JP2004517602A - 複雑性の減少した核酸標的およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、プローブと、２つ以上の核酸分子を含む標的とを接触させ（ここで、その核酸分子は、恣意的にサンプリングしたものであり、そして恣意的にサンプリングした核酸分子は、核酸分子の集団における核酸分子のサブセットを含む）；そしてプローブに対する標的の特異的結合の量を検出することによって、標的における２つ以上の核酸分子のレベルを測定する方法を提供する。本発明はまた、プローブと、２つ以上の核酸分子を含む標的とを接触させ（ここで、その核酸分子は、統計学的にサンプリングしたものであり、そして統計学的にサンプリングした核酸分子は、核酸分子の集団における核酸分子のサブセットを含む）；そしてプローブに対する標的の特異的結合の量を検出することによって、標的における２つ以上の核酸分子のレベルを測定する方法を提供する。
Description
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＣＡ６８８２２、ＮＳ３３３７７、ＡＩ３４８２９、および国防総省によって授与された助成金番号ＢＣ９６１２９４の下で、政府の支持を得て行われた。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、一般には、標的における核酸分子を測定する方法に関し、より詳細には、差次的遺伝子発現を検出する方法に関する。
【０００３】
全ての生体は、遺伝物質であるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を必要とし、これは、生物に対して特徴的な独自の収集物を与える遺伝子を含む。ＤＮＡは、ヌクレオチド構築ブロックである２つの相補配列の鎖から構成される。この２つの鎖は、相補配列と結合し、またはそれとハイブリダイズして、二重らせんを形成する。遺伝子は、ＤＮＡの分別のある（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）セグメントであり、そして新たな生物を生じ、そしてその独自の特徴を生物に与えるために必要な情報を提供する。単純な生物（例えば、細菌）であっても、数千もの遺伝子を含み、そしてその数は、ヒトのような複雑な生物においては、何倍も多い。生体の発生および機能の複雑性の理解は、これらの遺伝子の知識を必要とする。
【０００４】
何年もの間、科学者は、生体の発生および機能において重要な多くの遺伝子を探索し、そして同定してきた。新たな遺伝子の探索は、遺伝情報の同定を目標としたプロジェクトに指向されていることに起因して、近年大いに加速されてきている。最終的な目的は、生物の全ゲノムの決定およびそのコードされた遺伝子の決定であり、ゲノム研究といわれている。これらのゲノムプロジェクトの最も大きな野望のうちの１つがヒトゲノムプロジェクトであり、全ヒトゲノムの配列決定が目的である。配列決定技術における最近の進歩は、ゲノム情報の急速な蓄積をもたらし、これは、公のデータベースおよび私有のデータベース両方において利用可能である。これらの新たに発見された遺伝子ならびにまもなく発見される遺伝子は、新たな薬物の開発のための潜在的な標的の豊富な供給源を提供する。
【０００５】
遺伝子発見の速度が急速であるにもかかわらず、これらの遺伝子を特徴付けすることおよびこれらの遺伝子の生物学的機能を決定することは、依然として侮りがたい仕事である。新たに発見された遺伝子の特徴付けは、しばしば、時間がかかり、手間のかかることであり、時折、特に複雑な高等生物においては、遺伝子またはその遺伝子産物の機能を決定するために数年を必要とする。
【０００６】
遺伝子とその遺伝子産物との間の複雑な相互作用が意図される場合、複雑性の別のレベルが生じる。どのように生物が機能するかを理解するために、どの遺伝子、その転写物およびその遺伝子産物が生物の機能において役割を果たすかを理解することが重要であるだけでなく、遺伝子、その転写物、またはその遺伝子産物と、他の遺伝子およびそれらの遺伝子産物との間の潜在的に複雑な相互作用を理解することもまた重要である。
【０００７】
生物の特定の細胞または組織における遺伝子発現を評価するために、多くのアプローチが使用されてきた。これらのアプローチは、種々の条件下で遺伝子発現を特徴づけるために使用されてきており、異なる条件下で発現における差異を調べることが挙げられる。しかし、これらの方法の大部分は、量が豊富な転写物を検出するためには有用であるが、特に、選択されたわずかな遺伝子よりむしろ、多くの遺伝子の発現を観察する場合、量が少ない転写物を検出するためにはあまり有用でないことが証明されている。低レベルで発現される遺伝子は、しばしば、細胞における生理学的経路を調節するので、量が少ない転写物を検出することが望ましい。
【０００８】
従って、所定の設定の条件下で遺伝子の発現パターンを特徴付け、そして量が少ない転写物を検出する方法が必要である。本発明は、この必要性を満たし、そして関連した利点もまた提供する。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、プローブと、２つ以上の核酸分子を含む標的とを接触させ（ここで、この核酸分子は、恣意的にサンプリングされ、そして恣意的にサンプリングされた核酸分子は、核酸分子の集団において核酸分子のサブセットを含む）；そしてプローブに対する標的の特異的結合の量を検出することによって標的における２つ以上の核酸分子のレベルを測定する方法を提供する。本発明はまた、プローブと、２つ以上の核酸分子を含む標的とを接触させ（ここで、核酸分子は、統計学的にサンプリングしたものであり、そして統計学的にサンプリングした核酸分子は、核酸分子の集団において核酸分子のサブセットを含む）；そしてプローブに対する標的の特異的結合の量を検出することによって、標的における２つ以上の核酸分子のレベルを測定する方法を提供する。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、標的中の２つ以上の核酸分子のレベルを、プローブを恣意的にサンプリングされた標的または統計学的にサンプリングされた標的と接触させること、およびプローブに対する特異的結合の量を検出することによって、測定するための方法を提供する。本発明はまた、標的中の２つ以上の核酸分子のレベルを測定し、そして発現レベルを第２の標的中の核酸分子の発現レベルと比較することによって、条件と関連する２つ以上の差次的に発現された核酸分子を同定する方法を提供する。本発明の方法は、所定のセットの条件の下で標的において発現された核酸分子のプロフィールを得るために有用である。本発明の方法は、２つ以上の標的間のあまり豊富ではない核酸分子の相対的な豊富さ（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を比較するために特に有用である。本発明の方法は、核酸分子の豊富さのプロフィールが決定され、そして所定のセットの条件と相関付けされるか、または別の標的と比較されて、元々の標的が特定のセットの条件に曝露されたか否かを決定し、それにより疾患の診断または処置を評価するために有用な情報を提供し得る点で有利である。
【００１１】
本発明は、標的中の２つ以上の核酸分子の豊富さを測定する方法を提供する。本発明の方法は、プローブを、２つ以上の核酸分子を含む標的と接触させる工程であって、ここで、この核酸分子は、恣意的にサンプリングされ、そしてここで、この恣意的にサンプリングされた核酸分子は、核酸分子の集団における核酸分子のサブセットを含む、工程；およびその標的がそのプローブに特異的に結合する量を検出する工程を包含する。
【００１２】
本明細書で使用される場合、用語「核酸分子」は、２つ以上のヌクレオチドの核酸をいう。核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。例えば、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含み得る。核酸分子はまた、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含み得る。核酸分子は、インビボまたはインビトロでのいずれかで酵素的に合成され得るか、あるいは、核酸分子は、当該分野で周知の方法によって化学的に合成され得る。核酸分子はまた、改変された塩基、例えば、ｔＲＮＡに見出される改変された塩基（例えば、イノシン、メチルイノシン、ジヒドロウリジン（ｄｉｈｙｒｏｕｒｉｄｉｎｅ）、リボチミジン、プソイドウリジン、メチルグアノシン、およびジメチルグアノシン）を含み得る。さらに、化学的に合成された核酸分子は、ヌクレオチド塩基の誘導体を取り込み得る。
【００１３】
本明細書で使用される場合、用語「核酸分子の集団」は、２つ以上の異なる核酸分子の群をいう。核酸分子の集団はまた、３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、１０００個以上、またはさらに１０，０００個以上の異なる核酸分子であり得る。核酸分子は、例えば、単一ヌクレオチドにより、または単一塩基の改変により、異なり得る。一般に、核酸分子の集団は、標的サンプル（例えば、細胞、組織、または生物）から得られる。このような場合、核酸分子の集団は、標的サンプルの核酸分子を含有する。
【００１４】
核酸分子の集団は、核酸分子の１つの集団を別の集団から区別し得る特徴を有する。これらの特徴は、その集団を含む個々の核酸分子の数および性質に基づく。このような特徴には、例えば、その集団中の核酸分子の豊富さが含まれる。個々の核酸分子の豊富さは、所定の標的サンプル中の絶対量であり得るか、または標的サンプル中の他の核酸分子に対する量であり得る。標的から得られる核酸分子の集団において、個々の核酸分子は、そのサンプル標的中の他の核酸分子と比較して、より豊富であるかもしれないし、またはあまり豊富でないかもしれない。あまり豊富でない配列もまた、２つのサンプル間の相対的な豊富さであり得る。
【００１５】
本明細書で使用される場合、あまり豊富ではない核酸分子は、例えば、集団の中の最も豊富な核酸分子の約１０％未満の量であり得る。よりあまり豊富ではない核酸分子はまた、集団中の最も豊富な核酸分子の、約１％未満、約０．１％未満、または約０．０１％未満の量であり得る。例えば、あまり豊富ではない核酸分子は、１細胞当たり約１０コピー未満、または１細胞当たり１コピー程の少なさであり得る。
【００１６】
核酸分子の集団の別の特徴は、その集団の複雑性である。本明細書で使用される場合、「複雑性」は、その集団中の異なる配列を有する核酸分子の数をいう。例えば、細菌細胞中のｍＲＮＡの代表的な核酸分子の集団は、真核生物の細胞、組織、または生物中のｍＲＮＡの代表的な核酸分子の集団よりも低い複雑性を有する。なぜなら、より小さい数の遺伝子が、真核生物の細胞、組織、または生物と比較して、細菌細胞中で発現されるからである。
【００１７】
核酸分子の集団はまた、その集団中の個々の核酸分子の特性によって特徴づけられ得る。例えば、個々の核酸分子の長さは、核酸分子の集団の特徴に寄与する。同様に、集団中の個々の核酸分子の配列は、核酸分子の集団の特徴、例えば、核酸配列のＧ＋Ｃ含量および鎖内ハイブリダイゼーションを行い得るヌクレオチド配列の相補ストレッチに起因して形成され得る任意の二次構造に寄与する。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「核酸のサブセット」は、核酸分子のセットの全てよりも少ないことを意味する。例えば、標的サンプル集団の核酸分子のサブセットは、標的サンプル集団中の核酸分子の全てよりも少ない。核酸分子のサブセットから特に除外されるのは、サンプル標的中、例えば、総ｃＤＮＡまたは総ｍＲＮＡを使用して作製される標的中の全ての核酸分子の代表的な核酸分子の群である。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「標的」は、プローブが結合することが所望される１つ以上の核酸分子をいう。標的は、プローブに結合した場合に検出可能である。本発明の標的は、一般に、２つ以上の異なる核酸分子を含む。標的は、細胞、組織、または生物からの核酸分子の集団に由来し得る。標的はまた、３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１０００個以上、２０００個以上、５０００個以上、または１０，０００個以上の異なる核酸分子でさえ含み得る。標的は、それに結合する検出可能な部分、例えば、放射標識、蛍光標識、または検出可能な任意の標識を有し得る。標的が、例えば、放射標識によって標識される場合、その標的は、他の核酸分子を「プローブするため」またはそれとハイブリダイズするために使用され得る。標的を作製する方法は、本明細書に開示される。
【００２０】
標的のプローブに対する結合を、その標的に結合した検出可能な部分を必要とせずに直接測定する検出方法がまた、使用され得る。このような場合、核酸分子は、例えば、検出可能な部分を結合することによる標的の核酸分子の改変なしに、直接的に検出可能である。検出可能な部分なしに標的を使用するこのような検出方法の例は、質量分析を使用して標的に結合する検出である。結合された検出可能な部分を含まない核酸分子を含有する標的を使用する方法の別の例は、標的を、検出可能な部分を有する分子を含有するプローブに結合することである。このような場合、標的の、検出可能な部分を有する分子を含有するプローブへの結合は、検出され、そしてそのようにしてその標的は、プローブに結合した場合に検出可能である。１つの例は、プローブの結合が、蛍光消光剤からの蛍光タグの分離を引き起こす「分子ビーコン」である。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「特異的結合」は、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に、結合活性を有さない類似の構造を有する分子であるコントロール分子の結合と比較した場合の分子の結合を決定することによって、測定され得る。例えば、標的の、プローブへの特異的結合は、その標的の結合を、その標的に含まれない結合コントロール核酸と比較することによって決定され得る。特異的結合はまた、標的（例えば、過剰の非標識標的）と類似するコントロール分子との競合によって決定され得る。この場合、特異的結合は、標識された標的の、プローブへの結合が、過剰の非標識標的によって競合的に阻害される場合、示される。
【００２２】
本明細書中で使用される用語「特異的結合」には、低親和性特異的結合および高親和性特異的結合の両方が含まれる。特異的結合は、例えば、少なくとも約１０−４ＭのＫｄを有する低親和性分子によって示され得る。特異的結合はまた、高親和性分子、例えば、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、少なくとも約１０−１０ＭのＫｄを有する分子によって示され得るか、あるいは、少なくとも約１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ以上のＫｄを有し得る。
【００２３】
核酸分子のアレイを含むプローブの場合、プローブの特異的核酸分子の別の核酸分子への結合はまた、ハイブリダイズまたはハイブリダイゼーションとして知られている。本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイズ」または「ハイブリダイゼーション」は、核酸分子の２つの鎖の、配列依存性の様式で水素結合する能力をいう。適切な条件下で、相補的ヌクレオチド配列は、二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの二本鎖ハイブリッドを形成するようにハイブリダイズし得る。類似するが、同一ではない配列を有する核酸分子もまた、適切な条件下でハイブリダイズし得る。
【００２４】
本明細書で使用されるように、用語「プローブ」は、標的の結合が所望される２つ以上の分子の集団をいう。プローブの分子には、核酸分子、オリゴヌクレオチド、およびポリペプチド核酸分子が含まれる。プローブは、さらに、分子のアレイであり得る。
【００２５】
一般に、プローブは、固体支持体上に固定された分子から構成され、そしてその標的は、溶液中にある。しかし、標的は、固体支持体に結合し得、そしてプローブは、溶液中にあり得ることが理解される。さらに、プローブおよび標的の両方が溶液中にあり得る。プローブおよび標的が、互いに結合し得る限り、プローブおよび標的の構成は、溶液中にあり得るか、または固体支持体に結合されることが理解され得る。固体支持体に結合した場合、結合したプローブまたは標的が、固体支持体を溶液中のプローブまたは標的に接触させる工程、および、固体支持体の洗浄の工程の条件下で結合したままである限り、プローブまたは標的の、支持体への結合は、共有結合または非共有結合であり得る。そのプローブおよび標的がハイブリダイズするか、さもなければ特異的に相互作用する場合、固体支持体に結合したそのプローブまたは標的は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の工程の間、結合したままである。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「サンプリングされた」または「サンプリングする」が、核酸分子に関して使用される場合、特異的結合が検出され得る核酸分子をいう。別の分子をサンプリングする核酸分子は、その分子に特異的に結合し得、そして検出され得る。例えば、プローブは、標的における分子に検出可能に結合し得ることによって、標的における分子をサンプリングし得る。それゆえ、プローブにおける核酸分子が特異的に結合する標的における分子は、サンプリングされる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「恣意的にサンプリングされた」または「恣意的にサンプリングされた核酸分子」は、分子が結合する特定の部位に基づいてサンプリングすることなしに、その配列に基づいて結合することによって、核酸分子がサンプリングされることを意味する。核酸分子の集団から恣意的にサンプリングされた核酸分子を含む標的を作製する場合、その標的は、その集団中の核酸分子の配列を予め参照することなしに、作製される。従って、その集団を恣意的にサンプリングするために、その集団中の核酸分子のヌクレオチド配列の予備知識を有する必要がない。集団中の核酸分子のヌクレオチド配列の知識は、そのヌクレオチド配列が、その集団をサンプリングする前に参照されない限り、その集団を恣意的にサンプリングする能力を阻害しないことは理解される。恣意的にサンプリングされた核酸分子を含有するプローブを作製するための方法は、本明細書中に開示される（以下および実施例Ｉ〜ＩＩＩを参照のこと）。
【００２８】
恣意的にサンプリングされた核酸分子を含有する恣意的にサンプリングされたプローブは、１つ以上の恣意的なオリゴヌクレオチドを使用して作製され得る。本明細書で使用される場合、用語「恣意的なオリゴヌクレオチド」は、そのオリゴヌクレオチドが、無作為に選択された配列であり、そして任意の公知の配列に対するその相補性に基づいて選択された配列ではないことを意味する。そのため、恣意的なオリゴヌクレオチドは、核酸分子の集団を恣意的にサンプリングするために使用され得る。
【００２９】
恣意的にサンプリングされる核酸分子は、その配列に基づいてサンプリングされ、そして所定の配列への結合に基づいていない。例えば、恣意的なオリゴヌクレオチドは、恣意的な配列を有するオリゴヌクレオチドであり、そしてそのため、所定の核酸分子に結合する。なぜなら、恣意的なオリゴヌクレオチドの相補配列は、核酸分子において偶然に生じるからである。オリゴヌクレオチドは、相補配列の存在に基づいて核酸分子に結合し得るので、核酸分子のサンプリングは、その配列に基づいている。しかし、集団中の任意の特定の核酸分子への恣意的なオリゴヌクレオチドの結合は、例えば、恣意的なオリゴヌクレオチドの配列を公知の核酸配列と比較し、そしてそのオリゴヌクレオチドを以前に公知の核酸配列に基づいて選択することによって、オリゴヌクレオチドの結合の前に決定されない。恣意的なオリゴヌクレオチドの、増幅のためのプライマーとしての使用は、当該分野で周知である（ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７−９７１（１９９２））。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２つ、そして約１００ヌクレオチドより少ない核酸分子をいう。オリゴヌクレオチドは、例えば、少なくとも約５ヌクレオチドでありそして約１００ヌクレオチド未満、例えば、約５０ヌクレオチド未満であり得る。
【００３１】
本発明はまた、標的における２つ以上の核酸分子のレベルを、プローブを、２つ以上の核酸分子を包含する標的と接触させることによって測定する方法であって、ここで、核酸分子は、統計学的にサンプリングされ、そしてここで、その統計学的にサンプリングされた核酸分子は、核酸分子の集団における核酸分子のサブセットを含み；そしてその標的がそのプローブに特異的に結合する量を検出する、方法を提供する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「統計学的にサンプリングされた核酸分子」は、核酸配列が、そのヌクレオチド配列を予め参照して、２つ以上の核酸分子においてヌクレオチド配列の統計学的な発生率を予め決定することによって、その配列に基づいてサンプリングされることを意味する。従って、統計学的にサンプリングされた核酸分子を得るために、集団における少なくとも２つの核酸分子のヌクレオチド配列の予備的な知識を有することが必要である。
【００３３】
統計学的にサンプリングされた核酸分子は、そのヌクレオチド配列を予め参照して、しかし、そのヌクレオチド配列の所定の部分を予め参照せずに、核酸分子の配列に基づいてサンプリングされる。オリゴヌクレオチドの群は、ヌクレオチド配列の所定の部分を予め参照することなしに、例えば、恣意的なオリゴヌクレオチドの群を決定することによって同定され得る。次いで、恣意的なオリゴヌクレオチドは、どの恣意的プライマーが公知のヌクレオチド配列にマッチするかを決定することによって、公知のヌクレオチド配列に参照され得る。公知のヌクレオチド配列に参照されるこのような恣意的なオリゴヌクレオチドは、公知の配列に基づいて選択され、従って、統計学的なプライマーになる。この方法は、公知のヌクレオチド配列の所定の部位が同定され、そしてオリゴヌクレオチドが、その所定の部位にマッチするように特異的に設計される方法とは対照的である。
【００３４】
統計学的サンプリングは、有利である。なぜなら、オリゴヌクレオチドのセットが、そのオリゴヌクレオチドに相補的な配列の公知の配列の群中の存在に基づいて決定され得るからである。そのオリゴヌクレオチドは、さらに、複雑性結合に基づいてランクされ得る。複雑性結合は、所定のオリゴヌクレオチドが、１つより多い核酸分子に結合することを意味する。オリゴヌクレオチドが結合し得る分子の数が多いほど、「複雑性結合」はより高くなる。統計学的選択は、オリゴヌクレオチドが結合する配列の数に基づいて、オリゴヌクレオチドをランク付けし、そして最多数に結合するものを選択することによって、複雑性結合を増強するために使用され得る（例えば、ＷＯ９９／１１８２３を参照のこと）。統計学的サンプリングは、例えば、オリゴヌクレオチドの５以上の核酸分子への結合に基づき得、そして１０以上、５０以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、またはさらに１０，０００以上の核酸分子への結合に基づき得る。
【００３５】
さらに、統計学的サンプリングは、所定のオリゴヌクレオチドについての最高複雑度の結合について、例えば、平均数を超える核酸分子に相補的な平均を超える順位オリゴヌクレオチドを選択することによって増強し得る。このオリゴヌクレオチドは、任意の範囲の複雑性結合、例えば最高順位の複雑性結合の上から１０％、最高順位の複雑性結合の上から２０％、または最高順位の複雑性結合の上から５０％について選択され得る。
【００３６】
さらに、統計学的選択を使用して、所望ではないヌクレオチド配列（関連核酸分子のファミリーの保存配列を含む）を排除し得る（ＷＯ９９／１１８２３）。統計学的オリゴヌクレオチドは、約５ヌクレオチド長から約１０００ヌクレオチド長、例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２５、３０または５０ヌクレオチド長であり得る。１セットの系統学的プライマーは、縮合塩基（例えば、任意の所定の位置で１つを超えるヌクレオチド）を含み得る。
【００３７】
ヌクレオチド配列の予め選択した部分を使用して得られたサンプリングした核酸分子は、用語「統計学的にサンプリングした核酸分子」の意味から、具体的に排除される。例えば、公知のヌクレオチド配列の一部が同定され、同定された部分が一致するオリゴヌクレオチドを生成して核酸分子をサンプリングする場合、このようなサンプリングされた核酸分子は、統計学的にサンプリングされた分子ではない。しかし、オリゴヌクレオチドの群が最初に同定され、次いで核酸分子の集団の２つ以上の公知のヌクレオチド配列と比較されて、公知のヌクレオチド配列中に統計学的に存在するオリゴヌクレオチドまたは公知のヌクレオチド配列に類似のオリゴヌクレオチドを決定する場合、このような統計学的に同定したオリゴヌクレオチドを使用して、統計学的にサンプリングした核酸分子を入手し得る。統計学的にサンプリングした核酸分子を含む標的を生成するための方法が本明細書中に開示される。
【００３８】
統計学的にサンプリングされた核酸分子を含む統計学的にサンプリングされた標的は、１つ以上の統計学的オリゴヌクレオチドを使用して生成され得る。本明細書中で使用されるように、用語「統計学的オリゴヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドが、１つを超える公知の核酸分子における相補性のその統計学的出現に基づいて選択される配列であることを意味する。このように、統計学的オリゴヌクレオチドを使用して、核酸分子の集団を統計学的にサンプリングし得る。
【００３９】
本発明の方法は、標的のプローブに対する特異的結合を検出する。標的は、例えば、核酸分子を増幅することによって生成され得る。本明細書中で使用される場合、用語「増幅した標的」は、核酸分子を酵素的にコピーして核酸分子の集団中の核酸分子の１つを超えるコピーを生成することによって生成された標的をいう。増幅した核酸標的は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅方法を用いて生成され得る。標的サンプルが由来する標的サンプル中の各核酸分子の単一コピーを有する標的（これは、もともとの集団と同一の豊富さおよび複雑性を有する）は、増幅した標的とはみなさない。増幅した標的は、例えば、プローブによってサンプリングされた核酸分子が標的中で限定量である場合に有用であり得る。サンプリングされそして非常に低量で存在する核酸分子は、プローブ中の核酸分子を増幅せずかつその質量を増加させずには検出が困難である。しかし、限定された複雑性の標的（ここでは、異なる分子の複雑性または数が限定される）は増幅する必要はない。
【００４０】
増幅した標的を生成するための他の方法としては、例えば、以下が挙げられる：リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）；自立配列複製（３ＳＲ）；βレプリカーゼ反応（例えば、Ｑ−βレプリカーゼを使用する）；ファージ末端結合タンパク質反応；鎖置換増幅（ＳＤＡ）；核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）；交叉ハイブリダイゼーションによる協同性増幅（ＣＡＴＣＨ）；ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）およｇびＡＦＬＰ（Ｔｒｉｐｐｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒａｌ．Ｈｅｐａｔ．３：２６７（１９９６）；Ｈｏｆｌｅｒら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３：５７７（１９９５）；Ｔｙａｇｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５３９５（１９９６）；Ｂｌａｎｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１２１９８（１９９４）；Ｓｐｅａｒｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：１３０（１９９７）；Ｓｐａｒｇｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ １０：２４７（１９９６）；Ｇｏｂｂｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６６：２９３（１９９７）；Ｕｙｔｔｅｎｄａｅｌｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：１３（１９９７；およびＬｅｏｎｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６６：１９（１９９７）；Ｅｌｌｉｎｇｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：７２９−７４１（１９９８）；Ｅｈｒｉｃｈｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｓｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４６９７−４６９９（１９９７）；Ｅｈｒｉｃｈｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４３：３５８−３６４（１９９７）；Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２（１９９８））。
【００４１】
本発明の方法は、標的中の２つ以上の核酸分子のレベルを測定するのに有用である。本発明の方法はまた、２つの標的間の発現レベルを比較するために使用され得る。詳細には、本発明の方法は、核酸分子の差次的発現を測定するのに有用である（以下を参照のこと）。
【００４２】
全標的（標的調製のためにｍＲＮＡ集団の完全複雑性を使用する）は、細胞中の上位の数百または数千のｍＲＮＡを容易に試験し得る（Ｐｉｅｔｕら、Ｇｅｎｅｏｍｅ Ｒｅｓ．６：４９２−５０３（１９９６））。しかし、哺乳動物細胞由来の全標識化ｃＤＮＡ標的は、代表的には、１億を超える塩基の複雑性を有し、この塩基は、差次的ハイブリダイゼーションを使用して稀なｍＲＮＡ間の差次的発現を検出する試みを複雑にする。蛍光および共焦点顕微鏡の使用における近年の利点は、差次的ハイブリダイゼーション法の感度およびダイナミックレンジにおいて改良を導く（１０，０００倍の検出のダイナミックレンジおよび１／５００，０００をアプローチする感度での転写物の検出）（ＭａｒｓｈａｌｌおよびＨｏｄｇｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２７−３１（１９９８）；Ｒａｍｓａｙ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４０−４４（１９９８）。感度の改良にもかかわらず、全標的を使用する方法は、サンプル中のより豊富なｍＲＮＡにむけて偏向したままである。
【００４３】
差次的スクリーニングのための標準的な方法（これは、代表的には、全メッセージの逆転写物由来の標的およびオートラジオグラフィーまたはホスホルイメージングを使用する）を使用して、差次的発現を検出し得る（Ｐｉｅｔｕ、前出、１９９６）。しかし、この方法は、最も豊富なメッセージに限定される。豊富な転写物のみが、おそらく１／１５，０００の感度を有する有効標的を生じるに十分に高度に提示される（Ｂｏｌｌ，Ｇｅｎｅ ５０：４１−５３（１９８６））。本明細書中で議論されるように、差次的スクリーニングは、標的の複雑性を減少しそして標的中の稀な核酸分子の量を統計学的に増加することによって、非常に改良され得る。標的中のあまり豊富でない核酸の量を増大させることによって、差次的スクリーニングは、全標的を使用して観察されるように、最も豊富な核酸分子のみに限定される。
【００４４】
標的の複雑性を減少することによって、供給源中の全てのｍＲＮＡ種を同定する能力は、同時に、改良された動力学および改良されたシグナル対ノイズ比が犠牲にされる。複雑性減少方法は、集団において核酸分子のサブセットを有する標的を生成する。この集団は、いくつかの稀なｍＲＮＡを標的の最終質量に有意に寄与させることが可能であり、それにより供給源中の稀なｍＲＮＡ間の差次的遺伝子発現を観察する能力を増強する。各ｍＲＮＡの部分のみまたはｍＲＮＡ集団のサブセットのみについて確実に濃縮する産物の混合物を生成する任意の方法は、減少した複雑性の標的を生成するのに有用である。
【００４５】
２つの基本的に異なる型の複雑性減少方法が存在し、これらの方法は、サンプリングするｍＲＮＡ間の相対的化学量論を維持する方法および化学量論を維持しない方法である。あるクラスの方法は、ｍＲＮＡ集団のサブセットを提示する核酸を生じ、そして入力ＲＮＡのおおよその化学量論を維持する。このような方法は、最も増幅した制限フラグメント長多型性（ＡＦＬＰ）、およびｍＲＮＡの３’末端または内部フラグメントをサンプリングする制限ストラテジーによって例示される（Ｈａｂｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３４：５１６−５２１（１９９７）；Ｍｏｎｅｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：２６１６−２６１７（１９９６）；Ｂａｃｈｅｍら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．９：７４５−７５３（１９９６））。別の例は、ｃＤＮＡ標的を生成するためのサイズ分画したｍＲＮＡの使用である。ｍＲＮＡの全て（例えば、２．０〜２．１ｋｂの範囲）は、減少した複雑性の標的として使用され得る。これらのｍＲＮＡ間の化学量論が、標的において大部分は保存される（Ｄｉｔｔｍｅｒら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．２１：３８３−３９１（１９９７））。
【００４６】
減少した複雑性の標的を生成するための方法の第２のクラスは、開始ｍＲＮＡの化学量論を保存しないが、標的が作製される標的サンプルの間の個々のＲＮＡ間の差異は保存する。化学量論を維持しない減少した複雑性の標的を生成する１つの方法は、再提示差異分析または抑制減算ハイブリダイゼーションに基づく特定の方法において減算された標的を使用することである。（これは、チップと比較可能な稀なメッセージについての感度を示した（Ｒｈｙｎｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１６：１６７−１８１（１９８６）；Ｌｉｓｉｔｓｙｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９４６−９５１（１９９３）；ＬｉｓｉｔｓｙｎおよびＷｉｇｌｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５４：２９１−３０４（１９９５）；Ｊｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１０８４−１０８６（１９９７））。
【００４７】
化学量論を維持しない減少した複雑性の標的を生成するための特に有用な方法は、恣意的にサンプリングされた標的または統計学的にサンプリングされた標的を使用することによって例示される。恣意的にサンプリングされた標的および統計学的にサンプリングされた方法を使用する方法は、本明細書中に開示される。恣意的にサンプリングされた標的または統計学的にサンプリングされた標的を使用する方法は、標的中のあまり豊富ではない核酸分子の検出を可能にする。本発明の方法は、有利である。なぜなら、その方法は、標的中のあまり豊富でない核酸分子を検出する能力を増強し、そしてまた限定された量の核酸分子に由来する標的（例えば、いくつかの細胞または単一の細胞さえ）中の核酸分子の検出を可能にする。
【００４８】
恣意的にサンプリングされた標的または統計学的にサンプリングされた標的は、例えば、増幅によって生成され得る。増幅された標的が、恣意的オリゴヌクレオチドまたは統計学的オリゴヌクレオチドを使用して生成される場合、増幅された産物は、各標的核酸分子の開始時の豊富さおよびサンプリングされる標的核酸分子に対するオリゴヌクレオチドのマッチの質の両方の機能を反映する。従って、増幅した産物の最終混合物は、使用されるオリゴヌクレオチドとの良好なマッチを有しそして最初のプライミング事象後の優先的な「増幅能力（ａｍｐｌｉｆｉａｂｉｌｉｔｙ）」を有するあまり豊富ではない核酸分子に由来する、非常に豊富な増幅した産物を含み得る。増幅能力は、二次構造および産物サイズのような効果を含む。
【００４９】
恣意的オリゴヌクレオチドまたは統計学的オリゴヌクレオチドを使用する増幅した標的を生成する結果は、２つの異なる標的中の同じ核酸分子が、プライム能力（ｐｒｉｍａｂｉｌｉｔｙ）および増幅能力の同一の組み合わせを経験し、その結果、特定のｍＲＮＡの豊富さにおける変化は、たとえ１つの標的内の異なる核酸分子の間の相対的な豊富さが顕著に変化しても、維持される。このことは、あまり豊富でない核酸分子は、標的中のあまり豊富でない核酸分子として存在する化学量論を維持する方法とは対照的である。
【００５０】
増幅された標的を生成する場合、一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーにおける特定の制約は存在しない。オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、少なくともいくつかのＣまたはＧ塩基を含む。オリゴヌクレオチドプライマーはまた、好ましくは、プライマー二量体を回避するために、この反応においてそれ自身と相補的な３’末端または他のプライマーを含まない。オリゴヌクレオチドプライマーはまた、好ましくは、異なる配列を有するように選択され、その結果、ｍＲＮＡの同じ部分は異なるフィンガープリントにおいては増幅されない。
【００５１】
本明細書中に開示されるように、恣意的にサンプリングされた標的または統計学的にサンプリングされた標的を生成する方法は、核酸分子を含む標的サンプルを「フィンガープリント」するために伝統的に使用されている方法に基づき得る。フィンガープリントは、標的サンプル中の核酸分子の発現に特徴的である。恣意的にサンプリングされた標的を生成するために、使用され得る１つの方法は、ＲＮＡ恣意的プライムＰＣＲ（ＲＡＰ−ＰＣＲ）に基づく（実施例ＩおよびＩＩを参照のこと；Ｗｅｌｓｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：７２１３−７２１８（１９９０）；Ｗｅｌｓｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：４９６５−４９７０（１９９２）；ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７−９７１（１９９２））。
【００５２】
ＲＡＰ−ＰＣＲにおいて、プライマーとのマッチの豊富さおよび程度の両方は、任意の特定の産物の蔓延に寄与する。従って、図らずもプライマーとの優れたマッチを有しかつ効率的に増幅される稀なｍＲＮＡは、より豊富なＲＡＰ−ＰＣＲ産物で見出され、これは、非化学量論的なＲＡＰ−ＰＣＲによって生成される標的を作製する。このことは、ＲＡＰ−ＰＣＲの非常に有用な特性である。なぜなら、他の方法を使用してはサンプリングするのが困難であるｍＲＮＡのサンプリングを可能にするからである。
【００５３】
代表的なＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントにおいて、１レーンあたり約５０〜１００のｃＤＮＡフラグメントは、ポリアクリルアミドゲル上で可視であり、これは図らずも恣意プライマーとの最良のマッチの１つを有する比較的稀なｍＲＮＡからの産物を含む。１００のｃＤＮＡクローンのみが各標的によってアレイ中で検出され得る場合、次いで、アレイへのハイブリダイゼーションは非能率的である。しかし、ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントは、稀すぎてポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーによって視覚化できない多くの産物を含む。にもかかわらず、これらの稀な産物は再生性であり、そして高特異活性で標識される場合のアレイについての標的として作用するに十分豊富である。
【００５４】
本明細書中で開示されるように、ＲＡＰ−ＰＣＲに由来する単一の標的は、約１８，０００ＥＳＴクローンを含むアレイにおいて約１０００のｃＤＮＡを検出し得、これは、変性ポリアクリルアミドゲルにおいて提示されるフィンガープリントの性能を１０〜２０倍超える改良である。さらに、差次的に調節された遺伝子はｃＤＮＡアレイ上で検出され、転写物を提示するクローンはすぐに利用可能であり、そしてしばしば、このクローンについて配列情報もまた利用可能である。さらに、このクローンは、通常、通常のＲＡＰ−ＰＣＲ産物より非常に長い。対照的に、ＲＮＡフィンガープリンティングに対する標準的なアプローチは、差次的発現が行われる検証の前に、産物のゲル精製および配列決定が実行され得ることが必要である。本明細書中に開示されるように、標準的な変性ポリアクリルアミドゲルおよびオートラジオグラフィー法の検出能力未満である差次的に増幅されたＲＡＰ−ＰＣＲ産物は、ｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーションを使用して検出され得る。
【００５５】
ＲＡＰ−ＰＣＲによって生成される恣意的にサンプリングされた標的は、標的サンプル中で上位の数千の最高に発現された核酸分子をサンプリングし得、そして集団中の核酸分子の異なるサブセットをサンプリングし得、これは、増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーに依存する。標的中の稀な核酸分子のいくつかは、コロニーのアレイ上で容易に検出されるように十分提示される（実施例ＩおよびＩＩを参照のこと）。
【００５６】
恣意的にサンプリングされた標的をＲＡＰ−ＰＣＲを用いて生成するために、ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントは、標的サンプル中の核酸分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ）の恣意プライム逆転写およびＰＣＲによって作製される（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９７））。あるいは、第１鎖ｃＤＮＡは、オリゴｄＴまたはランダムの短いオリゴマーでプライムされ得、続いて恣意的にプライムされ得る。このようなＲＡＰ−ＰＣＲ「フィンガープリント」のゲル電気泳動による分析は、約１００の転写物の恣意的サンプルの相対的な豊富さを示す複合体フィンガープリントを明らかにする（実施例ＩＩを参照のこと）
本明細書中に開示されるように、ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントは、ナイロンメンブレン上にＥ．ｃｏｌｉコロニーとして配列されたヒトｃＤＮＡをプローブするかまたはハイブリダイズするように標的に変換された（実施例ＩＩ）。各アレイは、ゲノムおよびそれらの発現の組み込まれた分子の分析（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．）協会からの１８，４３２のｃＤＮＡクローンを含んでいた。約１０００のｃＤＮＡクローンへのハイブリダイゼーションは、ＲＡＰ−ＰＣＲによって生成された恣意的にサンプリングされた標的の各々を用いて検出された。異なるＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントは、互いにまたは全ｃＤＮＡ標的からのハイブリダイゼーションパターンとの非常にわずか重複（＜３％）を有するハイブリダイゼーションパターンを生じた。結果として、ＲＡＰ−ＰＣＲ標的の反復増幅は、メッセージ集団のより大きな機能が、放射性標識した全ｃＤＮＡ標的を用いて達成され得るよりもこの型のアレイ上でスクリーニングされるのを可能にする。
【００５７】
恣意的にサンプリングされた標的は、ＥＧＦで処理されたＨａＣａＴケラチノサイトから生成された。２つのＲＡＰ−ＰＣＲ標的は、２０００のクローンにハイブリダイズし、ここから、差次的に発現された２２の候補体遺伝子が観察された（実施例ＩＩ）。差次的発現は、これらのクローンのうちの１５個についてＲＴ−ＰＣＲを用いて試験され、そのうち１３個が確認された。ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを分析するためのこのｃＤＮＡアレイの使用は、ＲＡＰ−ＰＣＲまたはディファレンシャルディスプレイに対する従来の変性ポリアクリルアミドゲルアプローチの検出において１０〜２０倍超えて増加した。スループットは、アレイの使用によって提供されるクローニングおよび配列決定における減少により大いに改良される。また、同じ遺伝子、または目的の系において調節されることがすでに公知の遺伝子のクローニングおよび配列決定の反復は、最小化される。
【００５８】
恣意的にサンプリングされた標的を生成するためのＲＡＰ−ＰＣＲの使用は、特に有用である。なぜなら、差次的に調節される遺伝子の非常に高スループットの発見を可能にするからである（実施例ＩＩおよびＩＩＩを参照のこと）。この方法を用いるスループットは、約２０倍早い。本質的には、一旦ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントが生成されていると、ゲル電気泳動による産物の分析に関わらず、ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントは、核酸分子にプローブするかまたはハイブリダイズする標的として使用される。ＲＡＰ−ＰＣＲによって生成される、このような恣意的にサンプリングされた標的は、アレイのための標的として特に有用である。
【００５９】
ＲＡＰ−ＰＣＲ反応のパラメーターは、例えば、標的の複雑性を至適化し、そして複雑性結合を増強するために変動され得る。例えば、この複雑性を増大させるために、ＴａｑポリメラーゼＳｔｏｆｆｅｌフラグメント（これは、ＡＭＰＬＩＴＡＱよりも、無差別的である）が、増幅のために使用され得る。本明細書中で使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（実施例ＩＩ）は、１０塩基または１１塩基の長さであり、そして縮重されておらず、各位置に単一の塩基を有した。同じ温度で使用される、より長いオリゴヌクレオチドプライマーは、いくつかの縮重を有するプライマーで提供されるような、より複雑性の産物を提供し得る。しかし、標的の複雑性が高くなるにつれて、全体のｍＲＮＡ標的をより密接に類似させ、これは、非化学量論的サンプリングの利点を喪失させる。ＲＡＰ−ＰＣＲパラメーターをさらに変動させるために、オリゴヌクレオチドプライマー長、縮重、および３’付着が、逆転写反応およびＰＣＲ反応において変動され得る。種々の異なるポリメラーゼもまた、使用され得る。
【００６０】
ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントは、以下に記載されるように、放射性同位元素標識され得るか、または蛍光色素を用いて標識され得、そして高密度アレイ（例えば、ｃＤＮＡクローンのアレイ）に対して探索するための標的として使用され得る。２つの標的間の核酸分子レベルにおける差異は、例えば、ｍＲＮＡ転写レベルにおける差異（これは、通常、遺伝子発現レベルにおける差異を反映する）を示し得る。発現における差異はまた、分解または翻訳後プロセシングを反映し得る。恣意的にサンプリングされた標的を使用することによって、各標的は、メッセージ集団の全体の複雑性のおよそ１０％の検出を可能にすると見積もられる。そして最も重要なことに、この１０％は、稀なメッセージクラスを非常に効率的に含む。この稀なメッセージクラスは、標的中に含められる。なぜなら、ＲＡＰ−ＰＣＲは、標的サンプル間のメッセージの豊富さを反映する一方で、任意の個々のＲＡＰ−ＰＣＲ反応における増幅に対して選択されるｃＤＮＡは、豊富さよりもむしろ配列によって決定されるからである。オリゴヌクレオチドプライマーと核酸分子との間の配列整合性が非常に良好である場合、たとえ核酸分子があまり豊富ではないとしても、あまり豊富ではない核酸分子は、最終標的において、より豊富な核酸分子に対して相対的により豊富でない、より多量の核酸分子を有する見込みが十分にある。
【００６１】
ゲルに基づく分析またはアレイに基づく分析のいずれかのために適切であるように、ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントは、投入ＲＮＡの８倍希釈にわたって、ほぼ同一であるように維持されるべきである。低質のＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントは、通常、ＲＮＡの質および濃度に関しての制御が乏しい結果である。アレイハイブリダイゼーション工程を進行する前に、ＲＡＰ−ＰＣＲ産物の質は変動され得る。アレイ方法はそのような高生産性を有するので、この追加工程は、高価でないばかりでなく、時間浪費的でもなく、そして貧弱なフィンガープリント再現性に起因する偽陽性の数を低減させることによって、効率を非常に改善し得る。標的としてのＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントの再現性は、本明細書中で例示される（実施例ＩＩを参照のこと）。
【００６２】
標的サンプル中のあまり豊富ではない核酸分子を検出するための、本発明の方法の能力の増大は、稀なメッセージを検出するのに制限された能力を有する以前に使用された方法に対して、主な改善を提供する。細胞のメッセージ集団の全体の複雑性は、短い期間（例えば、数週間）で試験され得るようである。
【００６３】
例えば、実施例ＩＩに開示されるように、ＲＡＰ−ＰＣＲサンプルによって生成される標的であるｍＲＮＡの集団は、メッセージの豊富さとは、ほとんど独立している。これは、メッセージのあまり豊富ではないクラスは、豊富なクラスよりもより高い複雑性を有し、恣意プライマーが良好な整合をより見出すようにさせるからである。ディファレンシャルディスプレイとは異なり、ＲＡＰ−ＰＣＲは、２つの恣意的プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）現象を要求し、おそらくＲＡＰ−ＰＣＲを複雑なクラスへと偏向させる。細胞におけるｍＲＮＡ集団の大部分（２０，０００ｍＲＮＡ未満）は、わずか１０個のＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントで見出され得る。
【００６４】
ＲＡＰ−ＰＣＲを使用することに加えて、ディファレンシャルディスプレイはまた、恣意的にサンプリングされた標的を生成するために使用され得る（実施例ＩＩＩを参照のこと）。ディファレンシャルディスプレイのために、最初に、逆転写は、３’アンカープライマー（例えば、オリゴ（ｄＴ）プライマー）を使用する、次に、第２鎖のｃＤＮＡが、恣意プライマーとプライムされる。次いで、恣意プライマーと３’アンカーとの間でＲＣＰが行われる。
【００６５】
実施例ＩＩＩに開示されるように、１つの恣意プライマーと１つのオリゴ（ｄＴ）アンカープライマーの組合わせが使用されて、ｃＤＮＡアレイに対する恣意的にサンプリングされた標的が生成される。調製物を標的化するためのＲＡＰ−ＰＣＲアプローチおよびディファレンシャルディスプレイアプローチの両方は、いくつかの他のアレイハイブリダイゼーション方法において使用されるＲＮＡ量の１／２００未満を使用し得る。各フィンガープリントは、転写ｍＲＮＡの約５〜１０％を検出し、ＥＳＴクローンの安価なＥ．ｃｏｌｉコロニーアレイを使用して、ほぼ独立した豊富さをサンプリングした。ディファレンシャルディスプレイプロトコールを改変して、核酸分子を探索するための標的としての使用のために十分な量のＰＣＲ産物を生成した。同じ恣意プライマーとの異なるオリゴ（ｄＴ）アンカープライマーの使用は、各標的によってサンプリングされた遺伝子の中でかなりの重複を生じた。サンプリングされた遺伝子の重複は、各オリゴ（ｄＴ）アンカープライマーと共に異なる恣意プライマーを使用することによって、回避され得る。ＥＧＦによって制御されることが以前に未知であった４つの遺伝子、および他の細胞型においてＥＧＦによって制御されることが公知であった３つの遺伝子を、ディファレンシャルディスプレイによって生成された、恣意的にサンプリングされた標的を使用して特徴付けた。ディファレンシャルディスプレイによって生成された恣意的にサンプリングされた標的の使用は、差次的に制御される遺伝子の同定のために、特に有用である。
【００６６】
以前に生成された非常に多くのフィンガープリントは、十分なｄＮＴＰ（１００μＭ）およびプライマー（約１μＭ）の存在下で、各フィンガープリントの１アリコートに対してＰＣＲを実施することによって、その量が増大される場合に、核酸分子アレイによって探索されるための有効な標的へと変換され得る。フィンガープリントは、以前に示されているように（Ｒａｌｐｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０７１０−１０７１４（１９９３））、再増幅され得る。従って、以前に決定されたディファレンシャルディスプレイのサンプルを使用して、アレイを探索するための標的を生成し得、さらなる情報を得ることを可能にし得る。
【００６７】
本明細書中に開示されるように、ディファレンシャルディスプレイを使用して、ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ（前出、１９９２）の方法に基づいて、標的を生成する。オリゴ（ｄＴ）アンカリングに由来する標的を使用することは、特定の型のアレイについて、いくつかの潜在的利点を有する。例えば、いくつかのアレイは、オリゴ（ｄＴ）にプライムされた逆転写によって生成され、そしてこれらのクローンは、３’偏向される。オリゴ（ｄＴ）アンカープライマーおよび恣意プライマーによって生成される標的はまた、各ＰＣＲ産物が、対応する３’偏向クローンにハイブリダイズし得るように、３’偏向であるべきである。対照的に、恣意的プライミングを使用して生成された標的は、ｍＲＮＡに対して内部の領域をサンプリングし得る。恣意的産物が３’短縮化クローンよりも、ｍＲＮＡのさらに５’に局在化している場合、この標的は、対応するｍＲＮＡに結合し得ない。
【００６８】
