CN105189749B - 用于标记和分析样品的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及标记样品中的分析物的方法。

Description

用于标记和分析样品的方法和组合物

交叉引用

本申请要求申请日为2013年3月15日的美国临时申请No.61/801785和申请日为2013年3月28日的美国临时申请No.61/806143的优先权，这两个申请的全文内容都通过引用并入本申请。

背景技术

对生物样品中的核苷酸和蛋白质的分析是分子生物学领域的基本内容。检测、鉴别和利用遗传学和蛋白质组学信息的能力使得能进行灵敏性和特异性诊断以及治疗。

提供本发明以在单一细胞水平快速标记和分析核苷酸和蛋白质。

发明内容

本发明提供了标记靶寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：(a)将DNA分入多个区室(compartment)中；(b)在区室内进行DNA的体外转录反应，从而获得含有RNA的区室；(c)使含有RNA的区室内部(interior)与含有靶寡核苷酸的成组的区室内部合并；(d)使RNA与靶寡核苷酸进行杂交；以及(e)进行反应，以将对应RNA的序列附接到靶寡核苷酸。

在一些实施例中，DNA是双链的。

在一些实施例中，区室是油和水乳剂内的液滴(droplet)。

在一些实施例中，靶寡核苷酸包括至少一个包含细胞标记和分子标记的靶寡核苷酸。

在一些实施例中，靶寡核苷酸为DNA。

在一些实施例中，所述方法可以进一步包括以下步骤：在步骤(c)的合并前，将靶寡核苷酸分到成组的区室中。

在一些实施例中，所述的方法可以进一步包括以下步骤：在步骤(c)的合并前，将成组的细胞分到各区室并且使细胞裂解，以释放细胞寡核苷酸。例如，细胞寡核苷酸为靶核苷酸。替代地，细胞寡核苷酸是细胞mRNA。

在一些实施例中，所述的方法可以进一步包括以下步骤：进行细胞mRNA的反向转录，以生成细胞cDNA。

例如，所述的反向转录反应利用对基因组区有特异性的引物执行。所述的基因组区域可以是免疫球蛋白基因或T细胞受体基因。

例如，所述的反向转录反应可以在合并步骤前在成组的区室内进行。

替代地，所述的反向转录反应可以在合并后的区室内进行。

在一些实施例中，靶核苷酸是细胞cDNA。

在一些实施例中，反应为cDNA末端快速扩增(RACE)反应。

在一些实施例中，DNA与固相支持物偶联。例如，固相支持物为磁珠(bead)。

本发明还提供一种方法，其包括以下步骤：(a)提供多个包含多个DNA寡核苷酸的磁珠；(b)提供多个含引物序列、通用序列、接头(adapter)序列和细胞标记的DNA寡核苷酸；(c)将步骤(a)中的磁珠与步骤(b)中的寡核苷酸融入多个区室，使得每个区室含有单个的磁珠和单个的寡核苷酸；(d)在区室内，进行寡核苷酸的扩增反应，从而获得多个包含RNA所述引物序列、通用序列、接头序列和细胞标记的DNA寡核苷酸；(e)进行在区室内的体外DNA的转录反应，从而获得含有引物序列、通用序列和细胞标记的区室；(f)将含有RNA的区室内部与含有靶核苷酸的成组的区室内部合并；(g)使RNA与靶寡核苷酸杂交；和(h)进行反应，以将相应的RNA的序列附接到靶核苷酸。

在一些实施例中，磁珠上的多个寡核苷酸包括分子标记。

本发明进一步提供标记靶寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：(a)从包含多种细胞类型的生物样品中分离多个mRNA；以及(b)采用靶核苷酸的特异性引物和含有分子标记、通用序列和接头序列的模板切换寡核苷酸，进行mRNA的反向转录，以生成标记靶cDNA。

在一些实施例中，靶cDNA在3’端被标记。

在一些实施例中，靶寡核苷酸是免疫球蛋白或T细胞受体。

在一些实施例中，接头序列对序列平台是特异性的。

在一些实施例中，分子标记为寡聚体。例如，所述的寡聚体是随机寡聚体。

在一些实施例中，所述的随机寡聚体至少是9聚体。

在一些实施例中，所述的方法进一步包括采用通用序列和靶寡核苷酸的特异性引物扩增靶cDNA的步骤。

在一些实施例中，所述的方法可以进一步包括对扩增的cDNA测序的步骤。

本发明还提供了通过以下步骤在主体中测定免疫组库的方法：(a)从包含多种细胞类型的生物样品中分离多个mRNA；(b)采用免疫球蛋白或T细胞受体特异性引物和包含分子标记、通用序列和接头序列组成的模板切换寡核苷酸进行mRNA反转录，以生产分子标记型免疫球蛋白或T细胞受体cDNA；(c)采用通用序列和靶寡核苷酸的特异性引物扩增cDNA；(d)对cDNA测序，以生产多个测序读数；(e)将具有相同分子标记的测序读数进行分组，并且将所述序列聚集在相同组内；以及(f)为每个聚集组建立一致的序列，以产生一致的序列的集合，其中所述的一致的序列用于确定免疫组库的多样性。

在一些实施例中，靶cDNA为在3’端被标记。

引置条款

本说明书提及的所有出版物、专利和专利申请都作为相同内容列入参考，似乎每个单个出版物、专利或专利申请都特别和分别作为参考文献并入。

附图说明

本发明所述的新的特征在从属权利要求中特别阐述。通过阐述说明性的采用了本发明所述的原理的实施例的以下详细说明和附图，以便更好地理解本发明所述的特征和有益效果，其中：

附图1为基于患者样品的试验效果的示意图。

附图2为用于在样品内标记细胞的试验示意图。

附图3描述的步骤可以包括在快速扩增cDNA末端(RACE)试验中。

附图4描述了可以包括在RACE试验中的其它步骤。

附图5描述了可以包括在RACE试验中的其它步骤。

附图6描述了基于一群细胞的免疫组库试验的效果。

附图7描述了免疫组库的流式细胞仪和基因表达试验。

附图8描述了可以被合并的分区(partition)内的分析物的标记和分析。

附图9描述了多个标记和分析。

附图10描述了寡核苷酸偶联磁珠的制备和从磁珠上获得承载标记的寡核苷酸。

附图11描述了寡核苷酸偶联磁珠的制备和从磁珠上获得承载标记的寡核苷酸。

附图12描述了寡核苷酸偶联磁珠的制备和从磁珠上获得承载标记的寡核苷酸。

附图13描述了寡核苷酸偶联磁珠的制备和从磁珠上获得承载标记的寡核苷酸。

附图14显示了标记和分析mRNA的步骤。

附图15显示了标记和分析mRNA的其它步骤。

附图16描述了分离和合并的方法的实施例。

附图17描述了特定随机聚合体标记长度的综合特征。

附图18描述了分析中使用的信息系统。

具体实施方式

I.概述

本发明提供了用于标记分子和分析标记分子的组合物及其制备方法，。在一些实施例中，本发明提供了将分析物(如细胞、多核苷酸)分成单个分区(如液滴、孔、阵列点等)的组合物及其方法，并提供了在单个分区标记分析物的组合物及其方法。

在一些实施例中，本发明一般涉及从主体【110】(如人类、动物、植物、真菌、细菌、细胞群、生物膜)获得样品(如血液、唾液、组织、细胞)，分区，用标记分子【120】标记样品组分，处理和分析被标记样品组分【130】，和/或报告分析结果【140】。可以分开细胞组分，如DNA和RNA，单个细胞或细胞群。细胞群可以包括具有类似功能的细胞，如免疫细胞(如B细胞或T细胞)、癌细胞或神经细胞。此外，细胞群可以被分成细胞分区【210】并且单独地表面结合寡核苷酸(如DNA、dsDNA)的磁珠群可以在磁珠分区【230】内分割。单个细胞可以在细胞分区【220】内被裂解。在一些实施例中，寡核苷酸从磁珠【240】被转录，使得在磁珠分区内生成RNA转录物。在一些实施例中，RNA转录物可以在磁珠分区内反转录为cDNA，在一些实施例中，在随后的步骤，如在磁珠分区(如液滴)内容物与其他分区(如不同的液滴)内容物合并后，RNA转录物可以在磁珠分区内反转录为cDNA。细胞分区可以与磁珠分区逐个分区地【250】合并。然后在合并分区可以进行标记反应，以便用源于磁珠【250】的寡核苷酸标记细胞mRNA(或从其起源的cDNA)。然后对标记产物进行分池、扩增和测序【260】。

本发明所提供的组合物和方法可以用于跟踪信息源，保持被分析的样品中信息的异质性。通过在单个组分水平标记样品，信息的分辨率在分析阶段可以保持在单个组分水平，而不用考虑随后的组分融合和合并。例如，含有多个细胞类型的样品可以被分区为单个细胞类型。可以被分区为单个细胞类型的多个细胞类型包括，例如免疫细胞，如B细胞或T细胞。可以代替的是，含有多个细胞类型的样品可以被分区为含单个细胞的单个分区。通过标记单个细胞类型或单个细胞的承载信息的分子(如DNA、RNA、蛋白质)，单个分区可以被融合以作进一步分析，而不会损失单细胞水平的信息分辨率。此处所提供的组合物和方法还可以包括其他标记，如可以定量分析单个分区内单个分子的标记物。例如，单一分区可以包含大量独特的标记，每个区具有可以用于标记和定量分析在分区内的单个分子的不同的序列。

本发明所提供的方法、组合物和试剂盒可被广泛的应用于各种生命科学相关领域，包括生物医学研究、药物发现和研发以及临床诊断。潜在的应用包括单个细胞类型或单个细胞水平的基因表达分布，以用于检测和/或监测癌症、自身免疫疾病、病毒感染、器官移植排斥和其它疾病或紊乱。本发明还可以用于(a)分析主体的免疫组库，如具有特定疾病或紊乱的主体；(b)阐述细胞内信号路径；(c)验证药物发现和研发的治疗靶的有效性；和(d)鉴定或检测生物标记物，特别是与正常或疾病生物状态相关的生物标记物。本发明还可以用于分析循环无细胞DNA或RNA，以便预防、监控和/或诊断疾病，包括器官排斥。

