JP2018518157A - 治療薬剤の発見および分析のためのプラットフォーム - Google Patents

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Abstract

候補薬剤の特性評価方法であって、（a）核酸タグに結合している候補薬剤のライブラリーを提供する工程と；（b）ライブラリーを固体支持体と接触させて候補薬剤を固体支持体に結合させ、それにより候補薬剤アレイを形成する工程と；（c）アレイをスクリーニング剤と接触させる工程であって、アレイ中の1つ以上の候補薬剤がスクリーニング剤と反応する工程と；（d）アレイを検出し、アレイ中の少なくとも1つの候補薬剤がスクリーニング剤と反応することを判定する工程と；（e）核酸タグを配列決定し、アレイ中の候補薬剤に結合したタグ配列を決定する工程と；（f）少なくとも1つの候補薬剤に結合したタグ配列に基づいて、スクリーニング剤と反応するアレイ中の少なくとも1つの候補薬剤を同定する工程を含む方法。

Description

本開示は、全体的に、医学的、農業的および工業的用途を有する薬剤（例えば、小分子、タンパク質または細胞）の発見に関し、より具体的にはそのような用途のための候補薬剤をスクリーニングするためのプラットフォームに関する。
現在、ハイスループットスクリーニング創薬では、複数の工程とプラットフォームとを利用して、特定の標的に対する有効性および効力、ならびに分子標的のパネルに対する良好な毒性プロファイルを示す「リード物質」または「ヒット物質」にふさわしい小分子の大量のライブラリーをスクリーニングする。
この過程の第1工程では、小分子ライブラリーを、ハイスループット様式で所定の標的に対してスクリーニングする。これらのライブラリーは、典型的には、数十万のオーダーの化合物である。現在のハイスループット方法論は自動化することができる。ロボット工学の発展および自動化の結果、高価な機器は、低マイクロリットル範囲の投入試薬の量を用いて、100,000分子／日をスクリーニングすることができる。アッセイは、均一系または不均一系のいずれかであってよく、前者は比較的単純で安価であり、後者はより複雑で、時間がかかり高価であるが、より精度が高い。
最初の小分子スクリーニングアッセイは「ヒット物質」または「リード物質」を同定するのに有効であるが、これらのアッセイは通常ほんの第一歩にすぎない。これらのリード物質またはヒット物質は、典型的には、遺伝毒性、薬理学的毒性、細胞毒性、および生物細胞毒性に関して、明確な標的に対するプロファイリングアッセイを用いてさらにスクリーニングされ、有害な臨床効果を有し得る候補を排除する。これらのアッセイの各々は、キュレーションおよびデータマイニングされた独立したワークフローを採用する様々なプラットフォームおよびキットアッセイを用いて独立して行われ、ヒット物質またはリード物質の有用性についてのコンセンサスを作り出す。
タンパク質進化法は、別のタイプのスクリーニングを構成する。これらの方法論は、膨大な順列のアレイを扱ってきた。これらの方法論の処理量、速さ、およびコストの低さは、それらを迅速なタンパク質進化の主要な選択肢にしようとする傾向があったが、その方法はしばしば複雑であり、困難と共になされる。例えば、エマルジョンベースのスクリーニングは、液滴の合流／混合（多重スクリーニング用）の困難、エマルジョンの破壊（目的の成分の回収）の困難、液滴サイズの変化による濃度変動から生じる複雑化、および液滴の交差汚染を生じる。
細胞ベースの治療法は、小分子ベースの治療法またはタンパク質ベースの治療法と比較して潜在的に有利な治療能力を有する。細胞が外部シグナルを感知し、身体内の特定の部位に移動し、複数の刺激を統合し、複雑な挙動（特定のエフェクター分子の放出など）で応答することができるという重要な利点がある。細胞ベースの治療法の可能性を完全に達成するには、治療細胞を、空間と時間の両方においてその「挙動」を制御できるように正確に設計することが有効である。
細胞工学における現在のワークフローは、典型的には以下の工程を含む：（i）刺激の感知、統合および応答に関与する細胞内シグナル伝達回路の設計；（ii）細胞内でのそれらの機能の媒介に関与する遺伝子を組み込む複雑な遺伝子工学；ならびに（iii）ライブラリー中の全ての細胞の中から、所望の機能を良好に発揮する遺伝子相補体を有するものを同定するスクリーニング方法。所望の細胞挙動の複雑さのため、現在のスクリーニング方法は理想的ではない。例えば：蛍光活性化細胞選別（FACS）ベースの方法は処理量が多いが、細胞挙動のスナップ写真のみを見る。一方、蛍光顕微鏡法は細胞挙動の動態を詳細に追従することができるが、処理量が少ない。
したがって、小分子、タンパク質、細胞およびその他の薬剤を、有益な特性についてスクリーニングするためのプラットフォームおよび方法が必要とされている。本開示は、この必要性に対処し、他の利点も有する。
国際公開第2014/142841 A1号パンフレット 米国特許出願公開第2010/0111768 A1号明細書 米国特許第8,951,781号明細書 米国特許第5,565,324号明細書 米国特許第5,573,905号明細書 米国特許第6,060,596号明細書 米国特許第6,737,236号明細書 米国特許第7,427,678号明細書 米国特許第7,375,234号明細書 米国特許第7,763,736号明細書 米国特許第8,129,542号明細書 米国特許第7,259,258号明細書 米国特許第7,504,499号明細書 米国特許出願公開第2014/0342921A1号明細書 米国特許第8,460,865号明細書 米国特許出願公開第2011/0059865 A1号明細書 米国特許出願公開第2014/0079923 A1号明細書 米国特許出願公開第2015/0005447 A1号明細書 国際公開第2008/093098号パンフレット 米国特許第6,266,459号明細書 米国特許第6,355,431号明細書 米国特許第6,770,441号明細書 米国特許第6,859,570号明細書 米国特許第6,210,891号明細書 米国特許第6,258,568号明細書 米国特許第6,274,320号明細書 米国特許出願公開第2009/0026082 A1号明細書 米国特許出願公開第2009/0127589 A1号明細書 米国特許出願公開第2010/0137143 A1号明細書 米国特許出願公開第2010/0282617 A1号明細書 国際公開第00/63437号パンフレット 米国特許出願公開第2014/0243224 A1号明細書 米国特許第8,895,249号明細書 米国特許第8,778,849号明細書 米国特許第5,641,658号明細書 米国特許第7,115,400号明細書 米国特許出願公開第2002/0055100 A1号明細書 米国特許出願公開第2004/0096853 A1号明細書 米国特許出願公開第2004/0002090 A1号明細書 米国特許出願公開第2007/0128624 A1号明細書 米国特許出願公開第2008/0009420 A1号明細書 国際公開第05/010145号パンフレット 米国特許出願公開第2005/0130173 A1号明細書 米国特許出願公開第2005/0064460 A1号明細書 米国特許出願公開第2007/0099208 A1号明細書 米国特許第5,455,166号明細書 米国特許第5,130,238号明細書 米国特許第6,214,587号明細書 国際公開第91/06678号パンフレット 国際公開第04/018497号パンフレット 国際公開第07/123744号パンフレット 米国特許第7,057,026号明細書 米国特許第7,329,492号明細書 米国特許第7,211,414号明細書 米国特許第7,315,019号明細書 米国特許第7,405,281号明細書 米国特許出願公開第2008/0108082号明細書 国際公開第2012/058096号パンフレット 米国特許出願公開第2005/0191698 A1号明細書 米国特許第7,595,883号明細書 米国特許第7,244,559号明細書 米国特許第5,599,675号明細書 米国特許第5,750,341号 国際公開第1989/10977号パンフレット 米国特許出願公開第2010/0092957 A1号明細書 米国特許第7,960,120号明細書 米国特許第9,017,623号明細書 米国特許第8,857,462号明細書 米国特許出願公開第2014/0155295 A1号明細書 米国特許出願公開第2014/0206554 A1号明細書 米国特許出願公開第2014/0227684 A1号明細書 米国特許出願公開第2014/0378322 A1号明細書 米国特許第8,637,242号明細書 米国特許第6,911,132号明細書 米国特許出願公開第2006/0194331号明細書 国際公開第2007/120241号パンフレット 米国特許第6,773,566号明細書 米国特許第6,565,727号明細書 米国特許出願公開第2003/0205632号明細書 米国特許出願公開第2006/0164490号明細書 米国特許出願公開第2007/0023292号明細書 米国特許出願公開第2009/0283407号明細書 米国特許出願公開第2010/0096266号明細書 米国特許第7,547,380号明細書 米国特許第7,163,612号明細書 米国特許第7,641,779号明細書 米国特許第6,977,033号明細書 米国特許第7,328,979号明細書 米国特許出願公開第2006/0039823号明細書 米国特許出願公開第2011/0048951号明細書 米国特許出願公開第2009/0192044号明細書 米国特許第7,052,244号明細書 米国特許出願公開第2008/0124252号明細書 米国特許出願公開第2009/0321262号明細書 米国特許出願公開第2005/0179746号明細書 米国特許出願公開第2005/0037393 A1号明細書 米国特許第8,288,103号明細書 米国特許第8,486,625号明細書 米国特許出願公開第2011/0178285 A1号明細書 米国特許第9,012,022号明細書 米国特許第7,741,463号明細書 米国特許第7,622,294号明細書 米国特許第8,741,630号明細書
Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008) Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003) Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998) Dean et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002) Lage et al., Genome Research 13:294-307 (2003) Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995 Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992) Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996) Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001) Ronaghi et al. Science 281(5375), 363 (1998) Shendure et al. Science 309:1728-1732 (2005) Bains et al., Journal of Theoretical Biology 135(3), 303-7 (1988) Drmanac et al., Nature Biotechnology 16, 54-58 (1998) Fodor et al., Science 251(4995), 767-773 (1995) Levene et al. Science 299, 682-686 (2003) Lundquist et al. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008) Korlach et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008) Meth. Enzymol. 291:307-347 (1998) Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001) Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1999) Dhindsa et al., "Virtual Electrowetting Channels: Electronic Liquid Transport with Continuous Channel Functionality," Lab Chip, 10:832-836 (2010) Gunderson et al., Genome Research 14:870-877 (2004) Sleden et al., J Am Chem Soc 134: 765-8 (2012)
本開示は、候補薬剤の特性評価方法を提供する。本方法は、以下の工程を含むことができる：（a）候補薬剤のライブラリーを提供する工程であって、各候補薬剤が、タグ配列を有する核酸タグに結合している工程と；（b）候補薬剤のライブラリーを固体支持体と接触させて候補薬剤を固体支持体に結合させ、それにより、ライブラリーからの個々の候補薬剤にそれぞれ結合する個々のフィーチャーを固体支持体上に含む候補薬剤アレイを形成する工程と；（c）候補薬剤アレイをスクリーニング剤と接触させる工程であって、アレイ中の1つ以上の候補薬剤がスクリーニング剤と反応する工程と；（d）アレイのスクリーニング剤との接触の間または接触の後にアレイを検出し、それによりアレイ中の少なくとも1つの候補薬剤がスクリーニング剤と反応することを判定する工程と；（e）アレイ上の核酸タグを配列決定し、候補薬剤の各々に結合したタグ配列を決定する工程と；（f）少なくとも1つの候補薬剤に結合したタグ配列に基づいて、スクリーニング剤と反応するアレイ中の少なくとも1つの候補薬剤を同定する工程。
本開示は、タンパク質アレイの作製方法をさらに提供する。本方法は、以下の工程を含むことができる：（a）固体支持体に結合したcDNA分子のライブラリーを提供する工程と；（b）固体支持体上のcDNA分子を増幅してクラスターを形成する工程であって、各クラスターがライブラリーからの特定のcDNA分子の複数のコピーを含む工程と；（c）クラスターの複数のコピーを転写し、クラスターの各々に結合した複数のmRNA分子を生成する工程と；（d）クラスターのmRNA分子を翻訳し、クラスターの各々に結合した複数のタンパク質を生成する工程。
この開示は、以下の工程を含むタンパク質アレイの作製方法も提供する：（a）mRNA分子のライブラリーを提供する工程であって、ライブラリー中の個々のmRNA分子が標的配列およびタグ配列を含んでいる工程、（b）ライブラリーから第1サブライブラリーを得る工程であって、第1サブライブラリーはタグ配列またはその相補体を有する核酸を含み、核酸が固体支持体上の個々のフィーチャーに結合している工程、（c）ライブラリーから第2サブライブラリーを得る工程であって、第2サブライブラリーは標的配列およびタグ配列またはその相補体を有する核酸を含んでいる工程、（d）第2サブライブラリーを第1サブライブラリーと接触させ、それにより第2サブライブラリーの核酸を、タグ配列とその相補体のハイブリダイゼーションを介して固体支持体に結合させる工程と；（e）固体支持体上の標的配列を翻訳し、個々のフィーチャーに結合したタンパク質のアレイを作製する工程。
この開示によって、細胞のスクリーニング方法も提供される。本方法は、以下の工程を含むことができる：（a）複数の異種細胞を提供する工程であって、異種細胞の各々がタグ配列を有する核酸タグを含んでいる工程と；（b）異種細胞の混合物を固体支持体と接触させ、固体支持体に結合した細胞のアレイを形成する工程と；（c）固体支持体上の細胞のアレイを、少なくとも1つの光学特性についてスクリーニングする工程であって、スクリーニング反応が、固体支持体に結合した個々の細胞を検出することを含む工程と；（d）固体支持体に結合した核酸タグのタグ配列を配列決定する工程と；（e）アレイ中の少なくとも1つの細胞を候補細胞として、候補細胞の光学特性およびタグ配列に基づいて同定する工程。
本開示は、（a）固体支持体と；（b）固体支持体に結合した異種cDNA分子のライブラリーであって、各異種cDNA分子が固体支持体上の個々のフィーチャーに結合しており、各フィーチャーが特定のcDNA分子の複数のコピーを含むライブラリーと（c）cDNA分子に結合したmRNA分子であって、cDNA分子の各々が、それぞれの結合したmRNA分子に相補的であるmRNA分子と；（d）mRNA分子に結合したタンパク質分子であって、タンパク質分子の各々が、それぞれの結合したmRNA分子によってコードされているタンパク質分子を含むアレイを提供する。
本開示は、（a）mRNA分子のライブラリーであって、ライブラリー中の個々のmRNA分子が標的配列およびタグ配列を含むライブラリーと、（b）タグ配列の相補体を有する核酸を含む固体支持体を含み、核酸が固体支持体上の個々のフィーチャーに結合しており、個々のmRNA分子のタグ配列が、固体支持体上の個々のフィーチャーのそれぞれの相補的タグ配列にハイブリダイズし、mRNA分子の翻訳によって得られるタンパク質が、それぞれのmRNA分子に結合するアレイをさらに提供する。
図１Ａ〜Ｆは、候補薬剤のハイスループットスクリーニング過程の工程を示す図である。 候補タンパク質薬剤のハイスループット合成およびスクリーニング過程を示す図である。 図３Ａ及び３Ｂは、候補タンパク質薬剤のハイスループットタグ付け、合成およびスクリーニング過程を示す図である。 スクリーニング剤の、フローセルに結合した細胞へのばく露およびスクリーニング剤に対する様々な細胞応答から予想される蛍光対時間のプロットを示す図である。 個々のマイクロウェルに分けられ、次いでマイクロウェル特異的タグでタグ付けされた細胞を示す図である。 コード化されたビーズを用いる固体支持体上の細胞位置の解読を示す図である。 核酸タグを用いる固体支持体上の細胞位置の解読を示す図である。 細胞から固体支持体上の部位への核酸タグの転移と、固体支持体上の核酸タグの配列決定とを示す図である。 細胞膜内の脂肪酸に一対の核酸が結合することによってタグ付けされた細胞を示す図である。 フローセル表面上の核酸タグ付き細胞の捕捉を示す図である。 核酸タグの制限エンドヌクレアーゼ切断によるフローセル表面からの細胞の分離を示す図である。 細胞が得られた容器内の解読されたタグの位置に基づく、フローセル表面上の細胞の同定を示す図である。
この開示は、治療的使用の候補などの、候補薬剤のハイスループットスクリーニングのための装置および方法を提供する。本明細書に記載の特定の実施形態は、核酸配列決定技法および装置を有効に使用する。本明細書に記載の配列決定技法および装置を用いる利点は、各候補薬剤に会合する核酸を識別することができるように、ならびに、各候補薬剤の特定の刺激剤に対する応答を固体支持体上で個々に検出することができるように、多数の異種候補薬剤を空間的に配列できることである。
特定の実施形態では、複数の異種候補薬剤がライブラリーに提供され、各候補薬剤は特有の核酸タグに結合（または別の方法で会合）する。候補薬剤は、限定されないが、核酸、タンパク質、細胞および小分子を含む任意の様々な単位体であり得る。これらのタグ付けされた候補薬剤は、個々の成員が、空間分離された候補薬剤のアレイを形成するように、固体支持体に結合することができる。次いで、候補薬剤アレイを、スクリーニング剤（または他の刺激剤）に晒すことによってスクリーニングし、候補薬剤の反応を、固体支持体上の空間分解された位置で検出することができる。1つ以上の「ヒット物質」の位置は、予想される、所望のまたは特有のシグナルのアレイ上での空間分解検出に基づいて同定することができる。各タグをアレイ内のその位置に関して同定するために、配列決定反応をアレイ上で（スクリーニング工程の前後いずれかに）行うこともできる。候補薬剤は、「ヒット物質」の位置をその位置のタグの同定と相関させることによって同定することができる。
本明細書に記載の方法または装置において使用されるいくつかの候補薬剤は核酸ベースであり、例えば、タンパク質および細胞が挙げられる。タンパク質を使用するいくつかの実施形態では、タンパク質をコードするDNAまたはRNA分子の配列を決定して、あるタンパク質を別のタンパク質と識別することができる。さらに、個々のタンパク質のアミノ酸配列は、既知の遺伝コードに基づいてRNA配列から推論することができる。しかし、いくつかの実施形態では、タンパク質も、タンパク質をコードする核酸も配列決定する必要はない。むしろ、各タンパク質は、タンパク質の配列とa prioriに相関しているタグと結合（または別の方法で会合）することができる。したがって、タグを配列決定することは、あるタンパク質を別のタンパク質と識別するのに十分であり得る。同様に、細胞ベースの候補薬剤は、配列決定されて集団中の個々の細胞を同定することができる核酸を含有する。さらに、核酸配列を評価し、個々の細胞の有用な特性を決定することができる。ここでもまた、使用タグまたはa prioriに割り当てられたタグは、他の細胞内容物を配列決定する必要なしに、細胞特性が識別されるのを可能にすることができる。
本開示の方法および装置は、候補薬剤の治療的機能についてのスクリーニングに関して例示されているが、他の機能的または構造的特性をスクリーニングできることが理解されるであろう。例えば、本方法および装置を使用して、毒性、農業利用（例えば、農薬、成長因子、ホルモンなど）、工業利用（例えば、触媒、染料、プラスチックなど）、栄養学（例えば、香料、防腐剤など）、環境浄化についてスクリーニングすることができる。一般に、本方法および装置を使用して、生物学的機能または非生物学的機能をスクリーニングすることができる。
本明細書に記載の方法および装置は、ハイスループットスクリーニングの間に定量的な測定を行うことができるという利点を有する。例えば、市販の配列決定プラットフォーム、例えばIllumina社（サンディエゴ、カリフォルニア州）によって商品化されているものなどは、蛍光シグナルを定量するための比較的広いダイナミックレンジを有する精密光学部品を含む。さらなる利点は、候補薬剤アレイ中の複数の位置でのスクリーニング反応の時間的動態を追跡できるということである。対照的に、多くの従来スクリーニングで使用される流体選別方法は、通過する候補薬剤のスナップ写真のみを提供し、それにより測定を単一時点に限定する。本明細書に記載の方法および装置は、流体選別技法と同等か、場合によってはそれよりも優れている処理量を提供するが、スクリーニング結果の時間ベースの測定という付加価値がある。本明細書に記載の装置および方法のさらなる利点は、スクリーニング結果を検出できることと、スクリーニングからの「ヒット物質」を同定するために、タグとスクリーニング結果との空間的相関を与える方法でタグを検出できることである。
本明細書で使用される用語は、別段の指定がない限り、関連技術におけるそれらの通常の意味を持つと理解される。本明細書で使用されるいくつかの用語およびそれらの意味を、以下に記載する。
本明細書で使用される用語「アンプリコン」は、核酸に関連して使用される場合、核酸のコピーの産物を意味し、産物は、核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と同じかまたは相補的なヌクレオチド配列を有する。アンプリコンは、核酸またはそのアンプリコンを鋳型として使用する任意の様々な増幅方法によって生成することができ、例えば、ポリメラーゼ伸長、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ローリングサークル増幅（RCA）、多置換増幅（MDA）、ライゲーション伸長、またはライゲーション連鎖反応が挙げられる。アンプリコンは、特定のヌクレオチド配列の単一コピー（例えば、PCR産物）またはヌクレオチド配列の複数のコピー（例えば、RCAのコンカテマー産物）を有する核酸分子であり得る。標的核酸の第1アンプリコンは、典型的には相補的コピーである。続くアンプリコンは、第1アンプリコンの生成後に、標的核酸からまたはアンプリコンから作製されるコピーである。それに続くアンプリコンは、標的核酸と実質的に相補的であるか、または標的核酸と実質的に同一である配列を有することができる。
本明細書で使用される用語「アレイ」は、相対的位置に応じて互いに区別され得るフィーチャーまたは部位の集団を指す。アレイの異なる部位にある異種分子または他の単位体は、アレイ内の部位の位置に応じて互いに区別することができる。アレイの個々の部位は、特定のタイプの1つ以上の分子（または他の単位体）を含むことができる。例えば、一部位は、特定の配列を有する単一核酸分子を含むことができるか、または一部位は、同じ配列（および／もしくはその相補的な配列）を有するいくつかの核酸分子を含むことができる。アレイの部位は、同じ基質上に位置する異なるフィーチャーであり得る。例示的なフィーチャーには、限定されないが、基質内のウェル、基質内もしくは基質上のビーズ（もしくは他の粒子）、基質からの突起、基質上のリッジまたは基質内のチャネルが挙げられる。アレイの部位は、それぞれが異種分子（または他の単位体）を持つ別々の基質であり得る。別個の基質に結合した異種単位体は、基質が会合している固体支持体上の基質の位置に応じて、または液体もしくはゲル中の基質の位置に応じて同定され得る。別個の基質が固体支持体上に位置する例示的なアレイには、限定されないが、ウェル中にビーズを有するものが挙げられる。
本明細書で使用される用語「結合している」は、2つの物が互いに接合、固定、接着、接続、または結合している状態を指す。例えば、核酸などの検体は、共有結合または非共有結合によって、ゲルもしくは固体支持体などの物質に結合することができる。共有結合は、原子間での電子対の共有を特徴とする。非共有結合は、電子対の共有を伴わない化学結合であり、例えば水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、親水性相互作用および疎水性相互作用を挙げることができる。いくつかの実施形態では、捕捉剤を介して結合が起こり得る。捕捉剤には、例えば、抗体、受容体、核酸、リガンド、レクチン、炭水化物、アビジン、ビオチン、またはそれらの類似体を挙げることができる。
本明細書で使用される用語「候補薬剤」は、特定の構造または機能を有すると推測される単位体を意味することを意図している。例示的な単位体には、限定されないが、分子、細胞および細胞成分が挙げられる。分子は、タンパク質、アミノ酸、核酸（例えば、DNAまたはRNA）、ヌクレオチド、多糖類、糖類、代謝産物、ビタミン、酵素補因子などの生物活性分子であってもよい。他の候補薬剤には、大環状分子、環状ペプチド、融合分子（例えば、核酸-タンパク質融合物）、または提示構築物（例えば、ファージ上のペプチド）が挙げられる。候補薬剤が保持すると推測される例示的な機能には、限定されないが、別の薬剤の活性化、別の薬剤の阻害、別の薬剤の化学修飾、別の薬剤の分解、別の薬剤の合成が挙げられ、ここで、他の薬剤は、候補薬剤であるとして上記に例示した単位体のうちの任意の1つ以上であってもよい。候補薬剤の構造は、上記の単位体もしくは当該技術分野で知られている他の単位体についての、任意の既知構造または推測される構造であり得る。