３’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを用いるディファレンシャルディスプレイを使用して生成される、恣意的にサンプリングされた標的は、３’偏向ライブラリー、そして特に３’偏向ＥＳＴを探索するために、特に有用である。３’アンカーリングは、ほとんどの細菌性ＲＮＡのような、ポリ（Ａ）テイルを有さないＲＮＡをサンプリングするためには有用ではない。３’アンカープライマーを使用して生成される標的はまた、内部産物に基づくＰＣＲアレイについては適切ではない。３’偏向標的はまた、ランダムにプライムされたライブラリーについては、あまり有用ではない。
【００６９】
恣意的にサンプリングされた標的を生成するための他の方法もまた使用され得る。１つのそのような方法は、ＲＡＰ−ＰＣＲの改変であり、複雑度制限恣意的サンプル配列決定（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｌｉｍｉｔｅｄ ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｓａｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＣＬＡＳＳ）と呼ばれる。ＣＬＡＳＳは、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）の、周知でありかつフラストレーションを引き起こす制限に対する解決策として着想された（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４−４８７（１９９５））。ＳＡＧＥは、２つの供給源由来のｃＤＮＡの小切片を生成し、それらを互いに連鎖させ、そしてそれらを大量に配列決定する方法である。平均的な細胞は、２００，０００のｍＲＮＡ転写物を含み、約２０，０００の異なる配列を表し、そしてＳＡＧＥは、一度に約４０の配列決定を可能にする。従って、標準的な配列決定装置を使用して、２つの標的を比較するために、非常に多くの配列決定ゲル（約１００）が、４００，０００のｍＲＮＡ（これは、比較される２つの集団由来の２００，０００のｍＲＮＡを表す）に対する情報を得るために必要とされる。この方法は、核酸分子の発現に関する情報を得るために有用であるが、各々のさらなるＲＮＡサンプルは、５０個単位で、必要とされるゲルの数を増大させる。これは、非常に高価であり、そして時間浪費的である。この主な問題点は、１細胞あたり１〜１０コピーへと発現が変化した、稀なメッセージに対して統計的信頼度を有するように、１００枚のすべてのゲルが泳動されなければならないということである。
【００７０】
この問題点を解決するために、ＣＬＡＳＳが発明された。ＣＬＡＳＳは、使用されるオリゴヌクレオチドプライマーが、縮重３’末端を有することを除いて、ＲＡＰ−ＰＣＲと類似する。この縮重性は、プライマーの頻繁なプライムを引き起こし、これは短い配列タグを生成する。短いＰＣＲ伸長時間を選択することによって、優先的な産物は、ｍＲＮＡの総複雑度の画分からのみ生じ、そしてこの画分の大きさは、３＋縮重塩基の数を変動させることによって、随意に調整され得る。次いで、これらの短いタグは、連結および配列決定され得て、メッセージの複雑度の副標本に対して迅速に信頼度のある統計をもたらす。これは、ＳＡＧＥにおいて使用される連結および配列決定ストラテジー（Ｖａｌｃｕｌｅｓｃｕら、前出、１９９５）と類似である。ＣＬＡＳＳ産物はまた、例えば、アレイに対して探索するための標的として使用され得る。
【００７１】
ＣＬＡＳＳ方法は、縮重３’末端を有するさらなるプライマーのセットが生成および使用されて、異なる核酸分子のサンプリングを獲得し得るので、有益である。核酸分子の発現を決定するためのこの反復性のアプローチは、ＳＡＧＥの全体的アプローチ（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、前出、１９９５）よりも、核酸分子の供給源における発現パターンについて、より情報を提供する。
【００７２】
任意の稀なメッセージを確実にするために、１００枚のゲルのほぼ完全な配列決定が必要とされるＳＡＧＥとは対照的に、ＣＬＡＳＳは、核酸分子の集団が、小集団へと分配されるのを可能にし、その結果、１０％の仕事で、この細胞のすべての遺伝子の１０％の結果について信頼度が生み出される。１回のＣＬＡＳＳで、第１の通過（１０枚のゲル）において、稀なメッセージの９０％については全く情報が得られないが、標的サンプル中の核酸分子の１０％についての結果の信頼度は高い。遺伝子の１０％におけるこの高い信頼度は好ましい。なぜなら、差次的に調節される遺伝子について探求する場合に、パターンまたは「挙動の型」は、差次的な遺伝子調節の間に起こることが予期されるからである。同じ経路によって制御される他の協調的な制御なしに、単一の遺伝子が活性化されることは、あるとしても、まずない。従って、例えば、トポイソメラーゼインヒビターによって調節される１０のあまり豊富ではない転写物のうちの任意の１つを探索する場合に、ＳＡＧＥは、１０個すべてのあまり豊富ではない遺伝子を産生する１００枚の配列決定ゲルを泳動することを必要とする。対照的に、ＣＬＡＳＳは、少なくとも１つの遺伝子を同定するために、１０枚のゲルを１／１０の時間で泳動することを可能にする。これは、遺伝子発現のパターンを同定するのに十分であり得る。さらに、ＣＬＡＳＳを、異なるプライマーを用いて反復的に使用して、さらなるゲル（例えば、５０枚のゲル）を泳動して、同数の遺伝子の５倍の情報を獲得し得る。一方で、ＳＡＧＥでの５０枚のゲルの泳動は、統計的に関連のある情報を全く明らかにしない。従って、ＣＬＡＳＳは、遺伝子発現パターンを同定するための、さらにより経済的なアプローチである。
【００７３】
ＣＬＡＳＳは、任意の種（たとえそのアレイが入手不可能である種であっても）に対して、およびアレイに対して未だ沈積されていないｍＲＮＡに対して適用され得る。従って、既知のアレイに対してＲＡＰ−ＰＣＲすることによって生成される標的を使用することが、既知の遺伝子に関する発現情報を提供する一方で、ＣＬＡＳＳは、たとえ、アレイされたライブラリーにおいて以前に遭遇されていないとしても、任意の遺伝子に関する発現情報を提供する。従って、ＣＬＡＳＳは、遺伝子発現に関する情報を得るために、低コストで比較的高生産性の方法を提供する。
【００７４】
本発明はまた、統計的にサンプリングされた標的を使用して、標的における核酸分子のレベルを測定する方法を提供する。統計的にサンプリングされた標的を生成するために有用な方法は、以前に記載されている（ＷＯ ９９／１１８２３；ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄら、前出、１９９７；Ｐｅｓｏｌｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２５：１１２−１２３（１９９８）；Ｌｏｐｅｚ−ＮｉｅｔｏおよびＮｉｇａｍ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８５７−８６１（１９９６））。統計的にサンプリングされた標的を生成するための典型的な方法は、統計的にプライムされたＰＣＲ（ＳＰ−ＰＣＲ）である。統計的プライム法とＲＡＰ−ＰＣＲとの間の主な差異は、恣意的にプライマーを選択するというよりも、核酸分子の群におけるヌクレオチド配列の統計的出現性を決定するように、プライマーがコンピュータープログラムによって選択されるという点である。
【００７５】
統計的にサンプリングされた標的を生成するための方法は、定方向性の統計的選択であり得る。例えば、ＧｅｎｅＵＰと呼ばれるプログラムが考案されており、これは、目的のリスト（例えば、アポトーシスと関連するヒトｍＲＮＡのリスト）における配列をサンプリングするが、一方で別のリスト（例えば、ヒト細胞において豊富に発現されるｍＲＮＡおよび構造的ＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ）、Ａｌｕ反復、およびｍｔＤＮＡのリスト）における配列を排除するためのプライマー対を選択するためのアルゴリズムを使用する（Ｐｅｓｏｌｅら、前出１９９８）。定方向性の統計的方法は、任意の所定のオリゴヌクレオチドが、任意の所定のヌクレオチド配列および所定のオリゴヌクレオチドが結合し得る異なる核酸分子の数に整合するか否かについて、組織的な決定を提供する。そのような定方向性の統計的方法は、本発明において有用な統計的にサンプリングされた標的を生成するために使用され得る。
【００７６】
統計的にサンプリングされた標的を生成するための別の方法は、モンテカルロ統計的選択法である（Ｌｏｐｅｚ−ＮｉｅｔｏおよびＮｉｇａｍ、前出、１９９６）。モンテカルロ統計的選択法は、モンテカルロ法を使用することによって、無作為にプライマーセットを対にする。モンテカルロ法は、プライマー整合の無作為工程を刺激することによって、増幅のために使用され得るプライマーを決定する解決策に近い。モンテカルロ統計的方法は、任意の所定のオリゴヌクレオチドが、任意の所定のヌクレオチド配列および所定のオリゴヌクレオチドが結合し得る異なる核酸分子の数と整合するか否かについての組織的な決定を定方向性の統計的方法が提供するという点で定方向性の統計的方法とは異なる。
【００７７】
一般的に、異なる対の恣意的オリゴヌクレオチドを使用して生成される２つの恣意的にサンプリングされた標的は、標的サンプル中の、大部分が重複しない核酸分子のセットにハイブリダイズする。同様に、異なる対の統計的オリゴヌクレオチドを使用して生成される２つの統計的にサンプリングされた標的は、標的中の、大部分が重複しない核酸分子のセットにハイブリダイズする。一般的に、１００より少ない産物が、２つの差次的にプライムした、複雑性を低減した標的において、最も強くハイブリダイズする２０００コロニーの中で重複する（実施例Ｉを参照のこと）。この発現のパターンはまた、すべてのｍＲＮＡ集団を直接標識することによって生成されるパターンとは、ほとんど完全に異なる。しかし、より多くの核酸分子が、ＲＮＡ集団のさらなる恣意的サンプリングまたはＲＮＡ集団のさらなる統計的サンプリングによってサンプリングされるにつれて、サンプリングされる非重複核酸分子の数は減少する。ある程度まで、核酸分子の適用範囲の有効性は、統計的に選択されたプライマーを使用することによって改善され得る（Ｐｅｓｏｌｅら、前出、１９９８）。ＲＡＰ−ＰＣＲによって生成される複数の恣意的にサンプリングされた標的は、すべての遺伝子を包含するのに十分な標的を供給し得る。
【００７８】
恣意的にサンプリングされた標的および統計的にサンプリングされた標的を生成するための上記の方法は、改変され得る。例えば、差次的に調節される核酸について富化された、恣意的にサンプリングされた標的または統計的にサンプリングされた標的を生成するために、サブトラクションストラテジーが使用され得る。核酸分子の１つの供給源由来の標的（Ａ）が標識され、次いで、他の供給源由来の数倍過剰の非標識標的（Ｂ）と混合される。混合物全体を変性し、そしてプローブへの結合のためにハイブリダイゼーション溶液に添加する。両方の標的において存在する増幅核酸産物が二本鎖核酸分子を形成し、そして残存する有効な標識標的は、２つの標的間の差異に主に由来する。同じ実験は、供給源由来の標識標的（Ｂ）および供給源由来の過剰な非標識標的（Ａ）を用いてなされ得る。減算された標的の両方のセットに結合するプローブが、差次的な遺伝子発現を検出するために比較される。この手順はまた、標的ｃＤＮＡ混合物に存在する反復を部分的にクエンチする。従って、恣意的にサンプリングされた標的または統計的にサンプリングされた標的を生成するための、このようなサブトラクション方法の使用は、別の条件由来の標識標的をクエンチするように、１つの条件由来の非標識標的を使用することによって、２つの条件を比較するために使用され得る。
【００７９】
サブトラクションの制限は、発現の小さな差異を排除し得、これがｍＲＮＡの全体的な非存在であるように見え得るということである。さらに、サブトラクションは、二成分の問題においては有用であるが、多数の条件が組合わせて比較されねばならない場合には、有用性は限られる。
【００８０】
特異的結合の検出は、バックグラウンドのハイブリダイゼーションおよび反復の不完全な遮断によって、制限される。従って、複雑性を低減した標的を生成するために上記の方法を使用することに加えて、Ｃｏｔ１ＤＮＡを使用して、核酸の反復エレメントをクエンチし得る。Ｃｏｔ１ＤＮＡゲノム画分は、反復に富む。Ｃｏｔ１ＤＮＡを含む標的は、検出することが困難であり得る核酸分子を低い豊富さにて探索するために有用である。あまり豊富ではない配列は、総ゲノムＤＮＡの使用によって部分的にクエンチされ得るが、Ｃｏｔ１ＤＮＡは、より混ぜ物をして質の落ちた（ｓｏｐｈｉｓｔｉｃａｔｅｄ）アレイ（例えば、ＰＣＲに基づくアレイ）に対して有用であり、ここでは、比較的貧弱に増幅された産物について考慮されるのに十分なほどに、ノイズに対するシグナルの割合が高い。
【００８１】
恣意的にサンプリングされた標的または統計学的にサンプリングされた標的を産生する場合、種々のプロモーター（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、またはその他）がプライマーに組み込まれ、その結果、対応するポリメラーゼを用いる転写が用いられて標的を生成し得る。その標的を生成するための転写を用いることは、一本鎖標的を生成することの利点を有する。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーは、任意の他の統計学的プライマーまたは恣意プライマーと組み合わせて使用され得る。
【００８２】
恣意的にサンプリングされた標的または統計学的にサンプリングされた標的はまた、消化物の連結を使用して生成され得る。この場合、その標的を生成するために使用される核酸分子の集団は、制限酵素によって消化され、そしてオリゴヌクレオチドプライマーが、増幅された標的を生成するために連結される。連結媒介ＰＣＲでは、プライマー結合部位またはプライマー結合部位の部分が、例えば、部位特異的切断後に、連結によって鋳型上に配置される。
【００８３】
ネスト化ＰＣＲはまた、恣意的にサンプリングした標的または統計学的にサンプリングした標的を生成するために使用され得る。ネスト化ＰＣＲは、第１のプライマーを用いて実行される第１回のＰＣＲ、続いて、第１のプライマー配列を越えて１つ以上のヌクレオチドが伸長する配列を含むという点で、第１のプライマーとは異なる第２のプライマーを用いるＰＣＲを含む、２つのＰＣＲ工程を含む。
【００８４】
標的は、特定のプローブにハイブリダイズする標的について富化され得る。一旦特定の恣意的にまたは統計学的にプライムされた方法によって生成された標的が特定の核酸集団に使用され、そして得られる標的がプローブのセットに対して使用されたならば、検出可能にハイブリダイズされる標的のセットが公知となる。この点において、そのプローブによって、検出されたもののみまたは検出されたもののほとんどを含む新しい標的のセットを工夫することは可能である。例えば、特定のプライマー「Ａ」が、ヒト脳由来のＲＮＡを使用するＲＡＰ−ＰＣＲのために使用され、そして得られる標的がｃＤＮＡクローンのアレイにハイブリダイズされる場合、いくつかのクローンは検出可能にハイブリダイズされる。次いで、この特定の標的によってハイブリダイズされたこれらのプローブのみのアレイを作製することが可能である。アレイ上のｃＤＮＡの大部分は、同じプライマー「Ａ」を用いて作製されたヒト脳ＲＮＡから開発された標的とハイブリダイズすることが予想され得る。
【００８５】
いくつかの場合において、標的の基礎である核酸の配列が公知である。いくつかの標的は、特定のプローブと検出可能にハイブリダイズし、そして他の標的はハイブリダイズしない。標的と関連する配列情報は、これらのプローブにハイブリダイズした標的を生じた、恣意的または統計学的プライミング事象の規則を推定するために使用され得る。このような情報は、その配列が標的中に存在する場合、特定のプライマーによってどの配列がサンプリングされそうかを予測することを補助する。このような情報は、どの配列が効率よくサンプリングされるか、そしてどの配列が特定のプライマーによって効率よくサンプリングされるかの見積もりを改善し得る。
【００８６】
本発明の方法は、アレイを使用して標的中の分子のレベルを測定するために特に有用である。本明細書中で使用される場合、用語「アレイ」または「分子のアレイ」とは、固体支持体に安定に結合される複数の分子をいう。アレイは、例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリペプチド−核酸分子を含み得る。本明細書中で使用される場合、分子のアレイは、固体支持体に結合する前に、電気泳動的に分離された分子を特異的に除外し、そしてそのようなものとして、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質のサザンブロット、ノーザンブロット、およびウェスタンブロットをそれぞれ除外することが理解される。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、用語「非ドットブロット」アレイとは、アレイの分子が少なくとも約２スポット／ｃｍ２の配置で、吸引濾過またはニトロセルロースメンブレンもしくはナイロンメンブレンへのスポッティング以外の手段によって、固体支持体に結合されるアレイをいう。
【００８８】
本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド−核酸」または「ＰＮＡ」とは、共有結合しているペプチドおよび核酸分子（Ｎｉｅｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７１−７５（１９９９））をいう。
【００８９】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、ＰＮＡに関連して使用される場合、２つ以上のアミノ酸のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を意味する。この用語は、同様に、その誘導体、アナログ、および機能的な模倣物をいうことを意図される。例えば、誘導体は、ポリペプチドの化学的修飾（例えば、アルキル化、アシル化、カルバミル化、ヨード化、またはポリペプチドを誘導体化する任意の修飾）を含み得る。アナログは、修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリンまたはカルボキシグルタミン酸）を含み得、そしてペプチド結合によって連結されないアミノ酸を含み得る。模倣物は、その化合物の予測された三次元構造に関わらず、ポリペプチドの機能を模倣する化学的部分を含む化学物質を含む。例えば、ポリペプチドが、その機能的ドメイン中に２つの荷電した化学的部分を含む場合、模倣物は２つの荷電した化学的部分を１つの空間的配向および制限された構造に配置し、その結果、荷電した化学的機能は、三次元的空間において維持される。従って、これらのすべての修飾が用語「ポリペプチド」の中に含まれる。
【００９０】
アレイのための固体支持体は、ナイロンメンブレン、ガラス、誘導体化されたガラス、シリコン、または他の基材であり得る。このアレイは、平らな表面（例えば、膜）であり得るか、または、所望の場合、球体もしくはビーズであり得る。この分子は、「スポット」として固体支持体上に結合され得、そして一般的には、少なくとも約５／ｃｍ２または１０／ｃｍ２、しかし一般的には約１０００／ｃｍ２を超えない密度でスポットされ得る。
【００９１】
ＤＮＡ分子のアレイを製造するための種々の方法が記載されている（Ｒａｍｓａｙ、前出、１９８８；ＭａｒｓｈａｌｌおよびＨｏｄｇｓｏｎ、前出、１９９８に概説される）。種々の種（酵母、マウス、およびヒトを含む）由来の核酸分子を含むアレイが利用可能である。アレイの使用は有利である。なぜなら、多くの遺伝子の差示的発現が並行して決定され得るからである。
【００９２】
１つの型のアレイは、１平方センチメートルあたりに何千ものＰＣＲ産物を含む。ｍＲＮＡのセグメントからのＰＣＲ産物のアレイは、例えば、ガラスに結合され、そして２つの供給源からのｃＤＮＡ集団を使用して探査（ｐｒｏｂｅ）される。各々のｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ集団は、異なる蛍光色素で標識され、そしてハイブリダイゼーションが蛍光を用いて評価される（ＤｅＲｉｓｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１４：４５７−４６０（１９９６）；Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０（１９９５））。選択されたＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．クローンからの５０００を超えるＰＣＲ産物を含むアレイもまた、利用可能である。ＰＣＲ産物のアレイはまた、あらゆる酵母のＯＲＦのために、そしてヒトＥＳＴのサブセットのために利用可能である。
【００９３】
別の型のアレイは、Ｅ．ｃｏｌｉクローンの１８，４３２コロニーを含み、各々が異なるＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ． ＥＳＴプラスミドを含み、そして各々が２２×２２ｃｍメンブレン（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）上に２回スポットされる。Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアムからのアレイを使用することの１つの利点は、クローンの８０％より多くが、５’もしくは３’末端から、または両方から読まれ、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託されたシングルパス配列を有することである。従って、同じ配列を共有する既知の遺伝子または他のＥＳＴが存在するかどうかを決定するために、通常、いかなるＤＮＡもクローン化するか、または配列決定する必要はない。同じ遺伝子由来であるようであるヒトおよびマウスＥＳＴのＵｎｉｇｅｎｅクラスター化は、このプロセスにおいて大きな補助となる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｕｎｉｇｅｎｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。数センチモルガンの解像度での染色体へのマッピングはまた、同じウェブサイトでこれらのクラスターの大部分について利用可能である。これらのアレイ上のクローンはすべて利用可能であり、核酸分子を探査するために、または配列決定を完成させるために使用される（ｗｗｗ−ｂｉｏ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ）。他の種における近いホモログを同定することがしばしば可能である。他のＤＮＡを含まない、ＰＣＲ産物アレイおよびオリゴヌクレオチドアレイと対照的に、各々のスポットされたＥＳＴは、宿主由来のＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡと関連する。従って、このクローンアレイは、ＰＣＲアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイよりも高いバックグラウンドを有し得る。
【００９４】
ＥＳＴアレイが使用される場合、５’ＲＡＣＥは現在利用されているＥＳＴを超えて延長するために使用され得る（ＺｈａｎｇおよびＦｒｏｈｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：６１−８７（１９９７））。ほぼ全長のクローンを含むｃＤＮＡライブラリーが利用可能であり、そして末端配列決定される場合、差示的にハイブリダイズしたスポットから全長ｃＤＮＡまで、直接的に応用することが可能である。
【００９５】
別のクラスのアレイは、ガラスもしくはシリコン表面に結合されるか、またはＤＮＡチップ上の連続的光化学によって製造される（Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１０−６１４（１９９６））かのいずれかであるオリゴヌクレオチドを使用する。このようなチップは、１平方センチメートルあたりに何万もの異なるオリゴヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ペプチド−核酸のようなオリゴヌクレオチド核酸アナログのアレイが、調製され得る（Ｗｅｉｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２７９２−２７９９（１９９７））。
【００９６】
フィンガープリントの、アレイへのハイブリダイゼーションは、一般的に、検出された遺伝子の単離、クローニング、および配列決定が必要ないという非常に大きな利点を有する。原理的には、すべての公知のヒトｍＲＮＡは、３枚のメンブレン上（約５０，０００遺伝子）か、またはガラスアレイもしくは他の固体支持体上のより小さい領域中に適合する。現在、各々のフィンガープリントは、５０，０００の既知の遺伝子の２０００より多くにハイブリダイズするに十分な複雑性を有する。
【００９７】
さらなる特徴付けのための標的、特定の遺伝子に結合し得る何千もの遺伝子を有し得るアレイの使用は、所望の規準に基づいて選択され得る。例えば、すでに公知であり、そして目的の条件における新しい役割が推定され得る、同定された遺伝子が選択され得る。あるいは、この遺伝子のいくつかは、もっともらしい役割が決定され得る公知の機能を有する公知の遺伝子のファミリーメンバーであり得る。
【００９８】
アレイに加えて、多数のｃＤＮＡライブラリー（例えば、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアム（ｗｗｗ−ｂｉｏ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ／ｂｂｒｐ／ｉｍａｇｅ／ｉｍａｇｅ．ｈｔｍｌ）から）が利用可能であり、これには、ナイロンメンブレン上で利用可能なライブラリー（例えば、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ＡＬ；ｗｗｗ．ｒｅｓｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ；ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）およびｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ｗｗｗ．ｒｚｐｄ．ｄｅ）から）が含まれる。これらのライブラリーには、種々のヒト組織、発生段階、疾患状態、および他の供給源由来のクローンが含まれる。
【００９９】
本発明の方法は、標的へのプローブの特異的結合の量を検出する工程を包含する。本明細書中で開示されるように、種々の検出方法が使用され得る。例えば、検出可能な部分が放射性部分である場合には、その検出方法は、オートラジオグラフィーまたはホスホルイメージングであり得る。ホスホルイメージングは、定量およびデータ収集時間の短縮のために有利である。検出可能な部分が蛍光部分である場合、検出方法は、蛍光分光法または共焦点顕微鏡法であり得る。
【０１００】
本発明の方法は、標的中の核酸分子の発現レベルを測定するために核酸プローブを使用する。放射性部分が標的に結合している場合、例えば、放射性部分の取り込みは、放射性部分の結合を可能にする、任意の酵素的または化学的方法であり得る。例えば、末端標識は、核酸分子の末端に放射性部分を結合させるために使用され得る。あるいは、放射性ヌクレオチド、特に３２Ｐ−標識されたヌクレオチド、３３Ｐ−標識されたヌクレオチド、または３５Ｓ−標識されたヌクレオチドは、合成の間に核酸分子中に組み込まれ得る。ランダムプライム化合成の使用は、高い比活性標的を生成するために特に有用である。一般的には、ランダムプライム化合成は、二本鎖ＰＣＲ産物の両方の鎖からランダムにプライムされたおよそ等量の核酸分子を生成し、これは、ハイブリダイゼーションの間に、ある程度、標的に再アニーリングする（実施例Ｉを参照のこと）。所望の場合、再アニーリングの量は、例えば、ｅｘｏＩＩＩ消化を用いて制限され得る。
【０１０１】
標識された標的またはプローブを生成する場合、一般的に、ＡＴＰまたはｄＡＴＰではない標識されたヌクレオチドを取り込むことが好ましい。標識されたｄＡＴＰの使用は、バックグラウンドの増加を引き起こし得る。なぜなら、標的またはプローブ中の任意のポリＡ配列は、高度に標識され、そしてすべてのクローン中に存在するポリＡテールに相補的なポリＴストレッチを含む鎖にハイブリダイズするからである。同様に、ｄＴＴＰの使用は、ｍＲＮＡ中のポリＡテールに相補的なポリＴストレッチを高度に標識する。
【０１０２】
蛍光色素はまた、プローブもしくは標的に、結合されるかまたは組み込まれ得る。所望の場合、異なる波長で検出可能な異なる蛍光は、異なる標的に組み込まれ得、そして同じプローブ上で同時に使用され得る。異なる蛍光の使用は有利である。なぜなら、複数の標的が同じプローブに結合し、そして検出され得るからである。蛍光標識された標的は、例えば、蛍光スキャナーまたは共焦点顕微鏡を使用して検出され得る。同じアレイ上の２つの標的の相対的な豊富さを同時に測定することは、２つの異なるアレイ上のそれを測定することよりも、ハイブリダイゼーション条件または同じアレイの複製に対する標的ＰＣＲ産物の量の違いによって起こる問題を除去する。ナイロンメンブレンは、代表的には、メンブレンそれ自体からのバックグラウンド蛍光に起因して、大部分の市販の蛍光タグのためには不適切である。
【０１０３】
赤外線色素はまた、プローブまたは標的への結合のための検出可能な部分として有用である。ナイロンメンブレンに結合したアレイのような標的またはプローブを有する赤外線色素は、そのメンブレンがタンパク質を含まない場合に、特に有用である。
【０１０４】
標的中の核酸分子のレベルを決定する場合、特に、増幅条件に非常に感受性である特定の増幅産物について、いくつかのバリエーションが存在し得る。核酸標的の間の増幅産物におけるバリエーションを制御するために、その標的は、２つ以上の因子によって異なる核酸分子の２つの濃度で生成され得る。差示的発現を確認するための標的を生成する種々の核酸濃度の使用は、本明細書中に記載される（実施例ＩＩおよびＩＩＩを参照のこと）。
【０１０５】
本発明の方法は、プローブへの標的の特異的結合を検出することに関する。プローブに標的をハイブリダイズさせる場合、結合の特異性は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーによって決定される。オリゴヌクレオチドプライマーの長さおよび増幅反応の温度は、最終産物に寄与する。その産物は、各々の標的核酸分子の開始時の豊富さ、およびオリゴヌクレオチドプライマーと増幅された核酸標的との間の一致の特性の両方の関数である。例えば、約８塩基長のオリゴヌクレオチドプライマーが、標的を生成するために約６０℃の反応温度で使用され得る。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、約２×ＳＳＣにおける約３２℃〜約０．１×ＳＳＣにおける約６８℃までの範囲であり得る。ハイブリダイゼーション温度は、例えば、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、または約６５℃であり得る。さらに、ＳＳＣ濃度（以下を参照のこと）は、例えば、約０．２×、０．３×、０．５×、１×、または１．５×であり得る。
【０１０６】
本発明はさらに、標的へのプローブの特異的結合の量を比較することによって、２つの標的中の核酸分子の相対量を決定するための方法を提供し、ここで、特異的結合の量は標的中の核酸分子の発現レベルに、第２の標的中の核酸分子の発現レベルに対応する。例えば、所望の場合、発現のレベルが未知である標的であり得る第１の標的中の発現レベルは、第２の標的の発現レベルと比較され得る。第２の標的中の発現レベルは、例えば、第２の標的に同じプローブを結合させること、および第２の標的における発現レベルを決定することによって決定され得る。次いで、第１の標的および第２の標的における発現レベルが比較され得る。
【０１０７】
第１の標的中の相対的な発現レベルはまた、第２の標的中の発現レベルと比較され得、ここで、第２の標的中の豊富さはすでに公知である。本明細書中で使用される場合、用語「公知の」は、核酸分子の発現レベルに関連して使用される場合、核酸分子の豊富さが以前に決定されたことを意味する。このような公知の豊富さが、特定の条件のセットに適用されることが理解される。公知の豊富さに対して、未知の標的における核酸分子の豊富さを比較する目的のために、標的の間の豊富さを測定する同じ方法が使用されることがまた、理解される。
【０１０８】
本発明はまた、１つの条件に関連する、２つ以上の差示的に発現された核酸分子を同定する方法を提供する。この方法は、例えば、恣意的にサンプリングされた標的、または統計学的にサンプリングされた標的を使用して、標的中の２つ以上の核酸分子のレベルを測定する工程を包含し、ここでプローブへの標的の特異的結合の量は、標的中の核酸分子の豊富さに対応する。この方法はさらに、第２の標的中の核酸分子の発現レベルに対する標的中の核酸分子の相対的な発現レベルを比較する工程を包含し、それによって、標的の間の発現レベルの違いが、１つの条件を示す。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、用語「差示的に発現される（た）」は、分子の量が、２つの標的の間で異なるレベルで発現されることを意味する。２つの標的は、異なる細胞もしくは組織由来であり得るか、またはその標的は、異なる条件下で同じ細胞もしくは組織由来であり得る。その条件は、例えば、ガン、自己免疫疾患、病原体（細菌、ウイルス、真菌、酵母、または単細胞寄生生物もしくは多細胞寄生生物）による感染のような疾患状態に関連し得るか；効力、抵抗性、または毒性のような感染のような処置に関連し得るか；あるいは、化学物質のような刺激剤（例えば、薬物または天然の産物（例えば、増殖因子））に関連し得る。
【０１１０】
本発明の方法は、２つの標的の間の差次的な遺伝子発現を決定するために有用である。本発明の方法は、差次的な遺伝子発現が重要であると考えられる任意の系に対して適用され得る。この系としては、薬物応答、ホルモン応答、正常な発達、異常な発達、遺伝子型の遺伝、ガンまたは自己免疫疾患のような疾患の状態、加齢、感染性疾患、病理学、薬物処置、ホルモン活性、加齢、細胞周期、恒常性機構および上記の状態の組み合わせを含む他のものが挙げられる。
【０１１１】
本明細書において開示されるように、２つの標的における核酸分子の含有量を比較して、２つ以上の差次的に発現される核酸分子を同定し得る（実施例Ｉ〜ＩＩＩを参照のこと）。恣意的にサンプリングした標的を用いて、ＥＧＦを用いて処置するかまたは処置しない標的を、プローブとハイブリダイズさせ、そしてＥＧＦによって調節される多数の遺伝子を同定した。ＥＧＦ調節される遺伝子は、ＥＧＦに応答して増加し、そしてＥＧＦに応答して減少することが見出された（それぞれ、実施例ＩＩおよび実施例ＩＩＩにおける表１および表２を参照のこと）。したがって、本発明の方法は、刺激に応答して増加し、または刺激に応答して減少する核酸分子を決定するために使用し得る（実施例ＩＩを参照のこと）。
【０１１２】
本発明において使用される恣意的にサンプリングした標的および統計学的にサンプリングした標的は、ある集団において、あまり豊富でない核酸分子を容易に検出し得る。従って、本発明の方法は、差次的に発現される核酸分子を同定するために特に有用である。なぜなら、差次的に発現される核酸分子は、しばしばあまり豊富ではないからである。
【０１１３】
本発明の方法を、任意の２つの標的に適用して、差次的な遺伝子発現を決定し得る。本発明の方法を使用して、例えば、疾患状態を診断し得る。そのような場合において、「正常な」標的を、潜在的に罹患した標的と比較して、その疾患と関連する差次的遺伝子発現を決定する。正常な標的は、その患者からの罹患した組織の付近の同じ組織の標的サンプルであり得る。正常な標的はまた、異なる個体由来の同じ組織のサンプルであり得る。本発明の方法を用いて、正常な発現のプロフィールを、１対多の正常標的サンプルにおける遺伝子発現パターンを決定することによって確立し得る。次いで、これらのプロフィールを使用して、潜在的に罹患した標的サンプルと比較し得る。正常な組織と罹患した組織との間の差次的な遺伝子発現を使用して、特定の疾患状態を診断または確認し得る。さらに、公知の罹患した組織から得られる標的サンプルの収集物を同様に決定して、その疾患に関連する遺伝子発現を反映する標的の頻度プロフィールを同定し得る。そのような場合において、潜在的な疾患標的サンプルと、差次的遺伝子発現を伴わない公知の罹患した標的サンプルとの比較は、その潜在的な疾患標的サンプルが、その疾患に関連することを示す。
【０１１４】
本発明の方法はまた、薬物を用いた個体の処置を評価するために使用され得る。特定の薬物処置に関連する遺伝子発現パターンの分析はまた、薬理遺伝学としても知られる。本発明の方法を使用して、処置の効力、処置に対する耐性、または処置に関連する毒性（傷害性）を決定し得る。例えば、遺伝子発現プロフィールは、特定の疾患または状態についての処置の前、および処置の後に、個体において決定され得る。次いで、遺伝子発現における相違を、その処置の効率と相関させ得る。例えば、ある個体が処置に応答することが見出され、そしてその処置が差次的な遺伝子発現と関連する場合、その差次的な遺伝子発現の同定を使用して、その処置の効力を相関付け得る。上記のように、未処置の個体に関連する遺伝子発現パターンは、処置の前のその個体において決定され得るか、またはその処置を受けていない多数の個体において決定され得る。同様に、その処置の効力に関連する発現パターンにおける変化は、多数の個体（これらの個体について、その処置が効力があった）において決定され得る。そのような場合において、処置された標的サンプルと、差次的遺伝子発現を伴わない効力のある処置を行った公知の標的サンプルとを比較することで、その処置が、おそらく効力があるであろうことが示される。同様のアプローチを使用して、その処置の毒性を用いる処置または処置に対する耐性の関連を決定し得る。処置に対する耐性は、未処置の標的サンプルからの発現パターンにおける変化と関連し得るか、または未処置の標的サンプルと比較して発現パターンの変化がないことと関連し得る。
【０１１５】
本発明の方法はまた、薬物探索についての潜在的な標的であり得る同時調節される遺伝子を決定するために使用され得る。例えば、細胞または生物は、刺激物を用いて処置され得、そして未処置のサンプルと、刺激物を用いて処置された標的サンプルとの間の差次的な遺伝子発現が決定され得る。刺激物は例えば、薬物または増殖（成長）因子であり得る。未処置の標的サンプルと、刺激物を用いて処置した標的サンプルとの間の核酸分子の含量の相違を使用して、その刺激物に関連する差次的な遺伝子発現を同定し得る。そのような差次的な発現パターンを使用して、標的サンプルが刺激物に曝露されたか否かを決定し得る。さらに、この遺伝子発現プロフィールを使用して、もとの刺激物と同じ遺伝子発現プロフィールを誘発する化合物についてスクリーニングすることによってその刺激物を模倣する他の化合物を同定し得る。従って、本発明の方法を使用して、公知の薬物に類似する効果を有する新たな薬物を同定し得る。
【０１１６】
本発明の方法は、薬物応答に相関する経路についてのマーカーを同定するために有用である。このことは、供給源のＲＮＡのような核酸の供給源集団の発現プロフィールを反映する所定の標的サンプルについての含量プロフィールを決定することによる。例えば、本発明の方法を使用して、薬物に応答して調節されるいくつかの遺伝子を同定し、それにより潜在的な薬物標的である経路における「近隣」を提供することによって、潜在的な治療的標的の「近隣」を規定し得る。本発明はまた、例えば、治療に「失敗した」経路の悪い近隣を規定するためにも使用され得る。失敗した経路は、特定の経路が撹乱されるべきではないことを示し得る。経路の機能に対するさらなる洞察は、完全な配列情報が利用不能である、差次的に発現される任意の遺伝子を配列決定することによって入手され得る。この方法は、薬物比較について特に有用である。遺伝子発現パターンと薬物応答との相関を使用して、２つの類似の薬物がいくらか異なる効果の範囲を有する理由を決定し得る。
【０１１７】
遺伝子発現と薬物に対する応答との間の相関を知ると、薬物を、特定の疾患または状態とより関連する細胞型において試験し得る。ある病理と関連する細胞型に存在する経路を知ることによって、その細胞型の薬物応答に関する予測を行い得、それによって、その病理にもっとも影響を与えるようである試験された薬物のパネルから薬物の選択を可能にする。薬物応答および遺伝子発現についての情報の相関付けはまた、相乗効果を有する薬物（例えば、重複しない経路を塞ぐ薬物、または例えば、重複する遺伝子が標的化される場合に重複する経路に影響を与える薬物）を選択する助けとなり得る。
【０１１８】
本発明の方法は、刺激物に対する応答を決定すること、特に薬物探索についての刺激物に対する応答を決定することに適用され得る。１つの可能な適用は、本発明の方法を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ＮＣＩ）薬物スクリーニングパネルにおける６０の細胞株に対して使用することである。これらの６０の細胞株は、ＮＣＩによって維持され、そして薬物活性を評価するために使用される。
【０１１９】
例えば、ＮＣＩパネルの６０の細胞株の各々を、細胞増殖、および第二にアポトーシスの単一の変数を報告する複雑な測定デバイスとして使用し得る。薬物のような化学物質を用いて処置する際の各細胞型の増殖における変化が決定される。数万の薬物の研究が、６０すべての細胞株に対して比較される場合に、増殖に対する類似の効果は作用機構を共有することを証明することを示している。６０の細胞株の種々の薬物に対する応答の比較は、その詳細な化学官能基性に従って、薬物のグループ分けを可能にする。結果として、細胞株のパネルは、薬物探索のための最も重要な分析ツールの一つとなっている。
【０１２０】
本発明の方法は、ＮＣＩパネルの６０の細胞株において薬物応答を分析することに適用され得る。本明細書において開示されるように、この方法は、差次的遺伝子発現を決定することに適用され得る。この差次的発現は、特定の薬物に対するその細胞の応答と相関し得る。この方法を使用して、薬物応答に関連する多くの差次的に発現された遺伝子を同定し得る。従って、６０の細胞株ＮＣＩ薬物スクリーニングパネルにおける無関連の細胞における遺伝子発現の分析を使用して、そのパネルにおいて用いられた多くの１０，０００の薬物のいくつかと相関するｍＲＮＡの存在または非存在に基づいて、遺伝子発現のプロフィールを決定し得る。
【０１２１】
差次的遺伝子発現パターンは、薬物応答と相関すると予測される。その細胞株のなかの３０個におけるそのような相関の同定の後、残りの３０の細胞株における薬物応答の予測が試験され得る。この戦略は、すべての６０の細胞株について、すべての新たな薬物について広汎な発現プロフィールを決定して、その薬物に応答する能力と相関する遺伝子を見出す必要を回避する。この戦略は、以前の方法とは、処置後のその遺伝子の差次的発現が必ずしも起きないという点で異なる。必要なことは、それらの遺伝子が処置前の細胞型の間で差次的に制御されていることがのみである。
【０１２２】
６０の細胞株の各々は、薬物に対するその特徴的な応答を有し、そしてこれらの応答は、細胞の表現型に依存する。任意の細胞の、任意の薬物に対する応答は、遺伝子系がその細胞において作動可能であることに依存する。一旦処置されると、その細胞の遺伝子機構が撹乱される。このことは、差次的な遺伝子発現、差次的なタンパク質改変、および微小であり得る広汎な種々の他の変化をもたらす。それにもかかわらず、薬物への任意の曝露前の遺伝子発現の基底状態の遺伝子パターンまたはプロフィールがその細胞が薬物に如何に応答するかを決定することである。
【０１２３】
遺伝子プロフィールの基底状態は、細胞（例えば、ＮＣＩパネルの細胞株）について特徴付けるための重要な状態である。その細胞の基底状態は、所定の細胞が所定の薬物に如何に応答するかについて予測力を有する。さらに、この基底状態は、ほぼ１００，０００の異なる薬物の挙動について唯一の参照についての共通点であり、そしてこれを使用して、さらなる薬物に対する応答を決定し得る。
【０１２４】
例えば、２つのステロイドおよび２つのアルキル化剤が６０の細胞株のパネルに適用され、そしてその増殖範囲が比較される場合、その細胞株のステロイドに対する平均の応答は、類似する傾向にあり、そのアルキル化剤に対する平均の応答は類似する傾向にあるが、ステロイド対アルキル化剤の応答の比較は、ほとんど類似点を示さない。これは、ステロイドが天然に存在するレセプターを介してその効果を誘発するが、アルキル化剤は、広汎な障害を引き起こすことによってその効果を誘発するという事実を反映する。ステロイド性シグナルを処理すること対障害を処理することについてのシグナル伝達経路は、大いに異なる。
【０１２５】
ステロイドのパネルを使用して６０の細胞株にチャレンジする場合、これらの細胞のいくつかは増殖が促進され、いくつかは増殖が阻害され、そしていくつかはステロイドには無反応である。このデータの多くは、ＮＣＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）にて利用可能である。明らかな次の工程は、どの遺伝子が活性化され、どの遺伝子が不活化され、そしてどの遺伝子が無反応であるかを見るために、そのステロイドに応答する遺伝子を調査することである。各細胞型の遺伝子は、約３０のステロイドレセプター遺伝子のどれがステロイド処置の前にその細胞型において発現されているかに依存して、差次的に応答する。
【０１２６】
ステロイドに対する遺伝子の種々の応答は、細胞型依存性である。これは大部分、どのレセプターが存在しているかに起因する。ＮＣＩのパネルの細胞の基底状態の遺伝子発現を比較することによって、各細胞型において発現されるステロイドレセプター遺伝子の範囲が記載され得、それによって、任意の特定のステロイドについて応答性である細胞について、遺伝子に関して何が必要かを説明する。
【０１２７】
薬物レセプターもしくはホルモンレセプターの上記の関係は、ＮＣＩパネル基底線遺伝子発現データベースとＮＣＩパネル薬物応答データベースとの間に関連し得る相関の１つの例である。他の薬物応答は、容易に決定され得る。例えば、アポトーシスを誘発する薬物はまた、遺伝子発現を誘発し、そして細胞型に相関する、異なるアポトーシス応答を使用して、アポトーシスを制御する遺伝子産物を決定し得る。
【０１２８】
本発明の方法は、薬物または他の刺激物に対する応答の特徴付けについてＮＣＩパネルの細胞に加えて、任意の細胞型に適用され得ることが理解される。複数の薬物の間の機能的な重複は、薬物探索において重要な関心事である。異なる細胞型における薬物に対する遺伝子の応答の研究は、有用である。なぜなら、遺伝子発現は、その薬物に対するその細胞の応答を決定するからである。従って、本発明の方法は、特定の薬物に対する１以上の細胞の応答を決定するために適用され得る。
【０１２９】
この方法はまた、ＮＣＩパネルの細胞の基底状態を特徴付けるために適用され得る。本明細書において記載される方法を使用して、その薬物によって調節される経路における遺伝子と数万もの薬物との応答とを相関付けし得る。本発明の方法は、ＮＣＩパネルの細胞を用いてこれまでに試験された８万を超える薬物についての発現プロフィールを決定するために適用され得る。この方法は、薬物作用の協調機構、薬物活性を制御するありそうな経路、毒性と相関する経路、アポトーシスおよび他の薬物効果を決定することに適用可能である。
【０１３０】
本発明はまた、基底遺伝子発現を、処置に対する感受性（例えば、薬物の存在、病原体または他の刺激物の存在下での）を、細胞（ＮＣＩパネル細胞）の増殖における相違）と相関付けるために、異なる未処置の細胞または組織のパネルによる遺伝子発現のパターンの使用の方法を提供する。この方法は、処置の前に存在する遺伝子および経路を決定し、そしてまた処置を、その処置によって誘導される表現型と相関付けるために適用され得る。」
遺伝子発現についてのさらなる情報を得るために、異なる条件からの２つの異なるＲＮＡ集団の発現パターンが決定され得る（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４４１９−４４３１（１９９４）；ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１１：２４２−２４６ （１９９５））。例えば、アポトーシスに関心がある場合、ストレスを受けているが、アポトーシスを受けていない細胞からの標的を使用することを使用して、アポトーシスに応答する遺伝子、ストレスに応答する遺伝子、およびその両方に応答する遺伝子を決定し得る。差次的に調節される遺伝子の同定を使用して、種々の条件下での遺伝子の転写活性をさらに特徴付け得る。この遺伝子は、所定の条件に応答するシグナル伝達経路と、調節される遺伝子のプロモーターを相関付けるためにさらに特徴付けられ得る。
【０１３１】
核酸分子の差次的発現を決定する場合、標的におけるＲＮＡサンプルが差次的に調節されることの決定は、まず、その標的サンプルにおける核酸の２つの異なる濃度における差次的な含有量を比較することによってなされる。含有量は、ＲＮＡ供給源の２つの異なる濃度において含有量の相違が観察されない標的サンプルの核酸分子について決定される。両方のＲＮＡ供給源における両方のＲＮＡ濃度での差次的発現を示すそれらのハイブリダイゼーション事象のみが使用される（実施例ＩＩおよびＩＩＩを参照のこと）。
【０１３２】
差次的な発現を決定するためのアレイに対するハイブリダイゼーションについて、４つのメンブレンを放射標識した標的について使用した。２つのＲＮＡサンプルの各々について、ＲＮＡの２つの濃度の各々についてのものを比較した（実施例Ｉ〜ＩＩＩを参照のこと）。二色の蛍光が、その標的の検出のために使用される場合、２つのメンブレンが使用される（出発標的サンプル核酸の２つの濃度の各々についての１つ）。なぜなら、異なる検出可能な蛍光マーカーを有するその２つの標的を混合し得、そして同じプローブに適用され得るからである。次の確認工程が使用される場合（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）、１つのマーカーが、各標的サンプルについて使用され得る。
【０１３３】
差次的な発現の確認は、全長の配列を必要としない。そして、これは、公知の領域のＲＴ−ＰＣＲを用いて確認され得る。特に、低ストリンジェンシーＰＣＲを使用して、数百塩基長の産物を生成し得る（Ｍａｔｈｉｅｕ−Ｄａｕｄｅら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．９２：１５−２８ （１９９８））。この方法は、ＰＣＲ反応の質、ならびに使用されたＲＮＡの質および量を確認するために使用され得る内部「コントロール」ＰＣＲ産物を生成する。
【０１３４】
本発明はさらに、５以上の刺激物が制御する核酸分子のプロフィールを提供する。本明細書において使用される用語「プロフィール（またはプロファイル）」とは、所定のセットの条件下で標的に特徴的である２以上の核酸分子のグループをいう。本発明は、配列番号１〜４５と言及されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の一部を含むプロフィールを提供する。このプロフィールは、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号のヌクレオチド配列の一部を含む：Ｈ１１５２０、Ｈ１１１６１、Ｈ１１０７３、Ｕ３５０４８、Ｒ４８６３３、Ｈ２８７３５、ＡＦ０１９３８６、Ｈ２５５１３、Ｈ２５５１４、Ｍ１３９１８、Ｈ１２９９９、Ｈ０５６３９、Ｌ４９２０７、Ｈ１５１８４、Ｈ１５１２４、Ｘ７９７８１、Ｈ２５１９５、Ｈ２４３７７、Ｍ３１６２７、Ｈ２３９７２、Ｈ２７３５０、ＡＢ０００７１２、Ｒ７５９１６、Ｘ８５９９２、Ｒ７３０２１、Ｒ７３０２２、Ｕ６６８９４、Ｈ１００９８、Ｈ１００４５、ＡＦ０６７８１７、Ｒ７２７１４、Ｘ５２５４１、Ｈ１４５２９、Ｍ１０２７７、Ｈ２７３８９、Ｄ８９０９２、Ｄ８９６７８、Ｈ０５５４５、Ｊ０３８０４、Ｈ２７９６９、Ｒ７３２４７、Ｕ５１３３６、Ｈ２１７７７、Ｋ００５５８、およびＤ３１７６５。本発明のプロフィールは、以下をコードするヌクレオチド配列の一部を包含する：ＴＳＣ−２２、フィブロネクチンレセプターαサブユニット、レイ（ｒａｙ）遺伝子、Ｘ−ボックス結合タンパク質１、ＣＰＥレセプター、上皮制限ｅｔｓタンパク質ＥＳＸおよびＶａｖ−３。
【０１３５】
本発明はまた、配列番号１〜４５として言及されるヌクレオチド配列の各々の一部を含む標的を提供する。この標的は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号のヌクレオチド配列の一部を含有する：Ｈ１１５２０、Ｈ１１１６１ Ｈ１１０７３、Ｕ３５０４８、Ｒ４８６３３、Ｈ２８７３５、ＡＦ０１９３８６、Ｈ２５５１３、Ｈ２５５１４、Ｍ１３９１８、Ｈ１２９９９、Ｈ０５６３９、Ｌ４９２０７、Ｈ１５１８４、Ｈ１５１２４、Ｘ７９７８１、Ｈ２５１９５、Ｈ２４３７７、Ｍ３１６２７、Ｈ２３９７２、Ｈ２７３５０、ＡＢ０００７１２、Ｒ７５９１６、Ｘ８５９９２、Ｒ７３０２１、Ｒ７３０２２、Ｕ６６８９４、Ｈ１００９８、Ｈ１００４５、ＡＦ０６７８１７、Ｒ７２７１４、Ｘ５２５４１、Ｈ１４５２９、Ｍ１０２７７、Ｈ２７３８９、Ｄ８９０９２、Ｄ８９６７８、Ｈ０５５４５、Ｊ０３８０４、Ｈ２７９６９、Ｒ７３２４７、Ｕ５１３３６、Ｈ２１７７７、Ｋ００５５８、およびＤ３１７６５。本発明はまた、配列番号１〜４５からなる群より選択される核酸配列の一部を含むプローブを提供する。
【０１３６】
本発明は、さらに、その核酸分子が配列番号１〜４５そのものを含まない限り、配列番号１〜４５からなる群より選択される核酸配列を含む実質的に純粋な核酸分子またはその機能的フラグメントを提供する。
【０１３７】
本発明は、さらに、第二の標的と比較した第一の標的における２つ以上の核酸分子の量を測定する方法を提供する。この方法は、プローブに対して２つ以上の核酸分子を含む第一の増幅された核酸標的をハイブリダイズさせる工程を包含する。ここで、その標的は、核酸分子の集団から１つ以上のオリゴヌクレオチドを用いて増幅され、ここで、このオリゴヌクレオチドは、偶然、核酸分子のその集団における核酸分子にハイブリダイズし、ここで、その増幅は、その核酸分子の集団における核酸の含有量に基づかず、そしてその標的におけるその増幅された核酸は、その核酸分子の集団においてあまり豊富ではない核酸について増強される。さらに、本方法においては、そのプローブに対する第一に増幅された核酸標的のハイブリダイゼーションの量を検出する工程であって、ここで、ハイブリダイゼーションの量は、第一の標的における核酸分子の含有量に対応する、工程；ならびに、第一の標的において核酸分子の含有量を、第二の標的における核酸分子の含有量と比較する工程であって、ここで、増幅された核酸標的は、最初の核酸集団における核酸のサブセットを含む、工程が包含される。
