TW200404891A - Method for preparation of expressed gene identification cDNA tags and method for analysis of gene expression - Google Patents

Description

200404891 玖，發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明是關於鑑別表現基因用之cDNA幟的製備方 、幟基因庫及解析基因表現的方法。詳言之， 本發明 σ

疋關於表現基因生成物的mRNA，對應於該mRNA 的 c D N A a ’又對應於其cDNA斷片之特定區域之鑑別表現 基因用 ΤΛ 土 cDNa幟的製備方法，及利用該cdna幟之基因表 現解析生 '。該基因表現解析法包括使用原狀的c D N A幟之 直 j矣为' 〇4» '與使用該cDNA幟之連結物的間接方法。 【先如技術】 生物基於其個別基因組而擁有固有的基因表現模 式，又即使4仏 王物的品種是同一品種，由於細胞分化、增殖、 老化等生 壤狀態及致癌化、感染症、免疫病等各種疾病狀 態，因此柏^ 啊較於正常狀態，基因表現模式也將有所不同。 因此確立这 。裡基因表現模式，能將細胞之間的基因表現模 式互相比齡、 勺話’基因表現模式可能廣泛應用於鑑別適當 ^ 承、鐘別治療用候補基因、檢查組織適合性、法醫 學的基因s，丨 .a , &別、有關於決定與疾病相關基因之位置、鑑別 4斷用及預備診斷用指示基因等方面。 直到現在’評價基因表現的方法有RNA印跡法，rNa 酶保護法及反轉錄酶一聚合酶鏈反應（RT— PCR )分析法 (Alwine et al.: proc> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5 5 5 0, 1 977; Zinn et ai·: cell，34:865，1 98 3; Veres et al.，： 200404891

Science，237:415，1987)，更有檢索基因有用的表現序列 幟（expressed sequence tag: EST) ^ ( Adams et al.: Sciecne 2 5 2: 1 656，1991; Adams et al.: Nature, 3 5 5:632, 1 992; Okubo et al·: Nature Genetics，2: 1973，1992)等方法雖已 被開發，然一次的分析只能評價有限的基因。例如：〇 k ιι b ο et al:用能結合四鹼基的限制酶Sau3AI切斷兩條cDNA， 僅能得到從mRNA之3’末端構成的cDNA基因庫，以此 進行選殖，隨機決定鹼基序列可得基因表現之輪郭而開發 的方法[(Nature Genet. 2，1 73 ( 1 9 92 )]，但是此法所得的 各選殖基因平均長度是3 00個鹼基，序列的決定需一個一 個的選殖進行，因此最後被決定序列之mRNA的總數僅 為每個細胞1 0 0 0個程度，此程度與真正的細胞基因表現 模式尚遠。再說這些方法所必要之原料（例如人體的組織） 需非常大量，由於無再現性的理由，現在僅用於研究室而 近年來由於鑑別對應於表現基因區域之轉移生成物之 限定區域，開發了能夠分析多數表現基因之逐次分析法 (Serial analysis of gene expression, SAGE)(國際公開 公報W 097/1 03/63，美國專利申請第5,695,93 7號及第 5，8 6 6，3 3 0號）。此方法以對應於試料中之各短核苷酸序列 予以二量體化，製備而得叫做「雙幟」（ditag )，再將雙 幟以鎖狀連接成單一的連環，由於決定選殖化的幟之序列 而將發現基因的模式究明之方法。本SAGE法無法獲得對 200404891 應於試料中之各cDNA之單一鑑別基因用cDNA幟，又其 一次能鑑別的表現基因個數由於連結物所具有的雙幟伸縮 餘地有限，個數在1000以下，通常是在400以下。 本申請專利發明人為了克服鑑於到現在為止的分析基 因表現模式之方法的缺點及低解析界限等困難點，開發了 鑑別用表現基因cDNA幟的製備方法，及利用該cDNA幟 之基因表現解析法（國際專利申請第PC T/JPOI1/023 3 8 號）。 【發明内容】 本發明是關於本發明人先申請之國際專利申請 PCT/JPOII/0233 8號的鑑另ij用發現基因cDNA幟的製備方 法，及利用該基因表現解析法中能夠使用的限制酶選擇餘 地予以改良擴充成為容易製造連接子，提供該cDNA幟的 製備方法，及利用該cDNA幟之基因表現解析法。 各生物基於獨自的基因組之故，擁有固有的基因表現 模式及細胞的生理學狀態、發生學階段，本發明是提供各 種疾病狀態下特有之基因表現模式，有效地解析其可能的 鑑別用表現基因cDNA幟的製備方法，及利用該基因幟的 表現基因解析法。本發明方法與先前技術比較，使用細胞 材料試料量少，效率佳而且信賴度高。 即本發明所提供的是表現基因cDNA幟的製備方法， 其法是準備互補去氧核糖核酸（cDNA )，用第Π型限制酶 2〇〇4〇4891 切斷 制緣 〜々運接上第 種第n s型限制酶所能結合列，而 ^ j迷罘Π型pg： 之切斷末端，能絲也士贫 此夠生成罘二種第Π S型限鈿故处 IR制酶能纟士入 之連接子一 Y4 b I π α 序列之連接子一 χ，該連接 ，-能結含 序. 連接子—x-CDNA斷片連結物用 第二種弟Π S型限制酶切斷，製備而得連接子〜X —

幡連結物；在該連接子一 Y ^ 〜CDNA 蛾 接丨X— CDNA幟的第二種第 制酷所切斷末端連接上含有第三種第…制酶能… 列之連接子—Y ’製備得連接子—x_cDNA 。。序 一 γ連結物； 連接子 將連接子-X〜C Π \T Λ J,Ah ctlNA幟—連接子—γ連結 增幅生成物而且將該增幅 W幅得 乂喟惴生成物用第一種第n s刑 及第三種第ns型限制酶同時或按順二限制酶 表現基因趣織之前述製備方法。 ⑷鑑別用 又本發月所才疋供的是發現基因cDNA幡的製 其法是準備互補去氧 万法， 核糖核鉍（CDN A )，用篥η 切斷該cDNA得cDNa 乂限制酶 A斷片，將該cDNA斷片連 第一種第ns型限击要上含有 列之連接子-X 結合序 良備得連接子一X—cDNA斷择、去 物； 所片連結 將該連接子一 γ 〜eDMA斷片連結物用第二 限制酶之切斷末端連 罘II S型 上含有罘一種第π s型限生丨 合序列之連接子〜_ v . lgL制酶所結 ’製備得連接子一X〜cDKl Δ ^ 接子一 Υ連結物； eD^A幟〜連 6 200404891 將該連接子一X — cDNA幟一連接子一Y連結物增幅得 增幅物，用第一種第Π S型限制酶切斷該增幅物製備得鑑 別用表現基因cDNA幟之前述製備方法。

更說，本發明是鑑別用表現基因cDNA幟的製備方法， 其法是準備互補去氧核糖核酸（cDNA )，用Π型限制酶切 斷該cDNA得cDNA斷片。將cDNA斷片連接上含有第一 種第Π S型限制酶及第二種第Π S型限制酶能結合序列之 連接子一X，製備得連接子一X — cDNA斷片連結物； 將連接子一X — cDNA斷片連結物用第二種第II S型限 制酶切斷得連接子一X — cDNA幟；

將該連接子一X — cDNA幟之第二種第Π S型限制酶素 之切斷末端連接上含有第三種第Π S型限制酶所結合序列 的連接子一 Y，製備得連接子一X — cDNA幟一連接子一 Y連接物。 將該連接子一 X — cDNA幟一連接子- Y連 接物增幅得增幅物，用第一種第Π S型限制酶及第三種第 Π S型限制酶同時或按順序切斷增幅物，而製備得鑑別用 表現基因cDNA幟之前述製備方法。 又本發明所提供的是含有第一種第Π S型限制酶及第 二種第Π S型限制酶所結合序列連接子一 X。 更說，本發明是以提供鑑別用表現基因c DN A幟的製 備方法製備而得的cDNA基因庫，讓其與已固定好本發明 製備的鑑別用基因cDNA幟之測試裝置接觸為特徵之表現 基因解析法 7 200404891 更說，本發明是提供將宜鑑別的含有一群核酸基因 讓其與用本發明所製備的鑑別用cDNA幟固定在測試裝 接觸為特徵之表現基因解析法。做為這些測試裝置可用 DNA薄片。 更說，本發明是提供前述鑑別用表現基因cDN A幟 製備方法所製得的該cDNA幟互相連接過程及含有決定 結物的鹼基序列過程的表現基因解析法。該解析法含有 定該連結物之序列，決定其序列之各別的c D N A幟之定 解析法，及從其序列解析得各別cDNA幟之序列及其出 頻度的定量表現基因解析法。 再說，本發明所提供的是内含鑑別基因用cDNA幟 套組，其内容含有第Π型限制酶、第一種第Π S型限制酶 第三種第Π S型限制酶、第一種第Π S型限制酶之結合 列，而且前述的第Π型限制酶之切斷末端與其連接之連 部分生成第二種第Π S型限制酶所能結合序列的連接子 X，及含有含第三種第Π S型限制酶結合序列的連接子 Y。 更說，本發明所提供的是内含鑑別基因用cDNA幟 套組，其内容含有第Π型限制酶、第一種第Π S型限制酶 第二種第Π S型限制酶、第一種第Π S型限制酶及第二 第Π S型限制酶之結合序列的連接子一 X，及第一種第 S型限制酶之結合序列之連接子一 Y。 再說，本發明所提供的是内含鑑別基因用cDNA幟 庫 置 的 的 連 決 性 現 之 序 結 之 種 Π 之 200404891 套組，其内容含有！ 第二種第Π S型限 限制酶及第二種第 X，及含有第三種 Y。 鑑別表現基因 cDNATag)，有必· 來表示。 在此就本發明 第一原理：從 被分離的短核苷酸 的情報量。例如： 也就是262,144種 轉移生成物。另一；^ 〜200,〇〇〇個轉移j 7 : 345，1994 年）。 能製備得到的話， 低等真核生物 碼的轉移生成物之 要鐘別識別酵母的 驗基對已是充分的 對應各基因轉移生 因此對解析表現基 ^ Π型限制酶、第一種第n s型限制酶、 制酶、第三種第π S型限制酶、第一 Π π S型限制酶之結合序列的連接子一 第Π S型限制酶之結合序列的連接子— 用幡（Expressed Gene Identification 会時可用EGIcDNA幟或EGI幟之代號 的基本原理加以說明。 基因轉移生成物内的一定位置要鑑別已 序列之幟的轉移生成物時，需含有十分 有9個驗基對序列的幟具有4的9次方 類的序列可能性，可鑑別相應於同數的 r面，人體基因組的密碼編碼約有8 〇 , 〇 〇 〇 匕成物（Fields et al·: Nature Genetics, 因此理論上，9個鹼基對的序列之幟 可鑑別全部的人體基因生成物。 及原核生物的場合，依其基因組所編密 數較少，因此幟的大小可更短些。例如， 轉移生成物所需的幟只要短如6〜7個 ，本發明方法提供各種長度的核苷酸以 成物的單-鑑別表現基因用cDN A幟， 因模式是有益的。 200404891 第二原理：將被挾於連接子上游及下游的單一鑑別表 現基因用cDNA幟，只用一次增幅處理就可以進行表現基 因的解析，因此不易發生由於增幅及選殖起因的傾斜。 第三原理：利用按本發明方法製備而得的EGI cDN A 幟基因庫，定性或定量測試相應於EG I cDNA幟序列以檢 驗對應表現基因模式。

第四原理：從本發明方法所製備之鑑別表現基因用 cDNA幟製備物無間隔序列或有間隔序列的連結物（連 環），必要時，可用載體等選殖，可連續而且有效率的解 析。尤其是該cDNA幟係個別獨立的序列，容易解析連結 物的序列，容易進行從連結物分離單獨的c D N A幟。

又本發明與前面所記載的SAGE法在鑑別所包含短核 苷酸序列的幟之轉移生成物的所需十分資訊量，在應用稱 為第一原理而言是共通的。但是SAGE法是利用稱為「雙 幟」（ditag )的被二量體化之幟，而本發明所製備的單一 之鑑別發現基因用cDNA幟、其基因庫，並不製備由單一 之鑑別表現基因用cDNA幟所構成的連續體，兩者是不同 的0 【實施方式】 將本發明的理想實施方式之鑑別表現基因用c DN A幟 (以下稱EGI cDNA幟）的製備方法照第1圖〜第6圖所 示流程加以說明。 10 200404891 又本發明中的鑑別表現基因用cDNA幟之製備方法， 主要有三種樣式。即有在連接子一X — cDN A幟的第二種 第Π S型限制酶所切斷末端，連接上含有第三種第Π S型 限制酶所結合的連接子一 Υ過程之方法（本發明實施方式 1 )，有在既定的cDNA斷片連接上含有第一種第Π S型限 制酶及第二種第Π S型限制酶所結合的序列的連接子一 X 的方法（本發明實施方式2)，及含有前述連接子1及 連接子一Y兩過程的組合方法（本發明實施方式3 )。 本發明實施方式1之EGI cDNA幟的製備方法按照第 1圖及第2圖所示流程加以說明如下。 (1 )準備互補去氧核糖核酸cDNA， (2 )用第Π型限制酶R sal切斷該cDNA，製備得cDNA 斷片； (3 )在該cDNA斷片連接上含有第一種第Π S型限制酶 BseR I之結合序列，而且在前述第Π型限制酶R sal之切 斷末端與之連結部份連結以能讓第二種第Π S型限制酶 B s m F I之結合序列的連接子一X，製備得連接子一X — cDNA斷片連結物； (4)用第二種第IIS型限制酶BsmF I切斷該連接子一 X 一 cDNA斷片連結物，製備而得連接子一X — cDNA幟連 結物； (5 )必要時，將該連接子一X — cDN A幟連結物予以精 200404891 (6 )必要時，將該連接子一X — cDNA幟連結物的cDNA 幟之末端用含有第三種第Π S型限制酶E c i 1之結合序列 的連接子一 Y處理成可能結合的狀態後， (7)在該連接子一X — cDNA幟的第二種第Π S型限制 酶BsmF I所切斷末端，連接上含有第三種第Π S型限制 酶Ecil所結合序列之連接子一Y，製備得連接子一X cDNA幟一連接子一 Y連結物；