本明細書で使用される用語「異種」は、核酸に関連して使用される場合、核酸が互いに同じでないヌクレオチド配列を有することを意味する。2つ以上の核酸は、それらの全長に沿って異なるヌクレオチド配列を有することができる。あるいは、2つ以上の核酸は、それらの全長の実質的な部分に沿って異なるヌクレオチド配列を有することができる。例えば、2つ以上の核酸は、2つ以上の分子に対して異なる標的ヌクレオチド配列部分を有することができ、一方で、2つ以上の分子で同じであるユニバーサル配列部分も有することができる。本用語は、アミノ酸配列の相違に基づいて互いに異なるとして識別可能なタンパク質にも同様に適用することができる。
本明細書で使用される用語「各」は、単位体のコレクションに関連して使用される場合、コレクション内の個々の単位体を識別することを意図しているが、コレクション内の全ての単位体を必ずしも指すものではない。明示的な開示または文脈がはっきりと別段に指示している場合は、例外が生じることがある。
本明細書で使用される用語「伸長」は、核酸に関連して使用される場合、少なくとも1つのヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの核酸への付加を意味することを意図している。特定の実施形態では、1つ以上のヌクレオチドを、核酸の3'末端に、例えばポリメラーゼ触媒作用（例えば、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼもしくは逆転写酵素）を介して付加することができる。化学的または酵素的方法を使用して、1つ以上のヌクレオチドを核酸の3'もしくは5'末端に付加することができる。1つ以上のオリゴヌクレオチドを、核酸の3'もしくは5'末端に、例えば化学的または酵素的（例えば、リガーゼ触媒作用）方法を介して付加することができる。核酸は鋳型指向様式で伸長することができ、それにより伸長産物は、伸長される核酸にハイブリダイズする鋳型核酸に相補的である。
本明細書で使用される用語「フィーチャー」は、特定の種類の分子または細胞のアレイにおける位置を意味する。フィーチャーは、単一分子（または細胞）のみを含有することができるか、または同種のいくつかの分子（もしくは細胞）の集団を含有することができる。いくつかの実施形態では、フィーチャーは、分子または細胞を結合させる前に固体支持体上に存在する。他の実施形態では、分子または細胞の固体支持体への結合によってフィーチャーが作製される。アレイのフィーチャーは、典型的には離散的である。離散的フィーチャーは連続していてもよく、または互いに離間していてもよい。フィーチャーのサイズおよび／またはフィーチャー間の間隔は、アレイが高密度、中密度または低密度となるように変化させることができる。高密度アレイは、約15μm未満で離間した部位を有することを特徴とする。中密度アレイは、約15〜30μmで離間した部位を有し、一方で低密度アレイは、30μmを超えて離間した部位を有する。本明細書で有用なアレイは、例えば、100μm、50μm、10μm、5μm、1μm、または0.5μm未満で離間した部位を有することができる。本開示の装置または方法を使用して、上記の密度または密度範囲の部位を識別するのに十分な解像度でアレイを検出することができる。
本明細書で使用される用語「フローセル」は、反応が実施され得るチャンバー、試薬をチャンバーに送達するための注入口、およびチャンバーから試薬を除去するための排出口を有する容器を意味することを意図している。いくつかの実施形態では、チャンバーは、チャンバー内で生じる反応を検出するように構成される。例えば、チャンバーは、アレイ、光標識された分子などのチャンバー内での光学的検出を可能にする1つ以上の透明な面を備えることができる。例示的なフローセルには、限定されないが、核酸配列決定装置で使用されるフローセルが挙げられ、例えば、Illumina社（サンディエゴ、カリフォルニア州）によって市販されているGenome Analyzer（登録商標）、MiSeq（登録商標）、NextSeq（登録商標）もしくはHiSeq（登録商標）プラットホーム用の；またはLife Technologies（カールズバッド、カリフォルニア州）によって市販されているSOLiD（商標）もしくはIon Torrent（商標）配列決定プラットフォーム用のフローセルなどが挙げられる。例示的なフローセルならびにそれらの製造方法および使用方法は、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献１、特許文献２および特許文献３にも記載されている。
本明細書で使用される用語「ライブラリー」は、いくつかの異種単位体を含むコレクションを意味することを意図している。コレクション内の単位体は、構造および／または機能が異なる場合がある。例えば、コレクションは、異なるヌクレオチド配列を有する核酸を含み得るか、またはコレクションは、異なる一次構造（すなわち、アミノ酸配列）、二次構造、三次構造または四次構造を有するタンパク質を含み得る。しかし、ライブラリー内には単位体のいくつかの冗長性が存在し得ることが理解されるであろう。例えば、多種多様な異種核酸またはタンパク質を含むライブラリーであっても、特定の核酸またはタンパク質の複数のコピーが存在し得る。ライブラリーに存在し得る例示的な単位体のタイプには、候補薬剤またはスクリーニング剤に関して本明細書に記載されるものを挙げることができる。
本明細書で使用される用語「発光性」は、コールド体放射線を放出することを意味する。本用語は、加熱の結果として物質から放出される放射線である白熱とは区別されることを意図する。一般に発光は、エネルギー源が、原子の電子を、その最も低いエネルギーの基底状態からより高いエネルギーの励起状態に移して；その後その電子が、基底状態に戻れるように放射線の形でエネルギーを返したときに生じる。特に有用な発光単位体のタイプは、エネルギーが励起放射線によって提供された際にコールド体放射線を放出するものである。そのような単位体は、「蛍光性」または「光輝性」と称される。蛍光またはフォトルミネッセンスは、別の波長で単位体を照射した結果である波長の単位体による放射線の放出として知覚され得る。
本明細書で使用される用語「核酸」および「ヌクレオチド」は、当該技術分野でのそれらの使用と一致することと、天然に存在する種またはそれらの機能的類似体を含むことを意図している。特に有用な核酸の機能的類似体は、配列特異的な様式で核酸にハイブリダイズすることができるか、または特定のヌクレオチド配列の複製の鋳型として使用することができる。天然に存在する核酸は、一般に、ホスホジエステル結合を含有する主鎖を有する。類似構造は、代替の主鎖連鎖を有することができ、当該技術分野で知られている任意の様々なものが挙げられる。天然に存在する核酸は、一般にデオキシリボース糖（例えばデオキシリボ核酸（DNA）に見られる）またはリボース糖（例えばリボ核酸（RNA）に見られる）を有する。核酸は、当該技術分野で知られているこれらの糖成分の任意の様々な類似体を有するヌクレオチドを含有することができる。核酸は、天然ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含み得る。これに関して、天然デオキシリボ核酸は、アデニン、チミン、シトシンまたはグアニンからなる群より選択される1つ以上の塩基を有することができ、リボ核酸は、ウラシル、アデニン、シトシンまたはグアニンからなる群より選択される1つ以上の塩基を有することができる。核酸またはヌクレオチドに含めることができる有用な非天然塩基は、当該技術分野で知られている。
本明細書で使用される用語「ピッチ」は、アレイのフィーチャーに関連して使用される場合、隣接するフィーチャーの中心間距離を指すことを意図している。フィーチャーのパターンは、平均ピッチの観点から特徴付けることができる。パターンは、平均ピッチの周りの変動係数が小さくなるように並べることができるか、またはパターンをランダムにすることができ、その場合変動係数は比較的大きくなり得る。いずれの場合でも、平均ピッチは、例えば、少なくとも約10nm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、100μmまたはそれ以上であり得る。その代わりに、またはそれに加えて、平均ピッチは、例えば、最大で約100μm、10μm、5μm、1μm、0.5μm、0.1μmまたはそれ以下であり得る。当然ながら、特定のフィーチャーのパターンの平均ピッチは、上記範囲から選択された下限値のうちの1つと上限値のうちの1つの間にあり得る。
本明細書で使用される用語「タンパク質」または「アミノ酸」は、当該技術分野でのそれらの使用と一致することと、天然に存在する種またはそれらの機能的類似体を含むことを意図している。天然に存在するタンパク質は、一般に、ペプチド結合を含有する主鎖を有する。類似構造は、代替の主鎖連鎖を有することができ、当該技術分野で知られている任意の種々のものが挙げられる。天然に存在するタンパク質は、一般に、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンから選択される天然アミノ酸、および天然に存在するそれらの修飾を有する。いくつかの天然に起こる修飾には、（例えば、セリン、スレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸の）リン酸化、プレニル化、イソプレニル化、アシル化、アルキル化、グリコシル化、ビオチン化、ユビキチン化などが挙げられる。タンパク質は、非天然成分を有する天然アミノ酸を含むことができる。タンパク質は、天然または非天然アミノ酸を含むことができる。
本明細書で使用される用語「反応する」は、第1薬剤および第2薬剤に関連して使用される場合、薬剤の一方または両方の化学構造を修飾する作用、2つの薬剤間に1つ以上の共有結合を作り出す作用、試薬の一方がもう一方の薬剤の化学構造の修飾を触媒することを可能にする作用、または2つの薬剤を特異的に結合させる作用（例えば、非共有結合性相互作用を介して）を指す。例示的な反応には、限定されないが、還元、酸化、付加、脱離、転位、エステル化、アミド化、エーテル化、環化、もしくは置換などの化学反応；第1薬剤が第2薬剤に特異的親和性で結合する結合性相互作用；2つ以上の薬剤が互いから離れる解離反応；蛍光；発光；化学発光；および核酸複製、核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーション、核酸ライゲーション、リン酸化、酵素触媒、受容体結合、またはリガンド結合などの生物学的反応が挙げられる。
本明細書で使用される用語「組み換え」は、天然に存在しない遺伝子構築物を指すことを意図している。一例は、1つより多い起源由来の遺伝物質を組み合わせた産物である。例示的な組み換え分子には、限定されないが、DNA、RNAおよびタンパク質が挙げられる。組み換え分子が由来し得る起源には、例えば、異なる生物体由来の類似の遺伝要素、同じ生物体由来の異なる遺伝要素、異なる生物体由来の異なる遺伝要素、合成遺伝要素、または合成および天然遺伝要素の組み合わせが挙げられる。
本明細書で使用される用語「スクリーニング剤」は、第2候補薬剤と比較して第1候補薬剤に対して選択的な構造または機能を有する単位体を意味することを意図している。多くの実施形態では、スクリーニング剤の構造または機能は、本開示の方法または組成物におけるその使用の前に知られている。例示的な単位体には、限定されないが、分子、細胞および細胞成分が挙げられる。分子は、タンパク質、アミノ酸、核酸（例えば、DNAまたはRNA）、ヌクレオチド、多糖類、糖類、代謝産物、ビタミン、酵素補因子などの生物活性分子であってもよい。例示的な選択的機能には、限定されないが、別の薬剤の活性化、別の薬剤の阻害、別の薬剤の化学修飾、別の薬剤の分解、別の薬剤の合成が挙げられる；ここで他の薬剤は、候補薬剤であるとして上記で例示した単位体のうちの任意の1つ以上であり得る。スクリーニング剤の構造は、上記の単位体または当該技術分野で知られている他の単位体として任意の既知構造もしくは推測される構造であり得る。
本明細書で使用される、第2の物と比較して第1の物を「選択的に」操作すること（または、その「選択的」操作）への言及は、操作が第2の物に対する影響と比較して第1の物に対してより大きな影響を及ぼすことを意味することを意図している。操作は、第2の物に何ら影響を与える必要はない。操作は、第1の物に対して、第2の物に対する影響よりも少なくとも1%、10%、50%、90%、または99%大きい影響を及ぼし得る。操作は、第1の物に対して、第2の物に対する影響よりも少なくとも2倍、5倍、10倍、100倍、1x103倍、1x104倍または1x106倍大きい影響を及ぼし得る。操作には、例えば、修飾、接触、処理、変換、（例えば化学結合の）開裂、（例えば、化学結合の）光化学的開裂、（例えば化学結合の）形成、（例えば、化学結合の）光化学形成、共有結合性修飾、非共有結合性修飾、破壊、光剥離、除去、合成、重合、光重合、（例えば、核酸の）増幅、（例えば、核酸の）コピー、（例えば、核酸の）伸長、（例えば、核酸の）ライゲーション、または本明細書に記載されているか、そうでなければ当該技術分野で知られている他の操作を挙げることができる。
本明細書で使用される用語「小分子」は、約1000ダルトン未満の分子量を有する化合物を意味することを意図している。特定の実施形態では、小分子は非重合性である。しかし、小分子は、他の実施形態では、二量体または三量体であり得る。小分子は、重合体に取り込まれることができる単量体であり得ることも理解されるであろう。特に有用な小分子は有機化合物である。有用な小分子は、900、800、600、400、200または100ダルトン未満の分子量を有することができる。
本明細書で使用される用語「固体支持体」は、水性液体に不溶である硬質基質を指す。基質は、非多孔質または多孔質であり得る。基質は、場合によっては（例えば多孔性のために）液体を吸収することができ得るが、典型的には、液体を吸収した際に基質が実質的に膨潤せず、乾燥によって液体が除去された際に実質的に収縮しない程度に十分に硬い。非多孔性固体支持体は、一般に、液体または気体に対して不透過性である。例示的な固体支持体には、限定されないが、ガラスおよび変性もしくは官能化ガラス、プラスチック（例えば、アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の物質の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Teflon（商標）、環状オレフィン、ポリイミドなど）、ナイロン、セラミック、樹脂、Zeonor、シリカもしくはケイ素および変性ケイ素を含むシリカベースの物質、炭素、金属、無機ガラス、光ファイバー束ならびにポリマーが挙げられる。いくつかの実施形態に特に有用な固体支持体は、フローセルの構成要素であるか、またはフローセル装置内に配置される。例示的なフローセルを、本明細書においてさらに詳細に記載する。
本明細書で使用される用語「サブライブラリー」は、ライブラリーからの単位体またはライブラリーからの単位体のコピーを含む表現を有するコレクションを意味することを意図している。サブライブラリー内の表現は、ライブラリー内の表現と比べて、完全であっても部分的であってもよい。サブライブラリーは、ライブラリーから単位体の少なくとも一部を分離することによって、またはライブラリー内の単位体の少なくともいくつかのコピーを作ることによって得ることができる。
本明細書中で使用される用語「タグ配列」は、核酸に結合した（または会合した）薬剤を同定または特性評価するために使用され得る核酸中の一連のヌクレオチドを意味することを意図している。タグ配列は、天然に存在する配列、またはその核酸が得られた生物体において天然に存在しない配列であり得る。特定の実施形態では、生体試料と共に使用される1つ以上のタグ配列は、その生体試料のゲノム、トランスクリプトームまたは他の核酸において天然には存在しない。例えば、タグ配列は、特定の生体試料中の核酸配列に対して80%、70%、60%、50%または40%未満の配列同一性を有することができる。
本明細書で使用される用語「ユニバーサル配列」は、2つ以上の核酸分子について、分子が互いに異なる配列領域を有する場合であっても、共通している一連のヌクレオチドを指す。分子のコレクションの異なる成員において存在するユニバーサル配列は、ユニバーサル配列に相補的なユニバーサル捕捉核酸の集団を用いて、複数の異種核酸の捕捉を可能にすることができる。同様に、分子のコレクションの異なる成員において存在するユニバーサル配列は、ユニバーサル配列に相補的なユニバーサルプライマーの集団を用いて、複数の異種核酸の複製または増幅を可能にすることができる。したがって、ユニバーサル捕捉核酸またはユニバーサルプライマーは、ユニバーサル配列に特異的にハイブリダイズすることができる配列を含む。
以下に記載され、特許請求の範囲に列挙される実施形態は、上記の定義を考慮して理解され得る。
本開示は、候補薬剤の特性評価方法を提供する。本方法は、以下の工程を含むことができる：（a）候補薬剤のライブラリーを提供する工程であって、各候補薬剤が、タグ配列を有する核酸タグに結合している工程と；（b）候補薬剤のライブラリーを固体支持体と接触させて候補薬剤を固体支持体に結合させ、それにより、ライブラリーからの個々の候補薬剤にそれぞれ結合する個々のフィーチャーを固体支持体上に含む候補薬剤アレイを形成する工程と；（c）候補薬剤アレイをスクリーニング剤と接触させる工程であって、アレイ中の1つ以上の候補薬剤がスクリーニング剤と反応する工程と；（d）アレイのスクリーニング剤との接触の間または接触の後にアレイを検出し、それによりアレイ中の少なくとも1つの候補薬剤がスクリーニング剤と反応することを判定する工程と；（e）アレイ上の核酸タグを配列決定し、候補薬剤の各々に結合したタグ配列を決定する工程と；（f）少なくとも1つの候補薬剤に結合したタグ配列に基づいて、スクリーニング剤と反応するアレイ中の少なくとも1つの候補薬剤を同定する工程。
任意の様々な候補薬剤を、本明細書に記載の方法で使用することができる。いくつかの実施形態では、候補薬剤は、タンパク質、核酸、細胞または小分子からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、使用される候補薬剤は、タンパク質、核酸、細胞または小分子などの単位体の1つ以上のタイプを除外することが理解されるであろう。方法または組成物に含めることができるか、またはそれらから除外することができるこれらのタイプの単位体の例を、本開示を通じて記載する。
有用な候補薬剤は、生物活性を有する分子か、または有すると推測される分子であり得る。例示的な生物活性には、限定されないが、治療活性、毒性、ホルモン活性、生体分子または細胞の活性化、生体分子または細胞の阻害、抗生物質活性、抗ウイルス活性、農薬活性、精神薬理作用もしくは免疫作用などの生物体またはその器官への作用が挙げられる。特に有用な種類の候補薬剤は、酵素阻害剤または酵素活性剤であり、例えば、本明細書に記載の酵素を標的とするものが挙げられる。また、細胞シグナル伝達の候補活性剤、または細胞シグナル伝達の候補阻害剤も有用である。しかし、いくつかの実施形態では、候補薬剤は、生物活性を有する必要はなく、生物活性を有すると推測される必要もない。場合によっては、候補薬剤は非生物活性を有するか、または有すると推測されることになる。非生物的であり得る活性の例には、限定されないが、工業的触媒、食品保存、石油処理、ポリマー合成などが挙げられる。
候補薬剤は、重合性であっても非重合性であってもよい。特に有用な重合体には、限定されないが、タンパク質、核酸、多糖類、タンパク質核酸（PNA）およびプラスチックが挙げられる。有用な非重合性分子には、例えば、脂質、アミノ酸、ヌクレオチド、酵素補因子、代謝産物、単糖類および他の小分子が挙げられる。
候補薬剤として有用なタンパク質の例には、限定されないが、抗体；オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、セルラーゼ、リグニナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、パパイン、レニン、ヒストン修飾酵素もしくはエステラーゼなどの酵素；またはG-共役受容体、細胞表面受容体、免疫受容体、感覚受容体および核内ホルモン受容体などの受容体が挙げられる。
別の特に有用な種類の候補薬剤は、例えば、限定されないが、以下を含む生物体に由来する細胞が挙げられる細胞である：齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、有蹄類、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ネコ、イヌ、霊長類（すなわち、ヒトもしくは非ヒト霊長類）などの哺乳類；シロイヌナズナ、トウモロコシ、モロコシ、オートムギ、コムギ、イネ、アブラナ、もしくはダイズなどの植物；緑藻クラミドモナスなどの藻類；エレガンス線虫などの線虫；キイロショウジョウバエ、蚊、ミバエ、ミツバチもしくはクモなどの昆虫；ゼブラフィッシュなどの魚類；爬虫類；カエルもしくはアフリカツメガエルなどの両生類；キイロタマホコリカビ；ニューモシスチス・カリニ、トラフグ、酵母、サッカラモナス・セレビシエもしくはシゾサッカロマイセス・ポンベなどの真菌；または熱帯熱マラリア原虫。他の生物体には、細菌、大腸菌、ブドウ球菌もしくは肺炎マイコプラズマなどの原核生物；古細菌；C型肝炎ウイルスもしくはヒト免疫不全ウイルスなどのウイルス；またはウイロイドが挙げられる。細胞は、上記の生物体の均質培養物もしくは集団、あるいはいくつかの異種生物体のコレクション、例えば混合培養物、共同体もしくは生態系に由来し得る。
本明細書で使用される候補薬剤は天然に存在するものであってよく、例えば、天然の集団から収穫されるものであってよい。例えば、候補薬剤は、多細胞生物または共同体から単離された遺伝的に天然の細胞であり得る。同様に、1つ以上の遺伝的に天然の細胞または生物体から得られたタンパク質、核酸または他の生体分子を使用することができる。あるいは、候補薬剤は合成されてもよく、または天然薬剤の改変された変異体であってもよい。例えば、遺伝子操作された細胞、タンパク質または核酸が、本明細書に記載の方法において使用され得る。候補薬剤として使用される細胞または細胞成分は、単細胞生物または多細胞生物に由来し得る。特定の実施形態では、幹細胞、免疫細胞またはこれらの細胞型の1つ以上に由来する生体成分を、候補薬剤として本明細書で使用することができる。
いくつかの実施形態では、候補薬剤の合成と並行して核酸タグを合成することができる。例えば、コンビナトリアルケミストリー手法を用いて候補薬剤のライブラリーを合成することができ、特定のヌクレオチド（またはヌクレオチド配列）を加えて、多くの異種化学成分のいずれがライブラリーの各成員に付加されるかを示すことができる。したがって、特定の候補薬剤に結合したタグ中のヌクレオチド配列は、特定の候補薬剤の合成履歴、その特定の候補薬剤の化学構造を決定するために任意に使用され得る情報を提供する。結合およびコンビナトリアル合成方法に使用される化学物質は、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献４；特許文献５または特許文献６に記載されている。
本明細書に記載の方法の特定の実施形態は、候補薬剤のライブラリーをコンビナトリアル合成する工程を含み、ここで、各候補薬剤で実施されるコンビナトリアル合成の個々の反応は、1つ上のヌクレオチドの特有のシグネチャーの、上記候補薬剤の各々に結合した核酸タグへの付加によって追跡され、それにより候補薬剤のライブラリーを提供し、ここで各候補薬剤は特有の核酸タグに結合している。
核酸タグを候補薬剤に、核酸および使用中の特定のタイプの候補薬剤との使用に適した当該技術者分野で知られている任意の様々な化学物質を用いて結合させることができる。特定の実施形態では、核酸タグは候補薬剤に共有結合する。候補薬剤が核酸であるか、または核酸によってコードされる場合、連続核酸は、タグ配列および候補薬剤配列を含むことができる。化学的方法を用いて、核酸タグを、候補薬剤として働くか、または候補薬剤をコードする別の核酸に共有結合させることも可能である。核酸タグを候補薬剤に（候補薬剤が核酸または他の種であろうとなかろうと）結合させるのに適した化学物質には、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（NHSエステル）、イミドエステル、ヒドラジン、カルボジイミド、マレイミド、ハロアセチル、ピリジニルジスルフィド、ジアジリン、クリック化学物質（例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献７；特許文献８；特許文献９；特許文献１０；または特許文献１１を参照）またはスルフヒドリルが挙げられる。他の有用な化学物質には、核酸をビーズまたは他の固体支持体に結合させるために使用されているものが挙げられ、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献１２または特許文献１３に記載されている通りである。
タグ配列は、任意の様々な長さであり得る。より長い配列は、一般に、集団に対してより多くのおよび多様なタグを収容することができる。一般に、複数の全プローブは（異なる配列ではあるが）同じ長さのタグを有することになるが、異なる長さのタグを異なるプローブに使用することも可能である。タグ配列は、少なくとも2、4、6、8、10、12、15、20またはそれ以上の長さのヌクレオチドであり得る。その代わりに、またはそれに加えて、タグ配列の長さは、最大で20、15、12、10、8、6、4またはそれ以下のヌクレオチドであり得る。使用され得るタグ配列の例は、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献１４および特許文献１５に記載されている。
本開示の方法は、候補薬剤のライブラリーを固体支持体と接触させ、候補薬剤を固体支持体に結合させる工程を含むことができる。その結果、候補薬剤のアレイを支持体上に形成することができ、そのアレイは、それぞれがライブラリーからの個々の候補薬剤に結合する個々のフィーチャーを含んでいる。
