JP2004097158A - 発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法、及び該ｃＤＮＡタグを用いる遺伝子発現解析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法、及び遺伝子発現解析方法を提供する。
【解決手段】１種類のＩＩ型制限酵素、３種類のＩＩＳ型制限酵素、該３種類のＩＩＳ型制限酵素を利用し、第１、及び第２の酵素の認識配列を含むリンカーＸ、並びに第３の酵素の認識配列を含むリンカーＹを組み合わせることにより発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを作成する。
【効果】該ｃＤＮＡタグをそのまま又は連結工程等を実施して連結物を得て、発現遺伝子の解析を効率的に行なことができる。
【選択図】 なし
【解決手段】１種類のＩＩ型制限酵素、３種類のＩＩＳ型制限酵素、該３種類のＩＩＳ型制限酵素を利用し、第１、及び第２の酵素の認識配列を含むリンカーＸ、並びに第３の酵素の認識配列を含むリンカーＹを組み合わせることにより発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを作成する。
【効果】該ｃＤＮＡタグをそのまま又は連結工程等を実施して連結物を得て、発現遺伝子の解析を効率的に行なことができる。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法、該ｃＤＮＡタグライブラリー、及び遺伝子発現解析方法に関するものである。さらに詳細に述べると、発現遺伝子産物であるｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ又はそのｃＤＮＡ断片の特定領域に対応する、同定用ｃＤＮＡタグを作成する方法、及び該ｃＤＮＡタグを利用した遺伝子発現解析方法に関するものである。該遺伝子発現解析方法は、該ｃＤＮＡタグをそのまま用いる直接的な方法と、該ｃＤＮＡタグの連結物を用いる間接的な方法とを含んでいる。
【０００２】
【従来の技術】
各生物種は独自のゲノム配列に基づく、固有の遺伝子発現パターンを有し、また、生物の種が同一でも、細胞の分化の程度、増殖、老化などの生理的状態や、癌化、感染症、免疫病などの各種病的状態などにより、正常な状態と比べ異なる遺伝子発現パターンを有すると考えられている。したがって、このような遺伝子発現パターンを確立し、細胞間の遺伝子発現パターンを相互に比較することができれば、適切な治療ターゲットの同定、遺伝子治療用の候補遺伝子の同定、組織タイピング、法的な遺伝子確認、疾病関連遺伝子の位置決定、診断・予診用のインジケーター遺伝子の同定など、遺伝子発現パターンの幅広い応用が可能になる。
【０００３】
従来、遺伝子発現を評価するため、ノーザンブロッティング法、ＲＮアーゼプロテクション法、及び逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析法（Ａｌｗｉｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７４：５５５０、１９７７； Ｚｉｎｎら、Ｃｅｌｌ、３４：８６５、１９８３； Ｖｅｒｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３７：４１５、１９８７年）、さらに遺伝子を検索するための有用なエクスプレスド・シークエンス・タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ： ＥＳＴ）法（Ａｄａｍｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６５６、１９９１年； Ａｄａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３５５： ６３２、１９９２年；Ｏｋｕｂｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２：１７３、１９９２年）などが開発されたが、一度に限られた数の遺伝子しか評価できなかった。例えば、Ｏｋｕｂｏらは二本鎖ｃＤＮＡを４塩基認識酵素Ｓａｕ３ＡＩで切断し、ｍＲＮＡの３’末端部分だけからなるｃＤＮＡライブラリーを得て、これをクローニングしてランダムに塩基配列決定を行い遺伝子発現プロフィールを得る方法を開発した［Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２、 １７３（１９９２年）］が、この方法で得られるそれぞれのクローンの長さは平均約３００塩基であり、配列決定は一クローンずつ行わねばならず、このため最終的に配列決定されたｍＲＮＡの総数は一つの細胞種当たりわずか１０００個程度であって、細胞における真の遺伝子発現パターンからは程遠いものであった。また、これらの方法は、大量の原材料（例えば、ヒトの組織）が必要なこと、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を繰り返すためバイアスがかかること、結果に再現性がないこと等の理由により、研究室で用いられているに過ぎないのが現状であった。
【０００４】
近年、発現された遺伝子の領域に対応する転写産物の限定領域を同定することにより、多数の転写産物を分析することができる遺伝子発現の逐次分析（ｓｅｒｉａｌａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ： ＳＡＧＥ）法が開発された（国際公開公報ＷＯ９７／１０３６３、 米国特許出願第５，６９５，９３７号及び第５，８６６，３３０号）。この方法では、試料中の各ｃＤＮＡに対応する短いヌクレオチド配列が二量体化された「ジタグ」（ｄｉｔａｇ）と称するタグを調製し、このジタグを鎖状に連結して単一の連結物（コンカテマー）としてクローン化しタグの配列決定により遺伝子発現パターンを明らかにするものである。このＳＡＧＥ法では、試料中の各ｃＤＮＡに対応する単一の発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを得ることはできず、また一度に同定できる発現遺伝子の数は連結物が含み得るジタグの限界から１０００以下、通常４００以下である。
【０００５】
本発明者らは、このような従来の遺伝子発現パターンなどを解析する方法の欠点、及び低い解析限界を克服するため、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法、及び該ｃＤＮＡタグを用いる遺伝子発現解析方法を開発した（国際特許出願第ＰＣＴ／ＪＰ０２／０２３３８号）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、本発明者らが先に出願した国際特許出願第ＰＣＴ／ＪＰ０２／０２３３８号にかかる、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法、及び遺伝子発現解析方法に対し、使用できる制限酵素の選択の幅を拡げ、使用するリンカーの製造を容易にするなどの改良を加えた該ｃＤＮＡタグの作成方法、及び遺伝子発現解析方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、各生物種に固有な遺伝子発現パターン、及び細胞の生理的状態、発生段階、各種病的状態などにおける特有な遺伝子発現パターンの効率的な解析を可能にする、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法、及び該同定用タグを用いる遺伝子発現解析方法を提供する。本発明の方法は、従来の技術に比べ、遺伝子発現の解析に要する細胞試料の量が少なくて済み、効率的で、かつ信頼度の高いものである。
【０００８】
すなわち、本発明が提供するのは、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法であって：相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を準備し；該ｃＤＮＡをＩＩ型制限酵素で切断してｃＤＮＡ断片を作成し；該ｃＤＮＡ断片に、第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含み、かつ前記ＩＩ型制限酵の切断末端との連結部分に第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を生じるリンカーＸを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素で切断して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグの第２ＩＩＳ型制限酵素による切断末端に、第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を増幅し；かつ、得られた増幅産物を第１ＩＩＳ型制限酵素及び第３ＩＩＳ型制限酵素で同時にあるいは順次に切断して、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを得る前記作成方法である。
【０００９】
また、本発明が提供するのは、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法であって：相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を準備し；該ｃＤＮＡをＩＩ型制限酵素で切断してｃＤＮＡ断片を作成し；該ｃＤＮＡ断片に、第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素で切断して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグの第２ＩＩＳ型制限酵素による切断末端に、第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を増幅し；かつ、得られた増幅産物を第１ＩＩＳ型制限酵素で切断して、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを得る前記作成方法である。
【００１０】
さらに、本発明は、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法であって：相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を準備し；該ｃＤＮＡをＩＩ型制限酵素で切断してｃＤＮＡ断片を作成し；該ｃＤＮＡ断片に、第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素で切断して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグの第２ＩＩＳ型制限酵素による切断末端に、第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を増幅し；かつ、得られた増幅産物を第１ＩＩＳ型制限酵素及び第３ＩＩＳ型制限酵素で同時にあるいは順次に切断して、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを得る前記作成方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸを提供する。
さらに、本発明は、前記発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法で得られたｃＤＮＡタグライブラリーを、検出すべき核酸を固定した検出装置に接触させることを特徴とする遺伝子発現解析方法を提供する。
さらに、本発明は、同定すべき一群の核酸を含むライブラリーを、本発明で得られた同定用ｃＤＮＡタグを固定した検出装置に、接触させることを特徴とする遺伝子発現解析方法を提供する。これらの検出装置としてＤＮＡチップを用いることができる。
さらに、本発明は、前記発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法で得られた該タグを互いに連結する工程、及び該連結物の塩基配列を決定する工程を含む発現遺伝子解析方法を提供する。該解析方法には、該連結物の配列を決定し、その配列からそれぞれのｃＤＮＡタグの配列を決定する定性的解析方法、及びその配列からそれぞれのｃＤＮＡタグの配列及び出現頻度を求める、定量的発現遺伝子解析方法が含まれる。
【００１２】
さらに、本発明が提供するのは、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグ作成キットであって、ＩＩ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素、第２ＩＩＳ型制限酵素、第３ＩＩＳ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含み、かつ前記ＩＩ型制限酵の切断末端との連結部分に第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を生じるリンカーＸ、及び第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを含む、該キットである。
さらに、本発明が提供するのは、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグ作成キットであって、ＩＩ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素、第２ＩＩＳ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素および第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸ、第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹ、を含む該キットである。
【００１３】
さらに、本発明が提供するのは、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグ作成キットであって、ＩＩ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素、第２ＩＩＳ型制限酵素、第３ＩＩＳ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素および第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸ、及び第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを含む、該キットである。
なお、発現遺伝子同定用タグ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃＤＮＡ Ｔａｇ）を、必要に応じてＥＧＩ ｃＤＮＡ タグ又はＥＧＩタグという略号で表す。
ここで、本発明は基本的な原理について説明する。
第一は、遺伝子転写産物内の一定の位置から単離された短いヌクレオチド配列のタグが、その転写産物を同定するのに十分な情報量を含むということである。例えば、９ ｂｐの配列のタグは、４の９乗、すなわち２６２，１４４種の配列が可能であり、これに対応する同数の転写産物を識別することができる。一方、ヒト・ゲノムは約８０，０００〜２００，０００ の転写産物をコードすると示唆されている（Ｆｉｅｌｄｓら、 Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７：３４５、１９９４年） 。したがって、理論的には９ ｂｐの配列のタグを得られれば、すべてのヒト遺伝子転写産物を同定することができる。
【００１４】
下等な真核生物や原核生物の場合、ゲノムによりコードされる転写産物の数はより少ないので、タグのサイズをもっと短くすることができる。例えば、酵母では転写産物を識別するのに６〜７ ｂｐ ほどの短いタグで十分である。本発明の方法は、それぞれの遺伝子転写産物に対応する、様々なヌクレオチド長さを有する、単一の発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを提供するので、遺伝子発現パターンを解析するのに有益である。
【００１５】
第二は、上流及び下流をリンカーに挟まれた単一の短いｃＤＮＡタグを１回増幅処理するだけで、発現遺伝子の解析を行なうことができるので、増幅及び／又はクローニングに起因するバイアスが起こり難いことである。
第三は、本発明の方法により得られたＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーを利用して、ＥＧＩｃＤＮＡタグ配列に対応するｃＤＮＡを定性的、また定量的に測定し、対応する発現遺伝子のパターンを調べられることである。
第四は、本発明の方法で作成された同定用ｃＤＮＡタグにより、スペーサー配列の無い、又は有る連結物（コンカテマー）を作成し、必要に応じてベクターなどを用いてクローン化し連続的、かつ効率的に解析することができる。特に、該ｃＤＮＡタグがそれぞれ独立した配列なので、連結物の配列を解析するのも容易であるし、連結物から単独のｃＤＮＡタグを単離することも容易に行なうことができる。
なお、本発明と先に記載したＳＡＧＥ法とは、短いヌクレオチド配列のタグが転写産物を同定するのに十分な情報量を含むという第一原理を応用する点で共通する。しかし、ＳＡＧＥ法は、「ジタグ」（ｄｉｔａｇ） と称する二量体化されたタグを利用するものであり、本発明で作成される単一の同定用ｃＤＮＡタグ、そのライブラリー、単一の同定用ｃＤＮＡタグからなる連続体を作成しないという点で相違する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明の好ましい実施の形態による発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグ（以下、ＥＧＩｃＤＮＡタグという。）の作成方法を、図１〜６に示すフローチャートに基づき説明する。
なお、本発明の発現遺伝子同定用タグの作成方法には、主として三態様がある。すなわち、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグの第２ＩＩＳ型制限酵素による切断末端に、第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを連結する工程を有する方法（本発明の実施態様１）、所定のｃＤＮＡ断片に第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸを連結する工程を有する方法（本発明の実施態様２）、及び前記リンカーＸ及びリンカーＹを含む両工程を組み合わせ方法（本発明の実施態様３）である。
【００１７】
本発明の実施態様１のＥＧＩｃＤＮＡタグの作成方法を、図１及び２に基づいて示すと次のとおりである。
（１）相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を準備し、
（２）該ｃＤＮＡをＩＩ型制限酵素ＲｓａＩで切断してｃＤＮＡ断片を作成し；
（３）該ｃＤＮＡ断片に、第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩの認識配列を含み、かつ前記ＩＩ型制限酵：ＲｓａＩの切断末端との連結部分に第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩの認識配列を生じるリンカーＸを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成し；
（４）該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩで切断して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を作成し；
（５）必要に応じて該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を純化し；
（６）必要に応じて該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物のｃＤＮＡタグの末端を、第３ＩＩＳ型制限酵素Ｅｃｉｌの認識配列を含むリンカーＹが結合可能な状態に処理した後、（７） 該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグの第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩによる切断末端に、第３ＩＩＳ型制限酵素Ｅｃｉｌの認識配列を含むリンカーＹを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を作成し；
（８）該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を増幅し；かつ
（９）得られた増幅産物を第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩ及び第３ＩＩＳ型制限酵素Ｅｃｉｌで同時、又は順次切断して、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを得て、
（１０）必要に応じて、得られた発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを分離することを含む、ＥＧＩｃＤＮＡタグの作成方法。
【００１８】
なお、説明を容易にするため、本発明の実施態様１では各制限酵素を具体的に記載しているが、もちろん、幅広く、様々な制限酵素を使用できる。実施態様１で用いるリンカーＸは、第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含み、かつＩＩ型制限酵の切断末端との連結部分に第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を生じるリンカーであり、リンカーＹは、第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーである。
なお、実施態様１で用いるリンカーＸ、リンカーＹ、プライマーＸ及びプライマーＹのそれぞれの配列の例を下記に示す。
【００１９】
リンカーＸ：
５’−…ＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＮＮＮＮＧＧＧ…−３’（配列番号１）
３’−…ＮＮＮＮＮＮＮＣＴＣＣＴＣＮＮＮＮＮＣＣＣ…−５’（配列番号２）
リンカーＹ：
５’−…ＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＣＧＣＣＮＮＮＮＮＮＮ…−３’（配列番号３）
３’−…ＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＧＣＧＧＮＮＮＮＮＮＮ…−５’（配列番号４）
プライマーＸ：
５’−…ＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＮＮＮＮＧＧＧＡＣ…−３’（配列番号５）
プライマーＹ：
３’−…ＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＧＣＧＧＮＮＮＮＮＮＮ…−５’（（配列番号６）
本発明の実施態様２のＥＧＩｃＤＮＡタグの作成方法を、図３及び４に基づいて示すと次のとおりである。
【００２０】
（１）相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を準備し、
（２）該ｃＤＮＡをＩＩ型制限酵素Ｃｓｐ６Ｉで切断してｃＤＮＡ断片を作成し；
（３）該ｃＤＮＡ断片に、第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩ並びに第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｇＩの認識配列を含むリンカーＸを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成し；
（４）該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｇＩで切断して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を作成し；
（５）必要に応じて該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を純化し；
（６）必要に応じて該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物のｃＤＮＡタグの末端を、第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹが結合可能な状態に処理した後、
（７）該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグの第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｇＩによる切断末端に、第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩの認識配列を含むリンカーＹを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を作成し；
（８）該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を増幅し；かつ
