JP2002532070A

JP2002532070A - 核酸配列を解析するためのアレイおよび方法

Info

Publication number: JP2002532070A
Application number: JP2000586951A
Authority: JP
Inventors: フォス，ペトルス，アントニウス，ヨセフィーナ; ファン，アイク，ミカエル，ヨセフス，テレーシア; ホーガース，レーネ，コーネリス，ヨセフス; ハイネン，レオ
Original assignee: ケイゲーネエヌブイ
Priority date: 1998-12-04
Filing date: 1999-12-03
Publication date: 2002-10-02
Also published as: AU1696800A; EP1135524A1; CA2352476A1; IL143486A0; WO2000034518A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ａ）担体と、ｂ）前記担体に結合した少なくとも２つの異なる核酸配列トを含む、１つの核酸配列または複数の核酸配列の混合物を解析するためのアレイに関する。前記担体に結合した前記核酸配列の各々はゲノムＤＮＡおよび／または少なくとも１つのｃＤＮＡを少なくとも１つのフリーケントカッター制限酵素と少なくとも１つのレアカッター制限酵素で切断することにより得られる制限断片の配列に対応する少なくとも１つの核酸配列を含む。このアレイは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１０００の担体に固定された異なる核酸配列を含む。より好ましくは、このアレイは、単一の個体からまたは関係する個体のグループから取られた複数のＡＦＬＰマーカーを含む。また、本発明はこのようなアレイに使用するための核酸配列、特にＡＦＬＰマーカーを用意するための方法、およびこのようなアレイを使って１つの核酸配列または複数の核酸配列の混合物を解析するための方法に関する。最後に本発明は、本発明のアレイを含むパーツのキット、ならびに本発明のアレイを使って得られたデータに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】＜発明の属する技術分野＞本発明は核酸配列を解析するためのアレイ、およびこのようなアレイを用いて
核酸配列を解析するための方法に関する。

【０００２】特に、本発明は、遺伝子ＤＮＡまたは遺伝子ＤＮＡから取り出された制限フラ
グメントのサンプルの中に、ＡＦＬＰマーカーのような、遺伝的マーカー（遺伝
標識形質）として役に立つそれぞれがただ１つだけしかない制限フラグメントに
対応する配列の有無を決定するためのアレイと方法に関する。

【０００３】さらに、本発明は、このようなアレイを「バイオチップ」と称する生物分子の
検出のための高密度のアレイの形で作るための方法に関する。

【０００４】＜従来の技術＞核酸配列を解析するための多くの方法が知られている。一般に、これらの方法
は、例えばブロッティングによる、解析しようとする配列の固定；標識したＤＮ
ＡまたはＲＮＡプローブとそれらの配列のハイブリダイゼーション；ハイブリダ
イズしていない物質を除去するための洗浄；それに続くプローブとハイブリダイ
ズしている配列の検出を含む。

【０００５】この技術は、開始核酸配列、通常はゲノムＤＮＡからの制限フラグメントの混
合物を、ＰＣＲなどにより先に増幅した後に行われることが多い。その結果得ら
れる増幅された断片の混合物は、次に例えばゲル電気泳動などにより長さまたは
分子量の違いに従って分離され、さらに例えばブロッティングとそれに続くハイ
ブリダイゼーションにより可視化される。その結果得られるバンドのパターンが
、ＤＮＡ指紋と呼ばれる。

【０００６】通常、ＤＮＡフィンガープリント法においては、近縁の種、亜種、変種、栽培
変種植物、品種（人種）または個体の指紋が比較される。このような類縁関係に
ある指紋は、同一であるか非常に似ている、すなわち多数の一致する、それゆえ
に得られる情報の少ないバンドを含む。

【０００７】２つの類縁関係にある指紋間の相違は「ＤＮＡ多型」と呼ばれる。これらは、
１つの指紋中のまたは１つの指紋および／または複数の指紋の部分集合を表わす
固有のＤＮＡ断片（すなわちバンド）である。このような多型バンド、すなわち
それらのパターンの有無は、例えばある特定の種、亜種、変種、栽培変種植物、
品種（人種）または個体を識別するため、特定の遺伝形質すなわち遺伝子の有無
を証明するため、または病気状態を決定するための遺伝的マーカーとして利用で
きる。

【０００８】ＤＮＡフィンガープリント法、ＤＮＡタイピング（型判定）、ＤＮＡ多型、ゲ
ノタイピング、ＰＣＲおよび類似の技術に関するさらなる解説と定義については
、欧州特許第０５３４８５８号中の先行技術の説明が参照される。

【０００９】上述のハイブリダイゼーションを基礎とする技術は、解析しようとする配列に
ついての少なくとも或る程度の、例えば所望の１つまたは複数の配列とハイブリ
ダイズ可能なプローブを用意するのに十分な、事前の知識を必要とする。例えば
、植物のゲノムを解析するとき、そのゲノム中の「反復」配列とハイブリダイズ
するプローブは、一般的に何ら有用な情報を与えないであろう。このような反復
配列は、固有多型のタイピングを不可能にするからである。

【００１０】解析しようとする配列についての事前の知識を必要としないＤＮＡフィンガー
プリント技術が、参照によりこの明細書に組み込まれている欧州特許第０５３４
８５８号に、出願者により説明されている。この技術は、選択的制限フラグメン
ト増幅すなわちＡＦＬＰと呼ばれ、一般に次の工程を含む：（ａ）核酸、特にＤＮＡを１つまたは複数の特定の制限酵素で消化し、前記ＤＮ
Ａを対応する１組の制限フラグメントに断片化する；（ｂ）このようにして得られた制限フラグメントを、一端が制限フラグメントの
一端または両端と適合する少なくとも１つの二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダ
プターと結合し、それにより開始ＤＮＡのタグ付きの制限フラグメントを作る；（ｃ）前記タグ付きの制限フラグメントをハイブリダイズさせる条件下で少なく
とも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる；（ｄ）前記プライマーとハイブリダイズした前記タグ付き制限フラグメントをＰ
ＣＲまたは類似の技術により増幅し、前記プライマーがハイブリダイズしている
開始ＤＮＡの制限フラグメントに沿ってハイブリダイズしたプライマーをさらに
伸長させる；（ｅ）このようにして得られた増幅または伸長されたＤＮＡ断片を同定または回
収する。

【００１１】このようにして増幅されたＤＮＡ断片は、次に例えばゲル電気泳動により解析
および／または可視化された、アダプターに結合され、プライマーによって認識
され、それにより増幅工程において増幅された制限フラグメントに対応するバン
ドを示す遺伝子フィンガープリントを与える。

【００１２】このようにして得られるＡＦＬＰフィンガープリントは、開始ＤＮＡに特有の
制限部位パターンに関する情報を提供する。関係する個体からのＡＦＬＰフィン
ガープリントを比較することにより、各フィンガープリントに特有のバンドが分
かる。これらの多型は「ＡＦＬＰマーカー」と呼ばれ、再び特定の個体、栽培変
種植物、品種、変種、亜種または種を同定するためおよび／または特定の遺伝形
質、遺伝子または病気状態の有無を確認するために使用できる。

【００１３】ＡＦＬＰは、このように、解析しようとするＤＮＡ塩基配列についての事前の
知識を必要とせず、適切なプローブおよび／または開始ＤＮＡからの遺伝子ライ
ブラリーの構成を前もって同定する必要もない。

【００１４】ＡＦＬＰ、その利点、その実施例と、それに使用される技術、酵素、アダプタ
ー、プライマー、さらには化合物やツールのさらに詳しい説明については、すべ
て出願人による欧州特許第０５３４８５８号および係属中の欧州特許出願第９８
．２０２．５４９６号および第９８．２０２．４５１５号を参照する。また、以
下の説明においては、他の定義が示されていないかぎり欧州特許第０５３４８５
８号のパラグラフ５．１に与えられている定義を使用する。

【００１５】ＡＦＬＰは一般的にハイブリダイゼーションに基づく技術よりも時間がかから
ないが、増幅された断片を分離し（例えばゲル電気泳動により）て可視化（例え
ばフィンガープリントの生成により）しなければならないという不利な点がある
。これらは、電気泳動装置やオートラジオグラフィー装置のような特別の設備を
必要とする、非常に複雑で時間がかかる手順である。その後フィンガープリント
は、多型バンドを同定するために解析される（現在では一般にフィンガープリン
トをコンピュータに「読み込む」ことにより行われる）多型バンドが同定される
。通常、これはゲルの並設レーンにおいて同時に泳動させる既知の対照標準サン
プルを使用する必要がある。

【００１６】これらの原因のために、ＡＦＬＰは十分に設備の整った実験室でだけ行うこと
ができる。それでも、既知の実施要綱に従うルーチン検査が例えばゲノムおよび
／または関係するＡＦＬＰマーカーが広く知られている種または個体に対して行
われるときでさえも、結果が得られるまでに数日かかるかもしれない。

【００１７】＜発明が解決しようとする課題＞従って、本発明の第１の目的はこれらの手順を簡単にすること、すなわちもう
ゲル電気泳動および／またはオートラジオグラフィーを必要としない核酸の塩基
配列を解析するための技術を提供することである。

【００１８】＜課題を解決するための手段＞本発明の目的は、増幅されたゲノムＤＮＡの制限フラグメントの混合物のよう
な核酸のサンプルを、ハイブリダイゼーションがおこる条件下でサンプルを接触
させることにより解析するために使うことができる担体に固定された核酸断片の
アレイを提供することにより達成される。このアレイに基づく検出は、特にルー
チン化された高効率のゲノタイピングのために、ゲル電気泳動／オートラジオグ
ラフィーの代わりに使うことができる。

【００１９】さらに、本発明はこのようなアレイを作る方法を提供する。理論的には、これ
は十分に多数の従来のハイブリダイゼーションプローブを生成し、それらを適当
な担体に結合することにより行うことができる。しかし、これは多くの理由のた
めに実際的ではない。１つには、これらのプローブはすべて何であるかわかって
いなければならず、また、あらかじめ本質的に一度に１つずつ作られなければな
らない。このため、十分に多数の、すなわちここに開示されているマイクロアレ
イのためには１０００〜１００，０００の範囲の異なるプローブを含むアレイの
製造は非常に時間がかかる。

【００２０】また、これらのプローブは選択されたものでなければならない。もし例えば開
始ゲノムＤＮＡから得られたすべての制限フラグメントをアレイ上のプローブと
して使用すると、それに結合する配列が解析しようとする核酸配列中に多くあり
過ぎ、アレイの大部分が情報を与えないだろう。また、ゲノムＤＮＡを制限酵素
で切断することにより得られる断片の数そのものにより、このようなアレイを作
り、または解析する（すなわち“読む”）ことが非常に時間のかかるものとなる
だろう。

【００２１】また、本発明は、アレイに使用するための核酸配列の準備中に、関心を持つ断
片／バンドに対応する配列だけ、または実質的にそのような配列だけを選択する
こと、すなわち遺伝的マーカーを選択することを可能にすることで、この問題を
解決する。また、本発明により多数のそのような情報を含む断片の同定と用意を
同時に行うこと、および担体に結合させるために十分な量のこれらの断片を選択
的に用意し精製することが可能とする。

【００２２】本発明によれば、これは、２つまたはそれ以上の関係のある個体のゲノムＤＮ
ＡをＡＦＬＰを用いて解析し、ゲノム中の多型（ＡＦＬＰマーカー）を決定し、
これらのＡＦＬＰマーカーに対応する核酸配列を増幅して分離し、その増幅され
た配列を担体の特定の領域に結合させることにより実現され、それにより実質的
にＡＦＬＰマーカーに対応する核酸配列だけを含むアレイを提供する。

【００２３】このアレイは、同じまたは遺伝的に関係がある個体から得た核酸（ゲノムＤＮ
Ａまたはその制限フラグメントなど）の試料を、ハイブリダイゼーションがおこ
る条件下でその試料をアレイと接触させることにより解析するために使用できる
。解析しようとする核酸はそれにより実質的に相同な配列、すなわち同じＡＦＬ
Ｐマーカー、または少なくともマーカーと高度の相同性を持つ配列を担持してい
るアレイの部分と（だけ）ハイブリダイズする。従って、アレイのどの部分に（
すなわちどのＡＦＬＰマーカーに）解析しようとする核酸配列がハイブリダイズ
したか解析することにより、試料中の前記マーカーの有無が分かる。

【００２４】すなわち、本発明によれば、多数の多型断片またはバンドの存在（すなわち同
じだけの数が担体に結合する）を調べるために、ＤＮＡフィンガープリントを生
成して解析する必要なしに、核酸配列の試料を直接に検査することができる。

【００２５】また、本発明によれば、多数の無関係のマーカー（単一のＡＦＬＰ反応すなわ
ちフィンガープリントでは通常検出できないマーカー）を、これらの異なるマー
カーを１つのアレイに組み込むことにより、同時に調べることができる。

【００２６】本発明の他の目的および利点は、以下の説明から明らかになろう。

【００２７】Ｈ．Ｈｉｍｍｅｌｂａｕｅｒら、ＭａｍｍａｌｉａｎＧｅｎｏｍｅ９、
６１１−６１６（１９９８）は“ＩＲＳ−ＰＣＲｓｙｓｔｅｍ”と呼ぶ“
ＡＦＬＰ技術の１変形”を使って、多型マーカーの決定とマッピングのための方
法を説明している。この方法によれば、ゲノム（マウス）ＤＮＡが１つの制限酵
素（ＳａｃＩまたはＢａｍＨＩ）を使って切断され、アダプターおよびプライマ
ーを使ってＰＣＲで増幅され、その後このようにして得られたアンプリコン（増
幅単位）が格子状に配置されたゲノムライブラリー（ＢＡＣ−クロン）とハイブ
リダイズさせられて変種に特有の差を決定される。ポジティブクローンは次に、
戻し交配集団の個体から採った断片混合物をそのポジティブクローンとハイブリ
ダイズさせるか、または個々のクローンを増幅して戻し交配集団の個体から採っ
た複合断片混合物とハイブリダイズさせることにより、ゲノタイプ判定情報を生
成するために使うことができる。

【００２８】本発明においては、Ｈｉｍｍｅｌｂａｕｅｒの方法と比べると、２つの制限酵
素、すなわちレアカッターとフリーケントカッター、を使って切断することによ
り、マーカーが生成される。また本発明は、ＢＡＣライブラリーを用意する必要
がなく、その後の戻し交配体に対するハイブリダイゼーションも必要としない。

【００２９】また、ＨｉｍｍｅｌｂａｕｅｒらはＩＲＳ―ＰＣＲにより得られたクローンを
アレイに使うことを示唆していない。Ｈｉｍｍｅｌｂａｕｅｒが使用しているア
レイである高密度にスポットが配置されたゲノムＢＡＣクローンのフィルタグリ
ッドは、従来の複雑なプローブのハイブリダイゼーションを使って作成される。
また、このアレイはマーカーの存在を探すためにＤＮＡサンプルを直接に走査す
るために使用されない（使用できない）。その代わりに、このグリッドはマーカ
ーの決定に使用される（すなわち、さらに付け加えられた戻し交配体とのハイブ
リダイゼーションによる）、そしてそのマーカーは次にゲノムのマッピングに使
われる。

【００３０】また、例えばＷＯ９７／２７３１、ＷＯ９７／２２７２０、ＷＯ９７／４３４
５０、ＥＰ０７９９８９７、ＥＰ０７８５２８０、ＷＯ９７／３１２５６、ＷＯ
９７／２７３１７およびＷＯ９８／０８０８３を参照すると、オリゴヌクレオチ
ドアレイが記載されている。

【００３１】Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ^TM、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＤＮＡチップおよびＶＬＳＩ
ＰＳ^TMアレイが含まれるこのようなアレイは、１００〜１０，０００／cm²また
はそれ以上のヌクレオチド密度を持つことができ、一般的にシーケンシャル固相
核酸合成技術を使って固体支持体上にオリゴヌクレオチドを堆積させることによ
り作成される。しかし、自動装置を使うときでさえもこれは難しく時間がかかる
ので、アレイ上のオリゴヌクレオチドのサイズには実際上の制約がある。すなわ
ち約１００ヌクレオチド、通常は約１０−５０ヌクレオチドであり、通常サイズ
の変化はない。このように小さいオリゴヌクレオチドの使用は、比較的大きなミ
スマッチ発生頻度につながり、選択能力を低下させまたバックグラウンドノイズ
を増大させる。

【００３２】このため、これらの既知のアレイは一般的に標的の配列を検出するためにいく
つかの付着したオリゴヌクレオチドを必要とする。またそれらのアレイは特定の
マーカーの存在に関するデータを直接には提供せず、通常既知の結果との比較や
高度のコンピュータアルゴリズムの使用などによる強力な信号パターンの解析を
必要とする。

【００３３】本発明の第１の視点は、１つの核酸配列または核酸配列の混合物を解析するた
めのアレイであって、ａ）担体と、ｂ）各々がゲノムＤＮＡを少なくとも１つのフリーケントカッター制限酵素と
少なくとも１つのレアカッター制限酵素で切断することにより得られる制限フラ
グメントの配列に対応する少なくとも１つの核酸配列を含む、前記担体に結合し
た少なくとも２つの異なる核酸配列と、を含むアレイに関する。

【００３４】より具体的には、本発明は、担体に結合した核酸配列の少なくとも５０％、好
ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％がＡＦＬＰマーカ
ーに対応する制限フラグメントの配列を含むアレイに関する。

【００３５】さらに、本発明の別の視点は、ａ）ＡＦＬＰマーカーを決定する工程と、ｂ）前記ＡＦＬＰマーカーに対応する制限フラグメント配列を含む核酸配列を
用意する工程と、ｃ）担体にこの核酸配列を付着させる工程と、ｄ）異なるＡＦＬＰマーカーのために工程ａからｃを繰り返し、アレイを作り
上げる工程と、を含む、担体に結合した核酸配列のアレイを提供するための方法に関する。

【００３６】より具体的には、本発明は、ａ）ＡＦＬＰフィンガープリント中の多型バンドを決定する工程と、ｂ）前記多型バンドから１つの核酸配列を分離する工程と、ｃ）任意にさらにその核酸配列を増幅し、精製しおよび／または修飾する工程
と、ｄ）その核酸配列を担体に付着させる工程と、ｅ）異なるＡＦＬＰマーカーにたいして工程ａからｄをを繰り返し、アレイを
作り上げる工程と、を含む方法に関する。

【００３７】本発明のさらに別の視点では、担体に結合される制限フラグメントを生成する
ために使われる開始ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡからではなく、少なくとも１つのｃ
ＤＮＡから取り出される。一般に、発明のこの視点によるアレイは、ａ）担体と、ｂ）それぞれが少なくとも１つのｃＤＮＡを少なくとも１つのフリーケントカ
ッター制限酵素と少なくとも１つのレアカッター制限酵素で切断することにより
得られる制限フラグメントの配列に対応する少なくとも１つの核酸配列を含む、
前記担体に結合した少なくとも２つの異なる核酸配列と、を含む。

【００３８】このようなｃＤＮＡに基づくアレイを提供するための本発明の方法は、ａ）少なくとも１つのｃＤＮＡから得られた少なくとも１つの制限フラグメン
トを含む１つの核酸配列を用意する工程と、ｂ）この核酸配列を担体に付着させる工程と、ｃ）ｃＤＮＡから得られた異なる制限フラグメントに対して工程（ａ）と工程
（ｂ）を繰り返してアレイを作り上げる工程と、を含む。

【００３９】より具体的には、本発明は、ａ）ＡＦＬＰ法を使用して少なくとも１つのｃＤＮＡを解析して少なくとも１
つ、通常は複数のバンドを含むｃＤＮＡのＡＦＬＰフィンガープリントを得る工
程とｂ）前記バンドの少なくとも１つから少なくとも１つの核酸配列を分離する、ｃ）任意にさらにその核酸配列を増幅し、精製しおよび／または修飾する、そし
てｄ）その核酸配列を担体に付着させる、ｅ）異なるバンドおよび異なるｃＤＮＡにたいして工程ａからｄを繰り返してア
レイを作り上げる、工程を含む方法に関する。

【００４０】本発明のさらに別の視点は、１つの核酸（配列）または複数の核酸（複数の核
酸配列）の混合物を、前記アレイに接触させることを含む、１つの核酸または複
数の核酸の混合物を解析するための方法に関する。

【００４１】本発明の他の視点および実施形態は、以下の説明と実験から明らかになるであ
ろう。

【００４２】本明細書では、担体に固定される核酸配列はアレイに固定される核酸配列また
はＡＮＡＳで示され、その中に存在する制限フラグメントは制限フラグメント配
列またはＲＦＳで示される。通常、アレイに固定される核酸配列の各々は、１つ
（のみ）の制限フラグメント配列と、任意にさらに制限フラグメント配列に結合
した下記のような核酸配列または構造要素を含む。アレイに固定される核酸配列
が以下の説明の中で異なると言うときは、それらのアレイに固定される核酸配列
が異なる制限フラグメント配列を含むことを意味する。

【００４３】このアレイは、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１００
、さらに好ましくは少なくとも１０００のアレイに固定される核酸配列を含む。
高密度アレイまたはマイクロアレイに対しては、アレイに固定される核酸配列の
総数は１００〜１００，０００の範囲である。

【００４４】これらのアレイに固定される核酸配列は、通常、スポットまたはバンドのよう
な独立に検出可能な領域を形成するために、アレイに固定される核酸配列の各々
が担体の特定の異なる部分に付着させられかつそれらの部分と対応するように担
体に固定される。これは、関心のあるアレイに固定される核酸配列（すなわちマ
ーカー）が付着している領域を走査（視覚的にまたは他の方法）することにより
アレイを読むことを可能にする。

【００４５】好ましくは、アレイに固定される核酸配列は、例えば関係があるアレイに固定
される核酸配列を一緒に、すなわち１つまたは複数の線、列、行、正方形、長方
形などに、好ましくはアドレス指定可能な形式にまとめることができるあらかじ
め決められた規則的に分布したパターンに従って、担体に固定される。

【００４６】異なるアレイに固定される核酸配列の密度は、１〜１００，０００の異なるマ
ーカー／ｃｍ²、通常５〜５０，０００マーカー／ｃｍ²、一般には１０〜１０、
０００マーカー／ｃｍ²の範囲である。

【００４７】アレイに固定される核酸配列の各々は、特定の個体のゲノムＤＮＡのＡＦＬＰ
フィンガープリントから得られた、特定の多型バンドすなわちマーカーに対応す
る。通常は、単一のフィンガープリントから取り出された、または少なくとも単
一の個体から取り出された１つまたは複数のこのようなマーカーの組を含む。

【００４８】このアレイは、各々が別個のしかし関係のある個体のＡＦＬＰフィンガープリ
ントから取り出されたセットである１つまたは複数のこのような個々のセットか
ら作られる。関係のある個体とは、これらの個体がそれらのＤＮＡフィンガープ
リント、より具体的にはそれらのＡＦＬＰフィンガープリントを比較することに
より役立つまたは所望の情報が得られるような個体であることを意味する。通常
、これは、これらの個体が関係する遺伝的な特性すなわち形質（遺伝子マーカー
を含む）および／またはそれらのゲノム（遺伝子のような）中に同じまたは関係
のある核酸配列を持つことを意味する。実際には、比較の目的にもよるが、関係
する個体は通常、同じ科、属、種、亜種、変種、栽培変種または類から出たもの
である。

【００４９】本発明のアレイにおいては、１つの個体から取り出されたマーカー、および関
係する個体から取り出された複数のマーカーの組は、通常、あらかじめ決められ
た規則的なパターン形状のアレイ上に配置される。

【００５０】通常、マーカーは、関心を持つグループ（すなわち科、属、種、亜種、栽培変
種、類または変種）内の遺伝様性を最も良く代表するように選ばれた、限られた
数の関係のある個体から取り出される。この選択された個体の組はゲノタイピン
グコレクションと呼ばれる。

【００５１】このアレイは、関心を持つ１つまたは複数の形質または特性の有無を示す、ゲ
ノタイピングコレクションから大多数のまたは全てのマーカーを含むことが好ま
しい。例えば、アレイが、同じ科、属または種からの異なる個体内に存在するか
もしれない、関心を持つ遺伝子または形質の優勢、劣性およびいずれかまたは全
ての対立形に特有の全てまたはほとんどのマーカーを含んでもよい。

【００５２】本発明のアレイは、異なる（すなわち遺伝的に関係がない）形質または特性に
対応するマーカーの組を含むことが（も）できる。そしてこのようなアレイは、
これらの特性のすべての有無について同時に個体（のゲノム）を解析するために
使用できる。しかしながら、このような関係のないマーカーは、例えば“トウモ
ロコシアレイ”、“トマト−アレイ”、“小麦−アレイ”などを提供するために
するために、通常まだ１つのゲノタイピングコレクションの中から、すなわち同
じ科、属または好ましくは種に属する個体から得られたであろう。

【００５３】１つの実施形態では、アレイ上に存在するＡＦＬＰマーカーは、同じ種の異な
る亜種、変種、栽培変種、系統または類から取り出されたか、またはその代表で
ある。

【００５４】本発明のアレイは、例えば癌遺伝子や遺伝的に決定される病気の有無のような
、個体のある遺伝状態を表すマーカーを含むこともできる。

【００５５】すでに上述したように、ゲノムＤＮＡから得た制限フラグメントに基づく、例
えば多型断片／遺伝的マーカーに基づくアレイのほかに、本発明はｃＤＮＡ（か
ら得られる制限フラグメント）に基づくアレイも提供する。

【００５６】本発明のこの視点によれば、ＡＮＡＳ中に存在するＲＦＳは少なくとも１つの
ｃＤＮＡを少なくとも１つの制限酵素、好ましくはここに記載されている少なく
とも１つのフリーケントカッター制限酵素と少なくとも１つのレアカッター制限
酵素で切断することにより得られる制限フラグメントである。

【００５７】通常は、配列に付着させる前に、このようにして得られたｃＤＮＡ由来の制限
フラグメントを、好ましくはＡＦＬＰを用いて増幅する。このようなｃＤＮＡの
ＡＦＬＰ増幅は、一般にｃＤＮＡ−ＡＦＬＰと呼ばれ、ゲノムＤＮＡのＡＦＬＰ
増幅のために上述したのと本質的に同じようにして、および／またはそれ自体が
知られているどれかのｃＤＮＡ−ＡＦＬＰプロトコルを使って行うことができる
。それによりｃＤＮＡ由来のＡＦＬＰフィンガープリントが得られる。

【００５８】次にこのｃＤＮＡ−ＡＦＬＰフィンガープリントの１つまたは複数のバンドを
、ゲノムＤＮＡのために上述したのと本質的に同様に、例えば再増幅および／ま
たはＡＮＡＳへの組み込みの後ゲルから分離してアレイに結合させることができ
る。

【００５９】これは、同じｃＤＮＡから得られた異なるバンドに対して、および／または１
つまたは複数の異なるｃＤＮＡからのバンドに対して行ってもよい。また、ＲＦ
Ｓを用意するために使用する１つまたは複数のｃＤＮＡは、１つの個体（例えば
異なる細胞、部位、組織、器官）（から採取したｍＲＮＡ）からおよび／または
２またはそれ以上の個体、例えば、同じまたは異なる表現特性を持つ、同じ品種
（人種）、変種、種、属、科などに属する個体から得ることができる。またこの
ｃＤＮＡは、健康な個体（からのｍＲＮＡ）からおよび／または病気にかかった
個体から；および／または異なる発達段階にある個体から得ることもできる。

【００６０】さらに、上記の説明ではゲノムＤＮＡに基づくアレイとｃＤＮＡに基づくアレ
イを別々に説明したが、本発明のアレイはゲノムＤＮＡから得られた１つまたは
それ以上の制限フラグメントと、ｃＤＮＡから得られた１つまたはそれ以上の制
限フラグメントを両方含んでもよいことは、当業者には明らかであろう。

【００６１】アレイ上のアレイに固定される核酸配列の各々は、関心を持つ多型バンド（す
なわち１つのマーカー）または情報を与えるｃＤＮＡから得られた１つのバンド
に対応することが好ましいが、いくつかの全くまたは少ししか情報を与えないア
レイに固定される核酸配列（例えば、非多型バンドまたは有益な情報を与えるに
は多すぎるマーカーに対応するもの）がアレイ上に存在することを排除しない。

【００６２】しかしながら、これらは、アレイ上に存在する全てのアレイに固定される核酸
配列のうちの５０％より少なく、好ましくは３０％より少なく、より好ましくは
１０％よりも少ないことが好ましい。またアレイに固定される核酸配列のいくつ
かまたは大部分が１つの特定の用途のために情報を与え、他の用途のためには情
報を与えないことも含まれる。しかしながら、アレイに固定される核酸配列全部
のうちの９５−１００％がＡＦＬＰマーカーに対応するかまたはそれを含んでい
ることが好ましい。

【００６３】アレイに固定される核酸配列および制限フラグメント配列を得る方法は、後の
実験の部でさらに詳しく説明する。

【００６４】概して、この制限フラグメント配列は、開始ＤＮＡ、通常はゲノムＤＮＡまた
はｃＤＮＡを、少なくとも１つのフリーケントカッター制限酵素と少なくとも１
つのレアカッター制限酵素で切断することにより得ることができることが特徴で
ある。これらの断片は次にアダプターに結合され、（通常は選択）プライマーを
使って増幅される。このようにして増幅された断片はＤＮＡフィンガープリント
として可視化され、例えば１つまたは複数の関係する個体のフィンガープリント
またはデータベースと比較することにより、多型バンドが同定される。これらの
多型バンド中に存在する制限フラグメントは次に別々に分けられ（ゲルから切り
取ることにより）、そして任意であるがさらに精製および増幅され、その後担体
の特定の異なる領域に付着させられる。この付着を可能にするかまたは促進する
ために担体の表面または断片を修飾した後に付着させてもよい。

【００６５】したがって、本発明は、アレイに付着させる核酸配列を選択するためおよび用
意する（すなわち増幅して分ける）ための両方に、そしてそれを同時に行うため
に、ＡＦＬＰの手順を使用する。また、本発明におけるＡＦＬＰの使用は、例え
ば並行するＡＦＬＰ反応を進行させ、同じゲルの隣接するレーン内のこれらの反
応を可視化することにより、関係する個体（すなわち１つのゲノタイピングコレ
クションからの個体）からのマーカーを同時に同定しかつ用意することを可能に
する。このようにして、多数のマーカーを含むおよび／または１つのゲノタイピ
ングコレクションからの全ての関係するマーカーを含むマイクロアレイを非常に
効率的に作ることができる。

【００６６】ＡＦＬＰにおける場合と同じように、開始（ゲノム）ＤＮＡを消化するために
２つの異なる制限酵素、すなわち制限フラグメントのサイズを効率的に増幅され
るサイズ範囲まで低下させるという目的にかなうフリーケントカッターと、まれ
な配列を標的にするという目的にかなうレアカッターが使用される。両方につい
て、本願出願人による欧州特許第０５３４８５８号および第０７２１９８７号が
参照される。

【００６７】好ましいフリーケントカッター酵素の例としては、ＭｅｓＩとＴａｑＩが挙げ
られる。市販されているレアカッターの例としては、ＰｓｔＩ、ＨｐａII、Ｍｓ
ｐＩ、ＣｌａＩ、ＨｈａＩ、ＥｃｏＲII、ＢｓｔＢＩ、ＨｉｎＰＩ、ＭａｅII、
ＢｂｖＩ、ＰｖｕII、ＸｍａＩ、ＳｍａＩ、ＮｃｉＩ、ＡｖａＩ、ＨａｅII、Ｓ
ａII、ＸｈｏＩ、ＰｖｕIIが挙げられる。これらのうち、ＰｓｔＩ、ＨｐａII、
ＭｓｐＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲII、ＢｓｔＢＩ、ＨｉｎＰＩ、ＭａｅIIが好まし
い。

【００６８】ＡＦＬＰ反応は公知のプロトコルに従って行われる。それについては、本願出
願人による欧州特許第０５３４８５８が参照される。

【００６９】制限フラグメント配列（ＡＦＬＰアダプター付）は、通常、ＡＦＬＰフィンガ
ープリント中の１つのバンドとして検出することができる、すなわち５０〜１２
００塩基対の範囲内の大きさを持つ。制限フラグメント配列がゲル電気泳動によ
り分けられるにつれて、それらのサイズが異なっていることが明らかになるであ
ろう。

【００７０】また、ＡＦＬＰフィンガープリント中の１つのバンドとして／から得られた１
つの制限フラグメントの１部だけを制限フラグメント配列と使用することができ
る。このような部分配列は、例えば、ＡＦＬＰゲルから分離された制限フラグメ
ント配列を、１つまたはそれよりも多い制限酵素、すなわち通常は開始ゲノムま
たはｃＤＮＡから制限フラグメントを作るために最初に使用された１つまたは２
つの制限酵素以外の制限酵素、合成されたオリゴヌクレオチドを含むがそれらに
限定されない、を使って（さらに）切断することにより得られる。この目的のた
めに、任意の望ましいおよび／またはあらかじめ決められた制限酵素または酵素
の組み合わせが使用できる；適する制限酵素には、上記のフリーケントカッター
およびレアカッター、IIＳ型の制限酵素が含まれる。ただしそれらに限定されな
い。

【００７１】ＡＦＬＰゲルから得た制限フラグメントを（さらに）制限酵素で切断すること
により生成されるこのような部分配列は、もとの制限フラグメントのサイズ（す
なわち使用される制限酵素のための認識部位がその制限フラグメント中に存在し
ないとき）までの任意の適当なサイズを持つことができる。しかしながら、通常
は、これらの部分配列は制限フラグメントよりも小さい、すなわち１０〜１００
塩基対の範囲である。

【００７２】このようにより小さい、しかしまだ特有性がある部分配列の使用には、相同領
域を示す配列の間のクロスハイブリダイゼーションが避けられるなどの利点があ
る。また、この明細書における説明の目的のために、このような部分配列がここ
で使用されている制限フラグメント配列という語の範囲内に含まれていると考え
られるべきである。

【００７３】アレイに固定される核酸配列として２本鎖ＤＮＡを使用することは本発明の範
囲内であるが、好ましくはアレイに固定される核酸配列は一本鎖ＤＮＡを含む。

【００７４】アレイに固定される核酸配列は、少なくとも１つの（そして通常はただ１つの
）制限フラグメント配列を含み、その制限フラグメント配列の末端にしばしば、
他の配列または構造要素をさらに含むことができる。これらは、ＡＦＬＰアダプ
ター配列（１または２つ）および／またはアレイに固定される核酸配列をそのア
レイに付着させるために使うことができる基または官能基（以下“結合要素”と
言う）や他の核酸配列を含む。

【００７５】アダプター配列は通常アレイに固定される核酸配列の末端に存在する。そして
ＡＦＬＰ反応においてもとのゲノムＤＮＡを増幅するために使用されるアダプタ
ーおよび／または解析すべき試料を増幅するために使用されるアダプターでもよ
い。しかしながら、それらは、この後の実験の部で与えられる理由のために、そ
こに異なる（アダプター）配列を含むことが好ましい。

【００７６】アダプターはまた、アダプターを結合要素にするために、アレイに固定される
核酸配列をアレイに付着させるために使用できる基または官能基を含むように修
飾されていてもよい。

【００７７】結合要素は制限フラグメント配列の末端に在ってもよいが、この後にさらに詳
しく説明するように、アレイに固定される核酸配列をアレイに結合させるために
使用する技術により、制限フラグメント配列自体の中または上にあってもよい。

【００７８】アレイの担体は、核酸配列を付着させることができる固体材料なら何でもよく
、多孔材料、繊維材料、織られた材料、不織材料や複合材料が含まれる。また、
好ましくはないが、ゲルまたはマトリックス（例えばクロマトグラフィーに使わ
れている）のような半固体材料も使用できる。

【００７９】適当な担体には、プラスチック製の材料、樹脂、ポリサッカライド、シリカま
たはシリカを主成分とする材料、機能ガラス、修飾されたシリコン、カーボン、
金属、無機ガラス、膜、ナイロン、絹、羊毛、綿などの天然繊維、およびポリス
チレン、ポリエチレングリコルテトラフタレート、ポリビニルアセテート、ポリ
ビニルクロライド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリメチル
メタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ブチルゴム、スチレンブタジエ
ンゴム、天然ゴム、ポリエチレン、ポリプロビレン、（ポリ）テトラフルオロエ
チレン、（ポリ）ビニリデンフルオライド、ポリカーボネイトおよびポリメチル
ペンテンのような高分子材料などが含まれるが、これらに限定されない。さらに
適当な担体の材料が、例えば米国特許第５，４２７，７７９号、ＷＯ９７／２２
７２０、ＷＯ９７／４３４５０、ＷＯ９７／３１２５６、ＷＯ９７／２７３１７
および欧州特許第０７９９８９７号に挙げられている。

【００８０】好ましい担体の材料はガラスとシリコンである。

【００８１】担体は、実質的に平らな四角形で、その１つの面にアレイに固定される核酸配
列が結合しているのが好ましい。しかしながら、円板、球、またはビーズのよう
な他の適当な２次元または３次元の形も使用できる。また解析しようとする試料
を含む液体の媒体が担体を透過または流通することを可能にする柱、管または毛
細管、および（マクロの）多孔―、織物−または膜−型の構造、さらにはＷＯ９
７／２２７２０において言及されている流通ゲノセンサーを含むような材料や構
造でもよい。

【００８２】アレイおよびアレイに固定された異なる核酸配列の各々に対応する個々の領域
のサイズは、アレイに固定される核酸配列の全量、およびそのアレイを解析する
ための意図された方法に依って変わる。視覚により調べられるアレイにたいして
は、アレイ全体およびその区分された領域は、肉眼または顕微鏡で見ることがで
きかつ識別することができるようなサイズ、すなわちアレイ全体が１〜５００ｃ
ｍ²、および個々の領域が０．０１〜０．１ｃｍ²の範囲になるであろう。

【００８３】他のタイプの（通常は自動化されている）走査装置で解析されるアレイは、よ
り小さいサイズでもよく、アレイ全体が１〜１０ｃｍ²、および個々の領域が０
．００１〜０．１ｃｍ²の範囲の高密度またはマイクロアレイの形が好ましい。
これはハイブリダイゼーションを少量の試料で小さい容積内で行うこと、また流
通技術の使用をも可能にする。

【００８４】アレイに固定される核酸配列は、どのような既知の方法で担体に結合させても
よい。そして使用される特定の技術は主として用いられる担体に依存する。結合
は、３’末端、５’末端、または制限フラグメント配列／アレイに固定される核
酸配列のどこか他の個所でしていてもよい。

【００８５】アレイに固定される核酸配列は、適当な化学技術により、担体に共有結合で結
合させることが好ましい。上述したように、この目的のためには、アレイに固定
される核酸配列および／または担体を、１つまたは複数の結合基またはエレメト
を持つように、修飾してもよい。例えば、担体の表面を、カルボキシ、アミノ、
ヒドロキシなどのような基を１つまたは複数持たせて、活性化してよい。

【００８６】アレイに固定される核酸配列を担体に固着するための適当な方法は、当業者に
は明らかであろう。核酸を固体の担体に固着させるための方法はいずれも使用で
きる。この方法には米国特許第５，４２７，７７９号、第４，９７３，４９３号
、第４，９７９，９５９号、第５，００２，５８２号、第５，２１７，４９２号
、第５，５２５，０４１号、第５，２６３，９９２号、ＷＯ９７／４６３１３お
よびＷＯ９７／２２７２０、ならびにここに引用されている参照文献に記載され
ている方法が含まれる。

【００８７】共有結合による固着の１例として、Ｎ−オキシ−スクシンイミドのような光化
学反応基を用いて結合を進行させることができ、この場合には、アレイに固定さ
れる核酸配列を１つの光化学反応基で誘導体に変え表面に固着させるか、まず表
面を１つの光化学反応基で処理して、例えばＮ−末端がアミノ修飾された形のア
レイに固定される核酸配列を表面に接触させる。Ａｍｏｓら、Ｓｕｒｆａｃｅ
ＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｏｌｙｍｅｒｓｂｙＰｈｏｔｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ、Ｔｈｅ１７ｔｈＡｎｎｕ
ａｌＭｅｅｔｉｎｇｏｆｔｈｅＳｏｃｉｅｔｙｏｆＢｉｏｍａｔｅ
ｉｒａｌｓ、Ｍａｙ１９９１、ＳｃｏｔｔｓｄａｌｅＡＺ、の中に説明
されている一般的な方法に従った適当なプロトコルが、ＷＯ９７／４６３１３の
中に記載されている。

【００８８】他の共有結合技術には、例えば参照によりここに組み込まれているＷＯ９７
／２２７２０に記載されている、３´−アミノプロパノール基またはエポキシラ
ン−アミン化学の使用が含まれる。

【００８９】強力な、しかし共有結合でない結合技術の例には、ビオチニレート化したアレ
イに固定される核酸配列をストレプタビジンでコートされた担体に固着させるこ
とが含まれる。

【００９０】アレイに固定される核酸配列の各々のための小さい、別々に分けられた、アド
レス可能な領域を作るためには、例えばＷＯ９７／４６３１３およびＷＯ９７／
２２７２０記載されているマスキング技術または既知のマイクロディスペンス技
術が使用できる。

【００９１】アレイに固定される核酸配列を担体に固着させた後は、アレイはほぼ使用する
準備ができている。

【００９２】本発明のさらに別の視点は、本発明のアレイを使って核酸の試料を解析するた
めの方法に関する。この方法は、試料中に存在する核酸配列のうちの１つまたは
複数がアレイ上のアレイに固定される核酸配列と、より具体的にはアレイに固定
される核酸配列中に存在する制限フラグメント配列と結合できるように、ハイブ
リダイゼーション条件下で、解析しようとする試料をアレイに接触させることを
含む。この方法は、この後の実験の部でより詳細に説明される。

【００９３】通常、使用されるアレイ上に存在する１つの制限フラグメント配列（すなわち
１つのＡＦＬＰマーカー）に対応する少なくとも１つの配列すなわち断片を含む
のではないかと疑われている１つの核酸配列または混合物が解析される。この場
合、対応するとは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８５％、特に９
５〜１００％の配列の相同性を意味する。

【００９４】本発明の方法は、解析しようとする試料中の配列の制限フラグメント配列との
ハイブリダイゼーションに基づく。換言すれば、この発明においては、標的の試
料が関心を持つあらかじめ選択された配列／マーカーを使って直接に探査され、
１つの陽性のハイブリダイゼーション事象すなわち信号は、その標的試料中の前
記マーカーの存在を直接的に示す。また、これらのマーカーは標的ゲノム中に多
くはない特有の配列であるため、一般的に高い選択性が得られる。

【００９５】また、本発明の非常に好ましい実施形態では、標的ゲノムの解析において、前
記ゲノムＤＮＡに、アレイに対するハイブリダイゼーションの前にＡＦＬＰが行
われる。この場合のＡＦＬＰは、開始ＤＮＡが少なくとも１つの制限酵素を使っ
て切断され、次にアダプターとプライマーを使って増幅される、そのうち少なく
とも１つは、その３’−末端に少なくとも１つの選択性のある塩基を含むことを
意味する。

【００９６】さらにより好ましくは、ハイブリダイゼーションの前のＡＦＬＰ増幅において
は、制限フラグメント配列（少なくともそのうちのいくつか）の生成において使
われたのと同じフリーケントカッターとレアカッターが使用され、そして最も好
ましくは、同じ（選択性のある）プライマーを使用し、同じプロトコルに従う。
このようにして、増幅された試料は、アレイ上の制限フラグメント配列に正確に
対応する断片を含み、そして実質的にそのような断片だけを含む（すなわち、ア
レイ（上の制限フラグメント配列）とハイブリダイズすることが期待されない非
多型の断片を除いて）。これは特異性と信頼性をさらにいっそう向上させる。

【００９７】適当なハイブリダイゼーション条件（すなわち使用するバッファ（緩衝液）、
塩の濃度、温度、時間長）は、当業者が、経験に基づいて、またはいくつかの予
備的な実験の後に任意に、選択することができる。これらの条件は、アレイ上の
アレイに固定される核酸配列（制限フラグメント配列のサイズ、ＣＧ−含有量な
ど）や解析しようとする試料などの要因により変わり得る。

【００９８】適切なハイブリダイゼーション条件は、例えば、Ｓａｍｂｏｏｋら、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ、（１
９８９）２ｎｄ．Ｅｄ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ、Ｎ
Ｙ．；ＢｅｒｇｅｒａｎｄＫｉｍｍｅｌ、“ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、（１９８７）、Ｖｏｌｕｍｅ１５２、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．、１９９４；ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢ
ｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２４、ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈＮｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ、Ｐ．Ｔｈｉｊｓｓｅｎ、ｅｄ．、Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９３）、ＷＯ９７／４３４５０、ＥＰ０７９９８９７
、ＷＯ９７／２７３１７、ＷＯ９２／１００９２、ＷＯ９５／１１９５、ＷＯ９
７／２２７２０およびＵＳ５，４２４，１８６に記載されている。これらは全て
参照として本明細書に組み込まれている。

【００９９】適当なハイブリダイゼーション条件は、２５〜７０℃、好ましくは３５〜６５
℃の温度、１分から３０時間、好ましくは約３０分から２時間の時間、および公
知のハイブリダイゼーションバッファの使用を含む。既知のハイブリダイゼーシ
ョンバッファは、例えば、塩−、Ｔｒｉｓ−、またはｃｉｔｒａｔｅ−を含むバ
ッファ等である。このハイブリダイゼーション条件は、例えば、約４０℃では６
ＸＳＳＰＥ−Ｔ、３７℃では１ＸＳＳＰＥ−Ｔに、さらに３７−５０℃では０
．２５ＸＳＳＰＥ−Ｔまで下げられる。

【０１００】ハイブリダイゼーション条件は、７０％以上、好ましくは８０％、より好まし
くは９０％以上の相同性、そして特に９５〜１００％の相同性を持つ標的試料中
の核酸配列だけが、制限フラグメント配列とハイブリダイズし、アレイに固定さ
れる核酸配列とハイブリダイズするように選択することが好ましい。これらは一
般的に穏和または好ましくは厳しいハイブリダイゼーション条件である。このよ
うな厳しい条件、欧州特許第０７９９８９７号に記載されているとおりでもよい
。

【０１０１】ハイブリダイゼーションの後、望ましくない化合物、特にアレイ上のアレイに
固定される核酸配列とハイブリダイズしていない全ての核酸配列を除去するため
に洗浄される。その後、アレイは、アレイ上のどの領域（すなわちどのアレイに
固定される核酸配列／制限フラグメント配列）に試料からの核酸配列がハイブリ
ダイズしているか決定するために解析される。これらの領域は、一般的に、試料
中のマーカーの存在を示す正の信号として検出される。

【０１０２】アレイの解析は、その技術がハイブリダイゼーションの存在を示すことができ
るかぎり、光学技術、分光技術、化学技術、生物化学技術、光化学技術、電気技
術、光散乱技術、比色技術、放射線写真技術などが含まれる公知の方法のいずれ
で行ってもよい。適当な技術は、例えば、ＷＯ９７／２７３１７、ＷＯ９７／２
２７２０、ＷＯ９７／４３４５０、ＥＰ０７９９８９７、ＷＯ９２／３１２５６
、ＷＯ９５／２７３１７およびＷＯ９８／０８０８３に記載されている。

【０１０３】通常は、検出可能なラベルを使う技術が使用される。このようなラベルは、ア
レイとのハイブリダイゼーションの後でラベルの存在を示すアレイの領域がポジ
ティブなハイブリダイゼーションエベントに対応するように、通常解析しようと
する核酸配列に付けられる。

【０１０４】適当なラベルは、例えばＷＯ９７／２７３１７、ＷＯ９７／２２７２０、ＷＯ
９７／４３４５０、ＥＰ０７９９８９７、ＷＯ９２／３１２５６、ＷＯ９７／
２７３１７およびＷＯ９８／０８０８３に記載されており、蛍光ラベル、燐光ラ
ベル、化学発光ラベル、生物発光ラベル、化学ラベル、酵素のような生物化学ラ
ベル、ビオチン／ストレプタビジンのような生物ラベル、放射性同位元素、スピ
ンまたは共鳴ラベル、金のような金属コロイド、磁気ビーズ、色原体、染料およ
び類似のラベルを含む。

【０１０５】これらのラベルは、例えば、ラベルが付けられたプライマーまたはヌクレオチ
ドを使うことにより増幅中に標的の核酸に組み込まれてもよい。また、ラベルを
後でそこに付けることができる結合基を持つプライマーまたはヌクレオチドを、
増幅反応中に使用することもできる。

【０１０６】別の方法として、例えばＷＯ９７／２７３１７に記載されているように、標的
の核酸に増幅の後で末端ラベルを付けることもできる。さらにまた、例えば再び
ＷＯ９７／２７３１７に記載されているように、ハイブリダイゼーションの後で
標的の配列／アレイに固定された核酸配列の２重構造に結合する、いわゆる間接
ラベルを使用してもよい。

【０１０７】アレイ上のポジティブ信号の検出と任意である読取りは、通常、ラベルが使用
されているかどうか、また使用されている場合にはそのタイプに依存して、既知
の方法により行うことができる。例えば、アレイは視覚または（共焦点）顕微鏡
により；分光計により；写真フィルムを使って；電子検出器またはＣＣＤカメラ
により；比色または（生物）化学的な分析評価により；または他の適当な方法で
検査することができる。そしてそれらの方法について再び、ＷＯ９７／２７３１
７、ＷＯ９７／２２７２０、ＷＯ９７／４３４５０、ＥＰ０７９９８９７、ＷＯ
９２／３１２５６、ＷＯ９７／２７３１７およびＷＯ９８／０８０８３が参照が
行われる。

【０１０８】必要に応じて、アレイ上の結合部位にたいするポジティブなハイブリダイゼー
ション信号の相対強度または絶対強度は、例えばＷＯ９８／０８０８３に記載さ
れているように、元の試料に存在した対応する断片の量の相対的な指示値または
絶対的な量として使用することができる。

【０１０９】アレイに対するハイブリダイゼーション（パターン）の解析は役に立つ結果を
提供する。すなわち関心を持つ遺伝マーカーまたは遺伝形質の有無を示し、個体
を同定し、またはそれが属する品種、変種、栽培種または類などのその個体に情
報を提供する。それはまた直接に病気状態の有無を示す。

【０１１０】必要に応じて、アレイを読むことにより得られるデータは、例えば、任意にコ
ンピュータアルゴリズムを使ってそれを標準、先の結果またはデータベースと比
較することにより、さらに処理をおこなってもよい。

【０１１１】好都合なことに、本発明のアレイは、ＡＦＬＰにおける従来のフィンガープリ
ント／オートラジオグラフィ（放射能写真術）と置き換えるために使用できる。
本発明のこの面は、上述した一般的なＡＦＬＰ法の工程（ａ）〜（ｅ）を含み、
工程（ｅ）は、工程（ｄ）において得られた増幅されたまたは伸長されたＤＮＡ
断片（の混合物）をここに説明されているアレイに接触させることにより実施さ
れる。

【０１１２】従来のフィンガープリント／オートラジオグラフィと比較すると、アレイの使
用は一般的にフィンガープリント／オートラジオグラフィを使用するよりも速く
、またいくつかの別々のフィンガープリントの生成を必要とするであろういくつ
かのマーカーを単一のアレイにまとめることができる。これは、本発明のアレイ
を、例えば植物の育種におけるルーチンおよび／または高スループットの選別に
とりわけ適せしめる。

【０１１３】また、本発明のアレイは、アレイおよびアレイと共に使用するための他の構成
要素を含むパーツのキットとして提供できる。キットの他の構成要素には、制限
酵素、ポリメラーゼ、アダプター、プライマー、バッファ、ヌクレオチド、ラベ
ルまたは他の検出用の薬剤、容器／包装および説明書などである。本発明のアレ
イはまたディップスティックのような手持ち装置の形でもよい。

【０１１４】本発明のアレイは、通常、ハイブリダイズした配列を除去するための再生によ
り再使用可能になる。したがって、本発明のキットは、この再生のために使用で
きる薬剤を含んでもよい。

【０１１５】本発明のアレイは、あらゆる種類の核酸配列または核酸配列の混合物を解析す
るためにも使用できる。この解析できる核酸の種類には、植物から取った配列、
動物から取った配列、微生物から取った配列、酵母菌から取った配列、菌やから
取った配列、およびウィルスの配列などが含まれる。そしてこれだけに限定され
ない。あるアレイでどの種類の核酸配列が解析できるかは、そのアレイに結合さ
れている制限断片配列の起源−アレイに結合している制限断片がゲノムＤＮＡま
たはｃＤＮＡのどちらに由来するか（または両方か）ということも含まれる−に
依存する。

【０１１６】またこのアレイは、必要に応じて、上で与えられた方法の類似の変更により、
ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、構造遺伝子、調節遺伝子および／またはそれらの部分
を含むＤＮＡ配列、ならびにｍＲＮＡを含むＲＮＡを解析するために使用できる
。

【０１１７】アレイで解析される核酸試料は、生きている生物あるいは死んだ生物から、ま
たは組織または細胞から直接に分離された試料でもよい。しかしながら、アレイ
とのハイブリダイゼーションの前に、核酸試料を１つまたは複数の制限酵素、好
ましくはアレイを作るときに使われたのと同じ２つの制限酵素で切断することが
好ましい。ただしこれは必須ではない。

【０１１８】また、核酸試料（またはその部分）は、どれかのタイプの適当な増幅技術、好
ましくはＰＣＲに基づく技術を使って、アレイとのハイブリダイゼーションの前
に増幅してもよい。すでに上述したように、好ましくはアレイを作るときに使わ
れたのと同じアダプターとプライマーを使って、ＡＦＬＰを都合良く使用できる
。これは、既知の信頼できるプロトコルの使用を可能にするだけでなく、試料の
複雑さを低下させることもでき、それにより信号対ノイズ比を向上させることが
できる。

【０１１９】しかしながら、本発明のアレイは一般的に担体に結合された１組の特有のプロ
ーブ／マーカーを含むので、このアレイは、どのような核酸の試料にたいしても
、対応する配列の有無を調べるために使用できるということは理解されるべきで
ある。このこは、核酸の試料が採取される形（すなわち、完全ゲノムＤＮＡ、ｃ
ＤＮＡ、またはそれらの断片）、またはその核酸試料が増幅されているかどうか
、増幅されているときはどの増幅技術により増幅されたかということから独立で
ある。フィンガープリントと比較すると、アレイの使用は、断片の長さの差の検出にも
はや基づかないし、そうしなくてもよい、なぜなら関心を持つ配列が直接に検出
されるからであるということもさらに理解されるべきである。したがって、本発
明のアレイは、いったん準備されると、ＡＦＬＰだけにおけるよりもよりいっそ
う広範に適用できる。

【０１２０】また、本発明のアレイは主として検出と解析を意図されているが、望ましくな
い配列を除去した後でハイブリダイズした配列を解放することにより、ＤＮＡ、
ＲＮＡまたはそれらの断片を定量的に用意したり、分離したりするためにも使用
できる。このようにして得られた配列は次に例えばそれらの配列を決定するため
に、さらに使ったり解析したりすることができる。

【０１２１】原理的には、本発明のアレイは、多型マーカーが使用できおよび／または決定
できる目的のための発展させられ、また使用されることができる。これは、既知
のＤＮＡフィンガープリント、ゲノタイピング、プロファイリングおよびＤＮＡ
同定などの技術における多型マーカーのための技術において記載されているすべ
ての用途を含み、これに限定されるものではない。本発明のアレイは、もちろん
上で言及され、欧州特許第０５３４８５８号および継続中の欧州特許出願第９８
．２０２．５４９６号および第９８．２０２．４５１５号に記載されている用途
を含む、ＡＦＬＰマーカーが使用できるおよび／または決定できる用途において
とりわけ適している。

【０１２２】また、すでに言及した用途以外に、本発明のｃＤＮＡに基づくアレイは、ｃＤ
ＮＡ−ＡＦＬＰの使用が意図されている目的のために使用できる。その用途には
、発現プロファイリング、ファンクショナルゲノミックス、およびジーンマッピ
ングなどの用途が含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらの用途
のどれにたいしても、ｃＤＮＡ―ＡＦＬＰの同様に、１つのｃＤＮＡに基づくア
レイは、開始試料の中の１つまたは複数の特定のヌクレオチド配列の存在を、例
えばアレイから得られるハイブリダイゼーションの信号の強さに基づいて、定性
的だけでなく定量的に決定するために使用できるようにすることが意図されてい
る。これらは、ＤＮＡ配列だけでなく、ｍＲＮＡのような発現に依存するＲＮＡ
も含む。

【０１２３】ゲノムＤＮＡに基づくアレイならびにｃＤＮＡに基づくアレイが使用可能な分
野は、例えば、植物や動物の育種、変種や栽培品種の同定、診断医学、植物や動
物の病気の診断、人おいて遺伝により伝わる病気の同定、家族関係の解析、法科
学、臓器移植、伝染病の病原体のためのマルチプレクステストのような微生物お
よびウィルスのタイピング、ならびに遺伝、遺伝子の発現、突然変異、癌遺伝子
および／または薬剤耐性、またはｍＲＮＡの検出などである。

【０１２４】本発明アレイは、さらに、既知のヌクレオチドアレイが使用されていたり、使
用が意図されている他のあらゆる用途において使用できる。これらは、例えば、
ＷＯ９７／２７３１７、ＷＯ９７／２２７２０、ＷＯ９７／４３４５０、ＥＰ０
７９９８９７、ＥＰ０７８５２８０、ＷＯ９７／３１２５６、ＷＯ９７／２７３
１７およびＷＯ９８／０８０８３において言及されている用途を含む。

【０１２５】すでに上述したように、これらの用途においては、ある特定のゲノタイピング
コレクションの関心を持つ大部分のマーカー、さらにはすべてのマーカーを担持
する本発明のアレイの開発が意図されている。本発明の別のアレイは、１つのゲ
ノタイピングコレクションの内の個体を識別するために必要なマーカー、すなわ
ち種、亜種、変種、栽培種、類、微生物の変種およびラインへの所属など、また
は遺伝形質または特性の継承の研究のために必要なマーカーの大部分のまたはす
べてのマーカーを含んでもよい。また本発明の１つのアレイは、遺伝的に決定さ
れる、または遺伝的な影響を受ける病気または失調、例えば癌、癌遺伝子、癌遺
伝子の突然変異などの有無または状態がわかるすべてのマーカーを含んでもよい
。同様に、ｃＤＮＡに基づくアレイをこれらの目的のために提供することも可能
である。

【０１２６】本発明のアレイの使用が特別に意図されている植物、動物および微生物の種に
は、人、マウス、ラット、豚などの動物、小麦、大麦、トウモロコシ、トマト、
胡椒、レタス、米などの植物、および酵母、バクテリヤおよび黴などの微生物が
含まれる。

【０１２７】本発明のさらに別の視点は、１つの核酸または複数の核酸の混合物を本発明の
アレイを使って解析することにより得られる結果および／またはデータに関する
。これらの結果またはデータは、例えば、イメージ、スコア、ディジタルまたは
アナログの形か、他の適当な形であり、また随意に紙、写真フィルム、コンピュ
ータのディスクやファイルまたはデータベースとして随意に適当な媒体に記録さ
れる。

【０１２８】本発明は、下記の限定のためではない実験の部と、アレイをＧｎｅｔａｃ１
０００スキャナー（Ｇｅｎｏｍｉｃｓｏｌｕｔｉｏｎ）を使って走査すること
により得られた、本発明のマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションの結
果（その表現）を示す図１−８によって、さらに詳しく説明される。

【０１２９】このアレイはキセノンランプで照射されＣＣＤカメラを使って信号が検出され
た。Ｃｙ−３およびＣｙ−５のためにフィルタが用いられる。走査時間は約１８
０秒である。

【０１３０】［実験の部］実施例I：ＡＦＬＰマイクロアレイの作成ＡＦＬＰマイクロアレイを作成する方法は工程（１）−（９）を含む。工程（
２）−（５）は通常、欧州特許第０５３４８５８号に記載されているような従来
のＡＦＬＰ技法とプロトコルに従う。該方法の多くの工程、ならびにそこで使用
されるプライマー／プライマーコンビネーションを図９−１１に概略的に示す。

【０１３１】１．ゲノタイプ用コレクション（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ）の選定特定のグループ内の遺伝子の多様性を表す限定数の個体を最善の方法で選択し
た。選択した個体のセットはゲノタイプ用コレクションと呼ばれる。

【０１３２】選択されるグループはアレイの目的に応じて異なる。たとえば、アレイが育種
用に使用される場合は、個体は同じ種に属する様々な変種、系統、種属、栽培変
種、あるいは人種（品種）から選択される。

【０１３３】それぞれの個体の数は、ゲノタイプ用コレクションの性質、当該コレクション
の多様性、アレイに望まれるマーカーの数により異なる。通常、アレイは１から
１０の異なる個体からのマーカーを含む。

【０１３４】２．ゲノムＤＮＡの単離とＡＦＬＰテンプレートＤＮＡの調製ゲノムＤＮＡをゲノタイプ用コレクションの個体から単離し、各個体について
特定の制限酵素の組み合わせを用いて、図１０に示すようにＡＦＬＰテンプレー
トＤＮＡを調製する。これはそれぞれの個体について個別に、基本的には欧州特
許第０５３４８５８号に記載されているように、たとえばＡＦＬＰから既知の方
法により実施する。

【０１３５】制限酵素の組み合わせは前記のように、少なくとも１つのフリーケントカッタ
ーと少なくとも１種類のレアカッターを含み、使用するゲノタイプ用コレクショ
ンの種類（すなわち、属または種）に応じたものとする。

【０１３６】好ましい制限酵素の組み合わせ、すなわち最終的なフィンガープリントにおい
て情報を含む多形性バンドを提供するものは、経験またはいくつかのルーチン実
験をベースとして選択することができる。非限定的な例としては、ＥｃｏＲＩ／
ＭｓｅＩまたはＰｓｔＩ／ＴａｑＩがある。通常、従来のＡＦＬＰフィンガープ
リンティングにおいて情報を含む結果を与える制限酵素の組み合わせが判明して
いる場合は、その組み合わせもまた本発明のアレイを調製するために使用される
。

【０１３７】ゲノムＤＮＡが単離され、制限酵素コンビネーションで制限された後、得られ
たフラグメントにアダプターが付加され、ＡＦＬＰテンプレートＤＮＡが得られ
る。ここでも、従来のＡＦＬＰアダプターを、基本的に欧州特許第０５３４８５
８号に記載されているように、使用することができる。

【０１３８】３．増幅ゲノタイプ用コレクションから各個体のＤＮＡテンプレートを選択的プライマ
ーを使用して増幅する。

【０１３９】好ましくは、一連の関連ＡＦＬＰプライマーコンビネーション（以下「関連Ａ
ＰＣｓ」と呼ぶ）を用いてゲノタイプ用コレクションで多数回のＡＦＬＰ反応を
行う。本実施例に述べたＡＰＣｓを図９Ａ−９Ｄに概略的に示す。

【０１４０】関連ＡＰＣｓは同じ制限酵素コンビネーションとともに使用することができる
選択的ＡＦＬＰプライマーの組み合わせであり、選択性の少ないヌクレオチドと
対応するＡＰＣを用いて同時に増幅し、関連ＡＰＣｓから一時にすべてのＡＦＬ
Ｐフラグメントを得ることができる。ＡＰＣの一部を構成する各プライマーは、
下記を含む点において基本的に従来のＡＦＬＰプライマーと同じである：１）３’端に結合した、テンプレートのアダプター配列に対応する（すなわち
ハイブリダイズ可能な）配列：２）オリジナルゲノムＤＮＡの制限部位を制限酵素を使用して切断し、制限フ
ラグメントをアダプターに結合して得られるテンプレート配列の一部に対応する
（通常小さい）配列；３）プライマーの３’端に、数多くのいわゆる選択的塩基を含む（これについ
ては欧州特許第０５３４８５８号に詳述されている）。

【０１４１】ＡＰＣの各プライマーは模式的に、５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−ＲＲＲ−ＮＮＮ−３’ ここで、Ｎはアダプター配列に対応するヌクレオチド、Ｒは制限配列に対応する
ヌクレオチド、Ｎは選択的ヌクレオチド（ヌクレオチドＡ、ＲおよびＮの数は異
なり、図示したものと異なることがある）；あるいは［アダプター］−［制限酵素］−ＮＮＮただし、［アダプター］はアダプター配列、［制限酵素］は制限配列、Ｎは選択
的ヌクレオチド、と表すことができる。

【０１４２】各ＡＰＣは２種類のプライマー、すなわち、レアカッターのためのプライマー
とフリーケントカッターのためのプライマーを含む。一組のＡＰＣｓは、そうし
た２種類のプライマーＡＰＣｓを数多く含むことになる。

【０１４３】一組の関連ＡＰＣｓを提供するために、フリーケントカッターのプライマー、
レアカッターのプライマー、または両方のプライマーの３’端の最後の選択的塩
基は２種類またはそれ以上、好ましくは４つの塩基Ａ、Ｔ、ＧおよびＣのすべて
が異なるものとするのがよい。

【０１４４】ＡＰＣの２つのプライマーの１つの４つの塩基すべてが異なる場合、これは一
組の４つのＡＰＣｓを提供することになり、もしプライマーの両方が異なれば、
一組の１６種類のＡＰＣｓが得られることになる。そうした一組の関連ＡＦＬＰ
プライマーコンビネーションの例は：Ａ）制限酵素コンビネーションＥｃｏＲＩ−ＭｓｅＩ用の一組の４関連ＡＰＣ
ｓ（図９Ｂ）：［アダプター］−［EcoRI］−ＧＡＣ＋［アダプター］−［MseI］−ＴＣＡ［アダプター］−［EcoRI］−ＧＡＣ＋［アダプター］−［MseI］−ＴＣＣ［アダプター］−［EcoRI］−ＧＡＣ＋［アダプター］−［MseI］−ＴＣＧ［アダプター］−［EcoRI］−ＧＡＣ＋［アダプター］−［MseI］−ＴＣＴこれらのＡＰＣｓは制限酵素コンビネーションＥｃｏＲＩ−ＭｓｅＩとともに
使用することができ、ＥｃｏＲＩプライマーに選択的ヌクレオチドＧＡＣを、Ｍ
ｓｅＩプライマーのＴＣに選択的ヌクレオチドを共通して有する。これらの４つ
の関連ＡＰＣｓからのＡＦＬＰフラグメントは下記ＡＰＣの１つを用いて増幅す
ることができる。［アダプター］−［EcoRI］−ＧＡＣ＋［アダプター］−［MseI］−ＴＣ（図９
Ｂ）Ｂ）制限酵素コンビネーションＰｓｔＩ−ＴａｑＩ用の１６の関連ＡＰＣｓ
（図９Ｃ）：［アダプター］−［PstI］−ＣＡ＋［アダプター］−［TaqI］−ＡＧＡ［アダプター］−［PstI］−ＣＡ＋［アダプター］−［TaqI］−ＡＧＣ［アダプター］−［PstI］−ＣＡ＋［アダプター］−［TaqI］−ＡＧＧ［アダプター］−［PstI］−ＣＡ＋［アダプター］−［TaqI］−ＡＧＴ［アダプター］−［PstI］−ＣＣ＋［アダプター］−［TaqI］−ＡＧＡ［アダプター］−［PstI］−ＣＣ＋［アダプター］−［TaqI］−ＡＧＣ［アダプター］−［PstI］−ＣＣ＋［アダプター］−［TaqI］−ＡＧＧ［アダプター］−［PstI］−ＣＣ＋［アダプター］−［TaqI］−ＡＧＴ［アダプター］−［PstI］−ＣＧ＋［アダプター］−［TaqI］−ＡＧＡ［アダプター］−［PstI］−ＣＧ＋［アダプター］−［TaqI］−ＡＧＣ［アダプター］−［PstI］−ＣＧ＋［アダプター］−［TaqI］−ＡＧＧ［アダプター］−［PstI］−ＣＧ＋［アダプター］−［TaqI］−ＡＧＴ［アダプター］−［PstI］−ＣＴ＋［アダプター］−［TaqI］−ＡＧＡ［アダプター］−［PstI］−ＣＴ＋［アダプター］−［TaqI］−ＡＧＣ［アダプター］−［PstI］−ＣＴ＋［アダプター］−［TaqI］−ＡＧＧ［アダプター］−［PstI］−ＣＴ＋［アダプター］−［TaqI］−ＡＧＴこれらのＡＰＣｓは制限酵素コンビネーションＰｓｔＩ−ＴａｑＩとともに使
用することができ、いＩプライマーに選択的ヌクレオチドＣを、またＴａｑＩプ
ライマーに共通して選択的ヌクレオチドＡＧを有する。これらの４つの関連ＡＰ
ＣｓからのＡＦＬＰフラグメントは下記ＡＰＣを用いて一度に増幅することがで
きる。［アダプター］−［PstI］−ＣＡ＋［アダプター］−［TaqI］−ＡＧ（図９Ｄ
）好ましくは、１つのＡＰＣにおいては、１、２、３または４つの選択的ヌクレ
オチドを有するプライマーが使用される。さらに好ましくは、各ＡＰＣは２つの
＋３プライマー、または１つの＋３プライマーと１つの＋２プライマー、または
２つの＋２プライマーのコンビネーションを含む。

【０１４５】４．フィンガープリンティング関連ＡＰＣｓの適当なセットを選択した後、セットの１種類のＡＰＣを用いて
、ゲノタイプ用コレクションからの個体の制限ゲノムＤＮＡを増幅する。

【０１４６】これはゲノタイプ用コレクションのすべての個体について別々に、基本的に欧
州特許第０５３４８５８号に記載されているように、通常は並列的に実施して増
幅する。

【０１４７】ゲノタイプ用コレクションの各個体のそれぞれについて得られたＡＦＬＰ反応
物を次に配列用ゲルで並列解析する。電気泳動後、これらのゲルをホワットマン
３ＭＭペーパー上で乾燥し、ＡＦＬＰフィンガープリントを、たとえばオートラ
ジオグラフィーまたは燐映像法により視覚化する。

【０１４８】このようにしてゲノタイプ用コレクションの個体のＡＦＬＰフィンガープリン
トをフィンガープリント上に横並びに並べる。これを図１１に概略的に示すが、
ゲノタイプ用コレクションの４つの個体のＡＦＬＰ反応（“個体１”から“個体
４”、ゲルの左から右へ向かって対応するレーン）はゲル“ｐｋ１”から“ｐｋ
４”のそれぞれの４つの平行レーン中に視覚化されている（この中で各ゲルは４
つの関連ＡＰＣｓのセットからの異なるＡＰＣを用いて作られる）。

【０１４９】５．多形性バンドの同定ゲノタイプ用コレクションの個体のＡＦＬＰフィンガープリントはＤＮＡ多形
性を示すＡＦＬＰフラグメントの有無を検査する。そうしたＡＦＬＰフラグメン
トはＡＦＬＰマーカーと呼ばれる。これを再び図１１に略図で示すが、各マーカ
ーは円で囲まれている。各個体のフィンガープリントと同じバンドは選択されな
い。次にこれらのバンドをアレイ上に、以下に記述するように並べた。この方法
も図１２に概略的に示した。

【０１５０】６．ＡＦＬＰマーカーの単離ＡＦＬＰマーカーをゲルピースと付帯のホワットマン３ＭＭペーパーによりゲ
ルから切り取る。これは各マーカーについて別々に実施する。

【０１５１】７．精製、再増幅およびクローン化このようにして同定および単離したＡＦＬＰマーカーをそれぞれのゲルピース
から溶出させ、最初にＡＦＬＰフィンガープリントを作り出し、それからＡＦＬ
Ｐマーカーを作り出した時に使用したＡＦＬＰプライマー（つまり、ＡＰＣ）を
用いて別々に再増幅する。次に、このＡＦＬＰマーカーを標準手法により適当に
消化されたプラスミドベクター中にクローン化する。

【０１５２】８．ＡＦＬＰフラグメントライブラリーの作成関連ＡＰＣｓのセットのさまざまなＡＰＣｓについて、工程６および７の方法
を繰り返す。

【０１５３】これを図１１に示すが、その中ではｐｋ１からｐｋ４の各ゲルは、４つ（各ゲ
ルは各平行レーン中に、使用したＡＰＣにより得られたゲノタイプ用コレクショ
ンの１つの個体のフィンガープリントを含む）のセットからのＡＰＣｓの１種類
を用いて作り出す。

【０１５４】このようにしてゲノタイプ用コレクションを用いて同定されたＡＦＬＰマーカ
ーを含むＡＦＬＰフラグメントライブラリーを構築する。

【０１５５】実施例II：キャリヤの付加とアレイの形成ＡＦＬＰフラグメントライブラリーの個々のＡＦＬＰマーカーをキャリヤに付
加し、多くの異なるＡＦＬＰフラグメントを同じキャリヤに付加した。これは好
ましくは所定のパターンに基づいて実施し、たとえば特定のＡＰＣを有するゲノ
タイプ用コレクションから作り出したマーカーを、図１１に示すようなカラムの
形でグループ化する。

【０１５６】また、一組の関連ＡＰＣｓからの各ＡＰＣｓで作り出したマーカーをグループ
化し、図１１に示されているように一組のライン、列またはカラム、あるいは三
角形にする。

【０１５７】このようにしてＡＦＬＰマーカーのアレイをキャリヤ上に作り出す。高密度ア
レイの場合、それらのアレイはＡＦＬＰマイクロアレイと呼ばれる。通常、各Ａ
ＰＣは、ゲノタイプ用コレクションおよび使用する個体数に応じて、約１０−５
０のマーカーを提供することになる。

【０１５８】このようにして得たアレイは、実施例IIIに詳細が記述されているように、ア
レイに付加されたＡＦＬＰマーカーの存在によりさらなる個体のゲノムＤＮＡの
検出に使用することができる。通常、このさらなる個体はアレイを作り出すため
に使用したゲノタイプ用コレクションに属するか関連するもの、ないしは少なく
ともアレイ上に存在する１つ以上のマーカーをゲノム中に含む可能性があるもの
である。

【０１５９】実施例III：ＡＦＬＰマイクロアレイを使用したゲノタイピングこの方法は、実施例Ｉで記述した方法により得られたＡＦＬＰマイクロアレイ
を使用する。そうしたマイクロアレイは特定の属から取り出された複数のＡＦＬ
Ｐマーカーを含んでいる（一般的に、ＡＦＬＰマーカーは属特異性であり、かつ
異なる属から作り出されたＡＦＬＰマーカーは通常他の属からの個体のゲノタイ
ピングには使用できない）。

【０１６０】特定の個体のゲノタイピングは、テストする個体のＡＦＬＰマイクロアレイの
各ＡＦＬＰマーカーの存在の有無を調べることにより行うことができる。これは
たとえば個体からのＡＦＬＰフラグメントのコレクションを、マイクロアレイに
付加されたＡＦＬＰマーカーにハイブリダイズすることにより達成することがで
きる。

【０１６１】このＡＦＬＰフラグメントのコレクションは好ましくは対象とする個体から、
個体のＡＦＬＰテンプレートＤＮＡのＡＦＬＰ増幅により作り出される。このＡ
ＦＬＰフラグメントのコレクションは、ＡＦＬＰマイクロアレイ上のそれぞれの
相手にハイブリダイズしたＡＦＬＰフラグメントを検出できるように標識するこ
とができる。

【０１６２】一般に、この方法は以下の工程を含む。

【０１６３】１．ゲノムＤＮＡの単離とＡＦＬＰテンプレートＤＮＡの調製ゲノムＤＮＡをテストした個体から単離し、ＡＦＬＰテンプレートＤＮＡを調
製する。これは既知の方法により、基本的には欧州特許第０５３４８５８号に記
載されているように実施する。

【０１６４】好ましくは、アレイのテンプレートＤＮＡを作り出す時に使用したものと同じ
制限酵素コンビネーションを使用する。さらに好ましくは、実施例Ｉの工程２の
方法に類似した方法、すなわち同じまたは類似のプロトコルを使用する。

【０１６５】しかし、使用されるアダプターは、好ましくはそれらがアレイに結合した核酸
配列（もしあれば）中に存在するアダプター配列にハイブリダイズしないように
選択する。アダプター配列間のそのようなハイブリダイゼーションは、特に精度
の低いハイブリダイゼーション条件を使用した場合に、誤った陽信号（すなわち
、テストするサンプル中のＡＦＬＰマーカーの存在に対応しないもの）をもたら
すことがある。

【０１６６】これを避けるために、アレイでテストしようとするテンプレートＤＮＡの調製
においては、アレイを作り出すときに使用されるものとは異なるアダプターを使
用するのがよい。あるいは、かつ好ましくは、アレイへのマーカーの付加に先立
ち（しかし、通常は実施例Ｉの工程７の単離マーカーの増幅後に）、上記実施例
Ｉの工程６のゲルから単離したＡＦＬＰマーカー中に存在するアダプター配列を
除去するか、または他のアダプター配列と置き換える。これは実施例Ｉの手順７
で記述したＡＦＬＰフラグメントのクローン化中に行うことができる。

【０１６７】２．増幅および標識工程１で得られたテンプレートＤＮＡ上で、制限酵素コンビネーションに対応
するＡＰＣを用いて、選択したＡＰＣに特異性のＡＦＬＰフラグメントを作り出
すために単一のＡＦＬＰ反応を行う。

【０１６８】好ましくは、前記ＡＰＣはＡＦＬＰマイクロアレイ上のマーカーを作り出すた
めに使用した一組の関連ＡＰＣｓからのすべてのＡＰＣｓ、または少なくともそ
れらのサブセットを含むように選択する。通常、これは前記ＡＰＣの一方または
両方のプライマーが、一組の関連ＡＰＣｓのプライマーよりも選択性の低いヌク
レオチドを含むことを意味する。

【０１６９】通常、前記ＡＰＣのプライマーは上記実施例Ｉの工程３に示したようにアレイ
を作り出す時に使用された一組の関連ＡＰＣｓのプライマー中で異なる位置に選
択的塩基を含まない。前記ＡＰＣのプライマー中の残りの選択性塩基は、同じく
実施例Ｉの工程３で示したように、一組の関連ＡＰＣｓのプライマー中のものと
同じものである。

【０１７０】原理的には、前記ＡＰＣを使用して関連ＡＰＣｓセットを用いて別々に増幅さ
せたすべてのフラグメントを同時に増幅させることができる。したがって、工程
１のテンプレートＤＮＡ上の前記ＡＰＣを使用することにより、もしそうしたマ
ーカーがテストしようとするゲノムＤＮＡ中にも存在するとすれば、関連ＡＰＣ
ｓセットにより作り出されるすべてのマーカーを含む増幅フラグメント混合物を
作り出すことができる。

【０１７１】残りに関しては、増幅は既知の方法、たとえば基本的に欧州特許第０５３４８
５８号に記載されている方法により行い、好ましくは実施例Ｉの工程３に類似し
た方法、つまり同じまたは類似のプロトコルに従って行う。

【０１７２】増幅中または増幅後に、ＡＦＬＰフラグメントは末端標識ＡＦＬＰプライマー
を用いて、あるいは内部標識により標識を付ける。この標識は蛍光標識、放射性
標識、あるいはマイクロアレイ上での検出に好適なその他のタイプの標識とする
ことができる。

【０１７３】３．アレイへのハイブリダイゼーション選択したＡＰＣにより作り出した標識したＡＦＬＰフラグメントは、ＡＦＬＰ
マイクロアレイ上のＡＦＬＰフラグメントへのハイブリダイゼーションにおける
プローブとして使用される。標識したＡＦＬＰフラグメントのコレクションはＡ
ＦＬＰターゲットと呼ばれる。ＡＦＬＰマイクロアレイ上にあるＡＦＬＰマーカ
ーは、これらのＡＦＬＰマーカーが選択された個体に存在する場合、ＡＦＬＰタ
ーゲット中のそれぞれの標識された相手にハイブリダイズする。その結果、テス
トした個体中に存在するマーカーに対応するアレイ上のＡＦＬＰマーカーはそれ
ぞれの標識相手にハイブリダイズし、アレイ上に陽のハイブリダイゼーション信
号をもたらす（つまり、標識の存在を示す）。

【０１７４】テストした個体中に存在しないアレイ上のＡＦＬＰマーカーは、増幅されたサ
ンプル中には対応する標識された配列を見つけることができず、したがって陽の
信号は与えない。

【０１７５】４．アレイの走査、検出および分析ハイブリダイゼーション後に、ＡＦＬＰマイクロアレイは視覚的にまたは自動
化された装置を用いて走査する。個体中に存在するＡＦＬＰマーカーを包み込ん
だ各スポットは標識の存在を示し、個体中に存在しないＡＦＬＰマーカーを表す
スポットは標識されない。このようにしてテストした個体中のＡＦＬＰマイクロ
アレイ上の各ＡＦＬＰマーカーの存在の有無を評価することができる。これらの
結果はまた同じアレイで得られた以前の結果との比較によりさらに検証したり、
将来の参考用にデータベースに蓄えられる。

【０１７６】実施例IV：マイクロアレイに使用するためのＡＦＬＰフラグメントの作成手順この方法は通常以下の工程を含む。１．ＡＦＬＰゲルからのフラグメントの単離２．制限部位を再構築するプライマーを用いて単離したフラグメントを再増幅３．再増幅生成物の精製と消化４．ｐＵＣベクター中へのフラグメントのクローン化５．クローン化フラグメントのフィンガープリンティング・プールによるクロー
ンフラグメント（コロニーＰＣＲを用いて得られた）の確認、およびこのように
して得たフィンガープリントを工程１で使用したオリジナル・フィンガープリン
トと比較１．ゲルからのＡＦＬＰフラグメントの単離ＡＦＬＰ反応を、１０ｎｇＭｓｅプライマーとレアカッター用の３０ｎｇの
プライマー（そのうち５ｎｇは³³Ｐγ−ｄ−ＡＴＰでキナーゼ化）を使用して行
った。このＡＦＬＰ反応は、標準４．５％勾配ゲル上で行った。ゲルはホワット
マン−３ＭＭペーパーに移し乾燥した。乾燥したゲルは感光性写真フィルムで露
光した（＞ｏ／ｎ）。マイクロアレイ上にスポットされたフラグメントをゲルか
ら薄片（約１ｍｍ）として切り取り、１００μｌのＴＥ_0.1に移した。

【０１７７】２．再増幅ＥｃｏＲＩ＋Ａ／ＭｓｅＩ＋Ｃフラグメントを、制限部位を再構築する下記の
プライマー９８Ｌ１９および９８Ｌ２０を用いて再増幅した。

【０１７８】（９８Ｌ１９＝配列ＩＤ１；Ｅ０１＝配列ＩＤ２；９８Ｌ２０＝配列ＩＤ３；Ｍ
０２＝配列ＩＤ４）ＰＣＲ反応混合物は以下の通り：溶出液５μｌ；９８Ｌ１９１５０ｎｇ；９
８Ｌ２０１５０ｎｇ；５ｍＭｄＮＴＰ２μｌ；１０ｘＰＣＲ緩衝液５μ
ｌ；Ｔａｑポリメラーゼ０．２Ｕ、合計数量５０μｌ。ＰＣＲプロファイルは
以下の通り；３０秒９４℃：３０秒５６℃：１分７２℃、で３０サイクル
。

【０１７９】ＰｓｔＩ＋Ａ／ＭｓｅＩ＋Ｃフラグメントはプライマー９８／Ｌ８８と９８／
Ｌ２０を用いて再増幅した。

【０１８０】（９８Ｌ８８＝配列ＩＤ５；Ｐ０１＝配列ＩＤ６；Ｐｓ０１＝配列ＩＤ７）また
は任意に９８Ｌ８９／９８Ｌ２０を用いる。

【０１８１】（９８Ｌ８９＝配列ＩＤ８；Ｐ００＝配列ＩＤ９）３．再増幅フラグメントの精製と消化ＰＣＲ反応は、キアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）９６穴ＰＣＲ遠心分離キッ
ト（キアゲン：Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造会社のプロトコルに従って精製した
。

【０１８２】溶出工程は８０μｌの溶出緩衝液を用い、最終容量が約５０μｌになるように
行った。溶出液はマイクロ滴定プレート上に集めた。精製したＰＣＲ生成物は、
５Ｕのレアカッター酵素、５ＵのＭｓｅＩを加えて、合計容量が７４μｌ１ｘ
ＲＬ＋になるようにして制限し、この混合物を３７℃で２時間インキュベートし
た。この制限／消化の後、（マイクロ滴定プレート上の）ＤＮＡは、７．５μｌ
の３ＭＮａＯＡｃ、８０μｌのイソプロパノールを加えることによりイソプロ
パノールで沈降させ、また混合物は室温で１５時間保持し、その後４５分間遠心
分離（３５００ｒｐｍ）した。余剰のイソプロパノールを除去し、マイクロ滴定
プレートを再び遠心分離（１０００ｒｐｍで１０秒間）した。ペレット（目視で
きない）を１５μｌのＴＥ０．１に取り、３μｌのアリコートを２％寒天ゲル上
で検査した。

【０１８３】４．再増幅フラグメントのクローン化結合反応は下記の混合物中で実施した：７μｌの再増幅生成物（ＰＣＲベース
；８μｌの結合用混合物；１００ｎｇのＰｓｔＩ−またはＥｃｏＲＩ／ＮｄｅＩ
−制限、ゲル精製ｐＵＣ１８；３μｌの５ＸＲＬ＋；１．５μｌの１０ｍＭ
ＡＴＰ；１ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼの合計８μｌ。混合物は室温でインキュベー
ト（ｏ／ｎ）した。

【０１８４】トランスフォーメーション（ＰＣＲベース）は以下のように行った。７．５μ
ｌの結合反応物を氷上に置き、５０μｌの冷凍コンピテントＤＨ５α細胞を添加
（氷上）し、混合物を３０分間インキュベート（氷上）した。次にこの混合物に
９０秒間熱ショック（４２℃）を与え、氷上で２分間保持し、その後２００μｌ
のＴＹ培地を添加し、その混合物を回収した（３７℃で１時間）。この混合物の
２００μｌをＴＹ＋カルベネニシリン寒天プレート上に置き、３７℃でインキュ
ベート（ｏ／ｎ）した。

【０１８５】５．再増幅とクローン化フラグメントの確認下記の再増幅プライマーを使用した。 −レアカッター側：９８Ｌ５８：ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴ
ＴＡＣ（ｐＵＣ１８プライマー、配列ＩＤ１０） −ＮｄｅＩ側：９８Ｌ５５：ＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＡ
ＡＣ（ｐＵＣ１８プライマー、再構築したＭｓｅＩ部位付き、Ｍｓｅ＋Ｃの場合
のみ、配列ＩＤ１１）各クローンフラグメントについて３種類の異なるクローンを１０μｌＴＹに接
種した後、３７℃でインキュベートした（ｏ／ｎ）。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を１穴当
たり５０μｌのＴＥ０．１を用いて９６穴プレートに移し、５μｌをＰＣＲベー
スに移した。このＰＣＲベースを９５℃で５分間インキュベートし、その後４５
μｌのＰＣＲ混合物を添加した。このＰＣＲ混合物は、７５ｎｇのプライマー９
８Ｌ５８；７５ｎｇのプライマー９８Ｌ５５；２μｌの５ｍＭｄＮＴＰ；５μ
ｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液；０．２５μｌのＴａｑポリメラーゼ；０．８５μｌの
１０ｍｇ／ｍｌＤＳＡを含み、合計４５μｌである。ＰＣＲプロファイルは以
下の通り；２５秒、９４℃；３０秒、５６℃；１分、７２℃；を３０サイクル。
５μｌの混合物をゲル上でチェックした。

【０１８６】フラグメントを得た各ＡＰＣについて３つのプールを作った。プールＡはフラ
グメント１、４、７、１０．．．を含み；プールＢはフラグメント２、５、８、
１１．．．を含み；プールＣはフラグメント３、６、９、１２．．．を含む。各
クローンについて５μｌのコロニーＰＣＲ材料をプールし、５μｌの各プールを
テンプレート調製に使用した（標準ＡＦＬＰテンプレート）。

【０１８７】このテンプレートを標準ＡＦＬＰ反応の１／１０稀釈したプール・テンプレー
トによりチェックし、そのフィンガープリントをオリジナルフラグメントから得
たフィンガープリントと比較した。

【０１８８】実施例V：マイクロアレイを使用してＡＦＬＰフラグメントを検出するための
プロトコルマイクロアレイの調製マイクロアレイはｐＵＣ１８特異性プライマーを使用してコロニーＰＣＲを経
由して合成したＤＮＡプローブを用いて調製した。アレイの調製においては、濃
度約０．５μｇ／μｌのＤＮＡ溶液を使用した。稀釈コロニーＰＣＲ材料をプロ
ーブＤＮＡの通常の合成に使用した。

【０１８９】１．プローブの増幅できるだけ少ない数量でできるだけ多くのＤＮＡを合成するために、従来のＰ
ＣＲプロトコルの修正法を用いた（プライマーを増量し、ｄＮＴＰおよびＭｇＣ
ｌ₂を添加）。ＰＣＲ混合物は以下の通りである：５μｌの１／４００プリアン
プ；６．３μｌのプライマー１（５０ｎｇ／μｌ）；６．３μｌのプライマー２
（５０ｎｇ／μｌ）；８．４μｌのｄＮＴＰ（５ｍＭ）；３．３６μｌのＭｇＣ
ｌ₂（２５ｍＭ）；１０．５μｌのＰＣＲ緩衝液（１０ｘ）；０．５２５μｌの
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）；最終容量１０５μｌになるよう水
を添加。ＰＣＲプロファイルは以下の通り：３０秒、９４℃；３０秒、５５℃；
１分、７２℃；３０サイクル；ＰＥ９６００モード。ゲルレファレンスは２％寒
天ゲル上の２．５μｌＰＣＲ。以下のプライマーを使用した；標準：９８Ｌ５５
＋９８Ｌ５８；５’ＮＨ２を含むもの：９８Ｌ５９（ＮＨ₂）＋９８Ｌ５８ＮＨ₂ ；５’Ｃｙ−３および内部ＮＨ₂を含むもの：９８Ｌ５９（Ｃｙ−３、ＮＨ₂）＋
９８Ｌ５８（Ｃｙ−３、ＮＨ２）。

【０１９０】各プライマーを３１５ｎｇとした場合、理論的には８μｇの生成物が１０５μ
ｌＰＣＲの反応で形成される（平均フラグメント長さを２５０ｂｐ、かつすべて
のプライマーが使用されると仮定して）。ＰＣＲ効率が８０％の場合、６．４μ
ｇの生成物が合成される。したがって、５０μｌの生成物を約０．５μｇ／μｌ
の濃度で得るためには、１０５μｌの３回のＰＣＲ反応が必要である。

【０１９１】２．ＰＣＲ反応の沈降ＰＣＲ反応の沈降は以下のように行った。３ｘ１０５μｌＰＣＲ反応＋３１
．５μｌ（１／１０容量）の３ＭＮａＡｃに、３４６μｌ（１容量）の２−プ
ロパノールを加え、この混合物を−２０℃で３０分間保持した。この混合物を次
に遠心分離（３０分、１３０００ｒｐｍ、４℃）し、ペレットを１００μｌの７
０％ＥｔＯＨで洗浄した。この混合物を再び遠心分離（１０分、１３０００ｒｐ
ｍ、室温）し、ペレットを空気乾燥し、２５μｌのＨ₂Ｏに溶解させ、２５μｌ
のＤＭＳＯを加えた。基準ゲルとして２％寒天ゲル上の０．５μｌを使用した。

【０１９２】３．アレイの調製アレイを調製（プリント）するために、ＧＭＳ４１７アレイヤー（ジェネテ
ィックマイクロシステムズ）を使用した。そうしたアレイヤーは変数の多さに
応じて構成することができる。予備テストにおいては、多くの標準セッティング
を使用し、使用可能なすべてのアレイのレイアウトを作った。スポットの特定の
ための良い方法は、プローブを作るのに標識プライマー−特にＣｙ−３またはＣ
ｙ−５プライマー−を使用することである。これによりプリントした配列（“ス
ポット”）の位置は、アレイをスキャンすることにより明確に見えることとなり
、かつアレイへの付着および結合をモニターするための対照とすることができる
。使用したスライドはＥＭＳポリ−Ｌ−リシンスライド（エレクトロンマイクロ
スコピーサイエンシーズ、ワシントン）である。

【０１９３】スライドのプリンティングは以下のように行った。ａ）スライドの位置： −スライド上のマットグラス片を左側（クランプに対して） −スライドを互いに圧接するｂ）マイクロ滴定プレートの位置 −プレートのＡｌ軸をプレートホルダーの左側先端。ｃ）アレイヤーのセッティング：１ｘスポッティングＸ＝３Ｙ＝１５、デュプロＸ＝７．４Ｙ＝１５５ｘスポッティングＸ＝３Ｙ＝１９、デュプロＸ＝７．４Ｙ＝１５スポットスペース：３００μｍ−３５０μｍプローブＤＮＡの蒸発を制限するために、マイクロ滴定プレートは温水浴上に
保持することができる。

【０１９４】４．アレイの処理アレイの処理中、ＤＮＡはグラスキャリヤに付着させ、スライドとコーティン
グの種類に応じて変性させた。ＥＭＳポリ−Ｌ−リシンスライドの処理はＰ．ブ
ラウン（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／
ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／３ｐｏｓｔｐｒｏｃｅｓｓ．ｈｔｍｌ）に記述された
方法により実施した。

【０１９５】スライドは熱湯浴上で１分間再水和させてスライドを曇らせ、そして加熱調理
プレート上で瞬間乾燥（約３秒）させた。このスライドを次に１０秒間再水和さ
せ、６５ｍＪでＵＶクロスリンク（アマーシャムＵＶクロスリンカー、６５０ｘ
１００μＪ）させ、緩やかな撹拌をしながらブロック用溶液中で１５−２０分間
インキュベート（グラストレイ中で）した。ブロック用溶液は３２５ｍｌの１−
メチル−２−ピロリドン（１００ｍｌ）；６ｇの無水クエン酸（１．８ｇ）およ
び１５ｍｌのホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．０）（４．０ｍｌ）を包含する。この
スライドをＨ₂Ｏ（９５℃）中で２分間洗浄し；９６％エタノール中で１分間洗
浄し；そして１０００ｒｐｍの卓上遠心分離器で５分間遠心分離することにより
乾燥させた。

【０１９６】５．ターゲット反応の標識ターゲットＤＮＡの標識のためにはいくつかの方法を使用することができる。

【０１９７】ここでは、クレノウＤＮＡポリメラーゼを用いてＣｙ−３またはＣｙ−５標識
ｄＣＴＰ分子を酵素的にターゲットＤＮＡに組み込む標識法を用いた。

【０１９８】ＰＣＲ反応は以下の通りである：ＰＣＲ反応：５μｌの１／４００プリアンプ
または５μｌの１：１０ＡＦＬＰテンプレート；６．３μｌのプライマー１（
５０ｎｇ／μｌ）；６．３μｌのプライマー２（５０ｎｇ／μｌ）；３．３６μ
ｌのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）；８．４μｌのｄＮＴＰ（５ｍＭ）：１０．５μｌ
のＰｃｒ緩衝液（１０ｘ）；０．５２５μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５
Ｍ／μｌ）；および最終容量１０５μｌになるまでＨ₂Ｏを加える。ＰＣＲプロ
ファイルはＡＦＬＰ伸長反応に応じて異なる。もし１種類だけの選択的ヌクレオ
チドが使用される場合、安定したプロファイルが使用される。たとえば、３０秒
、５５℃；１分、７２℃；で３０サイクル、ＰＥ９６００モード、である。１種
類以上の選択的ヌクレオチドを使用する場合は、標準ＡＦＬＰプロファイル（タ
ッチダウンとともに）が使用される。たとえば、３０秒、９４℃；３０秒、６５
℃ １サイクル；１分、７２℃；次いで、アニーリング温度を低下させることに
より０．７℃で１２サイクル（合計１３サイクルのタッチダウン）；３０秒、９
５℃；３０秒、５６℃−２３サイクル；１分、７２℃である。

【０１９９】ターゲット反応は以下のように沈降させる。１０μｌ（１／１０用量）の３Ｍ
ＮａＡｃを１００μｌのターゲットＰＣＲ反応に加える。１１０μｌ（１用量
）の２−プロパノールを加え、混合物を３０分間−２０℃に保つ。この混合物を
次に遠心分離（１３０００ｒｐｍ、４℃で３０分間）し、ペレットを１００μｌ
の７０％ＥｔＯＨで洗浄し、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、室温で１０分間）す
る。このペレットを乾燥して室温にし、１０μｌのＨ₂Ｏ中に入れる。

【０２００】クレノウＤＮＡポリメラーゼを使用する標識ターゲットＤＮＡの調製は以下の
ように行った。５μｌのターゲットＤＮＡ（約３−６μｌのＡＦＬＰ反応）およ
び２．５μｌのＡＦＬＰプライマー（１μｇ／μｌ）をＨ₂Ｏに加えて合計容量
を２０μｌとし、この混合物を９５℃で５分間保持し、次に室温まで冷却する。
次にＣｙ−３またはＣｙ−５標識を有する５μｌのｄＣＴＰ（０．５ｍＭ）；各
１μｌの５ｍＭｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；５μｌの１０ｘＴ４緩衝液；
２．５μｌのクレノウＤＮＡＰｏｌ（８ｕ／μｌ）および１６．５μｌのＨ２
Ｏを加え、混合物を３７℃で２時間インキュベートする。

【０２０１】標識ターゲット反応はキアクイック・カラムを用いて製造会社の指示に基づい
て精製する。溶出は５０μｌの溶出緩衝液中に行う。ペレットは明確に染色しな
ければならず、クレノウターゲットの場合は１８μｌＨ₂Ｏ中に、またミルスタ
ーゲットの場合は１５μｌＨ₂Ｏ中に溶解する。

【０２０２】８．ハイブリダイゼーション標識ターゲットの変性は、１．５μｌの変性緩衝液Ｄ１（３ＭＮａＯＨ）を
加え、その後混合液を室温で５分間保持し、次いで氷の上に置いてその上に１．
５μｌの中和緩衝液Ｎ１（１ＭトリスｐＨ７．３、３ＭＨＣｌ）を加えること
により行った。

【０２０３】次に、４ｘＳＳＣ、５ｘデンハート、０．５％ＳＤＳを含む１８μｌの２ｘ
ハイブリダイゼーション緩衝液（予熱）を６０℃で加え、その後３０μｌのター
ゲット溶液をピペットを用いてスライドへ、次いでアレイに加えることにより、
ハイブリダイゼーションを開始した。カバーグラス（２４ｘ５０ｍｍ）を所定の
位置に（気泡なしで）置き、またスライドをシングルインキュベーションチャン
バー内（この場合は２滴の１０μｌ３ｘＳＳＣを添加）、または水を含む大き
なインキュベーションタンク内で、４５℃でインキュベート（ｏ／ｎ）した。

【０２０４】ハイブリダイゼーションをしたものを４ｘＳＳＣ０．１％ＳＤＳ（４５℃）
でリンス洗浄し；２ｘＳＳＣ０．１％ＳＤＳ中で約５分間インキュベート（４
５℃）；１ｘＳＳＣ０．１％ＳＤＳで５分間インキュベート（室温）；０．５
ｘＳＳＣ０．１％ＳＤＳで５分間インキュベート（室温）し；０．５ｘＳＳＣ
（室温）中で２分間インキュベートし；その後卓上遠心分離器で１０分間遠心分
離（５００ｒｐｍ）した。

【０２０５】９．走査アレイはジェネテック１０００スキャナー（ジェノミックソリューションズ
：ＧｅｎｏｍｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）を用いて走査した。アレイはキセノン
ランプで照射し、シグナルはＣＣＤカメラを用いて検出した。Ｃｙ−３およびＣ
ｙ−５用のフィルターを使用した。走査時間は約１８０秒とした。

【０２０６】実施例VI：マイクロアレイ上のＡＦＬＰマーカーの検出実施例ＶＩ−１：２０のイネ＋２／＋３ＡＦＬＰマーカーを含むアレイ上の５
種類のイネ＋２／＋３ＡＦＬＰマーカー混合物の検出制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＭｓｅＩと親系統ＩＲ２０および６３８３を使用し
て作り出したクローン化ＡＦＬＰマーカーから２０のイネ＋２／＋３ＡＦＬＰマ
ーカー（プローブ）のアレイを調製した。このＡＦＬＰマーカーの名称、使用し
たＡＦＬＰプライマーコンビネーション（ＰＣ）、推定モビリティ（塩基対中の
サイズ）およびこれら２０のＡＦＬＰマーカーの親オリジンは以下の通りである
。

【０２０７】これら２０のＡＦＬＰマーカーを作り出すために使用した＋２／＋３ＡＦＬＰ
プライマーの配列は次のとおり：

【０２０８】２０のＡＦＬＰ＋２／＋３マーカーを単離するために使用したＡＦＬＰ反応を
作り出し、標準手法（ヴォスら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃ
ｈ２３；４４０７−４４１４、１９９５および欧州特許第０５３４８５８号）
を用いて配列用ゲル上に溶解させた。このＡＦＬＰマーカーはホワットマンペー
パーに移し替えた後シーケンスゲルから切り取り、乾燥させ、Ｘ線フィルムに露
光してフィンガープリントパターンを視覚化し、下記のプライマーをプロトコル
に記述されているように使用して増幅させた。

【０２０９】ＥｃｏＲＩとＭｓｅＩを使用して切断し、キアゲンＰＣＲ精製キット（キアゲ
ン）を用いて精製した後、制限ＡＦＬＰマーカーフラグメントを、ＥｃｏＲＩと
ＮｄｅＩで消化したプラスミドベクター中にクローン化した。Ｅ．ｃｏｌｉにト
ランスフォーメーションした後、リコンビナントクローンは、プールされた増殖
クローンインサートのＡＦＬＰフィンガープリント分析により正しいサイズのイ
ンサートであることを確認した。確認されたインサートを持つクローンのインサ
ートを、標準染色ターミネーターサイクル配列キット（ＡＢＩ）を製造会社の標
準プロトコルに従って用いて配列した。

【０２１０】個々の確認クローンのインサートＤＮＡｓを、無標識ベクタープライマーまた
はＣｙ３−標識ベクタープライマーのいずれかを説明通り（添付のプロトコル参
照）に用いて、ＰＣＲによりバクテリアのストックから増殖し、またＰＣＲ反応
はｎ−プロパノールおよび重炭酸ナトリウムを用いて標準手法により沈降した。
ＤＮＡｓは最終濃度が約５００ナノグラム／μｌになるように５０％ＤＭＳＯに
再懸濁させた。

【０２１１】マイクロアレイはＧＭＳ４１７マイクロアレイヤー（ジェネティックマイク
ロシステムズ、マサチューセッツ州ウォーバーン）を用いて、デュプロ中に無標
識またはＣｙ３−標識ＤＮＡ溶液のいずれかをＥＭＳポリ−Ｌ−リシンスライド
（エレクトロンマイクロスコピーサイエンシーズ、ワシントン）上に約２５０ピ
コリットル（１回スポッティング）沈積させて調製した。スライドは標準手法（
添付のプロトコル参照）に基づいて処理し、標準手法（添付のプロトコル参照）
に基づいてクレノウ酵素によりＣｙ５染料（アマーシャムファルマシアバイ
オテック：ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃ）で標識した
後、前記の８、１０、１５、１７、および１９の５つのＡＦＬＰマーカー（ター
ゲット）の混合物に、温度４５℃で一昼夜ハイブリダイズした。プロトコルに従
って洗浄した後、このスライドをジェネタック１０００マイクロアレイスライ
ドスキャナー（ジェノミックソリューションズ、ミシガン州アンアーバー）
を用いて自動露光モードでＣｙ３チャンネルで３００秒間走査（図１Ｂ）し、ま
たＣｙ−５チャンネルで走査（自動、図１Ｃ）した。

【０２１２】両方のチャンネルを重ね合わせた影像を図１Ａに、スポッティングパターンの
解釈を容易にするために注釈付きで示した。図１は、１）すべてのＡＦＬＰプローブの均一な沈着（ハイブリダイゼーション後の疑
似色影像上のすべてのプローブの赤、緑または黄色信号）、２）予期された５つのＡＦＬＰプローブ８、１０、１５、１７および１９に対
する特異性のハイブリダイゼーション（Ｃｙ５チャンネル、疑似色影像上の緑と
；疑似色影像上のＣｙ３−標識フラグメントの黄色のコンビネーション）、３）残りの１５のＡＦＬＰプローブ１、２、３、４、５、６、７、９、１１、
１２、１３、１４、１６、１８および２０に対するハイブリダイゼーションがな
いこと、を示している。

【０２１３】実施例VI−２：１０のイネ＋２／＋３ＡＦＬＰマーカーを含むアレイ上の＋２
／＋３ＡＦＬＰ反応で増幅されたイネＡＦＬＰマーカーの検出１０のイネＡＦＬＰマーカー（プローブ）を含むアレイを実施例ＶＩ−１に記
述されているものと同一の方法で調製した。このアレイを記述した通りに処理し
、親系統６３８３およびＩＲ２０から、ＡＦＬＰプライマーＥ１１およびＭ４９
を用いて調製したＣｙ５−標識ＡＦＬＰ＋２／＋３反応（ターゲット）の混合物
を含むターゲットにハイブリダイズした。このプライマーコンビネーションを使
用した場合、実施例ＶＩ−１に記述したように、親系統ＩＲ２０はＡＦＬＰマー
カー６、８および１０を含むことが分っており、また系統６３８３はＡＦＬＰマ
ーカー１４、１６、１８および２０を含むことが分っている。このアレイを実施
例ＶＩ−１に記述した条件または実施例ＶＩ−１で引用したプロトコルに従って
洗浄した。

【０２１４】洗浄後、実施例ＶＩ−１に記述したようにＣｙ３（図２Ｂ）およびＣｙ５（図
２Ｃ）チャンネルで影像を撮影し、２つの影像を電子的に重ね合わせた（図２Ａ
）。図２はスポッティングパターンの解釈を容易にするために注釈を付けている
が、１）すべてのＡＦＬＰプローブの均一な沈着（ハイブリダイゼーション後の疑
似色影像上のすべてのプローブの赤、緑または黄色信号）、２）ＩＲ２０と６３８３のＡＦＬＰマーカー６、８、１０、１４、１６、１８
および２０の特異性のハイブリダイゼーション；Ｃｙ５、無標識プローブにハイ
ブリダイズした疑似色影像上の緑色およびＣｙ３−標識プローブにハイブリダイ
ズした疑似色影像上の緑色／黄色シグナル、３）残りのＡＦＬＰマーカー２、４および１２に対するハイブリダイゼーショ
ンがないこと；Ｃｙ３、疑似色影像上の赤色シグナル、を示している。

【０２１５】実施例VI−３：２０のイネ＋２／＋３ＡＦＬＰマーカーを含むアレイ上の＋２
／＋２ＡＦＬＰ反応で増幅されたイネＡＦＬＰマーカーの検出２０のイネＡＦＬＰマーカー（プローブ）を含むアレイを実施例ＶＩ−１に記
述したものと同一の方法で調製した。このアレイを記述した通りに処理し、ＡＦ
ＬＰプライマーＥ１１およびＭ１５：５‘−ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡ
ＣＡ−３’（配列ＩＤ１８）を用いて調製した、親系統６３８３由来のＣｙ５−
標識ＡＦＬＰ＋２／＋２反応（ターゲット）を用いてハイブリダイズした。この
親系統は実施例ＶＩ−１に記述したように、１１、１２、１３、１４、１５、１
６、１７、１８、１９および２０のＡＦＬＰマーカーを含むことが分っている。
このアレイを実施例ＶＩ−１に記述した条件または実施例ＶＩ−１で引用したプ
ロトコルに従って洗浄した。

【０２１６】洗浄後、実施例ＶＩ−１に記述したようにＣｙ３（図３Ｂ）およびＣｙ５（図
３Ｃ）チャンネルで影像を撮影し、２つの影像を電子的に重ね合わせた（図３Ａ
）。重ね合わせた影像は図３Ａにスポッティングパターンの解釈を容易にするた
めに注釈を付けて示した。図３は、１）すべてのＡＦＬＰプローブの均一な沈着（疑似色影像上の赤、緑または黄
色）、２）位置１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０
のＡＦＬＰマーカーに対する特異性のハイブリダイゼーション（Ｃｙ５、疑似色
影像上の緑色シグナル；およびＣｙ３−標識プローブの疑似色影像上の黄色シグ
ナル）、３）おそらくは位置Ａ２およびＡ３のＩＲ２０マーカーとの配列相似性による
ＡＦＬＰフラグメントと、６３８３ＡＦＬＰテンプレートからのＡＦＬＰプラ
イマーコンビネーションＥ１１／Ｍ１５との同時増幅による、位置２および３の
ＩＲ２０由来のＡＦＬＰプローブへの（交叉）ハイブリダイゼーション（Ｃｙ５
；疑似色影像上の緑色シグナル）、４）残りの８つのＩＲ由来ＡＦＬＰプローブ１、４、５、６、７、８、９およ
び１０に対するハイブリダイゼーションがないこと、を示している。

【０２１７】実施例VI−４：２０のイネＡＦＬＰマーカーを含むアレイ上の＋２／＋２ＡＦ
ＬＰ反応で増幅されたイネＡＦＬＰマーカーの検出２０のイネＡＦＬＰマーカー（プローブ）を含むアレイを実施例ＶＩ−１に記
述したものと同一の方法で調製した。このアレイを記述した通りに処理し、ＡＦ
ＬＰプライマーＥ１１およびＭ１５を用いて調製した親系統ＩＲ２０由来のＣｙ
３−標識ＡＦＬＰ＋２／＋２反応（ターゲット）と、同じくＡＦＬＰプライマー
コンビネーションＥ１１およびＭ１５を用いて調製した親系統６３８３由来のＣ
ｙ５−標識ＡＦＬＰ＋２／＋２反応の混合物で構成されるターゲットを用いてハ
イブリダイズした（プライマーの配列については実施例ＶＩ−２参照）。この親
系統ＩＲ２０は実施例ＶＩ−１に記述したように、ＡＦＬＰマーカー１、２、３
、４、５、６、７、８、９および１０を含み、また６３８３はＡＦＬＰマーカー
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０を含むこと
が分っている。このアレイを実施例ＶＩ−１に記述した条件または実施例ＶＩ−
１で引用したプロトコルに従って洗浄した。

【０２１８】洗浄後、Ｃｙ３（図４Ｂ）およびＣｙ５（図４Ｃ）チャンネルで、両方とも露
光時間１８０秒で影像を撮影し、２つの影像を電子的に重ね合わせた（図４Ａ）
。両チャンネルを重ね合わせた影像は図４にスポッティングパターンの解釈を容
易にするための注釈を付けて示されている。図４は、１）すべてのＡＦＬＰプローブの均一な沈着（ハイブリダイゼーション後の疑
似色影像上のすべてのプローブの赤、緑または黄色信号）、２）ＩＲ２０ＡＦＬＰマーカー１、４、６、７、９および１０の特異性ハイブ
リダイゼーション；Ｃｙ３、疑似色影像上の赤色、３）６３８３ＡＦＬＰマーカー１１、１４、１５、１７、および２０の特異性
ハイブリダイゼーション；Ｃｙ５、疑似色影像上の緑色、４）ＩＲ２０と６３８３両方のＡＦＬＰマーカー２、３、１２、１３および１
８の特異性ハイブリダイゼーション；疑似色影像上の黄色、５）プローブ５、８、１６および１９に対するハイブリダイゼーションがない
こと、を示している。

【０２１９】実施例VI−５：４８のトウモロコシ＋３／＋３ＡＦＬＰマーカーを含むアレイ
上のトウモロコシ＋３／＋３ＡＦＬＰマーカーの検出４８のトウモロコシ＋２／＋３ＡＦＬＰマーカー（プローブ）のアレイを、制
限酵素ＥｃｏＲＩとＭｓｅＩならびに親系統Ｂ７３、Ｍｏ１７、Ｆ２、Ｃｏ２５
５、ＤＫ１０５およびＡ７を用いて作り出したクローン化ＡＦＬＰマーカーから
調製した。このＡＦＬＰマーカーの名称、使用したＡＦＬＰプライマーコンビネ
ーション（ＰＣ）、推定モビリティ（塩基対中のサイズ）およびこれら４８のＡ
ＦＬＰマーカーの親オリジンは以下の通りである：

【０２２０】

【０２２１】これら４８のＡＦＬＰマーカーを作り出すために使用した＋２／＋３ＡＦＬＰ
マーカーの配列は以下の通りである：Ｅ３３：ＥｃｏＲＩ：５’ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡＧ−３’（配
列ＩＤ１９）Ｍ５０：ＭｓｅＩ：５’ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＡＴ−３’（配列
ＩＤ２０）この４８の＋３／＋３ＡＦＬＰマーカーを単離するために使用したＡＦＬＰ反
応を実施例ＶＩ−１のプロトコルに記述したように作り、切断し、精製し、確認
した。標準染色ターミネーターサイクル配列キット（ＡＢＩ）を製造会社の標準
プロトコル通り用いて、確認されたインサートを持つクローンのインサートを配
列した。

【０２２２】個々の確認クローンのインサートＤＮＡｓを、実施例ＶＩ−１に記述したよう
に無標識ベクタープライマーまたはＣｙ３−標識ベクタープライマーのいずれか
を用いて、ＰＣＲによりバクテリアのストックから増殖した。

【０２２３】ＰＣＲ反応を実施例ＶＩ−１のプロトコルに記述されているように沈降および
溶解した。マイクロアレイは、無標識またはＣｙ３−標識ＤＮＡ溶液のいずれか
を約２５０ピコリットル（１回スポット）または１２５０ピコリットル（５回ス
ポット）のデュプロに沈積させ、実施例ＶＩ−１のプロトコルに従って処理およ
びハイブリダイズした。ターゲットは、Ｂ７３ＤＮＡをＣｙ５染料（アマーシャ
ムファルマシアバイオテック）で、またＦ２ＤＮＡをＣｙ３で、標準手法（
添付のプロトコル参照）に基づいてクレノウ酵素で標識した後の親系統Ｂ７３お
よびＦ２の完全な＋２／＋３Ｅ３３／Ｍ５０ＡＦＬＰ反応の混合物である。プロ
トコルに従って洗浄した後、スライドをジェネタック１０００マイクロアレイ
スライドスキャナー（ジェノミックソリューションズ、ミシガン州アンアー
バー）を用いて自動露光モードで、Ｃｙ−５およびＣｙ３チャンネルでそれぞれ
１８０秒間走査した。

【０２２４】両方のチャンネルを重ね合わせた影像を図５に、スポッティングパターンの解
釈を容易にするために注釈付きで示した。図５は、１）すべてのＡＦＬＰプローブの均一な沈着（ハイブリダイゼーション後の疑
似色影像上のすべてのプローブの赤、緑または黄色信号）、２）予期されたＡＦＬＰプローブＡ３、Ｃ５、Ｅ９、Ｅ１１、Ｇ７、Ｇ１０お
よびＥ６に対するＢ７３ターゲットの特異性のハイブリダイゼーション（Ｃｙ５
チャンネル、疑似色影像上の緑色）、３）予期されたＡＦＬＰプローブＡ６、Ａ８、Ａ１１、Ｇ７およびＧ１０に対
するＦ２ターゲットの特異性のハイブリダイゼーション（Ｃｙ３チャンネル、疑
似色影像上の赤色）、４）予期されたプローブＡ１２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ８およびＧ１２に対するＢ７
３とＦ２ターゲットの特異性の同時ハイブリダイゼーション（Ｃｙ５およびＣｙ
３チャンネル、疑似色影像上の黄色）、５）プローブＡ９、Ｃ７、Ｇ５、Ａ８、Ｃ２、Ｃ６、Ｃ１２、Ｅ８およびＧ８
に対する強い非特異性交叉ハイブリダイゼーション、６）プローブＡ１、Ｅ１、Ｇ１、Ｇ１２、Ａ２、Ａ４およびＡ１０に対する弱
い非特異性交叉ハイブリダイゼーション、７）プローブＣ１、Ｃ１１、Ｇ３、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ１０、Ｅ１２、Ｇ２および
Ｇ４に対するハイブリダイゼーションがないこと、８）ＡＦＬＰプローブＡ１、Ａ９、Ｅ１およびＧ６に対するハイブリダイゼー
ションが特異的に欠落していること、を示している。

【０２２５】実施例IV−６：１１のアラビドプシス＋２／＋３ＡＦＬＰマーカーを含むアレ
イ上の＋２／＋３ＡＦＬＰマーカーの検出１１のアラビドプシス＋２／＋３ＡＦＬＰマーカー（プローブ）のアレイを、
制限酵素ＥｃｏＲＩとＭｓｅＩならびに親系統ＣｏｌｕｍｂｉａおよびＬａｎｄ
ｓｂｅｒｇｅｒｅｃｔａを用いて作り出したクローン化ＡＦＬＰマーカーから
調製した。このＡＦＬＰマーカーの名称、使用したＡＦＬＰプライマーコンビネ
ーション（ＰＣ）、推定モビリティ（塩基対中のサイズ）およびこれら１１のＡ
ＦＬＰマーカーの親オリジンは以下の通りである。

【０２２６】これら１１のＡＦＬＰマーカーを作り出すために使用した＋２／＋３ＡＦＬＰ
プライマーの配列は次のとおりである：Ｅ１１：ＥｃｏＲＩ：５’−ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡ−３’（配
列ＩＤ２１）Ｍ６２：ＭｓｅＩ：５’−ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＴＴ−３’（配
列ＩＤ２２）これら１１のＡＦＬＰマーカーを作り出すために使用した方法およびこれら１
１のアラビドプシスを含むＡＦＬＰマーカーを含むアレイの調製と処理は、実施
例ＶＩ−１に記述したまたは実施例ＶＩ−１で引用したプロトコルの通りである
。

【０２２７】アレイは実施例ＶＩ−１に記述したように調製したＣｏｌｕｍｂｉａおよびＬ
ａｎｄｓｂｅｒｇｅｒｅｃｔａ由来のＣｙ５−標識ＡＦＬＰ＋２／＋３反応で
構成されたターゲットとハイブリダイズした。標識ターゲットを作り出すために
使用したＡＦＬＰはＥ１１：５’−ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡ−３
’（配列ＩＤ２３）とＭ６２：５’−ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＴＴ
−３’（配列ＩＤ２４）である。このプライマーコンビネーションにより、親系
統ｃｏｌｕｍｂｉａはＡＦＬＰマーカーＡ３、Ａ５、Ｃ１、Ｃ３、Ｃ７、Ｃ９お
よびＣ１１を含み、また親系統ＬａｎｄｓｂｅｒｇｅｒｅｃｔａはＡＦＬＰマ
ーカーＡ７、Ａ９、Ａ１１およびＣ５を含むことが分っている。

【０２２８】このアレイを実施例ＶＩ−１に記述した条件または実施例ＶＩ−１で引用した
プロトコルに従って洗浄した。洗浄後、Ｃｙ３およびＣｙ５チャンネルで、両方
とも露光時間１８０秒で影像を撮影し、２つの影像を実施例ＶＩ−１に記述した
ように重ね合わせた（図６）。図６Ａは、１）ＣｏｌｕｍｂｉａＡＦＬＰプローブＡ３、Ａ５、Ｃ１、Ｃ３、Ｃ７、Ｃ９
およびＣ１１の特異性ハイブリダイゼーション（疑似色影像上の緑色）２）位置Ａ１に不詳のＣｙ３標識ＡＦＬＰフラグメントがあり、これがアレイ
のスタート位置になっている（疑似色影像上の赤色）、ことを示している。

【０２２９】図６Ｂは、１）ＬａｎｄｓｂｅｒｇｅｒｅｃｔａＡＦＬＰプローブＡ７、Ａ９、Ａ１１
およびＣ５の特異性ハイブリダイゼーション（疑似色影像上の緑色）２）位置Ａ１に不詳のＣｙ３標識ＡＦＬＰフラグメントがあり、これがアレイ
のスタート位置になっている（疑似色影像上の赤色）、ことを示している。

【０２３０】実施例VI−７：２１の＋１／＋２トマトｃＤＮＡ−ＡＦＬＰマーカーを含むア
レイ上の＋２／＋２ＡＦＬＰマーカーの検出２１のトマト＋１／＋２ｃＤＮＡフラグメント（プローブ）のアレイを、制限
酵素ＥｃｏＲＩおよびＭｓｅＩとトマト系統５２２０１を用いてクローン化ｃＤ
ＮＡ−ＡＦＬＰフラグメントから調製した。

【０２３１】ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ反応は記述（ヴォスら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲ
ｅｓｅａｒｃｈ２３；４４０７−４４１４、１９９５および欧州特許第０５３
４８５８号）のように実施した。

【０２３２】これらのｃＤＮＡ−ＡＦＬＰフラグメントを作り出すために使用した＋１／＋
２ＡＦＬＰプライマーの配列は以下の通りである：ＥｃｏＲＩ：Ｅ０１：５’−ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡ−３’（配列
ＩＤ２５）ＭｓｅＩ：Ｍ１６：５’−ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＣ−３’（配列
ＩＤ２６）ＭｓｅＩ：Ｍ１７：５’−ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＧ−３’（配列
ＩＤ２７）２１の＋１／＋２フラグメントを単離するために使用したｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ
反応は標準手法を用いて配列ゲル上に作り出して溶解させた。アレイは実施例Ｖ
Ｉ−１に記述の手法に基づいて調製した。ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰフラグメントは実
施例ＶＩ−１に記述されているようにデュプロ中にスポットした。

【０２３３】スライドは標準手法（添付のプロトコル参照）に基づいて処理し、下記６種の
トマト系統のＣｙ３−標識＋２／＋３ＡＦＬＰ反応（ターゲット）と温度４５℃
で一昼夜ハイブリダイズした：

【０２３４】含まれるＡＦＬＰプライマーの配列はＥ１２（５’−ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣ
ＡＡＴＴＣＡＣ−３’、配列ＩＤ２８）およびＭ１６（配列は前記、配列ＩＤ２
６）である。クレノウ酵素によるＣｙ３染料（アマーシャムファルマシアバ
イオテック）を用いた標識は、実施例ＶＩ−１に記述されている標準手法に基づ
いて実施した。プロトコルに従って洗浄した後、スライドをジェネタック１００
０マイクロアレイスライドスキャナーを用いて自動露光モードで、Ｃｙ３チ
ャンネルで走査した。６つのハイブリダイゼーションすべての影像は図７（Ａ−
Ｆ）に、スポッティングパターンの解釈を容易にするための注釈を付けて示され
ている。図７は、１）すべての系統とｃＤＮＡ−ＡＦＬＰプローブＢ５およびＢ１１とのハイブ
リダイゼーション、２）Ｌ．ｅｓｃ．Ｍｏｎｅｙｂｅｒｇ、Ｌ．Ｈｉｒｓｕｔｕｍ、Ｌ．
Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ、Ｌ．ＰｅｎｎｅｌｌｉとｃＤＮＡ−ＡＦ
ＬＰプローブＤ７（円で囲んだもの）とのハイブリダイゼーション、３）Ｌ．Ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、Ｌ．ＣｈｅｍｉｅｌｅｖｓｋｉとｃＤＮＡ
−ＡＦＬＰプローブＤ７とのハイブリダイゼーションがないこと、４）Ｃｙ３標識の不詳のｃＤＮＡ−ＡＦＬＰフラグメントのシグナルがＢ１お
よびＨ１１に沈着しており、スライド上のアレイの位置を示すマーカーになって
いる、ことを示している。

【０２３５】実施例VI−８：５のイネ＋２／＋３ＡＦＬＰマーカーと、これら５のイネ＋２
／＋３ＡＦＬＰマーカーに対応する５セットのオリゴのＡＦＬＰマーカーを含む
アレイ上の＋２／＋３ＡＦＬＰ反応で増幅されたイネＡＦＬＰマーカーの検出Ｃｙ３で標識した５つのイネＡＦＬＰマーカー（プローブ）およびこれらのＡ
ＦＬＰマーカーに対応する５セットのオリゴを含むアレイを、実施例ＶＩ−１に
記述されているように５つのＡＦＬＰマーカーを用いて実施例ＶＩ−６に記述さ
れているように調製した。これらのＡＦＬＰマーカーに対応する２つの相補オリ
ゴで構成されるオリゴのセットは以下の通りである。ＡＦＬＰマーカー番号フォワードオリゴ名称リバースオリゴ名称２９９ｆ０３９９ｆ０４４９９ｆ０７９９ｆ０８６９９ｆ１１９９ｆ１２８９９ｆ６９９９ｆ７０１０９９ｆ１９９９ｆ２０

【０２３６】アレイを記述した通りに処理し、ＡＦＬＰプライマーＥ１１およびＭ４９を用
いて調製した、親系統ＩＲ２０と６３８３由来のＣｙ５−標識ＡＦＬＰ＋２／＋
３反応（ターゲット）の等量混合物で構成されるターゲットとハイブリダイズし
た。このようにして標識ターゲットは、ＡＦＬＰ＋２／＋３反応フラグメントの
１本の鎖がＣｙ５で標識されている。親系統ＩＲ２０と６３８３は、実施例ＶＩ
−１に記述したように、ＡＦＬＰマーカー６、８および１０を含むことが分って
いる。このアレイを実施例ＶＩ−１に記述した条件または実施例ＶＩ−１で引用
したプロトコルに従って洗浄した。

【０２３７】洗浄後、Ｃｙ３（図８Ｂ）およびＣｙ５（図８Ｃ）チャンネルで、両方とも露
光時間１８０秒で影像を撮影し、２つの影像を電子的に重ね合わせた（図８Ａ）
。両チャンネルを重ね合わせた影像は、図８Ａにスポッティングパターンの解釈
を容易にするための注釈を付けて示されている。図４は、１）すべてのＡＦＬＰプローブの均一な沈着（ハイブリダイゼーション後の疑
似色影像上の赤、緑または黄色）、２）ＡＦＬＰマーカー６、８および１０に対する特異性ハイブリダイゼーショ
ン；Ｃｙ５、疑似色影像上の緑色、３）ＡＦＬＰマーカー６、８および１０の無標識ストランドに対応するリバー
ス配列オリゴへの特異性ハイブリダイゼーション；Ｃｙ５、疑似色影像上の緑色
）、４）ＡＦＬＰマーカー６、８および１０の標識ストランドに対応するフォワー
ド配列オリゴへの特異性ハイブリダイゼーションがないこと、５）ＡＦＬＰマーカー２および４に対応するＡＦＬＰマーカーまたはオリゴへ
のハイブリダイゼーションがないこと、を示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、２０米＋２／＋３ＡＦＬＰマーカーを含むアレイ上のの５
米＋２／＋３ＡＦＬＰマーカーの混合物の検出を示す図である。

【図２】図２は、１０米＋２／＋３ＡＦＬＰマーカーを含むアレイ上の＋２
／＋３ＡＦＬＰ反応で増幅されたＡＦＬＰマーカーの検出を示す図である。

【図３】図３は、２０米ＡＦＬＰマーカーを含むアレイ上の＋２／＋２ＡＦ
ＬＰ反応で増幅されたＡＦＬＰマーカーの検出を示す図である。

【図４】図４は、２０米ＦＬＰマーカーを含むアレイ上の＋２／＋２ＡＦＬ
Ｐ反応で増幅されたＡＦＬＰマーカーの検出を示す図である。

【図５】図５は、４８トウモロコシ＋３／＋３ＡＦＬＰマーカーを含むアレ
イ上のトウモロコシ＋２／＋３ＡＦＬＰマーカーの検出を示す図である。

【図６】図６は、１１アラビドプシス＋２／＋３ＡＦＬＰマーカーを含むア
レイ上のアラビドプシス＋２／＋３ＡＦＬＰマーカーの検出を示す図である。

【図７】図７は、２１＋１／＋２トマトＡＦＬＰマーカーを含むアレイ上の
＋２／＋２ＡＦＬＰマーカーの検出を示す図である。

【図８】図８は、５米＋２／＋３ＡＦＬＰマーカーとこれらの５米＋２／＋
３ＡＦＬＰマーカーの前方および後方の鎖に対応する５セットのオリゴを含むア
レイ上の＋２／＋２ＡＦＬＰ反応により増幅された米ＡＦＬＰマーカーの検出を
示す図である。

【図９】図９は、実施例Ｉにおいて用いられる関係のあるＡＦＬＰ−プライ
マの組み合わせ（ＡＰＣｓ）の説明する図である：図９Ａは酵素の組合わせ（Ｅ
Ｃ）ＥｃｏＲＩ−ＭｓｅＩの４つの関係するＡＰＣを示す；図９Ｂは図９Ａの４
つのＡＰＣを同時に増幅するために使用できるＡＰＣを示す；図９ＣはＥＣＰｓ
ｔＩ−ＴａｑＩの１６の関係するＡＰＣを示す。図９Ｄは図９Ｃの１６のＡＰＣ
を同時に増幅するために使用できるＡＰＣを示す。

【図１０】図１０は、アレイに固定される核酸配列を生成において使用され
る方法（ＡＦＬＰ増幅を含む）の説明する図である。

【図１１】図１１は、本発明のアレイに使用するのに適した複数のＡＦＬＰ
フィンガープリント、多型バンドを決定するための方法およびこうような多型バ
ンドからアレイを作成するための方法の説明する図である。

【図１２】図１２は、本発明のアレイを使ってゲノムＤＮＡを調べるための
方法の説明図であり、ゲノムＤＮＡは制限酵素で切断され、アレイとの接触の前
にＡＦＬＰ法で増幅される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ 37/00 １０２ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ホーガース，レーネ，コーネリス，ヨセフスオランダ国、エヌエル 6715 ジーアールエーデ、アールビーク 38 (72)発明者ハイネン，レオオランダ国、エヌエル 4132 ビーイービアネン、ケルクストラート 30エイＦターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA04 FA10 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 4B063 QA01 QA18 QA19 QA20 QQ43 QR08 QR14 QR33 QR42 QR56 QS25 QS34 QS39 QX01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】１つの核酸配列または核酸配列の混合物を解析するためのアレ
イであって、ａ）担体とｂ）各々がゲノムＤＮＡを少なくとも１つのフリーケントカッター制限酵素と
少なくとも１つのレアカッター制限酵素で切断することにより得られる制限フラ
グメントの配列に対応する少なくとも１つの核酸配列を含む、前記担体に結合し
た少なくとも２つの異なる核酸配列と、を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項２】担体に結合した少なくとも１０、好ましくは少なくとも１００
、より好ましくは少なくとも１０００の異なる核酸配列を含む、請求項１に記載
のアレイ。
【請求項３】異なる核酸配列の各々が、アレイの１つの独立して検出可能な
領域を形成する担体の１つの隔離された部分に対して固着されかつ対応するよう
に担体に結合されている、請求項１または請求項２に記載のアレイ。
【請求項４】担体に固定されている異なる核酸配列の密度が１〜１００、０
００配列／ｃｍ²、好ましくは５〜１０，０００配列／ｃｍ²、より好ましくは１
０〜１０００配列／ｃｍ²の範囲内である、前記請求項のいずれかに記載のアレ
イ。
【請求項５】担体に固定された核酸配列中に存在する制限フラグメント配列
が１０から１２００ヌクレオチドのサイズであり、開始ゲノムＤＮＡおよび／ま
たはｃＤＮＡから生成された制限フラグメントを１つまたは複数の制限酵素で切
断することにより得られる部分ヌクレオチド配列を含む、前記請求項のいずれか
に記載のアレイ。
【請求項６】制限フラグメントがゲノムＤＮＡから導出され、かつ担体に固
定された核酸配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ま
しくは少なくとも９０％がＡＦＬＰマーカーに対応する制限フラグメントの配列
を含む、前記請求項のいずれかに記載のアレイ。
【請求項７】単一の個体または関係する個体のグループから取られた複数の
ＡＦＬＰマーカーを含む、請求項６に記載のアレイ。
【請求項８】ＡＦＬＰマーカーの複数のセットを含み、各セットが単一の個
体から取られた１つ以上のマーカーを含み、前記１つ以上のマーカーのセットが
関係する個体のグループから取られたものである、請求項６または請求項７に記
載のアレイ。
【請求項９】ＡＦＬＰマーカーが、植物、動物、または微生物の同じ種に属
する複数の個体から取られたものである、請求項６ないし請求項８のいずれかに
記載のアレイ。
【請求項１０】ＡＦＬＰマーカーが、同一種の異なる亜種、変種、栽培品種
、または類から取られたものであるか、またはそれらの代表である、請求項７な
いし請求項９のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１１】ＡＦＬＰマーカーが、小麦、大麦、トウモロコシ、トマト、
胡椒、レタスまたは米を限定的でなく含む植物から取られたものである、請求項
９または請求項１０に記載のアレイ。
【請求項１２】ＡＦＬＰマーカーがヒトのゲノムから取られたものである、
請求項６ないし請求項９のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１３】ＡＦＬＰマーカーが、遺伝的に決定されるかまたは影響を受
ける病気の存在、非存在または状態の典型である、請求項１ないし請求項１２の
いずれか、特に請求項１２に記載のアレイ。
【請求項１４】制限フラグメントが１つ以上のｃＤＮＡから生成されたもの
である、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１５】担体に固定された核酸配列のアレイ、特に前記請求項のいず
れかに記載のアレイを提供するため方法であって、ａ）ＡＦＬＰマーカーを決定する工程と；ｂ）前記ＡＦＬＰマーカーに対応する制限フラグメント配列を含む核酸配列を
用意する工程と；ｃ）担体にこの核酸配列を固着させる工程と；ｄ）異なるＡＦＬＰマーカーのために工程ａ）からｃ）を繰り返し、アレイを
作り上げる工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】ａ）ＡＦＬＰフィンガープリント中の多型バンドを決定する
工程と；ｂ）前記多型バンドから１つの核酸配列を分離する工程と；ｃ）必要に応じて、さらにその核酸配列を増幅し、精製しおよび／または修飾
する工程と；ｄ）その核酸配列を担体に付着させる工程と；を含み、ｅ）異なるＡＦＬＰマーカーに対して工程ａ）からｄ）を繰り返してアレイを
作り上げる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】担体に固定された核酸配列のアレイ、特に前記請求項のいず
れかに記載のアレイを提供するため方法であって、ａ）少なくとも１つのｃＤＮＡから得られた少なくとも１つの制限フラグメン
トを含む核酸配列を用意する工程と；ｂ）担体にこの核酸配列を付着させる工程と；ｃ）異なるｃＤＮＡ由来の制限フラグメントのために工程ａとｂを繰り返しア
レイを作り上げる工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】ａ）ＡＦＬＰ法を用いて少なくとも１つのｃＤＮＡを解析し
て少なくとも１つ、通常は複数のバンドを含むｃＤＮＡ−ＡＦＬＰフィンガープ
リントを用意する工程と；ｂ）前記バンドの少なくとも１つから少なくとも１つの核酸配列を分離する工
程と；ｃ）必要に応じて、さらに前記核酸配列を増幅し、精製および／または修飾す
る工程と；ｄ）前記核酸配列を担体に付着させる工程と；ｅ）異なるバンドおよび／またはことなるｃＤＮＡに対して工程ａ）からｄ）
を繰り返し、アレイを作り上げる工程と、を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】請求項１５ないし請求項１８のいずれかに記載の方法により
得られるアレイ。
【請求項２０】１つの核酸配列または複数の核酸配列の混合物を解析するた
めの方法であって、前記核酸配列または混合物を、ハイブリダイゼーション条件
のもとで、請求項１ないし請求項１４、または請求項１９に記載のアレイ、また
は請求項１５ないし請求項１８のいずれかに記載の方法により得られるアレイに
接触させることを含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】核酸配列または混合物が、アレイ中に存在する核酸配列中に
存在する制限フラグメント配列に、より具体的にはアレイ内に存在するＡＦＬＰ
マーカーに対応する少なくとも１つの配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】核酸配列または混合物が、ＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡまたは
ゲノムＤＮＡから得られた制限フラグメントの混合物を含む、請求項２０または
請求項２２に記載の方法。
【請求項２３】核酸配列または混合物が、そのアレイ中に存在する制限フラ
グメント配列を生成するときに使用されたのと同じ少なくとも１つのフリーケン
トカッター制限酵素と少なくとも１つのレアカッター制限酵素でゲノムＤＮＡを
切断することにより得られる制限フラグメントの混合物を含む、請求項２０ない
し請求項２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】アレイと接触させられる制限フラグメントの混合物が、アレ
イとのハイブリダイゼーションの前に増幅される、請求項２０ないし請求項２３
のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】制限フラグメントの混合物が、好ましくはそのアレイ中に存
在する制限フラグメント配列を生成するときに使用されたのと同じ（選択性の）
プライマーを使って、ＡＦＬＰを用いて増幅される、請求項２３または請求項２
４に記載の方法。
【請求項２６】アレイに接触させられる１つの核酸配列または複数の核酸配
列の混合物が、そのアレイ中に存在するＡＦＬＰマーカーが取られた個体と関係
する個体から取られたものであり、好ましくは請求項６ないし請求項１３のいず
れかに記載のアレイを使用する、請求項２０ないし請求項２５のいずれかに記載
の方法。
【請求項２７】核酸配列または複数の核酸配列の混合物が由来する個体が、
そのアレイ中に存在するＡＦＬＰマーカーが取られた個体と同じ種に属する、請
求項２６に記載の方法。
【請求項２８】請求項１１に記載のアレイが、小麦、大麦、トウモロコシ、
トマト、胡椒、レタスまたは米を限定的でなく含む植物から取られた１つの核酸
配列または複数の核酸配列の混合物の解析に使用される、請求項２７に記載の方
法。
【請求項２９】請求項１ないし請求項１４および請求項１９のいずれかに記
載のアレイと、アレイと共に使用するための制限酵素、ポリメラーゼ、アダプタ
ー、プライマー、バッファ、ヌクレオチド、ラベルまたは他の検出用の薬剤、容
器／包装および説明書などの他の構成要素を必要に応じて含むパーツのキット。
【請求項３０】請求項１ないし請求項１４および請求項１９のいずれかに記
載のアレイを用いて１つの核酸または複数の核酸の混合物を解析することにより
得られる、または請求項２０ないし請求項２８のいずれかに記載の方法により得
られる、例えばイメージ、スコア、ディジタルまたはアナログの形態の、必要に
より紙、写真フィルム、コンピュータのディスクやファイルまたはデータベース
として記録された、未処理または処理済の結果またはデータ。