimum selective excitation patterns
US8502867B2 (en) 2010-03-19 2013-08-06 Lightspeed Genomics, Inc. Synthetic aperture optics imaging method using minimum selective excitation patterns
DK2556171T3 (en) 2010-04-05 2015-12-14 Prognosys Biosciences Inc Spatially CODED BIOLOGICAL ASSAYS
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
WO2011139371A1 (en) 2010-05-06 2011-11-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
EP2566985A4 (en) 2010-05-06 2014-08-06 Ibis Biosciences Inc INTEGRATED SAMPLE PREPARATION SYSTEMS AND MIXTURES OF STABILIZED ENZYMES
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
WO2011146632A1 (en) 2010-05-18 2011-11-24 Gene Security Network Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
SG185723A1 (en) 2010-06-07 2013-01-30 Esoterix Genetic Lab Llc Enumeration of nucleic acids
WO2011159942A1 (en) 2010-06-18 2011-12-22 Illumina, Inc. Conformational probes and methods for sequencing nucleic acids
US20120021919A1 (en) 2010-07-23 2012-01-26 Thomas Scholl Identification of Differentially Represented Fetal or Maternal Genomic Regions and Uses Thereof
US9029103B2 (en) 2010-08-27 2015-05-12 Illumina Cambridge Limited Methods for sequencing polynucleotides
EP2426214A1 (en) 2010-09-01 2012-03-07 Koninklijke Philips Electronics N.V. Method for amplifying nucleic acids
WO2012037394A1 (en) 2010-09-16 2012-03-22 Ibis Biosciences, Inc. Stabilization of ozone-labile fluorescent dyes by thiourea
EP3572528A1 (en) 2010-09-24 2019-11-27 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
WO2012050920A1 (en) 2010-09-29 2012-04-19 Illumina, Inc. Compositions and methods for sequencing nucleic acids
US10093981B2 (en) 2010-10-19 2018-10-09 Northwestern University Compositions and methods for identifying depressive disorders
US20150218639A1 (en) 2014-01-17 2015-08-06 Northwestern University Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment
US10233501B2 (en) 2010-10-19 2019-03-19 Northwestern University Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment
EA022475B1 (ru) * 2010-10-19 2016-01-29 Ооо "Центр Инновационных Технологий-Нано" Способ секвенирования днк
US20150225792A1 (en) 2014-01-17 2015-08-13 Northwestern University Compositions and methods for identifying depressive disorders
US8753816B2 (en) 2010-10-26 2014-06-17 Illumina, Inc. Sequencing methods
WO2012058096A1 (en) 2010-10-27 2012-05-03 Illumina, Inc. Microdevices and biosensor cartridges for biological or chemical analysis and systems and methods for the same
US8575071B2 (en) 2010-11-03 2013-11-05 Illumina, Inc. Reducing adapter dimer formation
US9074251B2 (en) 2011-02-10 2015-07-07 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
EP2643484A4 (en) 2010-11-22 2014-04-16 Univ California METHOD OF IDENTIFYING AN RNA TRANSCRIPTION OF CELLULAR ORIGIN
US20120152743A1 (en) * 2010-12-17 2012-06-21 General Electric Company Method for electroeluting genetic material from dried samples
EP3564392B1 (en) 2010-12-17 2021-11-24 Life Technologies Corporation Methods for nucleic acid amplification
JP5616773B2 (ja) 2010-12-21 2014-10-29 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸分析用反応デバイス、及び核酸分析装置
US9163281B2 (en) 2010-12-23 2015-10-20 Good Start Genetics, Inc. Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
US9109222B2 (en) 2010-12-27 2015-08-18 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid sample preparation methods and compositions
US8951781B2 (en) 2011-01-10 2015-02-10 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis
US9217132B2 (en) 2011-01-20 2015-12-22 Ibis Biosciences, Inc. Microfluidic transducer
AU2012212148B8 (en) 2011-02-02 2017-07-06 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Massively parallel contiguity mapping
US20130344540A1 (en) * 2011-02-03 2013-12-26 Mark T. Reed Methods for minimizing sequence specific bias
EP2683736B1 (en) 2011-03-09 2018-01-17 Cell Signaling Technology, Inc. Methods and reagents for creating monoclonal antibodies
HUE050032T2 (hu) 2011-04-12 2020-11-30 Verinata Health Inc Genomfrakciók feloldása polimorfizmus-szám alkalmazásával
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
GB2484764B (en) 2011-04-14 2012-09-05 Verinata Health Inc Normalizing chromosomes for the determination and verification of common and rare chromosomal aneuploidies
US9411937B2 (en) 2011-04-15 2016-08-09 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
EP3246416A1 (en) 2011-04-15 2017-11-22 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
US8778848B2 (en) 2011-06-09 2014-07-15 Illumina, Inc. Patterned flow-cells useful for nucleic acid analysis
EP2732423A4 (en) 2011-07-13 2014-11-26 Multiple Myeloma Res Foundation Inc METHOD FOR DETECTING AND DISTRIBUTING DATA
WO2013022778A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid sequencing by electrochemical detection
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
SI3623481T1 (sl) 2011-09-23 2022-01-31 Illumina, Inc. Sestavki za sekvenciranje nukleinske kisline
AU2012316218B2 (en) 2011-09-26 2016-03-17 Gen-Probe Incorporated Algorithms for sequence determinations
US9228233B2 (en) 2011-10-17 2016-01-05 Good Start Genetics, Inc. Analysis methods
GB2497838A (en) 2011-10-19 2013-06-26 Nugen Technologies Inc Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing
CA2853088C (en) 2011-10-21 2018-03-13 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
WO2013063308A1 (en) 2011-10-25 2013-05-02 University Of Massachusetts An enzymatic method to enrich for capped rna, kits for performing same, and compositions derived therefrom
CA2856163C (en) 2011-10-28 2019-05-07 Illumina, Inc. Microarray fabrication system and method
EP2774978B1 (en) 2011-10-31 2019-05-15 Hitachi High-Technologies Corporation Nucleic acid amplification method
AU2012347460B2 (en) 2011-12-09 2017-05-25 Adaptive Biotechnologies Corporation Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection
US9499865B2 (en) 2011-12-13 2016-11-22 Adaptive Biotechnologies Corp. Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes
US20130189679A1 (en) 2011-12-20 2013-07-25 The Regents Of The University Of Michigan Pseudogenes and uses thereof
WO2013096838A2 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Ibis Biosciences, Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids
EP3211100A1 (en) 2011-12-22 2017-08-30 Ibis Biosciences, Inc. Amplification primers and methods
ES2645418T3 (es) 2011-12-22 2017-12-05 Ibis Biosciences, Inc. Amplificación de una secuencia de un ácido ribonucleico
WO2013096819A2 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Ibis Biosciences, Inc. Macromolecule positioning by electrical potential
WO2013096799A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Ibis Biosciences, Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids from cellular samples
US9506113B2 (en) 2011-12-28 2016-11-29 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid ligation systems and methods
US9823246B2 (en) 2011-12-28 2017-11-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescence enhancing plasmonic nanoscopic gold films and assays based thereon
WO2013102081A2 (en) 2011-12-29 2013-07-04 Ibis Biosciences, Inc. Macromolecule delivery to nanowells
EP2872523B1 (en) 2011-12-30 2018-01-17 Abbott Molecular Inc. Microorganism nucleic acid purification from host samples
US9822417B2 (en) 2012-01-09 2017-11-21 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer
EP3434789A1 (en) 2012-01-13 2019-01-30 Data2Bio Genotyping by next-generation sequencing
CN105861487B (zh) 2012-01-26 2020-05-05 纽亘技术公司 用于靶向核酸序列富集和高效文库产生的组合物和方法
WO2013117595A2 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Illumina Cambridge Limited Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support
DK3363901T3 (da) 2012-02-17 2021-02-22 Hutchinson Fred Cancer Res Sammensætninger og fremgangsmåder til præcis identificering af mutationer
CN104220876A (zh) 2012-02-21 2014-12-17 奥斯陆大学医院 用于宫颈癌的检测和预后的方法和生物标志物
US10077478B2 (en) 2012-03-05 2018-09-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits
NO2694769T3 (zh) 2012-03-06 2018-03-03
US20150111758A1 (en) 2012-03-06 2015-04-23 Oslo Universitetssykehus Hf Gene signatures associated with efficacy of postmastectomy radiotherapy in breast cancer
US9803239B2 (en) 2012-03-29 2017-10-31 Complete Genomics, Inc. Flow cells for high density array chips
US20130261984A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Illumina, Inc. Methods and systems for determining fetal chromosomal abnormalities
CA2867665C (en) 2012-04-03 2022-01-04 Illumina, Inc. Integrated optoelectronic read head and fluidic cartridge useful for nucleic acid sequencing
EP2834370B1 (en) 2012-04-03 2019-01-02 The Regents Of The University Of Michigan Biomarker associated with irritable bowel syndrome and crohn's disease
US8209130B1 (en) 2012-04-04 2012-06-26 Good Start Genetics, Inc. Sequence assembly
US8812422B2 (en) 2012-04-09 2014-08-19 Good Start Genetics, Inc. Variant database
US20130274148A1 (en) 2012-04-11 2013-10-17 Illumina, Inc. Portable genetic detection and analysis system and method
US10227635B2 (en) 2012-04-16 2019-03-12 Molecular Loop Biosolutions, Llc Capture reactions
EP3789502A1 (en) 2012-05-02 2021-03-10 Ibis Biosciences, Inc. Dna sequencing
ES2683707T3 (es) 2012-05-02 2018-09-27 Ibis Biosciences, Inc. Secuenciación de ADN
US10584377B2 (en) 2012-05-02 2020-03-10 Ibis Biosciences, Inc. DNA sequencing
US20150133310A1 (en) 2012-05-02 2015-05-14 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid sequencing systems and methods
SG11201407107VA (en) 2012-05-08 2014-11-27 Adaptive Biotechnologies Corp Compositions and method for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed pcr reactions
US9012022B2 (en) 2012-06-08 2015-04-21 Illumina, Inc. Polymer coatings
US8895249B2 (en) 2012-06-15 2014-11-25 Illumina, Inc. Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
CN104619894B (zh) 2012-06-18 2017-06-06 纽亘技术公司 用于非期望核酸序列的阴性选择的组合物和方法
WO2014005076A2 (en) 2012-06-29 2014-01-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods and biomarkers for detection of kidney disorders
CA2878291A1 (en) 2012-07-03 2014-01-09 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Quantitative assessment of human t-cell repertoire recovery after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
EP3243937A1 (en) 2012-07-17 2017-11-15 Counsyl, Inc. System and methods for detecting genetic variation
US9092401B2 (en) 2012-10-31 2015-07-28 Counsyl, Inc. System and methods for detecting genetic variation
US9977861B2 (en) 2012-07-18 2018-05-22 Illumina Cambridge Limited Methods and systems for determining haplotypes and phasing of haplotypes
US10584381B2 (en) 2012-08-14 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014028537A1 (en) 2012-08-14 2014-02-20 10X Technologies, Inc. Microcapsule compositions and methods
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9422602B2 (en) 2012-08-15 2016-08-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for determining nucleic acid degradation
NL2017959B1 (en) 2016-12-08 2018-06-19 Illumina Inc Cartridge assembly
CA3178340A1 (en) 2012-08-20 2014-02-27 Illumina, Inc. Method and system for fluorescence lifetime based sequencing
MX2015003541A (es) 2012-09-19 2015-10-26 Abbvie Biotherapeutics Inc Metodos para identificar los anticuerpos con inmunogenia reducida.
