JP2013051958A

JP2013051958A - マルチ核酸増幅反応具

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Publication number: JP2013051958A
Application number: JP2012173237A
Authority: JP
Inventors: Masayoshi Takahashi; 匡慶高橋; Koji Hashimoto; 幸二橋本; Masaru Nikaido; 勝二階堂; Nobuhiro Motoma; 信弘源間
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 2011-08-05
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2013-03-21
Anticipated expiration: 2032-08-03
Also published as: JP5216928B2; JP2013116125A

Abstract

【課題】複数種類の標的配列の増幅反応を独立して同時に行うことのできるマルチ核酸増幅用容器を提供することである。
【解決手段】実施形態のマルチ核酸増幅反応具は、支持体と複数種類のプライマーセットを具備する。支持体は液相の反応場を支持するように構成される。複数種類のプライマーセットは、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面の互いに独立した固定化領域に種類毎に遊離可能に固定される。複数種類のプライマーセットは、そのそれぞれに対応する標的配列を増幅するように構成される。
【選択図】図１

Description

本発明はマルチ核酸増幅反応具に関する。

現在、遺伝子検査技術の進展に伴い、臨床現場や犯罪捜査など、様々な場面で遺伝子検査が実施されている。これらの遺伝子検査では、複数の対象遺伝子を検出し、それらの結果を総合することで初めて有用なものとなることが多い。例えば、臨床現場では病原菌特定などが行われる。その場合、患者の症状に基づいて感染が疑われる複数種の微生物、または各微生物の型が判定される。それにより、診断が行われる。犯罪捜査現場では、例えば、個人特定などが行われる。その場合、全ての人がそのゲノム上に持っている複数の遺伝子座における繰り返し配列について、繰り返しの回数が特定される。特定された複数の遺伝子座における繰り返し数から総合的に個人を特定する。それにより、高確率で個人を特定することができる。このように複数の対象遺伝子を検出する技術が非常に重要なものとなっている。

従来、複数の対象遺伝子を検出する場合、初めに特定の反応容器内で試料核酸の増幅が行われる。その後、得られた増幅産物についての検出が更なる検出用の反応装置内において行われる。

増幅は、主に次の複数または１つの反応容器内で行われる。複数の反応容器内で増幅を行う場合には、それぞれの対象遺伝子を増幅するための反応容器がそれぞれ用意される。１つの反応容器内で増幅を行う場合には、全ての対象遺伝子を検出するための試薬が１つの反応容器に収納されて、マルチ核酸増幅反応が行われる。検出されるべき核酸の検出は、一般的には、増幅産物をＤＮＡチップや電気泳動などに供することにより行われる。

特許第４１２７６７９号公報特開２００８−２６３９５９号公報特開２００５−２６１２９８号公報

本発明が解決しようとする課題は、複数種類の標的配列を互いに独立して同時に増幅させることができるマルチ核酸増幅反応具を提供することである。

実施形態のマルチ核酸増幅反応具は、支持体と複数種類のプライマーセットを具備する。支持体は液相の反応場を支持できるように構成される。複数種類のプライマーセットは、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面の互いに独立した固定化領域に種類毎に遊離可能な状態で固定される。複数種類のプライマーセットは、そのそれぞれに対応する標的配列を増幅するように構成される。

図１は、マルチ核酸増幅反応具の１例を示す図である。図２は、マルチ核酸増幅反応具の１例を示す図である。図３は、マルチ核酸増幅反応具の１例を示す図である。図４は、マルチ核酸増幅反応具の１例を示す図である。図５は、実施形態を用いる検出方法を示すスキームである。図６は、実施形態により得られた増幅産物を検出したときに得られる結果を模擬的に示すグラフである。図７は、マルチ核酸増幅反応具の１例を示す図である。図８は、マルチ核酸増幅反応具の１例を示す図である。図９は、マルチ核酸増幅検出反応具の１例を示す図である。図１０は、マルチ核酸増幅検出反応具の１例を示す図である。図１１は、チップ素材の１例を示す図である。図１２は、マルチ核酸増幅検出反応具の１例を示す図である。図１３は、マルチ核酸増幅検出反応具の１例を示す図である。図１４は、マルチ核酸増幅検出反応具の１例を示す図である。図１５は、マルチ核酸反応具の１例を示す図である。図１６は、マルチ核酸反応具により得られた実験結果を示す図である。図１７は、核酸検出用デバイスの概略図である。図１８は、核酸検出用デバイスの概略図である。図１９は、核酸検出用デバイスの概略図である。図２０は、核酸検出用デバイスの概略図である。図２１は、支持体の概略図である。図２２は、核酸検出用デバイスの概略図である。図２３は、核酸検出用デバイスの概略図である。図２４は、核酸増幅反応の結果を示すグラフである。図２５は、核酸検出用デバイスの概略図である。図２６は、核酸検出用デバイスの概略図である。図２７は、核酸検出用デバイスの概略図である。図２８は、核酸検出用デバイスの概略図である。図２９は、核酸検出用デバイスの概略図である。図３０は、核酸検出用デバイスの概略図及び核酸増幅反応の結果を示すグラフである。図３１は、核酸検出用デバイスの作成手順を示す図である。図３２は、核酸検出用デバイスの概略構成を示す断面図である。図３３は、核酸検出用デバイスの概略構成を示す図である。図３４は、核酸検出用デバイスの表面における反応領域近傍の拡大図である。図３５は、核酸検出用デバイス内蔵カセットの概略構成を示す図である。図３６は、核酸検出用デバイスと反応部規定用部材の対向配置を示す図である。図３７は、核酸検出用デバイスの表面における反応領域近傍の拡大図である。図３８は、核酸検出用デバイスの表面における反応領域近傍の拡大図である。図３９は、核酸検出用デバイスの表面における反応領域近傍の拡大図である。図４０は、核酸増幅反応の結果を示すグラフである。図４１は、核酸検出用デバイスの表面における反応領域近傍の拡大図である。図４２は、各電極から得られた結果を示すグラフである。図４３は、核酸検出用デバイスの表面における反応領域近傍の拡大図である。図４４は、各電極から得られた結果を示すグラフである。図４５は、核酸反応具を示す平面図である。図４６は、核酸反応具を示す透視図である。図４７は、核酸反応具を示す透視図である。図４８は、核酸反応具を示す透視図である。図４９は、核酸反応具を示す透視図である。図５０は、チップ素材を示す図である。図５１は、アレイ型プライマープローブチップを示す図である。図５２は、アレイ型プライマープローブチップを示す図である。図５３は、アレイ型プライマープローブチップを示す図である。図５４は、核酸検出カセットの概略構成を示す分解斜視図である。図５５は、核酸検出カセットの概略構成を示す斜視図である。図５６は、核酸検出装置の概略構成を示す斜視図である。

以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。

１．定義
「マルチ核酸増幅」とは、増幅されるべき複数種類の標的配列を同時に増幅することをいう。「増幅」とは、プライマーセットを用いて鋳型核酸を連続して複製する工程をいう。使用可能な増幅法は、プライマーセットを用いて標的核酸を増幅する方法であれはよく、これらに限定するものではないが、例えば、ＰＣＲ増幅、ＬＡＭＰ増幅、ＲＴ−ＬＡＭＰ増幅、ＳＭＡＰ増幅およびＩＣＡＮ増幅などを含む。

「標的配列」とは、プライマーセットにより増幅しようとする配列をいい、使用されるプライマーが結合する領域をも含む。

「標的核酸」とは、標的配列を少なくとも含む配列であり、使用されるプライマーセットにより鋳型として使用される核酸であり、「鋳型核酸」とも称する。

「プライマーセット」とは、１つの標的核酸を増幅するために必要なプライマーの集合体である。例えば、ＰＣＲ増幅用のプライマーセットの場合、１つのプライマーセットは、１つの標的核酸を増幅するための１種類のフォワードプライマーと１種類のリバースプライマーとを含めばよい。また例えば、ＬＡＭＰ増幅用のプライマーセットの場合、１つのプライマーセットは、少なくとも１つの標的核酸を増幅するためのＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーを含めばよく、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＰプライマー、即ち、ＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーを含んでもよい。

「目的配列」とは、当該アレイ型プライマープローブチップにより検出されるべき配列をいう。検出されるべき目的核酸は「目的配列」を含む。目的配列からなる核酸を「目的配列鎖」という。目的配列鎖は、その相補配列を含むプローブ核酸とハイブリダイズし、このハイブリダイズの有無または量が検出されて、目的核酸の有無または量が検出または測定される。

「ハイブリダイズ信号」とは、プローブ核酸とその相補配列とのハイブリダイズにより生じる信号であり、当該マイクロアレイの検出方式により、例えば、電流値、蛍光光度、発光光度などとして検出される検出信号を総称するものである。

「試料」とは、核酸反応具により増幅および/または検出されるべき核酸を含む物質であればよい。試料は、これらに限定するものではないが、例えば、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰等であってよく、または何らかのそれ自身公知の手段によって、前記の何れかまたはその混合物から核酸成分に抽出されたものであってもよい。

２．マルチ核酸増幅反応具
＜第１の実施形態＞
（１）マルチ核酸増幅反応具
マルチ核酸増幅反応具の１例を図１（ａ）および（ｂ）を参照しながら説明する。このマルチ核酸反応具は、複数種類の標的核酸をマルチ増幅するためのマルチ核酸増幅反応具の例である。

図１（ａ）は、マルチ核酸増幅反応具の１例の斜視図である。図１（ａ）に記載のマルチ核酸増幅反応具１は、容器形状の支持体２を有する。支持体２の内側底面には、互いに独立した複数の固定化領域３が配置される。図１（ｂ）は固定化領域３の部分を拡大した模式図である。そこに示されるように、１つの固定化領域３には１つの種類のプライマーセット４が固定される。複数の固定化領域３のそれぞれには、種類毎に複数のプライマーセット４がそれぞれ固定される。複数のプライマーセット４は、所望に応じて互いに異なってもよく、一部が互いに異なる配列であってもよく、或いは一部が互いに同じ配列であってもよい。

プライマーセット４は、目的とする複数の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類が用意される。１つの固定化領域３には、特定の１つの標的核酸を増幅するための１種類のプライマーセット４が固定される。例えば、ＰＣＲ増幅用の反応具の場合には、１つの固定化領域に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なフォワードプライマーとリバースプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。また、ＬＡＭＰ増幅用の反応具の場合には、１つの固定化領域に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、及びＬＰプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。

プライマーセット４は、反応場を提供するための液相と接触して遊離するように遊離可能な状態で固定化領域３に固定される。プライマーセット４の固定化領域３への固定化は、例えば、１組のプライマーセットを含む溶液を１つの固定化領域３に滴下し、その後乾燥させることにより達成することが可能である。更に、同様に、他の固定化領域３について、それぞれ所望のプライマーセット４を含む溶液を滴下および乾燥し、所望する数の複数のプライマーセットを支持体２に固定すればよい。これにより、支持体２の１つの面に独立して配置される全ての固定化領域３にプライマーセット４が固定される。しかしながら、プライマーセット４の固定化領域３への固定化は、反応場を提供するための液相と接触して遊離可能な状態で固定されればよい。従って、そのような固定化が可能なそれ自身公知の何れの固定化法が使用されてもよい。プライマーセットを含む溶液を滴下する方法の場合、プライマーセットを含む溶液は、例えば、水、緩衝液または有機溶剤などであってよい。

支持体２に配置される複数の固定化領域３は、互いに独立して配置されればよい。独立して配置されるとは、反応場においてプライマーセット毎に開始および／または進行される増幅を妨げることのない間隔で配置されることである。例えば、隣り合う固定化領域３は、互いに接して配置されてもよく、僅かな距離を隔てて互いに近傍に配置されてもよく、或いは、通常使用される所謂ＤＮＡチップなどの検出装置において固定化されるプローブと同様な距離を隔てて互いに配置されてもよい。例えば、隣り合う固定化領域３の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。

当該プライマーの長さは、これに制限されるものではないが、約５塩基以上、約６塩基以上、約７塩基以上、約８塩基以上、約９塩基以上、約１０塩基以上、約１５塩基以上、約２０塩基以上、約２５塩基以上、約３０塩基以上、約３５塩基以上、約４０塩基以上、約４５塩基以上または約５５塩基以上であってよく、約８０塩基以下、約７５塩基以下、約７０塩基以下、約６５塩基以下、約６０塩基以下、約５５塩基以下、約５０塩基以下、約４５塩基以下、約４０塩基以下、約３５塩基以下、約３０塩基以下、約２５塩基以下、約２０塩基以下、約２５塩基以下または約２０塩基以下であってもよく、これらの下限上限の何れかを組み合わせた範囲であってもよい。例えば、好ましい塩基長の例は、約１０塩基〜約６０塩基、約１３〜４０塩基、約１０〜３０塩基などであってよい。また、１つの支持体に同時に固定されるプライマーの長さは、全てのプライマーで同じであってもよく、全てのプライマーで異なっていてもよく、一部のプライマーが同じ長さであってもよく、一部のプライマーが異なる長さであってもよい。また、プライマーセット毎に異なってもよい。また、１つの領域に固定されるプライマーセットが、種類毎に異なる長さであってもよく、１つの領域に固定されるプライマーセットが全て同じ長さであってもよい。

反応場を提供するための液相は、固定されたプライマーが遊離された後に、それらを用いて増幅反応を進行できる液相であればよく、例えば、所望の増幅に必要な反応液であってよい。

容器形態の支持体は、例えば、チューブ、ウェル、チャンバー、流路、カップおよびディッシュ並びにそれらを複数個備えたプレート、例えば、マルチウェルプレートなどであってよい。また支持体の材質は、それ自身反応に関与しない材質であればよく、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてよい。また、容器形態の支持体は、商業的に入手可能な何れの容器を利用してもよい。

図１では、固定化領域３が支持体２の内側底面に配置された例を示したが、これに限定するものではなく、支持体２２の内側側面の少なくとも一部分に配置されてもよく、内側底面および内側側面、天井面のいずれか、または全てに配置されてもよい。

（２）マルチ核酸増幅反応具を用いた核酸の増幅反応
図２には、第１の実施形態と同様のマルチ核酸増幅反応具２１を用いた核酸増幅反応の様子を示す図である。図２（ａ）は反応前のマルチ核酸増幅反応具２１である。支持体２２の内側底面に配置された複数の固定化領域２３に複数のプライマーセット２４がそれぞれ固定されている。マルチ核酸増幅反応具２１に反応液２６を添加し、それを収容した状態を図２（ｂ）に示す。

反応液２６は、所望の増幅反応に必要な成分を含めばよい。これらに限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含んでよい。

図２（ｂ）に示すように、反応液２６を添加された後のマルチ核酸増幅反応具では、図２（ｃ）に模式的に示すように、内側底面に固定されたプライマーが遊離し徐々に拡散する。遊離および拡散した領域を模式的に領域２７で表す。遊離し、拡散していくプライマーは、その近傍に存在する鋳型核酸、ポリメラーゼおよび基質などの増幅に必要な他の成分と出会い、増幅反応が開始される。種類毎に独立して複数固定化されたプライマーセットは、その種類毎に独立して鋳型核酸について増幅反応を開始および進行することが可能である。それにより、複数種類のプライマーセットを用いた複数の鋳型配列についての増幅が、独立に、且つ同時に達成される。ここにおいて、「反応場」は、理論上、そこにおいて増幅反応の進行が可能な反応液２６により規定される領域、即ち、反応液が存在する領域という。また、反応場のうち、実際にそこにおいて増幅反応が開始され進行する領域を「反応領域」という。仮に実際に増幅反応が領域２７内のみで進行する場合には、領域２７が反応領域と解されてよい。

反応液２６は、固定されたプライマーセットが遊離された後に、プライマーセットと標的核酸との間の増幅反応が可能な液相であればよい。この反応液は、プライマーが固定化されている反応場（最初は空気で満たされている）に対し、増幅反応開始前に機械的に若しくは人為的に、何らかの手法で注入されればよい。

上記の例では、プライマーセットのみが支持体に固定化された例を示した。しかしながら、これに限定されるものではなく、プライマーセットが種類毎に各固定化領域に固定される条件において、増幅に必要な他の成分、例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素、基質、基質および／または緩衝剤などをプライマーと共に支持体に固定してもよい。その場合、固定しようとする物質をプライマーと一緒に所望の液体媒体に含ませて、上述の方法と同様に滴下および乾燥などにより固定すればよい。そのようなマルチ核酸増幅反応具において、増幅反応を行う場合には、固定された成分に応じてそこに添加される反応液の組成が選択されればよい。

＜第２の実施形態＞
マルチ核酸増幅反応具の更なる１例を、図３を参照しながら説明する。

図３は、マルチ核酸増幅反応具の更なる１例を示す平面図である。図３に記載のマルチ核酸増幅反応具３１は、基板を支持体３２として用いる例である。支持体３２の１つの面には、互いに独立した複数の固定化領域３３が配置される。固定化領域３３には、図１と同様に、１つの固定化領域３３には１つの種類のプライマーセット３４が固定される。複数の固定化領域３３のそれぞれには、種類毎に複数のプライマーセット３４がそれぞれ固定される。１つ固定化領域３３に含まれるプライマーセット３４の構成は、第１の実施形態と同様に１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要な異なる種類のプライマーを含む。

第２の実施形態を用いる増幅は、少なくとも支持体３２のプライマーセット３４が固定化された領域に対して、反応液を載せることにより反応場を形成すればよい。

固定化領域３３は、支持体３２表面に予め形成された凹部面、または凹部若しくは凸部により形成される流路の内壁に配置されてもよい。

基板を支持体として使用する場合、その材質は、それ自身反応に関与しない材質であればより、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてもよい。また、支持体へのプライマー３４の固定化は、第１の実施形態と同様に行えばよい。

更にまた、第２の実施形態のマルチ核酸増幅反応具を、これを維持できる容器内に配置し、その容器内に反応液を添加することにより反応場を形成してもよい。またこの場合、支持体３２の両面にプライマーセット３４を固定してもよい。これにより、本マルチ核酸増幅反応具に対してより多くの種類のプライマーセットを固定することが可能になり、より多くの標的配列を増幅することが可能になる。この側面において、マルチ核酸増幅反応具は、少なくとも１表面に複数のプライマーセットを独立して固定した支持体であれば、どのような形状の支持体であってもよい。この場合の支持体の材質およびプライマーの固定化法は、第１の実施形態および第２の実施形態と同様であってよい。このようなマルチ核酸増幅反応具は、基体とその少なくとも１つの表面の互いに独立した固定化領域に種類毎に遊離可能に固定された複数種類のプライマーセットを具備するマルチ核酸増幅反応担体として用いられてもよい。この場合、基体の大きさおよび形状は実施者が任意に選択してよい。例えば、板状、球状、棒状およびそれらの一部分からなる形態であってよい。

＜第３の実施形態＞
マルチ核酸増幅反応具の更なる１例を、図４を参照しながら説明する。図４に示すマルチ核酸増幅反応具４１は、流路を有する支持体を使用する例である。図４（ａ）は平面図であり、図４（ｂ）は、線ｍ−ｍ’で切断した断面図である。

マルチ核酸増幅反応具４１は、支持体４２の内部に形成された流路４４の内側底面に配置された互いに独立した複数の固定化領域４３に、種類毎に遊離可能に固定された複数のプライマーを具備する。

支持体４２は、基体４２ａと被覆体４２ｂとを有する。被覆体４２ｂには、流路を規定するための凹部がある。固定化領域４３は、流路４４の内側に面する基体４２ａ表面に配置されている。基体４２ａと被覆体４２ｂは、内部に収納された液体を維持することが可能なように密着している。この密着は、例えば、固定および／または接着などのそれ自身公知の手段により達成されてよく、或いは、一体化されてもよく、一体化された状態で支持体４２が形成されてもよい。

このマルチ核酸増幅反応具４１は、例えば、第１の基板４２ａと第２の基板４２ｂを用いて製造される。まず、第１の基板４２ａの予め決定された固定化領域４３に、種類毎に遊離可能に複数のプライマーセット４４を固定する。この固定化は、第１の実施形態と同様の方法により行うことが可能である。一方で、第２の基板４２ｂには、所望の流路に形状に対応させて凹部４５を形成する。凹部４５の形成は、使用される基板の材質に応じてそれ自身公知の方法により行うことが可能である。また、固定化領域４３の配置は、第２の基板４２ｂに形成された凹部４５により形成される流路内に含まれるように決定される。次に、第１の基板４２ａと第２の基板４２ｂを一体化する。この時、第２の基板４２ｂの凹部４５が第１の基板４２ａ側を向くように一体化される。また、第２の基板４２ｂの凹部４５の一部分に貫通孔（図示せず）が設けられてもよい。この貫通孔は、流路への反応液などの出し入れ口として利用されてよい。

第１の基板４２ａの材質と第２の基板４２ｂの材質は同じであっても、異なってよい。また、第１の基板４２ａおよび第２の基板４２ｂの材質は、それ自身反応に関与しない材質であればよく、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてよい。

この実施形態では、流路４６を有した支持体４２の流路の内側底面にプライマーセットを固定した例を示したが、流路の配置および形状はこれに限定されるものではない。プライマーセットを固定化する面は流路を構成する何れの面であってもよく、流路を構成する全ての面にプライマーセットが固定されてもよく、複数の面に固定されてもよい。

或いは、予め凹部４５または溝を形成することにより流路を形成した第１の基板４２ａに、その流路の一部の壁面に複数のプライマーセットを独立して固定し、その後、シリコンゴムで蓋をすることにより図４のマルチ核酸増幅反応具は製造されてもよい。

＜第４の実施形態＞
マルチ核酸増幅と検出
図５に示すように、マルチ核酸増幅反応具５１は、支持体としてのチューブ５２と、チューブ５２の内面に独立して固定された複数のプライマーセット（図示せず）を備えてもよい。このようなチューブ型のマルチ核酸増幅反応具５１においても複数種類の標的核酸を増幅することが可能である。その後に、得られた増幅産物を異なる複数の核酸プローブ５６を固定したＤＮＡチップ５５などの装置に加え検出を行うことが可能である。このように実施形態に例を示したマルチ核酸増幅反応具は、検出用サンプルの調製を従来に比べてより簡便に且つ複数の増幅を独立して行うことが可能である。

＜第５の実施形態＞
マルチ核酸増幅法
特定の容器、チューブ、ディッシュまたは流路を形成した基板などから形成される支持体の少なくとも１つの内側表面に対して、複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するために設計された複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定する工程を含むマルチ核酸増幅反応方法も更なる実施形態として提供される。

そのようなマルチ核酸増幅反応方法は、例えば、所望の支持体の少なくとも１つの表面に対して、複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するために設計された複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定することと、複数種類のプライマーセットが１つの反応場に含まれるように増幅に必要な試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なでオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含む反応液を添加することと、当該プライマーが固定された支持体を加熱または冷却することによる温度調節など、増幅反応に適した反応環境を調節することと、それによりマルチ核酸増幅反応を行うこととを具備してよい。

具体的な増幅反応は、増幅反応の種類に応じてそれ自身公知の技術を利用して行われてよい。

更に、マイクロビーズ、板小片または棒などの基体の表面に対して複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するために設計された複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定する工程を含むマルチ核酸増幅反応も更なる実施形態として提供される。

そのようなマルチ核酸増幅反応は、例えば、所望の基体の少なくとも１つの表面に対して、複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するために設計された複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定することと、基体を、増幅に必要な試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なでオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含む反応液内に配置することと、反応液を加熱または冷却することによる温度調節など、増幅反応に適した反応環境を調節することと、それによりマルチ核酸増幅反応を行うこととを具備する。

このようなマルチ核酸増幅によって標的核酸を増幅した後に、増幅産物の検出をＤＮＡチップで行った場合の結果について説明する。

図６（ａ−１）は、反応容器６１内に添加された反応液６２において、複数種類のプライマーセット、即ち、第１のプライマーセット（Ａ）６３ａと第２のプライマーセット（Ｂ）６３ｂとを用いて、標的配列をそれぞれ増幅する様子を示した図である。図（ａ−１）の反応系６４は、ここにおいて開示した当該マルチ核酸増幅反応具ではなく、従来の一般的な反応系である。即ち、反応容器６１の何れの面に対しても何れのプライマーセットは固定されずに、直接に反応液に混合された状態で増幅反応が行われる。

図６（ｂ−１）は、上述した第２の実施形態と同様な構成を有するマルチ核酸増幅反応具２１を示す。マルチ核酸増幅反応具２１は、容器２２とその内側底部に配置された第１のプライマー固定化領域２３ａと第２のプライマー固定化領域２３ｂとを具備する。第１のプライマー固定化領域２３ａには、第１のプライマーセット（Ａ）２４ａが遊離可能に固定されている。第２のプライマー固定化領域２３ｂには、第２のプライマーセット（Ｂ）２４ｂが遊離可能に固定されている。

図６（ａ−１）の反応系による増幅は、プライマーセット（Ａ）６３ａとプライマーセット（Ｂ）６３ｂとの間の増幅効率や増幅特異性などの違いのために得られる増幅量に違いが生じる。そのような増幅により得られる結果の１例を図６（ａー２）に示す。例えば、遺伝子発現量を検出したい場合、このような一般的な方法では、真の発現量を反映することはできない。

図６（ａ−２）に示す更なる実施形態の１例であるマルチ核酸増幅反応具２１の場合、容器２２に遊離可能に固定された第１のプライマー（Ａ）２４ａと第２のプライマー（Ｂ）２４ｂによる増幅は、互いに独立して目的の標的核酸について行える。従って、第１のプライマー（Ａ）２４ａと第２のプライマー（Ｂ）２４ｂのそれぞれの鋳型核酸が同量で反応場に存在する場合には、図６（ｂ−２）に示すような同じ大きさの検出信号を得ることが可能となる。

１例として上記の実施形態に示したマルチ核酸増幅反応具によれば、異なる配列による干渉を受けずに複数種類の標的配列を独立して同時に行うことができる。従来の技術では、複数種類のプライマーを１つの容器内で使用してマルチプレックス増幅を行った場合、反応効率に偏りが生じ、種類の数に限りがあることが問題となっている。即ち、異なる種類のプライマー間で、必要な酵素やｄＮＴＰの取り合いが生じることがある。また、標的配列の配列やプライマーの配列により、反応特異性および／または反応効率に違いがでることもある。その場合、プライマーの種類によって増幅反応開始点が異なること、一部のプライマーセットについての増幅のみが開始され進行されること、或いは、一部のプライマーセットについての増幅が十分に達成されないことなどの問題が生じてしまう。このような従来の問題も、本明細書において開示される実施形態により解決される。

即ち、実施形態を例に示したマルチ核酸増幅反応具を使用して増幅反応を行うと、固定した増幅試薬付近でのみ増幅反応が進行するため、同一容器中および／または同一溶液中でありながら、互いの増幅反応に干渉せず、各種ターゲットの増幅反応を独立に進行させることが可能である。また、ある程度個別の反応が進行した後で、更に異なるプライマーセットを追加してもよく、第１の実施形態に示した容器形態のマルチ核酸増幅反応具と、上記のマルチ核酸増幅反応担体とを組み合わせて使用してもよい。

＜実施例１＞
以下に、１０種類のＬＡＭＰマルチ増幅を可能とする、マルチ増幅用容器の実施例を記載する。

（１）マルチ増幅用容器の作製
使用したプライマーの塩基配列を表１−１および表１−２に示す。

各プライマーセットにおいて、ＦＩＰ；４０ｐｍｏｌ、ＢＩＰ；４０ｐｍｏｌ、Ｆ３；４０ｐｍｏｌ、Ｂ３；５ｐｍｏｌ、ＬＰ；２０ｐｍｏｌを含むＴＥ溶液０．６ｕＬをガラス基板表面にスポットし、室温にて１０分間放置することで、プライマーを乾燥固定した。プライマーを乾燥固定した基板上に、予め流路が形成されているシリコンゴムを充て、流路内にプライマーがスポットされているマルチ増幅用容器を作製した（図４）。

（２）マルチ増幅用容器用ＬＡＭＰ反応液の作製とＬＡＭＰ反応
マルチ増幅用容器用ＬＡＭＰ反応液の組成を表２示す。

この反応液に含まれる鋳型Ｎｏ．１〜１０の塩基配列を表３−１、表３−２、表３−３、表３−４、表３−５、表３−６、表３−７、表３−８、表３−９および表３−１０に示した。

マルチ増幅容器の流路に、マルチ増幅用容器用ＬＡＭＰ反応液を５０ｕＬ注入し、ガラス面が６３℃に設定したホットプレートと接するように、ホットプレートの上に載せ、１時間ＬＡＭＰ反応を行った。

（３）ＰＣＲチューブ用ＬＡＭＰ反応液の作製とＬＡＭＰ反応
ＰＣＲチューブ用ＬＡＭＰ反応液の組成を表４に示す。この反応液を、６３℃に設定した恒温装置にセットし、１時間ＬＡＭＰ反応を行った。

（４）ＬＡＭＰ増幅産物検出用ＤＮＡチップの作製
表５に示すプローブ（３’末端ＳＨ標識合成オリゴ）を合成した。

プローブＮｏ．１は、プライマーセットＮｏ．１から得られるＬＡＭＰ増幅産物を検出するためのプローブであり、同様にプローブＮｏ．２〜１０は、それぞれプライマーセットＮｏ．２〜１０から得られるＬＡＭＰ増幅産物を検出するためのプローブである。各プローブ３ｕＭを含む溶液１００ｎＬを電極上にスポットし、乾燥固定することで、ＤＮＡチップを作製した。ＤＮＡチップ、及びＤＮＡチップ測定装置は、SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. １, No. ３, pp. ２６６-２７０, ２００８に記載されているものを使用した。

（５）ＬＡＭＰ増幅産物の検出
マルチ増幅用容器にて増幅したＬＡＭＰ増幅産物、ＰＣＲチューブで増幅したＬＡＭＰ増幅産物をＤＮＡチップにより検出し、各増幅容器、チューブにて増幅された増幅産物を確認した。

その結果を表６に示した。ＰＣＲチューブを使用した場合、１０種類のうち３種のみが陽性となり、その他７種類は陰性であった。一方、マルチ増幅用容器を使用した場合、１０種類全てが陽性となり、１０種のマルチ増幅反応が可能であることが示された。ＰＣＲチューブ内では、同一溶液中にプライマーセットＮｏ．１〜１０、及び鋳型Ｎｏ．１〜１０が含まれ、その中でＬＡＭＰ増幅反応が進行する。１０種のプライマーセットのうち、いくつかの種類のＬＡＭＰ増幅反応が開始されると、酵素（Bst DNA Polymerase）などがその反応に消費され、その他の種類のＬＡＭＰ増幅反応効率が低下すると考えられた。一方、マルチ増幅用容器では、同一溶液中にプライマーセットＮｏ．１〜１０、及び鋳型Ｎｏ．１〜１０が含まれ、その中でＬＡＭＰ増幅反応が進行するものの、プライマーをスポットすることにより、流路中の各スポット位置でＬＡＭＰ増幅反応が開始され、各種プライマーによる増幅反応が独立に進行することが期待された。