(8 )將該連接子一X — cDNA幟一連接子一Y連結物增 幅；而且 (9 )將整備而得的增幅生成物同時用第一種第Π S型限 制酶BseR I及第三種第Π S型限制酶Ecil或按照順序切 斷而製備得鑑別發現基因cDNA幟； (10 )必要時，將含有所製備之鑑別表現基因cDNA幟予 以分離的ECI cDNA鑑別表現基因cDNA幟的製備方法。

為了容易說明，在本發明實施方式1當然有具體的記 載各種限制酶，但是可以廣泛的使用各種限制酶。在實施 方式1所用的連接子一X是含有第一種第Π S型限制酶所 能結合的序列，而且在與第Π型限制酶之切斷末端側之連 結部份能生成第三種第Π S型限制酶所結合的序列之連接 子，連接子一Y，這是含有第三種第Π S型限制酶所結合 之序列連接子。 此外，在實施方式1所使用的連接子一X，連接子一 Y，引子一X及引子一Y的各序列的例子列出如下： 12 200404891 連接子一 x : 5’一 ".NNNNNNNGAGGAGNNNNNGGG."-3’ (序列號碼1) 3’ —…NNNNNNNCTCCTCNNNNNNCCC··· - 5’ (序列號碼2) 連接子一 Y : 5，-…CNNNNNNNNNTCCGCCNNNNNNN··· -3’ (序列號碼3) 3，-··· TGNNNNNNNNNAGGCGGNNNNNNN··· — 5’ (序列號碼4) 引子一 X : 5，一.NNNNNNNGAGGAGNNNNNGGGAC."-3’ (序列號碼5) 引子一Y : 3，-··· TGNNNNNNNNNAGGCGGNNNNNNN …-5’ (序列號碼6) 本發明實施方式Π之EGIcDNA幟製備方法按照第 圖及第4圖所示流程做以下說明。 (1 )準備互補去氧核糖核酸cDNA， 200404891 (2 )用第Π型限制酶C sp 61切斷該c D N A，製備得c DN A 斷片； (3 )在該cDNA斷片連接上含有第一種第Π S型限制酶 BseR I所能結合的序列及第二種第Π S型限制酶Bsgl所 能結合序列的連接子一X，製備得連接子一X — cDN A斷 片連結物；

(4)用第二種第1IS型限制酶Bsgl切斷該連接子一 X —cDNA斷片連結物，製備得連接子一 X — cDN A幟連結 物； (5 )必要時，將該連接子一X — cDNA幟連結物予以精 製； (6 )必要時，將該連接子一X — cDNA幟連結物的cDNA 幟之末端用含有第三種第Π S型限制酶Ec i 1所結合序列 之連接子一Y處理成可能結合的狀態後；

(7)在該連接子一X — cDNA幟的第二種第II S型限制 酶Bsgl所切斷末端連接上含有第一種第Π S型限制酶 BseRI所結合序列之連接子一Y，製備得連接子一X — cDNA幟一連接子一 Y連結物； (8 )將該連接子一X — cDNA幟一連接子一Y連結物增 幅；而且 (9 )將製備得的增幅生成物同時用第一種第n S型限制 酶BseR I按照順序切斷而製備得鑑別表現基因cDNA幟； (1 0 )必要時，將含有製備得之鑑別表現基因c DN A幟分 14 200404891 離的ECI cDNA鑑別表現基因cDNA幟的製備方法。 為容易說明起見，在實施方式2也具體的記載各種限 制酶，當然可廣泛的使用各種限制酶。實施方式2中用的 連接子一X是含有第一種第ns型限制酶及第二種第ns 型限制酶Bsgl所能結合序列的連接子，連接子一Y是與 連接子一X同樣含有第一種第Π S型限制酶所結合的序列 之連接子。

此外，在實施方式2所用的連接子一 X、連接子一Y、 引子一X及引子一Y的各別序列表示如下面。 連接子一 X : 5’-·.· NNNNNNNGAGGAGNGTGCAG··· - 3’ (序列號碼7 ) 3’-··· NNNNNNNCTCCTCNCACGTCAT." - 5’ (序列號碼8 )

連接子一 Y : 5’_". ACNNNNNNNNCTCCTCNNNNNNN …-3’ (序列號碼9 ) 3，-··· NNTGNNNNNNNNGAGGAGNNNNNNN··· -5’ (序列號碼1 〇 ) 引子一X : 5’-...NNNNNNNGAGGAGNGTGCAGTAC."-3, 15 200404891 (序列號碼11 ) 引子一Y : 3，-··· TGNNNNNNNNGAGGAGNNNNNNN··· -5, (序列號碼1 2 )

本發明實施方式3之EGI cDNA幟製備方法按照第5 圖及第6圖所示流程做以下說明。 (1 )準備互補去氧核糖核酸cDNA， (2 )用第Π型限制酶Csp6I切斷該cDNA，製備得cDNA 斷片； (3 )在該cDNA斷片連接上含有第一種第Π S型限制酶 BseR I所能結合序列及第二種第Π S型限制酶Bsgl所結 合序列的連接子一X，製備得連接子一 X — cDNA斷片連 結物；

(4 )用第二種第Π S型限制酶B s g 1切斷該連接子 X cDNA斷片連結物，製備得連接子一X — cDNA幟連結物； (5)必要時，將該連接子一X — cDNA幟連結物予以精 製； (6 )必要時，將該連接子一 X — cDNA幟連結物的cDNA 幟之末端用含有第三種第Π S型限制酶Ecil所結合的序 列之連接子一Y處理成能夠結合的狀態後， (7)在該連接子一X — cDNA幟的第二種第Π S型限制 16 200404891 酶Bsgl所切斷末端連接上含有第三種第Π S型限制酶 Ecil所能結合序列之連接子一Y，製備得連接子一X — cDNA幟一連接子一Y連結物； (8 )將該連接子一X — cDNA幟一連接子一Y連結物增 幅；而且

(9)增幅生成物用第一種第Π S型限制酶BseRI及第三 種第Π S型限制酶Ecil切斷而製備得鑑別表現基因cDNA 幟， (1 0 )必要時，將含有製備而得之鑑別表現基因cDNA幟 分離的ECI cDNA幟的製備方法。 為了容易說明起見，實施方式3也具體的記載各種限 制酶，當然可廣泛的使用各種限制酶。在實施方式3所用 連接子一X是含有第一種第HS型限制酶及第二種第ns 型限制酶所結合的序列的連接子，而連接子一Y是含有第 三種第Π S型限制酶所結合序列的連接子。

更將本發明依據實施方式3詳細說明。在此所記載的 限制酶，處理次序如無事先預告都可使用於本發明全部。 (1)之過程是準備做為試料的cDNA。平常先將被測試 細胞製備mRNA，利用轉移酶製備cDNA而該cDNA是對 應於全長mRN A及其斷片者。該被測試細胞在3 ’末端是 具有多腺苷尾部的mRNA產生細胞的話，不限定於此’ 動物細胞、植物細胞、微生物細胞等的所有細胞都包括在 裏面，也可以使用病毒感染的動物細胞，植物細胞，微生 17 200404891 物細胞做為被測試細胞。 如果有 lpg的mRNA本發明就能解析

1 μ g 的 m R N A 平常能從1 mg的細胞得到，因此本發 义明討空針插入採的 活組織檢查標本等貴重的人體細胞樟太 τ尽寺的處理尤其是有 效的。 從被測試細胞的分離mRNA操作 進行。例如：被測試細胞用胍試藥， 得總RNA後，以按使用寡dT-纖維素 P 〇 1 y U —纖維素等的親和性柱層層析 係可依平常的技術 紛試藥等處理，分離 及瓊脂糖為擔体之 法及梯次法等而分離

得 m R N A 〇 其次是將所得的mRNA為模予，用寡dT_引子及反專 錄酶合成第-股cDNA( -條股CDNA)後，以該第一股 cDNA為模子，合成第二股cDNA (雙條的雙股CD·)。 這個做為S dT引子的有固定於固定相的寡dT引子，用 輔酶標籤的寡dT引子等雖可舉例，但是從再現性及目的 物DNA斷片的收率而言’固定在固定相的寒dT引子是 理想的引子。固定在固定相的該寡d”丨子中雖有固定在 凝膠珠的及固定在磁性珠的等等’其中以固定在磁性珠( 寡dT引子為理想引子。 (2)之過程是用第Π型限制酶切斷試料中的該cDNA ^ 製備得cDNA斷片。

子成 試料中的該cDNA可以結合於固定在固定相寡dT引 為雙股cDNA。本說明書中的稱為「第π型限制酶」 18 200404891

名詞是指結合預定序列並在所結合序列的内側或其鄰接之 特異位置切斷cDNA的限制酶。本發明中所使用的第Π型 限制酶應考慮是在解析mRNA中具有至少結合一個序列 之限制酶，例如：擁有由4、5或6個鹼基所構成的結合 序列之第Π型限制酶是較理想的限制酶。尤其是在考慮 mRNA之平均股長為2〇〇〇鹼基這一點時，具有4的4次方 =2 5 6個鹼基中的一個限制部位能出現四個鹼基之結合序 列的第Π型限制酶是較理想的限制酶。

本發明所使用的第Π型限制酶舉例有：Afal，Alul， Cful，Dpnl，EsaBC3I5 HpyBI，HpyCH4V，HpyF44m，Mltl, PlaAn，Rsal，Bfal，Csp6I，CviAn，CviQI, CviRII，Fgol, HpyCh4IV，Mael，Maell，MthZI，Rmal，PpaAn，TaqI， Tsp32I，Tsp32n，TthHB8I，XspI，BspKT6I，HpyCH4I， AspMDI，Bce243I，Bfi57I，BfuCI，Bmel2I，BscFI，Bsp67I, Bspl05I，Bspl43I，Bsp2095I，BspAI，BspFI，BspJI，Bstl9 Π，BstENII，Btkn，CacI，Ccyl, Chal，Cpfl，CviAI, Dpn Π，Fatl，FnuCI，FnuEI，HacI，Kzo9I，LlaAI，MboI，Mgol， MkrAI，Nden，NIan，NmeCI，NphI，RalF40I，Sau3Al， SauMI，Sth3 68I，Chal，ΗηΙΠ，Hsp92n , Nlam，Tail，TscI， Tsp49I, Accn，BanAI，BceBI，BecAII，BepI，Biml9n， Bme361I, Bpu95I，BseQI，BshI，Bshl 236I，BshFI，Bsp50I, Bspl23I，Bsp211I, BspBRI，BspKI，BspRI，BstFNI，BstUI, Bsul 532I，BsuRI，Btgl，Btkl，Cltl，Csp68KVI，CspKVl，Dsa 19 200404891 Π，s a B C 41，F a 1 Π，F a u Β Π，F n u DI，F n u D Π，H a e ΚΙ，M c h A E，MfoAI，MvnI，NgoPII，NspLKI，Pall，Pdel33I，PflKI， Plal, Sbvl，Sfal，Sual，Thai，AciI，Bco27I，BsiSI，Bst40I， BsuFI，Chol，HapII，Hin2I，Hin6I，HinPlI，Hpall，H s o 1， HspAI，Mnol，MspI，Pdel37I，SciNI，Sthl34I，AspLEI， BspLAI，BstHHI，Cfol，FnuDIE，Hhal，Sell，Msel, Trull， Tru9I，Sse9I，TasI，Tsp5 09I 及 TspEI。 這些第Π型限制酶中含有結合4個鹼基序列ATC G全 部者，只含CG者及只含AT者。 結合序列含有結合ATC G序列的上述第Π型限制酶的 例子有：Afal，Alul，Cful，CviRI，Dpnl，EsaBC3I，HpyBI， HpyCH4V，HpyF44n，Mltl，PlaAn，Rsal, Bfal，Csp6I， CviAH，CviQI，CviRn , F g ο I，H p y C H 41V，M ae I，M ae Π， MthZI, Rmal, PpaA Π , Tsp32I, Tsp32n , TaqK TthHB8I. XspI，BspKT6I，BstKTI，HpyCH4I，AspMDI，Bce243I， Bfi57I，BfuCI，Bmel2I，BscFI，Bsp67I，Bspl05I，Bspl43I, Bsp2095I，BspAI，BspFI，BspJI，Bstl 9 Π，BstEN Π，CacI· Ccyl，Chal，Cpfl，CviAI，Dpnn，Fatl，FnuCI，FnuEI，HacI， Kzo9I，LlaAI，Mbol，Mgol，MkrAI，Nde Π，NIa Π，NmeCI, NphI，RalF40I，Sau3AI，SauMI，Sth3 68I，Chal, Hnl Π， Hsp92II，NIam，Tail，TscI，及 Tsp491。 又只結合含有序列C G的該第Π型限制酶的例子有： Acc Π，Ban AI，BceBI，Bee Α Π ，B epI, B im 1 9 Π，Bme 3 6 1 I，

