CN107208157B - 用于条形编码核酸以用于测序的方法和组合物 - Google Patents

用于条形编码核酸以用于测序的方法和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN107208157B
CN107208157B CN201680007351.2A CN201680007351A CN107208157B CN 107208157 B CN107208157 B CN 107208157B CN 201680007351 A CN201680007351 A CN 201680007351A CN 107208157 B CN107208157 B CN 107208157B
Authority
CN
China
Prior art keywords
target
sequence
oligonucleotide
primer
barcode
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680007351.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107208157A (zh
Inventor
格伦·弗
朱莉·威廉米
玛丽亚·西姆比尔斯基
艾琳·夏姆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Becton Dickinson and Co
Original Assignee
Becton Dickinson and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Becton Dickinson and Co filed Critical Becton Dickinson and Co
Publication of CN107208157A publication Critical patent/CN107208157A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107208157B publication Critical patent/CN107208157B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

用于使用随机条形码标记样品中的核酸的方法和组合物，所述方法和组合物使用具有通用引发位点和靶标特异性区域的可延伸寡核苷酸。一些实施例涉及用于通过鉴定T细胞的所述TCRα链或β链来表征样品的方法和组合物。

Description

用于条形编码核酸以用于测序的方法和组合物
相关申请
本申请基于以下临时专利申请并且根据35 U.S.C.§119(e)要求以下临时专利申请的权益：2015年2月27日提交的美国临时专利申请序列号62/126,397；2015年3月5日提交的美国临时专利申请序列号62/128,849；2015年5月13日提交的美国临时专利申请序列号62/160,976；2015年6月10日提交的美国临时专利申请序列号62/173,899；以及2015年7月17日提交的美国临时专利申请序列号62/194,075。这些相关申请的内容出于所有目的通过引用以其整体结合在此。
参考序列表
本申请连同以电子格式的序列表一起提交。序列表呈大小为77.3Kb的2016年2月25日创建的名称为BDCRI-011WO_SEQLISTING.TXT的文档提供。电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体结合在此。
领域
在此提供的实施例涉及用于使用随机条形码标记样品中的核酸的方法和组合物。一些实施例涉及用于通过鉴定T细胞的TCRα链或β链来表征样品的方法和组合物。
背景
已开发出用于标记核酸分子以用于扩增或测序的方法和组合物。对核酸靶标进行随机计数是重要的定量方法。然而，先前工作的缺点是设计用于特定靶标的试剂要设计用于随机标记将是昂贵的。在此描述了用于标记靶标以用于随机计数的方法和组合物。
概述
在一个方面中，本披露提供了标记样品中的核酸的方法，这些方法包括：将靶标与包含通用衔接序列和靶标特异性序列的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与第二寡核苷酸杂交；延伸所述第二寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；将所述第二核苷酸序列与包含用于第一扩增引物的结合位点和通用衔接序列的第三寡核苷酸杂交，其中第一寡核苷酸和第三寡核苷酸中的一个或两个包含随机条形码的部分；延伸所述第三寡核苷酸以生成第三核苷酸序列；并且使用第一扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列以生成多个第四核苷酸序列，其中多个第四核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和随机条形码。在一些实施例中，样品是单细胞。在一些实施例中，靶标是mRNA分子。在一些实施例中，mRNA分子编码T细胞受体(TCR)α链或β链。在一些实施例中，靶标特异性序列特异性地结合到TCR α链或β链的C区上。在一些实施例中，方法包括使用第二扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列。在一些实施例中，第二扩增引物特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCRα链或β链的V区、TCR α链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在一些实施例中，第二寡核苷酸特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCRα链或β链的V区、TCRα链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在一些实施例中，第二寡核苷酸包含用于第二扩增引物的结合位点。在一些实施例中，方法包括使用第二扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列。在一些实施例中，第一寡核苷酸包含随机条形码。在一些实施例中，第三寡核苷酸包含随机条形码。在一些实施例中，第一寡核苷酸和第三寡核苷酸中的每一个包含随机条形码的部分。在一些实施例中，随机条形码包含分子标记。在一些实施例中，随机条形码包含通用标记、维标记、细胞标记、或其组合。在一些实施例中，第一寡核苷酸或第三寡核苷酸被连接到固体支持物上。在一些实施例中，样品包含多种靶标。在一些实施例中，多种靶标中的每一种用不同随机条形码标记。在一些实施例中，方法包括通过计数与靶标相缔合的不同随机条形码来计数多种靶标的数目。
在一个方面中，本披露提供了标记样品中的靶标以用于定量所述靶标的方法，这些方法包括：将所述靶标与包含第一通用衔接序列和靶标特异性序列的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与包含第二通用衔接序列和第二靶标特异性序列的第二寡核苷酸杂交；延伸所述第二寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；将所述第二核苷酸序列与包含用于第一扩增引物的结合位点和第一通用衔接序列的第三寡核苷酸杂交；延伸所述第三寡核苷酸以生成第三核苷酸序列；将所述第三核苷酸序列与包含用于第二扩增引物的结合位点和第二通用衔接序列的第四寡核苷酸杂交，其中第三寡核苷酸和第四寡核苷酸中的一个或两个包含随机条形码的部分；延伸所述第四寡核苷酸以生成第四核苷酸序列；并且使用第一扩增引物和第二扩增引物来扩增所述第四核苷酸序列以生成多个第五核苷酸序列，其中多个第五核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和随机条形码。在一些实施例中，样品是单细胞。在一些实施例中，靶标是mRNA分子。在一些实施例中，mRNA分子编码T细胞受体(TCR)α链或β链。在一些实施例中，靶标特异性序列特异性地结合到TCRα链或β链的C区上。在一些实施例中，第二靶标特异性序列特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCRα链或β链的V区、TCR α链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在一些实施例中，第三寡核苷酸包含随机条形码。在一些实施例中，第四寡核苷酸包含随机条形码。在一些实施例中，第三寡核苷酸和第四寡核苷酸中的每一个包含随机条形码的部分。在一些实施例中，随机条形码包含分子标记。在一些实施例中，随机条形码包含通用标记、维标记、细胞标记、或其组合。
在一个方面中，本披露提供了标记样品中的靶标以用于定量所述靶标的方法，这些方法包括：将所述靶标与包含靶标特异性序列和用于第一扩增引物的结合位点的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与包含通用衔接序列和第二靶标特异性序列的第二寡核苷酸杂交；延伸所述第二寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；将所述第二核苷酸序列与第三寡核苷酸杂交，该第三寡核苷酸包含用于第二扩增引物的结合位点和特异性地结合通用衔接序列的序列，其中第二寡核苷酸和第三寡核苷酸中的一个或两个包含随机条形码的部分；延伸所述第三寡核苷酸以生成第三核苷酸序列；并且使用第一扩增引物和第二扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列以生成多个第四核苷酸序列，其中多个第四核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和随机条形码。在一些实施例中，样品是单细胞。在一些实施例中，靶标是mRNA分子。在一些实施例中，mRNA分子编码T细胞受体(TCR)α链或β链。在一些实施例中，靶标特异性序列特异性地结合到TCR α链或β链的C区上。在一些实施例中，第二靶标特异性序列特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCR α链或β链的V区、TCRα链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在一些实施例中，第三寡核苷酸包含随机条形码。在一些实施例中，随机条形码包含分子标记。在一些实施例中，随机条形码包含通用标记、维标记、细胞标记、或其组合。
在一个方面中，本披露提供了标记样品中的靶标以用于定量所述靶标的方法，这些方法包括：在包含通用衔接序列的第二寡核苷酸存在下，将所述靶标与包含靶标特异性序列和第一扩增引物序列的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成包含通用衔接序列补体的第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与第三寡核苷酸杂交，该第三寡核苷酸包含通用衔接序列、随机条形码以及用于第二扩增引物的结合位点；延伸所述第三寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；并且使用第一扩增引物和第二扩增引物来扩增所述第二核苷酸序列以生成多个第三核苷酸序列，其中多个第三核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和随机条形码。在一些实施例中，方法包括通过模板转换来延伸第一寡核苷酸以生成包含通用衔接序列补体的第一核苷酸序列。在一些实施例中，随机条形码包含分子标记。在一些实施例中，随机条形码包含通用标记、维标记、细胞标记、或其组合。
在一个方面中，本披露提供了标记样品中的靶标以用于定量所述靶标的方法，这些方法包括：将所述靶标与包含通用衔接序列和靶标特异性序列的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与第二寡核苷酸和第三寡核苷酸杂交，该第二寡核苷酸包含第二靶标特异性序列，该第三寡核苷酸包含随机条形码和特异性地结合通用衔接序列的序列；扩增所述第一核苷酸序列以生成多个第二核苷酸序列，其中多个第二核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和所述随机条形码。在一些实施例中，样品是单细胞。在一些实施例中，靶标是mRNA分子。在一些实施例中，mRNA分子编码T细胞受体(TCR)α链或β链。在一些实施例中，靶标特异性序列特异性地结合到TCRα链或β链的C区上。在一些实施例中，方法包括使用第二扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列。在一些实施例中，第二扩增引物特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCRα链或β链的V区、TCRα链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在一些实施例中，第二寡核苷酸特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCR α链或β链的V区、TCR α链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在一些实施例中，第二寡核苷酸包含用于第二扩增引物的结合位点。在一些实施例中，方法包括使用第二扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列。在一些实施例中，第一寡核苷酸包含随机条形码。在一些实施例中，第三寡核苷酸包含随机条形码。在一些实施例中，第一寡核苷酸和第三寡核苷酸中的每一个包含随机条形码的部分。在一些实施例中，随机条形码包含分子标记。在一些实施例中，随机条形码包含通用标记、维标记、细胞标记、或其组合。在一些实施例中，第一寡核苷酸或第三寡核苷酸被连接到固体支持物上。在一些实施例中，样品包含多种靶标。在一些实施例中，多种靶标中的每一种用不同随机条形码标记。在一些实施例中，方法包括通过计数与靶标相缔合的不同随机条形码来计数多种靶标的数目。
在一个方面中，本披露提供了表征样品的方法，这些方法包括：将样品中的第一靶标与包含第一靶标特异性序列和第一随机条形码的第一寡核苷酸杂交，其中第一靶标是编码TCR α链或β链的mRNA；将样品中的第二靶标与包含第二靶标特异性序列和第二随机条形码的第二寡核苷酸杂交；延伸第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以将第一随机条形码并入第一靶标中并且将第二随机条形码并入第二靶标中；并且鉴定第一靶标和第二靶标的序列。在一些实施例中，样品是单细胞。在一些实施例中，第一靶标特异性序列特异性地结合到TCRα链或β链的C区上。在一些实施例中，延伸包括使用正向引物扩增第一靶标。在一些实施例中，正向引物特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCR α链或β链的V区、TCR α链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在一些实施例中，第二靶标选自图39所列出的基因组成的组。在一些实施例中，第一随机条形码或第二随机条形码包含以下各项中的一种或多种：分子标记、通用标记、维标记以及细胞标记。在一些实施例中，第一随机条形码和第二随机条形码包含相同的细胞标记。在一些实施例中，样品包含多个第一靶标或第二靶标。在一些实施例中，多个第一靶标或第二靶标中的每一个用不同随机条形码标记。在一些实施例中，方法包括通过计数与第一靶标或第二靶标相缔合的不同随机条形码来计数多个第一靶标或第二靶标的数目。
在一个方面中，本披露提供了标记样品中的靶标以用于定量所述靶标的方法，这些方法包括：将所述靶标与包含通用衔接序列和靶标特异性序列的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与包含第二靶标特异性序列的第二寡核苷酸杂交；延伸所述第二寡核苷酸以生成第一核苷酸序列的互补链和双链核苷酸序列；将包含用于第一扩增引物的结合位点的双链衔接寡核苷酸连接到所述双链核苷酸序列上以形成连接的核苷酸序列；使用包含随机条形码的第一扩增引物和第二扩增引物来扩增所述连接的核苷酸序列以生成多个第二核苷酸序列，其中多个第二核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和所述随机条形码。在一些实施例中，样品是单细胞。在一些实施例中，靶标是mRNA分子。在一些实施例中，mRNA分子编码T细胞受体(TCR)α链或β链。在一些实施例中，靶标特异性序列特异性地结合到TCRα链或β链的C区上。在一些实施例中，方法包括使用第二扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列。在一些实施例中，第二扩增引物特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCRα链或β链的V区、TCRα链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在一些实施例中，第二寡核苷酸特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCR α链或β链的V区、TCR α链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在一些实施例中，第二寡核苷酸包含用于第二扩增引物的结合位点。在一些实施例中，方法包括使用第二扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列。在一些实施例中，第一寡核苷酸包含随机条形码。在一些实施例中，第三寡核苷酸包含随机条形码。在一些实施例中，第一寡核苷酸和第三寡核苷酸中的每一个包含随机条形码的部分。在一些实施例中，随机条形码包含分子标记。在一些实施例中，随机条形码包含通用标记、维标记、细胞标记、或其组合。在一些实施例中，第一寡核苷酸或第三寡核苷酸被连接到固体支持物上。在一些实施例中，样品包含多种靶标。在一些实施例中，多种靶标中的每一种用不同随机条形码标记。在一些实施例中，方法包括通过计数与靶标相缔合的不同随机条形码来计数多种靶标的数目。
在一个方面中，本披露提供了试剂盒，这些试剂盒包含：第一寡核苷酸，该第一寡核苷酸包含通用衔接序列和靶标特异性序列；以及第二寡核苷酸，该第二寡核苷酸包含随机条形码和通用衔接序列或其补体。在一些实施例中，第一寡核苷酸或第二寡核苷酸被连接到固体支持物上。在一些实施例中，靶标特异性序列特异性地结合到TCR α链或β链的C区上。在一些实施例中，试剂盒包含正向引物，其中正向引物特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCR α链或β链的V区、TCRα链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在一些实施例中，随机条形码包含以下各项中的一种或多种：分子标记、通用标记、维标记以及细胞标记。
在一个方面中，本披露提供了一种方法，该方法包括：将细胞中的一个或多个受体靶mRNA和细胞特异性靶mRNA与包含随机条形码的逆转录引物接触；对一个或多个受体靶mRNA和细胞特异性靶mRNA进行逆转录以生成受体靶cDNA和细胞特异性靶cDNA；确定受体靶cDNA和细胞特异性靶cDNA的序列以及它们相应的随机条形码；计数受体靶cDNA和细胞特异性靶标的数目，从而表征细胞和受体。在一些实施例中，受体靶mRNA选自以下各项组成的组：一个或多个TCR α链、一个或多个TCRβ链、或其任何组合。在一些实施例中，细胞特异性靶mRNA是指示免疫细胞类型的基因。在一些实施例中，细胞特异性靶mRNA选自图39所列出的靶mRNA。在一些实施例中，逆转录包括沿着受体靶mRNA和细胞特异性靶mRNA引物延伸随机条形码。在一些实施例中，逆转录引物结合到TCR α链或β链的C区上，并且两种或更多种逆转录引物中的一种结合到细胞特异性靶标上。在一些实施例中，方法进一步包括扩增cDNA，从而在该确定之前生成cDNA扩增子。在一些实施例中，扩增包括用第一组正向引物扩增。在一些实施例中，第一组正向引物包括结合到受体的一个或多个α链和β链上的引物。在一些实施例中，第一组正向引物包括结合到T细胞特异性靶标上的引物。在一些实施例中，第一组正向引物包括结合到选自以下各项组成的组的区域上的引物：TCRα链或β链的V区以及TCRα链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在一些实施例中，方法进一步包括用第二组正向引物扩增cDNA扩增子。在一些实施例中，第二组正向引物结合到受体的第一组正向引物结合位点的3’的区域上。在一些实施例中，确定包括确定受体靶cDNA和细胞特异性靶cDNA的序列扩增子。在一些实施例中，表征包括确定受体的哪条链的哪个等位基因是功能活性的。在一些实施例中，表征包括与受体的其他等位基因相比，确定受体的哪条链的哪个等位基因被更高度地表达。在一些实施例中，表征包括确定细胞的表型。在一些实施例中，表征包括确定细胞的功能。在一些实施例中，细胞是免疫细胞。在一些实施例中，细胞是T细胞。
在一个方面中，本披露提供了一种试剂盒，该试剂盒包括：板，其中板中的每一个孔包含结合到不同序列上的两种或更多种不同逆转录引物，其中两种或更多种逆转录引物包含随机条形码；多种基因特异性正向引物；以及使用说明书。在一些实施例中，两种或更多种逆转录引物是三种逆转录引物。在一些实施例中，两种或更多种逆转录引物结合到选自以下各项组成的组的靶标上：一个或多个T细胞标志基因、一个或多个TCR α链、一个或多个TCR β链、或其任何组合。在一些实施例中，两种或更多种逆转录引物结合到TCRα链或β链的C区上。在一些实施例中，两种或更多种逆转录引物中的一种结合到TCR α链或β链的C区上，并且两种或更多种逆转录引物中的一种结合到细胞特异性靶标上。在一些实施例中，基因特异性引物结合到T细胞特异性靶标上。在一些实施例中，基因特异性引物结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCR α链或β链的V区以及TCRα链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在一些实施例中，试剂盒进一步包含测序引物。在一些实施例中，试剂盒进一步包含第二多种基因特异性引物，该第二多种基因特异性引物是多种基因特异性引物的嵌套引物。在一些实施例中，试剂盒进一步包括软件。在一些实施例中，软件被用于计数靶标的分子数目，该靶标被一种或多种随机条形码逆转录。在一些实施例中，软件被用于鉴定靶标的序列，该靶标被一种或多种随机条形码逆转录。在一些实施例中，随机条形码包含基因特异性区域、分子标记、样品标记、或其任何组合。
在一个方面中，本披露提供了一种使用通用衔接引物来估计样品中一种或多种靶标的数目的方法，该方法包括：将一种或多种靶标与包含通用衔接引物的寡核苷酸接触；将寡核苷酸与随机条形码杂交；扩增一种或多种靶标，从而将寡核苷酸和随机条形码并入一种或多种靶标的序列中；并且使用随机条形码来估计一种或多种靶标的数目。在一些实施例中，寡核苷酸进一步包含基因特异性区域。在一些实施例中，随机条形码包含适配成杂交到通用引物衔接子上的序列。在一些实施例中，接触包括将寡核苷酸与一种或多种靶标杂交。在一些实施例中，接触包括延伸寡核苷酸以并入一种或多种靶标的序列，从而生成第一转录物。在一些实施例中，延伸是用引物延伸执行。在一些实施例中，延伸是用逆转录执行。在一些实施例中，在接触中进一步包括第二延伸。在一些实施例中，第二延伸包括将反向基因特异性引物杂交到第一转录物上。在一些实施例中，第二延伸包括将选自以下各项组成的组的引物杂交到第一转录物上：通用引物、寡聚dT引物以及随机六聚体。在一些实施例中，杂交包括将通用引物衔接序列杂交到适配成杂交到通用引物衔接序列上的序列上。在一些实施例中，杂交进一步包括延伸随机条形码以并入第一转录物的序列。在一些实施例中，扩增是用通用引物和基因特异性引物执行。在一些实施例中，扩增是用通用引物和第二通用引物执行。在一些实施例中，第二通用引物进一步包含基因特异性区域。在一些实施例中，扩增是执行一次。在一些实施例中，扩增是执行两次。在一些实施例中，随机条形码包含分子标记、细胞标记、样品标记以及通用标记、或其任何组合。在一些实施例中，分子标记是任何其他标记的3’。在一些实施例中，分子标记是任何其他标记的5’。在一些实施例中，通用引物衔接序列的长度是从5-30个核苷酸。在一些实施例中，估计进一步包括确定基因特异性随机条形码的分子标记的序列。在一些实施例中，方法进一步包括计数分子标记的不同序列的出现次数。在一些实施例中，计数被用于估计一种或多种靶标的数目。在一些实施例中，确定包括对基因特异性随机条形码进行测序。在一些实施例中，测序包括在至少100个碱基的读取长度的条件下进行测序。在一些实施例中，测序包括在至少500个碱基的读取长度的条件下进行测序。在一些实施例中，随机条形码包含分子标记、细胞标记、样品标记、空间标记、维标记以及通用标记、或其任何组合。在一些实施例中，不同随机条形码上的分子标记是不同的。在一些实施例中，不同随机条形码包含相同样品标记、细胞标记、或样品标记和细胞标记两者。在一些实施例中，样品包括单细胞。在一些实施例中，样品包括多个细胞。在一些实施例中，多个细胞包括一种或多种不同细胞类型。在一些实施例中，一种或多种细胞类型选自以下各项组成的组：脑细胞、心脏细胞、癌细胞、循环肿瘤细胞、器官细胞、上皮细胞、转移性细胞、良性细胞、原代细胞和循环细胞、或其任何组合。在一些实施例中，样品包括实体组织。在一些实施例中，样品是获得自受试者。在一些实施例中，受试者是选自以下各项组成的组的受试者：人、哺乳动物、狗、大鼠、小鼠、鱼、蝇、蠕虫、植物、真菌、细菌、病毒、脊椎动物以及无脊椎动物。在一些实施例中，一种或多种靶标是核糖核酸分子。在一些实施例中，核糖核酸分子选自以下各项组成的组：mRNA、微小RNA、mRNA降解产物和包含聚-A尾的核糖核酸、或其任何组合。在一些实施例中，靶标是脱氧核糖核酸分子。
在一个方面中，本披露提供了一种用于使用通用引物衔接子和随机条形码来估计样品中一种或多种靶标的数目的方法，该方法包括：将第一寡核苷酸接触第二寡核苷酸，该第一寡核苷酸包含与通用引物衔接序列互补的序列和基因特异性序列，该第二寡核苷酸包含编码随机条形码的序列和编码通用引物衔接序列的序列；将基因特异性序列并入随机条形码序列中，从而生成基因特异性随机条形码；将基因特异性随机条形码缔合到一种或多种靶标上；并且使用基因特异性随机条形码来估计一种或多种靶标的数目。在一些实施例中，接触包括将通用引物衔接序列与互补于通用引物衔接序列的序列杂交。在一些实施例中，通用引物衔接序列的长度是从5-30个核苷酸。在一些实施例中，基因特异性序列的长度是从5-30个核苷酸。在一些实施例中，并入包括引物延伸第一寡核苷酸。在一些实施例中，并入包括引物延伸第二寡核苷酸。在一些实施例中，并入包括逆转录第一寡核苷酸。在一些实施例中，并入包括逆转录第二寡核苷酸。在一些实施例中，缔合包括将基因特异性随机条形码杂交到一种或多种靶标上。在一些实施例中，执行缔合使得一种或多种靶标中的每一种与独特的基因特异性随机条形码相缔合。在一些实施例中，执行缔合使得一种或多种靶标中的至少95％与独特的基因特异性随机条形码相缔合。在一些实施例中，估计包括生成靶标-条形码分子。在一些实施例中，靶标-条形码分子包含靶标缔合到其上的基因特异性随机条形码的序列。在一些实施例中，估计进一步包括确定基因特异性随机条形码的分子标记的序列。在一些实施例中，方法进一步包括计数分子标记的不同序列的出现次数。在一些实施例中，计数被用于估计一种或多种靶标的数目。在一些实施例中，确定包括对基因特异性随机条形码进行测序。在一些实施例中，测序包括在至少100个碱基的读取长度的条件下进行测序。在一些实施例中，测序包括在至少500个碱基的读取长度的条件下进行测序。在一些实施例中，第一寡核苷酸被连接到固体支持物上。在一些实施例中，固体支持物包括珠。在一些实施例中，珠选自以下各项组成的组：硅胶珠、可控孔度玻璃珠、磁性珠、Dynabead、交联葡聚糖/琼脂糖凝胶珠、纤维素珠以及聚苯乙烯珠、或其任何组合。在一些实施例中，珠包括磁性珠。在一些实施例中，固体支持物是半固体。在一些实施例中，固体支持物包括聚合物、基质或水凝胶。在一些实施例中，固体支持物包括针阵列装置。在一些实施例中，固体支持物包含抗体。在一些实施例中，固体支持物包含多种随机条形码。在一些实施例中，多种随机条形码中的每一种随机条形码包含分子标记。在一些实施例中，不同固体支持物上的分子标记的区别在于至少一个核苷酸。在一些实施例中，随机条形码进一步包含通用标记、样品标记以及细胞标记、或其任何组合。在一些实施例中，对于固体支持物上的所有随机条形码，通用标记、样品标记以及细胞标记是相同的。在一些实施例中，样品包括单细胞。在一些实施例中，样品包括多个细胞。在一些实施例中，多个细胞包括一种或多种不同细胞类型。在一些实施例中，一种或多种细胞类型选自以下各项组成的组：脑细胞、心脏细胞、癌细胞、循环肿瘤细胞、器官细胞、上皮细胞、转移性细胞、良性细胞、原代细胞和循环细胞、或其任何组合。在一些实施例中，样品包括实体组织。在一些实施例中，样品是获得自受试者。在一些实施例中，受试者是选自以下各项组成的组的受试者：人、哺乳动物、狗、大鼠、小鼠、鱼、蝇、蠕虫、植物、真菌、细菌、病毒、脊椎动物以及无脊椎动物。在一些实施例中，一种或多种靶标是核糖核酸分子。在一些实施例中，核糖核酸分子选自以下各项组成的组：mRNA、微小RNA、mRNA降解产物和包含聚-A尾的核糖核酸、或其任何组合。在一些实施例中，靶标是脱氧核糖核酸分子。
在一个方面中，本披露提供了一种用于使用如图1-42中的一个或多个所描绘的通用引物衔接子和随机条形码来估计样品中靶标的数目的方法。
通过引用结合
本说明书中所提及的所有出版物、专利以及专利申请出于所有目的通过引用结合在此，达到如同每一个单独的出版物、专利或专利申请被专门地并且单独地指示通过引用结合的相同的程度。PCT/US14/53301出于所有目的通过引用结合在此。
附图简要说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下阐述使用本发明原理的说明性实施例的详细说明和附图将获得对本发明的特征和优点的更好理解：
图1描绘了用于使用通用衔接引物将随机条形码添加到靶标上的方法的示例性实施例。在第一延伸步骤中，包含靶标特异性序列110和通用衔接引物105的寡核苷酸120被杂交到靶标115上以生成第一核苷酸序列121。在第二延伸步骤中，第二靶标特异性引物122被用于合成第一核苷酸序列121的互补链125。在第三延伸步骤中，包含用于通用衔接引物130的结合配偶体的随机条形码可以通过通用衔接引物105而接触互补链125以合成第三核苷酸序列136。在扩增步骤中，第三靶标特异性引物140和通用PCR引物150可以被用于扩增第三核苷酸序列136以生成随机条形编码的靶标145。
图2描绘了用于使用通用衔接引物将随机条形码添加到靶标上的方法的示例性实施例。该实施例类似于图1所描绘的实施例，除在第二延伸步骤中引入第二通用PCR引物之外。
图3描绘了用于使用通用衔接引物将随机条形码添加到靶标上的方法的示例性实施例。该实施例类似于图2所描绘的实施例，除在随机条形码中分子标记和样品编码的顺序转换之外。
图4描绘了用于使用通用衔接引物将随机条形码添加到靶标上的方法的示例性实施例。该实施例类似于图2所描绘的实施例，除在第一延伸步骤和第三延伸步骤两者中引入随机条形码的部分之外。
图5描绘了用于使用通用衔接引物将随机条形码添加到靶标上的方法的示例性实施例。该实施例类似于图4所描绘的实施例，除都在第一延伸步骤中引入分子标记和样品编码两者之外。
图6描绘了用于使用通用衔接引物将随机条形码添加到靶标上的方法的示例性实施例。该实施例类似于图1所描绘的实施例，除在第一延伸步骤和第三延伸步骤两者中引入随机条形码的部分之外。
图7描绘了用于使用通用衔接引物将随机条形码添加到靶标上的方法的示例性实施例。该实施例类似于图6所描绘的实施例，除都在第一延伸步骤中引入分子标记和样品编码两者之外。
图8描绘了用于使用通用衔接引物将随机条形码添加到靶标上的方法的示例性实施例。该实施例类似于图2所描绘的实施例，除在第二延伸步骤中引入第二通用衔接引物，并且在第四延伸步骤中引入第二通用PCR引物，并且在第三延伸步骤和第四延伸步骤两者中引入随机条形码的部分之外。
图9描绘了用于使用通用衔接引物将随机条形码添加到靶标上的方法的示例性实施例。该实施例类似于图8所描绘的实施例，除在第三延伸步骤中引入样品编码并且在第四延伸步骤中引入分子标记之外。
图10描绘了用于将随机条形码添加到靶mRNA上的方法的示例性实施例，其中第一延伸步骤是使用包含第二通用PCR引物和聚(dT)的第一寡核苷酸的逆转录步骤，并且第二延伸步骤可以使用包含靶标特异性序列和通用衔接引物的第二寡核苷酸，并且第三延伸步骤可以使用包含随机条形码和用于通用衔接引物的结合配偶体的第三寡核苷酸。
图11描绘了用于使用通用衔接引物将随机条形码添加到靶mRNA上的方法的示例性实施例。该实施例类似于图10所描绘的实施例，除在随机条形码中分子标记和样品编码的顺序转换之外。
图12描绘了用于使用通用衔接引物将随机条形码添加到靶mRNA上的方法的示例性实施例。该实施例类似于图10所描绘的实施例，除在第一延伸步骤中使用模板转换来引入通用衔接引物之外。
图13描绘了用于使用通用衔接引物将随机条形码添加到靶mRNA上的方法的示例性实施例。该实施例类似于图12所描绘的实施例，除在随机条形码中分子标记和样品编码的顺序转换之外。
图14描绘了用于使用通用衔接引物将随机条形码添加到靶标上的方法的示例性实施例。该实施例类似于图1所描绘的实施例，其中通用衔接引物可以被固定在珠上以用于生成基因特异性随机条形码。
图15描绘了用于使用通用衔接引物将随机条形码添加到靶标上的方法的示例性实施例。该实施例类似于图14所描绘的实施例，其中包含通用衔接引物的随机条形码可以被固定在珠上以用于生成基因特异性随机条形码。
图16描绘了固体支持物如何可以包含可以与本披露的通用衔接引物杂交的序列的示例性实施例，该序列可以是随机条形码的一部分。
图17示出了固体支持物如何可以包含可以与类似于图16所描绘的通用衔接引物的一种通用衔接引物杂交的序列的示例性实施例，除在随机条形码中分子标记和样品编码的顺序转换之外。
图18描绘了固体支持物如何可以包含可以与通用衔接引物杂交的序列的示例性实施例。该实施例类似于图16所描绘的实施例，除第二通用PCR引物被连接到靶标上之外。
图19示出了固体支持物如何可以包含可以与类似于图18所描绘的通用衔接引物的一种通用衔接引物杂交的序列的示例性实施例，除在随机条形码中分子标记和样品编码的顺序转换之外。
图20描绘了可以使用连接到固体支持物上的通用衔接引物来执行图12所描绘的模板转换的示例性实施例。
图21描绘了类似于图20所描绘的模板转换的示例性实施例，除在模板转换步骤过程中引入随机条形码之外。
图22描绘了示例性随机条形码。
图23示出了用于随机标记单细胞中的mRNA分子的示例性方法。
图24示出了计算机系统，该计算机系统包括可以结合本披露的实施例使用的非暂时性计算机可读介质。
图25示出了可以结合本披露的实施例使用的计算机系统的第一实例架构的示例性实施例。
图26示出了示例性图解，该示例性图解示出了用于本披露方法中的具有多个计算机系统的网络。
图27示出了根据本披露方法使用共享虚拟地址存储空间的多处理器计算机系统的示例性框图。
图28A、28B和28C描绘了用于本披露方法中的示例性柱体。
图29示出了在扩增过程中减少引物二聚体的方法的示例性实施例。
图30示出了在扩增过程中减少引物二聚体的方法的示例性实施例，其中扩增引物包含通用序列(例如，与Illumina测序仪相兼容)。
图31示出了本披露的衔接子连接方法的示例性实施例。
图32示出了使用本披露方法的映射和多路解编率。
图33示出了扩增子上的读取计数的分布。具有单一扩增子的基因用浅/深灰色标记。基因内的多个扩增子被涂上相同颜色并且集中在一起。
图34示出了本披露方法中SNP鉴定的计算机方法的示例性实施例。
图35示出了用于选择基因的等位基因特异性表达。表格中的数字表示在SNP位置处含有指示的碱基的读取数。用深灰色突显的值具有非常低的计数，而用浅灰色突显的值具有高的计数。
图36描绘了用于使用基因特异性引物检测IgG mRNA的示意图。IgG重链mRNA描绘于步骤1中具有VDJC结构。IgG轻链mRNA的文库制备方法是类似的，但没有短D区区段。C-Rev：C区特异性反向序列；marker-rev：基因特异性标志反向引物；MI-SI-Universal：包含分子索引条形码和样品索引条形码以及恒定引物序列的引物序列；ILMN R1：Illumina读取1的引物序列；ILMN R1：Illumina读取2的引物序列。
图37示出了用于文库制备的衔接子连接方法的示意图。IgG重链mRNA描绘于步骤1中具有VDJC结构。IgG轻链mRNA的文库制备方法是类似的，但没有短D区区段。C-Rev：C区特异性反向引物序列；marker-rev：基因特异性标志反向序列；MI-SI-Universal：包含分子索引条形码和样品索引条形码以及恒定引物序列的引物序列；ILMN R1：Illumina读取1的引物序列；ILMN R1：Illumina读取2的引物序列。
图38示出了T细胞受体(TCR)和基因标志mRNA在使用TCR C区反向序列或聚(A)尾以用于通用mRNA捕获的逆转录过程中被条形编码有分子标记(MI)和样品标记(SI)。使用基因特异性引物执行2次多重PCR以富集靶标并且连接测序衔接子。此文库制备策略可以扩增TCRα和TCRβ两者的互补决定区3(CDR3)，该互补决定区3是跨越不同重排TCR区段的‘高变’部分。
图39示出了可以用于TCR基因组中的示例性基因。
图40示出了在T细胞RNA样品中鉴定出的TCRα和TCRβ库(repertoire)。
图41示出了来自单一激活T细胞的主成分分析的结果。
图42示出了用于使用随机标记物标记TCR mRNA的一步式RT-PCR的示例性方案。
详细说明
本披露提供了用于使用基因特异性随机条形码来估计样品中靶标的数目的方法。本披露提供了用于生成基因特异性随机条形码的方法。本披露提供了用于以基因特异性方式执行随机条形编码的方法。例如，基因特异性随机条形编码可以通过图1所示的示例性实施例来产生。包含通用引物衔接子105和基因特异性靶结合区110的寡核苷酸可以接触靶标115。第一延伸反应可以通过延伸120寡核苷酸以并入靶标115的序列来执行，从而生成第一转录物121。可以执行第二延伸反应，其中反向基因特异性引物122可以被用于生成并入寡核苷酸的互补链125，该寡核苷酸包含基因特异性引物110和通用引物衔接子105。包含通用引物衔接子的随机条形码130(或可以杂交到通用引物衔接子上的序列)可以通过通用引物衔接序列105接触转录物125。可以执行第三延伸，其中生成包含靶标序列、通用衔接引物序列105和随机条形码序列的转录物136。在第三延伸之后，可以去除多余的随机条形码130(例如，通过大小排阻、电泳)。可以使用基因特异性引物140和可以杂交到通用标记(例如，通用PCR引物序列)上的通用衔接引物150执行扩增反应。扩增可以产生随机条形编码的靶标145，该随机条形编码的靶标可以被用于鉴定样品中不同数目的靶标。随机条形码可以1:1的比率与靶标相缔合。以此方式，随机条形码可以被用于计数靶标种类的不同出现次数。
在一些例子中，在第三延伸之后，可以不去除多余的随机条形码130。通过改变执行反应的温度，多余的随机条形码130可以不并入随机条形编码反应(例如，第三延伸)中。该反应可以在一组寡核苷酸可以杂交到转录物上并且另一组寡核苷酸可以不杂交到转录物上的温度下执行。例如，通用引物和基因特异性引物122可以具有70℃的Tm。通用衔接引物序列可以具有50℃的Tm。如果随机条形编码反应在70℃下执行，该反应可以防止多余的随机条形码130退火至靶标。通用衔接引物可以具有至少30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或80℃或更高的Tm。通用衔接引物可以具有至多30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或80C或更高的Tm。通用引物和基因特异性引物(例如，延伸引物)可以具有至少30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或80℃或更高的Tm。通用引物和基因特异性引物(例如，延伸引物)可以具有至多30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或80℃或更高的Tm。通用衔接引物的Tm可以比延伸引物的Tm高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、10％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％或更多。通用衔接引物的Tm可以比延伸引物的Tm高至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、10％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％或更多。
本披露的方法可以提供一种生成基因特异性随机条形码的方法。例如，本披露的生成基因特异性随机条形码的方法可以类似于图1所述并且所示的。随机条形码的标记(例如，样品标记(或样品编码，该样品编码在此可以与术语“样品标记”互换使用))可以呈任何顺序。在一些实施例中，随机条形码的全部或部分可以被包含在寡核苷酸120中，该寡核苷酸包含基因特异性引物110和通用引物衔接子105，例如通用衔接引物105的3’。图6和图7示出了图1的方法，但是其中分子标记(图6)或分子标记和样品标记两者(图7)被包含在寡核苷酸120中，该寡核苷酸包含基因特异性引物110和通用引物衔接子105。
在一些实施例中，本披露提供了用于针对相同基因的多个扩增子进行基因特异性扩增的方法。例如，可以使用本披露的基因特异性方法来扩增(例如，平行地)一种基因上的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个扩增子。可以使用本披露的基因特异性方法来扩增(例如，平行地)一种基因上的至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个扩增子。在一些例子中，可以扩增一种基因上的高达100个扩增子。扩增子可以被选择用于具体变体探测(calling)诸如SNP探测，确定等位基因特异性表达。
本披露的方法可以被用于鉴定抗体的VDJ区。VDJ重组(又称为体细胞重组)是免疫系统的免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)产生的早期阶段中的基因重组机制。VDJ重组可以几乎随机地组合可变(V)基因区段、多样(D)基因区段和连接(J)基因区段。由于其在选择不同基因方面的随机性，所以能够多样地编码蛋白质以匹配来自细菌、病毒、寄生虫、功能紊乱细胞(诸如肿瘤细胞)以及花粉的抗原。
VDJ区可以包含较大的3Mb基因座，该基因座包含可变(V)基因、多样性(D)基因和连接(J)基因。这些是可以参与VDJ重组的区段。可以存在可以不经历VDJ重组的恒定基因。此基因座的VDJ重组中的第一事件可以是D基因中的一个重排到J基因中的一个上。此后，V基因中的一个可以被附添到此DJ重排上以形成功能性的VDJ重排基因，然后该VDJ重排基因编码重链蛋白的可变区段。这两个步骤可以通过重组酶来催化，这些重组酶可以删除间插DNA。
此重组过程以逐步的形式发生在祖先B细胞中以产生抗体库所需的多样性。每个B细胞仅可以产生一种抗体。此特异性可以通过等位基因排斥使得发出一个等位基因功能性重排的信号以防止第二等位基因进一步重排来实现。
定义
除非另外定义，否则在此所使用的所有技术术语均具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非上下文另外明确指示，否则如本说明书和所附权利要求书所使用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”以及“该(the)”包括复数指示物。除非另外说明，否则在此对“或”的任何引用旨在涵盖“和/或”。
如在此所用，术语“相缔合的”或“与...相缔合的”可以意指两种或更多种物质在某一时间点可识别为共定位。缔合可以意指两种或更多种物质在或曾经在类似容器内。缔合可以是信息学关联，其中例如关于两种或更多种物质的数字信息被存储并且可以用于确定一种或多种物质在某一时间点共定位。缔合还可以是物理缔合。在一些实施例中，两种或更多种相缔合的物质彼此“系接”、“连接”或“固定”，或“系接”、“连接”或“固定”到共同的固体或半固体表面上。缔合可以是指用于将标记连接到固体或半固体支持物诸如珠上的共价或非共价方式。缔合可以是靶标与标记之间的共价键。
如在此所用，术语“数字计数”可以是指用于估计样品中靶分子的数目的方法。数字计数可以包括确定已与样品中的靶标相缔合的独特标记数目的步骤。这种随机方法将计数分子的问题从定位并识别相同分子的一个问题转变成关于检测一组预先定义的标记的一系列是/否数字问题。
如在此所用，术语“一个标记”或“多个标记”可以是指与样品内的靶标相缔合的核酸编码。标记可以是例如核酸标记。标记可以是整体或部分可扩增的标记。标记可以是整体或部分可测序的标记。标记可以是天然核酸中可识别为不同的一部分。标记可以是已知序列。标记可以包括核酸序列的接合点，例如天然序列和非天然序列的接合点。如在此所用，术语“标记”可以与术语“索引”、“标签”或“标记-标签”互换使用。标记可以传达信息。例如，在不同的实施例中，标记可用于确定样品身份、样品来源、细胞身份和/或靶标。
如在此所用，术语“非消耗贮存池(non-depleting reservoirs)”可以是指由许多不同的标记组成的随机条形码库。非消耗贮存池可以包含大量的不同随机条形码，使得当非消耗贮存池与靶标库相缔合时，每个靶标很可能与独特的随机条形码相缔合。每个标记的靶分子的独特性可以通过随机选择的统计学确定，并且取决于与标记的多样性相比集合体中相同靶分子的拷贝数。所得到的标记的靶分子组的大小可以通过条形编码过程的随机性质和检测到的随机条形码的数目分析确定，然后允许计算原始集合体或样品中存在的靶分子的数目。当存在的靶分子的拷贝数与独特的随机条形码的数目之比较低时，标记的靶分子是高度独特的(即用指定的标记来标记一个以上的靶分子的可能性非常低)。
如在此所用，术语“样品”可以是指包含靶标的组合物。适合用于由本披露方法、装置和系统进行的分析的样品包括细胞、组织、器官或生物体。
如在此所用，术语“取样装置”或“装置”可以是指可获取样品切片和/或将切片放置于基底上的装置。样品装置可以是指例如荧光激活细胞分选(FACS)器、细胞分选器、活检针、活检装置、组织切片装置、微流体装置、刀片网格和/或切片机。
如在此使用，术语“固体支持物”可以是指多种随机条形码可以连接到其上的离散固体或半固体表面。固体支持物可以涵盖核酸可固定(例如共价地或非共价地)在其上的由塑料、陶瓷、金属或聚合物材料(例如水凝胶)组成的任何类型的固体、多孔或中空球体、球、轴承、圆柱或其他类似的构型。固体支持物可以包括离散颗粒，该离散颗粒可以是球形(例如微球)或具有非球形或不规则形状诸如立方体、长方体、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。以阵列间隔开的多个固体支持物可以不包含基底。固体支持物可以与术语“珠”互换使用。
固体支持物可以是指“基底”。基底可以是一种类型的固体支持物。基底可以是指可在其上执行本披露的方法的连续固体或半固体表面。基底可以是指例如阵列、柱体、芯片、装置和载玻片。
如在此所用，术语“空间标记”可以是指可以与空间中的位置相关联的标记。
如在此所用，术语“随机条形码”可以是指包含标记的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形编码的多核苷酸序列。随机条形码可以用于定量样品内的靶标。随机条形码可以用于控制在标记与靶标相缔合后可能发生的错误。例如，随机条形码可以用于评价扩增或测序错误。与靶标相缔合的随机条形码可以称为随机条形码-靶标或随机条形码-标签-靶标。
如在此所用，术语“基因特异性随机条形码”可以是指包含标记和基因特异性的靶结合区的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形编码的多核苷酸序列。随机条形码可以用于定量样品内的靶标。随机条形码可以用于控制在标记与靶标相缔合后可能发生的错误。例如，随机条形码可以用于评估扩增或测序错误。与靶标相缔合的随机条形码可以称为随机条形码-靶标或随机条形码-标签-靶标。
如在此所用，术语“随机条形编码”可以是指核酸的随机标记(例如条形编码)。随机条形编码可以利用递归泊松策略来相关联和定量与靶标相缔合的标记。如在此所用，术语“随机条形编码”可以与“基因特异性随机条形编码”互换使用。
如在此所用，术语“靶标”可以是指可以与随机条形码相缔合的成分。适合用于由本披露方法、装置和系统进行的分析的示例性靶标包括寡核苷酸、DNA、RNA、mRNA、微小RNA、tRNA等。靶标可以是单链或双链的。在一些实施例中，靶标可以是蛋白质。在一些实施例中，靶标是脂质。
术语“逆转录酶”可以是指具有逆转录酶活性(即催化由RNA模板对DNA的合成)的一组酶。一般来讲，此类酶包括但不限于逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶、细菌逆转录酶、II组内含子衍生的逆转录酶以及其突变体、变体或衍生物。非逆转录病毒逆转录酶包括非LTR逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶以及II组内含子逆转录酶。II组内含子逆转录酶的实例包括乳酸乳球菌(Lactococc s lactis)Ll.LtrB内含子逆转录酶、嗜热细长聚球藻(Thermosynechococcus elongates)TeI4c内含子逆转录酶或嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)GsI-IIC内含子逆转录酶。其他种类的逆转录酶可以包括许多种类的非逆转录病毒逆转录酶(即转录子、II组内含子以及多样性产生的逆转录因子等)。
术语“模板转换”可以是指逆转录酶从初始核酸序列模板转换至与由初始模板合成的核酸的3'端几乎没有互补性的新核酸序列模板的3'端的能力。模板转换的实例是逆转录酶从初始核酸序列模板/引物底物转换至与核酸引物链的3'端几乎没有互补性的新核酸序列模板的3'端的能力。靶多核苷酸的核酸拷贝可以使用模板转换形成。模板转换允许使用从初始核酸序列模板转换至与由初始模板合成的DNA的3'端几乎没有互补性的新核酸序列模板的3'端的逆转录酶制备例如DNA拷贝，从而允许合成直接将衔接序列连接到靶寡核苷酸序列上而无需连接的连续产物DNA。模板转换可以包括衔接子、同聚物加尾(例如多腺苷酸化)、随机引物或可以与聚合酶相缔合的寡核苷酸的连接。
术语“通用衔接引物”、“通用引物衔接子”或“通用衔接序列”可互换使用，是指可以用于杂交随机条形码以生成基因特异性随机条形码的核苷酸序列。通用衔接序列可以例如是在用于本披露方法中的所有随机条形码上通用的已知序列。例如，当使用在此披露的方法标记多个靶标时，靶标特异性序列中的每一个可以连接到相同通用衔接序列上。在一些实施例中，多于一个通用衔接序列可以用于在此披露的方法中。例如，当使用在此披露的方法标记多个靶标时，靶标特异性序列中的至少两个连接到不同通用衔接序列上。通用衔接引物和其补体可以被包含在两个寡核苷酸中，这两个寡核苷酸中的一个包含靶标特异性序列而另一个包含随机条形码。例如，通用衔接序列可以是包含靶标特异性序列以生成与靶核酸互补的核苷酸序列的寡核苷酸部分。包含随机条形码和通用衔接序列的互补序列的第二寡核苷酸可以与该核苷酸序列杂交并且生成靶标特异性随机条形码。在一些实施例中，通用衔接引物具有与用于本披露方法中的通用PCR引物不同的序列。