３．増粘剤の使用
＜第６の実施形態＞
マルチ核酸反応具を用いて反応を行う際には、反応液に増粘剤が存在してもよい。増粘剤が反応液に含まれると、固定化されたプライマーが遊離された後に局所的な拡散に留まる。増粘剤は、増幅反応を阻害しない物質であることが好ましい。増粘剤についての詳細は後述する。

また、増幅反応をより効率的に達成するために、反応液の反応場への添加速度を制御する手段も有効である。例えば、プライマー固定化位置上を流れる反応液の流速は、１ｍｍ/秒以上が好ましく、さらには、１０ｍｍ/秒以上が好ましい。これにより、固定化されたプライマーセットの遊離が影響を受けるため、プライマーセットのより局所的な拡散が可能になる。しかしながら、プライマー固定化位置上を流れる反応液の流速は、反応場を規定する支持体および他の部材により構成される反応部の形状および大きさにより、任意の値を取り得る。

上述した第１の実施形態を用いてマルチ増幅反応を行う際に、使用する反応液に増粘剤を含ませることによって、より効率よくマルチ増幅反応を達成することが可能である。

反応液に増粘剤を含ませる方法は、反応液自体に増粘剤を添加してもよく、或いは、プライマーセットを支持体に固定する際に、プライマーセットを固定するための溶液に増粘剤を含ませることにより、使用されるべきプライマーセットと共にプライマー固定化領域に増粘剤を固定してもよい。或いは、プライマーを固定した後に、プライマー固定化領域に更に増粘剤を被覆することにより固定してもよい。更にまた、フィルム状の増粘剤を貼付するなどの手段でもよく、特に限定されない。

増粘剤を、反応液に含ませることにより、固定されたプライマーセットが反応液に遊離する速度、即ち、溶出速度を低下することが可能である。それにより、プライマーセットは、より長時間に亘り局所に留まる。その結果、固定されたプライマーセット毎の反応効率に左右されずに複数のプライマーセットによるマルチ増幅がより効率的に達成される。

増粘剤は、その比粘度がプライマーよりも大きい物質であり、且つ核酸増幅反応を阻害しない物質であることが好ましい。増粘剤の例は、樹液に由来する増粘剤、例えば、アーモンドガム、エレミ樹脂、ダンマル樹脂、アラビアガム、カラヤガム、トラガントガム、アラビノガラクタン、ガティガムおよびモモ樹脂など、豆類などの種子に由来する増粘剤、例えば、アマシードガム、グァーガム酵素分解物、タマリンド種子ガム、カシアガム、サイリュームシードガム、タラガム、カロブビーンガム＝ローカストビーンガム、サバクヨモギシードガム、トリアカンソスガム、グァーガムおよびセスバニアガムなど、海藻に由来する増粘剤、例えば、アルギン酸、フクロノリ抽出物、ファーセレランおよびカラギナンなど、果実類、葉および地下茎などに由来する増粘剤、例えば、アロエベラ抽出物、キダチアロエ抽出物、ペクチン、オクラ抽出物およびトロロアオイなど、微生物由来の増粘剤、例えば、アエロモナスガム、エンテロバクターガム、納豆菌ガム、アウレオバシジウム培養液、カードラン、プルラン、アゾトバクター・ビネランジーガム、キサンタンガム、マクロホモプシスガム、ウェランガム、ジェランガム、ラムザンガム、エルウイニア・ミツエンシスガム、スクレロガム、レバン、エンテロバクター・シマナスガムおよびデキストラン、並びに、その他増粘安定剤、例えば、酵母細胞膜、キチン、オリゴグルコサミン、微小繊維状セルロース、キトサン、微結晶セルロースおよびグルコサミンなどを含む。更に、増粘剤は、一般に飲食物添加物して使用される、例えば、寒天、大豆多糖類、ナタデココ、澱粉、コンニャクイモ抽出物、ゼラチンなどであってもよい。好ましくは、アガロースなどの寒天および/またはゼラチン、ポリエチレングリコールなどであるが、これらに限定されるものではない。

増粘剤を反応液に添加する場合、反応液の作製時に、反応液を作製するための溶媒に対して増粘剤を直接に溶解してもよい。または、先ず、溶媒に増粘剤を溶解して作製した増粘剤溶液を用意する。別途、反応に必要な他の成分を溶媒に溶解することにより反応液を作製する。得られた増粘剤溶液と反応液とを混合してもよい。溶媒は、水、塩水および緩衝液などであってよい。

プライマーセットを固定する溶液に増粘剤を添加する場合、増粘剤の濃度は、室温（２５℃）で液体であり、且つ反応場に滴下可能な状態であることが好ましい。増粘剤の濃度は、例えば、終濃度３０％〜０．０１％程度の範囲であればよい。例えばアガロースであれば、終濃度１０％〜０．０１％の範囲であればよく、さらには、５％〜０．０５％の範囲が好ましく、３％〜０．１％の範囲で混合することがより好ましい。プライマー固定領域に増粘剤を固定する場合も同様であってよい。

また、反応液に増粘剤を添加する場合、増粘剤の濃度は、室温（２５℃）で液体であることが好ましい。増粘剤の濃度は、例えば、終濃度３０％〜０．０１％程度の範囲であればよい。例えばアガロースであれば、終濃度１０％〜０．０１％の範囲であればよく、さらには、５％〜０．１％の範囲で混合することがより好ましい。

従来の方法では、それぞれの対象遺伝子を増幅するための反応容器を用意する方法の場合、対象遺伝子数の増加に伴って、必要な反応容器の数や、検査時の作業量が増加する。また、全ての対象遺伝子を検出するための試薬を１つの反応容器に入れる場合、増幅反応効率に偏りが生じるなどの原因から、対象遺伝子数に限界がある。また、従来のマルチ増幅の場合では、複数種のプライマーセットが溶出して拡散した場合、プライマー同士の非特異結合による増幅効率の低下、または、特性のよいプライマーセットのみが優先して増幅する恐れがあり、増幅反応の感度低下、増幅種類の制限などが生じる。このような問題も本実施形態により解消される。

＜第７の実施形態＞
上述では、反応液に増粘剤を含ませる例を示したが、反応液に増粘剤を含ませずに、少なくともプライマーセットが固定される領域に増粘剤を固定してもよい。第７の実施形態に増粘剤を固定する例を以下に記す。

増粘剤を支持体上に固定する場合、プライマーセットの固定の前であっても、プライマーセットの固定と同時であっても、プライマーセットを固定した後であってもよい。好ましくは、増粘剤は、プライマーセットの固定と同時またはプライマーセットの固定後に支持体に固定される。

プライマーセットの固定と同時に増粘剤を支持体に固定する場合、プライマーセットを溶解した液に対して増粘剤を溶解してもよい。或いは、先ず増粘剤を溶媒に溶解して増粘剤溶液を用意し、別途調製されたプライマーセット固定用の溶液と混合してもよい。得られたプライマーセットと増粘剤を含む溶液を、滴下および乾燥などにより固定すればよい。

プライマーセットの固定化前または後に、増粘剤溶液を固定する場合には、増粘剤を含む溶液を滴下、スプレー、印刷、刷毛で塗布または増粘剤溶液に支持体を浸漬した後に、乾燥などによりプライマー固定化領域を含む支持体表面に固定すればよい。

増粘剤溶液、またはプライマーセットと増粘剤とを含む溶液の乾燥方法は、ヒートブロック、ホットプレートおよびインキュベータなどを用いて、室温以上の温度で加熱することによる熱乾燥を行ってもよい。または、常温で放置し、自然乾燥を行ってもよい。或いは、真空乾燥や凍結乾燥を行ってもよい。例えばアガロースを用いる場合は、熱乾燥を行い、乾燥後の状態がフィルム状になっていることが好ましい。

固定に用いる増粘剤溶液中の増粘剤の濃度は、固定時の状態が室温（２５℃）で液体であり、且つ支持体上に滴下可能な状態であればよい。増粘剤を固定する際の増粘剤の濃度は、例えば、終濃度３０％〜０．０１％程度の範囲であればよい。例えばアガロースであれば、終濃度１０％〜０．０１％の範囲であればよく、さらには、５％〜０．０５％の範囲が好ましく、３％〜０．１％の範囲で混合することがより好ましい。

さらに、固定に用いる増粘剤溶液には、プライマーセットが含まれてもよく、プライマーセット以外にも、増幅反応に必要な他の物質が含まれていてもよい。

増粘剤の使用により、マルチ増幅反応における感度低下、増幅種類の制限などが解消される。

＜第８の実施形態＞
マルチ核酸増幅反応具の更なる１例を、図７を参照しながら説明する。

図７は、マルチ核酸増幅反応具の更なる１例を示す平面図である。図７に記載のマルチ核酸増幅反応具７１は、基板を支持体７２として用いる例である。支持体７２の１つの面には、互いに独立した複数の固定化領域７３が配置される。固定化領域７３には、図１と同様に、１つの固定化領域７３には１つの種類のプライマーセット７４が固定される。複数の固定化領域７３のそれぞれには、種類毎に複数のプライマーセット３４がそれぞれ固定される。１つ固定化領域７３に含まれるプライマーセット７４の構成は、第１の実施形態と同様に１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要な異なる種類のプライマーを含む。更に、固定化領域７３には、プライマーセット７４を覆うように増粘剤７５がコーティングにより固定されている。

第２５の実施形態を用いる増幅は、少なくとも支持体７２のプライマーセット７４が固定化された領域に対して、反応液を載せることにより反応場を形成すればよい。

固定化領域７３は、支持体７２表面に予め形成された凹部面、または凹部により形成される流路の内壁に配置されてもよい。

基板を支持体として使用する場合、その材質は、それ自身反応に関与しない材質であればより、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてもよい。また、支持体へのプライマーの固定化は、第１１の実施形態と同様に行えばよい。

更にまた、第２５の実施形態のマルチ核酸増幅反応具を、これを維持できる容器内に配置し、その容器内に反応液を添加することにより反応場を形成してもよい。またこの場合、支持体７２の両面にプライマーセット７４を固定してもよい。更に、プライマーセット７４を覆うように増粘剤７５がコーティングにより固定されてもよい。これにより、本マルチ核酸増幅反応具に対してより多くの種類のプライマーセットを固定することが可能になり、より多くの標的配列を増幅することが可能になる。この側面において、マルチ核酸増幅反応具は、少なくとも１表面に複数のプライマーセットを独立して固定した支持体であれば、どのような形状の支持体であってもよい。この場合の支持体の材質およびプライマーの固定化法は、第１の実施形態および第２の実施形態などと同様であってよい。このようなマルチ核酸増幅反応具７１は、基体とその少なくとも１つの表面の互いに独立した固定化領域に種類毎に遊離可能に固定された複数種類のプライマーセットを具備するマルチ核酸増幅反応担体として用いられてもよい。この場合、基体の大きさおよび形状は実施者が任意に選択してよい。例えば、板状、球状、棒状およびそれらの一部分からなる形状であってよい。

増粘剤の固定は、プライマーセットと同時であっても、プライマーセットの固定化の前であってもよい。また、増粘剤の固定を行わずに、反応時に反応液に増粘剤を含ませてもよい。

＜第９の実施形態＞
（１）マルチ核酸増幅反応具
マルチ核酸増幅反応具の更なる１例を、図８を参照しながら説明する。図８に示すマルチ核酸増幅反応具８１は、流路を有する支持体を使用する例である。図８（ａ）は平面図であり、図８（ｂ）は、線ｍ−ｍ’で切断した断面図である。

マルチ核酸増幅反応具８１は、支持体８２の内部に形成された流路８７の内側底面に配置された互いに独立した複数の固定化領域８３に、種類毎に遊離可能に固定された複数のプライマー８４を具備する。

支持体８２は、基体８２ａと被覆体８２ｂとを有する。被覆体８２ｂには、流路を規定する凹部８６がある。プライマー固定化領域８３は、流路８４の内部に接する基体８２ａ表面に配置されている。

このマルチ核酸増幅反応具８１は、例えば、第１の基板と第２の基板を用いて製造される。まず、第１の基板の予め決定された固定化領域８３に、複数のプライマーセット８４と増粘剤の混合物が遊離可能に固定される。プライマーセット８４は種類毎に固定される。この固定化は、上述したように行うことが可能である。一方で、第２の基板には、所望の流路８７に形状に対応させて凹部８６を形成する。凹部８６の形成は、使用される基板の材質に応じてそれ自身公知の方法により行うことが可能である。また、固定化領域８３の配置は、第２の基板に形成された凹部８６により形成される流路８７内に含まれるように決定される。次に、第１の基板と第２の基板を一体化する。一体化により、凹部８６の内壁と第１の基板の第２の基板側の面とにより流路形状の反応部が形成される。この時、第２の基板の凹部８６が第１の基板側を向くように一体化される。また、第２の基板の凹部８６の一部に貫通孔（図示せず）が設けられてもよい。この貫通孔は、流路８７への反応液などの出し入れ口として利用されてよい。

第１の基板の材質と第２の基板の材質は同じであっても、異なってよい。また、第１の基板および第２の基板の材質は、それ自身反応に関与しない材質であればよく、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてよい。

この実施形態では、流路８７を有した支持体８２の流路８７の内側底面にプライマーセット８４を固定した例を示したが、流路８７の配置および形状はこれに限定されるものではない。また、プローブセットを固定化する面は流路８７を規定する何れの面であってもよく、流路８７を規定する全ての面にプローブセットが固定されてもよく、また複数の面に固定されてもよい。

或いは、予め凹部若しくは凸部または溝を形成することにより流路８７を形成した第１の基板に、その流路８７の一部の壁面に配置されたプライマー固定化領域８３に対して、複数のプライマーセット８４を独立して固定してもよい。その後、シリコンゴムなどの蓋体を取り付けることにより、マルチ核酸増幅反応具が製造されてもよい。

使用されるプライマーの長さなどは、上述した通りであってよい。＜第１０の実施形態＞
（１）マルチ核酸増幅検出反応具
マルチ核酸反応具は、マルチ核酸増幅検出反応具として提供されてもよい。マルチ核酸増幅検出反応具は、上述のような第１の実施形態〜第９の実施形態に加えて、更にプローブ固定化領域およびそこに固定されたプローブ核酸を備える。マルチ核酸増幅検出反応具の例を次に説明する。

マルチ核酸増幅検出反応具の１例を図９（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を参照しながら説明する。

図９（ａ）は、マルチ核酸増幅検出反応具９１の１例の斜視図である。図９（ａ）に記載のマルチ核酸増幅検出反応具９１は、容器形状の支持体９２を有する。支持体９２の内側底面９３には、互いに独立した複数のプライマー固定化領域９４が配置される。複数のプライマー固定化領域９４に近接して、またそれぞれのプライマー領域に対応して複数のプローブ固定化領域９５が配置される。

図９（ｃ）はプライマー固定化領域９４を拡大した模式図である。そこに示されるように、１つのプライマー固定化領域９４には１つの種類のプライマーセット９６が固定される。複数のプライマー固定化領域９４のそれぞれには、種類毎に複数のプライマーセット９６がそれぞれ固定される。

プライマーセット９６は、目的とする複数の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類が用意される。１つのプライマー固定化領域９４には、特定の１つの標的核酸を増幅するための１種類のプライマーセット９６が固定される。例えば、ＰＣＲ増幅用の反応具の場合には、１つのプライマー固定化領域９４に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なフォワードプライマーとリバースプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。また、ＬＡＭＰ増幅用の反応具の場合には、１つのプライマー固定化領域９４に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、及びＬＰプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。

プライマーセット９６は、反応場を提供するための液相と接触して遊離するように遊離可能な状態でプライマー固定化領域９４に固定される。プライマーセット９６のプライマー固定化領域９４への固定化は、例えば、１組のプライマーセットを含む溶液を１つのプライマー固定化領域９４に滴下し、その後乾燥させることにより達成することが可能である。更に、同様に、他のプライマー固定化領域９４について、それぞれ所望のプライマーセット９６を含む溶液を滴下および乾燥し、所望する数の複数のプライマーセット９６を支持体９２に固定すればよい。これにより、支持体９２の１つの面に独立して配置される全ての固定化領域９４にプライマーセット９６が固定される。しかしながら、プライマーセット９６の固定化領域９４への固定化は、反応場を提供するための液相と接触して遊離可能な状態で固定されればよい。従って、そのような固定化が可能なそれ自身公知の何れの固定化法が使用されてもよい。プライマーセットを含む溶液を滴下する方法の場合、プライマーセットを含む溶液は、例えば、水、緩衝液または有機溶剤などであってよい。

支持体９２に配置される複数のプライマー固定化領域９４は、互いに独立して配置されればよい。独立して配置されるとは、反応場においてプライマーセット毎に開始および／または進行される増幅を妨げることのない間隔で配置されることである。例えば、隣り合うプライマー固定化領域９４は、互いに接して配置されてもよく、僅かな距離を隔てて互いに近傍に配置されてもよく、或いは、通常使用される所謂ＤＮＡチップなどの検出装置において固定化されるプローブ核酸と同様な距離を隔てて互いに配置されてもよい。

例えば、隣り合うプライマー固定化領域９４の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。

容器形態の支持体９２は、例えば、チューブ、ウェル、チャンバー、流路、カップおよびディッシュ並びにそれらを複数個備えたプレート、例えば、マルチウェルプレートなどであってよい。また支持体９２の材質は、それ自身反応に関与しない材質であればよく、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてよい。また、容器形態の支持体９２は、商業的に入手可能な何れの容器を利用してもよい。

図９では、プライマー固定化領域９４が支持体９２の内側底面９３に配置された例を示したが、これに限定するものではなく、支持体９２の内側側面の少なくとも一部分に配置されてもよく、底面および内側側面、被覆体により規定される天井面のいずれか、または全てに配置されてもよい。

図９（ｂ）には、プライマー固定化領域９４に近接して配置されたプローブ固定化領域９５の拡大図である。プローブ固定化領域９５には、検出されるべき所望の配列の相補配列を含むプローブ核酸９７が複数で固定される。

検出されるべき所望の配列は、目的配列であってよい。プローブ固定化領域９５は、プローブ核酸９７と目的配列鎖とのハイブリダイズ信号が、複数のプローブ固定化領域９５間で独立して検出されるように配置される。

プローブ核酸９７のプローブ固定化領域９５への固定は、それ自身公知の所謂ＤＮＡチップにおいて基板表面に対してプローブ核酸９７を固定する一般的な何れの技術を利用してもよい。プローブ核酸９７の固定した後にプライマーセット９６を固定してもよく、プライマーセット９６を固定した後にプローブ核酸９７を固定してもよく、プライマーセット９６の固定とプローブ核酸９７の固定を同時に行ってもよい。

例えば、隣り合うプローブ固定化領域９５の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。

また例えば、プローブ固定化領域９５とプライマー固定化領域９４の間の距離は、０μｍ〜０．１μｍ、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。

例えば、プローブ固定化領域９５とプライマー固定化領域９４の間の距離が０μｍである場合には、プローブ固定化領域９５とプライマー固定化領域９４は、支持体９２表面の同じ位置にあると解されてよい。また、プローブ固定化領域９５がプライマー固定化領域９４に含まれてもよく、プライマー固定化領域９４がプローブ固定化領域９５に含まれてもよい。

（２）マルチ核酸増幅検出反応具を用いた核酸の増幅検出方法
図１０には、第１０の実施形態と同様のマルチ核酸増幅検出反応具９１を用いて行われた核酸増幅反応後の反応場の様子を示す模式図である。図１０（ａ−１）および（ｂ−１）は、反応前のマルチ核酸増幅検出反応具９１である。支持体９２の内側底面９３に複数のプライマー固定化領域９４が配置される。複数のプライマー固定化領域９４の近傍にはプローブ固定化領域９５が配置される。複数のプライマー固定化領域９４には、複数のプライマーセット９６がそれぞれ固定されている。それぞれのプライマー固定化領域９４に対応して、それぞれの近傍に配置されたプローブ固定化領域９５には、複数のプローブ核酸９７が所望の種類毎に固定されている。

マルチ核酸増幅検出反応具９１に反応液９８を添加し、それを収容した状態を図１０（ｂ−２）および（ｂ−２）に示す。

反応液９８は、所望の増幅反応に必要な成分と増粘剤とを含めばよい。これらに限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含んでよい。

増粘剤は、第６の実施形態と同様の種類の物質を同様の濃度で含めばよい。

反応場への試料の添加は、マルチ核酸増幅検出反応具９１に反応液９８を添加する以前に反応液９８に予め添加することにより行ってもよく、反応液９８をマルチ核酸増幅検出反応具９１に添加した後に行ってもよく、マルチ核酸増幅検出反応具９１に反応液９８を添加する以前に試料をマルチ核酸増幅検出反応具９１に添加することにより行ってもよい。

図１０（ａ−２）および（ｂ−２）に示すように反応液９８を添加された後のマルチ核酸増幅検出反応具９１では、図１０（ａ−３）および（ｂ−３）に模式的に示すように、支持体９２の内側の底面９３に固定されたプライマーセット９６が遊離し、徐々に拡散する。遊離および拡散した領域を模式的に領域９９で示す。遊離し、拡散していくプライマーセット９６は、その近傍に存在する鋳型核酸、ポリメラーゼおよび基質などの増幅に必要な他の成分と出会い、その後、増幅反応が開始される。種類毎に独立して複数固定されたプライマーセット９６は、その種類毎に独立して鋳型核酸について増幅反応を開始および進行することが可能である。それにより、複数種類のプライマーセット９６を用いた複数の鋳型配列についての増幅が、独立に、且つ同時に達成される。ここにおいて、「反応場」は、理論上、そこにおいて増幅反応の進行が可能な反応液９８により規定される領域、即ち、反応液が存在する領域という。また、反応場のうち、実際にそこにおいて増幅反応が開始され進行する領域を「反応領域」という。仮に実際に増幅反応が領域９９内のみで進行する場合には、領域９９が反応領域と解される。図１０（ａ−３）の図は、全てのプライマー固定化領域９４に固定されたプライマーセット９６により増幅反応が生じた場合の模式図である。図１０（ｂ−３）は、固定されたプライマーセット９６が底面９３に固定された全てのプライマー固定化領域９４のうちの一部分、図１０（ｂ−３）では３つの領域のみにおいて増幅が生じた場合の模式図である。

プローブ固定化領域９５は、領域９９において増幅された増幅産物中に目的配列を含む核酸が存在した場合、その核酸とハイブリダイズする。プローブ固定化領域９５に固定されたプローブ核酸９７は、対応するプライマー固定化領域９４における増幅産物とのみハイブリダイズするように固定される。即ち、１つのプローブ固定化領域９５に固定されたプローブ核酸９７は、対応するプライマー固定化領域９４における増幅産物とのみハイブリダイズするように距離を維持して、それぞれのプローブ固定化領域９５およびプライマー固定化領域９４が配置される。

プローブ核酸９７と目的配列鎖とのハイブリダイズの検出は、それ自身公知のハイブリダイズ信号の検出手段により行われてよい。例えば、予めプライマーセット９６に蛍光物質を付与してもよく、デオキシヌクレオシド三リン酸などの基質に蛍光物質を付与してもよい。それらの蛍光物質からの蛍光強度を指標にハイブリダイズの有無および量が決定されてもよい。或いは、電気化学的手段によりハイブリダイズ信号が検出されてもよい。

ハイブリダイズの検出は、マルチ核酸増幅検出反応具９１内部の洗浄後に実行されてもよく、洗浄を行わずに実行されてもよい。電気化学的手段により検出する場合には、インタカレータを用いてハイブリダイズ信号を検出してもよい。この場合、例えば、予め反応液９８にインタカレータを含ませておいてもよく、ハイブリダイズ反応が開始する前、ハイブリダイズ反応中、ハイブリダイズ反応後に添加してもよい。これらの場合、何れもマルチ核酸増幅検出反応具９１内部の洗浄後に検出を行ってもよく、洗浄を行わずに検出を実行してもよい。ハイブリダイズ反応の開始、反応中、反応後の判定は、プライマー、プローブ核酸および鋳型核酸の配列、反応温度などの反応条件に応じて行ってもよく、予備実験により決定してもよい。

プライマーの長さは、上述された通りであってよい。

プローブ核酸の長さは、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、好ましくは１０塩基〜５０塩基であってよい。プローブ核酸は、検出されるべき目的配列の相補配列を含む。プローブ核酸は、目的配列の相補配列に加えて更なる配列例えば、スペーサ配列などを含んでもよい。

標的配列の長さは、例えば、１０塩基〜１００塩基、１００塩基〜２００塩基、塩基２００〜３００塩基、３００塩基〜４００塩基、好ましくは１００塩基〜３００塩基であってよい。

目的配列の長さは、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、好ましくは１０塩基〜５０塩基であってよい。

１つのプライマー固定化領域９４に固定されるプライマーセット９６の種類は、１種類の標的核酸を増幅するための１種類であってもよく、２種類以上の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類であってもよい。

１つのプローブ固定化領域９５に固定されるプローブ核酸９７群の種類は、１種類の目的配列とハイブリダイズするための１種類であってもよく、２種類以上の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類であってもよい。また、目的配列の部分が共通であり、更に他の目的配列とは異なる配列を含むプローブ核酸であってもよい。

１つのアレイ型マルチ核酸増幅検出反応具９１に配置されるプライマー固定化領域９４の数の下限は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、５０以上、７５以上、１００以上、１２５以上、１５０以上、１７５以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、１０００以上、１５００以上、２０００以上であってよく、上限は、１００００以下、５０００以下、２５００以下、２０００以下、１５００以下、１０００以下、５００以下、２５０以下、２００以下、１５０以下であってよく、これらの上限下限の何れかを組み合わせた範囲であってもよい。

１つのマルチ核酸増幅検出反応具９１に配置されるプライマー固定化領域９４とプローブ固定化領域９５の数は同じであっても異なっていてもよい。即ち、全てのプライマー固定化領域９４に対応するように同数のプローブ固定化領域９５が配置されてもよく、プライマー固定化領域９４の数がプローブ固定化領域９５の数よりも多くてもよく、プライマー固定化領域９４の数がプローブ固定化領域９５の数よりも少なくてもよい。また、増幅反応状態を確認するため、またはハイブリダイズ反応の状態を確認するためのポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールを含ませてもよい。このようなポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールは、プライマーセット９６および／またはプローブ核酸について設けてよい。

上記の例では、プライマーセット９６のみが支持体９２に固定化された例を示した。しかしながら、これに限定されるものではなく、プライマーセット９６が種類毎に各固定化領域に固定される条件において、増幅に必要な他の成分、例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素、基質、基質および／または緩衝剤などをプライマーセット９６と共に支持体９２に固定されてもよい。その場合、固定しようとする物質をプライマーセット９６と一緒に所望の液体媒体に含ませて、上述の方法と同様に滴下および乾燥などにより固定すればよい。そのようなマルチ核酸増幅検出反応具９１において、増幅反応を行う場合には、固定された成分に応じてそこに添加される反応液の組成が選択されればよい。

また、上述の例では、増粘剤を反応液に添加する例を示したが、増粘剤を反応液に含ませずに、支持体９２に固定してもよい。固定は、上述の通りに行ってよい。

支持体９２は、容器形状に限定されるものではなく、上述したように、板状、球状、棒状およびそれらの一部分からなる形状であってよく、基体の大きさおよび形状は実施者が任意に選択してよい。また、第３の実施形態のように流路を有する基板を用いて支持体９２を構成することは好ましい。

＜第１１の実施形態＞
第１１の実施形態のマルチ核酸増幅検出反応具を図１１〜図１４を参照しながら説明する。

（１）チップ素材
まず、電気化学的検出によりハイブリダイズ信号を検出するマルチ核酸増幅検出反応具のチップ素材の構成および製造方法の１例について図１１（ａ）および（ｂ）を用いて説明する。図１１（ａ）は、チップ素材１１１の平面図であり、図１１（ｂ）は、図１１（ａ）のチップ素材１１１の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。

チップ素材１１１は、矩形状の基板１１２上にその長手方向に沿って配置された例えば４つの電極１１３ａ〜１１３ｄを備えている。各電極１１３ａ〜１１３ｄは、第１の金属薄膜パターン１１４および第２の金属薄膜パターン１１５をこの順序で積層した構造を有する。また、各電極１１３ａ〜１１３ｄは大矩形部１１６と小矩形部１１７を細線１１７で連結した形状を有する。絶縁膜１１８は、各電極１１３ａ〜１１３ｄを含む基板１１２上に被覆されている。円形窓１１９は、大矩形部１１６に対応する絶縁膜１１８部分に開口されている。矩形窓１２０は、小矩形部１１７に対応する絶縁膜１１８部分に開口されている。電極１１３ａの円形窓１１９から露出する大矩形部１１６は第１の作用極１２１ａとして機能する。電極１１３ｂの円形窓１１９から露出する大矩形部１１６は第２の作用極１２１ｂとして機能する。電極１１３ｃの円形窓１１９から露出する大矩形部１１６は対極１２２として機能する。電極１１３ｄの円形窓１１９から露出する大矩形部１１６は参照極１２３として機能する。また、電極１１３ａ〜１１３ｄの矩形窓１２０から露出する小矩形部１１７はプローバー接触部として機能する。

このようなチップ素材１１１は、次のような方法により作製することができる。

まず、基板１１２上に第１の金属薄膜および第２の金属薄膜を例えば、スパッタリング法または真空蒸着法によりこの順序により堆積する。続いてこれらの金属薄膜を例えば、レジストパターンをマスクとして順次選択的にエッチングして、第１の金属薄膜パターン１１４および第２の金属薄膜パターン１１５をこの順序で積層した、例えば４つの電極１１３ａ〜１１３ｄを基板１１２の長手方向に沿って形成する。これらの電極１１３ａ〜１１３ｄは、大矩形部１１６と小矩形部１１７を細線１１７で連結した形状を有する。

次いで、電極１１３ａ〜１１３ｄを含む基板１１２上に、絶縁膜１１８を例えば、スパッタリング法またはＣＶＤ法により堆積する。続いて、各電極１１３ａ〜１１３ｄの大矩形部１１６に対応する絶縁膜１１８部分および小矩形部１１７に対応する絶縁膜１１８部分をレジストパターンをマスクとして選択的にエッチングして、大矩形部１１６に対応する絶縁膜１１８部分に円形窓１１９を、および小矩形部１１７に対応する絶縁膜１１８部分に矩形窓１２０を開口する。それにより前述したチップ素材１１１を作製する。

基板１１２は、例えば、パイレックス（登録商標）ガラスのようなガラスまたは樹脂から作られる。

第１の金属薄膜は、第２の金属薄膜を基板１１２に密着させるための下地金属膜として働き、例えば、Ｔｉから作られる。第２の金属薄膜は、例えば、Ａｕから作られる。

第１および第２の金属薄膜をパターニングするときのエッチングの例は、エッチングガスを用いるプラズマエッチングまたは反応性イオンエッチングを含む。

絶縁膜１１８は、例えば、シリコン酸化膜のような金属酸化膜、シリコン窒化膜のような金属窒化膜を挙げることができる。

絶縁膜１１８をパターニングするときのエッチングの例は、エッチングガスを用いるプラズマエッチングまたは反応性イオンエッチングを含む。

（２）マルチ核酸増幅検出反応具
次に、上記（１）において製造されたチップ素材１１１にプライマーセットとプローブ核酸を固定したマルチ核酸増幅検出反応具の構成および製造方法の１例を図１２（ａ）および図１２（ｂ）を参照しながら説明する。図１２（ａ）はマルチ核酸増幅検出反応具の平面図であり、図１２（ｂ）は図１２（ａ）のマルチ核酸増幅検出反応具の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。

チップ素材１１１上に形成された電極１１３ａの第１の作用極１２１ａを第１のプローブ固定化領域２０１ａとし、この第１のプローブ固定化領域２０１ａに第１の目的配列の相補配列を含む第１のプローブ核酸２０２ａを固定する。固定される第１のプローブ核酸２０２ａは、その複数本を１つのプローブ核酸群として固定される。同様に、電極１１３ｂの第２の作用極１２１ｂを第２のプローブ固定化領域とし、この第２のプローブ固定化領域に第１の目的配列とは異なる第２の目的配列の相補配列を含む第２のプローブ核酸２０２ｂを固定する。

プローブ核酸２０２ａおよび２０２ｂをプローブ固定化領域に固定する方法の例は、金電極を具備したチップ素材１１１については３’末端にチオール基を第１のプローブ核酸２０２ａに導入する方法などが含まれる。

次いで、第１の作用極１２１ａの近傍に第１のプライマー固定化領域２０３ａを、第２の作用極１２１ｂの近傍に第２のプライマー固定化領域２０３ｂを配置する。この第１のプライマー固定化領域２０３ａ上に第１のプライマーセット２０４ａと増粘剤２０５を遊離可能に固定し、第２のプライマー固定化領域２０３ｂ上に第２のプライマーセット２０４ｂと増粘剤２０５を遊離可能に固定する。それによりマルチ核酸増幅検出反応具を作製する。

第１のプライマーセット２０４ａは第１の標的配列を増幅するように設計された配列を有し、第２のプライマー固定化領域２０３ｂは第１の標的配列とは異なる配列からなる第２の標的配列を増幅するように設計された配列を有する。

第１および第２のプライマーセット２０４ａおよび２０４ｂをそれぞれ第１および第２のプライマー固定化領域２０３ａおよび２０３ｂへの固定は、例えば、水、緩衝液または有機溶剤のような液体にプライマーセットを含ませて滴下して、その後例えば、室温などの適切な温度条件下で乾燥するまでの時間例えば、室温の場合では１０分間放置することにより行う。

増粘剤の固定は、第７の実施形態と同様に行ってよく、或いは、増粘剤を固定せずに、反応液中に存在させるのみとしてもよい。

（３）使用時のマルチ核酸増幅検出反応具
上記（２）において作製されたマルチ核酸増幅検出反応具の使用方法について図１３および図１４を参照しながら説明する。

図１３（ａ）は、使用時のマルチ核酸増幅検出反応具の平面図であり、図１３（ｂ）は、図１３（ａ）のマルチ核酸増幅検出反応具の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。

本実施形態のマルチ核酸増幅検出反応具９１を使用する場合、電極１１３ａ〜１１３ｄにそれぞれ形成された第１の作用極１２１ａ、第２の作用極１２１ｂ、対極１２２および参照極１２３、並びに第１のプライマー固定化領域２０３ａおよび第２のプライマー固定化領域２０３ｂが同じ１つの反応場に含まれるように反応液が維持される。そのために、例えば、シリコンゴムのようなシリコン樹脂および／またはフッ素樹脂などのような樹脂を例えば、押出成形、射出成形または型押成形および／または接着剤による接着などのそれ自身公知の何れかの樹脂成形法により成形された被覆体３０１が、マルチ核酸増幅検出反応具９１の使用前にマルチ核酸増幅検出反応具９１上に装着される。被覆体３０１が装着された後に、鋳型核酸３０３を含む反応液３０２がマルチ核酸増幅検出反応具９１と被覆体３０１とにより形成される空間に添加される。

被覆体３０１が装着されたマルチ核酸増幅検出反応具９１において、電極１１３ａ〜１１３ｄのそれぞれの矩形窓１２０から露出する小矩形部１１７は露出している。

被覆体３０１をマルチ核酸増幅検出反応具９１に装着する例は、例えば、圧着、接着剤による接着などが含まれる。

次いで、反応液３０２は被覆体３０１がマルチ核酸増幅検出反応具９１に装着された後に添加される。

マルチ核酸増幅検出反応具９１と被覆体３０１とにより形成される空間に液体を添加する方法は、例えば、被覆体３０１の一部に開口部を予め設けておき、その開口部から添加してもよく、また先端の鋭利な例えば、針のような先端を有した注入器を用いて被覆体３０１の一部に差し込んで添加してもよい。

反応液３０２は、試料と、増粘剤と、増幅試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤および例えば、ヘキスト３３２５８のような２本鎖核酸を認識して信号を生ずるインタカレータを含んでよい。検査されるべき試料中に特定のプライマー固定化領域に固定されたプライマーセットにより増幅されるべき標的配列を含む鋳型核酸が存在した場合、そのプライマー固定化領域とそれに対応するプローブ固定化領域を含む反応場において増幅産物が形成される。その様子を模式的に図１４に示す。

図１４（ａ）は、反応場４０１において増幅産物が形成された状態を模式的に示す。図１４（ａ）は、使用時のマルチ核酸増幅検出反応具の平面図であり、図１４（ｂ）は、図１４（ａ）のマルチ核酸増幅検出反応具の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。上述のように図１３において添加された試料中には、第２のプライマーセット２０４ｂが結合できる配列を含む核酸が含まれていたために、図１４（ａ）および図１４（ｂ）に示すように、反応場４０１に第２のプライマーセットは遊離および拡散し、鋳型核酸と出会った後に増幅反応が行われ、それにより増幅産物が形成される。第２のプライマーセット２０４ｂによる増幅産物は、第２のプライマー固定化領域２０３ｂの周辺に拡散し、第２のプローブ固定化領域２０１ｂに到達する。到達した増幅産物が、目的配列を含む場合、第２のプローブ核酸２０２ｂと増幅産物がハイブリダイズして２本鎖核酸を形成する。この２本鎖核酸に対して、反応液３０２に含まれるインタカレータが結合してハイブリダイズ信号を生じる。

ハイブリダイズ信号は、例えば、電極１１３ａ〜１１３ｄのそれぞれの矩形窓１２０から露出する小矩形部１１７にプローバーを接触させ、ヘキスト３３２５８のようなインタカレータの電流応答を測定することにより行われる。

電気化学的検出を利用するアレイ型プライマープローブチップを使用することによって、より簡単に且つ短時間に試料に含まれる標的核酸を増幅した後に、その増幅産物に含まれる目的核酸の検出を行うことが可能である。

（４）目的核酸の検出方法
例として上述したようなマルチ核酸増幅検出反応具を使用して、複数の標的核酸を増幅して、ハイブリダイズ信号を指標として目的核酸を検出する方法も更なる実施形態として提供される。

また、特定の容器、チューブ、ディッシュまたは流路を形成した基板などの支持体の少なくとも１つの表面に対して、複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するために設計された複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定する工程および／または１種類以上のプローブ核酸をプローブ固定化領域に固定する工程を含む目的核酸の検出方法も更なる実施形態として提供される。

そのような目的核酸の検出方法は、例えば、所望の支持体の少なくとも１つの表面に対して、複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するために設計された複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定することと、複数のプライマー固定化領域の位置またはその近傍のプローブ固定化領域に、プローブ固定化領域毎にハイブリダイズ信号を独立して検出可能に種類毎に、目的配列の相補配列を含む少なくとも１種類のプローブ核酸を固定することと、複数種類のプライマーセットが１つの反応場に含まれるように増幅に必要な試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含む反応液を添加することと、例えば、反応液またはアレイ型プライマープローブチップへの添加などにより反応場に試料を持ち込むことと、当該プライマーが固定された支持体を加熱または冷却することによる温度調節など、増幅反応に適した反応環境を調節することと、それによりマルチ核酸増幅反応を行うことと、マルチ核酸増幅反応により生じた増幅産物と少なくとも１種類のプローブ核酸との間のハイブリダイズの有無および／または量を検出および／または測定することと、を具備してよい。また、前記反応液には増粘剤が含まれてよい。

具体的な検出手段は、それ自身公知のハイブリダイズ信号の検出手段、例えば、蛍光標識を利用する蛍光強度の検出および／または測定、或いはインタカレータを利用する電流応答を検出および／または測定する方法を利用して行われてよい。

更に、マイクロビーズ、板小片または棒などの基体の表面に対して複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するために設計された複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定する工程と、複数のプライマー固定化領域の位置またはその近傍のプローブ固定化領域に、プローブ固定化領域毎にハイブリダイズ信号を独立して検出可能に種類毎に、目的配列の相補配列を含む少なくとも１種類のプローブ核酸を固定することとを含む目的核酸の検出方法も更なる実施形態として提供される。

そのような目的核酸の検出方法は、例えば、所望の基体の少なくとも１つの表面に対して、複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するために設計された複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定することと、複数のプライマー固定化領域の位置またはその近傍のプローブ固定化領域に、プローブ固定化領域毎にハイブリダイズ信号を独立して検出可能に種類毎に、目的配列の相補配列を含む少なくとも１種類のプローブ核酸を固定することと、基体を、増幅に必要な試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含む反応液内に配置することと、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含む反応液を添加することと、反応液への添加により反応場に試料を持ち込むことと、反応液を加熱または冷却することによる温度調節など、増幅反応に適した反応環境を調節することと、それによりマルチ核酸増幅反応を行うことと、マルチ核酸増幅反応により生じた増幅産物と少なくとも１種類のプローブ核酸との間のハイブリダイズの有無および／または量を検出および／または測定することと、を具備する。また、反応液に増粘剤が含まれてもよい。

例として実施形態に示したマルチ核酸増幅検出反応具によれば、異なる配列による干渉を受けずに複数種類の標的配列についての増幅を独立して同時に行うことができる。更に、増幅反応と同時または増幅反応に引き続いて、増幅反応を行ったのと同じ反応場において、増幅反応により生じた増幅産物について目的核酸の有無および／または量を検出および／または測定することができる。また、増粘剤の適用により、複数種類の標的配列について並行して行われる増幅反応が効率よく行われる。

また、増粘剤の反応液への添加に代えて、増粘剤を上述した通りに支持体に固定してもよい。或いは、増粘剤は、反応液中に存在するのみであっても、支持体に固定されて提供されるのみであってもよい。

更に、増幅反応をより効率的に達成するために、反応液の反応場への添加を、注入速度２５ｍｍ／秒以上の速度で注入することが好ましい。これにより、固定化されたプライマーセットの遊離は影響を受けため、プライマーセットのより局所的な拡散が可能になる。

従来の技術では、複数種類のプライマーを１つの容器内で使用してマルチプレックス増幅を行った場合、反応効率に偏りが生じ、種類の数に限りがあることが問題となっている。即ち、異なる種類のプライマー間で、必要な酵素やｄＮＴＰの取り合いが生じることがある。また、標的配列の配列やプライマーの配列により、反応特異性および／または反応効率に違いがでることもある。その場合、プライマーの種類によって増幅反応開始点が異なること、一部のプライマーセットについての増幅のみが開始され進行されること、或いは、一部のプライマーセットについての増幅が十分に達成されないことなどの問題が生じてしまう。このような従来の問題も、本明細書において開示される実施形態により解決される。

即ち、実施形態を例に示したマルチ核酸増幅検出反応具を使用して増幅反応を行うと、固定した増幅試薬付近でのみ増幅反応が進行するため、同一容器中および／または同一溶液中でありながら、互いの増幅反応に干渉せず、各種ターゲットの増幅反応を独立に進行させることが可能であり、そのような増幅反応と同時または引き続いて、増幅反応を行ったのと同じ反応容器において目的核酸の有無および／または量を検出および／または測定することができる。また、ある程度個別の増幅反応が進行した後で、更に異なるプライマーセットを追加してもよく、第１の実施形態に示した容器形態のマルチ核酸増幅検出反応具と、上記のマルチ核酸増幅検出反応具とを組み合わせて使用してもよい。

複数の対象遺伝子を検出する場合、それぞれの対象遺伝子を増幅するための反応容器を用意する方法、全ての対象遺伝子を検出するための試薬を１つの反応容器に入れ、マルチ核酸増幅反応を行なう方法、のいずれかである。それぞれの対象遺伝子を増幅するための反応容器を用意する方法の場合、対象遺伝子数の増加に伴って、必要な反応容器の数や、検査時の作業量が増加する。また、全ての対象遺伝子を検出するための試薬を１つの反応容器に入れる場合、増幅反応効率に偏りが生じる。増粘剤を用いることにより、このような増幅反応効率に生じる偏りを防止できる。

＜実施例２＞
実施例２−１
第９の実施形態を用いて、プライマーの核酸状態を評価した。

蛍光標識したプライマーセットを用意した。図１５と同様の構成を有するマルチ核酸反応具１１２１を示す。

用意したプライマーセットを終濃度２００μＭとなるようにＴＥｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解した。この溶液に終濃度０．３％となるようにアガロースを溶解して固定溶液を調製した。支持体１１２２としてガラス基板を使用した。この固定溶液を支持体１１２２上の中央（図中、１１２３で示す）と、支持体１１２２の２点の隅部（図中、１１２４および１１２５で示す）の３点に滴下して室温に放置して乾燥した。その一面に溝１１２６を形成したシリコンゴム板を被覆体１１２７として使用した。被覆体１１２７の溝１１２６の二端にはそれぞれ貫通孔１１２８および１１２９が形成されている。支持体１１２２のプライマーセットおよびアガロースを固定した領域が被覆体１１２７の溝部１１２６内に含まれるように、支持体１１２２に被覆体１１２７を接着した。これにより、マルチ核酸反応具を得た。このマルチ核酸反応具には、被覆体１１２７の溝部１１２６と支持体１１２２の面とによって流路１１３０が形成されている。

被覆体１１２７の２つの貫通孔をそれぞれ流入口１１２８および排出口１１２９として使用することにより行った。流入口１１２８からＰＢＳを添加した。その後、プライマーの拡散状態を蛍光強度を指標にして観察した。

対象として、アガロースを固定せずに蛍光標識したプライマーセットのみを上述と同様に固定して作製した対照用マルチ核酸反応具を用意した。この対照用マルチ核酸は農具にも同様に流入口ＡからＴＥｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭＥＤＴＡ）を添加して、プライマーの核酸状態を蛍光強度を指標にして観察した。

結果を図１６（ａ）および（ｂ）に示す。図１６（ａ）は、プライマーのみを固定した対照用マルチ核酸反応具において得られた結果である。図１６（ｂ）は、プライマーセットおよびアガロースを固定したマルチ核酸反応具において得られた結果である。

対照用マルチ核酸反応具の方が、プライマーセットおよびアガロースを固定したマルチ核酸反応具よりもＴＥｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭＥＤＴＡ）添加により移動した距離が大きかった。この結果から、プライマーセットおよびアガロースを固定したマルチ核酸反応具により、より局所的なプライマーの拡散が可能となることが明らかになった。

実施例２−２
第１１の実施形態と同様の電気化学的検出用のマルチ核酸増幅検出反応具を作製した。

（１）チップ素材の作製
図１１に示すようなマルチ核酸増幅検出反応具用のチップ素材を形成した。パイレックスガラス表面にチタン及び金の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、エッチング処理により、チタンおよび金の電極パターンをガラス表面上に形成した。更にその上に絶縁膜を塗付して、エッチング処理により電極、即ち、作用極、対極、参照極およびプローブ用電極を露出させた。これをマルチ核酸増幅検出反応具のためのチップ素材とした。

（２）マルチ核酸増幅検出反応具の作製
上記のように作製したチップ素材の作用極上にプローブＤＮＡを固定化した。使用したプローブＤＮＡの塩基配列を表７に示す。

配列番号１〜１３に示す１３種類のプローブＤＮＡ（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、（Ｊ）、（Ｋ）、（Ｌ）および（Ｍ）を上記のように作製したチップ素材に固定化した。プローブＤＮＡをそれぞれ３μＭずつ含むプローブＤＮＡ溶液をそれぞれ調製した。これらの溶液の１００ｎＬを作用極上に各種類毎にスポットした。４０℃で乾燥後、超純水により洗浄した。その後、作用極表面に残った超純水を除去し、プローブＤＮＡがチップ素材の電極に固定化されたＤＮＡチップを作製した。

次に上記でシリコンゴム板製の被覆体を用意した。被覆体の一面には、プローブ固定化領域に対応する位置に溝が形成されている。

被覆体の溝の内側底面に対して複数のプライマーセットを固定した。プライマーセットの固定化領域は、先に固定したプローブＤＮＡの位置に対応する位置となるように調整した。

まず、使用するプライマーＤＮＡを用意した。使用するプライマーＤＮＡは、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法による増幅のためのプライマーセットである。プライマーＤＮＡの塩基配列を表８Ａ、８Ｂおよび８Ｃに示す。

プライマーＤＮＡ（セットＡ）、（セットＢ）、（セットＣ）、（セットＤ）、（セットＥ）、（セットＦ）、（セットＧ）、（セットＨ）、（セットＩ）、（セットＪ）、（セットＫ）、（セットＬ）、（セットＭ）については、２００μＭのＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３およびＬＰＦをそれぞれ準備した。ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＰＦをそれぞれ０．０３６μＬ、０．０３６μＬ、０．００５μＬ、０．００５μＬおよび０．０１８μＬで含む０．１００μＬの溶液に対して、０．６％アガロース溶液を０．１００μＬ混合した。この水溶液を、被覆体であるシリコンゴムの溝部の内側底面のプライマー固定化領域に固定した。

具体的には、用意したそれぞれ０．２００μＬのそれらの溶液を、被覆体の溝部の底部にスポットし、４０℃で２分間乾燥させた。スポットは、被覆体がＤＮＡチップに取り付けられたときに、それぞれのプローブＤＮＡが対応するプライマーセットと対向する位置になるように行った。被覆体の溝部と、プローブＤＮＡが固定化された面が対向するように、被覆体と上記で作製したチップ素材とを接着した。これにより、マルチ核酸増幅検出反応具を得た。被覆体であるシリコンゴムの溝部の２つの端部には、２つの貫通孔が開口されている。

（３）ＬＡＭＰ反応液の作製
ＬＡＭＰ反応液の組成を表９〜表１２に示す。

組成（１）から（４）には、共通して、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、リアクションミックスが含まれ、後述の鋳型溶液と合わせ総量が５０μＬとなるように蒸留水（即ち、ＤＷ）が添加されたものを使用した。

組成（１）には、鋳型Ａ、鋳型Ｃ、鋳型Ｅ、鋳型Ｇ、鋳型Ｉ、鋳型Ｋおよび鋳型Ｍが含まれる。

鋳型Ａは、プライマーセットＡによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ａ）とハイブリダイズする。鋳型Ｃは、プライマーセットＣによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｃ）とハイブリダイズする。鋳型Ｅは、プライマーセットＥによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物はプローブＤＮＡ（Ｅ）とハイブリダイズする。鋳型Ｇは、プライマーセットＧによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｇ）とハイブリダイズする。鋳型Ｉは、プライマーセットＩによってＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｉ）とハイブリダイズする。鋳型Ｋは、プライマーセットＫによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｋ）とハイブリダイズする。鋳型Ｍは、プライマーセットＭによってＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｍ）とハイブリダイズする。

組成（２）は、鋳型Ｂ、鋳型Ｄ、鋳型Ｆ、鋳型Ｈ、鋳型Ｊおよび鋳型Ｌを含む。

鋳型Ｂは、プライマーセットＢによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｂ）とハイブリダイズする。鋳型Ｄは、プライマーセットＤによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｄ）とハイブリダイズする。鋳型Ｆは、プライマーセットＦによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｆ）とハイブリダイズする。鋳型Ｈは、プライマーセットＨによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｈ）とハイブリダイズする。鋳型Ｊは、プライマーセットＪによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｊ）とハイブリダイズする。鋳型Ｌは、プライマーセットＬによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｌ）とハイブリダイズする。

組成（３）は、鋳型Ａ、鋳型Ｂ、鋳型Ｃ、鋳型Ｄ、鋳型Ｅ、鋳型Ｆ、鋳型Ｇ、鋳型Ｈ、鋳型Ｉ、鋳型Ｊ、鋳型Ｋ、鋳型Ｌおよび鋳型Ｍを全て含む。

組成（４）は鋳型を含まない。

鋳型Ａ、鋳型Ｂ、鋳型Ｃ、鋳型Ｄ、鋳型Ｅ、鋳型Ｆ、鋳型Ｇ、鋳型Ｈ、鋳型Ｉ、鋳型Ｊ、鋳型Ｋ、鋳型Ｌおよび鋳型Ｍの塩基配列を表１３Ａ、表１３Ｂおよび表１３Ｃに示す。

（４）マルチ核酸増幅検出反応具上でのＬＡＭＰ増幅反応及び、プローブＤＮＡよる目的核酸の検出
被覆体であるシリコンゴム板に設けられた２つの貫通孔のうちの一方を流入口とした。シリコンゴム板に設けられた溝部とチップ素材の一面とにより構成される流路を反応部として、そこにおいて反応を行った。反応液がプライマー固定化位置上を流速２５ｍｍ／ｓｅｃで通過するよう、流入口から反応部にＬＡＭＰ反応溶液を注入した。その後速やかに、ＤＮＡ自動検査装置内にマルチ核酸増幅検出反応具を設置した。ＤＮＡ自動検査装置内のペルチェ上で６４℃６０分間ＬＡＭＰ反応を行った。

６０分間のＬＡＭＰ反応の後、５５℃で１０分間ハイブリダイゼーション反応を行い、３０℃で３分間洗浄を行った。その後、洗浄溶液を除去し、３５．５μＭヘキスト３３２５８溶液を流入口から注入した。

各プローブ核酸固定化作用極に電位を掃引し、プローブＤＮＡとＬＡＭＰ産物により形成された二本鎖に特異的に結合したヘキスト３３２５８分子の酸化電流を計測した。上記一連の反応は、SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. １, No. ３, pp. ２６６-２７０, ２００８に記載のＤＮＡ自動検査装置にて実施した。

（５）検出結果
検出結果を表１４に示した。

［ＬＡＭＰ反応溶液組成（１）の結果］
鋳型Ａ、鋳型Ｃ、鋳型Ｅ、鋳型Ｇ、鋳型Ｉ、鋳型Ｋ、鋳型Ｍを含むＬＡＭＰ反応溶液組成（１）を添加した場合の結果は次の通りである。

電流値が得られたプローブＤＮＡは、プローブＤＮＡ（Ａ）、プローブＤＮＡ（Ｃ）、プローブＤＮＡ（Ｅ）、プローブＤＮＡ（Ｇ）、プローブＤＮＡ（Ｉ）、プローブＤＮＡ（Ｋ）およびプローブＤＮＡ（Ｍ）であった。これらのプローブＤＮＡ（Ａ）、プローブＤＮＡ（Ｃ）、プローブＤＮＡ（Ｅ）、プローブＤＮＡ（Ｇ）、プローブＤＮＡ（Ｉ）、プローブＤＮＡ（Ｋ）およびプローブＤＮＡ（Ｍ）の全てのプローブについて３０ｎＡ以上の電流値が得られた。

従って、組成（１）のＬＡＭＰ反応液の場合、シリコンゴムの内側底面に固定されているプライマーセットＡ、プライマーセットＣ、プライマーセットＥ、プライマーセットＧ、プライマーセットＩ、プライマーセットＫおよびプライマーセットＭによるＬＡＭＰ反応が各々局所的に進行し、生じた増幅産物が、上記のプローブＤＮＡとハイブリダイズしたことが明らかとなった。

一方、シリコンゴムの内側底面に固定されているプライマーＤＮＡがプライマーセットＢ、プライマーセットＤ、プライマーセットＦ、プライマーセットＨ、プライマーセットＪ、プライマーセットＬの場合には電流値は得られなかった。

これらの結果より、実施形態のマルチ核酸増幅検出反応具により、ＬＡＭＰ反応溶液に含まれる鋳型Ａ、鋳型Ｃ、鋳型Ｅ、鋳型Ｇ、鋳型Ｉ、鋳型Ｋおよび鋳型Ｍがそれぞれに対応するプライマーセットに増幅され、且つ対応するプローブ核酸とハイブリダイズしたことが検出できた。

この結果から、ＬＡＭＰ反応溶液には、鋳型Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、ＫおよびＭが含まれていたことを判定することが可能である。

［ＬＡＭＰ反応溶液組成（２）の結果］
また、鋳型Ｂ、鋳型Ｄ、鋳型Ｆ、鋳型Ｈ、鋳型Ｊおよび鋳型Ｌを含むＬＡＭＰ反応溶液組成（２）を添加した場合の結果は次の通りである。

組成（２）の反応溶液の添加により、プローブＤＮＡ（Ｂ）、プローブＤＮＡ（Ｄ）、プローブＤＮＡ（Ｆ）、プローブＤＮＡ（Ｈ）、プローブＤＮＡ（Ｊ）およびプローブＤＮＡ（Ｌ）の全てのプローブについて３０ｎＡ以上の電流値が得られた。

従って、鋳型Ｂ、鋳型Ｄ、鋳型Ｆ、鋳型Ｈ、鋳型Ｊおよび鋳型Ｌは、シリコンゴムの底面に固定されているプライマーＤＮＡ、即ち、プライマーセットＢ、プライマーセットＤ、プライマーセットＦ、プライマーセットＨ、プライマーセットＪおよびプライマーセットＬによりそれぞれ局所的に増幅され、生じた増幅産物が、対応するプローブＤＮＡにハイブリダイズしたことが確認された。

一方、シリコンゴムの底面に固定されているプライマーＤＮＡ、プライマーセットＡ、プライマーセットＣ、プライマーセットＥ、プライマーセットＧ、プライマーセットＩ、プライマーセットＫおよびプライマーセットＭ）では電流値は得られなかった。

この結果から、ＬＡＭＰ反応溶液には、鋳型Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌが含まれていたことを判定することが可能である。

［ＬＡＭＰ反応溶液組成（３）の結果］
１３種類の鋳型が全て含まれるＬＡＭＰ反応溶液組成（３）を添加した場合の結果は次の通りである。

全てのプローブＤＮＡについて、３０ｎＡ以上の電流値が得られた。これにより、シリコンゴムの底面に固定されている１３種類のプライマーＤＮＡによるＬＡＭＰ反応が各々局所的に進み、生じたＬＡＭＰ産物が１３種類のプローブＤＮＡと反応したことが明らかとなった。

この結果から、ＬＡＭＰ反応溶液には、１３種類の鋳型が含まれていたことが判定することが可能である。

また、鋳型を含まないＬＡＭＰ反応溶液組成（４）を添加した場合、シリコンゴムの底面に固定されている１３種類のプライマーＤＮＡによるＬＡＭＰ増幅反応は進まず、電流値は得られなかった。

以上の結果から、本実施例に記載したアレイ型プライマープローブチップを用いて、ＬＡＭＰ反応溶液中に含まれる複数種類の鋳型を検出し、且つその配列を識別することが可能であることが示された。

実施例２−３
増粘剤の代わりに水を混合したプライマーを固定した以外は、例２-３と同様に試験を行った。即ち、４種類のＬＡＭＰ反応液は、上記増粘剤を添加した場合に用いた試薬と全く同一であり、含まれる鋳型の種類も等しいものを使用した。

その結果を表１５に示した。

鋳型を含まないＬＡＭＰ反応液（４）では、何れのプローブＤＮＡについても電流値は検出されなかった。

一方、ＬＡＭＰ反応液（１）、（２）および（３）を添加した結果であっても、そこに含まれる鋳型に由来する電流値が得られない場合もあった。これは、ＬＡＰＭ反応液（１）、（２）および（３）に含まれる鋳型の一部分についての増幅が得られなかったために、ＬＡＭＰ増幅による増幅産物が生じず、従って、プローブＤＮＡとのハイブリダイズが生じなかったためであると考えられる。また更に、電流値が得られたプローブＤＮＡについての電流値も、増粘剤をプライマーセットと共に固定した場合と比べて、得られた電流値は小さい値であった。

これらの結果から、プライマーセットを固定化する際に増粘剤を添加しないと、プライマーＤＮＡの溶出範囲が広がり、本来得られるべき増幅反応が達成されない可能性が大きいことが示唆された。

上記の実施例２−２および２−３の結果から次のことが示された。本例に記載されたように、実施形態に従うマルチ核酸増幅検出反応具においてプライマーセットの固定と共に増粘剤を添加することにより、ＬＡＭＰ反応溶液中に含まれる複数種類の鋳型をより高精度に検出することが可能であり、且つその配列を識別することが可能であることが示された。

実施例２−４
上述した例２−２の（１）において作製したチップ素材に対して増粘剤とプライマーセットを固定した。

増粘剤の調製方法を記載する。増粘剤として、ナカライテスク社製「Agarose-Super LM (melting temperature≦６０℃)」を用いた。アガロースの場合、分子量や構造により固有の融解温度、ゲル化温度、再融解温度を有しており、特性に合わせて条件を設定する必要がある。

アガロース０．６gを１００ｍＬのＤＷに添加し、よく混合した後に、８０℃で過熱することで完全に溶解させ、０．６％アガロース溶液を作製した。プライマー溶液と混合する際は、再度８０℃に過熱して完全に溶解させた後に、プライマーと等量ずつ混合し、アガロース濃度が終濃度０．３％となるよう調製した。

上記のように調製した終濃度０．３％アガロース混合プライマー溶液を支持体上に滴下した。その後、４０℃に設定したホットプレート上で２分間加熱することで乾燥させた。乾燥後の状態がフィルム上になり、完全に固定化されていることを確認した後、使用するまで支持体と共に−２０℃で保管した。

４．流路形状の設計
更なる実施形態として、ここで記載されるマルチ核酸増幅反応具は、微細な流路にて核酸の増幅反応を行う反応デバイスとして、或いは、増幅反応後に増幅産物を検出する核酸検出用デバイス及び核酸検出装置として提供されてもよい。

近年の遺伝子工学の発展に伴い、医療分野では、遺伝子による病気の診断或いは予防が可能となりつつある。これは遺伝子診断と呼ばれ、病気の原因となるヒトの遺伝子欠陥、変化を検出することで病気の発症前もしくは極めて初期段階での病気の診断や予測をすることが出来る。また、ヒトゲノムの解読とともに、遺伝子型と疫病との関連に関する研究が進み、各個人の遺伝子型に合わせた治療（テーラーメイド医療）も現実化しつつある。従って、遺伝子の検出並びに遺伝子型の決定を簡便に行うことは非常に重要となっている。さらにこれらの遺伝子検査は、複数種類の遺伝子を検出することで総合的な判断を行う場合が多いため、複数種類の対象遺伝子を、同時に短時間で検出することは極めて重要である。

核酸を検出するための装置として、１つのデバイス内において複数試薬が関わる複数の反応を順次行うことができるμ−ＴＡＳと呼ばれるデバイスが盛んに研究開発されてきた。これらは試薬保持領域、反応領域、センサ領域などから成り、それらをつなぐ流路を備えることが特徴である。

複数種の遺伝子を同時に１つのデバイス内で検出する場合、複数の対象遺伝子を増幅するために複数の別々の増幅用容器を用意する方法、もしくは、全ての対象遺伝子の増幅反応をひとつの反応容器に入れてマルチ核酸増幅反応を行う方法、のいずれかが考えられる。しかしながら、検出したい対象遺伝子種が多くなった場合に、いずれの方法でもデバイス化が困難になるという問題がある。つまり複数の別々の増幅容器を用意する方法では、複数の増幅容器を多く用意する必要がありデバイスが複雑になる、またマルチ核酸増幅反応を行う方法では、対象遺伝子数が多くなると、遺伝子増幅反応の競合が発生し、増幅効率が大きく低下するという問題がある。

上記問題の解決手段の１つとして、１つの反応場において、複数種類の標的核酸を複数種類のプライマーセットを用いて同時に独立して（独立した領域で）増幅反応させ、得られた各増幅産物の量を独立して測定することで目的核酸の有無を決定する核酸検出用デバイスがある。

しかしながら、上述のような１つの反応場において複数種類の標的核酸を複数種類のプライマーセットを用いて同時に独立して増幅反応させることを想定した核酸検出用デバイスは、例えば、以下のような課題がある。

課題の１つは、核酸検出用デバイスの増幅領域におけるプライマーセットの保持の困難性である。プライマーセットは、核酸検出用デバイスの増幅領域に保持するためにプライマーセットを含む溶液を各増幅領域に滴下させる。しかしながら、この溶液は、プライマーセットを保持させる過程で、容易に動いてしまう。したがって、核酸検出用デバイスは、各増幅領域におけるプライマーセットの保持位置を正確に規定できないという問題がある。

他の課題は、プライマーセットの流出である。予め増幅領域に保持したプライマーセットは、標的核酸を含む溶液を増幅領域に導入した場合に、その保持位置から隣接する増幅領域に流出してしまう恐れがある。

他の課題は、プライマーセット及び増幅産物の動きによる増幅反応の阻害である。プライマーセット及び増幅産物は、増幅反応中に、溶液の流れにより、拡散する。隣接した別の増幅領域から対象外のプライマーセット及び増幅産物が流れてくると、増幅領域では、増幅反応が阻害される恐れがある。

他の課題は、保護膜からの溶出物による増幅反応の阻害である。増幅反応は、増幅産物の検出センサを内包する領域で行われる。しかしながら、センサの保護膜からの溶出物が増幅反応を阻害する恐れがある。

本実施形態を利用することによって、マルチ核酸増幅反応具は、このような問題および課題についても解決することが可能であり、それにより更なる態様である、核酸の増幅反応の効率を向上させるマルチ核酸増幅反応具、例えば、核酸反応用デバイス、核酸検出用デバイス及び核酸検出装置を提供することが可能になる。

以下に、図面を参照しながら、種々の実施形態について説明する。なお、実施形態を通して共通の構成には同一の符号を付すものとし、重複する説明は省略する。また、各図は実施形態とその理解を促すための模式図であり、その形状や寸法、比などは実際の装置と異なる個所があるが、これらは以下の説明と公知の技術を参酌して適宜、設計変更することができる。

＜第１２の実施形態＞第１２の実施形態に係る核酸検出用デバイス３００１の１例を図１７を参照しながら説明する。図１７（ａ）は、核酸検出用デバイス３００１の１例の平面図である。図１７（ｂ）は、図１７（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス３００１の断面図である。核酸検出用デバイス３００１は、１つの反応場において複数種類の標的核酸を複数種類のプライマーセット３０３１を用いて同時に独立して増幅反応させるために用いられる。

核酸検出用デバイス３００１は、支持体（第２の部材）３０１１、被覆体（第１の部材）３０１２を備える。支持体３０１１は、被覆体３０１２と接する面に略平面を備える。なお、第１２の実施形態では、支持体３０１１、被覆体３０１２の順で並ぶ方向を積層方向という。被覆体３０１２は、支持体３０１１と接する面（第１の面）に、溝部３１２１を備える。溝部３１２１は、支持体３０１１と接する面に設けられている。溝部３１２１は、被覆体３０１２及び、これと接する支持体３０１１により、内部は密閉される。被覆体３０１２及び支持体３０１１で密閉された溝部３１２１は、各種溶液の流路として機能する。溝部３１２１は、１例として、各種溶液の入口３１２１ａから出口３１２１ｂにかけて曲線状に蛇行した形状であるが、特に限定されない。溝部３１２１は、入口３１２１ａから出口３１２１ｂにかけて略同じ幅で形成されている。溝部３１２１は、例えば等間隔で複数のチャンバ（流路型チャンバ）１２１１が相互に配置されている。チャンバ４２１１は、核酸の増幅反応が行なわれ、後述する電極（センサ）と核酸サンプルが反応するために用いられる。チャンバ４２１１は、溝部３１２１におけるチャンバ４２１１以外の領域（部分）よりも、積層方向に凹んだ形状で形成されている。つまり、チャンバ４２１１の深さは、溝部３１２１におけるチャンバ４２１１以外の領域の深さよりも深く形成されている。逆に言えば、溝部３１２１におけるチャンバ４２１１以外の領域の深さは、チャンバ４２１１の深さよりも浅い。したがって、チャンバ４２１１の断面積は、溝部３１２１におけるチャンバ４２１１以外の領域の断面積よりも大きい。なお、チャンバ４２１１の断面積及び溝部３１２１におけるチャンバ４２１１以外の領域の断面積は、被覆体３０１２における溝部３１２１が設けられた面と直交する面に基づいた断面積である。溝部３１２１におけるチャンバ４２１１以外の領域の断面積は、チャンバ４２１１の断面積の例えば９０％以下であることが好ましいが、特に限定されるものではない。なお、チャンバ４２１１は、プライマー固定化領域３０２１と対応する。プライマー固定化領域３０２１は、例えば、チャンバ４２１１の上面部（チャンバ４２１１以外の領域よりも積層方向に凹んだ部分）に形成されている。複数のプライマー固定化領域３０２１は、互いに独立して溝部３１２１に配置される。

なお、支持体３０１１及び被覆体３０１２の材質は、同じであっても異なっていてもよい。また、支持体３０１１及び被覆体３０１２の材質は、支持体３０１１及び被覆体３０１２自身が増幅反応等に関与しない材質であればよい。支持体３０１１及び被覆体３０１２は、溝部３１２１内で増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。支持体３０１１及び被覆体３０１２は、例えば、シリコン、ガラス、樹脂及び金属などから任意に選択されてもよい。

次に、プライマー固定化領域３０２１における、核酸を増幅させるためのプライマーセット３０３１の固定（保持）について説明する。チャンバ４２１１は、流路壁面にプライマーセット３０３１を保持する。なお、プライマー固定化領域３０２１は、チャンバ４２１１の位置と対応するため、適宜チャンバ４２１１と読み替えてもよい。プライマーセット３０３１は、図１７に示すように、チャンバ４２１１における積層方向の上面部近傍（プライマー固定化領域３０２１）に、反応場を提供するための液相と接触すると遊離するような状態で固定される。複数のチャンバ４２１１（プライマー固定化領域３０２１）は、標的核酸の種類ごとに複数のプライマーセット３０３１がそれぞれ固定される。つまり、複数のチャンバ４２１１（プライマー固定化領域３０２１）は、複数種類の標的配列をそれぞれ増幅するように構成された複数種類のプライマーセットを保持する。プライマーセット３０３１の固定化は、例えば、溝部３１２１が鉛直方向の上方を向くように被覆体３０１２のみを準備し、１つのプライマー固定化領域３０２１にプライマーセット３０３１を含む溶液を滴下し、その後乾燥させることで可能である。なお、プライマーセット３０３１の保持方法は、乾燥によるものに限らず、その他凍結乾燥等の手法を用いてもよい。

上述のように、チャンバ４２１１は溝部３１２１におけるチャンバ４２１１以外の領域よりも深く形成されているため、プライマー固定化領域３０２１に局所的に滴下されたプライマーセット３０３１を含む溶液は、チャンバ４２１１以外の領域に容易に動くことはない。したがって、隣接したプライマー固定化領域３０２１は、異なったプライマーセット３０３１を独立して保持可能となる。

次に、複数のプライマーセット３０３１がそれぞれ異なるプライマー固定化領域３０２１に固定された核酸検出用デバイス３００１への反応液の添加について説明する。図１８（ａ）は、核酸検出用デバイス３００１の１例の平面図である。図１８（ｂ）は、図１８（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス３００１の断面図である。図１８は、核酸検出用デバイス３００１に反応液を添加した状態を示す。なお、図１８に示す核酸検出用デバイス３００１は、反応液が溝部３１２１に添加された以外は図１と同様である。

反応液は、核酸増幅反応に必要な成分を含んでいればよい。反応液は、これらに限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含んでいてもよい。

図１８に示すように、入口３１２１ａから反応液を添加した後、プライマー固定化領域３０２１に固定されたプライマーセット３０３１は、遊離、拡散し始める。プライマーが遊離および拡散した領域は、模式的に図１８中にプライマー遊離・拡散領域３０２２で示される。

反応液が核酸検出用デバイス３００１に導入された時、遊離、拡散するプライマーセット３０３１は、容易に隣接するその他のプライマー固定化領域３０２１に流出しないことが望まれる。つまり、プライマー遊離・拡散領域３０２２は、プライマー固定化領域３０２１（言い換えるとチャンバ４２１１）と対応することが望ましい。

核酸検出用デバイス３００１は、反応液導入時において、チャンバ４２１１におけるプライマーセット３０３１が固定された部分（チャンバ４２１１以外の領域よりも積層方向に凹んだ部分）近傍の流速を大幅に低減させることができる。そのため、核酸検出用デバイス３００１は、プライマーセット３０３１が隣接するその他のプライマー固定化領域３０２１に流出することを防止できる。したがって、第１２の実施形態に係る核酸検出用デバイス３００１は、隣接したプライマー固定化領域３０２１のプライマーセット３０３１をそれぞれ独立させることができる。

さらに、増幅反応中においても、ある増幅領域（プライマー固定化領域３０２１（チャンバ４２１１）に対応する領域）におけるプライマーセット３０３１及び生成された増幅産物は、その他の増幅領域へ拡散せず、独立して増幅領域内に位置することが望まれる。核酸検出用デバイス３００１は、チャンバ４２１１以外の領域における溝部３１２１の深さ（流路断面積）は、チャンバ４２１１の深さ（流路断面積）よりも浅い（小さい）。そのため、核酸検出用デバイス３００１は、増幅反応中において、ある増幅領域におけるプライマー及び生成された増幅産物が、その他の増幅領域へ拡散することを抑制することができる。したがって、第１２の実施形態に係る核酸検出用デバイス３００１は、複数種類のプライマーセット３０３１を用いた複数の鋳型配列についての増幅を、独立に（局所的に）、且つ同時に高効率で達成可能である。

局所的に得られた増幅産物の具体的な検出手段は、それ自身公知のハイブリダイズ信号の検出手段、例えば、蛍光標識を利用する蛍光強度の検出および／または測定、或いはインタカレータを利用する電流応答を検出および／または測定する方法を利用して行われてよく、限定されない。

次に、核酸検出用デバイス３００１によるハイブリダイズ信号の検出について説明する。図１９（ａ）は、核酸検出用デバイス３００１の１例の平面図である。図１９（ｂ）は、図１９（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス３００１の断面図である。なお、図１９に示す核酸検出用デバイス３００１は、支持体３０１１がプローブ固定化領域３１１１を備える以外は図１と同様である。プローブ固定化領域３１１１は、例えば、プライマー固定化領域３０２１（チャンバ４２１１）に対向する位置に支持体３０１１に配置されるが、特に限定するものではなく、チャンバ４２１１内であればどのような形態であってもよい。プローブ固定化領域３１１１は、例えば、ハイブリダイズ信号を検出する電極（核酸検出用の電極）が設けられる領域である。つまり、プローブ固定化領域３１１１における核酸検出用の電極は、被覆体３０１２における支持体３０１１と接する面と対向し、溝部３１２１（特にプライマー固定化領域３０２１（チャンバ４２１１））と対向する位置に配置される。

プローブ固定化領域３１１１は、検出されるべき所望の配列の相補配列を含むプローブ核酸が複数固定される。核酸検出用デバイス３００１は、プライマー固定化領域３０２１にて増幅反応を行った後、引き続きプローブ固定化領域３１１１にてハイブリダイズ信号を得ることができる。

次に、図１９に示す核酸検出用デバイス３００１に反応液を導入し、増幅反応を行った場合について説明する。図２０（ａ）は、核酸検出用デバイス３００１の１例の平面図である。図２０（ｂ）は、図２０（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス３００１の断面図である。図２０は、核酸検出用デバイス３００１に反応液を添加した状態を示す。なお、図２０に示す核酸検出用デバイス３００１は、反応液が溝部３１２１に添加された以外は図１９と同様である。核酸検出用デバイス３００１では、反応液が導入されると、鋳型核酸が存在する場合、対応した遊離、拡散したプライマーセット３０３１により鋳型核酸が増幅され、増幅産物３０３２が生じる。増幅反応で生じる増幅産物３０３２は、図２０に示すように局所的にチャンバ４２１１内で生成される。核酸検出用デバイス３００１は、増幅産物３０３２がプローブ固定化領域３１１１に固定されたプローブと反応することでハイブリダイズ信号を得ることができる。

＜実施例３＞
実施例３−１
以下に、第１２の実施形態に係る核酸検出デバイス３００１を用いた核酸検出の例を具体的に説明する。本実施例３−１では、被覆体３０１２としてシリコンゴム製のパッキン３０１２ａを使用し、パッキン３０１２ａ一面のプライマー固定化領域３０２１にプライマーセット３０３１を固定した。図２１は、実施例３−１に係る支持体３０１１の１例を示す概略図である。実施例３−１では、支持体３０１１
として、プローブ固定化領域３１１１を電極３１１１ａとした電気化学的検出用のアレイ型チップ（基板）３０１１ａを用い、ハイブリダイズの存在に依存して生じる電流応答を検出するセンサーとして使用した。なお、パッド部３１１２ａは、配線３１１３ｂを介して電極３１１１ａのハイブリダイズ信号を核酸検出装置（図示せず）に伝達するためのものである。つまり、核酸検出装置は、各電極３１１１ａからの電流値に基づいて核酸を検出する。

（１）核酸検出用デバイスの準備
１−１電気化学的検出用アレイ型チップの作製
電気化学的検出用アレイ型チップ３０１１ａは、パイレックス（登録商標）ガラス表面にチタン及び金の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、エッチング処理により、チタンおよび金の電極パターンをガラス表面上に形成した。更にその上に絶縁膜を塗付して、エッチング処理により電極３１１１ａを露出させた。

次に上記チップ素材上の各電極３１１１ａ（図２１中Ａ−Ｅ、ＮＣ（ネガティブコントロール））に、表１６に示す６種類の核酸プローブ（配列Ａ〜Ｅ、ＮＣ）を固定化した。各核酸プローブを含む溶液を各電極３１１１ａに滴下し、その後余分な核酸プローブを洗浄除去することで固定化した。

１−２プライマー固定済みパッキン３０１２ａの作製、核酸検出用デバイスの組立
まずプライマーセット３０３１として使用するプライマーＤＮＡを用意した。使用するプライマーＤＮＡは、Loop-mediated Isothermal amplification（ＬＡＭＰ）法による増幅のためのプライマーセット３０３１である。使用したプライマーＤＮＡの塩基配列を表１７に示す。プライマーＤＮＡを含んだ溶液を、それぞれ対応するプローブＤＮＡが固定された領域に対向するパッキン３０１２ａの底面にスポットし、４０℃で２分間乾燥させた。これにより、プライマー固定済みパッキン３０１２ａを得た。このパッキン３０１２ａをアレイ型チップ３０１１１ａに取り付け、図２２に示した核酸検出用デバイス３００１を得た。図２２（ａ）は、実施例３−１に係る核酸検出用デバイス３００１の１例の平面図である。図２２（ｂ）は、図２２（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス３００１の断面図である。

（２）核酸の検出
２−１鋳型溶液の準備
表１８のように、遺伝子Ａ、Ｂ、Ｄの３種類の鋳型とＬＡＭＰ増幅用試薬とを混合した鋳型溶液を準備した。

鋳型溶液には、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、リアクションミックスが含まれ、総量が５０μＬとなるように蒸留水（即ち、ＤＷ）が添加されたものを使用した。鋳型溶液は、表１９に示すように、プライマーＤＮＡ（セットＡ）によってＬＡＭＰ法による増幅反応が生じて、且つプローブＤＮＡ（Ａ）とハイブリダイズして検出される鋳型Ａと、プライマーＤＮＡ（セットＢ）によってＬＡＭＰ法による増幅反応が生じて、且つプローブＤＮＡ（Ｂ）とハイブリダイズして検出される鋳型Ｂと、プライマーＤＮＡ（セットＤ）によってＬＡＭＰ法による増幅反応が生じて、且つプローブＤＮＡ（Ｄ）とハイブリダイズして検出される鋳型Ｄと、を含む。

２−２鋳型溶液の添加
２−１にて準備した鋳型溶液を、核酸検出用デバイス３００１に５０μＬ添加した。

２−３核酸の反応
以下に示す条件にて、核酸検出用デバイス３００１の流路領域を加熱或いは冷却し、各種反応を行った。図２３（ａ）は、実施例３−１に係る核酸検出用デバイス３００１の１例の平面図である。図２３（ｂ）は、図２３（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス３００１の断面図である。図２３に示すように、特定のプライマーについて、増幅すべき標的配列を含む鋳型がＬＡＭＰ反応溶液に含まれている場合、そのプライマーが固定された場所で局所的にＬＡＭＰ反応が進み、生じた増幅産物３０３２はその近傍にあるプローブＤＮＡとハイブリダイズする。

核酸増幅反応：６４℃、６０分
ハイブリダイゼーション反応：５０℃、１０分
洗浄反応：３０℃、５分
電流検出用試薬（ヘキスト３３２５８）反応：２５℃、３分。

２−４核酸の検出
各プローブ核酸固定化作用極に電位を掃引し、プローブＤＮＡとＬＡＭＰ産物により形成された二本鎖に特異的に結合したヘキスト３３２５８分子の酸化電流を計測した。上記一連の反応は、SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. １, No. ３, pp. ２６６-２７０, ２００８に記載のＤＮＡ自動検査装置にて実施した。

結果
得られた結果を図２４に示す。図２４は、実施例３−１に係る核酸増幅反応の結果を示すグラフである。鋳型を添加した遺伝子Ａ、Ｂ、Ｄに対応するプローブＡ、Ｂ、Ｄを固定化した電極Ａ、Ｂ、Ｄにおいて、ＮＣよりも大きな電流値が得られた。一方、鋳型が添加されていない遺伝子Ｃ、Ｅに対応する電極Ｃ、Ｅの電流値は、ＮＣと同程度となった。このことから、鋳型溶液中の鋳型を確実に検出できたことが明らかとなった。

＜第１３の実施形態＞
第１３の実施形態について図面を参照し、詳細に説明する。なお、第１２の実施形態で説明した構成と同一の構成については、同符号を付して説明を省略する。第１３の実施形態に係る核酸検出用デバイス３００１の１例を図２５を参照しながら説明する。図２５（ａ）は、核酸検出用デバイス３００１の１例の平面図である。図２５（ｂ）は、図２５（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス３００１の断面図である。核酸検出用デバイス３００１は、１つの反応場において複数種類の標的核酸を複数種類のプライマーセット３０３１を用いて同時に独立して増幅反応させるために用いられる。第１３の実施形態は、溝部３１２１の形状が第１２の実施形態と異なる。

溝部３１２１は、入口３１２１ａから出口３１２１ｂにかけて、積層方向に略同じ深さで形成されている。溝部３１２１は、所定間隔でチャンバ４２１１が複数配置されている。チャンバ４２１１の幅は、溝部３１２１におけるチャンバ４２１１以外の領域の幅よりも広い形状で形成されている。逆に言えば、溝部３１２１におけるチャンバ４２１１以外の領域の幅は、チャンバ４２１１の幅よりも狭い。なお、チャンバ４２１１は、溝部３１２１におけるチャンバ４２１１以外の領域よりも幅が広ければよく、積層方向と直交する方向に円弧状に突出していても、角状に突出していてもよい。したがって、チャンバ４２１１の断面積は、溝部３１２１におけるチャンバ４２１１以外の領域の断面積よりも大きい。なお、チャンバ４２１１の断面積及び溝部３１２１におけるチャンバ４２１１以外の領域の断面積は、被覆体３０１２における溝部３１２１が設けられた面と直交する面に基づいた断面積である。溝部３１２１におけるチャンバ４２１１以外の領域の断面積は、チャンバ４２１１の断面積の最大値の例えば９０％以下であることが好ましいが、特に限定されるものではない。なお、チャンバ４２１１は、プライマー固定化領域３０２１と対応する。プライマー固定化領域３０２１は、溝部３１２１における積層方向の上面部近傍に形成されている。複数のプライマー固定化領域３０２１は、互いに独立して溝部３１２１に配置される。

上述のように、チャンバ４２１１は溝部３１２１におけるチャンバ４２１１以外の領域よりも幅が広く形成されているため、プライマー固定化領域３０２１に局所的に滴下されたプライマーセット３０３１を含む溶液は、チャンバ４２１１以外の領域に容易に動くことはない。したがって、隣接したプライマー固定化領域３０２１は、異なったプライマーセット３０３１を独立して保持可能となる。

次に、複数のプライマーセット３０３１がそれぞれ異なるプライマー固定化領域３０２１に固定された核酸検出用デバイス３００１への反応液の添加について説明する。図２６（ａ）は、核酸検出用デバイス３００１の１例の平面図である。図２６（ｂ）は、図２６（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス３００１の断面図である。図２６は、核酸検出用デバイス３００１に反応液を添加した状態を示す。なお、図２６に示す核酸検出用デバイス３００１は、反応液が溝部３１２１に添加された以外は図２５と同様である。反応液は、第１２の実施形態と同様の成分であってもよい。

図２６に示すように、入口３１２１ａから反応液を添加した後、プライマー固定化領域３０２１に固定されたプライマーセット３０３１は、遊離、拡散し始める。プライマーが遊離および拡散した領域は、模式的に図２６中にプライマー遊離・拡散領域３０２２で示される。核酸検出用デバイス３００１は、チャンバ４２１１以外の領域における溝部３１２１の幅（流路断面積）は、チャンバ４２１１の幅（流路断面積）よりも狭い（小さい）。そのため、核酸検出用デバイス３００１は、増幅反応中において、ある増幅領域におけるプライマー及び生成された増幅産物が、その他の増幅領域へ拡散することを抑制することができる。したがって、第１３の実施形態に係る核酸検出用デバイス３００１は、複数種類のプライマーセット３０３１を用いた複数の鋳型配列についての増幅を、独立に（局所的に）、且つ同時に高効率で達成可能である。

なお、図２５、２６に示す例では、プライマーセット３０３１がチャンバ４２１１の上面部近傍の流路壁面に固定された例について説明したが、これに限定されるものではない。図２７は、チャンバ４２１１（プライマー固定化領域３０２１）におけるプライマーセット３０３１の他の固定場所について示す核酸検出用デバイス３００１の１例の平面図である。プライマーセット３０３１は、積層方向と直交するチャンバ４２１１の流路壁面に固定されてもよい。つまり、プライマーセット３０３１は、チャンバ４２１１において、チャンバ４２１１以外の溝部３１２１の領域よりも積層方向と直交する方向に突出した部分に設けられている。

図２７に示すようにプライマーセット３０３１がチャンバ４２１１に固定された場合、核酸検出用デバイス３００１は、反応液導入時において、チャンバ４２１１におけるプライマーセット３０３１が固定された部分（チャンバ４２１１以外の溝部３１２１の領域よりも積層方向と直交する方向に突出した部分）近傍の流速を大幅に低減させることができる。そのため、核酸検出用デバイス３００１は、プライマーセット３０３１が隣接するその他のプライマー固定化領域３０２１に流出することを防止できる。したがって、第１３の実施形態に係る核酸検出用デバイス３００１は、隣接したプライマー固定化領域３０２１のプライマーセット３０３１をそれぞれ独立させることができる。

なお、図２５、２６、２７に示す例では、各チャンバ４２１１同士を接続する溝部３１２１の部分は、最短距離で接続する直線形状で構成されているが、これに限定されるものではない。図２８は、各チャンバ４２１１同士を接続する溝部３１２１の他の形状について示す核酸検出用デバイス３００１の１例の平面図である。図２８に示す例では、各チャンバ４２１１同士を接続する溝部３１２１の部分は、直線形状よりも流路の距離が長くなるような形状（例えば曲線形状）で構成されている。したがって、図２８に示す溝部３１２１は、図２５、２６、２７に示す直線形状で各チャンバ４２１１同士を接続する溝部３１２１の構成と比較して、各チャンバ４２１１同士の独立性を高めることができ、効率のよい核酸増幅を行うことができる。なお、ここでは、第１３の実施形態に関して、各チャンバ４２１１同士を接続する溝部３１２１の構成について説明したが、第１２の実施形態についても、図２８に示すような構成を適用することで、上述の効果を得ることができる。

次に、核酸検出用デバイス３００１によるハイブリダイズ信号の検出について説明する。図２９（ａ）は、核酸検出用デバイス３００１の１例の平面図である。図２９（ｂ）は、図２９（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス３００１の断面図である。なお、図２９に示す核酸検出用デバイス３００１は、支持体３０１１がプローブ固定化領域３１１１を備える以外は図２５と同様である。プローブ固定化領域３１１１は、特に限定するものではないが、例えば、チャンバ４２１１（プライマー固定化領域３０２１）に対向する位置に支持体３０１１に配置される。プローブ固定化領域３１１１は、ハイブリダイズ信号を検出する電極が設けられる領域である。

なお、支持体３０１１が特にインターカレータを利用する電流検出方式センサである場合、増幅反応時の加熱に伴うセンサ保護膜からの溶出物によって増幅阻害が起きる。しかしながら、第１３の実施形態に係る核酸検出デバイス３００１は、増幅・検出領域（チャンバ４２１１）以外の溝部３１２１を細く（幅を狭く）した構成なので、プローブ固定化領域３１１１に設けられるセンサとの接液面積を減少させることができるため、増幅阻害物の溶出を効果的に抑制することができる。

実施例３−２
上述した第１３の実施形態に係る核酸検出用デバイス３００１での核酸検出は、例えば以下のように実施される。検査の対象となる核酸を含む反応液を、ピペット等の器具にて核酸検出用デバイス３００１に形成される溝部３１２１１に導入する。反応液が導入されると、鋳型核酸が存在する場合、対応した遊離拡散したプライマーセット３０３１により鋳型核酸が増幅され、増幅産物が生じる。

図３０（ａ）は、実施例３−２に係る核酸検出用デバイス３００１の１例の平面図である。図３０（ｂ）は、図２０（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス３００１の断面図である。図３０（ｃ）は、実施例３−２に係る核酸増幅反応の結果を示すグラフである。図３０（ｃ）は、図３０（ａ）、（ｂ）に示す核酸検出用デバイス３００１の領域Ａ、Ｂ及びＤ（各チャンバ４２１１）において増幅反応が生じ、かつ増幅産物が対応するプローブ核酸の配列に相補的な目的配列を含む場合に得られる結果を示す。図３０（Ｃ）に示すように、領域Ａ、Ｂ、Ｄについて得られる電流値は、ＮＣのものよりも大きい。一方で、領域Ｃ、Ｅについて得られる検出信号は、ＮＣと同程度である。このことから、鋳型溶液中の鋳型を確実に検出できたことが明らかとなった。なお、検出信号は、特に隣接した領域Ａ、Ｂにおいても得られている。したがって、第１３の実施形態に係る核酸検出用デバイス３００１は、隣接領域同士での干渉はなく、独立して核酸の増幅反応から検出まで行うことができた。以上のように、実施例３−２によれば、第１３の実施形態に係る核酸検出用デバイス３００１を用いて、複数種類の標的核酸を、同時にかつ独立して増幅反応を行い、検出まで行うことができることが示された。

上述の本実施形態によれば、核酸検出用デバイスの増幅領域におけるプライマーセットの保持の困難性、プライマーセットの流出、プライマーセット及び増幅産物の動きによる増幅反応の阻害、保護膜からの溶出物による増幅反応の阻害のうち少なくとも１つの課題を解決することができる。したがって、複数種類の標的核酸を複数種類のプライマーセットを用いて同時に独立して増幅反応させる核酸検出用デバイス及びこれを用いた核酸検出装置は、効率的な増幅反応及び検出を同時にかつ独立して実現することが可能となる。

なお、第１２の実施形態に係るチャンバ４２１１の形状と第１３の実施形態に係るチャンバ４２１１の形状を組み合わせることも可能である。

５．保護フィルムの使用
更なる実施形態として、マルチ核酸増幅反応具は、核酸の増幅から検出までを同一デバイス内で行うための核酸検出用デバイスとして提供されてもよい。

また、マルチ核酸増幅反応具は、核酸増幅反応の阻害を低減させる核酸検出用デバイスとして提供されてもよい。

核酸検出を行うデバイスの１つとして、ＤＮＡチップが挙げられる。ＤＮＡチップとは、基板上に複数の核酸プローブが固定化されているデバイスであり、一度に多数の核酸配列を検出できることを特徴とする。

核酸プローブの固定化領域には様々な形態があるが、電極などのセンサ上に核酸プローブを固定化し、当該センサからの検出信号を配線によって引き出し、外部から検出する方法がある。

このような形態の場合、センサ部分や外部との接触部分以外の領域は保護膜（パシベーション膜）と呼ばれる膜によって覆われている。これは半導体技術を応用したものであり、保護膜は、得られる検出信号を配線部分等からのノイズや、汚染等から保護する。

一方、１つのデバイス内において、複数の試薬が関わる複数の反応を順次行うことのできるμ−ＴＡＳと呼ばれるデバイスが盛んに研究開発されている。このようなデバイスは、試薬保持領域、反応領域、センサ領域などから成り、それらをつなぐ流路を備える。これを応用し、核酸を検出するための検出装置も開発されている。核酸検出を行う場合、複数の試薬を使用し、複数の反応を行う必要がある。複数の反応は、核酸抽出反応、核酸精製反応、核酸増幅反応、核酸ハイブリダイゼーション反応、ハイブリダイゼーションの有無検出などである。これらの反応のうち、核酸増幅反応はＰＣＲ法やＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などがあるが、いずれも増幅温度や試薬の組成に大きな影響を受けるだけでなく、不純物が混入した場合、増幅阻害が起こりやすいという特徴を持つため、反応容器の材質や清浄性が非常に重要となる。

上記ＤＮＡチップのような核酸検出デバイスは様々な構成のものがあるが、前述のように複数の反応を別々な反応容器で行う場合、試薬や検査時間のロスが大きい。そこで、核酸増幅反応と核酸ハイブリダイゼーション反応を同一反応容器内で行うことができる核酸検出デバイスが開発されている。

しかしながら、核酸増幅反応は不純物の混入により増幅阻害が発生する。核酸検出用デバイスの保護膜からの溶出成分が核酸増幅を強く阻害し、感度の低下を招いていることが明らかとなっている。そのため、核酸検出用デバイスは、保護膜からの不純物の溶出量を低減させ、感度を向上させることが求められている。

実施形態によれば、マルチ核酸増幅反応具が核酸検出デバイスとして提供されるとき、核酸検出デバイスは、核酸検出デバイスは、基板と、センサ部と、配線と、保護部とを備える。前記センサ部は、前記基板上に形成された核酸検出用である。前記配線は、前記基板上に形成され、前記センサと接続されている。前記保護膜は、前記基板上に形成されている。前記核酸検出デバイスは、前記センサ部と核酸サンプルが反応するためのチャンバ内で核酸増幅反応を行った後に、前記センサ部によって核酸増幅産物の検出を行う。前記保護膜は、前記基板上における前記核酸サンプルの接液領域において、前記基板の一部を含む下層部を露出させる１以上の開口を備える。

＜第１４の実施形態＞
図３１は、第１４の実施形態に係る核酸検出用デバイス（ＤＮＡチップ）５１００の１例となる作成手順を示す図である。核酸検出用デバイス５１００は、図３１の（ａ）〜（ｅ）の順で各構成要素を積層することで構成される。図３２は、第１４の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００の１例となる概略構成を示す積層方向の断面図である。図３３は、第１４の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００の１例となる概略構成を示す図である。

核酸検出用デバイス５１００は、基板５０１０、センサ部５０１１、パッド５０１２、配線５０１３、保護膜５０１４を備える。基板５０１０は、図３２（ａ）に示すように、薄い板状部材である。基板５０１０は、ガラス、シリコン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリイミド、ＡＢＳ、金属などで構成されるが、特に限定されない。

センサ部５０１１は、図３２（ｂ）に示すように、基板５０１０の表面上に形成されている。センサ部５０１１は、導電性部材で構成された電極である。センサ部５０１１は、基板５０１０の一端側に複数設けられている。センサ部５０１１は、標的となる核酸を検出するための各種核酸プローブがそれぞれ固定化され、標的となる核酸を検出する。なお、１つのセンサ部５０１１は、１以上のセンサで構成されている。

パッド部５０１２は、図３２（ｃ）に示すように、基板５０１０の表面上に形成されている。パッド部５０１２は、導電性部材で構成されている。パッド部５０１２は、基板５０１０の他端側に複数設けられている。パッド部５０１２は、後述する配線５０１３を介してセンサ部５０１１の検出信号を検出装置（図示せず）に伝達するためのものである。

配線５０１３は、図３２（ｄ）に示すように、基板５０１０の表面上に形成されている。配線５０１３は、導電性部材で構成されている。配線５０１３は、センサ部５０１１とパッド部５０１２とを接続する。配線５０１３はスルーホールなどを利用した多層構造により立体配線となっている場合もある。配線５０１３は、各センサ部５０１１による検出信号を取り出し、パッド部５０１２に送るためのものである。保護膜５０１４は、図３２（ｅ）に示すように、基板５０１０の表面上に形成されている。

保護膜５０１４は、有機系材料で構成された保護膜である。保護膜５０１４は、例えば、疎水性が高い材料で構成されている。一般的に保護膜は、有機系の保護膜と無機系の保護膜に分類される。無機系の保護膜は、不純物の溶出が少ないことが知られているが、高コストである。そのため、第１４の実施形態で使用されている保護膜５０１４は、有機系の保護膜である。基板５０１０の表面上における保護膜５０１４の形状については、後述する。保護膜５０１４は、配線５０１３等からの検出信号へのノイズの混入や他配線への信号のリークを防ぎ、核酸検出用デバイス５１００の汚染等からも保護するために用いられる。上述の手順により、核酸検出用デバイス５１００は、図３２に示すように、各構成要素を積層されて構成される。第１４の実施形態に係る核酸検出デバイス５１００は、センサ部５０１１と核酸サンプルが反応するための後述する流路型反応部（チャンバ）５２０１内で核酸増幅反応を行った後に、センサ部５０１１によって核酸増幅産物の検出を行うために用いられる。なお、第１４の実施形態では、核酸検出用デバイス５１００の積層方向における保護膜５０１４側の最外面を核酸検出用デバイス５１００の表面というものとする。

上述のように構成された核酸検出用デバイス５１００の表面は、図３１に示すように、主として、センサ領域５０２０、配線領域５０２１、パッド領域５０２２、反応領域５０２３に大別できる。
センサ領域５０２０は、センサ部５０１１が形成されている領域である。配線領域５０２１は、配線５０１３が形成されている領域である。パッド領域５０２２は、パッド部５０１２が形成されている領域である。反応領域５０２３は、核酸増幅反応、核酸ハイブリダイゼーション反応などが行なわれる領域である。

ここで、反応領域５０２３について説明する。核酸検出用デバイス５１００は、図３２（ｂ）に示すように、核酸増幅反応、核酸ハイブリダイゼーション反応などに用いられる際、保護膜５０１４上に後述する反応部規定用部材５２００が対向するように配置される。センサ部５０１１及びセンサ部５０１１近傍は、反応部規定用部材５２００に設けられた後述する流路型反応部５２０１と対向する。第１４の実施形態では、反応領域５０２３とは、核酸検出用デバイス５１００の表面において、流路型反応部５２０１と対向する領域をいう。したがって、反応領域５０２３は、センサ領域５０２０を包含している。また、反応領域５０２３は、センサ部５０１１近傍の配線５０１３を含んでいる。なお、反応領域５０２３は、基板５０１０上における核酸増幅反応を行うための反応溶液（核酸サンプル）が接液する接液領域でもある。核酸検出用デバイス５１００の表面における反応領域５０２３は、流路型反応部５２０１の形状によって規定されている。

次に、核酸検出用デバイス５１００の表面における保護膜５０１４の形状について説明する。保護膜５０１４は、図３２に示すように、配線領域５０２１では、配線５０１３が露出しないように配線５０１３を覆う。保護膜５０１４は、図３２に示すように、パッド領域５０２２では、各パッド部５０１２が検出装置（図示せず）と接触するように、各パッド部５０１２の少なくとも一部が露出するように、基板５０１０上に設けられている。つまり、保護膜５０１４は、反応領域５０２３以外の領域では、各パッド部５０１２の少なくとも一部分を除いて、核酸検出用デバイス５１００の表面を覆う。

次に、反応領域５０２３における保護膜５０１４の形状について説明する。図３４は、第１４の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００の表面における反応領域５０２３近傍の拡大図である。保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、配線５０１３が露出しないように配線５０１３を覆う。一方、保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、センサ部５０１１には設けられていない。保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、少なくとも配線５０１３以外の部分では基板５０１０またはセンサ部５０１１を露出させる１以上の開口を備える。保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、必要最低限の部分以外には設けられていない。なお、保護膜５０１４は、基板５０１０上であっても、配線５０１３と基板５０１０との境界部分近傍に設けられていてもよい。

上述のように、第１４の実施形態に係る保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、基板５０１０の一部を含む下層部（基板５０１０またはセンサ部５０１１）を露出させる１以上の開口を備える。なお、保護膜５０１４は、１以上の開口を備える１枚の膜で核酸検出用デバイス５１００の表面を覆うように構成されていてもよい。また、保護膜５０１４は、複数枚の膜で核酸検出用デバイス５１００の表面を覆うように構成され、複数枚の膜の組み合わせによって形成された１以上の開口を備える構成であってもよい。上述のような反応領域５０２３における保護膜５０１４の構成は、反応領域５０２３内で増幅反応が行われた際に、保護膜５０１４から溶出する不純物に起因する増幅阻害の影響を大幅に低減することができる。通常、核酸の検出は、核酸抽出反応、核酸精製反応、核酸増幅反応、核酸ハイブリダイゼーション反応、ハイブリダイゼーションの有無検出などから成るが、第１４の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００は、核酸ハイブリダイゼーション反応だけでなく核酸増幅反応も、同一反応領域５０２３内で行うことが可能である。なお、反応領域５０２３であっても保護膜５０１４が配線５０１３を覆うのは、上述のように、配線５０１３が保護膜５０１４で覆われていないと、配線５０１３からノイズが混入するためである。

図３５は、第１４の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００を用いて、核酸増幅反応から核酸検出までを同一反応容器内で行うことができる核酸検出用デバイス内蔵カセット（送液カセット）１の一例となる概略構成を示す図である。なお、図３５では、図の簡略化のため、基板５０１０に形成された配線５０１３及び保護膜５０１４の図示は省略している。図３６は、反応部規定用部材（反応容器）５２００が対向配置された核酸検出用デバイス５１００を反応部規定用部材５２００側から見た図である。なお、図３６は、各センサ部５０１１が２つのセンサで構成されている例を示している。

核酸検出用デバイス内蔵カセット５００１は、図３５に示すように、上述した核酸検出用デバイス５１００、反応部規定用部材５２００、第１のカセット５３００、第２のカセット５４００を備える。
反応部規定用部材５２００は、図３６に示すように、流路型反応部５２０１を備える。流路型反応部５２０１は、核酸検出用デバイス５１００の表面と接する面に設けられた溝（流路）である。流路型反応部５２０１は、核酸増幅反応から核酸検出までを同一反応容器内で行なうための各種溶液がサンプル注入口５２０１ａから注入され、サンプル出口５２０１ｂから排出される。流路型反応部５２０１は、蛇行した流路形状で設けられているが、これに限定されない。流路型反応部５２０１は、直線状で設けられていても、円形状で設けられていても、角型状で設けられていてもよい。反応部規定用部材５２００は、平板型であってもチューブ型であってもよい。

なお、核酸増幅用プライマーは、核酸サンプルと混合した後に流路型反応部５２０１に注入させてもよいし、流路型反応部５２０１のいずれかの部位に予め保持させておいてもよい。後者の場合、増幅対象毎に用意された複数のプライマセットは、流路型反応部５２０１のそれぞれ別な場所に保持させておいてもよいし、全て一箇所に保持させておいてもよい。流路型反応部５２０１における複数のプライマセットの保持方法は限定されない。例えば、複数のプライマセットは、熱や真空乾燥などの手法で乾燥保持させてもよいし、液体の状態で保持させてもよい。また、複数のプライマセットは、凍結させて保持させてもよい。また、複数のプライマセットは、メンブレンなどの保持用担体に保持させてもよい。

なお、流路型反応部５２０１は、反応部規定用部材５０２０に形成されることで規定されているが、特に限定されない。流路型反応部５２０１は、基板５０１０をエッチングするなどして形成されてもよい。

第１のカセット５３００、第２のカセット５４００は、核酸検出用デバイス５１００、反応部規定用部材５２００を挟持する外枠である。第１のカセット５３００、第２のカセット５４００は、例えば硬質材料で構成される。なお、核酸検出用デバイス内蔵カセット５００１は、それぞれ別個の構成要素である核酸検出用デバイス５１００、反応部規定用部材５２００を第１のカセット５３００、第２のカセット５４００で挟み込むカセット構造であるが、特に限定されない。反応部規定用部材５２００は、第２のカセット５４００と一体で構成されていてもよい。核酸検出用デバイス内蔵カセット５００１は、反応部規定用部材５２００、第１のカセット５３００、第２のカセット５４００が一体で構成された容器型であって、これに核酸検出用デバイス５１００を差し込むように構成されていてもよい。

次に、比較例として、第１４の実施形態と異なり、反応領域において、センサ部以外の部分（配線のみならず基板も含む）が有機系の保護膜で覆われた核酸検出用デバイスについて説明する。核酸ハイブリダイゼーション反応は、センサ部が形成されている反応領域内で行われる。そのため、通常、反応領域では、センサ部以外の部分は、保護膜で覆われている。しかしながら、保護膜は、僅かに溶出物（不純物）があることが一般的に知られている。通常、不純物は、核酸ハイブリダイゼーション反応には影響を与えることはない。しかし、核酸増幅反応は、非常に繊細な反応であり、不純物が含まれると容易に増幅阻害が起こってしまう。したがって、核酸増幅反応を核酸ハイブリダイゼーション反応と同一の反応領域で行う場合、反応領域に存在する保護膜からの溶出物のため、上述の増幅阻害が発生してしまうという問題が発生する。

第１４の実施形態によれば、反応領域５０２３において保護膜５０１４の占める面積を低減させることで、保護膜５０１４からの不純物の溶出量を大きく低減でき、核酸増幅反応の阻害を低減できる。その結果、核酸検出デバイス５１００の感度は向上する。

＜第１５の実施形態＞
２第１５の実施形態について図面を参照し、詳細に説明する。なお、第１４の実施形態で説明した構成と同一の構成については、同符号を付して説明を省略する。図３７は、第１５の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００における反応領域５０２３近傍の拡大図である。第１５の実施形態は、反応領域５０２３における保護膜５０１４の形状が第１の実施形態と異なる。

保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、第１４の実施形態と同様に、配線５０１３が露出しないように配線５０１３を覆う。さらに、保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、センサ部５０１１の外周部分（センサ部５０１１と基板５０１０との境界部分）が露出しないようにセンサ部５０１１の外周部分を覆う。言い換えると、保護膜５０１４は、センサ部５０１１の略中央部分が露出するような開口を備える。つまり、保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、少なくとも配線５０１３及びセンサ部５０１１の外周部分以外の部分では、基板５０１０またはセンサ部５０１１を露出させる１以上の開口を備える。なお、保護膜５０１４は、基板５０１０上であっても、配線５０１３と基板５０１０との境界部分近傍に設けられていてもよい。

上述のように、第１５の実施形態に係る保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、基板５０１０の一部を含む下層部（基板５０１０またはセンサ部５０１１）を露出させる１以上の開口を備える。

保護膜５０１４をセンサ部５０１１の外周部分に設けるのは、次のような理由による。センサ部５０１１からの検出信号は、センサ部５０１１の露出面積（保護膜５０１４で覆われていない接液面積）に比例する。そのため、各センサ部５０１１の露出面積は、一定であることが望ましい。各センサ部５０１１の略中央部分と対向する部分に開口が設けられた保護膜５０１４を基板５０１０上に設けることで、各センサ部５０１１の面積は、厳密に一定に規定できる。

第１５の実施形態によれば、第１４の実施形態と同様の効果を得られる。さらに、第１５の実施形態によれば、各センサ部５０１１の露出面積（各センサ部５０１１が複数個のセンサで構成されている場合は、複数個のセンサの露出した面積の合算）が一定に規定されるため、核酸検出デバイス５１００の感度がより向上する。

＜第１６の実施形態＞
第１６の実施形態について図面を参照し、詳細に説明する。なお、第１４の実施形態で説明した構成と同一の構成については、同符号を付して説明を省略する。図３８は、第１６の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００における反応領域５０２３近傍の拡大図である。第１６の実施形態は、反応領域５０２３における保護膜５０１４の形状が第１４の実施形態と異なる。

保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、配線５０１３が露出しないように、配線５０１３を覆う。また、保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、各センサ部５０１１間の境界領域で基板５０１０上を覆う区切り形状を備える。ここで、各センサ部５０１１間の境界領域とは、反応領域５０２３における各センサ部５０１１間の略中央部分である。各センサ部５０１１間の境界領域に設けられた保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、センサ部５０１１近傍に設けられた開口（露出する基板５０１０）と、隣接する別のセンサ部５０１１近傍に設けられた開口（露出する基板５０１０）とを区切る（分断する）ように、基板５０１０上を覆う。なお、各センサ部５０１１間の境界領域で基板５０１０上を覆う保護膜５０１０の形状は、特に限定されない。一方、保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、センサ部５０１１には設けられていない。つまり、保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、少なくとも配線５０１３及び各センサ部５０１１間の境界理領域以外の部分では、基板５０１０またはセンサ部５０１１を露出させる１以上の開口を備える。なお、保護膜５０１４は、基板５０１０上であっても、配線５０１３と基板５０１０との境界部分近傍に設けられていてもよい。なお、保護膜５０１４は、第１５の実施形態と同様に、センサ部５０１１の外周部分を覆うように設けられていてもよい。
上述のように、第１６の実施形態に係る保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、基板５０１０の一部を含む下層部（基板５０１０またはセンサ部５０１１）を露出させる１以上の開口を備える。

各センサ部５０１１間の境界領域に保護膜５０１４を設けるのは、次のような理由による。各センサ部５０１１上には、標的となる核酸を検出するための各種核酸プローブがそれぞれ固定化される。製造時には、各核酸プローブを含む液体は、各センサ部５０１１上に滴下される。しかしながら、基板５０１０の親水性が高い場合、各センサ部５０１１間の境界領域に保護膜５０１４が設けられていないと、あるセンサ部５０１１に滴下された核酸プローブ溶液は、隣接するセンサ部５０１１に滴下された別の核酸プローブ溶液と接して混合する。一般的に有機系の保護膜は、親水性が低い。そのため、各センサ部５０１１間の境界領域に設けられた保護膜５０１４は、あるセンサ部５０１１に滴下された核酸プローブ溶液が隣接するセンサ部５０１１に滴下された別の核酸プローブ溶液と接することを防ぐことができる。

第１６の実施形態によれば、第１４の実施形態または第１５の実施形態と同様の効果を得られる。さらに、第１６の実施形態によれば、核酸検出用デバイス５１００の製造時における各センサ部５０１４に対する核酸プローブの固定を正確かつ容易にすることができる。

＜第１７の実施形態＞
第１７の実施形態について図面を参照し、詳細に説明する。なお、第１４の実施形態で説明した構成と同一の構成については、同符号を付して説明を省略する。図３９は、第１７の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００における反応領域５０２３近傍の拡大図である。第１７の実施形態は、各センサ部５０１１間の境界領域における保護膜５０１４の形状が第１６の実施形態と異なる。

保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、配線５０１３が露出しないように配線５０１３を覆う。一方、保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、センサ部５０１１には設けられていない。また、保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、第１６の実施形態と同様に、各センサ部５０１１間の境界領域で基板５０１０上を覆う区切り形状を備える。境界領域に設けられた保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、センサ部５０１１近傍に設けられた開口（露出する基板５０１０）と、隣接する別のセンサ部５０１１近傍に設けられた開口（露出する基板５０１０）とを区切る（分断する）ように、基板５０１０上を覆う。

保護膜５０１４は、各センサ部５０１１間の境界領域において、センサ部５０１１の周囲を取り囲む形状で設けられている。一例として、保護膜５０１４は、センサ部５０１１近傍において、隣接する少なくとも一方のセンサ部５０１１側に対して、凸状の弧形状を備える開口を備える。したがって、センサ部５０１１近傍は基板５０１０が露出しているが、さらにその周囲は、保護膜５０１４で覆われている。

つまり、保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、少なくとも配線５０１３及び境界理領域以外の部分では、基板５０１０またはセンサ部５０１１を露出させる１以上の開口を備える。なお、保護膜５０１４は、基板５０１０上であっても、配線５０１３と基板５０１０との境界部分近傍に設けられていてもよい。なお、保護膜５０１４は、第１５の実施形態と同様に、センサ部５０１１の外周部分を覆うように設けられていてもよい。
上述のように、第１７の実施形態に係る保護膜５０１４は、反応領域５０２３において、基板５０１０の一部を含む下層部（基板５０１０またはセンサ部５０１１）を露出させる１以上の開口を備える。

保護膜５０１４が各センサ部５０１１間の境界領域において、センサ部５０１１の周囲を取り囲む形状で設けられているのは、センサ部５０１１に滴下された核酸プローブを含む液体が必要以上に広がることを防ぐためである。

第１７の実施形態によれば、第１４の実施形態または第１５の実施形態と同様の効果を得られる。さらに、第１７の実施形態によれば、核酸検出用デバイス５１００の製造時における各センサ部に対する核酸プローブの固定を正確かつ容易にすることができる。

＜実施例４＞
実施例４−１
実施例４−１では、上記説明した第１６の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００を実際に用いた核酸増幅反応について説明する。図４１は、第１６の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００を用いた核酸増幅反応の結果と、比較例の核酸検出用デバイスを用いた核酸増幅反応の結果を比較して示す。なお、比較例の核酸検出用デバイスは、反応領域において、センサ１１以外の部分（配線のみならず基板も含む）が有機系の保護膜で覆われた構成である。図４１は、横軸に増幅時間、縦軸に増幅核酸量を示している。実施例４−１では、第１６の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００と比較例の核酸検出用デバイスのそれぞれの反応領域に増幅反応試薬を注入し、注入後４０分、６０分の増幅を行った時点での増幅核酸量を定量した。比較例の核酸検出用デバイスでは、４０分では増幅量が低く、６０分でもまだ十分ではない。これに対して、第１６の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００では、４０分の時点で十分量の増幅が得られている。この時点で増幅が飽和しているため、６０分での増幅核酸量は増加していない。

図４０に示す結果から、第１６の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００の構成は、増幅阻害が大幅に低減されていることが明らかとなった。なお、第１４、１５、１７の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００についても第１６の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００と同様の構成を備えるため、上記同様の特性が得られる。

実施例４−２
実施例４−２では、上記説明した第１６の実施形態に係る核酸検出用デバイス内蔵カセット５００１を実際に用いた核酸検出の使用例を具体的に説明する。図４１は、第１６の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００における反応領域５０２３近傍の拡大図である。なお、実施例４−２では図４１に示す通り、センサ部５０１１は２個１組のセンサで構成される。核酸検出用デバイス５１００は、センサ部５０１１毎（２個１組のセンサ毎）に異なる核酸を検出する。反応領域５０２３内の保護膜５０１４は、第１６の実施形態で説明したように、配線５０１３を覆う部分と、各センサ部５０１１間の境界領域にのみ形成されている。反応領域５０２３内のその他の部分は、基板５０１０（実施例４−２ではガラスを使用）が露出している。

（１）核酸検出用デバイス内蔵カセット５００１の準備
１−１．核酸検出用デバイス５１００の準備
核酸検出用デバイス５１００上の各電極（以降、各センサ部５０１１を構成するセンサに対応する）に、以下の表２０に示す５種類の核酸プローブ（配列Ａ〜Ｅ）を固定化した。各核酸プローブを含む溶液を各電極組に滴下し、その後余分な核酸プローブを洗浄除去することによって固定化を行った。なお、下記１、２番電極組、３、４番電極組、５、６番電極組、７、８番電極組、９、１０番電極組は、それぞれ別のセンサ部５０１１を構成している。

１）ネガティブコントロール用・・・１、２番電極
２）遺伝子-Ａ検出用・・・３、４番電極
３）遺伝子-Ｂ検出用・・・５、６番電極
４）遺伝子-Ｃ検出用・・・７、８番電極
５）遺伝子-Ｄ検出用・・・９、１０番電極。

１−２．核酸検出用デバイス内蔵カセット５００１の組立て
前記核酸検出用デバイス５１００のセンサ部５０１１上に、反応領域５０２３を形成できる反応部規定用部材５２００を取り付けた。反応部規定用部材５２００にはサンプル注入口が形成されており、反応液が漏れ出さないよう核酸検出用デバイス５１００に固定されている。反応部規定用部材５２００内には、予め以下の表２１に示すようなプライマセットを乾燥された状態で保持させた。増幅用プライマーは、ＬＡＭＰ法による増幅用に設計されたものである。

（２）核酸の検出
２−１．鋳型溶液の準備
以下の表２２に示すように遺伝子Ａ、Ｂ、Ｄの３種類の鋳型と、増幅用試薬を混合した鋳型溶液を準備した。

鋳型溶液には、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、リアクションミックスが含まれ、後述の鋳型溶液と合わせ総量が５０μＬとなるように蒸留水（即ち、ＤＷ）が添加されたものを使用した。プライマーＤＮＡ（セットＡ）によってＬＡＭＰ法による増幅反応が生じて、且つプローブＤＮＡ（Ａ）とハイブリダイズして検出される鋳型Ａと、プライマーＤＮＡ（セットＢ）によってＬＡＭＰ法による増幅反応が生じて、且つプローブＤＮＡ（Ｂ）とハイブリダイズして検出される鋳型Ｂと、プライマーＤＮＡ（セットＤ）によってＬＡＭＰ法による増幅反応が生じて、且つプローブＤＮＡ（Ｄ）とハイブリダイズして検出される鋳型Ｄと、を含む。

鋳型Ａ、Ｂ、Ｄは、以下の表２３に示す塩基配列を有する合成オリゴＤＮＡである。

２−２．鋳型溶液の添加
２−１にて準備した鋳型溶液を、反応領域に５０μＬ添加した。

２−３．核酸の反応
以下に示す条件にて、反応領域を加熱或いは冷却し、各種反応を行った。

核酸増幅反応：６４℃、６０分
ハイブリダイゼーション反応：５０℃、１０分
洗浄反応：３０℃、５分
電流検出用試薬（ヘキスト３３２５８）反応：２５℃、３分
２−４．核酸の検出
各プローブ核酸固定化作用極に電位を掃引し、プローブＤＮＡとＬＡＭＰ産物により形成された二本鎖に特異的に結合したヘキスト３３２５８分子の酸化電流を計測した。上記一連の反応は、SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. １, No. ３, pp. ２６６-２７０, ２００８に記載のＤＮＡ自動検査装置にて実施した。

（３）結果
図４２は、各電極から得られた結果を示すグラフである。鋳型を添加した遺伝子Ａ、Ｂ、Ｄに対応するプローブＡ、Ｂ、Ｄを固定化した電極３、４、５、６、９、１０において、ネガティブコントロールよりも大きな電流値が得られた。一方、鋳型が添加されていない遺伝子Ｃに対応するプローブＣを固定化した電極７、８は、ネガティブコントロールと同程度の電流値となった。図４２に示す結果から、第１６の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００を用いることで、鋳型を添加した遺伝子を確実に検出できたことが明らかとなった。

実施例４−３
実施例４−３では、上記説明した第１７の実施形態に係る核酸検出用デバイス内蔵カセット５００１を実際に用いた核酸検出の使用例を具体的に説明する。図４３は、第１７の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００における反応領域５０２３近傍の拡大図である。なお、実施例３では図４３に示す通り、センサ部５０１１は２個１組のセンサで構成される。核酸検出用デバイス５１００は、センサ部５０１１毎（２個１組のセンサ毎）に異なる核酸を検出する。反応領域５０２３内の保護膜５０１４は、第１７の実施形態で説明したように、配線５０１３を覆う部分と、各センサ部５０１１間の境界領域と、各センサ部５０１１を構成する２個のセンサの外周部分にのみ形成されている。反応領域５０２３内のその他の部分は、基板５０１０（実施例４−１ではガラスを使用）が露出している。なお、核酸検出用デバイス５１００を除く、検出に用いた材料および検出条件は、実施例４−１と同様である。なお、下記１、２番電極組、３、４番電極組、５、６番電極組、７、８番電極組、９、１０番電極組は、それぞれ別のセンサ部５０１１を構成している。

結果
図４４は、各電極から得られた結果を示すグラフである。鋳型を添加した遺伝子Ａ、Ｂ、Ｄに対応するプローブＡ、Ｂ、Ｄを固定化した電極３、４、５、６、９、１０において、ネガティブコントロールよりも大きな電流値が得られた。一方、鋳型が添加されていない遺伝子Ｃに対応するプローブCを固定化した電極７、８は、ネガティブコントロールと同程度の電流値となった。図４４に示す結果から、第１７の実施形態に係る核酸検出用デバイス５１００を用いることで、鋳型を添加した遺伝子を確実に検出できたことが明らかとなった。

６．核酸反応の阻害の防止
更なる態様において、マルチ核酸増幅反応具は、核酸反応を阻害しない核酸反応具として提供されてもよい。

上述の通り、複数の対象遺伝子を検出する技術は非常に重要である。しかしながら、そのような状況において開発されている核酸増幅装置および/または核酸検出装置の中には、核酸反応を阻害するものがあることが明らかになってきている。プライマーと標的核酸との反応、およびプローブ核酸と標的核酸との反応は、核酸同士間で生じる核酸反応である。反応場においては、本来生じるべき反応が阻害されることなく行われる必要がある。

本実施形態を利用することにより、マルチ核酸増幅反応具は、核酸反応を阻害しない核酸反応具として提供されてもよい。例えば、そのような核酸反応具は、核酸増幅用反応具、核酸検出用反応具、核酸増幅検出用反応具であってよい。詳しくは、アレイ型プローブチップ、アレイ型プライマーチップおよびアレイ型プライマープローブチップであってもよい。

そのような核酸反応具は、反応場を構成する部材の表面に保護膜が形成される。ここで「反応場」とは、そこにおいて核酸反応が行われる場をいう。

保護膜は、ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホン、並びにガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素および金属酸化物からなる群より選択される少なくとも１により構成される。

好ましい保護膜の例は、ノボラック樹脂、エポキシ樹脂、ポリオレフィン樹脂およびシリコン樹脂であり、またこれらを含む樹脂組成物であってもよい。また、ノボラック樹脂を使用する場合には、感光材を含まないことが好ましい。

保護膜は、核酸反応具の反応場を構成する部材の反応場に接するように形成されればよい。保護膜の形成は、保護膜材料の種類に応じてそれ自身公知の技術を利用して行えばよい。或いは保護膜は、反応場において、反応を阻害する可能性のある部材から問題となる物質が遊離することを防止するために適用されればよい。その場合、反応場に接触する部材の少なくとも一部分が保護膜で覆われればよい。

「プライマーセット」とは、１つの標的核酸を増幅するために必要なプライマーの集合体である。例えば、ＰＣＲ増幅用のプライマーセットの場合、１つのプライマーセットは、１つの標的核酸を増幅するための１種類のフォワードプライマーと１種類のリバースプライマーとを含めばよい。また例えば、ＬＡＭＰ増幅用のプライマーセットの場合、１つのプライマーセットは、少なくとも１つの標的核酸を増幅するためのＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーを含めばよく、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＰプライマー、即ち、ＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーを含んでもよい。１つの反応具において増幅反応が行われる場合、そこにおいて行われる増幅は、一般的に１つの特定の増幅である。従って、ＬＡＭＰ増幅反応用の反応具の場合、１つの反応具に含まれる複数種類のプライマーセットとは、互いに異なる塩基配列からなる標的配列を増幅するための互いに異なるプライマーセットであってもよい。或いは、１つの反応具に含まれる複数種類のプライマーセットとは、特定の標的配列を増幅するための互いに異なるプライマーの組合せを有するプライマーセットであってもよい。

以下に、核酸反応具の例を記載する。個々に示される例は、核酸反応具としてのアレイ型プローブチップ、アレイ型プライマーチップおよびアレイ型プライマープローブチップを記載する。

＜第１８の実施形態＞
アレイ型プローブチップ
アレイ型プローブチップ６００１の実施態様の模式図を図４５に示した。アレイ型プローブチップ６００１は、基体６０１１に電極６０１２を備える。電極６０１２の電気的情報を取り出すための信号取り出し部６０１３が各電極６０１２に対応する位置に配置される。電極６０１２と信号取り出し部６０１３はリード６０１４により接続される。プローブ核酸６０１５は、電極６０１２の表面に固定化される。電極６０１２表面を除く基体６０１１の表面およびリード６０１４の表面が保護膜６０１３により覆われている。

保護膜６０１３の形成は、所望の部位に対して塗布により行われてもよく、或いはパターニング、マスキングおよびエッチングなどの技術を利用して全体に保護膜を形成した後に所望の部位に所望の大きさおよび形状の保護膜を形成してもよい。少なくともリード６０１４を覆って、リード６０１４と反応液との接触を防止してもよい。或いは、少なくとも反応液と接触する領域に保護膜を形成してもよい。

基体６０１１は、例えば、ガラス、サファイア、セラミック、樹脂、ゴム、エラストマー、ＳｉＯ_２、ＳｉＮまたはＡｌ_２Ｏ_３などから製造することができるが、これに限定されない。好ましくは、自身電気的および化学的に不活性なそれ自身公知の何れかの材質により構成される。

電極６０１２の製造は、公知の手段によって行えばよい。電極は、特に限定されるものではないが、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウムおよびタングステン等の金属単体およびそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボンのような炭素、およびこれらの酸化物又は化合物で製造することができる。

プローブ核酸６０１５の電極６０１２への固定化は、化学的結合により行われてもよく、プローブ核酸液のスポッティングと乾燥により行われてもよい。

プローブ核酸６０１５と試料核酸（図示せず）とのハイブリダイズにより生じるハイブリダイズ信号は、電極６０１２により伝達され、信号取り出し部６０１３から取り出される。

図４５に示したアレイ型プローブチップ基体は、１０個の電極６０１２を備えるが、これに限定されず、１つの基体に配置される電極の数は任意に変更できる。また電極の配置パターンも図に示したものに限定されず、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。基体６０１１には、必要に応じて、参照電極および対極を設けてもよい。

基体６０２２は、チューブ、ウェル、チャンバー、流路、カップおよびディッシュ並びにそれらを複数個備えたプレート、例えば、マルチウェルプレート、板状、球状、棒状およびそれらの一部分からなる形状であってよいもよい。

基体６０２２が、容器形状を有する形状、例えば、チューブ、ウェル、チャンバー、流路、カップおよびディッシュ並びにそれらを複数個備えたプレート、例えば、マルチウェルプレートの場合、容器内部に反応液が収納されて反応場が形成されてよい。更に、アレイ型プローブチップには蓋体が具備されてもよい。蓋体は、容器形状または板形状の基体６０２２の少なくともプローブ核酸６０１５が固定化された領域を覆うように構成されればよい。蓋体は、板状であってよい。板状の蓋体の一部に溝などの凹部が形成されていてもよい。蓋体の凹部と基体６０２２との間の空間に反応場が形成されてよい。

基体６０２２が、板状、球状、棒状およびそれらの一部分からなる形状である場合、それらが反応液を含む更なる容器内部に浸漬されることにより反応場が形成されてもよく、基体６０２２に配置されたプローブ核酸が固定化された領域に反応液を載せることにより反応場が形成されてもよい。

＜第１９の実施形態＞
アレイ型プライマーチップ
アレイ型プライマーチップの１例を図４６（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を参照しながら説明する。

図４６（ａ）は、アレイ型プライマーチップの１例の斜視図である。図４６（ａ）に記載のアレイ型プライマーチップ６０２１は、その内壁に保護膜６０２０が形成されている容器６０２２を具備する。保護膜６０２０が形成された基体６０２２の内側底面６０２３には、互いに独立した複数の固定化領域６０２４が配置される。図４６（ｂ）は固定化領域６０２４の部分を拡大した模式図である。そこに示されるように、１つの固定化領域６０２４には１つの種類のプライマーセット６０２５が固定される。複数の固定化領域６０２４のそれぞれには、１組毎に複数のプライマーセット６０２５がそれぞれ固定される。

プライマーセット６０２５は、増幅しようとする標的核酸の種類に応じて複数種類が用意される。１つの固定化領域６０２４には、特定の１つの標的核酸を増幅するための１つのプライマーセット６０２５が固定される。例えば、ＰＣＲ増幅のためには、１つのプライマーセットには、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なフォワードプライマーとリバースプライマーとが含まれる。また、ＬＡＭＰ増幅のためには、１つのプライマーセットは、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、およびＬＰプライマーが含まれる。

プライマーセット６０２５は、反応場を提供するための液相と接触して遊離するように遊離可能な状態で固定化領域６０２４に固定される。プライマーセット６０２５の固定化領域６０２４への固定化は、例えば、１組のプライマーセットを含む溶液を１つの固定化領域６０２４に滴下し、その後乾燥させることにより達成することが可能である。更に、同様に、他の固定化領域６０２４について、それぞれ所望のプライマーセット６０２５を含む溶液を滴下および乾燥し、所望する数の複数のプライマーセットを基体６０２２に固定すればよい。これにより、基体６０２２の１つの面に独立して配置される全ての固定化領域６０２４にプライマーセット６０２５が固定される。しかしながら、プライマーセット６０２５の固定化領域６０２４への固定化は、反応場を提供するための液相と接触して遊離可能な状態で固定されればよい。従って、そのような固定化が可能なそれ自身公知の何れの固定化法が使用されてもよい。プライマーセットを含む溶液を滴下する方法の場合、プライマーセットを含む溶液は、例えば、水、緩衝液または有機溶剤などであってよい。

基体６０２２に配置される複数の固定化領域６０２４は、互いに独立して配置されればよい。独立して配置されるとは、反応場においてプライマーセット毎に開始および／または進行される増幅を妨げることのない間隔で配置されることである。例えば、隣り合う固定化領域６０２４は、互いに接して配置されてもよく、僅かな距離を隔てて互いに近傍に配置されてもよく、或いは、通常使用される所謂ＤＮＡチップなどの検出装置において固定化されるプライマーセットと同様な距離を隔てて互いに配置されてもよい。

例えば、隣り合う固定化領域６０２４の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。

反応場を提供するための液相は、固定されたプライマーセットが遊離された後に、それらを用いて増幅反応を進行できる液相であればよく、例えば、所望の増幅に必要な反応液であってよい。

図４６（ａ）および（ｂ）に示した核酸反応具は、基体６０２２が容器形状の例である。容器形状の基体６０２２は、例えば、チューブ、ウェル、チャンバー、流路、カップおよびディッシュ並びにそれらを複数個備えたプレート、例えば、マルチウェルプレートなどであってよい。また基体の材質は、どのような材質であってもよい。基体６０２２は、上述したアレイ型プローブチップと同様の基体材料を使用してよい。また、基体６０２２は板形状であってもよい。更に、アレイ型プライマーチップには蓋体が具備されてもよい。蓋体は、容器形状または板形状の基体６０２２の少なくともプライマー６０２５が固定化された領域を覆うように構成されればよい。蓋体は、板状であってよい。板状の蓋体の一部に溝などの凹部が形成されていてもよい。蓋体の凹部と基体６０２２との間の空間に反応場が形成されてよい。

核酸反応具はまた、図４６（ｃ）に示すような板状の基体６０２２の少なくとも１つの面６０２３に配置されたプライマー固定化領域６０２４にプライマーセット６０２５が固定されてもよい。この場合、反応場は、少なくとも基体６０２２のプライマーセット６０２５が固定化された領域に対して、反応液を載せることにより形成されればよい。この場合、基体６０２２の面６０２３に凹部および/または凸部が形成されてもよく、或いはこれらの凹部および/または凸部により流路が形成されてもよい。プライマー固定化領域６０２４およびプライマーセット６０２５は、基体６０２２の凹部内に配置されてもよく、複数の凸部に囲まれた領域に配置されてもよい。また、基体６０２２が、反応容器を含む容器内に配置されることにより反応場が形成されてもよい。この場合、基体６０２２は、板状、球状、棒状およびそれらの一部分からなる形状であってよい。

保護膜の形成は、それ自身公知の何れの技術を利用してもよい。

図４６（ａ）および（ｂ）では、固定化領域６０２４が基体６０２２の内側底面のみに配置された例を示したが、これに限定するものではない。基体６０２２の内側の少なくとも一部分に配置されればよく、内側底面および内側側面、蓋体により形成される天井面のいずれか、または全てに配置されてもよい。

図４７には、上記のアレイ型プライマーチップ６０３１を用いた核酸増幅反応の様子を示す図である。図４７（ａ）は反応前のアレイ型プライマーチップ６０３１である。内面に保護膜が形成された基体６０３２の内側底面に配置された複数の固定化領域６０３３に複数のプライマーセット６０３４がそれぞれ固定されている。アレイ型プライマーチップ６０３１に反応液６０３６を添加し、それを収容した状態を図４７（ｂ）に示す。

反応液６０３６は、所望の増幅反応に必要な成分を含めばよい。これらに限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なでオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含んでもよい。

図４７（ｂ）に示すように、反応液６０３６を添加された後のアレイ型プライマーチップ６０３１では、図４７（ｃ）に模式的に示すように、保護膜が形成された内側底面に固定されたプライマーセットが遊離し徐々に拡散する。遊離および拡散した領域を模式的に領域６０３５で表す。遊離し、拡散していくプライマーセットは、その近傍に存在する鋳型核酸、ポリメラーゼおよび基質などの増幅に必要な他の成分と出会い、増幅反応が開始される。種類毎に独立して複数固定化されたプライマーセットは、その種類毎に独立して鋳型核酸について増幅反応を開始および進行することが可能である。それにより、複数種類のプライマーセットを用いた複数の鋳型配列についての増幅が、独立に、且つ同時に達成される。ここにおいて、「反応場」は、理論上、そこにおいて増幅反応の進行が可能な反応液６０３６により規定される領域、即ち、反応液が存在する領域という。また、反応場のうち、実際にそこにおいて増幅反応が開始され進行する領域を「反応領域」という。仮に実際に増幅反応が領域６０３５内のみで進行する場合には、領域６０３５が反応領域と解される。

上記の例では、プライマーセットのみが基体に固定化された例を示した。しかしながら、これに限定されるものではなく、プライマーセットが種類毎に各固定化領域に固定される条件において、増幅に必要な他の成分、例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素、基質、基質および／または緩衝剤などをプライマーと共に基体に固定してもよい。その場合、固定しようとする物質をプライマーと一緒に所望の液体媒体に含ませて、上述の方法と同様に滴下および乾燥などにより固定すればよい。そのようなアレイ型プライマーチップにおいて、増幅反応を行う場合には、固定された成分に応じてそこに添加される反応液の組成が選択されればよい。

＜第２０の実施形態＞
アレイ型プライマープローブチップ
更なる実施形態の例を図４８に示す。この実施形態は、上記の基体と、基体の少なくとも１面に固定化されたプローブ核酸と、遊離可能に固定化されたプライマーとを含む。この実施形態は、アレイ型プライマープローブチップと称してもよい。アレイ型プライマープローブチップは、プローブ核酸とプライマーとを１つの基体に備える核酸反応具である。基体についての構成は、上述したアレイ型プローブチップおよびアレイ型プライマーチップと同様であってよい。

図４８（ａ）は、アレイ型プライマープローブチップの１例の斜視図である。図４８（ａ）に記載のアレイ型プライマープローブチップ６０４１は、容器形状の基体６０４２を具備する。基体６０４２の内壁には保護膜６０４３が形成されている。基体６０４２の内側底面６０４４の保護膜６０４３上には、互いに独立した複数のプライマー固定化領域６０４５が配置される。複数のプライマー固定化領域６０４５に近接して、またそれぞれのプライマー固定化領域に対応して複数のプローブ固定化領域６０４６が配置される。

図４８（ｂ）はプライマー固定化領域６０４５を拡大した模式図である。そこに示されるように、１つのプライマー固定化領域６０４５には１つの種類のプライマーセット６０４７が固定される。複数のプライマー固定化領域６０４５のそれぞれには、セット毎に複数のプライマーセット６０４７がそれぞれ固定される。

プライマーセット６０４７は上述したアレイ型プライマーチップと同様に固定されればよい。

図４８（ｃ）は、プライマー固定化領域６０４５に近接して配置されたプローブ固定化領域６０４６の拡大図である。プローブ固定化領域６０４６には、検出されるべき所望の配列の相補配列を含むプローブ核酸６０４８が複数で固定化される。

検出されるべき所望の配列は、プローブ核酸の相補配列であってよい。プローブ固定化領域６０４６は、プローブ核酸６０４８とその目的配列とのハイブリダイズ信号が、複数のプローブ固定化領域６０４６間で独立して検出されるように配置される。

プローブ核酸６０４８のプローブ固定化領域６０４６への固定は、それ自身公知の所謂ＤＮＡチップにおいて基板表面に対してプローブ核酸を固定する一般的な何れの技術を利用してもよい。プローブ核酸６０４８の固定化の後にプライマーセット６０４７が固定されてもよく、プライマーセット６０４７を固定した後にプローブ核酸６０４８が固定化されてもよい。また、プライマーセット６０４７の固定とプローブ核酸６０４８の固定化を同時に行ってもよい。

例えば、隣り合うプローブ固定化領域６０４６の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。

また例えば、プローブ固定化領域６０４６とプライマー固定化領域６０４５の間の距離は、０μｍ〜０．１μｍ、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。

例えば、プローブ固定化領域６０４６とプライマー固定化領域６０４５の間の距離が０μｍである場合には、プローブ固定化領域６０４６とプライマー固定化領域６０４５は、基体表面の同じ位置にあると解されてよい。また、プローブ固定化領域６０４６がプライマー固定化領域６０４５に含まれてもよく、プライマー固定化領域６０４５がプローブ固定化領域６０４６に含まれてもよい。

図４９に、このアレイ型プライマープローブチップ６０４１を用いて行われた核酸増幅反応後の反応場の様子を示す模式図である。図４９（ａ−１）および（ｂ−１）は、反応前のアレイ型プライマープローブチップ６０４１である。基体６０４２の内壁には保護膜６０４３が形成されている。基体６０４２の内側底面６０４４の保護膜６０４３上に配置された複数のプライマー固定化領域６０４５に複数のプライマーセット６０４７がそれぞれ固定されている。それぞれのプライマー固定化領域６０４５に対応して、それぞれの近傍にプローブ固定化領域６０４６が配置される。プローブ固定化領域６０４６には、複数のプローブ核酸６０４８が種類毎に固定化されている。

アレイ型プライマープローブチップ６０４１に反応液６０５０を添加し、それを収容した状態を図４９（ａ−２）および（ｂ−２）に示す。

反応液６０５０は、所望の増幅反応に必要な成分を含めばよい。これらに限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なでオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含んでよい。

反応場への試料の添加は、アレイ型プライマープローブチップ６０４１に反応液６０５０を添加する以前に反応液６０５０に予め添加することにより行ってもよく、反応液６０５０をアレイ型プライマープローブチップ６０４１に添加した後に行ってもよく、アレイ型プライマープローブチップ６０４１に反応液６０５０を添加する以前に試料をアレイ型プライマープローブチップ６０４１に添加することにより行ってもよい。

図４９（ａ−２）および（ｂ−２）に示すように反応液６０５０を添加された後のアレイ型プライマープローブチップ６０４１では、図４９（ａ−３）および（ｂ−３）に模式的に示すように、底面６０４４の保護膜６０４３上に固定されたプライマーセット６０４７が遊離し徐々に拡散する。遊離および拡散した領域を模式的に領域６０５１で示す。遊離し、拡散していくプライマーは、その近傍に存在する鋳型核酸、ポリメラーゼおよび基質などの増幅に必要な他の成分と出会い、増幅反応が開始される。種類毎に独立して複数固定されたプライマーセットは、その種類毎に独立して鋳型核酸について増幅反応を開始および進行することが可能である。それにより、複数種類のプライマーセットを用いた複数の鋳型配列についての増幅が、独立に、且つ同時に達成される。ここにおいて、「反応場」は、理論上、そこにおいて増幅反応の進行が可能な反応液６０５０により規定される領域、即ち、反応液が存在する領域という。また、反応場のうち、実際にそこにおいて増幅反応が開始され進行する領域を「反応領域」という。仮に実際に増幅反応が領域６０５１内のみで進行する場合には、領域６０５１が反応領域と解される。図４９（ａ−３）の図は、全てのプライマー固定化領域６０４５に固定されたプライマーセットにより増幅反応が生じた場合の模式図である。図４９（ｂ−３）は、固定されたプライマーセットにより、底部６０４４の保護膜６０４３上に形成された全てのプライマー固定化領域６０４５のうちの一部分、図４９（ｂ−３）では３つの領域のみにおいて増幅が生じた場合の模式図である。

プローブ固定化領域６０４６は、領域６０５１において増幅された増幅産物中に目的配列を含む核酸が存在した場合、その核酸とハイブリダイズする。プローブ固定化領域６０４６に固定されたプローブ核酸６０４８は、対応するプライマー固定化領域６０４５における増幅産物とのみハイブリダイズするように固定される。即ち、１つのプローブ固定化領域６０４６に固定されたプローブ核酸６０４８は、対応するプライマー固定化領域６０４５における増幅産物とのみハイブリダイズするように距離を維持してそれぞれのプローブ固定化領域６０４６およびプライマー固定化領域６０４５が配置される。

プローブ核酸６０４８とその目的配列とのハイブリダイズの検出は、それ自身公知のハイブリダイズ信号の検出手段により行われてよい。例えば、予めプライマーに蛍光物質を付与してもよく、オキシヌクレオシド三リン酸などの基質に蛍光物質を付与してもよい。それらの蛍光物質からの蛍光強度を指標にハイブリダイズの有無および量が決定されてもよい。或いは、電気化学的手段によりハイブリダイズ信号が検出されてもよい。

ハイブリダイズの検出は、アレイ型プライマープローブチップ６０４１内部の洗浄後に実行されてもよく、洗浄を行わずに実行されてもよい。電気化学的手段により検出する場合には、インタカレータを用いてハイブリダイズ信号を検出してもよい。この場合、例えば、予め反応液６０５０にインタカレータを含ませておいてもよく、ハイブリダイズ反応が開始する前、ハイブリダイズ反応中、ハイブリダイズ反応後に添加してもよい。これらの場合、何れもアレイ型プライマープローブチップ６０４１内部の洗浄後に検出を行ってもよく、洗浄を行わずに検出を実行してもよい。ハイブリダイズ反応の開始、反応中、反応後の判定は、プライマー、プローブ核酸および鋳型核酸の配列、反応温度などの反応条件に応じて行ってもよく、予備実験により決定してもよい。

当該プライマーの長さは、これに制限されるものではないが、約５塩基以上、約６塩基以上、約７塩基以上、約８塩基以上、約９塩基以上、約１０塩基以上、約１５塩基以上、約２０塩基以上、約２５塩基以上、約３０塩基以上、約３５塩基以上、約４０塩基以上、約４５塩基以上または約５５塩基以上であってよく、約８０塩基以下、約７５塩基以下、約７０塩基以下、約６５塩基以下、約６０塩基以下、約５５塩基以下、約５０塩基以下、約４５塩基以下、約４０塩基以下、約３５塩基以下、約３０塩基以下、約２５塩基以下、約２０塩基以下、約２５塩基以下または約２０塩基以下であってもよく、これらの下限上限の何れかを組み合わせた範囲であってもよい。例えば、好ましい塩基長の例は、約１０塩基〜約６０塩基、約１３〜４０塩基、約１０〜３０塩基などであってよい。また、１つの固定化領域に同時に固定されるプライマーの長さは、全てのプライマーで同じであってもよく、全てのプライマーで異なっていてもよく、一部のプライマーが同じ長さであってもよく、一部のプライマーが異なる長さであってもよい。また、プライマーセット毎に異なってもよい。また、１つの固定化領域に固定されるプライマーセットが、種類毎に異なる長さであってもよく、１つの固定化領域に固定されるプライマーセットが全て同じ長さであってもよい。

１つのプライマー固定化領域に固定されるプライマーセットの種類は、１種類の標的核酸を増幅するための１種類であってもよく、２種類以上の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類であってもよい。

１つのプローブ固定化領域に固定されるプローブ核酸群の種類は、１種類の目的配列とハイブリダイズするための１種類であってもよく、２種類以上の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類であってもよい。また、目的配列の部分が共通であり、更に他の目的配列とは異なる配列を含むプローブ核酸であってもよい。

１つのアレイ型プライマープローブチップに配置されるプライマー固定化領域の数の下限は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、５０以上、７５以上、１００以上、１２５以上、１５０以上、１７５以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、１０００以上、１５００以上、２０００以上であってよく、上限は、１００００以下、５０００以下、２５００以下、２０００以下、１５００以下、１０００以下、５００以下、２５０以下、２００以下、１５０以下であってよく、これらの上限下限の何れかを組み合わせた範囲であってもよい。

１つのアレイ型プライマープローブチップに配置されるプライマー固定化領域とプローブ固定化領域の数は同じであっても異なっていてもよい。即ち、全てのプライマー固定化領域に対応するように同数のプローブ固定化領域が配置されてもよく、プライマー固定化領域の数がプローブ固定化領域の数よりも多くてもよく、プライマー固定化領域の数がプローブ固定化領域の数よりも少なくてもよい。また、増幅反応状態を確認するため、またはハイブリダイズ反応の状態を確認するためのポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールを含ませてもよい。このようなポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールは、プライマーセットおよび／またはプローブ核酸についてそれぞれ設けてもよい。

上記の例では、プライマーセットのみが基体に固定化された例を示した。しかしながら、これに限定されるものではなく、プライマーセットが種類毎に各固定化領域に固定される条件において、増幅に必要な他の成分、例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素、基質、基質および／または緩衝剤などをプライマーと共に基体に固定してもよい。その場合、固定しようとする物質をプライマーと一緒に所望の液体媒体に含ませて、上述の方法と同様に滴下および乾燥などにより固定すればよい。そのようなアレイ型プライマープローブチップにおいて、増幅反応を行う場合には、固定された成分に応じてそこに添加される反応液の組成が選択されればよい。

＜第２１の実施形態＞
第２１の実施形態のアレイ型プライマープローブチップを図５０〜図５３を参照しながら説明する。

（１）チップ素材
まず、電気化学的検出によりハイブリダイズ信号を検出するアレイ型プライマープローブチップのチップ素材の構成および製造方法の１例について図５０（ａ）および（ｂ）を用いて説明する。図５０（ａ）は、チップ素材の平面図であり、図５０（ｂ）は、図５０（ａ）のチップ素材の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。

チップ素材１１１は、矩形状の基板１１２上にその長手方向に沿って配置された例えば４つの電極１１３ａ〜１１３ｄを備えている。各電極１１３ａ〜１１３ｄは、第１の金属薄膜パターン１１４および第２の金属薄膜パターン１１５をこの順序で積層した構造を有する。また、各電極１１３ａ〜１１３ｄは大矩形部１１６と小矩形部１１７を細線１１７で連結した形状を有する。絶縁性の保護膜６１１８は、各電極１１３ａ〜１１３ｄを含む基板１１２上に被覆されている。円形窓１１９は、大矩形部１１６に対応する絶縁性の保護膜６１１８部分に開口されている。矩形窓１２０は、小矩形部１１７に対応する絶縁性の保護膜６１１８部分に開口されている。電極１１３ａの円形窓１１９から露出する大矩形部１１６は第１の作用極１２１ａとして機能する。電極１１３ｂの円形窓１１９から露出する大矩形部１１６は第２の作用極１２１ｂとして機能する。電極１１３ｃの円形窓１１９から露出する大矩形部は対極１２２として機能する。電極１１３ｄの円形窓１１９から露出する大矩形部は参照極１２３として機能する。また、電極１１３ａ〜１１３ｄの矩形窓１２０から露出する小矩形部１１７はプローバー接触部として機能する。

このようなチップ素材は、次のような方法により作製することができる。

次いで、電極１１３ａ〜１１３ｄを含む基板１１２上に、保護膜６１１８を例えば、スパッタリング法またはＣＶＤ法により堆積する。続いて、各電極１１３ａ〜１１３ｄの大矩形部１１６に対応する保護膜６１１８部分および小矩形部１１７に対応する保護膜６１１８部分を、レジストパターンをマスクとして選択的にエッチングして、大矩形部１１６に対応する絶縁性の保護膜６１１８部分に円形窓１１９を、および小矩形部１１７に対応する絶縁性の保護膜６１１８部分に矩形窓１２０を開口する。それにより前述したチップ素材１１１を作製する。

絶縁性の保護膜６１１８は、ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホン、並びにガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素および金属酸化物からなる群より選択されればよい。例えば、シリコン酸化膜のような金属酸化膜、シリコン窒化膜のような金属窒化膜であってもよい。

絶縁性の保護膜６１１８をパターニングするときのエッチングの例は、エッチングガスを用いるプラズマエッチングまたは反応性イオンエッチングを含む。

（２）アレイ型プライマープローブチップ
次に、上記（１）において製造されたチップ素材１１１にプライマーセットとプローブ核酸を固定したアレイ型プライマープローブチップの構成および製造方法の１例を図５１（ａ）および図５１（ｂ）を参照しながら説明する。図５１（ａ）はアレイ型プライマープローブチップの平面図であり、図５１（ｂ）は図５１（ａ）のアレイ型プライマープローブチップの線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。

次いで、第１の作用極１２１ａの近傍に第１のプライマー固定化領域２０３ａを、第２の作用極１２１ｂの近傍に第２のプライマー固定化領域２０３ｂを配置する。この第１のプライマー固定化領域２０３ａ上に第１のプライマーセット２０４ａを、第２のプライマー固定化領域２０３ｂ上に第２のプライマーセット２０４ｂを固定する。それによりアレイ型プライマープローブチップを作製する。

第１および第２のプライマーセット２０４ａおよび２０４ｂをそれぞれ第１および第２のプライマー固定化領域２０３ａおよび２０３ｂへの固定は例えば、水、緩衝液または有機溶剤のような液体にプライマーセットを含ませて滴下して、その後例えば、室温などの適切な温度条件下で乾燥するまでの時間例えば、室温の場合では１０分間放置することにより行う。

（３）使用時のアレイ型プライマープローブチップ
上記（２）において作製されたアレイ型プライマープローブチップの使用方法について図５２および図５３を参照しながら説明する。

図５２（ａ）は、使用時のアレイ型プライマープローブチップの平面図であり、図５２（ｂ）は、図５２（ａ）のアレイ型プライマープローブチップの線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。

本実施形態のアレイ型プライマープローブチップ９１を使用する場合、電極１１３ａ〜１１３ｄにそれぞれ形成された第１の作用極１２１ａ、第２の作用極１２１ｂ、対極１２２および参照極１２３、並びに第１のプライマー固定化領域２０３ａおよび第２のプライマー固定化領域２０３ｂが同じ１つの反応場に含まれるように反応液が維持される。そのために、例えば、シリコンゴムのようなシリコン樹脂および／またはフッ素樹脂などのような樹脂を例えば、押出成形、射出成形または型押成形および／または接着剤による接着などのそれ自身公知の何れかの樹脂成形法により成形された被覆体３０１が、アレイ型プライマープローブチップ９１の使用前にアレイ型プライマープローブチップ９１上に装着される。被覆体３０１が装着された後に、鋳型核酸３０３を含む反応液３０２がアレイ型プライマープローブチップ９１と被覆体３０１とにより形成される空間に添加される。

被覆体３０１が装着されたアレイ型プライマープローブチップ９１において、電極１１３ａ〜１１３ｄのそれぞれの矩形窓１２０から露出する小矩形部１１７は露出している。

被覆体３０１をアレイ型プライマープローブチップ９１に装着する例は、例えば、圧着、接着剤による接着などが含まれる。

次いで、反応液３０２は被覆体３０１がアレイ型プライマープローブチップ９１に装着された後に添加される。

アレイ型プライマープローブチップ９１と被覆体３０１とにより形成される空間に液体を添加する方法は、例えば、被覆体３０１の一部に開口部を予め設けておき、その開口部から添加してもよく、また先端の鋭利な例えば、針のような先端を有した注入器を用いて被覆体３０１の一部に差し込んで添加してもよい。

反応液３０２は、試料と、増幅試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なでオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤および例えば、ヘキスト３３２５８のような２本鎖核酸を認識して信号を生ずるインタカレータを含む。検査されるべき試料中に特定のプライマー固定化領域に固定されたプライマーセットにより増幅されるべき標的配列を含む鋳型核酸が存在した場合、そのプライマー固定化領域とそれに対応するプローブ固定化領域を含む反応場において増幅産物が形成される。その様子を模式的に図５３に示す。

図５３（ａ）は、反応場３０２において増幅産物が形成された状態を模式的に示す。図５３（ａ）は、使用時のアレイ型プライマープローブチップの平面図であり、図５３（ｂ）は、図５３（ａ）のアレイ型プライマープローブチップの線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。上述のように図５２において添加された試料中には、第２のプライマーセット２０４ｂが結合できる配列を含む核酸が含まれていたために、図５３（ａ）および図５３（ｂ）に示すように、反応場３０２に第２のプライマーセットは遊離および拡散し、鋳型核酸と出会った後に増幅反応が行われ、それにより増幅産物が形成される。第２のプライマーセット２０４ｂによる増幅産物は、第２のプライマー固定化領域２０３ｂの周辺に拡散し、第２のプローブ固定化領域２０１ｂに到達する。到達した増幅産物が、目的配列を含む場合、第２のプローブ核酸２０２ｂと増幅産物がハイブリダイズして２本鎖核酸を形成する。この２本鎖核酸に対して、反応液３０２に含まれるインタカレータが結合してハイブリダイズ信号を生じる。

＜第２２の実施形態＞
検出方法
アレイ型プローブチップおよびアレイ型プライマープローブチップを用いて核酸の検出を行う場合、次のように行ってよい。

（ａ）電流検出方式
電気化学的に２本鎖核酸を検出する方法を説明する。この方法では、２本鎖核酸を特異的に認識する２本鎖認識体を用いる。２本鎖認識体の例には、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーターなどが含まれるが、これらに限定されない。更に、これらの物質を電気化学的に活性な金属錯体、例えばフェロセン、ビオロゲンなどで修飾することも可能である。

２本鎖認識体の濃度はその種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲で使用する。この際には、イオン強度０．００１〜５の範囲でｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。

ハイブリダイゼーション反応中又は反応後、反応溶液中に２本鎖認識体を添加する。ハイブリダイズによって２本鎖核酸が生じている場合は、２本鎖認識体がこれに結合する。そこで、例えば２本鎖認識体が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加して、２本鎖認識体に由来する反応電流値を測定することができる。この際、電位は定速で印加するか、あるいは、パルスで印加するかあるいな定電位を印加してもよい。測定の際に、例えばポテンショスタット、デジタルマルチメーター、およびファンクションジェネレーターなどの装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。例えば特開平１０−１４６１８３号公報に記載された公知の電気化学的検出手段が好適に用いられる。

（ｂ）蛍光検出法
蛍光によって２本鎖核酸を検出する方法を説明する。プライマーセットに含まれる少なくとも１つのプライマーについて、予め蛍光学的に活性な物質で標識しておく。または、蛍光学的に活性な物質で標識した２次プローブ核酸を用いて検出する。或いは、複数の標識を使用してもよい。蛍光学的に活性な物質は、これらに限定されないが、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、もしくはローダミンなどの蛍光色素を含む。蛍光物質は、例えば蛍光検出器を用いて検出される。標識の種類に応じた適宜の検出装置を用い、標識された検出配列又は２次プローブ核酸を検出する。

＜実施例５＞
例５−１
核酸反応に対する保護膜の影響を検討するために、プライマーを固定化せずに流路を反応場として有する増幅用チップにおいて増幅反応を行った。その後、アレイ型プローブチップにより検出を行った。

（１）チップ素材の作製
ウェハサイズのパイレックスガラスを板状の基体（即ち、基板）として使用した。表面にスピンコーターで保護膜材料を塗布した。保護膜材料としてネガ型レジスト（エポキシ）、ポジ型レジスト（ノボラック、ポリオレフィン）、感光剤を含まない材料（ノボラック）を使用した。

各材料を塗布した後、基板を乾燥オーブンに入れ１５０℃にてプレベークを実施し、膜を乾燥させた。

続いて、ネガ型フォトレジスト材料の場合は、密着型露光機にて４００ｍJにて露光を行った後、現像処理を行った。ポジ型レジスト材料の場合は、露光処理は行わずに現像処理のみ行った。フォトレジスト以外の材料については、露光、現像処理は行わなかった。

乾燥オーブンで１６０℃にてポストベークを行い、膜を完全に硬化させた。硬化後、Ｃｈｅｍｉｃａｌｄｒｙｅｔｃｈｉｎｇ（ＣＤＥ）処理２分行いチップ素材を形成した。

（２）増幅用チップ
予め流路を形成したシリコンゴムを前記チップ素材に取り付けた。これを増幅用チップとした。

（３）ＬＡＭＰ反応液の作製とＬＡＭＰ反応
使用したプライマーの塩基配列を表２４に示す。

ＬＡＭＰ反応液の組成を表２５に示す。

ＬＡＭＰ反応液に使用するＲｅａｃｔｉｏｎＭｉｘｔｕｒｅの組成を表２６に示す。

ＬＡＭＰ反応液に含まれる鋳型の塩基配列を表２７に示す。

増幅用チップの流路に、ＬＡＭＰ反応液を５０ｕＬ注入し、ペルチェ温度を６３℃に設定したジェネライザー内にセットし、１時間ＬＡＭＰ反応を行った。

<ＬＡＭＰ増幅産物検出用ＤＮＡチップの作製>
（４）アレイ型プローブチップ
アレイ型プライマープローブチップ用のチップ素材の概略図を図５０に示した。パイレックスガラス表面にチタンおよび金の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、エッチング処理により、チタンおよび金の電極をガラス表面上に形成した。更にその上に絶縁膜を塗付して、エッチング処理により絶縁膜に円形窓および矩形窓を開口して作用極、対極、参照極およびプローバー接触部を露出させた。これをアレイ型プライマープローブチップ用のチップ素材とした。

（５）アレイ型プローブチップの作製
表２８に示すプローブ核酸（３’末端ＳＨ標識合成オリゴ）を合成した。

プローブＤＮＡを３μＭずつ含むプローブＤＮＡ溶液を調製して、この溶液１００ｎＬを作用極上にスポットした。４０℃にて乾燥し、超純水により洗浄後、作用極表面に残った超純水を除去し、チップ素材の作用極にプローブＤＮＡを固定した。

ＤＮＡチップおよびＤＮＡチップ測定装置についての詳細は、以下の文献（SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. １, No. ３, pp. ２６６-２７０, ２００８）を参照されたい。

<ＬＡＭＰ増幅産物の検出>
各保護膜の増幅反応に対する影響を試験するために、増幅用チップにおいて増幅されたＬＡＭＰ増幅産物をアレイ型プローブチップにより検出した。

その結果を表２９に示す。

表２９に示すように、ノボラック樹脂(ナフトキノン系感光剤含有)を保護膜として使用した場合は、ハイブリダイズ信号は陰性であった。ノボラック樹脂、エポキシ樹脂、ポリオレフィン樹脂およびシリコン樹脂を保護膜として使用した場合には、ハイブリダイズ信号は陽性であった。

従って、ノボラック樹脂(ナフトキノン系感光剤含有)は、増幅反応などの核酸反応に影響を及ぼすことが明らかになった。一方で、ノボラック樹脂、エポキシ樹脂、ポリオレフィン樹脂およびシリコン樹脂は、増幅反応などの核酸反応に影響を及ぼす可能性は低いことが明らかになった。

ノボラック樹脂(ナフトキノン系感光剤含有)は、ポジ型レジストとして一般的に核酸反応を行うことを目的としたデバイスの製造において使用される１例である。そのような材料が、今回の試験において核酸反応に影響を及ぼすことが明らかになった。核酸反応を行うためのデバイスにおいては、核酸反応に影響を及ぼす材料を使用することは避ける必要がある。

上記の結果から、ノボラック樹脂、エポキシ樹脂、ポリオレフィン樹脂およびシリコン樹脂は、核酸反応を行うことを目的としたデバイスにおいて使用することが好ましい材料であることが示された。

＜例５−２＞
以下に、プライマー固定化領域に固定されたプライマーセットと、プライマー固定化領域の近傍のプローブ固定化領域に固定されたプローブ核酸としてのプローブＤＮＡとを含む電気化学的検出用のアレイ型プライマープローブチップを作製して使用した例を記載する。プローブ固定化領域は電極からなり、ハイブリダイズの存在に依存して生じる電流応答を検出するためのセンサーとして使用した。

（１）チップ素材の作製
アレイ型プライマープローブチップ用のチップ素材の概略図を図５０に示した。パイレックスガラス表面にチタン及び金の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、エッチング処理により、チタンおよび金の電極をガラス表面上に形成した。更にその上に絶縁膜を塗付して、エッチング処理により絶縁膜に円形窓および矩形窓を開口して作用極、対極、参照極およびプローバー接触部を露出させた。これをアレイ型プライマープローブチップ用のチップ素材とした。

（２）アレイ型プライマープローブチップの作製
まず、プローブＤＮＡを作用極上に固定した。使用したプローブＤＮＡの塩基配列を表３０に示す。

プローブＤＮＡ（Ａ）およびプローブＤＮＡ（Ｂ）をそれぞれ３μＭずつ含むプローブＤＮＡ溶液を調製して、この溶液１００ｎＬを作用極上にスポットした。４０℃にて乾燥し、超純水により洗浄後、作用極表面に残った超純水を除去し、チップ素材の作用極にプローブＤＮＡを固定した。

次に、プライマーセットとして使用するプライマーＤＮＡを用意した。使用するプライマーＤＮＡは、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法による増幅のためのプライマーセットである。使用したプライマーＤＮＡの塩基配列を表３１に示す。

プライマーＤＮＡ（セットＡ）については、２００μＭのＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＰＦをそれぞれ準備し、０．１μＬ、０．１μＬ、０．０１２５μＬ、０．００１２５μＬおよび０．０５μＬをそれぞれに含む０．２７５μＬの溶液を用いて、対応するプローブＤＮＡ（Ａ）の近傍のプライマー固定化領域である作用極に固定した。具体的には、用意したそれぞれ０．２７５μＬのそれらの溶液を、それぞれプローブＤＮＡ（Ａ）が固定された対応する近傍の作用極にスポットし、６３℃で５分間乾燥させた。これにより、アレイ型プライマープローブチップを得た。

（３）ＬＡＭＰ反応液の作製
ＬＡＭＰ反応液の組成を表３２示す。

組成（１）から（４）には、共通して、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、リアクションミックスが含まれ、後述の鋳型溶液と合わせ総量が５０μＬとなるように蒸留水（即ち、ＤＷ）が添加されたものを使用した。組成（１）は、プライマーＤＮＡ（セットＢ）によってＬＡＭＰ法による増幅反応が生じて、且つプローブＤＮＡ（Ｂ）とハイブリダイズして検出される鋳型Ｂを含む。組成（２）は鋳型を含まず、組成（３）はプライマーＤＮＡ（セットＡ）によりＬＡＭＰ法による増幅反応が生じて、且つプローブＤＮＡ（Ａ）とハイブリダイズして検出される鋳型Ａを含む。組成（１）は、鋳型Ａおよび鋳型Ｂを両方含むものを使用した。鋳型ＡおよびＢは、表３３に示す塩基配列を有する合成オリゴＤＮＡである。

（４）アレイ型プライマープローブチップ上でのＬＡＭＰ増幅反応及び、プローブＤＮＡよる目的核酸の検出
図５２に概略を示すように、プローブ固定化領域としての電極およびプライマーＤＮＡ固定化領域を含むように、反応容器を形成するための被覆体として成形されたシリコンゴムをアレイ型プライマープローブチップ上に装着し、予めシリコンゴムに設けられた穴から反応容器内にＬＡＭＰ反応溶液を注入後、蓋をした。これを６３℃に設定したプレート上に設置し、６０分間ＬＡＭＰ反応を行った。図５３に概略を示すように、特定のプライマーについて、これが結合することが可能であり、且つそれが増幅すべき標的配列を含む鋳型がＬＡＭＰ反応溶液に含まれている場合、そのプライマーが固定された場所で局所的にＬＡＭＰ反応が進み、生じたＬＡＭＰ産物は近傍にあるプローブＤＮＡとハイブリダイズする。

６０分間のＬＡＭＰ反応の後、４５℃で１０分間ハイブリダイゼーション反応を行い、４５℃で１０分間洗浄を行った。その後、洗浄溶液を除去し、７５μＭヘキスト３３２５８溶液を注入した。各プローブ核酸固定化作用極に電位を掃引し、プローブＤＮＡとＬＡＭＰ産物により形成された二本鎖に特異的に結合したヘキスト３３２５８分子の酸化電流を計測した。上記一連の反応は、以下の文献に記載のＤＮＡ自動検査装置にて実施した（SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. １, No. ３, pp. ２６６-２７０, ２００８）。

（５）検出結果
検出結果を表３４に示した。

鋳型Ｂが含まれるＬＡＭＰ反応溶液組成（１）を添加した場合、作用極２の近傍に固定されているプライマーＤＮＡ（セットＢ）によるＬＡＭＰ反応が進み、生じたＬＡＭＰ産物がプローブＤＮＡ（Ｂ）と反応して、その結果、７０ｎＡの電流値が得られた。

一方、作用極２の近傍に固定されているプライマーＤＮＡ（セットＡ）ではＬＡＭＰ反応が進まず、電流値は得られなかった。

これら２つの数値から、ＬＡＭＰ反応溶液には、鋳型Ｂが含まれていたことを判定することが可能であった。

また、鋳型を含まないＬＡＭＰ反応溶液組成（２）を添加した場合、作用極１および２のそれぞれの近傍に固定されているプライマーＤＮＡ（セットＡ）、プライマーＤＮＡ（セットＢ）によるＬＡＭＰ増幅反応は進まず、電流値は得られなかった。

以上の結果から、本実施例に記載したアレイ型プライマープローブチップを用いて、ＬＡＭＰ反応溶液中に含まれる鋳型を検出し、且つその配列を識別することが可能であることが示された。７．全自動処理に適したデバイス更なる実施形態として、前処理工程に続く標的核酸の検出を全自動で処理することに適する核酸検出カセット及び核酸検出装置が提供される。

従来、核酸を検出するシステムとしては、核酸抽出装置、核酸増幅装置、ハイブリタイゼーション装置、核酸検出装置、データ解析装置等の各装置が個別に利用されるシステムが知られている。この様なシステムにおいては、これら装置で実現される以外のサンプルの調整あるいは装置間のサンプルの移動は、人手を必要とされている。

核酸増幅においては、増幅前のサンプルに極わずかでも別の核酸が混入するとその核酸も大量に増幅し、誤検出を引き起こす問題がある。核酸分子は、乾燥状態でも安定であり、様々な物質に吸着し、更には空気中を浮遊することもあることが知られている。従って誤検出を防ぐために、核酸抽出を行う場所には増幅後のサンプルを持ち込まない等の厳重な管理体制を必要としている。

近年は、核酸抽出、増幅からハイブリタイゼーション、検出からデータ解析までの工程を自動で行う全自動核酸検出装置も開発されてきている。しかし現存する全自動核酸検出装置は、前記の検出対象外の核酸分子の混入に対して確実な対策が取られたものではなく、また大型の物が多かったため、研究用途向けのものとなっている。また、密閉構造を採用することにより対策された物も発売されているが、カセット等の部品点数が多く、かつ構造が複雑であるため小型化が困難であり、これら消耗品が高価であるため検出費用が嵩んでしまう。

一般的な全自動核酸検出において密閉構造を採用した場合、核酸サンプルや各薬液を装填するための複数の容器、それぞれの容器に対して流路を形成させ各々バルブを備えて制御を行っており、カセット等の部品点数が多く構造が複雑であるため、カセットが高価となっている。また、核酸検出装置についても、カセットの構造に併せて複雑な制御を必要としているため構造が複雑であり、小型化が難しく高価となる。

更なる実施形態により、核酸増幅から標的核酸の検出までを一貫して自動的に処理することに適する、小型密封型の核酸検出カセット及び核酸検出装置が提供される。

＜第２３の実施形態＞
図５４は、本実施形態に係る核酸検出（核酸抽出）カセット７０２２の一例となる概略構成を示す分解斜視図である。核酸検出カセット７０２２は、主に流路パッキン７００１、上プレート７００２、下プレート７００３、の３部品を備える。図５５は、図５４に示す流路パッキン７００１、上プレート７００２、下プレート７００３を組み合わせた核酸検出カセット７０２２の一例となる概略構成を示す斜視図である。図５５（ａ）は、核酸検出カセット７０２２の表面側から見た斜視図である。なお、本実施形態では、流路パッキン７００１、上プレート７００２、下プレート７００３の積層方向における上プレート７００２の外面を核酸検出カセット７０２２の表面とする。図５５（ｂ）は、核酸検出カセット７０２２の裏面側から見た斜視図である。なお、本実施形態では、流路パッキン７００１、上プレート７００２、下プレート７００３の積層方向における下プレート７００３の外面を核酸検出カセット７０２２の裏面とする。

流路パッキン７００１は、検体シリンジ７００４、洗浄シリンジ７００５、挿入剤シリンジ７００６、流路７００７、核酸検出流路７００８、廃液流路７００９、廃液シリンジ７０１０を備える。流路パッキン７００１は、表面（第１の面）及び表面と逆側の裏面（第２の面）を備える薄型の板状である。流路パッキン７００１は、検体シリンジ７００４、洗浄シリンジ７００５、挿入剤シリンジ７００６、流路７００７、核酸検出流路７００８、廃液流路７００９、廃液シリンジ７０１０が一つの部品として一体構成（一体成型）されている。そのため、流路パッキン７００１は、部品点数を削減できる。流路パッキン７００１は、例えば、シリコーン、エラストマーなどの軟質材料で構成されている。なお、エラストマーは、シリコーンよりも密な材質であるため、液体の蒸発をより防止することができる。

検体シリンジ７００４は、表面に液体の検体（検出対象となる核酸、検体サンプル、核酸サンプルともいう）を装填（注入）するための開口部を備え、裏面に容易に変形可能な薄膜部を備える容器形状である。したがって、検体シリンジ７００４は、薄膜部側への外部からの加圧により、容易に変形させ、潰すことが可能である。一方、検体シリンジ７００４は、例えば潰された状態で液体が装填されることで薄膜部側が膨張する。検体シリンジ７００４は、検体を貯めることができる。

洗浄シリンジ７００５は、表面に洗浄液を装填するための開口部を備え、裏面に容易に変形可能な薄膜部を備える容器形状である。したがって、洗浄シリンジ７００５は、検体シリンジ７００４と同様に、薄膜部側への外部からの加圧により、容易に変形させ、潰すことが可能である。一方、洗浄シリンジ７００５は、例えば潰された状態で液体が装填されることで薄膜部側が膨張する。洗浄シリンジ７００５は、ハイブリタイゼーション後の洗浄を行うための洗浄液を貯めることができる。

挿入剤シリンジ７００６は、洗浄シリンジ７００５は、表面に、電流検出時における酸化還元反応用の液体の挿入剤（核酸検出に用いる薬液）を装填するための開口部を備え、裏面に容易に変形可能な薄膜部を備える容器形状である。したがって、挿入剤シリンジ７００６は、検体シリンジ７００４と同様に、薄膜部側への外部からの加圧により、容易に変形させ、潰すことが可能である。一方、挿入剤シリンジ７００６は、例えば潰された状態で液体が装填されることで薄膜部側が膨張する。挿入剤シリンジ７００６は、挿入剤を貯めることができる。

流路７００７は、検体シリンジ７００４、洗浄シリンジ７００５及び挿入剤シリンジ７００６並びに核酸検出流路７００８を繋ぐ。なお、流路７００７は、独立して分岐した流路７０７１、７０７２、７０７３をさらに備える。流路７００７は、流路７０７１、７０７２、７０７３を介して、検体シリンジ７００４、洗浄シリンジ７００５、挿入剤シリンジ７００６と繋がれる。また、流路７００７は、核酸検出流路７００８とも繋がれている。したがって、流路７００７は、検体シリンジ７００４、洗浄シリンジ７００５、挿入剤シリンジ７００６が貯める液体を核酸検出流路７００８に送る（流し込む）ための流路である。また、検体シリンジ７００４、洗浄シリンジ７００５、挿入剤シリンジ７００６それぞれと流路７００７の接続部には、逆止弁７０１１ａ、７０１１ｂ、７０１１ｃがそれぞれ設けられている。逆止弁７０１１ａ、７０１１ｂ、７０１１ｃそれぞれは、流路７００７から検体シリンジ７００４、洗浄シリンジ７００５、挿入剤シリンジ７００６への液体の流入を防ぐ機能を備える。さらに、逆止弁７０１１ａ、７０１１ｂ、７０１１ｃそれぞれは、検体シリンジ７００４、洗浄シリンジ７００５、挿入剤シリンジ７００６からの送液時以外での各液体のふいな流出を防止する機能も備える。

核酸検出流路７００８は、例えば、流路パッキン７００１の裏面に設けられた溝である。核酸検出流路７００８は、液体の流入側が流路７００７と繋がれ、流出側が廃液流路７００９と繋がれている。核酸検出流路７００８は、核酸抽出、核酸増幅、ハイブリタイゼーション、核酸検出までを処理するための流路（領域）である。

廃液流路７００９は、核酸検出流路７００８と廃液シリンジ７０１０を繋ぐ。廃液流路７００９は、核酸検出流路７００８から流出する液体（廃液）を廃液シリンジ７０１０に送るための流路である。

廃液シリンジ７０１０は、流路パッキン７００１の裏面に容易に変形可能な薄膜部を備える袋状で構成されている。したがって、廃液シリンジ７０１０は、薄膜側へ外部からの加圧により、容易に変形させ、潰すことが可能である。廃液シリンジ７０１０は、通常時（廃液が流入する前）には、薄膜が予め折り畳まれ、潰された（縮んだ）状態で構成されている。廃液シリンジ７０１０は、廃液が流入した場合には、薄膜側が潰された状態から膨張する。したがって、廃液シリンジ７０１０は、核酸検出流路７００８から流出する液体を貯めることができる。

上述した流路パッキン７００１の構成によれば、検体シリンジ７００４、洗浄シリンジ７００５、挿入剤シリンジ７００６は、流路７００７、核酸検出流路７００８、廃液流路７００９を経由して廃液シリンジ７０１０と繋がっている。

上プレート７００２は、注入口７０１２ａ、７０１２ｂ、７０１２ｃ、核酸検出口７０１４、位置決め穴７０１５を備える。上プレート７００２は、プラスチック、ガラス、金属等の硬質材料で構成されている。上プレート７００２は、薄型形状である。上プレート７００２は、上記流路パッキン７００１の表面と相対（対向）し、流路パッキン７００１の表面と密着する。つまり、上プレート７００２は、流路パッキン７００１を密封（密閉）するために用いられる。

注入口７０１２ａ、７０１２ｂ、７０１２ｃそれぞれは、検体シリンジ７００４（その開口部）、洗浄シリンジ７００５（その開口部）、挿入剤シリンジ７００６（その開口部）と相対する位置に設けられている。注入口７０１２ａ、７０１２ｂ、７０１２ｃそれぞれは、核酸検出カセット７０２２の組み立て後に検体シリンジ７００４、洗浄シリンジ７００５、挿入剤シリンジ７００６に液体を装填するための開口である。注入口７０１２ａ、７０１２ｂ、７０１２ｃは、液体が検体シリンジ７００４、洗浄シリンジ７００５、挿入剤シリンジ７００６に装填された後、キャップシール７０１３を用いて封をされる。

核酸検出口７０１４は、核酸検出カセット７０２２の組み立て後において、流路パッキン７００１と相対することなく、下プレート７００３に設けられた基板７０２０ａと相対する位置に設けられている。基板７０２０ａは、後述する核酸検出部７０２０と接続され、核酸検出部７０２０が検出した信号を後述する核酸検出基板７０２４に伝達するために用いられる。核酸検出口７０１４は、核酸検出の際に核酸検出基板７０２４を挿入するための開口である。
位置決め穴７０１５は、後述するように核酸検出カセット７０２２の位置決め（位置合わせ）に用いられる開口である。

下プレート７００３は、検体送液穴７０１６、洗浄送液穴７０１７、挿入剤送液穴７０１８、廃液用窪み７０１９、核酸検出部７０２０、温調穴７０２１を備える。下プレート７００３は、上プレート７００２と同様に、プラスチック、ガラス、金属等の硬質材料で構成されている。下プレート７００３は、上記流路パッキン７００１の裏面と相対し、流路パッキン７００１の裏面と密着する。つまり、下プレート７００３は、薄型形状である。下プレート７００３は、上プレート７００２と共に流路パッキン７００１を密封するために用いられる。

検体送液穴７０１６は、下プレート７００３において、検体シリンジ７００４と相対する位置に設けられている。検体送液穴７０１６は、検体シリンジ７００４に検体が満杯に貯められた場合であっても、下プレート７００３側への検体シリンジ７００４の膨張を妨げないように確保された開口である。したがって、図５５に示すように、核酸検出カセット７０２２の裏面側では、検体シリンジ７００４の底部（薄膜部側）は、検体送液穴７０１６を通して、下プレート７００３内から露出する。

洗浄送液穴７０１７は、下プレート７００３において、洗浄シリンジ７００５と相対する位置に設けられている。洗浄送液穴７０１７は、洗浄シリンジ７００５に検体が満杯に貯められた場合であっても、下プレート７００３側への洗浄シリンジ７００５の膨張を妨げないように確保された開口である。したがって、図５５に示すように、核酸検出カセット７０２２の裏面側では、洗浄シリンジ７００５の底部（薄膜部側）は、洗浄送液穴７０１７を通して、下プレート７００３内から露出している。

挿入剤送液穴７０１８は、下プレート７００３において、挿入剤シリンジ７００６と相対する位置に設けられている。挿入剤送液穴７０１８は、挿入剤シリンジ７００６に検体が満杯に貯められた場合であっても、下プレート７００３側への挿入剤シリンジ７００６の膨張を妨げないように確保された開口である。したがって、図５５に示すように、核酸検出カセット７０２２の裏面側では、挿入剤シリンジ７００６の底部（薄膜側）は、挿入剤送液穴７０１８を通して、下プレート７００３内から露出している。

廃液用窪み７０１９は、流路パッキン７００１の表面と相対する下プレート７００３の面であって、廃液シリンジ７０１０と相対する位置に設けられている。廃液用窪み７０１９は、廃液シリンジ７０１０に廃液が満杯に貯められた場合であっても、下プレート７００３側への廃液シリンジ７０１０の膨張を妨げないように確保された窪み（隙間）である。

核酸検出部７０２０は、流路パッキン７００１の裏面と相対する下プレート７００３の面であって、核酸検出流路７００９と相対する位置に設けられている。核酸検出部７０２０は、標的となる核酸を検出処理する。核酸検出部７０２０は、核酸プローブが固定化されているセンサ領域である。

温調穴７０２１は、核酸検出カセット７０２２の裏面に対応する面であって、核酸検出部７０２０と相対する位置に設けられている。つまり、核酸検出部７０２０は、温調穴７０２１を通して、下プレート７００３内から露出している。温調穴７０２１は、核酸検出時に、核酸検出部７０２０に対して直接的に高精度の加熱冷却を行うための開口である。

上述したように、流路パッキン７００１、上プレート７００２、下プレート７００３の３部品は、上プレート７００２、下プレート７００３により流路パッキン７００１を狭持するような形で組み合わされる。流路パッキン７００１は、上プレート７００２、下プレート７００３により加圧されているため、密閉性が保たれる。つまり、核酸検出カセット７０２２は、流路パッキン７００１の密閉性を確保した密封用器である。核酸検出カセット７０２２は、流路パッキン７００１の密閉性により、核酸が外に漏れだすのを防止できる。なお、上プレート７００２、下プレート７００３の接合は、例えば、接着、溶接、ネジ止等、様々な方法が採用可能であり、限定されない。

図５６は、本実施形態に係る核酸検出カセット７０２２を使用する核酸検出装置７１００の一例となる概略構成を示す斜視図である。なお、本実施形態では、核酸検出カセット７０２２と核酸検出装置７１００を別構成として説明するが、核酸検出装置７１００が核酸検出カセット７０２２を含むものとしてもよい。

核酸検出装置７１００は、カセットスタンド７０２３、核酸検出基板７０２４、位置決めピン７０２５、核酸検出基板前後機構７０２６、加熱冷却装置７０２７、加熱冷却装置前後機構７０２８、検体送液ロッド７０２９、洗浄送液ロッド７０３０、挿入剤送液ロッド７０３１、ロッド前後機構（移動機構）７０３２、バネ７０３３ａ、７０３３ｂ、７０３３ｃを備える。

カセットスタンド７０２３は、核酸検出装置７１００の中央近傍に設けられている。カセットスタンド７０２３は、核酸検出カセット７０２２を保持する。カセットスタンド７０２３は、例えば、核酸検出カセット７０２２を挿抜可能なスロットである。

核酸検出基板７０２４は、核酸検出カセット７０２２がカセットスタンド７０２３に差し込まれた際に、核酸検出口７０１４と相対する位置に設けられている。核酸検出基板７０２４は、核酸検出口７０１４に対して挿抜可能な大きさである。核酸検出基板７０２４は、核酸検出部７０２０が検出した信号を取得することで核酸検出を行い、標的とする核酸の有無を判定するための基板である。

位置決めピン７０２５は、核酸検出カセット７０２２がカセットスタンド７０２３に差し込まれた際に、位置決め穴７０１５と相対する位置に設けられている。位置決めピン７０２５は、核酸検出装置７１００に対して核酸検出カセット７０２２を位置決めする。

核酸検出基板前後機構７０２６は、核酸検出基板７０２４、位置決めピン７０２５を搭載する。核酸検出基板前後機構７０２６は、核酸検出基板７０２４、位置決めピン７０２５を一体として同時に前後方向に移動可能である。なお、本実施形態では、核酸検出カセット７０２２（またはカセットスタンド７０２３）に対して近づく方向、または離れる方向を前後方向とする。核酸検出基板前後機構７０２６は、核酸検出カセット７０２２の裏面に対して核酸検出基板７０２４と位置決めピン７０２５を嵌め込む。核酸検出基板７０２４は、核酸検出口７０１４を通して、下プレート７００３の基板と接触する。位置決めピン７０２５は、位置決め穴７０１５に差し込まれることで、核酸検出装置７１００に対して核酸検出カセット７０２２を位置決めする。

加熱冷却装置７０２７は、核酸検出カセット７０２２がカセットスタンド７０２３に差し込まれた際に、温調穴７０２１と相対する位置に設けられている。加熱冷却装置７０２７は、温調穴７０２１に対して挿抜可能な大きさである。加熱冷却装置７０２７は、核酸検出部７０２０（これに相対する核酸検出流路７００８）を最適な温度に制御する。

加熱冷却装置前後機構７０２８は、加熱冷却装置７０２７を搭載する。つまり、加熱冷却装置７０２７及び加熱冷却装置前後機構７０２８は、カセットスタンド７０２３を挟んで核酸検出基板前後機構７０２６と逆側に設けられている。加熱冷却装置前後機構７０２８は、加熱冷却装置７０２７を前後方向に移動可能である。核酸検出基板前後機構７０２６は、核酸検出カセット７０２２の裏面に対して加熱冷却装置７０２７を嵌め込む。加熱冷却装置７０２７は、温調穴７０２１に嵌ることで、核酸検出部７０２０と接触する。