【０１３８】
本発明は、さらに、第二の標的と比較した第一の標的における２つ以上の核酸分子の量を測定する方法を提供する。この方法は、プローブに対して５０以上の核酸分子を含む第一の増幅された核酸標的をハイブリダイズさせる工程を包含する。ここで、この標的は、核酸分子の集団から増幅され、そしてこの増幅は、核酸分子の集団における核酸の含有量には基づかず、そしてその標的における増幅された核酸は、核酸分子の集団におけるより少ない含有量の核酸について増強される。この方法は、さらに、そのプローブに対して、増幅された核酸標的のハイブリダイゼーションの量を検出する工程（ここで、ハイブリダイゼーションの量は、第一の標的における核酸分子の発現レベルに対応する）；ならびに、第二の標的における核酸分子の含有量と、第一の標的における核酸分子の含有量とを比較する工程（ここで、その増幅された核酸標的は、ＲＮＡ集団のような各核酸集団における核酸のサブセットを含む）を包含する。
【０１３９】
本明細書において使用される用語「偶然にハイブリダイズする」とは、オリゴヌクレオチドについて言及する場合、そのオリゴヌクレオチドの相補的配列に対するハイブリダイゼーションが所定の核酸分子に生じる相補的配列の統計学的頻度に基づいていることを意味する。偶然にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドの配列を決定すること、続いてそのオリゴヌクレオチドが１つ以上の核酸分子にハイブリダイズするか否かを決定することによって、生成される。そのようなオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、公知の核酸分子の配列によっては予め定まらず、それゆえ偶然生じる。それ自体、任意のオリゴヌクレオチドは、偶然ハイブリダイズすると考えられる。なぜなら、そのオリゴヌクレオチドは、増幅される正確な配列を参照することなく決定されるからである。対照的に、偶然にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドは、第一に公知の配列を分析すること、次いで複数のそれらのオリゴヌクレオチドの間の正確な配列を増幅するオリゴヌクレオチドとして使用され得る核酸分子中における正確な配列を同定することによって生成される。そのようなオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、公知の核酸分子の配列によって予め決定されており、それゆえ、偶然には生じない。
【０１４０】
本明細書において使用される句「増幅は含有量に基づかない」とは、ある標的が、その集団における個々の核酸分子の相対量を参照することなく核酸分子の集団における核酸分子の代表である核酸分子を含むことを意味する。
【０１４１】
本明細書において使用される句「あまり豊富でない核酸について増幅される」とは、核酸分子の集団においてあまり豊富でない個々の核酸分子が、これらのあまり豊富ではない核酸分子の量が核酸分子のもとの集団におけるこれらの核酸分子の量と比べて増加するように増幅されることを意味する。従って、核酸分子の集団における核酸分子の相対比は、その標的において維持されない。
【０１４２】
本明細書において使用される用語「単一サンプル」とは、標的に言及して用いられる場合、その標的が別のサンプルには以前に曝露されていない単一の細胞、組織または器官のサンプルからの核酸分子を用いて生成されることを意味する。例えば、標的が、別のサンプルに対する１つのサンプルの曝露によって決定された核酸分子の集団から生成される場合（例えば、別のサンプルからの１つのサンプルの核酸分子のサブトラクション）、そのような標的は、単一のサンプルに由来すると考えられない。
【０１４３】
以下の実施例は、本発明の例示を意図し、限定することは意図しない。
【０１４４】
（実施例１：ＤＮＡアレイをプローブするための恣意的にサンプリングした標的の生成および使用）
本実施例は、ｍＲＮＡ発現を決定するためのＤＮＡアレイをプローブするために減少した複雑性を有する恣意的にサンプリングした標的の生成を記載する。
【０１４５】
ＤＮＡフィンガープリントを、ＲＡＰ−ＰＣＲを用いて生成し、そしてランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド（Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ ＴＸ）を用いて高比活性のプローブへと変換した。ＲＡＰ−ＰＣＲからの１０μｇまでのＰＣＲ産物をＱＩＡＱＵＩＣＫ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．；Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）を用いて精製した。このキットは、取り込まれていない塩基、プライマーおよび４０塩基対より小さなプライマーダイマーを除去する。このＤＮＡを、１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．３中に回収した。（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰからの放射性リンの取り込みを伴うランダムプライム合成を、標準的な条件下で使用した。回収されたフィンガープリントＤＮＡの１０％（１０μｌ）を、２８μｌの総量中で、６μｇのランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドプライマーおよび１μｇのフィンガープリントプライマー（Ｇｅｎｏｓｙｓ）の一方と合わせ、３分間煮沸し、次いで氷上に置いた。ヘキサマー／プライマー／ＤＮＡの混合物を、２２μｌの反応混合物と混合して、０．０５ｍＭの濃度の３つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ；ｄＣＴＰなし）、１００μＣｉの３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ（α−３２ｐ）ｄＣＴＰ（１０μｌ）、ｌ×クレノウフラグメント緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＮａＣｌ）および８Ｕ クレノウフラグメント（３．８２ Ｕ／μｌ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）を含む５０μｌの反応物を得た。この反応を室温で４時間行った。最大の標的長について、その反応を、１μｌの２．５ｍＭ ｄＣＴＰを添加することで追跡し、そして１５分間室温でインキュベートし、続いてさらに３７℃で１５分間インキュベートした。取り込まれていないヌクレオチドおよびヘキサマーを、Ｑｉａｇｅｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて除き、そして精製された産物を、１４０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．３中に２回溶出した。
【０１４６】
そのアレイへのハイブリダイゼーションについて、４つのメンブレンを、放射性標識された標的について、比較される２つのＲＮＡサンプルの各々についてＲＮＡの２つの濃度の各々について１つを使用した。ｃＤＮＡフィルター（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を調製するために、そのフィルターを、残留の細菌残渣を減少させるために平底容器の水平振盪で、２×ＳＳＣおよび０．ｌ％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の３回の交換において予備洗浄した。２０×ＳＳＣは、３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸Ｎａ３−２Ｈ２Ｏ、ｐＨ ７．０を含む。第一の洗浄を、室温で１０分間５００ｍｌにおいて行った。第二および第三の洗浄を１リットルの予め暖めた（５０℃）予備洗浄溶液中で、それぞれ１０分間行った。
【０１４７】
予備ハイブリダイゼーションについて、そのフィルターを、ローラーボトルに移し、そして６０ｍｌの予め暖めた（４２℃）の予備ハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、５×デンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ
断片化させ、変性させたサケ精子ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）および５０％ホルムアミド（Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ ＷＩ）を含む）中で１〜２時間４２℃にて予備ハイブリダイズさせた。５０×デンハルトの溶液は、１％ Ｆｉｃｏｌｌ、１％ポリビニルピロリドンおよび１％ウシ血清アルブミン（滅菌濾過）を含む。
【０１４８】
ハイブリダイゼーションについて、予備ハイブリダイゼーション溶液を除去し、そして７ｍｌの予め暖めた（４２℃）ハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ断片化され変性させたサケ精子ＤＮＡおよび５０％ホルムアミドを含む）を添加した。反復配列（例えばＡｌｕ反復）に起因するバックグラウンドハイブリダイゼーションを減少させるために、長い間隔を置いた反復性のエレメント（ＬＩＮＥ）またはセントロメアＤＮＡ反復、変性ヒトゲノムＤＮＡ（１μｇ／ｍｌストック濃度）を、沸騰水浴中で１０分間変性させ、そして直ぐに最終濃度１０μｇ／ｍｌでハイブリダイゼーション溶液に加えた。同時に、標識された標的（２８０μｌ）を、沸騰水浴中で４分間変性させ、そして直ぐにハイブリダイゼーション溶液に加えた。ハイブリダイゼーションを、４２℃で２〜４８時間、代表的には１８時間、ハイブリダイゼーションオーブンで、ローラーボトルを用いるかまたはプラスチックバッグ中にシールして行い、そして水浴中でインキュベートした。
【０１４９】
洗浄について、その温度をインキュベータオーブン（Ｔｅｃｈｎｅ ＨＢ−１Ｄ；ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）において５５℃に設定した。ハイブリダイゼーション溶液を注ぎ出し、そしてメンブレンを２回、５０ｍｌの２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳで、５分間室温で洗浄した。次いで、そのメンブレンを、１００ｍｌ ０．ｌ×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳで洗浄し、そして１０分間室温でインキュベートした。さらなる洗浄について、洗浄溶液（０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含む）を、予め５０℃に暖め、そしてそのフィルターを４０分間、１００ｍｌの洗浄溶液を有するローラーボトル中で洗浄した。次いで、そのフィルターを水平に振盪する平底容器に移し、そして１リットルの洗浄溶液中で２０分間緩和な振盪下で洗浄した。そのフィルターを、１００ｍｌの予め暖めた０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含むローラーボトルに戻し、そして１時間インキュベートした。最後の洗浄溶液を除き、そしてそのフィルターを、２×ＳＳＣ中で室温にて手短にリンスした。
【０１５０】
洗浄後、そのメンブレンを、３ＭＭ紙を用いて軽く乾燥し、そしてそのわずかに湿ったメンブレンをＳＡＲＡＮラップ中に包装した。このメンブレンを、Ｘ線フィルムに曝露した。
【０１５１】
図１は、クローンアレイに対する差次的ハイブリダイゼーションを示す。４つすべての画像は、より大きなメンブレンの同じ部分についてのオートラジオグラムの拡大図を示す。
【０１５２】
各画像は、約４０００の二連のスポットＥ．ｃｏｌｉコロニーにわたる。その各々は、異なるＥＳＴクローンを有する。パネルＡは、逆転写の間に放射標識したコンフルエントのヒトケラチノサイトからの１μｇのポリＡ＋ＲＮＡのハイブリダイゼーションを示す。約５００の明らかにハイブリダイズするクローンが見られ得る。パネルＢおよびＣは、未処理（パネルＢ）またはＥＧＦで処理した（パネルＣ）コンフルエントのヒトケラチノサイトのオリゴ（ｄＴ）プライムされたｃＤＮＡからのｃＤＮＡ上にて行われた一対の恣意プライマーを用いたＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを示す。ハイブリダイズする遺伝子のパターンをは、パネルＢおよびＣにおいてほぼ同一であったが、（パネルＡと比較すると）総ポリＡ＋ＲＮＡを用いて見られるものとは全く異なっていた。１つの差次的に発現されるｃＤＮＡからの２つの放射標識されたコロニーは、矢印によって示される。次いで、この遺伝子の差次的発現を、特異的なＲＴ−ＰＣＲ（Ｔｒｅｎｋｌｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３８８３−３８９１（１９９８））によって確認した。
【０１５３】
図１Ｄは、コンフルエントのヒトケラチノサイトからのＲＮＡにおいて行われた、異なる対の恣意プライマーを用いたＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを示す。ハイブリダイゼーションのこのパターンは、以前のプライマー対を用いて（パネルＢ）およびｍＲＮＡを用いて（パネルＡ）見出されるものとはほとんど完全に異なっており、ここで、パネルＤとパネルＡおよびパネルＢとの間の重複するスポットは殆どなかった。
【０１５４】
これらの結果は、恣意的にサンプリングされた標的（これは、減少した複雑性を有する）が、標的として総メッセージを用いて検出可能ではないｍＲＮＡの検出を可能にすることを実証する。従って総メッセージ標的（これは、それらの含有量に基づいてｍＲＮＡを検出する）とは異なり、恣意的にサンプリングされた標的を使用して、あまり豊富ではないｍＲＮＡを検出し得る。
【０１５５】
（実施例ＩＩ：ＲＴ−ＰＣＲによって生成された、恣意的にサンプリングされた標的は、ＥＧＦに対して応答して差次的に発現された遺伝子を検出する）
本実施例は、ＥＧＦを用いた細胞の処置の際の差次的な遺伝子発現を検出するための恣意的にサンプリングされた標的を生成するための、恣意プライマ−を用いたＲＴ−ＰＣＲの使用を記載する。
【０１５６】
ＲＴ−ＰＣＲによって生成された、恣意的にサンプリングされた標的を使用して、差次的な遺伝子発現についてのアレイをプローブした（Ｔｒｅｎｋｌｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３８８３−３８９１ （１９９８））。ＲＮＡ調製物について、不死化させたヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴ （Ｂｏｕｋａｍｐら、Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ １９：２０１−２１４ （１９９７））をコンフルエンスにまで増殖させて、そして２日間コンフルエンスに維持した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを含む培地であるＤＭＥＭを、実験の１日前に交換した。ＥＧＦ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を、２０ｎｇ／ｍｌで添加したか、またはＴＧＦ−β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）を５ｎｇ／ｍｌで添加した。処置細胞および未処置細胞を、４時間後、溶解緩衝液（ＲＬＴ緩衝液；Ｑｉａｇｅｎ）の存在下でペトリ皿をかきとることによって採集し、そしてＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を通してホモジナイズした。平均して７×１０６の細胞（１００ｍｍ直径のペトリ皿中コンフルエントにまで増殖した）から、ＲＮＥＡＳＹ総ＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）から、４０μｇの総ＲＮＡを得た。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２緩衝液ｐＨ８中のＲＮＡを、０．０８ Ｕ／μｌのＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅおよび０．３２Ｕ／μｌのＲＮａｓｅインヒビター（両方ともＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ由来）とともに、３７℃で４０分間インキュベートし、そしてＲＮＥＡＳＹキットを用いて再びきれいにした。このことは、フィンガープリントに寄与し得る少量のゲノムＤＮＡを除去するために重要である。ＲＮＡの量を、分光学的に測定した。そしてＲＮＡサンプルを、水中の４００ｎｇ／μｌに調整した。ＲＮＡサンプルを、アガロースゲル電気泳動によって質および濃度についてチェックし、そして−２０℃にて保存した。
【０１５７】
ＲＮＡフィンガープリントについて、ＲＡＰ−ＰＣＲを、標準的なプロトコルを用いて実施した（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄら、前出、１９９４）。逆転写を、一つのサンプルあたりで４つの濃度（１反応物あたり１０００ｎｇ、５００ｎｇ、２５０ｎｇおよび１２５ｎｇ）およびオリゴｄ（Ｔ）プライマー（１５マー）（Ｇｅｎｏｓｙｓ）を用いて総ＲＮＡに対して行った。ＲＮＡ（５μｌ）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２，２０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、各々０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．５μＭのプライマー、および２０ＵのＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を含む１０μｌの最終反応容量のために５μｌの緩衝液と混合した。初期のＲＡＰ−ＰＣＲ実験において逆転写酵素を含まないコントロールを含ませることによって、ＲＮＡサンプルを、ＤＮＡ夾雑物についてチェックした。この反応を、５分間での２５℃から３７℃への勾配の後３７℃で１時間行った。この酵素を、そのサンプルを５分間９４℃に加熱することによって不活化し、そして新たに合成されたｃＤＮＡを、水中に４倍に希釈した。
【０１５８】
ＰＣＲを、恣意的配列（対Ａ：ＧＰ１４（ＧＴＡＧＣＣＣＡＧＣ；配列番号 ）およびＧＰ１６（ＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡ；配列番号 ）、対Ｂ：Ｎｕｃｌ＋（ＡＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧ；配列番号 ）およびＯＰＮ２４（ＡＧＧＧＧＣＡＣＣＡ；配列番号 ））の１対の２つの異なる１０マーまたは１１マーのオリゴヌクレオチドプライマーの添加後に行った。一般に、それらが少なくともいくつかのＣまたはＧの塩基を含むこと、プライマーダイマーを避けるためにその３’末端がそれら自身または反応物中の他のプライマーに対して相補的ではないこと、およびｍＲＮＡの同じ部分が異なるフィンガープリントにおいて増幅されないように配列中の異なるプライマーセットが選択されることを除いて、そのプライマーには何ら特定の制限はない。
【０１５９】
希釈されたｃＤＮＡ（１０μｌ）を、最終反応容量２０μｌについて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．３、２０ｍＭ ＫＣｌ、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各々０．３５ｍＭのｄＮＴＰ、各々２μＭのオリゴヌクレオチドプライマー、２μＣｉ α−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰ（ＩＣＮ；Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）および５ Ｕ ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼＳｔｏｆｆｅｌフラグメント（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ ；Ｎｏｒｗａｌｋ ＣＴ）を含む同じ容量の２×ＰＣＲ混合物と混合した。サーモサイクリングを、９４℃で１分間、３５℃で１分間および７２℃で２分間の３５サイクルを用いて行った。
【０１６０】
増幅産物の３．５μｌアリコートを９μｌのホルムアミド色素溶液と混合し、８５℃で４分間変性し、そして氷上で冷却した。２．４μｌを、０．０９Ｍ Ｔｒｉｓ−ホウ酸、０．００２Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有する１×ＴＢＥ緩衝液で調整した。５％ポリアクリルアミド、４３％尿素ゲルにロードした。同じＲＮＡテンプレートの４つの異なる濃度から生じるＰＣＲ産物を、ゲル上で横に並べてロードした。
【０１６１】
電気泳動を、１，７００Ｖで、または５０〜７０ワットの定電力で、キシレンシアノールトラッキング色素がゲルの底部に達するまで（約４時間）実施した。このゲルを減圧下で乾燥し、そしてＫｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ Ｘ線フィルム上に１６〜４８時間配置した。
【０１６２】
プローブアレイに対する標的として使用するためのＲＡＰ−ＰＣＲ産物の標識化のために、ＲＡＰ−ＰＣＲからの１０μｇまでのＰＣＲ産物を、ＱＩＡＱＵＩＣＫ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。これは、取り込まれなかった塩基、プライマー、およびプローブダイマー（４０塩基対以下）を取り除く。ＤＮＡを、５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）中に回収した。
【０１６３】
α−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰの取り込みを伴うランダムプライム合成を、本質的に実施例Ｉに記載のように実施した。簡単に述べれば、回収されたフィンガープリントＤＮＡの１０％（代表的には、５μｌ中約１００ｎｇ）を、総容量１４μｌで、３μｇのランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドプライマーおよび各フィンガープリントプライマー０．３μｇと合わせた。これを３分間沸騰させ、次いで氷上に配置した。
【０１６４】
ヘキサマー／プライマー／ＤＮＡ混合物を、１１μｌ反応混合物と混合し、０．０５ｍＭの３つのｄＮＴＰ（ｄＣＴＰを含まない）、５０μＣｉの３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌのα−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰ（５μｌ）、１×クレノウフラグメント緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、および４Ｕクレノウフラグメント（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含む）を含む２５μｌの反応物を得た。反応を、室温で４時間実施した。最大標的長のために、反応を、１μｌの１．２５ｍＭのｄＣＴＰを添加することにより追跡し、そして２５℃で１５分間インキュベートし、続いて３７℃でさらに１５分間インキュベートした。取り込まれなかったヌクレオチド、ヘキサマー、およびプライマーを、Ｑｉａｇｅｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて除去し、そして精製産物を、１４０μｌの１０ｍＭＴｒｉ（ｐＨ８．３）の２つのアリコートを使用して溶出した。
【０１６５】
標的として使用するためのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡの標識化のために、ランダムヘキサマーをポリ（Ａ）＋選択ｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡを標識するために使用した。ゲノムＤＮＡ（１５０ｎｇ）を、上記のＲＡＰ−ＰＣＲ産物の標識化のために使用した同じプロトコルを使用して標識化した。２７μｌの容量中ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ（１μｇ）および９μｇランダムヘキサマーを、７０℃で２時間インキュベートし、そして氷上で冷却した。ＲＮＡ／ヘキサマー混合物を、２３μｌのマスター混合物と混合した。これは、１０μｌの５×ＡＭＶ反応緩衝液を含み、これは、最終容量５０μｌで、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、４０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、１μｌの３つのｄＮＴＰ、各３３ｍＭ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ；ｄＣＴＰを含まない）、２μｌのＡＭＶ逆転写酵素（２０単位；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および１０μｌ ３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ α−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰを含む。この反応物を、室温で１５分間インキュベートし、１時間４７℃に立ち上げ、４７℃で１時間保ち、そして４７℃で別に３０分間、１μｌの３３ｍＭ ｄＣＴＰを用いて追跡した。標識化された産物を、上述のようにして精製した。
【０１６６】
アレイに対するハイブリダイゼーションのために、４つの膜を使用した。１つの膜は、比較されるべき２つのＲＮＡサンプルの各々について２つのＲＮＡ濃度の各々に対する。ｃＤＮＡフィルター（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、平底容器で垂直に振盪して２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを３回換えて洗浄し、残りの細菌細片を減少させた。最初の洗浄を、室温で１０分間５００ｍｌで実施した。第二および第三の洗浄を、５５℃に予め暖めておいた１リットルの前洗浄溶液で、各洗浄ごとに１０分間実施した。
【０１６７】
プレハイブリダイゼーションについて、フィルターをローラーボトルに移し、そして、４２℃に予め暖めておいた６０ｍｌプレハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ，５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌフラグメント化変性サケ精子ＤＮＡ、および５０％ホルムアミドを含む）中で、ハイブリダイゼーションオーブン中で４２℃で１〜２時間、プレハイブリダイズした。
【０１６８】
ハイブリダイゼーションのために、プレハイブリダイゼーション溶液を除去し、そして４２℃に予め暖めておいた７ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌフラグメント化変性サケ精子ＤＮＡ、および５０％ホルムアミドを含む）を添加した。ＡｌｕエレメントおよびＬｉｎｅエレメントのような繰り返しに起因するバックグラウンドハイブリダイゼーションを減少させるために、剪断ヒトゲノムＤＮＡを、沸騰水浴中で１０分間変性させ、そしてその直後に最終濃度１０μｌ／ｍｌにまでハイブリダイゼーション溶液に添加した。１０ｎｇ／ｍｌポリ（ｄＡ）を添加し、放射性標識化標的中でオリゴｄ（Ｔ）ストレッチをブロックした。同時に、標識化された標的は、総容量２８０μｌで、沸騰水浴中で４分間変性させ、そしてその直後にハイブリダイゼーション溶液に添加した。ハイブリダイゼーションを、４２℃で２〜４８時間、代表的には１８時間、大きなローラーボトル中で実施した。
【０１６９】
洗浄のために、インキュベーターオーブン温度を６８℃に設定した。ハイブリダイゼーション溶液を注ぎ出し、膜を、室温で５分間、５０ｍｌの２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで２回、洗浄した。次いで、洗浄溶液を、１００ｍｌの０．１×ＳＳｃおよび０．１％ＳＤＳに代え、そして室温で１０分間インキュベートした。さらなる洗浄のために、洗浄溶液（０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する）を６８℃に予め暖めた。膜を、ローラーボトルにおいて、１００ｍｌの洗浄溶液中で４０分インキュベートし、次いで、フィルターを垂直に振盪する平底容器に移し、１リットル中で２０分間穏やかに攪拌しながら洗浄した。フィルターを、予め６８℃に暖めた１００ｍｌの０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有するローラーボトル中に戻し、そして１時間インキュベートした。最終洗浄溶液を除去し、このフィルターを２×ＳＳＣで室温で簡単にリンスした。
【０１７０】
洗浄後、この膜を３ＭＭ濾紙でブロットし、加湿させながらＳＡＲＡＮラップ中に包み、Ｘ線フィルムに露出した。この膜は、通常、十分に放射性であり、スクリーンへの１日曝露により、ＥＳＴクローンを有する１８，４３２の細菌コロニーのアレイ上の上方の１０００の産物が明示された。より弱い標的またはより薄いハイブリダイゼーション事象を、−７０℃で２〜３日間、増感スクリーンを用いて可視化した。
【０１７１】
差次的発現の確認のために、低いストリンジェンシーのＲＴ−ＰＣＲを用いた。差次的発現の最初の確認は、１サンプル当たり２つのＲＮＡ濃度の使用であった。両ＲＮＡサンプルにおける両ＲＮＡ濃度で差次的発現を示したハイブリダイゼーション事象のみが期待される。
【０１７２】
Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．協会クローンの７０％より多くが、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託された５’末端もしくは３’末端、または両方からの単一路の配列読みを有する。以前の配列情報が利用可能でない場合、クローンは、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓから順に並べられて、配列決定され得る。ＭａｃＶｅｃｔｏｒ ６．０（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ；Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ）を用いて１８〜２５塩基長のＰＣＲプライマーを誘導するために、配列を使用した。一般に、５０〜２５０塩基対のＰＣＲ産物を生成し、そして少なくとも６０℃の融解温度を有するように、プライマーを選択した。
【０１７３】
上記のＲＡＰ−ＰＣＲプロトコルにおける条件と同じ条件下で、オリゴｄ（Ｔ）プライマーまたはランダムな９マーのプライマーの混合物（Ｇｅｎｏｓｙｓ）を用いて、逆転写を実施した。ＰＣＲ反応を、以下に記載の２対の特異的プライマー（１８〜２５マー）を用いて実施した。ＰＣＲ条件は、１．５μＭの各プライマーを使用したことを除いては、ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントプロトコルにおける条件と同じであった。低いストリンジェンシーの熱プロフィールを使用した：９４℃で４０秒、４７℃で４０秒、および７２℃で１分（３つの別個の反応管中で１９、２２、および２５サイクル）。反応は、異なるサイクル数で３セットの管中で実施した。なぜなら、転写物の豊富さ、プライマー対の性能、およびＰＣＲ産物の増幅能は変動し得るからである。ＰＣＲ産物を、５％ポリアクリルアミドおよび４３％尿素ゲル上で上述と同じ条件下で流した。ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに１８〜７２時間露出させた。フィンガープリント中の他の恣意的産物間の不変性を、相対的定量の信頼性を示すために、内部コントロールとして使用した。
【０１７４】
プライマー対（Ｇｅｎｏｓｙｓ）を、差次的発現の確認のために使用した。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１１５２０（９０ヌクレオチド産物）について；プライマーＡ、ＡＡＴＧＡＧＧＧＧＧＡＣＡＡＡＴＧＧＧＡＡＧＣ（配列番号 ）；プライマーＢ、ＧＧＡＧＡＧＣＣＣＴＴＣＣＴＣＡＧＡＣＡＴＧＡＡＧ（配列番号 ）。ＴＳＣ−２２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３５０４８、Ｈ１１０７３、Ｈ１１１６１；１７９ヌクレオチド産物）について；プライマーＡ、ＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＴＧＡＣＡＧＧＴＡＧＣＴＧＧ（配列番号 ）；プライマーＢ、ＡＡＧＴＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＣＣ（配列番号 ）。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ４８６３３（１７８ヌクレオチド産物）について；プライマーＡ、ＣＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＡＡＡＣＡＧＣＣＧＴＧ（配列番号 ）；プライマーＢ、ＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＧＴＧＴＧＴＧＣＴＧ（配列番号 ）。
【０１７５】
分析されるアレイは、１８，４３２のＥ．ｃｏｌｉコロニーを含み、それぞれは、異なるＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．協会ＥＳＴプラスミド（ｗｗｗ−ｂｉｏ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ／ｂｂｒｐ／ｉｍａｇｅ／ｉｍａｇｅ．ｈｔｍｌ）を有し、２２×２２ｃｍ膜（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）上で２回スポットした。Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓアレイは、それらが単位コスト当たりこれまでの最大数のＥＳＴを含有する点で有利である。標的調製のためのＲＮＡフィンガープリンティング。
【０１７６】
ＥＧＦまたはＴＧＦ−βで４時間処理した場合のケラチノサイト（ＨａＣａｔ）における差次的遺伝子発現を探索するために、ＲＡＰ−ＰＣＲ増幅を実施した（Ｂｏｕｋａｍｐら、前出、１９９７）。これらの実験を、コンフルエントなケラチノサイトにおいてＥＧＦおよびＴＧＦ−β処理により差次的に調節された遺伝子を検出するために設計した。ＲＡＰ−ＰＣＲを使用して、正常ケラチノサイトまたは不死ケラチノサイトにおける遺伝子の約１％がＥＧＦに応答し、そしてより少ない遺伝子が、この時間枠でＴＧＦ−βに応答した。
【０１７７】
複数のＲＮＡ濃度および２セットの恣意的に選択されたプライマーを用いてＴＧＦ−βまたはＥＧＦで処理したコンフルエントなケラチノサイト由来のＲＮＡのＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを、図２に示す。レーン１、２、３、および４において、それぞれ２５０、１２５、６２．５、および３１．２５ｎｇのＲＮＡに対してオリゴｄＴプライマーを用いて、逆転写を行った。ＲＮＡは、示されるように、未処理ＨａＣａＴ細胞、ＴＧＦ−β処理ＨａＣａＴ細胞、またはＥＧＦ処理ＨａＣａＴ細胞由来であった。２セットのプライマー、ＧＰ１４およびＧＰ１６（パネルＡ）、またはＮｕｃ１＋およびＯＰＮ２４（パネルＢ）を用いて、ＲＡＰ−ＰＣＲを実施した。２つの差次的に増幅されたＲＡＰ−ＰＣＲ産物のサイズを、矢印で示す（３１７ヌクレオチドおよび２９１ヌクレオチド）。
【０１７８】
図２Ａに示した第一のフィンガープリントにおいて、２つの差次的に調節された産物が検出された。これらをクローニングシ、配列決定した。これらの２つの産物のサイズ、２９１ヌクレオチドおよび３１７ヌクレオチドを、矢印と共に示す（図２Ａを参照のこと）。使用したＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓアレイは、これらの２つのクローンの存在に基づいて選択した。このフィンガープリントを用いて、アレイ中で差次的に調節された遺伝子が、ＲＡＰ−ＰＣＲ産物を単離、クローニング、および配列決定することなく同定され得ることを実証した。図２Ａに示したフィンガープリントおよび図２Ｂに示した第二のフィンガープリント（これは、処理に応じて差次的な調節を提示しなかった）もまた用いて、フィンガープリント上では見えない、薄い差次的に調節された産物が、それにもかかわらず、アレイアプローチによって観察され得ることを実証した。
【０１７９】
得られた結果は、再現性が高かった。ゲル電気泳動を用いて、異なるＲＮＡ濃度で実施された単一の処理条件からのフィンガープリントのいずれにおいてもみることができる、約１００のバンド間で差異がなかった（図２を参照のこと）。同様に、図２Ａのフィンガープリンとに由来する標的によってハイブリダイズした上方の１０００クローンの９９％より多くが、両方の投入ＲＮＡ濃度でみることができた。さらに、９９％より多くの産物が、単一のＲＮＡ濃度での２つの処理条件（＋ＥＧＦおよび−ＥＧＦ）間で同じであった。これらの結果は、ＲＡＰ−ＰＣＲ増幅における上方の１０００のＰＣＲ産物間で高い再現性を示した。
【０１８０】
未処理コントロールおよびＥＧＦ処理サンプルをさらに特徴付けた。図２に示したＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを、上述のようにα−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰを用いてランダムプライム合成によって、高い比活性の放射性の標的に変換した。２つの条件の各々について、２つの異なる濃度でのＲＮＡから生成されたＥＧＦ処理および未処理のフィンガープリントを、２つの異なるフィンガープリンティングプライマー対の各々についてのランダムプライム合成によって、標的に変換した。次いで、これらの放射性標識したフィンガープリント標的を用いて、各々が１８，４３２ Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．協会ｃＤＮＡクローンを含む同一アレイのセットにハイブリダイズさせることによってプローブした。コントロールとして、総ゲノムＤＮＡおよび総ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡもまた、上述のようにランダムプライムすることにより標識し、そして同一アレイ上での標的として使用した。
【０１８１】
ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリント標的、総ｍＲＮＡ標的およびゲノム標的を、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓコロニーアレイのレプリカーゼに対して個々にハイブリダイズさせた。ゲノムＤＮＡを、ブロッキング剤として、および非常に反復性の高い配列に対する競合剤として使用した。０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での６８℃での洗浄は、膜上の公知のＡｌｕエレメントに対する事実上全てのハイブリダイゼーションを除いた。これは、おそらく、Ａｌｕエレメントが、この洗浄ストリンジェンシーで互いに十分に異なるためである。
【０１８２】
各膜の同じ側の半分からのオートラジオグラムを図３に示す。提示された全ての画像は、放射性標識ＤＮＡでのハイブリダイゼーションによりプローブされた同じフィルター（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の複製物の下側の半分のオートラジオグラムである。パネルＡおよびＢは、同じプライマー（ＧＰ１４およびＧＰ１６）を用いて生成され、そして未処理（パネルＡ）ＨａＣａＴ細胞またはＥＧＦ処理（パネルＢ）ＨａＣａＴ細胞に由来する２つのＲＡＰ−ＰＣＲ反応のハイブリダイゼーションを示す。差次的なハイブリダイゼーションシグナルを示す３つの二重スポットクローンが、各アレイ上に標記される。クローンおよび対応する遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、以下である：Ｈ１００４５およびＨ１００９８（ｖａｖ−３に対応する）；ならびにＡＦ０６７８１７（四角）（Ｋａｔｚａｖら、ＥＭＢＯ Ｊ．８：２２８３−２２９０（１９８９））；Ｈ２８７３５、未知遺伝子、ヘパラン硫酸３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ−１に類似、ＡＦ０１９３８６（丸）（Ｓｈｗｏｒａｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８００８−２８０１９（１９９７）；およびＲ４８６３３、未知遺伝子（菱形）。
【０１８３】
図３は、アレイに対するこれらのフィンガープリントからの標的のハイブリダイゼーションの結果を示す。図３Ａおよび図３Ｂに示されるように、２９１ヌクレオチド（ｖａｖ−３、四角で標記）および３１７ヌクレオチド（ヘパラン硫酸Ｎ−スルホトランスフェラーゼ（Ｎ−ＨＳＳＴ）に類似、円で標記）のＲＡＰ−ＰＣＲフラグメントに対応する並べられたクローンを示す。これらのＲＡＰ−ＰＣＲフラグメントの配列を決定した。元のフィンガープリントゲル上で可視化され得ない差次的に調節された遺伝子もまた、このアレイ上に示される（菱形で標記）。
【０１８４】
図３Ａと３Ｂとを比較すると、ＥＧＦでの処理に際し、ｖａｖ−３について１０倍より大きいダウンレギュレーションが観察された。Ｈ２８７３５に対応する遺伝子は、ＥＧＦ処理で１０倍より大きくアップレギュレートされた。Ｒ４８６３３に対応する遺伝子は、ＥＧＦ処理で約３倍アップレギュレートされた。ＥＧＦに応答する遺伝子発現におけるこれらの変化は、ＲＴ−ＰＣＲにより独立に確認された。
【０１８５】
これらの結果は、ＲＡＰ−ＰＣＲが、メッセージの豊富さとはほとんど独立して、ｍＲＮＡの集団をサンプリングすることを示す。これは、あまり豊富ではないクラスのメッセージが、豊富なクラスよりかなり高い複雑度を有し、恣意プライマーが良好な一致をより見出すようにするからである。ディファレンシャルディスプレイとは異なり、ＲＡＰ−ＰＣＲは、２つのこのような恣意的プライミング事象を要求し、おそらく、ＲＡＰ−ＰＣＲを複雑なクラスに向かってずらす。
【０１８６】
全体として、これらのデータは、細胞中のｍＲＮＡ集団の大部分（＜２０，０００ｍＲＮＡ）が、わずか１０程度のＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリント中に見出され得ることを示唆する。この結果は、この事象が標準的なゲル電気泳動アプローチを用いて検出され得ない場合でさえ、差次的な遺伝子調節を、組み合わせたフィンガープリンティングおよびアレイアプローチにより検出し得ることを示す。
【０１８７】
図３Ｃは、パネルＡ中と同じＲＮＡであるが、異なるプライマー対、Ｎｕｃｌ＋およびＯＰＮ２４とともに用い、ＲＡＰ−ＰＣＲ標的とハイブリダイズしたアレイを示す。図３Ｃに示されるように、異なるセットのプライマーを用いることは、ハイブリダイズする遺伝子の完全に異なるパターンを生じる。図３Ｄは、１μｇのポリ（Ａ）＋−選択されたｍＲＮＡの逆転写により生成されたｃＤＮＡとハイブリダイズされたアレイを示す。図３Ｅは、ランダムプライミングを用いて標識したヒトゲノムＤＮＡとハイブリダイズしたアレイを示す。
【０１８８】
データは多くの方法で分析した。最初に、各標的によりハイブリダイズされたクローン間の重複から推定がなされた。異なるタイプの標的のすべての間のすべての対をなす比較において、最も強くハイブリダイズした５００のクローン間で５％より少ない重複があった（図３Ａ、３Ｂ、３Ｄ、および３Ｅを比較のこと）。ゲノム標的によりハイブリダイズされた上方の５００のクローン（Ａｌｕ反復を含むことが知られたほとんどすべてのクローンを含んだ）のうち、５％より少ないものが、フィンガープリント標的または総ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ標的によりハイブリダイズされた上方の５００のクローンと重複した。これは、ゲノム標的の場合を除いて、散在する反復に対する有意なハイブリダイゼーションがなかったことを示す。異なるプライマーを用いて生成された２つのＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントによりハイブリダイズされたクローン間の重複は、３％より少なく、そしてポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ標的とのいずれかのフィンガープリントの重複は、両方とも３％より少なかった。従って、このフィンガープリントからの標的を用いて検出されたｃＤＮＡの大部分は、総ｍＲＮＡ標的を用いて検出され得なかった。これらの結果は、ＲＡＰ−ＰＣＲが、メッセージの豊富さとはほとんど独立に、ｍＲＮＡの集団をサンプリングすることを示す。これは、あまり豊富ではないクラスのメッセージが、豊富なクラスよりかなり高い複雑度を有し、恣意プライマーが良好な一致をより見出すようにするからである。ディファレンシャルディスプレイとは異なり、ＲＡＰ−ＰＣＲは、２つのこのような恣意的プライミング事象を要求し、おそらく、ＲＡＰ−ＰＣＲを複雑なクラスに向かってずらす。
【０１８９】
全体として、これらのデータは、細胞中のｍＲＮＡ集団の大部分（＜２０，０００ｍＲＮＡ）が、わずか１０程度のＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリント中に見出され得ることを示唆する。
【０１９０】
恣意プライマー（図２）の両方のセットから誘導された標的を使用して、約３倍のディファレンシャルハイブリダイゼーションの閾値で、３０個の差次的にハイブリダイズするｃＤＮＡクローンの全てを、約２０００個のハイブリダイズするコロニーの中から検出した。これらの２２個の差次的にハイブリダイズするクローンは、両方のＲＮＡ濃度で差次的ハイブリダイゼーションを示した。これらの２２個を、さらに、ＲＴ−ＰＣＲにより特徴付けた。ＥＧＦ処理に応答しての発現において２倍より高い差異を示す差次的に発現される遺伝子を、表１に示す。表１に示される結果については、差次的発現を低いストリンジェンシーのＲＴ−ＰＣＲにより確認した。左欄はＥＳＴクローンの受託番号を提供する（５’または３’、あるいは入手可能である場合には両方）。右欄は、対応する遺伝子または最も近いホモログを与える。ホモロジーが非常に低い場合には、この遺伝子を未知であるとみなした。ホモロジーについてのカットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）は、ｔｂｌａｓｔｘにおいてｐ＜ｅ−２０であった。
【０１９１】
【表１】
１つの濃度のみでレギュレートされたように思われる８個の擬陽性クローンをさらに特徴付けた。これら８個のうち、５個の擬陽性クローンは、１つの濃度で差次的ハイブリダイゼーションを示し、他の濃度についてはメンブレン上に存在したが、レギュレートされなかった。この型の擬陽性の最もありそうな供給源は、メンブレンである。各クローンは２回スポットされるが、時折、１つのメンブレンは他の３つのメンブレンよりも、これらのクローンについて、両方のスポットにおいて、実質的により高いかまたは低いＤＮＡを受けた可能性がある。しかしながら、この潜在的な差異は、容易に検出され、そしてまれであり、２０００個を超えるクローンにおいてほんの５回生じた。他の３個の擬陽性クローンは、１つの処理条件下のみ、およびＲＡＰ−ＰＣＲのために使用された１つのＲＮＡ濃度でのみ、ハイブリダイズした。これらの３個の擬陽性クローンは差次的に発現された遺伝子であり得たか、または種々のＰＣＲ産物からの擬陽性であり得る。しかし、擬陽性の数は非常に少なく、そして異なる開始濃度のＲＮＡのＰＣＲから誘導される２個の標的の結果を比較することにより、容易に同定された。
【０１９２】
差次的発現は、低ストリンジェンシーのＲＴ−ＰＣＲを使用して確認した。両方のインプットＲＮＡ濃度での差次的発現が示されたハイブリダイゼーション事象の場合のみ、さらに特徴付けられた。ｍＲＮＡの多くが珍しく、そして豊富さが乏しいことが予想されたので、差次的発現の確認のために、ノザンブロッティング（これは、ＲＴ−ＰＣＲよりも感度が非常に低い）よりも特定の標的を用いるＲＴ−ＰＣＲを使用した。Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアムからのアレイを使用する利点の一つは、７０％を超えるクローンが、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託された、５’末端または３’末端からか、あるいは両方からのシングルパス配列読み取り（ｓｉｎｇｌｅ ｐａｓｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄ）を有することである。
【０１９３】
ある配列がデータベース中で利用可能であるクローンを、さらなる特徴付けのために選択した。差次的にレギュレートされるアレイ上の遺伝子を示す２２個のＥＳＴのうちの５個は配列決定されておらず、そして残りの１７個のＥＳＴのうちの２個は同一の遺伝子由来であった。残りの１５個の特有の配列決定された遺伝子を、オーバーラップするクローンからの複数の読み取りおよびより長い配列からより高い質の配列を引き出すために、データベース中の他の配列とともに整列させた。ＵｎｉＧｅｎｅデータベースクラスターは、同一の遺伝子由来と考えられるヒトおよびマウスＥＳＴを集めている（Ｓｃｈｕｌｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５：６９４〜６９８（１９９７））。このデータベースは、同一のｍＲＮＡの異なるクローンからの混成配列をアセンブリするプロセスを非常に助ける（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。次いで、これらの混成配列を、ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーを選択するために使用した。
【０１９４】
各遺伝子について、低ストリンジェンシーの条件下でのＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを生成するために使用されるプライマーに類似した、２つの特異的なプライマーを使用した。目的の産物に加えて、恣意的産物のパターン（これは非常に不変的であり、そしてＲＮＡの質および量、ならびに逆転写効率についての内部標準として振舞う）を生成した（Ｍａｔｈｉｅｕ−Ｄａｕｄｅら、前述、１９９８）。ＰＣＲサイクルの数は、開始テンプレートｍＲＮＡの豊富さにおける差異を補うために、産物の豊富さに従って１４〜２５サイクルの間で調整した。このことは、ＰＣＲの間の大量の産物の再ハイブリダイゼーションがそれらの増幅を阻害し、そして産物の豊富さにおける差異がＰＣＲサイクルの回数が増加するに従い減少するので、必須である（Ｍａｔｈｉｅｕ−Ｄａｕｄｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：２０８０〜２０８６（１９９６））。
【０１９５】
低ストリンジェンシーのＲＴ−ＰＣＲ実験により、図２ＡのＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントで同定し、かつｃＤＮＡアレイに対する差次的ハイブリダイゼーションを示した、２つの転写物の差次的発現を確認した（図３Ａ対３Ｂを比較のこと）。これらの差次的に発現された遺伝子の１つは、ｖａｖプロトオンコジーンファミリーの新規なファミリーメンバーに対応する（Ｋａｔｚａｖら、前出、１９８９；Ｋａｔｚａｖら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇ．６：８７〜９７（１９９５）；Ｂｕｓｔｅｌｏ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇ．７：６５〜８８（１９９６）；ＲｏｍｅｒｏおよびＦｉｓｃｈｅｒ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．８：５４５〜５５３（１９９６））。他の差次的に発現された遺伝子は、ヘパリン硫酸３−Ｏ−スルフォトランスフェラーゼ−１に対するホモロジーを有する（Ｓｈｗｏｒａｋら、前述、１９９７）。
【０１９６】
他の１３個の差次的に発現されたものもまた試験し、そして低ストリンジェンシーのＲＴ−ＰＣＲを使用して１１個を確認した。差次的に発現された遺伝子のいくつかを図４に示す。逆転写を２つのＲＮＡの濃度で行った（５００ｎｇ、左欄；２５０ｎｇ、右欄）。この反応物を水で４倍に希釈し、そして４分の１を異なるサイクル数での低ストリンジェンシーのＲＴ−ＰＣＲのために使用した。このＲＴ−ＰＣＲ産物をポリアクリルアミド−尿素ゲルで分離した。コントロールに対するバンドを示す（２２サイクル）；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｈ１１５２０に対するバンド（２２サイクル）；ＴＳＣ−２２に対するバンド（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｈ１１０７３およびＨ１１１６１に対応する）（１９サイクル）（Ｊａｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２２：８２１−８２６（１９９６）；Ｄｍｉｔｒｅｎｋｏら、Ｔｓｉｔｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３０：４１−４７（１９９６）；Ｏｈｔａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：４６０−４６６（１９９６））；およびＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｒ４８６３３に対するバンド（１９サイクル）。Ｈ１１５２０およびＴＳＣ−２２に対応する遺伝子は、ＥＧＦ処理で約８〜１０倍アップレギュレートされる。Ｒ４８６３３に対応する遺伝子は、ＥＧＦ処理で約３倍アップレギュレートされた。