如在此所用，术语“特异性地结合”是指特异性结合对的结合特异性。在其他潜在靶标的存在下，通过特定靶多核苷酸序列的靶标特异性核酸序列进行杂交是此种结合的一个特征。特异性结合涉及两个不同的核酸分子，其中核酸分子中的一个通过化学或物理方式特异性地与第二核酸分子杂交。两个核苷酸分子在其彼此结合使得它们能够将其结合配偶体与具有类似特征的其他测定组分区分的意义上是相关的。结合组分对的成员被称为配体和受体(抗配体)、特异性结合对(SBP)成员和SBP配偶体等。
如在此互换使用的“多核苷酸”或“核苷酸”是指具有任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。多核苷酸或核苷酸序列可以是双链或单链的。当多核苷酸或核苷酸序列是单链时，它可以是指两个互补链中的任一个。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物、或可通过DNA或RNA聚合酶并入到聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和它们的类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后给予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分间断。多核苷酸可以诸如通过与标记组分缀合而在聚合之后进一步修饰。其他类型的修饰包括例如用类似物进行的“帽”取代天然存在的核苷酸中的一种或多种、核苷酸间修饰例如像具有不带电荷的键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、亚磷酰胺、氨基甲酸酯等)的那些和具有带电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、含有吊坠部分的那些(例如像蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚-L-赖氨酸等))、具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些、含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些、含有烷基化剂的那些、具有修饰的键(例如，α异头核酸等)的那些以及一种或多种多核苷酸的未修饰形式。此外，通常存在于糖中的任何羟基基团可例如被膦酸酯基团、磷酸酯基团置换、被标准保护基团保护、或被活化以制备到达另外核苷酸的另外键，或可缀合到固体支持物上。5’和3’末端OH可以用从1至20个碳原子的胺或有机加帽基团部分磷酸化或取代。其他羟基也可以被衍生化成标准保护基团。多核苷酸还可以含有本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2’-O-甲基-2’-O-烯丙基核糖、2’-氟代-核糖或2’-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构体糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键可被替代性连接基团置换。这些替代性连接基团包括但不限于其中磷酸酯被P(O)S(“硫代磷酸酯”)、P(S)S(“二硫代磷酸酯”)、“(O)NR 2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH 2(“甲缩醛(formacetal)”)置换的实施例，其中每一个R或R’独立地是H或任选地含有醚(--O--)键的取代或未取代的烷基(1-20个C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。多核苷酸中并非所有的键需要是相同。先前描述适用于在此提到的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
如在此所用的“寡核苷酸”通常是指短的、通常单链的、通常合成的多核苷酸，这些多核苷酸的长度通常但不必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并非相互排斥的。对于多核苷酸的以上描述同样地并且完全地可适用于寡核苷酸。
随机条形码
随机条形码可以是指可以用于对靶标进行随机标记(例如条形编码、加标签)的多核苷酸序列。随机条形码可以包含一种或多种标记。示例性标记可以包括通用标记、细胞标记、分子标记、样品标记、板标记、空间标记和/或预空间标记。图22示出了具有本披露的空间标记的示例性随机条形码。例如，随机条形码2204可以包含可以将随机条形码连接到固体支持物2205上的5’胺。随机条形码可以包含通用标记、维标记、空间标记、细胞标记和/或分子标记。通用标记可以是5’最末端标记。分子标记可以是3’最末端标记。空间标记、维标记和细胞标记可以呈任何顺序。在一些例子中，通用标记、空间标记、维标记、细胞标记以及分子标记呈任何顺序。随机条形码可以包含靶结合区。靶结合区可以与样品中的靶标(例如，靶核酸、RNA、mRNA、DNA)相互作用。例如，靶结合区可以包含可以与mRNA的聚-A尾相互作用的寡聚(dT)序列。在一些例子中，随机条形码的标记(例如，通用标记、维标记、空间标记、细胞标记以及分子标记)中的任何两种可以通过或通过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸分开。
随机条形码可以包含一种或多种通用标记。一种或多种通用标记对于连接到指定固体支持物上的随机条形码组中的所有随机条形码可以是相同的。在一些实施例中，一种或多种通用标记对于连接到多种珠上的所有随机条形码可以是相同的。在一些实施例中，通用标记可以包含能够杂交到测序引物上的核酸序列。测序引物可以用于对包含通用标记的随机条形码进行测序。测序引物(例如，通用测序引物)可以包括与高通量测序平台相关联的测序引物。在一些实施例中，通用标记可以包含能够杂交到PCR引物上的核酸序列。在一些实施例中，通用标记可以包含能够杂交到测序引物和PCR引物上的核酸序列。通用标记的能够杂交到测序引物或PCR引物上的核酸序列可以被称为引物结合位点。通用标记可以包含可以用于启动随机条形码的转录的序列。通用标记可以包含可以用于延伸随机条形码或随机条形码内的区域的序列。通用标记的长度可以是至少或至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。通用标记可以包含至少约10个核苷酸。通用标记的长度可以是至多或至多约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。在一些实施例中，可裂解接头或修饰的核苷酸可以是通用标记序列的一部分以能够使随机条形码从支持物上裂解下来。如在此所用，通用标记可以与“通用PCR引物”互换使用。
随机条形码可以包含维标记。维标记可以包含提供关于出现随机标记的维度的信息的核酸序列。例如，维标记可以提供关于靶标被随机条形编码的时间的信息。维标记可以与样品的随机条形编码时间相关联。维标记可以在随机标记的时间处被激活。不同的维标记可以在不同的时间处被激活。维标记提供了关于靶标、靶标组和/或样品被随机条形编码的顺序的信息。例如，可以在细胞周期的G0期时随机条形编码细胞群体。可以在细胞周期的Gl期时用随机条形码再次脉冲处理细胞。可以在细胞周期的S期时用随机条形码再次脉冲处理细胞，如此类推。每次脉冲(例如细胞周期的每个阶段)下的随机条形码可以包含不同的维标记。以此方式，维标记提供了关于在细胞周期的哪个阶段标记了哪个靶标的信息。维标记可以询问许多不同的生物时期。示例性的生物时期可以包括但不限于细胞周期、转录(例如转录起始)以及转录物降解。在另一实例中，样品(例如一个细胞、细胞群体)可以在用药物和/或疗法治疗之前和/或之后被随机标记。不同靶标的拷贝数目的变化可以指示样品对药物和/或疗法的应答。
维标记可以是可激活的。可激活的维标记可以在特定时间点处被激活。可激活的可以是组成型激活的(例如不被关闭的)。可激活的维标记可以是可逆型激活的(例如，可激活的维标记可以被打开和关闭)。维标记可以可逆地激活至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。维标记可以可逆地激活至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。维标记可以用以下各项激活：荧光、日光、化学事件(例如裂解、另一分子的连接)、修饰的添加(例如聚乙二醇化、苏素化、乙酰化、甲基化、脱乙酰化、脱甲基化)、光化学事件(例如光笼蔽)以及非天然核苷酸的引入。
维标记对于连接到指定固体支持物(例如珠)上的所有随机条形码可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如珠)可以是不同的。在一些实施例中，相同固体支持物上的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的随机条形码可以包含相同的维标记。在一些实施例中，相同固体支持物上的至少60％的随机条形码可以包含相同的维标记。在一些实施例中，相同固体支持物上的至少95％的随机条形码可以包含相同的维标记。
可以存在多至106种或更多种呈现在多种固体支持物(例如珠)中的独特维标记序列。维标记的长度可以是至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。维标记的长度可以是至多约300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4个或更少个核苷酸。维标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。维标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。维标记的长度可以包含约20个至约125个之间的核苷酸。
随机条形码可以包含空间标记。空间标记可以包含提供关于与随机条形码相缔合的靶分子的空间取向的信息的核酸序列。空间标记可以与样品的坐标相关联。坐标可以是固定坐标。例如坐标可以相对于基底是固定的。空间标记可以是参考二维或三维网格。坐标可以相对于界标是固定的。界标在空间中可以是可识别的。界标可以是可被成像的结构。界标可以是生物结构，例如解剖学界标。界标可以是细胞界标，例如细胞器。界标可以是非天然界标诸如具有可识别的标识符诸如颜色编码、条形编码、磁性特性、荧光剂、放射性或独特的大小或形状的结构。空间标记可以与物理分割(例如，孔、容器或微滴)相关联。在一些例子中，多种空间标记一起使用以编码空间中的一个或多个位置。
空间标记对于连接到指定固体支持物(例如珠)上的所有随机条形码可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如珠)可以是不同的。在一些实施例中，相同固体支持物上的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的随机条形码可以包含相同的空间标记。在一些实施例中，相同固体支持物上的至少60％的随机条形码可以包含相同的空间标记。在一些实施例中，相同固体支持物上的至少95％的随机条形码可以包含相同的空间标记。
可以存在多至106种或更多种呈现在多种固体支持物(例如珠)中的独特空间标记序列。空间标记的长度可以是至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。空间标记的长度可以是至多约300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4个或更少个核苷酸。空间标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。空间标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。空间标记的长度可以包含约20个至约125个之间的核苷酸。
随机条形码可以包含细胞标记。细胞标记可以包含提供用于确定哪种靶核酸源自于哪种细胞的信息的核酸序列。在一些实施例中，细胞标记对于连接至指定固体支持物(例如珠)的所有随机条形码是相同的，但对于不同的固体支持物(例如珠)是不同的。在一些实施例中，相同固体支持物上的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的随机条形码可以包含相同的细胞标记。在一些实施例中，相同固体支持物上的至少60％的随机条形码可以包含相同的细胞标记。在一些实施例中，相同固体支持物上的至少95％的随机条形码可以包含相同的细胞标记。
可以存在多至106种或更多种呈现在多种固体支持物(例如珠)中的独特细胞标记序列。细胞标记的长度可以是至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。细胞标记的长度可以是至多约300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4个或更少个核苷酸。细胞标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。细胞标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。细胞标记的长度可以包含约20个至约125个之间的核苷酸。
细胞标记可以进一步包含限定长度例如各自7个核苷酸(等于在一些汉明纠错码中使用的位数)的独特的核酸子序列组，该核酸子序列组被设计成提供纠错能力。包括7个核苷酸序列的纠错子序列组可以被设计成使得组中的任何成对序列组合表现出限定的“遗传距离”(或错配碱基数)，例如纠错子序列组可以被设计成表现出3个核苷酸的遗传距离。在这种情况下，检查针对标记的靶核酸分子(下文更全面描述的)的序列数据组中的纠错序列可以允许检测或校正扩增或测序错误。在一些实施例中，用于创建纠错码的核酸子序列的长度可以变化，例如它们的长度可以是3个核苷酸、7个核苷酸、15个核苷酸、或31个核苷酸。在一些实施例中，其他长度的核酸子序列可以用于创建纠错码。
随机条形码可以包含分子标记。分子标记可以包含提供对杂交到随机条形码上的靶核酸物质的具体类型的识别信息的核酸序列。分子标记可以包含为杂交到随机条形码(例如靶结合区)上的靶核酸物质的具体出现次数提供计数器的核酸序列。在一些实施例中，一组不同的分子标记被连接到指定固体支持物(例如珠)上。在一些实施例中，可以存在多至105种或更多种连接到指定固体支持物(例如珠)上的独特分子标记序列。在一些实施例中，可以存在多至104种或更多种连接到指定固体支持物(例如珠)上的独特分子标记序列。在一些实施例中，可以存在多至103种或更多种连接到指定固体支持物(例如珠)上的独特分子标记序列。在一些实施例中，可以存在多至102种或更多种连接到指定固体支持物(例如珠)上的独特分子标记序列。分子标记的长度可以是至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。分子标记的长度可以是至多约300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4个或更少个核苷酸。
随机条形码可以包含靶结合区。在一些实施例中，靶结合区可以包含特异性地杂交到靶标(例如靶核酸、靶分子，例如有待分析的细胞核酸)上，例如杂交到特定基因序列上的核酸序列。在一些实施例中，靶结合区可以包含可以连接(例如，杂交)到特定靶核酸的特异性位置上的核酸序列。在一些实施例中，靶结合区可以包含能够特异性杂交到限制位点突出端(例如EcoRI粘性突出端)上的核酸序列。随机条形码然后可以连接到包含与限制位点突出端互补的序列的任何核酸分子上。
在一些实施例中，靶结合区可以包含非特异性靶核酸序列。非特异性靶核酸序列可以是指可以不依赖于靶核酸的特异性序列结合到多个靶核酸上的序列。例如，靶结合区可以包含随机多聚体序列，或杂交到mRNA分子上的聚-A尾上的寡聚dT序列。随机多聚体序列可以是例如随机二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或具有任何长度的较高的多聚体序列。在一些实施例中，靶结合区对于连接到指定珠上的所有随机条形码是相同的。在一些实施例中，对于连接到指定珠上的多种随机条形码的靶结合区可以包含两种或更多种不同的靶结合序列。靶结合区的长度可以是至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。靶结合区的长度可以是至多约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。
随机条形码可以包含可以用于定向(例如比对)随机条形码的取向特性。随机条形码可以包含用于等电聚焦的一个部分。不同的随机条形码可以包含不同的等电聚焦点。当这些随机条形码被引入到样品时，可以使样品经受等电聚焦以便使随机条形码取向为已知方式。以此方式，取向特性可以用于发展样品中随机条形码的已知谱图。示例性取向特性可以包括电泳迁移率(例如基于随机条形码的大小)、等电点、自旋、导电性和/或自组装。例如，具有自组装取向特性的随机条形码可以在激活后自组装为特定取向(例如核酸纳米结构)。
随机条形码可以包含亲和特性。空间标记可以包含亲和特性。亲和特性可以包括可以有利于随机条形码结合到另一实体(例如细胞受体)上的化学和/或生物部分。例如，亲和特性可以包括抗体。抗体可以对样品上的特异性部分(例如受体)是特异性的。抗体可以将随机条形码引导至特定细胞类型或分子。在特定细胞类型或分子处和/或附近的靶标可以是随机标记的。亲和特性还可以提供除空间标记的核苷酸序列之外的空间信息，因为抗体可以将随机条形码引导至特定位置。抗体可以是治疗性抗体。抗体可以是单克隆抗体。抗体可以是多克隆抗体。抗体可以是人源化的。抗体可以是嵌合的。抗体可以是裸抗体。抗体可以是融合抗体。
抗体可以是指全长(即天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即特异性结合)部分，如抗体片段。
抗体可以是抗体片段。抗体片段可以抗体的一部分，诸如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、sFv等。抗体片段可以结合通过全长抗体鉴定的相同抗原。抗体片段可以包括由抗体的可变区组成的分离片段，诸如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段以及其中轻链可变区和重链可变区通过肽接头(“scFv蛋白”)连接的重组单链多肽分子。示例性抗体可以包括但不限于用于癌细胞的抗体、用于病毒的抗体、结合到细胞表面受体(CD8、CD34、CD45)上的抗体以及治疗性抗体。
随机条形码可以包含靶结合区。靶结合区可以与感兴趣的靶标杂交。例如，靶结合区可以包含寡聚dT，该寡聚dT可以与包含聚腺苷酸化端部的mRNA杂交。靶结合区可以是基因特异性的。例如，靶结合区可以被配置成杂交到靶标的特异性区域上。靶结合区的长度可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个核苷酸。靶结合区的长度可以是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个核苷酸。靶结合区的长度可以是从5-30个核苷酸。当随机条形码包含基因特异性靶结合区时，随机条形码可以被称为基因特异性随机条形码。
随机条形码可以包含通用衔接引物。基因特异性随机条形码可以包含通用衔接引物。通用衔接引物可以是指在所有随机条形码上通用的核苷酸序列。通用衔接引物可以用于构建本披露的基因特异性随机条形码。通用衔接引物的长度可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个核苷酸。通用衔接引物的长度可以是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个核苷酸。通用衔接引物的长度可以是从5-30个核苷酸。
制备基因特异性随机条形码的方法
在此披露的一些实施例提供了标记样品中的核酸的方法，这些方法包括：将靶标与包含通用衔接序列和靶标特异性序列的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与第二寡核苷酸杂交；延伸所述第二寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；将所述第二核苷酸序列与包含用于第一扩增引物的结合位点和通用衔接序列的第三寡核苷酸杂交，其中第一寡核苷酸和第三寡核苷酸中的一个或两个包含随机条形码的部分；延伸所述第三寡核苷酸以生成第三核苷酸序列；并且使用第一扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列以生成多个第四核苷酸序列，其中多个第四核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和随机条形码。在此披露的一些实施例提供了标记样品中的靶标以用于定量所述靶标的方法，这些方法包括：将所述靶标与包含第一通用衔接序列和靶标特异性序列的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与包含第二通用衔接序列和第二靶标特异性序列的第二寡核苷酸杂交；延伸所述第二寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；将所述第二核苷酸序列与包含用于第一扩增引物的结合位点和第一通用衔接序列的第三寡核苷酸杂交；延伸所述第三寡核苷酸以生成第三核苷酸序列；将所述第三核苷酸序列与包含用于第二扩增引物的结合位点和第二通用衔接序列的第四寡核苷酸杂交，其中第三寡核苷酸和第四寡核苷酸中的一个或两个包含随机条形码的部分；延伸所述第四寡核苷酸以生成第四核苷酸序列；并且使用第一扩增引物和第二扩增引物来扩增所述第四核苷酸序列以生成多个第五核苷酸序列，其中多个第五核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和随机条形码。在此披露的一些实施例提供了标记样品中的靶标以用于定量所述靶标的方法，这些方法包括：将所述靶标与包含靶标特异性序列和用于第一扩增引物的结合位点的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与包含通用衔接序列和第二靶标特异性序列的第二寡核苷酸杂交；延伸所述第二寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；将所述第二核苷酸序列与第三寡核苷酸杂交，该第三寡核苷酸包含用于第二扩增引物的结合位点和特异性地结合通用衔接序列的序列，其中第二寡核苷酸和第三寡核苷酸中的一个或两个包含随机条形码的部分；延伸所述第三寡核苷酸以生成第三核苷酸序列；并且使用第一扩增引物和第二扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列以生成多个第四核苷酸序列，其中多个第四核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和随机条形码。在此披露的一些实施例提供了标记样品中的靶标以用于定量所述靶标的方法，这些方法包括：在包含通用衔接序列的第二寡核苷酸存在下，将所述靶标与包含靶标特异性序列和第一扩增引物序列的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成包含通用衔接序列补体的第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与第三寡核苷酸杂交，该第三寡核苷酸包含通用衔接序列、随机条形码以及用于第二扩增引物的结合位点；延伸所述第三寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；并且使用第一扩增引物和第二扩增引物来扩增所述第二核苷酸序列以生成多个第三核苷酸序列，其中多个第三核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和随机条形码。在此披露的一些实施例提供了标记样品中的靶标以用于定量所述靶标的方法，这些方法包括：将所述靶标与包含通用衔接序列和靶标特异性序列的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与第二寡核苷酸和第三寡核苷酸杂交，该第二寡核苷酸包含第二靶标特异性序列，该第三寡核苷酸包含随机条形码和特异性地结合通用衔接序列的序列；扩增所述第一核苷酸序列以生成多个第二核苷酸序列，其中多个第二核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和所述随机条形码。在此披露的一些实施例提供了表征样品的方法，这些方法包括：将样品中的第一靶标与包含第一靶标特异性序列和第一随机条形码的第一寡核苷酸杂交，其中第一靶标是编码TCR α链或β链的mRNA；将样品中的第二靶标与包含第二靶标特异性序列和第二随机条形码的第二寡核苷酸杂交；延伸第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以将第一随机条形码并入第一靶标中并且将第二随机条形码并入第二靶标中；并且鉴定第一靶标和第二靶标的序列。在此披露的一些实施例提供了标记样品中的靶标以用于定量所述靶标的方法，这些方法包括：将所述靶标与包含通用衔接序列和靶标特异性序列的第一寡核苷酸杂交；延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；将所述第一核苷酸序列与包含第二靶标特异性序列的第二寡核苷酸杂交；延伸所述第二寡核苷酸以生成第一核苷酸序列的互补链和双链核苷酸序列；将包含用于第一扩增引物的结合位点的双链衔接寡核苷酸连接到所述双链核苷酸序列上以形成连接的核苷酸序列；使用包含随机条形码的第一扩增引物和第二扩增引物来扩增所述连接的核苷酸序列以生成多个第二核苷酸序列，其中多个第二核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和所述随机条形码。在此披露的一些实施例提供了试剂盒，这些试剂盒包含：第一寡核苷酸，该第一寡核苷酸包含通用衔接序列和靶标特异性序列；以及第二寡核苷酸，该第二寡核苷酸包含随机条形码和通用衔接序列或其补体。
在任何以上提及的实施例中，样品可以是单细胞(诸如B细胞、T细胞、癌细胞等)或多个细胞。在任何以上提及的实施例中，靶标可以是DNA(诸如基因组DNA)或mRNA分子。在任何以上提及的实施例中，DNA或mRNA分子可以编码T细胞受体(TCR)α链或β链。在任何以上提及的实施例中，靶标特异性序列可以特异性地结合到TCRα链或β链的C区上。在任何以上提及的实施例中，方法可以包括使用一对PCR引物(诸如通用PCR引物)来扩增核苷酸序列。在任何以上提及的实施例中，PCR扩增引物可以特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上：TCRα链或β链的V区、TCRα链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在任何以上提及的实施例中，特异性地结合到选自以下各项组成的组的区域上的靶标特异性序列可以用于延伸反应或扩增反应中的一种：TCRα链或β链的V区、TCR α链或β链的V和D区接合点、或其任何组合。在任何以上提及的实施例中，随机条形码的部分或全部可以是用于每一个延伸步骤的任何寡核苷酸的部分。在任何以上提及的实施例中，随机条形码可以包含分子标记、通用标记、维标记、细胞标记、或其组合。在任何以上提及的实施例中，任何寡核苷酸可以被附接到固体支持物(诸如珠)上。在任何以上提及的实施例中，样品可以包含多种靶标。在任何以上提及的实施例中，多种靶标中的每一种可以用不同随机条形码标记。在任何以上提及的实施例中，方法可以包括通过计数与靶标相缔合的不同随机条形码来计数多种靶标的数目。在任何以上提及的实施例中，模板转换可以用于引入通用衔接序列或其补体。在任何以上提及的实施例中，方法可以包括用第二随机条形码标记样品中的第二靶标。在任何以上提及的实施例中，第二靶标可以选自图39所列出的基因组成的组。在任何以上提及的实施例中，第二随机条形码包含以下各项中的一种或多种：分子标记、通用标记、维标记以及细胞标记。
本披露的方法可以使用逆转录、第一链cDNA合成以及第二链DNA合成的方法和/或扩增方法。
与本披露相关的第一链互补DNA合成的方法可以依赖于从核酸模板(例如，信使RNA)酶促合成DNA。能够催化DNA合成的酶可以被称为其中核酸模板是RNA的“RNA依赖性DNA聚合酶”以及其中模板是DNA的“DNA依赖性DNA聚合酶”(然而，通常RNA依赖性DNA聚合酶也能够起到DNA依赖性聚合酶的作用)。RNA依赖性DNA聚合酶诸如AMV或MMLV逆转录酶可以依赖于从信使RNA模板酶促合成互补DNA的第一链。除了模板、多核苷酸引物和脱氧核糖核苷酸三磷酸以外，可能需要这两种类型的DNA聚合酶。第一链互补DNA的合成可以用由长度为12-18个核苷酸组成的寡聚-d(T)来引发(prime)，该寡聚-d(T)通过退火到真核生物信使RNA分子的3'末端处的聚-A束来启动合成。其他引物(包括短的随机寡核苷酸引物)可以用于引发互补DNA合成。在一些例子中，基因特异性引物可以用于引发cDNA合成。在聚合酶反应过程中，引物可以通过在引物的3'端处并入脱氧核糖核苷酸三磷酸来逐步延伸。DNA聚合酶可以包含明确浓度的镁和有待存在于反应缓冲液中的其他离子。在合成互补DNA的第一链之后，可以采用数种方法以用DNA的第二链置换RNA-模板。这样的一种方法可以涉及用NaOH去除信使RNA，并且通过互补DNA的第一链进行自引发以用于第二链合成。单链互补DNA的3'端可以容许形成发夹样结构，该发夹样结构通过大肠杆菌DNA聚合酶I或逆转录酶来引发互补DNA的第二链的合成。另一种方法可以涉及置换合成第二链互补DNA。在置换合成过程中，第一链合成的产物互补DNA:信使RNA杂交体为切口平移反应提供模板和引物，其中RNA酶H酶在信使RNA链中产生切口和缺口，从而得到一系列RNA引物以用于使用大肠杆菌DNA聚合酶I酶合成互补DNA的第二链。在合成双链互补DNA之后，可以将合成的DNA引入宿主细胞(例如，菌株)中，并且凭借适合的载体(诸如噬菌体λ载体)来复制。此类方法可以涉及例如添加短的合成多核苷酸接头，这些短的合成多核苷酸接头在第二链合成之后连接到互补DNA的端部上。接头可以含有可以由合适的限制性内切酶(例如EcoR I)识别的序列。在接头已连接到互补DNA的端部上之后，它们可以用合适的限制性内切酶切割以在互补DNA的两端上生成相同的粘性DNA序列，从而促进互补DNA连接到噬菌体λ载体上。因为感兴趣的互补DNA克隆可以含有由限制性内切酶识别的限制位点，所以互补DNA可以用甲基化酶(诸如EcoR I甲基化酶)处理，之后连接合成接头以保护内部限制位点免遭随后的消化。
本披露的方法可以提供一种生成基因特异性随机条形码的方法和/或多种用于基因特异性随机条形编码的方法。例如，本披露的基因特异性随机条形编码的方法可以类似于图1所述并且所示的。在一些例子中，如图2所示，第二延伸可以用包含连接到第二通用引物(例如，第二通用PCR引物205)上的反向基因特异性引物122的反向引物来执行。第二通用PCR引物可以类似于通用标记，因为它可以包含可以在随机条形码之中共同的序列。第二通用PCR引物可以用于本披露的扩增方法和/或测序方法。第二通用PCR引物可以是通用标记。
随机条形码的标记(例如，样品标记或样品编码，该样品编码在此可以与术语“样品标记”互换使用)可以呈任何顺序。图3示出了诸如图2所示的本披露的基因特异性随机条形码生成方法的示例性实施例，其中第二延伸用连接到第二通用引物上的反向基因特异性引物执行，并且其中分子标记是样品标记的5’。图2示出了相同的方法，但是其中样品标记是分子标记的5’。随机条形码的全部或部分也可以被包含在包含通用衔接引物的寡核苷酸中。例如，随机条形码的标记可以被排列使得分子条形码是通用衔接引物的3’，如图4所示。例如，样品标记和分子标记两者可以是通用衔接引物的3’，如图5所示。
图8披露了用于使用两种通用衔接引物序列来生成基因特异性随机条形码的方法。靶分子可以与正向(例如，第一)通用衔接引物序列和反向(例如，第二)通用衔接引物序列接触。这些序列可以扩增靶标。随机条形码可以通过其自身的可以与通用衔接引物序列互补的序列而与通用衔接引物序列相缔合。随机条形码可以包含任何排列的本披露标记(例如，样品标记、分子标记)。靶标可以使用两种通用标记(例如，通用PCR引物)来扩增。图9描绘了其中样品标记和分子标记已交换位置的替代实施例。图9描绘了非限制性(即，任何标记可以置于图9所披露的构型中的任何位置处)的示例性实施例。
生成基因特异性随机条形码的方法可以在分子的3’端处(例如，在它们的多腺苷酸化位点处)执行。图10示出了使用基因特异性随机条形码以基因特异性地随机条形编码靶标的示例性实施例。包含聚-A尾的靶标可以杂交到包含寡聚dT和通用标记(例如，通用PCR引物)的多核苷酸上。寡聚dT可以被延伸(例如，逆转录)以并入靶标的序列。连接到通用衔接引物上的基因特异性引物可以杂交到靶标序列上。包含与通用衔接引物互补的序列的随机条形码可以依次地或同时地杂交到通用衔接引物上并且被延伸(例如，通过引物延伸)，从而生成基因特异性随机条形编码的靶标。随机条形编码的靶标可以根据本披露的方法进行扩增、测序和/或数字计数。图10意指了示例性实施例。图10披露的方法可以类似地执行，其中基因特异性引物序列置换所描绘的寡聚dT序列。在图10所示的方法中，随机条形码的标记可以呈任何顺序。例如，样品标记可以是分子标记的5’。分子标记可以是样品标记的5’，如图11所示。
在一些例子中，模板转换可以用于使用基因特异性随机条形码来随机条形编码靶标。图12描绘了模板转换的示例性实施例。包含例如聚-A尾的靶标可以接触包含寡聚dT和通用标记(例如，通用PCR引物)的多核苷酸。寡聚dT可以被延伸并且用寡核苷酸序列(例如，CCC)加尾。编码通用衔接引物的另一种寡核苷酸序列和与加尾序列互补的序列(例如，GGG)可以杂交在一起，并且并入转录物中(例如，模板转换)。包含与通用衔接引物序列互补的序列的随机条形码可以杂交到通用衔接引物上并且被延伸(例如，通过引物延伸)，从而生成基因特异性随机标记的靶标。在图12所示的方法中，随机条形码的标记可以呈任何顺序。例如，分子标记可以是样品标记的5’。样品标记可以是分子标记的5’，如图13所示。
在一些例子中，通用衔接引物可以是用于生成基因特异性随机条形码的支持物。例如，如图14所示，通用衔接引物可以被连接到固体支持物上。通用衔接引物可以是用于另一种寡核苷酸的支持物，该寡核苷酸可以包含可以杂交到通用衔接引物支持物上的序列和基因特异性序列(例如，X、Y、Z)。互补基因特异性序列(例如，X’、Y’、Z’)可以接触它的同源结合配偶体(例如，分别为X、Y、Z)。X、Y和Z可以被延伸以并入X’、Y’和Z’的序列，从而生成连接到通用衔接引物上的基因特异性序列。
在一些例子中，基因特异性随机条形码可以通过将包含通用衔接引物序列的随机条形码与寡核苷酸杂交来生成，该寡核苷酸包含与通用衔接引物序列互补的序列(例如，使得它们可以杂交)和编码基因特异性引物的序列。如图15所示，可以执行延伸反应以延伸X、Y和Z超过X’、Y’和Z’的序列。X’、Y’和Z’的序列可以被连接到可以杂交到随机条形码的通用衔接引物上的序列。延伸反应可以将X’、Y’和Z’的序列并入随机条形码中，从而生成基因特异性随机条形码。基因特异性随机条形码可以根据本披露的随机条形编码方法和计数方法来接触样品中的一种或多种靶标。与每种基因特异性随机条形码相缔合的靶标可以被扩增和/或计数以确定样品中每种类型的不同靶标的数目。在一些实施例中，通用衔接引物可以被固定在固体支持物(诸如珠)上，并且用作系链以通过与连接到随机条形码上的通用衔接引物序列互补的序列杂交来固定随机条形码。
在一些例子中，通用衔接序列可以是分子标记(以及任何其他标记)的5’。图16和图17示出了固体支持物如何可以包含可以与本披露的通用衔接引物杂交的序列的示例性实施例，该序列可以是随机条形码的一部分(反之亦然)。可以杂交到通用衔接引物上的序列可以被连接到固体支持物上。随机条形码可以包含基因特异性结合区Y。与Y互补的序列Y’可以被杂交到Y上。Y可以被延伸以并入Y’的序列，从而生成基因特异性随机条形码。包含第二通用PCR引物(例如，通用标记)和与Y互补的区域的反向引物可以用于生成包含随机条形码、通用引物衔接子、基因特异性结合区(Y)以及第二通用PCR引物的转录物。图16和图17所描绘的第二通用序列引物可以是如上所述的通用序列引物，或提供相同功能但具有不同序列。通用测序引物(或第二通用测序引物)可以用于测序转录物。通用测序引物可以不被串联地(例如，直接相邻地)缔合到本披露的标记(例如，细胞标记、分子标记、样品标记)上。在图16所示的方法中，随机条形码的标记可以呈任何顺序。例如，分子标记可以是样品标记的5’。样品标记可以是分子标记的5’，如图17所示。
在一些实施例中，图16和图17所披露的方法可以用Y’的序列执行，该Y’的序列包含如图18和图19所示的第二通用PCR引物(例如，也可以是以上所披露的通用测序引物)。包含第二通用PCR引物的寡核苷酸Y’可以接触包含基因特异性序列Y的随机条形码，其中Y可以与Y’杂交。方法的其余部分可以如针对图16和图17所述来执行。在图18所示的方法中，随机条形码的标记可以呈任何顺序。例如，分子标记可以是样品标记的5’。样品标记可以是分子标记的5’，如图19所示。
在一些例子中，可以用于使用基因特异性随机条形码来随机条形编码靶标的模板转换可以基本上类似于图12所披露的方法来执行。如图20所示，模板转换可以使用连接到固体支持物上的通用衔接引物来执行。包含例如聚-A尾的靶标可以接触包含寡聚dT和通用标记(例如，通用PCR引物)的多核苷酸。寡聚dT可以被延伸并且用寡核苷酸序列(例如，CCC)加尾。编码通用衔接引物的另一种寡核苷酸序列和与加尾序列互补的序列(例如，GGG)可以杂交在一起，并且并入转录物中(例如，模板转换)。包含与通用衔接引物序列互补的序列的随机条形码可以杂交到通用衔接引物上并且被延伸(例如，通过引物延伸)，从而生成基因特异性随机标记的靶标。在图20所示的方法中，随机条形码的标记可以呈任何顺序。随机条形码可以杂交到第二通用衔接引物上。在一些例子中，随机条形码可以被连接到固体支持物上，如图21所示。在一些实施例中，通用衔接引物可以被固定在固体支持物(诸如珠)上，并且用作系链以通过与连接到随机条形码上的通用衔接引物序列互补的序列杂交来固定随机条形码。
在图1-21所述的所有方法中，可以对基因特异性随机条形编码的靶标进行本披露的任何其他方法，诸如扩增、测序和/或数字计数以确定样品中独特靶标拷贝的数目。
图29示出了在扩增过程中减少引物二聚体的方法的示例性实施例。左侧示出了随机条形编码扩增的产物(例如，在第一步中扩增的)的示例性方法。引物二聚体可能形成。右侧是用于减少引物二聚体形成的方法的示例性实施例。分子标记可以引入在通用衔接引物的3’。可以执行一种PCR扩增反应，该PCR扩增反应可以随机条形编码靶标而不是条形编码扩增的靶标拷贝。引物二聚体可以通过在第一扩增反应过程中引入分子标记来减少。图30示出了类似于图29的方法，但是扩增引物包含通用序列(例如，与Illumina测序仪相兼容)。多余的分子索引可以在扩增之前去除，如图30右侧所示。
固体支持物
在此披露的随机条形码可以被连接到固体支持物(例如，珠、基底)上。如在此所用，术语“系接”、“连接”和“固定”可互换使用，并且可以是指用于将随机条形码连接到固体支持物上的共价或非共价方式。多种不同的固体支持物中的任一种可以用作用于连接预先合成的随机条形码或用于随机条形码的原位固相合成的固体支持物。
在一些例子中，固体支持物是珠。珠可以涵盖核酸可固定(例如共价地或非共价地)在其上的由塑料、陶瓷、金属或聚合物材料组成的任何类型的固体、多孔或中空球体、球、轴承、圆柱或其他类似的构型。珠可以包括离散颗粒，该离散颗粒可以是球形(例如微球)或具有非球形或不规则形状诸如立方体、长方体、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。珠的形状可以是非球形的。
珠可以包含多种材料，包括但不限于顺磁性材料(例如镁、钼、锂和钽)、超顺磁性材料(例如铁氧体(Fe3O4；磁铁矿)纳米粒子)、铁磁材料(例如铁、镍、钴、其一些合金以及一些稀土金属化合物)、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、二氧化硅、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、琼脂糖、水凝胶、聚合物、纤维素、尼龙以及其任何组合。
珠的直径可以是至少约5μm、10μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。珠的直径可以是至多约5μm、10μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。
珠可以连接到和/或包埋在基底中。珠可以连接到和/或包埋在凝胶、水凝胶、聚合物和/或基质中。珠在基底(例如凝胶、基质、支架或聚合物)中的空间位置可以使用珠上随机条形码上存在的可以充当位置地址的空间标记来鉴定。
珠的实例可以包括但不限于链霉亲和素珠、琼脂糖珠、磁性珠、
Figure GDA0002888063340000441
微珠、抗体缀合的珠(例如抗免疫球蛋白微珠)、蛋白质A缀合的珠、蛋白质G缀合的珠、蛋白质A/G缀合的珠、蛋白质L缀合的珠、寡聚dT缀合的珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠以及BcMagTM羧基末端的磁性珠。
珠可以缔合有(例如浸渗有)量子点或荧光染料以使得其在一个荧光光学通道或多个光学通道中发荧光。珠可以与氧化铁或氧化铬相缔合以使得其具有顺磁性或铁磁性。珠可以是可鉴定的。例如，可以使用照相机对珠进行成像。珠可以具有与珠相缔合的可检测编码。例如，珠可以包含随机条形码。珠可以例如由于在有机或无机溶液中的溶胀而改变大小。珠可以是疏水性的。珠可以是亲水性的。珠可以是生物相容的。
固体支持物(例如珠)可以是可视化的。固体支持物可以包含可视化标签(例如荧光染料)。固体支持物(例如珠)可以被蚀刻有鉴定物(例如数字)。鉴定物可以通过对珠进行成像来可视化。
固体支持物可以是指不溶性、半溶性或不溶性材料。当固体支持物包含接头、支架、构建块或连接到其上的其他反应性部分时它可以被称为“官能化的”，然而，当固体支持物没有连接到其上的这种反应性部分时它可以被称为“非官能化的”。固体支持物可以下述形式采用：游离于溶液中，诸如以微量滴定孔形式；以流通形式，诸如在柱中；或在测试条(dipstick)中。
固体支持物可以包括膜、纸、塑料、涂覆表面、平表面、玻璃、载玻片、芯片或其任何组合。固体支持物可以采取树脂、凝胶、微球或其他几何构型的形式。固体支持物可以包括二氧化硅芯片、微粒、纳米粒子、板以及阵列。固体支持物可以包括珠(例如二氧化硅凝胶、可控孔度玻璃、磁性珠、Dynabeads、王氏树脂；梅里菲尔德(Merrifield)树脂、交联葡聚糖/琼脂糖凝胶珠、纤维素珠、聚苯乙烯珠等)、毛细管、平支持物诸如玻璃纤维过滤器、玻璃表面、金属表面(钢铁、金、银、铝、硅以及铜)、玻璃支持物、塑料支持物、硅支持物、芯片、过滤器、膜、微孔板、载玻片等、塑料材料包括多孔板或膜(例如由聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚偏氟乙烯形成的)、晶片、梳状物、插针或针(例如适合于组合性合成或分析的插针阵列)或平表面诸如晶片(硅晶片)、带有具有或不具有滤底的凹陷的晶片的凹陷或纳升孔的阵列中的珠。
在一些例子中，本披露的随机条形码可以被连接到聚合物基质(例如，凝胶、水凝胶)上。聚合物基质可以能够渗透细胞内空间(例如在细胞器周围)。聚合物基质可以能够被泵送贯穿整个循环系统。
固体支持物可以是生物分子。例如，固体支持物可以是核酸、蛋白质、抗体、组蛋白、细胞区室、脂质、碳水化物等。为生物分子的固体支持物可以被扩增、翻译、转录、降解和/或修饰(例如聚乙二醇化、苏素化)。除连接到生物分子上的空间标记之外，为生物分子的固体支持物可以提供空间和时间信息。例如，生物分子在未修饰时可以包含第一构象，但是当经修饰时可以变化成第二构象。不同的构象可以使本披露的随机条形码暴露于靶标。例如，生物分子可以包含由于生物分子的折叠而难以接近的随机条形码。在生物分子经修饰(例如乙酰化)后，生物分子可以改变构象以暴露随机条形码。修饰的计时可以为本披露的随机条形编码方法提供另一时间维度。
在另一个实例中，包含本披露的随机条形码的生物分子可以位于细胞的细胞质中。在激活后，生物分子可以移动至细胞核，此时可以发生随机条形编码。以此方式，生物分子的修饰可以编码关于由随机条形码鉴定的靶标的附加空间-时间信息。
维标记可以提供关于生物事件(例如细胞分裂)的空间-时间的信息。例如，维标记可以添加到第一细胞，第一细胞可以分裂生成第二子细胞，第二子细胞可以包含全部、部分维标记或不包含维标记。维标记可以在初始细胞和子细胞中被激活。以此方式，维标记可以提供关于不同空间中随机条形编码的时间的信息。
基底
基底可以是指一种类型的固体支持物。基底可以是指可以包含本披露的随机条形码的固体支持物。基底可以包括多个微孔。微孔可以包括限定体积的小反应室。微孔可以截留一个或多个细胞。微孔可以仅截留一个细胞。微孔可以截留一个或多个固体支持物。微孔可以仅截留一个固体支持物。在一些例子中，微孔截留单细胞和单个固体支持物(例如珠)。
阵列的微孔可以多种形状和大小制造。适当的孔几何形状可以包括但不限于圆柱形、锥形、半球形、长方形或多面体(例如由若干个面组成的三维几何体，例如六角柱、八角柱、倒置三棱锥、倒置正方棱锥、倒置五棱锥、倒置六棱锥或倒置截棱锥)。微孔可以包括组合了这些几何结构中的两种或更多种的形状。例如，微孔可以部分是圆柱形，其中剩余部分具有倒置圆锥体的形状。微孔可以包括两个并排圆柱体，一个的直径(例如大致对应于珠的直径)大于另一个(例如大致对应于细胞的直径)，这两个并排圆柱体通过延长了圆柱体的全长(深度)的垂直通道(即平行于圆柱体轴线)连接。微孔的开口可以处于基底的上表面处。微孔的开口可以处于基底的下表面处。微孔的闭合端(或底部)可以是平的。微孔的闭合端(或底部)可以具有弯曲表面(例如凸形的或凹形的)。微孔的形状和/或大小可以基于微孔内捕获的细胞或固体支持物的类型确定。
微孔尺寸可以根据孔的直径和深度来表征。如在此所用，微孔的直径是指可以刻划在微孔几何体的横截面内的最大圆。微孔的直径可以在为有待捕获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的从约1倍至约10倍的范围内。微孔直径可以是有待捕获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。微孔直径可以是有待捕获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的至多10倍、至多5倍、至多4倍、至多3倍、至多2倍、至多1.5倍或至多1倍。微孔直径可以是有待捕获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的约2.5倍。
微孔的直径可以根据绝对尺寸规定。微孔的直径可以在从约5至约50微米的范围内。微孔直径可以是至少5微米、至少10微米、至少15微米、至少20微米、至少25微米、至少30微米、至少35微米、至少40微米、至少45微米或至少50微米。微孔直径可以是至多50微米、至多45微米、至多40微米、至多35微米、至多30微米、至多25微米、至多20微米、至多15微米、至多10微米或至多5微米。微孔直径可以是约30微米。
微孔深度可以被选择成提供对细胞和固体支持物的有效捕获。微孔深度可以被选择成提供测定缓冲液与孔内含有的其他试剂的有效交换。直径与高度之比(即纵横比)可以被选择成使得一旦细胞和固体支持物沉降在微孔内部，它们将不因微孔上的流体运动而移位。微孔的尺寸可以被选择使得微孔具有足够的空间来接纳不同大小的固体支持物和细胞，而不会因微孔之上的流体运动而移去。微孔的深度可以在为有待捕获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的从约1倍至约10倍的范围内。微孔深度可以是有待捕获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。微孔深度可以是有待捕获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的至多10倍、至多5倍、至多4倍、至多3倍、至多2倍、至多1.5倍或至多1倍。微孔深度可以是有待捕获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的约2.5倍。
微孔的深度可以根据绝对尺寸规定。微孔的深度可以在从约10至约60微米的范围内。微孔深度可以是至少10微米、至少20微米、至少25微米、至少30微米、至少35微米、至少40微米、至少50微米或至少60微米。微孔深度可以是至多60微米、至多50微米、至多40微米、至多35微米、至多30微米、至多25微米、至多20微米、或至多10微米。微孔深度可以是约30微米。
本披露的方法、装置和系统中使用的微孔的体积可以在从约200微米3至约120,000微米3的范围内。微孔体积可以是至少200微米3、至少500微米3、至少1,000微米3、至少10,000微米3、至少25,000微米3、至少50,000微米3、至少100,000微米3或至少120,000微米3。微孔体积可以是至多120,000微米3、至多100,000微米3、至多50,000微米3、至多25,000微米3、至多10,000微米3、至多1,000微米3、至多500微米3、或至多200微米3。微孔体积可以是约25,000微米3。微孔体积可以落入通过这些值中的任一个(例如从约18,000微米3至约30,000微米3)界定的任何范围之内。
本披露的方法、装置和系统中使用的微孔的体积可以根据从一个微孔至另一个微孔的体积变化进一步表征。对于微孔体积的变化系数(表达为百分比)可以在从约1％至约10％的范围内。微孔体积的变化系数可以是至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％。微孔体积的变化系数可以是至多10％、至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％或至多1％。微孔体积的变化系数可以具有在由这些值涵盖的范围之内例如在约1.5％与约6.5％之间的任何值。在一些实施例中，微孔体积的变化系数可以是约2.5％。
本披露的方法、装置和系统中使用的微孔的体积与珠的表面积(或与随机条形码寡核苷酸可以连接到其上的固体支持物的表面积)之比可以在从约2.5至约1,520范围内。该比可以是至少2.5、至少5、至少10、至少100、至少500、至少750、至少1,000或至少1,520。该比可以是至多1,520、至多1,000、至多750、至多500、至多100、至多10、至多5或至多2.5。该比可以是约67.5。微孔体积与珠(或用于固定的固体支持物)的表面积之比可以落入由这些值(例如从约30至约120)中的任一个界定的任何范围之内。
微孔阵列的孔可以被布置成一维阵列、二维阵列或三维阵列。三维阵列可以例如通过将一系列两个或更多个二维阵列堆叠起来(即通过将包括微孔阵列的两个或更多个基底堆叠起来)来实现。