（９）得られた増幅産物を第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩで切断して、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを得て、
（１０）必要に応じて、得られた発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを分離することを含む、ＥＧＩｃＤＮＡタグの作成方法。
【００２１】
なお、説明を容易にするため、実施態様２でも各制限酵素を具体的に記載しているが、もちろん、幅広く、様々な制限酵素を使用できる。実施態様２で用いるリンカーＸは、第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｇＩの認識配列を含むリンカーであり、リンカーＹは、リンカーＸと同じ第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーである。
なお、実施態様２で用いるリンカーＸ、リンカーＹ、プライマーＸ及びプライマーＹのそれぞれの配列を下記に示す。
【００２２】
リンカーＸ：
５’−…ＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＧＴＧＣＡＧ…−３’（配列番号７）
３’−…ＮＮＮＮＮＮＮＣＴＣＣＴＣＮＣＡＣＧＴＣＡＴ…−５’（配列番号８）
リンカーＹ：
５’−…ＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＣＴＣＣＴＣＮＮＮＮＮＮＮ…−３’（配列番号９）
３’−…ＮＮＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮ…−５’（配列番号１０）
プライマーＸ：
５’−…ＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＧＴＧＣＡＧＴＡＣ…−３’（配列番号１１）
プライマーＹ：
３’−…ＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮ…−５’（（配列番号１２）
本発明の実施態様３のＥＧＩｃＤＮＡタグの作成方法を、図５及び６に基づいて示すと次のとおりである。
【００２３】
（１）相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を準備し、
（２）該ｃＤＮＡをＩＩ型制限酵素Ｃｓｐ６Ｉで切断してｃＤＮＡ断片を作成し；
（３）該ｃＤＮＡ断片に、第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩ及び第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｇＩの認識配列を含むリンカーＸを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成し；（４）該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｇＩで切断して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を作成し；
（５）必要に応じて該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を純化し；
（６）必要に応じて該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物のｃＤＮＡタグの末端を、第３ＩＩＳ型制限酵素Ｅｃｉｌの認識配列を含むリンカーＹが結合可能な状態に処理した後、（７）該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグの第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｇＩによる切断末端に、第３ＩＩＳ型制限酵素Ｅｃｉｌの認識配列を含むリンカーＹを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を作成し；
（８）該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を増幅し；かつ
（９）得られた増幅産物を第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩ並びに第３ＩＩＳ型制限酵素Ｅｃｉｌで切断して、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを得て、
（１０）必要に応じて、得られた発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを分離することを含む、ＥＧＩｃＤＮＡタグの作成方法。
【００２４】
なお、説明を容易にするため、実施態様３でも各制限酵素を具体的に記載しているが、もちろん、幅広く、様々な制限酵素を使用できる。実施態様３で用いるリンカーＸは、第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーであり、リンカーＹは、第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーである。
さらに、本発明を、実施態様３に基づき詳細に説明する。なお、ここに記載する制限酵素、処理手順は特に断らない限り、本発明全体に適用することができる。
（１）の工程では、試料となるｃＤＮＡを準備する。通常、まず被検細胞からｍＲＮＡを調製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作成する。該ｃＤＮＡは、全長ｍＲＮＡに対応するもの及びそのフラグメントのいずれであってもよい。該被検細胞は、３’末端にポリＡテールを有するｍＲＮＡを産生する細胞である限り限定されず、動物細胞、植物細胞、微生物細胞等のあらゆる細胞を含む。ウイルス感染した動物細胞、植物細胞、微生物細胞を被検細胞として用いることもできる。
【００２５】
本発明では、１μｇのｍＲＮＡがあれば解析を行うことができる。１μｇのｍＲＮＡは、通常１ｍｇの細胞から得られるので、本発明は、ニードルバイオプシーなどで得た貴重な人体組織サンプルなど取り扱う際には特に有効である。
被検細胞からのｍＲＮＡの分離は、通常行われる手法により行うことができる。例えば、被検細胞を、グアニジン試薬、フェノール試薬等で処理してトータルＲＮＡを分離後、オリゴｄＴ−セルロースやセファロース２Ｂを担体とするポリＵ−セファロース等を用いるアフィニティーカラム法やバッチ法等によりｍＲＮＡを得る。
次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて、第一鎖ｃＤＮＡ（一本鎖ｃＤＮＡ）を合成後、該第一鎖ｃＤＮＡを鋳型として第二鎖ｃＤＮＡ（二本鎖ｃＤＮＡ）を合成する。ここのオリゴｄＴプライマーとしては、固相固定化オリゴｄＴプライマー、補酵素標識オリゴｄＴプライマー等が挙げられるが、再現性や目的ＤＮＡ断片の回収率の点から、固相固定化オリゴｄＴプライマーが好ましい。該固相固定化オリゴｄＴプライマーには、ラテックスビーズ固定化オリゴｄＴプライマー、マグネットビーズ固定化オリゴｄＴプライマー等があるが、マグネットビーズ固定化オリゴｄＴプライマーが好ましい。
【００２６】
（２）の工程では、試料中の該ｃＤＮＡをＩＩ型制限酵素で切断してｃＤＮＡ断片を作成する。
試料中の該ｃＤＮＡは、固相固定化オリゴｄＴプライマーに結合した二本鎖ｃＤＮＡとすることができる。本明細書中の「ＩＩ型制限酵素」という用語は、所定の認識配列を認識して、該認識配列の内側又はその隣接した特異的な位置でＤＮＡを切断する制限酵素をいう。本発明で用いるＩＩ型制限酵素としては、解析するｍＲＮＡ中に少なくとも１つは認識配列を有すると考えられるもの、例えば、４、５あるいは６個の塩基からなる認識配列を有するＩＩ型制限酵素が好ましい。特にｍＲＮＡの平均鎖長が２０００塩基である点を考慮すると、４の４乗＝２５６塩基に１つの割合で制限部位が出現し得る４塩基の認識配列を有するＩＩ型制限酵素が好ましい。
【００２７】
本発明に用いるＩＩ型制限酵素の例を挙げると、ＡｆａＩ， ＡｌｕＩ， ＣｆｕＩ， ＣｖｉＲＩ， ＤｐｎＩ， ＥｓａＢＣ３Ｉ， ＨｐｙＢＩ， ＨｐｙＣＨ４Ｖ， ＨｐｙＦ４４ＩＩＩ， ＭｌｔＩ， ＰｌａＡＩＩ， ＲｓａＩ， ＢｆａＩ， Ｃｓｐ６Ｉ， ＣｖｉＡＩＩ， ＣｖｉＱＩ， ＣｖｉＲＩＩ， ＦｇｏＩ， ＨｐｙＣＨ４ＩＶ， ＭａｅＩ， ＭａｅＩＩ， ＭｔｈＺＩ， ＲｍａＩ， ＰｐａＡＩＩ，ＴａｑＩ， Ｔｓｐ３２Ｉ， Ｔｓｐ３２ＩＩ， ＴｔｈＨＢ８Ｉ， ＸｓｐＩ， ＢｓｐＫＴ６Ｉ， ＢｓｔＫＴＩ， ＨｐｙＣＨ４Ｉ， ＡｓｐＭＤＩ，Ｂｃｅ２４３Ｉ， Ｂｆｉ５７Ｉ， ＢｆｕＣＩ， Ｂｍｅ１２Ｉ， ＢｓｃＦＩ， Ｂｓｐ６７Ｉ， Ｂｓｐ１０５Ｉ， Ｂｓｐ１４３Ｉ， Ｂｓｐ２０９５Ｉ， ＢｓｐＡＩ， ＢｓｐＦＩ， ＢｓｐＪＩ， Ｂｓｔ１９ＩＩ， ＢｓｔＥＮＩＩ， ＢｔｋＩＩ， ＣａｃＩ， ＣｃｙＩ， ＣｈａＩ， ＣｐｆＩ， ＣｖｉＡＩ， ＤｐｎＩＩ， ＦａｔＩ， ＦｎｕＣＩ， ＦｎｕＥＩ， ＨａｃＩ， Ｋｚｏ９Ｉ， ＬｌａＡＩ， ＭｂｏＩ， ＭｇｏＩ， ＭｋｒＡＩ， ＮｄｅＩＩ， ＮＩａＩＩ， ＮｍｅＣＩ， ＮｐｈＩ， ＲａｌＦ４０Ｉ， Ｓａｕ３ＡＩ， ＳａｕＭＩ， Ｓｔｈ３６８Ｉ， ＣｈａＩ， Ｈｎ１ＩＩ， Ｈｓｐ９２ＩＩ， ＮＩａＩＩＩ， ＴａｉＩ， ＴｓｃＩ， Ｔｓｐ４９Ｉ， ＡｃｃＩＩ， ＢａｎＡＩ， ＢｃｅＢＩ， ＢｅｃＡＩＩ， ＢｅｐＩ， Ｂｉｍ１９ＩＩ， Ｂｍｅ３６１Ｉ， Ｂｐｕ９５Ｉ， ＢｓｅＱＩ， ＢｓｈＩ， Ｂｓｈ１２３６Ｉ， ＢｓｈＦＩ， Ｂｓｐ５０Ｉ， Ｂｓｐ１２３Ｉ， Ｂｓｐ２１１Ｉ， ＢｓｐＢＲＩ， ＢｓｐＫＩ， ＢｓｐＲＩ， ＢｓｔＦＮＩ， ＢｓｔＵＩ， Ｂｓｕ１５３２Ｉ， ＢｓｕＲＩ， ＢｔｇＩ， ＢｔｋＩ， ＣｌｔＩ， Ｃｓｐ６８ＫＶＩ， ＣｓｐＫＶＩ， ＤｓａＩＩ， ＥｓａＢＣ４Ｉ， ＦａｌＩＩ， ＦａｕＢＩＩ， ＦｎｕＤＩ， ＦｎｕＤＩＩ， ＨａｅＩＩＩ， ＭｃｈＡＩＩ， ＭｆｏＡＩ， ＭｆｏＡＩ， ＭｖｎＩ， ＮｇｏＰＩＩ， ＮｓｐＬＫＩ， ＰａｌＩ， Ｐｄｅ１３３Ｉ，ＰｆｌＫＩ， ＰｌａＩ， ＳｂｖＩ， ＳｆａＩ， ＳｕａＩ， ＴｈａＩ， ＡｃｉＩ， Ｂｃｏ２７Ｉ， ＢｓｉＳＩ， Ｂｓｔ４０Ｉ， ＢｓｕＦＩ， ＣｂｏＩ， ＨａｐＩＩ， Ｈｉｎ２Ｉ， Ｈｉｎ６Ｉ， ＨｉｎＰ１Ｉ， ＨｐａＩＩ， ＨｓｏＩ， ＨｓｐＡＩ， ＭｎｏＩ， ＭｓｐＩ， Ｐｄｅ１３７Ｉ， ＳｃｉＮＩ， Ｓｔｈ１３４Ｉ， ＡｓｐＬＥＩ， ＢｓｐＬＡＩ， ＢｓｔＨＨＩ， ＣｆｏＩ， ＦｎｕＤＩＩＩ， ＨｈａＩ， ＳｅｌＩ，ＭｓｅＩ， Ｔｒｕ１Ｉ， Ｔｒｕ９Ｉ， Ｓｓｅ９Ｉ， ＴａｓＩ， Ｔｓｐ５０９Ｉ， 及びＴｓｐＥＩがある。
【００２８】
これらのＩＩ型制限酵素には、認識配列が４塩基 ＡＴＣＧすべてを含むもの、ＣＧのみを含むもの及びＡＴのみを含むものがある。
認識配列がＡＴＣＧすべてを含む上記ＩＩ型制限酵素の例を挙げると、ＡｆａＩ， ＡｌｕＩ， ＣｆｕＩ， ＣｖｉＲＩ， ＤｐｎＩ， ＥｓａＢＣ３Ｉ， ＨｐｙＢＩ， ＨｐｙＣＨ４Ｖ， ＨｐｙＦ４４ＩＩＩ， ＭｌｔＩ， ＰｌａＡＩＩ， ＲｓａＩ， ＢｆａＩ， Ｃｓｐ６Ｉ， ＣｖｉＡＩＩ， ＣｖｉＱＩ， ＣｖｉＲＩＩ， ＦｇｏＩ， ＨｐｙＣＨ４ＩＶ， ＭａｅＩ， ＭａｅＩＩ， ＭｔｈＺＩ， ＲｍａＩ， ＰｐａＡＩＩ， Ｔｓｐ３２Ｉ， Ｔｓｐ３２ＩＩ， ＴａｑＩ， ＴｔｈＨＢ８Ｉ， ＸｓｐＩ， ＢｓｐＫＴ６Ｉ， ＢｓｔＫＴＩ， ＨｐｙＣＨ４Ｉ， ＡｓｐＭＤＩ， Ｂｃｅ２４３Ｉ， Ｂｆｉ５７Ｉ， ＢｆｕＣＩ， Ｂｍｅ１２Ｉ， ＢｓｃＦＩ， Ｂｓｐ６７Ｉ， Ｂｓｐ１０５Ｉ，Ｂｓｐ１４３Ｉ， Ｂｓｐ２０９５Ｉ， ＢｓｐＡＩ， ＢｓｐＦＩ， ＢｓｐＪＩ， Ｂｓｔ１９ＩＩ， ＢｓｔＥＮＩＩ， ＢｔｋＩＩ， ＣａｃＩ， ＣｃｙＩ， ＣｈａＩ， ＣｐｆＩ， ＣｖｉＡＩ， ＤｐｎＩＩ， ＦａｔＩ， ＦｎｕＣＩ， ＦｎｕＥＩ， ＨａｃＩ， Ｋｚｏ９Ｉ， ＬｌａＡＩ， ＭｂｏＩ， ＭｇｏＩ， ＭｋｒＡＩ， ＮｄｅＩＩ， ＮＩａＩＩ， ＮｍｅＣＩ， ＮｐｈＩ， ＲａｌＦ４０Ｉ， Ｓａｕ３ＡＩ， ＳａｕＭＩ， Ｓｔｈ３６８Ｉ， ＣｈａＩ， Ｈｎ１ＩＩ， Ｈｓｐ９２ＩＩ， ＮＩａＩＩＩ， ＴａｉＩ， ＴｓｃＩ及びＴｓｐ４９Ｉがある。
【００２９】
また、認識配列がＣＧのみを含む該ＩＩ型制限酵素の例を挙げると、ＡｃｃＩＩ， ＢａｎＡＩ， ＢｃｅＢＩ， ＢｅｃＡＩＩ， ＢｅｐＩ， Ｂｉｍ１９ＩＩ， Ｂｍｅ３６１Ｉ， Ｂｐｕ９５Ｉ， ＢｓｅＱＩ， ＢｓｈＩ， Ｂｓｈ１２３６Ｉ， ＢｓｈＦＩ， Ｂｓｐ５０Ｉ， Ｂｓｐ１２３Ｉ， Ｂｓｐ２１１Ｉ， ＢｓｐＢＲＩ， ＢｓｐＫＩ， ＢｓｐＲＩ， ＢｓｔＦＮＩ， ＢｓｔＵＩ， Ｂｓｕ１５３２Ｉ， ＢｓｕＲＩ， ＢｔｇＩ， ＢｔｋＩ， ＣｌｔＩ， Ｃｓｐ６８ＫＶＩ， ＣｓｐＫＶＩ， ＤｓａＩＩ， ＥｓａＢＣ４Ｉ， ＦａｌＩＩ， ＦａｕＢＩＩ， ＦｎｕＤＩ， ＦｎｕＤＩＩ， ＨａｅＩＩＩ， ＭｃｈＡＩＩ， ＭｆｏＡＩ， ＭｆｏＡＩ， ＭｖｎＩ， ＮｇｏＰＩＩ， ＮｓｐＬＫＩ， ＰａｌＩ， Ｐｄｅ１３３Ｉ， ＰｆｌＫＩ， ＰｌａＩ， ＳｂｖＩ， ＳｆａＩ， ＳｕａＩ， ＴｈａＩ， ＡｃｉＩ， Ｂｃｏ２７Ｉ， ＢｓｉＳＩ， Ｂｓｔ４０Ｉ， ＢｓｕＦＩ， ＣｂｏＩ， ＨａｐＩＩ， Ｈｉｎ２Ｉ， Ｈｉｎ６Ｉ， ＨｉｎＰ１Ｉ， ＨｐａＩＩ， ＨｓｏＩ， ＨｓｐＡＩ， ＭｎｏＩ， ＭｓｐＩ， Ｐｄｅ１３７Ｉ， ＳｃｉＮＩ， Ｓｔｈ１３４Ｉ， ＡｓｐＬＥＩ， ＢｓｐＬＡＩ， ＢｓｔＨＨＩ， ＣｆｏＩ， ＦｎｕＤＩＩＩ， ＨｈａＩ及びＳｅｌＩがある。また、認識配列がＡＴのみを含むＩＩ型制限酵素の例を挙げると、ＭｓｅＩ， Ｔｒｕ１Ｉ， Ｔｒｕ９Ｉ， Ｓｓｅ９Ｉ， ＴａｓＩ， Ｔｓｐ５０９Ｉ 及びＴｓｐＥＩがある。これらの認識配列の特徴を考慮して、ＩＩ型制限酵素を選択するがの好ましい。
【００３０】
（３）の工程では、該ｃＤＮＡ断片に、第１ＩＩＳ型制限酵素並びに第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成する。
まず、（２）の工程で得られたｃＤＮＡ断片群から、オリゴｄＴプライマー配列を含むｃＤＮＡ断片を分離する。分離は、オリゴｄＴプライマーの標識を利用して行うことができる。例えば、ラテックスビーズ固定化オリゴｄＴプライマーを前記ｃＤＮＡの調製に用いている場合には、ＩＩ型制限酵素で処理した後、遠心分離することによって、該ビーズに固定されたオリゴｄＴプライマー配列を含むｃＤＮＡ断片を沈降、分離することができる。ここで得られるｃＤＮＡ断片は、ｍＲＮＡのポリＡテールと該ポリＡテールから５’上流側に向かって最初に出現する前記ＩＩ型制限酵素の切断末端部位を含むものである。次いで、該ｃＤＮＡ断片に、リンカーＸをＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）を用いて連結する。
【００３１】
リンカーＸに設定する第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列は、第１ＩＩＳ型制限酵素がスペーサー配列を残さないよう該ｃＤＮＡタグを切断する位置、又は所望のスペーサー配列を残すような適切な位置に在るのが好ましい。
例えば、第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列としてＢｓｅＲＩの認識配列を含み、第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列としてＢｓｇＩの認識配列を含み、かつＩＩ型制限酵素としてＣｓｐ６Ｉを用いたときに得られるｃＤＮＡ断片に連結させるリンカーＸとしては、次の構造を有する二本鎖ＤＮＡ断片がある。
５’−…ＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＧＴＧＣＡＧ…−３’（配列番号１３）
３’−…ＮＮＮＮＮＮＮＣＴＣＣＴＣＮＣＡＣＧＴＣＡＴ…−５’（配列番号１４）
該リンカーＸ中の配列「５’−ＧＡＧＧＡＧ−３’」は第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩの認識配列である。また該リンカーＸ中の３’末端配列「５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’」は、第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｇＩの認識配列である。なお、本明細書中の塩基配列において使用するＮ又はｎは、任意の塩基を意味する。
【００３２】
本明細書中で用いる「第１ＩＩＳ型制限酵素」という用語は、原則として、リンカーＸ上の認識配列を認識し、所望のＥＧＩｃＤＮＡタグを形成できるＩＩＳ型制限酵素及び、同様の機能を発揮するＩ型及びＩＩＩ型制限酵素をも含むものである。
該第１ＩＩＳ型制限酵素の例を挙げると、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ， ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ， ＢｓｅＲＩ， ＢｓｐＳＴ５Ｉ， ＬｗｅＩ， ＰｈａＩ， ＳｆａＮＩ， ＡａｒＩ， Ａｃｃ３６Ｉ，ＢｆｕＡＩ， ＢｓｐＭＩ， ＢｖｅＩ， Ｓｔｈ１３２Ｉ， ＳｓｐＤ５Ｉ， ＡｓｕＨＰＩ， ＨｐｈＩ， ＭｂｏＩＩ， ＮｃｕＩ， ＭｎｌＩ， ＢｂｓＩ， ＢｂｖＩＩ， ＢｂｓＩ， Ｂｂｖ１６ＩＩ， ＢｐｉＩ， ＢｐｕＡＩ， Ｂｓｃ９１Ｉ， ＢｓｐＢＳ３１Ｉ， ＢｓｐＩＳ４Ｉ， ＢｓｐＴＳ５１４Ｉ， ＢｓｔＢＳ３２Ｉ， ＢｓｔＴＳ５Ｉ， ＢｓｔＶ２Ｉ， Ｂｍｅ５８５Ｉ， ＢｓｃＡＩ， Ｂｓｔ１９Ｉ， ＢｓｔＦＺ４３８Ｉ， ＦａｕＩ， ＳｍｕＩ ＢｃｉＶＩ， ＢｆｕＩ， 及びＨｐｙＡＶ がある。
【００３３】
これらのうち、認識配列から最長末端までの距離が１０塩基以上の第１ＩＩＳ型制限酵素には、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ， ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ， 及びＢｓｅＲＩ がある。また、該距離が１６塩基以上の第１ＩＩＳ型制限酵素には、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ及びＧｓｕＩがある。
本明細書中で用いる「第２ＩＩＳ型制限酵素」という用語は、リンカーＸ上、又はリンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物結合部に形成された認識配列を認識して、ｃＤＮＡ断片の適切な位置を切断するＩＩＳ型制限酵素、及び同様の機能を発揮するＩ型及びＩＩＩ型制限酵素を含むものである。該第２ＩＩＳ型制限酵素の切断により、リンカーＸとｃＤＮＡタグの連結物が得られる。
【００３４】
該第２ＩＩＳ型制限酵素の例を挙げると、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ， ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ，ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ， ＢｓｅＲＩ， ＢｓｐＳＴ５Ｉ， ＬｗｅＩ， ＰｈａＩ， ＳｆａＮＩ， ＡａｒＩ， Ａｃｃ３６Ｉ， ＢｆｕＡＩ， ＢｓｐＭＩ， ＢｖｅＩ， Ｓｔｈ１３２Ｉ， ＳｓｐＤ５Ｉ， ＡｓｕＨＰＩ， ＨｐｈＩ， ＭｂｏＩＩ， ＮｃｕＩ， ＭｎｌＩ， ＢｂｓＩ， ＢｂｖＩＩ， ＢｂｓＩ， Ｂｂｖ１６ＩＩ， ＢｐｉＩ， ＢｐｕＡＩ， Ｂｓｃ９１Ｉ， ＢｓｐＢＳ３１Ｉ， ＢｓｐＩＳ４Ｉ， ＢｓｐＴＳ５１４Ｉ， ＢｓｔＢＳ３２Ｉ， ＢｓｔＴＳ５Ｉ， ＢｓｔＶ２Ｉ， Ｂｍｅ５８５Ｉ， ＢｓｃＡＩ， Ｂｓｔ１９Ｉ， ＢｓｔＦＺ４３８Ｉ， ＦａｕＩ， ＳｍｕＩ ＢｃｉＶＩ， ＢｆｕＩ， 及びＨｐｙＡＶがある。
【００３５】
これらのうち、認識配列から最長末端までの距離が１０塩基以上の第２ＩＩＳ型制限酵素には、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ，ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ及びＢｓｅＲＩがある。また、該距離が１６塩基以上の第２ＩＩＳ型制限酵素には、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， 及びＧｓｕＩがある。 なお、第１ＩＩＳ型制限酵素は切断部位の配列を限定する必要はないので、第１及び第２のＩＩＳ型制限酵素の組み合わせは限定されない。また、リンカーＸはＩＩ型制限酵素によって形成されるｃＤＮＡ断片と連結物を形成できる末端を持つか、あるいは連結物を形成できるように末端を加工できなければならないが、ＩＩ型制限酵素と第１ＩＩＳ型制限酵素または第２ＩＩＳ型制限酵素との組み合わせは限定されない。
【００３６】
また、第１ＩＩＳ型制限酵素の正鎖の切断位置が相補鎖の切断位置よりも離れている場合、それらの差の数だけリンカーＹにランダム配列を必要とする。該当するＩＩＳ型酵素の例を挙げると、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＲｌｅＡＩ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＢｓｅＭＩＩ，ＢｓｅＲＩ， ＡｓｕＨＰＩ， ＨｐｈＩ， ＭｂｏＩＩ， ＮｃｕＩ， ＭｎｌＩ， ＢｃｉＶＩ， ＢｆｕＩ， 及びＨｐｙＡＶがある。（４）の工程では、該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素で切断して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を作成する。
例えば、第２ＩＩＳ型制限酵素としてＢｓｇＩを用いる場合には、当該酵素は、該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物に形成された認識配列「５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’」及びその相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡを認識し、「５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’（１６／１４）」の位置を切断する。すなわち、ＢｓｇＩは、認識配列「５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’」の３’末端の塩基Ｃから３’下流側１６番目の塩基と１７番目との間のホスホジエステル結合、及び認識配列「５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’」の相補鎖「３’−ＣＴＧＣＡＣ−５’」の５’末端の塩基Ｃから５’上流側１４番目の塩基と１５番目との間のホスホジエステル結合を切断し、以下の構造を有する切断末端を有するＤＮＡ断片を生じる。
【００３７】
５’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＧＴＧＣＡＧＴＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ −３’（配列番号１５）
３’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＣＴＣＣＴＣＮＣＡＣＧＴＣＡＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−５’（配列番号１６）
（５）の工程では、必要に応じて、（４）の工程で該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素で切断して得られた、該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を純化する。この純化は、前記ｃＤＮＡタグが切除されたｃＤＮＡ断片残部を、（３）の工程で記載したように、標識オリゴｄＴプライマーの標識を利用して除去することにより行うことができる。例えば、ラテックスビーズ固定化オリゴｄＴプライマーを前記ｃＤＮＡの調製に用いている場合には、ラテックスビーズの沈降性を利用して、制限酵素処理液を遠心分離することによって、標識オリゴｄＴプライマー配列を含むｃＤＮＡ断片残部を沈降し、除去することができる。ここで遠心上清には、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物が含まれることになる。
【００３８】
（６）の工程では、必要に応じて該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物の第２ＩＩＳ型制限酵素によるｃＤＮＡタグの末端を第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹが結合可能な状態にする。
（７）の工程では、該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物の切断末端にリンカーＹを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を作成する。該リンカーＹとは、第１又は３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーをいう。また、該認識配列は、第ＩＩＳ型制限酵素がスペーサー配列を残さないよう該ｃＤＮＡタグを切断する位置、又は所望のスペーサー配列を残すような適切な位置に在るのが好ましい。例えば、（６）の工程で特に加工を施さなかった場合、連結するリンカーＹとしては、下記構造を有するＤＮＡ断片がある。この例では、スペーサー配列として、ＡＣ２残基が残されるよう設計されている。
【００３９】