与已有技术相比，本发明所述的组合物及方法在细胞或组织中基因表达的监控方面具有几种重要的有益效果。更重要的是，本发明所述的组合物和方法还可以监控和检测单个细胞的基因表达，因此可以消除系统监控的错误和噪音，该错误和噪音会在采用传统技术收集资料时，由于异质性细胞群的采样出现。例如，测试样品中异质性细胞群的存在可以起源于培养的细胞群中细胞分化的不同步；或，在一些实施例中，异质性还可以是由于组织样品、生物膜、生物反应器样品、血液样品、活组织检测样品或其它复合样品中存在的不同细胞类型混合物引起。本发明所述的组合物和方法的另一个重要效果是可以通过在样品中使用标记不同分子的分子标记，消除或减少由于PCR扩增偏差引起的错误。例如，当分析时，同一分子序列被发现具有两个不同的标记，这可以显示在分区内具有两个拷贝的分子。这个信息还可以用于折算由于扩增错误引起的结果偏差。本发明所述的组合物及方法的第三个重要的有益效果是可以扩大对细胞进行分选和分类的生物标记物的范围。除了靶向编码细胞外蛋白质标记物的基因序列外，所述的方法也可以使用细胞内标记物，例如编码转录因子或细胞因子、细胞分选和分类的基因序列，从而便于基因表达和细胞功能之间的关联。本发明因此提供了从生物样品中获得更高质量基因组数据的方法，从而能研发疾病的更好的治疗和改进的检测。

II.试验

A.分区内标记

本发明提供了以单一组分水平标记分析物的组合物及方法，例如以单一细胞类型或单一细胞水平。在一些实施例中，分析物被分到成组的分区；标记物被分到单独的成组的分区，每个组内的单个的分区的内含物组合以便能标记分析物。

分配分析物

包含分析物(如细胞)的样品被分为成组的单个分区(例如液滴或孔)。在一些实施例中，成组的单个分区内的分区最多含有一个分析物。在一些实施例中，成组的单个分区内的分区含有最多2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,30,40,50,60,70,80,90,或100个分析物。在一些实施例中，成组的单个分区内的分区平均含有一个分析物。在一些实施例中，成组的单个分区内的分区平均含有2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,30,40,50,60,70,80,90,或100个分析物或更多。在一些实施例中，成组的单个分区包含空的分区。通常，成组的单一分区含有一些空的分区和含有分析物(如最多一个分析物，最多两个分析物等)的分区。在一些实施例中，分析物包含多个组分(如多个分子)。在一些实施例中，该技术可以用于确认所有分区最多含有一个分析物；例如，空的分区(例如液滴)可以通过流式分选仪分选出来。

分配标签

与标签偶联的标签或固相支持物(如磁珠)可以被分为成组的单个分区。在一些实施例中，成组的单个分区中的分区含有最多一个标签或与标签偶联的固相支持物(如磁珠)。在一些实施例中，成组的单个分区中的分区含有最多2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,30,40,50,60,70,80,90，或100个标签或与标签偶联的固相支持物(如磁珠)。在一些实施例中，成组的单个分区中的分区平均含有一个标签或与标签偶联的固相支持物(如磁珠)。在一些实施例中，成组的单个分区中的分区平均含有2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,30,40,50,60,70,80,90，或100个标签或与标签偶联的固相支持物(如磁珠)。在一些实施例中，成组的单个分区包含一些空的分区。通常，成组的单个分区包含一些空的分区和含有标签(如最多一个标签，最多两个标签等)的一些分区。在一些实施例中，标签包含多个组分(如多个分子)。在一些实施例中，该技术可以用于确认所有分区最多含有一个标签或磁珠；例如，空的分区(例如液滴)可以通过流式分选仪分选出来。

可以在单个分区内含物中添加标记或标签，以便能够后续对含有特定组分(如分子)的特定分析物(如细胞)的鉴别。在一些实施例中，标记或标签被分成成组的分区；分区然后可以被用于标记分区内的分析物(如细胞)。

标记或标签可以与磁珠偶联，如其被分成成组的分区(如液滴)。在一些实施例中，制备标记或标签的材料被分成成组的分区；而后在单个分区内生成标签，并且然后用于标记分析物。例如，DNA标签(如游离DNA标签，与磁珠偶联的DNA标签)可以被分成单个分区，随后进行聚合酶链式反应(PCR)，以在分区内溶液中生成多个拷贝的标签。溶液内的标签可以直接用于标记分析物，或作为用于标记后续反应中的分析物的模板。在一些实施例中，DNA标签通过体内转录反应，以在分区内产生RNA标签。溶液中的RNA标签可以直接用于标记分析物，或作为用于标记后续反应(如RACE反应)的分析物的模板。

分区内标记

在一些实施例中，所述的分析物和标签分区的内含物可以组合，便于在单位分析物(如单位细胞)基础上进行标记。例如，如分区为液滴，则成组的分析物液滴中的单个液滴可以与成组的标签液滴中的单个液滴合并，从而便于分析物的标记。分区内含物的合并方法另外描述。

在一些实施例中，含有细胞的样品可以被分为单个分区，每个分区包括细胞。标签可用于分区内的分析物组分(如DNA，RNA等)，使得分区内每个组分都用相同标签标记，如用能鉴别特定细胞的细胞标签标记。在一些实施例中，标签可以用于分区内的分析物组分(如DNA，RNA等)，使得分区内组分的部分用相同标签标记，如用能鉴别特定细胞的细胞标签标记。标签可以包括分子标签，其中分区内的每个标签包含不同分子标签。在一些实施例中，单个标签可以包含细胞标签和分子标签两者。分区内组分可以用标签标记，使得分区内每个分析物或分析物组分都用不同分子标签标记物标记。分区内组分可以用标签标记，使得分区内每个分析物或分析组分都用相同细胞标签。分区内组分可以用标签标记，分区内每个分析物或分析物组分用不同分子标签标记和相同的细胞标签标记。

图8描述了所述方法的实施例。在一些实施例中，含有与核酸【820】偶联的磁珠的溶液被分配到液滴【810】中。在一些实施例中，液滴含有最多一个磁珠。核酸可以是双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、RNA、或DNA和RNA的组合。核酸可以包含单一的标签(如9聚体随机聚体)。此处的“随机聚体”是指具有随机合成碱基的寡核苷酸。当磁珠与dsDNA偶联时，则体内转录【801】可以用于由与磁珠偶联的标签dsDNA【830】生成RNA转录子。寡核苷酸可以是模板切换寡核苷酸。在一些实施例中，包含细胞【850】的溶液被分成液滴【840】。在一些实施例中，液滴含有最多一个细胞。细胞可以被裂解【802】。裂解可以通过在细胞中添加裂解液、缓冲液或去垢剂，通过声波降解法，通过剪切，通过冷冻和解冻，通过加热，通过电气裂解，通过研磨，或通过任何其它合适的方法实现。裂解液、缓冲液或去垢剂的添加可以通过滴注、液滴合并或任何其他合适的方法实现。

然后，含有细胞裂解物的液滴【860】可以与含有扩增寡核苷酸的液滴合并【803】。替代地，液滴中的材料可以在合并后裂解。液滴合并可以通过任何合适的方法进行，包括被动液滴合并(如在微流体汇合处)和主动液体合并(如电子、磁、热、或光学手段)。替代地，细胞裂解可以在液滴合并后进行。之后，从具有相同独特标签序列的单一细胞中，含有寡核苷酸和细胞裂解物的反转录【804】在合并后的液滴中产生cDNA【880】。

在一些实施例中，源于许多细胞的寡核苷酸可以被并行地标记，例如在高通量基础上进行。包含带有表面结合核酸的磁珠的溶液和包含细胞的溶液分别被分成液滴。在一些实施例中，磁珠液滴(【911】，【921】，【931】)包含磁珠(【912】，【922】，【932】)，细胞液滴(【914】，【924】，【934】)包含细胞(【915】，【925】，【935】)。核酸可以是双链DNA、单链DNA、RNA或DNA和RNA的组合。核酸可以包含独特的标签序列(如9聚体随机聚体)。然后，可以使用体内转录来扩增带有标签序列(【913】，【923】，【933】)的寡核苷酸。寡核苷酸可以是模板切换寡核苷酸。细胞可以被裂解。裂解可以通过在细胞中添加裂解液、缓冲液或去垢剂，通过声波降解法，通过剪切，通过冷冻和解冻，通过加热，通过电气裂解，通过研磨，或通过其它合适的方法实现。裂解液、缓冲液或去垢剂的添加可以通过滴注、液滴合并或任何其他合适的方法实现。包含裂解物(【916】，【926】，【936】)的液滴可以与含有扩增寡核苷酸的液滴合并。液滴合并可以通过任何合适的方法进行，包括被动液滴合并(如在微流体的汇合处)和主动液体合并(如电子、磁、热、或光学手段)。替代地，细胞裂解可以在液滴合并后进行。然后，利用寡核苷酸和细胞裂解物的反转录在合并后的液滴(【917】，【927】，【937】)中进行以产生cDNA(【918】，【928】，【938】)，其中每个液滴中的cDNA源于单一细胞，并用相同独特标签序列标记。标记后，来自所有细胞的cDNA被汇聚【902】。细胞的数量至少为10个，至少100个，至少1000个，至少10000个，或至少100000个。然后可以在汇聚的cDNA【902】上进行PCR反应。PCR可以特异性的针对目标靶基因或区域以进行测序。目标靶基因或区域可以是免疫球蛋白重链(IgH)，免疫球蛋白轻链(IgL)，T细胞受体β(TCRb)，T细胞受体α(TCRa)，或免疫细胞标记物。然后对扩增DNA进行测序【903】。来自测序的信息然后可以基于标签序列被复用【904】。

本发明所提供的方法可以产生含有来自细胞mRNA的遗传学信息和来自标签的标记信息的cDNA结构。标签信息可以是细胞标签信息。标签信息可以包含分子标签信息。

在分区内产生标记分子后，各分区可以被合并为一个总群。合并后，任何想做的分析都可以基于批量分子群进行，而不会损失分辨率。

在一些实施例中，包含mRNA信息、细胞标签信息和分子标签信息的cDNA分子的总群可以通过常规PCR进行扩增，以增加cDNA结构的总数量。然后进行序列特异性PCR以生成含有目标细胞标签信息、分子标签信息和遗传学信息的测序相容性DNA分子。对这些分子进行测序，通过使用标签信息，遗传学信息可以被追溯回起源细胞和分子并且可以与起源细胞和分子相关。