微孔之间的图案和间隔可以被选择成使将单细胞和单个固体支持物(例如珠)捕获在每个孔中的效率最佳化，以及使孔数目/阵列的单位面积最大化。微孔可以根据多种随机或非随机图案分布。例如，它们可以完全随机地分布在阵列基底的表面上，或者它们可以被布置呈方格网、矩形格网、六角形格网等。孔之间的中心至中心距离(或间隔)可以从约15微米至约75微米变化。在其他实施例中，孔之间的间隔是至少15微米、至少20微米、至少25微米、至少30微米、至少35微米、至少40微米、至少45微米、至少50微米、至少55微米、至少60微米、至少65微米、至少70微米或至少75微米。微孔间隔可以是至多75微米、至多70微米、至多65微米、至多60微米、至多55微米、至多50微米、至多45微米、至多40微米、至多35微米、至多30微米、至多25微米、至多20微米或至多15微米。微孔间隔可以是约55微米。微孔间隔可以落入通过这些值中的任一个(例如从约18微米至约72微米)界定的任何范围之内。
微孔阵列可以包括微孔之间的表面特征，这些表面特征被设计成帮助将细胞和固体支持物引导至孔中和/或防止它们沉降在孔之间的表面上。适合的表面特征的实例可以包括但不限于环绕孔或跨在孔之间的表面上的圆顶形、脊形的或峰形表面特征。
微孔阵列中的孔的总数目可以通过孔的图案和间隔以及阵列的总体尺寸确定。阵列中微孔的数目可以在从约96至约5,000,000个或更多个的范围内。阵列中微孔的数目可以是至少96个、至少384个、至少1,536个、至少5,000个、至少10,000个、至少25,000个、至少50,000个、至少75,000个、至少100,000个、至少500,000个、至少1,000,000个或至少5,000,000个。阵列中微孔的数目可以是至多5,000,000个、至多1,000,000个、至多75,000个、至多50,000个、至多25,000个、至多10,000个、至多5,000个、至多1,536个、至多384个或至多96个孔。阵列中微孔的数目可以是约96个。微孔的数目可以是约150,000个。阵列中微孔的数目可以落入通过这些值中的任一个(例如从约100至325,000个)界定的任何范围之内。
可以使用许多制造技术中的任何一种制造微孔阵列。可以使用的制造方法的实例包括但不限于体微机械加工(bulk micromachining)技术，诸如光刻术和湿法化学蚀刻、等离子蚀刻或深度反应离子蚀刻；微模制和微压花加工；激光微机械加工；3D打印或使用可固化材料的其他直接写入制造方法；以及类似的技术。
可以由许多基底材料中的任何一种制造微孔阵列。材料的选择可以根据制造技术的选择，并且反之亦然。适合材料的实例可以包括但不限于硅、熔融二氧化硅、玻璃、聚合物(例如，琼脂糖、明胶、水凝胶、聚二甲基硅氧烷(PDMS；弹性体)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙酯(PET)、环氧树脂、基于硫醇-烯的树脂、金属或金属膜(例如铝、不锈钢、铜、镍、铬以及钛)等。亲水性材料可以是为制造微孔阵列所希望的(例如以增强润湿性并且最小化细胞与其他生物材料的非特异性结合)。也可以使用可被处理或涂覆(例如通过氧等离子体处理或聚氧化乙烯表面层的接枝)的疏水性材料。使用多孔亲水性材料制造微孔阵列可以是所希望的以便促进装置中截留的气泡的毛细管芯吸/排出。微孔阵列可以由单一材料制造。微孔阵列可以包含已结合在一起或机械接合的两种或更多种不同的材料。
可以使用多种大小和形状中的任何一种的基底制造微孔阵列。例如，微孔被制造在其内的基底的形状(或足迹)可以是正方形、长方形、圆形的、或不规则形状。微孔阵列基底的足迹可以与微量滴定板的足迹类似。微孔阵列基底的足迹可以与标准显微镜载玻片的足迹类似，例如约75mm长×25mm宽(约3”长×1”宽)或约75mm长×50mm宽(约3”长×2”宽)。微孔被制造在其内的基底的厚度可以在从约0.1mm厚至约10mm厚或更大的范围内。微孔阵列基底的厚度可以是至少0.1mm厚、至少0.5mm厚、至少1mm厚、至少2mm厚、至少3mm厚、至少4mm厚、至少5mm厚、至少6mm厚、至少7mm厚、至少8mm厚、至少9mm厚或至少10mm厚。微孔阵列基底的厚度可以是至多10mm厚、至多9mm厚、至多8mm厚、至多7mm厚、至多6mm厚、至多5mm厚、至多4mm厚、至多3mm厚、至多2mm厚、至多1mm厚、至多0.5mm厚或至多0.1mm厚。微孔阵列基底的厚度可以是约1mm厚。微孔阵列基底的厚度可以是这些范围内的任何值，例如微孔阵列基底的厚度可以在约0.2mm与约9.5mm之间。
可以使用多种表面处理和表面修饰技术来改变微孔阵列表面的特性。实例可以包括但不限于用于使疏水性材料表面更亲水的氧等离子体处理；使用湿法或干法蚀刻技术用于平滑(或粗糙化)玻璃和硅表面；将聚氧化乙烯或其他聚合物层(诸如普朗尼克(pluronic))或牛血清白蛋白吸附或接枝到基底表面上以使得这些基底表面更亲水并且不太易于非特异性吸附生物分子和细胞；使用硅烷反应接枝化学反应性官能团以在其他方面使硅和玻璃表面具有惰性等。光去保护技术可以用于选择性地激活阵列结构中的特定位置处的化学反应性官能团，例如在微孔的内壁上选择性添加或活化化学反应性官能团诸如一级胺或羧基基团可以用于将寡核苷酸探针、肽、蛋白质或其他生物分子共价偶联到微孔的壁上。利用表面处理或表面修饰的选择可以取决于所需表面特性的类型和制备微孔阵列的材料类型中的两者或任一者。
微孔阵列的开口例如在细胞裂解步骤过程中可以是密封的以防止相邻微孔之间的靶核酸的交叉杂交。微孔(或微孔的阵列)可以例如使用夹靠在微孔阵列基底的表面的柔性膜或固体材料的片材(即板或台板)或适合的珠(其中珠的直径大于微孔的直径)密封或加盖。
使用柔性膜或固体材料的片材形成的密封件可以包括例如无机纳米孔膜(例如氧化铝)、透析膜、载玻片、盖玻片、弹性体膜(例如PDMS)或亲水性聚合物膜(例如涂覆有已与裂解缓冲液水合的琼脂糖的薄膜的聚合物膜)。
用于加盖微孔的固体支持物(例如珠)可以包括本披露的固体支持物(例如珠)中的任一种。在一些例子中，固体支持物是交联葡聚糖珠(例如交联葡聚糖)。交联葡聚糖可以在从约10微米至约80微米的范围内。用于加盖的交联葡聚糖珠可以是从20微米至约50微米。在一些实施例中，珠可以比微孔的直径大至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。用于加盖的珠可以比微孔的直径大至多约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
密封件或盖可以允许缓冲液流入和流出微孔，同时防止大分子(例如核酸)从孔中迁移出。可以通过密封件或盖阻挡至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸的大分子迁移入或迁移出微孔中。可以通过密封件或盖阻挡至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸的大分子迁移入或迁移出微孔中。
固体支持物(例如珠)可以分布在基底中。固体支持物(例如珠)可以凭借离心或其他非磁性方式分布在基底的孔中、从基底的孔中移除或者以其他方式输送通过包括一个或多个微孔阵列的装置。基底的微孔可以预加载有固体支持物。基底的微孔可以容纳至少1、2、3、4或5个或更多个固体支持物。基底的微孔可以容纳至多1、2、3、4或5个或更多个固体支持物。在一些例子中，基底的微孔可以容纳一个固体支持物。
可以使用微孔的替代物区室化单独的细胞和珠，例如单个固体支持物和单细胞可以限制在乳液(例如在微滴数字微流体系统中)中的单个微滴之内。
细胞可以有可能限制在多孔珠之内，这些多孔珠自身包含多种系接的随机条形码。单独的细胞和固体支持物可以区室化在任何类型的容器、微容器、反应室、反应器等中。
单个细胞随机条形编码可以在不使用微孔的情况下执行。单个细胞随机条形编码测定可以在不使用任何物理容器的情况下执行。例如，在不存在物理容器情况下的随机条形编码可以通过将细胞和珠彼此紧密接近地包埋在聚合物层或凝胶层内以创建不同细胞/珠对之间的扩散障碍来执行。在另一个实例中，在不存在物理容器情况下的随机条形编码可以原位、在体内、在完整的实体组织上、在完整的细胞上和/或在亚细胞区域执行。
微孔阵列可以是测定系统的可消耗部件。微孔阵列可以是可重复使用的。微孔阵列可以被配置成用作用于手动地执行测定的独立装置，或者它们可以被配置成包括仪器系统的提供全部或部分自动的测定程序的固定或可移除部件。在本披露的方法的一些实施例中，作为测定程序的一部分，随机条形码的基于珠的文库可以沉积在微孔阵列的孔中。在一些实施例中，作为例如用于执行核酸靶标的随机条形编码和数字计数的试剂盒的一部分，珠可以预加载到微孔阵列的孔中并且提供给用户。
在一些实施例中，可以提供两个成对的微孔阵列，一个预加载有通过第一磁体保持在适当位置的珠，并且另一个由用户用于加载单独的细胞。在将细胞分布到第二微孔阵列中之后，将两个阵列面对面地放置并且移去第一磁体，同时使用第二磁体将珠从第一阵列吸引到第二阵列的相应微孔中，从而确保珠位于第二微孔阵列中的细胞上，并且由此最小化细胞裂解后的靶分子的扩散损失，同时最大化靶分子到珠上的随机条形码的有效连接。
三维基底
三维阵列可以是任何形状。三维基底可以由本披露的基底中使用的任何材料制备。在一些例子中，三维基底包括DNA折纸(origami)。DNA折纸结构并入DNA作为构建材料来产生纳米级形状。DNA折纸法可以涉及使用多个合理设计的“订书钉(staple)DNA链”将一个或多个长“支架”DNA链折叠为特定的形状。订书钉链的序列可以被设计使得它们杂交到支架链的特定部分上并且在这种情况下迫使支架链成为特定结构。DNA折纸可以包括支架链和多个合理设计的订书钉链。支架链可以具有任何足够的非重复序列。
订书钉链的序列可以被选择使得DNA折纸具有随机标记可以连接到其的至少一种形状。在一些实施例中，DNA折纸可以是具有至少一个内表面和至少一个外表面的任何形状。内表面可以是DNA折纸的被在空间上防止与样品的表面相互作用的任何表面区域，而外表面是DNA折纸的未被在空间上防止与样品的表面相互作用的任何表面区域。在一些实施例中，DNA折纸具有一个或多个开口(例如两个开口)，使得DNA折纸的内表面可以被颗粒(例如固体支持物)接近。例如，在某些实施例中，DNA折纸具有允许下述颗粒接触DNA折纸的内表面的一个或多个开口，这些颗粒小于10微米、5微米、1微米、500nm、400nm、300nm、250nm、200nm、150nm、100nm、75nm、50nm、45nm或40nm。
DNA折纸可以响应于一种或多种特定环境刺激而改变形状(构象)。因此，DNA折纸的区域当DNA折纸呈现一些构象时可以是内表面，但当装置呈现其他构象时可以是外表面。在一些实施例中，DNA折纸可以通过呈现一种新构象而响应于特定环境刺激。
在一些实施例中，DNA折纸的订书钉链可以被选择使得DNA折纸基本上是桶形或管形的。DNA折纸的订书钉可以被选择使得桶形状在两端处是闭合的或在一端处或两端处是开放的，从而允许颗粒进入桶的内部并且接近其内表面。在某些实施例中，DNA折纸的桶形状可以是六边形管。
在一些实施例中，DNA折纸的订书钉链可以被选择使得DNA折纸具有第一结构域和第二结构域，其中第一结构域的第一端通过一个或多个单链DNA铰链连接到第二结构域的第一端上，并且第一结构域的第二端通过一个或多个分子锁闩(latch)连接到第二结构域的第二端上。多个订书钉可以被选择使得如果所有分子锁闩由其对应外部刺激接触，则第一结构域的第二端变得不连接到第二结构域的第二端上。锁闩可以由两个或更多个订书钉链形成，该两个或更多个订书钉链包括具有能够结合外部刺激(诸如核酸、脂质或蛋白质)的至少一个刺激结合结构域的至少一个订书钉链，以及具有结合刺激结合结构域的至少一个锁闩结构域的至少另一个订书钉链。刺激结合结构域与锁闩结构域的结合支持了DNA折纸的第一构象的稳定性。
空间标记可以三维递送至样品。例如，样品可以与阵列相缔合，其中阵列具有分布成或可分布成三维的空间标记。三维阵列可以是支架、多孔基底、凝胶、一系列通道等。
可以通过例如使用机器人将空间标记样品注射到样品的已知位置中使空间标记的三维图案与样品相关联。可以使用单个针来将空间标记在不同的深度处连续注射到样品中。针阵列可以在不同的深度处注射空间标记以生成三维分布的标记。
在一些例子中，三维固体支持物可以是装置。例如，针阵列装置(例如活检针阵列装置)可以是基底。本披露的随机条形码可以被连接到装置上。将装置放置于样品中和/或上可以使本披露的随机条形码接近样品中和/或上的靶标。装置的不同部分可以具有带有不同的空间标记的随机条形码。例如，在针阵列装置上，装置的每个针可以涂覆有随机条形码，其中每个针上具有不同的空间标记。以此方式，空间标记可以提供关于靶标的位置(例如，在取向上相对于针阵列的位置)的信息。
随机条形码在固体支持物和基底上的合成
随机条形码可以在固体支持物(例如珠)上合成。预先合成的随机条形码(例如，包含可连接到固体支持物上的5’胺)可以通过涉及固体支持物和随机条形码上的官能团对的多种固定技术中的任何一种连接到固体支持物(例如珠)上。随机条形码可以包含官能团。固体支持物(例如珠)可以包含官能团。随机条形码官能团和固体支持物官能团可以包括例如生物素、链霉亲和素、一种或多种一级胺、一种或多种羧基、一种或多种羟基、一种或多种醛、一种或多种酮、以及其任何组合。可以例如通过将随机条形码上的5’氨基基团偶联(例如使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)到官能化的固体支持物的羧基基团上而将随机条形码系接到固体支持物上。残留的未偶联的随机条形码可以通过执行多个冲洗步骤从反应混合物中去除。在一些实施例中，随机条形码和固体支持物使用类似的连接化学经由接头分子(例如短的官能化烃分子或聚氧化乙烯分子)间接地连接。接头可以是可裂解接头，例如酸不稳定性接头或光可裂解接头。
可以使用许多种固相寡核苷酸合成技术中的任何一种将随机条形码合成在固体支持物(例如珠)上，这些技术诸如磷酸二酯合成、磷酸三酯合成、亚磷酸三酯合成以及亚磷酰胺合成。单核苷酸可以分步方式偶联到正在形成、系接的随机条形码上。若干种寡核苷酸的短、预先合成的序列(或块)可以偶联到正在形成、系接的随机条形码上。
随机条形码可以通过用一轮或多轮分离-聚库合成(split-pool synthesis)散布分步式或分块式偶联反应来合成，其中合成珠的总库分为许多个单独的较小库，然后使这些较小库各自经受不同的偶联反应，然后进行单独库的重组和混合以随机化在珠的总库上正在形成的随机条形码序列。分离-聚库合成是组合式合成方法的一个实例，其中最大数目的化学化合物使用最小数目的化学偶联步骤合成。由此创建的化合物文库的潜在多样性通过用于每个偶联步骤的独特的构建块(例如核苷酸)的数目以及用于创建文库的偶联步骤数确定。例如，在每个步骤中使用4种不同的核苷酸、包括10轮偶联的分离-聚库合成将产生410＝1,048,576种独特的核苷酸序列。在一些实施例中，分离-聚库合成可以使用酶法诸如聚合酶延伸或连接反应而不是化学偶联执行。例如，在每轮分离-聚库聚合酶延伸反应中，系接到指定库中的珠的随机条形码的3’端可以与半随机引物组的5’端杂交，这些半随机引物例如具有5’-(M)k-(X)i-(N)j-3’的结构的引物，其中(X)i是i个核苷酸长的核苷酸的随机序列(包括所有可能的(X)i组合的引物组)，(N)j是特异性核苷酸(或j个核苷酸系列)，并且(M)k是特异性核苷酸(或k个核苷酸系列)，其中不同的脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)被添加到每个库并且通过聚合酶并入到系接的寡核苷酸。
缀合到或合成在固体支持物上的随机条形码的数目可以包括至少100、1000、10000或1000000种或更多种随机条形码。缀合到或合成在固体支持物上的随机条形码的数目可以包括至多100、1000、10000或1000000种或更多种随机条形码。缀合到或合成在固体支持物诸如珠上的寡核苷酸的数目可以比细胞中靶核酸的数目多至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。缀合到或合成在固体支持物诸如珠上的寡核苷酸的数目可以比细胞中靶核酸的数目多至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％的随机条形码可以被靶核酸结合。至多10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％的随机条形码可以被靶核酸结合。至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100种或更多种不同的靶核酸可以被固体支持物上的随机条形码捕获。至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100种或更多种不同的靶核酸可以被固体支持物上的随机条形码捕获。
随机条形编码的方法
本披露提供了用于估计身体样品(例如，组织、器官、肿瘤、细胞)中的不同位置处的不同靶标的数目的方法。这些方法可以包括将随机条形码放置成紧密接近样品、裂解样品、使不同的靶标与随机条形码相缔合、扩增靶标并且/或者数字计数靶标。该方法可以进一步包括分析和/或可视化从随机条形码上的空间标记获得的信息。图23示出了本披露的随机条形编码方法的示例性实施例。可以使样品(例如，样品的切片、薄片和细胞)与包含随机条形码的固体支持物接触。样品中的靶标可以与随机条形码相缔合。固体支持物可以被收集。cDNA合成可以在固体支持物上进行。cDNA合成可以脱离固体支持物进行。cDNA合成可以将来自随机条形码中的标记的标记信息结合到被合成的新的cDNA靶分子中，从而产生靶标-条形码分子。靶标-条形码分子可以使用PCT扩增。靶标-条形码分子上的靶标和随机条形码的标记的序列可以通过测序方法确定。
使样品与随机条形码接触
可以使包括例如细胞、器官或组织薄切片的样品与随机条形码接触。固体支持物可以是自由浮动的。固体支持物可以被嵌入在半固体或固体阵列中。随机条形码可以不与固体支持物相缔合。随机条形码可以是相同的核苷酸。随机条形码可以与基底相缔合。当随机条形码紧密接近靶标时，靶标可以与随机条形码杂交。可以非可消耗比接触随机条形码，使得每个不同的靶标可以与本披露的不同的随机条形码相缔合。为了确保靶标与随机条形码之间的有效缔合，靶标可以交联至随机条形码。
细胞裂解
在分布细胞和随机条形码之后，可以裂解细胞以释放靶分子。细胞裂解可以通过多种方式中的任何一种完成，例如通过化学或生化方式、通过渗透压休克或通过热裂解、机械裂解或光学裂解。细胞可以通过添加以下各项来裂解：包含洗涤剂(例如SDS、十二烷基硫酸锂、Triton X-100、吐温-20或NP-40)的细胞裂解缓冲液、有机溶剂(例如甲醇或丙酮)或消化酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶或胰蛋白酶)或其任何组合。为了增加靶标和随机条形码的缔合性，可以通过例如降低温度和/或增加裂解物的粘度改变靶分子的扩散速率。
随机条形码连接到靶核酸分子上
在裂解细胞并且使核酸分子从其释放之后，核酸分子可以与共定位的固体支持物的随机条形码随机地相缔合。缔合可以包括随机条形码的靶识别区杂交到靶核酸分子的互补部分上(例如随机条形码的寡聚dT可以与靶标的聚-A尾相关作用)。用于杂交的测定条件(例如缓冲液pH、离子强度、温度等)可以被选择以促进特定的稳定性杂交体的形成。
连接可以进一步包括将随机条形码的靶识别区与靶核酸分子的一部分连接。例如，靶结合区可以包含可以能够特异性杂交到限制位点突出端(例如EcoRI粘性突出端)上的核酸序列。测定程序可以进一步包括用限制性内切酶(例如EcoRI)处理靶核酸以创建限制位点突出端。随机条形码然后可以被连接到包含与限制位点突出端互补的序列的任何核酸分子上。连接酶(例如T4 DNA连接酶)可以用于接合两个片段。
来自多个细胞(或多个样品)的标记的靶标(例如靶标-条形码分子)可以随后例如通过提取随机条形码和/或靶标-条形码分子所连接到的珠进行合并。连接的靶标-条形码分子的基于固体支持物的集合体的提取可以通过使用磁性珠和外部施加的磁场来实现。一旦靶标-条形码分子已被合并，所有进一步的加工可以在单一反应器中进行。另外的加工可以包括例如逆转录反应、扩增反应、裂解反应、解离反应和/或核酸延伸反应。另外的加工反应可以在微孔内执行，也就是说，无需首先合并来自多个细胞的标记的靶核酸分子。
逆转录
本披露提供了一种用于使用逆转录创建随机靶标-条形码缀合物的方法。随机靶标-条形码缀合物可以包含随机条形码和靶核酸(即，随机条形编码的cDNA分子)的全部或一部分的互补序列。相缔合的RNA分子的逆转录可以通过添加逆转录引物以及逆转录酶发生。逆转录引物可以是寡聚dT引物、随机的六核苷酸引物或靶标特异性寡核苷酸引物。寡聚dT引物的长度可以是12-18个核苷酸并且结合到哺乳动物mRNA的3’端处的内源性聚-A尾上。随机的六核苷酸引物可以在多种互补位点处结合到mRNA上。靶标特异性寡核苷酸引物典型选择性地引发感兴趣的mRNA。
扩增
可以执行一次或多次核酸扩增反应以创建标记的靶核酸分子的多个拷贝。扩增可以多重复路方式执行，其中多个靶核酸序列同时进行扩增。扩增反应可以用于向核酸分子添加测序衔接子。扩增反应可以包括扩增样品标记(若存在的话)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增细胞标记和/或分子标记(若存在的话)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增样品标签、细胞标记、空间标记、分子标记、靶核酸或其组合的至少一部分。扩增反应可以包括扩增多个核酸的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或100％。方法可以进一步包括进行一次或多次cDNA合成反应以产生包含样品标记、细胞标记、空间标记和/或分子标记的靶标-条形码分子的一个或多个cDNA拷贝。
在一些实施例中，扩增可以使用聚合酶链式反应(PCR)执行。如在此所用，PCR可以是指用于通过同时引物延伸DNA的互补链进行特定DNA序列的体外扩增的反应。如在此所用，PCR可以涵盖反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、嵌套式PCR、定量PCR、多重复路PCR、数字PCR以及组装PCR。
标记的核酸的扩增可以包括基于非PCR的方法。基于非PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环-对-环扩增。其他基于非PCR的方法包括用于扩增DNA或RNA靶标的DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多个循环、连接酶链式反应(LCR)和Qβ复制酶(Qβ)方法、使用回文探针、链置换扩增、使用限制性内切酶的寡核苷酸驱动的扩增、其中引物与核酸序列杂交并且所得双链体在延伸反应和扩增之前被裂解的扩增方法、使用缺乏5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增以及分枝式延伸扩增(RAM)。在一些例子中，扩增可以不产生环化的转录物。
在一些例子中，在此披露的方法进一步包括在标记的核酸(例如，标记的RNA、标记的DNA、标记的cDNA)上进行聚合酶链式反应以产生随机标记的扩增子。标记的扩增子可以是双链分子。双链分子可以包括双链RNA分子、双链DNA分子或杂交到DNA分子上的RNA分子。双链分子的一个或两个链可以包含样品标记、空间标记、细胞标记和/或分子标记。随机标记的扩增子可以是单链分子。单链分子可以包括DNA、RNA或其组合。本披露的核酸可以包括合成的或改变的核酸。
扩增可以包括使用一个或多个非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定性或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例可以包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及二醇核酸(GNA)以及苏糖核酸(TNA)。非天然核苷酸可以添加到扩增反应的一个或多个循环。非天然核苷酸的添加可以用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。
进行一次或多次扩增反应可以包括使用一种或多种引物。一种或多种引物可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个或更多个核苷酸。一种或多种引物可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个或更多个核苷酸。一种或多种引物可以包含小于12-15个核苷酸。一种或多种引物可以退火至多个随机标记的靶标的至少一部分。一种或多种引物可以退火至多个随机标记的靶标的3’端或5’端。一种或多种引物可以退火至多个随机标记的靶标的内部区域。内部区域可以是自多个随机标记的靶标的3’端的至少约50、100、150、200、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、650、700、750、800、850、900或1000个核苷酸。一种或多种引物可以包括一组固定引物。一种或多种引物可以包括至少一种或多种定制引物。一种或多种引物可以包括至少一种或多种对照引物。一种或多种引物可以包括至少一种或多种基因特异性引物。
一种或多种引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一种或多种定制引物可以退火至第一样品标记、第二样品标记、空间标记、细胞标记、分子标记、靶标或其任何组合。一种或多种引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以被设计成扩增一种或多种靶标。靶标可以包括一个或多个样品中总核酸的亚组。靶标可以包括一个或多个样品中总随机标记的靶标的亚组。一种或多种引物可以包括至少96种或更多种定制引物。一种或多种引物可以包括至少960种或更多种定制引物。一种或多种引物可以包括至少9600种或更多种定制引物。一种或多种定制引物可以退火至两种或更多种不同的标记的核酸。两种或更多种不同的标记的核酸可以对应于一个或多个基因。
任何扩增方案可以用于本披露的方法中。例如，在一种方案中，第一轮PCR可以使用基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物扩增连接到珠的分子。第二轮PCR可以使用侧接Illumina测序引物2序列的嵌套基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物扩增第一PCR产物。第三轮PCR添加P5和P7以及样品索引以将PCR产物转入到Illumina测序文库中。使用150bp×2测序的测序可以揭示读取1上的细胞标记和分子索引、读取2上的基因和索引1读取上的样品索引。
扩增可以在一轮或多轮中进行。在一些例子中，存在多轮扩增。例如，图15所描绘方案可以具有两轮扩增。第一扩增可以是X’外的延伸以生成基因特异性区域。第二扩增可以发生在样品核酸杂交到X链时。
在一些实施例中，杂交不需要发生在核酸分子的端部处。在一些实施例中，更长核酸的完整链内的靶核酸被杂交并且扩增。例如，更长部分的基因组DNA或mRNA内的靶标。靶标可以是距离多核苷酸端部的大于50个核苷酸、大于100个核苷酸或大于1000个核苷酸。
测序
确定不同随机标记的核酸的数目可以包括确定标记的靶标、空间标记、分子标记、样品标记和细胞标记或其任何产物(例如标记的扩增子、标记的cDNA分子)的序列。可以对扩增的靶标进行测序。确定随机标记的核酸或其任何产物的序列可以包括进行测序反应以确定样品标记、空间标记、细胞标记、分子标记的至少一部分、随机标记的靶标、其补体、其反向补体或其任何组合的至少一部分的序列。
可以使用多种测序方法进行确定核酸(例如，扩增的核酸、标记的核酸、标记的核酸的cDNA拷贝等)的序列，这些测序方法包括但不限于通过杂交测序(SBH)、通过连接测序(SBL)、定量增量荧光核苷酸添加测序(QIFNAS)、分步连接与裂解、荧光共振能量转移(FRET)、分子信标、TaqMan报告探针消化、焦磷酸测序、荧光原位测序(FISSEQ)、FISSEQ珠、摆动测序(wobble sequencing)、多重测序、聚合集群(POLONY)测序；纳米格滚环测序(ROLONY)、等位基因特异性寡核苷酸连接测定(例如，寡核苷酸连接测定(OLA)、使用连接的线性探针和滚环扩增(RCA)读取、连接的持锁探针的单模板分子OLA、或使用连接的环形持锁探针和滚环扩增(RCA)读取的单模板分子OLA)等。
在一些例子中，确定标记的核酸或其任何产物的序列包括配对末端测序、纳米孔测序、高通量测序、鸟枪法测序、染料终止剂测序、多重引物DNA测序、引物步移、桑格双脱氧测序法、Maxim-Gilbert测序、焦磷酸测序、真正的单分子测序或其任何组合。可替代地，可以通过电子显微镜分析法或化学敏感场效应晶体管(chemFET)阵列来确定标记的核酸或其任何产物的序列。
也可以使用高通量测序方法，诸如使用平台(诸如Roche 454、Illumina Solexa、ABI-SOLiD、离子半导体(ION Torrent)、全基因组学公司(Complete Genomics)、太平洋生物科学(Pacific Bioscience)、螺旋(Helicos)、Polonator平台)的循环阵列测序。在一些实施例中，测序可以包括MiSeq测序。在一些实施例中，测序可以包括HiSeq测序。
随机标记的靶标可以包括代表从生物体基因组基因的约0.01％至生物体基因组基因的约100％的核酸。例如，可以使用包括多个多聚体的靶标互补区通过从样品捕获的含有互补序列的基因对约0.01％的生物体基因组基因至约100％的生物体基因组基因进行测序。在一些实施例中，标记的核酸包括代表从生物体转录组转录物的约0.01％至生物体转录组转录物的约100％的核酸。例如，可以使用包括聚-T尾的靶标互补区通过从样品捕获mRNA对约0.501％的生物体转录组转录物至约100％的生物体转录组转录物进行测序。
测序可以包括对标记的核酸的至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个核苷酸或碱基对进行测序。测序可以包括对标记的核酸的至少约200、300、400、500、600、700、800、900、1,000个或更多个核苷酸或碱基对进行测序。测序可以包括对标记的核酸的至少约1,500；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；或10,000个或更多个核苷酸或碱基对进行测序。
测序可以包括至少约200、300、400、500、600、700、800、900、1000个或更多个测序读取/运行。在一些例子中，测序包括测序至少约1,500；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；或10,000个或更多个测序读取/运行。测序可以包括小于或等于约1,600,000,000个测序读取/运行。测序可以包括小于或等于约200,000,000个读取/运行。
样品
细胞
用于本披露的方法中的样品可以包括一个或多个细胞。样品可以是指一个或多个细胞。在一些实施例中，细胞是从癌组织切除的癌细胞，例如乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、黑色素瘤以及非黑色素瘤皮肤癌等。在一些例子中，细胞来源于癌症但是从体液收集的(例如循环肿瘤细胞)。癌症的非限制性实例可以包括腺瘤、腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、小细胞癌、大细胞未分化癌、软骨肉瘤、以及纤维肉瘤。
在一些实施例中，细胞可以是已被病毒感染并且含有病毒寡核苷酸的细胞。在一些实施例中，病毒感染可以由选自以下各项组成的组的病毒导致：双链DNA病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或痘病毒)、单链(+链或“有义”)DNA病毒(例如细小病毒)、双链RNA病毒(例如呼肠孤病毒)、单链(+链或有义)RNA病毒(例如小核糖核酸病毒和披膜病毒)、单链(-链或反义)RNA病毒(例如第IV类病毒、弹状病毒)、单链(在其生命周期中具有DNA中间体的(+链或有义)RNA病毒)RNA-RT病毒(例如逆转录病毒)、以及双链DNA-RT病毒(例如嗜肝DNA病毒)。在一些例子中，样品是病毒或被病毒感染的细胞。病毒可以是SIV或HIV。
在一些实施例中，细胞是细菌。这些可以包括革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。可以使用本披露的方法、装置和系统分析的细菌的实例包括但不限于放线菌科(Actinomedurae)、衣氏放线菌、炭疽杆菌、蜡样芽胞杆菌、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、棒状杆菌、粪肠球菌、单核细胞增生李斯特菌、诺卡氏菌属、痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epiderm)、变异链球菌、肺炎链球菌等。革兰氏阴性细菌包括但不局限于猫阿菲波菌(Afipia felis)、类杆菌(Bacteriodes)、杆状巴尔通体、百日咳杆菌、伯氏疏螺旋体、回归热疏螺旋体、布鲁氏菌(Brucella)、肉芽肿鞘杆菌、弯曲杆菌、大肠杆菌、土拉热弗朗西丝菌、阴道加德纳菌、埃及嗜血杆菌(Haemophiliusaegyptius)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilius ducreyi)、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌、问号钩端螺旋体、脑膜炎奈瑟菌、牙龈卟啉单胞菌、斯氏普罗维登斯菌(Providencia sturti)、铜绿假单胞菌、肠炎沙门菌(Salmonella enteridis)、伤寒沙门菌、粘质沙雷菌、波伊德志贺氏菌、念珠状链杆菌、化脓链球菌、梅毒螺旋体、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、鼠疫耶尔森菌等。其他细菌可以包括鸟分枝杆菌、麻风分枝杆菌(Myobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Myobacterium tuberculosis)、汉赛巴尔通体(Bartonella henseiae)、鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体、伯氏考克斯体、肺炎支原体、螨立克次体、普氏立克次氏体、立氏立克次体、姜虫病立克次氏体、斑疹伤寒立克次氏体、尿素分解脲原体、肺炎双球菌、查菲埃立克体(Ehrlichia chafensis)、屎肠球菌、脑膜炎球菌等。
在一些实施例中，细胞是真菌。可以使用本披露的方法、装置和系统分析的真菌的非限制性实例包括但不限于曲霉属、假丝酵母属、白色念珠菌、粗球孢子菌、隐球菌(Cryptococci)及其组合。
在一些实施例中，细胞是原生动物或其他寄生物。使用本披露的方法、装置和系统分析的寄生物的实例包括但不限于：结肠小袋纤毛虫、小球隐孢子虫、卡晏环孢子虫(Cyclospora cayatanensis)、脑胞内原虫属(Encephalitozoa)、溶组织内阿米巴、比氏肠孢虫(Enterocytozoon bieneusi)、兰伯贾第虫、利什曼原虫、疟原虫(Plasmodii)、鼠弓形体、锥体虫(Trypanosomae)、梯形阿米巴(trapezoidal amoeba)、蠕虫类(例如，蠕虫(helminthes))、尤其是寄生蠕虫(包括但不限于线虫纲(蛔虫(例如，鞭虫、钩虫、蛲虫、禽蛔虫、丝状虫等)、绦虫纲(例如，绦虫)。
如在此所用，术语“细胞”可以是指一个或多个细胞。在一些实施例中，细胞是正常细胞，例如不同发育阶段的人类细胞或来自不同器官或组织类型的人类细胞(例如白细胞、红细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞、神经元、胶质细胞、成纤维细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、配子或来自心脏、肺、大脑、肝、肾、脾、胰脏、胸腺、膀胱、胃、结肠、小肠的细胞)。在一些实施例中，细胞可以是未分化的人类干细胞或已被诱导分化的人类干细胞。在一些实施例中，细胞可以是胎儿人类细胞。胎儿人类细胞可以获自怀有胎儿的母亲。在一些实施方案中，细胞是稀有细胞。稀有细胞可以是例如循环肿瘤细胞(CTC)、循环上皮细胞、循环内皮细胞、循环子宫内膜细胞、循环干细胞、干细胞、未分化干细胞、癌干细胞、骨髓细胞、祖细胞、泡沫细胞、间充质细胞、滋养细胞、免疫系统细胞(宿主或移植物)、细胞片段、细胞器(例如，线粒体或核)、病原体感染的细胞等。
在一些实施例中，细胞是非人类细胞，例如是其他类型的哺乳动物细胞(例如小鼠、大鼠、猪、狗、牛或马)。在一些实施例中，细胞是其他类型的动物或植物细胞。在其他实施例中，细胞可以是任何原核或真核细胞。
在一些实施例中，第一细胞样品获自不患有疾病或的个体，并且第二细胞样品获自患有疾病或病状的个体。在一些实施例中，个体是不同的。在一些实施例中，个体是相同的，但细胞样品是在不同时间点处获取的。在一些实施例中，个体是患者，并且细胞样品是患者样品。疾病或病状可以癌症、细菌感染、病毒感染、炎性疾病、神经退行性疾病、真菌疾病、寄生虫病、遗传病症或其任何组合。
在一些实施例中，适用于当前披露的方法中的细胞的直径大小可以是在从约2微米至约100微米的范围内。在一些实施例中，细胞可以具有至少2微米、至少5微米、至少10微米、至少15微米、至少20微米、至少30微米、至少40微米、至少50微米、至少60微米、至少70微米、至少80微米、至少90微米或至少100微米的直径。在一些实施例中，细胞可以具有至多100微米、至多90微米、至多80微米、至多70微米、至多60微米、至多50微米、至多40微米、至多30微米、至多20微米、至多15微米、至多10微米、至多5微米或至多2微米的直径。细胞可以具有在一个范围，例如从约5微米至约85微米内的任何值的直径。在一些实施例中，细胞具有约10微米的直径。
在一些实施例中，细胞在细胞与珠相缔合之前被分选出。例如，细胞可以通过荧光活化细胞分选法或磁活化细胞分选法，或更通常地通过流式细胞术分选出。细胞可以根据大小过滤。在一些例子中，滞留物含有待与珠相缔合的细胞。在一些例子中，流过物(flowthrough)含有待与珠相缔合的细胞。
在一些实施例中，样品包括免疫细胞。免疫细胞可以包括例如T细胞、B细胞、淋巴干细胞、髓系祖细胞、淋巴细胞、粒细胞、B祖细胞、T祖细胞、天然杀伤细胞、Tc细胞、Th细胞、浆细胞、记忆细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞和/或巨噬细胞、或其任何组合。
T细胞可以是T细胞克隆，该T细胞克隆可以是指从单一T细胞中衍生的T细胞或具有相同TCR的那些T细胞。T细胞可以是T细胞系的一部分，该T细胞系可以包括T细胞克隆和具有不同TCR的混合T细胞群体，所有这些不同TCR可以识别相同靶标(例如，抗原、肿瘤、病毒)。T细胞可以获得自许多来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾脏组织以及肿瘤。T细胞可以获得自诸如使用Ficoll分离从受试者中收集的单位血液。来自个体的循环血液的细胞可以通过血浆除去法或白细胞除去法来获得。血浆除去法产物可以包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞以及血小板。可以对细胞进行洗涤并且重新悬浮于培养基中以分离感兴趣的细胞。
T细胞可以通过溶解红细胞并且消耗单核细胞，例如通过穿过PERCOLLTM梯度的离心来从外周血淋巴细胞中分离。T细胞的特异性亚群(诸如CD28+、CD4+、CDC、CD45RA+以及CD45RO+T细胞)可以通过阳性或阴性选择技术来进一步分离。例如，T细胞可以通过用抗CD3/抗CD28(即，3×28)缀合的珠诸如
Figure GDA0002888063340000681
M-450CD3/CD28 T或XCYTEDYNABEADSTM孵育足以阳性选择所希望的T细胞的时间段来分离。免疫细胞(例如，T细胞和B细胞)可以是抗原特异性的(例如，对肿瘤是特异性的)。
在一些实施例中，细胞可以是抗原呈递细胞(APC)，诸如B细胞、来自淋巴结的激活B细胞、淋巴母细胞样细胞、休眠的B细胞或例如来自淋巴瘤的赘生性B细胞。APC可以是指表达其表面上的BCRC蛋白质中的至少一种的B细胞或滤泡树突状细胞。
免疫学方法
本披露的方法可以用于追踪单一T细胞的分子表型。不同亚型的T细胞可以通过不同分子标志物的表达来区分。T细胞表达来自多样的TCR库的独特T细胞受体(TCR)。在大多数T细胞中，TCR可以由α和β链的异质二聚体组成；每个功能链可以是T细胞发育过程中体细胞DNA重组事件的产物，从而允许在单一个体中表达超过一百万个不同TCR。TCR可以用于定义个体T细胞的身份，从而允许对免疫应答过程中的T细胞克隆扩充进行世系追踪。可以多种方式使用本披露的免疫学方法，包括但不限于鉴定单一T细胞中的独特TCRα和TCRβ链配对，在单细胞水平下定量TCR和标志物表达，鉴定个体中的TCR多样性，表征在不同T细胞群体中表达的TCR库，确定TCR的α链等位基因和β链等位基因的功能以及鉴定免疫应答过程中的T细胞克隆扩充。
本披露提供了如图38-40所示的用于捕获TCR库的方法。如图38所示，逆转录引物可以包含连接到锚定物(该锚定物可以是通用序列)上的任何本披露标记(例如，分子标记和样品标记)。引物可以包含基因特异性区域。基因特异性区域可以结合到以下各项的C区上：一个或多个TCR的α链、一个或多个TCR的β链、或一个或多个TCR的α链和β链两者。用于引物的用于C区结合的示例性序列是：TRAC：5’CAGACAGACTTGT 3’(SEQ ID NO:1)；TRBC：5’CCTTTTGGGTGTG3’(SEQ ID NO:2)。在一些例子中，逆转录引物可以包含可以结合到标志基因的聚A尾上的寡聚dT。标志基因可以是T细胞特异性基因。在一些例子中，标志基因可以是指至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个基因。标志基因可以是指至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个基因。
用于N1和N2多重PCR步骤的正向引物(如图38所示)可以被设计成靶向VDJ组合的V区、VDJ组合的D区和/或VDJ组合的J区。N1和/或N2正向引物可以被设计成结合到V区的5’端、V区的3’端、V区的任何地方、或V与D区之间的接合点处。引物可以被设计使得随后的测序读取(例如，输出)可以测序VDJ区的CDR(例如，CDR3)。可以在N1和/或N2 PCR反应中靶向的示例性基因示于图39中，并且用于N1和N2 PCR反应中的正向引物分别示于表1和表2中。
在一个实例中，本披露的方法(例如，本披露的免疫学方法)可以用于表征肿瘤中的肿瘤浸润性淋巴细胞，监测治疗前和治疗后患有肿瘤的患者的临床反应，并且确定治疗后的最小病残(例如，剩下的癌细胞)。
表1.N1正向引物
Figure GDA0002888063340000701
Figure GDA0002888063340000711
Figure GDA0002888063340000721
Figure GDA0002888063340000731
Figure GDA0002888063340000741
Figure GDA0002888063340000751
表2.N2正向引物。
Figure GDA0002888063340000752
Figure GDA0002888063340000761
Figure GDA0002888063340000771
Figure GDA0002888063340000781
Figure GDA0002888063340000791
Figure GDA0002888063340000801
Figure GDA0002888063340000811
Figure GDA0002888063340000821
Figure GDA0002888063340000831
用于构建并且解码基底的方法
用于将空间标记加载在基底上的方法
空间标记可以被预加载在基底上。基底的表面可以预印记有随机条形码。换句话讲，基底的表面上的每种随机条形码的坐标可以是已知的。随机条形码可以任何几何形式进行预印记。在一些例子中，可以将包含随机条形码的固体支持物预定位在基底上。
在一些例子中，基底上的随机条形码的坐标可以是未知的。随机条形码的位置可以是用户生成的。当基底上的随机条形码的位置是未知的时，可以对随机条形码的位置进行解码。
本披露提供了用解码包含随机条形码的基底(例如阵列)的方法。解码不仅可以依赖于光学特征标志的使用(尽管如在此所述，但是使用具有光学特征标记的珠可以允许“重新使用”解码探针)，而且还依赖于在解码步骤过程中添加的组合性解码核酸的使用。解码可以通过连续杂交执行。解码核酸可以杂交到置于珠上的不同的鉴定物编码核酸(鉴定物探针)上或杂交到生物活性剂本身上，例如当生物活性剂是核酸时，该核酸的至少一些部分是单链的以允许杂交到解码探针上。解码核酸可以被直接或间接标记。解码通过检测标记的存在而发生。
编码核酸(也称为鉴定物探针(IP)或鉴定物核酸)可以包含引物序列和相邻解码序列。每个解码器(或解码)探针可以包含可以杂交的引物序列上的引发序列(在此有时被称为“不变序列”)，和通常包含在可变序列内的至少一种解码核苷酸。解码器探针可以被制成组，其中每组包含至少四个亚组，每个亚组在相同位置即检测位置(即腺嘌呤、胸苷(或尿嘧啶，根据需要)、胞嘧啶和鸟嘌呤)具有不同的解码核苷酸，其中检测位置(检测核苷酸)处的每个核苷酸包含独特的标记，优选荧光团。可以在允许区分完全互补性和不完全互补性的条件下添加解码器探针。因此，包含与询问的编码核苷酸碱基配对的正确碱基的解码探针可以最佳地杂交。其他解码探针可以被冲洗掉。检测与检测核苷酸相缔合的独特荧光团可以实现对该位置处的编码核苷酸的鉴定。通过使用新的一组解码探针重复这些步骤，从而将检测核苷酸的位置延伸一个碱基，可以解释下一个编码核苷酸的身份。解码可以使用大量的探针。可以使用分离和混合组合的合成来制备解码探针。
在解码过程中可以使用奇偶性分析(Parity analysis)以增加系统的稳健性和精确性。奇偶性分析可以是指解码步骤，其中具体元素的信号可以跨多个解码阶段进行分析。也就是说，在至少一个解码步骤之后，可以跨解码阶段对阵列元素的信号进行分析。可以跨多个阶段评估来自特定珠的信号。虽然分析可以包括可以获自信号的任何参数，诸如评估跨阶段获得的总信号，但是可以对跨阶段的信号的奇偶性进行分析。
奇偶性可以是指当使用二进制信号时信号的数字或模数读取，即奇数或偶数。跨多个阶段的信号的数字和可以被翻译为奇偶性确定。奇偶性确定可以用于评估解码过程。例如，编码可以被设计成当跨所有阶段或解码步骤或预先确定的多个阶段或解码步骤观察时具有奇数个特定信号，例如红色信号。检测到偶数个红色阶段可以提供在解码中的某一点处出现了错误的指示。当获得这种结果时，可以丢弃有错误的编码，或者对分析进行重复。
本披露提供了将“冗余阶段”引入到解码系统中。冗余阶段可以是指用作奇偶检验的阶段。也就是说，在解码阶段之后，可以包括另外的阶段来分析奇偶性。这个分析可以提供解码的胜任性或可靠性的指示。当编码被设计具有预先确定的奇偶性时，冗余阶段可以用于检测从解码步骤获得的信号的奇偶性。冗余步骤可以检测奇偶性错误，因为如果在解码中存在错误，则在冗余阶段之后检测的奇偶性将不同于设计到编码中的奇偶性。
在一些例子中，解码可以通过使用串在一起的8聚体寡核苷酸发生以创建其上具有数个8聚体的解码寡核苷酸。解码寡核苷酸在其上可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个8聚体。解码寡核苷酸在其上可以包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个8聚体。解码寡核苷酸可以杂交到数种不同的随机条形码上(例如通过将解码寡核苷酸的不同8聚体区杂交到随机条形码上的不同8聚体区上)。可以对解码寡核苷酸进行荧光标记、熔融掉并且进行测序。可以不同颜色对解码寡核苷酸进行荧光标记。可以用相同颜色但是以不同水平的荧光强度对解码寡核苷酸进行荧光标记，从而生成探针的“灰度级”谱图。重复此举可以提供可解释的谱图，其中随机条形码的每个8聚体彼此相关。该方法可以重复至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。该方法可以重复至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。
在基底上的扩散
当样品(例如一个或多个细胞)根据本披露的方法进行随机条形编码时，可以将细胞裂解。细胞的裂解可以导致裂解内容物(例如细胞内容物)远离裂解的初始位置的扩散。换句话讲，裂解内容物可以移动到大于细胞所占据的表面积的表面积中。
样品裂解混合物(例如包含靶标)的扩散可以通过不同参数调整，这些参数包括但不限于裂解混合物的粘度、裂解混合物的温度、靶标的大小、基底中物理屏障的大小、裂解混合物的浓度等。例如，裂解反应的温度可以是在至少1C、2C、3C、4C、5C、10C、15C、20C、25C、30C、35C或40C或更高的温度下执行。裂解反应的温度可以是在至多1C、2C、3C、4C、5C、10C、15C、20C、25C、30C、35C或40C或更高的温度下执行。裂解混合物的粘度可以通过例如添加增稠试剂(例如甘油、珠)以减缓扩散速率来改变。裂解混合物的粘度可以通过例如添加减薄试剂(例如水)以增加扩散速率来改变。基底可以包括可以改变靶标自样品的扩散速率的物理屏障(例如孔、微孔、微峰)。裂解混合物的浓度可以被改变以增加或减小靶标自样品的扩散速率。裂解混合物的浓度可以增加或减小至少1、2、3、4、5、6、7、8或9倍或更多倍。裂解混合物的浓度可以增加或减小至多1、2、3、4、5、6、7、8或9倍或更多倍。
可以增加扩散速率。可以减小扩散速率。与未改变的裂解混合物相比，裂解混合物的扩散速率可以增加或减小至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍或更多倍。与未改变的裂解混合物相比，裂解混合物的扩散速率可以增加或减小至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍或更多倍。与未改变的裂解混合物相比，裂解混合物的扩散速率可以增加或减小至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。与未改变的裂解混合物相比，裂解混合物的扩散速率可以增加或减小至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
数据分析和显示软件
对靶标空间分辨率的数据分析和可视化
本披露提供了用于通过使用空间标记的随机条形编码和数字计数估计靶标的数目和位置的方法。获自本披露的方法的数据可以在谱图上进行可视化。可以使用利用在此所述方法生成的信息构建样品的靶标的数目和位置的谱图。可以使用该谱图来定位靶标的物理位置。可以使用该谱图来鉴定多个靶标的物理位置。多个靶标可以是相同种类的靶标，或多个靶标可以是多个不同的靶标。例如，可以构建脑谱图以显示多个靶标的数字计数和位置。