５’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＧＧＣＧＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＮＮ−３’（配列番号１７）
３’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＣＣＧＣＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＡ −５’（配列番号１８）
また、（７）の工程で作成されるリンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物は、例えば、下記の配列を有する。
【００４０】
５’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＧＴＧＣＡＧＴＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＣＧＣＣＮＮＮＮＮＮＮ−３’（配列番号１９）
３’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＣＴＣＣＴＣＮＣＡＣＧＴＣＡＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＧＣＧＧＮＮＮＮＮＮＮ−５’（配列番号２０）
本明細書中で用いる「第３ＩＩＳ型制限酵素」という用語は、第１ＩＩＳ型制限酵素に代えて用いる制限酵素であって、リンカーＹ上の認識配列を認識し、所望のＥＧＩｃＤＮＡタグを形成できるＩＩＳ型制限酵素及び、同様の機能を発揮するＩ型及びＩＩＩ型制限酵素をも含むものである。
【００４１】
該第３ＩＩＳ型制限酵素の例を挙げると、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ， ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ， ＢｓｅＲＩ， ＢｓｐＳＴ５Ｉ， ＬｗｅＩ， ＰｈａＩ， ＳｆａＮＩ， ＡａｒＩ， Ａｃｃ３６Ｉ，ＢｆｕＡＩ， ＢｓｐＭＩ， ＢｖｅＩ， Ｓｔｈ１３２Ｉ， ＳｓｐＤ５Ｉ， ＡｓｕＨＰＩ， ＨｐｈＩ， ＭｂｏＩＩ， ＮｃｕＩ， ＭｎｌＩ， ＢｂｓＩ， ＢｂｖＩＩ， ＢｂｓＩ， Ｂｂｖ１６ＩＩ， ＢｐｉＩ， ＢｐｕＡＩ， Ｂｓｃ９１Ｉ， ＢｓｐＢＳ３１Ｉ， ＢｓｐＩＳ４Ｉ， ＢｓｐＴＳ５１４Ｉ， ＢｓｔＢＳ３２Ｉ， ＢｓｔＴＳ５Ｉ， ＢｓｔＶ２Ｉ， Ｂｍｅ５８５Ｉ， ＢｓｃＡＩ， Ｂｓｔ１９Ｉ， ＢｓｔＦＺ４３８Ｉ， ＦａｕＩ， ＳｍｕＩ ＢｃｉＶＩ， ＢｆｕＩ， 及びＨｐｙＡＶ がある。
【００４２】
これらのうち、認識配列から最長末端までの距離が１０塩基以上の第３ＩＩＳ型制限酵素には、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ， ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ， 及びＢｓｅＲＩ がある。また、該距離が１６塩基以上の第１ＩＩＳ型制限酵素には、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ及びＧｓｕＩがある。
なお、第１ＩＩＳ型制限酵素及び第３ＩＩＳ型制限酵素の組み合わせは、同一である場合も含み、限定されない。第１ＩＩＳ型制限酵素及び第３ＩＩＳ型制限酵素の組み合わせのうち、反応系が同一ないし類似の場合、後述の（９）の工程で第１ＩＩＳ型制限酵素及び第３ＩＩＳ型制限酵素を同時に働かせ、あるいは酵素及び塩を除去する行程を省略することができる。
【００４３】
該工程により、「５’−［リンカーＸ］−［ｃＤＮＡタグ（ＥＧＩｃＤＮＡタグ）］−［リンカーＹ］−３’）の構造を有する連結物が得られる。
（８）での工程は、該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を増幅する。
（７）の工程で得られる連結物は、リンカーＸ及びＹにそれぞれプライマーＸ及びＹがハイブリダイズする配列を有し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で容易に増幅することができる。該ＰＣＲ法は標準的なポリメラーゼ連鎖反応法、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されているような方法でよい。さらに、該連結物を原核生物に適合するベクターに組み込むクローニング、又は当業者に公知の他の増幅法により増幅してもよい。
【００４４】
なお、末端にプライマーアニール用のリンカーを連結させた多種類の長さの異なるＤＮＡを含む鋳型混合物を用いてＰＣＲを行った場合、増幅効率は各鋳型ＤＮＡの鎖長によって異なる。一般に、鎖長が長いほど増幅効率は低く、鎖長が短いほど増幅効率は高い。そのため、得られた増幅産物中の各鋳型ＤＮＡに対応する増幅ＤＮＡ断片の出現比率は、鋳型ＤＮＡ混合物中の各ＤＮＡ断片の存在比を反映しない結果となる。しかし、本発明の方法では、鋳型として使用するＤＮＡの混合物は、鎖長が等しく、かつ短いので、得られた増幅産物中の各鋳型ＤＮＡに対応する増幅ＤＮＡ断片の出現比率は、鋳型ＤＮＡ混合物中の各ＤＮＡ断片の存在比を反映したものとなる。 従って、本発明においては、ＰＣＲによる増幅効率の差による影響は理論的に皆無であり、かつ得られる増幅産物中の各ｃＤＮＡ断片の出現比率は、被検細胞中で発現されている各ｍＲＮＡの比率を反映したものとなる。
【００４５】
該ＰＣＲは、時間、温度などの条件は、標準的な設定で行なうことができる。なお、本発明で増幅するリンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹは、配列長が短く、長さが均一で増幅効率が高いので、アニール／配列延長サイクル数を減らすことが可能である。また、リンカーの配列を変えるとＰＣＲの効率が変わるので、用いるリンカーによりアニール／配列延長サイクルの所望の効率にすることができる。
【００４６】
本明細書中の「プライマーＸ」という用語は、リンカーＸの核酸鎖に相補的で、ポリメラーゼ連鎖反応が誘導される条件下で反応の開始点として作用することができる、天然に存在する、又は合成されたオリゴヌクレオチドを意味する。なお、プライマーＸは、リンカーＸ上の第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を残すことができる位置にハイブリダイズし、かつ重合剤の存在下で増幅を開始させるに足る長さのものでなければならない。該プライマーＸに必要な長さは温度、ｐＨ、使用するリガーゼなど多くの要因により決まってくるであろう。また同様に、本明細書中で用いる「プライマーＹ」という用語は、リンカーＹの核酸鎖に相補的で、ポリメラーゼ連鎖反応が誘導される条件下で反応の開始点として作用することができる、天然に存在する、又は合成されたオリゴヌクレオチドを意味する。なお、プライマーＹは、リンカーＹ上の第１又は３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を残すことができる位置にハイブリダイズし、かつ重合剤の存在下で増幅を開始させるに足る長さのものでなければならない。
なお、当業者であれば、過度の実験を行わなくとも、第１ＩＩＳ型制限酵素、第３ＩＩＳ型制限酵素等を考慮に入れ、リンカーのヌクレオチド配列に基づいて容易に該増幅用プライマーを作製することができるであろう。
【００４７】
実施態様３の（９）工程では、得られた増幅産物を第１ＩＩＳ型制限酵素及び第３ＩＩＳ型制限酵素で同時に、あるいは必要に応じて酵素及び塩を除去する行程を挟んで順次に切断して、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを作成する。第１ＩＩＳ型制限酵素と第３ＩＩＳ型制限酵とは、それぞれ独立に選択することができる。また、順次に切断する場合その順序は制限されない。例えば、第１ＩＩＳ型制限酵素としてＢｓｅＲＩを用いた場合には、該酵素はリンカーＸ上の配列「５’−ＧＡＧＧＡＧ−３’」及びその相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡを認識し、「５’−ＧＡＧＧＡＧ−３’（１０／８）」を切断する。すなわち、ＢｓｅＲＩは、認識配列「５’−ＧＡＧＧＡＧ−３’」の３’末端の塩基Ｇから３’下流側１０番目の塩基と１１番目との間のホスホジエステル結合、及び認識配列５’−ＧＡＧＧＡＧ−３’の相補鎖３’−ＣＴＣＣＴＣ−５’の５’末端の塩基Ｃから５’上流側８番目の塩基と９番目との間のホスホジエステル結合を切断し、下記構造を有する切断末端を有するリンカーＸのＤＮＡ断片を生じる。
【００４８】
５’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＧＴＧＣＡＧＴＡＣ−３’（配列番号２１）
３’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＣＴＣＣＴＣＮＣＡＣＧＴＣＡ −５’（配列番号２２）
また同様に、第３ＩＩＳ型制限酵素としてＥｃｉＩを用いた場合には、リンカーＹ上の配列「５’−ＧＧＣＧＧＡ−３’」及びその相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡを認識し、「５’−ＧＧＣＧＧＡ’（１１／９）」を切断する。すなわち、Ｅｃｉｌは、認識配列「５’−ＧＧＣＧＧＡ−３’」の３’末端の塩基Ｇから３’下流側１１番目の塩基と１２番目との間のホスホジエステル結合、及び認識配列「５’−ＧＧＣＧＧＡ−３’」の相補鎖３’−ＴＣＣＧＣＣ−５’の５’末端の塩基Ｃから５’上流側９番目の塩基と１０番目との間のホスホジエステル結合を切断し、下記構造を有する切断末端を有するリンカーＹのＤＮＡ断片を生じる。
【００４９】
５’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＧＧＣＧＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴ −３’（配列番号２３）
３’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＣＣＧＣＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮ −５’（配列番号２４）
この結果、リンカーＸ及びＹを含むＤＮＡ断片から、ＥＧＩｃＤＮＡタグが切り離されることになる。
【００５０】
すなわち、（２）の工程において、ＩＩ型制限酵素としてＣｓｐ６Ｉを使用し、（３）の工程において、配列番号１３、及び１４で表される塩基配列からなるヌクレオチド鎖を含むリンカーＸを使用し、（４）の工程において、第２ＩＩＳ型制限酵素としてＢｓｇＩを使用し、（９）の工程において、配列番号１７、及び１８で表される塩基配列からなるヌクレオチド鎖を含むリンカーＹを使用し、（９）の工程において、第１ＩＩＳ型制限酵素としてＢｓｅＲＩを、第３ＩＩＳ型制限酵素としてＥｃｉＩを使用することによって、被検ｃＤＮＡ由来のＣｓｐ６ｌ切断部位（５’−ＡＣ−３’）に隣接するｃＤＮＡ由来の連続する１３塩基のヌクレオチド鎖を含む、下記のＥＧＩｃＤＮＡタグが得られる。
【００５１】
５’− ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣ−３’（配列番号２４）
３’−ＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ −５’（配列番号２６）
細胞由来のｍＲＮＡから得たｃＤＮＡライブラリーを使用し、本発明の方法を実施した場合、（９）の工程で、ＥＧＩｃＤＮＡタグのライブラリーが得られる。
【００５２】
本発明では、得られた該ＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーを利用して、ＥＧＩｃＤＮＡタグ配列に対応するｃＤＮＡを定性的、また定量的に測定し、対応する発現遺伝子のパターンを調べることができる。
例えば、検出すべきｃＤＮＡに応じたＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーを前もって作成し、それをスポットした検出装置に準備しておき、これに異なる標識などでラベルした被検者の試料と標準試料とを接触させ、相対的な信号強度を比較して、ターゲットの選択などを行なうことができる。この標識として蛍光標識、アイソトープなど公知のものを広く使用することができる。
また、例えば、該ＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーを、検出すべきｃＤＮＡなどを固定した検出装置に接触させることにより、該ＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーに含まれるｃＤＮＡを検出して、対応する発現遺伝子のパターンを調べることができる。
本発明で用いることができる検出装置には、ＤＮＡチップなどのマイクロアレイと、ドットハイブリダイゼーシュンなどのマクロアレイがある。該検出装置に用いる支持体には、ナイロンメンブレン、ニトロセルロースフィルター、ガラス板、シリコンチップなどがある。また、該検出装置とは、例えば、得られたＥＧＩｃＤＮＡタグを支持体上に固定し、検出すべきＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそのフラグメントなどをハイブリダイズさせて、検出できる装置をいう。
【００５３】
なお、ｍＲＮＡあるいはｃＤＮＡを検出できるように標識することが好ましい。例えば、標識としてラジオアイソトープ、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、または酵素などを使用することができる。
例えば、標識した検出すべきｃＤＮＡを一本鎖分子に分離し、必要に応じて段階的に希釈し、そして、例えば、シリコンチップの各グリッド中に、検出すべき遺伝子に対応したＥＧＩｃＤＮＡタグを保持した固相支持体と接触させる。得られた遺伝子発現パターンを標準となる遺伝子発現パターンと比較することにより、容易に試料細胞などの状態を知ることができる。また、未知の遺伝子のＥＧＩｃＤＮＡタグを固定しておいてパターンを記録しておくと、将来この遺伝子が判明したときに、再解析できる。
【００５４】
本発明では、第２ＩＩＳ型制限酵素の選択により、ＥＧＩｃＤＮＡタグの長さを調整でき、また遺伝子を解析する生物の種類などにより所望の長さは変わってくるが、一般にＥＧＩｃＤＮＡタグの長さは６〜２５塩基対、さらに１０〜２５塩基対、特に１０〜１６塩基対とするのが好ましい。
（１０）の工程では、必要に応じて、得られた発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを分離する。当該分離は、当業者が通常使用する方法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を利用して行うことができる。
さらに、ＥＧＩｃＤＮＡタグを互いに連結し、該連結物の塩基配列を決定することにより発現遺伝子を解析することができる。例えば、（９）の工程で得たＥＧＩｃＤＮＡタグは３’及び５’の接着末端が相補的であるため、Ｔ４リガーゼなどを用いて連結することができる。そして、得られたＥＧＩｃＤＮＡタグの連結物（コンカテマー）を当業者に公知な方法、例えば、ベクターに組み込んでクローニングしたり、シークエンサーを用いて配列を読む方法で解析したりすることができる。
【００５５】
本発明においては、該コンカテマーは、一般に３〜２００のＥＧＩｃＤＮＡタグ、さらに３〜８０のＥＧＩｃＤＮＡタグ、特に１６〜４０のＥＧＩｃＤＮＡタグを含むのが好ましい。なお、得られたコンカテマーには、ＥＧＩｃＤＮＡタグの形成方法により、ＥＧＩｃＤＮＡタグ相互の間にスペーサー配列がないものと、スペーサー配列があるものがある。本発明のＥＧＩｃＤＮＡタグ連結物は、例えば、プラスミドやファージのようなベクターに挿入して増幅する標準的な方法でクローニングすることができる。
本明細書の「組換えベクター」という用語は、ＥＧＩｃＤＮＡタグ連結物を挿入し、又は組み込みにより作成されたプラスミド、ウイルスまたは他の運搬体を指す。このようなベクターは、複製起点、プロモーター、及び形質転換細胞の表現型選択を可能とする特定の遺伝子を含むものである。本発明では、公知でシーケンスに適した多くのクローニングベクターを用いることができる。その例を挙げると、ｐＵＣ１８、その改変ベクターｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９、その改変ベクターｐＵＣ１１９， Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦＩ， Ｍ１３ｍｐ１９ＲＦＩ， ｐＢＲ３２２， ｐＣＲ３．１， ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ及びその改良ベクター、及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｒ）ＩＩなどがある。
【００５６】
次に、該組換えベクターを適当な宿主細胞に移入する。本明細書の「宿主細胞」とは、その細胞内でベクターが増殖できかつそのＤＮＡが発現され得る細胞、及び宿主細胞自体の子孫をも意味する。なお、複製の間に突然変異が起こることがあるので、すべての子孫が親細胞と同一であるとは限らない。
また、本発明では外来ＤＮＡが宿主内で連続して維持されるような、公知の安定した移入法を用いることができる。例えば、大腸菌のような原核細胞などの宿主を用いる場合は、指数増殖期後に収穫し、続いて公知の手法によるＲｂＣｌ法、ＣａＣｌ２法で処理した細胞から、ＤＮＡ取込み能のあるコンピテント細胞を調製する。また、エレクトロポレーションや常法により形質転換を行うこともできる。 なお、本発明では、ベクターにＥＧＩｃＤＮＡタグ連結物を組み込み塩基配列の決定を行うことで、一回の操作で２０個以上、２０個〜１００個、好ましくは約２０〜３０個程度のＥＧＩｃＤＮＡタグの配列を簡単に調べることができる。
【００５７】
これまで、本発明の好ましい実施態様について記載してきたが、当業者ならばこれらの記載に基づき、本発明の技術思想を逸脱することなしに種々の改変ができることは明かである。また次に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の保護範囲は制限することを意図するのもではない。したがって、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【００５８】
【実施例】
〔実施例１〕 末梢血リンパ球細胞の遺伝子発現解析
まず、健常人由来の末梢血から、ＮｙｃｏＰｒｅｐ１．０７７Ａ（Ｎｙｃｏ Ｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ社製）を用いて、末梢血単球（ＰＢＭＣ）を集めた。得られた末梢血単球を、１０μｇ／ｍｌリポ多糖（ＬＰＳ）の存在下又は非存在下、３７℃で３時間培養後、それぞれの培養細胞から、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡ抽出物を、ＤＮａｓｅＩ（宝酒造社製）で３７℃３０分間処理後、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。次いで、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ＭＡＧ ｍＲＮＡ精製キット（宝酒造社製）を用いて、全ＲＮＡからｍＲＮＡを吸着により単離後、ｃＤＮＡ合成キット（宝酒造社製）を用いて、ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製した。
【００５９】
得られた二本鎖ｃＤＮＡを制限酵素Ｃｓｐ６Ｉ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製）で３７℃２時間処理することで切断した後、磁石によってマグネットビーズ部分を壁面に集め、回収することによって、前記ｍＲＮＡにおけるポリＡテールと該ポリＡテールから５’上流側に向かって最初に出現する前記Ｃｓｐ６Ｉ認識切断部位との間の塩基配列を含むｃＤＮＡ断片が存在する画分を得た。次いで、該ｃＤＮＡ断片画分に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用い、次の３つの方法によって、第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩの認識配列を含むリンカーＸを連結した。なお、いずれにおいてもリンカーＸの連結は好適に行うことができた。
【００６０】
（１） Ｃｓｐ６Ｉ切断末端にリンカーＸを直接連結する方法
Ｃｓｐ６Ｉで切断することにより生じた接着末端に、以下の構造を有するリンカーＸを直接連結した。
５’−ＡＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧＣＡＧ−３’（配列番号２７）
３’−ＴＧＧＣＴＣＣＴＣＡＣＡＣＧＴＣＡＴ−５’（配列番号２８）
次いで、リンカーＸに含まれる制限酵素ＢｓｇＩの認識配列５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’を利用して、ＢｓｇＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）での３７℃２時間の切断を行い、今度は前回とは逆にマグネットビーズがない部分、すなわち遠心上清を回収した。この酵素の切断部位は５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’（１６／１４）の位置であるから、回収された部分にはリンカーに引き続くｃＤＮＡ由来の１３塩基が含まれることになる（Ｃｓｐ６Ｉ部位由来の共通のＴＡＣ３残基を除く）。
【００６１】
これに以下の構造を有する第二のリンカーＹを、１６℃２時間のＴ４ＤＮＡリガーゼ処理により接続した。
５’− ＡＣＣＡＣＴＧＣＧＡＣＴＣＣＧＣＣＴＧＧ−３’（配列番号２９）
３’−ＮＮＴＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＧＧＡＣＣ−５’（配列番号３０）
上記リンカーＹの接続により、両端を既知のリンカーで挟まれたｃＤＮＡ由来の１３塩基対を含む総延長５２塩基対のＤＮＡの一群「リンカーＸ−ＡＣ−ｃＤＮＡ由来の１３塩基対（ＥＧＩｃＤＮＡタグ）−ＡＣ−リンカーＹ」の小断片ｃＤＮＡ連結物ライブラリーを得た。この小断片は、以下のような塩基配列及びその相補鎖からなるものである。
【００６２】
５’−ＡＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧＣＡＧＴＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣＣＡＣＴＧＣＧＡＣＴＣＣＧＣＣＴＧＧ−３’
（配列番号３１）
次に、この小断片ｃＤＮＡ連結物ライブラリーを、リンカーＸ部分にハイブリダイズするプライマーＸ「５’−ＡＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧＣＡＧＴＡ−３’」（配列番号３２）及びリンカーＹ部分にハイブリダイズするプライマーＹ「５’−ＣＣＡＧＧＣＧＧＡＧＴＣＧＣＡＧＴＧＧＴ−３’」（配列番号３３）を用いて、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、９６℃で３０秒間の変性、５０℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長を１サイクルとする合計２０サイクルの増幅反応、及び７２℃で２分間の最終伸長反応により行った。
【００６３】
得られたＰＣＲ産物をＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）およびＥｃｉＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理した。これらの酵素の切断部位は「５’−ＧＡＧＧＡＧ−３’（１０／８）」および「５’−ＧＧＣＧＧＡ−３’（１１／９）」の位置であるから、以下の構造のＤＮＡ断片を生じさせた。
５’− ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣ−３’（配列番号３４）
３’−ＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ −５’（配列番号３５）
次いで、処理物を１２％ポリアクリルアミド電気泳動に供し、リンカー断片と分離して上記小断片ＤＮＡを回収した。
【００６４】
得られたｃＤＮＡタグを再びＴ４リガーゼで連結後、４．５％ポリアクリルアミド電気泳動に供することによって、５００〜１０００ｂｐの結合断片を回収した。回収された結合断片は、以下の構造を有するものであり、（Ｎ）１３に隣接する５’−ＡＣ−３’もｃＤＮＡ上のＣｓｐ６Ｉ認識配列由来の塩基であるから、人為的に付加したスペーサー配列を含まない、完全にｃＤＮＡ由来のｃＤＮＡタグ連結物ライブラリーが得られたことになる。以下の塩基配列中、（Ｎ）１３はｃＤＮＡ由来の１３塩基５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’を表している。
【００６５】
５’−・・・ＡＣ（Ｎ）１３ＡＣ（Ｎ）１３ＡＣ（Ｎ）１３ＡＣ（Ｎ）１３ＡＣ（Ｎ）１３ＡＣ（Ｎ）１３ＡＣ・・・−３’（配列番号３６）
３’−・・・ＴＧ（Ｎ）１３ＴＧ（Ｎ）１３ＴＧ（Ｎ）１３ＴＧ（Ｎ）１３ＴＧ（Ｎ）１３ＴＧ（Ｎ）１３ＴＧ・・・−５’（配列番号３７）