III.标签

本发明所述的方法、组合物和试剂盒包括使用标签以鉴别样品(如细胞或源于单一细胞的分子)的单个亚群(细胞标签)和在单个亚群含有的特异性分析物，如寡核苷酸序列(分子标签)。一般来讲，标签可以包含寡核苷酸、DNA、RNA、多肽、抗体和/或其它蛋白质。特别是，本发明描述了包含寡核苷酸的标签。在一些实施例中，寡核苷酸包括细胞标签。在一些实施例中，寡核苷酸包括分子标签。在一些实施例中，寡核苷酸包括细胞标签和分子标签。在一些实施例中，寡核苷酸包括其他序列。

细胞标签

细胞标签可以是独特的N-聚体序列，用于鉴别单个亚群(如细胞)，给定的组分(如基因表达产物或寡核苷酸序列(mRNA，DNA))可以起源于该单个亚群。细胞标签可以包含随机N-聚体寡核苷酸序列(每个细胞的一个独特的鉴别序列)，其可以并入含有可以进行下游扩增和被标记的所有或部分被靶向的基因产物或寡核苷酸序列测序的启动子序列、接头序列和/或引物序列的cDNA结构。每个特异性N-聚体序列可以作为单个细胞的独特的鉴别者，可以采用任何所述的一些方法并入cDNA。

作为本文所公开的实施例中的细胞标签的成组的随机N-聚体序列可以是9个碱基长，但如需要更大(或更小)数量的独特的鉴别者，这个长度可以变化。一般来说，用作为细胞标签的N-聚体序列的长度范围可以从2个碱基到100个碱基长，或可以多于2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,20,30,40,50,60,70,80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，或200个碱基长。优选地，作为细胞标签的随机N-聚体至少4个碱基长且最多14个碱基长。关于随机9聚体，由2.62×10⁵个可能的碱基组合，用于标记单个细胞。对于这种特定随机物长度的组合特征，见图17。在以下提供的实施例中，细胞标签序列首先由DNA序列组成，随后被转成通过体内转录反应并入模板切换寡核苷酸的互补RNA序列。在其它一些实施例中，细胞标签序列可以被直接以RNA引入，例如作为采用组合固态合成技术合成的模板切换寡核苷酸库的一部分引入。在很多情况下，细胞标签可以作为表达特定序列细胞的鉴别者，也可以作为用于将分子标签和其它启动子、引物和/或接头序列的集群并入最终cDNA库的模板切换引物的一部分。

分子标签

分子标签可以包括独特的N-聚体序列，其用于鉴别源于特定单个细胞的单个分子(基因序列、寡核苷酸、mRNA、DNA)。分子标签可以包括随机N-聚体序列(每个分子一个独特的鉴别者)组成，所述的随机N-聚体序列可以并入cDNA结构，所述的cDNA结构含有可以进行下游扩增和被靶向的所有或部分基因产物或寡核苷酸序列测序的启动子序列、接头序列和/或引物序列。每个特异性N-聚体序列可以作为用于待检测的靶序列的独特的鉴别者，并且采用任何以下描述的一些方法并入cDNA结构。在本文所公开的一些实施例中，这些作为分子标签的成组的随机N-聚体序列是9个碱基长，但另一方面，还可以调整长度以提供特定应用所需要的独特分子鉴别者的数量。一般来讲，作为分子标签的随机N-聚体的长度范围可以从2个碱基到100个碱基长，或者可以多于2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,20,30,40,50,60,70,80,90,100，110,120,130,140,150,160,170,180,190，或200个碱基长。优选地，作为细胞标签的随机N-聚体至少4个碱基长并且最多14个碱基长。取决于所进行的特异性的一系列标记反应，分子标签可以由DNA序列、RNA序列组成，或可以在标记过程中，通过体内转录或反转录反应，从一个转换成另一个。在一些实施例中，分子标签作为目标靶序列的鉴别者，还作为用于将其它启动子、引物和/或接头序列并入最终cDNA库中的模板切换引物的一部分。

其它寡核苷酸序列

在一些实施例中，其它寡核苷酸序列包括引物，如PCR引物或反转录引物或转录引物序列。典型地，用于将细胞和分子标签并入cDNA库的寡核苷酸结构包括用于在体内引发反转录反应的引物序列。可以使用任何数量的已知的引物序列，例如序列特异性引物，寡(dT)引物，随机六聚物引物，或随机十聚物引物。在一些实施例中，普通反转录酶引物，例如与真核生物mRNA上发现的3’多-A尾互补的多-dT引物，用于反转录细胞中表达的所有mRNA。在其它一些实施例中，反转录酶引物可以被设计为特异性基因序列，以便进行序列特异性反转录。

在一些实施例中，寡核苷酸可以包括通用引物序列。用于将细胞和分子标签并入cDNA库的寡核苷酸结构可以包括用于引发寡核苷酸结构的PCR扩增的通用引物序列。任何数量的已知的通用序列都可以使用，包括T7通用引物序列，或SP6通用引物序列。

在一些实施例中，寡核苷酸可以包括启动子序列。用于将细胞和分子标签并入cDNA库的寡核苷酸结构也可以包括用于引发多聚酶反应的启动子序列。可以使用任何数量的已知的启动子序列，包括T3启动子序列，或T7启动子序列。

用于将细胞和分子标签并入cDNA库的寡核苷酸也可以包括接头序列，例如，所述的接头序列可以使用以便于在商业化测序平台上进行最终cDNA库的测序。可以使用任何数量的已知的接头序列，如由Illumina、Life Technologies、Pacific Biosciences所推荐的或其它。

寡核苷酸与固相支持物的附接

各种技术都可以用于将细胞和分子标签并入到固相支持物上。

在一个方法中，单链引物序列(如T7启动子序列)与磁珠共价连接，采用互补细胞标签结构的PCR反应在含有磁珠的区室内进行，以在磁珠上产生双链DNA模板。随后，磁珠上的双链DNA作为模板以随后在体内进行转录和PCR反应。

在一个替代方法中，并入分子标签(例如随机N-聚体序列)的单链引物序列与磁珠共价连接，采用互补细胞标签结构的PCR反应在含有磁珠的区室内进行，以在磁珠上产生双链DNA模板。再者，磁珠上的双链DNA作为模板以随后在体内进行转录和PCR反应。

在一些方法中，初始引物与微孔底部表面共价连接，采用互补细胞标签结构的PCR反应在微孔中进行，以产生与微孔底部连接的双链DNA模板。在其它一些方法中，初始引物与微阵列基底共价连接，并且采用互补细胞标签结构的PCR反应在与微阵列相接触的液滴或液体层中进行，以产生与微阵列基底连接的双链DNA模板分子。在一些实施例中，采用合适引物的PCR反应可以在溶液中进行，例如可以在液体的液滴约束范围内或在微孔内进行。

固体支持物

合适的固相载体包括，但不限于，其它颗粒、纤维、磁珠和/或支持物，其与DNA、RNA、双链DNA、单链DNA、ssRNA具有亲和性，并且可以以各种形状体现，该形状或者是规则或者是不规则的形式，只要该形状可以最大化固相表面积，使载体可以进行微规模操控即可。

合适的磁珠的例子是包含乙烯芳香族单体的共聚物的有孔或无孔多聚物磁珠。乙烯芳香族单体的例子包括苯乙烯、烷基取代苯乙烯、α甲基苯乙烯、和烷基取代的α甲基苯乙烯。

合适的磁珠的其它例子是被改性以具有疏水性表面的有孔或无孔颗粒，如二氧化硅、碳化硅、氮化硅、氧化钛、氧化铝、氧化锆。

在一些方面，固相表面具有功能性表面，使得这些表面涂覆可逆的与核苷酸(如DNA、RNA)连接的组成部分。一个例子是，涂覆了一些组成部分的表面，每种组成部分具有自由官能团，这些官能团与氨基硅烷或微粒的氨基基团连接；结果，微粒表面可以涂覆含有组成部分的官能团。官能团作为与沉积DNA的聚亚烷基二醇具有生物亲和性的吸附剂。在一个实施例中，官能团是羧酸。自由官能团的合适的组成部分是琥珀酸组成部分，其中一个羧酸基团与氨基硅烷的氨基通过氨基键连接，第二个羧酸没有结合，导致游离羧酸基团与表面附接或连接。具有官能团涂覆表面、可逆性地与核苷酸分子连接的合适的固相载体是例如具有官能团涂覆表面的磁性反应固相载体，如，但不限于氨基涂覆、羧基涂覆和包被羧基基团涂覆的永磁微粒。

IV.模板切换寡核苷酸

标签可以通过模板切换寡核苷酸来传递。模板切换寡核苷酸可以是RNA或DNA。模板切换寡核苷酸可以包括杂交区和模板区。杂交区可以包括任何能与靶杂交的序列。在一些实施例中，杂交区包括与cDNA分子的3’末端的突出的C碱基互补的系列G碱基，其产生于反转录酶的末端转移酶活性。系列G碱基可以包括1个G碱基、2个G碱基、3个G碱基、4个G碱基、5个G碱基或多于5个G碱基。模板区可以包括将通过引物延伸反应并入cDNA的任何序列。在一些实施例中，模板区包括一个或更多标签序列。模板区可以含有一个标签序列、2个标签序列、3个标签序列、或更多标签序列。模板区可以包括分子标签区和细胞标签区。

模板切换寡核苷酸可以进一步包括其他区。在一些实施例中，模板切换寡核苷酸包括一个或多个测序接头序列或部分测序接头序列组成。测序接头序列可以是Illumina接头序列。测序接头序列可以是454个接头序列。接头序列可以是SOLiD接头序列。在一些实施例中，模板切换寡核苷酸包括一个或多个普通序列。普通序列可以用于普通PCR或其它反应中的引物连接。

模板切换寡核苷酸(如RNA寡核苷酸)可以在反转录的延伸反应中并入cDNA序列。杂交区使模板切换寡核苷酸能与cDNA杂交。一旦反转录酶到达mRNA末端，它就可以切换到模板切换寡核苷酸，并将它的序列并入cDNA。参见例子图3。