AU2013327423B2 (en) 2012-10-01 2017-06-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization
ES2701750T3 (es) 2012-10-16 2019-02-25 Abbott Molecular Inc Procedimientos para secuenciar un ácido nucleico
US9365896B2 (en) 2012-10-19 2016-06-14 Agilent Technologies, Inc. Addition of an adaptor by invasive cleavage
WO2014066179A1 (en) 2012-10-24 2014-05-01 Clontech Laboratories, Inc. Template switch-based methods for producing a product nucleic acid
EP2912468B1 (en) 2012-10-29 2018-09-12 The Johns Hopkins University Papanicolaou test for ovarian and endometrial cancers
CA3140836A1 (en) 2012-11-21 2014-05-30 Courtagen Life Sciences Inc. A method of removing amplicons of a non-target nucleic acid having one or more methylated cytosines from a sample
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CA2894694C (en) 2012-12-14 2023-04-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
CN105190656B (zh) 2013-01-17 2018-01-16 佩索纳里斯公司 用于遗传分析的方法和系统
EP3862435A1 (en) 2013-02-08 2021-08-11 10X Genomics, Inc. Polynucleotide barcode generation
US9512422B2 (en) 2013-02-26 2016-12-06 Illumina, Inc. Gel patterned surfaces
EP2964624B1 (en) 2013-03-08 2017-01-04 Illumina Cambridge Limited Rhodamine compounds and their use as fluorescent labels
DK2964612T3 (en) 2013-03-08 2017-04-03 Illumina Cambridge Ltd POLYMETHIN COMPOUNDS AND USE THEREOF AS FLUORESCING LABELS
WO2014142841A1 (en) 2013-03-13 2014-09-18 Illumina, Inc. Multilayer fluidic devices and methods for their fabrication
EP2970951B1 (en) 2013-03-13 2019-02-20 Illumina, Inc. Methods for nucleic acid sequencing
EP2971169A4 (en) 2013-03-13 2016-10-26 Abbott Molecular Inc SYSTEMS AND METHODS FOR ISOLATING NUCLEIC ACIDS
EP2971171A4 (en) 2013-03-14 2016-11-02 Abbott Molecular Inc SYSTEMS AND METHODS FOR MULTIPLEX AMPLIFICATION SPECIFIC TO METHYLATION
WO2014152421A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Good Start Genetics, Inc. Methods for analyzing nucleic acids
WO2014152937A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid control panels
EP2971175B1 (en) 2013-03-14 2019-04-17 Abbott Molecular Inc. Minimizing errors using uracil-dna-n-glycosylase
EP2971140B1 (en) 2013-03-15 2019-01-16 Ibis Biosciences, Inc. Methods to assess contamination in dna sequencing
CA2905410A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Abbott Molecular Inc. Systems and methods for detection of genomic copy number changes
EP2971130A4 (en) 2013-03-15 2016-10-05 Nugen Technologies Inc SEQUENTIAL SEQUENCING
WO2014150851A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Ibis Biosciences, Inc. Nucleotide analogs for sequencing
US9255265B2 (en) 2013-03-15 2016-02-09 Illumina, Inc. Methods for producing stranded cDNA libraries
WO2014142981A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Illumina, Inc. Enzyme-linked nucleotides
EP3597772A1 (en) 2013-04-17 2020-01-22 Agency For Science, Technology And Research Method for generating extended sequence reads
EP2986762B1 (en) 2013-04-19 2019-11-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
EP3005200A2 (en) 2013-06-03 2016-04-13 Good Start Genetics, Inc. Methods and systems for storing sequence read data
CN111662960B (zh) 2013-06-25 2024-04-12 普罗格诺西斯生物科学公司 采用微流控装置的空间编码生物分析
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
CN109734946B (zh) 2013-07-01 2021-10-26 Illumina公司 无催化剂的表面官能化和聚合物接枝
EP3017063B1 (en) 2013-07-03 2017-04-05 Illumina, Inc. Sequencing by orthogonal synthesis
US10392670B2 (en) 2013-07-25 2019-08-27 Dch Molecular Diagnostics, Inc. Methods and compositions for detecting bacterial contamination
ES2943498T3 (es) 2013-08-05 2023-06-13 Twist Bioscience Corp Genotecas sintetizadas de novo
CN113789372A (zh) 2013-08-08 2021-12-14 伊鲁米那股份有限公司 用于向流动池的试剂输送的流体系统
ES2873850T3 (es) 2013-08-19 2021-11-04 Abbott Molecular Inc Bibliotecas de secuenciación de próxima generación
CA2920390A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Illumina, Inc. Manipulation of droplets on hydrophilic or variegated-hydrophilic surfaces
WO2015031689A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Personalis, Inc. Methods and systems for genomic analysis
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
US9352315B2 (en) 2013-09-27 2016-05-31 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. Method to produce chemical pattern in micro-fluidic structure
WO2015051275A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Personalis, Inc. Methods for analyzing genotypes
HUE045954T2 (hu) 2013-10-17 2020-01-28 Illumina Inc Eljárások és készítmények nukleinsavkönyvtárak elõállítására
WO2015057319A1 (en) * 2013-10-17 2015-04-23 Clontech Laboratories, Inc. Methods for adding adapters to nucleic acids and compositions for practicing the same
US10851414B2 (en) 2013-10-18 2020-12-01 Good Start Genetics, Inc. Methods for determining carrier status
WO2015057565A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Good Start Genetics, Inc. Methods for assessing a genomic region of a subject
US10415083B2 (en) 2013-10-28 2019-09-17 The Translational Genomics Research Institute Long insert-based whole genome sequencing
WO2015073711A1 (en) 2013-11-13 2015-05-21 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read
US10100355B2 (en) 2013-12-09 2018-10-16 Illumina, Inc. Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing
US10254225B2 (en) 2013-12-10 2019-04-09 Illumina, Inc. Biosensors for biological or chemical analysis and methods of manufacturing the same
US9909181B2 (en) 2013-12-13 2018-03-06 Northwestern University Biomarkers for post-traumatic stress states
EP3083700B1 (en) 2013-12-17 2023-10-11 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Detection of an antibody against a pathogen
WO2015094861A1 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Clontech Laboratories, Inc. Methods for adding adapters to nucleic acids and compositions for practicing the same
CN114089597A (zh) 2013-12-19 2022-02-25 Illumina公司 包括纳米图案化表面的基底及其制备方法
EP3083994B1 (en) 2013-12-20 2021-08-18 Illumina, Inc. Preserving genomic connectivity information in fragmented genomic dna samples
WO2015103225A1 (en) 2013-12-31 2015-07-09 Illumina, Inc. Addressable flow cell using patterned electrodes
WO2015107430A2 (en) 2014-01-16 2015-07-23 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer
KR102001554B1 (ko) 2014-01-16 2019-07-18 일루미나, 인코포레이티드 고형 지지체 상에서의 앰플리콘 제조 방법 및 시퀀싱
US9677132B2 (en) 2014-01-16 2017-06-13 Illumina, Inc. Polynucleotide modification on solid support
RU2752700C2 (ru) 2014-02-18 2021-07-30 Иллумина, Инк. Способы и композиции для днк-профилирования
WO2015131107A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Nugen Technologies, Inc. Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors
AU2015227054A1 (en) 2014-03-05 2016-09-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
US11390921B2 (en) 2014-04-01 2022-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Determining WT-1 specific T cells and WT-1 specific T cell receptors (TCRs)
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
AU2015243445B2 (en) 2014-04-10 2020-05-28 10X Genomics, Inc. Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same
EP3132059B1 (en) 2014-04-17 2020-01-08 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
CN113774132A (zh) 2014-04-21 2021-12-10 纳特拉公司 检测染色体片段中的突变和倍性
WO2015175530A1 (en) 2014-05-12 2015-11-19 Gore Athurva Methods for detecting aneuploidy
AU2015259024B2 (en) 2014-05-16 2021-07-01 Illumina, Inc. Nucleic acid synthesis techniques
BR112016027815B1 (pt) 2014-05-27 2022-07-12 Illumina, Inc. Sistemas e métodos para análise bioquímica incluindo um instrumento de base e cartucho removível
GB201410022D0 (en) 2014-06-05 2014-07-16 Orion Diagnostica Oy Method
PL3151964T3 (pl) 2014-06-05 2020-09-07 Illumina, Inc. Systemy i sposoby obejmujące zawór obrotowy dla co najmniej jednej czynności spośród przygotowywania próbki lub analizy próbki
WO2015188178A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for characterizing and diagnosing periodontal disease
US20150353989A1 (en) 2014-06-09 2015-12-10 Illumina Cambridge Limited Sample preparation for nucleic acid amplification
GB201410420D0 (en) 2014-06-11 2014-07-23 Illumina Cambridge Ltd Methods for estimating cluster numbers
SG11201610357UA (en) 2014-06-13 2017-01-27 Illumina Cambridge Ltd Methods and compositions for preparing sequencing libraries
GB201410646D0 (en) 2014-06-14 2014-07-30 Illumina Cambridge Ltd Methods of increasing sequencing accuracy
JP6784601B2 (ja) 2014-06-23 2020-11-11 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション シークエンシングによって評価されるゲノムワイドでバイアスのないＤＳＢの同定（ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ）
WO2015200541A1 (en) 2014-06-24 2015-12-30 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital pcr barcoding
US10017759B2 (en) 2014-06-26 2018-07-10 Illumina, Inc. Library preparation of tagged nucleic acid
CN106795553B (zh) 2014-06-26 2021-06-04 10X基因组学有限公司 分析来自单个细胞或细胞群体的核酸的方法
KR20170023979A (ko) 2014-06-26 2017-03-06 10엑스 제노믹스, 인크. 핵산 서열 조립을 위한 프로세스 및 시스템
CN107209188A (zh) 2014-06-27 2017-09-26 雅培制药有限公司 用于检测人Pegivirus 2 (HPgV‑2)的组合物和方法
US10577603B2 (en) 2014-06-30 2020-03-03 Illumina, Inc. Methods and compositions using one-sided transposition
RU2697502C2 (ru) 2014-07-24 2019-08-14 Эбботт Молекьюлар Инк. Композиции и способы обнаружения и анализа микобактерии туберкулеза (mycobacterium tuberculosis)
US10526641B2 (en) 2014-08-01 2020-01-07 Dovetail Genomics, Llc Tagging nucleic acids for sequence assembly
CN107075581B (zh) 2014-08-06 2022-03-18 纽亘技术公司 由靶向测序进行数字测量
WO2016025332A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 President And Fellows Of Harvard College System and method for monitoring health based on collected bodily fluid