谱图可以由来自单个样品的数据生成。谱图可以使用来自多个样品的数据构建，从而生成组合谱图。谱图可以用来自数十个、数百个和/或数千个样品的数据构建。由多个样品构建的谱图可以显示与多个样品所共有的区域相关联的靶标的数字计数的分布。例如，重复测定可以显示在相同的谱图上。至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个复制品可以显示(例如叠加)在相同谱图上。至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个复制品可以显示(例如叠加)在相同谱图上。靶标的空间分布和数目可以通过多种统计学表示。
来自多个样品的组合数据可以增加组合谱图的位置分辨率。多个样品的取向可以通过常见的界标进行配准，其中样品上的单个位置测量是至少部分不连续的。具体的实例是使用切片机在一个轴线上切片样品，并且然后沿不同的入口切片第二样品。组合的数据集将产生与靶标的数字计数相关联的三维空间位置。多重复路以上方法将实现数字计数统计学的高分辨率三维谱图。
在仪器系统的一些实施例中，系统将包括计算机可读介质，该计算机可读介质包括用于提供对通过执行单细胞随机条形编码测定生成的序列数据集的数据分析的代码。可以由数据分析软件提供的数据分析功能性的实例包括但不限于(i)算法，用于解码/多路解编样品标记、细胞标记、空间标记和分子标记、以及通过对在运行测定中创建的随机条形码文库进行测序提供的靶序列数据；(ii)算法，用于基于该数据确定读取数目/基因/细胞和独特转录物分子数目/基因/细胞，以及创建汇总表；(iii)测序数据的统计分析，例如用于根据基因表达数据群集细胞或用于预测转录物分子数目/基因/细胞的测定的置信区间等；(iv)算法，用于鉴定稀有细胞的亚群体，例如使用主成分分析、分层式群集(hierarchicalclustering)、k-均值群集、自组织映射、神经网络等；(v)序列比对能力，用于将基因序列数据与已知参考序列进行比对并且检测突变、多态性标记和剪接变体；以及(vi)分子标记的自动化群集，以补偿扩增或测序错误。在一些实施例中，可商购获得软件可以用于执行数据分析的全部或一部分，例如七桥问题(https://www.sbgenomics.com)软件可以用于编译针对整个细胞集合体的每个细胞中出现的一个或多个基因的拷贝数目的表。在一些实施例中，数据分析软件可以包括用于以有用图形格式(例如指示细胞集合体中的每个细胞中出现的一个或多个基因的拷贝数目的热图)输出测序结果。在一些实施例中，数据分析软件可以进一步包括用于从测序结果中提取生物意义的算法，例如通过使细胞集合体的每个细胞中出现的一个或多个基因的拷贝数目与细胞类型、稀有细胞类型或来源于患有特定疾病或病状的受试者的细胞相关联。在一些实施例中，数据分析软件可以进一步包括用于在不同生物样品上比较细胞群体的算法。
在一些实施例中，所有数据分析功能性可以打包在单个软件包内。在一些实施例中，整套的数据分析能力可以包括一系列软件包。在一些实施例中，数据分析软件可以是可独立于测定仪器系统为用户利用的独立包。在一些实施例中，软件可以是基于网络的并且可以允许用户共享数据。
系统处理器和网络
一般来讲，如图24所示，包括在当前披露的仪器系统中的计算机或处理器可以进一步理解为可读取来自介质511或网络端口505的指令的逻辑设备，该网络端口可以任选地连接到具有固定介质512的服务器509上。诸如，如图24所示，系统500可以包括CPU 501、磁盘驱动器503、任选的输入装置诸如键盘515或鼠标516以及任选的监测器507。可以通过指定的通信介质传至在本地或远程位置处的服务器来实现数据通信。通信介质可以包括发送或接收数据的任何装置。例如，通信介质可以是网络连接、无线连接或因特网连接。这样的连接可以提供经由万维网的通信。可以设想的是，与本披露相关的数据可以通过这样的网络或连接进行传输，以由接收方522接收或审阅，如图24所示。
图25示出了可结合本披露的示例性实施例使用的计算机系统100的第一示例性体系结构的示例性实施例。如图25所描绘，示例性计算机系统可以包括用于处理指令的处理器102。处理器的非限制性实例包括：英特尔XeonTM处理器、AMD OpteronTM处理器、三星32-位RISC ARM 1176JZ(F)-S v1.0TM处理器、ARM Cortex-A8三星S5PC100TM处理器、ARMCortex-A8苹果A4TM处理器、迈威尔(Marvell)PXA 930TM处理器或功能等效的处理器。多个执行线程可以用于并行处理。在一些实施例中，也可以使用多个处理器或具有多核的处理器，无论是以单个计算机系统、成群地还是通过网络跨系统分布的，该网络包括多个计算机、手机或个人数据助理装置。
如图25所示，可以将高速缓存104连接到或并入处理器102中，以便为最近已经被或频繁地被处理器102使用的指令或数据提供高速存储器。通过处理器总线108将处理器102连接到北桥106上。北桥106通过存储器总线112连接到随机存取存储器(RAM)110上并且管理处理器102对RAM 110的访问。北桥106还通过芯片组总线116连接到南桥114上。南桥114进而连接到外设总线118上。外设总线可以是例如PCI、PCI-X、PCI Express或其他外设总线。北桥和南桥通常被称为处理器芯片组并且管理处理器、RAM与外设总线118上的外设部件之间的数据传输。在一些可替代性体系结构中，可以将北桥的功能性并入处理器中而取代使用单独的北桥芯片。
在一些实施例中，系统100可以包括附接到外设总线118上的加速器卡122。加速器可以包括现场可编程门阵列(FPGA)或其他用于加速某些处理的硬件。例如，加速器可以用于自适应性数据重构或用于评估扩展集处理中所用的代数表达式。
软件和数据被存储在外部存储器124中并且可以被加载到RAM110或缓存104中，以为处理器所用。系统100包括用于管理系统资源的操作系统；操作系统的非限制性实例包括：Linux、WindowsTM、MACOSTM、BlackBerry OSTM、iOSTM和其他功能等效的操作系统，以及在操作系统之上运行的用于根据本发明的示例性实施例管理数据存储和优化的应用软件。
在这个实例中，系统100还包括连接到外设总线上的网络接口卡(NIC)120和121，用于为外部存储器诸如附网存储(NAS)和其他可以用于分布式并行处理的计算机系统提供网络接口。
图26示出了一个示例性图解，该示例性图解示出了网络200，该网络具有多个计算机系统202a和202b、多个手机和个人数据助理202c以及附网存储(NAS)204a和204b。在示例性实施例中，系统212a、212b和212c可以管理数据存储并且针对存储在附网存储(NAS)214a和214b中的数据优化数据访问。数学模型可以用于数据并且使用跨计算机系统212a和212b、和手机以及个人数据助理系统212c的分布式并行处理进行评估。计算机系统212a和212b和手机以及个人数据助理系统212c还可以为存储在附网存储(NAS)214a和214b中的数据的自适应性数据重构提供并行处理。图26仅示出了一个实例，并且多种多样的其他计算机体系结构和系统也可以与本发明的不同实施例结合使用。例如，刀片式服务器可以用于提供并行处理。处理器刀片可以通过底板进行连接，以提供并行处理。存储器也可以通过单独的网络接口连接到底板上或作为附网存储(NAS)。
在一些示例性实施例中，处理器可以保持分开的存储空间并且通过网络接口、底板或其他连接器传输数据，用于通过其他处理器进行并行处理。在其他实施例中，处理器中的部分或全部可以使用共享的虚拟地址存储空间。
图27示出了根据示例性实施例使用共享的虚拟地址存储空间的多处理器计算机系统300的示例性框图。该系统包括可以访问共享的存储子系统304的多个处理器302a-f。该系统在存储子系统304中并入了多个可编程硬件存储算法处理器(MAP)306a-f。MAP306a-f各自可以包括存储器308a-f以及一个或多个现场可编程门阵列(FPGA)310a-f。MAP提供了可配置性功能单元并且具体算法或算法部分可以被提供给FPGA 310a-f，用于与对应的处理器密切配合进行处理。例如，MAP可以用于相对于数据模型来评估代数表达式以及用于在示例性实施例中进行自适应型数据重构。在这个实例中，每个MAP都可被所有处理器全球访问用于这些目的。在一种配置中，每个MAP都可以使用直接内存访问(DMA)来访问相关的存储器308a-f，从而允许它独立于对应的微处理器302a-f并且与这些微处理器不同步地执行任务。在这种配置中，MAP可以将结果直接馈至另一MAP以用于流水操作和并行执行算法。
以上计算机体系结构和系统仅仅是实例，并且多种多样的其他计算机、手机和个人数据助理体系结构和系统可以与示例性实施例结合使用，包括使用一般处理器、协同处理器、FPGA和其他可编程逻辑装置、片上系统(SOC)、特种集成电路应用(ASIC)以及其他处理和逻辑元件的任何组合的系统。在一些实施例中，全部或部分的计算机系统可以在软件或硬件中实施。任何种类的数据存储介质都可以与示例性实施例结合使用，包括随机存取存储器、硬盘驱动器、闪速存储器、磁带驱动器、磁盘阵列、附网存储(NAS)以及其他局部或分布式数据存储装置和系统。
在示例性实施例中，可以使用在任何以上或其他计算机体系结构和系统上执行的软件模块来实施本披露的计算机子系统。在其他实施例中，可以部分地或完全地在以下各项中实现该系统的功能：固件、可编程逻辑装置诸如现场可编程门阵列(FPGA)、片上系统(SOC)、特种集成电路应用(ASIC)或其他处理和逻辑元件。例如，可以通过使用硬件加速器卡诸如加速器卡通过硬件加速来实施集处理器和优化器。
试剂盒
在此披露了用于执行单细胞随机条形编码测定的试剂盒。试剂盒可以包括一个或多个基底(例如微孔阵列)，作为包括一个或多个微孔阵列的独立式基底(或芯片)或包装在一个或多个流动池或柱体之内，以及一种或多种固体支持物悬浮液，其中悬浮液内的单个固体支持物包含本披露的多种连接的随机条形码。在一些实施例中，试剂盒可以进一步包括用于固定独立式基底的机械固定装置，以便产生有助于将样品和试剂移液到基底中的反应孔。试剂盒可以进一步包括用于执行随机条形编码测定的试剂，例如裂解缓冲液、冲洗缓冲液或杂交缓冲液。试剂盒可以进一步包括用于执行核酸延伸反应例如逆转录反应的试剂(例如酶、引物、dNTP、NTP、RNA酶抑制剂或缓冲液)。试剂盒可以进一步包括用于执行扩增反应以制备测序文库的试剂(例如酶、通用引物、测序引物、靶标特异性引物或缓冲液)。
试剂盒可以包括板(例如，96孔板)，其中板的每个孔可以包含一种或多种逆转录引物。每个孔中的逆转录引物的类型数目可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种。每个孔中的逆转录引物的类型数目可以是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种。逆转录引物可以是基因特异性的，例如对以下各项有基因特异性：一个或多个TCR的α链、一个或多个TCR的β链、或一个或多个TCR的α链和β链两者、和/或TCR标志物。
试剂盒可以包含正向基因特异性引物。正向基因特异性引物可以用于N1和/或N2中(例如，嵌套的)。基因特异性引物可以对任何基因是特异性的。在一些例子中，基因特异性正向引物对T细胞是特异性的。
试剂盒可以包含用于测序反应中的一种或多种测序引物(例如，测序流动池引物)。
试剂盒可以包括用于浇铸基底(例如微孔阵列)的一个和多个模具，例如包括微柱阵列的模具，以及一个或多个固体支持物(例如珠)，其中悬浮液内单独的珠包含多种连接的本披露随机条形码。试剂盒可以进一步包括用于浇铸基底的材料(例如琼脂糖、水凝胶、PDMS等)。
试剂盒可以包括预加载有包含多种连接的本披露随机条形码的固体支持物的一个或多个基底。在一些例子中，可以存在于基底的每个微孔的固体支持物上。在一些实施例中，多种随机条形码可以直接连接到基底的表面上，而不是连接到固体支持物上。在这些实施例中的任一项中，一个或多个微孔阵列可以独立式基底(或芯片)的形式提供，或者它们可以包装在流动池或柱体中。
在本披露试剂盒的一些实施例中，试剂盒可以包含并入一个或多个基底的一个或多个柱体。在一些实施例中，一个或多个柱体可以进一步包括一个或多个预加载的固体支持物，其中悬浮液内单独的固体支持物包含多种连接的本披露随机条形码。在一些实施例中，可以将珠预分布到柱体的一个或多个微孔阵列中。在一些实施例中，呈悬浮液形式的珠可以预加载并且储存在柱体的试剂孔之内。在一些实施例中，一个或多个柱体可以进一步包含被预加载并且储存在柱体的试剂贮存池之内的其他测定试剂。
试剂盒可以包括软件(例如，本披露的软件)。软件可以包括可以在计算机上本地运行或来自云的脚本。软件可以用于分析测序数据(例如，用于计数针对靶标的分子索引数目，用于调整针对靶标的计数的分子索引数目，用于提供已计数的靶标的序列)。
试剂盒通常可以包括用于进行在此所述的方法中的一种或多种的说明书。包括在试剂盒中的说明书可以附着到包装材料上或可以作为包装说明书被包括。虽然说明书典型地是书写或印刷材料，但是它们不限于这些。能够储存此类说明书并且将它们传达至最终用户的任何介质为本披露所考虑。这种介质可以包括但不限于电子存储介质(例如磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如CD ROM)、RF标签等。如在此所用，术语“说明书”可以包括提供说明书的互联网网站地址。
装置
流动池
微孔阵列基底可以被包装在流动池内，该流动池提供与流体处理系统的其余部分的方便界面结合并且有助于被递送至微孔阵列和/或乳滴的流体例如，细胞和固体支持物悬浮液、裂解缓冲液、冲洗缓冲液等的交换。设计特征可以包括：(i)用于引入细胞样品、固体支持物悬浮液或其他测定试剂的一个或多个入口、(ii)被设计成提供均匀填充和有效流体交换同时最小化回漩涡或死区的一个或多个微孔阵列室，以及(iii)用于将流体递送到样品收集点或废物贮存池的一个或多个出口。流动池的设计可以包括与多个微孔阵列界面结合的多个微孔阵列室，使得可以并行处理一个或多个不同的细胞样品。流动池的设计可以进一步包括用于跨阵列室的宽度产生匀流速度剖面图(即“活塞流”)的特征，以提供细胞和珠到微孔的更均匀递送，例如，通过使用作为“流动扩散器(flow diffuser)”的位于室入口附近和微孔阵列上游的多孔隔板，或通过将每个阵列室分成若干分段，这些分段共同覆盖相同的总阵列区，但是通过它们分开的入口液流平行地流动。在一些实施例中，流动池可以围绕或并入一个以上的微孔阵列基底。在一些实施例中，整合的微孔阵列/流动池组件可以构成系统的固定部件。在一些实施例中，微孔阵列/流动池组件可以是从仪器可移除的。
一般来讲，将优化流体通道和一个或多个阵列室在流动池设计中的尺寸，以便(i)提供细胞和珠到微孔阵列的均匀递送，和(ii)最小化样品和试剂消耗。在一些实施例中，流体通道的宽度将在50um与20mm之间。在其他实施例中，流体通道的宽度可以是至少50um、至少100um、至少200um、至少300um、至少400um、至少500um、至少750um、至少1mm、至少2.5mm、至少5mm、至少10mm、至少20mm、至少50mm、至少100mm或至少150mm。在又其他实施例中，流体通道的宽度可以是至多150mm、至多100mm、至多50mm、至多20mm、至多10mm、至多5mm、至多2.5mm、至多1mm、至多750um、至多500um、至多400um、至多300um、至多200um、至多100um或至多50um。在一个实施例中，流体通道的宽度是约2mm。流体通道的宽度可以落入通过这些值中的任一个(例如从约250um至约3mm)界定的任何范围之内。
在一些实施例中，流体通道的深度将在50um与2mm之间。在其他实施例中，流体通道的深度可以是至少50um、至少100um、至少200um、至少300um、至少400um、至少500um、至少750um、至少1mm、至少1.25mm、至少1.5mm、至少1.75mm或至少2mm。在又其他实施例中，流体通道的深度可以是至多2mm、至多1.75mm、至多1.5mm、至多1.25mm、至多1mm、至多750um、至多500um、至多400um、至多300um、至多200um、至多100um或至多50um。在一个实施例中，流体通道的深度是约1mm。流体通道的宽度可以落入通过这些值中的任一个(例如从约800um至约1mm)界定的任何范围之内。
流动池可以使用本领域的普通技术人员已知的多种技术和材料制造。一般来讲，流动池被制造为单独零件并且随后被机械地夹固或永久地结合到微孔阵列基底上。适合的制造技术的实例包括常规机械加工、CNC机械加工、注塑、3D打印、对齐并层压一层或多层激光切割或冲切聚合物薄膜或多种微制造技术中的任一种，诸如光刻法和湿法化学蚀刻、干法蚀刻、深度反应离子蚀刻或激光微机械加工。一旦流动池零件已经被制造出，则它可以机械地附接至微孔阵列基底，例如通过将它抵着微孔阵列基底夹紧(使用或未使用垫圈)，或者可以使用本领域的普通技术人员已知的多种技术中的任一种(取决于使用的材料的选择)使它直接结合到微孔阵列基底上，例如通过使用阳极键合、热键合或多种粘合剂或粘附膜中的任一种，包括基于环氧树脂的、基于丙烯酸的、基于硅酮的、可UV固化的、基于聚氨酯的或基于氰基丙烯酸酯的粘合剂。
流动池可以使用本领域的普通技术人员已知的多种材料制造。一般来讲，使用的材料的选择将取决于使用的制造技术的选择，并且反之亦然。适合材料的实例包括但不限于硅、熔融二氧化硅、玻璃、多种聚合物中的任一种例如，聚二甲基硅氧烷(PDMS；弹性体)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、环氧树脂、金属(例如，铝、不锈钢、铜、镍、铬和钛)、非粘性材料诸如铁氟龙(teflon)(PTFE)或这些材料的组合。
柱体
在系统的一些实施例中，具有或不具有附接流动池的微孔阵列将被包装在消耗性柱体内，该柱体与仪器系统界面结合。柱体的设计特征可以包括(i)一个或多个入口，用于与仪器形成流体连接或将细胞样品、珠悬浮液或其他测定试剂手动引入柱体中；(ii)一个或多个旁路通道，即用于自计量细胞样品和珠悬浮液，以避免满溢或回流；(iii)一个或多个整合的微孔阵列/流动池组件、或一个或多个微阵列基底定位在其内的一个或多个室；(iv)整合的微型泵或其他流体致动机构，用于控制流体流动通过装置；(v)整合的微型阀(或其他约束机构)，用于将预加载试剂(例如，珠悬浮液)隔区化或控制流体流动通过装置；(vi)用于为滞留的空气提供逃逸路径的一个或多个通气孔；(vii)一个或多个样品和试剂废物贮存池；(viii)一个或多个出口，用于与仪器形成流体连接或提供经处理的样品收集点；(ix)机械接口特征，用于相对于仪器系统重复性定位可移除的消耗性柱体，并且用于提供进入，这样使得外磁体可以与微孔阵列紧密接近；(x)整合的温度控制部件或热接口，用于提供与仪器系统的良好热接触；以及(xi)光学接口特征，例如透明窗，用于对微孔阵列进行光学询问。
柱体可以被设计成平行地处理一个以上的样品。柱体可以进一步包括适于与独立式PCR热循环仪或测序仪界面结合的一个或多个可移除样品收集室。柱体可以自身适于与独立式PCR热循环仪或测序仪界面结合。在本披露中使用的术语“柱体”可以意指包括在性能测定过程中含有样品和珠的零件的任何组装。
柱体可以进一步包括部件，这些部件被设计成产生防止大分子扩散(或增加其路径长度和扩散时间)的物理或化学屏障，以便最小化微孔之间的交叉污染。此类屏障的实例可以包括但不限于用于将细胞和固体支持物(例如珠)递送到微孔阵列的一套蛇形通道、在裂解或孵育步骤过程中经过按压与微孔阵列基底表面接触的可伸缩压板或可变形膜、使用较大的珠，例如如先前所述的交联葡萄糖珠来堵塞微孔的开口、或在裂解或孵育步骤过程中使不互混的疏水流体从柱体内的贮存池中释放出来以有效地分离并隔区化阵列中的每个微孔。
可以优化流体通道和一个或多个阵列室在柱体设计中的尺寸，以便(i)提供细胞和珠到微孔阵列的均匀递送，和(ii)最小化样品和试剂消耗。流体通道的宽度可以在50微米与20mm之间。在其他实施例中，流体通道的宽度可以是至少50微米、至少100微米、至少200微米、至少300微米、至少400微米、至少500微米、至少750微米、至少1mm、至少2.5mm、至少5mm、至少10mm或至少20mm。在又其他实施例中，流体通道的宽度可以是至多20mm、至多10mm、至多5mm、至多2.5mm、至多1mm、至多750微米、至多500微米、至多400微米、至多300微米、至多200微米、至多100微米或至多50微米。流体通道的宽度可以是约2mm。流体通道的宽度可以落入通过这些值中的任一个(例如从约250um至约3mm)界定的任何范围之内。
柱体中流体通道可以具有一深度。柱体设计中流体通道的深度可以在50微米与2mm之间。流体通道的深度可以是至少50微米、至少100微米、至少200微米、至少300微米、至少400微米、至少500微米、至少750微米、至少1mm、至少1.25mm、至少1.5mm、至少1.75mm或至少2mm。流体通道的深度可以是至多2mm、至多1.75mm、至多1.5mm、至多1.25mm、至多1mm、至多750微米、至多500微米、至多400微米、至多300微米、至多200微米、至多100微米或至多50微米。流体通道的深度可以是约1mm。流体通道的宽度可以落入通过这些值中的任一个(例如从约800微米至约1mm)界定的任何范围之内。
柱体可以使用本领域的普通技术人员已知的多种技术和材料制造。一般来讲，使用多种机械组装或结合技术中的任一种将柱体制造为一系列单独的零部件(图28A-C)并且随后组装。适合的制造技术的实例包括但不限于常规机械加工、CNC机械加工、注塑、热成形以及3D打印。一旦柱体部件已经被制造出，可以使用螺钉、夹子等将它们进行机械组装，或使用多种技术中的任一种(取决于使用的材料的选择)使它们永久结合，例如通过使用热键合/焊接或多种粘合剂或粘附膜中的任一种，包括基于环氧树脂的、基于丙烯酸的、基于硅酮的、可UV固化的、基于聚氨酯的或基于氰基丙烯酸酯的粘合剂。
柱体部件可以使用多种适合的材料中的任一种制造，包括但不限于硅、熔融二氧化硅、玻璃、多种聚合物中的任一种，例如，聚二甲基硅氧烷(PDMS；弹性体)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、环氧树脂、非粘性材料诸如铁氟龙(PTFE)、金属(例如，铝、不锈钢、铜、镍、铬和钛)或其任何组合。
柱体的入口和出口特征可以被设计成提供与仪器的方便且防漏的流体连接，或可以用作开放贮存池以便将样品和试剂手动地移进或移出柱体。入口和出口连接器的方便机械设计的实例可以包括但不限于螺纹连接器、鲁尔锁紧连接器、鲁尔滑锁(Luer slip)或“滑动型尖端(slip tip)”连接器、压入配合连接器以及类似物。柱体的入口和出口可以进一步包括帽、弹簧加载盖或塞、或聚合物膜，它们在柱体被定位在该仪器中时可以被打开或刺破，并且用于防止在储存过程中柱体内表面的污染或在柱体从仪器上移除时防止流体溢出。柱体的一个或多个出口可以进一步包括适于与独立式PCR热循环仪或测序仪界面结合的可移除的样品收集室。
柱体可以包括整合的微型泵或用于控制流体流动通过装置的其他流体致动机构。适合的微型泵或流体致动机构的实例可以包括但不限于机电或气动致动的微型注射器或柱塞机构、气动地或通过外部活塞致动的膜隔膜泵、气动致动的试剂小袋或气囊、或电渗泵。
柱体可以包括用于将预加载试剂隔区化或控制流体流动通过装置的微型阀。适合的微型阀的实例可以包括但不限于使用可以被熔化或溶解的蜡或聚合物塞或可以被刺破的聚合物膜制造的一次性“阀”；使用可变形膜构造的夹管阀和使用可变形膜片构造的气动、磁、电磁或机电(螺线管)致动的止回阀以及微型门阀。
柱体可以包括用于为截留的空气提供逃逸路径的通气孔。可以根据多种技术构造通气孔，例如使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)或允许毛细管芯吸空气但阻止被水渗透的其他疏水材料的多孔塞。
柱体的机械接口特征可以提供柱体相对于仪器系统的易于移除但高度精确且可重复的定位。适合的机械接口特征可以包括但不限于定位销、定位导件、机械止动件以及类似物。机械设计特征可以包括凸凹特征，用于使外部设备(例如，磁体或光学部件)与微孔阵列室紧密接近(图28B)。
柱体还可以包括温度控制部件或热接口特征，用于与外部温度控制模块配合。适合的温度控制元件的实例可以包括但不限于电阻加热元件、微型红外发射光源、珀耳帖(Peltier)加热或冷却装置、散热器、热敏电阻、热电偶等。热接口特征可以由作为良好热导体的材料(例如，铜、金、银等)制造并且可以包括能够与外部加热块或冷却块产生良好热接触的一个或多个平表面。
柱体可以包括光学接口特征，用于对微孔阵列进行光学成像或光谱学询问。柱体可以包括光学透明窗，例如，微孔基底本身或与微孔阵列相对的流动池的或微阵列室的侧面，该透明窗由满足用于探测微孔阵列的成像或光谱技术的频谱要求的材料制造。适合的光学窗材料的实例可以包括但不限于玻璃、熔融二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、环烯烃聚合物(COP)或环烯烃共聚物(COC)。
尽管在此已经显示并说明了本发明的优选实施例，但是本领域技术人员将清楚的是仅作为举例而提供了此类实施例。本领域技术人员现在将会想到众多变体、变化、以及替代，而不背离本发明。应该理解的是，在此说明的本发明的实施例的不同替代方案可以用于实施本发明。本发明的意图在于以下权利要求书限定了本发明的范围以及由此覆盖在这些权利要求和它们的等效物的范围内的方法和结构。
实例
虽然本披露已通过以下实例来说明，但是不应该解释为由此而被限制；而是本披露涵盖上文所披露的遗传领域。可以在不背离本披露的精神和范围的情况下做出不同修改和实施例。
实例1.测序引物的衔接子连接
如图31所示，衔接子可以被连接到基因特异性扩增的产物3105上。基因特异性扩增的产物具有由聚合酶沉积的A核苷酸突出端。衔接子在一个链(例如，有义链)上具有T突出端并且在另一个链(例如，反义链)上具有游离磷酸酯。衔接子可以通过连接而被连接到基因特异性扩增的产物上。衔接子连接到基因特异性扩增的产物的5’端和3’端两者上。衔接子连接的基因特异性产物例如用测序(例如，流动池)引物来扩增。随后的起源于正向测序引物(例如，ILMN读取1)的PCR反应延伸到3’端上的读取2序列中。反向测序引物(例如，ILMN读取2)由于缺乏衔接子有义链上的磷酸化位点而可以不延伸到读取1序列(例如，5’端)中。以此方式，反向扩增反应是呈线性的而正向扩增反应是呈指数的。
实例2.基因特异性产物的高多路解编和映射率
可以对图31所示的衔接子连接的扩增的产物进行测序、多路解编以及映射。图32示出了基因特异性扩增子的多路解编和映射率以及每个样品的总读取计数的示例性实施例。
实例3.扩增子上的读取计数的分布
在本披露的基因特异性方法中，相同基因的不同区域(例如，扩增子)可以被扩增以例如用于SNP鉴定。图33示出了基因内的扩增子的读取计数。具有单一扩增子的基因用浅灰色或深灰色标记。具有多个扩增子(例如，从相同基因中扩增的多个区域)的基因通过颜色集中在一起。在一些例子中，读取计数对于相同基因(例如，ATR基因)内的扩增子是类似的。在一些例子中，读取计数对于相同基因(例如，TELO2)内的扩增子是不同的。相同基因中的扩增子之间的读取计数差异可以是由于基因中的遗传变异而产生(例如，基因具有不被所设计的引物识别的变体)。基因中的扩增子应该具有类似的读取计数，因为它们起源于具有相同拷贝数的相同基因。
实例4.SNP鉴定
本披露的方法可以用于鉴定SNP(来自相同基因内的多个扩增子或在基因上)。引物被设计成扩增感兴趣的选择区域(例如，SNP)。对扩增子进行测序。如图34所示，使用软件算法来鉴定SNP。对预期的SNP位置周围的区域进行检验。如果存在正确的侧翼序列，则通过核苷酸来鉴定SNP。如果在预期的SNP区域周围的侧翼序列是不正确的，则SNP被鉴定为‘N’核苷酸。SNP可以在正向读取、反向读取和/或正向读取和反向读取两者中被鉴定。当SNP在这两种读取中被鉴定时，正向读取或更高品质读取被用于鉴定。
图35示出了在HJURP、ATR、CD82和WRN基因中的对特异性SNP的等位基因特异性表达。表格中的数字表示在SNP位置处含有指示的碱基的读取数。用深灰色突显的值具有非常低的计数，而用浅灰色突显的值具有高的计数。HJURP和ATR主要含有C SNP。WRN例如具有G和T核苷酸的混合物。
实例5.用靶向的基因特异性引物对IgG mRNA的检测
如图36所描绘，检测IgG mRNA的灵敏的方法可以利用靶向方法。这种方法在IgGmRNA的mRNA转录物水平较不丰富(每个细胞<10％的mRNA库)时可以是有用的；多重PCR反应可以对于更高数目的测序读取富集靶向区域。考虑到抗体编码基因可以突变，用于这种方法的引物设计可以朝具有最小变异的区域靶向。引物被设计成在重mRNA和轻mRNA的恒定(C)和FR1区中含有已证实的序列(对于所有靶向的序列参见表3)以最小化这个问题。
在图36所示的工作流程中，识别具有锚定序列的C区的反向引物被用于逆转录。从这个反应中生成的cDNA用作低循环PCR的模板以使用FR1特异性正向引物和锚定特异性反向引物将分子标记体和样品标记体连接到3’端中。在随后的PCR反应中连接Illumina相兼容的测序衔接子以用于阐明IgG mRNA中的V(D)J序列。
实例6.用于IgG mRNA的检测的文库制备的衔接子连接
如图37所示，这种文库制备方法是检测并且测序IgG mRNA的无偏方法。当感兴趣的mRNA是丰富的(每个细胞>10％的mRNA库)时，可以使用这种方法。这种方法的优点是不管5’端中出现的突变可无偏富集IgG mRNA。
在图37所示的工作流程中，识别具有锚定序列的C区的反向引物被用于逆转录。从这个反应中生成的cDNA用作用于第二链cDNA合成的模板。这个ds cDNA连接到双链衔接子寡核苷酸上并且是使用正向衔接子引物和反向锚定引物以用于分子索引和样品索引扩增的PCR。在随后的PCR反应中连接Illumina相兼容的测序衔接子以用于阐明IgG mRNA中的V(D)J序列。
表3.用于实例5和实例6中的基因序列的列表。序列已被证实适合于高通量测序小鼠Balb/c菌株中的IgG mRNA。
Figure GDA0002888063340001021
Figure GDA0002888063340001031
实例7.使用随机条形码对TCR mRNA和标志mRNA的检测。
图38示出的实验方案被用于表征TCR α链和β链以及表型标志mRNA，这些表型标志mRNA使用每个孔2个细胞当量的T细胞RNA(20ng)表达在96孔板中沉积的T细胞中。所使用的表型标志物列于图39中。结合到TCR α链和β链的C区上的基因特异性引物是：TRAC：5’CAGACAGACTTGT 3’(SEQ ID NO:1)；TRBC：5’CCTTTTGGGTGTG3’(SEQ ID NO:2)。对于每个样品孔的表型标志物多路解编的测序读取和分子索引分别示于表4和表5中。对于每个样品孔的TCRα链多路解编的测序读取和分子索引示于表6和表7中。对于每个样品孔的TCR β链多路解编的测序读取和分子索引示于表8和表9中。
表4.对于每个样品孔的表型标志物的测序读取。
Figure GDA0002888063340001041
表5.对于每个样品孔的表型标志物的分子索引。
Figure GDA0002888063340001042
表6.对于每个样品孔的TCR α链的测序读取。
Figure GDA0002888063340001043
表7.对于每个样品孔的TCR α链的分子索引。
Figure GDA0002888063340001051
表8.对于每个样品孔的TCR β链的测序读取。
Figure GDA0002888063340001052
表9.对于每个样品孔的TCR β链的分子索引。
Figure GDA0002888063340001053
实例8.使用随机条形码对样品中TCR库的检测。
图38示出的实验方案被用于表征来自供体的T细胞RNA样品中的TCR库。对于所表达的TCRα链mRNA和β链mRNA的分子标记体示于图40中。鉴定了样品收集时刻在供体中表达的广范围的TCR。
实例9.单一T细胞的表型分析。
图38示出的实验方案被用于表征样品中单一激活T细胞的表型。图41示出的主成分分析(PCA)图被用于视觉上区分不同的T细胞亚型。每个点是IL-32或CD28(该IL-32或CD28是激活T细胞标志物)较高的一个细胞和多个细胞，用圆圈突显。激活T细胞与未圈出的非激活T细胞区分开来。
相同样品被用于分析单一CD3+T细胞的CDR3序列。结果示于表10中。
表10.单一CD3+T细胞的分子标记体。
Figure GDA0002888063340001061
实例10.使用一步法RT-PCR来添加随机条形码。
图42示出了用于表征样品中单一激活T细胞的表型的实验方案。一步法RT-PCR被用于使用以下各项将随机条形码添加到TCR mRNA上：包含靶标特异性序列和通用衔接引物以用于逆转录的第一寡核苷酸，以及靶标特异性正向引物和包含通用衔接引物的结合配偶体和随机条形码以用于PCR的反向引物。这个方案提供了更高灵敏度和简单工作流程的优点(数据未示出)。
在至少一些先前描述的实施例中，在一个实施例中使用的一个或多个元件可以在另一个实施例中互换地使用，除非这种置换是技术上不可行的。本领域技术人员将了解的是，可以在不背离所要求保护的主题的范围的情况下对以上所述的方法和结构做出各种其他省略、添加和修改。所有这样的修改和改变预期属于如所附权利要求书所限定的主题的范围之内。
关于在此使用基本上任何复数和/或单数术语，那些本领域技术人员可以根据上下文和/或应用的需要将复数翻译成单数和/或将单数翻译成复数。为了清晰起见，可以在此清晰地列出各种单数/复数的转换。
本领域技术人员将理解的是，一般而言，在此所使用的术语，尤其是在所附权利要求书中的术语(例如，所附权利要求书的主体)通常意指“开放性的”术语(例如，术语“包含(including)”应当被解释为“包含但不局限于”，术语“具有”应当被解释为“具有至少”，术语“包括(includes)”应当被解释为“包括但不限于”等)。本领域的普通技术人员另外将认识到的是，如果意指特定数目的一种所介绍的权利要求陈述，那么将在该权利要求中明确陈述这种意思，并且在无这类陈述的存在下，不呈现这种意思。例如，为了有助于理解，以下所附权利要求书可以包含介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”的使用，以用来介绍权利要求陈述。然而，此类短语的使用不应当解释为意指经由不定冠词“一个”或“一种”介绍权利要求陈述将任何含有此类介绍的权利要求陈述的具体权利要求限制于仅含有一个这种陈述的实施例，即使在相同的权利要求包括介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”以及不定冠词例如“一个”或“一种”(例如，“一个”和/或“一种”，也应当解释为表示“至少一个”或“一个或多个”)的时候也是如此；这对于使用定冠词来介绍权利要求陈述同样适用。另外，即使明确地陈述一个介绍的权利要求陈述的特定数目，本领域技术人员将会意识到此陈述物也应当解释为意味着至少该陈述的数目(例如，仅陈述“两个陈述”而无其他修饰语意指至少两个陈述，或两个或者多个陈述)。此外，在使用类似于“A、B以及C等中的至少一个”的惯例的情况下，通常这样的句法结构意指在一定意义上本领域技术人员将理解该惯例(例如，“具有A、B以及C中的至少一个的系统”将包括但不局限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、同时具有A和B、同时具有A和C、同时具有B和C、和/或同时具有A、B以及C等的系统)。在使用类似于“A、B以及C等中的至少一个”的惯例的情况下，通常这样的句法结构意指在一定意义上本领域技术人员将理解该惯例(例如，“具有A、B或C中的至少一个的系统”将包括但不局限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、同时具有A和B、同时具有A和C、同时具有B和C、和/或同时具有A、B以及C等的系统)。本领域的普通技术人员将进一步理解的是无论是在说明书、权利要求书还是附图中，呈现两个或更多个替代性术语的几乎任何分离性词语和/或短语都应当理解为考虑到了包括这些术语中的一者、这些术语中的任一者或这两个术语的可能性。例如，短语“A或B”应理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
此外，当以马库什(Markush)组的方式描述本披露的多个特征或方面时，在本领域内的技术人员将会认识到还以该马库什组中任一个单独的成员或多个成员的子组的方式来对本披露进行描述。
如本领域技术人员将理解，出于诸如就提供书面说明而言的任何和所有目的，在此披露的所有范围也包括任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以容易被认为已经充分描述并使得同一范围分成至少相等的二等分、三等分、四等分、五等分、十等分等。作为一个非限制性实例，在此讨论的每个范围可以容易分为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的是，所有诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等语言包括所提数值，并且是指可以接着分成如上所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解，一个范围包括每个独立成员。因此例如，具有1-3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组等。
序列表
<110> 赛卢拉研究公司
格伦·弗
朱莉·威廉米
玛丽亚·西姆比尔斯基
艾琳·夏姆
<120> 用于标记靶标的方法和组合物
<130> BDCRI.011WO
<150> 62/135,018
<151> 2015-07-17
<150> 62/173,899
<151> 2015-06-10
<150> 62/160,976
<151> 2015-05-13
<150> 62/128,849
<151> 2015-03-05
<150> 62/126,397
<151> 2015-02-27
<160> 423
<170> 用于Windows 4.0版的FastSEQ
<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR α链C区结合引物
<400> 1
cagacagact tgt 13
<210> 2
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR β链C区结合引物
<400> 2
ccttttgggt gtg 13
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RORC N1正向引物
<400> 3
cccaaacatt tccatggtgc tc 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RUNX1 N1正向引物
<400> 4
gcaacgggaa atgtggtcct 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RUNX3 N1正向引物
<400> 5
ctggtcccag gtcagcgt 18
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TBET N1正向引物
<400> 6
ctgccctaac tacagtcgtt tac 23
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GATA3 N1正向引物
<400> 7
ccgttcacca gttgccgtt 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDCD1 N1正向引物
<400> 8
acatcctacg gtcccaaggt 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCL2 N1正向引物
<400> 9
tgcaagagtg acagtggatt g 21
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCL6 N1正向引物
<400> 10
tgtcctcacg gtgcctttt 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BIRC5 N1正向引物
<400> 11
tgccacggcc tttccttaaa 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCL14 N1正向引物
<400> 12
ttcctcctca tcaccatcgc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCL17 N1正向引物
<400> 13
gagtgctgcc tggagtactt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCL18 N1正向引物
<400> 14
gaagctgaat gcctgagggg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCL20 N1正向引物
<400> 15
acttgcacat catggagggt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCL3 N1正向引物
<400> 16
tggactggtt gttgccaaac 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCL4 N1正向引物
<400> 17
cccagccagc tgtggtattc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCR4 N1正向引物
<400> 18
ccaaagggaa gagtgcaggg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCR7 N1正向引物
<400> 19
ggggagagtg tggtgtttcc 20
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD160 N1正向引物
<400> 20
ggaagacagc cagatccagt g 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD244 N1正向引物
<400> 21
gggctgagaa tgaggcagtt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD27 N1正向引物
<400> 22
tgcagagcct tgtcgttaca 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 N1正向引物
<400> 23
accatcacag gcatgttcct 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD30 N1正向引物
<400> 24
tttactcatc gggcagccac 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD38 N1正向引物
<400> 25
aggtcaatgc cagagacgga 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3D N1正向引物
<400> 26
gaaaacgcat cctggaccca 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3E N1正向引物
<400> 27
aagttgtccc ccatcccaaa 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD4 N1正向引物
<400> 28
ctgggagagg gggtagctag 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40LG N1正向引物
<400> 29
cctcccccag tctctcttct 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD5 N1正向引物
<400> 30
atcaatggtc caagccgcat 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD69 N1正向引物
<400> 31
gctgtagaca ggtccttttc g 21
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8A N1正向引物
<400> 32
actgctgtcc caaacatgca 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8B N1正向引物
<400> 33
ccaccatctt tgcaggttgc 20
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDCA7 N1正向引物
<400> 34
ccagtctagt ttctgggcag g 21
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CSF2 N1正向引物
<400> 35
agccagtcca ggagtgagac 20
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CX3CR1 N1正向引物
<400> 36
cacccgtcca gaccttgtt 19
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CXCL12 N1正向引物
<400> 37
tgggagttga tcgcctttcc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CXCL13 N1正向引物
<400> 38
aggcagatgg aacttgagcc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CXCR3 N1正向引物
<400> 39
gacctcagag gcctcctact 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CXCR5 N1正向引物
<400> 40
cctccccagc ctttgatcag 20
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EOMES N1正向引物
<400> 41
acttaacagc tgcaggggc 19
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAS N1正向引物
<400> 42
attgctggta gagaccccca 20
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FASLG N1正向引物
<400> 43
cctcaagggg gactgtcttt c 21
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOSL1 N1正向引物
<400> 44
ctcctgacag aaggtgccac 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXP3 N1正向引物
<400> 45
acagaagcag cgtcagtacc 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH N1正向引物
<400> 46
gacttcaaca gcgacaccca 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GZMA N1正向引物
<400> 47
ggaaccatgt gccaagttgc 20
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GZMB N1正向引物
<400> 48
aggtgaagat gacagtgcag g 21
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GZMH N1正向引物
<400> 49
agtgttgctg acagtgcaga 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GZMK N1正向引物
<400> 50
ttgccacaaa gcctggaatc 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-DRA N1正向引物
<400> 51
gggtctggtg ggcatcatta 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IFNG N1正向引物
<400> 52
ctaggcagcc aacctaagca 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL10 N1正向引物
<400> 53
ccccaaccac ttcattcttg 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL12A N1正向引物
<400> 54
ggtccctcca aaccgttgtc 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL12B N1正向引物
<400> 55
gctatggtga gccgtgattg 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL13 N1正向引物
<400> 56
ggagccaagg gttcagagac 20
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL17A N1正向引物
<400> 57
gccttcaaga ctgaacaccg a 21
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL17F N1正向引物
<400> 58
ttggagaagg tgctggtgac 20
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL1A N1正向引物
<400> 59
ggcatcctcc acaatagcag a 21
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL1B N1正向引物
<400> 60
cttaaagccc gcctgacaga 20
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2 N1正向引物
<400> 61
tcacttaaga cccagggact t 21
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL21 N1正向引物
<400> 62
cccaaggtca agatcgccac 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL21R N1正向引物
<400> 63
atttgaggct gcagtgagct 20