上記結合断片をプラスミドｐＵＣ１１８に組み込み、ＡＢＩ３７７型ＤＮＡシーケンサーにより塩基配列を決定した結果、ＰＢＭＣ細胞及びこれをＬＰＳにより刺激した細胞に特異的に発現している遺伝子断片を解析することができた。一回の塩基配列決定操作で約２０個程度のＥＧＩｃＤＮＡタグの配列を明らかにできたので、約５００サンプルの塩基配列決定を行うことにより、細胞で発現されているｍＲＮＡの種類とそれぞれの個数をおおむね明らかにできると考えられる１万個の配列を明らかできた。
【００６６】
表１及び２にこの方法で同定された遺伝子をいくつか示した。これらのＥＧＩｃＤＮＡタグの塩基配列を既知のデータベースに対し、ホモロジー検索を行った。表１にはＬＰＳ刺激により発現が高まる遺伝子を、表２には逆にＬＰＳ刺激で発現が抑制される遺伝子を示した。
【００６７】
【表１】
【００６８】
【表２】
【００６９】
なお、表１及び表２中、ｍｆ ＩＤとして塩基配列の前に示してある数字はコンピューター処理のために１３塩基を１０進法の数字により表示したものである。すなわち、ｍｆＩＤは、塩基配列の各塩基を、ａを０、ｃを１、ｇを２、ｔを３とそれぞれ読み替えてできた４進数を１０進数に変換し、１を加えた数である。このＩＤにより、塩基配列を、その長短にかかわらず数字で扱うことができる。例えば、塩基数１４の塩基配列を扱う場合、次のように数値で特定することができる。
【００７０】
５’−ａａａａａａａａａａａａａ−３’ ０００００００１（又は単に１）
５’−ａａａａａａａａａａａａｃ−３’ ０００００００２（又は単に２）
５’−ａａａａａａａａａａａａｇ−３’ ０００００００３（又は単に３）
５’−ａａａａａａａａａａａａｔ−３’ ０００００００４（又は単に４）
５’−ａａａａａａａａａａａｃａ−３’ ０００００００５（又は単に５）
・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・
５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｇｔ−３’ ６７１０８８６０
５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔａ−３’ ６７１０８８６１
５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｃ−３’ ６７１０８８６２
５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｇ−３’ ６７１０８８６３
５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’ ６７１０８８６４
このように該ＩＤにより如何なる１３塩基よりなる配列が現れても、全てこれらの９桁の数字の１つに割り当てることができる。これらの数字を小断片ＩＤ（ｍｉｎｉ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＩＤ：ｍｆ ＩＤ）と呼ぶ。
【００７１】
〔実施例２〕
実施例１で得られたＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーを、次に述べる検出装置により検出し、遺伝子の発現を解析した。
表１記載のＬＰＳ刺激により活性化される遺伝子のうち、ｍｆＩＤ６５４６２２８２， ５５１４９４４４， １７３５０５５８， ５８０５８７６５， ２７５００３７０， 及び４９０７８６５１のｍｆ塩基配列の対応配列を含むオリゴＤＮＡを合成し、常法によりスライドグラスにスポットしてＤＮＡチップを作成した。
実施例１で得たＬＰＳ刺激末梢血単球（ＰＢＭＣ）由来のｍＲＮＡを鋳型として蛍光性化合物Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（＊１）（アマシャム・ファルマシア社製）で蛍光標識し、かつＬＰＳ無刺激ＰＢＭＣ由来のｍＲＮＡを鋳型として蛍光性化合物Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（＊２）（アマシャム・ファルマシア社製）で蛍光標識しプローブ溶液を得た。
このプローブ溶液を混合し、６×ＳＥＴ ［０．９Ｍ ＮａＣｌ、１０μｇ／ｍｌ Ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡ、０．１％ＳＤＳ、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）］中で前記ＤＮＡチップと４５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
洗浄液［６×ＳＳＣ、０．１ ％ＳＤＳ］により５２℃で洗浄後、スキャナーを用いて各蛍光物質をスキャニングして蛍光強度データを得て、そのデータの解析を行った。各スポットのＣｙ３とＣｙ５とのシグナル強度のスキャッタープロット（Ｓｃａｔｔｅｒ Ｐｌｏｔ）の結果、ＬＰＳ刺激を受けたＰＢＭＣ由来のｍＲＮＡに由来するプローブが発する蛍光は、すべてのスポットにおいて、ＬＰＳ無刺激のものよりもシグナル強度が２倍以上強くなった。
【００７２】
＊１ ＣＡＳ ＲＮ Ｃｙ３ ＣＡＳ ＲＮ １４６３６８−１６−３
ＣＮ ３Ｈ−Ｉｎｄｏｌｉｕｍ， ２−［３−［１−［６−［（２，５−ｄｉｏｘｏ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ）ｏｘｙ］−６−ｏｘｏｈｅｘｙｌ］−１，３− ｄｉｈｙｄｒｏ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｓｕｌｆｏ−２Ｈ−ｉｎｄｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ］−１−ｐｒｏｐｅｎｙｌ］−１−ｅｔｈｙｌ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｓｕｌｆｏ−， ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ （９ＣＩ） （ＣＡ ＩＮＤＥＸ ＮＡＭＥ）
＊２ ＣＡＳ ＲＮ Ｃｙ５ ＣＡＳ ＲＮ １４６３６８−１４−１
ＣＮ ３Ｈ−Ｉｎｄｏｌｉｕｍ， ２−［５−［１−［６−［（２，５−ｄｉｏｘｏ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ）ｏｘｙ］ −６− ｏｘｏｈｅｘｙｌ］−１，３− ｄｉｈｙｄｒｏ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｓｕｌｆｏ−２Ｈ−ｉｎｄｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ］−１，３−ｐｅｎｔａｄｉｅｎｙｌ］−１−ｅｔｈｙｌ−３，３− ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｓｕｌｆｏ−， ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ （９ＣＩ）
（ＣＡ ＩＮＤＥＸ ＮＡＭＥ）
〔実施例３〕
実施例１で得られた個々のＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーの任意のタグを用いて、一組の被検試料における該遺伝子の発現の違いを解析することができる。
【００７３】
ＬＰＳ刺激刺激末梢血単球（ＰＢＭＣ）由来ｍＲＮＡ、ＬＰＳ無刺激ＰＢＭＣ由来ｍＲＮＡをそれぞれ鋳型として逆転写酵素で調製したｃＤＮＡをナイロンメンブレンにそれぞれスポットした後、８０℃で２時間処理する。
表１記載のＬＰＳ刺激により発現が誘導される遺伝子のうちｍｆＩＤ６５４６２２８２の塩基配列を含むオリゴＤＮＡを合成し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで該ＤＮＡを［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（アマシャム・ファルマシア社製）を用いて３２Ｐ（放射性同位体）でラベルしプローブ溶液を得る。
このプローブ溶液を６×ＳＥＴ中で前記ナイロンメンブレンと４５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行う。洗浄液［６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ］により５２℃で洗浄後、オートラジオグラフィーを行う。Ｘ線フィルム上のシグナルは、ＬＰＳ刺激ＰＢＭＣのｍＲＮＡ由来ｃＤＮＡのものの方がＬＰＳ無刺激ＰＢＭＣのものよりも２倍以上強くなる。
【００７４】
〔実施例４〕
ＩＩ型制限酵素Ｃｓｐ６Ｉの代わりにＡｆａＩを用い、第３ＩＩＳ型制限酵素ＥｃｉＩの代わりにＢｓｅＲＩを用いた他は、実施例１と同様の方法でＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーを作成した。まず、下記（１）〜（３）のいずれかの方法でリンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成する。
（１） 試料中のｃＤＮＡを、ＩＩ型制限酵素ＡｆａＩで切断することにより生じた平滑末端に、下記構造を有するリンカーＸを直接連結する。
５’− ＡＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧＣＡＧＴ−３’ （配列番号５８）
３’− ＴＧＧＣＴＣＣＴＣＡＣＡＣＧＴＣＡ−５’ （配列番号５９）
（２） 試料中のｃＤＮＡを、ＩＩ型制限酵素ＡｆａＩで切断することにより生じた平滑末端に、ｄＡＴＰの存在下で次のように、塩基Ａを１個導入する。
【００７５】
５’− ＡＣ・・・・−３
３’−ＡＴＧ・・・・−５’
次いで、上記接着末端に、次の構造を有するリンカーＸを連結する。
５’− ＡＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧＣＡＧＴ−３’ （配列番号６０）
３’− ＴＧＧＣＴＣＣＴＣＡＣＡＣＧＴＣ−５’ （配列番号６１）
（３） 試料中のｃＤＮＡを、ＩＩ型制限酵素ＡｆａＩで切断することにより生じた平滑末端から、ｄＧＴＰの存在下で、次のように、塩基Ｔを１個除去する。
【００７６】
５’−ＡＣ・・・−３’
３’− Ｇ・・・−５’
次いで、上記接着末端に、下記構造を有するリンカーＸを連結する。
５’− ＡＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧＣＡＧＴ −３’ （配列番号６２）
３’− ＴＧＧＣＴＣＣＴＣＡＣＡＣＧＴＣＡＴ−５’ （配列番号６３）
次いで、リンカーＸに含まれる制限酵素ＢｓｇＩの認識配列５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’を利用して、ＢｓｇＩで切断を行い、遠心上清を回収した。この酵素の切断部位は５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’（１６／１４）の位置であるから、回収された部分にはリンカーＸに続くｃＤＮＡ由来の１３塩基のタグが含まれることになる。
【００７７】
続いて下記構造を有するリンカーＹを接続した。続いて、実施例１と同じ方法で増幅し、第１ＩＩＳ型制限酵素及び第３ＩＩＳ型制限酵素で消化することにより所望のＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーを得た。
５’− ＡＣＣＡＣＴＧＣＧＡＣＴＣＣＴＣＴＧＧ−３’ （配列番号６４）
３’− ＮＮＴＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＣ−５’ （配列番号６５）
〔実施例５〕
実施例４で得られたＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーを、次に述べる検出装置により検出し、遺伝子の発現を解析することができる。
【００７８】
表１記載のＬＰＳ刺激により活性化され、かつｍｆＩＤ６５４６２２８２， ５５１４９４４４， １７３５０５５８， ５８０５８７６５， ２７５００３７０， 及び４９０７８６５１に対応する遺伝子に対応し、かつ実施例３で得られるＥＧＩｃＤＮＡタグの対応配列を含むオリゴＤＮＡを合成し、常法によりスライドグラスにスポットしてＤＮＡチップを作成する。
実施例３で得たＬＰＳ刺激末梢血単球（ＰＢＭＣ）由来のｍＲＮＡを鋳型として蛍光性化合物Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（＊１）（アマシャム・ファルマシア社製）で蛍光標識し、かつＬＰＳ無刺激ＰＢＭＣ由来のｍＲＮＡを鋳型として蛍光性化合物Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（＊２）（アマシャム・ファルマシア社製）で蛍光標識しプローブ溶液を得る。
このプローブ溶液を混合し、６×ＳＥＴ ［０．９Ｍ ＮａＣｌ、１０μｇ／ｍｌ Ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡ、０．１％ＳＤＳ、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）］中で前記ＤＮＡチップと４５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行う。
洗浄液［６×ＳＳＣ、０．１ ％ＳＤＳ］により５２℃で洗浄後、スキャナーを用いて各蛍光物質をスキャニングして蛍光強度データを得て、そのデータの解析を行う。各スポットのＣｙ３とＣｙ５とのシグナル強度のスキャッタープロット（Ｓｃａｔｔｅｒ Ｐｌｏｔ）の結果、ＬＰＳ刺激を受けたＰＢＭＣ由来のｍＲＮＡに由来するプローブが発する蛍光は、すべてのスポットにおいて、ＬＰＳ無刺激のものよりもシグナル強度が２倍以上強くなる。
【００７９】
【発明の効果】
本発明により、被検ｃＤＮＡ又は被検細胞に特異的に発現している遺伝子を再現性よく正確に検出し、解析することができる。本発明の方法により、任意の二つの細胞における機能、形態上の違いを遺伝子の発現状態の差として明らかにできるので、生理的条件下、あるいは病的状態におけるあらゆる生物現象の解析に広く応用できる。さらに、本発明者らが既に開発した発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法、及び遺伝子発現解析方法よりも、使用できる制限酵素の選択の幅が拡く、使用するリンカーの製造が容易であるなど改良点を有する前記ｃＤＮＡタグの作成方法、及び遺伝子発現解析方法が得られる。
【００８０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
各図は、本発明における発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグ作成方法の実施態様の工程を示す工程図である。
【図１】第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを用いる、本発明のＥＧＩ ｃＤＮＡタグの作成方法の工程（１）〜（６）を示す図である。
【図２】第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを用いる、本発明のＥＧＩ ｃＤＮＡタグの作成方法の工程（７）〜（１０）を示す図である。
【図３】第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸを用いる、本発明のＥＧＩ ｃＤＮＡ タグの作成方法の工程（１）〜（６）を示す図である。
【図４】第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸを用いる、本発明のＥＧＩ ｃＤＮＡ タグの作成方法の工程（７）〜（１０）を示す図である。
【図５】第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸ、並びに第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを用いる、本発明のＥＧＩ ｃＤＮＡ タグの作成方法の工程（１）〜（６）を示す図である。
【図６】第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸ、並びに第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを用いる、本発明のＥＧＩ ｃＤＮＡ タグの作成方法の工程（７）〜（１０）を示す図である。
【符号の説明】
Ｎ … Ａ、 Ｔ、 Ｃ又はＧから選ばれる任意の塩基を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法、該ｃＤＮＡタグライブラリー、及び遺伝子発現解析方法に関するものである。さらに詳細に述べると、発現遺伝子産物であるｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ又はそのｃＤＮＡ断片の特定領域に対応する、同定用ｃＤＮＡタグを作成する方法、及び該ｃＤＮＡタグを利用した遺伝子発現解析方法に関するものである。該遺伝子発現解析方法は、該ｃＤＮＡタグをそのまま用いる直接的な方法と、該ｃＤＮＡタグの連結物を用いる間接的な方法とを含んでいる。
【０００２】
【従来の技術】
各生物種は独自のゲノム配列に基づく、固有の遺伝子発現パターンを有し、また、生物の種が同一でも、細胞の分化の程度、増殖、老化などの生理的状態や、癌化、感染症、免疫病などの各種病的状態などにより、正常な状態と比べ異なる遺伝子発現パターンを有すると考えられている。したがって、このような遺伝子発現パターンを確立し、細胞間の遺伝子発現パターンを相互に比較することができれば、適切な治療ターゲットの同定、遺伝子治療用の候補遺伝子の同定、組織タイピング、法的な遺伝子確認、疾病関連遺伝子の位置決定、診断・予診用のインジケーター遺伝子の同定など、遺伝子発現パターンの幅広い応用が可能になる。
【０００３】
従来、遺伝子発現を評価するため、ノーザンブロッティング法、ＲＮアーゼプロテクション法、及び逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析法（Ａｌｗｉｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７４：５５５０、１９７７； Ｚｉｎｎら、Ｃｅｌｌ、３４：８６５、１９８３； Ｖｅｒｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３７：４１５、１９８７年）、さらに遺伝子を検索するための有用なエクスプレスド・シークエンス・タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ： ＥＳＴ）法（Ａｄａｍｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６５６、１９９１年； Ａｄａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３５５： ６３２、１９９２年；Ｏｋｕｂｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２：１７３、１９９２年）などが開発されたが、一度に限られた数の遺伝子しか評価できなかった。例えば、Ｏｋｕｂｏらは二本鎖ｃＤＮＡを４塩基認識酵素Ｓａｕ３ＡＩで切断し、ｍＲＮＡの３’末端部分だけからなるｃＤＮＡライブラリーを得て、これをクローニングしてランダムに塩基配列決定を行い遺伝子発現プロフィールを得る方法を開発した［Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２、 １７３（１９９２年）］が、この方法で得られるそれぞれのクローンの長さは平均約３００塩基であり、配列決定は一クローンずつ行わねばならず、このため最終的に配列決定されたｍＲＮＡの総数は一つの細胞種当たりわずか１０００個程度であって、細胞における真の遺伝子発現パターンからは程遠いものであった。また、これらの方法は、大量の原材料（例えば、ヒトの組織）が必要なこと、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を繰り返すためバイアスがかかること、結果に再現性がないこと等の理由により、研究室で用いられているに過ぎないのが現状であった。
【０００４】
近年、発現された遺伝子の領域に対応する転写産物の限定領域を同定することにより、多数の転写産物を分析することができる遺伝子発現の逐次分析（ｓｅｒｉａｌａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ： ＳＡＧＥ）法が開発された（国際公開公報ＷＯ９７／１０３６３、 米国特許出願第５，６９５，９３７号及び第５，８６６，３３０号）。この方法では、試料中の各ｃＤＮＡに対応する短いヌクレオチド配列が二量体化された「ジタグ」（ｄｉｔａｇ）と称するタグを調製し、このジタグを鎖状に連結して単一の連結物（コンカテマー）としてクローン化しタグの配列決定により遺伝子発現パターンを明らかにするものである。このＳＡＧＥ法では、試料中の各ｃＤＮＡに対応する単一の発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを得ることはできず、また一度に同定できる発現遺伝子の数は連結物が含み得るジタグの限界から１０００以下、通常４００以下である。
【０００５】
本発明者らは、このような従来の遺伝子発現パターンなどを解析する方法の欠点、及び低い解析限界を克服するため、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法、及び該ｃＤＮＡタグを用いる遺伝子発現解析方法を開発した（国際特許出願第ＰＣＴ／ＪＰ０２／０２３３８号）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、本発明者らが先に出願した国際特許出願第ＰＣＴ／ＪＰ０２／０２３３８号にかかる、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法、及び遺伝子発現解析方法に対し、使用できる制限酵素の選択の幅を拡げ、使用するリンカーの製造を容易にするなどの改良を加えた該ｃＤＮＡタグの作成方法、及び遺伝子発現解析方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、各生物種に固有な遺伝子発現パターン、及び細胞の生理的状態、発生段階、各種病的状態などにおける特有な遺伝子発現パターンの効率的な解析を可能にする、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法、及び該同定用タグを用いる遺伝子発現解析方法を提供する。本発明の方法は、従来の技術に比べ、遺伝子発現の解析に要する細胞試料の量が少なくて済み、効率的で、かつ信頼度の高いものである。
【０００８】
すなわち、本発明が提供するのは、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法であって：相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を準備し；該ｃＤＮＡをＩＩ型制限酵素で切断してｃＤＮＡ断片を作成し；該ｃＤＮＡ断片に、第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含み、かつ前記ＩＩ型制限酵の切断末端との連結部分に第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を生じるリンカーＸを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素で切断して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグの第２ＩＩＳ型制限酵素による切断末端に、第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を増幅し；かつ、得られた増幅産物を第１ＩＩＳ型制限酵素及び第３ＩＩＳ型制限酵素で同時にあるいは順次に切断して、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを得る前記作成方法である。
【０００９】
また、本発明が提供するのは、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法であって：相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を準備し；該ｃＤＮＡをＩＩ型制限酵素で切断してｃＤＮＡ断片を作成し；該ｃＤＮＡ断片に、第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素で切断して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグの第２ＩＩＳ型制限酵素による切断末端に、第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を増幅し；かつ、得られた増幅産物を第１ＩＩＳ型制限酵素で切断して、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを得る前記作成方法である。
【００１０】
さらに、本発明は、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法であって：相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を準備し；該ｃＤＮＡをＩＩ型制限酵素で切断してｃＤＮＡ断片を作成し；該ｃＤＮＡ断片に、第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素で切断して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグの第２ＩＩＳ型制限酵素による切断末端に、第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を作成し；該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を増幅し；かつ、得られた増幅産物を第１ＩＩＳ型制限酵素及び第３ＩＩＳ型制限酵素で同時にあるいは順次に切断して、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを得る前記作成方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸを提供する。
さらに、本発明は、前記発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法で得られたｃＤＮＡタグライブラリーを、検出すべき核酸を固定した検出装置に接触させることを特徴とする遺伝子発現解析方法を提供する。
さらに、本発明は、同定すべき一群の核酸を含むライブラリーを、本発明で得られた同定用ｃＤＮＡタグを固定した検出装置に、接触させることを特徴とする遺伝子発現解析方法を提供する。これらの検出装置としてＤＮＡチップを用いることができる。
さらに、本発明は、前記発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法で得られた該タグを互いに連結する工程、及び該連結物の塩基配列を決定する工程を含む発現遺伝子解析方法を提供する。該解析方法には、該連結物の配列を決定し、その配列からそれぞれのｃＤＮＡタグの配列を決定する定性的解析方法、及びその配列からそれぞれのｃＤＮＡタグの配列及び出現頻度を求める、定量的発現遺伝子解析方法が含まれる。
【００１２】
さらに、本発明が提供するのは、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグ作成キットであって、ＩＩ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素、第２ＩＩＳ型制限酵素、第３ＩＩＳ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含み、かつ前記ＩＩ型制限酵の切断末端との連結部分に第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を生じるリンカーＸ、及び第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを含む、該キットである。
さらに、本発明が提供するのは、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグ作成キットであって、ＩＩ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素、第２ＩＩＳ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素および第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸ、第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹ、を含む該キットである。
【００１３】
さらに、本発明が提供するのは、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグ作成キットであって、ＩＩ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素、第２ＩＩＳ型制限酵素、第３ＩＩＳ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素および第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸ、及び第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを含む、該キットである。
なお、発現遺伝子同定用タグ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃＤＮＡ Ｔａｇ）を、必要に応じてＥＧＩ ｃＤＮＡ タグ又はＥＧＩタグという略号で表す。
ここで、本発明は基本的な原理について説明する。
第一は、遺伝子転写産物内の一定の位置から単離された短いヌクレオチド配列のタグが、その転写産物を同定するのに十分な情報量を含むということである。例えば、９ ｂｐの配列のタグは、４の９乗、すなわち２６２，１４４種の配列が可能であり、これに対応する同数の転写産物を識別することができる。一方、ヒト・ゲノムは約８０，０００〜２００，０００ の転写産物をコードすると示唆されている（Ｆｉｅｌｄｓら、 Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７：３４５、１９９４年） 。したがって、理論的には９ ｂｐの配列のタグを得られれば、すべてのヒト遺伝子転写産物を同定することができる。
【００１４】
下等な真核生物や原核生物の場合、ゲノムによりコードされる転写産物の数はより少ないので、タグのサイズをもっと短くすることができる。例えば、酵母では転写産物を識別するのに６〜７ ｂｐ ほどの短いタグで十分である。本発明の方法は、それぞれの遺伝子転写産物に対応する、様々なヌクレオチド長さを有する、単一の発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを提供するので、遺伝子発現パターンを解析するのに有益である。
【００１５】
第二は、上流及び下流をリンカーに挟まれた単一の短いｃＤＮＡタグを１回増幅処理するだけで、発現遺伝子の解析を行なうことができるので、増幅及び／又はクローニングに起因するバイアスが起こり難いことである。
第三は、本発明の方法により得られたＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーを利用して、ＥＧＩｃＤＮＡタグ配列に対応するｃＤＮＡを定性的、また定量的に測定し、対応する発現遺伝子のパターンを調べられることである。
第四は、本発明の方法で作成された同定用ｃＤＮＡタグにより、スペーサー配列の無い、又は有る連結物（コンカテマー）を作成し、必要に応じてベクターなどを用いてクローン化し連続的、かつ効率的に解析することができる。特に、該ｃＤＮＡタグがそれぞれ独立した配列なので、連結物の配列を解析するのも容易であるし、連結物から単独のｃＤＮＡタグを単離することも容易に行なうことができる。
なお、本発明と先に記載したＳＡＧＥ法とは、短いヌクレオチド配列のタグが転写産物を同定するのに十分な情報量を含むという第一原理を応用する点で共通する。しかし、ＳＡＧＥ法は、「ジタグ」（ｄｉｔａｇ） と称する二量体化されたタグを利用するものであり、本発明で作成される単一の同定用ｃＤＮＡタグ、そのライブラリー、単一の同定用ｃＤＮＡタグからなる連続体を作成しないという点で相違する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明の好ましい実施の形態による発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグ（以下、ＥＧＩｃＤＮＡタグという。）の作成方法を、図１〜６に示すフローチャートに基づき説明する。
なお、本発明の発現遺伝子同定用タグの作成方法には、主として三態様がある。すなわち、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグの第２ＩＩＳ型制限酵素による切断末端に、第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを連結する工程を有する方法（本発明の実施態様１）、所定のｃＤＮＡ断片に第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸを連結する工程を有する方法（本発明の実施態様２）、及び前記リンカーＸ及びリンカーＹを含む両工程を組み合わせ方法（本発明の実施態様３）である。
【００１７】
本発明の実施態様１のＥＧＩｃＤＮＡタグの作成方法を、図１及び２に基づいて示すと次のとおりである。
（１）相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を準備し、
（２）該ｃＤＮＡをＩＩ型制限酵素ＲｓａＩで切断してｃＤＮＡ断片を作成し；
（３）該ｃＤＮＡ断片に、第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩの認識配列を含み、かつ前記ＩＩ型制限酵：ＲｓａＩの切断末端との連結部分に第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩの認識配列を生じるリンカーＸを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成し；
（４）該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩで切断して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を作成し；
（５）必要に応じて該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を純化し；
（６）必要に応じて該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物のｃＤＮＡタグの末端を、第３ＩＩＳ型制限酵素Ｅｃｉｌの認識配列を含むリンカーＹが結合可能な状態に処理した後、（７） 該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグの第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩによる切断末端に、第３ＩＩＳ型制限酵素Ｅｃｉｌの認識配列を含むリンカーＹを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を作成し；
（８）該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を増幅し；かつ
（９）得られた増幅産物を第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩ及び第３ＩＩＳ型制限酵素Ｅｃｉｌで同時、又は順次切断して、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを得て、
（１０）必要に応じて、得られた発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを分離することを含む、ＥＧＩｃＤＮＡタグの作成方法。
【００１８】
なお、説明を容易にするため、本発明の実施態様１では各制限酵素を具体的に記載しているが、もちろん、幅広く、様々な制限酵素を使用できる。実施態様１で用いるリンカーＸは、第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含み、かつＩＩ型制限酵の切断末端との連結部分に第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を生じるリンカーであり、リンカーＹは、第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーである。
なお、実施態様１で用いるリンカーＸ、リンカーＹ、プライマーＸ及びプライマーＹのそれぞれの配列の例を下記に示す。
【００１９】
リンカーＸ：
５’−…ＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＮＮＮＮＧＧＧ…−３’（配列番号１）
３’−…ＮＮＮＮＮＮＮＣＴＣＣＴＣＮＮＮＮＮＣＣＣ…−５’（配列番号２）
リンカーＹ：
５’−…ＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＣＧＣＣＮＮＮＮＮＮＮ…−３’（配列番号３）
３’−…ＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＧＣＧＧＮＮＮＮＮＮＮ…−５’（配列番号４）
プライマーＸ：
５’−…ＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＮＮＮＮＧＧＧＡＣ…−３’（配列番号５）
プライマーＹ：
３’−…ＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＧＣＧＧＮＮＮＮＮＮＮ…−５’（（配列番号６）
本発明の実施態様２のＥＧＩｃＤＮＡタグの作成方法を、図３及び４に基づいて示すと次のとおりである。
【００２０】
（１）相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を準備し、
（２）該ｃＤＮＡをＩＩ型制限酵素Ｃｓｐ６Ｉで切断してｃＤＮＡ断片を作成し；
（３）該ｃＤＮＡ断片に、第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩ並びに第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｇＩの認識配列を含むリンカーＸを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成し；
（４）該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｇＩで切断して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を作成し；
（５）必要に応じて該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を純化し；
（６）必要に応じて該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物のｃＤＮＡタグの末端を、第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹが結合可能な状態に処理した後、
（７）該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグの第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｇＩによる切断末端に、第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩの認識配列を含むリンカーＹを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を作成し；
（８）該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を増幅し；かつ
（９）得られた増幅産物を第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩで切断して、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを得て、
（１０）必要に応じて、得られた発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを分離することを含む、ＥＧＩｃＤＮＡタグの作成方法。
【００２１】
なお、説明を容易にするため、実施態様２でも各制限酵素を具体的に記載しているが、もちろん、幅広く、様々な制限酵素を使用できる。実施態様２で用いるリンカーＸは、第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｇＩの認識配列を含むリンカーであり、リンカーＹは、リンカーＸと同じ第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーである。
なお、実施態様２で用いるリンカーＸ、リンカーＹ、プライマーＸ及びプライマーＹのそれぞれの配列を下記に示す。
【００２２】
リンカーＸ：
５’−…ＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＧＴＧＣＡＧ…−３’（配列番号７）
３’−…ＮＮＮＮＮＮＮＣＴＣＣＴＣＮＣＡＣＧＴＣＡＴ…−５’（配列番号８）
リンカーＹ：
５’−…ＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＣＴＣＣＴＣＮＮＮＮＮＮＮ…−３’（配列番号９）
３’−…ＮＮＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮ…−５’（配列番号１０）
プライマーＸ：
５’−…ＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＧＴＧＣＡＧＴＡＣ…−３’（配列番号１１）
プライマーＹ：
３’−…ＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＮＮＮＮＮＮ…−５’（（配列番号１２）
本発明の実施態様３のＥＧＩｃＤＮＡタグの作成方法を、図５及び６に基づいて示すと次のとおりである。
【００２３】
（１）相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を準備し、
（２）該ｃＤＮＡをＩＩ型制限酵素Ｃｓｐ６Ｉで切断してｃＤＮＡ断片を作成し；
（３）該ｃＤＮＡ断片に、第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩ及び第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｇＩの認識配列を含むリンカーＸを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成し；（４）該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｇＩで切断して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を作成し；
（５）必要に応じて該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を純化し；
（６）必要に応じて該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物のｃＤＮＡタグの末端を、第３ＩＩＳ型制限酵素Ｅｃｉｌの認識配列を含むリンカーＹが結合可能な状態に処理した後、（７）該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグの第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｇＩによる切断末端に、第３ＩＩＳ型制限酵素Ｅｃｉｌの認識配列を含むリンカーＹを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を作成し；
（８）該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を増幅し；かつ
（９）得られた増幅産物を第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩ並びに第３ＩＩＳ型制限酵素Ｅｃｉｌで切断して、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを得て、
（１０）必要に応じて、得られた発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを分離することを含む、ＥＧＩｃＤＮＡタグの作成方法。
【００２４】
なお、説明を容易にするため、実施態様３でも各制限酵素を具体的に記載しているが、もちろん、幅広く、様々な制限酵素を使用できる。実施態様３で用いるリンカーＸは、第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーであり、リンカーＹは、第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーである。
さらに、本発明を、実施態様３に基づき詳細に説明する。なお、ここに記載する制限酵素、処理手順は特に断らない限り、本発明全体に適用することができる。
（１）の工程では、試料となるｃＤＮＡを準備する。通常、まず被検細胞からｍＲＮＡを調製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作成する。該ｃＤＮＡは、全長ｍＲＮＡに対応するもの及びそのフラグメントのいずれであってもよい。該被検細胞は、３’末端にポリＡテールを有するｍＲＮＡを産生する細胞である限り限定されず、動物細胞、植物細胞、微生物細胞等のあらゆる細胞を含む。ウイルス感染した動物細胞、植物細胞、微生物細胞を被検細胞として用いることもできる。
【００２５】
本発明では、１μｇのｍＲＮＡがあれば解析を行うことができる。１μｇのｍＲＮＡは、通常１ｍｇの細胞から得られるので、本発明は、ニードルバイオプシーなどで得た貴重な人体組織サンプルなど取り扱う際には特に有効である。
被検細胞からのｍＲＮＡの分離は、通常行われる手法により行うことができる。例えば、被検細胞を、グアニジン試薬、フェノール試薬等で処理してトータルＲＮＡを分離後、オリゴｄＴ−セルロースやセファロース２Ｂを担体とするポリＵ−セファロース等を用いるアフィニティーカラム法やバッチ法等によりｍＲＮＡを得る。
次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて、第一鎖ｃＤＮＡ（一本鎖ｃＤＮＡ）を合成後、該第一鎖ｃＤＮＡを鋳型として第二鎖ｃＤＮＡ（二本鎖ｃＤＮＡ）を合成する。ここのオリゴｄＴプライマーとしては、固相固定化オリゴｄＴプライマー、補酵素標識オリゴｄＴプライマー等が挙げられるが、再現性や目的ＤＮＡ断片の回収率の点から、固相固定化オリゴｄＴプライマーが好ましい。該固相固定化オリゴｄＴプライマーには、ラテックスビーズ固定化オリゴｄＴプライマー、マグネットビーズ固定化オリゴｄＴプライマー等があるが、マグネットビーズ固定化オリゴｄＴプライマーが好ましい。
【００２６】
（２）の工程では、試料中の該ｃＤＮＡをＩＩ型制限酵素で切断してｃＤＮＡ断片を作成する。
試料中の該ｃＤＮＡは、固相固定化オリゴｄＴプライマーに結合した二本鎖ｃＤＮＡとすることができる。本明細書中の「ＩＩ型制限酵素」という用語は、所定の認識配列を認識して、該認識配列の内側又はその隣接した特異的な位置でＤＮＡを切断する制限酵素をいう。本発明で用いるＩＩ型制限酵素としては、解析するｍＲＮＡ中に少なくとも１つは認識配列を有すると考えられるもの、例えば、４、５あるいは６個の塩基からなる認識配列を有するＩＩ型制限酵素が好ましい。特にｍＲＮＡの平均鎖長が２０００塩基である点を考慮すると、４の４乗＝２５６塩基に１つの割合で制限部位が出現し得る４塩基の認識配列を有するＩＩ型制限酵素が好ましい。
【００２７】
本発明に用いるＩＩ型制限酵素の例を挙げると、ＡｆａＩ， ＡｌｕＩ， ＣｆｕＩ， ＣｖｉＲＩ， ＤｐｎＩ， ＥｓａＢＣ３Ｉ， ＨｐｙＢＩ， ＨｐｙＣＨ４Ｖ， ＨｐｙＦ４４ＩＩＩ， ＭｌｔＩ， ＰｌａＡＩＩ， ＲｓａＩ， ＢｆａＩ， Ｃｓｐ６Ｉ， ＣｖｉＡＩＩ， ＣｖｉＱＩ， ＣｖｉＲＩＩ， ＦｇｏＩ， ＨｐｙＣＨ４ＩＶ， ＭａｅＩ， ＭａｅＩＩ， ＭｔｈＺＩ， ＲｍａＩ， ＰｐａＡＩＩ，ＴａｑＩ， Ｔｓｐ３２Ｉ， Ｔｓｐ３２ＩＩ， ＴｔｈＨＢ８Ｉ， ＸｓｐＩ， ＢｓｐＫＴ６Ｉ， ＢｓｔＫＴＩ， ＨｐｙＣＨ４Ｉ， ＡｓｐＭＤＩ，Ｂｃｅ２４３Ｉ， Ｂｆｉ５７Ｉ， ＢｆｕＣＩ， Ｂｍｅ１２Ｉ， ＢｓｃＦＩ， Ｂｓｐ６７Ｉ， Ｂｓｐ１０５Ｉ， Ｂｓｐ１４３Ｉ， Ｂｓｐ２０９５Ｉ， ＢｓｐＡＩ， ＢｓｐＦＩ， ＢｓｐＪＩ， Ｂｓｔ１９ＩＩ， ＢｓｔＥＮＩＩ， ＢｔｋＩＩ， ＣａｃＩ， ＣｃｙＩ， ＣｈａＩ， ＣｐｆＩ， ＣｖｉＡＩ， ＤｐｎＩＩ， ＦａｔＩ， ＦｎｕＣＩ， ＦｎｕＥＩ， ＨａｃＩ， Ｋｚｏ９Ｉ， ＬｌａＡＩ， ＭｂｏＩ， ＭｇｏＩ， ＭｋｒＡＩ， ＮｄｅＩＩ， ＮＩａＩＩ， ＮｍｅＣＩ， ＮｐｈＩ， ＲａｌＦ４０Ｉ， Ｓａｕ３ＡＩ， ＳａｕＭＩ， Ｓｔｈ３６８Ｉ， ＣｈａＩ， Ｈｎ１ＩＩ， Ｈｓｐ９２ＩＩ， ＮＩａＩＩＩ， ＴａｉＩ， ＴｓｃＩ， Ｔｓｐ４９Ｉ， ＡｃｃＩＩ， ＢａｎＡＩ， ＢｃｅＢＩ， ＢｅｃＡＩＩ， ＢｅｐＩ， Ｂｉｍ１９ＩＩ， Ｂｍｅ３６１Ｉ， Ｂｐｕ９５Ｉ， ＢｓｅＱＩ， ＢｓｈＩ， Ｂｓｈ１２３６Ｉ， ＢｓｈＦＩ， Ｂｓｐ５０Ｉ， Ｂｓｐ１２３Ｉ， Ｂｓｐ２１１Ｉ， ＢｓｐＢＲＩ， ＢｓｐＫＩ， ＢｓｐＲＩ， ＢｓｔＦＮＩ， ＢｓｔＵＩ， Ｂｓｕ１５３２Ｉ， ＢｓｕＲＩ， ＢｔｇＩ， ＢｔｋＩ， ＣｌｔＩ， Ｃｓｐ６８ＫＶＩ， ＣｓｐＫＶＩ， ＤｓａＩＩ， ＥｓａＢＣ４Ｉ， ＦａｌＩＩ， ＦａｕＢＩＩ， ＦｎｕＤＩ， ＦｎｕＤＩＩ， ＨａｅＩＩＩ， ＭｃｈＡＩＩ， ＭｆｏＡＩ， ＭｆｏＡＩ， ＭｖｎＩ， ＮｇｏＰＩＩ， ＮｓｐＬＫＩ， ＰａｌＩ， Ｐｄｅ１３３Ｉ，ＰｆｌＫＩ， ＰｌａＩ， ＳｂｖＩ， ＳｆａＩ， ＳｕａＩ， ＴｈａＩ， ＡｃｉＩ， Ｂｃｏ２７Ｉ， ＢｓｉＳＩ， Ｂｓｔ４０Ｉ， ＢｓｕＦＩ， ＣｂｏＩ， ＨａｐＩＩ， Ｈｉｎ２Ｉ， Ｈｉｎ６Ｉ， ＨｉｎＰ１Ｉ， ＨｐａＩＩ， ＨｓｏＩ， ＨｓｐＡＩ， ＭｎｏＩ， ＭｓｐＩ， Ｐｄｅ１３７Ｉ， ＳｃｉＮＩ， Ｓｔｈ１３４Ｉ， ＡｓｐＬＥＩ， ＢｓｐＬＡＩ， ＢｓｔＨＨＩ， ＣｆｏＩ， ＦｎｕＤＩＩＩ， ＨｈａＩ， ＳｅｌＩ，ＭｓｅＩ， Ｔｒｕ１Ｉ， Ｔｒｕ９Ｉ， Ｓｓｅ９Ｉ， ＴａｓＩ， Ｔｓｐ５０９Ｉ， 及びＴｓｐＥＩがある。
【００２８】
これらのＩＩ型制限酵素には、認識配列が４塩基 ＡＴＣＧすべてを含むもの、ＣＧのみを含むもの及びＡＴのみを含むものがある。
認識配列がＡＴＣＧすべてを含む上記ＩＩ型制限酵素の例を挙げると、ＡｆａＩ， ＡｌｕＩ， ＣｆｕＩ， ＣｖｉＲＩ， ＤｐｎＩ， ＥｓａＢＣ３Ｉ， ＨｐｙＢＩ， ＨｐｙＣＨ４Ｖ， ＨｐｙＦ４４ＩＩＩ， ＭｌｔＩ， ＰｌａＡＩＩ， ＲｓａＩ， ＢｆａＩ， Ｃｓｐ６Ｉ， ＣｖｉＡＩＩ， ＣｖｉＱＩ， ＣｖｉＲＩＩ， ＦｇｏＩ， ＨｐｙＣＨ４ＩＶ， ＭａｅＩ， ＭａｅＩＩ， ＭｔｈＺＩ， ＲｍａＩ， ＰｐａＡＩＩ， Ｔｓｐ３２Ｉ， Ｔｓｐ３２ＩＩ， ＴａｑＩ， ＴｔｈＨＢ８Ｉ， ＸｓｐＩ， ＢｓｐＫＴ６Ｉ， ＢｓｔＫＴＩ， ＨｐｙＣＨ４Ｉ， ＡｓｐＭＤＩ， Ｂｃｅ２４３Ｉ， Ｂｆｉ５７Ｉ， ＢｆｕＣＩ， Ｂｍｅ１２Ｉ， ＢｓｃＦＩ， Ｂｓｐ６７Ｉ， Ｂｓｐ１０５Ｉ，Ｂｓｐ１４３Ｉ， Ｂｓｐ２０９５Ｉ， ＢｓｐＡＩ， ＢｓｐＦＩ， ＢｓｐＪＩ， Ｂｓｔ１９ＩＩ， ＢｓｔＥＮＩＩ， ＢｔｋＩＩ， ＣａｃＩ， ＣｃｙＩ， ＣｈａＩ， ＣｐｆＩ， ＣｖｉＡＩ， ＤｐｎＩＩ， ＦａｔＩ， ＦｎｕＣＩ， ＦｎｕＥＩ， ＨａｃＩ， Ｋｚｏ９Ｉ， ＬｌａＡＩ， ＭｂｏＩ， ＭｇｏＩ， ＭｋｒＡＩ， ＮｄｅＩＩ， ＮＩａＩＩ， ＮｍｅＣＩ， ＮｐｈＩ， ＲａｌＦ４０Ｉ， Ｓａｕ３ＡＩ， ＳａｕＭＩ， Ｓｔｈ３６８Ｉ， ＣｈａＩ， Ｈｎ１ＩＩ， Ｈｓｐ９２ＩＩ， ＮＩａＩＩＩ， ＴａｉＩ， ＴｓｃＩ及びＴｓｐ４９Ｉがある。
【００２９】
また、認識配列がＣＧのみを含む該ＩＩ型制限酵素の例を挙げると、ＡｃｃＩＩ， ＢａｎＡＩ， ＢｃｅＢＩ， ＢｅｃＡＩＩ， ＢｅｐＩ， Ｂｉｍ１９ＩＩ， Ｂｍｅ３６１Ｉ， Ｂｐｕ９５Ｉ， ＢｓｅＱＩ， ＢｓｈＩ， Ｂｓｈ１２３６Ｉ， ＢｓｈＦＩ， Ｂｓｐ５０Ｉ， Ｂｓｐ１２３Ｉ， Ｂｓｐ２１１Ｉ， ＢｓｐＢＲＩ， ＢｓｐＫＩ， ＢｓｐＲＩ， ＢｓｔＦＮＩ， ＢｓｔＵＩ， Ｂｓｕ１５３２Ｉ， ＢｓｕＲＩ， ＢｔｇＩ， ＢｔｋＩ， ＣｌｔＩ， Ｃｓｐ６８ＫＶＩ， ＣｓｐＫＶＩ， ＤｓａＩＩ， ＥｓａＢＣ４Ｉ， ＦａｌＩＩ， ＦａｕＢＩＩ， ＦｎｕＤＩ， ＦｎｕＤＩＩ， ＨａｅＩＩＩ， ＭｃｈＡＩＩ， ＭｆｏＡＩ， ＭｆｏＡＩ， ＭｖｎＩ， ＮｇｏＰＩＩ， ＮｓｐＬＫＩ， ＰａｌＩ， Ｐｄｅ１３３Ｉ， ＰｆｌＫＩ， ＰｌａＩ， ＳｂｖＩ， ＳｆａＩ， ＳｕａＩ， ＴｈａＩ， ＡｃｉＩ， Ｂｃｏ２７Ｉ， ＢｓｉＳＩ， Ｂｓｔ４０Ｉ， ＢｓｕＦＩ， ＣｂｏＩ， ＨａｐＩＩ， Ｈｉｎ２Ｉ， Ｈｉｎ６Ｉ， ＨｉｎＰ１Ｉ， ＨｐａＩＩ， ＨｓｏＩ， ＨｓｐＡＩ， ＭｎｏＩ， ＭｓｐＩ， Ｐｄｅ１３７Ｉ， ＳｃｉＮＩ， Ｓｔｈ１３４Ｉ， ＡｓｐＬＥＩ， ＢｓｐＬＡＩ， ＢｓｔＨＨＩ， ＣｆｏＩ， ＦｎｕＤＩＩＩ， ＨｈａＩ及びＳｅｌＩがある。また、認識配列がＡＴのみを含むＩＩ型制限酵素の例を挙げると、ＭｓｅＩ， Ｔｒｕ１Ｉ， Ｔｒｕ９Ｉ， Ｓｓｅ９Ｉ， ＴａｓＩ， Ｔｓｐ５０９Ｉ 及びＴｓｐＥＩがある。これらの認識配列の特徴を考慮して、ＩＩ型制限酵素を選択するがの好ましい。
【００３０】
（３）の工程では、該ｃＤＮＡ断片に、第１ＩＩＳ型制限酵素並びに第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成する。
まず、（２）の工程で得られたｃＤＮＡ断片群から、オリゴｄＴプライマー配列を含むｃＤＮＡ断片を分離する。分離は、オリゴｄＴプライマーの標識を利用して行うことができる。例えば、ラテックスビーズ固定化オリゴｄＴプライマーを前記ｃＤＮＡの調製に用いている場合には、ＩＩ型制限酵素で処理した後、遠心分離することによって、該ビーズに固定されたオリゴｄＴプライマー配列を含むｃＤＮＡ断片を沈降、分離することができる。ここで得られるｃＤＮＡ断片は、ｍＲＮＡのポリＡテールと該ポリＡテールから５’上流側に向かって最初に出現する前記ＩＩ型制限酵素の切断末端部位を含むものである。次いで、該ｃＤＮＡ断片に、リンカーＸをＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）を用いて連結する。
【００３１】
リンカーＸに設定する第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列は、第１ＩＩＳ型制限酵素がスペーサー配列を残さないよう該ｃＤＮＡタグを切断する位置、又は所望のスペーサー配列を残すような適切な位置に在るのが好ましい。
例えば、第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列としてＢｓｅＲＩの認識配列を含み、第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列としてＢｓｇＩの認識配列を含み、かつＩＩ型制限酵素としてＣｓｐ６Ｉを用いたときに得られるｃＤＮＡ断片に連結させるリンカーＸとしては、次の構造を有する二本鎖ＤＮＡ断片がある。
５’−…ＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＧＴＧＣＡＧ…−３’（配列番号１３）
３’−…ＮＮＮＮＮＮＮＣＴＣＣＴＣＮＣＡＣＧＴＣＡＴ…−５’（配列番号１４）
該リンカーＸ中の配列「５’−ＧＡＧＧＡＧ−３’」は第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩの認識配列である。また該リンカーＸ中の３’末端配列「５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’」は、第２ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｇＩの認識配列である。なお、本明細書中の塩基配列において使用するＮ又はｎは、任意の塩基を意味する。
【００３２】
本明細書中で用いる「第１ＩＩＳ型制限酵素」という用語は、原則として、リンカーＸ上の認識配列を認識し、所望のＥＧＩｃＤＮＡタグを形成できるＩＩＳ型制限酵素及び、同様の機能を発揮するＩ型及びＩＩＩ型制限酵素をも含むものである。
該第１ＩＩＳ型制限酵素の例を挙げると、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ， ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ， ＢｓｅＲＩ， ＢｓｐＳＴ５Ｉ， ＬｗｅＩ， ＰｈａＩ， ＳｆａＮＩ， ＡａｒＩ， Ａｃｃ３６Ｉ，ＢｆｕＡＩ， ＢｓｐＭＩ， ＢｖｅＩ， Ｓｔｈ１３２Ｉ， ＳｓｐＤ５Ｉ， ＡｓｕＨＰＩ， ＨｐｈＩ， ＭｂｏＩＩ， ＮｃｕＩ， ＭｎｌＩ， ＢｂｓＩ， ＢｂｖＩＩ， ＢｂｓＩ， Ｂｂｖ１６ＩＩ， ＢｐｉＩ， ＢｐｕＡＩ， Ｂｓｃ９１Ｉ， ＢｓｐＢＳ３１Ｉ， ＢｓｐＩＳ４Ｉ， ＢｓｐＴＳ５１４Ｉ， ＢｓｔＢＳ３２Ｉ， ＢｓｔＴＳ５Ｉ， ＢｓｔＶ２Ｉ， Ｂｍｅ５８５Ｉ， ＢｓｃＡＩ， Ｂｓｔ１９Ｉ， ＢｓｔＦＺ４３８Ｉ， ＦａｕＩ， ＳｍｕＩ ＢｃｉＶＩ， ＢｆｕＩ， 及びＨｐｙＡＶ がある。
【００３３】
これらのうち、認識配列から最長末端までの距離が１０塩基以上の第１ＩＩＳ型制限酵素には、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ， ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ， 及びＢｓｅＲＩ がある。また、該距離が１６塩基以上の第１ＩＩＳ型制限酵素には、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ及びＧｓｕＩがある。
本明細書中で用いる「第２ＩＩＳ型制限酵素」という用語は、リンカーＸ上、又はリンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物結合部に形成された認識配列を認識して、ｃＤＮＡ断片の適切な位置を切断するＩＩＳ型制限酵素、及び同様の機能を発揮するＩ型及びＩＩＩ型制限酵素を含むものである。該第２ＩＩＳ型制限酵素の切断により、リンカーＸとｃＤＮＡタグの連結物が得られる。
【００３４】
該第２ＩＩＳ型制限酵素の例を挙げると、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ， ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ，ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ， ＢｓｅＲＩ， ＢｓｐＳＴ５Ｉ， ＬｗｅＩ， ＰｈａＩ， ＳｆａＮＩ， ＡａｒＩ， Ａｃｃ３６Ｉ， ＢｆｕＡＩ， ＢｓｐＭＩ， ＢｖｅＩ， Ｓｔｈ１３２Ｉ， ＳｓｐＤ５Ｉ， ＡｓｕＨＰＩ， ＨｐｈＩ， ＭｂｏＩＩ， ＮｃｕＩ， ＭｎｌＩ， ＢｂｓＩ， ＢｂｖＩＩ， ＢｂｓＩ， Ｂｂｖ１６ＩＩ， ＢｐｉＩ， ＢｐｕＡＩ， Ｂｓｃ９１Ｉ， ＢｓｐＢＳ３１Ｉ， ＢｓｐＩＳ４Ｉ， ＢｓｐＴＳ５１４Ｉ， ＢｓｔＢＳ３２Ｉ， ＢｓｔＴＳ５Ｉ， ＢｓｔＶ２Ｉ， Ｂｍｅ５８５Ｉ， ＢｓｃＡＩ， Ｂｓｔ１９Ｉ， ＢｓｔＦＺ４３８Ｉ， ＦａｕＩ， ＳｍｕＩ ＢｃｉＶＩ， ＢｆｕＩ， 及びＨｐｙＡＶがある。
【００３５】
これらのうち、認識配列から最長末端までの距離が１０塩基以上の第２ＩＩＳ型制限酵素には、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ，ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ及びＢｓｅＲＩがある。また、該距離が１６塩基以上の第２ＩＩＳ型制限酵素には、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， 及びＧｓｕＩがある。 なお、第１ＩＩＳ型制限酵素は切断部位の配列を限定する必要はないので、第１及び第２のＩＩＳ型制限酵素の組み合わせは限定されない。また、リンカーＸはＩＩ型制限酵素によって形成されるｃＤＮＡ断片と連結物を形成できる末端を持つか、あるいは連結物を形成できるように末端を加工できなければならないが、ＩＩ型制限酵素と第１ＩＩＳ型制限酵素または第２ＩＩＳ型制限酵素との組み合わせは限定されない。
【００３６】
また、第１ＩＩＳ型制限酵素の正鎖の切断位置が相補鎖の切断位置よりも離れている場合、それらの差の数だけリンカーＹにランダム配列を必要とする。該当するＩＩＳ型酵素の例を挙げると、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＲｌｅＡＩ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＢｓｅＭＩＩ，ＢｓｅＲＩ， ＡｓｕＨＰＩ， ＨｐｈＩ， ＭｂｏＩＩ， ＮｃｕＩ， ＭｎｌＩ， ＢｃｉＶＩ， ＢｆｕＩ， 及びＨｐｙＡＶがある。（４）の工程では、該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素で切断して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を作成する。
例えば、第２ＩＩＳ型制限酵素としてＢｓｇＩを用いる場合には、当該酵素は、該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物に形成された認識配列「５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’」及びその相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡを認識し、「５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’（１６／１４）」の位置を切断する。すなわち、ＢｓｇＩは、認識配列「５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’」の３’末端の塩基Ｃから３’下流側１６番目の塩基と１７番目との間のホスホジエステル結合、及び認識配列「５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’」の相補鎖「３’−ＣＴＧＣＡＣ−５’」の５’末端の塩基Ｃから５’上流側１４番目の塩基と１５番目との間のホスホジエステル結合を切断し、以下の構造を有する切断末端を有するＤＮＡ断片を生じる。
【００３７】
５’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＧＴＧＣＡＧＴＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ −３’（配列番号１５）
３’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＣＴＣＣＴＣＮＣＡＣＧＴＣＡＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−５’（配列番号１６）
（５）の工程では、必要に応じて、（４）の工程で該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素で切断して得られた、該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を純化する。この純化は、前記ｃＤＮＡタグが切除されたｃＤＮＡ断片残部を、（３）の工程で記載したように、標識オリゴｄＴプライマーの標識を利用して除去することにより行うことができる。例えば、ラテックスビーズ固定化オリゴｄＴプライマーを前記ｃＤＮＡの調製に用いている場合には、ラテックスビーズの沈降性を利用して、制限酵素処理液を遠心分離することによって、標識オリゴｄＴプライマー配列を含むｃＤＮＡ断片残部を沈降し、除去することができる。ここで遠心上清には、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物が含まれることになる。
【００３８】
（６）の工程では、必要に応じて該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物の第２ＩＩＳ型制限酵素によるｃＤＮＡタグの末端を第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹが結合可能な状態にする。
（７）の工程では、該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物の切断末端にリンカーＹを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を作成する。該リンカーＹとは、第１又は３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーをいう。また、該認識配列は、第ＩＩＳ型制限酵素がスペーサー配列を残さないよう該ｃＤＮＡタグを切断する位置、又は所望のスペーサー配列を残すような適切な位置に在るのが好ましい。例えば、（６）の工程で特に加工を施さなかった場合、連結するリンカーＹとしては、下記構造を有するＤＮＡ断片がある。この例では、スペーサー配列として、ＡＣ２残基が残されるよう設計されている。
【００３９】
５’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＧＧＣＧＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＮＮ−３’（配列番号１７）
３’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＣＣＧＣＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＡ −５’（配列番号１８）
また、（７）の工程で作成されるリンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物は、例えば、下記の配列を有する。
【００４０】
５’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＧＴＧＣＡＧＴＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＣＧＣＣＮＮＮＮＮＮＮ−３’（配列番号１９）
３’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＣＴＣＣＴＣＮＣＡＣＧＴＣＡＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＧＣＧＧＮＮＮＮＮＮＮ−５’（配列番号２０）
本明細書中で用いる「第３ＩＩＳ型制限酵素」という用語は、第１ＩＩＳ型制限酵素に代えて用いる制限酵素であって、リンカーＹ上の認識配列を認識し、所望のＥＧＩｃＤＮＡタグを形成できるＩＩＳ型制限酵素及び、同様の機能を発揮するＩ型及びＩＩＩ型制限酵素をも含むものである。
【００４１】
該第３ＩＩＳ型制限酵素の例を挙げると、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ， ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ， ＢｓｅＲＩ， ＢｓｐＳＴ５Ｉ， ＬｗｅＩ， ＰｈａＩ， ＳｆａＮＩ， ＡａｒＩ， Ａｃｃ３６Ｉ，ＢｆｕＡＩ， ＢｓｐＭＩ， ＢｖｅＩ， Ｓｔｈ１３２Ｉ， ＳｓｐＤ５Ｉ， ＡｓｕＨＰＩ， ＨｐｈＩ， ＭｂｏＩＩ， ＮｃｕＩ， ＭｎｌＩ， ＢｂｓＩ， ＢｂｖＩＩ， ＢｂｓＩ， Ｂｂｖ１６ＩＩ， ＢｐｉＩ， ＢｐｕＡＩ， Ｂｓｃ９１Ｉ， ＢｓｐＢＳ３１Ｉ， ＢｓｐＩＳ４Ｉ， ＢｓｐＴＳ５１４Ｉ， ＢｓｔＢＳ３２Ｉ， ＢｓｔＴＳ５Ｉ， ＢｓｔＶ２Ｉ， Ｂｍｅ５８５Ｉ， ＢｓｃＡＩ， Ｂｓｔ１９Ｉ， ＢｓｔＦＺ４３８Ｉ， ＦａｕＩ， ＳｍｕＩ ＢｃｉＶＩ， ＢｆｕＩ， 及びＨｐｙＡＶ がある。
【００４２】
これらのうち、認識配列から最長末端までの距離が１０塩基以上の第３ＩＩＳ型制限酵素には、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ， ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ， 及びＢｓｅＲＩ がある。また、該距離が１６塩基以上の第１ＩＩＳ型制限酵素には、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ及びＧｓｕＩがある。
なお、第１ＩＩＳ型制限酵素及び第３ＩＩＳ型制限酵素の組み合わせは、同一である場合も含み、限定されない。第１ＩＩＳ型制限酵素及び第３ＩＩＳ型制限酵素の組み合わせのうち、反応系が同一ないし類似の場合、後述の（９）の工程で第１ＩＩＳ型制限酵素及び第３ＩＩＳ型制限酵素を同時に働かせ、あるいは酵素及び塩を除去する行程を省略することができる。
【００４３】
該工程により、「５’−［リンカーＸ］−［ｃＤＮＡタグ（ＥＧＩｃＤＮＡタグ）］−［リンカーＹ］−３’）の構造を有する連結物が得られる。
（８）での工程は、該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を増幅する。
（７）の工程で得られる連結物は、リンカーＸ及びＹにそれぞれプライマーＸ及びＹがハイブリダイズする配列を有し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で容易に増幅することができる。該ＰＣＲ法は標準的なポリメラーゼ連鎖反応法、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されているような方法でよい。さらに、該連結物を原核生物に適合するベクターに組み込むクローニング、又は当業者に公知の他の増幅法により増幅してもよい。
【００４４】
なお、末端にプライマーアニール用のリンカーを連結させた多種類の長さの異なるＤＮＡを含む鋳型混合物を用いてＰＣＲを行った場合、増幅効率は各鋳型ＤＮＡの鎖長によって異なる。一般に、鎖長が長いほど増幅効率は低く、鎖長が短いほど増幅効率は高い。そのため、得られた増幅産物中の各鋳型ＤＮＡに対応する増幅ＤＮＡ断片の出現比率は、鋳型ＤＮＡ混合物中の各ＤＮＡ断片の存在比を反映しない結果となる。しかし、本発明の方法では、鋳型として使用するＤＮＡの混合物は、鎖長が等しく、かつ短いので、得られた増幅産物中の各鋳型ＤＮＡに対応する増幅ＤＮＡ断片の出現比率は、鋳型ＤＮＡ混合物中の各ＤＮＡ断片の存在比を反映したものとなる。 従って、本発明においては、ＰＣＲによる増幅効率の差による影響は理論的に皆無であり、かつ得られる増幅産物中の各ｃＤＮＡ断片の出現比率は、被検細胞中で発現されている各ｍＲＮＡの比率を反映したものとなる。
【００４５】
該ＰＣＲは、時間、温度などの条件は、標準的な設定で行なうことができる。なお、本発明で増幅するリンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹは、配列長が短く、長さが均一で増幅効率が高いので、アニール／配列延長サイクル数を減らすことが可能である。また、リンカーの配列を変えるとＰＣＲの効率が変わるので、用いるリンカーによりアニール／配列延長サイクルの所望の効率にすることができる。
【００４６】
本明細書中の「プライマーＸ」という用語は、リンカーＸの核酸鎖に相補的で、ポリメラーゼ連鎖反応が誘導される条件下で反応の開始点として作用することができる、天然に存在する、又は合成されたオリゴヌクレオチドを意味する。なお、プライマーＸは、リンカーＸ上の第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を残すことができる位置にハイブリダイズし、かつ重合剤の存在下で増幅を開始させるに足る長さのものでなければならない。該プライマーＸに必要な長さは温度、ｐＨ、使用するリガーゼなど多くの要因により決まってくるであろう。また同様に、本明細書中で用いる「プライマーＹ」という用語は、リンカーＹの核酸鎖に相補的で、ポリメラーゼ連鎖反応が誘導される条件下で反応の開始点として作用することができる、天然に存在する、又は合成されたオリゴヌクレオチドを意味する。なお、プライマーＹは、リンカーＹ上の第１又は３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を残すことができる位置にハイブリダイズし、かつ重合剤の存在下で増幅を開始させるに足る長さのものでなければならない。
なお、当業者であれば、過度の実験を行わなくとも、第１ＩＩＳ型制限酵素、第３ＩＩＳ型制限酵素等を考慮に入れ、リンカーのヌクレオチド配列に基づいて容易に該増幅用プライマーを作製することができるであろう。
【００４７】
実施態様３の（９）工程では、得られた増幅産物を第１ＩＩＳ型制限酵素及び第３ＩＩＳ型制限酵素で同時に、あるいは必要に応じて酵素及び塩を除去する行程を挟んで順次に切断して、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを作成する。第１ＩＩＳ型制限酵素と第３ＩＩＳ型制限酵とは、それぞれ独立に選択することができる。また、順次に切断する場合その順序は制限されない。例えば、第１ＩＩＳ型制限酵素としてＢｓｅＲＩを用いた場合には、該酵素はリンカーＸ上の配列「５’−ＧＡＧＧＡＧ−３’」及びその相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡを認識し、「５’−ＧＡＧＧＡＧ−３’（１０／８）」を切断する。すなわち、ＢｓｅＲＩは、認識配列「５’−ＧＡＧＧＡＧ−３’」の３’末端の塩基Ｇから３’下流側１０番目の塩基と１１番目との間のホスホジエステル結合、及び認識配列５’−ＧＡＧＧＡＧ−３’の相補鎖３’−ＣＴＣＣＴＣ−５’の５’末端の塩基Ｃから５’上流側８番目の塩基と９番目との間のホスホジエステル結合を切断し、下記構造を有する切断末端を有するリンカーＸのＤＮＡ断片を生じる。
【００４８】
５’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＧＡＧＧＡＧＮＧＴＧＣＡＧＴＡＣ−３’（配列番号２１）
３’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＣＴＣＣＴＣＮＣＡＣＧＴＣＡ −５’（配列番号２２）
また同様に、第３ＩＩＳ型制限酵素としてＥｃｉＩを用いた場合には、リンカーＹ上の配列「５’−ＧＧＣＧＧＡ−３’」及びその相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡを認識し、「５’−ＧＧＣＧＧＡ’（１１／９）」を切断する。すなわち、Ｅｃｉｌは、認識配列「５’−ＧＧＣＧＧＡ−３’」の３’末端の塩基Ｇから３’下流側１１番目の塩基と１２番目との間のホスホジエステル結合、及び認識配列「５’−ＧＧＣＧＧＡ−３’」の相補鎖３’−ＴＣＣＧＣＣ−５’の５’末端の塩基Ｃから５’上流側９番目の塩基と１０番目との間のホスホジエステル結合を切断し、下記構造を有する切断末端を有するリンカーＹのＤＮＡ断片を生じる。
【００４９】
５’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＧＧＣＧＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴ −３’（配列番号２３）
３’−・・・ＮＮＮＮＮＮＮＣＣＧＣＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮ −５’（配列番号２４）
この結果、リンカーＸ及びＹを含むＤＮＡ断片から、ＥＧＩｃＤＮＡタグが切り離されることになる。
【００５０】