US10174383B2 (en) 2014-08-13 2019-01-08 Vanadis Diagnostics Method of estimating the amount of a methylated locus in a sample
WO2016026924A1 (en) 2014-08-21 2016-02-25 Illumina Cambridge Limited Reversible surface functionalization
WO2016040446A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Good Start Genetics, Inc. Methods for selectively suppressing non-target sequences
WO2016040602A1 (en) 2014-09-11 2016-03-17 Epicentre Technologies Corporation Reduced representation bisulfite sequencing using uracil n-glycosylase (ung) and endonuclease iv
WO2016044391A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Ibis Biosciences, Inc. Sequencing by synthesis using pulse read optics
US20160085910A1 (en) 2014-09-18 2016-03-24 Illumina, Inc. Methods and systems for analyzing nucleic acid sequencing data
JP2017536087A (ja) 2014-09-24 2017-12-07 グッド スタート ジェネティクス， インコーポレイテッド 遺伝子アッセイのロバストネスを増大させるためのプロセス制御
US10040048B1 (en) 2014-09-25 2018-08-07 Synthego Corporation Automated modular system and method for production of biopolymers
WO2016057950A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Illumina, Inc. Method and device for separating immiscible liquids to effectively isolate at least one of the liquids
US11873480B2 (en) 2014-10-17 2024-01-16 Illumina Cambridge Limited Contiguity preserving transposition
CA2964472A1 (en) 2014-10-29 2016-05-06 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing
WO2016069886A1 (en) 2014-10-29 2016-05-06 Adaptive Biotechnologies Corporation Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples
WO2016070131A1 (en) 2014-10-30 2016-05-06 Personalis, Inc. Methods for using mosaicism in nucleic acids sampled distal to their origin
SI3212684T1 (sl) 2014-10-31 2020-04-30 Illumina Cambridge Limited Polimeri in DNK kopolimer premazi
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
GB201419731D0 (en) 2014-11-05 2014-12-17 Illumina Cambridge Ltd Sequencing from multiple primers to increase data rate and density
WO2016073778A2 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Nirmidas Biotech, Inc. Metal composites for enhanced imaging
CN107208091A (zh) 2014-11-11 2017-09-26 雅培分子公司 杂交探针和方法
AU2015346514B2 (en) 2014-11-11 2021-04-08 Illumina, Inc. Polynucleotide amplification using CRISPR-Cas systems
US10246701B2 (en) 2014-11-14 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture
US11789906B2 (en) 2014-11-19 2023-10-17 Arc Bio, Llc Systems and methods for genomic manipulations and analysis
US10233490B2 (en) 2014-11-21 2019-03-19 Metabiotech Corporation Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations
WO2016086029A1 (en) 2014-11-25 2016-06-02 Adaptive Biotechnologies Corporation Characterization of adaptive immune response to vaccination or infection using immune repertoire sequencing
WO2016090266A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Amyris, Inc. High-throughput sequencing of polynucleotides
CA3010579A1 (en) 2015-01-06 2016-07-14 Good Start Genetics, Inc. Screening for structural variants
EP3244992B1 (en) 2015-01-12 2023-03-08 10X Genomics, Inc. Processes for barcoding nucleic acids
JP2018508852A (ja) 2015-01-13 2018-03-29 １０エックス ゲノミクス，インコーポレイテッド 構造的変異及び相化情報を視覚化するシステム及び方法
WO2016126882A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
CA2975855A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Compositions and methods for synthetic gene assembly
MX2017010142A (es) 2015-02-09 2017-12-11 10X Genomics Inc Sistemas y metodos para determinar variacion estructural y ajuste de fases con datos de recuperacion de variantes.
WO2016133764A1 (en) 2015-02-17 2016-08-25 Complete Genomics, Inc. Dna sequencing using controlled strand displacement
US10208339B2 (en) 2015-02-19 2019-02-19 Takara Bio Usa, Inc. Systems and methods for whole genome amplification
US10641772B2 (en) 2015-02-20 2020-05-05 Takara Bio Usa, Inc. Method for rapid accurate dispensing, visualization and analysis of single cells
EP3262407B1 (en) 2015-02-24 2023-08-30 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
BR112017018054A2 (pt) 2015-02-24 2018-07-24 10X Genomics Inc métodos para a cobertura de sequências de ácidos nucleicos direcionadas
EP3262196B1 (en) 2015-02-24 2020-12-09 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for determining hla status using immune repertoire sequencing
EP3274692B1 (en) 2015-03-24 2022-08-10 Illumina, Inc. Methods for imaging samples for biological or chemical analysis
CN107532205B (zh) 2015-03-31 2021-06-08 伊卢米纳剑桥有限公司 模板的表面连环化
WO2016161273A1 (en) 2015-04-01 2016-10-06 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of identifying human compatible t cell receptors specific for an antigenic target
DK3901281T3 (da) 2015-04-10 2023-01-23 Spatial Transcriptomics Ab Rumligt adskilt, multipleks nukleinsyreanalyse af biologiske prøver
KR20170136555A (ko) 2015-04-15 2017-12-11 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 Lna-기반 돌연변이체 농축 차세대 서열분석 검정
US9981239B2 (en) 2015-04-21 2018-05-29 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
US11085073B2 (en) 2015-04-24 2021-08-10 Qiagen Gmbh Method for immobilizing a nucleic acid molecule on a solid support
AU2016252998B2 (en) * 2015-04-24 2021-11-04 Atila Biosystems Incorporated Amplification with primers of limited nucleotide composition
WO2016170179A1 (en) 2015-04-24 2016-10-27 Qiagen Gmbh Method for immobilizing a nucleic acid molecule on solid support
US10844428B2 (en) 2015-04-28 2020-11-24 Illumina, Inc. Error suppression in sequenced DNA fragments using redundant reads with unique molecular indices (UMIS)
JP2018518157A (ja) 2015-05-11 2018-07-12 イラミーナ インコーポレーテッド 治療薬剤の発見および分析のためのプラットフォーム
US11479812B2 (en) 2015-05-11 2022-10-25 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
US10395759B2 (en) * 2015-05-18 2019-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for copy number variant detection
CN107532218A (zh) * 2015-05-18 2018-01-02 10X基因组学有限公司 稳定化还原剂及其使用方法
GB201508858D0 (en) 2015-05-22 2015-07-01 Illumina Cambridge Ltd Polymethine compounds with long stokes shifts and their use as fluorescent labels
CA2987397C (en) 2015-05-29 2022-03-01 Illumina, Inc. Sample carrier and assay system for conducting designated reactions
US11274333B2 (en) 2015-05-29 2022-03-15 Molecular Cloning Laboratories (MCLAB) LLC Compositions and methods for preparing sequencing libraries
EP3303614B1 (en) 2015-05-29 2020-03-11 Illumina Cambridge Limited Enhanced utilization of surface primers in clusters
US10808282B2 (en) 2015-07-07 2020-10-20 Illumina, Inc. Selective surface patterning via nanoimprinting
CN108184327A (zh) 2015-07-14 2018-06-19 雅培分子公司 用于鉴定耐药性结核的组合物和方法
EP3322805B1 (en) 2015-07-14 2021-10-20 Abbott Molecular Inc. Purification of nucleic acids using copper-titanium oxides or magnesium-titanium oxides
EP3325648B1 (en) 2015-07-17 2023-03-29 Illumina, Inc. Polymer sheets for sequencing applications
WO2017015543A1 (en) 2015-07-23 2017-01-26 Asuragen, Inc. Methods, compositions, kits, and uses for analysis of nucleic acids comprising repeating a/t-rich segments
IL255445B (en) 2015-07-30 2022-07-01 Illumina Inc Removal of orthogonal blocking of nucleotides
JP6946292B2 (ja) 2015-08-06 2021-10-06 エイアールシー バイオ リミテッド ライアビリティ カンパニー ゲノム分析のためのシステムおよび方法
WO2017027653A1 (en) 2015-08-11 2017-02-16 The Johns Hopkins University Assaying ovarian cyst fluid
WO2017034868A1 (en) 2015-08-24 2017-03-02 Illumina, Inc. In-line pressure accumulator and flow-control system for biological or chemical assays
CN107921432A (zh) 2015-09-02 2018-04-17 伊卢米纳剑桥有限公司 改善流控系统中的液滴操作的系统和方法
US20200231947A1 (en) 2015-09-09 2020-07-23 Qiagen Gmbh Polymerase enzyme
WO2017044843A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 The General Hospital Corporation Full interrogation of nuclease dsbs and sequencing (find-seq)
GB2557529A (en) 2015-09-18 2018-06-20 Twist Bioscience Corp Oligonucleic acid variant libraries and synthesis thereof
WO2017053450A1 (en) 2015-09-22 2017-03-30 Twist Bioscience Corporation Flexible substrates for nucleic acid synthesis
GB201516987D0 (en) 2015-09-25 2015-11-11 Illumina Cambridge Ltd Polymethine compounds and their use as fluorescent labels
AU2016331185A1 (en) 2015-09-30 2018-04-26 The General Hospital Corporation Comprehensive in vitro reporting of cleavage events by sequencing (CIRCLE-seq)
US10253352B2 (en) 2015-11-17 2019-04-09 Omniome, Inc. Methods for determining sequence profiles
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
WO2017095958A1 (en) 2015-12-01 2017-06-08 Twist Bioscience Corporation Functionalized surfaces and preparation thereof
SG10202108763UA (en) 2015-12-04 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods and compositions for nucleic acid analysis
KR20190090081A (ko) 2015-12-07 2019-07-31 지머젠 인코포레이티드 Htp 게놈 공학 플랫폼에 의한 미생물 균주 개량
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
BR112018011503A2 (pt) 2015-12-07 2018-12-04 Zymergen Inc promotores da corynebacterium glutamicum
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
EP3400298B1 (en) 2016-01-08 2024-03-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiple beads per droplet resolution
CN108474745A (zh) 2016-01-11 2018-08-31 伊鲁米那股份有限公司 具有显微荧光计、流体系统和流动池闩锁夹持模块的检测装置
US10626390B2 (en) 2016-02-08 2020-04-21 RGENE, Inc. Multiple ligase compositions, systems, and methods
SG11201806757XA (en) 2016-02-11 2018-09-27 10X Genomics Inc Systems, methods, and media for de novo assembly of whole genome sequence data
US20190062827A1 (en) 2016-03-14 2019-02-28 RGENE, Inc. HYPER-THERMOSTABLE LYSINE-MUTANT ssDNA/RNA LIGASES
EP4071250A1 (en) 2016-03-22 2022-10-12 Myriad Women's Health, Inc. Combinatorial dna screening