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL22 N1正向引物
<400> 64
tgggaagcca aactccatca t 21
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL23R N1正向引物
<400> 65
agaatcatta ggccaggcgt g 21
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL24 N1正向引物
<400> 66
ctcaccccat catccctttc c 21
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL26 N1正向引物
<400> 67
tactgacggc atgttaggtg 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL3 N1正向引物
<400> 68
acagacgact ttgagcctcg 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL31 N1正向引物
<400> 69
ggccatctct tcctttcgga 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL32 N1正向引物
<400> 70
ctttccagtc ctacggagcc 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33R N1正向引物
<400> 71
ttcaggactc cctccagcat 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL4 N1正向引物
<400> 72
accatgagaa ggacactcgc 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL4R N1正向引物
<400> 73
tgaacttcag ggagggtggt 20
<210> 74
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL5 N1正向引物
<400> 74
gcagtgagaa tgagggcca 19
<210> 75
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL6 N1正向引物
<400> 75
cggcaaatgt agcatgggc 19
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL6R N1正向引物
<400> 76
ccagcaccag ggagtttcta 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRF4 N1正向引物
<400> 77
ctcttcagca tcccccgtac 20
<210> 78
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LAG3 N1正向引物
<400> 78
agctgtacca gggggagag 19
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LIF N1正向引物
<400> 79
tccccatcgt cctccttgtc 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LTA N1正向引物
<400> 80
aggcagggag gggactattt 20
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCL1 N1正向引物
<400> 81
gactggctac gtagttcggg 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MKI67 N1正向引物
<400> 82
tactttttcg cctcccaggg 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MYC N1正向引物
<400> 83
agctacggaa ctcttgtgcg 20
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NKG2D N1正向引物
<400> 84
caacacccag gggatcagtg 20
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PRDM1 N1正向引物
<400> 85
accaaagcat cacgttgaca t 21
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PRF1 N1正向引物
<400> 86
ggagtccagc gaatgacgtc 20
<210> 87
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTPRCv1 N1正向引物
<400> 87
gttcccatgt taaatcccat tcat 24
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTPRCv2 N1正向引物
<400> 88
accctctctc cctccctttc 20
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP30 N1正向引物
<400> 89
accaaccaga ccaggactta 20
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SELL N1正向引物
<400> 90
gcatctcatg agtgccaagc 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TBX21 N1正向引物
<400> 91
ttataaccat cagcccgcca 20
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFB1 N1正向引物
<400> 92
tattcctttg cccggcatca 20
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF N1正向引物
<400> 93
agtggacctt aggccttcct 20
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFRSF9 N1正向引物
<400> 94
tggcatgtga gtcattgctc 20
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TYMS N1正向引物
<400> 95
tcagtcttta ggggttgggc 20
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UHRF1 N1正向引物
<400> 96
ccagttcttc ctgacaccgg 20
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ZBED2 N1正向引物
<400> 97
aatgtaccag ccagtcagcg 20
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ZNF683 N1正向引物
<400> 98
ggagagcgtc cattccagtg 20
<210> 99
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV1-1 N1正向引物
<400> 99
tctgggtttt atgggctgtc ctggta 26
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV1-2-01 N1正向引物
<400> 100
ggacaaaaca ttgaccagcc cac 23
<210> 101
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV1-2-02 N1正向引物
<400> 101
atctgggttc aacgggctgt tctggta 27
<210> 102
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV2 N1正向引物
<400> 102
aatcactctg tgtccaatgc ttaca 25
<210> 103
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV3 N1正向引物
<400> 103
attcagtctc tggaaaccct tatc 24
<210> 104
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV4 N1正向引物
<400> 104
gtagccacaa caacattgct ac 22
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV5 N1正向引物
<400> 105
cagctcctcc acctacttat act 23
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV6 N1正向引物
<400> 106
ccagcatact tacagtggta 20
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV7 N1正向引物
<400> 107
gcacgtactc tgtcagtcgt t 21
<210> 108
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV8-1 N1正向引物
<400> 108
gtggaactgt taatctcttc tggta 25
<210> 109
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV8-2 N1正向引物
<400> 109
ctctcttctg gtatgtgcaa cacc 24
<210> 110
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV8-3 N1正向引物
<400> 110
ggcaacacct tatctcttct ggta 24
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV8-4 N1正向引物
<400> 111
ctcttctggt atgtgcaata 20
<210> 112
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV8-5 N1正向引物
<400> 112
gccatggcag aagaatgtgg att 23
<210> 113
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV8-6 N1正向引物
<400> 113
agtgtatctc ttctggtatg tgcaa 25
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV8-7 N1正向引物
<400> 114
ggagttcctt ctctcttctg gta 23
<210> 115
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV9-1 N1正向引物
<400> 115
gaaaccacac agtacccttc cctt 24
<210> 116
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV9-2 N1正向引物
<400> 116
aggataccct tcccttttct ggta 24
<210> 117
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV10 N1正向引物
<400> 117
tgagcccctt cagcaactta ag 22
<210> 118
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV11 N1正向引物
<400> 118
cactcttcaa tttccactgg ttccgg 26
<210> 119
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV12-1 N1正向引物
<400> 119
agtgcttctc agtctttctt ctgg 24
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV12-2 N1正向引物
<400> 120
ttcccagtcc ttcttctggt a 21
<210> 121
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV12-3 N1正向引物
<400> 121
ctctcaactg cacttacagc aac 23
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV13-1 N1正向引物
<400> 122
gcctcaaact acttcccttg gta 23
<210> 123
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV13-2 N1正向引物
<400> 123
cagcgcctca gactacttca ttt 23
<210> 124
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV14 N1正向引物
<400> 124
ggtctattct ggtacaagca gc 22
<210> 125
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV15 N1正向引物
<400> 125
taacttctac tggttctggc agggtc 26
<210> 126
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV16 N1正向引物
<400> 126
aactattcct attctgggag tcct 24
<210> 127
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV17 N1正向引物
<400> 127
gtggtataga caaaattcag gtagagg 27
<210> 128
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV18 N1正向引物
<400> 128
ctgcacttat cagtccagct attcaac 27
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV19 N1正向引物
<400> 129
ttctggtaca agcaaccacc 20
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV20 N1正向引物
<400> 130
cacagtcagc ggtttaagag g 21
<210> 131
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV21 N1正向引物
<400> 131
ctgatagcgc tatttacaac ctcc 24
<210> 132
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV22 N1正向引物
<400> 132
gcggtgcaat ttttctgact ctg 23
<210> 133
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV23 N1正向引物
<400> 133
ctgcgtttga ctactttcca tggta 25
<210> 134
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV24 N1正向引物
<400> 134
cccttccagc aatttttatg cc 22
<210> 135
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV25 N1正向引物
<400> 135
ccacgtactg caattcctca ac 22
<210> 136
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV26-1 N1正向引物
<400> 136
gtgtattggt atcgacagat tcactc 26
<210> 137
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV26-2 N1正向引物
<400> 137
tacattggta tcgacagctt ccctcc 26
<210> 138
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV27 N1正向引物
<400> 138
actgtgtact gcaactcctc aag 23
<210> 139
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV28 N1正向引物
<400> 139
tgttctattt acatgatccg tgtgc 25
<210> 140
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV29 N1正向引物
<400> 140
taccctgctg aaggtcctac at 22
<210> 141
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV30 N1正向引物
<400> 141
gcagttcctc caaggcttta ta 22
<210> 142
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV31 N1正向引物
<400> 142
cgtgaaactg gactgtgcat acaa 24
<210> 143
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV32 N1正向引物
<400> 143
tgacagttat acagatggag ctttg 25
<210> 144
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV33 N1正向引物
<400> 144
cgtacacttt atactggtac aagcaac 27
<210> 145
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV34 N1正向引物
<400> 145
ctcaccataa actgcacgtc atcaa 25
<210> 146
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV35 N1正向引物
<400> 146
gcatatttaa cacctggcta tggta 25
<210> 147
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV36 N1正向引物
<400> 147
gtgactaact ttcgaagcct acta 24
<210> 148
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV37 N1正向引物
<400> 148
gcccttcaga tttcttcagt ggttc 25
<210> 149
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV38-1 N1正向引物
<400> 149
gtgcaggagg cagagactgt ga 22
<210> 150
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV38-2 N1正向引物
<400> 150
tattctggta caagcagcct cc 22
<210> 151
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV39 N1正向引物
<400> 151
cacttcagac agactgtatt ggt 23
<210> 152
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV40 N1正向引物
<400> 152
acatacacat ccacggggt 19
<210> 153
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV41 N1正向引物
<400> 153
actcggtagg aataagtgcc ttac 24
<210> 154
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV2 N1正向引物
<400> 154
cttggggcag aaagtcgagt 20
<210> 155
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV3-1 N1正向引物
<400> 155
ggtcacacag atgggaaacg 20
<210> 156
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV4-1 N1正向引物
<400> 156
tggggcacag ggctatgta 19
<210> 157
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV4-2 N1正向引物
<400> 157
tacgcagaca ccaagacacc 20
<210> 158
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV4-3 N1正向引物
<400> 158
acgcagacac caagacacc 19
<210> 159
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV5-1 N1正向引物
<400> 159
agcaagtgac actgagctgc 20
<210> 160
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV5-3/5/6 N1正向引物
<400> 160
ccaaagtccc acacacctga 20
<210> 161
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV5-4 N1正向引物
<400> 161
tcacccaaag tcccacacac 20
<210> 162
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV5-7 N1正向引物
<400> 162
caaaacgaga ggacagcacg 20
<210> 163
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV5-8 N1正向引物
<400> 163
gcgactctga gatgctctcc 20
<210> 164
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV6-1/9 N1正向引物
<400> 164
gtgtgcccag gatatgaacc a 21
<210> 165
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV6-2/3/5/6/8 N1正向引物
<400> 165
gtatcgacaa gacccaggca 20
<210> 166
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV6-4 N1正向引物
<400> 166
tcacccaggc accaacatc 19
<210> 167
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV6-7 N1正向引物
<400> 167
atcgacaaga cccaggcaag 20
<210> 168
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV7-1 N1正向引物
<400> 168
gtccctgaga cacaaggtag c 21
<210> 169
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV7-2 N1正向引物
<400> 169
tctcccagtc ccccagtaac 20
<210> 170
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV7-3 N1正向引物
<400> 170
tctcccagac ccccagtaac 20
<210> 171
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV7-4 N1正向引物
<400> 171
ccccaaggta caaagtcgca 20
<210> 172
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV7-6/7 N1正向引物
<400> 172
tcccagtctc ccaggtacaa a 21
<210> 173
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV7-8 N1正向引物
<400> 173
cccctaggta caaagtcgca 20
<210> 174
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV7-9 N1正向引物
<400> 174
aaccgccttt attggtaccg a 21
<210> 175
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV9 N1正向引物
<400> 175
gatgctcccc taggtctgga 20
<210> 176
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV10-1 N1正向引物
<400> 176
atcacccaga gcccaagaca 20
<210> 177
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV10-2 N1正向引物
<400> 177
cagagacagg aaggcaggtg 20
<210> 178
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV10-3 N1正向引物
<400> 178
ctggtatcga caagacccgg 20
<210> 179
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV11-1 N1正向引物
<400> 179
accctttact ggtaccggca 20
<210> 180
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV11-2 N1正向引物
<400> 180
tctggccatg ctacccttta c 21
<210> 181
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV11-3 N1正向引物
<400> 181
gtggcttttt ggtgcaatcc 20
<210> 182
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV12-3 N1正向引物
<400> 182
acagacagac catgatgcgg 20
<210> 183
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV12-4 N1正向引物
<400> 183
cagacagacc atgatgcggg 20
<210> 184
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV12-5 N1正向引物
<400> 184
cagacaccaa ggcacaaggt 20
<210> 185
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV13 N1正向引物
<400> 185
agggaaacag ccactctgaa 20
<210> 186
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV14 N1正向引物
<400> 186
cccagccaca gcgtaataga 20
<210> 187
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV15 N1正向引物
<400> 187
aagccagtga ccctgagttg 20
<210> 188
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV16 N1正向引物
<400> 188
cgcccagact ccaaaacatc 20
<210> 189
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV17 N1正向引物
<400> 189
accgacagaa tctgaggcaa g 21
<210> 190
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV18 N1正向引物
<400> 190
ggaggcaaga ctgagatgca 20
<210> 191
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV19 N1正向引物
<400> 191
ggcaagggct gagattgatc 20
<210> 192
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV20-1 N1正向引物
<400> 192
gtgaagatcg agtgccgttc 20
<210> 193
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV23-1 N1正向引物
<400> 193
acccccgaaa aaggacatac t 21
<210> 194
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV24-1 N1正向引物
<400> 194
atgctgatgt tacccagacc c 21
<210> 195
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV25-1 N1正向引物
<400> 195
gttctcaaac catgggccat g 21
<210> 196
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV27 N1正向引物
<400> 196
tggtatcgac aagacccagg 20
<210> 197
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV28 N1正向引物
<400> 197
gtgaaagtaa cccagagctc g 21
<210> 198
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV29-1 N1正向引物
<400> 198
ttctggtacc gtcagcaacc 20
<210> 199
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV30 N1正向引物
<400> 199
gggaacatca aaccccaacc 20
<210> 200
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RORC N2正向引物
<400> 200
cagacgtgtg ctcttccgat ctacccaaga gaagcagaag tcg 43
<210> 201
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RUNX1 N2正向引物
<400> 201
cagacgtgtg ctcttccgat ctgaaaattc gtgcgtgggc tt 42
<210> 202
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RUNX3 N2正向引物
<400> 202
cagacgtgtg ctcttccgat ctcacctgct gcactcatct ga 42
<210> 203
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TBET N2正向引物
<400> 203
cagacgtgtg ctcttccgat ctggtcaggg aaaggactca cc 42
<210> 204
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GATA3 N2正向引物
<400> 204
cagacgtgtg ctcttccgat cttaaggtgg ttgtgctcgg ag 42
<210> 205
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDCD1 N2正向引物
<400> 205
cagacgtgtg ctcttccgat ctgcagaagt gcaggcacct a 41
<210> 206
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCL2 N2正向引物
<400> 206
cagacgtgtg ctcttccgat ctgctgatat tctgcaacac tgtaca 46
<210> 207
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCL6 N2正向引物
<400> 207
cagacgtgtg ctcttccgat ctgtaggcag acacagggac tt 42
<210> 208
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BIRC5 N2正向引物
<400> 208
cagacgtgtg ctcttccgat ctttgtctaa gtgcaaccgc ct 42
<210> 209
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCL14 N2正向引物
<400> 209
cagacgtgtg ctcttccgat ctcttaccac ccctcagagt gc 42
<210> 210
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCL17 N2正向引物
<400> 210
cagacgtgtg ctcttccgat ctctcacccc agactcctga ct 42
<210> 211
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCL18 N2正向引物
<400> 211
cagacgtgtg ctcttccgat ctgtcccatc tgctatgccc a 41
<210> 212
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCL20 N2正向引物
<400> 212
cagacgtgtg ctcttccgat cttccataag ctattttggt ttagtgc 47
<210> 213
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCL3 N2正向引物
<400> 213
cagacgtgtg ctcttccgat ctctctgaga gttcccctgt cc 42
<210> 214
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCL4 N2正向引物
<400> 214
cagacgtgtg ctcttccgat cttggaactg aactgagctg ct 42
<210> 215
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCR4 N2正向引物
<400> 215
cagacgtgtg ctcttccgat ctattctgta taacactcat atctttgcc 49
<210> 216
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCR7 N2正向引物
<400> 216
cagacgtgtg ctcttccgat ctctcttggc tccactggga tg 42
<210> 217
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD160 N2正向引物
<400> 217
cagacgtgtg ctcttccgat ctttgtgcag accaagagca cc 42
<210> 218
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD244 N2正向引物
<400> 218
cagacgtgtg ctcttccgat ctggaaagcg acaagggtga ac 42
<210> 219
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD27 N2正向引物
<400> 219
cagacgtgtg ctcttccgat ctcgtgacag agtgcctttt cg 42
<210> 220
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 N2正向引物
<400> 220
cagacgtgtg ctcttccgat cttgtagatg acctggcttg cc 42
<210> 221
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD30 N2正向引物
<400> 221
cagacgtgtg ctcttccgat cttgtttgcc cagtgtttgt gc 42
<210> 222
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD38 N2正向引物
<400> 222
cagacgtgtg ctcttccgat ctatcagcat acctttattg tgatctatc 49
<210> 223
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3D N2正向引物
<400> 223
cagacgtgtg ctcttccgat cttgatgtca ttgccactct gct 43
<210> 224
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3E N2正向引物
<400> 224
cagacgtgtg ctcttccgat ctctggggat ggactgggta aat 43
<210> 225
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD4 N2正向引物
<400> 225
cagacgtgtg ctcttccgat ctaccacttc cctcagtccc aa 42
<210> 226
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40LG N2正向引物
<400> 226
cagacgtgtg ctcttccgat ctgagtcagg ccgttgctag tc 42
<210> 227
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD5 N2正向引物
<400> 227
cagacgtgtg ctcttccgat ctaggtcaca gatcttcccc cg 42
<210> 228
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD69 N2正向引物
<400> 228
cagacgtgtg ctcttccgat ctagtgttgg aaaatgtgca atatgtg 47
<210> 229
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8A N2正向引物
<400> 229
cagacgtgtg ctcttccgat ctatgcctgc ccattggaga gaa 43
<210> 230
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8B N2正向引物
<400> 230
cagacgtgtg ctcttccgat ctgctgtcca gttcccagaa gg 42
<210> 231
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDCA7 N2正向引物
<400> 231
cagacgtgtg ctcttccgat ctatgtaaac cattgctgtg ccatt 45
<210> 232
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CSF2 N2正向引物
<400> 232
cagacgtgtg ctcttccgat ctggccacac tgaccctgat ac 42
<210> 233
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CX3CR1 N2正向引物
<400> 233
cagacgtgtg ctcttccgat cttgttttcc tcttaacgtt agaccac 47
<210> 234
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CXCL12 N2正向引物
<400> 234
cagacgtgtg ctcttccgat ctctcattct gaaggagccc cat 43
<210> 235
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CXCL13 N2正向引物
<400> 235
cagacgtgtg ctcttccgat ctgcattcga agatccccag actt 44
<210> 236
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CXCR3 N2正向引物
<400> 236
cagacgtgtg ctcttccgat ctccaatatc ctcgctcccg g 41
<210> 237
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CXCR5 N2正向引物
<400> 237
cagacgtgtg ctcttccgat cttcctcgca agctgggtaa tc 42
<210> 238
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EOMES N2正向引物
<400> 238
cagacgtgtg ctcttccgat ctactaactt gaaccgtgtt taagg 45
<210> 239
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAS N2正向引物
<400> 239
cagacgtgtg ctcttccgat ctcccccatt tccccgatgt 40
<210> 240
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FASLG N2正向引物
<400> 240
cagacgtgtg ctcttccgat ctgcatatcc tgagccatcg gt 42
<210> 241
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOSL1 N2正向引物
<400> 241
cagacgtgtg ctcttccgat ctggtgattg gaccaggcca tt 42
<210> 242
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXP3 N2正向引物
<400> 242
cagacgtgtg ctcttccgat ctgggtctct tgagtcccgt g 41
<210> 243
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH N2正向引物
<400> 243
cagacgtgtg ctcttccgat ctgccctcaa cgaccacttt gt 42
<210> 244
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GZMA N2正向引物
<400> 244
cagacgtgtg ctcttccgat ctcctttgtt gtgcgagggt gt 42
<210> 245
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GZMB N2正向引物
<400> 245
cagacgtgtg ctcttccgat ctaggccctc ttgtgtgtaa ca 42
<210> 246
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GZMH N2正向引物
<400> 246
cagacgtgtg ctcttccgat ctccaaagaa gacacagacc ggt 43
<210> 247
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GZMK N2正向引物
<400> 247
cagacgtgtg ctcttccgat ctaaagcaac cttgtcccgc ct 42
<210> 248
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-DRA N2正向引物
<400> 248
cagacgtgtg ctcttccgat ctgcctcttc gattgctccg ta 42
<210> 249
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IFNG N2正向引物
<400> 249
cagacgtgtg ctcttccgat ctcctgcaat ctgagccagt gc 42
<210> 250
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL10 N2正向引物
<400> 250
cagacgtgtg ctcttccgat ctttcaattc ctctgggaat gtt 43
<210> 251
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL12A N2正向引物
<400> 251
cagacgtgtg ctcttccgat ctgaactagg gagggggaaa gaag 44
<210> 252
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL12B N2正向引物
<400> 252
cagacgtgtg ctcttccgat cttcctcacc cccacctctc ta 42
<210> 253
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL13 N2正向引物
<400> 253
cagacgtgtg ctcttccgat cttgctacct cactggggtc ct 42
<210> 254
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL17A N2正向引物
<400> 254
cagacgtgtg ctcttccgat ctgcccctca gagatcaaca gac 43
<210> 255
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL17F N2正向引物
<400> 255
cagacgtgtg ctcttccgat ctcttaccca gtgctctgca ac 42
<210> 256
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL1A N2正向引物
<400> 256
cagacgtgtg ctcttccgat ctgcattttg gtccaagttg tgc 43
<210> 257
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL1B N2正向引物
<400> 257
cagacgtgtg ctcttccgat ctacattctg atgagcaacc gc 42