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Bpu95I，BseQI, BshI，Bshl 23 6I，BshFI, Bsp50I，Bspl23I， B s p 2 1 11，B s p B RI，B s p KI，B s p RI，B s t F NI，B s t U I，B s u 1 5 3 2 I · BsuRI，Btgl，Btkl，Cltl，Csp68KVI，CspKVI，Dsan，

E s a B C 41，F a 1 Π , F a u B Π，F n u DI, F n u D Π , H a e ΙΠ，M c h A Π · MfoAI, Mvnl5 NgoP Π , NspLKI, Pall, Pdel33I, PflKI, PlaK Sbvl，Sfal，Sual，Thai，Acil，Bco27I，BsiSI，Bst40I，BsuFl， Cbol，Hapn , Hin2I，Hin6I, HinPlI, Hpan，Hsol, HspAI, Mnol，MspI，Pdel37I，SciNI，Sthl34I，AspLEI，BspLAI， BstHHI，Cfol, FnuDDI，Hhal 及 Sell。又只結合含有序歹ij AT的該第Π型限制酶的例子有：Msel，Trull，Tru9I，Sse9I， TasI，Tsp5 0 9I及TspEI。鑑於這些限制酶所結合的序列性 質，以選擇第Π型限制酶為理想。 在（3 )之過程，於該cDN A斷片連接含有第一種第nS 型限制酶及第二種第Π S型限制酶所結合序列的連接子 x，製備得連接子一 X— cDN A斷片連結物。

首先從（2 )之過程得cDNA斷片群中分離寡dT—引 子序列的cDNA斷片。可利用標籤標記的寡dT—引子進 行分離操作。例如：用固定在固定相凝膠珠的寡dT—引 子以製備前述的c D N A之場合，以第u型限制酶處理後用 離心機分離，固定於固定相凝膠珠的含有寡dT—引子序 列的cDNA斷片沈澱而分離。在此步驟得的cDNA斷片是 含有mRN A之多腺苷尾部與從該多腺苷尾部向5，上游側 首先出現的前述第Π型限制酶之切斷末端的序列。接著用 21 200404891 DNA連接酶（例如T4DNA i* M t 』 Α運接酶）在該cDNA斷片連接 上連接子一 X。 設定在連接子一 X的第一餘> 種昂Π S型限制酶所結合之 序列位置是用第一種第n S型酶來切斷該cDNA幟時不留 下間隔序列之位置，或留下所希望的間隔序列之適當位置 為理想。 gi 例如第一種第E S型限制酶所結合序列含有BseRi所 能結合序列’第二種第Π S型限制酶之結合序列含有b所 的結合序列，而且使用Csp6I當做第π型限制酶. cDNA斷片，要連接上此cDNA斷片的連接子含有 W件白ή 造的雙股DNA斷片 5 9 - NNNNNNNGAGGAGNGTGCAG- 35 (序列號碼1 3 ) 3’ 一 NNNNNNNCTCCTCNCACGTCAT - 5, (序列號碼1 4 )

該連接子一X中的序列「5，-GAGGAG-3’」是第 種第 型限制酶BseRI所結合的序列。又該連接子一X中的3， 末端序列「5，-GAGGAG-3,」是第二種第Π S型限制_这

Π S 所能結合的序列。 鹼基 本說明書中的鹼基序列所使用N或N表示任意的 的意思。 22 200404891 本說明書中使用稱為「第一種第π s型限制酶」名詞， 原則上，含有結合連接子一X上面的驗基序列，能夠形成 所預期的EG IcDNA幟的第Π S型限制酶及發揮同樣功能 的第I型及第DI型限制酶也包含在裏面。 該第一種第Π S型限制酶的例子有：M m e I，A c u I. Bce83I, Bpml，BpuEI，Bsgl，BspKT5I，Eco57I, Eco57MI，

G s u I，B s m FI，B s p L U 1 1 IE，B s t Ο Z 6 1 6 I，S t s I，B c e A I， BstPZ418I, FokI，BcefI，AlwXI，Bbvl, Bsp423I，BseKI, BseKI，BseXI，Bsp423I5 Bstl2I，Bst71I，BstVlI，RleAI， AceDI，Bbr7I，Ecil，TspDTI，TspGWI，Tthllin，Hgal， BseMn，BseRI，BspST5I，Lwel，Phal，SfaNI，Aarl，Acc36I， BfuAI，BspMI，Bvel，Sthl32I，SspD5I，AsuHPI, Hphl，Mbo Π，Ncul，Mnll，Bbsl，BbvII , Bbsl, Bbvl6n，Bpil，BpuAI, BspBS31I，BspIS4I，BspTS514I，BstBS32I, BstTS5I, BstV2I，Bme5 8 5 I，BscAI，BscAI，Bstl9I, BstFZ43 81, FauL Smul，Bci VI，Bful 及 HpyA V o 這些限制酶當中從結合序列起到最長末端止的間距是 10個驗基以上的第一種第Π S型限制酶有：MmeI，AcuK Bce83I，Bpml，BpuEI，Bsgl，BspKT5I，Eco57I，Eco57MI， G s u I，B s m FI，B s p L U 1 1 ΠΙ，B s t Ο Z 6 1 6 I，S t s I，B c e A I， BstPZ418I，FokI，BcefI，AlwXI，Bbvl，Bsp423I，BseKI， BseXI，Bsp423I，Bstl2I，Bst71I，BstVlI，RleAI， AceHI , B b r 71，E c i I，T s p D TI，T s p G WI，T t h 1 1 1 Π，H g a 1, B s e M il 及 23 200404891

BseRI。又該間距是1 6個驗基以上的第一種第Π S型限制 酶有：Mme I，A c ul，B c e 8 3 I，B p m I，B p u EI，B s g I，B sp Κ T 5 I， Eco57I，Eco57MI 及 Gsul o

本詳細說明書中所使用稱為「第二種第Π S型限制 酶」術語是指結合在連接子一 X上面或在連接子一 X — cDNA斷片連結物之連接部所形成的結合序列，在CDN A 斷片之適當位置予與切斷的Π S型限制酶，並且含有發揮 同樣功能的I型及第m型限制酶而言。從該第Π S型限制 酶的切斷可製備得連接子一 X與cDNA幟連結物。 該第二種第Π S型限制酶的例子有·· Mm el, Ac ul， Bce83I，Bpml，BpuEI，Bsgl，BspKT5I, Eco57I, Eco57MI，

G s u I，B s m FI，B s p L U 1 1 ΙΠ，B s t Ο Z 6 1 615 S t s I，B c e A I， BstPZ418I, FokI，BcefI，AlwXI，Bbvl，BseKI，BseXI, Bsp423I，Bstl2I，Bst71I，BstVlI，RleAI，Acem，Bbr7I，Ecil， TspDTI，TspGWI，Tthill Π，Hgal，BseMJl , BseRI, BspS 151， Lwel，Phal，SfaNI，Aarl，Acc36I，BfuAI, BspMI，Bvel， Sthl32I，SspD5I，AsuHPI，HphI，Mb〇n，Ncul，Mnll，Bbsl, Bbvn，Bbsl，Bbvl6n，Bpil, BpuAI, Bsc91I, BspBS31I, BspIS4I, BspTS514I，BstBS32I，BstTS5I，BstV2I，BstV2I, B m e 5 8 5 I，B s e AI，B s 11 91，B s t F Z 4 3 8 I，F a u I，S m u IB c i VI，

Bful 及 HpyAV。 這些限制酶當中從結合序列起到最長末端止的間距是 10個驗基以上的第二種第Π S型限制酶有：MmeI，AcuI, 24 200404891

Bce83I，Bpml，BpuEI，Bsgl，BspKT5I, Eco57I，Eco57MI， Gsul，BsmFI，BspLUlin, BstOZ616I，StsI，BceAI, BstPZ418I，FokI，BcefI，AlwXI, Bbvl，BseKI, BseXI， Bsp423I5 Bstl2I，Bst71I，BstVlI，RleAI，AceDI，Bbr7I，Ecil， TspDTI，TspGWI，Tthllin,HgaI，BseMII 及 BseRI。又 該間距是1 6個鹼基以上的第二種第Π S型限制酶有： Mmel，Acul，Bce83I5 Bpml，BpuEI，Bsgl，BspKT5I，Eco57I, Eco5 7MI 及 Gsul o 尚且因不限第一種第Π S型限制酶的切斷序列，所以 就不限定第一及第二種第H S型限制酶之組合。又連接子 一 X是否擁有因第E型限制酶所生成之CDNA斷片與能夠 生成連結物末端或是能夠生成非加工不可之連結物末端， 而不限定第Π型限制酶及第一種第Π S型限制酶或第二種 第Π S限制酶之組合。

又從第一種第Π S型限制酶的正股之切斷位置與互補 股的切斷位置間隔著的場合，兩者的差之個數的連接子-Y予以必要的隨機安排序列。該Π S型限制酶的例子有： Mmel, Acul, Bce83I? Bpml, BpuEI, Bsgl, BspKT5I, Eco57K

Eco57MI，Gsul，RleAI，Ecil，TspDTI，TspGWI，Tthlll Π , BseMn，BseRI，AsuHPI，HphI，MboH，Ncul，Mnll，BciVI， Bful 及 HpyA V o (4)之過程中用第二種第Π S型限制酶將該連接子一 X — cDN A斷片連結物切斷製備得連接子一 X 一 cDNA幟 25 200404891 連結物。

例如以Bsgl做為第二種第Π S型限制酶使用時，該 限制酶結合在該連接子一 X — cDNA斷片連結物上所生成 的結合序列「5’一 GTGCAG— 3’」及互補股所構成的雙股 DNA，而切斷「5，一 GTGCAG— 3，（16/14)」位置」。即 Bsgl切斷從其所結合序列3 ’ 一的3 ’末端之鹼基C的下游 側第1 6號鹼基與第1 7號鹼基之間的磷酸二酯鍵，及切斷 從所結合序列「5’一 GTGCAG— 3，」之互補股「3，一 CTGCAC —5 ’」的5 ’末端鹼基C的5 ’上游側第1 4號鹼基與第1 5 號鹼基之間的磷酸二S鍵，而生成有下列DNA斷片。 NNNNNNNGAGGAGNGTGCAGTACNNNNNNNNNNNNN —3 ’ （序列號碼1 5 )

NNNNNNNCTCCTCNCACGTCATGNNNNNNNNNNN 一 5 ’ （序列號碼1 6 ) 在（5 )之過程相應其必要，將在（4 )過程所得該 連接子一 X — cDNA斷片連結物用第二種第Π S型限制酶 切斷製備得的該連接子一 X — cDNA斷片幟連結物精製。 此精製係按（3 )之過程所記載將前述已切掉cDNA幟餘 下之cDNA斷片，利用標籤寡dT引子之標籤而除去。其 26 200404891 法例如利用凝膠珠之沈澱性將限制酶處理液體用離心機分 離以沈殿去除標籤寡dT引子序列。在此離心上澄液則含 有連接子一 X — cDNA斷片幟連結物。 在（6 )之過程相應其必要，第二種第s型限制酶 的孩連接子一X — cDNA幟末端的cDNA幟之末端使能與 含有第二Π S限制酶所結合序列之連接子一 γ相結合的狀 態。 在（7)之過程將連接子一 γ在該連接子—X— cDNA 職連結物切斷末端連結物製備得連接子一 X 一 c 〇 Ν Λ幟 連接子一 Υ連結物。該連接子一 丫稱為含有第一或第三種 第π s型限制酶所結合的序列。又該結合序列是這些n s 型限制酶在不留下間隔序列狀態下切斷該cDNA幟的位 置，或留下預期的間隔序列的適當位置為理想。例如在（6 ) 之過程不施與加工的場合，做為連接的連接子一 γ有下列 構造的DNA斷片。就此例而言，做為間隔序列，設計能 有AC的二個 餘鹼基會留下的預計安排。 一 NNNNNNGGCGGANNNNNNNNNGTNN— 3, (序列號碼1 7 ) 3’ — NNNNNNCCGCCTNNNNNNNNNCA 一5， (序列號碼1 8 ) 又在（7)之過程製備的連接子—x—c〇na幟一連 200404891 接子一Y連結物，例如有下列序列。

NNNNNNNGAGGAGNGTGCAGTACNNNNNNNNNNNNNACNNNNNNNNNTCCGC CNNNNNNN - 3' (序列號碼1 9 ) 3,-

NNNNNNNCTCCTCNCACGTCATGNNNNNNNNNNNNNTGNNNNNNNNNAGGCG GNNNNNNN-5' (序列號碼2 0 ) .本說明書所使用的「第三種第Π S型限制酶」術語是 代替第一種第Π S型限制酶的限制酶，含有結合連接子一 Υ上的結合序列，能生成EG IcDNA幟的Π S型限制酶及 發揮同樣功能的I型及第Π型限制酶。

該第三種第Π S型限制酶舉例有：Mmel，Acul，Bce83I, Bpml，BpuEI，Bsgl, BspKT5I，Eco57I，Eco57MI，Gsul, BsmFI，BspLUlin，BstOZ616I，StsI，BceAI，BstPZ418I， FokI，BcefI，AlwXI，Bbvl，Bsp423I，BseKI, BseXI, Bsp423 I， B s 11 21，B s 17 11，B s t V 11，R1 e AI，A c e ΠΙ , B b r 71，E c i I，T s p D TI， TspGWI，Tthllin，Hgal，BseMn，BseRI, BspST5I，Lwel, Phal，SfaNI，Aarl, Acc36I，BfuAI，BspMI，BveK Sthl32I· S s p D 5 I，A s u Η PI，H p h I，M b ο Π，N c u I，Μ n 1 I, B b s I，B b v Π， 28 200404891