PL3377226T3 (pl) 2016-03-28 2021-07-26 Illumina, Inc. Wielopłaszczyznowe mikromacierze
WO2017180909A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Nextgen Jane, Inc. Sample collection and preservation devices, systems and methods
US11542544B2 (en) 2016-05-11 2023-01-03 Illumina, Inc. Polynucleotide enrichment and amplification using CRISPR-Cas or Argonaute systems
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
US11118233B2 (en) 2016-05-18 2021-09-14 The University Of Chicago BTK mutation and ibrutinib resistance
JP6824290B2 (ja) 2016-05-18 2021-02-03 イルミナ インコーポレイテッド パターン化された疎水性表面を用いる自己組織化パターニング
US11299783B2 (en) 2016-05-27 2022-04-12 Personalis, Inc. Methods and systems for genetic analysis
EP3464628B1 (en) 2016-06-06 2024-01-31 RedVault Biosciences, LP Target reporter constructs and uses thereof
WO2017214557A1 (en) 2016-06-10 2017-12-14 Counsyl, Inc. Nucleic acid sequencing adapters and uses thereof
WO2017218777A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 California Institute Of Technology Nucleic acid reactions and related methods and compositions
JP2019519241A (ja) 2016-06-30 2019-07-11 ザイマージェン インコーポレイテッド グルコース透過酵素ライブラリーを生成するための方法およびその使用
WO2018005655A2 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Zymergen Inc. Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof
WO2018013509A1 (en) 2016-07-11 2018-01-18 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Compositions and methods for diagnosing and treating arrhythmias
WO2018013558A1 (en) 2016-07-12 2018-01-18 Life Technologies Corporation Compositions and methods for detecting nucleic acid regions
EP3487616B1 (en) 2016-07-21 2023-08-09 Takara Bio USA, Inc. Multi-z imaging of wells of multi-well devices and liquid dispensing into the wells
JP7155021B2 (ja) 2016-07-22 2022-10-18 オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニヴァーシティ 単細胞全ゲノムライブラリおよびそれを作成する組み合わせインデックス付加方法
AU2017315252B2 (en) 2016-08-22 2023-03-16 Biolumic Limited System, device and methods of seed treatment
CN109996876A (zh) 2016-08-22 2019-07-09 特韦斯特生物科学公司 从头合成的核酸文库
WO2018042251A1 (en) 2016-08-29 2018-03-08 Oslo Universitetssykehus Hf Chip-seq assays
US10428325B1 (en) 2016-09-21 2019-10-01 Adaptive Biotechnologies Corporation Identification of antigen-specific B cell receptors
WO2018057526A2 (en) 2016-09-21 2018-03-29 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
WO2018064116A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Illumina, Inc. Methods and systems for data compression
US10385214B2 (en) 2016-09-30 2019-08-20 Illumina Cambridge Limited Fluorescent dyes and their uses as biomarkers
WO2018067517A1 (en) 2016-10-04 2018-04-12 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
MY194951A (en) 2016-10-14 2022-12-28 Illumina Inc Cartridge assembly
BR112019009949A2 (pt) 2016-11-16 2019-08-20 Illumina Inc método implantado por computador para validar chamadas de variante e sistema para validar chamadas de variante
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
AU2017378492B2 (en) 2016-12-16 2022-06-16 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
WO2018118971A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet tagging contiguity preserved tagmented dna
CA3025880C (en) 2016-12-22 2020-01-28 Illumina Cambridge Limited Coumarin compounds and their uses as fluorescent labels
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
PT3565905T (pt) 2017-01-04 2022-08-02 Mgi Tech Co Ltd Sequenciação de ácidos nucleicos utilizando reagentes de afinidade
GB201704754D0 (en) 2017-01-05 2017-05-10 Illumina Inc Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
CA3050247A1 (en) 2017-01-18 2018-07-26 Illumina, Inc. Methods and systems for generation and error-correction of unique molecular index sets with heterogeneous molecular lengths
WO2018140966A1 (en) 2017-01-30 2018-08-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
DK3354746T3 (da) 2017-01-30 2019-09-02 Gmi Gregor Mendel Inst Fuer Molekulare Pflanzenbiologie Gmbh Nye spike-in-nukleotider til normalisering af sekvensdata
WO2018144217A1 (en) 2017-01-31 2018-08-09 Counsyl, Inc. Methods and compositions for enrichment of target polynucleotides
WO2018144216A1 (en) 2017-01-31 2018-08-09 Counsyl, Inc. Methods and compositions for enrichment of target polynucleotides
US10995333B2 (en) 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
WO2018148727A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from 9°n
US20200002689A1 (en) 2017-02-13 2020-01-02 Qiagen Sciences, Llc Polymerase enzyme from 9°n
WO2018148723A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from pyrococcus abyssi
WO2018148726A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from phage t4
WO2018148724A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from pyrococcus furiosus
WO2018152162A1 (en) 2017-02-15 2018-08-23 Omniome, Inc. Distinguishing sequences by detecting polymerase dissociation
US11550939B2 (en) 2017-02-22 2023-01-10 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage using enzymatic bioencryption
CA3056388A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
CN110446787A (zh) 2017-03-24 2019-11-12 生物辐射实验室股份有限公司 通用发夹引物
US11584958B2 (en) 2017-03-31 2023-02-21 Grail, Llc Library preparation and use thereof for sequencing based error correction and/or variant identification
WO2018187013A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Omniome, Inc. Fluidic apparatus and methods useful for chemical and biological reactions
AU2018259202B2 (en) 2017-04-23 2022-03-24 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
ES2937929T3 (es) 2017-04-23 2023-04-03 Illumina Inc Composiciones y métodos para mejorar la identificación de muestras en bibliotecas de ácido nucleico indexadas
WO2018197950A1 (en) 2017-04-23 2018-11-01 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
DK3872187T3 (da) 2017-04-23 2022-12-05 Illumina Cambridge Ltd Sammensætninger og fremgangsmåder til forbedring af prøveidentificering i indekserede nukleinsyrebiblioteker
US10161003B2 (en) 2017-04-25 2018-12-25 Omniome, Inc. Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency
US11028435B2 (en) 2017-05-01 2021-06-08 Illumina, Inc. Optimal index sequences for multiplex massively parallel sequencing
SG11201910070PA (en) 2017-05-08 2019-11-28 Illumina Inc Universal short adapters for indexing of polynucleotide samples
WO2018213803A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 Neon Therapeutics, Inc. Immunogenic neoantigen identification
WO2018213774A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 10X Genomics, Inc. Systems and methods for analyzing datasets
KR20200010285A (ko) 2017-05-19 2020-01-30 지머젠 인코포레이티드 증가된 nadph를 유도하는 생합성 경로의 게놈 공학
SG11201901822QA (en) 2017-05-26 2019-03-28 10X Genomics Inc Single cell analysis of transposase accessible chromatin
US10844372B2 (en) 2017-05-26 2020-11-24 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
JP7350659B2 (ja) 2017-06-06 2023-09-26 ザイマージェン インコーポレイテッド Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａの改良のためのハイスループット（ＨＴＰ）ゲノム操作プラットフォーム
WO2018226880A1 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Zymergen Inc. A htp genomic engineering platform for improving escherichia coli
EP3635112A2 (en) 2017-06-06 2020-04-15 Zymergen, Inc. A htp genomic engineering platform for improving fungal strains
EP3635111A1 (en) 2017-06-06 2020-04-15 Zymergen, Inc. High throughput transposon mutagenesis
DK3635136T3 (da) 2017-06-07 2022-01-10 Univ Oregon Health & Science Enkeltcelle-helgenombiblioteker til methyleringssekvensering
AU2018279728B2 (en) 2017-06-08 2023-07-20 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and compositions for identifying epitopes
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
WO2018231872A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
WO2018236918A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. MDA USING A BALL OLIGONUCLEOTIDE
CA3068034A1 (en) 2017-06-26 2019-01-03 Universitat Fur Bodenkultur Wien Novel biomarkers for detecting senescent cells
GB201711219D0 (en) 2017-07-12 2017-08-23 Illumina Cambridge Ltd Short pendant arm linkers for nucleotides in sequencing applications
AU2018302034B2 (en) 2017-07-18 2021-05-20 Pacific Biosciences Of California, Inc. Method of chemically modifying plastic surfaces
WO2019027767A1 (en) 2017-07-31 2019-02-07 Illumina Inc. SEQUENCING SYSTEM COMPRISING AGGREGATION OF MULTIPLEXED BIOLOGICAL SAMPLES
SG11201911869XA (en) 2017-08-01 2020-01-30 Illumina Inc Spatial indexing of genetic material and library preparation using hydrogel beads and flow cells
HUE061474T2 (hu) 2017-08-01 2023-07-28 Mgi Tech Co Ltd Nukleinsav-szekvenálási eljárás
KR102480894B1 (ko) 2017-08-01 2022-12-23 일루미나, 인코포레이티드 뉴클레오티드 서열분석용 하이드로겔 비드
AU2018313286A1 (en) 2017-08-11 2020-03-12 Atila Biosystems Incorporated Digital amplification with primers of limited nucleotide composition
CN114563419A (zh) 2017-08-15 2022-05-31 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于检测化学和生物分析物的扫描装置和方法
WO2019038594A2 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Biolumic Limited TRANSGENIC PLANTS WITH HIGH GROWTH AND HIGH RUSTICITY
SG11202002194UA (en) 2017-09-11 2020-04-29 Twist Bioscience Corp Gpcr binding proteins and synthesis thereof
US11447818B2 (en) 2017-09-15 2022-09-20 Illumina, Inc. Universal short adapters with variable length non-random unique molecular identifiers
SG11202002381TA (en) 2017-09-20 2020-04-29 Guardant Health Inc Methods and systems for differentiating somatic and germline variants
US10837047B2 (en) 2017-10-04 2020-11-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
EP3691662A4 (en) 2017-10-06 2021-05-12 The University of Chicago T-LYMPHOCYTES SCREENING FOR CANCER-SPECIFIC ANTIGENS