任意の様々な固体支持体を使用することができる。特に有用な固体支持体は、核酸アレイに使用されるものである。例としては、ガラス、変性ガラス、官能化ガラス、無機ガラス、マイクロスフェア（例えば不活性および／または磁性粒子）、プラスチック、多糖類、ナイロン、ニトロセルロース、セラミック、樹脂、シリカ、シリカベースの物質、炭素、金属、光ファイバーまたは光ファイバー束、重合体およびマルチウェル（例えば、マイクロタイター）プレートが挙げられる。例示的なプラスチックには、アクリル、ポリスチレン、スチレンと他の物質の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタンおよびTeflon（商標）が挙げられる。例示的なシリカベースの物質には、ケイ素および様々な形態の変性ケイ素が挙げられる。
特定の実施形態では、固体支持体は、ウェル、チューブ、チャネル、キュベット、ペトリ皿、ボトルなどの容器内にあり得るか、またはその一部であり得る。特に有用な容器は、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献１；特許文献２および特許文献３、または非特許文献１に記載のようなフローセルである。例示的なフローセルは、Illumina社（サンディエゴ、カリフォルニア州）によって市販されているGenome Analyzer（登録商標）、MiSeq（登録商標）、NextSeq（登録商標）もしくはHiSeq（登録商標）プラットホームなどの配列決定プラットフォームでの使用のためのフローセルである。別の特に有用な容器は、マルチウェルプレートまたはマイクロタイタープレート中のウェルである。
任意に、固体支持体はゲルコーティングを含むことができる。核酸の固体支持体へのゲルを介した結合は、Illumina社（サンディエゴ、カリフォルニア州）から市販されているフローセルによって例示されるか、または、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８もしくは特許文献１９に記載されている。本明細書に記載の方法および装置において使用され得る例示的なゲルには、限定されないが、アガロースなどのコロイド構造；ゼラチンなどのポリマーメッシュ構造；またはポリアクリルアミド、SFA（例えば、参照により本明細書に組み込まれる特許文献１６を参照）もしくはPAZAM（例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献１７、もしくは特許文献１８を参照）などの架橋ポリマー構造を有するものが挙げられる。ゲルを使用して、候補薬剤に直接（例えば、ゲルと候補薬剤との間の共有結合を介して）結合させるか、または、候補薬剤に既に結合している相補的核酸へのゲル結合核酸のハイブリダイゼーションを介して結合させることができる。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、核酸および／または候補薬剤を結合させることができるフィーチャーのアレイとして構成され得る。特定の実施形態では、各フィーチャーは、1つだけの候補薬剤を収容することになるか、さもなければ候補薬剤の特定の混合物の単一種を含有するように構成されることになる。フィーチャーは、任意の様々な所望の形式で存在することができる。例えば、フィーチャーは、ウェル、ピット、チャネル、リッジ、隆起領域、ペグ、ポストなどであり得る。いくつかの実施形態では、フィーチャーはビーズを含有することができる。しかし、特定の実施形態では、フィーチャーはビーズまたは粒子を含む必要はない。例示的なフィーチャーには、454 LifeSciences（Rocheの子会社、バーゼル、スイス）またはIon Torrent（Life Technologiesの子会社、カールズバッド、カリフォルニア州）によって販売される商業的配列決定プラットフォームに使用される基質に存在するウェルが挙げられる。ウェルを有する他の基質には、例えば、エッチングされた光ファイバー、および各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献２０；特許文献２１；特許文献２２；特許文献２３；特許文献２４；特許文献２５；特許文献２６；特許文献２７；特許文献２８；特許文献２９；特許文献３０または特許文献３１に記載の他の基質が挙げられる。いくつかの実施形態では、基質のウェルは、参照により本明細書に組み込まれる特許文献３２に記載のようなゲル物質（ビーズの有無にかかわらない）を含み得る。
固体支持体上のフィーチャーは、上記で例示したガラス、プラスチックまたは他の物質などの非金属表面上の金属フィーチャーであり得る。金属フィーチャーを有する例示的な固体支持体およびその製造方法は、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献３３または特許文献３２に記載されている。
フィーチャーは、スポットまたはパッチの格子として固体支持体に表示される。フィーチャーは、反復パターンまたは不規則な非反復パターンで配置され得る。特に有用な反復パターンは、六角形パターン、直線パターン、格子パターン、鏡映対称性を有するパターン、回転対称性を有するパターンなどである。非対称パターンも有用であり得る。ピッチは、最も近い隣接フィーチャーの異なる対の間で同じであってもよく、またはピッチは、最も近い隣接フィーチャーの異なる対の間で変化してもよい。
高密度アレイは、約15μm未満の平均ピッチ（隣接フィーチャーについて）を有することを特徴とする。中密度アレイは約15〜30μmの平均ピッチを有し、低密度アレイは30μmを超える平均ピッチを有する。本発明に有用なアレイは、100μm、50μm、10μm、5μm、1μmまたは0.5μm未満の平均ピッチを有し得る。上記または本明細書の他の場所に記載の平均ピッチ値および範囲は、秩序アレイまたはランダムアレイに適用可能であることを意図している。
特定の実施形態では、固体支持体上のフィーチャーは、各々が約100nm2、250nm2、500nm2、1μm2、2.5μm2、5μm2、10μm2、100μm2、または500μm2以上の面積を有し得る。その代わりに、またはそれに加えて、フィーチャーは、各々が約1mm2、500μm2、100μm2、25μm2、10μm2、5μm2、1μm2、500nm2、または100nm2以下の面積を有し得る。上記範囲は、上から見た際または上から撮像した際の固体支持体上のビーズまたは他の粒子の見掛け領域を表すことができる。
特定の実施形態では、固体支持体は、ビーズまたは他の粒子のコレクションを含むことができる。表面上に配置されたビーズを有するアレイの例には、BeadChip（商標）アレイ（Illumina社、サンディエゴ、カリフォルニア州）などのビーズがウェルに位置するもの、454 LifeSciences（Rocheの子会社、バーゼル、スイス）からの配列決定プラットフォームで使用される基質、またはIon Torrent（Life Technologiesの子会社、カールズバッド、カリフォルニア州）の配列決定プラットフォームで使用されている基質が挙げられる。ビーズを表面上に有する他の固体支持体は、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献２０；特許文献２１；特許文献２２；特許文献２３；特許文献２４；特許文献２５；特許文献２６；特許文献２７；特許文献２８；特許文献２９；特許文献３０または特許文献３１に記載されている。上記参考文献のいくつかは、ビーズを固体支持体の中または上に充填する前に、核酸をビーズに結合させる方法を記載している。このように、ビーズのコレクションは、各々が結合した特有の核酸を有する異種ビーズを含むことができる。しかし、ユニバーサルプライマーを含むようにビーズを作製することができ、次いでビーズをアレイ上に充填することができ、それにより本明細書に記載の方法で使用するユニバーサルアレイを形成できることが理解されるであろう。候補薬剤を、ビーズが固体支持体に充填される前または後に、ビーズに結合させることができる。先に述べたように、ビーズアレイに典型的に使用される固体支持体は、ビーズなしで使用することができる。例えば、核酸（プローブもしくはプライマーなど）または候補薬剤は、ウェルに直接結合させることができるか、またはウェル中のゲル物質に結合させることができる。したがって、上記参考文献は、本明細書に記載の方法および組成物における使用のために改変することができる物質、組成物または装置の実例である。
したがって、本明細書に記載の方法で使用される固体支持体は、異種候補薬剤または異種核酸がアレイ中の異種ビーズに結合されているビーズアレイを含むことができる。この実施形態では、各ビーズを異種候補薬剤または核酸に結合させることができ、異種核酸を固体支持体に効果的に結合させるために、ビーズを固体支持体上にランダムに分布させることができる。任意に、固体支持体は、単一ビーズまたは単一候補薬剤だけを収容する寸法を有するウェルを含むことができる。そのような構成では、ビーズは、ウェル内にビーズがはめ込まれることによって生じる力のために、ウェルに結合することがある。また、結合性化学物質または接着剤を使用して、ビーズをウェル内に保持することも可能である。
固体支持体は、複数の核酸または候補薬剤を含むことができるか、または固体支持体を本明細書に記載の方法により作製し、複数の核酸または候補薬剤を結合させることができる。例えば、固体支持体は、少なくとも10、100、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109もしくはそれ以上の異種核酸または候補薬剤を含み得る。その代わりに、またはそれに加えて、固体支持体は、最大で1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、100、10もしくはそれ以下の異種核酸または候補薬剤を含み得る。異種核酸または候補薬剤の各々は、例えば、候補薬剤の核酸成分が増幅されてクラスターを形成する場合、いくつかのコピーで存在し得ることが理解されるであろう。したがって、上記範囲は、固体支持体上の異種候補薬剤または核酸クラスターの数を表すことができる。また、上記範囲は、特定の核酸または候補薬剤に特有のものとして、本明細書に記載される異種タグ、または他の配列要素の数を表せることも理解されるであろう。その代わりに、またはそれに加えて、その範囲は、本明細書に記載の方法を用いて固体支持体上に作製された伸長核酸または修飾候補薬剤の数を表すことができる。
フィーチャーは、固体支持体を核酸または候補薬剤と接触させる前に、固体支持体上に存在し得る。例えば、核酸または候補薬剤がプライマーへのハイブリダイゼーションを介して支持体に結合する実施形態では、フィーチャーの外側の間質領域は実質的にいずれのプライマーも欠くのに対して、プライマーをフィーチャーに結合させることができる。核酸または候補薬剤を、固体支持体上の予め形成されたフィーチャーで捕捉することができ、場合によっては、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献３３、特許文献３４、または特許文献３２に記載の方法を使用して固体支持体上で増幅させることができる。
いくつかの実施形態では、核酸タグおよび／または候補薬剤の固体支持体への結合の間または結合の後にフィーチャーが形成される。例えば、固体支持体はプライマーのローンを有していてもよく、そうでなければフィーチャーを欠いていてもよい。この場合、核酸または候補薬剤を固体支持体上に結合させることによってフィーチャーを形成することができる。任意に、得られたクラスターがフィーチャーとなるように、捕捉された核酸を固体支持体上で増幅することができる。結合は、プライマーと別の核酸の相補的部分との間の捕捉として上記で例示されているが、プライマー以外の捕捉成分は、予め形成されたフィーチャーにまたはローンとして存在し得ることが理解されるであろう。他の例示的な捕捉成分には、限定されないが、核酸もしくは候補薬剤と反応して共有結合を生成することができる化学成分、または核酸もしくは候補薬剤上のリガンドに非共有結合することができる受容体が挙げられる。
特定の実施形態では、核酸プライマーは固体支持体に結合することになる。結合した核酸タグを有する候補薬剤ライブラリーは、結合した核酸プライマーへの核酸タグのハイブリダイゼーションを介して固体支持体に結合することができる。例えば、核酸タグはユニバーサルプライマー結合配列を含むことができ、核酸プライマーはユニバーサルプライマー配列を含むことができ、候補薬剤は、ユニバーサルプライマー結合配列のユニバーサルプライマー配列へのハイブリダイゼーションを介して固体支持体に結合することができる。ユニバーサルプライマーの代替として、固体支持体は、特定のタグ配列にハイブリダイズする標的特異的プライマーを含むことができる。
フィーチャー当たり単一の候補薬剤のアレイは、候補薬剤の固体支持体への結合によって形成することができる。したがって、固体支持体上の1つ以上のフィーチャーは、それぞれが単一の候補薬剤（例えば、単一分子、単一細胞または他の単一単位体）を含むことができる。フィーチャーは、いくつかの実施形態では、特定のタイプの単一候補薬剤だけを収容するように構成され得る。しかし、フィーチャーが1つより多い候補薬剤を収容することができるか否かにかかわらず、フィーチャーはそれでもなお、単一候補薬剤だけ、b個だけの単一核酸タグ、または単一候補薬剤および単一核酸酸タグの両方だけを含んでよい。あるいは、個々のフィーチャーは、複数の候補薬剤および／または核酸タグを含むことができる。例えば、個々のフィーチャーは、互いに同じ配列を有する核酸分子の集合体および／またはタンパク質の集合体を含むことができる。特定の実施形態では、集合体は単一の核酸鋳型からの増幅によって生成され、例えば各フィーチャーに結合したクラスターとしてアンプリコンを生成する。
本明細書に記載の方法は、任意の様々な増幅技法を使用することができる。使用され得る例示的な技法には、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ローリングサークル増幅（RCA）、多置換増幅（MDA）、またはランダムプライム増幅（RPA）が挙げられる。いくつかの実施形態では、増幅を溶液中で行うことができる。好ましくは、本開示の方法で使用される増幅技法は固相上で行われることになる。特に、固体支持体に結合し、核酸タグにハイブリダイズする1つ以上のプライマー種（例えば、核酸タグ中に存在する1つ以上のユニバーサルプライマー結合部位に対するユニバーサルプライマー）を、増幅技法で伸長することができる。固相PCRの実施態様を例に取ると、増幅に使用されるプライマーの一方または両方を固体支持体に（例えばゲルを介して）結合させることができる。固体支持体に結合した2種のプライマーを利用する形式は、二本鎖アンプリコンが、コピーされた鋳型配列に隣接する2つの固体支持体結合プライマー間にブリッジ様構造を形成するため、ブリッジ増幅と称されることが多い。ブリッジ増幅に使用され得る例示的な試薬および条件は、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献３５、特許文献３６、特許文献３３、特許文献３７、特許文献３８、特許文献３９、特許文献４０または特許文献４１に記載されている。固体支持体に結合した増幅プライマーの1つと、溶液中の第2プライマーを用いて、固相PCR増幅を行うこともできる。固体支持体結合プライマーと可溶性プライマーとの組合せを使用する例示的な形式は、エマルジョンPCRにおいて使用される形式であり、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる非特許文献２、特許文献４２、または特許文献４３または特許文献４４に記載の通りである。エマルジョンPCRはその形式の例証であり、本明細書に記載の方法の目的については、エマルジョンの使用は任意であり、実際にいくつかの実施形態ではエマルジョンを使用しないことが理解されるであろう。
RCA技法を、本開示の方法での使用のために改変することができる。RCA反応に使用され得る例示的な成分およびRCAがアンプリコンを生成する原理は、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる非特許文献３および特許文献４５に記載されている。RCAに使用されるプライマーは、溶液中に存在していてもよく、または固体支持体に結合していてもよい。プライマーは、本明細書に記載のユニバーサルプライマーのうちの1つ以上であり得る。
MDA技法を、本開示の方法での使用のために改変することができる。MDAのいくつかの基本原理および有用な条件は、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；特許文献４６；特許文献４７；特許文献４８に記載されている。MDAに使用されるプライマーは、溶液中に存在していてもよく、または増幅部位で固体支持体に結合していてもよい。この場合も、プライマーは、本明細書に記載のユニバーサルプライマーのうちの1つ以上であり得る。
特定の実施形態では、上に例示した増幅技法の組み合わせを使用することができる。例えば、RCAおよびMDAを組み合わせて使用することができ、ここでRCAを使用してコンカテマーアンプリコンを溶液中に生成する（例えば溶液相プライマーを使用して）。次いで、アンプリコンを、固体支持体に結合したプライマー（例えば、ユニバーサルプライマー）を用いるMDAの鋳型として使用することができる。この例では、RCAとMDAを組み合わせた工程の後に生成されるアンプリコンが固体支持体に結合することになる。
本開示の方法は、候補薬剤アレイをスクリーニング剤または刺激剤と接触させる工程を含むことができる。アレイ中の1つ以上の候補薬剤は、場合によってはスクリーニング剤と反応してもよく、または刺激剤に応答してもよい。その結果、1つ以上の候補薬剤をヒット物質として分類することができる。
いくつかの実施形態では、スクリーニング剤は、1つ以上の候補薬剤に結合することによって、または候補薬剤と候補薬剤に対する親和性を有する検体との間の結合を遮断することによって、アレイ中の1つ以上の候補薬剤と反応することになる。アレイを検出し、スクリーニング剤が結合しているフィーチャーを同定することができる。例えば、スクリーニング剤は、例えばスクリーニング剤上に存在する標識のために検出可能なシグナルを生成することができる。
いくつかの実施形態では、スクリーニング剤は、候補薬剤が存在するアレイ上の1つ以上のフィーチャーを修飾することになる。例えば、スクリーニング剤は、候補薬剤、スクリーニング剤またはその両方を化学修飾することによって、候補薬剤と反応することができる。アレイを検出し、修飾が加えられたフィーチャーを同定することができる。特に、修飾は、例えば候補薬剤が存在するフィーチャーに結合している標識のために検出可能なシグナルを生成することができる。例示的な修飾には、以下が挙げられる：候補薬剤が存在するフィーチャーへの標識成分の付加；候補薬剤が存在するフィーチャーへの親和性成分の付加であって、親和性成分を標識に結合させること；候補薬剤が存在するフィーチャーにおける蛍光消光剤の除去であって、消光剤の除去により発光シグナルを生じさせること；候補物質が存在するフィーチャーへの蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）ドナーまたはアクセプター成分の添加であって、その添加でフィーチャーから放出される見掛けの発光波長を変化させること；候補薬剤が存在するフィーチャーからの標識成分の除去；候補薬剤が存在するフィーチャーからの親和性成分の除去であって、親和性成分を標識に結合させること；候補薬剤が存在するフィーチャーからの蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）ドナーまたはアクセプター成分の除去であって、その除去でフィーチャーから放出される見掛けの発光波長を変化させることなど。
いくつかの実施形態では、スクリーニング剤は、アレイ中の1つ以上の候補薬剤と反応して検体を生成することになる。アレイを検出し、検体が生成されたフィーチャーを同定することができる。例えば、検体は、検出可能なシグナルを生成することができる。生成され得る例示的な検体には、発光標識、検出可能な受容体のリガンド、酵素により使用されて検出可能な生成物を生成する基質などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、スクリーニング剤は、候補薬剤のライブラリーと直接接触する必要はない。むしろ、捕捉剤をスクリーニング剤と接触させて捕捉生成物を生成し、次いで捕捉生成物を候補捕捉剤のコレクションと接触させることができる。別の実施形態では、捕捉剤を候補薬剤のコレクションと接触させて捕捉生成物を生成し、次いで捕捉生成物をスクリーニング剤と接触させることができる。捕捉生成物を使用する実施形態によって例示されるように、スクリーニング剤を候補薬剤について所望のもしくは推測される構造または機能を示すのに有用なものとするために、スクリーニング剤を候補薬剤と直接接触させる必要はない。
本明細書に記載の方法は、アレイをスクリーニング剤と接触させる間またはその後に、候補薬剤アレイを検出する工程をさらに含み、それによりアレイ中の少なくとも1つの候補薬剤がスクリーニング剤と反応することを判定することができる。アレイが結合される固体支持体は、本明細書に記載の任意の様々な状態であり得る。例えば、固体支持体は候補薬剤を、それに結合した核酸タグと共に含むことができる。あるいは、固体支持体は、核酸タグを含まなくてもよく、代わりに候補薬剤から核酸タグを除去した後の状態にある。核酸（例えば、タグおよび／または核酸ベースの候補薬剤）は、検出工程中は単一分子形態または集合体形態であり得る。さらなる実施形態では、固体支持体は候補薬剤を含まなくてもよく、代わりに候補薬剤を除去した後の状態にある。したがって、検出は、本明細書に記載の方法の任意の様々な時点で行うことができる。
任意の様々なシグナルを、本明細書に記載のスクリーニング工程で検出することができ、例えば、放射線の吸光度、発光、発光寿命、発光偏光などの光シグナル；レーリーおよび／またははミー散乱；磁気特性；電気特性；電荷；質量；放射能などが挙げられる。本明細書に記載の方法で検出され得る例示的な標識には、限定されないが、フルオロフォア、発光団、発色団、ナノ粒子（例えば、金、銀、カーボンナノチューブ）、重原子、放射性同位元素、質量標識、電荷標識、スピン標識、受容体、リガンドなどが挙げられる。
特定の実施形態は画像技術を使用する。当該技術分野で知られている検出装置を用いて画像を得ることができる。例としては、光、明視野、暗視野、位相コントラスト、蛍光、反射、干渉、または共焦点画像化用に構成された顕微鏡が挙げられる。特定の実施形態では、蛍光顕微鏡（例えば、共焦点蛍光顕微鏡）を用いて、例えば蛍光標識によって蛍光を発するスクリーニング剤（または他の検体）を検出することができる。蛍光標本はまた、Illumina社（サンディエゴ、カリフォルニア州）によって市販されているGenome Analyzer（登録商標）、MiSeq（登録商標）、NextSeq（登録商標）もしくはHiSeq（登録商標）プラットフォーム装置；またはLife Technologies（カールズバッド、カリフォルニア州）によって市販されているSOLiD（商標）配列決定プラットフォームなどの蛍光検出用の光学部品を有する核酸配列決定装置を用いて、画像化され得る。使用され得る他の結像光学系には、各々が参照により本明細書に組み込まれる非特許文献１、特許文献４９、特許文献５０または特許文献５１；特許文献５２、特許文献５３、特許文献５４、特許文献５５または特許文献５６、および特許文献５７に記載の検出装置において見られるものが挙げられる。
固体支持体の画像を所望の分解能で得て、例えば、固体支持体上のアレイ中の候補薬剤を識別することができる。したがって、分解能は、少なくとも0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、500μm、1mmまたはそれ以上で離間したアレイのフィーチャーを識別するのに十分なものであり得る。その代わりに、またはそれに加えて、分解能は、最大で1mm、500μm、100μm、50μm、10μm、5μm、1μm、0.5μmまたはそれ以下で離間したアレイのフィーチャーを識別するように設定することができる。
本開示の方法は、核酸タグを配列決定して、固体支持体（例えば、アレイ）上の候補薬剤に結合したタグ配列を決定する工程を含むことができる。多くの実施形態では、候補薬剤はアレイ中にランダムに配置され、配列決定反応は、異種候補薬剤の各々を特定する情報を提供する。配列決定は、候補薬剤およびその核酸タグが結合している固体支持体上で行うことができる。したがって、核酸タグは、その配列を決定するために固体支持体から除去される必要はない。場合によっては、核酸タグで配列決定反応を行う前に、候補薬剤を固体支持体から除去してもよい。
いくつかの実施形態では、候補薬剤は核酸であるか、または候補薬剤をコードする核酸に結合している。そのような実施形態では、配列決定技術を用いて候補薬剤の配列を決定することができる。配列決定は、候補薬剤が結合している固体支持体上で行うことができる。候補薬剤およびその核酸タグを、一緒に配列決定する（例えば、連続配列決定読み取りにおいて）、または別々に配列決定することができる（例えば、タグの配列決定と候補薬剤の配列決定との間で非配列決定工程を実施することができる）。
本開示の方法は、時間ベースの検出または候補薬剤アレイの反応速度測定を採用することができる。したがって、アレイの検出は、複数の時点でアレイ上の個々のフィーチャーのうちの1つ以上についてシグナルを取得することを含むことができる。本明細書に記載の任意の様々なシグナルおよび標識は、時間ベースの分析または反応速度分析で検出することができる。
本開示の方法は、核酸タグを配列決定して、アレイ中の候補薬剤に結合したタグ配列を決定する工程を含むことができる。いくつかの実施形態では、候補薬剤は核酸であり、候補薬剤はそれが結合する核酸によってコードされる（例えば、mRNAまたはcDNAに結合したタンパク質候補薬剤）か、または候補薬剤は核酸を含有する（例えば、核酸を含有する細胞）。合成時配列決定（SBS）技法などの配列決定技法は、特に有用な方法である。
SBSは、以下のようにして行うことができる。第1SBSサイクルを開始するために、1つ以上の標識ヌクレオチド、DNAポリメラーゼ、SBSプライマーなどを、固体支持体上の1つ以上のフィーチャー（例えば、核酸が固体支持体に結合しているフィーチャー（単数または複数））と接触させることができる。SBSプライマー伸長が標識ヌクレオチドの組み込みをもたらしたフィーチャーを検出することができる。任意に、ヌクレオチドは、ヌクレオチドがSBSプライマーに添加された時点でさらなるプライマー伸長を終結させる可逆的終結成分を含むことができる。例えば、可逆的終結成分を有するヌクレオチド類似体をプライマーに添加し、非ブロック化剤が送達されてその成分を除去するまで、その後の伸長が起こらないようにすることができる。したがって、可逆的終結を使用する実施形態では、非ブロック化剤を固体支持体に送達することができる（検出が起こる前または後に）。様々な送達工程の間に洗浄を行うことができる。次いで、このサイクルをn回繰り返してプライマーをnヌクレオチド伸長させ、それにより長さnの配列を検出することができる。本開示の組成物、装置または方法での使用に容易に適用することができる例示的なSBS手順、流体システムおよび検出プラットフォームは、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる非特許文献１、特許文献４９、特許文献５０または特許文献５１；特許文献５２、特許文献５３、特許文献５４、特許文献５５または特許文献５６、および特許文献５７に記載されている。