【０１９７】
確認されなかった２個の差次的に発現される遺伝子のうち、１個は増幅不可能であることが証明された。他方の遺伝子は、産物を生じたが、ＲＴ−ＰＣＲにより分析すると差次的に調節されないようであった。
【０１９８】
ＲＡＰ−ＰＣＲ標的は、まれなあまり豊富ではないｍＲＮＡの検出で非常に有効であった。クローンのセットにハイブリダイズされた各々のフィンガープリントは、オポリ（Ａ）＋選択されたｍＲＮＡから誘導された標的によりハイブリダイズされたセットとはほとんど完全に異なる（図３を参照のこと）。さらに、多数の他のプライマー対、メンブレン、およびＲＮＡ供給源は、任意の２つのフィンガープリントによりハイブリダイズされたクローン間か、またはフィンガープリントと総ポリ（Ａ）＋−選択されたｃＤＮＡ標的との間で、一貫して、５％未満の重複を示した。差次的に発現されたｖａｖ−３ ｍＲＮＡ（これはｖａｖオンコジーンファミリーの新規のメンバーである）の検出を、ポリ（Ａ）＋−選択されたＲＮＡのノザンブロットを使用して試みた。１細胞あたり２、３コピーの等量まで系列希釈したベクターを検出し得るにもかかわらず、ｖａｖ−３ ｍＲＮＡはノザンブロットで検出不可能であったが、ＲＴ−ＰＣＲは発現を確認した。Ｇ３ＰＤＨコントロールを使用して、ノザンブロットに使用される条件がコントロール遺伝子を検出し得ることを確認した。それゆえ、ｖａｖ−３は、ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントにおいて顕著なバンドとして表されるあまり豊富ではないメッセージであるようである。
【０１９９】
ＥＳＴデータベース中でＲＡＰ−ＰＣＲ標的により検出されるｃＤＮＡのホモログの頻度を決定した（＞９８％同一性）。これを同一のメンブレン上の他のｃＤＮＡのランダムセットに対するホモログの頻度と比較した。ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントが共通のｍＲＮＡに非常に偏っていたならば、部分的には、基準化されていないかまたは不完全に基準化されたｃＤＮＡライブラリーに由来するので、その多くはＥＳＴデータベース中に頻繁に生じる。しかし、ＲＡＰ−ＰＣＲにより検出されたｃＤＮＡは、無作為に選択されたｃＤＮＡについての頻度に匹敵するＥＳＴデータベースにおける頻度を有した（これは、クローンがデータベース中で固有であった場合を含む）。これらの結果は、ＲＡＰ−ＰＣＲにより生じた、恣意的にサンプリングした標的によるサンプリングは、少なくとも、アレイを構築するために使用した部分的に基準化したライブラリーの無作為サンプリングと同程度に良好であり、そして総ｍＲＮＡ標的のような標的について得られたものとは非常に異なることを示す。
【０２００】
これらの結果は、ＲＴ−ＰＣＲおよび恣意プライマーを使用して生成された恣意的にサンプリングされた標的が、ＥＧＦに応答して差次的に発現される遺伝子を検出し得ることを実証する。
【０２０１】
（実施例ＩＩＩ）
（ディファレンシャルディスプレイにより生成される、恣意的にサンプリングされた標的は、ＥＧＦに応答して差次的に発現される遺伝子を検出する）
本実施例は、恣意的にサンプリングされた標的を生成するためのディファレンシャルディスプレイの使用およびＥＧＦに応答して差次的に発現される遺伝子の検出を示す。
【０２０２】
ＲＮＡを、実施例ＩＩに記載されるように、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴから調製した。簡単にいうと、細胞をコンフルエンスまで増殖させ、そしてコンフルエンスで２日間維持した。培地を実験の１日前に交換した。ＥＧＦ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を２０ｎｇ／ｍｌで添加した。４時間後に処置細胞および非処置細胞を収集し、そして総ＲＮＡを、ＲＮＥＡＳＹ総ＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、調製した。残留するゲノムＤＮＡを取り除くために、抽出した総ＲＮＡをＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で処理し、そしてＲＮＥＡＳＹキットを使用して再度洗浄した。この精製ＲＮＡを、水で４００ｎｇ／ｕｌに調整し、そしてアガロースゲル電気泳動により質をチェックした。
【０２０３】
標準ディファレンシャルディスプレイのために、各々アンカーオリゴ（ｄＴ）プライマー（０．２μＭ）と共に、各ＲＮＡ鋳型を２０μｌの反応系あたり４つの異なる濃度（８００、４００、２００および１００ｎｇ）を使用することを除いて、ＲＮＡＩＭＡＧＥキット（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ ＴＮ）、ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−ＡＢＩ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）およびα−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰを補充した材料を使用して、製造業者の説明書に従って、ディファレンシャルディスプレイを行った。このＰＣＲ反応系は、２μＭ ｄＮＴＰ（総量４μＭについては、ｃＤＮＡ混合物からの繰越を含む）、０．２μＭの各プライマー、および１０分の１の新規に合成したｃＤＮＡ（これは８０、４０、２０および１０ｎｇのＲＮＡに対応する）を含有した。アンカーオリゴ（ｄＴ）プライマーを、４つの異なる恣意プライマーを用いて可能な全ての組み合わせで使用した。用いたアンカーオリゴ（ｄＴ）プライマーは、Ｈ−Ｔ１１Ｇ（ＨＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ；配列番号 ）；Ｈ−Ｔ１１Ａ（ＨＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡ；配列番号 ）；およびＨ−Ｔ１１Ｃ（ＨＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ；配列番号 ）であった。ここで、ＨはＡＡＧＣであり、これは、プライマーが特定の場所にとどまることを確実にするためのクランプとして使用される恣意的配列であり、引き続いてのＰＣＲ工程で高いＴｍを有する。使用した恣意プライマーは、Ｈ−ＡＰ１（ＡＡＧＣＴＴＧＡＴＴＧＣＣ；配列番号 ）；Ｈ−ＡＰ２（ＡＡＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＴ；配列番号 ）；Ｈ−ＡＰ３（ＡＡＧＣＴＴＴＧＧＴＣＡＧ；配列番号 ）；およびＨ−ＡＰ４（ＡＡＧＣＴＴＣＴＣＡＡＣＧ；配列番号 ）であった。
【０２０４】
改変型ディファレンシャルディスプレイについては、反応系１０μｌあたり４つの異なる濃度の各ＲＮＡ鋳型（１０００、５００、２５０および１２５ｎｇ）を使用して逆転写を行った。この反応混合物は、１．５μＭオリゴ（ｄＴ）アンカープライマーＡＴ１５Ａ、ＧＴ１５ＧおよびＴ１３Ｖ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＤＴＴ、各々０．２ｍＭのｄＮＴＰ、８Ｕ ＲＮａｓｅインヒビター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および２０Ｕ ＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含んだ。アンカープライマーはＡＴ１５Ａ（ＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡ；配列番号 ）；ＧＴ１５Ｇ（ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ；配列番号 ）；およびＴ１３Ｖ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ；配列番号 ；ここで、ＶはＡ、ＧまたはＣである）であった。この反応混合物を、２５℃から３７℃へ５分間かけて変化させ（ｒａｍｐ）、３７℃で１時間保持し、そして最終的には酵素を９４℃で５分間不活化した。新規に合成したｃＤＮＡを水で４倍に希釈した。
【０２０５】
１０μｌの希釈したｃＤＮＡ（これは２５０、１２５、６２．５および３１．２５ｎｇのＲＮＡに対応する）に、１０μｌの反応混合物を添加して２０μｌの最終反応容量（これは、２μＭアンカーオリゴ（ｄＴ）プライマー、０．４μＭ恣意プライマー、ＫＡ２（ＧＧＴＧＣＣＴＴＴＧＧ；配列番号 ）またはＯＰＮ２８（ＧＣＡＣＣＡＧＧＧＧ；配列番号 ）のいずれか、２．５単位ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼＳｔｏｆｆｅｌフラグメント（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−ＡＢＩ）、２μＣｉ α−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰ、ｄＮＴＰ各１７５μＭ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌおよび３．１２５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する）を得た後、ＰＣＲを行った。これらの濃度は、逆転写反応からの持ち越し分は含まない。反応を、９４℃で４０秒間、４０℃で１分４０秒、そして７２℃で４０秒の３５サイクルでサーマルサイクルを行った。
【０２０６】
４つの異なる濃度の同一のＲＮＡ鋳型から生じるＰＣＲ産物のアリコートを、実施例ＩＩに記載されるように、５％ポリアクリルアミドゲル上に並べて示し、そしてオートラジオグラフィーにより可視化した。
【０２０７】
アレイをプローブするための標的として使用するためにディファレンシャルディスプレイ産物の標識のために、ディファレンシャルディスプレイ産物のランダムプライム化標識を、実施例ＩＩに記載されるように行った。ディファレンシャルディスプレイＰＣＲ反応物（１４μｌ）を、ＱＵＩＡＱＵＩＣＫ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫＩＴ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、そしてＤＮＡを５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）中に回収した。ランダムプライム合成を、標準的プロトコールを使用して行った。簡単に言うと、５μｌの回収したディファレンシャルディスプレイ産物を、３μｇのランダムへキサマーと合わせ、３分間煮沸し、そして氷上に置いた。ヘキサマー／ＤＮＡ混合物を、反応混合物と合わせて、０．０５ｍＭの３種のｄＮＴＰ（ｄＣＴＰを除く）、５０μＣｉの３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ α−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰ、１×Ｋｌｅｎｏｗフラグメント緩衝液、および４ＵのＫｌｅｎｏｗフラグメント（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含有する２５μｌの反応系を得た。この反応を室温で４時間行い、１μｌの１．２５ｍＭ ｄＣＴＰを添加することにより室温で１５分間チェイスし、そしてさらに１５分間３７℃でインキュベートした。組み込まれていないヌクレオチドおよびヘキサマーをＱｉａｇｅｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔを用いて取り除き、そして精製産物を１４０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）の２個のアリコートを使用して溶出した。
【０２０８】
アレイへのハイブリダイゼーションを、本質には実施例ＩおよびＩＩに記載されるように行った。簡単にいうと、ｃＤＮＡメンブレン（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、残余の細菌性細片を減少するための水平方向振盪平底容器中で、２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含有する予備洗浄溶液を３回交換して予備洗浄した。１回目の洗浄は、５００ｍｌの予備洗浄緩衝液を室温で１０分間使用した。２回目および３回目の洗浄は、各々、５５℃まで予め加温した１リットルの予備洗浄溶液中で、１０分間行った。
【０２０９】
このメンブレンを大型のローラービンに移し、そして予め４２℃まで加温した６０ｍｌのプレハイブリダイゼーション溶液（これは６×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌフラグメント化変性サケ精子ＤＮＡおよび５０％ホルムアルデヒドを含有する）中で、１〜２時間の間、４２℃でプレハイブリダイズさせた。
【０２１０】
プレハイブリダイズ溶液を取り除き、そして予め４２℃まで加温した１０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（これは６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌフラグメント化変性サケ精子ＤＮＡおよび５０％ホルムアルデヒドを含有する）をこのボトルに添加した。ＡｌｕおよびＬｉｎｅエレメントのような反復（これはヒトゲノムＤＮＡに共通である）に起因するバックグラウンドハイブリダイゼーションを減少するために、煮沸水浴で１０分間変性させ、そしてすぐに１０μｇ／ｍｌの終濃度でハイブリダイゼーション溶液を添加した。１０ｎｇ／ｍｌポリ（ｄＡ）の１アリコートを添加して、放射標識標的中のオリゴ（ｄＴ）ストレッチをブロックした。同時に、標識した標的を煮沸水浴中で４分間変性し、そしてすぐにハイブリダイゼーション溶液を添加した。このハイブリダイゼーションは、４２℃で１８〜２０時間行った。
【０２１１】
ハイブリダイゼーションに続いて、このハイブリダイゼーション溶液を注ぎだして、そしてメンブレンを６回の洗浄溶液の交換で２〜３時間にわたって徹底的に洗浄した（これはローラーボトルから水平方向に振盪する平底容器へメンブレンを移し、そしてローラーボトルに戻す工程を包含する）。この洗浄のストリンジェンシーは、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ（室温）から、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ（６４℃）へと段階的に増加させた。この個々の洗浄は、全てのメンブレンについて、正確に同一の示された温度に維持した。最後の高ストリンジェンシーな洗浄は少なくとも４０分であり、全てのボトルにおいて正確に平衡化した温度を確保した。この最終の洗浄溶液を取り除き、そしてメンブレンを２×ＳＳＣで室温で簡単にリンスし、３ＭＭの紙でブロッティングし、湿気を帯びている間にＳＡＲＡＮラップで覆い、そしてＫｏｄａｋ Ｂｉｏｍａｘフィルムに対して配置した（Ｅａｓｔｍａｎ−Ｋｏｄａｋ；Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）。
【０２１２】
低ストリンジェンシーのＲＴ−ＰＣＲを使用して差次的発現を確認した。確認の最初のレベルは１サンプルあたり２つのＲＮＡ濃度の使用であった。両方のＲＮＡサンプルにおいて両方のＲＮＡ濃度で差次的発現を示すハイブリダイゼーション事象のみをさらに特徴付けた。
【０２１３】
Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（アレイの商業的供給元）から入手可能したヌクレオチド、または配列決定したヌクレオチド配列を用いて、１８〜２５塩基長のＰＣＲプライマーを誘導した（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ ６．０（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ）を使用）。一般に、選択した、１００〜２５０塩基対のＰＣＲ産物を生成するプライマーは、少なくとも６０℃の融解温度を有し、そして好ましくは、ファミリーメンバーをサンプリングする可能性を減少させるように、ｍＲＮＡのポリアデニル化部位に近接して配置された。
【０２１４】
逆転写を、サンプルあたり２つのＲＮＡ濃度およびオリゴ（ｄＴ１５）プライマー（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ；配列番号 ；Ｇｅｎｏｓｙｓ）を使用して総ＲＮＡに対して行った。反応物は、１ｌあたり１００ｎｇおよび５０ｎｇの総ＲＮＡ、０．５μＭオリゴ（ｄＴ１５）プライマー（配列番号 ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．８Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅインヒビター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および２Ｕ／μｌのＭｕＬＶ−逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含んだ。反応物を、２５℃から３７℃まで急激に上げ、そして３７℃で１時間維持した。反応物を９４℃で５分間加熱することにより、酵素を不活化し、そして新たに合成したｃＤＮＡを水で４倍に希釈した。
【０２１５】
希釈したｃＤＮＡ（１０μｌ）を、２×ＰＣＲ混合物（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、２０ｍＭ ＫＣｌ、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３５ｍＭの各ｄＮＴＰ、３μＭの各特異的プライマー、２μＣｉ α−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰ（ＩＣＮ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）および２ＵのＡＭＰＬＩＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼＳｔｏｆｆｅｌフラグメント（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ））と２０μｌの最終反応容量に混合した。低ストリンジェンシーサーマルプロファイルは、以下を使用した：９４℃で４０秒、４０℃で４０秒、および７２℃で１分、別個のチューブで１７サイクルおよび１９サイクル。この反応物を、異なるサイクル数で２セットのチューブで行った。なぜなら、転写物の量、プライマー対の性能およびＰＣＲ産物の増幅能力は変化し得るからである。ＰＣＲ産物を上記と同じ条件下で５％ポリアクリルアミドおよび４３％尿素ゲル上で泳動した。このゲルを乾燥させて、１８〜７２時間ホスホルイメージャースクリーン上に置き、そしてＳＴＯＲＭホスホルイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）で読みとった。フィンガープリントにおける他の恣意的産物の間の不変性を内部コントロールとして使用して、相対量の信頼性を示した。差次的に調節した遺伝子あたり４セットの反応物からの遺伝子特異的産物を、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して定量した。
【０２１６】
プライマー対を使用して、差次的発現を確認した。
【０２１７】
【表３】
総ＲＮＡを、実施例ＩＩに記載のように（Ｂｏｕｋａｍｐら、前出、１９９７）、不死化ＨａＣａＴケラチノサイト（ＥＧＦ処理およびＥＧＦ未処理）から得た。試行した最初の差次的ディスプレイプロトコルは、ＲＮＡイメージキット１（ｃｕｔ Ｇ５０’；ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ。アンカープライマー、オリゴ（ｄＴ）−Ｇ（Ｈ−Ｔ１１Ｇ；配列番号 ）、オリゴ（ｄＴ）−Ｃ（Ｈ−Ｔ１１Ｃ；配列番号 ）またはオリゴ（ｄＴ）−Ａ（Ｈ−Ｔ１１Ａ；配列番号 ））を逆転写のために使用し、次いで、各ｃＤＮＡを、４つの差次的恣意プライマー（Ｈ−ＡＰ１（配列番号 ）、Ｈ−ＡＰ２（配列番号 ）、Ｈ−ＡＰ３（配列番号 ）、およびＨ−ＡＰ４（配列番号 ））と組み合わせて、ＰＣＲのために使用した。
【０２１８】
図５に示されるように、フィンガープリントを、反応の特性を決定するために、変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した。差次的ディスプレイ反応物をＲＮＡＩＭＡＧＥキットプロトコル（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、４つの異なる開始濃度（８００、４００、２００および１００ｎｇの総ＲＮＡ）を使用したことを除いて、製造業者の示唆に従って行った。次いで、この材料の１／１０をＰＣＲの使用のために使用した。アンカーしたオリゴ（ｄＴ）プライマーＨ−Ｔ１１Ｃ（配列番号 ）を、示したように、異なる２つの恣意プライマー（Ｈ−ＡＰ３（配列番号 ）およびＨ−ＡＰ４（配列番号 ））とともに使用した。恣意プライマー、Ｈ−ＡＰ４（配列番号 ）は、２つの異なるアンカーオリゴ（ｄＴ）プライマー、Ｈ−Ｔ１１Ｃ（配列番号 ）およびＨ−Ｔ１１Ａ（配列番号 ）とともに使用した。恣意プライマーまたはアンカーオリゴ（ｄＴ）プライマーのいずれかを共有する反応物は、可視可能なバンドの可視可能な重複はほとんど見られなかった。
【０２１９】
図５Ｂは、異なるセットのプライマーを使用する差次的ディスプレイを示す。差次的ディスプレイは、示したように、３つの異なるアンカーオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｔ１３Ｖ（配列番号 ）、ＡＴ１５Ａ（配列番号 ）、およびＧＴ１５Ｇ（配列番号 ））とともに恣意プライマーＫＡ２（配列番号 ）を使用して行った。差次的ディスプレイプロトコルを、生成された産物のより大量かつ高度な複雑性を生じるように調整した。ＲＮＡの開始濃度は、１０００、５００、２５０および１２５ｎｇであった。次いで、この材料の１／４をＰＣＲに使用した。図５Ａで見られるように、異なるオリゴ（ｄＴ）アンカープライマーを使用すると、ほぼ完全に、提示されるバンドのパターンが変化する。
【０２２０】
フィンガープリントは、約３０〜５０の明らかに可視可能な産物を生じた（図５Ａを参照のこと）。フィンガープリントは、一般に、これらの実験に使用した１００〜８００ｎｇの範囲の総ｍＲＮＡにおいて再現可能であり、ＲＮＡ濃度依存的な産物はほとんどなかった。オリゴ（ｄＴ）アンカープライマーまたは恣意プライマー（図５Ａ）のいずれかと共有される再現可能な、大部分のフィンガープリントのうちの３つを、３つの非標識ｄＮＴＰおよびα−（３２Ｐ）ｄＣＴＰの存在下でランダムプライミングすることによって放射性標識し、そして各々を使用して、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．ＥコンソーシアムからのＥＳＴを有する、１８，０００の二重スポットしたＥ．ｃｏｌｉコロニーの同一のアレイをプローブした。このアレイを、上記のように、ハイブリダイズし、そして洗浄した。
【０２２１】
このキットプロトコルは、実施例ＩＩに記載のＲＡＰ−ＰＣＲプロトコルにおいて１μＭのプライマーおよび２００μＭ ｄＮＴＰを使用したものと比較して、０．２μＭの恣意プライマーおよび４μＭ ｄＮＴＰを使用した。フィンガープリント反応物は、おそらく、成分が制限されたために、２０μｌ中４０ｎｇ未満の産物しか含まなかった。これは、実施例２で記載された方法において使用されたＤＮＡより約５倍少なかった。この理由のために、Ｘ線フィルムへの十分な曝露を得るためには、増感スクリーンを用いて約１０日間かかった。十分な曝露後には、約５００の産物が各標的を用いて容易に識別可能であった。確実に観察可能な遺伝子の数は、ホスホルイメージャースクリーンを使用する場合、通常、少なくとも２倍以上増加する。このことは、Ｘ線フィルムと比較して、ホスホルイメージングの感度がより高いことを示す。さらに、別個に標識したフィンガープリントを同じ標的にプールすることによって、なおさらにスループットを増大させ得る。
【０２２２】
アレイに対する標的のハイブリダイゼーションの曝露時間を減少させるために、実験をＲＡＰ−ＰＣＲプロトコルを使用する実施例ＩＩに記載の、高濃度のプライマーおよびｄＮＴＰで行った（図５Ｂ）。これらの実験は、予測された産物量の増加および対応する、アレイに対する曝露時間の減少を生じた。
【０２２３】
オリゴ（ｄＴ）プライマーの選択性を、異なるアンカー塩基を使用して決定した。図６に示されるように、ディファレンシャルディスプレイ産物は、ｃＤＮＡアレイにハイブリダイズした。図５Ａで記載したように、プライマーＧＴ１５Ｇ（配列番号 ）およびＫＡ２（配列番号 ）を用いて、未処理ＨａＣａＴ細胞（図６Ａ）およびＥＧＦ処理ＨａＣａＴ細胞（図６Ｂ）から生成したディファレンシャルディスプレイ産物をランダムプライミングによって標識し、そしてｃＤＮＡアレイにハイブリダイズさせた。メンブレンの５％未満を示す部分は、矢印で示した差次的に調節された遺伝子とともに示される。図６Ｃは、プライマーＡＴ１５Ａ（配列番号 ）およびＫＡ２（配列番号 ）を用いて未処理ＨａＣａＴ細胞から生成したディファレンシャルディスプレイ産物のハイブリダイゼーションを示す。図６Ａと６Ｃとを比較すると、ハイブリダイゼーションシグナルの有意な重複が存在し、これは、ポリアクリルアミドディスプレイからは明らかではなかった（図５Ｂ、レーンＡＴ１５Ａ／ＫＡ２とＧＴ１５Ｇ／ＫＡ２とを比較のこと）。
【０２２４】
恣意プライマーが同じアンカープライマーを維持しながら変化させた場合、ハイブリダイズしたクローンのパターンは、ほぼ全体的に変化し、代表的には、任意の２つのフィンガープリントの間で５％の重複未満であった。対照的に、同じ恣意プライマーおよび異なるアンカープライマーを含む標的は、それらがハイブリダイズしたものに対して約３０％のクローンを共有した。図６Ａおよび６Ｃは、少部分のアレイからのこのような共有される産物の例を示す。
【０２２５】
同様の観察が、広範な種々の条件下で生成されたフィンガープリントを使用してなされた。これらの条件としては、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒキットのプロトコルおよびプライマー、改変プロトコル、およびＧｅｎＨｕｎｔｅｒキット中のプライマーとは独立したプライマーを使用するプロトコルが挙げられる。この重複が反復に起因するという可能性を、同じメンブレンに対するゲノム標的および総ｍＲＮＡ標的の使用によって排除した。
【０２２６】
異なるアンカープライマーを有するが、同じ恣意プライマーを共有する、標的の間の重複は、変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した場合、フィンガープリント産物において顕著な類似性を全く反映しなかった。例えば、図６Ａおよび６Ｃで使用される標的を図５Ｂに示す。この標的は、共通して３０％の産物を有するにも拘わらず、容易に識別される類似性を示さない。多くの共有された産物は、アレイに対して強くハイブリダイズするクローンの中にある。従って、ゲル上で可視可能な産物のいくつかは、一方の末端で恣意プライマーを共有し得るが、ＰＣＲの間にこの産物は、異なるアンカープライマーにより複数の異なる位置で反対の方向に優先的にプライムされる。このことは、この観察（同じ恣意プライマーを有するが、異なるアンカープライマーを有する標的はそれらがハイブリダイズするものに対してクローンの３０％まで重複する）と適合性でありながらポリアクリルアミドディスプレイにおいて類似性をほとんど有さないか、または全く有さないフィンガープリントを生じる。
【０２２７】
共有された産物は、かなり広い範囲の条件下で恣意プライマーを共有する、アンカーされたフィンガープリントについての一般的現象である。フィンガープリントの中の重複は、同じ恣意プライマーを用いないことによって、異なるアンカープライマーを用いて避けられ得る。
【０２２８】
総ゲノムＤＮＡにより生成されたパターンとハイブリダイズするクローンのパターンとの比較は、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒフィンガープリントにより生成された標的にハイブリダイズするクローンが、わずか数％のｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）において生じるＡｌｕ反復エレメントを一般には含まなかったことを示した。標的によってハイブリダイズされたクローンは、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの逆転写物に由来する総ｃＤＮＡ標的によってハイブリダイズされたクローンと有意に重複しなかった。このことは、サンプリングされた遺伝子が、最も豊富なＲＮＡに重度に偏っていなかったことを示す。これらの結果は、フィンガープリントについて恣意プライマーのみを使用して得られた結果と一致し（実施例ＩＩを参照のこと）、そしてアンカーオリゴ（ｄＴ）プライミングと組み合わせた恣意プライマーを使用してｃＤＮＡアレイにおけるまれな遺伝子をモニターし得ることを示す。これらの結果はまた、ＲＡＰ−ＰＣＲおよびディファレンシャルディスプレイが豊富な転写物に重度に偏っていないことを確認する。
【０２２９】
未処理ＨａＣａＴ細胞とＥＧＦ処理ＨａＣａＴ細胞との間の差次的遺伝子発現について調査した２０００を超えるクローンの中に、１つのＲＮＡ濃度で差次的発現を明らかに反映するようである、２９の異なるクローンが存在した。ノイズ比および差次的発現比に対して最も高いシグナルを有する１２クローンを選択し、そして特異的プライマーをＲＴ−ＰＣＲのために設計した。これらの差次的に発現された遺伝子のうちの１つの例を、図６Ａと６Ｂとを対比して矢印で示す。
【０２３０】
少なくとも１．５倍の差次的発現を、７つの遺伝子について確認した。これを図７に示す。逆転写を２倍異なるＲＮＡ濃度で行った。反応物を水で４倍に希釈し、そして低ストリンジェンシーＰＣＲを異なるサイクル数で行った。各ＰＣＲ反応についての投入ＲＮＡ／ｃＤＮＡの量は１２５ｎｇ（左列）および２５０ｎｇ（右列）であった。図７に示す反応を１０サイクルで行い、そしてポリアクリルアミド−尿素ゲル上で分離した。コントロール（非調節）および少なくとも１．６倍だけ異なる遺伝子についての産物を示す。示された、調節された遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ７２７１４、Ｈ１４５２９、Ｈ２７３８９、Ｈ０５５４５，Ｈ２７９６９、Ｒ７３２４７、およびＨ２１７７７に対応する。
【０２３１】
図７に示した遺伝子の調節を、表２に要約する。ＥＧＦでの４時間の処理によって調節された、同定された遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号に対応する）および未処理細胞と比較した発現における増加の倍数を示す。
【０２３２】
【表２】
Ｅｇｒ−１は、他の細胞型においてＥＧＦにより差次的に調節されることが以前に公知であった（Ｉｗａｍｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７０：Ｈ２１００−Ｈ２１０７（１９９６）；Ｋｕｊｕｂｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３６：５８−６５（１９９３）；Ｃａｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１３４５−１３４９（１９９２）；Ｉｔｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：１７５５−１７６０（１９９０））。βアクチンおよびαチューブリンの発現における変化の観察は、これらの細胞がＥＧＦ処理後に受ける形態の劇的な変化と関連するようである。βアクチン遺伝子およびαチューブリン遺伝子のＥＧＦによる調節は、他の細胞型において観察された（Ｔｏｒｏｋら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６７：４２２−４３３（１９９６）；ＨａｚａｎおよびＮｏｒｔｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：９０７８−９０８４（１９９８）；Ｓｈｉｎｊｉら、Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ４４：２３９−２４４（１９９７）；Ｂａｌｌら、Ｃｅｌｌ Ｍｏｔｉｌ．Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ２３：２６５−２７８（１９９２））。これらの観察によって、差次的発現を検出するために使用した処理および方法が、独立して確証される。プロテインホスファターゼ２Ａ ｍＲＮＡの調節はこれまで観察されていなかったが、ＥＧＦシグナルの伝達におけるこのタンパク質の役割と一致する（Ｃｈａｊｒｙら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３５：９７−１０２（１９９６））。同様に、イノシトールリン酸の代謝と関連する遺伝子は、ＥＧＦにより調節されることがこれまでに示されていなかったが、このような調節は、別の外胚葉性細胞型のＥＧＦ処理後に、この酵素により生成された化合物が増加するという以前の観察と一致する（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６１：１０３５−１０４２（１９９３））。ＥＧＦ、未知遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２７９６９）およびＲＮＡ結合タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８９６９２）の２つの他の遺伝子による調節は、いずれの細胞型でも以前報告されていなかった。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ３１７６５は、ＫＩＡＡ００６１に対応する。
【０２３３】
５つの他の遺伝子は、ＲＴ−ＰＣＲが使用されるときに調節されることは確認されなかった。擬陽性の数は、実験の間で変化し得、そしてフィンガープリントの質および市販されるメンブレンの質に依存する。擬陽性の数は、実施例ＩＩに記載されるように、ＲＴ−ＰＣＲで確認する前に、アレイに対して２つのＲＮＡ濃度を使用することにより制限され得る。これらの実験は、単一の濃度のみを含んだ。なぜなら、主な目的は、オリゴ（ｄＴ）−Ｘアンカープライミング方法により作製された標的の中での適用範囲および重複の有効性を決定することであったからである。それにも拘わらず、１つの濃度で観察された、差次的にハイブリダイズするクローンの半分を超えるものが、差次的に発現された遺伝子に対応する。２つのアレイハイブリダイゼーションが、各処理について２つの異なる投入テンプレート濃度で行われた場合、エラー割合は、１０％より十分低い。
【０２３４】
これらの結果は、ディファレンシャルディスプレイおよび恣意プライマーを使用して生成された、恣意的にサンプリングされた標的が、ＥＧＦに応答して差次的に発現された遺伝子を検出し得ることを実証する。
【０２３５】
本出願全体を通して、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が関連する技術状態をさらに十分に記載するために、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【０２３６】
本発明は、上記の実施例を参照して記載されているが、種々の改変が本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、請求の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、クローンアレイへの差次的ハイブリダイゼーションを示す。各画像は、約４０００の、二重スポット（ｄｏｕｂｌｅ ｓｐｏｔ）し、各々が異なるＥＳＴクローンを有するＥ．ｃｏｌｉコロニーに及ぶオートラジオグラムである。パネルＡは、コンフルエントなヒトケラチノサイト由来の１μｇのポリＡ＋ ＲＮＡ（逆転写の間に放射性標識されている）から作製した総標的の結合を示す。パネルＢおよびＣは、未処理（パネルＢ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）処理（パネルＣ）のコンフルエントなヒトケラチノサイトのオリゴ（ｄＴ）プライムされたｃＤＮＡ由来のｃＤＮＡに対して行った恣意プライマー対でのＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを示す。１つの差次的に発現されたｃＤＮＡに由来する放射性標識された２つのコロニーを矢印で示す。パネルＤは、コンフルエントなヒトケラチノサイト由来のＲＮＡに対して行った、恣意プライマーの異なる対でのＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを示す。
【図２】
図２は、ポリアクリルアミド−尿素ゲル上で分離したＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを示す。逆転写を、レーン１、２、３、および４において、それぞれ２５０、１２５、６２．５および３１．２５ｎｇのＲＮＡのオリゴｄＴプライマーを用いて行った。ＲＮＡは、示したように、未処理ＨａＣａＴ細胞、ＴＧＦ−βおよびＥＧＦ処理ＨａＣａＴ細胞由来であった。ＲＡＰ−ＰＣＲは、２セットのプライマー、プライマーＧＰ１４およびＧＰ１６（パネルＡ）、またはＮｕｃ１＋およびＯＰＮ２４（パネルＢ）で行った。分子量マーカーを各パネルの左に示し、そして２つの差次的に増幅されたＲＡＰ−ＰＣＲ産物のサイズを矢印で示す（３１７および２９１）。
【図３】
図３は、ＲＡＰ−ＰＣＲによって生成された標的の、アレイに対するハイブリダイゼーションを示す。放射性標識したＤＮＡとハイブリダイズした、２連の同じフィルター（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の下半分のオートラジオグラムを示す。パネルＡおよびＢは、同じプライマーを使用して生成され、そして未処理ＨａＣａＴ細胞（パネルＡ）およびＥＧＦ処理ＨａＣａＴ細胞（パネルＢ）に由来する２つのＲＡＰ−ＰＣＲ反応物のハイブリダイゼーションを示す。差次的なハイブリダイゼーションシグナルを示す、３つの二重スポットしたクローンを、各アレイに対して印付けする。このクローンのＧｅｎＢａｎｋ登録番号および対応する遺伝子は、Ｈ１００４５およびＨ１００９８（ｖａｖ−３およびＡＦ０６７８１７に対応する）（四角）；Ｈ２８７３５（遺伝子は未知）（Ｓｈｅｐａｒａｎ スルフェート３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ−１、ＡＦ０１９３８６に類似する）（丸）；Ｒ４８６３３（遺伝子は未知）（菱形）である。パネルＣは、パネルＡにおけるＲＮＡと同じＲＮＡを使用して生成されたＲＡＰ−ＰＣＲ標的と、しかし、異なるプライマー対とハイブリダイズしたアレイを示す。パネルＤは、１μｇのポリ（Ａ）＋選択ｍＲＮＡの逆転写によって生成されたｃＤＮＡ標的とハイブリダイズしたアレイを示す。パネルＥは、ランダムプライミングを使用して標識されたヒトゲノムＤＮＡとハイブリダイズしたアレイを示す。
【図４】
図４は、ポリアクリルアミド−尿素ゲル上でのＲＴ−ＰＣＲ産物の分離および低ストリンジェンシーＲＴ−ＰＣＲを使用する、ＥＧＦに対する応答における差次的調節の確認を示す。逆転写を、２つのＲＮＡ濃度（５００ｎｇ（左列）；２５０ｎｇ（右列））で、異なるサイクル数で行った。コントロール（２２サイクル）についてのバンド；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１１５２０（２２サイクル）についてのバンド；ＴＳＣ−２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１１０７３およびＨ１１１６１に対応）（１９サイクル）についてのバンド；およびＲ４８６３３（１９サイクル）についてのバンドを示す。
【図５】
図５は、未処理ＨａＣａＴ細胞およびＥＧＦ処理ＨａＣａＴ細胞のディファレンシャルディスプレイを示す。パネルＡは、４つの異なる開始濃度の総ＲＮＡ（１、２、３および４と表し、そしてそれぞれ８００、４００、２００および１００ｎｇに対応する）で行ったディファレンシャルディスプレイ反応物を示す。これは、次いで、ＰＣＲのために使用された。アンカーオリゴ（ｄＴ）プライマー、Ｈ−Ｔ１１ＣまたはＨ−Ｔ１１Ａを、２つの異なる恣意プライマー、Ｈ−ＡＰ３またはＨ−ＡＰ４のうち１つと組み合わせて使用した。これは、レーンの上に示される。パネルＢは、４つの異なる開始濃度のＲＮＡ（１、２、３および４と示され、そしてそれぞれ、１０００、５００、２５０および１２５ｎｇに対応する）を使用して、３つの異なるアンカーオリゴ（ｄＴ）プライマー、Ｔ１３Ｖ、ＡＴ１５ＡおよびＧＴ１５Ｇとともに恣意プライマーＫＡ２を使用するディファレンシャルディスプレイを示す。これは、次いで、ＰＣＲに使用された。
【図６】
図６は、ディファレンシャルディスプレイ反応物の、ｃＤＮＡアレイに対するハイブリダイゼーションを示す。未処理ＨａＣａＴ細胞（パネルＡ）およびＥＧＦ処理ＨａＣａＴ細胞（パネルＢ）に由来する、プライマーＧＴ１５ＧおよびＫＡ２で生成したディファレンシャルディスプレイ産物を、ランダムプライミングによって標識し、そしてｃＤＮＡアレイにハイブリダイズさせた。膜の５％未満を示す部分は、矢印で示される差次的に調節された遺伝子とともに示される。パネルＣは、未処理ＨａＣａＴ細胞に由来する、プライマーＡＴ１５ＡおよびＫＡ２で生成したディファレンシャルディスプレイ産物のハイブリダイゼーションを示す。
【図７】
図７は、低ストリンジェンシーＲＴ−ＰＣＲを使用するＥＧＦによる遺伝子の差次的調節の確認を示す。逆転写を、２倍異なるＲＮＡ濃度で行い、そして低ストリンジェンシーＰＣＲを異なるサイクル数で行った。最初の第１鎖ｃＤＮＡ合成について使用され、そして各ＲＡＰ−ＰＣＲ反応において使用された投入ＲＮＡの量は１２５ｎｇ（左列）、および２５０ｎｇ（右列）であった。１９サイクル反応物由来のＲＴ−ＰＣＲ産物を、ポリアクリルアミド−尿素ゲル上で分離した。コントロール産物（非調節）、およびＥＧＦに応答して１．６倍以上の調節を示す遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ７２７１４、Ｈ１４５２９、Ｈ２７３８９、Ｈ０５５４５、Ｈ２７９６９、Ｒ７３２４７、およびＨ２１７７７に対応する）についての産物を示す。
【図８】
図８は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１１５２０（配列番号１）のヌクレオチド配列を示す。
【図９】
図９は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１１１６１（配列番号２）のヌクレオチド配列を示す。
【図１０】
図１０は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１１０７３（配列番号３）のヌクレオチド配列を示す。
【図１１】
図１１は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３５０４８（配列番号４）のヌクレオチド配列を示す。
【図１２】
図１２は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ４８６３３（配列番号５）のヌクレオチド配列を示す。
【図１３】
図１３は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２８７３５（配列番号６）のヌクレオチド配列を示す。
【図１４】
図１４は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０１９３８６（配列番号７）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５】
図１５は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２５５１３（配列番号８）のヌクレオチド配列を示す。
【図１６】
図１６は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２５５１４（配列番号９）のヌクレオチド配列を示す。
【図１７】
図１７は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１３９１８（配列番号１０）のヌクレオチド配列を示す。
【図１８】
図１８は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１２９９９（配列番号１１）のヌクレオチド配列を示す。
【図１９】
図１９は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ０５６３９（配列番号１２）のヌクレオチド配列を示す。
【図２０】
図２０は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ４９２０７（配列番号１３）のヌクレオチド配列を示す。
【図２１】
図２１は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１５１８４（配列番号１４）のヌクレオチド配列を示す。
【図２２】
図２２は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１５１２４（配列番号１５）のヌクレオチド配列を示す。
【図２３】
図２３は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７９７８１（配列番号１６）のヌクレオチド配列を示す。
【図２４】
図２４は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２５１９５（配列番号１７）のヌクレオチド配列を示す。
【図２５】
図２５は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２４３７７（配列番号１８）のヌクレオチド配列を示す。
【図２６】
図２６は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３１６２７（配列番号１９）のヌクレオチド配列を示す。
【図２７】
図２７は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２３９７２（配列番号２０）のヌクレオチド配列を示す。
【図２８】
図２８は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２７３５０（配列番号２１）のヌクレオチド配列を示す。
【図２９】
図２９は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０００７１２（配列番号２２）のヌクレオチド配列を示す。
【図３０】
図３０は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ７５９１６（配列番号２３）のヌクレオチド配列を示す。
【図３１】
図３１は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ８５９９２（配列番号２４）のヌクレオチド配列を示す。
【図３２】
図３２は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ７３０２１（配列番号２５）のヌクレオチド配列を示す。
【図３３】
図３３は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ７３０２２（配列番号２６）のヌクレオチド配列を示す。
【図３４】
図３４は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ６６８９４（配列番号２７）のヌクレオチド配列を示す。
【図３５】
図３５は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１００９８（配列番号２８）のヌクレオチド配列を示す。
【図３６】
図３６は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１００４５（配列番号２９）のヌクレオチド配列を示す。
【図３７】
図３７は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０６７８１７（配列番号３０）のヌクレオチド配列を示す。
【図３８】
図３８は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ７２７１４（配列番号３１）のヌクレオチド配列を示す。
【図３９】
図３９は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５２５４１（配列番号３２）のヌクレオチド配列を示す。
【図４０】
図４０は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１４５２９（配列番号３３）のヌクレオチド配列を示す。
【図４１】
図４１は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１０２７７（配列番号３４）のヌクレオチド配列を示す。
【図４２】
図４２は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２７３８９（配列番号３５）のヌクレオチド配列を示す。
【図４３】
図４３は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８９０９２（配列番号３６）のヌクレオチド配列を示す。
【図４４】
図４４は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８９６７８（配列番号３７）のヌクレオチド配列を示す。
【図４５】
図４５は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ０５５４５（配列番号３８）のヌクレオチド配列を示す。
【図４６】
図４６は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０３８０４（配列番号３９）のヌクレオチド配列を示す。
【図４７】
図４７は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２７９６９（配列番号４０）のヌクレオチド配列を示す。
【図４８】
図４８は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ７３２４７（配列番号４１）のヌクレオチド配列を示す。
【図４９】
図４９は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ５１３３６（配列番号４２）のヌクレオチド配列を示す。
【図５０】
図５０は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２１７７７（配列番号４３）のヌクレオチド配列を示す。
【図５１】
図５１は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋ００５５８（配列番号４４）のヌクレオチド配列を示す。
【図５２】
図５２は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ３１７６５（配列番号４５）のヌクレオチド配列を示す。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＣＡ６８８２２、ＮＳ３３３７７、ＡＩ３４８２９、および国防総省によって授与された助成金番号ＢＣ９６１２９４の下で、政府の支持を得て行われた。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、一般には、標的における核酸分子を測定する方法に関し、より詳細には、差次的遺伝子発現を検出する方法に関する。
【０００３】
全ての生体は、遺伝物質であるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を必要とし、これは、生物に対して特徴的な独自の収集物を与える遺伝子を含む。ＤＮＡは、ヌクレオチド構築ブロックである２つの相補配列の鎖から構成される。この２つの鎖は、相補配列と結合し、またはそれとハイブリダイズして、二重らせんを形成する。遺伝子は、ＤＮＡの分別のある（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）セグメントであり、そして新たな生物を生じ、そしてその独自の特徴を生物に与えるために必要な情報を提供する。単純な生物（例えば、細菌）であっても、数千もの遺伝子を含み、そしてその数は、ヒトのような複雑な生物においては、何倍も多い。生体の発生および機能の複雑性の理解は、これらの遺伝子の知識を必要とする。
【０００４】
何年もの間、科学者は、生体の発生および機能において重要な多くの遺伝子を探索し、そして同定してきた。新たな遺伝子の探索は、遺伝情報の同定を目標としたプロジェクトに指向されていることに起因して、近年大いに加速されてきている。最終的な目的は、生物の全ゲノムの決定およびそのコードされた遺伝子の決定であり、ゲノム研究といわれている。これらのゲノムプロジェクトの最も大きな野望のうちの１つがヒトゲノムプロジェクトであり、全ヒトゲノムの配列決定が目的である。配列決定技術における最近の進歩は、ゲノム情報の急速な蓄積をもたらし、これは、公のデータベースおよび私有のデータベース両方において利用可能である。これらの新たに発見された遺伝子ならびにまもなく発見される遺伝子は、新たな薬物の開発のための潜在的な標的の豊富な供給源を提供する。
【０００５】
遺伝子発見の速度が急速であるにもかかわらず、これらの遺伝子を特徴付けすることおよびこれらの遺伝子の生物学的機能を決定することは、依然として侮りがたい仕事である。新たに発見された遺伝子の特徴付けは、しばしば、時間がかかり、手間のかかることであり、時折、特に複雑な高等生物においては、遺伝子またはその遺伝子産物の機能を決定するために数年を必要とする。
【０００６】