BR112019027609A2 (pt) 2017-10-16 2020-07-21 Illumina, Inc. método implementado em rede neural de treinamento de um detector de sítio de splice que identifica sítios de splice em sequências genômicas, previsor de sítio de splice treinado e sistema
CN113627458A (zh) 2017-10-16 2021-11-09 因美纳有限公司 基于循环神经网络的变体致病性分类器
GB201716931D0 (en) 2017-10-16 2017-11-29 Illumina Cambridge Ltd New fluorescent compounds and their use as biomarkers
CA3079411C (en) 2017-10-19 2023-12-05 Omniome, Inc. Simultaneous background reduction and complex stabilization in binding assay workflows
US11099202B2 (en) 2017-10-20 2021-08-24 Tecan Genomics, Inc. Reagent delivery system
KR20240024357A (ko) 2017-10-20 2024-02-23 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 가열된 나노웰
WO2019084043A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS
EP3700672B1 (en) 2017-10-27 2022-12-28 10X Genomics, Inc. Methods for sample preparation and analysis
US10907205B2 (en) 2017-11-02 2021-02-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Transposase-based genomic analysis
CA3036161C (en) 2017-11-13 2023-03-28 The Multiple Myeloma Research Foundation, Inc. Integrated, molecular, omics, immunotherapy, metabolic, epigenetic, and clinical database
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
EP3714043A4 (en) 2017-11-22 2021-08-11 The Regents of The University of Michigan COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF CANCER
US11254980B1 (en) 2017-11-29 2022-02-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements
WO2019108851A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis
WO2019136058A1 (en) 2018-01-02 2019-07-11 The Regents Of The University Of Michigan Multi-droplet capture
KR20200106067A (ko) 2018-01-04 2020-09-10 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 Dna 기반 디지털 정보 저장
EP3913358B1 (en) 2018-01-08 2023-09-06 Illumina Inc High-throughput sequencing with semiconductor-based detection
US11378544B2 (en) 2018-01-08 2022-07-05 Illumina, Inc. High-throughput sequencing with semiconductor-based detection
NZ759659A (en) 2018-01-15 2022-07-01 Illumina Inc Deep learning-based variant classifier
WO2019152539A1 (en) 2018-01-30 2019-08-08 Optical Biosystems, Inc. Method for detecting particles using structured illumination
EP4324962A2 (en) 2018-01-31 2024-02-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for deconvoluting partition barcodes
EP3746566A1 (en) 2018-01-31 2020-12-09 Dovetail Genomics, LLC Sample prep for dna linkage recovery
WO2019157529A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
WO2019160820A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Illumina, Inc. Dna sequencing using hydrogel beads
US11639928B2 (en) 2018-02-22 2023-05-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
JP2021518128A (ja) 2018-03-20 2021-08-02 ザイマージェン インコーポレイテッド チャイニーズハムスター卵巣細胞の遺伝子操作のためのｈｔｐプラットフォーム
JP7134186B2 (ja) 2018-03-22 2022-09-09 イルミナ インコーポレイテッド Ｒｎａおよびｄｎａからの核酸ライブラリーの作製
JP6974504B2 (ja) 2018-04-02 2021-12-01 イルミナ インコーポレイテッド 配列に基づく遺伝子試験のための対照を作製するための組成物及び方法
CN112166199A (zh) 2018-04-02 2021-01-01 普罗格尼迪公司 用于对核酸分子进行计数的方法、系统和组合物
SG11202009889VA (en) 2018-04-06 2020-11-27 10X Genomics Inc Systems and methods for quality control in single cell processing
EP3553182A1 (en) 2018-04-11 2019-10-16 Université de Bourgogne Detection method of somatic genetic anomalies, combination of capture probes and kit of detection
WO2019200338A1 (en) 2018-04-12 2019-10-17 Illumina, Inc. Variant classifier based on deep neural networks
US11512002B2 (en) 2018-04-18 2022-11-29 University Of Virginia Patent Foundation Silica materials and methods of making thereof
CA3097583A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 Omniome, Inc. Improving accuracy of base calls in nucleic acid sequencing methods
US11359226B2 (en) 2018-04-20 2022-06-14 Illumina, Inc. Contiguity particle formation and methods of use
US10400272B1 (en) 2018-04-26 2019-09-03 Omniome, Inc. Methods and compositions for stabilizing nucleic acid-nucleotide-polymerase complexes
WO2019213619A1 (en) 2018-05-04 2019-11-07 Abbott Laboratories Hbv diagnostic, prognostic, and therapeutic methods and products
WO2019222264A1 (en) 2018-05-15 2019-11-21 Illumina, Inc. Compositions and methods for chemical cleavage and deprotection of surface-bound oligonucleotides
EP3814497A4 (en) 2018-05-18 2022-03-02 Twist Bioscience Corporation POLYNUCLEOTIDES, REAGENTS, AND METHODS FOR NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION
US10801064B2 (en) 2018-05-31 2020-10-13 Personalis, Inc. Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples
US11814750B2 (en) 2018-05-31 2023-11-14 Personalis, Inc. Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples
US11339428B2 (en) 2018-05-31 2022-05-24 Pacific Biosciences Of California, Inc. Increased signal to noise in nucleic acid sequencing
EP4269618A3 (en) 2018-06-04 2024-01-10 Illumina, Inc. Methods of making high-throughput single-cell transcriptome libraries
WO2019236478A1 (en) 2018-06-04 2019-12-12 Guardant Health, Inc. Methods and systems for determining the cellular origin of cell-free nucleic acids
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
US11525159B2 (en) 2018-07-03 2022-12-13 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
US20200251183A1 (en) 2018-07-11 2020-08-06 Illumina, Inc. Deep Learning-Based Framework for Identifying Sequence Patterns that Cause Sequence-Specific Errors (SSEs)
SG11202100344WA (en) 2018-07-23 2021-02-25 Guardant Health Inc Methods and systems for adjusting tumor mutational burden by tumor fraction and coverage
CA3107165A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Omniome, Inc. Serial formation of ternary complex species
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
BR112021002779A2 (pt) 2018-08-15 2021-05-04 Illumina, Inc. composições e métodos para melhorar o enriquecimento de bibliotecas
EP4249651A3 (en) 2018-08-20 2023-10-18 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleotide sequence generation by barcode bead-colocalization in partitions
WO2020047004A2 (en) 2018-08-28 2020-03-05 10X Genomics, Inc. Methods of generating an array
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
US20200071754A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting contamination between samples
SG11202101400UA (en) 2018-08-31 2021-03-30 Guardant Health Inc Microsatellite instability detection in cell-free dna
US20200075124A1 (en) 2018-09-04 2020-03-05 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting allelic imbalance in cell-free nucleic acid samples
EP3814533B1 (en) 2018-09-20 2021-08-11 TAmiRNA GmbH Micro-rna signatures for the prediction of liver dysfunction
SG10202108013QA (en) 2018-10-15 2021-09-29 Illumina Inc Deep learning-based techniques for pre-training deep convolutional neural networks
AU2019364418A1 (en) 2018-10-25 2021-04-22 Illumina, Inc. Methods and compositions for identifying ligands on arrays using indexes and barcodes
AU2019364545A1 (en) 2018-10-26 2021-04-29 Illumina, Inc. Modulating polymer beads for DNA processing
CA3116176A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Guardant Health, Inc. Methods, compositions and systems for calibrating epigenetic partitioning assays
US10876148B2 (en) 2018-11-14 2020-12-29 Element Biosciences, Inc. De novo surface preparation and uses thereof
US10768173B1 (en) * 2019-09-06 2020-09-08 Element Biosciences, Inc. Multivalent binding composition for nucleic acid analysis
US10704094B1 (en) 2018-11-14 2020-07-07 Element Biosciences, Inc. Multipart reagents having increased avidity for polymerase binding
US20240011086A1 (en) 2018-11-15 2024-01-11 Omniome, Inc. Electronic detection of nucleic acid structure
CA3113091A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Illumina, Inc. Analysis of multiple analytes using a single assay
US10710076B2 (en) 2018-12-04 2020-07-14 Omniome, Inc. Mixed-phase fluids for nucleic acid sequencing and other analytical assays
JP2022511207A (ja) 2018-12-05 2022-01-31 イルミナ ケンブリッジ リミテッド ブリッジ増幅によるクラスタ生成のための方法および組成物
CN113366120A (zh) * 2018-12-07 2021-09-07 深圳华大生命科学研究院 纳米孔测序方法
US11459607B1 (en) 2018-12-10 2022-10-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes
KR20210103931A (ko) 2018-12-14 2021-08-24 일루미나 케임브리지 리미티드 서열분석 동안 비표지된 뉴클레오타이드에 의한 페이싱 감소
WO2020126593A1 (en) 2018-12-17 2020-06-25 Illumina Cambridge Limited Compositions for use in polyunucleotide sequencing
SG11202012758WA (en) 2018-12-17 2021-01-28 Illumina Cambridge Ltd Primer oligonucleotide for sequencing
AU2019411272A1 (en) 2018-12-18 2021-01-07 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for paired end sequencing using a single surface primer
PL3899037T3 (pl) 2018-12-19 2024-04-08 Illumina, Inc. Sposoby poprawy priorytetu klonalności klastrów polinukleotydowych
JP2022514010A (ja) 2018-12-20 2022-02-09 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド 核酸分子の回収率を改善するための方法、組成物、およびシステム
CN113227348A (zh) 2018-12-20 2021-08-06 欧姆尼欧美公司 用于分析核酸和其他分析物的温度控制
US11293061B2 (en) 2018-12-26 2022-04-05 Illumina Cambridge Limited Sequencing methods using nucleotides with 3′ AOM blocking group
WO2020142768A1 (en) 2019-01-04 2020-07-09 Northwestern University Storing temporal data into dna
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
EP3908678A1 (en) 2019-01-10 2021-11-17 Iovance Biotherapeutics, Inc. System and methods for monitoring adoptive cell therapy clonality and persistence
AU2020216438A1 (en) 2019-01-31 2021-07-29 Guardant Health, Inc. Compositions and methods for isolating cell-free DNA
SG11202108788TA (en) 2019-02-12 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for processing nucleic acid molecules
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