Bbsl，Bbvl6n，Bpil，BpuAI，Bsc91I，BspBS31I，BspIS4I， BspTS514I，BstBS32I，BstTS5I, BstV2I, BstV2I，Bme 5 8 5 I, B s c AI，B s 11 91，B s t F Z 4 3 8 I，F a u I，S m u IB c i VI , B f u I 及 H p y A V 〇 這些限制酶當中，從結合序列到最長末端止的間距是l 〇 個鹼基以上之第三種第Π S型限制酶有：MmeI,AcuI， Bce83I, Bpml，BpuEI，Bsgl，BspKT5I，Eco57I, Eco57MI,

G s u I，B s m F15 B s p L U 1 1 M，B s t Ο Z 6 1 61，S t s I，B c e AI, BstPZ418I，FokI，BcefI，AlwXI，Bbvl，Bsp423I， BseKI BseXI，Bsp423I，Bstl2I，Bst71I，BstVlI，RleAI，AceDI, Bbr7I，Ecil，TspDTI，TspGWI，Tthlll Π，Hgal，BseME 及 BseRI。又該間距是1 6個鹼基以上的第一種第Π S型限制 酶有：Mmel，Acul，Bce83I，Bpml，BpuEI，Bsgl，BspKT5I， Eco57I，Eco57MI 及 Gsul。

尚且含有第一種第Π SS!限制酶及第三種第Π S型限 制酶之組合在内’不受此限制。第一種第E S型限制酶及 第三種第Π S型限制酶之組合當中，反應系統是同一乃至 類似時’在後述的（9 )過程同時讓第一種第π S型限制 酶及第三種第ns型限制酶作用，或可將省略除去酵素及 鹽的過程。 從該過程得有「5，-[連接子一 X]—[CDNA幟（EG IcDNA 幟）]一[連接子一 Y ]—3,」的構造之連結物。

在（8)過程將該連接子一 X— cDNA幟一連接子一Y 29 200404891 連結物增幅。 在（7 )過程製備得的連結物在連接子一X及連接子一 Y各引子都有雜交序列，容易用聚合酶鏈反應（PCR)予 與增幅。該P C R法是標準的聚合酶鏈反應法，例如美國 專利第4，6 8 3，1 9 5號所記載之方法亦可。更將該連結物編 入適合於原核生物的載體選殖或同業者周知的其他方法增 幅亦可。 尚且使用含有已與引子連接用的連接子連接的不同長 度DNA之模子混合物進行PCR時，其增幅效率依各模子 DNA股長度而不同。平常，股的長度是越長其增幅效率 越低，股的長度是越短增幅效率越高。因此所得對應於增 幅生成物中的各模子DNA之增幅DNA斷片的出現率就不 反映存在模子DNA混合物中之各DN A斷片的存在比率。 但是，本發明的方法做為模子所使用的DN A混合物，股 長度是相等的而且因股之長度是短的，所得到的增幅生成 物中的各種增幅DN A斷片之出現比率反映了模子DN A混 合物中的各種DNA斷片的存在比率結果。因此在本發明 中都 有因PCR增幅 率引起的差而受影嚮。而且所得 的增幅生成物中之各cDNA斷片的出現率成為反映了在被 測試細胞中發現的各mRNA之比率。 該P C R可按標準的設定反應時間，反應溫度等條件。 此外因按本發明方法增幅的連接子一 X — cDNA幟一連接 子一 γ，其序列的長度短，長度是均一，增幅效率高，所 30 4 广、 200404891 以有可能減少連接/延長序列循環次數。又因改連接子的 序列與更改PCR之效率，可達到所預期之連接/延長序 列循環的效率。

本發明中稱為「引子一 X」的術語意味著對連接子一 X 之核酸股是互補的，可做為在誘導聚合酶鏈反應條件下的 反應開始點而作用的天然存在之寡核苷酸或人工合成的寡 核苷酸。此外引子一X是可留下在連接子一 X上之第一種 第Π S型限制酶所結合序列位置予與雜交而且在有重合試 劑條件下，必須是足以開始增幅的反應所需的鹼基長度。 連接子X所需的長度應可按反應溫度，反應p Η，使用的 連接等許多要因而決定的。又同樣的在本發明詳細說明書 中所使用的「引子一 Υ」的術語意味著對連接子一Υ之核 酸股是互補的，可做為在謗導聚合酶鏈反應條件下的反應 開始點而作用的天然存在之寡核苷酸或人工合成的寡核苷 酸。此外引子一 Υ是是可留下在連接子一 Υ上之第一種第 Π S型限制酶或第三種第Π S型限制酶所結合序列位置予 以雜交而且在有重合試劑條件下，必須是足以開始增幅的 反應所需的鹼基長度。 尚且是這行業業者的話，不過度的進行實驗而把第一 Π S限制酶，第三種第Π S型限制酶等考慮進去，應可以 很容易製備連接子的核苷酸序列。 在實施方式3的（9 )之過程所得增幅產生物用第一種 第Π S型限制酶及第三種第Π S型限制酶同時或相應其必 31 200404891 要中間挟進除掉酵素及鹽的過程按順序切斷，製備得鑑別 表現基因用CDNA幟。第一種第JJ s型限制酶以及第三種 第Π S型限制酶是可各別獨立選擇的。又按順序切斷的場 合’其順序不受此限。例如使用BseR I做為第一種第π S型限制酶時’該限制酵素結合在連接子一 X上的序列「5， —GAGGAG — 3’」及由其互補股所構成的雙股DNA， 切斷「5’ 一 GAGGAG— 3，（ 10/8 )」。即 BseR I 結合從序 列「5’一 GAGGAG — 3，」的 3，末端之鹼基，3，下游側 第1 0號的驗基與第1 1號鹼基之間的磷酸二酯鍵將其切斷 或切斷從結合序列5,一 GAGGAG— 3,之互補股3，一 CTCCT —5 ’的5 ’末端之鹼基c，5，上游側第8號鹼基間的與第9 號驗基之鱗酸二酯鍵，生成有下列構造的切斷末端連接子 —X的DNA斷片。 5’- NNNNNNNGAGGAGNGTGCAGTAC- 3， (序列號碼2 1 ) 3’ 一 NNNNNNCTCCTCNCACGTCA - 5， (序列號碼2 2 ) 又同樣的，做為第三種第Π S型限制酶，使用Ecil 的場合，結合連接子一 Y上的序列「5，一 G G C G A — 3，」 及由其互補股構成的雙股DNA，切斷「5，一 GGCGA — 3， (11/9)」。即Ecil結合從序列 「5，一 GGCGGA— 3，」 r 〇·^·Ζ 32 200404891 的3 ’末端之鹼基，3 ’下游側第1 1號的鹼基與第1 2號驗芙 之間的磷酸二酯鍵將其切斷及切斷從結合序列5，— GGCGGA — 3’之互補股3’一 TCCGCC— 5'的5,末端之驗兵 C，5 ’上游側第9號鹼基間的磷酸二酯鍵，生成有下列構 造的切斷末端連接子一 Y的DNA斷片。 5’一 NNNNNNNGGCGGANNNNNNNNNGT- 3, (序列號碼2 3 )

3’ 一 NNNNNNNCCGCCTNNNNNNNN— 5， (序列號碼24 ) 此結果成為從含有連 接予一 X及連接子一 γ的 DNA斷 片將EG IcDNA幟切掉。 〜m Lsp6 I做為Π s型限制 在（3 )之過程使用含有由庳别％斑# J田序列唬碼第丨3號及第Μ儀 表現的鹼基序列構成的核νΑ f紅股之連接子一 X，在（ 之過程，使用Bsg I做為 之過程，使用含有由序歹,j 驗基序列構成的核苷酸股 使用BseRI做為第-種第D s型限制酶 第二種第π s型限制酶，在（9) 號碼第1 7號及第1 8號所表現的 之連接子一γ，在（9)之過程，

使用E c i 1做為 第三種第Π S型限制酶 的Csp6 I之切斷部位（5,〜 續第1 3號驗基之核苷酸股， 將含有鄰接於被測試CDN A由來 AC— 3’）之cDNA由來的連 製備得下列之E G I c D N A幟。 33 200404891 5’一 NNNNNNNNNNNNNAC— 3， (序列號碼2 5 ) 3’一 TGNNNNNNNNNNNN —5, (序列號碼2 6 ) 使用從細胞由來的mRNA製備得cDNA基因庫按本 發明方法實施的場合，在（9 )之過程得到eg IcDNA幟 基因庫。 在本發明利用所製備得該EG IcDNA幟基因庫，定性 的或定量的測定對應於EG IcDNA幟的cDNA應可查得對 應之表現基因的模式。 例如首先製備對應於宜檢測的cDNA之EG IcDNA幟 基因庫，將其置於檢測裝置準備妥當，然後以不同標籤等 標記的被測試者的試料與標準試料接觸比較其信號之強 可進行選擇目標乾等。可廣泛使用做為此標籤的有螢 光化&物，放射性同位素等周知的試藥。

又例如讓該cDN A之EG IcDNA幟基因庫與固定在檢 測裝置之宜檢測的cDNA等接觸而測試含在該cDna之EG I cDNA幟基因庫内的cDNA以查得對應之表現基因的模 式。 本發明可用的檢測裝置有DNA薄片，微對偶基因， 圓點雜父的大對偶基因。使用於該檢測裝置的支持体有尼 遠薄膜，硝基纖維素濾紙，玻璃板，矽薄片等。又所謂該 34 200404891 檢測裝置是例如將已製備EG I cDN A幟固定在支持体上， 與宜檢測的DNA，R ΝΑ及其斷片等雜交，能夠使用檢測 的裝置。 此外，能檢測mRNA或cDNA的狀態是用標籤來標記 為理想。例如可以使用做為籤試藥用的有放射性同位素， 螢光化合物，生物發光化合物，化學發光化合物，金屬螯 合劑或酶等。 例如標籤已標記的宜檢測cDNA分離成單股，必要時， 按階段的稀釋備用，與例如在矽薄片之各柵攔中，與保持 著有對應於宜檢測基因之EG I cDNA幟之固體相支持體接 觸。將所得的表現基因與當做標準的表現基因模式比較， 可容易的知道試料細胞等的狀態。 又將未知的基因之EG IcDNA幟固定並紀錄下來，待 將來此基因已判明清楚時可再解析。 本發明依第二種第Π S型限制酶的選擇可調整EG 1 cDNA幟的長度，或雖依所解析的基因生物的種類等，變 更所希望的長度，但是平常EG IcDNA幟的長度是6〜25 鹼基對，更好是10〜25鹼基對，尤其理想的是10〜16鹼 基對。 在（1 0 )之過程，必要時分離所得的鑑別表現基因用 cDNA幟。該分離步驟用本業業者平常使用方法，例如利 用聚丙烯醯胺凝膠電泳進行。 再加說明，將EGI cDNA幟連結，依決定該連結物的 35 200404891 鹼基序列可解析表現基因，例如（9 )之過程所得的E G IcDNA幟是3’及5’的連接末端因是互補的，所以可用T4 連結酶連接。而所得的EG IcDNA幟之連結物（連環）可 用本業業者周知的方法，例如可一面編入載體選殖，一面 用定序器解讀序列。 在本發明中，該連環平常是3〜200的EG IcDNA幟， 更好是3〜80的EGIcDNA幟，尤其較為理想的是16〜80 的EG IcDNA。此外所得到的連環因EG IcDNA的形成方 法而生成無間隔序列者與有間隔序列者。 在本詳細說明書中稱為「重組載體」術語是指用插入 EGIcDNA幟或依編入而製成的質體，過滤病毒或其他的 載體。這樣的載體含有選擇複製起點，啟動子及轉形細胞 的表現型是可能的特定之基因。本發明可用周知的適合於 序列的許多選殖載體。舉其例有：載體p u C 1 1 8，p U C 1 9， 其改變載體的 pUC119，M13mpl8RFI，M13mpl9RFI， pBR3 22, pCR3.1，pBAD-TOPO及其改良的載體，及 pBluescriptRII 等。 其次將該重組載體移入適當的細胞内。本詳細說明書 之稱為「宿主細胞」是在其細胞内載體能增殖而且其[)n八 能被表現之細胞及宿主細胞本身的子孫細胞也意味在内。 此外因在複製時有突變發生所以所有的子孫細胞不一定跟 母細胞同樣。 又’本發明可用周知的方法來繼續維持在宿主細胞内

36 200404891 的外插D N A。例如使用像原核細胞大腸菌等當宿主時， 於到達對數增殖期後收穫細胞，繼續從用周知的方法，

Rbc 1法，氯化鈣法處理的細胞中調製有併入能力的競爭 性細胞。也可利用電穿透作用及平常方法進行轉形。尚且 本發明把EGI cDNA幟連結物插入載體進行鹼基序列的決 定，一次操作可決定2 0個以上鹼基，2 0個〜1 0 0個，可 以簡單的判明之理想序列是約20〜30個程度的EGI cDNA 幟的序列。 到此為止本詳細說明記載了本發明的理想之實施方 式，根據這些記載，是本業業者的話，在不脫離本發明技 術思想狀況下能明顯的進行種別的改進。又其次表明本發 明的實施例，具体的加以說明，但是這些的實施例並非意 欲限定本發明的保護範圍。因此本發明僅用申請專利範圍 來限定本發明的保護範圍。