遺伝子とその遺伝子産物との間の複雑な相互作用が意図される場合、複雑性の別のレベルが生じる。どのように生物が機能するかを理解するために、どの遺伝子、その転写物およびその遺伝子産物が生物の機能において役割を果たすかを理解することが重要であるだけでなく、遺伝子、その転写物、またはその遺伝子産物と、他の遺伝子およびそれらの遺伝子産物との間の潜在的に複雑な相互作用を理解することもまた重要である。
【０００７】
生物の特定の細胞または組織における遺伝子発現を評価するために、多くのアプローチが使用されてきた。これらのアプローチは、種々の条件下で遺伝子発現を特徴づけるために使用されてきており、異なる条件下で発現における差異を調べることが挙げられる。しかし、これらの方法の大部分は、量が豊富な転写物を検出するためには有用であるが、特に、選択されたわずかな遺伝子よりむしろ、多くの遺伝子の発現を観察する場合、量が少ない転写物を検出するためにはあまり有用でないことが証明されている。低レベルで発現される遺伝子は、しばしば、細胞における生理学的経路を調節するので、量が少ない転写物を検出することが望ましい。
【０００８】
従って、所定の設定の条件下で遺伝子の発現パターンを特徴付け、そして量が少ない転写物を検出する方法が必要である。本発明は、この必要性を満たし、そして関連した利点もまた提供する。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、プローブと、２つ以上の核酸分子を含む標的とを接触させ（ここで、この核酸分子は、恣意的にサンプリングされ、そして恣意的にサンプリングされた核酸分子は、核酸分子の集団において核酸分子のサブセットを含む）；そしてプローブに対する標的の特異的結合の量を検出することによって標的における２つ以上の核酸分子のレベルを測定する方法を提供する。本発明はまた、プローブと、２つ以上の核酸分子を含む標的とを接触させ（ここで、核酸分子は、統計学的にサンプリングしたものであり、そして統計学的にサンプリングした核酸分子は、核酸分子の集団において核酸分子のサブセットを含む）；そしてプローブに対する標的の特異的結合の量を検出することによって、標的における２つ以上の核酸分子のレベルを測定する方法を提供する。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、標的中の２つ以上の核酸分子のレベルを、プローブを恣意的にサンプリングされた標的または統計学的にサンプリングされた標的と接触させること、およびプローブに対する特異的結合の量を検出することによって、測定するための方法を提供する。本発明はまた、標的中の２つ以上の核酸分子のレベルを測定し、そして発現レベルを第２の標的中の核酸分子の発現レベルと比較することによって、条件と関連する２つ以上の差次的に発現された核酸分子を同定する方法を提供する。本発明の方法は、所定のセットの条件の下で標的において発現された核酸分子のプロフィールを得るために有用である。本発明の方法は、２つ以上の標的間のあまり豊富ではない核酸分子の相対的な豊富さ（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を比較するために特に有用である。本発明の方法は、核酸分子の豊富さのプロフィールが決定され、そして所定のセットの条件と相関付けされるか、または別の標的と比較されて、元々の標的が特定のセットの条件に曝露されたか否かを決定し、それにより疾患の診断または処置を評価するために有用な情報を提供し得る点で有利である。
【００１１】
本発明は、標的中の２つ以上の核酸分子の豊富さを測定する方法を提供する。本発明の方法は、プローブを、２つ以上の核酸分子を含む標的と接触させる工程であって、ここで、この核酸分子は、恣意的にサンプリングされ、そしてここで、この恣意的にサンプリングされた核酸分子は、核酸分子の集団における核酸分子のサブセットを含む、工程；およびその標的がそのプローブに特異的に結合する量を検出する工程を包含する。
【００１２】
本明細書で使用される場合、用語「核酸分子」は、２つ以上のヌクレオチドの核酸をいう。核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。例えば、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含み得る。核酸分子はまた、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含み得る。核酸分子は、インビボまたはインビトロでのいずれかで酵素的に合成され得るか、あるいは、核酸分子は、当該分野で周知の方法によって化学的に合成され得る。核酸分子はまた、改変された塩基、例えば、ｔＲＮＡに見出される改変された塩基（例えば、イノシン、メチルイノシン、ジヒドロウリジン（ｄｉｈｙｒｏｕｒｉｄｉｎｅ）、リボチミジン、プソイドウリジン、メチルグアノシン、およびジメチルグアノシン）を含み得る。さらに、化学的に合成された核酸分子は、ヌクレオチド塩基の誘導体を取り込み得る。
【００１３】
本明細書で使用される場合、用語「核酸分子の集団」は、２つ以上の異なる核酸分子の群をいう。核酸分子の集団はまた、３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、１０００個以上、またはさらに１０，０００個以上の異なる核酸分子であり得る。核酸分子は、例えば、単一ヌクレオチドにより、または単一塩基の改変により、異なり得る。一般に、核酸分子の集団は、標的サンプル（例えば、細胞、組織、または生物）から得られる。このような場合、核酸分子の集団は、標的サンプルの核酸分子を含有する。
【００１４】
核酸分子の集団は、核酸分子の１つの集団を別の集団から区別し得る特徴を有する。これらの特徴は、その集団を含む個々の核酸分子の数および性質に基づく。このような特徴には、例えば、その集団中の核酸分子の豊富さが含まれる。個々の核酸分子の豊富さは、所定の標的サンプル中の絶対量であり得るか、または標的サンプル中の他の核酸分子に対する量であり得る。標的から得られる核酸分子の集団において、個々の核酸分子は、そのサンプル標的中の他の核酸分子と比較して、より豊富であるかもしれないし、またはあまり豊富でないかもしれない。あまり豊富でない配列もまた、２つのサンプル間の相対的な豊富さであり得る。
【００１５】
本明細書で使用される場合、あまり豊富ではない核酸分子は、例えば、集団の中の最も豊富な核酸分子の約１０％未満の量であり得る。よりあまり豊富ではない核酸分子はまた、集団中の最も豊富な核酸分子の、約１％未満、約０．１％未満、または約０．０１％未満の量であり得る。例えば、あまり豊富ではない核酸分子は、１細胞当たり約１０コピー未満、または１細胞当たり１コピー程の少なさであり得る。
【００１６】
核酸分子の集団の別の特徴は、その集団の複雑性である。本明細書で使用される場合、「複雑性」は、その集団中の異なる配列を有する核酸分子の数をいう。例えば、細菌細胞中のｍＲＮＡの代表的な核酸分子の集団は、真核生物の細胞、組織、または生物中のｍＲＮＡの代表的な核酸分子の集団よりも低い複雑性を有する。なぜなら、より小さい数の遺伝子が、真核生物の細胞、組織、または生物と比較して、細菌細胞中で発現されるからである。
【００１７】
核酸分子の集団はまた、その集団中の個々の核酸分子の特性によって特徴づけられ得る。例えば、個々の核酸分子の長さは、核酸分子の集団の特徴に寄与する。同様に、集団中の個々の核酸分子の配列は、核酸分子の集団の特徴、例えば、核酸配列のＧ＋Ｃ含量および鎖内ハイブリダイゼーションを行い得るヌクレオチド配列の相補ストレッチに起因して形成され得る任意の二次構造に寄与する。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「核酸のサブセット」は、核酸分子のセットの全てよりも少ないことを意味する。例えば、標的サンプル集団の核酸分子のサブセットは、標的サンプル集団中の核酸分子の全てよりも少ない。核酸分子のサブセットから特に除外されるのは、サンプル標的中、例えば、総ｃＤＮＡまたは総ｍＲＮＡを使用して作製される標的中の全ての核酸分子の代表的な核酸分子の群である。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「標的」は、プローブが結合することが所望される１つ以上の核酸分子をいう。標的は、プローブに結合した場合に検出可能である。本発明の標的は、一般に、２つ以上の異なる核酸分子を含む。標的は、細胞、組織、または生物からの核酸分子の集団に由来し得る。標的はまた、３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１０００個以上、２０００個以上、５０００個以上、または１０，０００個以上の異なる核酸分子でさえ含み得る。標的は、それに結合する検出可能な部分、例えば、放射標識、蛍光標識、または検出可能な任意の標識を有し得る。標的が、例えば、放射標識によって標識される場合、その標的は、他の核酸分子を「プローブするため」またはそれとハイブリダイズするために使用され得る。標的を作製する方法は、本明細書に開示される。
【００２０】
標的のプローブに対する結合を、その標的に結合した検出可能な部分を必要とせずに直接測定する検出方法がまた、使用され得る。このような場合、核酸分子は、例えば、検出可能な部分を結合することによる標的の核酸分子の改変なしに、直接的に検出可能である。検出可能な部分なしに標的を使用するこのような検出方法の例は、質量分析を使用して標的に結合する検出である。結合された検出可能な部分を含まない核酸分子を含有する標的を使用する方法の別の例は、標的を、検出可能な部分を有する分子を含有するプローブに結合することである。このような場合、標的の、検出可能な部分を有する分子を含有するプローブへの結合は、検出され、そしてそのようにしてその標的は、プローブに結合した場合に検出可能である。１つの例は、プローブの結合が、蛍光消光剤からの蛍光タグの分離を引き起こす「分子ビーコン」である。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「特異的結合」は、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に、結合活性を有さない類似の構造を有する分子であるコントロール分子の結合と比較した場合の分子の結合を決定することによって、測定され得る。例えば、標的の、プローブへの特異的結合は、その標的の結合を、その標的に含まれない結合コントロール核酸と比較することによって決定され得る。特異的結合はまた、標的（例えば、過剰の非標識標的）と類似するコントロール分子との競合によって決定され得る。この場合、特異的結合は、標識された標的の、プローブへの結合が、過剰の非標識標的によって競合的に阻害される場合、示される。
【００２２】
本明細書中で使用される用語「特異的結合」には、低親和性特異的結合および高親和性特異的結合の両方が含まれる。特異的結合は、例えば、少なくとも約１０−４ＭのＫｄを有する低親和性分子によって示され得る。特異的結合はまた、高親和性分子、例えば、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、少なくとも約１０−１０ＭのＫｄを有する分子によって示され得るか、あるいは、少なくとも約１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ以上のＫｄを有し得る。
【００２３】
核酸分子のアレイを含むプローブの場合、プローブの特異的核酸分子の別の核酸分子への結合はまた、ハイブリダイズまたはハイブリダイゼーションとして知られている。本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイズ」または「ハイブリダイゼーション」は、核酸分子の２つの鎖の、配列依存性の様式で水素結合する能力をいう。適切な条件下で、相補的ヌクレオチド配列は、二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの二本鎖ハイブリッドを形成するようにハイブリダイズし得る。類似するが、同一ではない配列を有する核酸分子もまた、適切な条件下でハイブリダイズし得る。
【００２４】
本明細書で使用されるように、用語「プローブ」は、標的の結合が所望される２つ以上の分子の集団をいう。プローブの分子には、核酸分子、オリゴヌクレオチド、およびポリペプチド核酸分子が含まれる。プローブは、さらに、分子のアレイであり得る。
【００２５】
一般に、プローブは、固体支持体上に固定された分子から構成され、そしてその標的は、溶液中にある。しかし、標的は、固体支持体に結合し得、そしてプローブは、溶液中にあり得ることが理解される。さらに、プローブおよび標的の両方が溶液中にあり得る。プローブおよび標的が、互いに結合し得る限り、プローブおよび標的の構成は、溶液中にあり得るか、または固体支持体に結合されることが理解され得る。固体支持体に結合した場合、結合したプローブまたは標的が、固体支持体を溶液中のプローブまたは標的に接触させる工程、および、固体支持体の洗浄の工程の条件下で結合したままである限り、プローブまたは標的の、支持体への結合は、共有結合または非共有結合であり得る。そのプローブおよび標的がハイブリダイズするか、さもなければ特異的に相互作用する場合、固体支持体に結合したそのプローブまたは標的は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の工程の間、結合したままである。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「サンプリングされた」または「サンプリングする」が、核酸分子に関して使用される場合、特異的結合が検出され得る核酸分子をいう。別の分子をサンプリングする核酸分子は、その分子に特異的に結合し得、そして検出され得る。例えば、プローブは、標的における分子に検出可能に結合し得ることによって、標的における分子をサンプリングし得る。それゆえ、プローブにおける核酸分子が特異的に結合する標的における分子は、サンプリングされる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「恣意的にサンプリングされた」または「恣意的にサンプリングされた核酸分子」は、分子が結合する特定の部位に基づいてサンプリングすることなしに、その配列に基づいて結合することによって、核酸分子がサンプリングされることを意味する。核酸分子の集団から恣意的にサンプリングされた核酸分子を含む標的を作製する場合、その標的は、その集団中の核酸分子の配列を予め参照することなしに、作製される。従って、その集団を恣意的にサンプリングするために、その集団中の核酸分子のヌクレオチド配列の予備知識を有する必要がない。集団中の核酸分子のヌクレオチド配列の知識は、そのヌクレオチド配列が、その集団をサンプリングする前に参照されない限り、その集団を恣意的にサンプリングする能力を阻害しないことは理解される。恣意的にサンプリングされた核酸分子を含有するプローブを作製するための方法は、本明細書中に開示される（以下および実施例Ｉ〜ＩＩＩを参照のこと）。
【００２８】
恣意的にサンプリングされた核酸分子を含有する恣意的にサンプリングされたプローブは、１つ以上の恣意的なオリゴヌクレオチドを使用して作製され得る。本明細書で使用される場合、用語「恣意的なオリゴヌクレオチド」は、そのオリゴヌクレオチドが、無作為に選択された配列であり、そして任意の公知の配列に対するその相補性に基づいて選択された配列ではないことを意味する。そのため、恣意的なオリゴヌクレオチドは、核酸分子の集団を恣意的にサンプリングするために使用され得る。
【００２９】
恣意的にサンプリングされる核酸分子は、その配列に基づいてサンプリングされ、そして所定の配列への結合に基づいていない。例えば、恣意的なオリゴヌクレオチドは、恣意的な配列を有するオリゴヌクレオチドであり、そしてそのため、所定の核酸分子に結合する。なぜなら、恣意的なオリゴヌクレオチドの相補配列は、核酸分子において偶然に生じるからである。オリゴヌクレオチドは、相補配列の存在に基づいて核酸分子に結合し得るので、核酸分子のサンプリングは、その配列に基づいている。しかし、集団中の任意の特定の核酸分子への恣意的なオリゴヌクレオチドの結合は、例えば、恣意的なオリゴヌクレオチドの配列を公知の核酸配列と比較し、そしてそのオリゴヌクレオチドを以前に公知の核酸配列に基づいて選択することによって、オリゴヌクレオチドの結合の前に決定されない。恣意的なオリゴヌクレオチドの、増幅のためのプライマーとしての使用は、当該分野で周知である（ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７−９７１（１９９２））。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２つ、そして約１００ヌクレオチドより少ない核酸分子をいう。オリゴヌクレオチドは、例えば、少なくとも約５ヌクレオチドでありそして約１００ヌクレオチド未満、例えば、約５０ヌクレオチド未満であり得る。
【００３１】
本発明はまた、標的における２つ以上の核酸分子のレベルを、プローブを、２つ以上の核酸分子を包含する標的と接触させることによって測定する方法であって、ここで、核酸分子は、統計学的にサンプリングされ、そしてここで、その統計学的にサンプリングされた核酸分子は、核酸分子の集団における核酸分子のサブセットを含み；そしてその標的がそのプローブに特異的に結合する量を検出する、方法を提供する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「統計学的にサンプリングされた核酸分子」は、核酸配列が、そのヌクレオチド配列を予め参照して、２つ以上の核酸分子においてヌクレオチド配列の統計学的な発生率を予め決定することによって、その配列に基づいてサンプリングされることを意味する。従って、統計学的にサンプリングされた核酸分子を得るために、集団における少なくとも２つの核酸分子のヌクレオチド配列の予備的な知識を有することが必要である。
【００３３】
統計学的にサンプリングされた核酸分子は、そのヌクレオチド配列を予め参照して、しかし、そのヌクレオチド配列の所定の部分を予め参照せずに、核酸分子の配列に基づいてサンプリングされる。オリゴヌクレオチドの群は、ヌクレオチド配列の所定の部分を予め参照することなしに、例えば、恣意的なオリゴヌクレオチドの群を決定することによって同定され得る。次いで、恣意的なオリゴヌクレオチドは、どの恣意的プライマーが公知のヌクレオチド配列にマッチするかを決定することによって、公知のヌクレオチド配列に参照され得る。公知のヌクレオチド配列に参照されるこのような恣意的なオリゴヌクレオチドは、公知の配列に基づいて選択され、従って、統計学的なプライマーになる。この方法は、公知のヌクレオチド配列の所定の部位が同定され、そしてオリゴヌクレオチドが、その所定の部位にマッチするように特異的に設計される方法とは対照的である。
【００３４】
統計学的サンプリングは、有利である。なぜなら、オリゴヌクレオチドのセットが、そのオリゴヌクレオチドに相補的な配列の公知の配列の群中の存在に基づいて決定され得るからである。そのオリゴヌクレオチドは、さらに、複雑性結合に基づいてランクされ得る。複雑性結合は、所定のオリゴヌクレオチドが、１つより多い核酸分子に結合することを意味する。オリゴヌクレオチドが結合し得る分子の数が多いほど、「複雑性結合」はより高くなる。統計学的選択は、オリゴヌクレオチドが結合する配列の数に基づいて、オリゴヌクレオチドをランク付けし、そして最多数に結合するものを選択することによって、複雑性結合を増強するために使用され得る（例えば、ＷＯ９９／１１８２３を参照のこと）。統計学的サンプリングは、例えば、オリゴヌクレオチドの５以上の核酸分子への結合に基づき得、そして１０以上、５０以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、またはさらに１０，０００以上の核酸分子への結合に基づき得る。
【００３５】
さらに、統計学的サンプリングは、所定のオリゴヌクレオチドについての最高複雑度の結合について、例えば、平均数を超える核酸分子に相補的な平均を超える順位オリゴヌクレオチドを選択することによって増強し得る。このオリゴヌクレオチドは、任意の範囲の複雑性結合、例えば最高順位の複雑性結合の上から１０％、最高順位の複雑性結合の上から２０％、または最高順位の複雑性結合の上から５０％について選択され得る。
【００３６】
さらに、統計学的選択を使用して、所望ではないヌクレオチド配列（関連核酸分子のファミリーの保存配列を含む）を排除し得る（ＷＯ９９／１１８２３）。統計学的オリゴヌクレオチドは、約５ヌクレオチド長から約１０００ヌクレオチド長、例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２５、３０または５０ヌクレオチド長であり得る。１セットの系統学的プライマーは、縮合塩基（例えば、任意の所定の位置で１つを超えるヌクレオチド）を含み得る。
【００３７】
ヌクレオチド配列の予め選択した部分を使用して得られたサンプリングした核酸分子は、用語「統計学的にサンプリングした核酸分子」の意味から、具体的に排除される。例えば、公知のヌクレオチド配列の一部が同定され、同定された部分が一致するオリゴヌクレオチドを生成して核酸分子をサンプリングする場合、このようなサンプリングされた核酸分子は、統計学的にサンプリングされた分子ではない。しかし、オリゴヌクレオチドの群が最初に同定され、次いで核酸分子の集団の２つ以上の公知のヌクレオチド配列と比較されて、公知のヌクレオチド配列中に統計学的に存在するオリゴヌクレオチドまたは公知のヌクレオチド配列に類似のオリゴヌクレオチドを決定する場合、このような統計学的に同定したオリゴヌクレオチドを使用して、統計学的にサンプリングした核酸分子を入手し得る。統計学的にサンプリングした核酸分子を含む標的を生成するための方法が本明細書中に開示される。
【００３８】
統計学的にサンプリングされた核酸分子を含む統計学的にサンプリングされた標的は、１つ以上の統計学的オリゴヌクレオチドを使用して生成され得る。本明細書中で使用されるように、用語「統計学的オリゴヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドが、１つを超える公知の核酸分子における相補性のその統計学的出現に基づいて選択される配列であることを意味する。このように、統計学的オリゴヌクレオチドを使用して、核酸分子の集団を統計学的にサンプリングし得る。
【００３９】
本発明の方法は、標的のプローブに対する特異的結合を検出する。標的は、例えば、核酸分子を増幅することによって生成され得る。本明細書中で使用される場合、用語「増幅した標的」は、核酸分子を酵素的にコピーして核酸分子の集団中の核酸分子の１つを超えるコピーを生成することによって生成された標的をいう。増幅した核酸標的は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅方法を用いて生成され得る。標的サンプルが由来する標的サンプル中の各核酸分子の単一コピーを有する標的（これは、もともとの集団と同一の豊富さおよび複雑性を有する）は、増幅した標的とはみなさない。増幅した標的は、例えば、プローブによってサンプリングされた核酸分子が標的中で限定量である場合に有用であり得る。サンプリングされそして非常に低量で存在する核酸分子は、プローブ中の核酸分子を増幅せずかつその質量を増加させずには検出が困難である。しかし、限定された複雑性の標的（ここでは、異なる分子の複雑性または数が限定される）は増幅する必要はない。
【００４０】
増幅した標的を生成するための他の方法としては、例えば、以下が挙げられる：リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）；自立配列複製（３ＳＲ）；βレプリカーゼ反応（例えば、Ｑ−βレプリカーゼを使用する）；ファージ末端結合タンパク質反応；鎖置換増幅（ＳＤＡ）；核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）；交叉ハイブリダイゼーションによる協同性増幅（ＣＡＴＣＨ）；ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）およｇびＡＦＬＰ（Ｔｒｉｐｐｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒａｌ．Ｈｅｐａｔ．３：２６７（１９９６）；Ｈｏｆｌｅｒら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３：５７７（１９９５）；Ｔｙａｇｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５３９５（１９９６）；Ｂｌａｎｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１２１９８（１９９４）；Ｓｐｅａｒｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：１３０（１９９７）；Ｓｐａｒｇｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ １０：２４７（１９９６）；Ｇｏｂｂｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６６：２９３（１９９７）；Ｕｙｔｔｅｎｄａｅｌｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：１３（１９９７；およびＬｅｏｎｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６６：１９（１９９７）；Ｅｌｌｉｎｇｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：７２９−７４１（１９９８）；Ｅｈｒｉｃｈｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｓｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４６９７−４６９９（１９９７）；Ｅｈｒｉｃｈｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４３：３５８−３６４（１９９７）；Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２（１９９８））。
【００４１】
本発明の方法は、標的中の２つ以上の核酸分子のレベルを測定するのに有用である。本発明の方法はまた、２つの標的間の発現レベルを比較するために使用され得る。詳細には、本発明の方法は、核酸分子の差次的発現を測定するのに有用である（以下を参照のこと）。
【００４２】
全標的（標的調製のためにｍＲＮＡ集団の完全複雑性を使用する）は、細胞中の上位の数百または数千のｍＲＮＡを容易に試験し得る（Ｐｉｅｔｕら、Ｇｅｎｅｏｍｅ Ｒｅｓ．６：４９２−５０３（１９９６））。しかし、哺乳動物細胞由来の全標識化ｃＤＮＡ標的は、代表的には、１億を超える塩基の複雑性を有し、この塩基は、差次的ハイブリダイゼーションを使用して稀なｍＲＮＡ間の差次的発現を検出する試みを複雑にする。蛍光および共焦点顕微鏡の使用における近年の利点は、差次的ハイブリダイゼーション法の感度およびダイナミックレンジにおいて改良を導く（１０，０００倍の検出のダイナミックレンジおよび１／５００，０００をアプローチする感度での転写物の検出）（ＭａｒｓｈａｌｌおよびＨｏｄｇｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２７−３１（１９９８）；Ｒａｍｓａｙ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４０−４４（１９９８）。感度の改良にもかかわらず、全標的を使用する方法は、サンプル中のより豊富なｍＲＮＡにむけて偏向したままである。
【００４３】
差次的スクリーニングのための標準的な方法（これは、代表的には、全メッセージの逆転写物由来の標的およびオートラジオグラフィーまたはホスホルイメージングを使用する）を使用して、差次的発現を検出し得る（Ｐｉｅｔｕ、前出、１９９６）。しかし、この方法は、最も豊富なメッセージに限定される。豊富な転写物のみが、おそらく１／１５，０００の感度を有する有効標的を生じるに十分に高度に提示される（Ｂｏｌｌ，Ｇｅｎｅ ５０：４１−５３（１９８６））。本明細書中で議論されるように、差次的スクリーニングは、標的の複雑性を減少しそして標的中の稀な核酸分子の量を統計学的に増加することによって、非常に改良され得る。標的中のあまり豊富でない核酸の量を増大させることによって、差次的スクリーニングは、全標的を使用して観察されるように、最も豊富な核酸分子のみに限定される。
【００４４】
標的の複雑性を減少することによって、供給源中の全てのｍＲＮＡ種を同定する能力は、同時に、改良された動力学および改良されたシグナル対ノイズ比が犠牲にされる。複雑性減少方法は、集団において核酸分子のサブセットを有する標的を生成する。この集団は、いくつかの稀なｍＲＮＡを標的の最終質量に有意に寄与させることが可能であり、それにより供給源中の稀なｍＲＮＡ間の差次的遺伝子発現を観察する能力を増強する。各ｍＲＮＡの部分のみまたはｍＲＮＡ集団のサブセットのみについて確実に濃縮する産物の混合物を生成する任意の方法は、減少した複雑性の標的を生成するのに有用である。
【００４５】
２つの基本的に異なる型の複雑性減少方法が存在し、これらの方法は、サンプリングするｍＲＮＡ間の相対的化学量論を維持する方法および化学量論を維持しない方法である。あるクラスの方法は、ｍＲＮＡ集団のサブセットを提示する核酸を生じ、そして入力ＲＮＡのおおよその化学量論を維持する。このような方法は、最も増幅した制限フラグメント長多型性（ＡＦＬＰ）、およびｍＲＮＡの３’末端または内部フラグメントをサンプリングする制限ストラテジーによって例示される（Ｈａｂｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３４：５１６−５２１（１９９７）；Ｍｏｎｅｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：２６１６−２６１７（１９９６）；Ｂａｃｈｅｍら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．９：７４５−７５３（１９９６））。別の例は、ｃＤＮＡ標的を生成するためのサイズ分画したｍＲＮＡの使用である。ｍＲＮＡの全て（例えば、２．０〜２．１ｋｂの範囲）は、減少した複雑性の標的として使用され得る。これらのｍＲＮＡ間の化学量論が、標的において大部分は保存される（Ｄｉｔｔｍｅｒら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．２１：３８３−３９１（１９９７））。
【００４６】
減少した複雑性の標的を生成するための方法の第２のクラスは、開始ｍＲＮＡの化学量論を保存しないが、標的が作製される標的サンプルの間の個々のＲＮＡ間の差異は保存する。化学量論を維持しない減少した複雑性の標的を生成する１つの方法は、再提示差異分析または抑制減算ハイブリダイゼーションに基づく特定の方法において減算された標的を使用することである。（これは、チップと比較可能な稀なメッセージについての感度を示した（Ｒｈｙｎｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１６：１６７−１８１（１９８６）；Ｌｉｓｉｔｓｙｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９４６−９５１（１９９３）；ＬｉｓｉｔｓｙｎおよびＷｉｇｌｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５４：２９１−３０４（１９９５）；Ｊｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１０８４−１０８６（１９９７））。
【００４７】
化学量論を維持しない減少した複雑性の標的を生成するための特に有用な方法は、恣意的にサンプリングされた標的または統計学的にサンプリングされた標的を使用することによって例示される。恣意的にサンプリングされた標的および統計学的にサンプリングされた方法を使用する方法は、本明細書中に開示される。恣意的にサンプリングされた標的または統計学的にサンプリングされた標的を使用する方法は、標的中のあまり豊富ではない核酸分子の検出を可能にする。本発明の方法は、有利である。なぜなら、その方法は、標的中のあまり豊富でない核酸分子を検出する能力を増強し、そしてまた限定された量の核酸分子に由来する標的（例えば、いくつかの細胞または単一の細胞さえ）中の核酸分子の検出を可能にする。
【００４８】
恣意的にサンプリングされた標的または統計学的にサンプリングされた標的は、例えば、増幅によって生成され得る。増幅された標的が、恣意的オリゴヌクレオチドまたは統計学的オリゴヌクレオチドを使用して生成される場合、増幅された産物は、各標的核酸分子の開始時の豊富さおよびサンプリングされる標的核酸分子に対するオリゴヌクレオチドのマッチの質の両方の機能を反映する。従って、増幅した産物の最終混合物は、使用されるオリゴヌクレオチドとの良好なマッチを有しそして最初のプライミング事象後の優先的な「増幅能力（ａｍｐｌｉｆｉａｂｉｌｉｔｙ）」を有するあまり豊富ではない核酸分子に由来する、非常に豊富な増幅した産物を含み得る。増幅能力は、二次構造および産物サイズのような効果を含む。
【００４９】
恣意的オリゴヌクレオチドまたは統計学的オリゴヌクレオチドを使用する増幅した標的を生成する結果は、２つの異なる標的中の同じ核酸分子が、プライム能力（ｐｒｉｍａｂｉｌｉｔｙ）および増幅能力の同一の組み合わせを経験し、その結果、特定のｍＲＮＡの豊富さにおける変化は、たとえ１つの標的内の異なる核酸分子の間の相対的な豊富さが顕著に変化しても、維持される。このことは、あまり豊富でない核酸分子は、標的中のあまり豊富でない核酸分子として存在する化学量論を維持する方法とは対照的である。
【００５０】
増幅された標的を生成する場合、一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーにおける特定の制約は存在しない。オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、少なくともいくつかのＣまたはＧ塩基を含む。オリゴヌクレオチドプライマーはまた、好ましくは、プライマー二量体を回避するために、この反応においてそれ自身と相補的な３’末端または他のプライマーを含まない。オリゴヌクレオチドプライマーはまた、好ましくは、異なる配列を有するように選択され、その結果、ｍＲＮＡの同じ部分は異なるフィンガープリントにおいては増幅されない。
【００５１】
本明細書中に開示されるように、恣意的にサンプリングされた標的または統計学的にサンプリングされた標的を生成する方法は、核酸分子を含む標的サンプルを「フィンガープリント」するために伝統的に使用されている方法に基づき得る。フィンガープリントは、標的サンプル中の核酸分子の発現に特徴的である。恣意的にサンプリングされた標的を生成するために、使用され得る１つの方法は、ＲＮＡ恣意的プライムＰＣＲ（ＲＡＰ−ＰＣＲ）に基づく（実施例ＩおよびＩＩを参照のこと；Ｗｅｌｓｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：７２１３−７２１８（１９９０）；Ｗｅｌｓｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：４９６５−４９７０（１９９２）；ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７−９７１（１９９２））。
【００５２】
ＲＡＰ−ＰＣＲにおいて、プライマーとのマッチの豊富さおよび程度の両方は、任意の特定の産物の蔓延に寄与する。従って、図らずもプライマーとの優れたマッチを有しかつ効率的に増幅される稀なｍＲＮＡは、より豊富なＲＡＰ−ＰＣＲ産物で見出され、これは、非化学量論的なＲＡＰ−ＰＣＲによって生成される標的を作製する。このことは、ＲＡＰ−ＰＣＲの非常に有用な特性である。なぜなら、他の方法を使用してはサンプリングするのが困難であるｍＲＮＡのサンプリングを可能にするからである。
【００５３】
代表的なＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントにおいて、１レーンあたり約５０〜１００のｃＤＮＡフラグメントは、ポリアクリルアミドゲル上で可視であり、これは図らずも恣意プライマーとの最良のマッチの１つを有する比較的稀なｍＲＮＡからの産物を含む。１００のｃＤＮＡクローンのみが各標的によってアレイ中で検出され得る場合、次いで、アレイへのハイブリダイゼーションは非能率的である。しかし、ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントは、稀すぎてポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーによって視覚化できない多くの産物を含む。にもかかわらず、これらの稀な産物は再生性であり、そして高特異活性で標識される場合のアレイについての標的として作用するに十分豊富である。
【００５４】
本明細書中で開示されるように、ＲＡＰ−ＰＣＲに由来する単一の標的は、約１８，０００ＥＳＴクローンを含むアレイにおいて約１０００のｃＤＮＡを検出し得、これは、変性ポリアクリルアミドゲルにおいて提示されるフィンガープリントの性能を１０〜２０倍超える改良である。さらに、差次的に調節された遺伝子はｃＤＮＡアレイ上で検出され、転写物を提示するクローンはすぐに利用可能であり、そしてしばしば、このクローンについて配列情報もまた利用可能である。さらに、このクローンは、通常、通常のＲＡＰ−ＰＣＲ産物より非常に長い。対照的に、ＲＮＡフィンガープリンティングに対する標準的なアプローチは、差次的発現が行われる検証の前に、産物のゲル精製および配列決定が実行され得ることが必要である。本明細書中に開示されるように、標準的な変性ポリアクリルアミドゲルおよびオートラジオグラフィー法の検出能力未満である差次的に増幅されたＲＡＰ−ＰＣＲ産物は、ｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーションを使用して検出され得る。
【００５５】
ＲＡＰ−ＰＣＲによって生成される恣意的にサンプリングされた標的は、標的サンプル中で上位の数千の最高に発現された核酸分子をサンプリングし得、そして集団中の核酸分子の異なるサブセットをサンプリングし得、これは、増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーに依存する。標的中の稀な核酸分子のいくつかは、コロニーのアレイ上で容易に検出されるように十分提示される（実施例ＩおよびＩＩを参照のこと）。
【００５６】
恣意的にサンプリングされた標的をＲＡＰ−ＰＣＲを用いて生成するために、ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントは、標的サンプル中の核酸分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ）の恣意プライム逆転写およびＰＣＲによって作製される（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９７））。あるいは、第１鎖ｃＤＮＡは、オリゴｄＴまたはランダムの短いオリゴマーでプライムされ得、続いて恣意的にプライムされ得る。このようなＲＡＰ−ＰＣＲ「フィンガープリント」のゲル電気泳動による分析は、約１００の転写物の恣意的サンプルの相対的な豊富さを示す複合体フィンガープリントを明らかにする（実施例ＩＩを参照のこと）
本明細書中に開示されるように、ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントは、ナイロンメンブレン上にＥ．ｃｏｌｉコロニーとして配列されたヒトｃＤＮＡをプローブするかまたはハイブリダイズするように標的に変換された（実施例ＩＩ）。各アレイは、ゲノムおよびそれらの発現の組み込まれた分子の分析（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．）協会からの１８，４３２のｃＤＮＡクローンを含んでいた。約１０００のｃＤＮＡクローンへのハイブリダイゼーションは、ＲＡＰ−ＰＣＲによって生成された恣意的にサンプリングされた標的の各々を用いて検出された。異なるＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントは、互いにまたは全ｃＤＮＡ標的からのハイブリダイゼーションパターンとの非常にわずか重複（＜３％）を有するハイブリダイゼーションパターンを生じた。結果として、ＲＡＰ−ＰＣＲ標的の反復増幅は、メッセージ集団のより大きな機能が、放射性標識した全ｃＤＮＡ標的を用いて達成され得るよりもこの型のアレイ上でスクリーニングされるのを可能にする。
【００５７】
恣意的にサンプリングされた標的は、ＥＧＦで処理されたＨａＣａＴケラチノサイトから生成された。２つのＲＡＰ−ＰＣＲ標的は、２０００のクローンにハイブリダイズし、ここから、差次的に発現された２２の候補体遺伝子が観察された（実施例ＩＩ）。差次的発現は、これらのクローンのうちの１５個についてＲＴ−ＰＣＲを用いて試験され、そのうち１３個が確認された。ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを分析するためのこのｃＤＮＡアレイの使用は、ＲＡＰ−ＰＣＲまたはディファレンシャルディスプレイに対する従来の変性ポリアクリルアミドゲルアプローチの検出において１０〜２０倍超えて増加した。スループットは、アレイの使用によって提供されるクローニングおよび配列決定における減少により大いに改良される。また、同じ遺伝子、または目的の系において調節されることがすでに公知の遺伝子のクローニングおよび配列決定の反復は、最小化される。
【００５８】
恣意的にサンプリングされた標的を生成するためのＲＡＰ−ＰＣＲの使用は、特に有用である。なぜなら、差次的に調節される遺伝子の非常に高スループットの発見を可能にするからである（実施例ＩＩおよびＩＩＩを参照のこと）。この方法を用いるスループットは、約２０倍早い。本質的には、一旦ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントが生成されていると、ゲル電気泳動による産物の分析に関わらず、ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントは、核酸分子にプローブするかまたはハイブリダイズする標的として使用される。ＲＡＰ−ＰＣＲによって生成される、このような恣意的にサンプリングされた標的は、アレイのための標的として特に有用である。
【００５９】
ＲＡＰ−ＰＣＲ反応のパラメーターは、例えば、標的の複雑性を至適化し、そして複雑性結合を増強するために変動され得る。例えば、この複雑性を増大させるために、ＴａｑポリメラーゼＳｔｏｆｆｅｌフラグメント（これは、ＡＭＰＬＩＴＡＱよりも、無差別的である）が、増幅のために使用され得る。本明細書中で使用されるオリゴヌクレオチドプライマー（実施例ＩＩ）は、１０塩基または１１塩基の長さであり、そして縮重されておらず、各位置に単一の塩基を有した。同じ温度で使用される、より長いオリゴヌクレオチドプライマーは、いくつかの縮重を有するプライマーで提供されるような、より複雑性の産物を提供し得る。しかし、標的の複雑性が高くなるにつれて、全体のｍＲＮＡ標的をより密接に類似させ、これは、非化学量論的サンプリングの利点を喪失させる。ＲＡＰ−ＰＣＲパラメーターをさらに変動させるために、オリゴヌクレオチドプライマー長、縮重、および３’付着が、逆転写反応およびＰＣＲ反応において変動され得る。種々の異なるポリメラーゼもまた、使用され得る。
【００６０】
ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントは、以下に記載されるように、放射性同位元素標識され得るか、または蛍光色素を用いて標識され得、そして高密度アレイ（例えば、ｃＤＮＡクローンのアレイ）に対して探索するための標的として使用され得る。２つの標的間の核酸分子レベルにおける差異は、例えば、ｍＲＮＡ転写レベルにおける差異（これは、通常、遺伝子発現レベルにおける差異を反映する）を示し得る。発現における差異はまた、分解または翻訳後プロセシングを反映し得る。恣意的にサンプリングされた標的を使用することによって、各標的は、メッセージ集団の全体の複雑性のおよそ１０％の検出を可能にすると見積もられる。そして最も重要なことに、この１０％は、稀なメッセージクラスを非常に効率的に含む。この稀なメッセージクラスは、標的中に含められる。なぜなら、ＲＡＰ−ＰＣＲは、標的サンプル間のメッセージの豊富さを反映する一方で、任意の個々のＲＡＰ−ＰＣＲ反応における増幅に対して選択されるｃＤＮＡは、豊富さよりもむしろ配列によって決定されるからである。オリゴヌクレオチドプライマーと核酸分子との間の配列整合性が非常に良好である場合、たとえ核酸分子があまり豊富ではないとしても、あまり豊富ではない核酸分子は、最終標的において、より豊富な核酸分子に対して相対的により豊富でない、より多量の核酸分子を有する見込みが十分にある。
【００６１】
ゲルに基づく分析またはアレイに基づく分析のいずれかのために適切であるように、ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントは、投入ＲＮＡの８倍希釈にわたって、ほぼ同一であるように維持されるべきである。低質のＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントは、通常、ＲＮＡの質および濃度に関しての制御が乏しい結果である。アレイハイブリダイゼーション工程を進行する前に、ＲＡＰ−ＰＣＲ産物の質は変動され得る。アレイ方法はそのような高生産性を有するので、この追加工程は、高価でないばかりでなく、時間浪費的でもなく、そして貧弱なフィンガープリント再現性に起因する偽陽性の数を低減させることによって、効率を非常に改善し得る。標的としてのＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントの再現性は、本明細書中で例示される（実施例ＩＩを参照のこと）。
【００６２】
標的サンプル中のあまり豊富ではない核酸分子を検出するための、本発明の方法の能力の増大は、稀なメッセージを検出するのに制限された能力を有する以前に使用された方法に対して、主な改善を提供する。細胞のメッセージ集団の全体の複雑性は、短い期間（例えば、数週間）で試験され得るようである。
【００６３】
例えば、実施例ＩＩに開示されるように、ＲＡＰ−ＰＣＲサンプルによって生成される標的であるｍＲＮＡの集団は、メッセージの豊富さとは、ほとんど独立している。これは、メッセージのあまり豊富ではないクラスは、豊富なクラスよりもより高い複雑性を有し、恣意プライマーが良好な整合をより見出すようにさせるからである。ディファレンシャルディスプレイとは異なり、ＲＡＰ−ＰＣＲは、２つの恣意的プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）現象を要求し、おそらくＲＡＰ−ＰＣＲを複雑なクラスへと偏向させる。細胞におけるｍＲＮＡ集団の大部分（２０，０００ｍＲＮＡ未満）は、わずか１０個のＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントで見出され得る。
【００６４】
ＲＡＰ−ＰＣＲを使用することに加えて、ディファレンシャルディスプレイはまた、恣意的にサンプリングされた標的を生成するために使用され得る（実施例ＩＩＩを参照のこと）。ディファレンシャルディスプレイのために、最初に、逆転写は、３’アンカープライマー（例えば、オリゴ（ｄＴ）プライマー）を使用する、次に、第２鎖のｃＤＮＡが、恣意プライマーとプライムされる。次いで、恣意プライマーと３’アンカーとの間でＲＣＰが行われる。
【００６５】
実施例ＩＩＩに開示されるように、１つの恣意プライマーと１つのオリゴ（ｄＴ）アンカープライマーの組合わせが使用されて、ｃＤＮＡアレイに対する恣意的にサンプリングされた標的が生成される。調製物を標的化するためのＲＡＰ−ＰＣＲアプローチおよびディファレンシャルディスプレイアプローチの両方は、いくつかの他のアレイハイブリダイゼーション方法において使用されるＲＮＡ量の１／２００未満を使用し得る。各フィンガープリントは、転写ｍＲＮＡの約５〜１０％を検出し、ＥＳＴクローンの安価なＥ．ｃｏｌｉコロニーアレイを使用して、ほぼ独立した豊富さをサンプリングした。ディファレンシャルディスプレイプロトコールを改変して、核酸分子を探索するための標的としての使用のために十分な量のＰＣＲ産物を生成した。同じ恣意プライマーとの異なるオリゴ（ｄＴ）アンカープライマーの使用は、各標的によってサンプリングされた遺伝子の中でかなりの重複を生じた。サンプリングされた遺伝子の重複は、各オリゴ（ｄＴ）アンカープライマーと共に異なる恣意プライマーを使用することによって、回避され得る。ＥＧＦによって制御されることが以前に未知であった４つの遺伝子、および他の細胞型においてＥＧＦによって制御されることが公知であった３つの遺伝子を、ディファレンシャルディスプレイによって生成された、恣意的にサンプリングされた標的を使用して特徴付けた。ディファレンシャルディスプレイによって生成された恣意的にサンプリングされた標的の使用は、差次的に制御される遺伝子の同定のために、特に有用である。
【００６６】
以前に生成された非常に多くのフィンガープリントは、十分なｄＮＴＰ（１００μＭ）およびプライマー（約１μＭ）の存在下で、各フィンガープリントの１アリコートに対してＰＣＲを実施することによって、その量が増大される場合に、核酸分子アレイによって探索されるための有効な標的へと変換され得る。フィンガープリントは、以前に示されているように（Ｒａｌｐｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０７１０−１０７１４（１９９３））、再増幅され得る。従って、以前に決定されたディファレンシャルディスプレイのサンプルを使用して、アレイを探索するための標的を生成し得、さらなる情報を得ることを可能にし得る。
【００６７】
本明細書中に開示されるように、ディファレンシャルディスプレイを使用して、ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ（前出、１９９２）の方法に基づいて、標的を生成する。オリゴ（ｄＴ）アンカリングに由来する標的を使用することは、特定の型のアレイについて、いくつかの潜在的利点を有する。例えば、いくつかのアレイは、オリゴ（ｄＴ）にプライムされた逆転写によって生成され、そしてこれらのクローンは、３’偏向される。オリゴ（ｄＴ）アンカープライマーおよび恣意プライマーによって生成される標的はまた、各ＰＣＲ産物が、対応する３’偏向クローンにハイブリダイズし得るように、３’偏向であるべきである。対照的に、恣意的プライミングを使用して生成された標的は、ｍＲＮＡに対して内部の領域をサンプリングし得る。恣意的産物が３’短縮化クローンよりも、ｍＲＮＡのさらに５’に局在化している場合、この標的は、対応するｍＲＮＡに結合し得ない。
【００６８】
３’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを用いるディファレンシャルディスプレイを使用して生成される、恣意的にサンプリングされた標的は、３’偏向ライブラリー、そして特に３’偏向ＥＳＴを探索するために、特に有用である。３’アンカーリングは、ほとんどの細菌性ＲＮＡのような、ポリ（Ａ）テイルを有さないＲＮＡをサンプリングするためには有用ではない。３’アンカープライマーを使用して生成される標的はまた、内部産物に基づくＰＣＲアレイについては適切ではない。３’偏向標的はまた、ランダムにプライムされたライブラリーについては、あまり有用ではない。
【００６９】
恣意的にサンプリングされた標的を生成するための他の方法もまた使用され得る。１つのそのような方法は、ＲＡＰ−ＰＣＲの改変であり、複雑度制限恣意的サンプル配列決定（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｌｉｍｉｔｅｄ ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｓａｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＣＬＡＳＳ）と呼ばれる。ＣＬＡＳＳは、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）の、周知でありかつフラストレーションを引き起こす制限に対する解決策として着想された（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４−４８７（１９９５））。ＳＡＧＥは、２つの供給源由来のｃＤＮＡの小切片を生成し、それらを互いに連鎖させ、そしてそれらを大量に配列決定する方法である。平均的な細胞は、２００，０００のｍＲＮＡ転写物を含み、約２０，０００の異なる配列を表し、そしてＳＡＧＥは、一度に約４０の配列決定を可能にする。従って、標準的な配列決定装置を使用して、２つの標的を比較するために、非常に多くの配列決定ゲル（約１００）が、４００，０００のｍＲＮＡ（これは、比較される２つの集団由来の２００，０００のｍＲＮＡを表す）に対する情報を得るために必要とされる。この方法は、核酸分子の発現に関する情報を得るために有用であるが、各々のさらなるＲＮＡサンプルは、５０個単位で、必要とされるゲルの数を増大させる。これは、非常に高価であり、そして時間浪費的である。この主な問題点は、１細胞あたり１〜１０コピーへと発現が変化した、稀なメッセージに対して統計的信頼度を有するように、１００枚のすべてのゲルが泳動されなければならないということである。
【００７０】
この問題点を解決するために、ＣＬＡＳＳが発明された。ＣＬＡＳＳは、使用されるオリゴヌクレオチドプライマーが、縮重３’末端を有することを除いて、ＲＡＰ−ＰＣＲと類似する。この縮重性は、プライマーの頻繁なプライムを引き起こし、これは短い配列タグを生成する。短いＰＣＲ伸長時間を選択することによって、優先的な産物は、ｍＲＮＡの総複雑度の画分からのみ生じ、そしてこの画分の大きさは、３＋縮重塩基の数を変動させることによって、随意に調整され得る。次いで、これらの短いタグは、連結および配列決定され得て、メッセージの複雑度の副標本に対して迅速に信頼度のある統計をもたらす。これは、ＳＡＧＥにおいて使用される連結および配列決定ストラテジー（Ｖａｌｃｕｌｅｓｃｕら、前出、１９９５）と類似である。ＣＬＡＳＳ産物はまた、例えば、アレイに対して探索するための標的として使用され得る。
【００７１】
ＣＬＡＳＳ方法は、縮重３’末端を有するさらなるプライマーのセットが生成および使用されて、異なる核酸分子のサンプリングを獲得し得るので、有益である。核酸分子の発現を決定するためのこの反復性のアプローチは、ＳＡＧＥの全体的アプローチ（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、前出、１９９５）よりも、核酸分子の供給源における発現パターンについて、より情報を提供する。