<210> 258
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2 N2正向引物
<400> 258
cagacgtgtg ctcttccgat ctaagcatca tctcaacact gactt 45
<210> 259
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL21 N2正向引物
<400> 259
cagacgtgtg ctcttccgat ctctgccagc tccagaagat gt 42
<210> 260
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL21R N2正向引物
<400> 260
cagacgtgtg ctcttccgat ctagacaaga gctggctcac ct 42
<210> 261
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL22 N2正向引物
<400> 261
cagacgtgtg ctcttccgat ctggaaacca atgccacttt tgt 43
<210> 262
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL23R N2正向引物
<400> 262
cagacgtgtg ctcttccgat ctctggccaa tatgctgaaa ccc 43
<210> 263
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL24 N2正向引物
<400> 263
cagacgtgtg ctcttccgat ctgcccagtg agactgtgtt gt 42
<210> 264
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL26 N2正向引物
<400> 264
cagacgtgtg ctcttccgat cttgtgtgtg gagtgggatg tg 42
<210> 265
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL3 N2正向引物
<400> 265
cagacgtgtg ctcttccgat ctatttcacc ttttcctgcg gc 42
<210> 266
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL31 N2正向引物
<400> 266
cagacgtgtg ctcttccgat ctgtgtggga actctgccgt g 41
<210> 267
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL32 N2正向引物
<400> 267
cagacgtgtg ctcttccgat cttgctctga accccaatcc tc 42
<210> 268
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL33R N2正向引物
<400> 268
cagacgtgtg ctcttccgat ctaggtacca aatgcctgtg cc 42
<210> 269
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL4 N2正向引物
<400> 269
cagacgtgtg ctcttccgat ctcgggcttg aattcctgtc ct 42
<210> 270
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL4R N2正向引物
<400> 270
cagacgtgtg ctcttccgat cttcctcgta tgcatggaac cc 42
<210> 271
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL5 N2正向引物
<400> 271
cagacgtgtg ctcttccgat ctaggcatac tgacactttg cc 42
<210> 272
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL6 N2正向引物
<400> 272
cagacgtgtg ctcttccgat ctggaaagtg gctatgcagt ttg 43
<210> 273
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL6R N2正向引物
<400> 273
cagacgtgtg ctcttccgat ctacagcatg tcacaaggct gt 42
<210> 274
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRF4 N2正向引物
<400> 274
cagacgtgtg ctcttccgat ctgcccccaa atgaaagctt ga 42
<210> 275
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LAG3 N2正向引物
<400> 275
cagacgtgtg ctcttccgat ctctttggag aagacagtgg cga 43
<210> 276
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LIF N2正向引物
<400> 276
cagacgtgtg ctcttccgat ctttgccggc tctccagagt a 41
<210> 277
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LTA N2正向引物
<400> 277
cagacgtgtg ctcttccgat ctggagaaac agagacaggc cc 42
<210> 278
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCL1 N2正向引物
<400> 278
cagacgtgtg ctcttccgat cttttgctta gaaggatggc gc 42
<210> 279
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MKI67 N2正向引物
<400> 279
cagacgtgtg ctcttccgat cttcctgccc caccaagatc at 42
<210> 280
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MYC N2正向引物
<400> 280
cagacgtgtg ctcttccgat ctcaaccttg gctgagtctt ga 42
<210> 281
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NKG2D N2正向引物
<400> 281
cagacgtgtg ctcttccgat ctccaccctc cacaggaaat tg 42
<210> 282
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PRDM1 N2正向引物
<400> 282
cagacgtgtg ctcttccgat ctacatgtga atgttgagcc ca 42
<210> 283
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PRF1 N2正向引物
<400> 283
cagacgtgtg ctcttccgat ctcatggcca cgttgtcatt gt 42
<210> 284
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTPRCv1 N2正向引物
<400> 284
cagacgtgtg ctcttccgat cttaccagga atggatgtcg ctaatca 47
<210> 285
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTPRCv2 N2正向引物
<400> 285
cagacgtgtg ctcttccgat cttagttggc tatgctggca tg 42
<210> 286
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP30 N2正向引物
<400> 286
cagacgtgtg ctcttccgat cttcactagg agacgtggaa ttg 43
<210> 287
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SELL N2正向引物
<400> 287
cagacgtgtg ctcttccgat ctcctgcccc cagacctttt atc 43
<210> 288
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TBX21 N2正向引物
<400> 288
cagacgtgtg ctcttccgat ctagaaaagg ggctggaaag gg 42
<210> 289
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFB1 N2正向引物
<400> 289
cagacgtgtg ctcttccgat ctaccttggg cactgttgaa gt 42
<210> 290
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF N2正向引物
<400> 290
cagacgtgtg ctcttccgat ctggctcaga catgttttcc gtg 43
<210> 291
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFRSF9 N2正向引物
<400> 291
cagacgtgtg ctcttccgat ctttttgatg tgaggggcgg at 42
<210> 292
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TYMS N2正向引物
<400> 292
cagacgtgtg ctcttccgat ctatgtgcat ttcaatccca cgtac 45
<210> 293
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UHRF1 N2正向引物
<400> 293
cagacgtgtg ctcttccgat ctccaaagtt tgcagcctat acc 43
<210> 294
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ZBED2 N2正向引物
<400> 294
cagacgtgtg ctcttccgat ctggttttgg tggagctgac ga 42
<210> 295
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ZNF683 N2正向引物
<400> 295
cagacgtgtg ctcttccgat ctatccacct gaagctgcac c 41
<210> 296
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV1-1 N2正向引物
<400> 296
cagacgtgtg ctcttccgat ctccttagtc gctctgatag ttatgg 46
<210> 297
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV1-2-01 N2正向引物
<400> 297
cagacgtgtg ctcttccgat ctcgaagcac ccacatttct gtctta 46
<210> 298
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV1-2-02 N2正向引物
<400> 298
cagacgtgtg ctcttccgat ctgtcggtct aaagggtaca gttacc 46
<210> 299
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV2 N2正向引物
<400> 299
cagacgtgtg ctcttccgat ctcagggacg atacaacatg acctat 46
<210> 300
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV3 N2正向引物
<400> 300
cagacgtgtg ctcttccgat ctaacaagag ccaaacctcc ttcc 44
<210> 301
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV4 N2正向引物
<400> 301
cagacgtgtg ctcttccgat ctagaaagtc cagcactctg agcct 45
<210> 302
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV5 N2正向引物
<400> 302
cagacgtgtg ctcttccgat ctcgcattgc agacacccag actg 44
<210> 303
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV6 N2正向引物
<400> 303
cagacgtgtg ctcttccgat ctggtcacct ttgataccac cctta 45
<210> 304
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV7 N2正向引物
<400> 304
cagacgtgtg ctcttccgat ctacagccgt gcagcctgaa gattca 46
<210> 305
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV8-1 N2正向引物
<400> 305
cagacgtgtg ctcttccgat ctaggaaacc ctctgtgcag tgg 43
<210> 306
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV8-2 N2正向引物
<400> 306
cagacgtgtg ctcttccgat ctcatatgag cgacgcggct gagtac 46
<210> 307
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV8-3 N2正向引物
<400> 307
cagacgtgtg ctcttccgat ctggaaaccc tctgtgcatt gg 42
<210> 308
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV8-4 N2正向引物
<400> 308
cagacgtgtg ctcttccgat cttatgagcg acgcggctga gta 43
<210> 309
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV8-5 N2正向引物
<400> 309
cagacgtgtg ctcttccgat ctgacactta tcacttcccc aatcaa 46
<210> 310
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV8-6 N2正向引物
<400> 310
cagacgtgtg ctcttccgat ctaccctcag tccatataag cgacac 46
<210> 311
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV8-7 N2正向引物
<400> 311
cagacgtgtg ctcttccgat ctaagaagag cgaaacctcc ttcta 45
<210> 312
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV9-1 N2正向引物
<400> 312
cagacgtgtg ctcttccgat ctgaagccat gtaccgtaaa gaaac 45
<210> 313
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV9-2 N2正向引物
<400> 313
cagacgtgtg ctcttccgat ctttggagaa aggctcagtt caag 44
<210> 314
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV10 N2正向引物
<400> 314
cagacgtgtg ctcttccgat ctagcctccc agctcagcga ttca 44
<210> 315
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV11 N2正向引物
<400> 315
cagacgtgtg ctcttccgat ctgtttggaa tatcgcagcc tctca 45
<210> 316
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV12-1 N2正向引物
<400> 316
cagacgtgtg ctcttccgat ctgagactcc aagctcagtg attc 44
<210> 317
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV12-2 N2正向引物
<400> 317
cagacgtgtg ctcttccgat ctgactccca gcccagtgat tc 42
<210> 318
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV12-3 N2正向引物
<400> 318
cagacgtgtg ctcttccgat ctaggtttac agcacaggtc gataa 45
<210> 319
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV13-1 N2正向引物
<400> 319
cagacgtgtg ctcttccgat ctcaaacatt tctccctgca catc 44
<210> 320
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV13-2 N2正向引物
<400> 320
cagacgtgtg ctcttccgat ctcagtgaaa catctctctc tgcaaat 47
<210> 321
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV14 N2正向引物
<400> 321
cagacgtgtg ctcttccgat ctatccgcca accttgtcat ct 42
<210> 322
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV15 N2正向引物
<400> 322
cagacgtgtg ctcttccgat ctggtctctc atcctggaga ttca 44
<210> 323
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV16 N2正向引物
<400> 323
cagacgtgtg ctcttccgat ctgagacatc tttccacctg aagaa 45
<210> 324
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV17 N2正向引物
<400> 324
cagacgtgtg ctcttccgat cttccaagaa aagcagttcc ttgttg 46
<210> 325
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV18 N2正向引物
<400> 325
cagacgtgtg ctcttccgat ctagaggttt tcaggccagt cctat 45
<210> 326
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV19 N2正向引物
<400> 326
cagacgtgtg ctcttccgat ctacaagtcg tggactcagc agtata 46
<210> 327
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV20 N2正向引物
<400> 327
cagacgtgtg ctcttccgat cttgcacatc acagccccta a 41
<210> 328
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV21 N2正向引物
<400> 328
cagacgtgtg ctcttccgat ctatgcctcg ctggataaat catcag 46
<210> 329
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV22 N2正向引物
<400> 329
cagacgtgtg ctcttccgat ctctcttccc agaccacaga ctc 43
<210> 330
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV23 N2正向引物
<400> 330
cagacgtgtg ctcttccgat ctgccaagca gttctcattg catatc 46
<210> 331
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV24 N2正向引物
<400> 331
cagacgtgtg ctcttccgat ctaccaagga gggttacagc tatttg 46
<210> 332
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV25 N2正向引物
<400> 332
cagacgtgtg ctcttccgat ctcacatcac agccacccag actac 45
<210> 333
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV26-1 N2正向引物
<400> 333
cagacgtgtg ctcttccgat ctgacagaaa gtccagcacc ttgatc 46
<210> 334
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV26-2 N2正向引物
<400> 334
cagacgtgtg ctcttccgat cttctctggc aatcgctgaa gac 43
<210> 335
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV27 N2正向引物
<400> 335
cagacgtgtg ctcttccgat ctaaggacag ttctctccac atcac 45
<210> 336
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV28 N2正向引物
<400> 336
cagacgtgtg ctcttccgat ctactttatg gccacctata catcag 46
<210> 337
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV29 N2正向引物
<400> 337
cagacgtgtg ctcttccgat ctcagcctgg agactctgca gtgtact 47
<210> 338
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV30 N2正向引物
<400> 338
cagacgtgtg ctcttccgat ctcagcaaag ctccctgtac ct 42
<210> 339
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV31 N2正向引物
<400> 339
cagacgtgtg ctcttccgat ctcacagcca gaagacctgc aacat 45
<210> 340
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV32 N2正向引物
<400> 340
cagacgtgtg ctcttccgat ctaacatgtc tccctgcata ttacag 46
<210> 341
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV33 N2正向引物
<400> 341
cagacgtgtg ctcttccgat ctttcatcaa cctcaccatc aattcc 46
<210> 342
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV34 N2正向引物
<400> 342
cagacgtgtg ctcttccgat ctcagcaaag ttccctgcat atcac 45
<210> 343
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV35 N2正向引物
<400> 343
cagacgtgtg ctcttccgat ctataaccag aaaggacagc ttcc 44
<210> 344
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV36 N2正向引物
<400> 344
cagacgtgtg ctcttccgat ctatcacagc cacccagacc ggagact 47
<210> 345
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV37 N2正向引物
<400> 345
cagacgtgtg ctcttccgat ctagattcac agccaggctt aaaa 44
<210> 346
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV38-1 N2正向引物
<400> 346
cagacgtgtg ctcttccgat ctttccagaa agcagccaaa tcc 43
<210> 347
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV38-2 N2正向引物
<400> 347
cagacgtgtg ctcttccgat ctcttccaga aagcagccaa atcc 44
<210> 348
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV39 N2正向引物
<400> 348
cagacgtgtg ctcttccgat ctctcagcac cctccacatc ac 42
<210> 349
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV40 N2正向引物
<400> 349
cagacgtgtg ctcttccgat ctcaaaaact tcggaggcgg aaatat 46
<210> 350
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAV41 N2正向引物
<400> 350
cagacgtgtg ctcttccgat ctaaagcaca gctccctgca catcac 46
<210> 351
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV2? N2正向引物
<400> 351
cagacgtgtg ctcttccgat cttcaaattt cactctgaag atccggtcca caa 53
<210> 352
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV3-1 N2正向引物
<400> 352
cagacgtgtg ctcttccgat ctgctcactt aaatcttcac atcaattccc tgg 53
<210> 353
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV4-1 N2正向引物
<400> 353
cagacgtgtg ctcttccgat ctcttaaacc ttcacctaca cgccctgc 48
<210> 354
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV（4-2、4-3）? N2正向引物
<400> 354
cagacgtgtg ctcttccgat ctcttattcc ttcacctaca caccctgc 48
<210> 355
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV5-1? N2正向引物
<400> 355
cagacgtgtg ctcttccgat ctgctctgag atgaatgtga gcaccttg 48
<210> 356
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV5-3? N2正向引物
<400> 356
cagacgtgtg ctcttccgat ctgctctgag atgaatgtga gtgccttg 48
<210> 357
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV（5-4、5-5、5-6、5-7、5-8）N2正向引物
<400> 357
cagacgtgtg ctcttccgat ctgctctgag ctgaatgtga acgccttg 48
<210> 358
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV6-1 N2正向引物
<400> 358
cagacgtgtg ctcttccgat cttcgctcag gctggagtcg gctg 44
<210> 359
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV（6-2、6-3）N2正向引物
<400> 359
cagacgtgtg ctcttccgat ctgctggggt tggagtcggc tg 42
<210> 360
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV6-4? N2正向引物
<400> 360
cagacgtgtg ctcttccgat ctccctcacg ttggcgtctg ctg 43
<210> 361
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV6-5? N2正向引物
<400> 361
cagacgtgtg ctcttccgat ctgctcaggc tgctgtcggc tg 42
<210> 362
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV6-6? N2正向引物
<400> 362
cagacgtgtg ctcttccgat ctcgctcagg ctggagttgg ctg 43
<210> 363
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV6-7? N2正向引物
<400> 363
cagacgtgtg ctcttccgat ctcccctcaa gctggagtca gctg 44
<210> 364
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV6-8 N2正向引物
<400> 364
cagacgtgtg ctcttccgat ctcactcagg ctggtgtcgg ctg 43
<210> 365
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ?TRBV6-9? N2正向引物
<400> 365
cagacgtgtg ctcttccgat ctcgctcagg ctggagtcag ctg 43
<210> 366
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV7-1? N2正向引物
<400> 366
cagacgtgtg ctcttccgat ctccactctg aagttccagc gcacac 46
<210> 367
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV7-2? N2正向引物
<400> 367
cagacgtgtg ctcttccgat ctcactctga cgatccagcg cacac 45
<210> 368
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV7-3? N2正向引物
<400> 368
cagacgtgtg ctcttccgat ctctctactc tgaagatcca gcgcacag 48
<210> 369
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV7-4? N2正向引物
<400> 369
cagacgtgtg ctcttccgat ctccactctg aagatccagc gcacag 46
<210> 370
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV7-6? N2正向引物
<400> 370
cagacgtgtg ctcttccgat ctcactctga cgatccagcg cacag 45
<210> 371
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV7-7? N2正向引物
<400> 371
cagacgtgtg ctcttccgat ctccactctg acgattcagc gcacag 46
<210> 372
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV7-8? N2正向引物
<400> 372
cagacgtgtg ctcttccgat ctccactctg aagatccagc gcacac 46
<210> 373
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV7-9? N2正向引物
<400> 373
cagacgtgtg ctcttccgat ctcaccttgg agatccagcg cacag 45
<210> 374
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV9? N2正向引物
<400> 374
cagacgtgtg ctcttccgat ctgcactctg aactaaacct gagctctctg 50
<210> 375
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV10-1 N2正向引物
<400> 375
cagacgtgtg ctcttccgat ctcccctcac tctggagtct gctg 44
<210> 376
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV10-2? N2正向引物
<400> 376
cagacgtgtg ctcttccgat ctccccctca ctctggagtc agcta 45
<210> 377
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV10-3 N2正向引物
<400> 377
cagacgtgtg ctcttccgat ctcctcctca ctctggagtc cgcta 45
<210> 378
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV（11-1、11-3）N2正向引物
<400> 378
cagacgtgtg ctcttccgat ctccactctc aagatccagc ctgcag 46
<210> 379
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV11-2 N2正向引物
<400> 379
cagacgtgtg ctcttccgat ctctccactc tcaagatcca gcctgcaa 48
<210> 380
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV（12-3、12-4、12-5）N2正向引物
<400> 380
cagacgtgtg ctcttccgat ctccactctg aagatccagc cctcag 46
<210> 381
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV13 N2正向引物
<400> 381
cagacgtgtg ctcttccgat ctcattctga actgaacatg agctccttgg 50
<210> 382
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV14 N2正向引物
<400> 382
cagacgtgtg ctcttccgat ctctactctg aaggtgcagc ctgcag 46
<210> 383
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV15 N2正向引物
<400> 383
cagacgtgtg ctcttccgat ctgataactt ccaatccagg aggccgaaca 50
<210> 384
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV16 N2正向引物
<400> 384
cagacgtgtg ctcttccgat ctctgtagcc ttgagatcca ggctacga 48
<210> 385
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV17 N2正向引物
<400> 385
cagacgtgtg ctcttccgat ctcttccacg ctgaagatcc atcccg 46
<210> 386
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV18 N2正向引物
<400> 386
cagacgtgtg ctcttccgat ctgcatcctg aggatccagc aggtag 46
<210> 387
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV19 N2正向引物
<400> 387
cagacgtgtg ctcttccgat ctcctctcac tgtgacatcg gccc 44
<210> 388
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV20-1 N2正向引物
<400> 388
cagacgtgtg ctcttccgat ctcttgtcca ctctgacagt gaccagtg 48
<210> 389
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV23-1 N2正向引物
<400> 389
cagacgtgtg ctcttccgat ctcagcctgg caatcctgtc ctcag 45
<210> 390
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV24-1 N2正向引物
<400> 390
cagacgtgtg ctcttccgat ctctccctgt ccctagagtc tgccat 46
<210> 391
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV25-1 N2正向引物
<400> 391
cagacgtgtg ctcttccgat ctccctgacc ctggagtctg cca 43
<210> 392
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV27 N2正向引物
<400> 392
cagacgtgtg ctcttccgat ctccctgatc ctggagtcgc cca 43
<210> 393
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV28 N2正向引物
<400> 393
cagacgtgtg ctcttccgat ctctccctga ttctggagtc cgcca 45
<210> 394
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV29-1 N2正向引物
<400> 394
cagacgtgtg ctcttccgat ctctaacatt ctcaactctg actgtgagca aca 53
<210> 395
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRBV30 N2正向引物
<400> 395
cagacgtgtg ctcttccgat ctcggcagtt catcctgagt tctaagaagc 50
<210> 396
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG CH1反向重链
<400> 396
accaggcatc ccagggtcac catggagt 28
<210> 397
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 701/mIGHV5-6-5*01重链
<400> 397
gaagtgaagc tggtggagtc tggggga 27
<210> 398
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 702/mIGHV1-72*01重链
<400> 398
caggtccaac tgcagcagcc tggggct 27
<210> 399
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 703/mIGHV1-9*01重链
<400> 399
caggttcagc tgcagcagtc tggagct 27
<210> 400
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 704/mIGHV1-14*01重链
<400> 400
gagttccagc tgcagcagtc tggacct 27
<210> 401
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 705/mIGHV14-3*02重链
<400> 401
gaggttcagc tgcagcagtc tggggca 27
<210> 402
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 706/mIGHV9-3-1*01重链
<400> 402
cagatccagt tggtgcagtc tggacct 27
<210> 403
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 707/mIGHV2-9-1*01重链
<400> 403
caggtgcagc tgaaggagtc aggacct 27
<210> 404
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 708/mIGHV3-6*02重链
<400> 404
gatgtacagc ttcaggagtc aggacct 27
<210> 405
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 772/IGHV8-12*01重链
<400> 405
caggttactc tgaaagagtc tggccct 27
<210> 406
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG CK反向轻链
<400> 406
gaggcacctc cagatgttaa ctgctca 27
<210> 407
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 728/mIGKV4-59*01轻链
<400> 407
caaattgttc tcacccagtc tcca 24
<210> 408
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 729/mIGKV4-72*01轻链
<400> 408
caaattgttc tctcccagtc tcca 24
<210> 409
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 730/mIGKV3-2*01轻链
<400> 409
gacattgtgc tgacccaatc tcca 24
<210> 410
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 731/mIGKV6-23*01轻链
<400> 410
gacattgtga tgacccagtc tca 23
<210> 411
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 732/mIGKV8-28*01轻链
<400> 411
gacattgtga tgacccagtc tcca 24
<210> 412
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 733/mIGKV12-41*01轻链
<400> 412
gacatccaga tgactcagtc tcca 24
<210> 413
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 734/mIGKV10-94*01轻链
<400> 413
gatatccaga tgacacagac taca 24
<210> 414
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 735/mIGKV14-111*01轻链
<400> 414
gacatcaaga tgacccagtc tcca 24
<210> 415
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 736/mIGKV1-110*01轻链
<400> 415
gatgttgtga tgacccaaac tcca 24
<210> 416
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 766/IGKV2-137*01轻链
<400> 416
gatattgtga tgactcaggc tgca 24
<210> 417
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 767/IGKV5-43*01轻链
<400> 417
gatattgtgc taactcagtc tcca 24
<210> 418
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 768/IGKV11-125*01轻链
<400> 418
gatgtccaga tgattcagtc tcca 24
<210> 419
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 769/IGKV13-84*01轻链
<400> 419
gacatccaga tgacacaatc ttca 24
<210> 420
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 770/IGKV15-101*01轻链
<400> 420
aatacccaga tgaaccagac tcca 24
<210> 421
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 771/IGKV18-36*01轻链
<400> 421
actggcgaaa caacacaggc tcca 24
<210> 422
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCRa CDR3
<400> 422
Cys Ala Gly Gly Val Val Leu Arg Asn Ser Gly Asn Thr Pro Leu Val
1 5 10 15
Phe
<210> 423
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCRb CDR3
<400> 423
Cys Ala Ser Ser Glu Gly Phe Gln Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10