【實施例】 〔實施例1〕 解析末梢血液淋巴球細胞的基因 首先從健康人的末梢血液用NycoPrepl.077A (Nyco Med Pharma公司製造）集得末梢血液中的單核細胞（P B M C )。將所集得的末梢血液單核細胞在脂多糖（L P S ) 1 0 // g / m 1的存在下或非存在下，於3 7 °C 3小時培養後， 用Isogen(Nipponjin公司製造）從各培養細胞萃取全R NA。將全R NA萃取物用DNasel (寶酒造公司製造）於3 7 37 200404891 °C 3 〇分鐘處理後，用RNeasy (QIAGEN公司製造）精製。 繼續用Oligotex-MAG mRNA精製全套試藥（寶酒造公 司製造），以吸附法從全RNA將mRNA分離後，用CDNA 合成全套試藥（寶酒造公司製造）從mRNA製備得雙股 cDNA 〇

將調製得的雙股cDNA用限制酶CsP6I於37°C 2小時 處理而切斷後，由於磁力將磁性珠集於壁面，從回收操作 得含有在前述mRNA的多腺苷末端與從該多腺苷末端， 與甸5 ’上游側最初出現的前述C s p 61所結合之序列切斷 部位之間的驗基序列的存有cDNA斷片的部分。繼續用丁4 連結酶將該cDNA斷片的部分按下述三種方法，連接含有 第〆種第Π S型限制酶B s e RI所結合的序列連接子—X。 此外用那一種方法也都能進行適合之連接。

(1 )在C s p 61所切斷末端直接連接連接子—X的方法 用Csp6I切斷所生成的連接末端直接連接有下列構造 的連接子一 X 5, 一 ACCGAGGAGTGTGCA — 3’ (序列號碼2 7 ) 3’一丁GGCTCCTCACACGTCAT— 5’ (序列號碼28 ) 繼續利用含於連接子一X之限制酶B s g I所結合的序 列 5’一 GTGCAG— 3’ ’ 用 Bsgl ( New England Biolabs 公 38 200404891 司製造）進行在3 7°C 2小時的切斷，這操作跟前次相反’ 回收有磁性珠的部分亦即離心後的上澄液。因為這限制酵 素的切斷部位是5,一 GTGCAG-3，（16/14)，被回收的 部分繼含有連接子後成為含有cDNA由來的1 3個鹼基（除 Csp6I邵位由來的TAC3個多餘鹼基以外）。 此結合序列用T4DNA連結酶的1 6°C 2小時處理連接 上有下列構造的第二連接子—γ。 5,- ACCACTGCGACTCCGCCTGG- 3， (序列號碼2 9 ) 3，- NNTGGTGACGCTGAGGGGACC- 5， (序列號碼3 0 ) 由於連接上述的連接子一Y而得兩端含有已知的連 接子一X所挾著c DN A由來的1 3個鹼基對，總長度為5 2 個鹼基對的一群「連接子一X — AC— cDNA由來之Π個 驗基對（EGIcDNA幡）一AC —連接子—Y」的小斷片連 結物基因庫。這小斷片是由以下的鹼基序列及其互補股而 構成。

ACCGAGGAGTGTGCAGTACNNNNNNNNNNNNNACCACTGCGACTCCGC CTGG- 3 ’ (序列號碼3 1 ) 39 200404891

其次，將此小斷片c D N A連結物基因庫用在連接子一 X 部分所雜交之引子一 X「5’一 ACCGAGGAGTGTGCAGTA 一 3 ’」（序列號碼3 2 )及連接子一 Y部分所雜交之引子-Y 「5, 一 CCAGGCGGAGTCGCAGTGGT — 3，」（序列號碼 33)以使用Taq聚合酶進行PCR而增幅。PCR是96°C30 秒的變性，5 0 °C 1分鐘的連接，72 °C 1分鐘的伸長為1循 環合計2 0循環的增幅反應及在7 2 °C 2分鐘的進行最終之 伸長反應。 將所製備的PCR生成物用Π S型限制酶（New England Biolabs 公司製造）及 Ecil ( New Engliand Biolabs 公司 製造）處理。因為這些限制酶的切斷部位是「5，一 G A G G A G —3’（10/8)」及「5，一 GGCGGA — 3，（ 11/9)」的位置， 所以讓其生成有以下之構造的dna斷片。

5’一 NNNNNNNNNNNNNAC- 3， (序列號碼34 ) 3，一丁GNNNNNNNNNNNNN - 5, (序列號碼3 5 ) 繼續將處理物供1 2%聚丙晞醯胺凝膠電泳後，把上 述小斷片從連接子斷片分離回收。 將製備得的cDNA幟再以T4連結酶連結後，供4.5% 聚丙稀酿胺凝膠電泳後回收500〜1 000個鹼基對的結合斷 40 200404891 片。將回收的結合斷片是具有下列的構造，鄰接於（N ) 第13號鹼基的5’一 AC-3， 也是cDNA上面的Csp6I所 結合序列由來的驗基，因不含用人為的間隔序列，成為製 備得了完全是cDNA由來的cDNA幟連結物基因庫。在下 列的鹼基序列中，（N )第1 3號表示cDNA由來的第1 3 號鹼基 5’一 NNNNNNNNNNNNN— 3’。

5’ - AC ( N ) 1 3 AC ( N ) 1 3 A C ( N ) 1 3 AC ( N ) 1 3 AC ( N ) 1 3 A C ( N ) 13 AC - 3， （序列號碼36 ) 3’- TG ( N ) 1 3TG ( N ) 1 3 TG ( N ) 1 3TG ( N ) 13TG(N) 1 3 T G ( N ) 13TG — 5’ （序列號碼37 )

上述的結合斷片重組進入質體pUC118，用ABI377型 序列定序器決定鹼基序列的結果，由於L P S所激發的細 胞内表現基因斷片已解析出來。因為一次的決定鹼基序列 操作可以解析清楚約為20個鹼基的EG I cDNA幟，由於 進行決定約5 0 0個鹼基的序列，則細胞中的表現m R Ν Λ 的種類與各mRNA的鹼基個數大約能解析清楚預想的1 萬個鹼基序列。 ’ 表1及表2表示用本方法鑑別的幾個基因。把這些 EGIcDNA幟的鹼基序列與已知的儲存資料對照進行檢索 相似性。在表1表示受LP S激發的結果提高了基因表現， 表2則表示相反的受LPS激發的結果抑制了基因表現。 41 200404891

【表1】由於LP S激發的活化表現基因 mfID Mf鹼基序列 基因名稱 ' 11231226 5，- AGGGTCCTTTTGC-3， 組蛋白H3.3的WI3.3B (序列號碼38) (Hs.180877) 65462282 5，-TTGCGTGAAAAGC -3， Arg-Serpin (序列號碼39) milNA(Plasminogen 活化因子抑制劑-2，PAI-2) (Hs.75716) 22150632 5，-CCACTTTCTGCT -3， (序列號碼40) 未知 55149444 5，-TCAGCGAATGAAT -3’ IL-1受體拮抗劑 (序列號碼41) IL-Ira(IL-IRN)基因，完整密碼 序列（Iis.81134) 17350558 5，-CAAGAGTTTGCTC -3， (序列號碼42) CC Chemokine LARC 前驅體 58058765 5，-TCTCCTGGAAATA -3, Cytokine次單體 (序列號碼43) Family B (Cys-X-Cys), Member 10( SCYA10 )mRNA 27500370 5，-CGGATGCTTCCAC -3’ 干擾素調節因子1 (序列號碼44) (IRF-1 ) mRNA 61929620 5，-TGTAATTGAGCAT -3’ 推定轉譯開始因子 (序列號碼45) (SUI-1) 49078651 5，-GTGTATGACCTGG -3， 活化（Act-2) mRNA (序列號碼46) 完整 cds (Hs.75703) 24468063 5，-CCTCCCCGGCCTG -3， JAK結合蛋白 (序列號碼47) (SSI-1 ) mRNA

42 200404891 【表2】由於L P S激發的抑制表現基因

mfID Mf鹼基序列 基因名稱 30790136 5,-CTCCCTCACTTCT -3， (序列號碼48) Gardner-Rasheed feline 的 肉腫病毒（v-fgr)癌基因 同質（FGR)mRNA 32376076 5，-CTGTGAACCAAGT -3’ (序列號碼49) 核糖體蛋白質L3 (RPL3 ) mRNA 22677064 5，-CCCGGAACGCACT -3’ (序列號碼50) 主要組織相容基因複合體 Class II，DMa (HLA-DMA)mMRA 17588982 5，-CAATACGAGTTCC -3’ (序列號碼51) 肌動蛋白相關蛋白質2/3 複合體，次單體1B (41Kd) (ARPClB)，mRNA 58325411 5，-TCTGCTTGCGGAG -3, (序列號碼52) Zyxin (ZYX) mRNA 2253845 5，-CCCCTTCTGGGCA -3， (序列號碼53) G(i)蛋白質α—次單體（腺_ 酸環化酶）GTP-接合蛋白質 (Hs.77269) mMRA 19476075 5，-CAGGCAGTGCGGG -3， (序列號碼54) CARD (ASC) mRNA 含有Card apoptosis相關斑點 型蛋白質（ASC) mRNA .52161694 5，-TACGTTGTAGCTC -3， (序列號碼55) 粒線體DNA ~~ 完整序列 17076820 5，-CAACAGCAGCCAT -3’ (序列號碼56) 造血細胞蛋白質一酷胺酸激酶 CHCK)基因，完整密碼序 列、；l—a2 59268236 5、TGAGACCTAGAGT -3， (序列號碼57) ADP/ATP轉位酶 mRNA,3，UTR

此外在表1及表2中用mf ID表示鹼基序列的數字 是為了電腦處理將1 3個鹼基以十進法的數字表達。即m f ID是把驗基序列中的各驗基之a讀成〇，c讀成1，g讀 成2，t讀成3，的四進法轉變成十進法，力口 1後的數。 從這個ID不拘序列的長短，可將鹼基序列予與用數字來 43 200404891 處理。例如對鹼基數為1 4 鹼基序列之場合可桉下列的 數字訂定。 55-aaaaaaaaaaaaa-3 55-aaaaaaaaaaaac-3 55-aaaaaaaaaaaag-3 5、aaaaaaaaaaaat-3 5、aaaaaaaaaaaca-3 00000001 (或只用1表達） 00000002 (或只用2表達） 00000003 (或只用3表達） 00000004 (或只用4表達）

00000005 (或只用5表達）

5，-tttttttttttgt -3， 67108860 5，-tttttttttttta -3， 67108861 5，-ttttttttttttc -3， 67108862 5，-ttttttttttttg 一3， 67108863 5，-ttttttttttttt -3， 67108864 照此任何構成的1 3個之鹼基序列出現的話，全部序列 可用一個8位數的數字來安排表達。這些數字稱為小斷片 ID(mini fragment ID: mf ID) 〇 〔實施例2〕 在實施例1製備得的EGIcDNA幟基因庫用下述的檢 測裝置測試解析基因的表現。 44 200404891 表1所記載的L P S激發而活化的基因之中，合成含 有 mfID65462282， 55149444， 17350558， 58058765， 27500370及49078651的mf鹼基序列的對應序列的寡 DNA，按平常方法點在Stained Glass而製備DNA薄片。 在實施例1製備得的受LP S激發末梢血液的單核球 (PBMC )由來之mRNA做為模子，將其用螢光性化合物 Cy3-dUTP(註 1)( Amersham Pharmacia 公司製造）標籤標 記而且以LP S無激發的末梢血液的單核球（p B M C )由來 之mRNA做為模子，螢光性化合物Cy5-dUTP (註2 ) (Amersham Pharmacia公司製造）標籤標記的試藥製備 得探針液。 此探針液混合並在6 X SET 0.9M NaCl，10 // g/ml Yeast tRNA，0 · 1% SDS，120mM Tr i s - H C1 (p H 7』）J 裏面 與前述DNA薄片在45 °C進行雜交一夜。 用洗淨液 6 X S S C，0 · 1 % S D S 於5 2。(：洗淨後，使用 掃描器將螢光物質掃描得到螢光強度數據，進行解析數 據。各位置的Cy3與Cy5的資訊強度之散射圖上連點

(Scatte Plot )的結果，從受LPS激發的PBMC由來mRNA 來的探針所發的螢光在所有的位置都比無受激發的ΡΒμC 由來mRNA來的探針所發的螢光強2倍以上。 註 1 : CAS RN Cy3 CAS RN 1 463 68 - 1 6 - 3CN3H-Indolium，2-[3-[l-[6-[(2,5-dioxo-l_ pyrrolidinyl)〇xy]-6-〇x〇hexyl]-l,3-dihydro-3,3-dim ethyl- 45 200404891 5-sulfo-2H-indol-2-ylidene]-l-lpropneyl]-l-ethyl-3,3-dimethyl-5-sulfo-，inner salt (9CI) (CA INDEX NAME) 註 2 : CAS RN Cy5 CAS RN 14 6 3 6 8 —14 —1 CN 3H-Indolium? 2-[5-[l-[6-[(2,5-dioxox-l-pyrrolidinyl)oxy]-6-oxohexyl]-1,3- dihydro-3,3- dim ethyl-5-sulfo-2H-indol-2-ylidene]-l,3-pentadienyl]-l-ethyl-3,3-dimethyl-5-sulfo-, inner salt (9CI) (CA INDEX NAME)