パイロ配列決定などの、環状反応を使用する他の配列決定法を使用することができる。パイロ配列決定は、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖に組み込まれる際の無機ピロリン酸（PPi）の放出を検出する（各々が参照により本明細書に組み込まれる非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；または特許文献２４、特許文献２５もしくは特許文献２６）。パイロ配列決定では、放出されたPPiは、ATPスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（ATP）に直ちに変換されることによって検出することができ、生成されたATPのレベルはルシフェラーゼ産生光子を介して検出することができる。したがって、配列決定反応は、発光検出システムを介して観察することができる。蛍光ベースの検出システムに使用される励起放射線源は、必ずしもパイロ配列決定手順に必要ではない。パイロ配列決定を本開示の装置、組成物または方法に適用する際に使用され得る有用な流体システム、検出器および手順は、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献５８、特許文献５９、特許文献６０または特許文献６１に記載されている。
ライゲーション時配列決定反応も有用であり、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる非特許文献１１；または特許文献６２もしくは特許文献６３に記載のものが挙げられる。いくつかの実施形態は、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；または特許文献６４に記載のようにハイブリダイゼーション時配列決定手順を含むことができる。ライゲーション時配列決定およびハイブリダイゼーション時配列決定手順の両方において、アレイの部位に存在する核酸は、オリゴヌクレオチド送達および検出の反復サイクルにかけられる。本明細書または本明細書で引用した参考文献に記載の組成物、装置または方法は、ライゲーション時配列決定またはハイブリダイゼーション時配列決定手順に容易に適合させることができる。典型的には、オリゴヌクレオチドを蛍光標識し、本明細書または本明細書で引用した参考文献のSBS手順に関して記載されたものと同様の蛍光検出器を用いて検出することができる。
いくつかの配列決定の実施形態は、DNAポリメラーゼ活性のリアルタイム観察を伴う方法を利用することができる。例えば、ヌクレオチド取り込みは、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγ-リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）相互作用、またはゼロモード導波路（ZMW）によって検出することができる。FRETベースの配列決定の技法および試薬は、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７に記載されている。
いくつかの配列決定の実施形態は、ヌクレオチドの伸長産物への組み込みの際に放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づく配列決定は、Ion Torrent（ギルフォード、コネチカット州、Thermo Fisher子会社）から市販されている電気検出器および関連技法、または各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献２７；特許文献２８；特許文献２９；もしくは特許文献３０に記載の配列決定法およびシステムを使用することができる。
本開示の方法は、1つ以上の候補薬剤を固体支持体から除去する工程をさらに含むことができる。特定の実施形態では、フィーチャーの核酸タグを配列決定する前に、候補薬剤をアレイのフィーチャーから除去することができる。これは、候補薬剤が配列決定技法に干渉する場合、または配列決定技法で使用される試薬から候補薬剤を保護することが望ましい場合に有益であり得る。いくつかの実施形態では、スクリーニングにおいてヒット物質として同定された1つ以上の候補薬剤をアレイから選択的に除去することができる。
いくつかの実施形態では、候補薬剤は、それを固体支持体に結合させているテザーを切断することによって除去することができる。例えば、候補薬剤は、それが結合している核酸タグを介して固体支持体につながれていてもよい。タグ核酸が、相補的核酸へのハイブリダイゼーションによって支持体に結合する場合、ハイブリッド複合体を変性させることによって除去を達成することができる。あるいは、核酸タグは、候補薬剤への結合点とタグ配列との間に位置する切断部位を含むことができる。このように、候補薬剤を、切断部位を標的とする切断反応によってタグ配列から分離することができる。いくつかの方法では、増幅または修飾工程の間に、切断部位を核酸に導入することができる。例えば、切断部位を、伸長工程の間に伸長プライマーに導入することができる。
例示的な切断部位には、限定されないが、結合切断をもたらす化学的、酵素的または物理的過程を受け易い成分が挙げられる。例えば、その位置は、エンドヌクレアーゼによって認識されるヌクレオチド配列であり得る。適切なエンドヌクレアーゼおよびそれらの認識配列は、当該技術分野でよく知られており、多くの場合市販されている（例えば、New England Biolabs、ビバリー、マサチューセッツ州；ThermoFisher、ウォルサム、マサチューセッツ州またはSigma Aldrich、セントルイス、ミズーリ州から）。特に有用なエンドヌクレアーゼは、核酸中の結合部位に対して3'側の離れた部位で核酸鎖の結合を切断し、その例にはII型またはII型制限エンドヌクレアーゼが挙げられる。
光解離性成分は、有用な切断部位を提供する。例示的な光解離性成分には、限定されないが、(1-(4,5-ジメトキシ-2-ニトロフェニル)エチル)エステル（すなわちDMNPE）および(1-(2-ニトロフェニル)エチル)エステル（すなわちNPE）が挙げられる。参照により本明細書に組み込まれる非特許文献１８を参照。他の光解離性成分、ならびにその合成および使用のための方法は、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献４９または特許文献６５に記載されている。光解離性成分は、候補薬剤の個々のフィーチャーからの標的切断に有利に使用することができる。空間分解放射線（例えば、レーザー、集束光源および／または空間フィルタ／マスクからの）を使用して、特定の候補薬剤が光解離性成分を介して繋がれている個々のフィーチャーにアドレスすることができる。その結果、特定の候補薬剤を選択的に除去することができる（同じアレイ上の他のフィーチャーの候補薬剤と比較して）。
いくつかの実施形態では、切断部位は、脱塩基部位であるか、または脱塩基部位を作るために除去されやすい塩基を有するヌクレオチドである。脱塩基部位を形成するために除去されやすいヌクレオチドの例には、ウラシルおよび8-オキソ-グアニンが挙げられる。特定の実施形態では、New England Biolabsから入手可能なUSER（商標）試薬が使用される。核酸を切断するために使用され得る切断部位および方法の他の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる特許文献６６に記載されている。
本開示は、タンパク質アレイの作製方法をさらに提供する。本方法は、以下の工程を含むことができる：（a）固体支持体に結合したcDNA分子のライブラリーを提供する工程と；（b）固体支持体上のcDNA分子を増幅してクラスターを形成する工程であって、各クラスターがライブラリーからの特定のcDNA分子の複数のコピーを含む工程と；（c）クラスターの複数のコピーを転写し、クラスターの各々に結合した複数のmRNA分子を生成する工程と；（d）クラスターのmRNA分子を翻訳し、クラスターの各々に結合した複数のタンパク質を生成する工程。
この開示は、以下の工程を含むタンパク質アレイの作製方法も提供する：（a）mRNA分子のライブラリーを提供する工程であって、ライブラリー中の個々のmRNA分子が標的配列およびタグ配列を含んでいる工程、（b）ライブラリーから第1サブライブラリーを得る工程であって、第1サブライブラリーはタグ配列またはその相補体を有する核酸を含み、核酸が固体支持体上の個々のフィーチャーに結合している工程、（c）ライブラリーから第2サブライブラリーを得る工程であって、第2サブライブラリーは標的配列およびタグ配列またはその相補体を有する核酸を含んでいる工程、（d）第2サブライブラリーを第1サブライブラリーと接触させ、それにより第2サブライブラリーの核酸を、タグ配列とその相補体のハイブリダイゼーションを介して固体支持体に結合させる工程と；（e）固体支持体上の標的配列を翻訳し、個々のフィーチャーに結合したタンパク質のアレイを作製する工程。
ゲノムDNA（gDNA）、メッセンジャーRNA（mRNA）またはコピーDNA（cDNA）分子のライブラリーは、1つ以上の目的のタンパク質を発現する1つ以上の生物体に由来し得る。例えば、所望のタンパク質または所望の活性を有するタンパク質を発現することが推測される生物体からライブラリーを得ることができる。本明細書に記載のもののような当該技術分野で知られている任意の生物体を使用することができる。この生物体は、工業的、治療的、診断的または予後的関心のものであり得る。例えば、ライブラリーは人体から得ることができ、予後または診断目的のためにスクリーニングすることができる。あるいは、生物体は、治療効果をもたらす遺伝子または工業的用途を有する遺伝子を発現すると推測されるものであってもよい。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、非ヒト生物体から得られるか、そうでなければ非ヒト起源である。
いくつかの用途では、gDNA、mRNAまたはcDNA分子のライブラリーは、組み換え生物体のライブラリーで発現される単一遺伝子の変異体を含む。そのような変異体は、限定されないが、各々が参照により本明細書に組み込まれる非特許文献１９および非特許文献２０に記載のものが挙げられる既知のタンパク質工学技法を用いて作製することができる。例えば、変異体を、遺伝子の全部または一部のランダム突然変異誘発によって生成することができる。セミランダム突然変異誘発技法も使用することができる。
本明細書に記載の方法において発現される遺伝子（例えば、mRNA、cDNAまたはタンパク質として）は、抗体、酵素、受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、核内ホルモン受容体、ヒストン修飾酵素および本明細書で例示される他のものからなる群より選択され得る。遺伝子は組み換え体であってよく、例えば、遺伝子の天然の供給源とは異なる生物体において発現されるか、または遺伝子にとって天然ではない修飾を有する。特定の実施形態では、gDNA、mRNA、cDNAまたはタンパク質ライブラリーは、クローニングまたは発現用に一般的に使用される細菌、酵母、昆虫、哺乳動物または他の細胞系から単離することができる。
ライブラリーのそれぞれ個々の成員がタンパク質コード配列およびタグ配列を含むように、異種核酸（例えば、gDNA、mRNAまたはcDNA）のライブラリーを構築することができる。タグ配列を、各タンパク質コード配列にランダムにまたは系統的に割り当てる（すなわち、既知タグが既知変異体とa prioriに関連している）ことができる。一例として、タンパク質もコードすることになる核酸構築物を合成する際に、ランダムヌクレオチドをタグ領域の1つ以上の位置に組み込むことによって、タグをランダムに割り当てることができる。別の例では、平均して各タンパク質コード核酸が特有のタグ配列にライゲーションするように、異種核酸タグの集団を異種タンパク質コード核酸の集団にランダムにライゲーションさせることができる。系統的なタグ付けの例として、特定のタグの核酸構築物への合成は、それが構築物中にあるタンパク質コード配列中の突然変異または変異体とa prioriに相関するような方法で行うことができる。
本明細書に記載の方法は、ライブラリーから第1および第2サブライブラリーを得る工程を含むことができる。いくつかの実施形態では、サブライブラリーは、ライブラリーから画分を除去することによって、またはライブラリーを物理的に分割することによって得られる。一般に、ライブラリーは、各候補薬剤の複数のコピーを含む液体であろう。gDNA、mRNA、cDNA、大環状分子、環状ペプチド、融合分子（例えば、核酸-タンパク質融合）、提示構築物（例えば、ファージ上のペプチド）またはタンパク質などの、任意の様々な候補薬剤を使用することができる。したがって、流体を分画または分割することによって得られるサブライブラリーは、ほぼ同じ内容物を有すると予想される。場合によっては、複数のコピーを作製するために、増幅工程を核酸ライブラリー（例えば、DNAまたはRNAライブラリー）で実施することができる。
gDNA、mRNA、cDNAまたはタンパク質ライブラリーを、本明細書の他の箇所に記載の方法を用いて固体支持体に結合させることができる。特定の実施形態では、mRNA分子ライブラリーが使用され、ここでmRNA分子の各々は、候補薬剤をタグ配列と共にコードする配列を含む。第1サブライブラリーは、ライブラリーのmRNA分子を固体支持体と接触させてmRNA分子を固体支持体に結合させることを含む方法によって得られる。例えば、固体支持体は、固体支持体に結合した核酸プライマーを有することができ、mRNA分子は、核酸プライマーとのハイブリダイゼーションを介して固体支持体に結合することができる。より具体的な例として、mRNA分子はユニバーサルプライマー結合配列を含むことができ、核酸プライマーはユニバーサルプライマー配列を含み、mRNA分子はユニバーサルプライマー結合配列のユニバーサルプライマー配列へのハイブリダイゼーションを介して固体支持体に結合することができる。次いで、結合したmRNA分子を固体支持体上でコピーまたは増幅し、タグ配列の相補体を生成することができる。次いで、第1サブライブラリーと同じライブラリーに由来する第2サブライブラリーを、第1サブライブラリーのアンプリコン（またはコピー）と接触させ、それにより第2サブライブラリーの核酸を、タグ配列とその相補体のハイブリダイゼーションを介して固体支持体に結合させることができる。このようにして、固体支持体を、スクリーニング反応または翻訳に利用可能なmRNA分子のライブラリーを含むように改変し、第2サブライブラリーのmRNA分子によって発現されるタンパク質のライブラリーを生成する。
いくつかの実施形態では、第1核酸または第2核酸サブライブラリーの1つを、溶液中でコピーまたは増幅することができる。このようにして増幅またはコピーされたサブライブラリーは、他のサブライブラリーのタグ配列にハイブリダイズすることができる相補的タグ配列を含むことになる。サブライブラリーのいずれかを固体支持体に結合させることができ、他方のサブライブラリーをハイブリダイズさせ、スクリーニング反応、mRNAを産生する転写反応および／またはタンパク質ライブラリーを生成する翻訳反応に利用可能な核酸分子ライブラリーを有する固体支持体を作製することができる。
mRNAライブラリーを利用する実施形態では、ライブラリー中の個々のmRNA分子の一部または全部を逆転写してcDNAを生成することを含む方法によって、第1サブライブラリーを得ることができる。逆転写は、溶液中または固体支持体上で起こり得る。次いで、得られたcDNA分子を溶液中または固体支持体上で増幅することができる。したがって、ライブラリー中に存在するタグ配列の相補体を有するcDNA分子を生成することができる。場合によっては、cDNA分子は、mRNA分子の一部分だけ、例えば、マルチドメインタンパク質の特定のドメインまたはドメインのサブセットを発現する部分だけを含むことができる。
本発明の方法は、cDNAをmRNAに転写する工程を含むことができる。転写は、各々が参照により本明細書に組み込まれる非特許文献１９および非特許文献２０の文献に記載のような既知のカクテル、または市販されているカクテルを使用して行うことができる。特定の実施形態では、転写は、支持体に結合したcDNA分子上で行われる。転写反応のmRNA産物は、それらが生成されるフィーチャーに結合することができる。例えば、本明細書の実施例２に記載の技法を用いて結合を達成することができる。また、タンパク質を、それらをコードするDNA分子に結合させること（例えば、直接結合またはエマルジョン液滴中の共局在化によって）も有用であり得る。タンパク質は、それらをコードするDNA分子に近接して結合させることもできる（例えば、核酸プログラム型タンパク質アレイ（NAPPA））。
本発明の方法は、mRNAをタンパク質に翻訳する工程を含むことができる。翻訳は、各々が参照により本明細書に組み込まれる非特許文献１９および非特許文献２０に記載のような既知のカクテル、または市販されているカクテルを使用して行うことができる。特定の実施形態では、翻訳は、支持体に結合したmRNA分子上で行われる。翻訳反応のタンパク質産物は、それらが生成されるフィーチャーに結合することができる。例えば、本明細書の実施例２に記載の技法を用いて結合を達成することができる。
本明細書に記載のタンパク質アレイの作製方法を、タンパク質のスクリーニング方法に使用することができる。本方法は、以下の工程を含むことができる：（i）タンパク質アレイを作製する工程と；（ii）タンパク質アレイをスクリーニング剤と接触させる工程であって、アレイ中の1つ以上のタンパク質がスクリーニング剤（または刺激剤）と反応する工程と；（iii）スクリーニング剤（または刺激剤）との接触の間または接触の後にタンパク質アレイを検出し、それによりアレイ中の少なくとも1つのタンパク質がスクリーニング剤（または刺激剤）と反応することを判定する工程。
特定の実施形態では、スクリーニング剤は、1つ以上のタンパク質に結合することによって、またはタンパク質とタンパク質に対する親和性を持つ検体間の結合を遮断することによって、1つ以上のタンパク質と反応する。アレイの検出は、1つ以上のタンパク質に結合しているスクリーニング剤を検出することを含むことができる。例えば、スクリーニング剤は発光性であってもよく、アレイ上の発光を検出することによって検出を行うことができる。
いくつかの実施形態では、スクリーニング剤は、1つ以上のタンパク質を化学修飾することによって、1つ以上のタンパク質と反応する。この場合、アレイの検出は、1つ以上の修飾されたタンパク質を検出することによって達成することができる。例えば、1つ以上の修飾されたタンパク質は発光性であってもよく、アレイ上の発光を検出することによって検出を達成することができる。
いくつかの実施形態では、スクリーニング剤は、検体生成物を生成することによって、1つ以上のタンパク質と反応する。この場合、アレイの検出は、検体生成物を検出することを含む。例えば、検体生成物は発光性であってもよく、アレイ上の発光を検出することによって検出を実施することができる。
本明細書において先に記載したように、アレイの検出は、複数の時点でアレイ上の個々のフィーチャーのうちの1つ以上についてシグナルを取得することを含むことができる。
gDNA、cDNAまたはmRNA分子の一部であるタグ配列は、本明細書に記載の方法または当該技術分野で知られている方法を用いて配列決定することができる。例えば、配列決定反応は、スクリーニングが実施されているか、実施されたか、または実施される予定の固体支持体上で実施することができる。したがって、本明細書に記載の方法は、固体支持体上のタグ配列またはその相補体を配列決定し、それにより固体支持体上の個々のフィーチャーでのタグ配列またはその相補体の位置を決定する工程を含むことができる。そのような方法は、少なくとも1つのタンパク質に結合したタグ配列に基づいて、スクリーニング剤と反応するアレイ中の少なくとも1つのタンパク質を同定する工程をさらに含むことができる。
本明細書に記載の方法は、固体支持体上の候補gDNA、cDNAまたはmRNAを配列決定する工程をさらに含むことができる。したがって、1つ以上の配列決定反応を固体支持体上で行い、タグ配列の同一性および／または候補配列の同一性を決定し、それにより固体支持体上の個々のフィーチャーでの所望の候補薬剤の位置を決定することができる。
場合によっては、gDNA、cDNAまたはmRNAは、配列決定法の平均読み取り長より長くてもよい。そのような場合、候補核酸を複数の配列決定操作にかけ、それぞれで異種プライマーを用いることができる。例えば、第1配列決定操作は、本明細書に記載の配列決定方法論およびプラットフォームまたは本明細書に組み込まれる参考文献において一般的に使用されるユニバーサルプライミング配列にハイブリダイズするプライマーを使用することができる。第1配列決定プライマーがハイブリダイズした位置の下流にハイブリダイズする第2配列決定プライマーを用いて、次の配列決定操作を行うことができる。鋳型核酸の重複するまたは隣接する読み取りを得られるように、プライマーを、配列決定操作の予想される読み取り長に従って配置することができる。候補核酸の所望の領域（単数または複数）をカバーするのに十分な数の配列決定プライマーについて、複数の配列決定操作を繰り返すことができる。
候補核酸が、配列決定法の平均読み取り長よりも長い場合の別の選択肢は、カセット手法を使用することである。カセット手法では、核酸の小さな領域またはドメインが、候補核酸において突然変異または修飾される。カセットは、1回の配列決定操作で読み込むのに十分短いように選択することができる。カセットの上流にある候補核酸の領域がライブラリーの全成員において均一である限り、それはユニバーサルプライミング部位としての役割を効果的に果たし、配列決定プライマーは、カセットでの局在配列決定のために、この領域にハイブリダイズすることができる。
いくつかの実施形態では、候補gDNA、cDNAまたはmRNAを配列決定する必要はない。むしろ、タグの配列決定が候補核酸を同定するのに十分であるように、タグ配列は既知候補核酸配列とa prioriに関連付けられていてもよい。候補核酸と、それがコードするタンパク質と、またはタンパク質の特性とを同定するために、特定のフィーチャーに存在するタグのa prioriな知識を、スクリーニング工程においてフィーチャーから観察されるシグナルと相関させることができる。
いくつかの実施形態では、候補核酸（例えば、gDNA、cDNAまたはmRNA）またはタンパク質は、それを固体支持体に結合させるテザーを切断することによって除去することができる。例えば、そのような候補薬剤は、タグ配列を介して固体支持体に繋がれてもよい。切断部位は、候補薬剤への結合点とタグ配列との間に位置することができる。このように、候補薬剤を、切断部位を標的とする切断反応によってタグ配列から分離することができる。例示的な切断部位には、限定されないが、本明細書の他の箇所に記載されているか、そうでなければ当該技術分野で知られているものが含まれる。
したがって、本開示の方法は、アレイの1つ以上のフィーチャーに結合したgDNA、cDNA、mRNAまたはタンパク質分子を選択的に除去する工程を含むことができる。選択的除去には、例えば、本明細書の他の場所に記載の試薬および方法を使用した、分子をフィーチャーに結合させる光解離性結合の光媒介性切断を挙げることができる。
本開示は、（a）固体支持体と；（b）固体支持体に結合した異種cDNA分子のライブラリーであって、各異種cDNA分子が固体支持体上の個々のフィーチャーに結合しており、各フィーチャーが特定のcDNA分子の複数のコピーを含むライブラリーと；（c）cDNA分子に結合したmRNA分子であって、cDNA分子の各々が、それぞれの結合したmRNA分子に相補的であるmRNA分子と；（d）mRNA分子に結合したタンパク質分子であって、タンパク質分子の各々が、それぞれの結合したmRNA分子によってコードされるタンパク質分子を含むアレイを提供する。
本開示は、（a）mRNA分子のライブラリーであって、ライブラリー中の個々のmRNA分子が標的配列およびタグ配列を含むライブラリーと、（b）タグ配列の相補体を有する核酸を含む固体支持体を含み、核酸が固体支持体上の個々のフィーチャーに結合しており、個々のmRNA分子のタグ配列が、固体支持体上の個々のフィーチャーのそれぞれの相補的タグ配列にハイブリダイズし、mRNA分子の翻訳によって得られるタンパク質が、それぞれのmRNA分子に結合するアレイをさらに提供する。
本開示のアレイは、本明細書に記載の方法の1つ以上の工程から生じる成分を含むことができる。例えば、例えばgDNA、cDNAまたはmRNA種などの核酸は、本明細書に記載の方法に従って固体支持体に結合させることができる。同様に、タンパク質は、本明細書に記載の方法に従って固体支持体に結合させることができる。特定の実施形態では、実施例２および３に記載のように、cDNAを固体支持体に結合させ、コードされたmRNAをcDNAに結合させ、コードされたタンパク質をmRNAに結合させることができる。これらの実施例に記載のように、cDNAを介する結合は任意であり、代わりにmRNAを固体支持体に結合させることができ（例えば、相補的タグへのハイブリダイゼーションまたは他の結合方法を介して）、コードされたタンパク質をmRNAに結合させることができる。
任意に、mRNA分子を、それをコードするcDNA分子に、RNAポリメラーゼで形成された複合体を介して結合させることができる。結合は、複合体化されたcDNA、mRNAおよびRNAポリメラーゼ間の共有結合架橋によって媒介され得る。同様に、タンパク質分子は、それをコードするmRNAに、リボソームと形成された複合体を介して結合することができる。結合は、複合体化されたmRNA、タンパク質およびリボソーム間の共有結合架橋によって媒介され得る。
本明細書に記載のスクリーニング工程の任意の様々なスクリーニング剤、標識または生成物が、本開示のアレイに存在し得る。例えば、タンパク質があるフィーチャーは、任意に、発光分子（スクリーニング剤など）のタンパク質への特異的な非共有結合を介して、またはタンパク質に共有結合した発光成分を介して、発光標識することができる。全てのフィーチャーが必ずしも標識されるわけではない。むしろ、所望の活性または選択された活性を有するタンパク質を含有するフィーチャーのサブセットを選択的に標識し、他のフィーチャーは標識しないことができる。例えば、ライブラリーの内容物およびスクリーニングの性質に応じて、フィーチャーの50%、25%、10%、5%または1%未満を標識してもよい。
本明細書に記載の任意の様々な候補薬剤および／または核酸タグが、本開示のアレイに存在し得る。アレイ上の異なる種の数、アレイ上の種を含有するフィーチャーの密度、または特定のフィーチャーに結合するそれぞれの種の数は、アレイの作製方法および使用方法に関して本明細書に記載される範囲内であり得る。
この開示によって、細胞のスクリーニング方法も提供される。本方法は、以下の工程を含むことができる：（a）複数の異種細胞を提供する工程であって、異種細胞の各々がタグ配列を有する核酸タグを含んでいる工程と；（b）異種細胞の混合物を固体支持体と接触させ、固体支持体に結合した細胞のアレイを形成する工程と；（c）固体支持体上の細胞のアレイを、少なくとも1つの光学特性についてスクリーニングする工程であって、スクリーニング反応が、固体支持体に結合した個々の細胞を検出することを含む工程と；（d）固体支持体に結合した核酸タグのタグ配列を配列決定する工程と；（e）アレイ中の少なくとも1つの細胞を候補細胞として、候補細胞の光学特性およびタグ配列に基づいて同定する工程。
特定の実施形態では、細胞は、候補薬剤として本明細書に記載の方法で使用される。細胞は、多細胞生物体から単離された天然細胞、単細胞生物体を含む天然細胞、多細胞生物体由来の遺伝子操作された細胞または遺伝子操作された単細胞生物体であり得る。本明細書に記載の方法または組成物で使用される細胞は、天然の供給源から得ることができ、またはそれらはex vivo培養物から得ることができる。
Ex vivoでコピー、培養または増殖させることができる細胞は、特に有用である。例えば、スクリーニング工程の前または後に候補細胞の1つ以上のコピーを作製することは有用であり得る。したがって、スクリーニングにおいてヒット物質として同定された細胞（または細胞のクローン）を、事前に作られたストックまたはスクリーニングで使用される固体支持体から単離することができる。単離された細胞をさらに使用もしくは操作して、例えば、細胞をさらに十分に特性評価することができ、または治療手段において細胞を使用することができる。
遺伝子組み換え細胞を使用する実施形態では、遺伝子組み換えは、例えば、以下をもたらすものを含む当該技術分野で知られている任意の様々なものであり得る：非天然組み換えタンパク質の発現、突然変異組み換えタンパク質の発現、天然に存在するタンパク質のコード配列の全部または一部の欠失、天然に存在するタンパク質の発現の阻害、天然に存在するタンパク質の発現の増強、非天然検体の生成または天然検体の生成の阻害。例えば、候補細胞ライブラリー中の1つ以上の遺伝子のコード配列は、点突然変異、欠失（例えば、タンパク質コード配列全体、タンパク質のドメインもしくは他の部分の除去）、または挿入（例えば、キメラ）を含有し得る。
ライブラリー中にある候補細胞は、核酸タグを含むことができる。細胞をタグ付けするいくつかの例示的な方法は、実施例４および／または以下に記載されている。
いくつかの実施形態では、核酸タグを細胞の表面に共有結合させることができる。一般に、ライブラリー中の各細胞を単一核酸タグ配列のみでタグ付けする方法が採用される（とはいえ、同じタグ配列のコピーをそれぞれ有する複数の核酸分子が各細胞内または各細胞上に存在し得る）。例えば、各細胞が核酸タグ分子と個々に反応できるように、細胞を物理的に単離することができる。物理的に細胞を分離する方法には、例えば、個々の容器、マイクロプレート上のウェル、アレイ上のフィーチャー、ビーズ、液滴アクチュエータ装置内の流体小滴、エマルジョン中の流体小滴、または小胞への各細胞の分離が挙げられる。
核酸タグが送達され得る液滴を作製するのに特に有用な方法には、例えば、RainDance Technologies（ビルリカ、マサチューセッツ州）によって市販されているもの、または各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献６７もしくは特許文献６８に記載のものが挙げられる。液滴の作製および液滴へのタグの添加のさらなる方法は、10X Genomicsによって市販されているか、または各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献６９；特許文献７０；特許文献７１または特許文献７２に記載されている。これらの方法を改変し、細胞（または本明細書に記載の他の候補薬剤）が個々の液滴に充填され、充填された液滴が核酸タグを含有する流体と相互作用し、個々の液滴が単一タグ核酸種および単一候補薬剤種で終わるようにすることができる。当然ながら、核酸種の複数のコピーまたは候補薬剤種の複数のコピーが個々の液滴中に存在することができる。いくつかの実施形態では、核酸タグは、個々の液滴に送達されるビーズに結合する。核酸タグは、例えば実施例４に記載の結合性化学物質を用いて細胞の表面に結合することができる。
細胞（または他の候補薬剤）を分離するために、例えば細胞をタグ付けするために使用され得る特に有用な液滴操作装置は、例えば以下に記載の液滴アクチュエータである：特許文献７３、2005年6月28日に登録された、「エレクトロウェッティングベースの技術により液滴を操作するための装置」という名称の特許文献７４；Pamulaらによる、2006年8月31日に公開された「プリント回路基板上で液滴を操作するための装置および方法」という名称の特許文献７５；Pollackらによる、2007年10月25日に公開された「液滴ベースの生化学」という名称の特許文献７６；Shenderovによる、2004年8月10日に登録された「マイクロ流体用の静電アクチュエータおよびその使用方法」という名称の特許文献７７；Shenderovによる、2003年5月20日に登録された「マイクロ流体用の可動部品のないアクチュエータ」という名称の特許文献７８；Kimらによる、2003年11月6日に公開された「エレクトロウェッティング駆動マイクロポンピング」という名称の特許文献７９；Kimらによる、2006年7月27日に公開された「ノズルからの液滴の完全な移動を促進するための方法および装置」という名称の特許文献８０；Kimらによる、2007年2月1日に公開された「プリント回路基板上での小物移動」という名称の特許文献８１；Shahらによる、2009年11月19日に公開された「液滴マイクロ流体における磁性粒子の使用方法」という名称の特許文献８２；Kimらによる、2010年4月22日に公開された「チップ上の液滴の電気的操作のリアルタイムフィードバック制御のための方法および装置」という名称の特許文献８３；Velevによる、2009年6月16日に登録された「流体表面を有する液滴輸送装置および方法」という名称の特許文献８４；Sterlingらによる、2007年1月16日に登録された「エレクトロウェッティングによる、化学的、生化学的および生物学的アッセイなどのためのマイクロ流体制御用の方法、装置および品物」という名称の特許文献８５；Beckerらによる、2010年1月5日に登録された「プログラム可能な流体処理のための方法および装置」という名称の特許文献８６；Beckerらによる、2005年12月20日に登録された「プログラム可能な流体処理のための方法および装置」という名称の特許文献８７；Decreらによる、2008年2月12日に登録された「流体の操作のためのシステム」という名称の特許文献８８；Yamakawaらによる、2006年2月23日に公開された「化学分析装置」という名称の特許文献８９；Wuによる、2011年3月3日に公開された「熱交換化学プロセスのためのデジタルマイクロ流体ベースの装置」という名称の特許文献９０；Fouilletらによる、2009年7月30日に公開された「電極アドレス指定方法」という名称の特許文献９１；Fouilletらによる、2006年5月30日に登録された「静電気力による微小懸垂線に沿った微小液体容積の移動のための装置」という名称の特許文献９２；Marchandらによる、2008年5月29日に公開された「液滴マイクロリアクター」という名称の特許文献９３；Adachiらによる、2009年12月31日に公開された「液体移送装置」という名称の特許文献９４；Rouxらによる、2005年8月18日に公開された「2つまたは複数の固体基質間での液滴の移動を制御するための装置」という名称の特許文献９５；ならびに非特許文献２１、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、ライブラリー中の細胞を、核酸タグを含むように遺伝子組み換えすることができる。例えば、集団中の個々の細胞は、タグ配列をコードするプラスミドを保持することができるか、または個々の細胞のゲノムは、タグ配列を含むように改変することができる。場合によっては、タグ配列は、本明細書に記載の方法でスクリーニングされる遺伝的変異体も含む核酸構築物中にコードされる。
それぞれ個々の細胞がランダムに割り当てられたタグ配列を獲得するように、または各細胞を改変して既知タグ配列を含むようにすることができるように、異種細胞のライブラリーを構築することができる。例えば、ランダムなタグ付けは、スクリーニングされる遺伝的変異体もコードすることになる核酸構築物を合成する際に、ランダムなヌクレオチドをタグ領域の1つ以上の位置に組み込むことによって行うことができる。別の例では、平均して各変異体核酸が特有のタグ配列にライゲーションするように、異種核酸タグの集団を異種変異体コード核酸の集団にランダムにライゲーションさせることができる。次いで、構築物をライブラリー中の細胞に加えることができる。同様に、平均して各細胞が特有のタグ配列に結合するように、異種核酸タグの集団を異種細胞の集団に共有結合させることができる。
他の実施形態では、それぞれ個々の細胞が、既知細胞とa prioriに関連する既知タグを取得するように、異種細胞のライブラリーを構築することができる。A prioriなタグ付けの例として、特定のタグの核酸構築物への合成は、それが上記構築物中の突然変異または変異体と相関するような方法で行うことができる。いくつかの実施形態では、細胞は互いに物理的に分離されており、既知タグ配列を有する核酸を細胞と接触させ、単一タイプのタグの単一細胞との共有結合を形成する。
特定の実施形態では、核酸タグをビーズに結合させることができ、ビーズを細胞に結合させることができる。任意に、ビーズを、特異的結合親和性を有する抗体または細胞に結合させることができる。しかし、他の結合様式を使用してビーズを細胞に結合させることができ、例えば、核酸を候補薬剤または固体支持体に結合させるという文脈において本明細書で例示されるものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、核酸タグは、細胞の原形質膜脂質または脂肪酸への核酸タグの共有結合によって、細胞に結合することができる。あるいは、核酸タグは、細胞の原形質膜脂質中のタンパク質への共有結合によって、細胞に結合することができる。共有結合の代替として、核酸タグは、細胞表面上のリガンドに結合する受容体を含むことができ、または核酸タグは、細胞表面上の受容体に結合するリガンドを含むことができる。例示的な結合方法を、以下の実施例４に記載する。
細胞ライブラリーを、他のタイプの候補薬剤を固体支持体に結合させるための本明細書に記載の方法の1つ以上を用いて、アレイに結合させることができる。例えば、固体支持体は、核酸プライマーを含むことができ、細胞は、核酸タグの核酸プライマーへのハイブリダイゼーションを介して固体支持体に結合することができる。場合によっては、核酸タグはユニバーサルプライマー結合配列を含むことができ、核酸プライマーはユニバーサルプライマー配列を含むことができ、候補薬剤は、ユニバーサルプライマー結合配列のユニバーサルプライマー配列へのハイブリダイゼーションを介して固体支持体に結合することができる。
本開示の方法は、核酸タグなどの核酸がハイブリダイズされる固体支持体に結合したプライマーを伸長させる工程を含むことができる。得られた伸長プライマーは、タグ配列および核酸由来の他の配列（相補的形態であるが）を含むことになる。したがって、伸長プライマーは、候補薬剤からの核酸の空間的にタグ付けされたバージョンである。核酸中に存在するタグ配列以外の配列要素も、伸長プライマーに含めることができることが理解されるであろう。そのような要素には、例えば、プライマー結合部位、切断部位、他のタグ配列（例えば、試料識別タグ）、捕獲配列、核酸結合タンパク質または核酸酵素の認識部位などが挙げられる。
プライマーの伸長は、本明細書で例示される方法か、そうでなければ核酸の増幅または核酸の配列決定について当該技術分野で知られている方法を用いて実施することができる。特定の実施形態では、1つ以上のヌクレオチドを、プライマーの3'末端に、例えばポリメラーゼ触媒作用（例えばDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼまたは逆転写酵素）を介して付加することができる。化学的または酵素的方法を使用して、1つ以上のヌクレオチドをプライマーの3'もしくは5'末端に付加することができる。1つ以上のオリゴヌクレオチドを、プライマーの3'もしくは5'末端に、例えば化学的または酵素的（例えば、リガーゼ触媒作用）方法を介して付加することができる。プライマーは鋳型指向様式で伸長することができ、それにより伸長産物は、プライマーにハイブリダイズする鋳型核酸に相補的である。いくつかの実施形態では、RNA鋳型を用いる逆転写酵素によってDNAプライマーを伸長させ、それによりcDNAを生成する。したがって、本明細書に記載の方法で作製された伸長プローブは、逆転写DNA分子であり得る。核酸を伸長するための例示的な方法は、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献９６または特許文献９７または特許文献９８に記載されている。
プライマーにハイブリダイズした核酸の全部または一部は、伸長によってコピーすることができる。例えば、伸長プローブは、少なくとも1、2、5、10、25、50、100、200、500、1000またはそれ以上の核酸からコピーされたヌクレオチドを含むことができる。伸長産物の長さは、例えば、伸長反応において可逆的に終結するヌクレオチドを使用し、限られた数の伸長サイクルを実行することによって制御することができる。そのサイクルは、SBS技法で例示されるように実行することができ、標識ヌクレオチドの使用は必要ではない。したがって、本明細書に記載の方法で生成された伸長プライマーは、1000、500、200、100、50、25、10、5、2または1以下の核酸からコピーされたヌクレオチドを含むことができる。当然ながら、伸長プローブは、上記の範囲内または範囲外のいずれの長さでもあり得る。
アレイに結合した細胞ライブラリーは、他の候補薬剤のスクリーニングに関して本明細書に記載の方法を用いてスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、細胞アレイのスクリーニングは、細胞をスクリーニング剤で処理する工程を含むことができる。その結果、スクリーニング剤は、アレイ上の少なくとも1つの候補細胞に結合し得る。任意に、スクリーニング剤は発光性であり、スクリーニング反応は、少なくとも1つの候補細胞の発光を検出することによって実施されることになる。
いくつかの実施形態では、アレイに送達されるスクリーニング剤は、アレイ中の少なくとも1つの候補細胞を改変することになる。例えば、スクリーニング剤は、アレイ上の少なくとも1つの候補細胞を刺激し得る。あるいは、スクリーニング剤は、アレイ上の少なくとも1つの候補細胞を阻害または殺傷さえし得る。
細胞アレイと接触するスクリーニング剤は、少なくとも1つの候補細胞の発光を増減させてもよく、スクリーニング反応は、少なくとも1つの候補細胞の発光を検出する工程を含むことができる。
本明細書の他の箇所に記載されているように、検出工程は、反応速度測定または時間ベースの測定を含むことができる。例えば、細胞アレイの検出は、複数の時点でアレイ上の個々のフィーチャーのうちの1つ以上についてシグナルを取得する工程を含むことができる。
細胞に結合しているか、または細胞中に存在する核酸タグは、本明細書に記載の方法で配列決定することができる。細胞に結合している核酸は、細胞上で配列決定することができる。あるいは、例えば、実施例４に例示されているもののようなプライマー伸長法を介して、核酸を固体支持体に移すことができ、タグ配列（またはその相補体）を含有する伸長プライマーの領域は、固体支持体上で配列決定することができる。本明細書の他の箇所に記載の固体支持体に結合した核酸の配列決定方法を、細胞に結合する核酸タグまたは核酸タグが由来する細胞に近接したフィーチャーに結合する核酸タグに使用することができる。
場合によっては、核酸タグ（またはタグのコピー）を固体支持体に結合させたままで、細胞を固体支持体から除去することが望ましい場合がある。その後、タグ配列を、細胞の非存在下で配列決定することができる。
核酸タグが細胞内に存在する実施形態では、アレイの表面上で細胞を溶解し、細胞内容物の放出および核酸タグの局在捕捉をもたらすことができる。核酸タグは、固体支持体上のプライマーに相補的なユニバーサル配列領域を含むことができる。したがって、核酸タグを、増幅および／または配列決定に適した形式で固体支持体上に捕捉することができる。固体支持体上に捕捉された核酸は、任意に増幅することができる。固体支持体上に捕捉された核酸またはそれから生成されたアンプリコンは、本明細書に記載の方法を用いて固体支持体上で配列決定することができる。
本開示の方法は、1つ以上の細胞をアレイから除去する工程を含むことができる。例えば、スクリーニング工程でヒット物質として同定された1つ以上の細胞を選択的に除去することができる。任意に、細胞の生存能力を保持する条件を使用することができる。そのようにして、除去された細胞（単数または複数）を、培養、コピー、または増殖することができる。細胞（単数または複数）を、他の候補薬剤に関して本明細書の他の箇所に記載の技法および試薬を用いて除去することができる。例えば、光解離性リンカーおよび空間フィルタリングされた光線の使用は、特定の細胞をアレイ中の他の細胞から単離するのに特に有用であり得る。
いくつかの実施形態では、スクリーニング工程の後に生存細胞をアレイから除去する必要はない。むしろ、タグ配列は、タグの配列決定が、細胞を単離または特性評価することをさらに必要とせずに細胞を同定するのに十分であるように、既知の細胞とa prioriに関連していてもよい。特定のフィーチャーに存在するタグのa prioriな知識は、細胞を同定するために、スクリーニング工程においてフィーチャーから観察されたシグナルと相関させることができる。
以下の実施例は、本発明を説明することを意図しているが、本発明を限定するものではない。
（実施例１）
小分子スクリーニング
Illumina（サンディエゴ、カリフォルニア州）によって市販されているものなどの次世代配列決定プラットフォームは、創薬のための統合されたハイスループットスクリーニングプラットフォームを構築する基盤を提供する。標的分子への結合を可能にする官能基で核酸を修飾することにより、配列決定フローセルを、ハイスループット化合物スクリーニング用のアレイを構築するための基質として利用することが可能である。様々なスクリーニングアッセイを、同じプラットフォームを使用して、結合した標的に変えて実施することができる。配列決定プラットフォーム上の小分子をスクリーニングするための例示的な方法を図１Ａ〜図１Ｆに図示し、以下に記載する。
図１Ａは、それぞれが29ヌクレオチド長である50,000の異種核酸分子がテープベースの合成機器上で合成される第1工程を示す。テープは、個々の核酸種がそれぞれ合成される個々にアドレス可能な部位を含む。核酸分子はまた、スルフヒドリル、アミンまたはN-ヒドロキシスクシンイミド基などの官能基（FG）を5'末端に含む。核酸の5'領域はユニバーサルプライマー（50,000の核酸の全てについて同じ）をコードする10ヌクレオチドを含み、3'領域は50,000の異種タグ配列（「コード」配列とも称される）のうちの1つをコードする。例示的なテープベースのDNA合成機器は、参照により本明細書に組み込まれる特許文献９９に記載されている。
第2工程は図１Ｂに示されており、単一鋳型ハイブリッド核酸を合成テープの各ウェル中の核酸にライゲーションさせ、ユニバーサルオーバーハングプライマーを作製する。図に示すように、ライゲーションは、異種核酸のユニバーサルプライマー配列と、単一鋳型ハイブリッド上のオーバーハングとのハイブリダイゼーション後に生じる。任意に、ライゲーション事象の前に、異種核酸をテープから除去することができる（例えば、核酸を精製または修飾するために）。他の任意の構成は、異種核酸の代わりに単一鋳型ハイブリッドに結合した官能基を有することを含む。その代わりに、またはそれに加えて、単一鋳型ハイブリッドは、ビオチン、アジドまたはアルキン基などの表面結合成分を有することができる。
図１Ｃに示すように、特定の候補薬剤（例えば、「化合物」）を合成機器テープ上の個々のウェルの各々にロボットで添加する第3工程が実施される。候補薬剤の各々は、異種核酸上の官能基と反応する反応基を含む。結果として、候補薬剤の各々は、合成機器テープ上の特定の核酸タグに結合され、それによりコードされた候補薬剤を生成する。
図１Ｄに示すように、コードされた候補薬剤をフローセル表面上の識別可能な部位に固定化する工程4が実施される。固定化は、核酸の単一鋳型部分の、フローセル表面上にある相補的ユニバーサルプライマーへのハイブリダイゼーションによって行うことができる。プライマーを、フローセル表面に、PAZAMゲル、または例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献１６、もしくは特許文献１００に記載のような他のヒドロゲルを介して結合させることができる。
工程5では、図１Ｅに示すように、スクリーニング剤（「標的分子」とも称される）を、フローセルの表面上にある固定化されコードされた候補薬剤と接触させる。スクリーニング剤は、Illumina配列決定機器などの光学装置を用いて検出することができる蛍光標識を含む。画像を、例えばリアルタイムで取得し、識別可能な部位の各々でのスクリーニング剤の結合反応速度を測定することができる。図１Ｅの例では、コードNに結合した候補薬剤は、所望の結合反応速度プロファイルによって決定される「ヒット物質」である。
図１Ｆに示すように、コードNの配列は、フローセル上で実行される配列決定プロトコルに基づいて決定することができる。コードNの配列を、それが合成された合成機器テープ上の位置と相関させることができ、次に、「ヒット物質」の同一性を、コードNが合成された合成機器テープ上の位置にどの候補薬剤が配信されたかの知識に基づいて判定することができる。
（実施例２）
タンパク質スクリーニング
固相増幅法は、高度に多重化された核酸の提示を可能にする。特に有用な固相増幅法は、ブリッジ増幅（クラスター形成とも称される）であり、これは、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献３５；特許文献３７；特許文献３６；特許文献３８；特許文献３９；特許文献４０；特許文献４１に記載のように実施することができる。
この実施例は、固相増幅から生じる核酸クラスターを使用してフローセル上にタンパク質アレイを形成することを記載する。この技法のいくつかの重要な利点は、（a）多種多様な異種タンパク質の活性についてスクリーニングすることができるように、比較的小さいサイズであるが、表面上で光学的に識別可能な多数のタンパク質含有フィーチャーを提供すること；および（b）フィーチャーがタンパク質をコードする核酸を含有し、核酸は配列決定に適したものであり、それによりフローセルの各フィーチャーのタンパク質を同定できることである。
図２に示すように、cDNAライブラリーは、転写部位および翻訳部位とともにP5ならびにP7プライマー結合部位を有するアダプターを有するように構築される。ライブラリーはフローセルに結合され、ライブラリー成員は、ブリッジ増幅を用いてフローセルの表面上で増幅され、クラスターを形成する。P5およびP7プライマー結合配列、アダプターを有する核酸ライブラリーの作製方法、およびクラスターの作製方法についての記載は、例えば、ブリッジ増幅技術に関して上記で引用した参考文献、各々が参照により本明細書に組み込まれる非特許文献１、特許文献１６および特許文献１０１を参照。
得られたcDNAクラスターを、RNAポリメラーゼを用いてmRNAに転写する。mRNAは、以下により、その転写が始まるcDNAクラスターに近接して維持される：（a）RNAポリメラーゼが停止してmRNA転写物がcDNAに結合したままとなるように、cDNA構築物の末端に転写終結部位がないことにより、（b）同様にRNAポリメラーゼを停止させる既知転写休止部位（例えば、大腸菌のTrpオペロン由来）の使用により、（c）化学的方法を用いて転写を停止させることにより（例えば、ビシクロマイシン）、または（d）転写されたRNAがハイブリダイズすることになるcDNAクラスターにおいて相補配列を有することにより。
mRNAは、cDNAクラスターに局在し、そこから転写され、その後翻訳されてタンパク質を作製する。これは、mRNA中の開始コドン（cDNAライブラリー構築物の5'末端のアダプター中の転写開始配列とともに導入され得る）によって促進される。さらに、mRNAは、3'末端に終止コドンを持たないことになる。図２に示すように、終止コドンの欠如は、タンパク質がリボソームを介してmRNAに結合したままであるように、mRNAの末端でのリボソーム停止をもたらす（その後mRNAは、停止したRNAポリメラーゼによってcDNAクラスターに結合した状態にある）。あるいは、リボソームを化学的手段（例えば、クロラムフェニコール／ピューロマイシン）によって停止させることができる。共役した転写および翻訳は、容易に入手可能なウサギ網状赤血球溶解物、細菌S30または小麦胚芽抽出物系を用いて行うことができる。
別の手法では、タンパク質を溶液中で生成させ、次いでフローセルまたは他の表面に結合させることができる。この手法は表面上での増幅を含まないが、溶液ベースの技法がより容易に利用可能であるか、または評価されるタンパク質に適用可能である場合に有益であり得る。得られたタンパク質アレイをスクリーニング剤または他の刺激剤でスクリーニングし、ヒット物質を同定する。クラスター内のcDNAを配列決定し、タンパク質ヒット物質を同定する。
（実施例３）
タグを用いたタンパク質スクリーニング
Illumina（サンディエゴ、カリフォルニア州）によって市販されているものなどの次世代配列決定プラットフォームは、タンパク質進化のための統合されたハイスループットスクリーニングプラットフォームを構築する基盤を提供する。例示的な方法を図３Ａおよび図３Ｂに示す。
第1工程として、目的の標的タンパク質およびランダムタグ（「コード」とも称される）に対するランダムまたはセミランダム突然変異を有するベクターのライブラリーを作製する。ベクターを、タンパク質およびタグのコード配列を含むmRNAを発現するように構築する。異種ランダムタグの数は、各変異体mRNAが高い確率で特有のタグを含むように、ライブラリー中のタンパク質変異体の数より多い。例えば、10ヌクレオチドのランダム配列は106個の異種タグを提供することになり、20ヌクレオチドのランダム配列は1012個の異種タグを提供することになる。