Claims (17)

1.一种标记样品中的核酸的方法，所述方法包括：
将靶标与包含通用衔接序列和靶标特异性序列的第一寡核苷酸杂交，其中所述靶标是mRNA分子；
延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；
将所述第一核苷酸序列与第二寡核苷酸杂交；
延伸所述第二寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；
将所述第二核苷酸序列与包含第一扩增引物的序列和所述通用衔接序列的第三寡核苷酸杂交，其中所述第三寡核苷酸包含分子标记，其中所述分子标记位于所述第一扩增引物的序列和所述通用衔接序列之间；
延伸所述第三寡核苷酸以生成第三核苷酸序列；并且
使用第一扩增引物和第二扩增引物来扩增所述第三核苷酸序列以生成多个第四核苷酸序列，其中所述第二扩增引物与所述第三核苷酸序列特异性结合以形成所述第三核苷酸序列的互补链，并且所述第一扩增引物与所述第三核苷酸序列的互补链特异性结合；
其中所述多个第四核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和所述分子标记；其中所述分子标记包含为靶核酸物质的出现次数提供计数的核酸序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是单细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述mRNA分子编码T细胞受体的α链或β链。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述靶标特异性序列特异性地结合所述T细胞受体的α链的C区或β链的C区。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述第二扩增引物特异性地结合选自以下的区域：T细胞受体的α链的V区或β链的V区、T细胞受体的α链的V和D区接合点或β链的V和D区接合点、或其组合。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸特异性地结合选自以下的区域：T细胞受体的α链的V区或β链的V区、T细胞受体的α链的V和D区接合点或β链的V和D区接合点、或其组合。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸或所述第三寡核苷酸被连接到固体支持物上。
8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述样品包含所述靶标的多个拷贝。
9.如权利要求8所述的方法，包括通过计数与所述靶标相缔合的不同分子标记来计数所述靶标的多个拷贝的数目。
10.一种标记样品中的靶标以用于定量所述靶标的方法，所述方法包括：
将所述靶标与包含第一通用衔接序列和靶标特异性序列的第一寡核苷酸杂交，其中所述靶标是mRNA分子；
延伸所述第一寡核苷酸以生成第一核苷酸序列；
将所述第一核苷酸序列与包含第二通用衔接序列和第二靶标特异性序列的第二寡核苷酸杂交；
延伸所述第二寡核苷酸以生成第二核苷酸序列；
将所述第二核苷酸序列与包含第一扩增引物的序列和所述第一通用衔接序列的第三寡核苷酸杂交；
延伸所述第三寡核苷酸以生成第三核苷酸序列；
将所述第三核苷酸序列与包含第二扩增引物的序列和所述第二通用衔接序列的第四寡核苷酸杂交，其中所述第三寡核苷酸和所述第四寡核苷酸中的一个或两个包含分子标记，其中所述分子标记位于所述扩增引物的序列和所述通用衔接序列之间；
延伸所述第四寡核苷酸以生成第四核苷酸序列；并且
使用第一扩增引物和第二扩增引物来扩增所述第四核苷酸序列以生成多个第五核苷酸序列，
其中所述多个第五核苷酸序列中的每一个包含所述靶标和所述分子标记；其中所述分子标记包含为靶核酸物质的出现次数提供计数的核酸序列。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述样品是单细胞。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述mRNA分子编码T细胞受体的α链或β链。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述靶标特异性序列特异性地结合所述T细胞受体的α链的C区或β链的C区。
14.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述第二靶标特异性序列特异性地结合选自以下的区域：T细胞受体的 α链的V区或β链的V区、T细胞受体的α链的V和D区接合点或β链的V和D区接合点、或其组合。
15.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述第三寡核苷酸包含所述分子标记。
16.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述第四寡核苷酸包含所述分子标记。
17.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述第三寡核苷酸和所述第四寡核苷酸中的每一个包含所述分子标记。
CN201680007351.2A 2015-02-27 2016-02-26 用于条形编码核酸以用于测序的方法和组合物 Active CN107208157B (zh)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562126397P 2015-02-27 2015-02-27
US62/126,397 2015-02-27
US201562128849P 2015-03-05 2015-03-05
US62/128,849 2015-03-05
US201562160976P 2015-05-13 2015-05-13
US62/160,976 2015-05-13
US201562173899P 2015-06-10 2015-06-10
US62/173,899 2015-06-10
US201562194075P 2015-07-17 2015-07-17
US62/194,075 2015-07-17
PCT/US2016/019971 WO2016138500A1 (en) 2015-02-27 2016-02-26 Methods and compositions for barcoding nucleic acids for sequencing