此处所述的试验可以包括cDNA末端快速扩增(RACE)反应，如图3-5中描述。在一些实施例中，RACE试验可以在细胞中mRNA转录子【310】上进行。mRNA转录子可以源于各种基因，包括与免疫功能相关的基因，如IgH或TCRβ。在一些实施例中，mRNA转录子包含6个区：5’非翻译区(5’UTR)、前导区、V区、D区、J区和C区。然后可以添加反转录(RT)引物【320】。在一些实施例中，RT引物对于免疫球蛋白重链保守区可以是特异性的，如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD、kappa(IgK)和免疫球蛋白的lambda(IgL)轻链区，T细胞受体α保守区(TRAC)和或T细胞受体β保守区(TRBC)。然后反转录酶可以用于进行mRNA的反转录【302】，导致带有来自反转录酶末端转移酶活性的突出的C碱基的cDNA。

之后，可以添加模板切换寡核苷酸【340】，将模板分子从原始mRNA切换到cDNA。在一些实施例中，模板切换寡核苷酸包括三个区：部分测序接头序列(如3’端的普通序列)，随机分子标签序列和同质多聚物尾(即与cDNA的突出的C碱基互补的G碱基区)。部分测序接头序列可以是部分Illumina接头序列。随机分子标签序列可以由9个随机碱基(9聚体)组成。然后cDNA可以被延伸【303】以包括模板切换寡核苷酸序列，从而形成全长cDNA【350】。在一些实施例中，全长cDNA包括V端的特异性随机分子标签序列和与测序接头序列的部分互补的序列。测序接头序列可以是Illumina接头序列。

然后可以加入其它引物【401】。在一些实施例中，添加3个其它引物，包括：具有部分测序接头序列【420】的回巢C引物，具有称作长引物的6个碱基对索引【430】的测序接头序列，和短引物【440】。测序接头序列可以是Illumina接头序列。可以进行PCR反应【402】以生成并入引物序列的扩增cDNA【450】。在一些实施例中，PCR进行30个循环。然后可以加入其它引物。在一些实施例中，添加一个其它引物，该引物包括全长测序接头序列【460】。测序接头序列可以是Illumina接头序列，如P7。然后在全长接头序列上进行PCR反应【403】。在一些实施例中，PCR进行8个循环。

然后可以对获得的cDNA产物【510】进行测序和分析。在一些实施例中，这通过测序完成。测序是通过采用读数引物进行。在一些实施例中，使用三个读数引物，其包括：具有150个碱基对读数区【530】的、覆盖大部分CDR3区的第一读数引物(Read1)【520】，具有150个碱基对读数区【550】的、覆盖特异性随机分子标签条码区、5’UTR、前导区和部分V区的第二读数引物(Read2)【540】,和具有覆盖索引区的读数区的索引读数引物【560】。在一些实施例中，读数长度可以是50，100，150，200，250，500，750，1000，1250，1500碱基对。cDNA产物可以通过其他技术(包括杂交探针)分析。

RACE试验可以是5’RACE或3’RACE。在一些实施例中，测序从线性cDNA产物进行。在一些实施例中，测试序从环状cDNA产物进行。通过解链和成环可以获得环形cDNA产物，也就是说，线性DNA的3’和5’端被放在一起并连接(如采用环形连接酶，如CircLigase^tm,

Biotechnologies)。

V.反应

本发明所提供的组合物和方法可以包括涉及执行分析的一个或多个反应。反应可以包括：样品制备，如细胞裂解；制备标签，如体内转录；标记，如用模板切换寡核苷酸进行反转录；分析物扩增，如PCR；和分析，如测序。

细胞裂解

把细胞分为单个分区后，细胞可以裂解以释放细胞内含物，包括RNA、DNA、蛋白质和其它细胞内含物。裂解反应可以采用任何数量的已知的技术进行，例如通过添加去垢剂，添加裂解溶液或低渗缓冲液，采用机械搅拌或超声反应、重复冷冻和解冻循环或通过其它任何合适的方法进行。通过传统的液体分散方法、通过滴注或融合技术或通过其它任何合适的方法添加裂解溶液、缓冲液或去垢剂。在下游反应前，含有细胞裂解物【860】的分区随后与含有标签的分区合并【803】。在一些实施例中，裂解可以在一分区与另一分区(如含标签的分区)内含物合并前进行。在一些实施例中，裂解可以在一分区与另一分区(如含标签的分区)内含物合并后进行。

体内转录

体内转录反应可以用于将DNA模板分子转化为RNA转录子。本发明所述的组合物和方法中使用的DNA模板分子可以被设计为含有促进体内转录的启动子序列。DNA模板分子可以包括随机或特异性N-聚体标记序列，还可以包括促进下游扩增和测序反应的引物和接头序列。本发明所述方法的体内转录产物为RNA模板切换寡核苷酸，所述的RNA模板切换寡核苷酸包含所述的合适的引物、接头和/或标签序列。在一些实施例中，与磁珠连接的双链DNA模板被转录以生产含有模板切换寡核苷酸的RNA结构，所述的模板切换寡核苷酸可以包括引物、接头和/或随机或特异性N-聚体细胞标签序列、随机或特异性N-聚体分子标签序列或同时包括随机或特异性N-聚体细胞标签序列和随机或特异性N-聚体分子标签序列。替代地，体内转录可以在溶液中与自由模板DNA一起使用以产生RNA模板切换结构。

在一些实施例中，体内转录反应可以在DNA模板序列与细胞裂解物或其它生物样品合并之前进行。在一些实施例中，体内转录反应可以在DNA模板序列与细胞或源于细胞的材料(如多聚核苷酸，多肽等)或其它生物样品合并之后进行。用于体内转录反应的DNA模板可以包括促进转录反应的启动子序列。可以使用任何数量的已有的启动子序列，例如T3RNA多聚酶启动子序列，T7RNA多聚酶启动子序列，或任何其它合适的RNA多聚酶启动子序列。转录反应可以采用任何合适的体内转录系统(例如T3RNA多聚酶系统)，在合适的反应条件下进行，所述的T3RNA多聚酶系统包括合适的转录酶(T3RNA多聚酶)、三磷酸核糖核酸和缓冲液组分(如二硫苏糖醇和镁离子)。

体内转录试验可以被设计为使得：样品中所有的现存寡核苷酸都可以被转录为RNA，或者仅仅寡核苷酸的一部分可以被转录为RNA。例如，所有的寡核苷酸可以含有相同的启动子，或仅寡核苷酸的一部分可以含有启动子。在一些实施例中，寡核苷酸含有不同的启动子。

多聚酶链式反应(PCR)

PCR反应可以用于本发明描述的任何步骤中。PCR反应可以用于，例如，(i)进行并入启动子、引物、接头和/或特异性N-聚体细胞标签的以磁珠为基础的DNA结构的合成反应；(ii)进行并入启动子、引物、接头和/或特异性N-聚体分子标签的磁珠为基础的DNA结构的合成反应；(iii)进行并入启动子、引物、接头和/或特异性N-聚体序列细胞标签和特异性N-聚体分子标签的以磁珠为基础的DNA结构的合成反应；(iv)进行汇聚的cDNA库的常规扩增；或(v)进行代表目标靶基因或寡核苷酸序列的cDNA序列的序列特异性扩增。在一些优选的方法中，在AmpliTaq或Phusion多聚酶、与磁珠(如Roche454磁珠)连接的单链引物(如Roche454引物A)和包含454A和/或454B引物序列组成的DNA结构、T7启动子、部分Illumina接头序列、N-聚体细胞标签、终止于GGG的通用接头序列和可选限制性位点序列存在下，进行乳液PCR反应，以在磁珠上合成双链DNA，其然后用于基于磁珠进行体内转录(如果必要的话，先用平端限制酶处理磁珠，以去除限制性位点)以生成融合N-聚体细胞标签的RNA模板切换寡核苷酸。

尽管此处描述的很多例子采用乳液PCR描述基于磁珠的DNA结构的合成，但是PCR合成和扩增反应还可以在溶液中进行，以合成所述的DNA结构。任何数量的已知的DNA多聚酶系统(包括多聚酶，合适的引物，必要的辅因子和缓冲液，以及三磷酸脱氧核糖核酸)都可以在合适的一系列反应条件下使用以进行合成或扩增。示例性的系统包括phusion多聚酶系统，Taq多聚酶系统，AmpliTaq多聚酶系统，或任何其它合适的多聚酶系统。优选地，上文描述的在用于合成DNA结构的多聚酶的PCR反应中所选择使用的多聚酶是在该结构的3’端没有添加突出的A碱基的多聚酶，因为这必须使用T4DNA多聚酶或其它合适的外切酶去除。

在一些实施例中，在合适的一系列引物的存在下，以常规方式使用PCR反应，以合成和/或扩增所有DNA模板或cDNA库分子。在一些实施例中，在合适的一系列引物的存在下，以选择方式使用PCR反应，以特异性扩增cDNA库中存在的靶基因序列或靶寡核苷酸序列。在一些实施例中，常规PCR和特异性PCR反应都有发生。所使用的PCR反应循环的次数从约2个循环到40个循环或更多。

DNA测序

DNA测序可以用于对汇聚的或扩增的cDNA库测序，以鉴别：(i)细胞标签的本性；(ii)分子标签的本性；和/或(iii)目标靶基因或寡核苷酸的全部或部分序列。DNA测序采用任何数量的商业化可用的测序系统进行(如试剂、试剂盒和仪器)，例如Illumina MiSeq，HiSeq，或NextSeq500系统；Life Technologies SOLiD测序系统，Pacific BiosciencesSMRT测序系统，或任何其它商业化可用或新出现的测序技术平台。并入DNA或RNA结构的设计中，用于添加细胞标签和/或分子标签到cDNA库的接头序列的选取是根据所采用的测序系统的选取而引起的。

在一些实施例中，本发明所述的方法中采用的测序技术每个运行至少产生100个读数，每个运行至少产生200个读数，每个运行至少产生300个读数，每个运行至少产生400个读数，每个运行至少产生500个读数，每个运行至少产生600个读数，每个运行至少产生700个读数，每个运行至少产生800个读数，每个运行至少产生900个读数，每个运行至少产生1000个读数，每个运行至少产生5000个读数，每个运行至少产生10000个读数，每个运行至少产生50000个读数，每个运行至少产生100000个读数，每个运行至少产生500000个读数，每个运行至少产生1000000个读数，每个运行至少产生2000000个读数，每个运行至少产生3000000个读数，每个运行至少产生4000000个读数，每个运行至少产生5000000个读数，每个运行至少产生6000000个读数，每个运行至少产生7000000个读数，每个运行至少产生8000000个读数，每个运行至少产生9000000个读数，每个运行至少产生10000000个读数。

在一些实施例中，每个B细胞样品进行的测序读数的数量至少是B细胞样品数量的2倍，至少是B细胞样品数量的3倍，至少是B细胞样品数量的5倍，至少是B细胞样品数量的6倍，至少是B细胞样品数量的7倍，至少是B细胞样品数量的8倍，至少是B细胞样品数量的9倍，至少是B细胞样品数量的10倍。读数深度使得能精确覆盖B细胞样品，促进错误校正，保证库测序饱和。

在一些实施例中，每个T细胞样品进行的测序读数的数量应当至少是T细胞样品数量的2倍，至少是T细胞样品数量的3倍，至少是T细胞样品数量的5倍，至少是T细胞样品数量的6倍，至少是T细胞样品数量的7倍，至少是T细胞样品数量的8倍，至少是T细胞样品数量的9倍，至少是T细胞样品数量的10倍。读数深度使得能精确覆盖T细胞样品，促进错误校正，保证库测序饱和。

VI.用于分区和合并的机制

本发明所描述的组合物和方法可以通过分区的方式进行。这些分区可以含有单个的细胞，以分析在单个的细胞水平的样品。这些分区可以包括标签和传递标签的装置。这些分区可以包括液滴、微孔阵列、微阵列或任何其它合适的技术。

A.液滴

在一些实施例中，分区以液滴的方式进行。液滴可以包括水性基质(如水、缓冲液、细胞生长基质)，其被不溶性油相(如矿物质油、硅油、全氟油)包围。液滴可以包括被空气包围的水性基质(如水、缓冲液、细胞生长基质)。液滴可以位于小瓶、试管、毛细管、注射器、微流控通道中或在表面(如通过表面声波的液滴致动的压电表面)上。液滴可以通过任何合适的方法产生，如通过微流控装置(如RainDance RainDrop系统，微流控T型通道)，批量乳化或吸液管吸取产生。

液滴中还可以另外使用表面活性剂形成。表面活性剂的示例包括Triton X-100、SDS、ABIL EM90、Span80、monolein、油酸、Tween20、Tween 80、Synpernic PEF、C12E8、n-丁醇、磷脂类、PF-辛醇、PF-癸醇、PF-TDOEG、PFPE-COOH、PFPE-COONH₄、PFPE-PEG、PFPE-DMP、和Pico-Surf。

液滴可以被分选。例如，含有细胞的样品可以被分为含有细胞(如最多一个细胞)的液滴和不含细胞的液滴。含有零个细胞的液滴可以被分选和丢弃。液滴的分选可以采用合适的方法，如微流控液滴分选装置或荧光激活液滴分选(FADS)系统。

液滴可以被合并。例如，含有细胞或细胞裂解物的液滴可以与含有标签的液滴合并。液滴合并可以采用任何合适的方法进行，包括被动液滴合并(如在微流控接合处)和主动液滴合并(如电、磁、热或光学方法)。

被分区的细胞的数量可以至少为10个，至少为100个，至少为1000个，至少为10000个，或至少为100000个。分区可以包括最多1个细胞，最多2个细胞，最多3个细胞，最多4个细胞，最多5个细胞，或最多10个细胞。

B.微孔阵列

在一些实施例中，分区可以利用一个或多个微孔阵列进行。微孔阵列可以包括板、膜、胶带或包含微孔阵列的其它基质。基质可以包括塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、环烯烃、卢塞特有机玻璃)、环氧树脂、光阻材料(如SU-8)、PDMS、玻璃、金属、或任何其它合适的材料。微孔阵列可以包括至少1个、至少6个、至少24个、至少96个、至少384个、至少1536个、至少3456个、至少9600个微孔组成。样品通过吸液管吸取、液体处理器、自动液体处理器或其它任何合适的方法被分配到微孔中。

微孔的内含物可以被分选。例如，根据Poisson分配统计学原理，含有细胞的样品可以被分到含有最多1个细胞的微孔中。含有零个细胞的微孔内含物可以选择丢弃。微孔内含物可以通过任何合适的方法(如荧光或光学检测)被分选。需要丢弃的微孔内含物可以通过吸液管吸取、液体处理器、自动液体处理器或其它任何合适的方法去除。

微孔内含物可以被合并。例如，含有细胞或细胞裂解物的微孔内含物可以与含有标签的微孔内含物合并。微孔内含物合并可以通过任何合适的方法实现，合适的方法包括吸液管吸取、液体处理、自动液体处理或物理比对和与多种微孔板的接触。

被分区的细胞数量可以至少为10个，至少为100个，至少为1000个，至少为10000个，或至少为100000个。分区内可以包括最多1个细胞，最多2个细胞，最多3个细胞，最多4个细胞，最多5个细胞，或最多10个细胞。在一些实施例中，微孔被设计为容纳不超过一个细胞和/或不超过一个磁珠。例如，微孔的直径可以小于10，15，20，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，250，或300um。

C.有间隔物的微阵列

在一些实施例中，分区是通过一个或多个微阵列芯片进行的。微阵列芯片可以包括芯片、载片、或其它包含具有结合材料的阵列位点的基质。该基质可以包括玻璃、硅、尼龙、塑料或任何其它合适的材料。与阵列位点结合的材料可以包括DNA、RNA、蛋白质、多肽、抗体、细胞、化学物质、组织或碳水化合物。

结合到微阵列位点的材料进一步通过包含的间隔物或壁分区。含有间隔物或壁的膜或材料层可以比对微阵列表面，并与微阵列表面结合，从而把每个微阵列位点分区，并提供分配的内含物。所述的膜可以包括PDMS、玻璃、硅、塑料(如PMMA)、金属、或任何其它合适的材料。

被间隔物分区后，微阵列位点的内含物可以从基质分离，或可以被复制，以形成位点内含物的非结合拷贝。例如，含有表面结合DNA的微阵列位点可以通过反应，以在自由溶液中通过体内转录形成RNA分子。

微阵列体积内含物可以被合并。例如，含有标签的微阵列体积内含物可以与含有细胞或细胞裂解物的体积合并。微阵列体积内含物合并可以通过任何合适的方法进行，合适的方法包括吸液管吸取、液体处理、自动液体处理或物理比对以及与多种微孔板或其它分区的微阵列接触。

VI.数字化计数和分析

高通量测序提供了非常大的数据组。

可以使用一个或多个生物信息学工具实现，该工具如ALLPATHS(采用全基因组鸟枪组装程序，其可以从短读数产生高通量组装程序)、Arachne(从全基因组鸟枪短读数组装基因组序列的工具，其大部分在通过克隆末端的测序获得的向前或反向对中)、BACCardl(验证基因组组装、协助基因组修整和基因组间比较的绘图工具)、CCRaVAT&QuTie(启用在大规模事件控制和定量的性质相关研究中的稀有变异体分析)、CNV-seq(采用高通量测序检测拷贝数量变异的方法)、Elvira(用于小基因组(如病毒)的高通量组装的一系列工具/程序)、Glimmer(用于在微生物DNA，特别是细菌、古生菌和病毒的基因组中发现基因的系统)、gnumap(一种程序，其被设计成精确地将从下一代测序机器获得的序列数据绘图)、Goseq(一种R库，其用于形成基因本体和其他基于RNA-seq数据测试的分类，该测试校正选择性偏差)、ICAtools(用于大规模测序工程中的基质的一套程序)、LOCAS，一种组装第二代测序技术的短读数的程序、Maq(通过将短读数制图成参考序列而建立组件)、MEME(motif为基础的序列分析工具)，NGSView(通过图形化界面，实现在桌面计算机上同时可视化和操控几百万序列)，OSLay(未完成的组装件的优选联结布局)，Perm(用周期性全敏感种子对短序列读数高效制图)、Projector(为间隙关闭目的自动重叠群制图)、Qpalma(比对工具，其用于比对通过如Illumina、Solexa或454之类测序平台形成的剪切读数)、RazerS(利用灵敏度控制的快速读数制图)、SHARCGS(在基因组测序中基于稳健重叠群延伸的短读数组装器；一种DNA组装程序，其被设计用于25-40聚体输入片段和深度序列覆盖的从头组装)、Tablet(下一代序列组装可视化)、和Velvet(用于极短读数的序列组装器)。

数据分析步骤的非限定性实施例总结如下：

相同细胞和/或分子标签的分组读数：首先序列基于相同细胞和/或分子标签匹配。

为每组构建最小生成森林：如果Hamming距离大于5％，聚集成亚组(树)。

关于每个亚组(或树)，为每个读数中每个读取的碱基创建一个正确概率的总数的载体。

从每个位置的具有最大总数的碱基创建一致的读数：一致的读数用于突变分析和多样性检测。

VII.信息系统

本发明所提供的方法可以在服务器或计算机服务器上进行(图18)。服务器【1801】包括中央处理单元(CPU，也称“处理器”)【1805】，所述的中央处理单元可以是单核处理器，多核处理器，或用于平行处理的多个处理器。用作控制组装件的部分的处理器可以是微处理器。服务器【1801】还包括存储器【1810】(如随机存取存储器、只读存储器、闪存存储器)；电子存储单元【1815】(如硬盘)；用于与一个或多个其他系统通信的通信界面【1820】(如网络适配器)；和周边设备【1825】，其可以包括高速缓冲存储器、其他存储器、数据存储设备和/或电子显示适配器。存储器【1810】、存储单元【1815】、界面【1820】和周边设备【1825】通过通信总线(实心线)与处理器【1805】通信，如主板。存储单元【1815】可以是存储数据的数据存储单元。服务器【1801】与计算机网络(“网络”)【1830】在通信界面【1820】的帮助下可操作性耦合。处理器在其它硬件的帮助下也可以可操作性与网络耦合。网络【1830】可以是互联网、内联网和/或外联网，与互联网通信的内联网和/或外联网、电信或数据网络。在一些实施例中，网络【1830】在服务器【1801】的帮助下可以实现对等网络，所述的对等网络使设备与服务器【1801】偶联，以作为客户端或服务器运行。一般来讲，服务器可以通过网络【1830】传递的电子信号传递和接受计算机可读指令(如设备/系统操作协议或参数)或数据(如传感器测量值、检测核酸获得的原始数据、检测核酸获得的原始数据的分析、检测核酸获得的原始数据的解释等)。此外，网络可以用于，例如，传递或接收跨越国际边界的数据。