〔實施例3〕 使用在實施例1得的各EG I cDNA幟基因庫的任意之 幟可解析在一組的被測試試料該基因的表現之不同。 以有受LPS激發的末梢血液單核球（PBMC )由來之 mRNA，無受LPS激發的末梢血液單核球（PBMC )由來 之mRNA的各mRNA為模子，使用轉形酶所調製之cDNA 點在尼龍膜後於8 0 °C 2小時處理。

從表1所記載合成含有L P S激發所發現的被導致基 因中mfID6 54 622 82之鹼基之寡DNA，用T4聚核苷酸激 酶將該 DNA 用[7 -3 2P] ATP ( Amersham Pharmacia 公司製 造）標籤標記（放射性同位素）製備得探針液。 此探針液混合並在6 X SET[0.9M NaCl, 1 Yeast tRNA，〇 · 1 % SDS，1 20mM Tr i s - H C 1 (p H 7 · 8 )]裏 面與前述DNA薄片在45 °C —晚上進行雜交。用洗淨液 6 X S S C，0 · 1 % S D S於5 2 °C洗淨後，進行自動放射顯影術 46 200404891 操作。X -線感光軟片上的資訊得知受L P S激發的P B M C 由來mRNA來的探針都比無激發的PBMC由來mRNA強 2倍以上。 〔實施例4〕

使用Afa I代替第Π型限制酶Csp6 I ，使用BseR I 代替第三種第Π S型限制酶Eci I以外，與實施例1同樣 方法製備EG IcDN A幟基因庫。首先使下（1)〜（3)的 方法中之一種方法製備連接子一X c D N A斷片連結物。

(1 )將試料中的cDNA用第Π型限制酶Afa I切斷所生 成的平滑末端，直接連接有下列構造的連接子一 X 5’-ACCGAGGAGTGTGCAGT -3’ （序歹>J 號碼 5 8 ) 3，-TGGCTCCTCACACGTCA -5’ （序歹J 號碼 59)

(2 )將試料中的cDNA用第Π型限制酶Afa I切斷所生 成的平滑末端，在dATP存在下直接引進一個鹼基A。

5，- AC 3’- ATG

接著將上述連接末端連結有下列構造的連接子一 X 47 200404891 5’-ACCGAGGAGTGTGCAGT -3， （序歹號碼 60 ) 3，-TGGCTCCTCACACGTC -5’ （序歹)J 號碼 61) (3 ) 試料中的cDNA用第Π型限制酶Afa I切斷所生 成的平滑末端.，在dATP存在下按下述方法除去一個鹼基 T °

5，- AC 3，- G 接著在上述連接末端連結以下述構造。 5，-ACCGAGGAGTGTGCAGT —3’ （序列號碼 62 ) 3，-TGGCTCCTCACACGTCAT -5’ （序歹J 號碼 63 )

接著利用含在連接子一X的限制酶B s g I所結合的序列 5’-GTGCAG -3’用B sg I切斷回收離心上澄液。因這限 制酶的切斷部位是5’-GTGCAG -3 ( 16/ 14 )的位置，所 回收的部分中含有連接子一X之繼續成為含有cDNA由來 之1 3個鹼基的幟。 繼續連接上有下列構造的連接子一 Y，更用與實施例 1同樣方法增幅，使用第一種第Π S型限制酶及第三種第 48 200404891 Π S型限制酶消化而得所希望的EG IcDNA幟基因庫。 5’- ACCACTGCGACTCCTCTGG-3’ （序歹J 號碼 64) 3，- NNTGGTGACGCTGAGGAGACC-5，（序歹號碼 6 5 ) 〔實施例5〕

從貫施例4得的E G I c D N A幡基因庫可按下述檢測裝 置測試解析基因表現。 表1所記載的受L P S激發而活化而且對應於 mfID65462282, 55149444， 17350558, 58058765, 27500370 及4907 8 65 1基因，合成含有實施例3製備得的FG IC[)N Λ S幟之對應序列的寡DNA，照平常方法點在載玻璃製備 得DNA薄片。

在實施例3得的受L P S激發的末梢血液之單核球細 胞（PBMC)由來的mRNA當做模子，螢光性化合物Cy3-dUTP( * 1) (AmershamPharmacia 公司製造）標籤標記， 並且以無受L P S激發的末梢血液之單核球細胞（P B M C) 由來的mRNA當做模子，螢光性化合物C5-dUTP ( * 2 ) (Amersham Pharmacia公司製造）標籤標記試藥製備得 探針液。 此探針液混合並在6XSET[0.9M NaCl， \0 n g/ ml Yeast tRNA，0.1% SDS，120mM Tr i s - HC 1 (p H 7.8 )]裏面與 前述DNA薄片在45 °C進行雜交一夜。 49 200404891 用洗淨液6xSSC、〇_1%SDS於52。〇洗淨後，進行 自動放射顯影術操作吏用掃描器將鸯光物質掃描得到勞 光強度數#，進行解析數據。各位置的C”與C”的資 訊強度之散射圖上連點（Scatte Pl〇t)的結果，從受[丨)S 激發的PBMC由來mRNA來的探針所發的螢光在所有的 位置都比無激發的PBMC由來mRNA來的探針所發的螢 光強2倍以上。 【發明的效果】 由本發明特異的表現於被測试c D N A或被測試細胞的 基因可以有良好再現性正確的測試解析。按本發明的方法 因為在功能上，形態上相異的任意之兩種細胞其基因表現 狀態的差異可以明顯化，所以可廣汎應用於生理條件下， 或在病態狀態的全部生物現象之解析。從本發明人們已經 開發的鑑別表現基因用cDNA幟的製備方法及表現基因之 解析方法，更擁有擴大可用限制酶之選擇幅度，容易製備 使用的連接子的等改良之前述cDNA幟之整備法及表現基 因之解析法。 50 200404891 【序列」 < 1 10 > < 120>

KUREHA CHEMICAL INDUSTRY COMPANY, LIMITED < 130> < 160> < 170> < 210 > < 21 1 > < 212 > < 213 > < 220 > < 221 > < 222 > METHOD FOR PREPARATION OF EXPRESSED GENE IDENTIFICATION CDNA TAG AND METHOD FOR ANALYSIS OF GENE EXPRESSION 0701004001

65

Paten In version 3 .1 21 DNA Artificial

misc_feature (1) · ·⑺ 51 200404891 < 223 > n stands for any base · < 220 > < 221 > misc —feature < 222 > (14) · · (18) < 223 > n stands for any base ·

< 400 > 1 2 1 nnnnnnngag gagnnnnngg g < 2 1 0 > 2 < 2 1 1 > 2 1

< 212> DNA

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200404891 nnnnnnngag gagngtgcag < 2 1 0 > 14 < 2 1 1 > 22

< 212 > DNA < 2 1 3 > Artificial < 220 > < 22 1 > misc_feature < 222 > (9) · -(9) < 223 > n stands for any base · < 220 > < 221 > misc_feature < 222 > (16) · -(22) < 223 > n stands for any base · < 400 > 14 tactgcacnc tcctcnnnnn nn 22 64 15200404891 < 210 > < 21 1 > < 212 > < 213 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 220 > < 221 > < 222 > 36 DNA Artificial

mi sc_feature (1) · -(7) n stands for any base · misc_feature (14) · -(14) n stands for any base ·

misc_feature (23) · · ( 36) 65 200404891 < 223 > < 400 > nnnnnnngag < 210 > < 21 1 > < 212 > < 213 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 220 > < 221 > < 222 > n stands for any base · 15 gagngtgcag tacnnnnnnn nnnnnn 36 16 34 DNA Artificial

misc__feature(1) · - (ID n stands for any base ·

misc_feature (21)· -(21) n stands for any base · 66 < 223 > < 220 >200404891 < 22 1 > < 222 > < 223 > < 400 > nnnnnnnnnn mi sc_feature (28) ·· ( 34) n stands for any base · 16 ngtactgcac nctcctcnnn nnnn 34

< 210> < 21 1 > < 212 > < 213 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 220 > 17 26 DNA Artificial

mi sc_feature (1) · -(7) n stands for any base · 67 200404891 < 221 > < 222 > < 223 > < 400 > nnnnnnn <210〉 < 21 1 > < 212 > < 213 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 220 > < 221 > < 222 > mi sc_fe ature (14) · -(26) n stands for any base · 17 ggc ggannnnnnn nngtnn 26 18 24 DNA Art i fic i al misc_feature (3) · -(11) n stands for any base · misc_feature (18) · · ( 24 )

68 200404891 < 223 > < 400 > acnnnnnnnn < 210> < 21 1 > < 2 1 2 > < 213 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > n stands for any base · 18 ntccgccnnn nnnn 24 19 60 DNA Art i fi c i al

mi sc_feature (1) · -(7) n stands for any base ·

mi scfeature (14) · -(14) n stands for any base · 69 < 220 >200404891 < 221 > mi sc_feature < 222 > (24) ·· ( 36) < 223 > n stands for any base · < 220 > < 221 > mi sc_feat ure < 222 > (39) ·· ( 47) < 223 > n stands for any base · < 220 > < 221 > mi sc_feature < 222 > (54) · .(60) < 223 > n stands for any base · < 400 > 19 nnnnnnngag gagngtgcag tacnnnnnnn nnnnnnacnn nnnnnnntcc gccnnnnnnn 60 < 210 > 20 70 60200404891 < 21 1 > < 212 > < 213 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 220〉 < 221 > < 222 > < 223 > < 220 > < 22 1 > < 222 > < 223 > < 220 > < 221 > DNA Artificial misc_feature (1) · *(7) n stands for any base ·

misc__feature (14) · . ( 14) n stands for any mi sc_feature (24)· -(36) n stands for any misc feature base · base ·

71 200404891 < 222 > < 223 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 400 > nnnnnnnctc cggnnnnnnn < 210 > < 21 1 > < 212 > < 213 > < 220 > < 221 > (39) · -(47) n stands for any base · misc_feature (54) · .(60) n stands for any base ·

20 ctcncacgtc atgnnnnnnn nnnnnntgnn nnnnnnnagg 60 21 23 DNA Artificial

misc_feature (1)- *(7) 72 < 222 > 200404891 < 223 > < 220 > < 22 1 > < 222 > < 223 > < 400 > 2 1 nnnnnnngag < 210 > < 21 1 > < 212 > < 213 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 220 > < 221 > n stands for any base · mi sc_feature (14) ·· ( 14 ) n stands for any base ·

gagngtgcag tac 22 2 1 DNA Artificial misc_feature (8) · -(8) n stands for any base · mi sc feature 23

73 200404891 < 222 > < 223 > < 400 > actgcacnct < 210 > < 21 1 > < 212> < 2 1 3 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 220 > < 221 > (15 ) · -(21) n stands for any base · 22 cctcnnnnnn n 23 24 DNA Artificial misc_feature (1)··(7) n stands for any base · misc_feature (14) · -(22) 2 1

74 < 222 > 200404891 < 223 > < 400 > nnnnnnnggc < 210> < 2 1 1 > < 212 > < 213 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > n stands for any base · 23 ggannnnnnn nngt 2 4 24 22 DNA Arti fi c i al

misc_feature (1) * -(9) n stands for any base ·

misc_feature (15) · · ( 22 ) n stands for any base · 75 200404891 < 400 > 24 nnnnnnnnnt ccgccnnnnn nn 22 < 210 > 25 < 21 1 > 15 < 212 > DNA < 213 > Artificial < 220 > < 221 > misc_feature < 222 > (1) * -(13)] < 223 > n stands for any base · < 400 > 25 nnnnnnnnnn nnnac 15

< 210 > 26 < 21 1 > 15 < 212 > DNA 76 200404891 < 213 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 400 > nnnnnnnnnn < 210 > < 21 1 > < 212 > < 213 > < 400 > accgaggagt < 2 1 0 > < 21 1 >

Artificial mi sc_feature (1) * -(13) n stands for any base ·

26 nnngt 15 27 16 DNA Artificial 27 gtgcag 28 18 16

77 200404891 < 212 > DNA < 213 > A r t i f i c i a 1 < 400 > 28 tactgcacac tcctcggt < 210 > 29 < 211 > 20 < 212 > DNA < 213 > Artificial < 400 > 29 accactgcga ctccgcctgg < 210 > 30 < 211 > 22 < 212 > DNA < 2 1 3 > Artificial < 220 >200404891 < 22 1 > < 222 > < 223 > η < 400 > ccaggcggag < 210 > < 21 1 > < 212 > < 2 1 3 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > misc_feature (21) · -(22) stands for any base ·

30 tcgcagtggt η n 22 3 1 52 DNA Artificial

mi sc_feature (20) · · ( 32) n stands for any base · 79 200404891 < 400 > accgaggagt gactccgcct 3 1 gtgcagtacn nnnnnnnnnn nnaccactgc gg 52 < 210 > < 21 1 > < 212 > < 213 > < 400 > accgaggagt 32 18

DNA

Artificial 32 gtgcagta 18

< 210 > < 21 1 > < 212 > < 213 > 33 20

DNA

Artificial 80 33200404891 < 400 > ccaggcggag tcgcagtggt 20 < 210> < 211 > < 212 > < 213 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 400 > nnnnnnnnnn < 210 > < 21 1 > 34 15DNAArtificial

mi sc_feature (1) · -(13) n stands for any base ·

34 nnnac 15 3 5 15 81 200404891 < 2 1 2 > < 213 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 400 > nnnnnnnnnn DN A Artificial misc_feature (1) · -(13) n stands for any base ·

35 nnngt 1 5 < 210 > < 21 1 > < 212 > < 2 1 3 > < 220 > < 221 > < 222 > 36 92 DNA Arti fi c i al

misc_feature (3)——（15 ) 82 200404891 < 223 > n stands for any base < 220 > < 221 > misc__feature < 222 > (18) · . ( 30) < 223 > n stands for any base < 220 > < 221 > misc_feature < 222 > (33) · -(45) < 223 > n stands for any base < 220 > < 221 > misc_feature < 222 > (48) . -( 60 ) < 223 > n stands for any base < 220 > < 221 > mi sc feature 83 200404891 < 222 > (63) . · ( 75 ) < 223 > n stands for any base · < 220 > < 221 > misc_feature < 222 > (78) · -(90) < 223 > n stands for any base · < 400 > 36 acnnnnnnnn nnnnnacnnn nnnnnnnnnn acnnnnnnnn nnnnnacnnn nnnnnnnnnn 60 acnnnnnnnn nnnnnacnnn nnnnnnnnnn ac 92 < 210 > 37 < 21 1 > 92 < 212 > DNA < 213 > Artificial < 220 > 84 200404891 < 221 > < 222 > < 223 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 220 > mi sc feature (3)..(15) n stands for any base · misc_feature (18) · -(30) n stands for any base ·

misc_feature (33) ·· ( 45 ) n stands for any misc_feature (48) · .(60) n stands for any base · base ·

85 200404891 < 22 1 > < 222 > < 223 > misc_feature (63) ·· ( 75) n stands for any base · < 220 > < 221 > < 222 > < 223 > < 400 > gtnnnnnnnn nnnnngtnnn gtnnnnnnnn mi sc_feature (78) · · ( 90) n stands for any base ·

37 nnnnngtnnn nnnnnnnnnn gtnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnngtnnn nnnnnnnnnn gt 92

< 210 > < 21 1 > < 212 >

38 13 DNA 86 200404891 < 2 1 3 > 人類（Homo sapiens)

< 400 > 38 agggtccttt tgc < 210> 39 < 21 1 > 13 < 212 > DNA < 214 > 人類（Homo sapiens) < 400 > 39 ttgcgtgaaa age < 210> 40 < 21 1 > 13 < 212 > DNA < 21 3 > 人類（Homo sapiens) 87 40200404891 < 400 > cccactttct < 2 1 0 > < 21 1 > < 212 > < 213 > < 400 > tcagcgaatg < 210> < 21 1 > < 212 > < 213 > < 400 > caagagtttg get 13 41 13 DNA 人類（Homo sapiens) 41 aat 13

42 13 DNA 人類（Homo sapiens) 4 2 etc 13

88 200404891 < 210 > < 21 1 > < 212 > < 213 > < 400 > tctcctggaa < 210 > < 21 1 > < 2 1 2 > < 213 > < 400 > cggatgcttc < 210 > < 21 1 > < 212 > < 213 > < 400 >

43 13 DNA 人類（Homo sapiens) 4 3 at a 13

44 13 DNA 人類（Homo sapiens) 44 c ac 13

45 13 DNA 人類（Homo sapiens) 4 5 89 200404891 tgtaattgag < 2 1.0 > < 2 1 1 > < 212 > < 213 > < 400 > gtgtatgacc < 210 > < 21 1 > < 212 > < 213 > < 400 > cctccccggc < 210 > cat 13 46 13

DNA 人類（Homo sapiens) 46 tgg 47 13

DNA 人類（Homo sapiens) 47 ctg 1 3 48

13

90 200404891

< 21 1 > 13 < 212 > DNA < 2 1 3 > 人類（Homo sapiens) < 400 > 48 ctccctcact tct < 210 > 49 < 21 1 > 13 < 212 > DNA < 213 > 人類（Homo sapiens) < 400 > 49 ctgtgaacca agt < 210 > 50 < 21 1 > 13 < 212 > DNA < 213 > 人類（Homo sapiens)

91 200404891 < 400 > 50 cccggaacgc < 210 > < 21 1 > < 212 > < 213 > < 400 > caatacgagt < 210> < 21 1 > < 212 > < 2 1 3 > < 400 > tctgcttgcg act 13 5 1 13 DNA 人類（Homo sapiens) 5 1 t cc 13

52 13 DNA 人類（Homo sapiens) 52 ag 1 3

92 200404891 < 2 1 0 > 53 < 21 1 > 13 < 212 > DNA < 213 > 人類（Homo sapiens) < 400 > 5 3 ccccttctgg gca

< 210 > 54 < 21 1 > 13 < 212 > DNA < 213 > 人類（Homo sapiens) < 400 > 54 caggcagtgc ggg < 210 > 55 < 21 1 > 13 < 212 > DNA < 213 > 人類（Homo sapiens)

93 200404891 < 400 > 5 5 tacgttgtag etc 13 < 210 > < 21 1 > < 212 > < 213 > 56 13

DNA 人類（Homo sapiens) < 400 > 56 1 3

caacagcagc cat < 210 > 57 < 21 1 > 13 < 212 > DNA < 213 > 人類（Homo sapiens) < 400 > 57 tgagacctag agt < 210 > 58 94 13 200404891 < 21 1 > < 212 > < 213 > < 400 > accgaggagt < 210 > < 21 1 > < 212 > < 213 > < 400 > actgcacact < 210 > < 21 1 > < 212 > < 213 >

13DNA 人類（Homo sapiens) 58 gtgcagt 59 13DNAArtificial

59 cctcggt 60 17DNAArtificial 17

95 200404891 < 400 > 60 accgaggagt gtgcagt < 210 > 61 < 2 1 1 > 16 < 212 > DNA < 213 > Art i f i c i al < 400 > 61 ctgcacactc ctcggt < 2 1 0 > 62 < 2 1 1 > 17 < 212 > DNA < 213 > Artificial < 400 > 62 accgaggagt gtgcagt 200404891 < 210> 63 < 211 > 18 < 212 > DNA < 213 > Arti ficial < 400 > 63 tactgcacac tcctc ggt < 210 > 64 < 21 1 > 19 < 212 > DNA < 213 > Artificial < 400 > 64 accactgcga ctcctctgg

< 210> 65 < 21 1 > 21 < 212 > DNA 200404891 < 2 1 3 > Artificial < 220 > < 221 > misc_feature < 222 > ( 20 ) · -(21) < 223 > n stands for any base ·

< 400 > 65 ccagaggagt cgcagtggtn n 21 【圖式簡單說明】

各圖表示在本發明鑑別表現基因用的cDNA幟之製備 方法之實施方式的過程流程圖。 【第1圖】 用含有第三種第Π S型限制酶所結合序列的連接子一 X製備本發明的EGI cDNA幟之製備方法過程（1 )〜（6 ) 的流程圖。 【第2圖】 用含有第三種第Π S型限制酶所結合序列的連接子一 Y製備本發明的EGI cDNA幟之製備方法過程（7 )〜（10 ) 98 200404891 的流程圖。 【圖3】 用含有第一種第ns型限制酶及第二種第ns型限制 酶所結合序列的連接子一X製備本發明的E G I c D Ν Λ幟之 製備方法過程（1 )〜（6 )的流程圖。 【第4圖】

用含有第一種第ns型限制酶及第二種第ns型限制 酶所結合序列的連接子一 X製備本發明的EG I cDNA幟之 製備方法過程（7 )〜（1 0 )的流程圖。 【第5圖】 用含有第一種第ns型限制酶及第二種第ns型限制 酶所結合序列的連接子一X及第三種第Π S限制酶所能結 合序列的連接子一Y製備本發明的EG I cDNA幟之製備方 法過程（1 )〜（6 )的流程圖。 【第6圖】

用含有第一種第Π S型限制酶及第二種第Π S型限制 酶所結合序列的連接子一 X及第三種第Π S限制酶所結合 序列的連接子一Y製備本發明的EG I cDNA幟之製備方法 過程（7 )〜（1 0 )的流程圖。 【元件符號簡單說明】 N…表示從A， T， C或G選擇的任意鹼基。 99

Claims (1)

1. 200404891 拾，申請專利範圍: 1 . 一種鑑別表現基因用的cDNA幟之製備方法，其係包 含：

   製備互補的去氧核糖核酸（cDNA )，接續用第Π型限 制酶切斷該cDNA以製備而得cDNA斷片，在該cDNA斷 片上連接上含有第一種第Π S型限制酶之結合序列，其係 位在與前述第Π型限制酶之切斷末端連結部分，其生成物 係為第二種第Π S型限制酶所能結合的連接子—-X，製備 成連接子一X— cDNA斷片連結物；用第二種第nS型限 制酶切斷該連接子一X— cDNA斷片連結物，而製備得連 接子一X—cDNA幟連結物； 然後在連接子一X— cDNA幟之第二種第Π S型限制 酶切斷末端連接上含有第三種第Π S型限制酶結合序列的 連接子Y，而製備得連接子一X— cDNA幟一連接子一Y 連結物；

   將該連接子一 X— cDNA幟一連接子一Y連結物增幅， 而且將所得增幅生成物用第一種第Π S型限制酶及第三種 第Π S型限制酶同時切斷，或依順序切斷，而製備得前述 之鑑別表現基因用的cDNA幟。 2. —種鑑別表現基因用的cDNA幟之製備方法，其係包 含： 準備互補的去氧核糖核酸（cDNA )，並用第Π型限制 100 200404891 酶切斷該cDNA以製備 接上含有第一種第ns S型限制酶之結合序列 cDNA斷片，在該cDNA斷片上連 型限制酶之結合序列及第二種第^ 的連接予一 X，而製備得連接子〜 X—cDNA斷片連結物； 將該連接子一X〜eDNA斷片連結物用第二種第π § 型限制酶切斷而製備連接子一 x—cDna蛾連接物；在該 連接子X cDNA幟之第二種第ns型限剎酶切斷末端 連接上口有第一種第D s型限制酶結合序列的連接子〜

   Y，而製備得連接子—X—cDNA幟一連接子一 γ連接物； 將琢連接子一X—cDNA幟一連接子一 γ連結物增幅， 而且將所得增幅生成物用第一種第n S型隊制酶切斷，而 製備得前述之鑑別表現基因用的CDNA幟。 3. —種鑑別表現基因用的cDNA幟之製備方法，其係包 含： 準備互補的去氧核糖核酸（c D N A )，用第2型限制 酶切斷該cDNA以製備cDNA斷片，在該cDNA斷片上連 接上含有第一種第Π s型限制酶及第二種第n s型限制酶 結合序列的連接子一 X，而製備成連接子一 X— cDN A斷片 連接物； 將該連接子一X — cDNA連接物用第二種第Π S型限 制酶切斷，而製備成連接子一 X— cDNA幡連接物； 將該連接子一X— cDNA幟連接物，含有第二種第HS 101 200404891 型限制酶切斷末端側，連接上第三種第π s型限制酶結合 序列連接子一 Y，而製得連接子一 X— C D N A幟一連接子一-Y連接物； 將該連接子一X— cDN A幟一連接子Y連結物增幅， 而且將所得增幅生成物用第一種第Π S型限制酶及第三種 第Π S型限制酶同時切斷，或依順序切斷，而製備得前述 之鑑別表現基因用的cDNA幟。

   4.如申請專利範圍第1、2、3項任一項所述之方法，其 更包含將前述含有用第Π型限制酶切斷之cDNA斷片的末 端處理成連接子一 X能連接之狀態的步驟。 5 ·如申請專利範圍第1、2、3項任一項所述之方法’其 更包含將前述連接子一 X—斷片連結物提純的步驟。

   6.如申請專利範圍第1、2、3項任一項所述之方法，其 更包含將前述連接子一 X— cDNA斷片連結物之cDNA末 端處理成能連接前述連接子一Y之狀態的步驟。 7 ·如申請專利範圍第5項所述之方法，其更包含將前述 連接子一 X— cDNA斷片連結物之cDNA末端處理成能連 接前述連接子一 Y之狀態的步驟。 102 200404891 8.如申請專利範圍第1、2、3項任一項所述之方法，其 更包含將鑑別表現基因用的cDNA幟加以分離的步驟。 9.如申請專利範圍第1、2、3項任一項所述之方法，其 更包含從被測試細胞的mRNA製備cDNA之步驟。

   1 0.如申請專利範圍第1、2、3項任一項所述之方法，其 更包含從被測試細胞的mRNA製備cDNA做為寡dT引子、 或固定相用固定化之寡dT引子之步驟。 1 1 .如申請專利範圍第1 0項所述之方法，其中該固定相的 固定化之寡dT引子係為凝膠珠或是磁性固定化之寡dT 引子。

   1 2 ·如申請專利範圍第1、2、3項任一項所述之方法，其 中該弟Π型限制酶擁有4個驗基對。 103 1 3 ·如申請專利範圍第1、2、3項任一項所述之方法，其 中該第Π型限制酶係選自下列限制酶所組成之族群中，包 括 Afal、Alul、Cful、CviRI、Dpnl、DEsaBC3I、HpyBl、 HpyCH4V、HpyF44III、Mltl、PlaAII、Rsal、Bfal、Csp6 I > CviA Π、CviQI、CviRlI、Fgol、HpyCH4 IV、Mael、 Mae Π、MthZI、Rmal、PpaA Π、Tsp32I、TaqI、TthHB8I、 200404891

   XspI、BspKT6I、BstKTI、HpyCH4I、AspMDI、Bce243 I、 Bfi57I、 BfuCI、B m e 1 2 I、B s c F I、B s p 6 71、B s p 1 0 5 I、 Bspl43I、Bsp2095I、BspAI、BspFI、BspJI、Bstl9II、BstEN Π、Btkn、CacI、Ccyl、Chal、Cpfl、CviAI、Dpn Π、Fatl、 FnuCI、FnuEI、HacI、Kzo9I、LlaAI、Mbol、Mgol、MkrAI、 N de Π、NIan、NmeCI、NphI、RalF40I、Sau3 AI、SauMI、 Sth3 68I、Chal、Hnl Π、Hsp92 Π 、Nlaffi、Tail、TscI 及 Tsp49I °

   1 4 ·如申請專利範圍第1、2、3項任一項所述之方法，其 中該第一種第n s型限制酶係選自下列限制酶所組成之族 群中，包括 Mmel、Acul、Bce83I、Bpml、BpuEI、Bsgl、 BspKT5I、Eco57MI、GsuI、BsmFI、BspLUllin、BstOZ616I、 StsI、BceAI、BstPZ418I、FokI、BcefI、AlwXl、Bbvl、 Bsp423I、BseKI、BseXI、Bsp423I、Bstl2I、Bst71I、BstVlI， RleAI、Aceffi、Bbr7I、Ecil、TspDTI、TspGWI、Tthlll Π、Hgal、BseMU、BseRI、BspST5I、Lwel、Phal、SfaNI、 Aarl、Acc36I、BfuAI、BspMI、Bvel、Sthl32I、SspD5I、 AsuHPI、HphI、Mb〇n、Ncul、ΜηΠ、Bbsl、BbvII、Bbsl、 Bbvl 6 Π、Bpil、BpuAI、Bsc9 11、BspBS3 11、BspIS4I、 BspTS514I、BstBS32I、BstTS5I、BstV2I、Bme585I、BscAI、 Bstl9I、BstFZ43 81、Faul、Smul、Bci VI、Bful 及 HpyA。 104 200404891

   1 5 ·如申請專利範圍第1、2、3項任一項所述之方法，其 中該第一種第Π型限制酶是係選自下列限制酶所組成之族 群中，包括 Mmel、Acul、Bce83I、Bpml、BpuEI、Bsgl、 BspKT5I、Eco57I、Eco57MI、Gsul、BsmFI、BspLUllH、 BstOZ616I、StsI、BceAI、BstPZ418I、FokI、BcefI、AlwXI、 Bbvl、Bsp423I、BseKI、BseXI、Bsp423I、Bstl2I、Bst71I、 BstV 11、Rle AI、Ace ΠΙ、B b r 71、E c i I、Ts p D TI、Ts p G W I、 Tthllin、Hgal、BseMII、及 BseR I。 1 6 ·如申請專利範圍第1、2、3項任一項所述之方法，其 中該第一種第Π S型限制酶是係選自下列限制酶所組成之 族群中，包括 MmeI、AcuI、Bce83I、BpmI、BpuEI、BsgI、 BspKT5I 、 Eco57I 及 Gsul 。

   1 7 ·如申請專利範圍第1、2、3項任一項所述之方法，其 中該第二種第Π S型限制酶是係選自下列限制酶所組成之 族群中，包括 Mmel、Mmel、Acul、Bce83I、Bpml、BpuEI、 Bsgl、BspKT5I、Eco57I、Eco57MI、Gsul、BsmFI、BspLUlll Π、BstOZ616I、StsI、BceAI、BstPZ41 81、FokI、BcefI、 AlwXI、Bbvl、BseKI、BseXI、Bsp423I、Bstl2I、Bst71I、 BstVlI、RleAI、AcelD、Bbr7I、Ecil、TspDTI、TsgG WI、 TthlllE、Hgal、BseMII、BseRI、BspST5I、Lwe 卜 Phal、 SfaNI、Aarl、Acc36I、BfuAI、BspMI、Bvel、Sthl32I、 105 200404891 SspD5I、AsuHPI、HphI、Mbo H、Ncul、Mnll、Bbsl、Bbv Π 、Bbsl、Bbv 1 6 Π 、Bpil、BpuAI、Bsc91I、BspBS31I、 BspIS4I、BspTS514I、BstBS32I、BstTS5I、BstV2I、 Bme5 8 5 I、BscAI、Bstl9I、BstFZ43 81、Faul、Smul Bci VI、Bful 及 HpyAV。 1 8.如申請專利範圍第1、2、3項任一項所述之方法，其 中該第二種第Π S型限制酶是係選自下列限制酶所組成之 族群中，包括 MmeI、AcuI、Bce83I、BpmI、BpuEI、BsgI、 B spKT5 I、Ec 〇 5 71、E c〇 5 7ΜI、G suI、B s m FI、Bs pL U 1 1 DI、 BstOZ616I、StsI、BceAI、BstPZ418I、FokI、BcefI、AlwXI、 Bbvl、BseKI、BseXI、Bsp4 23I、Bstl2I、Bst71I、BstVlI、 RleAI、Aceffi、Bbr7I、Ecil、TspDTI、TspGWI、Tthlll Π 、Hgal、BseMn 及 BseR I。 1 9.如申請專利範圍第1、2、3項任一項所述之方法，其 中該第二種第Π S型限制酶係選自下列限制酶所組成之族 群中，包括 Mmel、Acul、Bce83I、Bpml、BpuEl、Bsgl、 BspKT5I、Eco57I、Eco57MI 及 GSUI。 2 0.如申請專利範圍第1或3項任一項所述之方法，其中 該第三種第Π S型限制酶是係選自下列限制酶所組成之族 群中，包括 Mmel、Acul、Bce83I、Bpml、BpuEI、Bsgl、 200404891 BsoKT5I、Eco57I、Eco57MI、Gsul、BsmFI、BspLU 1 1 m、 BstOZ616I、StsI、BstPZ4 18I、FokI、AlwXI、Bbvl、BseKI、 BseXI、Bsp423I、Bstl2I、Bst71I、BstVlI、RleAI、Ace IH、Bbr7I、Ecil、TspDTI、TspGWI、Tthl 1 1 Π、Hgal、

   B seM Π、BseRI、BspST5I、Lwel、Phal、SfaNI、Aarl、 Acc36I、BfuAI、BspMI、Bvel、Sthl32I、SspD5I、AsuHPI、 HphI、Mb〇n、Ncul、Mnll、BbvII、Bbsl、Bvel6n、Bpil、 BpuAI、 BpuAI、 Bsc91I、 BspBS31I、 BspIS4I、 BspTS514I 、 BstBS32I、BstTS5I、BstV2I、Bme5 8 5 I、BscAI、Bstl9I、 BstFZ43 8I、Faul、Smul BciVI、Bful 及 Ilpy AV 卜

   2 1 .如申請專利範圍第1或3項任一項所述之方法，其中 該第三種第Π S型限制酶係選自下列限制酶所組成之族群 中，包括 Mmel、Acul、Bce83I、Bpml、BpuEI、Bsgl、 BspKT5I、Eco57I、Eco57MI、Gsul、BsmFI、BspLUlim、 BstOZ616I、StsI、BceAI、BstPZ418I、FokI、BcefI、AlwXI、 Bbvl、BseKI、BseXI、Bsp4231、Bstm、Bst7U、BstVli、 R1 e AI、A c e HI、B b r 71、E c i I、T s p D TI、T s p G WI、T t h 1 1 1 Π 、Hgal、BseMn 及 BseR I o 2 2.如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第三種第 Π S型限制酶係選自下列限制酶所組成之族群中，包括 Mmel、Acul、Bce83I、Bpml、BpuEI、Bsgl、Eco57I、Eco57MI 107 200404891 及 GsUI。 2 3 .如申請專利範圍第1、2或3項任一項所述之方法，其 中該鑑別表現基因用的cDNA幟之長度係6〜25鹼基對。 24.如申請專利範圍第1、2或3項任一項所述之方法，其 中該鑑別表現基因用的cDNA幟之長度係10〜25鹼基對。

   2 5 .如申請專利範圍第1、2或3項任一項所述之方法，其 中該鑑別表現基因用的cDNA幟之長度係1 0〜1 6鹼基對。 26. —種連接子一X，其係包含第一種第Π S限制酶及第 二種第Π S限制酶之結合序列。

   2 7.如申請專利第2 6項所述之一種連接子一 X，其係包含 含序列號碼7及8的鹼基。 2 8. —種連接子一X— cDNA斷片連結物，其係包含有第Π 型限制酶切斷的cDNA斷片、第一種第Π S型限制酶及第 二種第Π S型限制酶之結合序列的連接子一X。 29.如申請專利第28項所記載的連接子一X—cDNA斷片 連接物，其之切斷末端係已連接了含有第三種第Π S限制 108 200404891 酶結合序列之連接子一X— cDNA幟一連接子一Y連結 物0 3 0.如申請專利範圍第29項所述之連接子一 XcDNA幟一 連接子一 Y連結物，其係包含序列號碼1 9的鹼基序列及 其互補股。

   3 1. —種鑑別表現基因用cDNA幟基因庫，其係以如第1、 2或3項任一項所述之方法製備而得。 3 2. —種表現基因的解析方法，其特徵為將申請專利範圍 第3 1項之鑑別表現基因用cDNA幟基因庫與已固定宜檢 驗核酸的檢驗裝置接觸。

   3 3 ·如申請專利範圍第3 2項所述之一種表現基因的解析方 法，其中該檢驗裝置是宜檢驗一群核酸個別在其位置點的 DNA薄片。 3 4. —種表現基因的解析方法，其特徵為將含有宜鑑別之 一群核酸基因庫與已固定在檢驗裝置上之如申請專利範圍 第1、2或3項任一項所述之鑑別表現基因用cDNA幟接 觸的步驟。 109 200404891 3 5 .如申請專利範圍第3 4項所述之一種表現基因 法，其中該檢驗裝置是如申請專利範圍第1至3 所得的鑑別用c D N A幟個別在位置點的D N A薄> 3 6.如申請專利範圍第3 4項所述之一種表現基因 法，其更包含將如申請專利範圍第1至3項任一 法製備而得之鑑別表現基因用cDNA幟連結之步 該連結物的鹼基序列的步驟。 3 7.如申請專利範圍第3 6項所述之一種表現基H 方法，其中該連結物的鹼基含有3〜2 0 0個鑑別； 用幟。 3 8 ·如申請專利範圍第3 6項所述之一種表現基g 方法，其中該連結物的鹼基含有3〜8 0個鑑別表 幟。 3 9 ·如申請專利範圍第3 6項所述之一種表現基g 方法，其中該連結物的鹼基含有1 6〜4 0個鑑別；i 用幟。 的解析方 項任一項 r 〇 的解析方 項所述方 驟及決定 的解析 ί現基因 的解析 現基因用

   40.如申請專利範圍第37項所述之一種表現基1 解析方法，其中決定該連結物鹼基序列的步驟， 的解析 L現基因 的定性 從而可決 110 200404891 定各個cDNA幟的序列。 4 1。如申請專利範圍第3 7項所述之一種表現基因的定量 解析方法，其中決定該連結物鹼基序列的步驟，從而可決 定各個cDNA幟的序列。

   4 2.—種cDNA幟之連結物，其係以如申請專利範圍第1 至3項任一項所述方法製備而得，其中該cD N A幟連結物 之間並無間隔序列。 43.如申請專利範圍第42項所述之一種cDNA幟之連結 物，其係包含3〜200個cDNA幟。 44. 如申請專利範圍第42項所述之一種cDNA幟之連結 物，其係包含3〜80個cDNA幟。

   45. 如申請專利範圍第42項所述之一種cDNA幟之連結 物，其係包含有16〜40個cDNA幟。 4 6. —種cDNA幟之連結物，其係以如申請專利範圍第1 至3項任一項所述方法製備而得，其中該cDNA幟連結物 之間係有間隔序列。 ill 200404891 47.如申請專利範圍第46項所述之一種cDNA幟之連結 物，其係包含有3〜2 0 0個c D N A幟。 4 8.如申請專利範圍第46項所述之一種cDNA幟之連結 物，其係包含有3〜80個cDNA幟。

   49.如申請專利範圍第46項所述之一種cDNA幟之連結 物，其係包含有1 6〜4 0個c D N A幟。 5 0. —種製備鑑別表現基因c DN A幟的套組，其係包含第 Π型限制酶、第一種第Π S型限制酶、第二種第II S型 限制酶，第三種第Π S限制酶、第一種第Π S型限制酶之 結合序列，而且在與前述第Π型限制酶的切斷末端連結部 分，生成第二種第Π S型限制酶之結合序列的連接子一X 及含有第三種第Π S型限制酶結合序列的連接子一 Y。

   5 1 . —種製備鑑別表現基因cDNA幟的套組，其係包含有 第Π型限制酶、第一種第ns型限制酶、第二種第HS型 限制酶、第一種第Π S限制酶、第一種第Π S型限制酶結 合序列、第Π S型限制酶及含有第二種第Π S限制酶結合 序列的連接子一X，含有第一種第Π S型限制酶結合序列 的連接子一Y。 112 200404891 5 2. —種製備鑑別表現基因cDNA幟的套組，其係包含有 第Π型限制酶、第一種第ns型限制酶、第二種第ns型 限制酶、第一種第Π S限制酶、第一種第Π S型限制酶、 第Π S型限制酶及含有二所結合序列的連接子一 X，含有 第三種第Π S型限制酶所結合序列的連接子一Y。 5 3 .如申請專利範圍第5 0、5 1、5 2項任一項所述之套組， 其更包含連接子一X雜交引子一X、及連接子一Y雜交引 子一 Y 。

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