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107208157A CN107208157A (zh) 2017-09-26
CN107208157B true CN107208157B (zh) 2022-04-05

Family

ID=55543072

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680007351.2A Active CN107208157B (zh) 2015-02-27 2016-02-26 用于条形编码核酸以用于测序的方法和组合物

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20160257993A1 (zh)
EP (1) EP3262189B1 (zh)
CN (1) CN107208157B (zh)
ES (1) ES2906221T3 (zh)
WO (1) WO2016138500A1 (zh)

Families Citing this family (127)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10081839B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US10083273B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
WO2011041485A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Gene Security Network, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
PL2556171T3 (pl) 2010-04-05 2016-04-29 Prognosys Biosciences Inc Oznaczenia biologiczne kodowane przestrzennie
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
EP2854057B1 (en) 2010-05-18 2018-03-07 Natera, Inc. Methods for non-invasive pre-natal ploidy calling
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
RU2620959C2 (ru) 2010-12-22 2017-05-30 Натера, Инк. Способы неинвазивного пренатального установления отцовства
WO2012108920A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Natera, Inc Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
GB2504240B (en) 2012-02-27 2015-05-27 Cellular Res Inc Compositions and kits for molecular counting of nucleic acids
CN118240918A (zh) 2013-06-25 2024-06-25 普罗格诺西斯生物科学公司 采用微流控装置的空间编码生物分析
JP6545682B2 (ja) 2013-08-28 2019-07-17 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 大規模並列単一細胞分析
US10262755B2 (en) 2014-04-21 2019-04-16 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
US10577655B2 (en) 2013-09-27 2020-03-03 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
US9582877B2 (en) 2013-10-07 2017-02-28 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
CN109971852A (zh) 2014-04-21 2019-07-05 纳特拉公司 检测染色体片段中的突变和倍性
CN107250379B (zh) 2015-02-19 2021-12-28 贝克顿迪金森公司 结合蛋白质组信息和基因组信息的高通量单细胞分析
EP3262192B1 (en) 2015-02-27 2020-09-16 Becton, Dickinson and Company Spatially addressable molecular barcoding
ES2934982T3 (es) 2015-03-30 2023-02-28 Becton Dickinson Co Métodos para la codificación con códigos de barras combinatorios
EP4119677B1 (en) 2015-04-10 2023-06-28 Spatial Transcriptomics AB Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
US11390914B2 (en) 2015-04-23 2022-07-19 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for whole transcriptome amplification
WO2016183106A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
WO2016196229A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Cellular Research, Inc. Methods for rna quantification
CN108026524A (zh) 2015-09-11 2018-05-11 赛卢拉研究公司 用于核酸文库标准化的方法和组合物
AU2017261189B2 (en) * 2016-05-02 2023-02-09 Becton, Dickinson And Company Accurate molecular barcoding
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
EP3465502B1 (en) 2016-05-26 2024-04-10 Becton, Dickinson and Company Molecular label counting adjustment methods
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
EP3472359B1 (en) 2016-06-21 2022-03-16 10X Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing
US10704082B2 (en) 2016-09-15 2020-07-07 ArcherDX, Inc. Methods of nucleic acid sample preparation
US10683531B2 (en) 2016-09-15 2020-06-16 ArcherDX, Inc. Methods of nucleic acid sample preparation for analysis of cell-free DNA
CN109890983A (zh) * 2016-09-23 2019-06-14 生命技术公司 用于评估免疫应答的组合物和方法
KR102522023B1 (ko) 2016-09-26 2023-04-17 셀룰러 리서치, 인크. 바코딩된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 시약을 이용한 단백질 발현의 측정
WO2018067517A1 (en) 2016-10-04 2018-04-12 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
EP4198140A1 (en) * 2016-11-02 2023-06-21 ArcherDX, LLC Methods of nucleic acid sample preparation for immune repertoire sequencing
JP7228510B2 (ja) 2016-11-08 2023-02-24 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 細胞標識分類の方法
EP3539035B1 (en) 2016-11-08 2024-04-17 Becton, Dickinson and Company Methods for expression profile classification
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CA3050127A1 (en) * 2017-01-12 2018-07-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods for analyzing t cell receptors and b cell receptors
WO2018132610A1 (en) 2017-01-13 2018-07-19 Cellular Research, Inc. Hydrophilic coating of fluidic channels
US11319583B2 (en) 2017-02-01 2022-05-03 Becton, Dickinson And Company Selective amplification using blocking oligonucleotides
US10894976B2 (en) 2017-02-21 2021-01-19 Natera, Inc. Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids
CN110799654A (zh) 2017-03-21 2020-02-14 穆韦尔斯有限公司 密封微孔测定法
CN107083423B (zh) * 2017-03-27 2022-01-28 北京极客基因科技有限公司 一种药物靶点预测和药物全方面评价方法
CA3059559A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
WO2019010486A1 (en) * 2017-07-07 2019-01-10 Board Of Regents, The University Of Texas System ULTRA-ACCURATE AND HIGH COVERAGE OF IMMUNE REPERTOIRE USING MOLECULAR IDENTIFIERS
US11339424B2 (en) * 2017-09-06 2022-05-24 Dxome Co., Ltd. Method for amplification and quantitation of small amount of mutation using molecular barcode and blocking oligonucleotide
CN107488738B (zh) * 2017-10-12 2020-04-28 中国医学科学院肿瘤医院 一种预测乳腺癌对曲妥珠单抗联合化疗治疗敏感性的生物标志物
WO2019090621A1 (zh) * 2017-11-09 2019-05-16 深圳华大智造科技有限公司 钩状探针、核酸连接方法以及测序文库的构建方法
WO2019113457A1 (en) * 2017-12-07 2019-06-13 Massachusetts Institute Of Technology Single cell analyses
EP3728636A1 (en) 2017-12-19 2020-10-28 Becton, Dickinson and Company Particles associated with oligonucleotides
EP3752832A1 (en) 2018-02-12 2020-12-23 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
JP2021520816A (ja) 2018-04-14 2021-08-26 ナテラ， インコーポレイテッド 循環腫瘍ｄｎａの個別化された検出を用いる癌検出およびモニタリングの方法
CN112243461B (zh) 2018-05-03 2024-07-12 贝克顿迪金森公司 在相对的转录物末端进行分子条形码化
CN112272710A (zh) 2018-05-03 2021-01-26 贝克顿迪金森公司 高通量多组学样品分析
US11702653B2 (en) 2018-05-21 2023-07-18 Battelle Memorial Institute Control compositions and methods for sequencing
US11525159B2 (en) 2018-07-03 2022-12-13 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
CN112654699A (zh) * 2018-07-06 2021-04-13 加利福尼亚大学董事会 脂质修饰的寡核苷酸及其使用方法
WO2020036926A1 (en) * 2018-08-17 2020-02-20 Cellecta, Inc. Multiplex preparation of barcoded gene specific dna fragments
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
WO2020072380A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 Cellular Research, Inc. Determining 5' transcript sequences
US11932849B2 (en) 2018-11-08 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
US20220064630A1 (en) 2018-12-10 2022-03-03 10X Genomics, Inc. Resolving spatial arrays using deconvolution
US11441176B2 (en) 2018-12-13 2022-09-13 Battelle Memorial Institute Methods and control compositions for a quantitative polymerase chain reaction
CN113195717A (zh) 2018-12-13 2021-07-30 贝克顿迪金森公司 单细胞全转录组分析中的选择性延伸
EP3666904A1 (en) 2018-12-14 2020-06-17 Lexogen GmbH Nucleic acid amplification and identification method
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
WO2020150356A1 (en) 2019-01-16 2020-07-23 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
US11661631B2 (en) 2019-01-23 2023-05-30 Becton, Dickinson And Company Oligonucleotides associated with antibodies
US20220090183A1 (en) * 2019-02-25 2022-03-24 Elegen Corporation Methods of using microfluidic positional encoding devices
WO2020214642A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
WO2020219751A1 (en) * 2019-04-24 2020-10-29 Genepath Diagnostics Inc. Method for detecting specific nucleic acids in samples
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
SG11202111878RA (en) * 2019-05-31 2021-11-29 10X Genomics Inc Method of detecting target nucleic acid molecules
EP4004231A1 (en) 2019-07-22 2022-06-01 Becton, Dickinson and Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
CN114729350A (zh) 2019-11-08 2022-07-08 贝克顿迪金森公司 使用随机引发获得用于免疫组库测序的全长v(d)j信息
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
CN110938674B (zh) * 2019-12-05 2024-03-19 广州金域医学检验集团股份有限公司 甲基化测序dna文库的构建方法及其应用
ES2946357T3 (es) 2019-12-23 2023-07-17 10X Genomics Inc Métodos para el análisis espacial usando ligación con molde de ARN
CN115244184A (zh) 2020-01-13 2022-10-25 贝克顿迪金森公司 用于定量蛋白和rna的方法和组合物
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
ES2965354T3 (es) 2020-04-22 2024-04-12 10X Genomics Inc Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana
US11661625B2 (en) 2020-05-14 2023-05-30 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
EP4153775A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021237087A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
WO2021247568A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 10X Genomics, Inc. Spatial trancriptomics for antigen-receptors
WO2021247543A2 (en) 2020-06-02 2021-12-09 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021251867A1 (en) * 2020-06-09 2021-12-16 Simsen Diagnostics Ab, Lymphocyte clonality determination
WO2021252591A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
WO2021263111A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
EP4121557A4 (en) 2020-08-06 2024-05-01 Singular Genomics Systems, Inc. SPATIAL SEQUENCING
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
WO2022109343A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Becton, Dickinson And Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
WO2022140028A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
EP4301870A1 (en) 2021-03-18 2024-01-10 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
EP4196605A1 (en) 2021-09-01 2023-06-21 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
WO2023220701A1 (en) * 2022-05-13 2023-11-16 Integrated Dna Technologies, Inc. Use of unique molecular identifiers for improved accuracy of long read sequencing and characterization of crispr editing

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102159726A (zh) * 2008-09-05 2011-08-17 生命科技公司 用于核酸测序验证、校准和标准化的方法和系统
WO2013188831A1 (en) * 2012-06-15 2013-12-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Uniquely tagged rearranged adaptive immune receptor genes in a complex gene set
WO2014015084A2 (en) * 2012-07-17 2014-01-23 Counsyl, Inc. System and methods for detecting genetic variation
CN104024849A (zh) * 2011-08-12 2014-09-03 生命科技公司 用于高通量聚糖分析的装置、方法、计算机程序产品和试剂盒

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL364917A1 (en) * 1999-02-23 2004-12-27 Baylor College Of Medicine T cell receptor vbeta-dbeta-jbeta sequence and methods for its detection
US20150132754A1 (en) * 2012-05-14 2015-05-14 Cb Biotechnologies, Inc. Method for increasing accuracy in quantitative detection of polynucleotides
WO2014144495A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Abvitro, Inc. Single cell bar-coding for antibody discovery
US9708657B2 (en) * 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
JP6545682B2 (ja) * 2013-08-28 2019-07-17 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 大規模並列単一細胞分析
JP6608368B2 (ja) * 2013-12-30 2019-11-20 アトレカ インコーポレイテッド 核酸バーコードを用いた単一細胞と関連づけられた核酸の分析方法
EP4219744A3 (en) * 2014-01-27 2023-08-30 The General Hospital Corporation Methods of preparing nucleic acids for sequencing
CN104263818B (zh) * 2014-09-02 2016-06-01 武汉凯吉盈科技有限公司 基于高通量测序技术的全血免疫组库探测方法
US10760120B2 (en) * 2015-01-23 2020-09-01 Qiagen Sciences, Llc High multiplex PCR with molecular barcoding

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102159726A (zh) * 2008-09-05 2011-08-17 生命科技公司 用于核酸测序验证、校准和标准化的方法和系统
CN104024849A (zh) * 2011-08-12 2014-09-03 生命科技公司 用于高通量聚糖分析的装置、方法、计算机程序产品和试剂盒
WO2013188831A1 (en) * 2012-06-15 2013-12-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Uniquely tagged rearranged adaptive immune receptor genes in a complex gene set
WO2014015084A2 (en) * 2012-07-17 2014-01-23 Counsyl, Inc. System and methods for detecting genetic variation

Also Published As

Publication number Publication date
US20160257993A1 (en) 2016-09-08
EP3262189B1 (en) 2021-12-08
CN107208157A (zh) 2017-09-26
WO2016138500A1 (en) 2016-09-01
ES2906221T3 (es) 2022-04-13
EP3262189A1 (en) 2018-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107208157B (zh) 用于条形编码核酸以用于测序的方法和组合物
US20220333185A1 (en) Methods and compositions for whole transcriptome amplification
US20230083422A1 (en) Methods and compositions for combinatorial barcoding
US11525157B2 (en) Error correction in amplification of samples
US11124823B2 (en) Methods for RNA quantification
CN107208158B (zh) 空间上可寻址的分子条形编码
EP3248018B1 (en) Devices and systems for molecular barcoding of nucleic acid targets in single cells
JP6894480B2 (ja) 単一細胞の迅速かつ正確な分注、視覚化及び解析のための方法
US20180073073A1 (en) Methods and compositions for labeling targets and haplotype phasing
CN105189749B (zh) 用于标记和分析样品的方法和组合物
CN110964796A (zh) 大规模平行单细胞分析
CN113557090B (zh) 成分进入流体的精确递送
US20200157600A1 (en) Methods and compositions for whole transcriptome amplification

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20201223

Address after: new jersey

Applicant after: Becton, Dickinson and Co.

Address before: California, USA

Applicant before: Cellular Research, Inc.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant