JP2003523183A

JP2003523183A - 固相支持体上の複数のポリヌクレオチドを増幅し、検出する方法

Info

Publication number: JP2003523183A
Application number: JP2001548754A
Authority: JP
Inventors: ヒュー，キアンジン; ペン，ツァオユアン; ユー，ツァイリン
Original assignee: マーゲンリミティド
Priority date: 1999-12-29
Filing date: 2000-12-19
Publication date: 2003-08-05
Anticipated expiration: 2020-12-19
Also published as: CN1500150A; WO2001048242A3; US6500620B2; JP4860869B2; WO2001048242A2; EP1255860A2; AU2282801A; WO2001048242A9; US20010036632A1

Abstract

(57)【要約】ミクロアレイ上に固定化されたプライマーを使用する固相ポリメラーゼ仲介増幅により、複数のターゲットポリヌクレオチドを検出し、クローニングする方法が提供される。ここにおいて提供される方法、組成物およびキットは、研究および臨床的用途、特に問題の生物学的試料における遺伝情報の大規模アッセイに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関係する出願に対する相互参照この出願は、仮出願第60／173,618号、1999年12月29日出願の優先権を主張す
る。

【０００２】発明の技術分野本発明は、一般に、核酸生物学的の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は
、診断および治療に使用するための生物学的試料における高い処理量の増幅、検
出および遺伝子発現の比較のための方法および組成物を提供する。

【０００３】背景少量の遺伝物質の検出は、生物学的研究および臨床的診断における主要な課題
である。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、特定のポリヌクレオチド配列、例え
ば、ゲノムDNA、一本鎖cDNAまたはmRNAを高い感度および特異性でin vitro増幅
する強力なツールを提供する。この1つの用途は、例えば、環境、食物および医
学的源、およびその他からの生物学的試料中のターゲット遺伝子配列を増幅して
、試料の中に存在する原因となる、病原性、腐敗性またはインジケーター生物の
同定を可能とすることである。

【０００４】基本的PCR技術は、米国特許第4,683,202号、第4,683,195号、および第4,800,1
59号（それらの開示は引用することによって本明細書の一部とされる）に記載さ
れているように、典型的には問題のターゲット配列をフランクする特定の核酸配
列に対してハイブリダイゼーションすることができる2つのオリゴヌクレオチド
プライマーを含む。鋳型変性、プライマーのアニーリングおよび鎖伸長の複数の
サイクルを反復することによって、ターゲット配列を指数的に複製することがで
きる。

【０００５】標準的PCR法を使用するときの主要な問題は汚染である。PCRは少量のターゲッ
トポリヌクレオチドを検出し、増幅する感度のよい方法を提供するが、PCRは非
特異的核酸配列を増幅することができ、これにより最終的検出およびアッセイに
おいて誤った陽性生成物をつくる。標準的溶液相PCRにおいて、プライマーは鋳
型に結合し、溶液中に新生鎖合成を開始し、反応混合物および生成物は最終的検
出およびアッセイのために数回移動をしばしば必要とし、汚染の機会を増加させ
る。

【０００６】 KohsakaおよびCarson（1994）「J. Clin. Lab. Anal.」8：452−455は、移
動なしに同一マイクロウェル中のターゲット遺伝子配列の増幅および検出を可能
とする、固相PCRアプローチを記載している。2つのオリゴヌクレオチドプライマ
ーの一方をマイクロタイタープレートのウェルに結合し、他方のプライマーは溶
液中に止まる。固定化されたプライマーは鋳型に結合し、新生相補的鎖の伸長を
開始する。新しく合成された鎖は、変性による鋳型の除去後、プレートに結合さ
れたままであり、PCRの完結時に、標識化プローブで検出することができる。増
幅前に既知量の内部競合的DNA鋳型を添加することによって、ターゲット核酸の
定量に固相PCRアプローチを使用することもできる。例えば、米国特許第5,747,2
51号（その開示は引用することによって本明細書の一部とされる）参照。

【０００７】 Kohsaka他の固相PCRは、96ウェルのマイクロタイタープレート上のウェル中で
1つの単一ターゲットポリヌクレオチドを検出することに制限された。競合鋳型
を使用する定量固相PCRは、1つの種または組織からのターゲットの検出に制限さ
れた。さらに、標識化プローブとのハイブリダイゼーションにより検出するため
に、プレートに結合される増幅された生成物は一本鎖でなくてはならず、これに
より検出感度を制限する。

【０００８】米国特許第5,641,658号（Adams他）には、単一固相支持体に結合した2つのプ
ライマーで核酸を増幅する方法を記載している。この方法はターゲット配列をフ
ランクする2つのプライマーの選択、および固相支持体上への両方のプライマー
の固定化を必要とする。プライマー対を使用して、支持体上のターゲットポリヌ
クレオチドを検出し、増幅する。増幅された生成物を支持体上に固定し、2つの
隣接する鎖は、合理的に互いに離れている場合、さらに一緒にハイブリダイゼー
ションさせて「ループ」を形成することができる。2つのプライマーの増幅系は
試料中の特定のターゲット核酸の存在または不存在下に感受性であることが約束
されているが、各ターゲットについて2つの固定化されたプライマーの使用は支
持体上のプライマーの注意した配置を必要とするので、プライマーアレイはルー
プの形成を可能とし、しかも追加の鎖の増幅を妨害しないであろう。換言すると
、これらの方法は高い密度、高い処理量のアッセイについて理想的ではなことが
ある。

【０００９】特定の生物学的試料における遺伝子の発現パターンは、ほとんどすべての生物
学的機能および活性の分子的基本の洞察を提供する。異なる生物学的源における
遺伝子発現レベルを検出し、比較する多数の方法がこの分野において知られてい
る。このような比較の1つの標準的方法はノザンブロットである。この技術にお
いて、RNAを試料から抽出し、RNAの分析のために適当な種々のゲルのいずれか上
に負荷し、次いで標準的方法に従い、これを展開してRNAをサイズにより分離す
る（例えば、下記の文献を参照のこと：Sambrook J. 他、「Molecular Cloni
ng：A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Co
ld Spring Harbor、NY（第2版、1989））。次いで、ゲルをブロットし（Sambr
ook、前掲、に記載されているように）、問題のRNAのためのプローブにハイブリ
ダイゼーションさせる。

【００１０】 Sutcliffeの米国特許第5,807,680号は、示差的に発現したmRNAを同時に同定し
、それらの相対濃度を測定する方法を記載している。この技術は、アンカープラ
イマーを使用するcDNAの形成に続くPCRを含み、組織により発現されたmRNAのほ
とんどすべてをゲル上に離散バンドとして可視化することができ、バンドの強度
はmRNAの濃度にほぼ対応する。

【００１１】技術の他のグループは、相対的転写発現レベルの分析を使用する。包括的な、
高い処理量の分析を可能とするために、4つのこのようなアプローチが開発され
た。第1に、試料中のRNAからcDNAを逆転写することができ（上記参考文献に記載
されているように）、5'および3'末端を単一通過配列決定して、被験試料および
対照試料中で発現された遺伝子の発現された配列タグを明らかにすることができ
る。異なる試料からタグの相対発現量を計数することによって、試料内の遺伝子
転写物の相対発現量を概算することができる。

【００１２】第2に、遺伝子発現の系統的分析、または「SAGE」として知られている、EST上
の変動が開発され、これは多数の転写物の定量的同時分析を可能とする。この技
術は短い診断配列タグを単離し、配列決定してターゲット機能の特徴を示す遺伝
子発現パターンを明らかにし、そして、例えば、正常細胞および腫瘍細胞におけ
る数千の遺伝子の、発現レベルを比較するために使用されてきている。例えば、
下記の文献を参照のこと：Velculescu他、「Science」270：368−369（1995）；
Zhang他、「Science」276：1268−1272（1997）。

【００１３】第3に、示差的表示に基づくアプローチが開発された。これらのアプローチに
おいて、発現された遺伝子内のフラグメントの長さについての情報を結合させる
と、特異的配列デリミッターにより規定されたフラグメントを遺伝子のユニーク
識別子として使用することができる。次いで細胞内の発現された遺伝子の相発現
量をその遺伝子に関連しフラグメントの相対発現量により推定することができる
。この考えを利用するために開発されたいくつかのアプローチのいくつかの例は
、ジーン・ロジック・インコーポレーテッド（Gene Logic，Inc.）が使用する
示差的に発現された配列の制限酵素分析（「READS」）、およびディジタル・ジ
ーン・テクノロジーズ・インコーポレーテッド（Digital Gene Technologies
，Inc.）（カリフォルニア州パロアルト）が使用する全遺伝子発現分析（「TOGA
」）であり、例えば、PCRによる示差的に発現された遺伝子を同定するためのデ
ルタ・ディファレンシャル・ディスプレイ・キット（Delta（商標）Differentia
l Display Kit）が販売されている。

【００１４】第4に、好ましい態様において、検出はハイブリダイゼーション分析の多数の
技術の1つにより実行される。これらのアプローチにおいて、問題の試料からのR
NAを通常逆転写して標識化cDNAを形成する。次いで、典型的には既知順序のチッ
プまたは他の表面上に配置された既知配列のオリゴヌクレオチドまたはcDNAに対
してcDNAをハイブリダイゼーションさせる。標識化cDNAがハイブリダイゼーショ
ンするオリゴヌクレオチドの位置はcDNAに対する情報を提供するが、ハイブリダ
イゼーションした標識化RNAまたはcDNAの量は問題のRNAまたはcDNAの相対発現量
の推定値を提供する。さらに、この技術は2以上の異なる検出可能な標識との同
時のハイブリダイゼーションを可能とする。次いで、ハイブリダイゼーションは
試料の相対的発現の直接的比較を生ずる。

【００１５】 DNAミクロアレイ技術の最近の開発は、単一固相支持体上で複数のターゲット
分子の大規模アッセイの実行を可能とする。米国特許第5,837,832号（Chee他）
および関係する特許出願には、試料における特異的核酸配列のハイブリダイゼー
ションおよび検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーのアレイの固定化が記
載されている。ミクロアレイ分析の制限は、小さい体積および少量のみのミクロ
アレイ検出に利用可能である核酸を検出するという困難を包含する。核酸ハイブ
リダイゼーションをベースとする技術として、ミクロアレイハイブリダイゼーシ
ョンの感度は利用可能なターゲット核酸の数、すなわち、遺伝子発現の存在量に
より主として制限される。現在、核酸ターゲットに結合した標識化シグナル（例
えば、蛍光タグからの）を増幅することによって、これらの制限をある程度克服
することができる。