突然変異のランダムな導入およびランダムタグの使用の代わりに、第1工程は、所定の突然変異を引き起こし、既知タグと結合させるように行うことができる。
第2工程では、ベクターで形質転換された細菌のライブラリーを培養して、それぞれのベクター由来のmRNAを生成する。ライブラリーを溶解し、ライブラリー中（すなわちmRNAライブラリー）の種々のベクターからのmRNA転写物の混合物を放出させる。
第3工程では、mRNAライブラリーを分割して2つのサブライブラリーを作製する。ライブラリーを分割すると、両方のサブライブラリーに同じ成員が存在するように、ライブラリーは各成員の複数のコピーを含んでいる。再度、特有のタグ配列が各タンパク質変異体配列に結合される。
第4工程では、図３Ｂに示すように、第1サブライブラリーをフローセルに結合させ、フローセル上で増幅させ、コード配列および得られたアンプリコンのそれぞれのタグを配列決定する。このようにして、各成員が結合されている部位が特定される。次いで、第2サブライブラリーの成員をフローセルと接触させると、第2サブライブラリーからの成員が、タグ配列の相補性を介して第1サブライブラリー由来の同一の成員から生成されたアンプリコンにハイブリダイズする。このようにして、第2サブライブラリーの各成員が位置する部位は、配列決定結果およびタグとそれらの相補体との間の予想されるハイブリダイゼーションに基づいて推論することができる。フローセル上に捕捉された第2サブライブラリーの成員は、その後翻訳され、タンパク質標的をフローセル上に発現する。タンパク質の各々は、それが翻訳されたRNAに結合したままの状態で発現される。例えば、結合は、実施例２に記載の技法を用いて達成することができる。次いで、スクリーニング剤または他の刺激剤でタンパク質をスクリーニングすると、所望の機能をハイスループット様式で同定することができる。結果は、タンパク質をコードするRNA配列と相関するフローセル上の部位に局在するタンパク質活性シグナルである。
この方法論は、フローセルレーンあたり3,000万以上のタンパク質の大量処理を可能にすることができる。このスクリーニング過程は、エマルジョンベースのスクリーニングに関連する困難を回避する。例えば、フローセルの各フィーチャーでの定量的および反応速度ベースのデータをIllumina配列決定機器を使用して取得し、従来のエマルジョンベースの技法を使用して得られるものよりも洗練された選択的スクリーニング基準を可能にすることができる。
（実施例４）
細胞スクリーニング
この実施例は、蛍光顕微鏡検査で典型的に伴う利点である、リアルタイムで動的過程を追跡する能力を有する蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）の高い処理能力の利点を提供し、同時に集団内の個々の細胞を同定する次世代配列決定の利点を付加する、細胞のスクリーニング方法論を記載する。結果として、本明細書に記載の方法は、所望の挙動を示す細胞の回収および特性評価を可能にする。具体的には、この実施例は、Illumina社（サンディエゴ、カリフォルニア州）からの次世代配列決定プラットフォームを適応させ、蛍光により、特異的刺激に応答する個々の細胞の表現型挙動（例えば、蛍光レポーターの発現によって測定される）を超ハイスループットで観察し、後続の同定および回収のための、それぞれ個々の細胞の表面上に提示されたタグの配列決定が続く。このプラットフォームは、細胞工学用ハイスループットスクリーニングの標準的な方法を提供することができる。
細胞は、小分子およびタンパク質とは異なる、そして多くの場合、それらの改良版である潜在的治療能力を有する。細胞は身体の特定の場所に積極的に移動し、複数の外部刺激を感知することができ、複数の情報源を統合して正確な出力で応答することができる。さらに、細胞ベースの応答は、予めプログラムされた機能または外部要因の追加によって制御することができる複雑な動的パターンを有することができる。現在、クローン病を治療するための操作された微生物の使用から、がんを治療するための患者由来の操作されたヒト免疫細胞の使用まで、広範囲の疾患の治療のための細胞ベースの療法が検討されている。重要なことには、微生物またはヒト細胞のいずれかを、治療的に有用であるように操作することができる。
細胞工学のワークフロー
細胞工学（微生物またはヒト細胞のいずれかにおける）は、考慮すべき多くの変数を伴う複雑な過程である。したがって、単一設計を試みるのではなく、選択またはスクリーニングされ得る候補細胞のライブラリーを設計することが有益である。具体的には、細胞工学は、以下の工程を含むことができる：（1）外部シグナル、情報統合ネットワーク、およびシグナル依存応答（しばしば遺伝子発現を伴う応答）に対する1つ以上のセンサーを含むことができる遺伝子回路の設計；（2）候補細胞のライブラリーにわたって上記成分の1つ以上の遺伝子標的を修飾すること（例えば、CRISPR-Cas9を用いて）；ならびに（3）多数の異種候補細胞の中から、所望の細胞挙動を与えるヒット物質を同定するハイスループットスクリーニング。
堅固なハイスループットスクリーニング技術は、検査が必要な細胞数が多い（しばしば何千もの異なる設計が試みられる）場合に、細胞工学に大きな利点を提供することができ、操作過程に導入される変更により、大規模で多様な細胞行動が明らかになるであろう。
所望のスクリーニングは、非常に高い処理能力を達成しながら、複雑な時間的動態を追跡することもできる。本明細書に記載のスクリーニングは、これらの利点を提供する。
細胞スクリーニング法は、以下の2つの段階を有する：
段階1：表現型観察。図４に示すように、適切な蛍光レポーターを有する操作された生細胞のライブラリーを、配列決定プラットフォーム（例えばIllumina MiSeq（登録商標）、NextSeq（登録商標）、HiSeq（登録商標）またはGenome Analyzer（登録商標）プラットフォーム）のフローセルに充填する。個々の細胞はランダムに分布し、フローセルの表面に結合することになる（分析される特定の細胞に応じて特定の結合性化学物質を使用して）。それぞれ個々の細胞の蛍光を一定の時間間隔で記録し、配列決定中にIlluminaフローセルで目下で行われている際にフローセル表面を走査する。個々の細胞は、目下の配列決定クラスターに匹敵する（またはそれよりも大きい）平均サイズを有することになり、それにより配列決定プラットフォームの解像度をスクリーニングによく適合させることに留意されたい。また、細胞は、シグナル強度が配列決定プラットフォームによって目下で検出されているものと類似である（またはより大きい）ように、何千もの蛍光レポーター分子を抱えることができる。特定の時間に、細胞をスクリーニング剤（または他の刺激剤）に晒し、細胞の応答を検出する（例えば、レポーター遺伝子の発現の変化、または任意の他のタイプの細胞レポーターの蛍光強度の変化 - 細胞質中のカルシウム濃度、細胞内局在の変化によるフルオロフォアクエンチングなどに反映されるように）。蛍光レポーターの変化を経時的に観察することにより、多様な刺激剤（または刺激剤の組み合わせ）に応答した表現型の変化の時間的動態を決定することが可能になる。
段階2：個々のタグの解読による単一細胞識別。集団内の各細胞にはタグが割り当てられることになる。細胞をタグ付けするための3つの異なる技法を以下に説明する。最初の工程では、タグを個々の細胞に結合させる。タグのタイプ（例えば、ビーズ、膜結合核酸など）とは無関係に、1つの細胞が各容器に位置するように、最初に細胞を個々の容器（例えば、マイクロウェル）に分類する。次いで、図５に示すように、各容器内の細胞に特有のタグを与える。
2.1 ビーズでの単一細胞バーコード化。集団内の各細胞（例えば、T細胞では直径〜10μm）を、1〜10個のビーズでタグ付けする。ビーズは、約1〜2μmの直径を有することができる。有用なビーズには、例えば、Illuminaのビーズアレイ技術で使用されているものか、または各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献１０２もしくは特許文献１０３に記載のものが挙げられる。個々の細胞を個々の容器に予め分離し、各容器に同じ特有のタグを共有するビーズ（すなわち、各容器と各タグとの間に既知の対応があることになる）を加えることによって、各細胞は単一タグをコードするビーズでタグ付けされる。細胞タグ付けは多くの方法で、例えば、標的細胞の表面上に天然に存在する特異的エピトープを認識する抗体とビーズを共有結合させることにより達成することができる。このように、各ビーズタグ付き細胞はフローセルの表面上にランダムに分布することになるが、各細胞はそれ自身のビーズ（単数または複数）と空間的に共局在化することに留意されたい（図６）。したがって、段階1に続いて、フローセル上のビーズ（単数または複数）を解読し、同定されたタグを対応するビーズ（単数または複数）に最も近接した細胞に割り当てることによって、各細胞の同一性が明らかになる。ビーズ上のタグは、合成技術による配列決定（例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる非特許文献１、特許文献４９、特許文献５０もしくは特許文献５１；特許文献５２、特許文献５３、特許文献５４、特許文献５５もしくは特許文献５６、および特許文献５７を参照）、または各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献１５もしくは非特許文献２２に記載の解読技術を用いて解読することができる。
2.2 配列決定タグでの単一細胞同定。ビーズタグ付けに代わるものまたは追加されるものは、各細胞の表面上に直接提示される特有の配列識別子を使用することである。そのために、集団中の各細胞は、フローセルへの細胞充填の前に（例えば、段階1の前に）、表面提示された個々の一本鎖DNAタグで修飾されることになる。核酸タグ結合性化学物質は、特定の細胞型によって決まる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる非特許文献２３によって報告されているように、ヒト細胞を、原形質膜脂質に共有結合した一本鎖DNA分子でタグ付けすることができる。別の例として、酵母細胞を、Aga1-Aga2細胞壁複合体上に提示されたHaloTagタンパク質に共有結合した一本鎖DNA分子でタグ付けすることができる。
それぞれ個々のタグは、少なくとも3つの領域で構成されている。領域1は、結合部分（例えば、細胞型に応じて、脂質またはタンパク質）に連結される。領域2は、必要とされるプレキシティに応じた規定数の塩基からなる（4ヌクレオチド全てを使用して、長さ「n」の配列に対して4nの組み合わせを生成することが可能である；例えば、4塩基長の配列は、256の異なる個々の細胞を同定するためのタグを包含することになり、5つでは1024の異なるタグを生じることになる、など）。したがって、9塩基のタグ配列さえあれば、250,000を超える異種細胞を個別に同定することが可能である。領域3は、配列決定プライマーに相補的なDNA配列からなる。各細胞は、単一タグをコードする核酸で、予め容器中の個々の細胞を単離し、各容器に同じ特有のタグ配列を共有する核酸（前述のように、各容器と各タグとの間には既知の対応が存在することになる）を添加することによってタグ付けされることに留意されたい。
別々の工程（表現型測定が得られる前または後に実施される）において、それぞれ個々の細胞の同一性は、例えば、以下に記載の2つの方法のうちの1つで決定されることになる。
2.2.1 各細胞に結合した特定のタグのin situ配列決定。各細胞は、特定のタグの複数のコピーを提示する。したがって、シグナルは配列決定機器で容易に検出できる（図７を参照）。さらに、各タグを同定するための読み取り長は比較的短く（例えば、9塩基は＞250,000タグを識別するのに十分である）、十分に、市販の配列決定機器の典型的な数百ヌクレオチドの読み取り長の範囲内である。
In situタグ配列決定は、多くの方法で達成することができる。1つの可能性は、生細胞の表面上で直接配列することである。別の可能性は、配列決定の前に細胞を固定することである（生細胞から流出するヌクレオチドが配列決定反応を妨害する場合）。第3の可能性は、各細胞から核酸タグを分離して捕捉することである。このために、フローセル表面を、全ての細胞結合核酸に共通の領域に相補的な領域を含有する捕捉プローブ（例えば、配列決定プライマー）で修飾し、表面への細胞の初期結合を可能にし、配列決定の前に分離された核酸の捕捉を容易にする。必要に応じて、核酸タグの表面捕捉後に細胞を除去することができる。
2.2.2 フローセルに結合したタグのコピーのin situ配列決定。図８に示すように、細胞表面提示核酸タグを、フローセル表面結合プライマー（部分的相補配列を有する）にハイブリダイズさせる。細胞表面核酸タグを、特定の制限酵素での消化によって細胞から分離させ、次いで細胞をフローセルから洗い流す。次いでフローセル表面結合核酸タグを伸長し、元の細胞タグのコピーを効果的に作製し、次いで配列決定することになる。多くの場合、細胞は何千もの核酸からなる直径約1μmの「スポット」を残す可能性があるため、コピーをブリッジ増幅する必要はない。しかし、希望であればブリッジ増幅を実施することができる（この場合、適切なプライマー結合部位を核酸タグに添加することができ、第2プライマータイプをフローセル表面に結合させることができる）。
場合によっては、図９に示すように、膜固定核酸を用いてタグを個々の細胞に結合させることができる。膜固定核酸は、リンカー領域、制限部位（RE）、配列決定プライマー結合部位（SBS3）、タグ配列（バーコード）および捕捉配列を含むことになる。次いで、参照により本明細書に組み込まれる非特許文献２３に記載のように、または図１０に示すように、捕獲配列に相補的な配列を有する表面結合核酸によって細胞を表面捕捉することができる。
スクリーニング工程における細胞表現型挙動を示す蛍光シグナルの記録（例えば、ある期間のおよび特定の培地条件下でのレポーターからの蛍光の測定）に続いて、核酸タグをフローセル表面上でコピーし、その後細胞を洗い流すことができる。表面上のコピーは、図１１に示すように、どの細胞がフローセル表面上のどこに位置したかに関する空間情報を効果的に保存する。
表面上の各細胞の空間位置を記録することにより、記録された蛍光時系列の各々にタグ同一性を割り当てることが可能となり、したがって表現型応答を細胞同一性と効果的に結びつけることができる。次いで、これらの同一性を用いて、単一容器内（図１２に示すように、細胞が最初にタグ付けされた場所）の個々のクローンを同定することができるか、または選択された細胞の表面上に存在するタグに相補的な核酸でプルダウンすることにより、選択された細胞を細胞混合物から回収することができる。
この出願を通じて、様々な刊行物、特許または特許出願が参照されている。これらの刊行物の開示内容全体は、本発明が関係する技術水準をより詳細に説明するために、参照により本出願に組み込まれる。
用語「含む（comprising）」は、本明細書において非限定的であることを意図しており、列挙された要素を含むだけでなく、任意の追加の要素をさらに包含する。
本発明を上記で示した実施例を参照して説明してきたが、本発明から逸脱することなく種々の変更が行われ得ることが理解されるべきである。したがって、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (146)

  1. 以下を含む、候補薬剤の特性評価方法：
    （a）候補薬剤のライブラリーを提供する工程であって、各候補薬剤が、タグ配列を有する核酸タグに結合している工程と；
    （b）候補薬剤の前記ライブラリーを固体支持体と接触させて前記候補薬剤を前記固体支持体に結合させ、それにより、前記ライブラリーからの個々の候補薬剤にそれぞれ結合する前記固体支持体上に個々のフィーチャーを含む候補薬剤アレイを形成する工程と；
    （c）前記候補薬剤アレイをスクリーニング剤と接触させる工程であって、前記アレイ中の1つ以上の候補薬剤が前記スクリーニング剤と反応する工程と；
    （d）前記アレイの前記スクリーニング剤との接触の間または接触の後に前記アレイを検出し、それにより前記アレイ中の少なくとも1つの候補薬剤が前記スクリーニング剤と反応することを判定する工程と；
    （e）前記アレイ上の前記核酸タグを配列決定し、前記候補薬剤の各々に結合した前記タグ配列を決定する工程と；
    （f）少なくとも1つの前記候補薬剤に結合した前記タグ配列に基づいて、前記スクリーニング剤と反応する前記アレイ中の少なくとも1つの前記候補薬剤を同定する工程。
  2. 前記候補薬剤が、タンパク質、核酸、細胞、および小分子からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記タンパク質が、抗体、酵素、受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、ヒストン修飾酵素および核内ホルモン受容体からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記細胞が、多細胞生物体から単離された遺伝的に天然の細胞、単細胞生物体を含む遺伝的に天然の細胞、遺伝子操作された細胞、および培養細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  5. 前記細胞が幹細胞または免疫細胞である、請求項１または４に記載の方法。
  6. 前記小分子が、候補酵素阻害剤、候補抗生物質、候補抗ウイルス剤、候補農薬、候補ホルモン、細胞シグナル伝達の候補活性剤、細胞シグナル伝達の候補阻害剤、および候補酵素活性剤からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
  7. 工程（a）が、候補薬剤のライブラリーをコンビナトリアル合成することを含み、ここで、各候補薬剤で実施されるコンビナトリアル合成の個々の反応は、1つ上のヌクレオチドの特有のシグネチャーの、前記候補薬剤の各々に結合した核酸タグへの付加によって追跡され、それにより候補薬剤のライブラリーを提供し、ここで各候補薬剤は特有の核酸タグに結合している、請求項１に記載の方法。
  8. 前記固体支持体が核酸プライマーを含み、前記候補薬剤が、前記核酸タグの前記核酸プライマーへのハイブリダイゼーションを介して前記固体支持体に結合する、請求項１に記載の方法。
  9. 前記核酸タグがユニバーサルプライマー結合配列を含み、前記核酸プライマーがユニバーサルプライマー配列を含み、前記候補薬剤が、前記ユニバーサルプライマー結合配列の前記ユニバーサルプライマー配列へのハイブリダイゼーションを介して前記固体支持体に結合する、請求項８に記載の方法。
  10. 前記スクリーニング剤が、1つ以上の前記候補薬剤に結合することによって、または前記候補薬剤と前記候補薬剤に対する親和性を持つ検体間の結合を遮断することによって、1つ以上の前記候補薬剤と反応する、請求項１に記載の方法。
  11. 前記アレイの検出が、1つ以上の前記候補薬剤に結合している前記スクリーニング剤を検出することを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記スクリーニング剤が発光性であり、前記検出が前記アレイ上の発光を検出することを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記スクリーニング剤が、1つ以上の前記候補薬剤を化学修飾することによって、1つ以上の前記候補薬剤と反応する、請求項１に記載の方法。
  14. 前記アレイの検出が、1つ以上の修飾された前記候補薬剤を検出することを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 1つ以上の前記修飾された候補薬剤が発光性であり、前記検出が前記アレイ上の発光を検出することを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記スクリーニング剤が、検体生成物を生成することによって1つ以上の前記候補薬剤と反応する、請求項１に記載の方法。
  17. 前記アレイの検出が、前記検体生成物を検出することを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記検体生成物が発光性であり、前記検出が前記アレイ上の発光を検出することを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記アレイの検出が、複数の時点で前記アレイ上の個々の前記フィーチャーのうちの1つ以上についてシグナルを取得することを含む、請求項１に記載の方法。
  20. 前記シグナルが光シグナルを含む、請求項１に記載の方法。
  21. 前記核酸タグを増幅し、個々の前記フィーチャーの前記核酸タグのアンプリコンを生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  22. 前記核酸タグの配列決定が、個々の前記フィーチャーの前記核酸タグの前記アンプリコンを配列決定することを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記核酸タグの配列決定が、前記配列を示す光シグナルを検出することを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記固体支持体がフローセル内に配置される、請求項１に記載の方法。
  25. 以下を含む、タンパク質アレイの作製方法：
    （a）mRNA分子のライブラリーを提供する工程であって、前記ライブラリー中の個々のmRNA分子が標的配列およびタグ配列を含んでいる工程、
    （b）前記ライブラリーから第1サブライブラリーを得る工程であって、第1サブライブラリーは前記タグ配列またはその相補体を有する核酸を含み、前記核酸が固体支持体上の個々のフィーチャーに結合している工程、
    （c）前記ライブラリーから第2サブライブラリーを得る工程であって、第2サブライブラリーは前記標的配列および前記タグ配列またはその相補体を有する核酸を含んでいる工程、
    （d）第2サブライブラリーを第1サブライブラリーと接触させ、それにより第2サブライブラリーの核酸を、前記タグ配列とその相補体のハイブリダイゼーションを介して前記固体支持体に結合させる工程と；
    （e）前記固体支持体上の前記標的配列を翻訳し、個々の前記フィーチャーに結合したタンパク質のアレイを作製する工程。
  26. 前記固体支持体上の前記タグ配列またはその相補体を配列決定し、それにより前記固体支持体上の個々の前記フィーチャーでの前記タグ配列またはその相補体の位置を決定する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 第1サブライブラリーの前記核酸が前記標的配列をさらに含む、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. 前記固体支持体上の前記標的配列を配列決定する工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 以下を含む、タンパク質のスクリーニング方法：
    （i）請求項２５に記載のタンパク質アレイを作製する工程と；
    （ii）前記タンパク質アレイをスクリーニング剤と接触させる工程であって、前記アレイ中の1つ以上のタンパク質が前記スクリーニング剤と反応する工程と；
    （iii）前記スクリーニング剤との接触の間または接触の後に前記タンパク質アレイを検出し、それにより前記アレイ中の少なくとも1つのタンパク質が前記スクリーニング剤と反応することを判定する工程。
  30. 前記固体支持体上の前記タグ配列またはその相補体を配列決定し、それにより前記固体支持体上の個々の前記フィーチャーでの前記タグ配列またはその相補体の位置を決定する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 少なくとも1つの前記タンパク質に結合した前記タグ配列に基づいて、前記スクリーニング剤と反応する前記アレイ中の少なくとも1つの前記タンパク質を同定する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記スクリーニング剤が、1つ以上の前記タンパク質に結合することによって、または1つ以上の前記タンパク質と1つ以上の前記タンパク質に対する親和性を持つ検体間の結合を遮断することによって、1つ以上の前記タンパク質と反応する、請求項２９に記載の方法。
  33. 前記アレイの検出が、1つ以上の前記タンパク質に結合している前記スクリーニング剤を検出することを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記スクリーニング剤が発光性であり、前記検出が前記アレイ上の発光を検出することを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記スクリーニング剤が、1つ以上の前記タンパク質を化学修飾することによって、1つ以上の前記タンパク質と反応する、請求項３２に記載の方法。
  36. 前記アレイの検出が、1つ以上の修飾された前記タンパク質を検出することを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 1つ以上の修飾された前記タンパク質が発光性であり、前記検出が前記アレイ上の発光を検出することを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記スクリーニング剤が、検体生成物を生成することによって1つ以上の前記タンパク質と反応する、請求項３２に記載の方法。
  39. 前記アレイの検出が、前記検体生成物を検出することを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記検体生成物が発光性であり、前記検出が前記アレイ上の発光を検出することを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記アレイの検出が、複数の時点で前記アレイ上の個々の前記フィーチャーのうちの1つ以上についてシグナルを取得することを含む、請求項３２に記載の方法。
  42. 前記シグナルが光シグナルを含む、請求項４１に記載の方法。
  43. mRNA分子の前記ライブラリーが、複数の同一遺伝子の変異体を含む、請求項２５に記載の方法。
  44. 前記変異体がランダム突然変異誘発によって生成される、請求項４３に記載の方法。
  45. mRNA分子の前記ライブラリーが組み換え生物体に由来する、請求項２５または４３に記載の方法。
  46. 前記タンパク質が、抗体、酵素、受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、ヒストン修飾酵素、および核内ホルモン受容体からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
  47. 第1サブライブラリーが、前記ライブラリーのmRNA分子を前記固体支持体と接触させ、前記mRNA分子を前記固体支持体に結合させることを含む方法によって得られる、請求項２５に記載の方法。
  48. 前記mRNA分子が前記固体支持体上で増幅され、前記タグ配列の相補体を生成する、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記固体支持体が核酸プライマーを含み、前記mRNA分子が、前記核酸プライマーへのハイブリダイゼーションを介して前記固体支持体に結合する、請求項２５に記載の方法。
  50. 前記mRNA分子がユニバーサルプライマー結合配列を含み、前記核酸プライマーがユニバーサルプライマー配列を含み、前記mRNA分子が、前記ユニバーサルプライマー結合配列の前記ユニバーサルプライマー配列へのハイブリダイゼーションを介して前記固体支持体に結合する、請求項４９に記載の方法。
  51. 第1サブライブラリーが、個々のmRNA分子または前記タグ配列を含む個々のmRNA分子の一部を逆転写することを含む方法によって得られる、請求項２５に記載の方法。
  52. 逆転写されたmRNA分子、またはその一部が前記固体支持体上で増幅され、前記タグ配列の相補体を生成する、請求項５１に記載の方法。
  53. mRNA分子の前記ライブラリーが流体試料中に提供され、第1サブライブラリーおよび第2サブライブラリーが、前記流体試料の別個の画分に由来する、請求項２５に記載の方法。
  54. 前記固体支持体がフローセル内に配置される、請求項２５に記載の方法。
  55. 前記タンパク質が、前記mRNA分子に共有結合している、請求項２５に記載の方法。
  56. 前記アレイの1つ以上のフィーチャーに結合した前記mRNA分子またはタンパク質を選択的に除去する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  57. 前記選択的除去が、前記mRNA分子またはタンパク質を前記フィーチャーに結合させている結合のレーザー媒介性切断を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 請求項２５に記載の方法であって、第1サブライブラリーが、前記タグ配列の相補体を有する核酸を含み、
    第2サブライブラリーが、前記標的配列および前記タグ配列を有するRNA分子を含み、ならびに
    （d）が、第2サブライブラリーを第1サブライブラリーと接触させ、それにより第2サブライブラリーのmRNA分子を、前記タグ配列とその相補体のハイブリダイゼーションを介して前記固体支持体に結合させることを含む方法。
  59. 請求項２５に記載の方法であって、第1サブライブラリーが、前記タグ配列を有する核酸を含み、
    第2サブライブラリーが、前記標的配列および前記タグ配列の相補体を有するcDNA分子を含み、
    （d）が、第2サブライブラリーを第1サブライブラリーと接触させ、それにより第2サブライブラリーのcDNA分子を、前記タグ配列とその相補体のハイブリダイゼーションを介して前記固体支持体に結合させることを含み、
    （e）が、cDNA分子を逆転写してmRNA分子を前記固体支持体上に生成し、mRNA分子を前記固体支持体上で翻訳して個々の前記フィーチャーに結合したタンパク質のアレイを生成することを含む方法。
  60. 前記標的配列を、リボソームで、前記固体支持体上で翻訳し、前記リボソームをピューロマイシンで処理して個々の前記フィーチャーに結合したタンパク質のアレイを生成する、請求項２５に記載の方法。
  61. 前記固体支持体が、少なくとも1×106個の前記フィーチャーを含む、請求項２５に記載の方法。
  62. 前記固体支持体上の前記フィーチャーの平均ピッチが10ミクロン未満である、請求項２５に記載の方法。
  63. 前記フィーチャーが100平方ミクロン未満の平均面積を含む、請求項２５に記載の方法。
  64. （a）mRNA分子のライブラリーであって、前記ライブラリー中の個々のmRNA分子が標的配列およびタグ配列を含むライブラリーと、
    （b）前記タグ配列の相補体を有する核酸を含む固体支持体、
    を含むアレイであって、
    前記核酸が固体支持体上の個々のフィーチャーに結合しており、
    個々の前記mRNA分子の前記タグ配列が、前記固体支持体上の個々の前記フィーチャーのそれぞれの相補的タグ配列にハイブリダイズし、
    前記mRNA分子の翻訳によって得られるタンパク質が、それぞれのmRNA分子に結合する、アレイ。
  65. 前記タンパク質が、リボソームを介してそれぞれの前記mRNA分子に結合している、請求項６４に記載のアレイ。
  66. 前記タンパク質が、前記リボソームに共有結合している、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記タンパク質が発光標識されている、請求項６４に記載のアレイ。
  68. 発光標識されたスクリーニング剤が、タンパク質の結合部位に特異的に結合し、それにより前記タンパク質が蛍光標識される、請求項６７に記載のアレイ。
  69. 前記固体支持体が、少なくとも1×106個の前記フィーチャーを含む、請求項６４に記載のアレイ。
  70. 前記固体支持体上の前記フィーチャーの平均ピッチが10ミクロン未満である、請求項６４に記載のアレイ。
  71. 前記フィーチャーが100平方ミクロン未満の平均面積を含む、請求項６４に記載のアレイ。
  72. mRNA分子の前記ライブラリーが、複数の同一遺伝子の変異体を含む、請求項６４に記載のアレイ。
  73. 前記タンパク質が、抗体、酵素、受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、ヒストン修飾酵素および核内ホルモン受容体からなる群より選択される、請求項６４に記載の方法。
  74. 前記固体支持体がフローセル内に配置される、請求項６４に記載の方法。
  75. 以下を含む細胞のスクリーニング方法：
    （a）複数の異種細胞を提供する工程であって、前記異種細胞の各々がタグ配列を有する核酸タグを含んでいる工程と；
    （b）前記異種細胞の混合物を固体支持体と接触させ、前記固体支持体に結合した細胞のアレイを形成する工程と；
    （c）前記固体支持体上の細胞のアレイを、少なくとも1つの光学特性についてスクリーニングする工程であって、前記スクリーニング反応が、前記固体支持体に結合した個々の前記細胞を検出することを含む工程と；
    （d）前記固体支持体に結合した核酸タグの前記タグ配列を配列決定する工程と；
    （e）前記アレイ中の少なくとも1つの細胞を候補細胞として、前記候補細胞の光学特性および前記タグ配列に基づいて同定する工程。
  76. 前記細胞が、多細胞生物体から単離された天然細胞、単細胞生物体を含む天然細胞、遺伝子操作された細胞、および培養細胞からなる群より選択される、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記細胞が幹細胞または免疫細胞である、請求項７６に記載の方法。
  78. 工程（a）が、異種細胞を別個の容器に分離し、タグ配列を有する核酸を容器の各々に添加し、それにより複数の異種細胞を提供することを含み、ここで異種細胞の各々は別個の容器内にあり、特有のタグ配列を有する核酸タグを含む、請求項７５に記載の方法。
  79. タグ配列を有する前記核酸がビーズに結合し、前記ビーズが複数の異種細胞の細胞に結合している、請求項７５に記載の方法。
  80. 前記ビーズが特異的結合親和性を有する抗体または前記細胞を含む、請求項７９に記載の方法。
  81. タグ配列を有する前記核酸が、原形質膜脂質または脂肪酸への共有結合によって複数の異種細胞の細胞に結合している、請求項７５に記載の方法。
  82. タグ配列を有する前記核酸が、原形質膜脂質中のタンパク質への共有結合によって複数の異種細胞の細胞に結合している、請求項７５に記載の方法。
  83. 前記固体支持体が核酸プライマーを含み、前記細胞が、前記核酸タグの前記核酸プライマーへのハイブリダイゼーションを介して前記固体支持体に結合する、請求項７５に記載の方法。
  84. 前記核酸タグがユニバーサルプライマー結合配列を含み、前記核酸プライマーがユニバーサルプライマー配列を含み、前記候補薬剤が、ユニバーサルプライマー結合配列のユニバーサルプライマー配列へのハイブリダイゼーションを介して前記固体支持体に結合する、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記アレイの検出が、複数の時点で前記アレイ上の個々の前記フィーチャーのうちの1つ以上についてシグナルを取得することを含む、請求項７５に記載の方法。
  86. 前記シグナルが光シグナルを含む、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記核酸タグを増幅し、前記固体支持体上の前記核酸タグのアンプリコンを生成することをさらに含む、請求項７５に記載の方法。
  88. 前記核酸タグの配列決定が、前記核酸タグの前記アンプリコンを配列決定することを含む、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記核酸タグの配列決定が、前記配列を示す光シグナルを検出することを含む、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記固体支持体がフローセル内に配置される、請求項７５に記載の方法。
  91. 前記細胞が生存細胞である、請求項７５に記載の方法。
  92. 前記固体支持体から少なくとも1つの前記候補細胞を除去することをさらに含む、請求項９０に記載の方法。
  93. 少なくとも1つの前記候補細胞を前記固体支持体からの除去後に培養し、それにより少なくとも1つの前記細胞を複製することをさらに含む、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記異種細胞が遺伝子組み換え細胞を含む、請求項７５に記載の方法。
  95. 前記遺伝子組み換え細胞が、非天然組み換えタンパク質のコード化、突然変異組み換えタンパク質のコード化、天然に存在するタンパク質の欠失を有すること、天然に存在するタンパク質の発現を阻害すること、天然に存在するタンパク質の発現を増強すること、非天然検体の生成および天然検体の生成を阻害することからなる群より選択される遺伝子組み換えを含む、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記細胞アレイのスクリーニングが、前記細胞をスクリーニング剤で処理することを含む、請求項７５に記載の方法。
  97. 前記スクリーニング剤が、少なくとも1つの前記候補細胞に結合する、請求項９６に記載の方法。
  98. 前記スクリーニング剤が発光性であり、前記スクリーニング反応が少なくとも1つの前記候補細胞の発光を検出することを含む、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記スクリーニング剤が、少なくとも1つの前記候補細胞を改変する、請求項９６に記載の方法。
  100. 前記スクリーニング剤が、少なくとも1つの前記候補細胞を刺激する、請求項９６に記載の方法。
  101. 前記スクリーニング剤が少なくとも1つの前記候補細胞の発光を増加または減少させ、前記スクリーニング反応が少なくとも1つの前記候補細胞の発光を検出することを含む、請求項９９または１００に記載の方法。
  102. タグ配列を有する核酸タグを増幅し、前記核酸タグの複数のコピーを前記異種細胞の各々に結合させることをさらに含む、請求項７５に記載の方法。
  103. （d）が、前記核酸タグは前記固体支持体に結合しているという条件下で、前記固体支持体から個々の前記細胞を除去することと、次いで前記固体支持体に結合した核酸タグの前記タグ配列を配列決定することを含む、請求項７５に記載の方法。
  104. （d）が、前記核酸タグをコピーして、前記固体支持体に結合した核酸タグコピーを生成することと、次いで前記固体支持体に結合した核酸タグコピーのタグ配列を配列決定することを含む、請求項７５に記載の方法。
  105. （d）が、前記核酸タグをコピーして、前記固体支持体に結合した核酸タグコピーを生成することと、次いで、前記核酸タグコピーが前記固体支持体に結合しているという条件下で、前記固体支持体から個々の前記細胞を除去することと、次いで前記固体支持体に結合した核酸タグの前記タグ配列を配列決定することを含む、請求項７５に記載の方法。
  106. 以下を含む、タンパク質アレイの作製方法：
    （a）固体支持体に結合したcDNA分子のライブラリーを提供する工程と；
    （b）前記固体支持体上の前記cDNA分子を増幅してクラスターを形成する工程であって、各クラスターが前記ライブラリーからの特定のcDNA分子の複数のコピーを含む工程と；
    （c）前記クラスターの複数の前記コピーを転写し、前記クラスターの各々に結合した複数のmRNA分子を生成する工程と；
    （d）前記クラスターの前記mRNA分子を翻訳し、前記クラスターの各々に結合した複数のタンパク質を生成する工程。
  107. 前記固体支持体上の前記mRNA分子の各々の少なくとも一部を配列決定する工程をさらに含む、請求項１０６に記載の方法。
  108. 以下を含む、タンパク質のスクリーニング方法：
    （i）請求項１０６に記載のタンパク質アレイを作製する工程と；
    （ii）前記固体支持体上の前記タンパク質をスクリーニング剤と接触させる工程であって、1つ以上の前記タンパク質が前記スクリーニング剤と反応する工程と；
    （iii）前記スクリーニング剤との接触の間または接触の後に前記固体支持体上の前記タンパク質を検出し、それにより前記スクリーニング剤と反応する少なくとも1つのタンパク質が存在することを判定する工程。
  109. 前記固体支持体上の前記mRNA分子の各々の少なくとも一部を配列決定する工程をさらに含む、請求項１０８に記載の方法。
  110. 少なくとも1つの前記タンパク質に結合している前記mRNA分子の少なくとも一部の前記配列に基づいて、前記スクリーニング剤と反応する前記アレイ中の少なくとも1つの前記タンパク質を同定する工程をさらに含む、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記スクリーニング剤が、1つ以上の前記タンパク質に結合することによって、または1つ以上の前記タンパク質と1つ以上の前記タンパク質に対する親和性を持つ検体との間の結合を遮断することによって、1つ以上の前記タンパク質と反応する、請求項１０８に記載の方法。
  112. 前記検出が、1つ以上の前記タンパク質に結合している前記スクリーニング剤を検出することを含む、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記スクリーニング剤が発光性であり、前記検出が発光を検出することを含む、請求項１１２に記載の方法。
  114. 前記スクリーニング剤が、1つ以上の前記タンパク質を化学修飾することによって、1つ以上の前記タンパク質と反応する、請求項１０８に記載の方法。
  115. 前記検出が、1つ以上の修飾された前記タンパク質を検出することを含む、請求項１１４に記載の方法。
  116. 1つ以上の修飾された前記タンパク質が発光性であり、前記検出が発光を検出することを含む、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記スクリーニング剤が、検体生成物を生成することによって1つ以上の前記タンパク質と反応する、請求項１０８に記載の方法。
  118. 前記検出が、前記検体生成物を検出することを含む、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記検体生成物が発光性であり、前記検出が発光を検出することを含む、請求項１１８に記載の方法。
  120. 前記アレイの検出が、複数の時点で個々の前記クラスターのうちの1つ以上についてシグナルを取得することを含む、請求項１０８に記載の方法。
  121. 前記シグナルが光シグナルを含む、請求項１２０に記載の方法。
  122. mRNA分子の前記ライブラリーが、複数の同一遺伝子の変異体を含む、請求項１０６に記載の方法。
  123. 前記変異体がランダム突然変異誘発によって生成される、請求項１２２に記載の方法。
  124. cDNA分子の前記ライブラリーが組み換え生物体に由来する、請求項１０６または１２２に記載の方法。
  125. 前記タンパク質が、抗体、酵素、受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、ヒストン修飾酵素、および核内ホルモン受容体からなる群より選択される、請求項１０６に記載の方法。
  126. 前記固体支持体が核酸プライマーを含み、前記cDNA分子が、前記核酸プライマーへのハイブリダイゼーションを介して前記固体支持体に結合する、請求項１０６に記載の方法。
  127. 前記cDNA分子がユニバーサルプライマー結合配列を含み、前記核酸プライマーがユニバーサルプライマー配列を含み、前記cDNA分子が、前記ユニバーサルプライマー結合配列の前記ユニバーサルプライマー配列へのハイブリダイゼーションを介して前記固体支持体に結合する、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記固体支持体がフローセル内に配置される、請求項１０６に記載の方法。
  129. 1つ以上のクラスターに結合した前記タンパク質を選択的に除去する工程をさらに含む、請求項１０６に記載の方法。
  130. 前記選択的除去が、前記タンパク質分子を前記固体支持体に結合させている結合のレーザー媒介性切断を含む、請求項１２９に記載の方法。
  131. 前記mRNA分子を、リボソームで、前記固体支持体上で翻訳し、前記リボソームをピューロマイシンで処理して前記タンパク質を前記mRNA分子に結合させる、請求項１０６に記載の方法。
  132. 前記固体支持体が、少なくとも1×106個の前記クラスターを含む、請求項１０６に記載の方法。
  133. 前記固体支持体上の前記クラスターの平均ピッチが10ミクロン未満である、請求項１０６に記載の方法。
  134. 前記クラスターが100平方ミクロン未満の平均面積を含む、請求項１０６に記載の方法。
  135. 以下を含むアレイ：
    （a）固体支持体と；
    （b）前記固体支持体に結合した異種cDNA分子のライブラリーであって、各異種cDNA分子が前記固体支持体上の個々のフィーチャーに結合しており、各フィーチャーが特定のcDNA分子の複数のコピーを含むライブラリーと；
    （c）前記cDNA分子に結合したmRNA分子であって、前記cDNA分子の各々が、それぞれの結合した前記mRNA分子に相補的であるmRNA分子と；
    （d）前記mRNA分子に結合したタンパク質分子であって、前記タンパク質分子の各々が、それぞれの結合した前記mRNA分子によってコードされているタンパク質分子。
  136. 前記タンパク質が、リボソームを介してそれぞれの前記mRNA分子に結合している、請求項１３５に記載のアレイ。
  137. 前記タンパク質が、前記リボソームに共有結合している、請求項１３６に記載の方法。
  138. 前記RNA分子が、RNAポリメラーゼを介してそれぞれの前記cDNA分子に結合している、請求項１３５に記載のアレイ。
  139. 前記mRNA分子が、前記cDNA分子に共有結合している、請求項１３８に記載の方法。
  140. 前記タンパク質が発光標識されている、請求項１３５に記載のアレイ。
  141. 発光標識されたスクリーニング剤が、タンパク質の結合部位に特異的に結合し、それにより前記タンパク質が蛍光標識される、請求項１４０に記載のアレイ。
  142. 前記固体支持体が、少なくとも1×106個の前記フィーチャーを含む、請求項１３５に記載のアレイ。
  143. 前記固体支持体上の前記フィーチャーの平均ピッチが10ミクロン未満である、請求項１３５に記載のアレイ。
  144. 前記フィーチャーが100平方ミクロン未満の平均面積を含む、請求項１３５に記載のアレイ。
  145. cDNA分子の前記ライブラリーが、複数の同一遺伝子の変異体を含む、請求項１３５に記載のアレイ。
  146. 前記タンパク質が、抗体、酵素、受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、ヒストン修飾酵素および核内ホルモン受容体からなる群より選択される、請求項１３５に記載の方法。
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WO (1) WO2016183029A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021065200A (ja) * 2019-10-28 2021-04-30 日本電信電話株式会社 生体分子の支持体とその製造方法
WO2022009642A1 (ja) * 2020-07-06 2022-01-13 ソニーグループ株式会社 生体粒子分析方法及び生体粒子分析システム

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10788452B2 (en) * 2015-04-21 2020-09-29 General Automation Lab Technologies Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods for bacterial community relationship determination and other high throughput microbiology applications
WO2017218293A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Richard Edward Watts Oligonucleotide directed and recorded combinatorial synthesis of encoded probe molecules
WO2018204420A1 (en) 2017-05-02 2018-11-08 Haystack Sciences Corporation Molecules for verifying oligonucleotide directed combinatorial synthesis and methods of making and using the same
CN111971124B (zh) 2017-09-25 2022-08-23 普莱克斯姆公司 寡核苷酸编码的化学文库
CN109444425A (zh) * 2018-11-01 2019-03-08 上海交通大学 一种细胞水平蛋白高通量检测方法
WO2021174199A1 (en) * 2020-02-28 2021-09-02 Synvitrobio, Inc. Methods and compositions for identifying traits using a cell-free system
US20230193245A1 (en) * 2020-06-29 2023-06-22 Google Llc Methods and compositions for making and using peptide arrays
GB202112907D0 (en) 2021-09-10 2021-10-27 Res & Innovation Uk Methods of biomolecule display

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013096777A2 (en) * 2011-12-23 2013-06-27 Wake Forest University Health Sciences Integrated compound discovery systems and methods

Family Cites Families (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
WO1991006678A1 (en) 1989-10-26 1991-05-16 Sri International Dna sequencing
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5565324A (en) 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
KR100230718B1 (ko) 1994-03-16 1999-11-15 다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프 등온 가닥 변위 핵산 증폭법
US5552278A (en) 1994-04-04 1996-09-03 Spectragen, Inc. DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage
US5641658A (en) 1994-08-03 1997-06-24 Mosaic Technologies, Inc. Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
GB9626815D0 (en) 1996-12-23 1997-02-12 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
EP0968223B1 (en) 1997-01-08 2016-12-21 Sigma-Aldrich Co. LLC Bioconjugation of macromolecules
US6023540A (en) 1997-03-14 2000-02-08 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor with encoded microspheres
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US6327410B1 (en) 1997-03-14 2001-12-04 The Trustees Of Tufts College Target analyte sensors utilizing Microspheres
DE69824716D1 (de) 1997-04-01 2004-07-29 Manteia S A Methode zur sequenzierung von nukleinsäuren
US7427678B2 (en) 1998-01-08 2008-09-23 Sigma-Aldrich Co. Method for immobilizing oligonucleotides employing the cycloaddition bioconjugation method