【００７２】
任意の稀なメッセージを確実にするために、１００枚のゲルのほぼ完全な配列決定が必要とされるＳＡＧＥとは対照的に、ＣＬＡＳＳは、核酸分子の集団が、小集団へと分配されるのを可能にし、その結果、１０％の仕事で、この細胞のすべての遺伝子の１０％の結果について信頼度が生み出される。１回のＣＬＡＳＳで、第１の通過（１０枚のゲル）において、稀なメッセージの９０％については全く情報が得られないが、標的サンプル中の核酸分子の１０％についての結果の信頼度は高い。遺伝子の１０％におけるこの高い信頼度は好ましい。なぜなら、差次的に調節される遺伝子について探求する場合に、パターンまたは「挙動の型」は、差次的な遺伝子調節の間に起こることが予期されるからである。同じ経路によって制御される他の協調的な制御なしに、単一の遺伝子が活性化されることは、あるとしても、まずない。従って、例えば、トポイソメラーゼインヒビターによって調節される１０のあまり豊富ではない転写物のうちの任意の１つを探索する場合に、ＳＡＧＥは、１０個すべてのあまり豊富ではない遺伝子を産生する１００枚の配列決定ゲルを泳動することを必要とする。対照的に、ＣＬＡＳＳは、少なくとも１つの遺伝子を同定するために、１０枚のゲルを１／１０の時間で泳動することを可能にする。これは、遺伝子発現のパターンを同定するのに十分であり得る。さらに、ＣＬＡＳＳを、異なるプライマーを用いて反復的に使用して、さらなるゲル（例えば、５０枚のゲル）を泳動して、同数の遺伝子の５倍の情報を獲得し得る。一方で、ＳＡＧＥでの５０枚のゲルの泳動は、統計的に関連のある情報を全く明らかにしない。従って、ＣＬＡＳＳは、遺伝子発現パターンを同定するための、さらにより経済的なアプローチである。
【００７３】
ＣＬＡＳＳは、任意の種（たとえそのアレイが入手不可能である種であっても）に対して、およびアレイに対して未だ沈積されていないｍＲＮＡに対して適用され得る。従って、既知のアレイに対してＲＡＰ−ＰＣＲすることによって生成される標的を使用することが、既知の遺伝子に関する発現情報を提供する一方で、ＣＬＡＳＳは、たとえ、アレイされたライブラリーにおいて以前に遭遇されていないとしても、任意の遺伝子に関する発現情報を提供する。従って、ＣＬＡＳＳは、遺伝子発現に関する情報を得るために、低コストで比較的高生産性の方法を提供する。
【００７４】
本発明はまた、統計的にサンプリングされた標的を使用して、標的における核酸分子のレベルを測定する方法を提供する。統計的にサンプリングされた標的を生成するために有用な方法は、以前に記載されている（ＷＯ ９９／１１８２３；ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄら、前出、１９９７；Ｐｅｓｏｌｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２５：１１２−１２３（１９９８）；Ｌｏｐｅｚ−ＮｉｅｔｏおよびＮｉｇａｍ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８５７−８６１（１９９６））。統計的にサンプリングされた標的を生成するための典型的な方法は、統計的にプライムされたＰＣＲ（ＳＰ−ＰＣＲ）である。統計的プライム法とＲＡＰ−ＰＣＲとの間の主な差異は、恣意的にプライマーを選択するというよりも、核酸分子の群におけるヌクレオチド配列の統計的出現性を決定するように、プライマーがコンピュータープログラムによって選択されるという点である。
【００７５】
統計的にサンプリングされた標的を生成するための方法は、定方向性の統計的選択であり得る。例えば、ＧｅｎｅＵＰと呼ばれるプログラムが考案されており、これは、目的のリスト（例えば、アポトーシスと関連するヒトｍＲＮＡのリスト）における配列をサンプリングするが、一方で別のリスト（例えば、ヒト細胞において豊富に発現されるｍＲＮＡおよび構造的ＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ）、Ａｌｕ反復、およびｍｔＤＮＡのリスト）における配列を排除するためのプライマー対を選択するためのアルゴリズムを使用する（Ｐｅｓｏｌｅら、前出１９９８）。定方向性の統計的方法は、任意の所定のオリゴヌクレオチドが、任意の所定のヌクレオチド配列および所定のオリゴヌクレオチドが結合し得る異なる核酸分子の数に整合するか否かについて、組織的な決定を提供する。そのような定方向性の統計的方法は、本発明において有用な統計的にサンプリングされた標的を生成するために使用され得る。
【００７６】
統計的にサンプリングされた標的を生成するための別の方法は、モンテカルロ統計的選択法である（Ｌｏｐｅｚ−ＮｉｅｔｏおよびＮｉｇａｍ、前出、１９９６）。モンテカルロ統計的選択法は、モンテカルロ法を使用することによって、無作為にプライマーセットを対にする。モンテカルロ法は、プライマー整合の無作為工程を刺激することによって、増幅のために使用され得るプライマーを決定する解決策に近い。モンテカルロ統計的方法は、任意の所定のオリゴヌクレオチドが、任意の所定のヌクレオチド配列および所定のオリゴヌクレオチドが結合し得る異なる核酸分子の数と整合するか否かについての組織的な決定を定方向性の統計的方法が提供するという点で定方向性の統計的方法とは異なる。
【００７７】
一般的に、異なる対の恣意的オリゴヌクレオチドを使用して生成される２つの恣意的にサンプリングされた標的は、標的サンプル中の、大部分が重複しない核酸分子のセットにハイブリダイズする。同様に、異なる対の統計的オリゴヌクレオチドを使用して生成される２つの統計的にサンプリングされた標的は、標的中の、大部分が重複しない核酸分子のセットにハイブリダイズする。一般的に、１００より少ない産物が、２つの差次的にプライムした、複雑性を低減した標的において、最も強くハイブリダイズする２０００コロニーの中で重複する（実施例Ｉを参照のこと）。この発現のパターンはまた、すべてのｍＲＮＡ集団を直接標識することによって生成されるパターンとは、ほとんど完全に異なる。しかし、より多くの核酸分子が、ＲＮＡ集団のさらなる恣意的サンプリングまたはＲＮＡ集団のさらなる統計的サンプリングによってサンプリングされるにつれて、サンプリングされる非重複核酸分子の数は減少する。ある程度まで、核酸分子の適用範囲の有効性は、統計的に選択されたプライマーを使用することによって改善され得る（Ｐｅｓｏｌｅら、前出、１９９８）。ＲＡＰ−ＰＣＲによって生成される複数の恣意的にサンプリングされた標的は、すべての遺伝子を包含するのに十分な標的を供給し得る。
【００７８】
恣意的にサンプリングされた標的および統計的にサンプリングされた標的を生成するための上記の方法は、改変され得る。例えば、差次的に調節される核酸について富化された、恣意的にサンプリングされた標的または統計的にサンプリングされた標的を生成するために、サブトラクションストラテジーが使用され得る。核酸分子の１つの供給源由来の標的（Ａ）が標識され、次いで、他の供給源由来の数倍過剰の非標識標的（Ｂ）と混合される。混合物全体を変性し、そしてプローブへの結合のためにハイブリダイゼーション溶液に添加する。両方の標的において存在する増幅核酸産物が二本鎖核酸分子を形成し、そして残存する有効な標識標的は、２つの標的間の差異に主に由来する。同じ実験は、供給源由来の標識標的（Ｂ）および供給源由来の過剰な非標識標的（Ａ）を用いてなされ得る。減算された標的の両方のセットに結合するプローブが、差次的な遺伝子発現を検出するために比較される。この手順はまた、標的ｃＤＮＡ混合物に存在する反復を部分的にクエンチする。従って、恣意的にサンプリングされた標的または統計的にサンプリングされた標的を生成するための、このようなサブトラクション方法の使用は、別の条件由来の標識標的をクエンチするように、１つの条件由来の非標識標的を使用することによって、２つの条件を比較するために使用され得る。
【００７９】
サブトラクションの制限は、発現の小さな差異を排除し得、これがｍＲＮＡの全体的な非存在であるように見え得るということである。さらに、サブトラクションは、二成分の問題においては有用であるが、多数の条件が組合わせて比較されねばならない場合には、有用性は限られる。
【００８０】
特異的結合の検出は、バックグラウンドのハイブリダイゼーションおよび反復の不完全な遮断によって、制限される。従って、複雑性を低減した標的を生成するために上記の方法を使用することに加えて、Ｃｏｔ１ＤＮＡを使用して、核酸の反復エレメントをクエンチし得る。Ｃｏｔ１ＤＮＡゲノム画分は、反復に富む。Ｃｏｔ１ＤＮＡを含む標的は、検出することが困難であり得る核酸分子を低い豊富さにて探索するために有用である。あまり豊富ではない配列は、総ゲノムＤＮＡの使用によって部分的にクエンチされ得るが、Ｃｏｔ１ＤＮＡは、より混ぜ物をして質の落ちた（ｓｏｐｈｉｓｔｉｃａｔｅｄ）アレイ（例えば、ＰＣＲに基づくアレイ）に対して有用であり、ここでは、比較的貧弱に増幅された産物について考慮されるのに十分なほどに、ノイズに対するシグナルの割合が高い。
【００８１】
恣意的にサンプリングされた標的または統計学的にサンプリングされた標的を産生する場合、種々のプロモーター（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、またはその他）がプライマーに組み込まれ、その結果、対応するポリメラーゼを用いる転写が用いられて標的を生成し得る。その標的を生成するための転写を用いることは、一本鎖標的を生成することの利点を有する。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーは、任意の他の統計学的プライマーまたは恣意プライマーと組み合わせて使用され得る。
【００８２】
恣意的にサンプリングされた標的または統計学的にサンプリングされた標的はまた、消化物の連結を使用して生成され得る。この場合、その標的を生成するために使用される核酸分子の集団は、制限酵素によって消化され、そしてオリゴヌクレオチドプライマーが、増幅された標的を生成するために連結される。連結媒介ＰＣＲでは、プライマー結合部位またはプライマー結合部位の部分が、例えば、部位特異的切断後に、連結によって鋳型上に配置される。
【００８３】
ネスト化ＰＣＲはまた、恣意的にサンプリングした標的または統計学的にサンプリングした標的を生成するために使用され得る。ネスト化ＰＣＲは、第１のプライマーを用いて実行される第１回のＰＣＲ、続いて、第１のプライマー配列を越えて１つ以上のヌクレオチドが伸長する配列を含むという点で、第１のプライマーとは異なる第２のプライマーを用いるＰＣＲを含む、２つのＰＣＲ工程を含む。
【００８４】
標的は、特定のプローブにハイブリダイズする標的について富化され得る。一旦特定の恣意的にまたは統計学的にプライムされた方法によって生成された標的が特定の核酸集団に使用され、そして得られる標的がプローブのセットに対して使用されたならば、検出可能にハイブリダイズされる標的のセットが公知となる。この点において、そのプローブによって、検出されたもののみまたは検出されたもののほとんどを含む新しい標的のセットを工夫することは可能である。例えば、特定のプライマー「Ａ」が、ヒト脳由来のＲＮＡを使用するＲＡＰ−ＰＣＲのために使用され、そして得られる標的がｃＤＮＡクローンのアレイにハイブリダイズされる場合、いくつかのクローンは検出可能にハイブリダイズされる。次いで、この特定の標的によってハイブリダイズされたこれらのプローブのみのアレイを作製することが可能である。アレイ上のｃＤＮＡの大部分は、同じプライマー「Ａ」を用いて作製されたヒト脳ＲＮＡから開発された標的とハイブリダイズすることが予想され得る。
【００８５】
いくつかの場合において、標的の基礎である核酸の配列が公知である。いくつかの標的は、特定のプローブと検出可能にハイブリダイズし、そして他の標的はハイブリダイズしない。標的と関連する配列情報は、これらのプローブにハイブリダイズした標的を生じた、恣意的または統計学的プライミング事象の規則を推定するために使用され得る。このような情報は、その配列が標的中に存在する場合、特定のプライマーによってどの配列がサンプリングされそうかを予測することを補助する。このような情報は、どの配列が効率よくサンプリングされるか、そしてどの配列が特定のプライマーによって効率よくサンプリングされるかの見積もりを改善し得る。
【００８６】
本発明の方法は、アレイを使用して標的中の分子のレベルを測定するために特に有用である。本明細書中で使用される場合、用語「アレイ」または「分子のアレイ」とは、固体支持体に安定に結合される複数の分子をいう。アレイは、例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリペプチド−核酸分子を含み得る。本明細書中で使用される場合、分子のアレイは、固体支持体に結合する前に、電気泳動的に分離された分子を特異的に除外し、そしてそのようなものとして、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質のサザンブロット、ノーザンブロット、およびウェスタンブロットをそれぞれ除外することが理解される。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、用語「非ドットブロット」アレイとは、アレイの分子が少なくとも約２スポット／ｃｍ２の配置で、吸引濾過またはニトロセルロースメンブレンもしくはナイロンメンブレンへのスポッティング以外の手段によって、固体支持体に結合されるアレイをいう。
【００８８】
本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド−核酸」または「ＰＮＡ」とは、共有結合しているペプチドおよび核酸分子（Ｎｉｅｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７１−７５（１９９９））をいう。
【００８９】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、ＰＮＡに関連して使用される場合、２つ以上のアミノ酸のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を意味する。この用語は、同様に、その誘導体、アナログ、および機能的な模倣物をいうことを意図される。例えば、誘導体は、ポリペプチドの化学的修飾（例えば、アルキル化、アシル化、カルバミル化、ヨード化、またはポリペプチドを誘導体化する任意の修飾）を含み得る。アナログは、修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリンまたはカルボキシグルタミン酸）を含み得、そしてペプチド結合によって連結されないアミノ酸を含み得る。模倣物は、その化合物の予測された三次元構造に関わらず、ポリペプチドの機能を模倣する化学的部分を含む化学物質を含む。例えば、ポリペプチドが、その機能的ドメイン中に２つの荷電した化学的部分を含む場合、模倣物は２つの荷電した化学的部分を１つの空間的配向および制限された構造に配置し、その結果、荷電した化学的機能は、三次元的空間において維持される。従って、これらのすべての修飾が用語「ポリペプチド」の中に含まれる。
【００９０】
アレイのための固体支持体は、ナイロンメンブレン、ガラス、誘導体化されたガラス、シリコン、または他の基材であり得る。このアレイは、平らな表面（例えば、膜）であり得るか、または、所望の場合、球体もしくはビーズであり得る。この分子は、「スポット」として固体支持体上に結合され得、そして一般的には、少なくとも約５／ｃｍ２または１０／ｃｍ２、しかし一般的には約１０００／ｃｍ２を超えない密度でスポットされ得る。
【００９１】
ＤＮＡ分子のアレイを製造するための種々の方法が記載されている（Ｒａｍｓａｙ、前出、１９８８；ＭａｒｓｈａｌｌおよびＨｏｄｇｓｏｎ、前出、１９９８に概説される）。種々の種（酵母、マウス、およびヒトを含む）由来の核酸分子を含むアレイが利用可能である。アレイの使用は有利である。なぜなら、多くの遺伝子の差示的発現が並行して決定され得るからである。
【００９２】
１つの型のアレイは、１平方センチメートルあたりに何千ものＰＣＲ産物を含む。ｍＲＮＡのセグメントからのＰＣＲ産物のアレイは、例えば、ガラスに結合され、そして２つの供給源からのｃＤＮＡ集団を使用して探査（ｐｒｏｂｅ）される。各々のｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ集団は、異なる蛍光色素で標識され、そしてハイブリダイゼーションが蛍光を用いて評価される（ＤｅＲｉｓｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１４：４５７−４６０（１９９６）；Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０（１９９５））。選択されたＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．クローンからの５０００を超えるＰＣＲ産物を含むアレイもまた、利用可能である。ＰＣＲ産物のアレイはまた、あらゆる酵母のＯＲＦのために、そしてヒトＥＳＴのサブセットのために利用可能である。
【００９３】
別の型のアレイは、Ｅ．ｃｏｌｉクローンの１８，４３２コロニーを含み、各々が異なるＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ． ＥＳＴプラスミドを含み、そして各々が２２×２２ｃｍメンブレン（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）上に２回スポットされる。Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアムからのアレイを使用することの１つの利点は、クローンの８０％より多くが、５’もしくは３’末端から、または両方から読まれ、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託されたシングルパス配列を有することである。従って、同じ配列を共有する既知の遺伝子または他のＥＳＴが存在するかどうかを決定するために、通常、いかなるＤＮＡもクローン化するか、または配列決定する必要はない。同じ遺伝子由来であるようであるヒトおよびマウスＥＳＴのＵｎｉｇｅｎｅクラスター化は、このプロセスにおいて大きな補助となる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｕｎｉｇｅｎｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。数センチモルガンの解像度での染色体へのマッピングはまた、同じウェブサイトでこれらのクラスターの大部分について利用可能である。これらのアレイ上のクローンはすべて利用可能であり、核酸分子を探査するために、または配列決定を完成させるために使用される（ｗｗｗ−ｂｉｏ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ）。他の種における近いホモログを同定することがしばしば可能である。他のＤＮＡを含まない、ＰＣＲ産物アレイおよびオリゴヌクレオチドアレイと対照的に、各々のスポットされたＥＳＴは、宿主由来のＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡと関連する。従って、このクローンアレイは、ＰＣＲアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイよりも高いバックグラウンドを有し得る。
【００９４】
ＥＳＴアレイが使用される場合、５’ＲＡＣＥは現在利用されているＥＳＴを超えて延長するために使用され得る（ＺｈａｎｇおよびＦｒｏｈｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：６１−８７（１９９７））。ほぼ全長のクローンを含むｃＤＮＡライブラリーが利用可能であり、そして末端配列決定される場合、差示的にハイブリダイズしたスポットから全長ｃＤＮＡまで、直接的に応用することが可能である。
【００９５】
別のクラスのアレイは、ガラスもしくはシリコン表面に結合されるか、またはＤＮＡチップ上の連続的光化学によって製造される（Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１０−６１４（１９９６））かのいずれかであるオリゴヌクレオチドを使用する。このようなチップは、１平方センチメートルあたりに何万もの異なるオリゴヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ペプチド−核酸のようなオリゴヌクレオチド核酸アナログのアレイが、調製され得る（Ｗｅｉｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２７９２−２７９９（１９９７））。
【００９６】
フィンガープリントの、アレイへのハイブリダイゼーションは、一般的に、検出された遺伝子の単離、クローニング、および配列決定が必要ないという非常に大きな利点を有する。原理的には、すべての公知のヒトｍＲＮＡは、３枚のメンブレン上（約５０，０００遺伝子）か、またはガラスアレイもしくは他の固体支持体上のより小さい領域中に適合する。現在、各々のフィンガープリントは、５０，０００の既知の遺伝子の２０００より多くにハイブリダイズするに十分な複雑性を有する。
【００９７】
さらなる特徴付けのための標的、特定の遺伝子に結合し得る何千もの遺伝子を有し得るアレイの使用は、所望の規準に基づいて選択され得る。例えば、すでに公知であり、そして目的の条件における新しい役割が推定され得る、同定された遺伝子が選択され得る。あるいは、この遺伝子のいくつかは、もっともらしい役割が決定され得る公知の機能を有する公知の遺伝子のファミリーメンバーであり得る。
【００９８】
アレイに加えて、多数のｃＤＮＡライブラリー（例えば、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアム（ｗｗｗ−ｂｉｏ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ／ｂｂｒｐ／ｉｍａｇｅ／ｉｍａｇｅ．ｈｔｍｌ）から）が利用可能であり、これには、ナイロンメンブレン上で利用可能なライブラリー（例えば、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ＡＬ；ｗｗｗ．ｒｅｓｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ；ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）およびｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ｗｗｗ．ｒｚｐｄ．ｄｅ）から）が含まれる。これらのライブラリーには、種々のヒト組織、発生段階、疾患状態、および他の供給源由来のクローンが含まれる。
【００９９】
本発明の方法は、標的へのプローブの特異的結合の量を検出する工程を包含する。本明細書中で開示されるように、種々の検出方法が使用され得る。例えば、検出可能な部分が放射性部分である場合には、その検出方法は、オートラジオグラフィーまたはホスホルイメージングであり得る。ホスホルイメージングは、定量およびデータ収集時間の短縮のために有利である。検出可能な部分が蛍光部分である場合、検出方法は、蛍光分光法または共焦点顕微鏡法であり得る。
【０１００】
本発明の方法は、標的中の核酸分子の発現レベルを測定するために核酸プローブを使用する。放射性部分が標的に結合している場合、例えば、放射性部分の取り込みは、放射性部分の結合を可能にする、任意の酵素的または化学的方法であり得る。例えば、末端標識は、核酸分子の末端に放射性部分を結合させるために使用され得る。あるいは、放射性ヌクレオチド、特に３２Ｐ−標識されたヌクレオチド、３３Ｐ−標識されたヌクレオチド、または３５Ｓ−標識されたヌクレオチドは、合成の間に核酸分子中に組み込まれ得る。ランダムプライム化合成の使用は、高い比活性標的を生成するために特に有用である。一般的には、ランダムプライム化合成は、二本鎖ＰＣＲ産物の両方の鎖からランダムにプライムされたおよそ等量の核酸分子を生成し、これは、ハイブリダイゼーションの間に、ある程度、標的に再アニーリングする（実施例Ｉを参照のこと）。所望の場合、再アニーリングの量は、例えば、ｅｘｏＩＩＩ消化を用いて制限され得る。
【０１０１】
標識された標的またはプローブを生成する場合、一般的に、ＡＴＰまたはｄＡＴＰではない標識されたヌクレオチドを取り込むことが好ましい。標識されたｄＡＴＰの使用は、バックグラウンドの増加を引き起こし得る。なぜなら、標的またはプローブ中の任意のポリＡ配列は、高度に標識され、そしてすべてのクローン中に存在するポリＡテールに相補的なポリＴストレッチを含む鎖にハイブリダイズするからである。同様に、ｄＴＴＰの使用は、ｍＲＮＡ中のポリＡテールに相補的なポリＴストレッチを高度に標識する。
【０１０２】
蛍光色素はまた、プローブもしくは標的に、結合されるかまたは組み込まれ得る。所望の場合、異なる波長で検出可能な異なる蛍光は、異なる標的に組み込まれ得、そして同じプローブ上で同時に使用され得る。異なる蛍光の使用は有利である。なぜなら、複数の標的が同じプローブに結合し、そして検出され得るからである。蛍光標識された標的は、例えば、蛍光スキャナーまたは共焦点顕微鏡を使用して検出され得る。同じアレイ上の２つの標的の相対的な豊富さを同時に測定することは、２つの異なるアレイ上のそれを測定することよりも、ハイブリダイゼーション条件または同じアレイの複製に対する標的ＰＣＲ産物の量の違いによって起こる問題を除去する。ナイロンメンブレンは、代表的には、メンブレンそれ自体からのバックグラウンド蛍光に起因して、大部分の市販の蛍光タグのためには不適切である。
【０１０３】
赤外線色素はまた、プローブまたは標的への結合のための検出可能な部分として有用である。ナイロンメンブレンに結合したアレイのような標的またはプローブを有する赤外線色素は、そのメンブレンがタンパク質を含まない場合に、特に有用である。
【０１０４】
標的中の核酸分子のレベルを決定する場合、特に、増幅条件に非常に感受性である特定の増幅産物について、いくつかのバリエーションが存在し得る。核酸標的の間の増幅産物におけるバリエーションを制御するために、その標的は、２つ以上の因子によって異なる核酸分子の２つの濃度で生成され得る。差示的発現を確認するための標的を生成する種々の核酸濃度の使用は、本明細書中に記載される（実施例ＩＩおよびＩＩＩを参照のこと）。
【０１０５】
本発明の方法は、プローブへの標的の特異的結合を検出することに関する。プローブに標的をハイブリダイズさせる場合、結合の特異性は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーによって決定される。オリゴヌクレオチドプライマーの長さおよび増幅反応の温度は、最終産物に寄与する。その産物は、各々の標的核酸分子の開始時の豊富さ、およびオリゴヌクレオチドプライマーと増幅された核酸標的との間の一致の特性の両方の関数である。例えば、約８塩基長のオリゴヌクレオチドプライマーが、標的を生成するために約６０℃の反応温度で使用され得る。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、約２×ＳＳＣにおける約３２℃〜約０．１×ＳＳＣにおける約６８℃までの範囲であり得る。ハイブリダイゼーション温度は、例えば、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、または約６５℃であり得る。さらに、ＳＳＣ濃度（以下を参照のこと）は、例えば、約０．２×、０．３×、０．５×、１×、または１．５×であり得る。
【０１０６】
本発明はさらに、標的へのプローブの特異的結合の量を比較することによって、２つの標的中の核酸分子の相対量を決定するための方法を提供し、ここで、特異的結合の量は標的中の核酸分子の発現レベルに、第２の標的中の核酸分子の発現レベルに対応する。例えば、所望の場合、発現のレベルが未知である標的であり得る第１の標的中の発現レベルは、第２の標的の発現レベルと比較され得る。第２の標的中の発現レベルは、例えば、第２の標的に同じプローブを結合させること、および第２の標的における発現レベルを決定することによって決定され得る。次いで、第１の標的および第２の標的における発現レベルが比較され得る。
【０１０７】
第１の標的中の相対的な発現レベルはまた、第２の標的中の発現レベルと比較され得、ここで、第２の標的中の豊富さはすでに公知である。本明細書中で使用される場合、用語「公知の」は、核酸分子の発現レベルに関連して使用される場合、核酸分子の豊富さが以前に決定されたことを意味する。このような公知の豊富さが、特定の条件のセットに適用されることが理解される。公知の豊富さに対して、未知の標的における核酸分子の豊富さを比較する目的のために、標的の間の豊富さを測定する同じ方法が使用されることがまた、理解される。
【０１０８】
本発明はまた、１つの条件に関連する、２つ以上の差示的に発現された核酸分子を同定する方法を提供する。この方法は、例えば、恣意的にサンプリングされた標的、または統計学的にサンプリングされた標的を使用して、標的中の２つ以上の核酸分子のレベルを測定する工程を包含し、ここでプローブへの標的の特異的結合の量は、標的中の核酸分子の豊富さに対応する。この方法はさらに、第２の標的中の核酸分子の発現レベルに対する標的中の核酸分子の相対的な発現レベルを比較する工程を包含し、それによって、標的の間の発現レベルの違いが、１つの条件を示す。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、用語「差示的に発現される（た）」は、分子の量が、２つの標的の間で異なるレベルで発現されることを意味する。２つの標的は、異なる細胞もしくは組織由来であり得るか、またはその標的は、異なる条件下で同じ細胞もしくは組織由来であり得る。その条件は、例えば、ガン、自己免疫疾患、病原体（細菌、ウイルス、真菌、酵母、または単細胞寄生生物もしくは多細胞寄生生物）による感染のような疾患状態に関連し得るか；効力、抵抗性、または毒性のような感染のような処置に関連し得るか；あるいは、化学物質のような刺激剤（例えば、薬物または天然の産物（例えば、増殖因子））に関連し得る。
【０１１０】
本発明の方法は、２つの標的の間の差次的な遺伝子発現を決定するために有用である。本発明の方法は、差次的な遺伝子発現が重要であると考えられる任意の系に対して適用され得る。この系としては、薬物応答、ホルモン応答、正常な発達、異常な発達、遺伝子型の遺伝、ガンまたは自己免疫疾患のような疾患の状態、加齢、感染性疾患、病理学、薬物処置、ホルモン活性、加齢、細胞周期、恒常性機構および上記の状態の組み合わせを含む他のものが挙げられる。
【０１１１】
本明細書において開示されるように、２つの標的における核酸分子の含有量を比較して、２つ以上の差次的に発現される核酸分子を同定し得る（実施例Ｉ〜ＩＩＩを参照のこと）。恣意的にサンプリングした標的を用いて、ＥＧＦを用いて処置するかまたは処置しない標的を、プローブとハイブリダイズさせ、そしてＥＧＦによって調節される多数の遺伝子を同定した。ＥＧＦ調節される遺伝子は、ＥＧＦに応答して増加し、そしてＥＧＦに応答して減少することが見出された（それぞれ、実施例ＩＩおよび実施例ＩＩＩにおける表１および表２を参照のこと）。したがって、本発明の方法は、刺激に応答して増加し、または刺激に応答して減少する核酸分子を決定するために使用し得る（実施例ＩＩを参照のこと）。
【０１１２】
本発明において使用される恣意的にサンプリングした標的および統計学的にサンプリングした標的は、ある集団において、あまり豊富でない核酸分子を容易に検出し得る。従って、本発明の方法は、差次的に発現される核酸分子を同定するために特に有用である。なぜなら、差次的に発現される核酸分子は、しばしばあまり豊富ではないからである。
【０１１３】
本発明の方法を、任意の２つの標的に適用して、差次的な遺伝子発現を決定し得る。本発明の方法を使用して、例えば、疾患状態を診断し得る。そのような場合において、「正常な」標的を、潜在的に罹患した標的と比較して、その疾患と関連する差次的遺伝子発現を決定する。正常な標的は、その患者からの罹患した組織の付近の同じ組織の標的サンプルであり得る。正常な標的はまた、異なる個体由来の同じ組織のサンプルであり得る。本発明の方法を用いて、正常な発現のプロフィールを、１対多の正常標的サンプルにおける遺伝子発現パターンを決定することによって確立し得る。次いで、これらのプロフィールを使用して、潜在的に罹患した標的サンプルと比較し得る。正常な組織と罹患した組織との間の差次的な遺伝子発現を使用して、特定の疾患状態を診断または確認し得る。さらに、公知の罹患した組織から得られる標的サンプルの収集物を同様に決定して、その疾患に関連する遺伝子発現を反映する標的の頻度プロフィールを同定し得る。そのような場合において、潜在的な疾患標的サンプルと、差次的遺伝子発現を伴わない公知の罹患した標的サンプルとの比較は、その潜在的な疾患標的サンプルが、その疾患に関連することを示す。
【０１１４】
本発明の方法はまた、薬物を用いた個体の処置を評価するために使用され得る。特定の薬物処置に関連する遺伝子発現パターンの分析はまた、薬理遺伝学としても知られる。本発明の方法を使用して、処置の効力、処置に対する耐性、または処置に関連する毒性（傷害性）を決定し得る。例えば、遺伝子発現プロフィールは、特定の疾患または状態についての処置の前、および処置の後に、個体において決定され得る。次いで、遺伝子発現における相違を、その処置の効率と相関させ得る。例えば、ある個体が処置に応答することが見出され、そしてその処置が差次的な遺伝子発現と関連する場合、その差次的な遺伝子発現の同定を使用して、その処置の効力を相関付け得る。上記のように、未処置の個体に関連する遺伝子発現パターンは、処置の前のその個体において決定され得るか、またはその処置を受けていない多数の個体において決定され得る。同様に、その処置の効力に関連する発現パターンにおける変化は、多数の個体（これらの個体について、その処置が効力があった）において決定され得る。そのような場合において、処置された標的サンプルと、差次的遺伝子発現を伴わない効力のある処置を行った公知の標的サンプルとを比較することで、その処置が、おそらく効力があるであろうことが示される。同様のアプローチを使用して、その処置の毒性を用いる処置または処置に対する耐性の関連を決定し得る。処置に対する耐性は、未処置の標的サンプルからの発現パターンにおける変化と関連し得るか、または未処置の標的サンプルと比較して発現パターンの変化がないことと関連し得る。
【０１１５】
本発明の方法はまた、薬物探索についての潜在的な標的であり得る同時調節される遺伝子を決定するために使用され得る。例えば、細胞または生物は、刺激物を用いて処置され得、そして未処置のサンプルと、刺激物を用いて処置された標的サンプルとの間の差次的な遺伝子発現が決定され得る。刺激物は例えば、薬物または増殖（成長）因子であり得る。未処置の標的サンプルと、刺激物を用いて処置した標的サンプルとの間の核酸分子の含量の相違を使用して、その刺激物に関連する差次的な遺伝子発現を同定し得る。そのような差次的な発現パターンを使用して、標的サンプルが刺激物に曝露されたか否かを決定し得る。さらに、この遺伝子発現プロフィールを使用して、もとの刺激物と同じ遺伝子発現プロフィールを誘発する化合物についてスクリーニングすることによってその刺激物を模倣する他の化合物を同定し得る。従って、本発明の方法を使用して、公知の薬物に類似する効果を有する新たな薬物を同定し得る。
【０１１６】
本発明の方法は、薬物応答に相関する経路についてのマーカーを同定するために有用である。このことは、供給源のＲＮＡのような核酸の供給源集団の発現プロフィールを反映する所定の標的サンプルについての含量プロフィールを決定することによる。例えば、本発明の方法を使用して、薬物に応答して調節されるいくつかの遺伝子を同定し、それにより潜在的な薬物標的である経路における「近隣」を提供することによって、潜在的な治療的標的の「近隣」を規定し得る。本発明はまた、例えば、治療に「失敗した」経路の悪い近隣を規定するためにも使用され得る。失敗した経路は、特定の経路が撹乱されるべきではないことを示し得る。経路の機能に対するさらなる洞察は、完全な配列情報が利用不能である、差次的に発現される任意の遺伝子を配列決定することによって入手され得る。この方法は、薬物比較について特に有用である。遺伝子発現パターンと薬物応答との相関を使用して、２つの類似の薬物がいくらか異なる効果の範囲を有する理由を決定し得る。
【０１１７】
遺伝子発現と薬物に対する応答との間の相関を知ると、薬物を、特定の疾患または状態とより関連する細胞型において試験し得る。ある病理と関連する細胞型に存在する経路を知ることによって、その細胞型の薬物応答に関する予測を行い得、それによって、その病理にもっとも影響を与えるようである試験された薬物のパネルから薬物の選択を可能にする。薬物応答および遺伝子発現についての情報の相関付けはまた、相乗効果を有する薬物（例えば、重複しない経路を塞ぐ薬物、または例えば、重複する遺伝子が標的化される場合に重複する経路に影響を与える薬物）を選択する助けとなり得る。
【０１１８】
本発明の方法は、刺激物に対する応答を決定すること、特に薬物探索についての刺激物に対する応答を決定することに適用され得る。１つの可能な適用は、本発明の方法を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ＮＣＩ）薬物スクリーニングパネルにおける６０の細胞株に対して使用することである。これらの６０の細胞株は、ＮＣＩによって維持され、そして薬物活性を評価するために使用される。
【０１１９】
例えば、ＮＣＩパネルの６０の細胞株の各々を、細胞増殖、および第二にアポトーシスの単一の変数を報告する複雑な測定デバイスとして使用し得る。薬物のような化学物質を用いて処置する際の各細胞型の増殖における変化が決定される。数万の薬物の研究が、６０すべての細胞株に対して比較される場合に、増殖に対する類似の効果は作用機構を共有することを証明することを示している。６０の細胞株の種々の薬物に対する応答の比較は、その詳細な化学官能基性に従って、薬物のグループ分けを可能にする。結果として、細胞株のパネルは、薬物探索のための最も重要な分析ツールの一つとなっている。
【０１２０】
本発明の方法は、ＮＣＩパネルの６０の細胞株において薬物応答を分析することに適用され得る。本明細書において開示されるように、この方法は、差次的遺伝子発現を決定することに適用され得る。この差次的発現は、特定の薬物に対するその細胞の応答と相関し得る。この方法を使用して、薬物応答に関連する多くの差次的に発現された遺伝子を同定し得る。従って、６０の細胞株ＮＣＩ薬物スクリーニングパネルにおける無関連の細胞における遺伝子発現の分析を使用して、そのパネルにおいて用いられた多くの１０，０００の薬物のいくつかと相関するｍＲＮＡの存在または非存在に基づいて、遺伝子発現のプロフィールを決定し得る。
【０１２１】
差次的遺伝子発現パターンは、薬物応答と相関すると予測される。その細胞株のなかの３０個におけるそのような相関の同定の後、残りの３０の細胞株における薬物応答の予測が試験され得る。この戦略は、すべての６０の細胞株について、すべての新たな薬物について広汎な発現プロフィールを決定して、その薬物に応答する能力と相関する遺伝子を見出す必要を回避する。この戦略は、以前の方法とは、処置後のその遺伝子の差次的発現が必ずしも起きないという点で異なる。必要なことは、それらの遺伝子が処置前の細胞型の間で差次的に制御されていることがのみである。
【０１２２】
６０の細胞株の各々は、薬物に対するその特徴的な応答を有し、そしてこれらの応答は、細胞の表現型に依存する。任意の細胞の、任意の薬物に対する応答は、遺伝子系がその細胞において作動可能であることに依存する。一旦処置されると、その細胞の遺伝子機構が撹乱される。このことは、差次的な遺伝子発現、差次的なタンパク質改変、および微小であり得る広汎な種々の他の変化をもたらす。それにもかかわらず、薬物への任意の曝露前の遺伝子発現の基底状態の遺伝子パターンまたはプロフィールがその細胞が薬物に如何に応答するかを決定することである。
【０１２３】
遺伝子プロフィールの基底状態は、細胞（例えば、ＮＣＩパネルの細胞株）について特徴付けるための重要な状態である。その細胞の基底状態は、所定の細胞が所定の薬物に如何に応答するかについて予測力を有する。さらに、この基底状態は、ほぼ１００，０００の異なる薬物の挙動について唯一の参照についての共通点であり、そしてこれを使用して、さらなる薬物に対する応答を決定し得る。
【０１２４】
例えば、２つのステロイドおよび２つのアルキル化剤が６０の細胞株のパネルに適用され、そしてその増殖範囲が比較される場合、その細胞株のステロイドに対する平均の応答は、類似する傾向にあり、そのアルキル化剤に対する平均の応答は類似する傾向にあるが、ステロイド対アルキル化剤の応答の比較は、ほとんど類似点を示さない。これは、ステロイドが天然に存在するレセプターを介してその効果を誘発するが、アルキル化剤は、広汎な障害を引き起こすことによってその効果を誘発するという事実を反映する。ステロイド性シグナルを処理すること対障害を処理することについてのシグナル伝達経路は、大いに異なる。
【０１２５】
ステロイドのパネルを使用して６０の細胞株にチャレンジする場合、これらの細胞のいくつかは増殖が促進され、いくつかは増殖が阻害され、そしていくつかはステロイドには無反応である。このデータの多くは、ＮＣＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）にて利用可能である。明らかな次の工程は、どの遺伝子が活性化され、どの遺伝子が不活化され、そしてどの遺伝子が無反応であるかを見るために、そのステロイドに応答する遺伝子を調査することである。各細胞型の遺伝子は、約３０のステロイドレセプター遺伝子のどれがステロイド処置の前にその細胞型において発現されているかに依存して、差次的に応答する。
【０１２６】
ステロイドに対する遺伝子の種々の応答は、細胞型依存性である。これは大部分、どのレセプターが存在しているかに起因する。ＮＣＩのパネルの細胞の基底状態の遺伝子発現を比較することによって、各細胞型において発現されるステロイドレセプター遺伝子の範囲が記載され得、それによって、任意の特定のステロイドについて応答性である細胞について、遺伝子に関して何が必要かを説明する。
【０１２７】
薬物レセプターもしくはホルモンレセプターの上記の関係は、ＮＣＩパネル基底線遺伝子発現データベースとＮＣＩパネル薬物応答データベースとの間に関連し得る相関の１つの例である。他の薬物応答は、容易に決定され得る。例えば、アポトーシスを誘発する薬物はまた、遺伝子発現を誘発し、そして細胞型に相関する、異なるアポトーシス応答を使用して、アポトーシスを制御する遺伝子産物を決定し得る。
【０１２８】
本発明の方法は、薬物または他の刺激物に対する応答の特徴付けについてＮＣＩパネルの細胞に加えて、任意の細胞型に適用され得ることが理解される。複数の薬物の間の機能的な重複は、薬物探索において重要な関心事である。異なる細胞型における薬物に対する遺伝子の応答の研究は、有用である。なぜなら、遺伝子発現は、その薬物に対するその細胞の応答を決定するからである。従って、本発明の方法は、特定の薬物に対する１以上の細胞の応答を決定するために適用され得る。
【０１２９】
この方法はまた、ＮＣＩパネルの細胞の基底状態を特徴付けるために適用され得る。本明細書において記載される方法を使用して、その薬物によって調節される経路における遺伝子と数万もの薬物との応答とを相関付けし得る。本発明の方法は、ＮＣＩパネルの細胞を用いてこれまでに試験された８万を超える薬物についての発現プロフィールを決定するために適用され得る。この方法は、薬物作用の協調機構、薬物活性を制御するありそうな経路、毒性と相関する経路、アポトーシスおよび他の薬物効果を決定することに適用可能である。
【０１３０】
本発明はまた、基底遺伝子発現を、処置に対する感受性（例えば、薬物の存在、病原体または他の刺激物の存在下での）を、細胞（ＮＣＩパネル細胞）の増殖における相違）と相関付けるために、異なる未処置の細胞または組織のパネルによる遺伝子発現のパターンの使用の方法を提供する。この方法は、処置の前に存在する遺伝子および経路を決定し、そしてまた処置を、その処置によって誘導される表現型と相関付けるために適用され得る。」
遺伝子発現についてのさらなる情報を得るために、異なる条件からの２つの異なるＲＮＡ集団の発現パターンが決定され得る（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４４１９−４４３１（１９９４）；ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１１：２４２−２４６ （１９９５））。例えば、アポトーシスに関心がある場合、ストレスを受けているが、アポトーシスを受けていない細胞からの標的を使用することを使用して、アポトーシスに応答する遺伝子、ストレスに応答する遺伝子、およびその両方に応答する遺伝子を決定し得る。差次的に調節される遺伝子の同定を使用して、種々の条件下での遺伝子の転写活性をさらに特徴付け得る。この遺伝子は、所定の条件に応答するシグナル伝達経路と、調節される遺伝子のプロモーターを相関付けるためにさらに特徴付けられ得る。
【０１３１】
核酸分子の差次的発現を決定する場合、標的におけるＲＮＡサンプルが差次的に調節されることの決定は、まず、その標的サンプルにおける核酸の２つの異なる濃度における差次的な含有量を比較することによってなされる。含有量は、ＲＮＡ供給源の２つの異なる濃度において含有量の相違が観察されない標的サンプルの核酸分子について決定される。両方のＲＮＡ供給源における両方のＲＮＡ濃度での差次的発現を示すそれらのハイブリダイゼーション事象のみが使用される（実施例ＩＩおよびＩＩＩを参照のこと）。
【０１３２】
差次的な発現を決定するためのアレイに対するハイブリダイゼーションについて、４つのメンブレンを放射標識した標的について使用した。２つのＲＮＡサンプルの各々について、ＲＮＡの２つの濃度の各々についてのものを比較した（実施例Ｉ〜ＩＩＩを参照のこと）。二色の蛍光が、その標的の検出のために使用される場合、２つのメンブレンが使用される（出発標的サンプル核酸の２つの濃度の各々についての１つ）。なぜなら、異なる検出可能な蛍光マーカーを有するその２つの標的を混合し得、そして同じプローブに適用され得るからである。次の確認工程が使用される場合（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）、１つのマーカーが、各標的サンプルについて使用され得る。
【０１３３】
差次的な発現の確認は、全長の配列を必要としない。そして、これは、公知の領域のＲＴ−ＰＣＲを用いて確認され得る。特に、低ストリンジェンシーＰＣＲを使用して、数百塩基長の産物を生成し得る（Ｍａｔｈｉｅｕ−Ｄａｕｄｅら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．９２：１５−２８ （１９９８））。この方法は、ＰＣＲ反応の質、ならびに使用されたＲＮＡの質および量を確認するために使用され得る内部「コントロール」ＰＣＲ産物を生成する。
【０１３４】
本発明はさらに、５以上の刺激物が制御する核酸分子のプロフィールを提供する。本明細書において使用される用語「プロフィール（またはプロファイル）」とは、所定のセットの条件下で標的に特徴的である２以上の核酸分子のグループをいう。本発明は、配列番号１〜４５と言及されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の一部を含むプロフィールを提供する。このプロフィールは、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号のヌクレオチド配列の一部を含む：Ｈ１１５２０、Ｈ１１１６１、Ｈ１１０７３、Ｕ３５０４８、Ｒ４８６３３、Ｈ２８７３５、ＡＦ０１９３８６、Ｈ２５５１３、Ｈ２５５１４、Ｍ１３９１８、Ｈ１２９９９、Ｈ０５６３９、Ｌ４９２０７、Ｈ１５１８４、Ｈ１５１２４、Ｘ７９７８１、Ｈ２５１９５、Ｈ２４３７７、Ｍ３１６２７、Ｈ２３９７２、Ｈ２７３５０、ＡＢ０００７１２、Ｒ７５９１６、Ｘ８５９９２、Ｒ７３０２１、Ｒ７３０２２、Ｕ６６８９４、Ｈ１００９８、Ｈ１００４５、ＡＦ０６７８１７、Ｒ７２７１４、Ｘ５２５４１、Ｈ１４５２９、Ｍ１０２７７、Ｈ２７３８９、Ｄ８９０９２、Ｄ８９６７８、Ｈ０５５４５、Ｊ０３８０４、Ｈ２７９６９、Ｒ７３２４７、Ｕ５１３３６、Ｈ２１７７７、Ｋ００５５８、およびＤ３１７６５。本発明のプロフィールは、以下をコードするヌクレオチド配列の一部を包含する：ＴＳＣ−２２、フィブロネクチンレセプターαサブユニット、レイ（ｒａｙ）遺伝子、Ｘ−ボックス結合タンパク質１、ＣＰＥレセプター、上皮制限ｅｔｓタンパク質ＥＳＸおよびＶａｖ−３。
【０１３５】
本発明はまた、配列番号１〜４５として言及されるヌクレオチド配列の各々の一部を含む標的を提供する。この標的は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号のヌクレオチド配列の一部を含有する：Ｈ１１５２０、Ｈ１１１６１ Ｈ１１０７３、Ｕ３５０４８、Ｒ４８６３３、Ｈ２８７３５、ＡＦ０１９３８６、Ｈ２５５１３、Ｈ２５５１４、Ｍ１３９１８、Ｈ１２９９９、Ｈ０５６３９、Ｌ４９２０７、Ｈ１５１８４、Ｈ１５１２４、Ｘ７９７８１、Ｈ２５１９５、Ｈ２４３７７、Ｍ３１６２７、Ｈ２３９７２、Ｈ２７３５０、ＡＢ０００７１２、Ｒ７５９１６、Ｘ８５９９２、Ｒ７３０２１、Ｒ７３０２２、Ｕ６６８９４、Ｈ１００９８、Ｈ１００４５、ＡＦ０６７８１７、Ｒ７２７１４、Ｘ５２５４１、Ｈ１４５２９、Ｍ１０２７７、Ｈ２７３８９、Ｄ８９０９２、Ｄ８９６７８、Ｈ０５５４５、Ｊ０３８０４、Ｈ２７９６９、Ｒ７３２４７、Ｕ５１３３６、Ｈ２１７７７、Ｋ００５５８、およびＤ３１７６５。本発明はまた、配列番号１〜４５からなる群より選択される核酸配列の一部を含むプローブを提供する。
【０１３６】
本発明は、さらに、その核酸分子が配列番号１〜４５そのものを含まない限り、配列番号１〜４５からなる群より選択される核酸配列を含む実質的に純粋な核酸分子またはその機能的フラグメントを提供する。
【０１３７】
本発明は、さらに、第二の標的と比較した第一の標的における２つ以上の核酸分子の量を測定する方法を提供する。この方法は、プローブに対して２つ以上の核酸分子を含む第一の増幅された核酸標的をハイブリダイズさせる工程を包含する。ここで、その標的は、核酸分子の集団から１つ以上のオリゴヌクレオチドを用いて増幅され、ここで、このオリゴヌクレオチドは、偶然、核酸分子のその集団における核酸分子にハイブリダイズし、ここで、その増幅は、その核酸分子の集団における核酸の含有量に基づかず、そしてその標的におけるその増幅された核酸は、その核酸分子の集団においてあまり豊富ではない核酸について増強される。さらに、本方法においては、そのプローブに対する第一に増幅された核酸標的のハイブリダイゼーションの量を検出する工程であって、ここで、ハイブリダイゼーションの量は、第一の標的における核酸分子の含有量に対応する、工程；ならびに、第一の標的において核酸分子の含有量を、第二の標的における核酸分子の含有量と比較する工程であって、ここで、増幅された核酸標的は、最初の核酸集団における核酸のサブセットを含む、工程が包含される。
【０１３８】
本発明は、さらに、第二の標的と比較した第一の標的における２つ以上の核酸分子の量を測定する方法を提供する。この方法は、プローブに対して５０以上の核酸分子を含む第一の増幅された核酸標的をハイブリダイズさせる工程を包含する。ここで、この標的は、核酸分子の集団から増幅され、そしてこの増幅は、核酸分子の集団における核酸の含有量には基づかず、そしてその標的における増幅された核酸は、核酸分子の集団におけるより少ない含有量の核酸について増強される。この方法は、さらに、そのプローブに対して、増幅された核酸標的のハイブリダイゼーションの量を検出する工程（ここで、ハイブリダイゼーションの量は、第一の標的における核酸分子の発現レベルに対応する）；ならびに、第二の標的における核酸分子の含有量と、第一の標的における核酸分子の含有量とを比較する工程（ここで、その増幅された核酸標的は、ＲＮＡ集団のような各核酸集団における核酸のサブセットを含む）を包含する。
【０１３９】
本明細書において使用される用語「偶然にハイブリダイズする」とは、オリゴヌクレオチドについて言及する場合、そのオリゴヌクレオチドの相補的配列に対するハイブリダイゼーションが所定の核酸分子に生じる相補的配列の統計学的頻度に基づいていることを意味する。偶然にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドの配列を決定すること、続いてそのオリゴヌクレオチドが１つ以上の核酸分子にハイブリダイズするか否かを決定することによって、生成される。そのようなオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、公知の核酸分子の配列によっては予め定まらず、それゆえ偶然生じる。それ自体、任意のオリゴヌクレオチドは、偶然ハイブリダイズすると考えられる。なぜなら、そのオリゴヌクレオチドは、増幅される正確な配列を参照することなく決定されるからである。対照的に、偶然にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドは、第一に公知の配列を分析すること、次いで複数のそれらのオリゴヌクレオチドの間の正確な配列を増幅するオリゴヌクレオチドとして使用され得る核酸分子中における正確な配列を同定することによって生成される。そのようなオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、公知の核酸分子の配列によって予め決定されており、それゆえ、偶然には生じない。
【０１４０】
本明細書において使用される句「増幅は含有量に基づかない」とは、ある標的が、その集団における個々の核酸分子の相対量を参照することなく核酸分子の集団における核酸分子の代表である核酸分子を含むことを意味する。
【０１４１】
本明細書において使用される句「あまり豊富でない核酸について増幅される」とは、核酸分子の集団においてあまり豊富でない個々の核酸分子が、これらのあまり豊富ではない核酸分子の量が核酸分子のもとの集団におけるこれらの核酸分子の量と比べて増加するように増幅されることを意味する。従って、核酸分子の集団における核酸分子の相対比は、その標的において維持されない。
【０１４２】
本明細書において使用される用語「単一サンプル」とは、標的に言及して用いられる場合、その標的が別のサンプルには以前に曝露されていない単一の細胞、組織または器官のサンプルからの核酸分子を用いて生成されることを意味する。例えば、標的が、別のサンプルに対する１つのサンプルの曝露によって決定された核酸分子の集団から生成される場合（例えば、別のサンプルからの１つのサンプルの核酸分子のサブトラクション）、そのような標的は、単一のサンプルに由来すると考えられない。
【０１４３】
以下の実施例は、本発明の例示を意図し、限定することは意図しない。
【０１４４】