すなわち、（２）の工程において、ＩＩ型制限酵素としてＣｓｐ６Ｉを使用し、（３）の工程において、配列番号１３、及び１４で表される塩基配列からなるヌクレオチド鎖を含むリンカーＸを使用し、（４）の工程において、第２ＩＩＳ型制限酵素としてＢｓｇＩを使用し、（９）の工程において、配列番号１７、及び１８で表される塩基配列からなるヌクレオチド鎖を含むリンカーＹを使用し、（９）の工程において、第１ＩＩＳ型制限酵素としてＢｓｅＲＩを、第３ＩＩＳ型制限酵素としてＥｃｉＩを使用することによって、被検ｃＤＮＡ由来のＣｓｐ６ｌ切断部位（５’−ＡＣ−３’）に隣接するｃＤＮＡ由来の連続する１３塩基のヌクレオチド鎖を含む、下記のＥＧＩｃＤＮＡタグが得られる。
【００５１】
５’− ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣ−３’（配列番号２４）
３’−ＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ −５’（配列番号２６）
細胞由来のｍＲＮＡから得たｃＤＮＡライブラリーを使用し、本発明の方法を実施した場合、（９）の工程で、ＥＧＩｃＤＮＡタグのライブラリーが得られる。
【００５２】
本発明では、得られた該ＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーを利用して、ＥＧＩｃＤＮＡタグ配列に対応するｃＤＮＡを定性的、また定量的に測定し、対応する発現遺伝子のパターンを調べることができる。
例えば、検出すべきｃＤＮＡに応じたＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーを前もって作成し、それをスポットした検出装置に準備しておき、これに異なる標識などでラベルした被検者の試料と標準試料とを接触させ、相対的な信号強度を比較して、ターゲットの選択などを行なうことができる。この標識として蛍光標識、アイソトープなど公知のものを広く使用することができる。
また、例えば、該ＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーを、検出すべきｃＤＮＡなどを固定した検出装置に接触させることにより、該ＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーに含まれるｃＤＮＡを検出して、対応する発現遺伝子のパターンを調べることができる。
本発明で用いることができる検出装置には、ＤＮＡチップなどのマイクロアレイと、ドットハイブリダイゼーシュンなどのマクロアレイがある。該検出装置に用いる支持体には、ナイロンメンブレン、ニトロセルロースフィルター、ガラス板、シリコンチップなどがある。また、該検出装置とは、例えば、得られたＥＧＩｃＤＮＡタグを支持体上に固定し、検出すべきＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそのフラグメントなどをハイブリダイズさせて、検出できる装置をいう。
【００５３】
なお、ｍＲＮＡあるいはｃＤＮＡを検出できるように標識することが好ましい。例えば、標識としてラジオアイソトープ、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、または酵素などを使用することができる。
例えば、標識した検出すべきｃＤＮＡを一本鎖分子に分離し、必要に応じて段階的に希釈し、そして、例えば、シリコンチップの各グリッド中に、検出すべき遺伝子に対応したＥＧＩｃＤＮＡタグを保持した固相支持体と接触させる。得られた遺伝子発現パターンを標準となる遺伝子発現パターンと比較することにより、容易に試料細胞などの状態を知ることができる。また、未知の遺伝子のＥＧＩｃＤＮＡタグを固定しておいてパターンを記録しておくと、将来この遺伝子が判明したときに、再解析できる。
【００５４】
本発明では、第２ＩＩＳ型制限酵素の選択により、ＥＧＩｃＤＮＡタグの長さを調整でき、また遺伝子を解析する生物の種類などにより所望の長さは変わってくるが、一般にＥＧＩｃＤＮＡタグの長さは６〜２５塩基対、さらに１０〜２５塩基対、特に１０〜１６塩基対とするのが好ましい。
（１０）の工程では、必要に応じて、得られた発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを分離する。当該分離は、当業者が通常使用する方法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を利用して行うことができる。
さらに、ＥＧＩｃＤＮＡタグを互いに連結し、該連結物の塩基配列を決定することにより発現遺伝子を解析することができる。例えば、（９）の工程で得たＥＧＩｃＤＮＡタグは３’及び５’の接着末端が相補的であるため、Ｔ４リガーゼなどを用いて連結することができる。そして、得られたＥＧＩｃＤＮＡタグの連結物（コンカテマー）を当業者に公知な方法、例えば、ベクターに組み込んでクローニングしたり、シークエンサーを用いて配列を読む方法で解析したりすることができる。
【００５５】
本発明においては、該コンカテマーは、一般に３〜２００のＥＧＩｃＤＮＡタグ、さらに３〜８０のＥＧＩｃＤＮＡタグ、特に１６〜４０のＥＧＩｃＤＮＡタグを含むのが好ましい。なお、得られたコンカテマーには、ＥＧＩｃＤＮＡタグの形成方法により、ＥＧＩｃＤＮＡタグ相互の間にスペーサー配列がないものと、スペーサー配列があるものがある。本発明のＥＧＩｃＤＮＡタグ連結物は、例えば、プラスミドやファージのようなベクターに挿入して増幅する標準的な方法でクローニングすることができる。
本明細書の「組換えベクター」という用語は、ＥＧＩｃＤＮＡタグ連結物を挿入し、又は組み込みにより作成されたプラスミド、ウイルスまたは他の運搬体を指す。このようなベクターは、複製起点、プロモーター、及び形質転換細胞の表現型選択を可能とする特定の遺伝子を含むものである。本発明では、公知でシーケンスに適した多くのクローニングベクターを用いることができる。その例を挙げると、ｐＵＣ１８、その改変ベクターｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９、その改変ベクターｐＵＣ１１９， Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦＩ， Ｍ１３ｍｐ１９ＲＦＩ， ｐＢＲ３２２， ｐＣＲ３．１， ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ及びその改良ベクター、及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｒ）ＩＩなどがある。
【００５６】
次に、該組換えベクターを適当な宿主細胞に移入する。本明細書の「宿主細胞」とは、その細胞内でベクターが増殖できかつそのＤＮＡが発現され得る細胞、及び宿主細胞自体の子孫をも意味する。なお、複製の間に突然変異が起こることがあるので、すべての子孫が親細胞と同一であるとは限らない。
また、本発明では外来ＤＮＡが宿主内で連続して維持されるような、公知の安定した移入法を用いることができる。例えば、大腸菌のような原核細胞などの宿主を用いる場合は、指数増殖期後に収穫し、続いて公知の手法によるＲｂＣｌ法、ＣａＣｌ２法で処理した細胞から、ＤＮＡ取込み能のあるコンピテント細胞を調製する。また、エレクトロポレーションや常法により形質転換を行うこともできる。 なお、本発明では、ベクターにＥＧＩｃＤＮＡタグ連結物を組み込み塩基配列の決定を行うことで、一回の操作で２０個以上、２０個〜１００個、好ましくは約２０〜３０個程度のＥＧＩｃＤＮＡタグの配列を簡単に調べることができる。
【００５７】
これまで、本発明の好ましい実施態様について記載してきたが、当業者ならばこれらの記載に基づき、本発明の技術思想を逸脱することなしに種々の改変ができることは明かである。また次に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の保護範囲は制限することを意図するのもではない。したがって、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【００５８】
【実施例】
〔実施例１〕 末梢血リンパ球細胞の遺伝子発現解析
まず、健常人由来の末梢血から、ＮｙｃｏＰｒｅｐ１．０７７Ａ（Ｎｙｃｏ Ｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ社製）を用いて、末梢血単球（ＰＢＭＣ）を集めた。得られた末梢血単球を、１０μｇ／ｍｌリポ多糖（ＬＰＳ）の存在下又は非存在下、３７℃で３時間培養後、それぞれの培養細胞から、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡ抽出物を、ＤＮａｓｅＩ（宝酒造社製）で３７℃３０分間処理後、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。次いで、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ＭＡＧ ｍＲＮＡ精製キット（宝酒造社製）を用いて、全ＲＮＡからｍＲＮＡを吸着により単離後、ｃＤＮＡ合成キット（宝酒造社製）を用いて、ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製した。
【００５９】
得られた二本鎖ｃＤＮＡを制限酵素Ｃｓｐ６Ｉ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製）で３７℃２時間処理することで切断した後、磁石によってマグネットビーズ部分を壁面に集め、回収することによって、前記ｍＲＮＡにおけるポリＡテールと該ポリＡテールから５’上流側に向かって最初に出現する前記Ｃｓｐ６Ｉ認識切断部位との間の塩基配列を含むｃＤＮＡ断片が存在する画分を得た。次いで、該ｃＤＮＡ断片画分に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用い、次の３つの方法によって、第１ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩの認識配列を含むリンカーＸを連結した。なお、いずれにおいてもリンカーＸの連結は好適に行うことができた。
【００６０】
（１） Ｃｓｐ６Ｉ切断末端にリンカーＸを直接連結する方法
Ｃｓｐ６Ｉで切断することにより生じた接着末端に、以下の構造を有するリンカーＸを直接連結した。
５’−ＡＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧＣＡＧ−３’（配列番号２７）
３’−ＴＧＧＣＴＣＣＴＣＡＣＡＣＧＴＣＡＴ−５’（配列番号２８）
次いで、リンカーＸに含まれる制限酵素ＢｓｇＩの認識配列５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’を利用して、ＢｓｇＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）での３７℃２時間の切断を行い、今度は前回とは逆にマグネットビーズがない部分、すなわち遠心上清を回収した。この酵素の切断部位は５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’（１６／１４）の位置であるから、回収された部分にはリンカーに引き続くｃＤＮＡ由来の１３塩基が含まれることになる（Ｃｓｐ６Ｉ部位由来の共通のＴＡＣ３残基を除く）。
【００６１】
これに以下の構造を有する第二のリンカーＹを、１６℃２時間のＴ４ＤＮＡリガーゼ処理により接続した。
５’− ＡＣＣＡＣＴＧＣＧＡＣＴＣＣＧＣＣＴＧＧ−３’（配列番号２９）
３’−ＮＮＴＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＧＧＡＣＣ−５’（配列番号３０）
上記リンカーＹの接続により、両端を既知のリンカーで挟まれたｃＤＮＡ由来の１３塩基対を含む総延長５２塩基対のＤＮＡの一群「リンカーＸ−ＡＣ−ｃＤＮＡ由来の１３塩基対（ＥＧＩｃＤＮＡタグ）−ＡＣ−リンカーＹ」の小断片ｃＤＮＡ連結物ライブラリーを得た。この小断片は、以下のような塩基配列及びその相補鎖からなるものである。
【００６２】
５’−ＡＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧＣＡＧＴＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣＣＡＣＴＧＣＧＡＣＴＣＣＧＣＣＴＧＧ−３’
（配列番号３１）
次に、この小断片ｃＤＮＡ連結物ライブラリーを、リンカーＸ部分にハイブリダイズするプライマーＸ「５’−ＡＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧＣＡＧＴＡ−３’」（配列番号３２）及びリンカーＹ部分にハイブリダイズするプライマーＹ「５’−ＣＣＡＧＧＣＧＧＡＧＴＣＧＣＡＧＴＧＧＴ−３’」（配列番号３３）を用いて、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、９６℃で３０秒間の変性、５０℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長を１サイクルとする合計２０サイクルの増幅反応、及び７２℃で２分間の最終伸長反応により行った。
【００６３】
得られたＰＣＲ産物をＩＩＳ型制限酵素ＢｓｅＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）およびＥｃｉＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理した。これらの酵素の切断部位は「５’−ＧＡＧＧＡＧ−３’（１０／８）」および「５’−ＧＧＣＧＧＡ−３’（１１／９）」の位置であるから、以下の構造のＤＮＡ断片を生じさせた。
５’− ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣ−３’（配列番号３４）
３’−ＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ −５’（配列番号３５）
次いで、処理物を１２％ポリアクリルアミド電気泳動に供し、リンカー断片と分離して上記小断片ＤＮＡを回収した。
【００６４】
得られたｃＤＮＡタグを再びＴ４リガーゼで連結後、４．５％ポリアクリルアミド電気泳動に供することによって、５００〜１０００ｂｐの結合断片を回収した。回収された結合断片は、以下の構造を有するものであり、（Ｎ）１３に隣接する５’−ＡＣ−３’もｃＤＮＡ上のＣｓｐ６Ｉ認識配列由来の塩基であるから、人為的に付加したスペーサー配列を含まない、完全にｃＤＮＡ由来のｃＤＮＡタグ連結物ライブラリーが得られたことになる。以下の塩基配列中、（Ｎ）１３はｃＤＮＡ由来の１３塩基５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’を表している。
【００６５】
５’−・・・ＡＣ（Ｎ）１３ＡＣ（Ｎ）１３ＡＣ（Ｎ）１３ＡＣ（Ｎ）１３ＡＣ（Ｎ）１３ＡＣ（Ｎ）１３ＡＣ・・・−３’（配列番号３６）
３’−・・・ＴＧ（Ｎ）１３ＴＧ（Ｎ）１３ＴＧ（Ｎ）１３ＴＧ（Ｎ）１３ＴＧ（Ｎ）１３ＴＧ（Ｎ）１３ＴＧ・・・−５’（配列番号３７）
上記結合断片をプラスミドｐＵＣ１１８に組み込み、ＡＢＩ３７７型ＤＮＡシーケンサーにより塩基配列を決定した結果、ＰＢＭＣ細胞及びこれをＬＰＳにより刺激した細胞に特異的に発現している遺伝子断片を解析することができた。一回の塩基配列決定操作で約２０個程度のＥＧＩｃＤＮＡタグの配列を明らかにできたので、約５００サンプルの塩基配列決定を行うことにより、細胞で発現されているｍＲＮＡの種類とそれぞれの個数をおおむね明らかにできると考えられる１万個の配列を明らかできた。
【００６６】
表１及び２にこの方法で同定された遺伝子をいくつか示した。これらのＥＧＩｃＤＮＡタグの塩基配列を既知のデータベースに対し、ホモロジー検索を行った。表１にはＬＰＳ刺激により発現が高まる遺伝子を、表２には逆にＬＰＳ刺激で発現が抑制される遺伝子を示した。
【００６７】
【表１】
【表２】
なお、表１及び表２中、ｍｆ ＩＤとして塩基配列の前に示してある数字はコンピューター処理のために１３塩基を１０進法の数字により表示したものである。すなわち、ｍｆＩＤは、塩基配列の各塩基を、ａを０、ｃを１、ｇを２、ｔを３とそれぞれ読み替えてできた４進数を１０進数に変換し、１を加えた数である。このＩＤにより、塩基配列を、その長短にかかわらず数字で扱うことができる。例えば、塩基数１４の塩基配列を扱う場合、次のように数値で特定することができる。
【００７０】
５’−ａａａａａａａａａａａａａ−３’ ０００００００１（又は単に１）
５’−ａａａａａａａａａａａａｃ−３’ ０００００００２（又は単に２）
５’−ａａａａａａａａａａａａｇ−３’ ０００００００３（又は単に３）
５’−ａａａａａａａａａａａａｔ−３’ ０００００００４（又は単に４）
５’−ａａａａａａａａａａａｃａ−３’ ０００００００５（又は単に５）
・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・
５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｇｔ−３’ ６７１０８８６０
５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔａ−３’ ６７１０８８６１
５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｃ−３’ ６７１０８８６２
５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｇ−３’ ６７１０８８６３
５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’ ６７１０８８６４
このように該ＩＤにより如何なる１３塩基よりなる配列が現れても、全てこれらの９桁の数字の１つに割り当てることができる。これらの数字を小断片ＩＤ（ｍｉｎｉ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＩＤ：ｍｆ ＩＤ）と呼ぶ。
【００７１】
〔実施例２〕
実施例１で得られたＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーを、次に述べる検出装置により検出し、遺伝子の発現を解析した。
表１記載のＬＰＳ刺激により活性化される遺伝子のうち、ｍｆＩＤ６５４６２２８２， ５５１４９４４４， １７３５０５５８， ５８０５８７６５， ２７５００３７０， 及び４９０７８６５１のｍｆ塩基配列の対応配列を含むオリゴＤＮＡを合成し、常法によりスライドグラスにスポットしてＤＮＡチップを作成した。
実施例１で得たＬＰＳ刺激末梢血単球（ＰＢＭＣ）由来のｍＲＮＡを鋳型として蛍光性化合物Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（＊１）（アマシャム・ファルマシア社製）で蛍光標識し、かつＬＰＳ無刺激ＰＢＭＣ由来のｍＲＮＡを鋳型として蛍光性化合物Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（＊２）（アマシャム・ファルマシア社製）で蛍光標識しプローブ溶液を得た。
このプローブ溶液を混合し、６×ＳＥＴ ［０．９Ｍ ＮａＣｌ、１０μｇ／ｍｌ Ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡ、０．１％ＳＤＳ、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）］中で前記ＤＮＡチップと４５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
洗浄液［６×ＳＳＣ、０．１ ％ＳＤＳ］により５２℃で洗浄後、スキャナーを用いて各蛍光物質をスキャニングして蛍光強度データを得て、そのデータの解析を行った。各スポットのＣｙ３とＣｙ５とのシグナル強度のスキャッタープロット（Ｓｃａｔｔｅｒ Ｐｌｏｔ）の結果、ＬＰＳ刺激を受けたＰＢＭＣ由来のｍＲＮＡに由来するプローブが発する蛍光は、すべてのスポットにおいて、ＬＰＳ無刺激のものよりもシグナル強度が２倍以上強くなった。
【００７２】
＊１ ＣＡＳ ＲＮ Ｃｙ３ ＣＡＳ ＲＮ １４６３６８−１６−３
ＣＮ ３Ｈ−Ｉｎｄｏｌｉｕｍ， ２−［３−［１−［６−［（２，５−ｄｉｏｘｏ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ）ｏｘｙ］−６−ｏｘｏｈｅｘｙｌ］−１，３− ｄｉｈｙｄｒｏ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｓｕｌｆｏ−２Ｈ−ｉｎｄｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ］−１−ｐｒｏｐｅｎｙｌ］−１−ｅｔｈｙｌ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｓｕｌｆｏ−， ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ （９ＣＩ） （ＣＡ ＩＮＤＥＸ ＮＡＭＥ）
＊２ ＣＡＳ ＲＮ Ｃｙ５ ＣＡＳ ＲＮ １４６３６８−１４−１
ＣＮ ３Ｈ−Ｉｎｄｏｌｉｕｍ， ２−［５−［１−［６−［（２，５−ｄｉｏｘｏ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ）ｏｘｙ］ −６− ｏｘｏｈｅｘｙｌ］−１，３− ｄｉｈｙｄｒｏ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｓｕｌｆｏ−２Ｈ−ｉｎｄｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ］−１，３−ｐｅｎｔａｄｉｅｎｙｌ］−１−ｅｔｈｙｌ−３，３− ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｓｕｌｆｏ−， ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ （９ＣＩ）
（ＣＡ ＩＮＤＥＸ ＮＡＭＥ）
〔実施例３〕
実施例１で得られた個々のＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーの任意のタグを用いて、一組の被検試料における該遺伝子の発現の違いを解析することができる。
【００７３】
ＬＰＳ刺激刺激末梢血単球（ＰＢＭＣ）由来ｍＲＮＡ、ＬＰＳ無刺激ＰＢＭＣ由来ｍＲＮＡをそれぞれ鋳型として逆転写酵素で調製したｃＤＮＡをナイロンメンブレンにそれぞれスポットした後、８０℃で２時間処理する。
表１記載のＬＰＳ刺激により発現が誘導される遺伝子のうちｍｆＩＤ６５４６２２８２の塩基配列を含むオリゴＤＮＡを合成し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで該ＤＮＡを［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（アマシャム・ファルマシア社製）を用いて３２Ｐ（放射性同位体）でラベルしプローブ溶液を得る。
このプローブ溶液を６×ＳＥＴ中で前記ナイロンメンブレンと４５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行う。洗浄液［６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ］により５２℃で洗浄後、オートラジオグラフィーを行う。Ｘ線フィルム上のシグナルは、ＬＰＳ刺激ＰＢＭＣのｍＲＮＡ由来ｃＤＮＡのものの方がＬＰＳ無刺激ＰＢＭＣのものよりも２倍以上強くなる。
【００７４】
〔実施例４〕
ＩＩ型制限酵素Ｃｓｐ６Ｉの代わりにＡｆａＩを用い、第３ＩＩＳ型制限酵素ＥｃｉＩの代わりにＢｓｅＲＩを用いた他は、実施例１と同様の方法でＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーを作成した。まず、下記（１）〜（３）のいずれかの方法でリンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成する。
（１） 試料中のｃＤＮＡを、ＩＩ型制限酵素ＡｆａＩで切断することにより生じた平滑末端に、下記構造を有するリンカーＸを直接連結する。
５’− ＡＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧＣＡＧＴ−３’ （配列番号５８）
３’− ＴＧＧＣＴＣＣＴＣＡＣＡＣＧＴＣＡ−５’ （配列番号５９）
（２） 試料中のｃＤＮＡを、ＩＩ型制限酵素ＡｆａＩで切断することにより生じた平滑末端に、ｄＡＴＰの存在下で次のように、塩基Ａを１個導入する。
【００７５】
５’− ＡＣ・・・・−３
３’−ＡＴＧ・・・・−５’
次いで、上記接着末端に、次の構造を有するリンカーＸを連結する。
５’− ＡＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧＣＡＧＴ−３’ （配列番号６０）
３’− ＴＧＧＣＴＣＣＴＣＡＣＡＣＧＴＣ−５’ （配列番号６１）
（３） 試料中のｃＤＮＡを、ＩＩ型制限酵素ＡｆａＩで切断することにより生じた平滑末端から、ｄＧＴＰの存在下で、次のように、塩基Ｔを１個除去する。
【００７６】
５’−ＡＣ・・・−３’
３’− Ｇ・・・−５’
次いで、上記接着末端に、下記構造を有するリンカーＸを連結する。
５’− ＡＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧＣＡＧＴ −３’ （配列番号６２）
３’− ＴＧＧＣＴＣＣＴＣＡＣＡＣＧＴＣＡＴ−５’ （配列番号６３）
次いで、リンカーＸに含まれる制限酵素ＢｓｇＩの認識配列５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’を利用して、ＢｓｇＩで切断を行い、遠心上清を回収した。この酵素の切断部位は５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’（１６／１４）の位置であるから、回収された部分にはリンカーＸに続くｃＤＮＡ由来の１３塩基のタグが含まれることになる。
【００７７】
続いて下記構造を有するリンカーＹを接続した。続いて、実施例１と同じ方法で増幅し、第１ＩＩＳ型制限酵素及び第３ＩＩＳ型制限酵素で消化することにより所望のＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーを得た。
５’− ＡＣＣＡＣＴＧＣＧＡＣＴＣＣＴＣＴＧＧ−３’ （配列番号６４）
３’− ＮＮＴＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＣ−５’ （配列番号６５）
〔実施例５〕
実施例４で得られたＥＧＩｃＤＮＡタグライブラリーを、次に述べる検出装置により検出し、遺伝子の発現を解析することができる。
【００７８】
表１記載のＬＰＳ刺激により活性化され、かつｍｆＩＤ６５４６２２８２， ５５１４９４４４， １７３５０５５８， ５８０５８７６５， ２７５００３７０， 及び４９０７８６５１に対応する遺伝子に対応し、かつ実施例３で得られるＥＧＩｃＤＮＡタグの対応配列を含むオリゴＤＮＡを合成し、常法によりスライドグラスにスポットしてＤＮＡチップを作成する。
実施例３で得たＬＰＳ刺激末梢血単球（ＰＢＭＣ）由来のｍＲＮＡを鋳型として蛍光性化合物Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（＊１）（アマシャム・ファルマシア社製）で蛍光標識し、かつＬＰＳ無刺激ＰＢＭＣ由来のｍＲＮＡを鋳型として蛍光性化合物Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（＊２）（アマシャム・ファルマシア社製）で蛍光標識しプローブ溶液を得る。
このプローブ溶液を混合し、６×ＳＥＴ ［０．９Ｍ ＮａＣｌ、１０μｇ／ｍｌ Ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡ、０．１％ＳＤＳ、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）］中で前記ＤＮＡチップと４５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行う。
洗浄液［６×ＳＳＣ、０．１ ％ＳＤＳ］により５２℃で洗浄後、スキャナーを用いて各蛍光物質をスキャニングして蛍光強度データを得て、そのデータの解析を行う。各スポットのＣｙ３とＣｙ５とのシグナル強度のスキャッタープロット（Ｓｃａｔｔｅｒ Ｐｌｏｔ）の結果、ＬＰＳ刺激を受けたＰＢＭＣ由来のｍＲＮＡに由来するプローブが発する蛍光は、すべてのスポットにおいて、ＬＰＳ無刺激のものよりもシグナル強度が２倍以上強くなる。
【００７９】
【発明の効果】
本発明により、被検ｃＤＮＡ又は被検細胞に特異的に発現している遺伝子を再現性よく正確に検出し、解析することができる。本発明の方法により、任意の二つの細胞における機能、形態上の違いを遺伝子の発現状態の差として明らかにできるので、生理的条件下、あるいは病的状態におけるあらゆる生物現象の解析に広く応用できる。さらに、本発明者らが既に開発した発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法、及び遺伝子発現解析方法よりも、使用できる制限酵素の選択の幅が拡く、使用するリンカーの製造が容易であるなど改良点を有する前記ｃＤＮＡタグの作成方法、及び遺伝子発現解析方法が得られる。
【００８０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
各図は、本発明における発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグ作成方法の実施態様の工程を示す工程図である。
【図１】第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを用いる、本発明のＥＧＩ ｃＤＮＡタグの作成方法の工程（１）〜（６）を示す図である。
【図２】第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを用いる、本発明のＥＧＩ ｃＤＮＡタグの作成方法の工程（７）〜（１０）を示す図である。
【図３】第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸを用いる、本発明のＥＧＩ ｃＤＮＡ タグの作成方法の工程（１）〜（６）を示す図である。
【図４】第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸを用いる、本発明のＥＧＩ ｃＤＮＡ タグの作成方法の工程（７）〜（１０）を示す図である。
【図５】第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸ、並びに第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを用いる、本発明のＥＧＩ ｃＤＮＡ タグの作成方法の工程（１）〜（６）を示す図である。
【図６】第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸ、並びに第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを用いる、本発明のＥＧＩ ｃＤＮＡ タグの作成方法の工程（７）〜（１０）を示す図である。
【符号の説明】
Ｎ … Ａ、 Ｔ、 Ｃ又はＧから選ばれる任意の塩基を示す。
Claims (53)
- 発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法であって：
相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を準備し、
該ｃＤＮＡをＩＩ型制限酵素で切断してｃＤＮＡ断片を作成し；
該ｃＤＮＡ断片に、第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含み、かつ前記ＩＩ型制限酵の切断末端との連結部分に第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を生じるリンカーＸを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成し；
該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素で切断して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を作成し；
該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグの第２ＩＩＳ型制限酵素による切断末端に、第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を作成し；
該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を増幅し；かつ
得られた増幅産物を第１ＩＩＳ型制限酵素及び第３ＩＩＳ型制限酵素で同時にあるいは順次に切断して、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを得る前記作成方法。 - 発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法であって：
相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を準備し、
該ｃＤＮＡをＩＩ型制限酵素で切断してｃＤＮＡ断片を作成し；
該ｃＤＮＡ断片に、第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成し；
該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素で切断して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を作成し；
該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグの第２ＩＩＳ型制限酵素による切断末端に、第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を作成し；
該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を増幅し；かつ
得られた増幅産物を第１ＩＩＳ型制限酵素で切断して、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを得る前記作成方法。 - 発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグの作成方法であって：
相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を準備し、
該ｃＤＮＡをＩＩ型制限酵素で切断してｃＤＮＡ断片を作成し；
該ｃＤＮＡ断片に、第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を作成し；
該リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を第２ＩＩＳ型制限酵素で切断して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ連結物を作成し；
該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグの第２ＩＩＳ型制限酵素による切断末端に、第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを連結して、リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を作成し；
該リンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物を増幅し；かつ
得られた増幅産物を第１ＩＩＳ型制限酵素及び第３ＩＩＳ型制限酵素で同時にあるいは順次に切断して、発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを得る前記作成方法。 - さらに、ＩＩ型制限酵素で切断したｃＤＮＡ断片の末端を、前記リンカーＸが結合可能な状態に処理する工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載記載の方法。
- さらに前記リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物を純化する工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
- さらに、前記リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物のｃＤＮＡ断片の末端を、前記リンカーＹが結合可能な状態に処理する工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載記載の方法。
- さらに、前記リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物のｃＤＮＡ断片の末端を、前記リンカーＹが結合可能な状態に処理する工程を含む、請求項５記載の方法。
- 得られた発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグを分離する工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載記載の方法。
- 被検細胞由来のｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する、請求項１〜３のいずれか１項記載記載の方法。
- オリゴｄＴプライマーとして、固相固定化オリゴｄＴプライマーを用いて、被検細胞由来のｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する、請求項１〜３のいずれか１項記載記載の方法。
- 固相固定化オリゴｄＴプライマーが、ラテックスビーズ又はマグネットビーズ固定化オリゴｄＴプライマーである、請求項１０記載の方法。
- 前記ＩＩ型制限酵素が、４塩基対の認識部位を有する、請求項１〜３のいずれか１項記載記載の方法。
- 前記ＩＩ型制限酵素が、ＡｆａＩ， ＡｌｕＩ， ＣｆｕＩ， ＣｖｉＲＩ， ＤｐｎＩ， ＥｓａＢＣ３Ｉ， ＨｐｙＢＩ， ＨｐｙＣＨ４Ｖ， ＨｐｙＦ４４ＩＩＩ， ＭｌｔＩ， ＰｌａＡＩＩ， ＲｓａＩ， ＢｆａＩ， Ｃｓｐ６Ｉ， ＣｖｉＡＩＩ， ＣｖｉＱＩ， ＣｖｉＲＩＩ， ＦｇｏＩ， ＨｐｙＣＨ４ＩＶ， ＭａｅＩ， ＭａｅＩＩ， ＭｔｈＺＩ， ＲｍａＩ， ＰｐａＡＩＩ， Ｔｓｐ３２Ｉ， Ｔｓｐ３２ＩＩ， ＴａｑＩ， ＴｔｈＨＢ８Ｉ， ＸｓｐＩ， ＢｓｐＫＴ６Ｉ， ＢｓｔＫＴＩ， ＨｐｙＣＨ４Ｉ， ＡｓｐＭＤＩ， Ｂｃｅ２４３Ｉ， Ｂｆｉ５７Ｉ， ＢｆｕＣＩ， Ｂｍｅ１２Ｉ， ＢｓｃＦＩ， Ｂｓｐ６７Ｉ， Ｂｓｐ１０５Ｉ， Ｂｓｐ１４３Ｉ， Ｂｓｐ２０９５Ｉ， ＢｓｐＡＩ， ＢｓｐＦＩ， ＢｓｐＪＩ， Ｂｓｔ１９ＩＩ， ＢｓｔＥＮＩＩ， ＢｔｋＩＩ， ＣａｃＩ， ＣｃｙＩ， ＣｈａＩ， ＣｐｆＩ， ＣｖｉＡＩ， ＤｐｎＩＩ， ＦａｔＩ， ＦｎｕＣＩ， ＦｎｕＥＩ， ＨａｃＩ， Ｋｚｏ９Ｉ， ＬｌａＡＩ， ＭｂｏＩ， ＭｇｏＩ， ＭｋｒＡＩ， ＮｄｅＩＩ， ＮＩａＩＩ， ＮｍｅＣＩ， ＮｐｈＩ， ＲａｌＦ４０Ｉ， Ｓａｕ３ＡＩ， ＳａｕＭＩ， Ｓｔｈ３６８Ｉ， ＣｈａＩ， Ｈｎ１ＩＩ， Ｈｓｐ９２ＩＩ， ＮＩａＩＩＩ， ＴａｉＩ， ＴｓｃＩ及びＴｓｐ４９Ｉからなる群から選ばれたものである、請求項１〜３のいずれか１項記載記載の方法。
- 前記第１ＩＩＳ型制限酵素が、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ， ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ， ＢｓｅＲＩ， ＢｓｐＳＴ５Ｉ， ＬｗｅＩ， ＰｈａＩ， ＳｆａＮＩ， ＡａｒＩ，Ａｃｃ３６Ｉ， ＢｆｕＡＩ， ＢｓｐＭＩ， ＢｖｅＩ， Ｓｔｈ１３２Ｉ， ＳｓｐＤ５Ｉ， ＡｓｕＨＰＩ， ＨｐｈＩ， ＭｂｏＩＩ， ＮｃｕＩ，ＭｎｌＩ， ＢｂｓＩ， ＢｂｖＩＩ， ＢｂｓＩ， Ｂｂｖ１６ＩＩ， ＢｐｉＩ， ＢｐｕＡＩ， Ｂｓｃ９１Ｉ， ＢｓｐＢＳ３１Ｉ， ＢｓｐＩＳ４Ｉ， ＢｓｐＴＳ５１４Ｉ， ＢｓｔＢＳ３２Ｉ， ＢｓｔＴＳ５Ｉ， ＢｓｔＶ２Ｉ， Ｂｍｅ５８５Ｉ， ＢｓｃＡＩ， Ｂｓｔ１９Ｉ， ＢｓｔＦＺ４３８Ｉ， ＦａｕＩ， ＳｍｕＩ ＢｃｉＶＩ， ＢｆｕＩ， 及びＨｐｙＡＶからなる群から選ばれたものである、請求項１〜３のいずれか１項記載記載の方法。
- 前記第１ＩＩＳ型制限酵素が、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ， ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ， 及びＢｓｅＲＩからなる群から選ばれたものである、請求項１〜３のいずれか１項記載記載の方法。
- 前記第１ＩＩＳ型制限酵素が、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ及びＧｓｕＩからなる群から選ばれたものである、請求項１〜３のいずれか１項記載記載の方法。
- 前記第２ＩＩＳ型制限酵素がＭｍｅＩ， ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ， ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ， ＢｓｅＲＩ， ＢｓｐＳＴ５Ｉ， ＬｗｅＩ， ＰｈａＩ， ＳｆａＮＩ， ＡａｒＩ， Ａｃｃ３６Ｉ， ＢｆｕＡＩ， ＢｓｐＭＩ， ＢｖｅＩ， Ｓｔｈ１３２Ｉ， ＳｓｐＤ５Ｉ， ＡｓｕＨＰＩ， ＨｐｈＩ， ＭｂｏＩＩ， ＮｃｕＩ， ＭｎｌＩ， ＢｂｓＩ， ＢｂｖＩＩ， ＢｂｓＩ， Ｂｂｖ１６ＩＩ， ＢｐｉＩ， ＢｐｕＡＩ， Ｂｓｃ９１Ｉ， ＢｓｐＢＳ３１Ｉ， ＢｓｐＩＳ４Ｉ， ＢｓｐＴＳ５１４Ｉ， ＢｓｔＢＳ３２Ｉ， ＢｓｔＴＳ５Ｉ， ＢｓｔＶ２Ｉ， Ｂｍｅ５８５Ｉ， ＢｓｃＡＩ， Ｂｓｔ１９Ｉ， ＢｓｔＦＺ４３８Ｉ， ＦａｕＩ， ＳｍｕＩ ＢｃｉＶＩ， ＢｆｕＩ， 及びＨｐｙＡＶからなる群から選ばれたものである、請求項１〜３のいずれか１項記載記載の方法。
- 前記第２ＩＩＳ型制限酵素が、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ， ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ及びＢｓｅＲＩからなる群から選ばれたものである、請求項１〜３のいずれか１項記載記載の方法。
- 前記第２ＩＩＳ型制限酵素が、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， 及びＧｓｕＩからなる群から選ばれたものである、請求項１〜３のいずれか１項記載記載の方法。
- 前記第３ＩＩＳ型制限酵素がＭｍｅＩ， ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ， ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ， ＢｓｅＲＩ， ＢｓｐＳＴ５Ｉ， ＬｗｅＩ， ＰｈａＩ， ＳｆａＮＩ， ＡａｒＩ， Ａｃｃ３６Ｉ， ＢｆｕＡＩ， ＢｓｐＭＩ， ＢｖｅＩ， Ｓｔｈ１３２Ｉ， ＳｓｐＤ５Ｉ， ＡｓｕＨＰＩ， ＨｐｈＩ， ＭｂｏＩＩ， ＮｃｕＩ， ＭｎｌＩ， ＢｂｓＩ， ＢｂｖＩＩ， ＢｂｓＩ， Ｂｂｖ１６ＩＩ， ＢｐｉＩ， ＢｐｕＡＩ， Ｂｓｃ９１Ｉ， ＢｓｐＢＳ３１Ｉ， ＢｓｐＩＳ４Ｉ， ＢｓｐＴＳ５１４Ｉ， ＢｓｔＢＳ３２Ｉ， ＢｓｔＴＳ５Ｉ， ＢｓｔＶ２Ｉ， Ｂｍｅ５８５Ｉ， ＢｓｃＡＩ， Ｂｓｔ１９Ｉ， ＢｓｔＦＺ４３８Ｉ， ＦａｕＩ， ＳｍｕＩ ＢｃｉＶＩ， ＢｆｕＩ， 及びＨｐｙＡＶからなる群から選ばれたものである、請求項１、又は３のいずれか１項記載記載の方法。
- 前記第３ＩＩＳ型制限酵素が、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， ＧｓｕＩ， ＢｓｍＦＩ， ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ， ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ， ＳｔｓＩ， ＢｃｅＡＩ， ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ， ＦｏｋＩ， ＢｃｅｆＩ， ＡｌｗＸＩ， ＢｂｖＩ， ＢｓｅＫＩ， ＢｓｅＸＩ， Ｂｓｐ４２３Ｉ， Ｂｓｔ１２Ｉ， Ｂｓｔ７１Ｉ， ＢｓｔＶ１Ｉ， ＲｌｅＡＩ， ＡｃｅＩＩＩ， Ｂｂｒ７Ｉ， ＥｃｉＩ， ＴｓｐＤＴＩ， ＴｓｐＧＷＩ， Ｔｔｈ１１１ＩＩ， ＨｇａＩ， ＢｓｅＭＩＩ及びＢｓｅＲＩからなる群から選ばれたものである、請求項１、又は３のいずれか１項記載の方法。
- 前記第３ＩＩＳ型制限酵素が、ＭｍｅＩ， ＡｃｕＩ， Ｂｃｅ８３Ｉ， ＢｐｍＩ， ＢｐｕＥＩ， ＢｓｇＩ， ＢｓｐＫＴ５Ｉ， Ｅｃｏ５７Ｉ， Ｅｃｏ５７ＭＩ， 及びＧｓｕＩからなる群から選ばれたものである、請求項１記載の方法。
- 発現遺伝子同定用タグの長さが６〜２５塩基対である、請求項１〜３のいずれか１項記載記載の方法。
- 発現遺伝子同定用タグの長さが１０〜２５塩基対である、請求項１〜３のいずれか１項記載記載の方法。
- 発現遺伝子同定用タグの長さが１０〜１６塩基対である、請求項１〜３のいずれか１項記載記載の方法。
- 第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸ。
- 配列番号７及び８の塩基配列を有する、請求項２６記載のリンカーＸ。
- ＩＩ型制限酵素で切断されたｃＤＮＡ断片と、第１ＩＩＳ型制限酵素及び第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸとを含む、リンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物。
- 請求項２８記載のリンカーＸ−ｃＤＮＡ断片連結物の切断末端に、第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを連結したリンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物。
- 配列番号１９の塩基配列及びその相補鎖を含む、請求項２９記載のリンカーＸ−ｃＤＮＡタグ−リンカーＹ連結物。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載記載の方法で得られた発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグライブラリー。
- 請求項３１の同定用ｃＤＮＡタグライブラリーを、検出すべき核酸を固定した検出装置に接触させることを特徴とする遺伝子発現解析方法。
- 該検出装置が、同定すべき一群の核酸を各スポットに有するＤＮＡチップである、請求項３２記載の遺伝子発現解析方法。
- 同定すべき一群の核酸を含むライブラリーを、請求項１〜３のいずれか１項で得られた同定用ｃＤＮＡタグを固定した検出装置に、接触させることを特徴とする遺伝子発現解析方法。
- 該検出装置が、請求項１〜３のいずれか１項で得られた同定用ｃＤＮＡタグを各スポットに有するＤＮＡチップである、請求項３４記載の遺伝子発現解析方法。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載の方法で得られた発現遺伝子同定用タグを互いに連結する工程、及び該連結物の塩基配列を決定する工程を含む発現遺伝子解析方法。
- 該連結物が３〜２００の発現遺伝子同定用タグを含む、請求項３６記載の方法。
- 該連結物が３〜８０の発現遺伝子同定用タグを含む、請求項３６記載の方法。
- 該連結物が１６〜４０の発現遺伝子同定用タグを含む、請求項３６記載の方法。
- 該連結物の配列を決定し、その配列からそれぞれのｃＤＮＡタグの配列を決定する、請求項３７記載の定性的発現遺伝子解析方法。
- 該連結物の配列を決定し、その配列からそれぞれのｃＤＮＡタグの配列及び出現頻度を求める、請求項３７記載の定量的発現遺伝子解析方法。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載の方法で得られたｃＤＮＡタグの連結物であって、該ｃＤＮＡタグの間にスペーサー配列がない連結物。
- ３〜２００のｃＤＮＡタグを含む、請求項４２記載の連結物。
- ３〜８０の該ｃＤＮＡタグを含む、請求項４２記載の連結物。
- １６〜４０の該 ｃＤＮＡタグを含む、請求項４２記載の連結物。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載の方法で得られたｃＤＮＡタグの連結物であって、該ｃＤＮＡタグの間にスペーサー配列がある連結物。
- ３〜２００のｃＤＮＡタグを含む、請求項４６記載の連結物。
- ３〜８０の該ｃＤＮＡタグを含む、請求項４６記載の連結物。
- １６〜４０の該ｃＤＮＡタグを含む、請求項４６記載の連結物。
- 発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグ作成キットであって、ＩＩ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素、第２ＩＩＳ型制限酵素、第３ＩＩＳ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含み、かつ前記ＩＩ型制限酵の切断末端との連結部分に第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を生じるリンカーＸ、及び第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを含む、該キット。
- 発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグ作成キットであって、ＩＩ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素、第２ＩＩＳ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素および第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸ、第１ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹ、を含む該キット。
- 発現遺伝子同定用ｃＤＮＡタグ作成キットであって、ＩＩ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素、第２ＩＩＳ型制限酵素、第３ＩＩＳ型制限酵素、第１ＩＩＳ型制限酵素および第２ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＸ、及び第３ＩＩＳ型制限酵素の認識配列を含むリンカーＹを含む、該キット。
- さらにリンカーＸにハイブリダイズするプライマーＸ、及びリンカーＹにハイブリダイズするプライマーＹを含む、請求項５０〜５２のいずれか１項記載の該キット。
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