US11467153B2 (en) 2019-02-12 2022-10-11 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
US11499189B2 (en) 2019-02-14 2022-11-15 Pacific Biosciences Of California, Inc. Mitigating adverse impacts of detection systems on nucleic acids and other biological analytes
WO2020172444A1 (en) 2019-02-20 2020-08-27 Omniome, Inc. Scanning apparatus and methods for detecting chemical and biological analytes
US11655499B1 (en) 2019-02-25 2023-05-23 10X Genomics, Inc. Detection of sequence elements in nucleic acid molecules
CA3131689A1 (en) 2019-02-26 2020-09-03 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for glp1 receptor
CN113785057A (zh) 2019-02-26 2021-12-10 特韦斯特生物科学公司 用于抗体优化的变异核酸文库
WO2020176659A1 (en) 2019-02-27 2020-09-03 Guardant Health, Inc. Methods and systems for determining the cellular origin of cell-free dna
CN112654681B (zh) 2019-03-01 2023-01-06 伊卢米纳剑桥有限公司 环外胺取代的香豆素化合物及其作为荧光标记物的用途
BR112021006234A2 (pt) 2019-03-01 2021-09-28 Illumina, Inc. Bibliotecas de células únicas e núcleos únicos de alto rendimento e métodos de preparo e uso
CA3103636A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Illumina Cambridge Limited Tertiary amine substituted coumarin compounds and their uses as fluorescent labels
NL2023327B1 (en) 2019-03-01 2020-09-17 Illumina Inc Multiplexed fluorescent detection of analytes
WO2020178231A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Illumina, Inc. Multiplexed fluorescent detection of analytes
WO2020185791A1 (en) 2019-03-11 2020-09-17 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing optically tagged beads
NL2023310B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Training data generation for artificial intelligence-based sequencing
NL2023316B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Artificial intelligence-based sequencing
US11347965B2 (en) 2019-03-21 2022-05-31 Illumina, Inc. Training data generation for artificial intelligence-based sequencing
WO2020205296A1 (en) 2019-03-21 2020-10-08 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata
NL2023311B9 (en) 2019-03-21 2021-03-12 Illumina Inc Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata
US11210554B2 (en) 2019-03-21 2021-12-28 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata
US11421271B2 (en) 2019-03-28 2022-08-23 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for nucleic acid sequencing using photoswitchable labels
WO2020206170A1 (en) 2019-04-02 2020-10-08 Progenity, Inc. Methods, systems, and compositions for counting nucleic acid molecules
US11609208B2 (en) 2019-04-12 2023-03-21 Western Digital Technologies, Inc. Devices and methods for molecule detection based on thermal stabilities of magnetic nanoparticles
US11579217B2 (en) 2019-04-12 2023-02-14 Western Digital Technologies, Inc. Devices and methods for frequency- and phase-based detection of magnetically-labeled molecules using spin torque oscillator (STO) sensors
US11738336B2 (en) 2019-04-12 2023-08-29 Western Digital Technologies, Inc. Spin torque oscillator (STO) sensors used in nucleic acid sequencing arrays and detection schemes for nucleic acid sequencing
US11327073B2 (en) 2019-04-12 2022-05-10 Western Digital Technologies, Inc. Thermal sensor array for molecule detection and related detection schemes
US11112468B2 (en) 2019-04-12 2021-09-07 Western Digital Technologies, Inc. Magnetoresistive sensor array for molecule detection and related detection schemes
US11593649B2 (en) 2019-05-16 2023-02-28 Illumina, Inc. Base calling using convolutions
US11423306B2 (en) 2019-05-16 2022-08-23 Illumina, Inc. Systems and devices for characterization and performance analysis of pixel-based sequencing
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
US11939636B2 (en) 2019-05-31 2024-03-26 Guardant Health, Inc. Methods and systems for improving patient monitoring after surgery
WO2020252186A1 (en) 2019-06-11 2020-12-17 Omniome, Inc. Calibrated focus sensing
AU2020298294A1 (en) 2019-06-21 2022-02-17 Twist Bioscience Corporation Barcode-based nucleic acid sequence assembly
US20220154173A1 (en) 2019-07-12 2022-05-19 Iiiumina Cambridge Limited Compositions and Methods for Preparing Nucleic Acid Sequencing Libraries Using CRISPR/CAS9 Immobilized on a Solid Support
WO2021011803A1 (en) 2019-07-16 2021-01-21 Omniome, Inc. Synthetic nucleic acids having non-natural structures
US10656368B1 (en) 2019-07-24 2020-05-19 Omniome, Inc. Method and system for biological imaging using a wide field objective lens
TW202124406A (zh) 2019-09-10 2021-07-01 美商歐姆尼歐美公司 核苷酸之可逆修飾
US11208682B2 (en) 2019-09-13 2021-12-28 Western Digital Technologies, Inc. Enhanced optical detection for nucleic acid sequencing using thermally-dependent fluorophore tags
JP2022549048A (ja) 2019-09-20 2022-11-24 イルミナ インコーポレイテッド インデックス及びバーコードを使用してアレイ上のリガンドを識別するための方法及び組成物
US11111507B2 (en) 2019-09-23 2021-09-07 Zymergen Inc. Method for counterselection in microorganisms
US11287422B2 (en) 2019-09-23 2022-03-29 Element Biosciences, Inc. Multivalent binding composition for nucleic acid analysis
EP3798319A1 (en) 2019-09-30 2021-03-31 Diagenode S.A. An improved diagnostic and/or sequencing method and kit
EP4045683A1 (en) 2019-10-18 2022-08-24 Omniome, Inc. Methods and compositions for capping nucleic acids
ES2938896T3 (es) 2019-10-21 2023-04-17 Univ Freiburg Albert Ludwigs Un ensayo in vitro verdaderamente imparcial para perfilar la actividad fuera de objetivo de una o más nucleasas programables específicas de objetivo en células (ABNOBA-SEQ)
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
EP4025711A2 (en) 2019-11-08 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
US11747329B2 (en) 2019-11-22 2023-09-05 Western Digital Technologies, Inc. Magnetic gradient concentrator/reluctance detector for molecule detection
EP4065725A1 (en) 2019-11-26 2022-10-05 Guardant Health, Inc. Methods, compositions and systems for improving the binding of methylated polynucleotides
CA3157457A1 (en) 2019-11-27 2021-06-03 Xiaolin Wu Cyclooctatetraene containing dyes and compositions
CN114008199A (zh) 2019-12-19 2022-02-01 伊路敏纳公司 高通量单细胞文库及其制备和使用方法
US11498078B2 (en) 2019-12-23 2022-11-15 Singular Genomics Systems, Inc. Flow cell receiver and methods of use
US11747262B2 (en) 2019-12-23 2023-09-05 Singular Genomics Systems, Inc. Flow cell carrier and methods of use
US20210189483A1 (en) 2019-12-23 2021-06-24 Mgi Tech Co. Ltd. Controlled strand-displacement for paired end sequencing
ES2946357T3 (es) 2019-12-23 2023-07-17 10X Genomics Inc Métodos para el análisis espacial usando ligación con molde de ARN
CA3166578A1 (en) 2019-12-31 2021-07-08 Singular Genomics Systems, Inc. Polynucleotide barcodes for long read sequencing
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
WO2021152586A1 (en) 2020-01-30 2021-08-05 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of analyzing microbiome, immunoglobulin profile and physiological state
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
CN115243792A (zh) 2020-02-04 2022-10-25 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 流通池及其制造和使用方法
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
JP2023513314A (ja) 2020-02-13 2023-03-30 ザイマージェン インコーポレイテッド メタゲノムライブラリーおよび天然物発見プラットフォーム
JPWO2021162028A1 (zh) * 2020-02-14 2021-08-19
EP4107735A2 (en) 2020-02-20 2022-12-28 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based many-to-many base calling
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
ES2965266T3 (es) 2020-03-09 2024-04-11 Illumina Inc Métodos para la secuenciación de polinucleótidos
JP2023517156A (ja) 2020-03-09 2023-04-24 イルミナ，インコーポレイテッド 核酸配列決定における改善
WO2021214766A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of diagnosing viral infections and vaccines thereto
EP4242325A3 (en) 2020-04-22 2023-10-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
EP4143338A1 (en) 2020-04-30 2023-03-08 Guardant Health, Inc. Methods for sequence determination using partitioned nucleic acids
US11188778B1 (en) 2020-05-05 2021-11-30 Illumina, Inc. Equalization-based image processing and spatial crosstalk attenuator
CN115836135A (zh) 2020-05-05 2023-03-21 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于修饰聚合酶-核酸复合物的组合物和方法
US20230203592A1 (en) 2020-05-05 2023-06-29 Akershus Universitetssykehus Hf Compositions and methods for characterizing bowel cancer
CA3177286A1 (en) 2020-05-12 2021-11-18 Illumina Inc. Generating nucleic acids with modified bases using recombinant terminal deoxynucleotidyl transferase
US11851700B1 (en) 2020-05-13 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules
EP4150113A1 (en) 2020-05-14 2023-03-22 Guardant Health, Inc. Homologous recombination repair deficiency detection
WO2021237087A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021236929A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
EP4158054A1 (en) 2020-06-02 2023-04-05 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
EP4025692A2 (en) 2020-06-02 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021252617A1 (en) 2020-06-09 2021-12-16 Illumina, Inc. Methods for increasing yield of sequencing libraries
EP4165207A1 (en) 2020-06-10 2023-04-19 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
MA58991A1 (fr) 2020-06-22 2023-03-31 Illumina Cambridge Ltd Nucléosides et nucléotides avec groupe de blocage acétal 3'
WO2021263111A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
CA3177299A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Illumina Inc. Catalytically controlled sequencing by synthesis to produce scarless dna
MX2022014718A (es) 2020-07-02 2023-03-06 Illumina Inc Un metodo para calibrar la eficiencia de siembra de genotecas de ácidos nucleicos en celdas de flujo.