（実施例１：ＤＮＡアレイをプローブするための恣意的にサンプリングした標的の生成および使用）
本実施例は、ｍＲＮＡ発現を決定するためのＤＮＡアレイをプローブするために減少した複雑性を有する恣意的にサンプリングした標的の生成を記載する。
【０１４５】
ＤＮＡフィンガープリントを、ＲＡＰ−ＰＣＲを用いて生成し、そしてランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド（Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ ＴＸ）を用いて高比活性のプローブへと変換した。ＲＡＰ−ＰＣＲからの１０μｇまでのＰＣＲ産物をＱＩＡＱＵＩＣＫ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．；Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）を用いて精製した。このキットは、取り込まれていない塩基、プライマーおよび４０塩基対より小さなプライマーダイマーを除去する。このＤＮＡを、１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．３中に回収した。（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰからの放射性リンの取り込みを伴うランダムプライム合成を、標準的な条件下で使用した。回収されたフィンガープリントＤＮＡの１０％（１０μｌ）を、２８μｌの総量中で、６μｇのランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドプライマーおよび１μｇのフィンガープリントプライマー（Ｇｅｎｏｓｙｓ）の一方と合わせ、３分間煮沸し、次いで氷上に置いた。ヘキサマー／プライマー／ＤＮＡの混合物を、２２μｌの反応混合物と混合して、０．０５ｍＭの濃度の３つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ；ｄＣＴＰなし）、１００μＣｉの３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ（α−３２ｐ）ｄＣＴＰ（１０μｌ）、ｌ×クレノウフラグメント緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＮａＣｌ）および８Ｕ クレノウフラグメント（３．８２ Ｕ／μｌ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）を含む５０μｌの反応物を得た。この反応を室温で４時間行った。最大の標的長について、その反応を、１μｌの２．５ｍＭ ｄＣＴＰを添加することで追跡し、そして１５分間室温でインキュベートし、続いてさらに３７℃で１５分間インキュベートした。取り込まれていないヌクレオチドおよびヘキサマーを、Ｑｉａｇｅｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて除き、そして精製された産物を、１４０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．３中に２回溶出した。
【０１４６】
そのアレイへのハイブリダイゼーションについて、４つのメンブレンを、放射性標識された標的について、比較される２つのＲＮＡサンプルの各々についてＲＮＡの２つの濃度の各々について１つを使用した。ｃＤＮＡフィルター（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を調製するために、そのフィルターを、残留の細菌残渣を減少させるために平底容器の水平振盪で、２×ＳＳＣおよび０．ｌ％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の３回の交換において予備洗浄した。２０×ＳＳＣは、３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸Ｎａ３−２Ｈ２Ｏ、ｐＨ ７．０を含む。第一の洗浄を、室温で１０分間５００ｍｌにおいて行った。第二および第三の洗浄を１リットルの予め暖めた（５０℃）予備洗浄溶液中で、それぞれ１０分間行った。
【０１４７】
予備ハイブリダイゼーションについて、そのフィルターを、ローラーボトルに移し、そして６０ｍｌの予め暖めた（４２℃）の予備ハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、５×デンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ
断片化させ、変性させたサケ精子ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）および５０％ホルムアミド（Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ ＷＩ）を含む）中で１〜２時間４２℃にて予備ハイブリダイズさせた。５０×デンハルトの溶液は、１％ Ｆｉｃｏｌｌ、１％ポリビニルピロリドンおよび１％ウシ血清アルブミン（滅菌濾過）を含む。
【０１４８】
ハイブリダイゼーションについて、予備ハイブリダイゼーション溶液を除去し、そして７ｍｌの予め暖めた（４２℃）ハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ断片化され変性させたサケ精子ＤＮＡおよび５０％ホルムアミドを含む）を添加した。反復配列（例えばＡｌｕ反復）に起因するバックグラウンドハイブリダイゼーションを減少させるために、長い間隔を置いた反復性のエレメント（ＬＩＮＥ）またはセントロメアＤＮＡ反復、変性ヒトゲノムＤＮＡ（１μｇ／ｍｌストック濃度）を、沸騰水浴中で１０分間変性させ、そして直ぐに最終濃度１０μｇ／ｍｌでハイブリダイゼーション溶液に加えた。同時に、標識された標的（２８０μｌ）を、沸騰水浴中で４分間変性させ、そして直ぐにハイブリダイゼーション溶液に加えた。ハイブリダイゼーションを、４２℃で２〜４８時間、代表的には１８時間、ハイブリダイゼーションオーブンで、ローラーボトルを用いるかまたはプラスチックバッグ中にシールして行い、そして水浴中でインキュベートした。
【０１４９】
洗浄について、その温度をインキュベータオーブン（Ｔｅｃｈｎｅ ＨＢ−１Ｄ；ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）において５５℃に設定した。ハイブリダイゼーション溶液を注ぎ出し、そしてメンブレンを２回、５０ｍｌの２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳで、５分間室温で洗浄した。次いで、そのメンブレンを、１００ｍｌ ０．ｌ×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳで洗浄し、そして１０分間室温でインキュベートした。さらなる洗浄について、洗浄溶液（０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含む）を、予め５０℃に暖め、そしてそのフィルターを４０分間、１００ｍｌの洗浄溶液を有するローラーボトル中で洗浄した。次いで、そのフィルターを水平に振盪する平底容器に移し、そして１リットルの洗浄溶液中で２０分間緩和な振盪下で洗浄した。そのフィルターを、１００ｍｌの予め暖めた０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含むローラーボトルに戻し、そして１時間インキュベートした。最後の洗浄溶液を除き、そしてそのフィルターを、２×ＳＳＣ中で室温にて手短にリンスした。
【０１５０】
洗浄後、そのメンブレンを、３ＭＭ紙を用いて軽く乾燥し、そしてそのわずかに湿ったメンブレンをＳＡＲＡＮラップ中に包装した。このメンブレンを、Ｘ線フィルムに曝露した。
【０１５１】
図１は、クローンアレイに対する差次的ハイブリダイゼーションを示す。４つすべての画像は、より大きなメンブレンの同じ部分についてのオートラジオグラムの拡大図を示す。
【０１５２】
各画像は、約４０００の二連のスポットＥ．ｃｏｌｉコロニーにわたる。その各々は、異なるＥＳＴクローンを有する。パネルＡは、逆転写の間に放射標識したコンフルエントのヒトケラチノサイトからの１μｇのポリＡ＋ＲＮＡのハイブリダイゼーションを示す。約５００の明らかにハイブリダイズするクローンが見られ得る。パネルＢおよびＣは、未処理（パネルＢ）またはＥＧＦで処理した（パネルＣ）コンフルエントのヒトケラチノサイトのオリゴ（ｄＴ）プライムされたｃＤＮＡからのｃＤＮＡ上にて行われた一対の恣意プライマーを用いたＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを示す。ハイブリダイズする遺伝子のパターンをは、パネルＢおよびＣにおいてほぼ同一であったが、（パネルＡと比較すると）総ポリＡ＋ＲＮＡを用いて見られるものとは全く異なっていた。１つの差次的に発現されるｃＤＮＡからの２つの放射標識されたコロニーは、矢印によって示される。次いで、この遺伝子の差次的発現を、特異的なＲＴ−ＰＣＲ（Ｔｒｅｎｋｌｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３８８３−３８９１（１９９８））によって確認した。
【０１５３】
図１Ｄは、コンフルエントのヒトケラチノサイトからのＲＮＡにおいて行われた、異なる対の恣意プライマーを用いたＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを示す。ハイブリダイゼーションのこのパターンは、以前のプライマー対を用いて（パネルＢ）およびｍＲＮＡを用いて（パネルＡ）見出されるものとはほとんど完全に異なっており、ここで、パネルＤとパネルＡおよびパネルＢとの間の重複するスポットは殆どなかった。
【０１５４】
これらの結果は、恣意的にサンプリングされた標的（これは、減少した複雑性を有する）が、標的として総メッセージを用いて検出可能ではないｍＲＮＡの検出を可能にすることを実証する。従って総メッセージ標的（これは、それらの含有量に基づいてｍＲＮＡを検出する）とは異なり、恣意的にサンプリングされた標的を使用して、あまり豊富ではないｍＲＮＡを検出し得る。
【０１５５】
（実施例ＩＩ：ＲＴ−ＰＣＲによって生成された、恣意的にサンプリングされた標的は、ＥＧＦに対して応答して差次的に発現された遺伝子を検出する）
本実施例は、ＥＧＦを用いた細胞の処置の際の差次的な遺伝子発現を検出するための恣意的にサンプリングされた標的を生成するための、恣意プライマ−を用いたＲＴ−ＰＣＲの使用を記載する。
【０１５６】
ＲＴ−ＰＣＲによって生成された、恣意的にサンプリングされた標的を使用して、差次的な遺伝子発現についてのアレイをプローブした（Ｔｒｅｎｋｌｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３８８３−３８９１ （１９９８））。ＲＮＡ調製物について、不死化させたヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴ （Ｂｏｕｋａｍｐら、Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ １９：２０１−２１４ （１９９７））をコンフルエンスにまで増殖させて、そして２日間コンフルエンスに維持した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを含む培地であるＤＭＥＭを、実験の１日前に交換した。ＥＧＦ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を、２０ｎｇ／ｍｌで添加したか、またはＴＧＦ−β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）を５ｎｇ／ｍｌで添加した。処置細胞および未処置細胞を、４時間後、溶解緩衝液（ＲＬＴ緩衝液；Ｑｉａｇｅｎ）の存在下でペトリ皿をかきとることによって採集し、そしてＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を通してホモジナイズした。平均して７×１０６の細胞（１００ｍｍ直径のペトリ皿中コンフルエントにまで増殖した）から、ＲＮＥＡＳＹ総ＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）から、４０μｇの総ＲＮＡを得た。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２緩衝液ｐＨ８中のＲＮＡを、０．０８ Ｕ／μｌのＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅおよび０．３２Ｕ／μｌのＲＮａｓｅインヒビター（両方ともＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ由来）とともに、３７℃で４０分間インキュベートし、そしてＲＮＥＡＳＹキットを用いて再びきれいにした。このことは、フィンガープリントに寄与し得る少量のゲノムＤＮＡを除去するために重要である。ＲＮＡの量を、分光学的に測定した。そしてＲＮＡサンプルを、水中の４００ｎｇ／μｌに調整した。ＲＮＡサンプルを、アガロースゲル電気泳動によって質および濃度についてチェックし、そして−２０℃にて保存した。
【０１５７】
ＲＮＡフィンガープリントについて、ＲＡＰ−ＰＣＲを、標準的なプロトコルを用いて実施した（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄら、前出、１９９４）。逆転写を、一つのサンプルあたりで４つの濃度（１反応物あたり１０００ｎｇ、５００ｎｇ、２５０ｎｇおよび１２５ｎｇ）およびオリゴｄ（Ｔ）プライマー（１５マー）（Ｇｅｎｏｓｙｓ）を用いて総ＲＮＡに対して行った。ＲＮＡ（５μｌ）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２，２０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、各々０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．５μＭのプライマー、および２０ＵのＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を含む１０μｌの最終反応容量のために５μｌの緩衝液と混合した。初期のＲＡＰ−ＰＣＲ実験において逆転写酵素を含まないコントロールを含ませることによって、ＲＮＡサンプルを、ＤＮＡ夾雑物についてチェックした。この反応を、５分間での２５℃から３７℃への勾配の後３７℃で１時間行った。この酵素を、そのサンプルを５分間９４℃に加熱することによって不活化し、そして新たに合成されたｃＤＮＡを、水中に４倍に希釈した。
【０１５８】
ＰＣＲを、恣意的配列（対Ａ：ＧＰ１４（ＧＴＡＧＣＣＣＡＧＣ；配列番号 ）およびＧＰ１６（ＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡ；配列番号 ）、対Ｂ：Ｎｕｃｌ＋（ＡＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧ；配列番号 ）およびＯＰＮ２４（ＡＧＧＧＧＣＡＣＣＡ；配列番号 ））の１対の２つの異なる１０マーまたは１１マーのオリゴヌクレオチドプライマーの添加後に行った。一般に、それらが少なくともいくつかのＣまたはＧの塩基を含むこと、プライマーダイマーを避けるためにその３’末端がそれら自身または反応物中の他のプライマーに対して相補的ではないこと、およびｍＲＮＡの同じ部分が異なるフィンガープリントにおいて増幅されないように配列中の異なるプライマーセットが選択されることを除いて、そのプライマーには何ら特定の制限はない。
【０１５９】
希釈されたｃＤＮＡ（１０μｌ）を、最終反応容量２０μｌについて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．３、２０ｍＭ ＫＣｌ、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各々０．３５ｍＭのｄＮＴＰ、各々２μＭのオリゴヌクレオチドプライマー、２μＣｉ α−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰ（ＩＣＮ；Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）および５ Ｕ ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼＳｔｏｆｆｅｌフラグメント（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ ；Ｎｏｒｗａｌｋ ＣＴ）を含む同じ容量の２×ＰＣＲ混合物と混合した。サーモサイクリングを、９４℃で１分間、３５℃で１分間および７２℃で２分間の３５サイクルを用いて行った。
【０１６０】
増幅産物の３．５μｌアリコートを９μｌのホルムアミド色素溶液と混合し、８５℃で４分間変性し、そして氷上で冷却した。２．４μｌを、０．０９Ｍ Ｔｒｉｓ−ホウ酸、０．００２Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有する１×ＴＢＥ緩衝液で調整した。５％ポリアクリルアミド、４３％尿素ゲルにロードした。同じＲＮＡテンプレートの４つの異なる濃度から生じるＰＣＲ産物を、ゲル上で横に並べてロードした。
【０１６１】
電気泳動を、１，７００Ｖで、または５０〜７０ワットの定電力で、キシレンシアノールトラッキング色素がゲルの底部に達するまで（約４時間）実施した。このゲルを減圧下で乾燥し、そしてＫｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ Ｘ線フィルム上に１６〜４８時間配置した。
【０１６２】
プローブアレイに対する標的として使用するためのＲＡＰ−ＰＣＲ産物の標識化のために、ＲＡＰ−ＰＣＲからの１０μｇまでのＰＣＲ産物を、ＱＩＡＱＵＩＣＫ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。これは、取り込まれなかった塩基、プライマー、およびプローブダイマー（４０塩基対以下）を取り除く。ＤＮＡを、５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）中に回収した。
【０１６３】
α−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰの取り込みを伴うランダムプライム合成を、本質的に実施例Ｉに記載のように実施した。簡単に述べれば、回収されたフィンガープリントＤＮＡの１０％（代表的には、５μｌ中約１００ｎｇ）を、総容量１４μｌで、３μｇのランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドプライマーおよび各フィンガープリントプライマー０．３μｇと合わせた。これを３分間沸騰させ、次いで氷上に配置した。
【０１６４】
ヘキサマー／プライマー／ＤＮＡ混合物を、１１μｌ反応混合物と混合し、０．０５ｍＭの３つのｄＮＴＰ（ｄＣＴＰを含まない）、５０μＣｉの３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌのα−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰ（５μｌ）、１×クレノウフラグメント緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、および４Ｕクレノウフラグメント（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含む）を含む２５μｌの反応物を得た。反応を、室温で４時間実施した。最大標的長のために、反応を、１μｌの１．２５ｍＭのｄＣＴＰを添加することにより追跡し、そして２５℃で１５分間インキュベートし、続いて３７℃でさらに１５分間インキュベートした。取り込まれなかったヌクレオチド、ヘキサマー、およびプライマーを、Ｑｉａｇｅｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて除去し、そして精製産物を、１４０μｌの１０ｍＭＴｒｉ（ｐＨ８．３）の２つのアリコートを使用して溶出した。
【０１６５】
標的として使用するためのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡの標識化のために、ランダムヘキサマーをポリ（Ａ）＋選択ｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡを標識するために使用した。ゲノムＤＮＡ（１５０ｎｇ）を、上記のＲＡＰ−ＰＣＲ産物の標識化のために使用した同じプロトコルを使用して標識化した。２７μｌの容量中ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ（１μｇ）および９μｇランダムヘキサマーを、７０℃で２時間インキュベートし、そして氷上で冷却した。ＲＮＡ／ヘキサマー混合物を、２３μｌのマスター混合物と混合した。これは、１０μｌの５×ＡＭＶ反応緩衝液を含み、これは、最終容量５０μｌで、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、４０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、１μｌの３つのｄＮＴＰ、各３３ｍＭ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ；ｄＣＴＰを含まない）、２μｌのＡＭＶ逆転写酵素（２０単位；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および１０μｌ ３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ α−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰを含む。この反応物を、室温で１５分間インキュベートし、１時間４７℃に立ち上げ、４７℃で１時間保ち、そして４７℃で別に３０分間、１μｌの３３ｍＭ ｄＣＴＰを用いて追跡した。標識化された産物を、上述のようにして精製した。
【０１６６】
アレイに対するハイブリダイゼーションのために、４つの膜を使用した。１つの膜は、比較されるべき２つのＲＮＡサンプルの各々について２つのＲＮＡ濃度の各々に対する。ｃＤＮＡフィルター（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、平底容器で垂直に振盪して２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを３回換えて洗浄し、残りの細菌細片を減少させた。最初の洗浄を、室温で１０分間５００ｍｌで実施した。第二および第三の洗浄を、５５℃に予め暖めておいた１リットルの前洗浄溶液で、各洗浄ごとに１０分間実施した。
【０１６７】
プレハイブリダイゼーションについて、フィルターをローラーボトルに移し、そして、４２℃に予め暖めておいた６０ｍｌプレハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ，５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌフラグメント化変性サケ精子ＤＮＡ、および５０％ホルムアミドを含む）中で、ハイブリダイゼーションオーブン中で４２℃で１〜２時間、プレハイブリダイズした。
【０１６８】
ハイブリダイゼーションのために、プレハイブリダイゼーション溶液を除去し、そして４２℃に予め暖めておいた７ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌフラグメント化変性サケ精子ＤＮＡ、および５０％ホルムアミドを含む）を添加した。ＡｌｕエレメントおよびＬｉｎｅエレメントのような繰り返しに起因するバックグラウンドハイブリダイゼーションを減少させるために、剪断ヒトゲノムＤＮＡを、沸騰水浴中で１０分間変性させ、そしてその直後に最終濃度１０μｌ／ｍｌにまでハイブリダイゼーション溶液に添加した。１０ｎｇ／ｍｌポリ（ｄＡ）を添加し、放射性標識化標的中でオリゴｄ（Ｔ）ストレッチをブロックした。同時に、標識化された標的は、総容量２８０μｌで、沸騰水浴中で４分間変性させ、そしてその直後にハイブリダイゼーション溶液に添加した。ハイブリダイゼーションを、４２℃で２〜４８時間、代表的には１８時間、大きなローラーボトル中で実施した。
【０１６９】
洗浄のために、インキュベーターオーブン温度を６８℃に設定した。ハイブリダイゼーション溶液を注ぎ出し、膜を、室温で５分間、５０ｍｌの２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで２回、洗浄した。次いで、洗浄溶液を、１００ｍｌの０．１×ＳＳｃおよび０．１％ＳＤＳに代え、そして室温で１０分間インキュベートした。さらなる洗浄のために、洗浄溶液（０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する）を６８℃に予め暖めた。膜を、ローラーボトルにおいて、１００ｍｌの洗浄溶液中で４０分インキュベートし、次いで、フィルターを垂直に振盪する平底容器に移し、１リットル中で２０分間穏やかに攪拌しながら洗浄した。フィルターを、予め６８℃に暖めた１００ｍｌの０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有するローラーボトル中に戻し、そして１時間インキュベートした。最終洗浄溶液を除去し、このフィルターを２×ＳＳＣで室温で簡単にリンスした。
【０１７０】
洗浄後、この膜を３ＭＭ濾紙でブロットし、加湿させながらＳＡＲＡＮラップ中に包み、Ｘ線フィルムに露出した。この膜は、通常、十分に放射性であり、スクリーンへの１日曝露により、ＥＳＴクローンを有する１８，４３２の細菌コロニーのアレイ上の上方の１０００の産物が明示された。より弱い標的またはより薄いハイブリダイゼーション事象を、−７０℃で２〜３日間、増感スクリーンを用いて可視化した。
【０１７１】
差次的発現の確認のために、低いストリンジェンシーのＲＴ−ＰＣＲを用いた。差次的発現の最初の確認は、１サンプル当たり２つのＲＮＡ濃度の使用であった。両ＲＮＡサンプルにおける両ＲＮＡ濃度で差次的発現を示したハイブリダイゼーション事象のみが期待される。
【０１７２】
Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．協会クローンの７０％より多くが、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託された５’末端もしくは３’末端、または両方からの単一路の配列読みを有する。以前の配列情報が利用可能でない場合、クローンは、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓから順に並べられて、配列決定され得る。ＭａｃＶｅｃｔｏｒ ６．０（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ；Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ）を用いて１８〜２５塩基長のＰＣＲプライマーを誘導するために、配列を使用した。一般に、５０〜２５０塩基対のＰＣＲ産物を生成し、そして少なくとも６０℃の融解温度を有するように、プライマーを選択した。
【０１７３】
上記のＲＡＰ−ＰＣＲプロトコルにおける条件と同じ条件下で、オリゴｄ（Ｔ）プライマーまたはランダムな９マーのプライマーの混合物（Ｇｅｎｏｓｙｓ）を用いて、逆転写を実施した。ＰＣＲ反応を、以下に記載の２対の特異的プライマー（１８〜２５マー）を用いて実施した。ＰＣＲ条件は、１．５μＭの各プライマーを使用したことを除いては、ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントプロトコルにおける条件と同じであった。低いストリンジェンシーの熱プロフィールを使用した：９４℃で４０秒、４７℃で４０秒、および７２℃で１分（３つの別個の反応管中で１９、２２、および２５サイクル）。反応は、異なるサイクル数で３セットの管中で実施した。なぜなら、転写物の豊富さ、プライマー対の性能、およびＰＣＲ産物の増幅能は変動し得るからである。ＰＣＲ産物を、５％ポリアクリルアミドおよび４３％尿素ゲル上で上述と同じ条件下で流した。ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに１８〜７２時間露出させた。フィンガープリント中の他の恣意的産物間の不変性を、相対的定量の信頼性を示すために、内部コントロールとして使用した。
【０１７４】
プライマー対（Ｇｅｎｏｓｙｓ）を、差次的発現の確認のために使用した。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１１５２０（９０ヌクレオチド産物）について；プライマーＡ、ＡＡＴＧＡＧＧＧＧＧＡＣＡＡＡＴＧＧＧＡＡＧＣ（配列番号 ）；プライマーＢ、ＧＧＡＧＡＧＣＣＣＴＴＣＣＴＣＡＧＡＣＡＴＧＡＡＧ（配列番号 ）。ＴＳＣ−２２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３５０４８、Ｈ１１０７３、Ｈ１１１６１；１７９ヌクレオチド産物）について；プライマーＡ、ＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＴＧＡＣＡＧＧＴＡＧＣＴＧＧ（配列番号 ）；プライマーＢ、ＡＡＧＴＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＣＣ（配列番号 ）。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ４８６３３（１７８ヌクレオチド産物）について；プライマーＡ、ＣＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＡＡＡＣＡＧＣＣＧＴＧ（配列番号 ）；プライマーＢ、ＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＧＴＧＴＧＴＧＣＴＧ（配列番号 ）。
【０１７５】
分析されるアレイは、１８，４３２のＥ．ｃｏｌｉコロニーを含み、それぞれは、異なるＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．協会ＥＳＴプラスミド（ｗｗｗ−ｂｉｏ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ／ｂｂｒｐ／ｉｍａｇｅ／ｉｍａｇｅ．ｈｔｍｌ）を有し、２２×２２ｃｍ膜（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）上で２回スポットした。Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓアレイは、それらが単位コスト当たりこれまでの最大数のＥＳＴを含有する点で有利である。標的調製のためのＲＮＡフィンガープリンティング。
【０１７６】
ＥＧＦまたはＴＧＦ−βで４時間処理した場合のケラチノサイト（ＨａＣａｔ）における差次的遺伝子発現を探索するために、ＲＡＰ−ＰＣＲ増幅を実施した（Ｂｏｕｋａｍｐら、前出、１９９７）。これらの実験を、コンフルエントなケラチノサイトにおいてＥＧＦおよびＴＧＦ−β処理により差次的に調節された遺伝子を検出するために設計した。ＲＡＰ−ＰＣＲを使用して、正常ケラチノサイトまたは不死ケラチノサイトにおける遺伝子の約１％がＥＧＦに応答し、そしてより少ない遺伝子が、この時間枠でＴＧＦ−βに応答した。
【０１７７】
複数のＲＮＡ濃度および２セットの恣意的に選択されたプライマーを用いてＴＧＦ−βまたはＥＧＦで処理したコンフルエントなケラチノサイト由来のＲＮＡのＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを、図２に示す。レーン１、２、３、および４において、それぞれ２５０、１２５、６２．５、および３１．２５ｎｇのＲＮＡに対してオリゴｄＴプライマーを用いて、逆転写を行った。ＲＮＡは、示されるように、未処理ＨａＣａＴ細胞、ＴＧＦ−β処理ＨａＣａＴ細胞、またはＥＧＦ処理ＨａＣａＴ細胞由来であった。２セットのプライマー、ＧＰ１４およびＧＰ１６（パネルＡ）、またはＮｕｃ１＋およびＯＰＮ２４（パネルＢ）を用いて、ＲＡＰ−ＰＣＲを実施した。２つの差次的に増幅されたＲＡＰ−ＰＣＲ産物のサイズを、矢印で示す（３１７ヌクレオチドおよび２９１ヌクレオチド）。
【０１７８】
図２Ａに示した第一のフィンガープリントにおいて、２つの差次的に調節された産物が検出された。これらをクローニングシ、配列決定した。これらの２つの産物のサイズ、２９１ヌクレオチドおよび３１７ヌクレオチドを、矢印と共に示す（図２Ａを参照のこと）。使用したＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓアレイは、これらの２つのクローンの存在に基づいて選択した。このフィンガープリントを用いて、アレイ中で差次的に調節された遺伝子が、ＲＡＰ−ＰＣＲ産物を単離、クローニング、および配列決定することなく同定され得ることを実証した。図２Ａに示したフィンガープリントおよび図２Ｂに示した第二のフィンガープリント（これは、処理に応じて差次的な調節を提示しなかった）もまた用いて、フィンガープリント上では見えない、薄い差次的に調節された産物が、それにもかかわらず、アレイアプローチによって観察され得ることを実証した。
【０１７９】
得られた結果は、再現性が高かった。ゲル電気泳動を用いて、異なるＲＮＡ濃度で実施された単一の処理条件からのフィンガープリントのいずれにおいてもみることができる、約１００のバンド間で差異がなかった（図２を参照のこと）。同様に、図２Ａのフィンガープリンとに由来する標的によってハイブリダイズした上方の１０００クローンの９９％より多くが、両方の投入ＲＮＡ濃度でみることができた。さらに、９９％より多くの産物が、単一のＲＮＡ濃度での２つの処理条件（＋ＥＧＦおよび−ＥＧＦ）間で同じであった。これらの結果は、ＲＡＰ−ＰＣＲ増幅における上方の１０００のＰＣＲ産物間で高い再現性を示した。
【０１８０】
未処理コントロールおよびＥＧＦ処理サンプルをさらに特徴付けた。図２に示したＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを、上述のようにα−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰを用いてランダムプライム合成によって、高い比活性の放射性の標的に変換した。２つの条件の各々について、２つの異なる濃度でのＲＮＡから生成されたＥＧＦ処理および未処理のフィンガープリントを、２つの異なるフィンガープリンティングプライマー対の各々についてのランダムプライム合成によって、標的に変換した。次いで、これらの放射性標識したフィンガープリント標的を用いて、各々が１８，４３２ Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．協会ｃＤＮＡクローンを含む同一アレイのセットにハイブリダイズさせることによってプローブした。コントロールとして、総ゲノムＤＮＡおよび総ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡもまた、上述のようにランダムプライムすることにより標識し、そして同一アレイ上での標的として使用した。
【０１８１】
ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリント標的、総ｍＲＮＡ標的およびゲノム標的を、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓコロニーアレイのレプリカーゼに対して個々にハイブリダイズさせた。ゲノムＤＮＡを、ブロッキング剤として、および非常に反復性の高い配列に対する競合剤として使用した。０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での６８℃での洗浄は、膜上の公知のＡｌｕエレメントに対する事実上全てのハイブリダイゼーションを除いた。これは、おそらく、Ａｌｕエレメントが、この洗浄ストリンジェンシーで互いに十分に異なるためである。
【０１８２】
各膜の同じ側の半分からのオートラジオグラムを図３に示す。提示された全ての画像は、放射性標識ＤＮＡでのハイブリダイゼーションによりプローブされた同じフィルター（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の複製物の下側の半分のオートラジオグラムである。パネルＡおよびＢは、同じプライマー（ＧＰ１４およびＧＰ１６）を用いて生成され、そして未処理（パネルＡ）ＨａＣａＴ細胞またはＥＧＦ処理（パネルＢ）ＨａＣａＴ細胞に由来する２つのＲＡＰ−ＰＣＲ反応のハイブリダイゼーションを示す。差次的なハイブリダイゼーションシグナルを示す３つの二重スポットクローンが、各アレイ上に標記される。クローンおよび対応する遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、以下である：Ｈ１００４５およびＨ１００９８（ｖａｖ−３に対応する）；ならびにＡＦ０６７８１７（四角）（Ｋａｔｚａｖら、ＥＭＢＯ Ｊ．８：２２８３−２２９０（１９８９））；Ｈ２８７３５、未知遺伝子、ヘパラン硫酸３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ−１に類似、ＡＦ０１９３８６（丸）（Ｓｈｗｏｒａｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８００８−２８０１９（１９９７）；およびＲ４８６３３、未知遺伝子（菱形）。
【０１８３】
図３は、アレイに対するこれらのフィンガープリントからの標的のハイブリダイゼーションの結果を示す。図３Ａおよび図３Ｂに示されるように、２９１ヌクレオチド（ｖａｖ−３、四角で標記）および３１７ヌクレオチド（ヘパラン硫酸Ｎ−スルホトランスフェラーゼ（Ｎ−ＨＳＳＴ）に類似、円で標記）のＲＡＰ−ＰＣＲフラグメントに対応する並べられたクローンを示す。これらのＲＡＰ−ＰＣＲフラグメントの配列を決定した。元のフィンガープリントゲル上で可視化され得ない差次的に調節された遺伝子もまた、このアレイ上に示される（菱形で標記）。
【０１８４】
図３Ａと３Ｂとを比較すると、ＥＧＦでの処理に際し、ｖａｖ−３について１０倍より大きいダウンレギュレーションが観察された。Ｈ２８７３５に対応する遺伝子は、ＥＧＦ処理で１０倍より大きくアップレギュレートされた。Ｒ４８６３３に対応する遺伝子は、ＥＧＦ処理で約３倍アップレギュレートされた。ＥＧＦに応答する遺伝子発現におけるこれらの変化は、ＲＴ−ＰＣＲにより独立に確認された。
【０１８５】
これらの結果は、ＲＡＰ−ＰＣＲが、メッセージの豊富さとはほとんど独立して、ｍＲＮＡの集団をサンプリングすることを示す。これは、あまり豊富ではないクラスのメッセージが、豊富なクラスよりかなり高い複雑度を有し、恣意プライマーが良好な一致をより見出すようにするからである。ディファレンシャルディスプレイとは異なり、ＲＡＰ−ＰＣＲは、２つのこのような恣意的プライミング事象を要求し、おそらく、ＲＡＰ−ＰＣＲを複雑なクラスに向かってずらす。
【０１８６】
全体として、これらのデータは、細胞中のｍＲＮＡ集団の大部分（＜２０，０００ｍＲＮＡ）が、わずか１０程度のＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリント中に見出され得ることを示唆する。この結果は、この事象が標準的なゲル電気泳動アプローチを用いて検出され得ない場合でさえ、差次的な遺伝子調節を、組み合わせたフィンガープリンティングおよびアレイアプローチにより検出し得ることを示す。
【０１８７】
図３Ｃは、パネルＡ中と同じＲＮＡであるが、異なるプライマー対、Ｎｕｃｌ＋およびＯＰＮ２４とともに用い、ＲＡＰ−ＰＣＲ標的とハイブリダイズしたアレイを示す。図３Ｃに示されるように、異なるセットのプライマーを用いることは、ハイブリダイズする遺伝子の完全に異なるパターンを生じる。図３Ｄは、１μｇのポリ（Ａ）＋−選択されたｍＲＮＡの逆転写により生成されたｃＤＮＡとハイブリダイズされたアレイを示す。図３Ｅは、ランダムプライミングを用いて標識したヒトゲノムＤＮＡとハイブリダイズしたアレイを示す。
【０１８８】
データは多くの方法で分析した。最初に、各標的によりハイブリダイズされたクローン間の重複から推定がなされた。異なるタイプの標的のすべての間のすべての対をなす比較において、最も強くハイブリダイズした５００のクローン間で５％より少ない重複があった（図３Ａ、３Ｂ、３Ｄ、および３Ｅを比較のこと）。ゲノム標的によりハイブリダイズされた上方の５００のクローン（Ａｌｕ反復を含むことが知られたほとんどすべてのクローンを含んだ）のうち、５％より少ないものが、フィンガープリント標的または総ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ標的によりハイブリダイズされた上方の５００のクローンと重複した。これは、ゲノム標的の場合を除いて、散在する反復に対する有意なハイブリダイゼーションがなかったことを示す。異なるプライマーを用いて生成された２つのＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントによりハイブリダイズされたクローン間の重複は、３％より少なく、そしてポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ標的とのいずれかのフィンガープリントの重複は、両方とも３％より少なかった。従って、このフィンガープリントからの標的を用いて検出されたｃＤＮＡの大部分は、総ｍＲＮＡ標的を用いて検出され得なかった。これらの結果は、ＲＡＰ−ＰＣＲが、メッセージの豊富さとはほとんど独立に、ｍＲＮＡの集団をサンプリングすることを示す。これは、あまり豊富ではないクラスのメッセージが、豊富なクラスよりかなり高い複雑度を有し、恣意プライマーが良好な一致をより見出すようにするからである。ディファレンシャルディスプレイとは異なり、ＲＡＰ−ＰＣＲは、２つのこのような恣意的プライミング事象を要求し、おそらく、ＲＡＰ−ＰＣＲを複雑なクラスに向かってずらす。
【０１８９】
全体として、これらのデータは、細胞中のｍＲＮＡ集団の大部分（＜２０，０００ｍＲＮＡ）が、わずか１０程度のＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリント中に見出され得ることを示唆する。
【０１９０】
恣意プライマー（図２）の両方のセットから誘導された標的を使用して、約３倍のディファレンシャルハイブリダイゼーションの閾値で、３０個の差次的にハイブリダイズするｃＤＮＡクローンの全てを、約２０００個のハイブリダイズするコロニーの中から検出した。これらの２２個の差次的にハイブリダイズするクローンは、両方のＲＮＡ濃度で差次的ハイブリダイゼーションを示した。これらの２２個を、さらに、ＲＴ−ＰＣＲにより特徴付けた。ＥＧＦ処理に応答しての発現において２倍より高い差異を示す差次的に発現される遺伝子を、表１に示す。表１に示される結果については、差次的発現を低いストリンジェンシーのＲＴ−ＰＣＲにより確認した。左欄はＥＳＴクローンの受託番号を提供する（５’または３’、あるいは入手可能である場合には両方）。右欄は、対応する遺伝子または最も近いホモログを与える。ホモロジーが非常に低い場合には、この遺伝子を未知であるとみなした。ホモロジーについてのカットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）は、ｔｂｌａｓｔｘにおいてｐ＜ｅ−２０であった。
【０１９１】
【表１】
【０１９２】
差次的発現は、低ストリンジェンシーのＲＴ−ＰＣＲを使用して確認した。両方のインプットＲＮＡ濃度での差次的発現が示されたハイブリダイゼーション事象の場合のみ、さらに特徴付けられた。ｍＲＮＡの多くが珍しく、そして豊富さが乏しいことが予想されたので、差次的発現の確認のために、ノザンブロッティング（これは、ＲＴ−ＰＣＲよりも感度が非常に低い）よりも特定の標的を用いるＲＴ−ＰＣＲを使用した。Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアムからのアレイを使用する利点の一つは、７０％を超えるクローンが、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託された、５’末端または３’末端からか、あるいは両方からのシングルパス配列読み取り（ｓｉｎｇｌｅ ｐａｓｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄ）を有することである。
【０１９３】
ある配列がデータベース中で利用可能であるクローンを、さらなる特徴付けのために選択した。差次的にレギュレートされるアレイ上の遺伝子を示す２２個のＥＳＴのうちの５個は配列決定されておらず、そして残りの１７個のＥＳＴのうちの２個は同一の遺伝子由来であった。残りの１５個の特有の配列決定された遺伝子を、オーバーラップするクローンからの複数の読み取りおよびより長い配列からより高い質の配列を引き出すために、データベース中の他の配列とともに整列させた。ＵｎｉＧｅｎｅデータベースクラスターは、同一の遺伝子由来と考えられるヒトおよびマウスＥＳＴを集めている（Ｓｃｈｕｌｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５：６９４〜６９８（１９９７））。このデータベースは、同一のｍＲＮＡの異なるクローンからの混成配列をアセンブリするプロセスを非常に助ける（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。次いで、これらの混成配列を、ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーを選択するために使用した。
【０１９４】
各遺伝子について、低ストリンジェンシーの条件下でのＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを生成するために使用されるプライマーに類似した、２つの特異的なプライマーを使用した。目的の産物に加えて、恣意的産物のパターン（これは非常に不変的であり、そしてＲＮＡの質および量、ならびに逆転写効率についての内部標準として振舞う）を生成した（Ｍａｔｈｉｅｕ−Ｄａｕｄｅら、前述、１９９８）。ＰＣＲサイクルの数は、開始テンプレートｍＲＮＡの豊富さにおける差異を補うために、産物の豊富さに従って１４〜２５サイクルの間で調整した。このことは、ＰＣＲの間の大量の産物の再ハイブリダイゼーションがそれらの増幅を阻害し、そして産物の豊富さにおける差異がＰＣＲサイクルの回数が増加するに従い減少するので、必須である（Ｍａｔｈｉｅｕ−Ｄａｕｄｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：２０８０〜２０８６（１９９６））。
【０１９５】
低ストリンジェンシーのＲＴ−ＰＣＲ実験により、図２ＡのＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントで同定し、かつｃＤＮＡアレイに対する差次的ハイブリダイゼーションを示した、２つの転写物の差次的発現を確認した（図３Ａ対３Ｂを比較のこと）。これらの差次的に発現された遺伝子の１つは、ｖａｖプロトオンコジーンファミリーの新規なファミリーメンバーに対応する（Ｋａｔｚａｖら、前出、１９８９；Ｋａｔｚａｖら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇ．６：８７〜９７（１９９５）；Ｂｕｓｔｅｌｏ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇ．７：６５〜８８（１９９６）；ＲｏｍｅｒｏおよびＦｉｓｃｈｅｒ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．８：５４５〜５５３（１９９６））。他の差次的に発現された遺伝子は、ヘパリン硫酸３−Ｏ−スルフォトランスフェラーゼ−１に対するホモロジーを有する（Ｓｈｗｏｒａｋら、前述、１９９７）。
【０１９６】
他の１３個の差次的に発現されたものもまた試験し、そして低ストリンジェンシーのＲＴ−ＰＣＲを使用して１１個を確認した。差次的に発現された遺伝子のいくつかを図４に示す。逆転写を２つのＲＮＡの濃度で行った（５００ｎｇ、左欄；２５０ｎｇ、右欄）。この反応物を水で４倍に希釈し、そして４分の１を異なるサイクル数での低ストリンジェンシーのＲＴ−ＰＣＲのために使用した。このＲＴ−ＰＣＲ産物をポリアクリルアミド−尿素ゲルで分離した。コントロールに対するバンドを示す（２２サイクル）；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｈ１１５２０に対するバンド（２２サイクル）；ＴＳＣ−２２に対するバンド（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｈ１１０７３およびＨ１１１６１に対応する）（１９サイクル）（Ｊａｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２２：８２１−８２６（１９９６）；Ｄｍｉｔｒｅｎｋｏら、Ｔｓｉｔｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３０：４１−４７（１９９６）；Ｏｈｔａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：４６０−４６６（１９９６））；およびＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｒ４８６３３に対するバンド（１９サイクル）。Ｈ１１５２０およびＴＳＣ−２２に対応する遺伝子は、ＥＧＦ処理で約８〜１０倍アップレギュレートされる。Ｒ４８６３３に対応する遺伝子は、ＥＧＦ処理で約３倍アップレギュレートされた。
【０１９７】
確認されなかった２個の差次的に発現される遺伝子のうち、１個は増幅不可能であることが証明された。他方の遺伝子は、産物を生じたが、ＲＴ−ＰＣＲにより分析すると差次的に調節されないようであった。
【０１９８】
ＲＡＰ−ＰＣＲ標的は、まれなあまり豊富ではないｍＲＮＡの検出で非常に有効であった。クローンのセットにハイブリダイズされた各々のフィンガープリントは、オポリ（Ａ）＋選択されたｍＲＮＡから誘導された標的によりハイブリダイズされたセットとはほとんど完全に異なる（図３を参照のこと）。さらに、多数の他のプライマー対、メンブレン、およびＲＮＡ供給源は、任意の２つのフィンガープリントによりハイブリダイズされたクローン間か、またはフィンガープリントと総ポリ（Ａ）＋−選択されたｃＤＮＡ標的との間で、一貫して、５％未満の重複を示した。差次的に発現されたｖａｖ−３ ｍＲＮＡ（これはｖａｖオンコジーンファミリーの新規のメンバーである）の検出を、ポリ（Ａ）＋−選択されたＲＮＡのノザンブロットを使用して試みた。１細胞あたり２、３コピーの等量まで系列希釈したベクターを検出し得るにもかかわらず、ｖａｖ−３ ｍＲＮＡはノザンブロットで検出不可能であったが、ＲＴ−ＰＣＲは発現を確認した。Ｇ３ＰＤＨコントロールを使用して、ノザンブロットに使用される条件がコントロール遺伝子を検出し得ることを確認した。それゆえ、ｖａｖ−３は、ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントにおいて顕著なバンドとして表されるあまり豊富ではないメッセージであるようである。
【０１９９】
ＥＳＴデータベース中でＲＡＰ−ＰＣＲ標的により検出されるｃＤＮＡのホモログの頻度を決定した（＞９８％同一性）。これを同一のメンブレン上の他のｃＤＮＡのランダムセットに対するホモログの頻度と比較した。ＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントが共通のｍＲＮＡに非常に偏っていたならば、部分的には、基準化されていないかまたは不完全に基準化されたｃＤＮＡライブラリーに由来するので、その多くはＥＳＴデータベース中に頻繁に生じる。しかし、ＲＡＰ−ＰＣＲにより検出されたｃＤＮＡは、無作為に選択されたｃＤＮＡについての頻度に匹敵するＥＳＴデータベースにおける頻度を有した（これは、クローンがデータベース中で固有であった場合を含む）。これらの結果は、ＲＡＰ−ＰＣＲにより生じた、恣意的にサンプリングした標的によるサンプリングは、少なくとも、アレイを構築するために使用した部分的に基準化したライブラリーの無作為サンプリングと同程度に良好であり、そして総ｍＲＮＡ標的のような標的について得られたものとは非常に異なることを示す。
【０２００】
これらの結果は、ＲＴ−ＰＣＲおよび恣意プライマーを使用して生成された恣意的にサンプリングされた標的が、ＥＧＦに応答して差次的に発現される遺伝子を検出し得ることを実証する。
【０２０１】
（実施例ＩＩＩ）
（ディファレンシャルディスプレイにより生成される、恣意的にサンプリングされた標的は、ＥＧＦに応答して差次的に発現される遺伝子を検出する）
本実施例は、恣意的にサンプリングされた標的を生成するためのディファレンシャルディスプレイの使用およびＥＧＦに応答して差次的に発現される遺伝子の検出を示す。
【０２０２】
ＲＮＡを、実施例ＩＩに記載されるように、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴから調製した。簡単にいうと、細胞をコンフルエンスまで増殖させ、そしてコンフルエンスで２日間維持した。培地を実験の１日前に交換した。ＥＧＦ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を２０ｎｇ／ｍｌで添加した。４時間後に処置細胞および非処置細胞を収集し、そして総ＲＮＡを、ＲＮＥＡＳＹ総ＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、調製した。残留するゲノムＤＮＡを取り除くために、抽出した総ＲＮＡをＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で処理し、そしてＲＮＥＡＳＹキットを使用して再度洗浄した。この精製ＲＮＡを、水で４００ｎｇ／ｕｌに調整し、そしてアガロースゲル電気泳動により質をチェックした。
【０２０３】