VIII.用途

本发明可以用于抑制、治疗、检测、诊断、预防或研究任何一种疾病或疾病的症状，包括癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病和有机体(如细菌、病毒或真菌)感染。所述的有机体优选为人类，但还可以是非人类主体，如非人类哺乳动物。非人类哺乳动物的示例包括但不限于，非人类灵长类(如猿、猴子、大猩猩)、啮齿目动物(如小鼠、大鼠)、牛、猪、绵羊、马、狗、猫或兔。

癌症的例子包括前列腺癌、胰腺癌、直肠癌、脑癌、肺癌、乳腺癌、骨癌和皮肤癌。炎症性疾病的例子包括过敏性大肠综合征、溃疡性结肠炎、阑尾炎、扁桃体炎、皮炎。遗传性过敏疾病的例子包括过敏性反应、哮喘等。自身免疫性疾病的例子包括IDDM、RA、MS、SLE、克罗恩疾病、弥漫性毒性甲状腺肿(Gravers病)等。自身免疫性疾病还包括脂泻病、疱疹样皮炎。例如，响应于癌症抗原、自身抗原、病原性抗原、疫苗抗原等的免疫的决策是在研究中的。

本发明所述方法的一个特定的应用是评估主体的免疫组库的多样性。

VDJ线性(lineage)多样性：通过在给定的读数深度上落入每个VJ、VDJ、VJC、或VDJC(如VDJ)组合的所观察到的线性的数量阐述VDJ用途。

VDJ和特定序列丰度直方图：直方图将VDJ和特定序列的丰度(后者或者是具体或已经进行线性分析过滤和分组)分成等距的小柱子。

VJ、VDJ、VJC、或VDJC(如VDJ)用途的3D表示图：通过将V-区段、D-区段、J-区段和/或C-区段应用到三维曲线图上的不同的轴来表示组库。或者采用丰度(一般指读数数量，可以有正常偏差)或者观察到的线性多样性，各种大小的气泡用于每个V/D/J/C坐标上代表组合的总用途。

突变与序列丰度的关系曲线图：进行线性分析后，通过读数-数量(或归一化的丰度偏差)将特定序列分为等距小柱子。对某一丰度柱而言，根据突变与丰度的关系曲线，每个特定序列上突变的数量是平均数。

V、D、J、C、VJ、VDJ、VJC、VDJC、抗体重链、抗体轻链、CDR3或T细胞受体用途(Pearson，KL divergence)的相关性测量：VJ、VDJ、VJC或VDJC(如VDJ)组合被处理作为带有索引组分v的载体，通过VDJ组合的线性多样性或丰度进行加权。基于指数，可以计算每对个体之间的Pearson关系和KL偏离度。

此处的分析结果可以指免疫组库的分析结果，该结果可以表示为数据组，该数据组包括序列信息，典型的为V、D、J、C、VJ、VDJ、VJC、VDJC、抗体重链、抗体轻链、CDR3或T细胞受体的用途，V、D、J、C、VJ、VDJ、VJC、VDJC、抗体重链、抗体轻链、CDR3或T细胞受体和特定序列的丰度，V、D、J、C、VJ、VDJ、VJC、VDJC、抗体重链、抗体轻链、CDR3或T细胞受体用途等的突变频率和相关性测量等。之后，这些结果可以被输出，或贮存例如在组库分析物的数据库中，并且可以用于与测试结果、参考结果等进行比较。

当从被试验的样品中获得免疫组库分析结果后，该组库可以与参考或对照组库进行比较，之后对药物有效性、或其它预期分析做出诊断、预防分析等结论。参考或对照组库可以通过本发明所述的方法获得，然后将被选入作为目标样品相关性比较用。测试组库结果可以通过与单一参考/对照组库结果进行比较，以获得关于免疫能力和/或获得样品的个体的历史的信息。替代地，测试组库结果可以通过与两个或更多个不同参考/对照组库结果进行比较，以获得关于测试样品的特征的更深度的信息。例如，所获得的组库结果可以与阳性和阴性参考组库结果做比较，以获得关于是否为目标表现型的确定的信息。在另一个实施例中，两个“测试”组库也可以互相比较。在一些实施例中，测试系统与参考样品比较，然后将该结果与源自第二个测试组库和同一参考样品的结果进行比较。

不同差值(如两个组库间的差值)的判断或分析可以采用任何传统方法学进行，本领域的技术人员熟知很多公知的方法，如通过系统输出的数字化图像比较，通过用途资料数据库比较等知晓。

然后执行统计学分析步骤以获得序列患病率加权贡献，如V、D、J、C、VJ、VDJ、VJC、VDJC、抗体重链、抗体轻链、CDR3或T细胞受体的用途、突变分析等。例如，可以用最近的Tibshirani等(2002)P.N.A.S.99:6567-6572中描述的质心收缩法分析来计算每类的质心，然后计算给定组库和每个质心之间的平均平方距离，其通过类内标准化偏差归一化。

统计学分析可以包括统计度量(如熵度量、生态度量、各种丰度度量、品种丰富度度量或品种异质性度量)的使用，以表征一系列免疫组库的多样性。用于表征生态品种多样性的方法也可以用于本发明中。参见，例如Peet,Annu Rev.Ecol.Syst.5:285(1974)。统计度量也可以用于表征丰度变化或异质性。表征异质性的方法的例子基于信息理论，特别是Shannon-Weaver熵法，该方法总结了单一数量的频率分布。参加，如Peet,AnnuRev.Ecol.Syst.5:285(1974)。

分类可以用概率来定义，在所述的概率中，以经验为主进行定点分割。在本发明的一个实施例中，约为0.4的概率可以用于区别接触目标抗原的个体和不接触目标抗原的个体，更普遍的概率为约0.5，也可以用为约0.6或更高的概率。“高”概率可以至少约0.75，至少约0.7，至少约0.6，或至少约0.5。“低”概率可以不超过约0.25，不超过0.3，或不超过0.4。在许多实施例中，上述获得的信息可以用于预测宿主、主体或患者是否应该治疗，并优化其中的剂量。

此外，本发明所述的方法是作为一种检测一种疾病发展路径中最早的变化(如癌症发生的路径、感染路径等)的措施，和/或监控各种治疗和预防性干预的有效性。

本发明所述的方法还可以用于分析试剂对细胞的有效性。例如，可以执行服用一种或多种测试化合物后基因表达变化的分析以分析测试化合物对个体的效果。

对于潜在治疗价值进行分析的试剂可以是任何化合物，小分子，蛋白质，脂质，碳水化合物，核酸或其他适于治疗用途的合适试剂。优选地，测试在体内进行，例如采用动物模型，以判断其对免疫组库的效果。

用于筛选的目标试剂包括具有大量的化学种类的已知和未知化合物，主要是有机分子，其可以包括有机金属分子、遗传序列等。本发明的一个重要方面是可以评估候选药物，包括毒性测试等等。

测试化合物包括上述描述的各种分子种类，进一步可以包括未知内含物的样品。所讨论的天然存在的、复杂的混合物源于天然来源，如植物，真菌，细菌，原生生物或动物。尽管许多样品会包括溶液中的化合物，但是可以溶解在合适溶剂中的固体样品也可以被测试。目标样品包括环境样品，如地表水、海水、矿物废物等，生物样品，如从农作物、组织样品等制备的裂解物；生产性样品，如药物制备过程中的时间过程；和制备用于分析的化合物库等(如针对潜在治疗价值被评估的化合物，如候选药物)。

包括候选试剂的化合物是从各种广泛的来源获得的，来源包括合成或天然化合物库。例如，很多方法可以用于各种有机化合物的随机合成和定向合成，有机化合物包括生物分子，包括随机寡核苷酸和寡肽的表达。替代地，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库可以利用或很容易制备。此外，天然或合成产生的库和化合物可以通过传统化学、物理和生物化学手段进行修饰，并且可以用于产生组合库。已知的药物试剂可以用于直接或随机化学修饰，如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，以产生结构类似物。

尽管本发明所述的优选实施方式已在本文北显示并被描述，但是很明显，对本领域的技术人员来讲，这些实施方式仅通过实施例进行了阐述。对于本领域的技术人员来讲，将存在很多变形、变化和替代方案，而不会偏离本发明。应该理解，本发明所描述的各种实施方式的替代方案也可以用于实践本发明。以下权利要求意在限定本发明的范围，在这些权利要求的范围内的方法和结构及他们的等同方案因此都被覆盖。

实施例

实施例1-带细胞标签和分子标签磁珠的制备

与带细胞标签的dsDNA偶联的磁珠可以通过图10显示的方法制备。将表面连接有DNA的磁珠放在含寡核苷酸、引物、酶和其它执行PCR反应必备的试剂的溶液中。在一些实施例中，连接磁珠【1010】的DNA【1011】包含一个区：启动子区。该启动子区可以是T7启动子。在一些实施例中，溶液中的寡核苷酸【1020】包含四个区：启动子区【1021】、部分测序接头【1022】、随机聚体细胞标签【1023】和通用序列【1024】。该启动子区可以是T7启动子。部分测序接头可以是部分Illumina接头。通用序列可以通过GGG终止。在一些实施例中，溶液【1034】中的引物包括通用序列。然后进行PCR。在一些实施例中，PCR为乳剂PCR【1001】。PCR反应使结合在磁珠上的DNA上增加其它序列。在一些实施例中，获得的DNA为双链DNA。在一些实施例中，dsDNA包括六个区：启动子区【1041】、部分测序接头区【1042】、随机聚体细胞标签【1043】和通用序列【1044】。该启动子区可以是T7启动子。部分测序接头可以是部分Illumina接头。通用序列可以通过GGG终止。然后进行体内转录反应【1002】，从而产生RNA寡核苷酸产物【1050】。在一些实施例中，该寡核苷酸产物包括三个区：部分测序接头区【1052】、随机聚体细胞标签【1053】和通用序列【1054】。部分测序接头区可以是部分Illumina接头。通用序列可以通过GGG终止。