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
MX2023000345A (es) 2020-07-08 2023-02-13 Illumina Inc Globulos como portadores de transposomas.
WO2023282916A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Guardant Health, Inc. Methods of detecting genomic rearrangements using cell free nucleic acids
EP4153606A2 (en) 2020-07-13 2023-03-29 Singular Genomics Systems, Inc. Methods of sequencing complementary polynucleotides
US11946044B2 (en) 2020-07-30 2024-04-02 Guardant Health, Inc. Methods for isolating cell-free DNA
KR20230041725A (ko) 2020-08-06 2023-03-24 일루미나, 인코포레이티드 비드-연결된 트랜스포좀을 사용한 rna 및 dna 시퀀싱 라이브러리의 제작
EP4193363A1 (en) 2020-08-07 2023-06-14 Oxford Nanopore Technologies plc Methods of identifying nucleic acid barcodes
IL299783A (en) 2020-08-18 2023-03-01 Illumina Inc Sequence-Specific Targeted Transposition, Selection and Sorting of Nucleic Acids
WO2022046947A1 (en) 2020-08-25 2022-03-03 Guardant Health, Inc. Methods and systems for predicting an origin of a variant
WO2022053610A1 (en) 2020-09-11 2022-03-17 Illumina Cambridge Limited Methods of enriching a target sequence from a sequencing library using hairpin adaptors
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
JP2023544721A (ja) 2020-09-30 2023-10-25 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド 分配およびメチル化依存性ヌクレアーゼを使用してｄｎａを解析するための組成物および方法
KR20230091116A (ko) 2020-10-21 2023-06-22 일루미나, 인코포레이티드 다수의 삽입체를 포함하는 시퀀싱 주형, 및 시퀀싱 처리량을 개선하기 위한 조성물 및 방법
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
US20220195516A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Methods, systems and compositions for nucleic acid sequencing
EP4121555A1 (en) 2020-12-21 2023-01-25 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
US20220195518A1 (en) 2020-12-22 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for nucleic acid sequencing
WO2022140629A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Guardant Health, Inc. Methods and systems for analyzing methylated polynucleotides
WO2022165188A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Illumina, Inc. Methods, compositions and kits to improve seeding efficiency of flow cells with polynucleotides
CA3208854A1 (en) 2021-02-04 2022-08-11 Illumina, Inc. Long indexed-linked read generation on transposome bound beads
US11486001B2 (en) 2021-02-08 2022-11-01 Singular Genomics Systems, Inc. Methods and compositions for sequencing complementary polynucleotides
WO2022174054A1 (en) 2021-02-13 2022-08-18 The General Hospital Corporation Methods and compositions for in situ macromolecule detection and uses thereof
AU2022227563A1 (en) 2021-02-23 2023-08-24 10X Genomics, Inc. Probe-based analysis of nucleic acids and proteins
CA3210101A1 (en) 2021-03-05 2022-09-09 Katie Julia QUINN Methods and related aspects for analyzing molecular response
US20220344004A1 (en) 2021-03-09 2022-10-27 Guardant Health, Inc. Detecting the presence of a tumor based on off-target polynucleotide sequencing data
WO2022197754A1 (en) 2021-03-16 2022-09-22 Illumina Software, Inc. Neural network parameter quantization for base calling
AU2022238446A1 (en) 2021-03-18 2023-09-07 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
EP4314327A1 (en) 2021-03-22 2024-02-07 Illumina Cambridge Limited Methods for improving nucleic acid cluster clonality
IL307177A (en) 2021-03-29 2023-11-01 Illumina Inc Compounds and methods for assessing DNA damage in the library and normalizing amplicon size bias
KR20230161979A (ko) 2021-03-29 2023-11-28 일루미나, 인코포레이티드 개선된 라이브러리 제조 방법
IL307172A (en) 2021-03-30 2023-11-01 Illumina Inc Improved methods of isothermal complementary DNA and library preparation
WO2022212402A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Illumina, Inc. Methods of preparing directional tagmentation sequencing libraries using transposon-based technology with unique molecular identifiers for error correction
US20220336054A1 (en) 2021-04-15 2022-10-20 Illumina, Inc. Deep Convolutional Neural Networks to Predict Variant Pathogenicity using Three-Dimensional (3D) Protein Structures
KR20240009435A (ko) 2021-05-20 2024-01-22 일루미나, 인코포레이티드 합성에 의한 시퀀싱을 위한 조성물 및 방법
US20230016633A1 (en) 2021-06-15 2023-01-19 Illumina, Inc. Hydrogel-free surface functionalization for sequencing
US11859241B2 (en) 2021-06-17 2024-01-02 Element Biosciences, Inc. Compositions and methods for pairwise sequencing
US11535892B1 (en) 2021-06-17 2022-12-27 Element Biosciences, Inc. Compositions and methods for pairwise sequencing
EP4359555A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Illumina, Inc. Compositions, methods, kits, cartridges, and systems for sequencing reagents
WO2023278184A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Illumina, Inc. Methods and systems to correct crosstalk in illumination emitted from reaction sites
KR20240027608A (ko) 2021-06-29 2024-03-04 일루미나, 인코포레이티드 유기체 서열을 사용하여 훈련된 자체-학습 염기 호출자
US20230027409A1 (en) 2021-07-13 2023-01-26 Illumina, Inc. Methods and systems for real time extraction of crosstalk in illumination emitted from reaction sites
US11455487B1 (en) 2021-10-26 2022-09-27 Illumina Software, Inc. Intensity extraction and crosstalk attenuation using interpolation and adaptation for base calling
KR20240031968A (ko) 2021-07-19 2024-03-08 일루미나, 인코포레이티드 염기 호출에 대한 보간 및 적응을 갖는 강도 추출
GB202110479D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
WO2023002203A1 (en) 2021-07-21 2023-01-26 Dnae Diagnostics Limited Method and system comprising a cartridge for sequencing target polynucleotides
GB202110485D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
US20230116852A1 (en) 2021-07-23 2023-04-13 Illumina, Inc. Methods for preparing substrate surface for dna sequencing
AU2022319125A1 (en) 2021-07-28 2024-01-18 Illumina, Inc. Quality score calibration of basecalling systems
WO2023014741A1 (en) 2021-08-03 2023-02-09 Illumina Software, Inc. Base calling using multiple base caller models
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
WO2023035003A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Elegen Corp. Multi-way bead-sorting devices, systems, and methods of use thereof using pressure sources
US20230096386A1 (en) 2021-09-30 2023-03-30 Illumina Cambridge Limited Polynucleotide sequencing
WO2023056328A2 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Illumina, Inc. Solid supports and methods for depleting and/or enriching library fragments prepared from biosamples
WO2023069927A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 Illumina, Inc. Methods for capturing library dna for sequencing
WO2023086847A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Encodia, Inc. Methods for barcoding macromolecules in individual cells
WO2023086635A1 (en) 2021-11-15 2023-05-19 Vir Biotechnology, Inc. Virological and molecular surrogates of response to sars-cov-2 neutralizing antibody sotrovimab
WO2023114896A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Illumina Cambridge Limited Methods for metal directed cleavage of surface-bound polynucleotides
AU2022409487A1 (en) 2021-12-16 2024-01-18 Illumina, Inc. Hybrid clustering
AU2022413263A1 (en) 2021-12-17 2024-01-18 Illumina, Inc. Orthogonal hybridization
WO2023122491A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Illumina Cambridge Limited Periodate compositions and methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides
CA3222842A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Oliver MILLER Periodate compositions and methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides
CA3222937A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Jonathan Mark Boutell Methods of nucleic acid sequencing using surface-bound primers
WO2023135485A1 (en) 2022-01-13 2023-07-20 Oslo Universitetssykehus Hf Prostate cancer markers and uses thereof
AU2023208743A1 (en) 2022-01-20 2024-01-04 Illumina, Inc. Methods of detecting methylcytosine and hydroxymethylcytosine by sequencing
WO2023152568A2 (en) 2022-02-10 2023-08-17 Oslo Universitetssykehus Hf Compositions and methods for characterizing lung cancer
WO2023175026A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Illumina, Inc. Methods of determining sequence information
CA3223653A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Aathavan KARUNAKARAN Concurrent sequencing of forward and reverse complement strands on separate polynucleotides for methylation detection
WO2023186815A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 Illumina Cambridge Limited Labeled avidin and methods for sequencing
US20230313292A1 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Illumina Cambridge Limited Chromenoquinoline dyes and uses in sequencing