標準ディファレンシャルディスプレイのために、各々アンカーオリゴ（ｄＴ）プライマー（０．２μＭ）と共に、各ＲＮＡ鋳型を２０μｌの反応系あたり４つの異なる濃度（８００、４００、２００および１００ｎｇ）を使用することを除いて、ＲＮＡＩＭＡＧＥキット（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ ＴＮ）、ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−ＡＢＩ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）およびα−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰを補充した材料を使用して、製造業者の説明書に従って、ディファレンシャルディスプレイを行った。このＰＣＲ反応系は、２μＭ ｄＮＴＰ（総量４μＭについては、ｃＤＮＡ混合物からの繰越を含む）、０．２μＭの各プライマー、および１０分の１の新規に合成したｃＤＮＡ（これは８０、４０、２０および１０ｎｇのＲＮＡに対応する）を含有した。アンカーオリゴ（ｄＴ）プライマーを、４つの異なる恣意プライマーを用いて可能な全ての組み合わせで使用した。用いたアンカーオリゴ（ｄＴ）プライマーは、Ｈ−Ｔ１１Ｇ（ＨＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ；配列番号 ）；Ｈ−Ｔ１１Ａ（ＨＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡ；配列番号 ）；およびＨ−Ｔ１１Ｃ（ＨＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ；配列番号 ）であった。ここで、ＨはＡＡＧＣであり、これは、プライマーが特定の場所にとどまることを確実にするためのクランプとして使用される恣意的配列であり、引き続いてのＰＣＲ工程で高いＴｍを有する。使用した恣意プライマーは、Ｈ−ＡＰ１（ＡＡＧＣＴＴＧＡＴＴＧＣＣ；配列番号 ）；Ｈ−ＡＰ２（ＡＡＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＴ；配列番号 ）；Ｈ−ＡＰ３（ＡＡＧＣＴＴＴＧＧＴＣＡＧ；配列番号 ）；およびＨ−ＡＰ４（ＡＡＧＣＴＴＣＴＣＡＡＣＧ；配列番号 ）であった。
【０２０４】
改変型ディファレンシャルディスプレイについては、反応系１０μｌあたり４つの異なる濃度の各ＲＮＡ鋳型（１０００、５００、２５０および１２５ｎｇ）を使用して逆転写を行った。この反応混合物は、１．５μＭオリゴ（ｄＴ）アンカープライマーＡＴ１５Ａ、ＧＴ１５ＧおよびＴ１３Ｖ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＤＴＴ、各々０．２ｍＭのｄＮＴＰ、８Ｕ ＲＮａｓｅインヒビター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および２０Ｕ ＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含んだ。アンカープライマーはＡＴ１５Ａ（ＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡ；配列番号 ）；ＧＴ１５Ｇ（ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ；配列番号 ）；およびＴ１３Ｖ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ；配列番号 ；ここで、ＶはＡ、ＧまたはＣである）であった。この反応混合物を、２５℃から３７℃へ５分間かけて変化させ（ｒａｍｐ）、３７℃で１時間保持し、そして最終的には酵素を９４℃で５分間不活化した。新規に合成したｃＤＮＡを水で４倍に希釈した。
【０２０５】
１０μｌの希釈したｃＤＮＡ（これは２５０、１２５、６２．５および３１．２５ｎｇのＲＮＡに対応する）に、１０μｌの反応混合物を添加して２０μｌの最終反応容量（これは、２μＭアンカーオリゴ（ｄＴ）プライマー、０．４μＭ恣意プライマー、ＫＡ２（ＧＧＴＧＣＣＴＴＴＧＧ；配列番号 ）またはＯＰＮ２８（ＧＣＡＣＣＡＧＧＧＧ；配列番号 ）のいずれか、２．５単位ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼＳｔｏｆｆｅｌフラグメント（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−ＡＢＩ）、２μＣｉ α−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰ、ｄＮＴＰ各１７５μＭ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌおよび３．１２５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する）を得た後、ＰＣＲを行った。これらの濃度は、逆転写反応からの持ち越し分は含まない。反応を、９４℃で４０秒間、４０℃で１分４０秒、そして７２℃で４０秒の３５サイクルでサーマルサイクルを行った。
【０２０６】
４つの異なる濃度の同一のＲＮＡ鋳型から生じるＰＣＲ産物のアリコートを、実施例ＩＩに記載されるように、５％ポリアクリルアミドゲル上に並べて示し、そしてオートラジオグラフィーにより可視化した。
【０２０７】
アレイをプローブするための標的として使用するためにディファレンシャルディスプレイ産物の標識のために、ディファレンシャルディスプレイ産物のランダムプライム化標識を、実施例ＩＩに記載されるように行った。ディファレンシャルディスプレイＰＣＲ反応物（１４μｌ）を、ＱＵＩＡＱＵＩＣＫ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫＩＴ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、そしてＤＮＡを５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）中に回収した。ランダムプライム合成を、標準的プロトコールを使用して行った。簡単に言うと、５μｌの回収したディファレンシャルディスプレイ産物を、３μｇのランダムへキサマーと合わせ、３分間煮沸し、そして氷上に置いた。ヘキサマー／ＤＮＡ混合物を、反応混合物と合わせて、０．０５ｍＭの３種のｄＮＴＰ（ｄＣＴＰを除く）、５０μＣｉの３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ α−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰ、１×Ｋｌｅｎｏｗフラグメント緩衝液、および４ＵのＫｌｅｎｏｗフラグメント（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含有する２５μｌの反応系を得た。この反応を室温で４時間行い、１μｌの１．２５ｍＭ ｄＣＴＰを添加することにより室温で１５分間チェイスし、そしてさらに１５分間３７℃でインキュベートした。組み込まれていないヌクレオチドおよびヘキサマーをＱｉａｇｅｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔを用いて取り除き、そして精製産物を１４０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）の２個のアリコートを使用して溶出した。
【０２０８】
アレイへのハイブリダイゼーションを、本質には実施例ＩおよびＩＩに記載されるように行った。簡単にいうと、ｃＤＮＡメンブレン（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、残余の細菌性細片を減少するための水平方向振盪平底容器中で、２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含有する予備洗浄溶液を３回交換して予備洗浄した。１回目の洗浄は、５００ｍｌの予備洗浄緩衝液を室温で１０分間使用した。２回目および３回目の洗浄は、各々、５５℃まで予め加温した１リットルの予備洗浄溶液中で、１０分間行った。
【０２０９】
このメンブレンを大型のローラービンに移し、そして予め４２℃まで加温した６０ｍｌのプレハイブリダイゼーション溶液（これは６×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌフラグメント化変性サケ精子ＤＮＡおよび５０％ホルムアルデヒドを含有する）中で、１〜２時間の間、４２℃でプレハイブリダイズさせた。
【０２１０】
プレハイブリダイズ溶液を取り除き、そして予め４２℃まで加温した１０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（これは６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌフラグメント化変性サケ精子ＤＮＡおよび５０％ホルムアルデヒドを含有する）をこのボトルに添加した。ＡｌｕおよびＬｉｎｅエレメントのような反復（これはヒトゲノムＤＮＡに共通である）に起因するバックグラウンドハイブリダイゼーションを減少するために、煮沸水浴で１０分間変性させ、そしてすぐに１０μｇ／ｍｌの終濃度でハイブリダイゼーション溶液を添加した。１０ｎｇ／ｍｌポリ（ｄＡ）の１アリコートを添加して、放射標識標的中のオリゴ（ｄＴ）ストレッチをブロックした。同時に、標識した標的を煮沸水浴中で４分間変性し、そしてすぐにハイブリダイゼーション溶液を添加した。このハイブリダイゼーションは、４２℃で１８〜２０時間行った。
【０２１１】
ハイブリダイゼーションに続いて、このハイブリダイゼーション溶液を注ぎだして、そしてメンブレンを６回の洗浄溶液の交換で２〜３時間にわたって徹底的に洗浄した（これはローラーボトルから水平方向に振盪する平底容器へメンブレンを移し、そしてローラーボトルに戻す工程を包含する）。この洗浄のストリンジェンシーは、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ（室温）から、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ（６４℃）へと段階的に増加させた。この個々の洗浄は、全てのメンブレンについて、正確に同一の示された温度に維持した。最後の高ストリンジェンシーな洗浄は少なくとも４０分であり、全てのボトルにおいて正確に平衡化した温度を確保した。この最終の洗浄溶液を取り除き、そしてメンブレンを２×ＳＳＣで室温で簡単にリンスし、３ＭＭの紙でブロッティングし、湿気を帯びている間にＳＡＲＡＮラップで覆い、そしてＫｏｄａｋ Ｂｉｏｍａｘフィルムに対して配置した（Ｅａｓｔｍａｎ−Ｋｏｄａｋ；Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）。
【０２１２】
低ストリンジェンシーのＲＴ−ＰＣＲを使用して差次的発現を確認した。確認の最初のレベルは１サンプルあたり２つのＲＮＡ濃度の使用であった。両方のＲＮＡサンプルにおいて両方のＲＮＡ濃度で差次的発現を示すハイブリダイゼーション事象のみをさらに特徴付けた。
【０２１３】
Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（アレイの商業的供給元）から入手可能したヌクレオチド、または配列決定したヌクレオチド配列を用いて、１８〜２５塩基長のＰＣＲプライマーを誘導した（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ ６．０（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ）を使用）。一般に、選択した、１００〜２５０塩基対のＰＣＲ産物を生成するプライマーは、少なくとも６０℃の融解温度を有し、そして好ましくは、ファミリーメンバーをサンプリングする可能性を減少させるように、ｍＲＮＡのポリアデニル化部位に近接して配置された。
【０２１４】
逆転写を、サンプルあたり２つのＲＮＡ濃度およびオリゴ（ｄＴ１５）プライマー（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ；配列番号 ；Ｇｅｎｏｓｙｓ）を使用して総ＲＮＡに対して行った。反応物は、１ｌあたり１００ｎｇおよび５０ｎｇの総ＲＮＡ、０．５μＭオリゴ（ｄＴ１５）プライマー（配列番号 ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．８Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅインヒビター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および２Ｕ／μｌのＭｕＬＶ−逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含んだ。反応物を、２５℃から３７℃まで急激に上げ、そして３７℃で１時間維持した。反応物を９４℃で５分間加熱することにより、酵素を不活化し、そして新たに合成したｃＤＮＡを水で４倍に希釈した。
【０２１５】
希釈したｃＤＮＡ（１０μｌ）を、２×ＰＣＲ混合物（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、２０ｍＭ ＫＣｌ、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３５ｍＭの各ｄＮＴＰ、３μＭの各特異的プライマー、２μＣｉ α−（３２Ｐ）−ｄＣＴＰ（ＩＣＮ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）および２ＵのＡＭＰＬＩＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼＳｔｏｆｆｅｌフラグメント（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ））と２０μｌの最終反応容量に混合した。低ストリンジェンシーサーマルプロファイルは、以下を使用した：９４℃で４０秒、４０℃で４０秒、および７２℃で１分、別個のチューブで１７サイクルおよび１９サイクル。この反応物を、異なるサイクル数で２セットのチューブで行った。なぜなら、転写物の量、プライマー対の性能およびＰＣＲ産物の増幅能力は変化し得るからである。ＰＣＲ産物を上記と同じ条件下で５％ポリアクリルアミドおよび４３％尿素ゲル上で泳動した。このゲルを乾燥させて、１８〜７２時間ホスホルイメージャースクリーン上に置き、そしてＳＴＯＲＭホスホルイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）で読みとった。フィンガープリントにおける他の恣意的産物の間の不変性を内部コントロールとして使用して、相対量の信頼性を示した。差次的に調節した遺伝子あたり４セットの反応物からの遺伝子特異的産物を、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して定量した。
【０２１６】
プライマー対を使用して、差次的発現を確認した。
【０２１７】
【表３】
【０２１８】
図５に示されるように、フィンガープリントを、反応の特性を決定するために、変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した。差次的ディスプレイ反応物をＲＮＡＩＭＡＧＥキットプロトコル（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、４つの異なる開始濃度（８００、４００、２００および１００ｎｇの総ＲＮＡ）を使用したことを除いて、製造業者の示唆に従って行った。次いで、この材料の１／１０をＰＣＲの使用のために使用した。アンカーしたオリゴ（ｄＴ）プライマーＨ−Ｔ１１Ｃ（配列番号 ）を、示したように、異なる２つの恣意プライマー（Ｈ−ＡＰ３（配列番号 ）およびＨ−ＡＰ４（配列番号 ））とともに使用した。恣意プライマー、Ｈ−ＡＰ４（配列番号 ）は、２つの異なるアンカーオリゴ（ｄＴ）プライマー、Ｈ−Ｔ１１Ｃ（配列番号 ）およびＨ−Ｔ１１Ａ（配列番号 ）とともに使用した。恣意プライマーまたはアンカーオリゴ（ｄＴ）プライマーのいずれかを共有する反応物は、可視可能なバンドの可視可能な重複はほとんど見られなかった。
【０２１９】
図５Ｂは、異なるセットのプライマーを使用する差次的ディスプレイを示す。差次的ディスプレイは、示したように、３つの異なるアンカーオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｔ１３Ｖ（配列番号 ）、ＡＴ１５Ａ（配列番号 ）、およびＧＴ１５Ｇ（配列番号 ））とともに恣意プライマーＫＡ２（配列番号 ）を使用して行った。差次的ディスプレイプロトコルを、生成された産物のより大量かつ高度な複雑性を生じるように調整した。ＲＮＡの開始濃度は、１０００、５００、２５０および１２５ｎｇであった。次いで、この材料の１／４をＰＣＲに使用した。図５Ａで見られるように、異なるオリゴ（ｄＴ）アンカープライマーを使用すると、ほぼ完全に、提示されるバンドのパターンが変化する。
【０２２０】
フィンガープリントは、約３０〜５０の明らかに可視可能な産物を生じた（図５Ａを参照のこと）。フィンガープリントは、一般に、これらの実験に使用した１００〜８００ｎｇの範囲の総ｍＲＮＡにおいて再現可能であり、ＲＮＡ濃度依存的な産物はほとんどなかった。オリゴ（ｄＴ）アンカープライマーまたは恣意プライマー（図５Ａ）のいずれかと共有される再現可能な、大部分のフィンガープリントのうちの３つを、３つの非標識ｄＮＴＰおよびα−（３２Ｐ）ｄＣＴＰの存在下でランダムプライミングすることによって放射性標識し、そして各々を使用して、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．ＥコンソーシアムからのＥＳＴを有する、１８，０００の二重スポットしたＥ．ｃｏｌｉコロニーの同一のアレイをプローブした。このアレイを、上記のように、ハイブリダイズし、そして洗浄した。
【０２２１】
このキットプロトコルは、実施例ＩＩに記載のＲＡＰ−ＰＣＲプロトコルにおいて１μＭのプライマーおよび２００μＭ ｄＮＴＰを使用したものと比較して、０．２μＭの恣意プライマーおよび４μＭ ｄＮＴＰを使用した。フィンガープリント反応物は、おそらく、成分が制限されたために、２０μｌ中４０ｎｇ未満の産物しか含まなかった。これは、実施例２で記載された方法において使用されたＤＮＡより約５倍少なかった。この理由のために、Ｘ線フィルムへの十分な曝露を得るためには、増感スクリーンを用いて約１０日間かかった。十分な曝露後には、約５００の産物が各標的を用いて容易に識別可能であった。確実に観察可能な遺伝子の数は、ホスホルイメージャースクリーンを使用する場合、通常、少なくとも２倍以上増加する。このことは、Ｘ線フィルムと比較して、ホスホルイメージングの感度がより高いことを示す。さらに、別個に標識したフィンガープリントを同じ標的にプールすることによって、なおさらにスループットを増大させ得る。
【０２２２】
アレイに対する標的のハイブリダイゼーションの曝露時間を減少させるために、実験をＲＡＰ−ＰＣＲプロトコルを使用する実施例ＩＩに記載の、高濃度のプライマーおよびｄＮＴＰで行った（図５Ｂ）。これらの実験は、予測された産物量の増加および対応する、アレイに対する曝露時間の減少を生じた。
【０２２３】
オリゴ（ｄＴ）プライマーの選択性を、異なるアンカー塩基を使用して決定した。図６に示されるように、ディファレンシャルディスプレイ産物は、ｃＤＮＡアレイにハイブリダイズした。図５Ａで記載したように、プライマーＧＴ１５Ｇ（配列番号 ）およびＫＡ２（配列番号 ）を用いて、未処理ＨａＣａＴ細胞（図６Ａ）およびＥＧＦ処理ＨａＣａＴ細胞（図６Ｂ）から生成したディファレンシャルディスプレイ産物をランダムプライミングによって標識し、そしてｃＤＮＡアレイにハイブリダイズさせた。メンブレンの５％未満を示す部分は、矢印で示した差次的に調節された遺伝子とともに示される。図６Ｃは、プライマーＡＴ１５Ａ（配列番号 ）およびＫＡ２（配列番号 ）を用いて未処理ＨａＣａＴ細胞から生成したディファレンシャルディスプレイ産物のハイブリダイゼーションを示す。図６Ａと６Ｃとを比較すると、ハイブリダイゼーションシグナルの有意な重複が存在し、これは、ポリアクリルアミドディスプレイからは明らかではなかった（図５Ｂ、レーンＡＴ１５Ａ／ＫＡ２とＧＴ１５Ｇ／ＫＡ２とを比較のこと）。
【０２２４】
恣意プライマーが同じアンカープライマーを維持しながら変化させた場合、ハイブリダイズしたクローンのパターンは、ほぼ全体的に変化し、代表的には、任意の２つのフィンガープリントの間で５％の重複未満であった。対照的に、同じ恣意プライマーおよび異なるアンカープライマーを含む標的は、それらがハイブリダイズしたものに対して約３０％のクローンを共有した。図６Ａおよび６Ｃは、少部分のアレイからのこのような共有される産物の例を示す。
【０２２５】
同様の観察が、広範な種々の条件下で生成されたフィンガープリントを使用してなされた。これらの条件としては、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒキットのプロトコルおよびプライマー、改変プロトコル、およびＧｅｎＨｕｎｔｅｒキット中のプライマーとは独立したプライマーを使用するプロトコルが挙げられる。この重複が反復に起因するという可能性を、同じメンブレンに対するゲノム標的および総ｍＲＮＡ標的の使用によって排除した。
【０２２６】
異なるアンカープライマーを有するが、同じ恣意プライマーを共有する、標的の間の重複は、変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した場合、フィンガープリント産物において顕著な類似性を全く反映しなかった。例えば、図６Ａおよび６Ｃで使用される標的を図５Ｂに示す。この標的は、共通して３０％の産物を有するにも拘わらず、容易に識別される類似性を示さない。多くの共有された産物は、アレイに対して強くハイブリダイズするクローンの中にある。従って、ゲル上で可視可能な産物のいくつかは、一方の末端で恣意プライマーを共有し得るが、ＰＣＲの間にこの産物は、異なるアンカープライマーにより複数の異なる位置で反対の方向に優先的にプライムされる。このことは、この観察（同じ恣意プライマーを有するが、異なるアンカープライマーを有する標的はそれらがハイブリダイズするものに対してクローンの３０％まで重複する）と適合性でありながらポリアクリルアミドディスプレイにおいて類似性をほとんど有さないか、または全く有さないフィンガープリントを生じる。
【０２２７】
共有された産物は、かなり広い範囲の条件下で恣意プライマーを共有する、アンカーされたフィンガープリントについての一般的現象である。フィンガープリントの中の重複は、同じ恣意プライマーを用いないことによって、異なるアンカープライマーを用いて避けられ得る。
【０２２８】
総ゲノムＤＮＡにより生成されたパターンとハイブリダイズするクローンのパターンとの比較は、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒフィンガープリントにより生成された標的にハイブリダイズするクローンが、わずか数％のｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）において生じるＡｌｕ反復エレメントを一般には含まなかったことを示した。標的によってハイブリダイズされたクローンは、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの逆転写物に由来する総ｃＤＮＡ標的によってハイブリダイズされたクローンと有意に重複しなかった。このことは、サンプリングされた遺伝子が、最も豊富なＲＮＡに重度に偏っていなかったことを示す。これらの結果は、フィンガープリントについて恣意プライマーのみを使用して得られた結果と一致し（実施例ＩＩを参照のこと）、そしてアンカーオリゴ（ｄＴ）プライミングと組み合わせた恣意プライマーを使用してｃＤＮＡアレイにおけるまれな遺伝子をモニターし得ることを示す。これらの結果はまた、ＲＡＰ−ＰＣＲおよびディファレンシャルディスプレイが豊富な転写物に重度に偏っていないことを確認する。
【０２２９】
未処理ＨａＣａＴ細胞とＥＧＦ処理ＨａＣａＴ細胞との間の差次的遺伝子発現について調査した２０００を超えるクローンの中に、１つのＲＮＡ濃度で差次的発現を明らかに反映するようである、２９の異なるクローンが存在した。ノイズ比および差次的発現比に対して最も高いシグナルを有する１２クローンを選択し、そして特異的プライマーをＲＴ−ＰＣＲのために設計した。これらの差次的に発現された遺伝子のうちの１つの例を、図６Ａと６Ｂとを対比して矢印で示す。
【０２３０】
少なくとも１．５倍の差次的発現を、７つの遺伝子について確認した。これを図７に示す。逆転写を２倍異なるＲＮＡ濃度で行った。反応物を水で４倍に希釈し、そして低ストリンジェンシーＰＣＲを異なるサイクル数で行った。各ＰＣＲ反応についての投入ＲＮＡ／ｃＤＮＡの量は１２５ｎｇ（左列）および２５０ｎｇ（右列）であった。図７に示す反応を１０サイクルで行い、そしてポリアクリルアミド−尿素ゲル上で分離した。コントロール（非調節）および少なくとも１．６倍だけ異なる遺伝子についての産物を示す。示された、調節された遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ７２７１４、Ｈ１４５２９、Ｈ２７３８９、Ｈ０５５４５，Ｈ２７９６９、Ｒ７３２４７、およびＨ２１７７７に対応する。
【０２３１】
図７に示した遺伝子の調節を、表２に要約する。ＥＧＦでの４時間の処理によって調節された、同定された遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号に対応する）および未処理細胞と比較した発現における増加の倍数を示す。
【０２３２】
【表２】
【０２３３】
５つの他の遺伝子は、ＲＴ−ＰＣＲが使用されるときに調節されることは確認されなかった。擬陽性の数は、実験の間で変化し得、そしてフィンガープリントの質および市販されるメンブレンの質に依存する。擬陽性の数は、実施例ＩＩに記載されるように、ＲＴ−ＰＣＲで確認する前に、アレイに対して２つのＲＮＡ濃度を使用することにより制限され得る。これらの実験は、単一の濃度のみを含んだ。なぜなら、主な目的は、オリゴ（ｄＴ）−Ｘアンカープライミング方法により作製された標的の中での適用範囲および重複の有効性を決定することであったからである。それにも拘わらず、１つの濃度で観察された、差次的にハイブリダイズするクローンの半分を超えるものが、差次的に発現された遺伝子に対応する。２つのアレイハイブリダイゼーションが、各処理について２つの異なる投入テンプレート濃度で行われた場合、エラー割合は、１０％より十分低い。
【０２３４】
これらの結果は、ディファレンシャルディスプレイおよび恣意プライマーを使用して生成された、恣意的にサンプリングされた標的が、ＥＧＦに応答して差次的に発現された遺伝子を検出し得ることを実証する。
【０２３５】
本出願全体を通して、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が関連する技術状態をさらに十分に記載するために、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【０２３６】
本発明は、上記の実施例を参照して記載されているが、種々の改変が本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、請求の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、クローンアレイへの差次的ハイブリダイゼーションを示す。各画像は、約４０００の、二重スポット（ｄｏｕｂｌｅ ｓｐｏｔ）し、各々が異なるＥＳＴクローンを有するＥ．ｃｏｌｉコロニーに及ぶオートラジオグラムである。パネルＡは、コンフルエントなヒトケラチノサイト由来の１μｇのポリＡ＋ ＲＮＡ（逆転写の間に放射性標識されている）から作製した総標的の結合を示す。パネルＢおよびＣは、未処理（パネルＢ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）処理（パネルＣ）のコンフルエントなヒトケラチノサイトのオリゴ（ｄＴ）プライムされたｃＤＮＡ由来のｃＤＮＡに対して行った恣意プライマー対でのＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを示す。１つの差次的に発現されたｃＤＮＡに由来する放射性標識された２つのコロニーを矢印で示す。パネルＤは、コンフルエントなヒトケラチノサイト由来のＲＮＡに対して行った、恣意プライマーの異なる対でのＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを示す。
【図２】
図２は、ポリアクリルアミド−尿素ゲル上で分離したＲＡＰ−ＰＣＲフィンガープリントを示す。逆転写を、レーン１、２、３、および４において、それぞれ２５０、１２５、６２．５および３１．２５ｎｇのＲＮＡのオリゴｄＴプライマーを用いて行った。ＲＮＡは、示したように、未処理ＨａＣａＴ細胞、ＴＧＦ−βおよびＥＧＦ処理ＨａＣａＴ細胞由来であった。ＲＡＰ−ＰＣＲは、２セットのプライマー、プライマーＧＰ１４およびＧＰ１６（パネルＡ）、またはＮｕｃ１＋およびＯＰＮ２４（パネルＢ）で行った。分子量マーカーを各パネルの左に示し、そして２つの差次的に増幅されたＲＡＰ−ＰＣＲ産物のサイズを矢印で示す（３１７および２９１）。
【図３】
図３は、ＲＡＰ−ＰＣＲによって生成された標的の、アレイに対するハイブリダイゼーションを示す。放射性標識したＤＮＡとハイブリダイズした、２連の同じフィルター（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の下半分のオートラジオグラムを示す。パネルＡおよびＢは、同じプライマーを使用して生成され、そして未処理ＨａＣａＴ細胞（パネルＡ）およびＥＧＦ処理ＨａＣａＴ細胞（パネルＢ）に由来する２つのＲＡＰ−ＰＣＲ反応物のハイブリダイゼーションを示す。差次的なハイブリダイゼーションシグナルを示す、３つの二重スポットしたクローンを、各アレイに対して印付けする。このクローンのＧｅｎＢａｎｋ登録番号および対応する遺伝子は、Ｈ１００４５およびＨ１００９８（ｖａｖ−３およびＡＦ０６７８１７に対応する）（四角）；Ｈ２８７３５（遺伝子は未知）（Ｓｈｅｐａｒａｎ スルフェート３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ−１、ＡＦ０１９３８６に類似する）（丸）；Ｒ４８６３３（遺伝子は未知）（菱形）である。パネルＣは、パネルＡにおけるＲＮＡと同じＲＮＡを使用して生成されたＲＡＰ−ＰＣＲ標的と、しかし、異なるプライマー対とハイブリダイズしたアレイを示す。パネルＤは、１μｇのポリ（Ａ）＋選択ｍＲＮＡの逆転写によって生成されたｃＤＮＡ標的とハイブリダイズしたアレイを示す。パネルＥは、ランダムプライミングを使用して標識されたヒトゲノムＤＮＡとハイブリダイズしたアレイを示す。
【図４】
図４は、ポリアクリルアミド−尿素ゲル上でのＲＴ−ＰＣＲ産物の分離および低ストリンジェンシーＲＴ−ＰＣＲを使用する、ＥＧＦに対する応答における差次的調節の確認を示す。逆転写を、２つのＲＮＡ濃度（５００ｎｇ（左列）；２５０ｎｇ（右列））で、異なるサイクル数で行った。コントロール（２２サイクル）についてのバンド；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１１５２０（２２サイクル）についてのバンド；ＴＳＣ−２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１１０７３およびＨ１１１６１に対応）（１９サイクル）についてのバンド；およびＲ４８６３３（１９サイクル）についてのバンドを示す。
【図５】
図５は、未処理ＨａＣａＴ細胞およびＥＧＦ処理ＨａＣａＴ細胞のディファレンシャルディスプレイを示す。パネルＡは、４つの異なる開始濃度の総ＲＮＡ（１、２、３および４と表し、そしてそれぞれ８００、４００、２００および１００ｎｇに対応する）で行ったディファレンシャルディスプレイ反応物を示す。これは、次いで、ＰＣＲのために使用された。アンカーオリゴ（ｄＴ）プライマー、Ｈ−Ｔ１１ＣまたはＨ−Ｔ１１Ａを、２つの異なる恣意プライマー、Ｈ−ＡＰ３またはＨ−ＡＰ４のうち１つと組み合わせて使用した。これは、レーンの上に示される。パネルＢは、４つの異なる開始濃度のＲＮＡ（１、２、３および４と示され、そしてそれぞれ、１０００、５００、２５０および１２５ｎｇに対応する）を使用して、３つの異なるアンカーオリゴ（ｄＴ）プライマー、Ｔ１３Ｖ、ＡＴ１５ＡおよびＧＴ１５Ｇとともに恣意プライマーＫＡ２を使用するディファレンシャルディスプレイを示す。これは、次いで、ＰＣＲに使用された。
【図６】
図６は、ディファレンシャルディスプレイ反応物の、ｃＤＮＡアレイに対するハイブリダイゼーションを示す。未処理ＨａＣａＴ細胞（パネルＡ）およびＥＧＦ処理ＨａＣａＴ細胞（パネルＢ）に由来する、プライマーＧＴ１５ＧおよびＫＡ２で生成したディファレンシャルディスプレイ産物を、ランダムプライミングによって標識し、そしてｃＤＮＡアレイにハイブリダイズさせた。膜の５％未満を示す部分は、矢印で示される差次的に調節された遺伝子とともに示される。パネルＣは、未処理ＨａＣａＴ細胞に由来する、プライマーＡＴ１５ＡおよびＫＡ２で生成したディファレンシャルディスプレイ産物のハイブリダイゼーションを示す。
【図７】
図７は、低ストリンジェンシーＲＴ−ＰＣＲを使用するＥＧＦによる遺伝子の差次的調節の確認を示す。逆転写を、２倍異なるＲＮＡ濃度で行い、そして低ストリンジェンシーＰＣＲを異なるサイクル数で行った。最初の第１鎖ｃＤＮＡ合成について使用され、そして各ＲＡＰ−ＰＣＲ反応において使用された投入ＲＮＡの量は１２５ｎｇ（左列）、および２５０ｎｇ（右列）であった。１９サイクル反応物由来のＲＴ−ＰＣＲ産物を、ポリアクリルアミド−尿素ゲル上で分離した。コントロール産物（非調節）、およびＥＧＦに応答して１．６倍以上の調節を示す遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ７２７１４、Ｈ１４５２９、Ｈ２７３８９、Ｈ０５５４５、Ｈ２７９６９、Ｒ７３２４７、およびＨ２１７７７に対応する）についての産物を示す。
【図８】
図８は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１１５２０（配列番号１）のヌクレオチド配列を示す。
【図９】
図９は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１１１６１（配列番号２）のヌクレオチド配列を示す。
【図１０】
図１０は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１１０７３（配列番号３）のヌクレオチド配列を示す。
【図１１】
図１１は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３５０４８（配列番号４）のヌクレオチド配列を示す。
【図１２】
図１２は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ４８６３３（配列番号５）のヌクレオチド配列を示す。
【図１３】
図１３は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２８７３５（配列番号６）のヌクレオチド配列を示す。
【図１４】
図１４は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０１９３８６（配列番号７）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５】
図１５は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２５５１３（配列番号８）のヌクレオチド配列を示す。
【図１６】
図１６は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２５５１４（配列番号９）のヌクレオチド配列を示す。
【図１７】
図１７は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１３９１８（配列番号１０）のヌクレオチド配列を示す。
【図１８】
図１８は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１２９９９（配列番号１１）のヌクレオチド配列を示す。
【図１９】
図１９は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ０５６３９（配列番号１２）のヌクレオチド配列を示す。
【図２０】
図２０は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ４９２０７（配列番号１３）のヌクレオチド配列を示す。
【図２１】
図２１は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１５１８４（配列番号１４）のヌクレオチド配列を示す。
【図２２】
図２２は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１５１２４（配列番号１５）のヌクレオチド配列を示す。
【図２３】
図２３は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７９７８１（配列番号１６）のヌクレオチド配列を示す。
【図２４】
図２４は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２５１９５（配列番号１７）のヌクレオチド配列を示す。
【図２５】
図２５は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２４３７７（配列番号１８）のヌクレオチド配列を示す。
【図２６】
図２６は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３１６２７（配列番号１９）のヌクレオチド配列を示す。
【図２７】
図２７は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２３９７２（配列番号２０）のヌクレオチド配列を示す。
【図２８】
図２８は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２７３５０（配列番号２１）のヌクレオチド配列を示す。
【図２９】
図２９は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０００７１２（配列番号２２）のヌクレオチド配列を示す。
【図３０】
図３０は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ７５９１６（配列番号２３）のヌクレオチド配列を示す。
【図３１】
図３１は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ８５９９２（配列番号２４）のヌクレオチド配列を示す。
【図３２】
図３２は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ７３０２１（配列番号２５）のヌクレオチド配列を示す。
【図３３】
図３３は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ７３０２２（配列番号２６）のヌクレオチド配列を示す。
【図３４】
図３４は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ６６８９４（配列番号２７）のヌクレオチド配列を示す。
【図３５】
図３５は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１００９８（配列番号２８）のヌクレオチド配列を示す。
【図３６】
図３６は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１００４５（配列番号２９）のヌクレオチド配列を示す。
【図３７】
図３７は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０６７８１７（配列番号３０）のヌクレオチド配列を示す。
【図３８】
図３８は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ７２７１４（配列番号３１）のヌクレオチド配列を示す。
【図３９】
図３９は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５２５４１（配列番号３２）のヌクレオチド配列を示す。
【図４０】
図４０は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ１４５２９（配列番号３３）のヌクレオチド配列を示す。
【図４１】
図４１は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１０２７７（配列番号３４）のヌクレオチド配列を示す。
【図４２】
図４２は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２７３８９（配列番号３５）のヌクレオチド配列を示す。
【図４３】
図４３は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８９０９２（配列番号３６）のヌクレオチド配列を示す。
【図４４】
図４４は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８９６７８（配列番号３７）のヌクレオチド配列を示す。
【図４５】
図４５は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ０５５４５（配列番号３８）のヌクレオチド配列を示す。
【図４６】
図４６は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０３８０４（配列番号３９）のヌクレオチド配列を示す。
【図４７】
図４７は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２７９６９（配列番号４０）のヌクレオチド配列を示す。
【図４８】
図４８は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ７３２４７（配列番号４１）のヌクレオチド配列を示す。
【図４９】
図４９は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ５１３３６（配列番号４２）のヌクレオチド配列を示す。
【図５０】
図５０は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２１７７７（配列番号４３）のヌクレオチド配列を示す。
【図５１】
図５１は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋ００５５８（配列番号４４）のヌクレオチド配列を示す。
【図５２】
図５２は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ３１７６５（配列番号４５）のヌクレオチド配列を示す。
Claims (95)
- 標的における２つ以上の核酸分子のレベルを測定する方法であって、
（ａ）プローブと、２つ以上の核酸分子を含む標的とを接触させる工程であって、該核酸分子は、恣意的にサンプリングされ、そして該恣意的にサンプリングされた核酸分子は核酸分子の集団において核酸分子のサブセットを含む、工程；および
（ｂ）該標的の該プローブに対する特異的結合の量を検出する工程、
を包含する、方法。 - 前記標的が、前記集団の１つ以上のあまり豊富ではない核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記あまり豊富ではない核酸分子が、前記集団において最も豊富な核酸分子の１０％未満の量である、請求項１に記載の方法。
- 前記あまり豊富ではない核酸分子が、前記集団において最も豊富な核酸分子の１％未満の量である、請求項１に記載の方法。
- 前記あまり豊富ではない核酸分子が、前記集団において最も豊富な核酸分子の０．１％未満の量である、請求項１に記載の方法。
- 前記あまり豊富ではない核酸分子が、前記集団において最も豊富な核酸分子の０．０１％未満の量である、請求項１に記載の方法。
- 前記標的が、１つ以上の恣意的オリゴヌクレオチドを使用して生成される、請求項１に記載の方法。
- 前記標的が、ＲＮＡ恣意的プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＡＰ−ＰＣＲ）を使用して生成される、請求項１に記載の方法。
- 前記標的が、ディファレンシャルディスプレイを使用して生成される、請求項１に記載の方法。
- 前記標的が、消化−連結を使用して生成される、請求項１に記載の方法。
- 前記標的が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼを含むプライマーを使用して生成される、請求項１に記載の方法。
- 前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ポリメラーゼからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
- 前記標的が増幅されている、請求項１に記載の方法。
- 前記増幅された標的が、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して生成されている、請求項１３に記載の方法。
- 前記標的が増幅されていない、請求項１に記載の方法。
- 前記プローブが分子のアレイである、請求項１に記載の方法。
- 前記アレイにおける前記分子が核酸分子である、請求項１６に記載の方法。
- 前記アレイにおける前記分子がオリゴヌクレオチドである、請求項１６に記載の方法。
- 前記アレイにおける前記分子がポリペプチドである、請求項１６に記載の方法。
- 前記アレイにおける前記分子がペプチド−核酸である、請求項１６に記載の方法。
- 前記標的が、１０以上の核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記標的が、２０以上の核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記標的が、５０以上の核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記標的が、１００以上の核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記標的が、１０００以上の核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記プローブに対する前記標的の前記特異的結合の量を比較する工程であって、該特異的結合の量が、該標的における前記核酸分子の発現レベル、第２の標的における該核酸分子の発現レベルに対応する、工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
- 前記第２の標的における前記核酸分子の前記発現レベルが既知である、請求項２６に記載の方法。
- 前記第２の標的における前記核酸分子の前記発現レベルが、該第２の標的と、前記プローブとを接触させる工程、および該第２の標的に対する該プローブの特異的結合の量を検出する工程によって決定される、請求項２６に記載の方法。
- 標的における２つ以上の核酸分子のレベルを測定する方法であって、該方法は、
（ａ）プローブと、２つ以上の核酸分子を含む標的とを接触させる工程であって、該核酸分子は、統計学的にサンプリングされ、そして該統計学的にサンプリングされた核酸分子は核酸分子の集団において核酸分子のサブセットを含む、工程；
および
（ｂ）該標的の該プローブに対する特異的結合の量を検出する工程、
を包含する、方法。 - 前記標的が、前記集団の１つ以上のあまり豊富ではない配列を含む、請求項２９に記載の方法。
- 前記あまり豊富ではない配列が、前記集団において最も豊富な配列の１０％未満の量である、請求項３０に記載の方法。
- 前記あまり豊富ではない配列が、前記集団において最も豊富な配列の１％未満の量である、請求項３０に記載の方法。
- 前記あまり豊富ではない配列が、前記集団において最も豊富な配列の０．１％未満の量である、請求項３０に記載の方法。
- 前記あまり豊富ではない配列が、前記集団において最も豊富な配列の０．０１％未満の量である、請求項３０に記載の方法。
- 前記統計学的にサンプリングされた標的が、関連しない核酸分子の複雑性について増強される、請求項２９に記載の方法。
- 前記標的が、１つ以上の統計学的オリゴヌクレオチドを使用して生成される、請求項２９に記載の方法。
- 前記統計的オリゴヌクレオチドが、複雑性の結合の順位付けに基づいて選択される、請求項３６に記載の方法。
- 前記統計学的オリゴヌクレオチドが、複雑性の結合について増強される、請求項３６に記載の方法。
- 前記標的が、指示された統計学的選択法を使用して生成される、請求項２９に記載の方法。
- 前記標的が、モンテカルロ統計的選択法を用いて生成される、請求項２９に記載の方法。
- 前記標的が、消化−連結を使用して生成される、請求項２９に記載の方法。
- 前記標的が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼを含むプライマーを使用して生成される、請求項２９に記載の方法。
- 前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ポリメラーゼからなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
- 前記標的が増幅される、請求項２９に記載の方法。
- 前記増幅された標的が、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して生成される、請求項４４に記載の方法。
- 前記標的が増幅されない、請求項２９に記載の方法。
- 前記プローブが分子のアレイである、請求項２９に記載の方法。
- 前記アレイにおける前記分子が核酸分子である、請求項４７に記載の方法。
- 前記アレイにおける前記分子がオリゴヌクレオチドである、請求項４７に記載の方法。
- 前記アレイにおける前記分子がポリペプチドである、請求項４７に記載の方法。
- 前記アレイにおける前記分子がペプチド−核酸である、請求項４７に記載の方法。
- 前記核酸標的が、１０以上の核酸分子を含む、請求項２９に記載の方法。
- 前記核酸標的が、２０以上の核酸分子を含む、請求項２９に記載の方法。
- 前記核酸標的が、５０以上の核酸分子を含む、請求項２９に記載方法。
- 前記核酸標的が、１００以上の核酸分子を含む、請求項２９に記載の方法。
- 前記核酸標的が、１０００以上の核酸分子を含む、請求項２９に記載の方法。
- 請求項２９に記載の方法であって、前記プローブに対する前記標的の前記特異的結合の量を比較する工程をさらに包含し、該特異的結合の量が、該標的における前記核酸分子の、第２の標的における該核酸分子の量に対応する、方法。
- 前記第２の標的における前記核酸分子の前記量が既知である、請求項５７に記載の方法。
- 前記第２の標的における前記核酸分子の前記量が、該第２の標的と、前記プローブとを接触させる工程、および該第２の標的に対する該プローブの特異的結合の量を検出する工程によって決定される、請求項５７に記載の方法。
- 状態と関連した、２つ以上の差次的に発現された核酸分子を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）請求項１に記載の方法に従って標的における２つ以上の核酸分子のレベルを測定する工程であって、プローブに対する該標的の特異的結合の量が、該標的における該核酸分子の発現レベルに対応する、工程；
（ｂ）該標的における該核酸分子の該発現レベルと、第２の標的における該核酸分子の発現レベルとを比較する工程であって、これによって、該標的間の発現レベルの差異が状態を示す、工程；
を包含する、方法。 - 前記状態が疾患状態と関連している、請求項６０に記載の方法。
- 前記疾患状態が、癌、自己免疫疾患、感染性疾患、加齢、発生障害、増殖性障害、神経学的障害からなる群より選択される、請求項６０に記載の方法。
- 前記状態が、処置と関連している、請求項６０に記載の方法。
- 前記発現レベルの差異が、前記処置の効力を示す、請求項６３に記載の方法。
- 前記発現レベルの差異が、前記処置に対する耐性を示す、請求項６３に記載の方法。
- 前記発現レベルの差異が、前記処置の毒性を示す、請求項６３に記載の方法。
- 前記状態が、刺激と関連している、請求項６０に記載の方法。
- 前記刺激が化学薬品である、請求項６７に記載の方法。
- 前記化学薬品が薬物である、請求項６８に記載の方法。
- 前記刺激が増殖因子である、請求項６７に記載の方法。
- 前記増殖因子が、上皮増殖因子（ＥＧＦ）である、請求項６７に記載の方法。
- 前記標的が、配列番号１〜４５として参照される核酸からなる群より選択される核酸配列の一部を含む、請求項７１に記載の方法。
- 前記刺激が照射である、請求項６７に記載の方法。
- 前記刺激がストレスである、請求項６７に記載の方法。
- 前記標的が皮膚細胞に由来する、請求項６０に記載の方法。
- 前期皮膚細胞が、ケラチノサイトを含む、請求項７５に記載の方法。
- 前記標的が腫瘍に由来する、請求項６０に記載の方法。
- 前記刺激が病原体である、請求項６７に記載の方法。
- ５つ以上の刺激調節された核酸分子を含むプロファイル。
- １０以上の刺激調節された核酸分子を含む、請求項７９に記載のプロファイル。
- １００以上の刺激調節された核酸分子を含む、請求項７９に記載のプロファイル。
- １０００以上の刺激調節された核酸分子を含む、請求項７９に記載のプロファイル。
- 前記刺激が上皮増殖因子である、請求項８０に記載のプロファイル。
- 配列番号１〜４５として参照されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の一部を含む、請求項８３に記載のプロファイル。
- 請求項１に記載の方法により得られる、プロファイル。
- 前記プロファイルが２つ以上の核酸分子を含む、請求項８５に記載のプロファイル。
- 前記プロファイルが５つ以上の核酸分子を含む、請求項８５に記載のプロファイル。
- 前記プロファイルが１０以上の核酸分子を含む、請求項８５に記載のプロファイル。
- 前記プロファイルが１００以上の核酸分子を含む、請求項８５に記載のプロファイル。
- 請求項２９に記載の方法によって得られる、プロファイル。
- 前記プロファイルが２つ以上の核酸分子を含む、請求項９０に記載のプロファイル。
- 前記プロファイルが５つ以上の核酸分子を含む、請求項９０に記載のプロファイル。
- 前記プロファイルが１０以上の核酸分子を含む、請求項９０に記載のプロファイル。
- 前記プロファイルが１００以上の核酸分子を含む、請求項９０に記載のプロファイル。
- 配列番号１〜４５として参照されるヌクレオチド配列の各々の一部を含む、標的。
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