EP1054973A1 (en) * 1998-02-11 2000-11-29 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
WO1999055886A1 (en) * 1998-04-24 1999-11-04 Genova Pharmaceuticals Corporation Function-based gene discovery
EP2360271A1 (en) * 1998-06-24 2011-08-24 Illumina, Inc. Decoding of array sensors with microspheres
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
US6565727B1 (en) 1999-01-25 2003-05-20 Nanolytics, Inc. Actuators for microfluidics without moving parts
US6294063B1 (en) 1999-02-12 2001-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for programmable fluidic processing
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
US20050181440A1 (en) 1999-04-20 2005-08-18 Illumina, Inc. Nucleic acid sequencing using microsphere arrays
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
AU4476900A (en) 1999-04-20 2000-11-02 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
EP1212411A2 (en) * 1999-08-20 2002-06-12 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods and compositions for the construction and use of fusion libraries
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
AU1921001A (en) * 1999-11-18 2001-05-30 Large Scale Proteomics Corporation Sequence tag microarray and method for detection of multiple proteins through dna methods
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US6770441B2 (en) 2000-02-10 2004-08-03 Illumina, Inc. Array compositions and methods of making same
AU2001255344A1 (en) * 2000-04-12 2001-11-12 King Faisal Specialist Hospital And Research Centre System for identifying and analyzing expression of are-containing genes
EP1368460B1 (en) 2000-07-07 2007-10-31 Visigen Biotechnologies, Inc. Real-time sequence determination
SG90149A1 (en) * 2000-07-18 2002-07-23 Government Of The Republic Of Diagnostic assay
US8529743B2 (en) 2000-07-25 2013-09-10 The Regents Of The University Of California Electrowetting-driven micropumping
US6773566B2 (en) 2000-08-31 2004-08-10 Nanolytics, Inc. Electrostatic actuators for microfluidics and methods for using same
US20020187482A1 (en) * 2000-09-25 2002-12-12 Zicai Liang Methods and means of RNA analysis
US20040018491A1 (en) * 2000-10-26 2004-01-29 Kevin Gunderson Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US7211414B2 (en) 2000-12-01 2007-05-01 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
AR031640A1 (es) 2000-12-08 2003-09-24 Applied Research Systems Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido
EP1270740A1 (en) * 2001-06-29 2003-01-02 SIRS-Lab GmbH Biochip and its use for determining inflammation
RU2206575C2 (ru) * 2001-07-25 2003-06-20 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Композиция для иммобилизации биологических макромолекул в гидрогелях, способ приготовления композиции, биочип, способ проведения пцр на биочипе
GB0127564D0 (en) 2001-11-16 2002-01-09 Medical Res Council Emulsion compositions
US7163612B2 (en) 2001-11-26 2007-01-16 Keck Graduate Institute Method, apparatus and article for microfluidic control via electrowetting, for chemical, biochemical and biological assays and the like
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
US20040002818A1 (en) * 2001-12-21 2004-01-01 Affymetrix, Inc. Method, system and computer software for providing microarray probe data
US20040002090A1 (en) 2002-03-05 2004-01-01 Pascal Mayer Methods for detecting genome-wide sequence variations associated with a phenotype
US7375234B2 (en) 2002-05-30 2008-05-20 The Scripps Research Institute Copper-catalysed ligation of azides and acetylenes
FR2841063B1 (fr) 2002-06-18 2004-09-17 Commissariat Energie Atomique Dispositif de deplacement de petits volumes de liquide le long d'un micro-catenaire par des forces electrostatiques
EP3002289B1 (en) 2002-08-23 2018-02-28 Illumina Cambridge Limited Modified nucleotides for polynucleotide sequencing
US7595883B1 (en) 2002-09-16 2009-09-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biological analysis arrangement and approach therefor
US6911132B2 (en) 2002-09-24 2005-06-28 Duke University Apparatus for manipulating droplets by electrowetting-based techniques
US7547380B2 (en) 2003-01-13 2009-06-16 North Carolina State University Droplet transportation devices and methods having a fluid surface
ES2396245T3 (es) 2003-01-29 2013-02-20 454 Life Sciences Corporation Método de amplificación y secuenciamiento de ácidos nucleicos
EP1636337A4 (en) 2003-06-20 2007-07-04 Illumina Inc METHODS AND COMPOSITIONS USEFUL FOR THE AMPLIFICATION AND GENOTYPING OF THE GENOME
WO2005010145A2 (en) 2003-07-05 2005-02-03 The Johns Hopkins University Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations
CN100478075C (zh) 2003-11-17 2009-04-15 皇家飞利浦电子股份有限公司 用于操纵流体实体的系统
US7259258B2 (en) 2003-12-17 2007-08-21 Illumina, Inc. Methods of attaching biological compounds to solid supports using triazine
EP1701785A1 (en) 2004-01-07 2006-09-20 Solexa Ltd. Modified molecular arrays
FR2866493B1 (fr) 2004-02-16 2010-08-20 Commissariat Energie Atomique Dispositif de controle du deplacement d'une goutte entre deux ou plusieurs substrats solides
FR2872715B1 (fr) 2004-07-08 2006-11-17 Commissariat Energie Atomique Microreacteur goutte
FR2872809B1 (fr) 2004-07-09 2006-09-15 Commissariat Energie Atomique Methode d'adressage d'electrodes
JP2006058031A (ja) 2004-08-17 2006-03-02 Hitachi High-Technologies Corp 化学分析装置
US7476503B2 (en) 2004-09-17 2009-01-13 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and method for performing nucleic acid analysis
US7458661B2 (en) 2005-01-25 2008-12-02 The Regents Of The University Of California Method and apparatus for promoting the complete transfer of liquid drops from a nozzle
PL1859330T3 (pl) 2005-01-28 2013-01-31 Univ Duke Urządzenia i sposoby manipulacji kropelkami na płytkach obwodów drukowanych
CA2611671C (en) 2005-06-15 2013-10-08 Callida Genomics, Inc. Single molecule arrays for genetic and chemical analysis
US20070023292A1 (en) 2005-07-26 2007-02-01 The Regents Of The University Of California Small object moving on printed circuit board
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
GB0522310D0 (en) 2005-11-01 2005-12-07 Solexa Ltd Methods of preparing libraries of template polynucleotides
JP5180845B2 (ja) * 2006-02-24 2013-04-10 カリダ・ジェノミックス・インコーポレイテッド Ｄｎａアレイ上でのハイスループットゲノム配列決定
US20080009420A1 (en) 2006-03-17 2008-01-10 Schroth Gary P Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays
CN101460953B (zh) 2006-03-31 2012-05-30 索雷克萨公司 用于合成分析的序列的系统和装置
DE602006018794D1 (de) 2006-04-18 2011-01-20 Advanced Liquid Logic Inc Biochemie auf tröpfchenbasis
EP2040082A4 (en) 2006-07-10 2014-04-23 Hitachi High Tech Corp LIQUID TRANSFER DEVICE
WO2008042067A2 (en) 2006-09-28 2008-04-10 Illumina, Inc. Compositions and methods for nucleotide sequencing
US7754429B2 (en) 2006-10-06 2010-07-13 Illumina Cambridge Limited Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides
WO2008051530A2 (en) 2006-10-23 2008-05-02 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing
US9266076B2 (en) 2006-11-02 2016-02-23 The Regents Of The University Of California Method and apparatus for real-time feedback control of electrical manipulation of droplets on chip
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
EP2677309B9 (en) 2006-12-14 2014-11-19 Life Technologies Corporation Methods for sequencing a nucleic acid using large scale FET arrays, configured to measure a limited pH range
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
WO2008093098A2 (en) 2007-02-02 2008-08-07 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
US8772046B2 (en) 2007-02-06 2014-07-08 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
GB0706631D0 (en) * 2007-04-04 2007-05-16 King S College London Nucleic acids and libraries
US8926811B2 (en) 2007-06-27 2015-01-06 Digital Biosystems Digital microfluidics based apparatus for heat-exchanging chemical processes
GB0806562D0 (en) 2008-04-10 2008-05-14 Fermentas Uab Production of nucleic acid
US8093064B2 (en) 2008-05-15 2012-01-10 The Regents Of The University Of California Method for using magnetic particles in droplet microfluidics
US20100035249A1 (en) * 2008-08-05 2010-02-11 Kabushiki Kaisha Dnaform Rna sequencing and analysis using solid support
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
WO2010111231A1 (en) 2009-03-23 2010-09-30 Raindance Technologies, Inc. Manipulation of microfluidic droplets
CN106701739A (zh) * 2009-12-04 2017-05-24 株式会社日立制作所 基因表达解析用解析装置及设备
JP2013512691A (ja) * 2009-12-07 2013-04-18 プログノシス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド ペプチド提示アレイ
US9073033B2 (en) 2010-01-19 2015-07-07 Illumina, Inc. Methods and compositions for processing chemical reactions
JP5759678B2 (ja) * 2010-04-14 2015-08-05 国立大学法人埼玉大学 核酸リンカー
WO2011143231A2 (en) * 2010-05-10 2011-11-17 The Broad Institute High throughput paired-end sequencing of large-insert clone libraries
EP2632593B1 (en) 2010-10-27 2021-09-29 Illumina, Inc. Flow cells for biological or chemical analysis
US8951781B2 (en) 2011-01-10 2015-02-10 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis
EP3150750B1 (en) * 2011-04-08 2018-12-26 Prognosys Biosciences, Inc. Peptide constructs and assay systems
CA3003082C (en) 2011-10-28 2020-12-15 Illumina, Inc. Microarray fabrication system and method
US8637242B2 (en) 2011-11-07 2014-01-28 Illumina, Inc. Integrated sequencing apparatuses and methods of use
WO2013085710A2 (en) 2011-12-09 2013-06-13 Illumina, Inc. Expanded radix for polymeric tags
GB2500243A (en) * 2012-03-15 2013-09-18 Isogenica Ltd Identifying members of immobilised peptide libraries comprising protein-DNA complexes
US9012022B2 (en) 2012-06-08 2015-04-21 Illumina, Inc. Polymer coatings
US8895249B2 (en) 2012-06-15 2014-11-25 Illumina, Inc. Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
CN104508128A (zh) * 2012-07-30 2015-04-08 株式会社日立制作所 带标签序列的2维cDNA文库设备、以及使用其的基因表达解析方法及基因表达解析装置
US20140378322A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
MX364957B (es) 2012-08-14 2019-05-15 10X Genomics Inc Composiciones y metodos para microcapsulas.
WO2014059370A1 (en) * 2012-10-12 2014-04-17 Institute For Systems Biology Improved high throughput system for genetic studies
CA2894694C (en) 2012-12-14 2023-04-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CA2900481A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 10X Genomics, Inc. Polynucleotide barcode generation
US9512422B2 (en) 2013-02-26 2016-12-06 Illumina, Inc. Gel patterned surfaces
EP2969479B1 (en) 2013-03-13 2021-05-05 Illumina, Inc. Multilayer fluidic devices and methods for their fabrication
US9255265B2 (en) * 2013-03-15 2016-02-09 Illumina, Inc. Methods for producing stranded cDNA libraries
CN114107458A (zh) * 2013-03-15 2022-03-01 血统生物科学公司 测序免疫组库的方法
WO2014189768A1 (en) * 2013-05-19 2014-11-27 The Board Of Trustees Of The Leland Devices and methods for display of encoded peptides, polypeptides, and proteins on dna
EP2805769A1 (en) * 2013-05-24 2014-11-26 European Molecular Biology Laboratory Methods for nano-scale single cell analysis
EP3919624A3 (en) 2013-07-01 2021-12-29 Illumina, Inc. Catalyst-free surface functionalization and polymer grafting
SG10201806890VA (en) * 2013-08-28 2018-09-27 Cellular Res Inc Massively parallel single cell analysis
WO2015148606A2 (en) 2014-03-25 2015-10-01 President And Fellows Of Harvard College Barcoded protein array for multiplex single-molecule interaction profiling
AU2015288389B2 (en) * 2014-07-07 2021-05-13 Astrego Diagnostics Ab Phenotypic characterization and in situ genotyping of a library of genetically different cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013096777A2 (en) * 2011-12-23 2013-06-27 Wake Forest University Health Sciences Integrated compound discovery systems and methods

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021065200A (ja) * 2019-10-28 2021-04-30 日本電信電話株式会社 生体分子の支持体とその製造方法
JP7365022B2 (ja) 2019-10-28 2023-10-19 日本電信電話株式会社 生体分子の支持体とその製造方法
WO2022009642A1 (ja) * 2020-07-06 2022-01-13 ソニーグループ株式会社 生体粒子分析方法及び生体粒子分析システム

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