与带细胞标签和分子标签的dsDNA偶联的磁珠可以通过图11显示的方法制备。将表面连接有DNA的磁珠放在含寡核苷酸、引物、酶和其它执行PCR所必备的试剂的溶液中。在一些实施例中，连接磁珠【1110】的DNA【1020】包括四个区：启动子区【1121】、部分测序接头区【1122】、随机聚体分子标签【1123】，其中在磁珠上的每个DNA分子含有不同的分子标签序列，和通用序列【1124】。该启动子区可以是T7启动子。部分测序接头可以是部分Illumina接头。在一些实施例中，溶液中的寡核苷酸【1130】包含三个区：通用序列【1134】、随机聚体细胞标签【1135】和第二通用序列【1136】。第二通用序列可以通过GGG终止。在一些实施例中，溶液【1146】中的引物包括第二通用序列。然后进行PCR。在一些实施例中，PCR为乳剂PCR【1101】。结果，在磁珠上的DNA延展，从而并入其它序列。该反应还可以被设计为使得所获得的与磁珠偶联的DNA为dsDNA。在一些实施例中，dsDNA包括六个区：启动子区【1151】、部分测序接头区【1152】、随机聚体分子标签【1153】，其中磁珠上的每个dsDNA分子含有不同的分子标签序列、第一通用序列【1154】、随机聚体细胞标签【1155】和第二通用序列【1156】。该启动子区可以是T7启动子。部分测序接头区可以是部分Illumina接头。第二通用序列可以通过GGG终止。然后进行体内转录反应【1102】，从而产生RNA寡核苷酸产物【1160】。在一些实施例中，该寡核苷酸产物包括五个区：部分测序接头区【1162】、随机聚体分子标签【1163】，其中来自磁珠上不同dsDNA分子的寡核苷酸产物含有不同的分子标签序列，第一通用序列【1164】、随机聚体细胞标签【1165】和第二通用序列【1166】。部分测序接头区可以是部分Illumina接头。第二通用序列可以通过GGG终止。

图12描述了制备偶联含有细胞标签的dsDNA的磁珠的另一种方法。在一些实施例中，与磁珠【1210】结合的DNA【1211】包括一个区：接头区【1211】。所述的接头区可以是454A接头。在一些实施例中，溶液中的寡核苷酸【1220】包括七个区：第一接头区【1221】、启动子区【1222】、部分测序接头区【1223】、随机聚体细胞标签区【1224】、通用序列【1225】、限制位点【1226】和第二接头区【1227】。第一和第二接头区可以分别是454A和454B接头。该启动子区可以是T7启动子。部分测序接头区可以是部分Illumina接头。通用序列可以通过GGG终止。在一些实施例中，溶液【1237】中的引物含有第二接头区序列。所述的第二接头区可以是454B接头。然后进行PCR反应。在一些实施例中，PCR为乳剂PCR【1201】。该反应产生与包含多个不同区的dsDNA偶联的磁珠。在一些实施例中，dsDNA【1240】包括七个区：第一接头区【1241】、启动子区【1242】、部分测序接头区【1243】、随机聚体细胞标签区【1244】、通用序列【1245】、限制位点【1246】、和第二接头区【1247】。第一和第二接头区可以分别是454A和454B接头。该启动子区可以是T7启动子。部分测序接头区可以是部分Illumina接头。通用序列可以通过GGG终止。然后可以进行限制性酶切。在一些实施例中，限制性酶切为平端限制性酶切【1202】。这就改变了与磁珠表面结合的dsDNA。在一些实施例中，表面结合的DNA然后包括五个区：接头区【1251】、启动子区【1252】、部分测序接头区【1253】、随机聚体细胞标签区【1254】、和通用序列【1255】。接头区可以是454A接头。该启动子区可以是T7启动子。部分测序接头区可以是部分Illumina接头。通用序列可以通过GGG终止。然后进行体内转录反应【1203】，从而生成RNA寡核苷酸产物【1260】。在一些实施例中，寡核苷酸产物包括三个区：部分测序接头区【1263】、随机聚体细胞标签【1264】和通用序列【1265】。部分测序接头区可以是部分Illumina接头。第二通用序列可以通过GGG终止。

图13描述了制备偶联含有细胞标签的dsDNA的磁珠的另一种方法。在一些实施例中，与磁珠【1310】结合的DNA【1311】包含一个区：接头区【1311】。所述的接头区可以是454A接头。在一些实施例中，溶液中的寡核苷酸【1320】包括五个区：接头区【1321】、启动子区【1322】、部分测序接头区【1323】、随机聚体细胞标签区【1324】、和通用序列【1325】。接头区可以是454A接头。该启动子区可以是T7启动子。部分测序接头区可以是部分Illumina接头。通用序列可以通过GGG终止。在一些实施例中，溶液【1335】中的引物包括通用序列。通用序列可以通过GGG终止。然后进行PCR反应。在一些实施例中，PCR为乳剂PCR【1301】。PCR反应会产生与含有细胞标签和显示区的dsDNA偶联的磁珠。在一些实施例中，dsDNA【1340】包括五个区：接头区【1341】、启动子区【1342】、部分测序接头区【1343】、随机聚体细胞标签区【1344】和通用序列【1345】。接头区可以是454A接头。该启动子区可以是T7启动子。部分测序接头区可以是部分Illumina接头。通用序列可以通过GGG终止。第一和第二接头区可以分别是454A和454B接头。该启动子区可以是T7启动子。部分测序接头区可以是部分Illumina接头。通用序列可以通过GGG终止。然后进行体内转录【1302】，从而产生RNA寡核苷酸产物【1350】。在一些实施例中，寡核苷酸产物包括三个区：部分测序接头区【1353】、随机聚体细胞标签【1354】和通用序列【1355】。部分测序接头区可以是部分Illumina接头。通用序列可以通过GGG终止。

实施例2-通过液滴合并产生高通量单一细胞RNA标记

将含有细胞群的第一溶液通过液滴发生器(如BioRad QX200系统，DolomiteMicrofluidics系统，Micronit Microfluidics系统，油包水型微流控T型接合装置)分成第一系列的液滴，具体采用Poisson分配统计学以保证每个液滴含有0或1个细胞。含有来自实施例1的磁珠群、寡核苷酸、引物、酶和其它PCR体内转录和反转录必需的试剂的第二溶液通过液滴发生器分成第二系列的液滴，具体采用Poisson分配统计学以保证每个液滴含有0或1个细胞。液滴发生器系统可以产生成千上万的液滴，实现高通量的筛选。双链DNA(dsDNA)结合在磁珠表面上。dsDNA可以含有：(a)用于启动子区(如T7启动子)的序列；(b)测序仪接头区；(c)对于在磁珠上每个DNA分子不同的随机聚体分子标签区；(d)第一通用序列；(e)通过GGG终止的第二通用序列；和/或(f)对于特定磁珠上每个DNA分子为相同的随机聚体细胞标签区。来自第一系列的含有0个细胞的液滴被丢弃，并且来自第二系列的含有0个细胞的液滴被丢弃。液滴的丢弃通过液滴分选器(如荧光激活液滴分选(FADS)系统)进行。

在第一系列液滴和第二系列液滴内会进行一系列反应。这些反应可以平行进行或按顺序进行。第一系列液滴的细胞裂解是在液滴内进行。然后对来自细胞裂解物的mRNA进行反转录，从而在液滴内生成cDNA转录子。反转录反应可以采用对于mRNA某区域是特异性的引物进行；在一些实施例中，引物为通用引物(如QIAGEN QuantiTect ReverseTranscription Kit中描述)。(在一些实施例中，反转录反应是在第一系列液滴中的液滴与其它液滴，如来自第二系列液滴种的液滴合并后发生)。在第二系列液滴中，磁珠上的DNA分子作为液滴内的体内转录反应的模板，其从编码细胞和/或分子标签的DNA分子产生一系列的mRNA转录子。(在一些实施例中，体内转录反应可以在第二个系列液滴中的液滴和其它液滴，如第一个系列液滴中的液滴合并后发生)。

采用微流控装置(如RainDance RainDrop系统，Dolomite Microfluidics系统)，每个含有细胞裂解物的单一液滴与含有单一磁珠转录子的液滴合并。mRNA标签中的GGG序列然后与细胞cDNA中突出的CCC杂交。然后采用RNA标签作为用于延伸反应的模板进行反转录反应(如图3，步骤【303】)，产生用DNA分子/细胞标签标记的细胞cDNA。

对汇聚的cDNA进行常规PCR，以进一步扩增产物。针对用于测序的目标基因进行靶向特异性PCR。这些靶向特异性PCR产物含有目标基因和随机聚体细胞和分子标签以及测序接头序列。这些靶向特异性PCR产物被测序(如通过Illumina测序，其中在PCR产物中的测序接头序列为Illumina标签)。细胞标签序列中的信息用于将特定遗传学信息与特定细胞进行关联。分子标签序列中的信息用于将特异性遗传学信息与每个细胞的特异性起源mRNA分子相关联，从而能矫正PCR扩增的偏差。

实施例3-测量免疫反应

对含有细胞群的样品进行功能性免疫反应(IR)试验，所述的细胞群中的每个细胞表达不同的免疫受体，并且包括编码免疫球蛋白重链或TCRβ、免疫球蛋白轻链或TCRα的基因和与免疫功能相关的各种其他基因。样品被分成含免疫细胞的分区。每个分区细胞群可以被裂解，其RNA可以被提取。通过采用免疫球蛋白或T细胞受体和含分子标签的模板切换寡核苷酸以及接头序列执行反转录反应而使细胞群中的RNA被分子标签所标记，其中所述的分子标签对于来自给定细胞的每个分子是不同的。

标记后，被标记的RNA或其相应地cDNA被汇聚、扩增和测序分析。来自表达RNA的信息可以与来自分子标签的信息组合使用，以确定主体免疫反应的多样性。

实施例4-单一细胞水平的免疫反应的测量

对包含单一细胞的群(【611】、【612】、【613】、【614】、【615】、【616】、【617】、【618】、【619】)进行功能性免疫反应(IR)试验，每个细胞表达不同的免疫受体【603】，并包含编码免疫球蛋白重链或TCRβ【601】、免疫球蛋白轻链或TCRα【602】的基因和与免疫功能相关的各种其他基因【604】。样品被分成含有不超过1个细胞的分区。每个分区细胞可以被裂解，其RNA可以被提取【605】。来自每个单一细胞的RNA被细胞标签所标记，其中所述的细胞标签对于来自一个特定细胞的每个分子都相同，并且来自每个单一细胞的RNA也可以被分子标签标记，其中来自所述的分子标签对于来自给定细胞的每个分子不同。