【００１６】発明の要約本発明は、複数のポリヌクレオチドを高い処理量の方式で増幅し、検出する新
規なアプローチを提供する。1つの面において、これらの方法は、固相核酸増幅
に適当なプライマーの固相ミクロアレイを使用することによって、複数のターゲ
ットポリヌクレオチドを検出することを包含する。各プライマーは特定のターゲ
ット配列に対して特異的であり、そして異なるプライマーのグループはミクロア
レイ内の離散位置において固定化される。固定化されたプライマーは固相支持体
上で特定のターゲットポリヌクレオチドの「in situ」ハイブリダイゼーション
および増幅することができる。各プライマー部位における新生鎖は、増幅の間に
鎖の中に組込まれた標識で定量的に検出可能である。1つの好ましい態様におい
て、本発明を実行する増幅手段はPCRである。固相支持体上のミクロアレイは約1
00,000までのグループのプライマーを含んでなることができる。それ自体、この
方法は試料中の約100,000までのターゲットポリヌクレオチドを検出することが
できる。大部分の用途のために、多数のグループを検出することができるが、支
持体上の存在できるグループの数に対する下限は存在しないことが明らかである
。

【００１７】本発明の1つの態様によれば、各プライマー部位において固相に結合された単
一相補的鎖を生ずる特定のターゲットポリヌクレオチドの非対称的PCRのために
、固定化されたプライマーを単独で使用し、必要に応じて鎖の中に組込まれた標
識で検出する。本発明の他の態様によれば、各ターゲットポリヌクレオチドのた
めの他のプライマーを溶液の中に存在させ、こうしてターゲットポリヌクレオチ
ドの両方の鎖を合成し、各プライマーの中に保持させて、検出を増強させること
ができる。溶液相プライマーは特定のターゲットポリヌクレオチドに対して特異
的であるか、あるいは、ターゲットポリヌクレオチドのすべてまたは下位集団に
結合するできる万能プライマーのいずれかであることができる。

【００１８】本発明は、また、少なくとも2つの異なる生物学的源からの複数のターゲット
ポリヌクレオチドの発現パターンを検出し、比較する方法が提供され、この方法
は下記の工程を含んでなる：a）少なくとも2つの異なる生物学的源からの複数の
ターゲットポリヌクレオチドを含んでなる試料を、固相支持体に固定化されたオ
リゴヌクレオチドプライマーの複数のグループのアレイと接触させ、オリゴヌク
レオチドプライマーの各グループは特定のターゲットポリヌクレオチドについて
選択されかつターゲットポリヌクレオチドの配列に対して相補的なプライマーを
含んでなり、ここで各生物学的源からの前記ターゲットポリヌクレオチドは生物
学的源に対してユニークである共有結合された配列を含有し；b）ポリヌクレオ
チドのハイブリダイゼーションおよび増幅に適当な条件下にポリメラーゼ仲介ポ
リヌクレオチド増幅の第1ラウンドを実行し、ここで異なる生物学的源からのタ
ーゲットポリヌクレオチドは、固定化されたプライマーから伸長する相補的新生
ポリヌクレオチド合成のための初期の鋳型として働き；c）各生物学的源に対し
てユニークである配列タグに対してハイブリダイゼーションする溶液相プライマ
ーの存在下に、ポリメラーゼ仲介ポリヌクレオチド増幅の第2ラウンドを実行し
、ここで配列タグはプライマーとして働き、そして工程b）からの固定化された
新生ポリヌクレオチド鎖は溶液相配列タグから伸長する新しい増幅生成物の合成
のための鋳型として働き；そしてd）異なる生物学的源からのターゲットポリヌ
クレオチドの固定化増幅生成物を検出し、比較する。

【００１９】本発明は、さらに、本明細書に開示する対称PCRまたは非対称PCRアプローチを
使用して、複数のターゲットポリヌクレオチドを検出するキットを提供する。キ
ットはPCRプライマーのミクロアレイと、PCR反応および検出に必要な試薬とを含
んでなる。プライマーのミクロアレイは、特定のターゲットポリヌクレオチド配
列に対する調製されたプライマーの約100,000グループまでを含んでなることが
できる。本発明の1つの態様において、キットはPCR反応間に合成された鎖の中に
組込むことができる標識化ヌクレオチドを含んでなる。

【００２０】好ましい態様の詳細な説明本発明は、高い処理量の方式の、感度がよく、しかも簡単な核酸ターゲットを
増幅し、検出する新規な方法および組成物を提供する。本発明は、基本的生物学
的研究および医学的診断および療法の両方において実用性を見出す、ゲノム解析
の種々の面において使用することができる。

【００２１】「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーの形態であっ
て、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。この用語はこの
分子の一次構造のみを意味する。こうして、この用語は二本鎖および一本鎖のDN
AおよびRNAを包含する。また、それは既知の型の修飾、例えば、この分野におい
て知られている標識、メチル化、「キャップ」、1以上の天然に存在するヌクレ
オチドのアナローグによる置換、ヌクレオチド間の修飾、例えば、荷電されてい
ない結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、
およびその他）、ペンダント部分を含有するもの、例えば、タンパク質（例えば
、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−L−リシン、およ
びその他を包含する）、インターカレーターを有するもの（例えば、アクリジン
、プソラレン、およびその他）、キレーターを含有するもの（例えば、金属、放
射性金属、およびその他）、アルキレーターを含有するもの、修飾された結合を
含有するもの（例えば、アルファ芳香族核酸、およびその他）、ならびに非修飾
形態のポリヌクレオチドを包含する。

【００２２】用語「プライマー」は、本明細書において使用するとき、ポリヌクレオチドに
対して相補的であるプライマー伸長生成物の合成が触媒される条件下に置かれる
とき、相補的鎖に沿ったポリヌクレオチド合成の開始点として作用することがで
きるオリゴヌクレオチドを意味する。このような条件は、適当な緩衝液（「緩衝
液」はコファクターであるか、またはpH、イオン強度、およびその他に影響を与
える代替物を包含する）中の適当な温度における、4つの異なるヌクレオシド三
リン酸またはヌクレオシドアナローグおよび1以上の重合因子、例えば、DNAポリ
メラーゼおよび／または逆転写酵素の存在を包含する。プライマーは、ポリメラ
ーゼのための因子の存在下に伸長生成物の合成を開始するために十分に長くなく
てはならない。典型的なプライマーは、ターゲット配列に対して実質的に相補的
である、少なくとも約5ヌクレオチド長さの配列を含有するが、多少より長いプ
ライマーが好ましい。通常プライマーは約15〜26のヌクレオチドを含有するが、
35ヌクレオチドまでの、より長いプライマーを使用することもできる。

【００２３】プライマーは、それをアニールすることができるターゲット配列、すなわち、
増幅すべき特定の配列、に対して実質的に相補的である配列を常に含有する。プ
ライマーは、必要に応じて、ターゲット配列に対して相補的である配列に加えて
配列を含むことができる。このような配列は、プライマー中のターゲット−相補
的配列から上流（すなわち、5'末端）に存在することが好ましい。例えば、1以
上の制限酵素認識部位を含んでなる配列（「リンカー」または「アダプター」）
は、ターゲット−相補的配列から上流プライマーの中に存在するとき、増幅生成
物のクローニングおよび引き続く操作を促進する。プライマーの中に含めるため
に有効な他の配列は、配列決定プライマーに対して相補的な配列およびプロモー
ター配列を特定する配列を包含する。用語「プロモーター配列」は核酸配列の一
本鎖を規定し、この一本鎖は認識された配列に結合するRNAポリメラーゼにより
特異的に認識され、かつRNA転写物が産生される転写プロセスを開始する。原理
的には、開始配列を認識することができる既知の入手可能なポリメラーゼが存在
する、任意のプロモーター配列を使用することができる。既知の有用なプロモー
ターは、ある種のバクテリオファージポリメラーゼ、例えば、バクテリオファー
ジT3、T7またはSP6により認識されるプロモーターである。

【００２４】本明細書において使用するとき、用語「タグ」または「配列タグ」または「プ
ライマータグ配列」は、このようなタグをその中に支持するポリヌクレオチドの
バッチを同定する働きをする特異的核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを意味
する。同一生物学的源からのポリヌクレオチドは特異的配列タグと共有結合的に
標識されるので、引き続く分析において、ポリヌクレオチドはその由来源に従い
同定可能である。また、配列タグは核酸増幅反応のプライマーとして働く。

【００２５】「ミクロアレイ」は、好ましくは離散領域の線形または二次元のアレイであり
、各離散領域は、固体支持体の表面上に形成された、定められた領域を有する。
ミクロアレイ上の離散領域の密度は、単一固相支持体表面上で検出すべきターゲ
ットポリヌクレオチドの総数により決定され、好ましくは少なくとも約50／cm²
、より好ましくは少なくとも約100／cm²、なおより好ましくは少なくとも約500
／cm²、最も好ましくは少なくとも約1,000／cm²である。本明細書において使用
するとき、DNAミクロアレイは、ターゲットポリヌクレオチドを増幅またはクロ
ーニングするために使用するチップまたは他の表面上に配置された、オリゴヌク
レオチドプライマーのアレイである。プライマーの各特定のグループの位置は既
知であるので、ターゲットポリヌクレオチドの同定はミクロアレイ中の特定の位
置に対するターゲットポリヌクレオチドの結合に基づいて決定することができる
。

【００２６】「リンカー」は制限部位を含有する合成オリゴデオキシリボヌクレオチドであ
る。リンカーをDNAフラグメントの末端上に平滑末端結合して制限部位をつくり
、引き続いて制限部位を使用してフラグメントをベクター分子の中にクローニン
グすることができる。

【００２７】用語「標識」は、アッセイ試料中のターゲットポリヌクレオチドの存在を示す
検出可能なシグナルを産生できる組成物を意味する。適当な標識は、放射性同位
体、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、蛍光分子、化学発光成分、磁気粒子、生
物発光成分、およびその他を包含する。それ自体、標識は分光的、光化学的、生
化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の
組成物である。

【００２８】用語「支持体」は、慣用支持体、例えば、ビーズ、粒子、ディップスティック
、繊維、フィルター、膜およびシランまたはシリケートの支持体、例えば、ガラ
ススライドを意味する。

【００２９】用語「増幅」は、広い意味において、増幅生成物をつくることを意味するため
に使用し、増幅生成物は、例えば、追加のターゲット分子、またはターゲット様
分子またはターゲット分子に対して相補的な分子を包含することができ、このよ
うな分子は試料中のターゲット分子の存在によりつくられる。ターゲットが核酸
である状況において、増幅生成物は酵素的にDNAまたはRNAポリメラーゼまたは転
写酵素を使用して作ることができる。

【００３０】本明細書において使用するとき、「生物学的試料」は個体から単離された組織
または流体の試料を意味し、これらは下記のものを包含するが、これらに限定さ
れない：血液、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸器、腸、
および生殖管、涙、唾液、乳、細胞（血球を包含するが、これに限定されない）
、腫瘍、器官、およびまたin vitro細胞培養構成成分の試料。

【００３１】用語「生物学的源」は、本明細書において使用するとき、ターゲットポリヌク
レオチドが由来する源を意味する。源は前述した「試料」の任意の形態であるこ
とができ、下記のものを包含するが、これらに限定されない：細胞、組織または
流体。「異なる生物学的源」は、同一個体の異なる細胞／組織／器官、または同
一種の異なる個体からの細胞／組織／器官、または異なる種からの細胞／組織／
器官。