AU2023246691A1 (en) 2022-03-30 2024-01-18 Illumina, Inc. Methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides
WO2023192900A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Illumina Singapore Pte. Ltd. Nucleosides and nucleotides with 3' vinyl blocking group useful in sequencing by synthesis
US20230348973A1 (en) 2022-03-31 2023-11-02 Illumina Cambridge Limited Paired-end re-synthesis using blocked p5 primers
CA3223128A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Illumina, Inc. Compositions and methods for improving sequencing signals
WO2023196572A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Illumina Singapore Pte. Ltd. Altered cytidine deaminases and methods of use
WO2023209606A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Illumina Cambridge Limited Methods and systems for encapsulating lyophilised microspheres
WO2023220602A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Guardant Health, Inc. Detecting degradation based on strand bias
WO2023232829A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Illumina, Inc Compositions and methods for nucleic acid sequencing
WO2023240093A1 (en) 2022-06-06 2023-12-14 Element Biosciences, Inc. Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations
WO2024003087A1 (en) 2022-06-28 2024-01-04 Illumina, Inc. Fluorescent dyes containing fused tetracyclic bis-boron heterocycle and uses in sequencing
WO2024039516A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Illumina, Inc. Third dna base pair site-specific dna detection
WO2024057280A1 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Illumina Cambridge Limited Nanoparticle with polynucleotide binding site and method of making thereof
WO2024061799A1 (en) 2022-09-19 2024-03-28 Illumina, Inc. Deformable polymers comprising immobilised primers
US20240102067A1 (en) 2022-09-26 2024-03-28 Illumina, Inc. Resynthesis Kits and Methods
US20240124914A1 (en) 2022-09-30 2024-04-18 Illumina, Inc. Thermophilic compositions for nucleic acid amplification
US20240124929A1 (en) 2022-09-30 2024-04-18 Illumina, Inc. Mesophilic compositions for nucleic acid amplification
WO2024069581A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina Singapore Pte. Ltd. Helicase-cytidine deaminase complexes and methods of use
WO2024073043A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Methods of using cpg binding proteins in mapping modified cytosine nucleotides
WO2024073047A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Cytidine deaminases and methods of use in mapping modified cytosine nucleotides
US20240110221A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Methods of modulating clustering kinetics
WO2024068889A2 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Compositions and methods for reducing photo damage during sequencing
US20240110234A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Amplification Compositions and Methods

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4957858A (en) 1986-04-16 1990-09-18 The Salk Instute For Biological Studies Replicative RNA reporter systems
EP0224126A3 (en) 1985-11-25 1989-02-01 The University of Calgary Covalently linked complementary oligodeoxynucleotides as universal nucleic acid sequencing primer linkers
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
CA1340843C (en) 1987-07-31 1999-12-07 J. Lawrence Burg Selective amplification of target polynucleotide sequences
SE8801070D0 (sv) 1988-03-23 1988-03-23 Pharmacia Ab Method for immobilizing a dna sequence on a solid support
US6107023A (en) 1988-06-17 2000-08-22 Genelabs Technologies, Inc. DNA amplification and subtraction techniques
GB8818020D0 (en) 1988-07-28 1988-09-01 Ici Plc Method for amplification of nucleotide sequences
CA2004326A1 (en) 1988-12-23 1990-06-23 Nanibushan Dattagupta Assay of sequences using amplified genes
US5629158A (en) * 1989-03-22 1997-05-13 Cemu Bitecknik Ab Solid phase diagnosis of medical conditions
US5547839A (en) 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
US5800992A (en) * 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
CA2044616A1 (en) 1989-10-26 1991-04-27 Roger Y. Tsien Dna sequencing
CA2036946C (en) 1990-04-06 2001-10-16 Kenneth V. Deugau Indexing linkers
US5326692B1 (en) 1992-05-13 1996-04-30 Molecular Probes Inc Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift
US5645994A (en) * 1990-07-05 1997-07-08 University Of Utah Research Foundation Method and compositions for identification of species in a sample using type II topoisomerase sequences
ES2130177T3 (es) 1991-08-10 1999-07-01 Medical Res Council Tratamiento de poblaciones de celulas.
WO1993004199A2 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Scientific Generics Limited Methods of detecting or quantitating nucleic acids and of producing labelled immobilised nucleic acids
CA2077135A1 (en) * 1991-08-30 1993-03-01 Joh-E Ikeda A method of dna amplification
AU3728093A (en) 1992-02-19 1993-09-13 Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc., The Novel oligonucleotide arrays and their use for sorting, isolating, sequencing, and manipulating nucleic acids
US5849544A (en) * 1992-07-24 1998-12-15 University Of Australia Amplification and detection process
RU2048522C1 (ru) 1992-10-14 1995-11-20 Институт белка РАН Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления
US5436142A (en) * 1992-11-12 1995-07-25 Cold Spring Harbor Laboratory Methods for producing probes capable of distingushing variant genomic sequences
US5514539A (en) * 1993-06-29 1996-05-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 gene of 51 isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines
JPH07203998A (ja) 1994-01-26 1995-08-08 Hamamatsu Photonics Kk 核酸塩基配列決定方法
NZ287118A (en) 1994-05-28 1999-01-28 Tepnel Medical Ltd Method of detecting and amplifying oligonucleotides
US6060288A (en) 1994-08-03 2000-05-09 Mosaic Technologies Method for performing amplification of nucleic acid on supports
US5641658A (en) 1994-08-03 1997-06-24 Mosaic Technologies, Inc. Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support
JPH11503611A (ja) 1995-04-11 1999-03-30 トラスティーズ・オブ・ボストン・ユニバーシティ 生体高分子の固相配列決定法
US5753439A (en) * 1995-05-19 1998-05-19 Trustees Of Boston University Nucleic acid detection methods
WO1997019193A2 (en) 1995-11-21 1997-05-29 Yale University Unimolecular segment amplification and detection
US5939291A (en) 1996-06-14 1999-08-17 Sarnoff Corporation Microfluidic method for nucleic acid amplification
US6218142B1 (en) * 1997-03-05 2001-04-17 Michael Wassenegger Nucleic acid molecules encoding polypeptides having the enzymatic activity of an RNA-directed RNA polymerase (RDRP)
US20020055100A1 (en) 1997-04-01 2002-05-09 Kawashima Eric H. Method of nucleic acid sequencing
ES2563643T3 (es) 1997-04-01 2016-03-15 Illumina Cambridge Limited Método de secuenciación de ácido nucleico
CA2256563A1 (en) 1997-04-04 1998-10-15 Innogenetics N.V. Isothermal polymerase chain reaction by cycling the concentration of divalent metal ions
US6235471B1 (en) 1997-04-04 2001-05-22 Caliper Technologies Corp. Closed-loop biochemical analyzers
DK1019496T3 (da) 1997-07-07 2005-01-10 Medical Res Council In vitro-sorteringsmetode
US6326489B1 (en) 1997-08-05 2001-12-04 Howard Hughes Medical Institute Surface-bound, bimolecular, double-stranded DNA arrays
US6124120A (en) 1997-10-08 2000-09-26 Yale University Multiple displacement amplification
US6511803B1 (en) 1997-10-10 2003-01-28 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6248558B1 (en) 1998-03-31 2001-06-19 Vanderbilt University Sequence and method for genetic engineering of proteins with cell membrane translocating activity
WO2000004193A1 (en) 1998-07-20 2000-01-27 Yale University Method for detecting nucleic acids using target-mediated ligation of bipartite primers
AR021833A1 (es) * 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
WO2000041524A2 (en) 1999-01-11 2000-07-20 President And Fellows Of Harvard College Isothermal amplification of dna
US6300070B1 (en) * 1999-06-04 2001-10-09 Mosaic Technologies, Inc. Solid phase methods for amplifying multiple nucleic acids
JP6049051B2 (ja) 2011-07-29 2016-12-21 日東電工株式会社 両面真空成膜方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106566855A (zh) * 2006-07-31 2017-04-19 毕万里 使用可逆修饰寡核苷酸扩增核酸
CN106566855B (zh) * 2006-07-31 2021-11-09 苏州新海生物科技股份有限公司 使用可逆修饰寡核苷酸扩增核酸
CN106086203A (zh) * 2016-07-12 2016-11-09 深圳绿倍生态科技有限公司 一种小球藻核酸模板的制备方法及其应用
CN109688817A (zh) * 2016-10-03 2019-04-26 Illumina公司 胺和肼的荧光检测及其分析方法
CN110684829A (zh) * 2018-07-05 2020-01-14 深圳华大智造科技有限公司 一种高通量的单细胞转录组测序方法和试剂盒

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