标记后，被标记的RNA或其相应的cDNA(【621】、【622】、【623】、【624】、【625】、【626】、【627】、【628】、【629】)被汇聚、扩增和测序【606】以进行分析。表达RNA中的信息可以与细胞和/或分子标签中的信息组合使用，以基于它们的免疫功能基因表达(【631】、【632】、【633】、【634】、【635】、【636】、【637】、【638】、【639】)，将细胞分类成组。这个捕获传统上通过多种试验提供的信息。例如，免疫反应试验可以提供与来自免疫组库试验【710】、流式细胞仪【720】和基因表达试验【730】的信息类似的信息。

实施例5-单一细胞cDNA标记

图14描述了将细胞标签结合到从细胞mRNA生产的cDNA的5’端(对应于mRNA3’端)上，而将分子标签结合到cDNA的3’端(对应于mRNA的5’端)上。在这个实例中，采用RACE结合分子标签，并且使用cDNA合成引物添加细胞标签。可以使用相同方法将细胞标签结合在cDNA的3’端上，而将分子标签结合到cDNA的5’端上。

将一个细胞或来自一个细胞的裂解物放入一个区室。如果细胞之前没有被裂解，则该细胞在区室内裂解。裂解物包括含mRNA序列和聚(A)尾【1414】的mRNA分子【1410】。区室还含有oligodT分子【1420】。在一些实施例中，oligodT分子包括五个区：NVT区【1425】、TCA区【1426】、第一通用序列【1427】，随机聚体细胞标签区【1428】，其中，区室内的所有oligodT分子具有相同的细胞标签序列，和第二通用序列【1429】。区室还包括寡核苷酸【1430】，寡核苷酸【1430】可以包括三个区：通用序列【1431】，随机聚体分子标签【1432】，其中，区室内的所有寡核苷酸具有不同的分子标签序列，和突出区【1433】。采用对应于在mRNA【1410】的引物聚A尾的寡核苷酸T分子区【1425】可以进行反转录反应。包含分子标签的模板切换寡核苷酸【1430】然后可以用作用于5’RACE试验的模板，以在cDNA分子上添加分子标签。这样产生cDNA分子产物【1440】。在一些实施例中，cDNA包含九个区：第一通用序列【1441】、随机聚体分子标签【1432】，其中区室内所有原始寡核苷酸具有不同的分子标签序列、突出区【1433】、mRNA信息序列【1444】，其含有原始mRNA分子的信息、NVT区【1435】、TCA区【1436】、第二通用序列【1437】，随机聚体细胞标签区【1438】，其中区室内所有cDNA分子具有相同的细胞标签序列、和第三通用序列【1439】。

然后，区室内的标记cDNA产物与来自其它区室内的标记cDNA产物汇聚，并通过常规PCR进行扩增。扩增后的cDNA产物【1510】包括九个区：第一通用序列【1511】、随机聚体分子标签【1512】，其中给定区室内的所有原始寡核苷酸具有不同的分子标签序列、突出区【1513】、mRNA信息序列【1514】，其含有原始mRNA分子的信息、NVT区【1515】、TCA区【1516】、第二通用序列【1517】、随机聚体细胞标签区【1518】，其中来自给定区室(以及因此来自这些分子的产物)的所有cDNA分子具有相同的细胞标签序列、和第三通用序列【1519】。这些PCR产物融化，并用酶对单链DNA(ssDNA)进行循环。循环产物cDNA分子包括九个区：第一通用序列【1521】、随机聚体分子标签【1522】，其中来自给定区室的所有原始寡核苷酸具有不同的分子标签序列、突出区【1523】、mRNA信息序列【1524】，其含有来自原始mRNA分子的信息、NVT区【1525】、TCA区【1526】、第二通用序列【1527】、随机聚体细胞标签区【1528】，其中来自给定区室(以及因此来自这些分子的产物)的所有cDNA分子具有相同的细胞标签序列、和第三通用序列【1529】。循环使各区可以重新排序以将用于测序的目标区聚集在一起。进行靶特异性PCR以扩增含有目标基因、细胞标签和分子标签的区，然后可以测序，并处理信息。靶特异性PCR产物可以包括七个区：第一通用序列【1531】、随机聚体分子标签【1532】，其中来自给定区室的所有原始寡核苷酸具有不同的分子标签序列、突出区【1533】、mRNA信息序列【1534】，其含有来自原始mRNA分子的信息、第二通用序列【1537】、随机聚体细胞标签区【1538】，其中来自给定区室(产物是由这些分子产生)的所有cDNA分子具有相同的细胞标签序列、第三通用序列【1539】。

实施例6-采用微孔阵列进行单一细胞cDNA标记

实施例4描述的单一细胞cDNA标记可以采用微孔阵列板上的孔作为区室【1610】来进行，如图16所描绘的。oligodT分子可以与磁珠(【1611】、【1612】、【1613】、【1614】、【1615】、【1616】)偶联，每个孔内沉积一个磁珠。微孔阵列板可以设计为每个孔仅允许有一个磁珠。例如，孔的直径可以不超过100微米。主cDNA混合物包括必要的试剂和酶，包括带有随机聚体分子标签的寡核苷酸，以便如实施例4所述，生成标记cDNA产物。主cDNA混合物也可以沉积在孔中。随机模板切换寡核苷酸也可以沉积在孔中。孔还可以有选择地含有裂解试剂。第二微孔阵列板【1620】也负载细胞(【1621】、【1622】、【1623】、【1624】、【1625】、【1626】)，每个孔不超过一个细胞。微孔阵列板可以设计为每个孔仅允许有一个细胞。例如，孔的直径可以不超过30微米。细胞可以在PBS溶液中。两个微孔阵列板比对，使第一个板上的单个孔与第二个板【1601】上的单个孔接触。孔可以放置在42℃恒温箱中。一个孔中的细胞与另外一个孔中的cDNA混合物的接触引起细胞裂解【1602】。裂解后，可以收集磁珠，并且可以在磁珠上进行常规PCR。在一些实施例中，通过匹配的微孔形成的区室用作用于如实施例4中所描述的工艺的区室。

实施例7-采用微阵列进行单一细胞cDNA标记

实施例4中描述的单一细胞cDNA标记可以使用在微阵列的彼此分开的阵列点作为区室【1640】进行。oligodT分子可以与阵列(【1641】、【1642】、【1643】、【1644】、【1645】、【1646】)上的单一阵列点结合，这些阵列点彼此分开以形成区室。在一些实施例中，通过将PDMS膜与壁或腔室特征比对而在阵列表面实现分区。主cDNA混合物包括必要的试剂盒和酶，包括带有随机聚体分子标签的寡核苷酸，以生成实施例4中所描述的标记cDNA产物。主cDNA混合物可以沉积在腔室内。微孔阵列板【1650】负载细胞(【1651】、【1652】、【1653】、【1654】、【1655】、【1656】)，每个孔中不超过一个细胞。细胞可以在PBS溶液中。微孔阵列板和微阵列比对，以将微孔阵列板上的单个孔与第二个板【1601】的单个腔室接触。一个孔内的细胞与另一个孔中的cDNA的接触引起细胞的裂解【1603】。通过匹配的微孔和微阵列腔室形成的区室然后用作用于实施例4中所描述的工艺的区室。

Claims (26)

1.一种标记靶寡核苷酸的方法，其包括：

a.将DNA分为多个区室；

b.在所述区室内在所述DNA上进行体外转录反应，从而获得含有RNA的区室；

c.将所述含有RNA的区室的内部与含有靶寡核苷酸的成组的区室的内部合并；

d.使所述RNA与所述靶寡核苷酸杂交；以及

e.执行反应，以将对应于所述RNA的序列附接到所述靶寡核苷酸，由此提供标记的靶寡核苷酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA为双链。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述区室为油和水的乳剂内的液滴。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记的靶寡核苷酸包括至少一个包含细胞标签和分子标签的靶寡核苷酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶寡核苷酸为互补DNA(cDNA)或信使RNA(mRNA)。

6.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括，在步骤(c)的所述合并之前，将所述靶寡核苷酸分为所述成组的区室。

7.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括，在步骤(c)的所述合并之前，将成组的细胞分成所述成组的区室并且裂解所述细胞，以便释放细胞寡核苷酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞寡核苷酸为所述靶寡核苷酸。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞寡核苷酸为细胞mRNA。

10.根据权利要求9所述的方法，其进一步包括在所述细胞mRNA上进行反转录，以生成细胞cDNA。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶寡核苷酸为细胞cDNA。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应为cDNA末端快速扩增(RACE)反应。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述反转录是利用对基因组区具有特异性的引物进行的。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA与固相支持物偶联。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述固相支持物为磁珠。

16.根据权利要求10所述的方法，其中所述反转录在所述合并步骤前，在所述成组的区室内进行。

17.根据权利要求10所述的方法，其中所述反转录在合并后的区室内进行。

18.根据权利要求13所述的方法，其中所述基因组区为免疫球蛋白基因或T细胞受体基因。

19.根据权利要求2所述的方法，其中所述双链DNA包含启动子区、部分测序接头区、随机聚体细胞标签以及通用序列。

20.根据权利要求2所述的方法，其中所述双链DNA包含启动子区、部分测序接头区、随机聚体细胞标签以及通用序列，其中每个DNA分子含有不同的分子标签序列。

21.根据权利要求14和15中任一项所述的方法，其中所述DNA包含分子标签。

22.根据权利要求4所述的方法，其中执行反应以附接序列包括将包含细胞标签和分子标签的序列附接到所述靶寡核苷酸。

23.根据权利要求18所述的方法，其中所述基因组区包含免疫球蛋白重链(IgH)、免疫球蛋白轻链(IgL)、T-细胞受体β(TCRb)或T-细胞受体α(TCRa)基因。

24.根据权利要求4所述的方法，其中所述分子标签是寡聚体。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述寡聚体是随机寡聚体。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述随机寡聚体是至少9聚

体。

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