【００３２】本発明の1つの面において、1つの生物学的試料からのターゲットポリヌクレオ
チドの固相増幅を実行し、ここでオリゴヌクレオチドプライマーの複数のグルー
プを固相支持体上に固定化する。好ましい態様において、グループ内のプライマ
ーは配列が同一であり、そして1つの特定のターゲットポリヌクレオチドの定め
た配列に対して相補的であるように選択または設計し、適当な条件下にターゲッ
トポリヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションすることができ、核酸合成
（すなわち、鎖の伸長または拡張）のための開始プライマーとして適当である。
各ターゲットポリヌクレオチドについて選択されたプライマーを、グループとし
て、固体支持体上に離散位置において固定化する。好ましくは、グループ間の距
離は増幅された生成物を検出するために使用する検出手段の分解能より大きい。
好ましい態様において、好ましい態様において、プライマーを固定化してミクロ
アレイまたはチップを形成し、これらを自動化プロセスを介してプロセシングし
、分析することができる。核酸増幅手段に適当な条件下にターゲットポリヌクレ
オチドを固相増幅させるために、固定化されたプライマーを使用する。

【００３３】本発明の1つの面によれば、初期ターゲットポリヌクレオチドは、センス鎖（
「陽性鎖」）と相補的鎖（「陰性鎖」）とを有する二本鎖形態である。増幅を実
施する前に、ターゲットポリヌクレオチドを変性し、例えば、熱変性し、これに
より2つの鎖を変性し、反応溶液中で分離する。好ましくは、本発明において使
用するプライマーは、推定されるターゲットポリヌクレオチド濃度に対して非常
に大きいモル過剰で存在して、2つのターゲットポリヌクレオチド鎖の復元と反
作用させる。あるいは、初期ターゲットポリヌクレオチドは一本鎖であり、一本
鎖のDNAまたはRNAである。

【００３４】本発明の1つの好ましい態様において、核酸増幅はポリメラーゼにより仲介さ
れる。より好ましくは、増幅はPCR反応に適当な条件下に実行する。当業者は理
解するように、PCR反応は一般に変化する反応温度におけるアニーリング−伸長
−変性工程の複数のサイクルを含み、その間に鋳型として初期ターゲットポリヌ
クレオチドに基づいて新生鎖の複数のコピーを合成する。その結果、初期ターゲ
ット配列は、PCR反応の条件および拘束に依存して、線形的または指数的に「増
幅」される。

【００３５】本発明によるPCR反応間に、固定化されたプライマーのアレイを反応混合物中
でターゲットポリヌクレオチドと接触させる。ターゲットポリヌクレオチドが二
本鎖形態である場合、接触は変性後に実施する。アニーリングに適当な条件下に
、一本鎖ターゲットポリヌクレオチド内の定められた配列領域に対して相補的な
配列を含有する固定化されたシグナルプライマーに対して、一本鎖ターゲットポ
リヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせる。鎖伸長に適当な条件（DNAポ
リメラーゼおよび遊離ヌクレオチドdNTPを包含するが、これらに限定されない）
下に、各ターゲットポリヌクレオチド鎖は新生相補的鎖合成の開始鋳型として働
き、この合成はアニーリングされたプライマーの3'−ヒドロキシルから開始され
、ターゲット鋳型の5'末端に及ぶ。鎖伸長が完結した後、反応条件を変性を可能
とするように変化させ、その間にターゲット鎖および新生鎖は分離されるので、
ターゲット鎖は試料溶液の中へ解放され、新生鎖は固定化されたプライマーを介
して固体支持体上に保持される。

【００３６】本発明を実施するとき、固定化されたシグナルプライマーを単独で使用するか
、あるいは、新生固定化された鎖の3'末端において配列に対して相補的である反
応溶液中のプライマーと組み合わせて使用することができる。さらに、溶液相プ
ライマーは、すべてのターゲットポリヌクレオチド、または各々が特定のターゲ
ット配列に対して特異的である特異的プライマーのプールを増幅することができ
る万能プライマーであることができる。

【００３７】本発明の1つの面において、使用する溶液相プライマーが存在しない。したが
って、前述の初期増幅反応は、伸長後に変性工程を導入するか否かに依存して、
一本鎖としてまたは初期ターゲットポリヌクレオチド鎖とアニールさせて、各プ
ライマー部位において固体支持体に付着された新生鎖を産生する。そして、これ
らの新生鎖の存在は、さらに後述するように、適当な検出手段により検出するこ
とができる。

【００３８】本発明の他の面において、溶液相プライマーを複数のターゲットポリヌクレオ
チドの増幅のために固体支持体固定化プライマーと組み合わせて使用する。初期
増幅反応に引き続いて、増幅反応の他のラウンドを実行し、その間に溶液相プラ
イマーに対して3'末端において相補的な、以前に形成した新生鎖は、溶液相プラ
イマーに対してアニールし、そしてターゲットポリヌクレオチドと実質的に同一
な第2新生鎖を引き続いて合成するための鋳型として働く。その結果、二本鎖新
生ポリヌクレオチドを形成し、固相支持体上に各プライマー部位において付着さ
せることができる。

【００３９】本発明の固相増幅アプローチの実施例は図1および図2に描写されている。

【００４０】図1は、各組が特定のターゲット遺伝子に対して特異的な、3組の固定化5'末端
プライマーを有する固相支持体上の、3つのターゲット遺伝子A、BおよびCの増幅
および検出を描写する。追加のプライマーは溶液の中に存在しない。1Aにおいて
、遺伝子A、BおよびCに対して特異的な固定化プライマーのアレイは閉じた矢印
で描写されている。1Bにおいて、一本鎖ターゲットポリヌクレオチドは、アニー
リング条件下にそれらの相補的配列において固定化5'末端に対してハイブリダイ
ゼーションする。次いで1Cにおいて、条件を伸長にシフトさせ、その間に5'末端
プライマーは鋳型としてターゲットポリヌクレオチドを使用する新生鎖の合成の
ための開始部位として働く。その中に組込まれた標識、ビオチン−dCTPを有する
新生鎖を合成し、こうして新生鎖は後に検出可能である。伸長が完結したとき、
条件を変性にシフトさせ、その間に当初のターゲット鋳型鎖はアレイから溶液の
中に解放され、標識化新生一本鎖は固定化5'末端プライマーを介して支持体に共
有結合される。1Dにおいて、アニーリングの第2ラウンドが起こり、こうしてタ
ーゲット鋳型鎖はそれ以上の増幅のための追加の固定化プライマーに対してハイ
ブリダイゼーションする。1Eは固定化プライマー部位において生ずる増幅生成物
を示し、あるものは一本鎖のビオチン標識化ポリヌクレオチドであり、そして他
のものは二本鎖である。なぜなら、ターゲット鋳型は変性しない新生鎖とアニー
ルしたままであるからである。固定化プライマーはターゲット鋳型の推定濃度よ
りも非常に高いモル過剰量で存在するで、それは溶液相プライマーが存在しない
場合でさえ一本鎖および二本鎖の両方の増幅生成物を存在させる。

【００４１】図2は、固定化特異的5'末端プライマーおよび溶液相3'末端プライマーの両方
を使用するターゲット遺伝子（A、BおよびC）の増幅および検出を描写する。3'
−プライマーはポリアデニル化mRNA鋳型に対する結合のための万能プライマー、
例えば、ポリ−dTであることができる。2A〜2Cは本質的に1A〜1Cに対応し、各固
定化5'末端プライマー部位におけるPCRの第2ラウンド、および組込まれたビオチ
ン標識で検出できる生ずる一本鎖新生鎖を図解する。変性後、ターゲット鋳型は
新生鎖から分離され、溶液の中に解放される。2Dは第2ラウンドのPCRを描写し、
その間に各新生鎖は溶液相万能プライマーから開始された、他の新生鎖合成のた
めの鋳型として働く。その間に、当初のターゲット鋳型はそれ以上の増幅のため
の追加の固定化5'−プライマー部位に対してハイブリダイゼーションする。固定
化プライマー部位上の二本鎖増幅生成物を生じ、各鎖は2Eに示すようにビオチニ
ル化されている。

【００４２】本発明の固相増幅法を使用して、異なる生物学的源における遺伝子発現を検出
し、比較する。この面において、増幅反応を実施するために、固定化プライマー
を溶液相プライマーと組み合わせて使用する。1つの態様によれば、異なる源は
同一被検体の異なる組織または細胞であることができる。選択的に、異なる源は
同一種の2以上の被検体の匹敵する組織、例えば、健康な対照からの1つおよび患
者からの他のものである。なお他の態様において、異なる源は2以上の異なる種
または異なる動物からもの、例えば、ヒトの1つおよびマウスの他のものである
。

【００４３】本発明による遺伝子発現の示差的分析は、本質的にプライマーの固相アレイ上
で異なる生物学的源からのターゲットポリヌクレオチドを一緒に増幅することに
よって実行される。この態様において、各源からの初期ターゲットポリヌクレオ
チドのバッチをオリゴヌクレオチド配列で示差的に標識付けし、こうして目的の
増幅生成物はこのような配列タグを有し、初期ターゲットの源を示す。「源タグ
」で標識化した増幅生成物検出し、比較することによって、異なる源中のターゲ
ットポリヌクレオチドの存在および相対存在量を決定し、比較することができる
。

【００４４】本発明のこの態様において例示するように、異なる生物学的源からのオリジナ
ルターゲットポリヌクレオチドはその中で発現された全mRNAである。この分野に
おいて知られている方法および物質を使用して、各源から全mRNAを単離する。次
いで各生物学的源から単離されたmRNAの全プールを使用して特異的に標識付けさ
れたcDNAのバッチを調製し、これを引き続く増幅のための「ターゲットポリヌク
レオチド鋳型」として使用する。1つの態様において、逆転写された各バッチを
特異的配列タグでそれらの3'末端において標識付けする。特異的配列タグは未修
飾ターゲットポリヌクレオチドのいずれの中にも存在しない。例えば、検出すべ
きターゲットポリヌクレオチドがヒト細胞／組織からのものである場合、配列タ
グは細菌またはウイルスゲノムに由来することができ、そして配列はハイブリダ
イゼーション／増幅条件下にmRNAに転写されるヒト配列とアニールしない。この
ようにして、1つのバッチからの配列タグは交差ハイブリダイゼーションのため
に他のバッチの人工的増幅を引き起こさないであろう。

【００４５】さらに、cDNAターゲットの各バッチの配列タグはcDNAターゲットの他のバッチ
のそれと異なるので、それらを比較することができる。配列タグは、逆転写のた
めの特別に設計されたプライマーを使用することによって、逆転写cDNAの中に導
入することができる。例えば、プライマーは3'末端にポリ−dT部分を有し、そし
て5'末端に細菌SP6配列を有することができる。逆転写間に、mRNA鋳型のポリ−A
テイルとアニールするポリ−dT部分の5'末端から開始されるcDNA合成のための鋳
型として、mRNAは働く。次いで、生ずるcDNA生成物は5'末端にSP6「配列タグ」
を有し、これはcDNAのこのバッチに対してユニークである。同様に、他の源から
のcDNAの異なるバッチを異なる配列タグ、例えば、細菌T7配列で「標識付け」す
ることができる。

【００４６】例えば、SP6およびT7で示差的に標識付けされた、cDNAの2つの異なるバッチを
、増幅および検出のための一緒に混合する。示差的に標識化される遊離SP6およ
びT7配列タグは、増幅反応混合物の中に存在する。例えば、2つの配列タグを直
接的検出のために2つの異なる蛍光色素（例えば、1つの赤色色素および1つの緑
色色素）で標識化することができるか、あるいは、引き続く色検出のために2つ
の異なる化学的成分（例えば、1つのビオチンおよび1つのジゴキシゲニン）で標
識化することができる。配列タグが後に増幅反応におけるプライマーとして働く
ように、標識は配列タグの3'末端に存在しないことが重要である。

【００４７】本発明の好ましい増幅手段はPCR反応である。cDNAの2つの示差的に標識付けさ
れたバッチの混合物を特異的プライマーの複数のグループの固相アレイと接触さ
せ、各グループは前述の特定のターゲットcDNAに対応する。PCRの初期ラウンド
において、固定化プライマーは両方の源からのターゲットポリヌクレオチドとア
ニールし、鎖伸長のために十分な条件下に新生相補的鎖を合成する。新生相補的
鎖はターゲット配列領域を通して伸び、ターゲットcDNA鋳型の末端における配列
タグに対して相補的な配列を3'末端に含有する。例えば、第1新生鎖は、それを
源1からのSP6標識付けcDNA鋳型上で増幅された場合、SP6配列に対して相補的な3
'末端を有する；そして第2新生鎖は、それを源2からのT7標識付けcDNA鋳型上で
増幅された場合、T7配列に対して相補的な3'末端を有する。こうして、固相アレ
イ上で固定化された各新生鎖はその源に対して特異的配列タグを「受け継ぐ」。

【００４８】 PCRの引き続くラウンドにおいて、異なる源について標識付けされた新生鎖の
第1組は新生鎖の第2組の合成のための鋳型として働く。この時、PCRの初期プラ
イマーは溶液中で示差的に標識化された遊離配列タグ、例えば、蛍光標識化SP6
プライマーおよびリサミン標識化T7プライマーである。したがって、標識化配列
タグから伸長した新生鎖の第2組は、PCR反応の最初のラウンドにおけるターゲッ
トcDNA鋳型の当初の源に対応して、示差的に標識化される。非結合試薬および変
性しない当初鋳型を洗浄除去した後、各固定化プライマー部位は当初の生物学的
源を示す標識を1つの鎖上に有する二本鎖ポリヌクレオチドを有する。それ自体
、異なる標識の最終検出は異なる生物学的源における特定のターゲットポリヌク
レオチドの存在および存在量を明らかにするであろう。

【００４９】当業者は理解するように、各生物学的源からの遺伝子発現の正確な量を測定す
ることは不必要であるが、このような正確な測定は可能である。むしろ、本発明
は異なる源における遺伝子発現の比較分析のアプローチを提供する。アレイ上の
各プライマースポットにおいて、異なる標識の検出を使用して異なる生物学的源
からの各ターゲットポリヌクレオチドの比を決定し、引き続いて相対存在量を決
定する。

【００５０】異なる生物学的源の示差的発現分析の1例は図3に図解されている。

【００５１】図3は2つの異なる試料からのターゲット遺伝子の増幅および検出を描写し、各
ターゲット遺伝子は試料特異的配列決定タグで標識付けされている。増幅反応は
溶液相の、示差的に標識化された配列タグ、例えば、Cy3−配列タグ1およびCy5
−配列タグ2の存在下に実施される。3Aにおいて、各遺伝子に対して特異的な5'
末端プライマーを固体支持体上でグループで固定化する。3Bにおいて、以前に配
列タグで5'末端において標識付けされたターゲット鎖を固定化5'末端プライマー
に対してアニールし、PCR増幅の鋳型として働かせる。3Cにおいて、ターゲット
鋳型に対して相補的な新生鎖は各固定化プライマー部位から開始され、ターゲッ
ト配列を通して配列タグに対して相補的である3'末端に伸びる。それ自体、各新
生鎖もまた相補的タグ配列で標識付けされる。増幅の第1ラウンドが完結したと
き、当初のターゲット鋳型は変性の間に新生鎖から解放される。次いで、3DはPC
Rの第2ラウンドを描写し、その間に各固定化新生鎖は鋳型として働き、そして溶
液相、Cy3−またはCy5−標識化配列タグは他の新生鎖合成のプライマーとして働
く。その結果、対応するターゲット遺伝子が来る試料起源に依存して、新しい鎖
の各々はCy3またはCy5標識を支持するであろう。また、3Dにおいて、当初のター
ゲット鋳型は追加の固定化5'末端プライマー部位に対してアニールして増幅の新
しいラウンドを開始する。PCRの第2ラウンドが完結すると、変性が起こらないの
で、Cy3またはCy5−標識化新生鎖は固定化新生鎖にアニールしたままである。し
たがって、3Eに示すように、固定化増幅生成物をCy3またはCy5の存在について検
出することができ、これらの存在は当初のターゲット遺伝子源を示す。

【００５２】本発明の示差的発現分析は生物学的研究の種々の面ならびに臨床的用途におい
て実用性を有する。例えば、複数の系における問題の特定遺伝子の発現パターン
を1つの試料混合物内で比較して、変動を最小にすることができる。それは、例
えば、異なる種間のある種の遺伝子の発現レベルの比較を可能とし、こうして問
題の遺伝子の機能性の評価を可能とする。また、本発明は、ターゲット遺伝子の
発現レベルを健康な個体に対して比較することによって、疾患を有する患者のあ
る種の遺伝子欠陥の臨床的診断において有効である。その上、本発明を使用して
、異なる細胞／組織／生物における遺伝子発現レベルを比較して、特定の生物学
的経路におけるある種の遺伝子の役割を評価することができる。

【００５３】前述の増幅法は、単一固相支持体上の複数のターゲットポリヌクレオチドの高
い処理量のアッセイに使用することができる。単一形態または対の、プライマー
の複数のグループを固相支持体上に固定化して、前もって決定したパターンを有
するミクロアレイを形成する。プライマーの各グループは特定のターゲットポリ
ヌクレオチドに対応し、ミクロアレイ内の離散位置を占有する。前述したように
、複数のターゲットポリヌクレオチドを含有するか、あるいは含有することが推
測される試料をPCR反応に適当な条件下にミクロアレイと接触させるとき、各タ
ーゲットポリヌクレオチドは増幅され、離散位置において付着され、ミクロアレ
イはそれに対して固定化された対応するプライマーを有する。

【００５４】本発明によれば、潜在的ターゲットポリヌクレオチドの数は、小さい密なミク
ロアレイを製造しかつ分析する入手可能な技術によってのみ制限される。例えば
、プライマー対の約100,000までの異なる集団を固体支持体上の離散位置に準備
し、支持体をPCR溶液および試料と接触させることによって、既知の技術を使用
して、約100,000までのポリヌクレオチドを単一固体支持体上で分析することが
でき、ここで試料は設計されたプライマーが検出するターゲットポリヌクレオチ
ドの少なくとも1つのコピーを含んでなる。

【００５５】方法および材料 1. ターゲットポリヌクレオチド本発明の目的に対して、ターゲットポリヌクレオチドは二本鎖DNA、一本鎖DNA
、またはRNAであることができる。ターゲットポリヌクレオチドの例は、ゲノムD
NA、cDNA、mRNA、ミトコンドリアDNA、ウイルスDNA、増幅されたDNA、およびウ
イルスDNAを包含するが、これらに限定されない。二本鎖ターゲットポリヌクレ
オチドは増幅反応の開始において変性を行い、一本鎖鋳型を形成する。

【００５６】 mRNAターゲットポリヌクレオチドは、逆転写により仲介される増幅のための鋳
型として直接使用することができる。各固定化プライマー部位において発生する
鎖伸長が完結した後、ハイブリダイゼーションしたRNA鋳型鎖を、例えば、RNア
ーゼHにより、破壊して、新生相補的DNA鎖を固相支持体に付着させて残す。第2
プライマー（特異的または万能）が溶液相の中に存在する場合、第1新生cDNA鎖
は他の新生鎖を合成する鋳型として働き、これにより各固定化プライマー部位に
おいて二本鎖新生DNA分子を形成するか、あるいは2つの固定化プライマーを結合
する。

【００５７】選択的に、試料中のmRNAターゲットポリヌクレオチドをまず相補的DNAに逆転
写し、引き続いてこのDNAは本発明の固相PCR反応のための初期鋳型として働く。
逆転写は、例えば、ポリ−dT万能プライマーから開始させることができる。ポリ
−dT万能プライマーは、また、本発明によるPCR増幅反応の溶液相中の万能プラ
イマーとして使用することができる。ポリ−dT開始cDNA生成物は固相支持体上に
固定化された特異的プライマーにその3'末端でアニールし、ポリ−A配列をその3
'末端に有する新生相補的鎖の引き続く合成のための鋳型として働く。変性工程
後、単一固定化新生鎖は溶液相中でポリ−dT万能プライマーに対してハイブリダ
イゼーションすることができ、固相支持体に固定された二本鎖新生ポリヌクレオ
チドのPCR増幅および形成の引き続くラウンドのための鋳型として働く。

【００５８】本発明の複数のポリヌクレオチドは1つの単一生物学的源からのものであるか
、あるいは、複数の生物学的源、例えば、異なる種または組織からのものである
ことができる。例えば、詳細に前述したように、1つのPCR反応において、既知の
検出法により2つの源の増幅された生成物の区別を可能とする条件下に、健康な
個体から単離されたターゲットポリヌクレオチドの1集団を、問題の疾患を有す
る患者から単離されたターゲットポリヌクレオチドの他の目的と混合することが
できる。したがって、本発明はターゲットポリヌクレオチドの交差種の比較分析
に使用することができる。

【００５９】 2. オリゴヌクレオチドプライマー本発明は、オリゴヌクレオチドプライマーの別々の、固定化されたグループを
含んでなる調製された固体支持体を提供する。各プライマーは、特定のターゲッ
トポリヌクレオチドの増幅を実施するために適当である。こうして、例えば、標
準PCRプライマーの選択プログラム、例えば、プライマー3（Massachusetts Ins
titute of Technology（MIT）からの）を使用して、ターゲットポリヌクレオ
チド中の既知の配列に基づいて、プライマーを選択または設計することができる
。

【００６０】固相支持体は約5〜約100平方マイクロメートルの領域を提供することができ、
その上で前もって決定したパターンに従い離散領域において単一プライマーの約
100,000までのグループを固定化することができる。調製した固体支持体は、支
持体上の任意の所定の位置にプライマーまたはプライマー対の配列の関連する書
かれたまたは電子的記録を有することができ、こうして増幅されたターゲットの
支持体上の位置をさらに同定することができる。

【００６１】ミクロアレイ上の引き続く計画した増幅反応の必要性により、特定のターゲッ
トヌクレオチドに対応する各グループ内のプライマーの数を決定し、制限するこ
とができる。こうして、例えば、特に反応体積およびターゲット鋳型ポリヌクレ
オチド分子の期待する数、およびPCRの提案されたサイクル数が与えられると、
ミクロアレイ上の特異的部位においてPCRを実施するために必要と思われるプラ
イマーの数は、反応を成功させるために支持体上の各位置にどれだけ多くのオリ
ゴヌクレオチドプライマーのコピーをグループとして適用するかを正確に決定す
る助けとなるであろう。好ましくは、プライマーの量（すなわち、プライマー分
子数またはプライマー濃度）は所定の固体支持体上の各準備された位置において
ほぼ同一であろう（例えば、約100,000までのターゲットポリヌクレオチドを増
幅または検出するためにプライマーの1000〜10,000、約100,000までの集団を有
するDNAミクロアレイのフォーマットにおいて）。

【００６２】検出すべきポリヌクレオチドに基づく特定の用途のために、プライマー配列を
使用して固体支持体を調製することができる。特に増幅すべきターゲットポリヌ
クレオチドの配列および品質を考慮して、オリゴヌクレオチドプライマーは特定
のPCRに適当な任意の長さを有することができる。1例として、プライマーは約4
〜約30ヌクレオチド長さであることができる。

【００６３】本発明の核酸プライマーは、変更が得られる収率または生成物に有意な程度に
悪影響を及ぼさない程度に、核酸塩基の小さい欠失、付加および／または置換を
含有することができることが理解される。

【００６４】オリゴヌクレオチドプライマーは、通常核酸の中に見出される天然に存在する
複素環式塩基（ウラシル、シトシン、チミン、アデニンおよびグアニン）、なら
びに修飾された塩基および塩基アナローグを含むことができる。ターゲット配列
に対するプライマーのハイブリダイゼーションと適合性の任意の修飾された塩基
および塩基アナローグは、本発明において有効である。プライマーの糖またはグ
リコシド部分は、デオキシリボース、リボース、および／またはこれらの糖の修
飾された形態、例えば、2'−O−アルキルリボースを含むことができる。好まし
い態様において、糖部分は2'−デオキシリボースである；しかしながら、ターゲ
ット配列に対してハイブリダイゼーションするプライマーの能力と適合性である
任意の糖を使用することができる。

【００６５】 1つの態様において、プライマーのヌクレオシド単位は、この分野においてよ
く知られているように、ホスホジエステル主鎖により結合される。追加の態様に
おいて、ヌクレオシド間の結合はプライマーの特異的ハイブリダイゼーションと
適合性であるこの分野において知られている任意の連鎖を包含することができ、
ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルファメート（例えば、米国特許
第5,470,967号）およびポリアミド（すなわち、ペプチド核酸）を包含するが、
これらに限定されない。ペプチド核酸は下記の文献に記載されている：Nielsen
他（1991）「Science」254：1497−1500；米国特許第5,714,331号；およびNiels
en（1999）「Cur. Opin. Biotechnol.」10：71−75。

【００６６】ある態様において、プライマーはキメラ分子であることができ、すなわち、2
以上の型の塩基または糖サブユニットを含んでなることができ、および／または
結合は同一プライマー内の2以上の型であることができる。プライマーは、この
分野において知られているように、例えば、インターカレーターおよび／または
小さいグルーブバインダー組込むことによって、そのターゲット配列に対するハ
イブリダイゼーションを促進する部分を含むことができる。

【００６７】塩基、糖、およびヌクレオシド間主鎖、ならびにプライマー上の任意のペンダ
ント基の存在の変動は、配列特異的方式で、ターゲット配列に結合するプライマ
ーの能力と適合性であろう。既知および発生すべき、多数の構造的修飾はこれら
の拘束内で可能である。その上、プライマーを形成する種々の複素環式塩基、糖
、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを製造する方法、および前もって決定した特
異的配列のオリゴヌクレオチドの製造は、十分に開発され、この分野において知
られている。オリゴヌクレオチド合成の好ましい方法は、米国特許第5,419,966
号において教示されている。

【００６８】特定のPCRまたは引き続く操作、例えば、増幅されたターゲットポリヌクレオ
チドの単離を助けるまたは促進する、任意の特別の追加の成分または配列を使用
して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。例えば、プライ
マーはターゲット配列に対して相補的であるものに加えて配列を含むことができ
る。このような配列は通常プライマー中のターゲット相補的配列から上流（すな
わち、5'側に対して）に存在する。例えば、1以上の制限酵素認識部位を含んで
なる配列（いわゆる「リンカー」または「アダプター」）は、プライマーの中の
ターゲット相補的配列から上流に存在するとき、増幅生成物のクローニングおよ
び引き続く操作を促進する。プライマーの中に含めるために有用な他の配列は、
配列決定プライマーに対して相補的な配列、およびバクテリオファージRNAポリ
メラーゼ、例えば、T3RNAポリメラーゼ、T7RNAポリメラーゼおよびSP6RNAポリメ
ラーゼのプロモーターを特定する配列を包含する。

【００６９】 PCR増幅を実施するために溶液相プライマーをまた使用するとき、溶液相プラ
イマーは万能プライマーであることができる。異なる万能プライマーを比較すべ
き組織または種の試料について使用することができる。これらの異なるプライマ
ーを示差的に標識化し（例えば、1つについて緑色、他のについて赤色）、こう
して検出の間に、1つの種または組織の試料からのターゲットを他の種または組
織の試料からの対応するターゲットと区別することができる。

【００７０】野生型対応物に比較して特異的なヌクレオチド突然変異を含有する突然変異体
ポリヌクレオチドを検出するように、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを
設計することができる。野生型ポリヌクレオチドであるが、少なくとも3'末端の
ヌクレオチドが異なる配列に基づいて、プライマーを設計することができる。そ
れ自体、これらの3'末端置換プライマーは野生型ターゲットポリヌクレオチドに
結合し、PCR増幅することができない。その代わりに、それらはヌクレオチド置
換に合致する配列突然変異を有する突然変異体ポリヌクレオチドを認識し、増幅
することができる。問題の領域に広がる3'末端置換プライマーのアレイを使用す
ることによって、その領域内の突然変異を検出することができる。

【００７１】 3. 固相支持体本発明の固相支持体は、ヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび合成を
支持するために適当な、任意の固体の材料および構造を有することができる。好
ましくは、固相支持体は少なくとも1つの実質的に剛性の表面を含んでなり、そ
の表面上にプライマーを固定化し、PCR反応を実行することができる。固相支持
体は、例えば、ガラス、合成ポリマー、プラスチック、硬質非メッシュ状ナイロ
ンまたはセラミックから作ることができる。他の適当な固体支持体材料は既知で
あり、当業者に容易に入手可能である。固体支持体のサイズはDNAミクロアレイ
技術に有効な、任意の標準ミクロアレイのサイズであり、そしてサイズは本発明
の反応を実施するために使用する特定の装置に適合するように調整することがで
きる。オリゴヌクレオチドを固定化する目的の固相支持体の誘導化するための方
法および材料はこの分野において知られており、そして、例えば、米国特許第5,
919,523号に記載されており、その開示は引用することによって本明細書の一部
とされる。

【００７２】固体支持体を流体を含有する容器の中に準備するか、あるいはその一部分であ
ることができる。例えば、固体支持体をチャンバーの中に入れることができる。
このチャンバーは固体支持体のへりに沿ってシールをつくった側面を有し、支持
体上にポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含有する。特定の例において、チャンバ
ーは長方形の支持体の各側に壁を有して、PCR混合物が支持体上に止まり、かつ
またプライマーを提供するために有効な全表面をつくることができるようにする
。

【００７３】 4. プライマーの固定化本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、固体支持体上の特定の位置にオリ
ゴヌクレオチドを固定し、固定化し、準備し、および／または適用するための任
意の入手可能な手段を使用して、固体支持体の表面に付着させ、固定化し、準備
し、および／または適用することができる。例えば、下記の特許に記載されてい
るように、写真平版（Affymetrix、カリフォルニア州サンタクララ）を使用して
、チップまたは固体支持体上の特定の位置にオリゴヌクレオチドプライマーを適
用することができる：米国特許第5,919,523号、第5,837,832号、第5,831,070号
および第5,770,722号に記載されており、それらの開示は引用することによって
本明細書の一部とされる。また、オリゴヌクレオチドプライマーは、米国特許第
5,807,522号（1998）に記載されているように、固体支持体に適用することがで
きる。さらに、ロボット・システム、例えば、ジェネティック・ミクロ・システ
ムス（Genetic MicroSystems、マサチュセッツ州ウォバーン）、ジーンマシン
ズ（GeneMachines、カリフォルニア州サンカルロス）またはカーテシアン・テク
ノロジー（Cartesian Technologies、カリフォルニア州アービン）により製作
されているシステムを使用して、プライマーを固体支持体に適用することができ
る。

【００７４】 5. PCR反応本発明を実施するとき、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施するために必要
な試薬と混合された適当なターゲットポリヌクレオチドを含んでなる反応混合物
を、固体支持体上の各固定化されたプライマー対または単一プライマーの集団と
接触させて配置する。適当なターゲットポリヌクレオチドは、二本鎖DNA、RNA鋳
型の逆転写により発生した一本鎖cDNA、またはmRNA集団であることができる。反
応混合物はターゲット鎖に対して相補的なポリヌクレオチドの合成を促進する酵
素を含有する。適当なポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼ酵素、例えば、Ta
q DNAポリメラーゼ、TthI DNAポリメラーゼ、Tne DNAポリメラーゼ、Tma DN
Aポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼまたは任意の他
の熱安定性DNAポリメラーゼを包含する。また、反応混合物はポリメラーゼ連鎖
反応間に新生鎖の中に組込むことができる標識分子を含有し、こうして増幅され
た生成物をPCR後に固体支持体で検出できるようにすることができる。標識はこ
の分野においてよく知られている方法に従い直接的または間接的に検出すること
ができる。直接的検出に適当な標識は、任意の蛍光分子、例えば、フルオレセイ
ンイソチオシアネート、テキサス・レッドまたはローダミンであることができる
。また、間接的検出を促進する分子、例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニンを
PCR間に新生鎖の中に組込むことができる。ビオチンを引き続いて標識化ストレ
プトアビジンまたは標識化抗−ビオチン抗体に結合させることによって検出する
ことができる。同様に、組込まれたジゴキシゲニンは標識化または非標識化抗−
ジゴキシゲニン抗体により検出することができ、そして非標識化抗−ジゴキシゲ
ニン抗体は標識化抗−抗−ジゴキシゲニン抗体を結合させることによって検出す
ることができる。

【００７５】 PCRを実施する試薬がミクロアレイ上の固定化されたプライマーと接触した後
、例えば、自動化システム、例えば、in situ PCR装置を使用して、PCRの発生
を促進する条件下にミクロアレイを配置する。PCR手順のための反応条件はin s
itu PCR装置のマニュアルにより推奨される通りであることができ、使用する鋳
型の特質またはプライマーおよび鋳型のハイブリダイゼーションを使用するとき
予測される困難が分かったとき、適当に変化させることができる。温度およびサ
イクル数は、推奨されるように、また、プライマーの選択および鋳型配列、およ
び他の関係する因子が分かったとき適当に、選択することができる。ミクロアレ
イ上のin situ型PCR反応は、本質的に下記の文献に記載されているように、実
施することができる：Embretson他、「Nature」362：359−362（1993）；Gosden
他、「Bio Techniques」15（1）：78−80（1993）；Heniford他、「Nucl. Aci
d Res.」21（14）：3159−3166（1993）；Long他、「Histochemistry」99：151
−162（1993）；Nuvo他、「PCR Methods and Applications」2（4）：305−3
12（1993）；Patterson他、「Science」260：976−979（1993）。

【００７６】 6. 標識化および検出本発明のPCR法は、試料中の複数のターゲットポリヌクレオチドの検出を提供
する。適当な標識化用試薬の存在下にPCRが完結した後、増幅され、標識化され
たターゲットポリヌクレオチドをミクロアレイ上の当初のプライマー位置の各々
において検出することができる。増幅され、標識化されたターゲットポリヌクレ
オチドの検出は、標識化配列を検出するために使用し、例えば、増幅されたまた
は新しく合成されたDNA鎖の中に組込まれた標識の検出を包含する、標準的方法
により実施することができる。こうして、例えば、蛍光標識または放射能標識を
直接的検出することができる。他の標識化技術は、鎖合成間にDNAの中に組込ま
れた標識、例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニンを標識化された、または標識
化された分子それ自体に結合することができる抗体または他の結合性分子（例え
ば、ストレプトアビジン）により検出することを必要とし、例えば、標識化分子
は、例えば、蛍光分子（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサス
・レッドおよびローダミン）に結合させた、または酵素的に活性化が可能な分子
に結合した抗ストレプトアビジン抗体または抗ジゴキシゲニン抗体であることが
できる。新しく合成された分子上の標識がなんであっても、かつ標識が直接的に
DNAの中に存在するか、またはDNAに結合する（またはDNAに結合する分子に結合
する）分子に結合されているかどうかにかかわらず、標識（例えば、蛍光、酵素
的、化学発光、または比色）は、標識、または特定の標識を検出する他の適当な
手段に依存して、レーザースキャナーまたはCCDカメラ、またはX線フィルムによ
り検出することができる。

【００７７】ターゲットポリヌクレオチドは、PCRの間に増幅されたDNAの中に組込まれる標
識化ヌクレオチド（例えば、直接的標識化のためにdNTP−蛍光標識；間接的標識
化のためにdNTP−ビオチンまたはdNTP−ジゴキシゲニン）を使用することによっ
て検出することができる。間接的に標識化されたDNAについて、検出は蛍光また
は酵素結合ストレプトアビジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体により実施される。
PCR法において、ポリヌクレオチドターゲットに対する新しく合成された補体の
中に組込まれた標識を検出することによって、ポリヌクレオチドを検出する。こ
の目的のために、前述したように、DNAが合成されているときDNAの中に組込むこ
とができる任意の標識、例えば、フルオロ−dNTP、ビオチン−dNTP、またはジゴ
キシゲニン−ジゴキシゲニンを使用することができ、そしてそれらの標識はこの
分野において知られている。溶液中で1以上の万能プライマーを使用して実施さ
れるPCR増幅は、万能プライマーを検出することによって、固体支持体上の位置
において増幅されたターゲットを検出するオプションを提供する。こうして、2
以上の万能プライマーを使用する場合、異なる源からのターゲット鎖を固体支持
体上で示差的に検出することができる。

【００７８】示差的発現系において、異なる生物学的源に由来する増幅生成物は、節「C.
異なる生物学的源からの示差的発現を比較する」に記載されているように、それ
らの由来に基づいて増幅された鎖を示差的に標識化することによって検出するこ
とができる。1つの面において、本発明において使用する検出法は単一源ターゲ
ットについての検出法と異なり、示差的標識（例えば、赤色色素および緑色色素
）を、増幅の間に新生鎖の中に組込むよりは、むしろ、溶液中のプライマータグ
上に前もって組込む。あるいは、示差的標識に加えて、第3標識をまた新生鎖の
中に組込むことができ、こうして示差的発現の比較に対する全体の感度は増強さ
れる。

【００７９】 7. 検出キット本発明は、本発明の方法を実施するキットを提供する。キットは、例えば、そ
うでなければ固体支持体上の検出が困難である、複数のターゲットポリヌクレオ
チドを検出する物質および試薬を含むことができる。キットは、例えば、固体支
持体、ターゲットポリヌクレオチドの特定の組のためのターゲットポリヌクレオ
チド、ポリメラーゼ連鎖反応の試薬および成分、例えば、DNA合成のための酵素
、標識化物質、および他の緩衝剤および洗浄のための試薬を含むことができる。
また、キットは固体支持体上で特定のターゲットを増幅するためにキットを使用
するための使用説明書を含むことができる。キットは固体支持体上に既に固定さ
れたプライマーの組、例えば、ターゲットポリヌクレオチドの特定の組を増幅の
ためのプライマーの組を有する調製された固体支持体を含有する場合、このよう
な調製された固体支持体の設計および構築は前述した通りである。このような固
体支持体は、検出しようとするターゲットポリヌクレオチドに依存して個々のキ
ットのためにあつらえて作ったものであることができる。また、固体支持体がin
situ型のPCR装置を使用してPCR増幅することができる場合、例えば、in situ
型または固相型のPCR手順を使用して、固体支持体上でPCRを実施するために必要
な試薬をキットは含むことができる。支持体をPCRの試薬と接触させることがで
きる。反応前に、潜在的に複数のターゲットポリヌクレオチドを含有する試料を
PCR反応混合物に添加する。PCR試薬は、通常のPCR緩衝剤、熱安定性ポリメラー
ゼ（例えば、Taq DNAポリメラーゼ）、ヌクレオチド（例えば、dNTP）、および
他の成分および標識化用分子（例えば、前述したように直接的または間接的標識
化のための）を包含する。固体支持体は、固体支持体上に表示した位置に付着さ
れたプライマーを提供する。PCRを実施するために、固定化プライマーを有する
支持体を、PCRを実施のための試薬および反応混合物中のターゲットポリヌクレ
オチド鋳型と接触させ、PCR（例えば、in situ型または固相型のPCR）条件に暴
露する。キットに使用するための使用説明書は、例えば、上記方法の説明におい
て示したような手順についての詳細な説明を含むことができる。固定化プライマ
ーを単独で、または、代替的に、溶液相プライマーと一緒に使用するPCRの増幅
の実行を支持するように、キットを組立てることができる。

【００８０】実施例実施例1 ミクロアレイ上の4つのDNA鋳型の増幅 4つのcDNAターゲットポリヌクレオチド、ヒトG3PDH、PKC−α、c−Raf、およ
びサイクリンAをミクロアレイ上の増幅により検出のために選択した。この増幅
は、プライマー対の両方のメンバーが支持体上に固定化されている対称PCR、ま
たはプライマー対の一方のメンバーが固定化されており、そして他のメンバーが
溶液の中に存在する、非対称PCRにより実施される。

【００８１】 a. G3PDHの対称増幅これらのターゲットポリヌクレオチドの仮定または推定した配列に基づいて、
プライマー対の集団を4つのターゲットの各々について設計し、合成する。固体
支持体に対するプライマーの付着を促進するためにアミンの5'末端の修飾を使用
して、プライマーを合成した。シラン化ガラススライド（Sigma Chemicals、ミ
ゾリー州セントルイス、から購入した）上に、異なる濃度で、プライマーを対と
してまたは単一プライマーとしてスポットした。

【００８２】準備されたプライマーを有するシラン化スライドを、室温において飽和NaClチ
ャンバー中で一夜水和した。水和されたスライドを4×SSCで5分間リンスし、次
いで水で洗浄した。スライドをSurModics（ウイスコンシン州マディソン）ブロ
ッキング溶液（0.1％SDSを含む）で50℃において15分間ブロックし、次いで水で
2回洗浄し、次いで空気乾燥した。そこでスライドは使用できる状態にある。

【００８３】 PCR溶液を下記の最終濃度に調製した：200μMの各dATP、dGTP、およびdTTP；1
00μMのdCTPおよび100μMのビオチン−14−dCTP。また、反応溶液は1×Taq反応
緩衝液（1.5mMのMgCl₂を含む）；DNA鋳型としてヒトG3PDH遺伝子プラスミド（10
0ngのファージミドDNAまたは500ngの一本鎖cDNAライブラリー）および2.5単位の
Taq酵素を含有する。次のような70μlの反応溶液が発生した： 7μl 2mMのd3TP（dATP、dGTP、およびdTTP） 12.5μl 0.4mMのdCTP 12.5μl 0.4mMのビオチン−14−dCTP 7μl 10×反応緩衝液（w／15mMのMgCl₂） 5μl DNA鋳型 25.5μl 水 0.5μl 5単位／μlのTaq DNAポリメラーゼ 70μlの総体積について。

【００８４】 HyBaidチャンバー（マサチュセッツ州フランクリン）をスライド上に配列され
た位置を中心にして配置し、反応溶液をチャンバーに移し、プラスチックカバー
でシールした。PCR装置を予備加温し、下記のサイクリングプロトコルを適用し
た：開始 −−−94℃ 5分主サイクル：（工程1〜3）35×反復する −1 −−−94℃ 30秒 −2 −−−55℃ 30秒 −3 −−−72℃ 30秒最終エクステンション −−−72℃ 7分終了 −−−4℃ 保持

【００８５】 PCRが完結した後、スライドをジゴキシゲニンブロッキング溶液（Boehringer Mannheim、インジアナ州インジアナポリス）で室温において30分間ブロックし
た。スライドをストレプトアビジン（5μg／ml）（ジゴキシゲニンブロッキング
溶液中で1：250に希釈した）で室温において30分間おだやかに震盪しながら染色
した。ジゴキシゲニン洗浄緩衝液を使用して、スライドを室温において15分間、
2回洗浄した。スライドをジゴキシゲニンブロッキング溶液で室温において30分
間ブロックした。

【００８６】スライドをジゴキシゲニンブロッキング溶液中で1：100に希釈した第1抗体（
ウサギ抗ストレプトアビジン）と室温において1時間インキュベートした。スラ
イドをジゴキシゲニン洗浄緩衝液で室温において15分間、2回洗浄した。スライ
ドをジゴキシゲニンブロッキング溶液中で1：100に希釈した第2抗体（Cy3結合ヤ
ギ抗ウサギ抗体）と室温において30分間インキュベートした。スライドをジゴキ
シゲニン洗浄緩衝液で室温において15分間、2回洗浄した。スライドをジェネテ
ィック・ミクロシステム（Genetic MicroSystem）、GMS418からの緑色ビームで
走査した。

【００８７】対称PCRの結果を図4Aに示す。照明されたスポットは、ヒトG3PDHプライマーが
固定化されているスポットにおけるhu G3PDH鋳型の増幅の成功を示す。対照的
に、他の非ヒトG3PDHプライマーが固定化されているスポットにおいて、ターゲ
ットヒトG3PDH鋳型の検出は見られない。

【００８８】 b. hu G3PDHの非対称増幅 4つのターゲットcDNA、hu G3PDH、PKC−α、c−Raf、およびサイクリンAの各
々についてプライマーの組を使用して、非対称PCR反応を実行した。装置上の各
スポットは、図4Bに示めされたように定められた濃度で、ターゲットcDNAに対し
て特異的なプライマーの組を含有する。固定化プライマーに加えて、hu G3PDH
アンチセンスプライマーをまた25pmolで反応溶液に添加した。鋳型として1pgのh
u G3PDH cDNAを使用するPCR増幅を前述した条件下に実施した。

【００８９】 hu G3PDH cDNAの非対称PCRの結果を図4Bに示す。欄1〜6のスポットしたプラ
イマー濃度はそれぞれ3.125、6.25、12.5、25、50および100pmol／μlである。
照明されたスポットは、hu G3PDHプライマーを含有するスポットにおいてhu G
3PDHの増幅生成物のみを検出することができることを示し、アッセイの強い特異
性を示唆する。さらに、非対称PCRの結果の解像能は図2Aに示す対称PCRの結果よ
りも高いように見え、非対称方法を使用するときのよりすぐれた感度を示唆する
。

【００９０】 c. 1つのミクロアレイ上の4つのターゲットcDNAの非対称増幅 1つの単一ミクロアレイ上で複数のターゲットポリヌクレオチドを検出するた
めに、本発明の非対称方法をさらに試験した。

【００９１】ミクロアレイおよびその上のプライマーは1bにおけるプライマーと同一であり
、各スポットはターゲットcDNAに対して特異的な単一プライマーの組を含有し、
決定された濃度を有する。反応溶液は、各々25pMolで、4つのターゲットcDNAの
各々のためのアンチセンス鎖プライマーを含有した。また、反応溶液はPCR増幅
のための鋳型として4つのcDNAの各々を含有した。PCR反応を実施例1aに記載され
ているように実施した。

【００９２】図4Cに示す結果は、プライマーの最低濃度においてさえ、すべてのターゲット
鋳型が首尾よく増幅されたことを示す。

【００９３】実施例2 RNAターゲットの固相増幅この実施例において、生物学的源中のmRNA発現の検出について、非対称PCR法
を試験した。

【００９４】 5μgのmRNAをOVC1.1細胞から単離し、一本鎖cDNAの逆転写に使用した。SuperS
cript IIキット（Life Technology Inc.）を使用して逆転写反応を実施した
。反応溶液中で25pMolの万能プライマー（Uni−1）を使用する非対称PCRを実行
するための鋳型として、0.5μgの調製したcDNAを使用し、そして4つのターゲッ
ト遺伝子、hu G3PDH、PKC−α、サイクリンAおよびc−Rafに対して特異的プラ
イマーを種々の濃度でミクロアレイの異なるスポット上に固定化した。上記実施
例1（a）に記載されているような条件および手順に従い、PCR反応を実施した。

【００９５】結果を表5に示す。4つのターゲット遺伝子の発現パターンは異なる発現量を示
し、G3PDHは最大量であり、そしてc−Rafは最小量である。

【００９６】実施例3 ハイブリダイゼーション前の固相増幅によるシグナルの増強この実施例において、ハイブリダイゼーション前にPCRによる固相増幅を実施
したとき発生したシグナルと、ハイブリダイゼーション単独により発生したシグ
ナルを比較した。図6に図解されているように、ミクロアレイ上のハイブリダイ
ゼーション前に固相PCRを実行しかつ実行しないで、卵巣癌腫細胞系統OVC1.1お
よび胎児の脳の遺伝子発現分析からのシグナルを比較した。

【００９７】図6A〜図6Bは、標準方法に従う酵素的標識化により全mRNAから調製した蛍光プ
ローブとハイブリダイゼーションした、OVC1.1細胞からのアレイ因子を含有する
DNAミクロアレイを図解する。（下記の文献を参照のこと：Schena M.、およびD
avis R.W.（1998）、「genes，Genomes and Chips. in DNA Microarray：
A Practical Approach」（編者M. Schena）、Oxford University Press、
英国オックスフォード）。図6Aは標準プロトコル後のハイブリダイゼーションシ
グナルを図解するが、図6Bは上記実施例1（a）に記載されている条件および手順
に従い実施した固相PCR反応後のハイブリダイゼーションの結果を図解する。

【００９８】同一ラインに沿った他の実験の結果を図6C〜図6Dに示す。図6Cは胎児の脳のcD
NAターゲットを含んでなるミクロアレイに対する蛍光標識化細胞のmRNAプローブ
のハイブリダイゼーション後のシグナルを図解するが、図6Dは本発明による固相
PCR反応後のハイブリダイゼーションの結果を示す。

【００９９】実施例4 固相増幅後のハイブリダイゼーションシグナルの特異性下記の実施例において、固相増幅後のハイブリダイゼーション反応の特異性を
試験した。4つのcDNAターゲットポリヌクレオチド、ヒトG3PDH、PKC−α、c−Ra
f、およびサイクリンAをミクロアレイ上の増幅による特異的検出について選択し
た。

【０１００】 a. G3PDHの特異的増幅アミン被覆ガラスチップを、ヒト遺伝子G3PDH、PKC−α、c−Raf、およびサイ
クリンAからの4つの異なるセンス鎖プライマーでスポットした。pG3PDHからの1p
g（約4×10⁵コピー）の一本鎖ファージミドDNAを25pMolのG3PDHアンチセンスプ
ライマーとともに溶液中で使用するDNAポリメラーゼ連鎖反応により、ヒトG3PDH
を特異的に増幅し、PCR後検出した。

【０１０１】 5μgのmRNAをOVC1.1細胞から単離し、一本鎖cDNAの逆転写に使用した。SuperS
cript IIキット（Life Technology Inc.）を使用して逆転写反応を実施した
。0.5μgの調製したcDNAを鋳型として使用して、反応溶液中で25pMolの万能プラ
イマー（Uni−1）を用いる非対称PCRを実施し、そして4つのターゲット遺伝子、
hu G3PDH、PKC−α、サイクリンAおよびc−Rafに対して特異的なプライマーを
種々の濃度でミクロアレイの異なるスポット上に固定化した。PCR反応を上記実
施例1（a）に記載されている条件および手順に従い実施した。

【０１０２】結果を図7に示す。欄1〜6のスポッティングプライマー濃度はそれぞれ3.125、
6.25、12.5、25、50および100pmol／μlである。照明されたスポットは、hu G3
PDHプライマーを含有するスポットにおいてhu G3PDHの増幅生成物のみを検出す
ることができることを示し、アッセイの強い特異性を示唆する。

【０１０３】 b. G3PDHおよびc−Rafの特異的増幅アミン被覆ガラスチップを、ヒト遺伝子G3PDH、PKC−α、c−Raf、およびサイ
クリンAからの4つの異なるセンス鎖プライマーでスポットした。100ngのc−Raf
DNA、およびpG3PDHからの1pg（約4×10⁵コピー）の一本鎖ファージミドDNAを2
5pMolのG3PDHアンチセンスプライマーとともに、しかしc−Rafアンチセンスプラ
イマーの不存在下に、溶液中で使用するDNAポリメラーゼ連鎖反応により、ヒトG
3PDHを特異的に増幅し、PCR後検出した。

【０１０４】 4つのターゲット遺伝子、hu G3PDH、PKC−α、サイクリンAおよびc−Rafに対
して特異的プライマーを種々の濃度においてミクロアレイの異なるスポット上に
固定化した。PCR反応を上記実施例1（a）に記載されている条件および手順に従
い実施した。結果を図8に示す。欄1〜6のスポッティングプライマー濃度はそれ
ぞれ3.125、6.25、12.5、25、50および100pmol／μlである。照明されたスポッ
トは、hu G3PDHプライマーを含有するスポットにおいてhu G3PDHの増幅生成物
を検出することができることを示し、シグナルはc−Rafプライマーを含有するす
るスポットにおいて検出されたc−Rafよりも強く、アッセイの強い特異性ならび
にhu G3PDHに対する非対称PCRの感度の増強を示唆する。

【０１０５】 c. G3PDH、PKC−α、c−Raf、およびサイクリンAの特異的増幅アミン被覆ガラスチップを、ヒト遺伝子G3PDH、PKC−α、c−Raf、およびサイ
クリンAからの4つの異なるセンス鎖プライマーでスポットした。鋳型として4つ
の遺伝子集団および25pMolのG3PDHアンチセンスプライマーを溶液中で使用するD
NAポリメラーゼ連鎖反応により、すべての4つの遺伝子を特異的に増幅し、PCR後
検出した。

【０１０６】結果を図9に示す。欄1〜6のスポッティングプライマー濃度はそれぞれ3.125、
6.25、12.5、25、50および100pmol／μlである。照明されたスポットは、すべて
の4つの増幅生成物を検出できることを示す。

【０１０７】 d. 胎児の脳のcDNAライブラリー遺伝子発現分析に対する特異的増幅について
の試験ミクロアレイチップ上のDNA PCRの鋳型として、ヒトの胎児の脳のcDNAライブ
ラリー（Stratagene）を使用した。4つのターゲット遺伝子、hu G3PDH、PKC−
α、サイクリンAおよびc−Rafに対して特異的なプライマーを種々の濃度でスポ
ットしたミクロアレイ上で、0.05μgの調製したcDNAを鋳型として使用して、反
応溶液中で25pMolの万能プライマー（Uni−1）を用いるPCR増幅を実施した。PCR
反応を上記実施例1（a）に記載されている条件および手順に従い実施した。

【０１０８】結果を図10に示す。欄1〜6のスポッティングプライマー濃度はそれぞれ3.125
、6.25、12.5、25、50および100pmol／μlである。データは同一DNA試料を使用
するHO1 ExpressChip（商標）（Mergen，Ltd.、カリフォルニア州サンレアンド
ロ）上のハイブリダイゼーションの結果と合致した。

【０１０９】 e. OVC1.1細胞遺伝子発現分析に対する特異的増幅についての試験アミン被覆ガラスチップを、ヒト遺伝子G3PDH、PKC−α、c−Raf、およびサイ
クリンAからの4つの異なるセンス鎖プライマーでスポットした。pG3PDHからの1p
g（約4×10⁵コピー）の一本鎖ファージミドDNAを25pMolのG3PDHアンチセンスプ
ライマーとともに溶液中で使用するDNAポリメラーゼ連鎖反応により、ヒトG3PDH
を特異的に増幅し、PCR後検出した。

【０１１０】 5μgのmRNAをOVC1.1細胞から単離し、SuperScript IIキット（Life Technol
ogy Inc.）を使用して一本鎖cDNAに逆転写した。0.05μgのcDNAを鋳型として使
用して、反応溶液中で25pMolの万能プライマー（Uni−1）を用いる非対称PCRを
実施し、そしてターゲット遺伝子、hu G3PDH、PKC−α、およびサイクリンAの
ためのセンス鎖オリゴヌクレオチドプライマーを種々の濃度でミクロアレイの異
なるスポット上に固定化した。

【０１１１】結果を図11に示す。欄1〜6のスポッティングプライマー濃度はそれぞれ3.125
、6.25、12.5、25、50および100pmol／μlである。照明されたスポットは、固相
増幅による相対的シグナルの非常にわずかの歪みを示す。

【０１１２】この明細書の中に引用したすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物ま
たは特許出願が特別にかつ個々に引用することによって本明細書の一部とされる
と示される場合、引用することによって本明細書の一部とされる。

【０１１３】本発明を理解を明瞭にする目的で例示および実施例により多少詳細に記載した
が、当業者にとって容易に明らかなように、添付の特許請求の範囲の精神または
範囲から逸脱しないで本発明の教示を考慮すればある種の変化および変更が可能
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図1（1A〜1E）は、固定化されたプライマーを使用して、ターゲットポリヌク
レオチド（A、B、C）を増幅し、検出する固相増幅方法を概略的に描写する。

【図２】図2（2A〜2E）は、固定化されたプライマーを溶液相万能プライマーと組み合
わせて使用して、ターゲットポリヌクレオチド（A、B、C）を増幅し、検出する
固相増幅方法を概略的に描写する。

【図３】図3（3A〜3E）は、固定化されたプライマーを溶液相プライマーとして働く示
差的に標識化された配列タグと組み合わせて使用して、2つの異なる生物学的源
からのターゲットポリヌクレオチド（A、B、C）を増幅し、検出し、比較する固
相増幅方法を概略的に描写する。

【図４】図4（4A〜4C）は、鋳型として4つのターゲットcDNAを使用する固相増幅実験の
結果を示す。

【図５】図5は、ターゲットmRNAの固相増幅の結果を示す。

【図６】図6は、ハイブリダイゼーション前の固相PCR増幅によるハイブリダイゼーショ
ンシグナルの増強を示す。図6Aは標準プロトコル後のハイブリダイゼーションシ
グナルを図解するが、図6Bは固相PCR反応後のハイブリダイゼーションシグナル
を図解する。図6Cは胎児の脳のcDNAターゲットを含んでなるミクロアレイに対す
るハイブリダイゼーション後のシグナルを図解するが、図6Dは固相PCR反応後の
ハイブリダイゼーションシグナルの結果を図解する。

【図７】図7は、鋳型としてG3PDHターゲットcDNAを使用する固相増幅後のハイブリダイ
ゼーションの特異性を図解する。

【図８】図8は、鋳型としてG3PDHおよびc−RafターゲットcDNAを使用する固相増幅後の
ハイブリダイゼーションの特異性を図解する。

【図９】図9は、鋳型として4つの異なるターゲットcDNAを使用する固相増幅後のハイブ
リダイゼーションの特異性を図解する。

【図１０】図10は、鋳型として4つの異なるターゲットcDNAを使用する胎児の脳のライブ
ラリーからのターゲットmRNAの固相増幅後のハイブリダイゼーションの特異性を
図解する。

【図１１】図11は、鋳型として3つの異なるターゲットcDNAを使用するOVC1.1からのター
ゲットmRNAの固相増幅後のハイブリダイゼーションの特異性を図解する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ユー，ツァイリンアメリカ合衆国，カリフォルニア 94577，サンリーンドロ，ベルバディアアベニュ 2374 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA04 CA09 FA02 HA19 4B063 QA12 QA13 QQ42 QR32 QR55 QR62 QS25 QS34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の複数のターゲットポリヌクレオチドを検出する方法
であって、工程： a）オリゴヌクレオチドプライマーのアレイを準備し、各アレイは固相支持体
の離散領域上に固定化されたオリゴヌクレオチドプライマーの1以上のグループ
を含有し、オリゴヌクレオチドプライマーの各グループは特定のターゲットポリ
ヌクレオチドについて選択可能であり、そして特定のターゲットポリヌクレオチ
ドの配列に対して相補的であるプライマー配列を含んでなり； b）試料を含んでなる反応混合物とアレイを接触させ、前記試料は複数のター
ゲットポリヌクレオチドを含有するか、あるいは含有することが推測され、前記
反応混合物はポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび増幅に適当な試
薬をさらに含んでなり； c）少なくとも2ラウンドのポリメラーゼ仲介ポリヌクレオチド増幅を実行し、
ここでターゲットポリヌクレオチドは固定化されたプライマーから伸長する検出
可能な新生ポリヌクレオチド合成のための初期の鋳型として働き；そして d）対応する固定化されたプライマーを介して固相支持体の離散領域上に捕捉
された、合成されたポリヌクレオチドの存在および量を検出する；を含んでなる、前記方法。
【請求項２】反応混合物が溶液相プライマーの集団をさらに含んでなる、
請求項1に記載の方法。
【請求項３】溶液相プライマーが万能プライマーである、請求項2に記載
の方法。
【請求項４】万能プライマーがオリゴ−dTプライマーである、請求項3に
記載の方法。
【請求項５】万能プライマーがSP6プロモーター、T3プロモーターまたはT
7プロモーターを含んでなる、請求項3に記載の方法。
【請求項６】反応混合物が新生ポリヌクレオチドの中に組込まれた検出可
能な標識を含み、これにより新生ポリヌクレオチドが検出可能とされている、請
求項1に記載の方法。
【請求項７】検出可能な標識が蛍光分子である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】検出可能な標識がビオチニル化dNTPまたはジゴキシゲニンdN
TPである、請求項6に記載の方法。
【請求項９】反応混合物が新生ポリヌクレオチドの中に組込まれた第2標
識に特異的に結合する第1検出可能標識を含み、これにより新生ポリヌクレオチ
ドが検出可能である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】第2標識がビオチニル化dNTPであり、そして第1検出可能標
識が蛍光分子または酵素的に活性化可能な分子に結合したストレプトアビジンで
ある、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】第2標識がジゴキシゲニンdNTPであり、そして第1検出可能
標識が蛍光分子または酵素的に活性化可能な分子に結合した抗ジゴキシゲニン抗
体である、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】アレイが固定化オリゴヌクレオチドプライマーの少なくと
も約100〜約100,000グループを含んでなる、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】アレイが固定化オリゴヌクレオチドプライマーの少なくと
も約1,000グループを含んでなる、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】アレイが固定化オリゴヌクレオチドプライマーの少なくと
も約10,000グループを含んでなる、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】固相支持体が、ガラス、プラスチック、合成ポリマー、セ
ラミックおよびナイロンから成る群から選択される物質から作られている、請求
項1に記載の方法。
【請求項１６】ポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、TthI DNAポリ
メラーゼ、Tne DNAポリメラーゼ、Tma DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラー
ゼ、Vent DNAポリメラーゼまたは任意の他の熱安定性DNAポリメラーゼである、
請求項1に記載の方法。
【請求項１７】少なくとも2つの異なる生物学的源からの複数のターゲッ
トポリヌクレオチドの発現パターンを検出し、比較する方法であって、工程： a）固相支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプライマーの複数のグル
ープのアレイを準備し、オリゴヌクレオチドプライマーの各グループは特定のタ
ーゲットポリヌクレオチドについて選択され、そしてターゲットポリヌクレオチ
ドの配列に対して相補的であるプライマーを含んでなり、ここで各生物学的源か
らのターゲットポリヌクレオチドは生物学的源に対してユニークな共有結合され
た配列タグを含有し； b）少なくとも2つの異なる生物学的源からの複数のターゲットポリヌクレオチ
ドを含む試料とアレイを接触させ； c）ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび増幅に適当な条件下に
ポリメラーゼ仲介ポリヌクレオチド増幅の第1ラウンドを実行し、ここで異なる
生物学的源からのターゲットポリヌクレオチドは、固定化されたプライマーから
伸長する相補的新生ポリヌクレオチド鎖の合成のための初期の鋳型として働き； d）各生物学的源に対してユニークな溶液相配列の存在下にポリメラーゼ仲介
ポリヌクレオチド増幅の第2ラウンドを実行し、ここで溶液相配列タグはプライ
マーとして働き、そして工程c）からの固定化された新生ポリヌクレオチド鎖は
、溶液相配列タグから伸長する新しい増幅生成物の合成のための鋳型として働き
；そして e）異なる生物学的源からのターゲットポリヌクレオチドの固定化増幅生成物
を検出し、比較する；を含んでなる、前記方法。
【請求項１８】異なる生物学的源が異なる細胞である、請求項17に記載の
方法。
【請求項１９】異なる生物学的源が異なる組織である、請求項17に記載の
方法。
【請求項２０】異なる生物学的源が異なる個体である、請求項17に記載の
方法。
【請求項２１】異なる生物学的源が異なる種である、請求項17に記載の方
法。
【請求項２２】異なる生物学的源からのターゲットポリヌクレオチドの増
幅生成物を異なる標識により検出する、請求項17に記載の方法。
【請求項２３】前記標識が蛍光分子である、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】前記標識がビオチンまたはジゴキシゲニンである、請求項
22に記載の方法。
【請求項２５】配列タグが万能プライマーである、請求項17に記載の方法
。
【請求項２６】万能プライマーが、SP6プロモーター、T3プロモーターま
たはT7プロモーターを含んでなる、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】試料中の複数のターゲットポリヌクレオチドを検出するキ
ットであって、 a）オリゴヌクレオチドプライマーの複数の固定化されかつ別々の集団を含ん
でなる固相支持体、各集団は異なるターゲットポリヌクレオチドに対してハイブ
リダイゼーションするように選択され、ここで各プライマーはポリヌクレオチド
を増幅する特異的ターゲットポリヌクレオチドを使用するポリメラーゼ連鎖反応
を実施するために適当である； b）固体支持体上でポリメラーゼ仲介増幅反応を実施するために必要な試薬：
および c）支持体上の増幅されたポリヌクレオチドを検出する検出手段；を含んでなる、前記キット。
【請求項２８】検出手段が、増幅反応の間に増幅されたポリヌクレオチド
の中に組込まれる標識を含んでなる、請求項27に記載のキット。
【請求項２９】検出手段が第1標識を含んでなり、前記第1標識は増幅反応
の間に増幅されたポリヌクレオチドの中に組込まれる第2標識に特異的に結合す
る、請求項27に記載のキット。
【請求項３０】少なくとも2つの異なる生物学的源からの複数のターゲッ
トポリヌクレオチドの発現パターンを検出し、比較するためのアレイであって、固相支持体の離散領域上に固定化されたオリゴヌクレオチドプライマーの少な
くとも2つのグループを含んでなり、オリゴヌクレオチドプライマーの各グルー
プは特定のターゲットポリヌクレオチドについて選択され、そして特定のターゲ
ットポリヌクレオチドの配列に対して相補的な配列を含んでなり、ここで各グル
ープは固体支持体上でその位置により同定可能であり、さらにここでは単一の生
物学的源からのターゲットポリヌクレオチドの発現パターンを検出するために使
用可能である、前記アレイ。
【請求項３１】アレイが固定化オリゴヌクレオチドプライマーの少なくと
も約100〜約100,000グループを含んでなる、請求項30に記載のアレイ。
【請求項３２】アレイが固定化オリゴヌクレオチドプライマーの少なくと
も約1,000グループを含んでなる、請求項30に記載のアレイ。
【請求項３３】アレイが固定化オリゴヌクレオチドプライマーの少なくと
も約10,000グループを含んでなる、請求項30に記載のアレイ。