検体送液ロッド７０２９は、核酸検出カセット７０２２がカセットスタンド７０２３に差し込まれた際に、検体送液穴７０１６と相対する位置に設けられている。検体送液ロッド７０２９は、検体送液穴７０１６を介して検体シリンジ７００４の薄膜部に加圧し、検体シリンジ７００４内の検体を流路７００７に送り出す機能を備える。検体送液ロッド７０２９は、核酸検出カセット７０２２と相対する先端部分に、前後方向と直交する面を備える。検体送液ロッド７０２９の先端部分の面は、検体送液穴７０１６の形状と略同じ形状である。検体送液ロッド７０２９の先端部分の前後方向における幅は、核酸検出カセット７０２２の表裏方向において、核酸検出カセット７０２２裏面から検体シリンジ７００４の開口部（これと接触する上プレート７００２の面）までの距離と略同じである。したがって、検体送液ロッド７０２９は、検体シリンジ７００４の薄膜部を完全に潰すことができ、検体シリンジ７００４内の検体を流路７００７に全て送り出すことができる。

洗浄送液ロッド７０３０は、核酸検出カセット７０２２がカセットスタンド７０２３に差し込まれた際に、洗浄送液穴７０１７と相対する位置に設けられている。洗浄送液ロッド７０３０は、洗浄送液穴７０１７を介して洗浄シリンジ７００５の薄膜部に加圧し、洗浄シリンジ７００５内の検体を流路７００７に送り出す機能を備える。洗浄送液ロッド７０３０は、核酸検出カセット７０２２と相対する先端部分に、前後方向と直交する面を備える。洗浄送液ロッド７０３０の先端部分の面は、洗浄送液穴７０１７の形状と略同じ形状である。洗浄送液ロッド７０３０の先端部分の前後方向における幅は、核酸検出カセット７０２２の表裏方向において、核酸検出カセット７０２２裏面から洗浄シリンジ７００５の開口部（これと接触する上プレート７００２の面）までの距離と略同じである。したがって、洗浄送液ロッド７０３０は、洗浄シリンジ７００５の薄膜部を完全に潰すことができ、洗浄シリンジ７００５内の検体を流路７００７に全て送り出すことができる。

挿入剤送液ロッド７０３１は、核酸検出カセット７０２２がカセットスタンド７０２３に差し込まれた際に、挿入剤送液穴７０１８と相対する位置に設けられている。挿入剤送液ロッド７０３１は、挿入剤送液穴７０１８を介して挿入剤シリンジ７００６の薄膜部に加圧し、挿入剤シリンジ７００６内の検体を流路７００７に送り出す機能を備える。挿入剤送液ロッド７０３１は、核酸検出カセット７０２２と相対する先端部分に、前後方向と直交する面を備える。挿入剤送液ロッド７０３１の先端部分の面は、洗浄送液穴７０１７の形状と略同じ形状である。挿入剤送液ロッド７０３１の先端部分の前後方向における幅は、核酸検出カセット７０２２の表裏方向において、核酸検出カセット７０２２裏面から挿入剤シリンジ７００６の開口部（これと接触する上プレート７００２の面）までの距離と略同じである。したがって、挿入剤送液ロッド７０３１は、挿入剤シリンジ７００６の薄膜部を完全に潰すことができ、挿入剤シリンジ７００６内の挿入剤を流路７００７に全て送り出すことができる。

ロッド前後機構７０３２は、検体送液ロッド７０２９、洗浄送液ロッド７０３０、挿入剤送液ロッド７０３１を搭載する。つまり、検体送液ロッド７０２９、洗浄送液ロッド７０３０、挿入剤送液ロッド７０３１、ロッド前後機構７０３２は、カセットスタンド７０２３を挟んで核酸検出基板前後機構７０２６と逆側に設けられている。ロッド前後機構７０３２は、検体送液ロッド７０２９、洗浄送液ロッド７０３０、挿入剤送液ロッド７０３１を一体として同時に核酸検出カセット７０２２に対して前後方向に移動可能である。ロッド前後機構７０３２は、核酸検出カセット７０２２の裏面に対して検体送液ロッド７０２９、洗浄送液ロッド７０３０、挿入剤送液ロッド７０３１を押し当てる。検体送液ロッド７０２９は、検体送液穴７０１６を通して、検体シリンジ７００４の薄膜部と接触し、加圧する。同様に、洗浄送液ロッド７０３０は、洗浄送液穴７０１７を通して、洗浄シリンジ７００５の薄膜部と接触し、加圧する。挿入剤送液ロッド７０３１は、挿入剤送液穴７０１８を通して、挿入剤シリンジ７００６の薄膜部と接触し、加圧する。

ここで、ロッド前後機構７０３２における検体送液ロッド７０２９、洗浄送液ロッド７０３０、挿入剤送液ロッド７０３１の搭載位置関係について説明する。検体送液ロッド７０２９、洗浄送液ロッド７０３０に関する搭載位置関係は、以下のとおりである。検体送液ロッド７０２９、洗浄送液ロッド７０３０、挿入剤送液ロッド７０３１のいずれもが核酸検出カセット７０２２と接する前、検体送液ロッド７０２９の先端部分は、洗浄送液ロッド７０３０の先端部分よりも前後方向に所定距離だけ核酸検出カセット７０２２の近くに位置する。ここで所定距離は、例えば、検体送液ロッド７０２９の先端部分の幅以上の距離である。つまり、検体送液ロッド７０２９、洗浄送液ロッド７０３０、挿入剤送液ロッド７０３１が核酸検出カセット７０２２に向って移動する際に、検体送液ロッド７０２９が検体シリンジ７００４の薄膜部を完全に潰して、検体シリンジ７００４内の検体を流路７００７に全て送り出す前に、洗浄送液ロッド７０３０が洗浄シリンジ７００５の薄膜部と接触して、洗浄シリンジ７００５内の洗浄剤を流路７００７に送り出し始めることはない。

洗浄送液ロッド７０３０、挿入剤送液ロッド７０３１に関する搭載位置関係は、以下のとおりである。同条件で、洗浄送液ロッド７０３０の先端部分は、挿入剤送液ロッド７０３１の先端部分よりも前後方向に所定距離だけ核酸検出カセット７０２２の近くに位置する。ここで所定距離は、例えば、洗浄送液ロッド７０３０の先端部分の幅以上の距離である。つまり、検体送液ロッド７０２９、洗浄送液ロッド７０３０、挿入剤送液ロッド７０３１が核酸検出カセット７０２２に向って移動する際に、洗浄送液ロッド７０３０が洗浄シリンジ７００５の薄膜部を完全に潰して、洗浄シリンジ７００５内の洗浄剤を流路７００７に全て送り出す前に、挿入剤送液ロッド７０３１が挿入剤シリンジ７００６の薄膜部と接触して、挿入剤シリンジ７００６内の挿入剤を流路７００７に送り出し始めることはない。

上述した関係より、検体送液ロッド７０２９、挿入剤送液ロッド７０３１に関する搭載位置関係も、以下のとおりとなる。同条件で、検体送液ロッド７０２９の先端部分は、挿入剤送液ロッド７０３１の先端部分よりも前後方向に所定距離だけ核酸検出カセット７０２２の近くに位置する。

バネ７０３３ａ、７０３３ｂ、７０３３ｃそれぞれは、検体送液ロッド７０２９、洗浄送液ロッド７０３０及び挿入剤送液ロッド７０３１並びにロッド前後機構７０３２の間に設けられている。バネ７０３３ａ、７０３３ｂ、７０３３ｃは、前後方向（ロッド前後機構７０３２の移動方向）に伸縮可能な弾性を備える。

バネ７０３３ａ、７０３３ｂ、７０３３ｃそれぞれは、検体送液ロッド７０２９、洗浄送液ロッド７０３０、挿入剤送液ロッド７０３１と核酸検出カセット７０２２の接触により前後方向に縮む。なお、バネ７０３３に代えて、他の弾性体を用いてもよい。また、バネ７０３３ａ、７０３３ｂ、７０３３ｃに代えて、検体送液ロッド７０２９、洗浄送液ロッド７０３０、挿入剤送液ロッド７０３１と核酸検出カセット７０２２の接触により前後方向に縮む機械的な構成を用いてもよい。

次に、本実施形態に係る核酸検出カセット７０２２及び核酸検出装置７１００の使用手順（方法）及びこれらを用いた核酸検出の手順の一例について説明する。なお、下記で説明する手順は一例であり、適宜入れ替えることは可能である。

はじめに、核酸検出カセット７０２２の準備手順の一例について説明する。図５５に示すように密封された核酸検出カセット７０２２の検体シリンジ７００４には検体が、洗浄シリンジ７００５には洗浄液が、挿入剤シリンジ７００６には挿入剤が注入口７０１２ａ、７０１２ｂ、７０１２ｃを介してそれぞれ装填される。注入口７０１２は、キャップシール７０１３を用いて封をされる。核酸検出カセット７０２２は、検体シリンジ７００４、洗浄シリンジ７００５、挿入剤シリンジ７００６が設けられた部分が上側にであって、上プレート７００２が核酸検出基板７０２４と相対するようにカセットスタンド７０２３に差し込まれる。

次に、核酸検出カセット７０２２がカセットスタンド７０２３に差し込まれた核酸検出装置７１００の使用手順の一例について説明する。

はじめに、核酸検出基板前後機構７０２６を作動させる。核酸検出基板前後機構７０２６は、核酸検出基板７０２４、位置決めピン７０２５を核酸検出カセット７０２２に向けて前進させる。核酸検出基板前後機構７０２６は、核酸検出基板７０２４を検出位置（下プレート７００３の基板７０２０ａと接触する位置）まで移動させる。これと同時に、核酸検出基板前後機構７０２６は、位置決めピン７０２５を核酸検出カセット７０２２の位置決め穴７０１５まで移動させて差し込む。核酸検出カセット７０２２は、位置決めピン７０２５が位置決め穴７０１５に差し込まれることで、核酸検出装置７１００に対して位置決めされる。

次に、加熱冷却装置前後機構７０２８を作動させる。加熱冷却装置前後機構７０２８は、加熱冷却装置７０２７を核酸検出カセット７０２２に向けて前進させる。加熱冷却装置前後機構７０２８は、温調穴７０２１を通して、加熱冷却装置７０２７を核酸検出部７０２０と接触する位置まで移動させる。

次に、ロッド前後機構７０３２を作動させる。ロッド前後機構７０３２は、検体送液ロッド７０２９、洗浄送液ロッド７０３０、挿入剤ロッド７０３１を核酸検出カセット７０２２に向けて前進させる。ロッド前後機構７０３２は、検体送液穴７０１６を通して検体送液ロッド７０２９を検体シリンジ７００４に押し当てる。検体シリンジ７００４は、上述したように、薄膜構造であり容易に変形する。そのため、検体は、検体送液ロッド７０２９の加圧により、流路７００７を経由して、核酸検出流路７００８に送り出される。ロッド前後機構７０３２は、検体シリンジ７００４を完全に潰して全ての検体を流路７００７に送るまで検体送液ロッド７０２９を前進させる。なお、洗浄送液ロッド７０３０の先端部分、挿入剤送液ロッド７０３１の先端部分は、上述したような検体送液ロッド７０２９の先端部分との位置関係により、洗浄シリンジ７００５、挿入剤シリンジ７００６とそれぞれ接していない。

この際、核酸検出流路７００８内の空気は、検体に押し出され、廃液流路７００９を経由して廃液シリンジ７０１０に流入する。廃液シリンジ７０１０は、流入した空気により内部圧力が上昇し、僅かに膨張する。廃液シリンジ７０１０は、膨張により、廃液が流入するための容量を確保する。なお、検体シリンジ７００４の容量は、流路７００７、核酸検出流路７００８、廃液流路７００９を満たす量と略同量である。そのため、検体シリンジ７００４から流路７００７に送り出された全ての検体は、流路７００７、核酸検出流路７００８、廃液流路７００９を満たすが、廃液シリンジ７０１０にまで流れ出ることはない。

次に、加熱冷却装置前後機構７０２８を作動させる。加熱冷却装置前後機構７０２８は、加熱冷却装置７０２７を核酸検出カセット７０２２に向けて前進させる。加熱冷却装置前後機構７０２８は、温調穴７０２１を通して加熱冷却装置７０２７を核酸検出部７０２０と接触させる。次に、加熱冷却装置７０２７を作動させて検体を加熱する。核酸検出流路７００８の内壁には、予め増幅用プライマーが固定されているため、加熱により、検体内へプライマーが溶出す。核酸検出流路７００８では、核酸増幅が行われると同時に、核酸検出部７０２０に固定化されたプローブ電極へのハイブリタイゼーションが行われる。

次に、再度ロッド前後機構７０３２を作動させる。ロッド前後機構７０３２は、検体送液ロッド７０２９、洗浄送液ロッド７０３０、挿入剤ロッド７０３１を核酸検出カセット７０２２に向けて前進させる。ロッド前後機構７０３２は、洗浄送液穴７０１７を通して洗浄送液ロッド７０３０を洗浄シリンジ７００５に押し当てる。なお、検体送液ロッド７０２９は、上述したように、バネ７０３３ａによって伸縮自在に構成されている。そのため、ロッド前後機構７０３２が検体送液ロッド７０２９を更に核酸検出カセット７０２２側に移動させても、検体送液ロッド７０２９は、バネ７０３３が収縮するため、核酸検出カセット７０２２を破壊することはない。

また、洗浄シリンジ７００５は、上述したように、薄膜構造であり容易に変形する。そのため、洗浄液は、洗浄送液ロッド７０３０の加圧により、流路７００７を経由して、核酸検出流路７００８に送り出される。洗浄液は、核酸検出流路７００８を洗浄する。ロッド前後機構７０３２は、洗浄シリンジ７００５を完全に潰して全ての検体を流路７００７に送るまで洗浄送液ロッド７０３０を前進させる。なお、挿入剤送液ロッド７０３１の先端部分は、上述したような洗浄送液ロッド７０３０の先端部分との位置関係により、挿入剤シリンジ７００６と接していない。

なお、洗浄シリンジ７００５の容量は、流路７００７、核酸検出流路７００８、廃液流路７００９を満たす量と略同量である。そのため、洗浄シリンジ７００５から流路７００７に送り出された全ての洗浄液は、流路７００７、核酸検出流路７００８、廃液流路７００９を満たしていた検体を廃液シリンジ７０１０に押し出し代わりに、流路７００７、核酸検出流路７００８、廃液流路７００９を満たす。つまり、核酸検出流路７００８内の検体は、廃液流路７００９を通して全て廃液シリンジ７０１０に流入する。なお、洗浄液は、流路７００７、核酸検出流路７００８、廃液流路７００９を満たすが、廃液シリンジ７０１０にまで流れ出ることはない。廃液シリンジ７０１０は容易に膨張するため、流入した検体により更に膨らむ。

次に、再度ロッド前後機構７０３２を作動させる。ロッド前後機構７０３２は、検体送液ロッド７０２９、洗浄送液ロッド７０３０、挿入剤ロッド７０３１を核酸検出カセット７０２２に向けて前進させる。ロッド前後機構７０３２は、挿入剤送液穴７０１８を通して挿入剤送液ロッド７０３１を挿入剤シリンジ７００６に押し当てる。なお、洗浄送液ロッド７０３０は、上述したように、バネ７０７０３３ｂによって伸縮自在に構成されている。そのため、ロッド前後機構７０３２が洗浄送液ロッド７０３０を再度更に核酸検出カセット７０２２側に移動させても、洗浄送液ロッド７０３０は、バネ７０７０３３ｂが収縮するため、核酸検出カセット７０２２を破壊することはない。

また、挿入剤シリンジ７００６は、上述したように、薄膜構造であり容易に変形する。そのため、挿入剤は、挿入剤送液ロッド７０３１の加圧により、流路７００７を経由して、核酸検出流路７００８に送り出される。核酸検出流路７００８内では、挿入剤により核酸検出反応が行なわれる。ロッド前後機構７０３２は、挿入剤シリンジ７００６を完全に潰して全ての検体を流路７００７に送るまで挿入剤送液ロッド７０３１を前進させる。

なお、挿入剤シリンジ７００６の容量は、流路７００７、核酸検出流路７００８、廃液流路７００９を満たす量と略同量である。そのため、挿入剤シリンジ７００６から流路７００７に送り出された全ての挿入剤は、流路７００７、核酸検出流路７００８、廃液流路７００９を満たしていた洗浄液を廃液シリンジ７０１０に押し出し代わりに、流路７００７、核酸検出流路７００８、廃液流路７００９を満たす。つまり、核酸検出流路７００８内の洗浄液は、廃液流路７００９を通して全て廃液シリンジ７０１０に流入する。なお、挿入剤は、流路７００７、核酸検出流路７００８、廃液流路７００９を満たすが、廃液シリンジ７０１０にまで流れ出ることはない。廃液シリンジ７０１０は容易に膨張するため、流入した洗浄液により更に膨らむ。

上述したように、ロッド前後機構７０３２は、並設された検体送液ロッド７０２９、洗浄送液ロッド７０３０、挿入剤ロッド７０３１で検体シリンジ７００４、洗浄シリンジ７００５、挿入剤シリンジ７００６を順に押し潰すことで、順次核酸検出流路７００８へ送液する。核酸検出流路７００８から排出される廃液は、圧力上昇により廃液用シリンジ７０１０が自然膨張することにより、廃液用シリンジ７０１０に送液される。

なお、上述した一連の核酸増幅から核酸検出反応の作業を行う際には、加熱冷却装置７０２７を用いて核酸検出部７０２０を最適な温度に制御することは言うまでもない。核酸検出反応の完了後、核酸検出基板７０２４を用いて核酸検出を行い、標的とする核酸の有無を判定する。

なお、本実施形態では、バネ７０７０３３ｃが挿入剤送液ロッド７０３１とロッド前後機構７０３２との間に設けられている例について説明したが、バネ７０７０３３ｃが設けられていなくてもよい。これは、ロッド前後機構７０３２は、挿入剤送液ロッド７０３１が挿入剤シリンジ７００６内の挿入剤を流路７００７に全て送り出した後に、更に核酸検出カセット７０２２側に移動させることはないからである。また、本実施形態では、核酸検出カセット７０２２が洗浄シリンジ７００５を備える例について説明したが、核酸検出カセット７０２２は、洗浄シリンジ７００５を備えていなくてもよい。洗浄液は、標的とする核酸の検出精度をあげるために用いられるため、核酸増幅から核酸検出反応の処理に必須ではないためである。この場合、核酸検出カセット７０２２は、逆止弁７０１１ｂ、注入口７０７０１２ｂ、洗浄送液穴７０１７を備える必要がなく、核酸検出装置７１００は、洗浄送液ロッド７０３０、バネ７０７０３３ｃを備える必要がない。

本実施形態によれば、極めて簡易的な構成で、安価な小型密封型の核酸検出カセット７０２２及びこれを用いる核酸検出装置７１００により、核酸増幅から標的核酸の検出までを一貫して自動的に処理することができる。

本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。

次のような実施形態も包含される。

［１］液相の反応場を支持するように構成された支持体と、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面の互いに独立した複数の固定化領域に種類毎に遊離可能に固定された、複数種類の標的配列をそれぞれに増幅するように構成された複数種類のプライマーセットとを具備するマルチ核酸増幅反応具。

［２］前記支持体が容器形態または流路形態を有する前記［１］に記載のマルチ核酸増幅反応具。

［３］基体と、前記基体の少なくとも１つの表面の互いに独立した複数の固定化領域に種類毎に遊離可能に固定化された、複数種類の標的配列をそれぞれに増幅するように構成された複数種類のプライマーセットを具備するマルチ核酸増幅反応担体。

［４］液相の１つの反応場を支持するように構成された支持体の少なくとも１つの面であり、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する面の互いに独立した複数の固定化領域に、複数種類の標的核酸をそれぞれに増幅するための複数種類のプライマーセットを種類毎に遊離可能に固定することと、前記支持体に対して核酸増幅を行うための反応液を添加して１つの反応場を形成することと、前記１つの反応場において前記複数種類の標的核酸について増幅反応をそれぞれ行うことを具備するマルチ核酸増幅方法。

［５］液相の反応場を支持するように構成された支持体と、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に独立して配置された複数のプライマー固定化領域と、前記複数のプライマー固定化領域に種類毎に遊離可能に独立して固定され、複数種類の標的配列をそれぞれに増幅するように構成された複数種類のプライマーセットと、前記プライマー固定化領域に遊離可能に固定された増粘剤とを具備するマルチ核酸反応具。

［６］前記支持体の前記反応場を支持する面に取り付けられた被覆体を更に具備する前記［５］に記載のマルチ核酸増幅反応具であって、前記被覆体は、前記支持体の少なくとも全てのプライマー固定化領域を含む領域に対応する部分に形成された溝部と、前記溝部の一端と他端とにそれぞれ開口する貫通孔とを有し、前記被覆体の前記溝部と前記支持体の前記反応部を支持する面とによって、反応部が形成されるマルチ核酸反応具。

［７］更に、前記複数のプライマー固定化領域の近傍に配置された複数のプローブ固定化領域と、前記複数のプローブ固定化領域に固定化された複数のプローブ核酸とを具備する上記［１］または［２］に記載のマルチ核酸反応具。

［８］前記増粘剤が、寒天またはゼラチンである前記［５］〜［７］の何れか１項に記載のマルチ核酸反応具。

［９］前記増粘剤が、前記プライマーを覆うように固定されている［１］〜［８］の何れか１項に記載のマルチ核酸反応具。

［１０］前記増粘剤が、前記プライマーと共に、前記プライマー固定化領域に固定されている前記［５］〜［９］の何れか１項に記載のマルチ核酸反応具。

［１１］支持体と、前記支持体の少なくとも１つの表面の互いに独立した複数のプライマー固定化領域に種類毎に遊離可能に固定化された、複数種類の標的配列をそれぞれに増幅するように構成された複数種類のプライマーセットと、前記プライマー固定化領域に遊離可能に固定化された増粘剤とを具備するマルチ核酸反応担体。

［１２］更に、前記複数のプライマー固定化領域の近傍に配置された複数のプローブ固定化領域と、前記複数のプローブ固定化領域に固定化された複数のプローブ核酸とを具備する前記［１１］に記載のマルチ核酸反応担体。

［１３］前記増粘剤が、寒天またはゼラチンである［１１］または［１２］に記載のマルチ核酸反応担体。

［１４］前記増粘剤が、前記プライマーを覆うように固定化されている前記［１１］〜［１３］の何れか１項に記載のマルチ核酸反応担体。

［１５］前記増粘剤が、前記プライマーと共に、前記プライマー固定化領域に固定化されている前記［１１］〜［１３］の何れか１項に記載のマルチ核酸反応担体。

［１６］板状の支持体と、前記支持体の１つの面に固定され、軸方向に伸びる溝部を前記支持体側の面に開口する被覆体と、前記被覆体の前記溝部と前記支持体の前記１つの面とにより構成される流路と、前記流路の一端に開口された第１の貫通孔と、前記流路の他端に開口された第２の貫通孔と、前記流路内壁のプライマー固定化領域にそれぞれ遊離可能に固定された複数のプライマーセットと、前記プライマー固定化領域に遊離可能に固定された増粘剤とを具備するマルチ核酸増幅反応具であって、前記複数のプライマーセットは、種類毎に独立してプライマー固定化領域に固定され、１つのプライマーセットは１つの標的核酸を増幅するための複数のプライマーを含むマルチ核酸反応具。

［１７］更に、前記複数のプライマー固定化領域の近傍に配置された複数のプローブ固定化領域と、前記複数のプローブ固定化領域に固定化された複数のプローブ核酸とを具備する前記［１６］に記載のマルチ核酸反応具。

［１７］（ａ）板状の支持体と、前記支持体の１つの面に固定され、軸方向に伸びる溝部を前記支持体側の面に開口する被覆体と、前記被覆体の溝部と前記支持体の前記１つの面とにより構成される流路と、前記流路の一端に開口された第１の貫通孔と、前記流路の他端に開口された第２の貫通孔と、前記流路内壁に互いに独立して配置された複数のプライマー固定化領域と、前記複数のプライマー固定化領域にそれぞれ遊離可能に固定された複数のプライマーセットと、前記プライマー固定化領域に遊離可能に固定された増粘剤とを具備するマルチ核酸反応具を準備することと、
ここで、前記複数のプライマーセットは、種類毎に独立してプライマー固定化領域に独立して固定され、１つのプライマーセットは１つの標的核酸を増幅するための複数のプライマーを含む、
（ｂ）前記第１の開口部から、前記流路に対して標的核酸を含む反応液を添加することと、
（ｃ）前記標的核酸を増幅することと、
を具備するマルチ核酸反応方法。

［１９］（ａ）板状の支持体と、前記支持体の１つの面に固定され、軸方向に伸びる溝部を前記支持体側の面に開口する被覆体と、前記被覆体の溝部と前記支持体面の前記１つの面とにより構成される流路と、前記流路の一端に開口された第１の貫通孔と、前記流路の他端に開口された第２の貫通孔と、前記流路内壁に互いに独立して配置された複数のプライマー固定化領域と、前記複数のプライマー固定化領域にそれぞれ遊離可能に固定された複数のプライマーセットとを具備するマルチ核酸反応具を準備することと、
ここで、前記複数のプライマーセットは、種類毎に独立してプライマー固定化領域に固定され、１つのプライマーセットは１つの標的核酸を増幅するための複数のプライマーを含む、
（ｂ）前記第１の開口部から、前記流路に対して標的核酸と増粘剤とを含む反応液を添加することと、
（ｃ）前記標的核酸を増幅すること、
を具備するマルチ核酸反応方法。

［２０］前記マルチ核酸反応具が更に、前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれの近傍に配置された複数のプローブ固定化領域と、前記複数のプローブ固定化領域に固定化されたプローブ核酸とを具備し、
（ｅ）前記（ｃ）において得られた増幅産物と前記プローブ核酸とのハイブリダイズ信号を検出すること、
を更に具備する前記［１８］または［１９］に記載のマルチ核酸反応方法。

［２１］前記プライマー固定化領域への前記プライマーセットが固定化された後に、前記増粘剤が、前記プライマー固定化領域に固定される前記［１８］〜［２０］に記載のマルチ核酸反応方法。

［２２］前記プライマー固定化領域に対して、前記プライマーセットと前記増粘剤との混合物が固定化される前記［１８］〜［２１］に記載のマルチ核酸反応方法。

［２３］前記反応液の添加が、１０ｍｍ／秒以上の流速により行われる前記［１８］〜［２２］の何れか１項に記載のマルチ核酸反応方法。

［２４］第１の面に溝部を備える第１の部材を備え、
前記溝部は、核酸サンプルが反応するための流路型チャンバを備え、
前記流路型チャンバの断面積は、前記溝部における前記流路型チャンバ以外の断面積よりも大きい、
核酸検出用デバイス。

［２５］前記流路型チャンバの深さは、前記溝部における前記流路型チャンバ以外の領域の深さよりも深い、前記［２４］に記載の核酸検出用デバイス。

［２６］前記流路型チャンバの幅は、前記溝部における前記流路型チャンバ以外の領域の幅よりも広い、前記［２４］に記載の核酸検出用デバイス。

［２７］前記流路型チャンバの断面積及び前記流路型チャンバ以外の前記溝部の断面積は、前記第１の面と直交する面に基づいた断面積である、前記［２４］に記載の核酸検出用デバイス。

［２８］複数の前記流路型チャンバは、複数種類の標的配列をそれぞれ増幅するように構成された複数種類のプライマーセットを保持する、前記［２４］に記載の核酸検出用デバイス。

［２９］前記流路型チャンバは、壁面に前記プライマーセットを保持する、前記［２４］に記載の核酸検出用デバイス。

［３０］前記第１の部材の前記第１の面と対向し、前記溝部と対向する位置に核酸検出用の電極を備える第２の部材を備える、前記［２４］〜［２９］のいずれか１項に記載の核酸検出用デバイス。

［３１］前記［２４］〜［３０］のいずれか１項に記載の核酸検出用デバイスを用いる核酸検出装置であって、
前記電極からの電流値に基づいて核酸を検出する核酸検出装置。

［３２］基板と、
前記基板上に形成された核酸検出用のセンサ部と、
前記基板上に形成され、前記センサと接続された配線と、
前記基板上に形成された保護膜と、
を備え、
前記センサ部と核酸サンプルが反応するためのチャンバ内で核酸増幅反応を行った後に、前記センサ部によって核酸増幅産物の検出を行う核酸検出デバイスにおいて、
前記保護膜は、前記基板上における前記核酸サンプルの接液領域において、前記基板の一部を含む下層部を露出させる１以上の開口を備える、
核酸検出用デバイス。

［３３］前記センサ部は電極である、前記［３２］に記載の核酸検出用デバイス。

［３４］前記保護膜は、前記接液領域において、前記配線を覆う、前記［３２］に記載の核酸検出用デバイス。

［３５］前記保護膜は、前記センサ部の外周部分を覆う、前記［３４］に記載の核酸検出用デバイス。

［３６］前記保護膜は、前記接液領域において、前記センサ部近傍に設けられた開口と、前記センサ部と隣接する別のセンサ部近傍に設けられた開口とを区切るように前記基板を覆う、前記［３２］に記載の核酸検出用デバイス。

［３７］前記センサ部は、１以上のセンサで構成されている、前記［３２］に記載の核酸検出用デバイス。

［３８］基体と、前記基体の少なくとも１つの表面に互いに独立して配置された複数の第１の電極と、前記複数の第１の電極上にそれぞれ固定されたプローブ核酸と、前記複数の第１の電極に対応して複数で配置される検出信号取り出し部と、前記複数の第１の電極とそれらに対応する前記検出信号取り出し部とを接続するリードと、前記リード表面と前記基体の前記少なくとも１つの表面の露出部分とを覆う保護膜とを具備し、前記保護膜が、ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホン、並びにガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素および金属酸化物からなる群より選択される少なくとも１である核酸反応具。

［３９］更に、前記基体の前記少なくとも１つの表面の前記複数の第１の電極と同じ位置またはその近傍に配置された複数のプライマー固定化領域と、前記プライマー固定化領域に遊離可能に種類毎に固定された複数のプライマーセットを具備する前記［３８］に記載の核酸反応具。

［４０］前記基体が板状形体である前記［３８］または［３９］に記載の核酸反応具。

［４１］前記第２の電極が、前記基体の前記少なくとも１つの表面の前記第１の電極が配置された領域とは異なる領域に互いに独立して配置される前記［４０］に記載の核酸反応具。

［４２］更に、前記プローブ核酸固定化領域および前記プライマー固定化領域を含む領域を覆うように前記基体に取り付けられた被覆体を具備する前記［３８］〜［４０］の何れか１項に記載の核酸反応具。

［４３］基体と、前記基体の前記少なくとも１つの表面の露出部分とを覆う保護膜と、前記保護膜上に互いに独立して配置された複数のプライマーセットとを具備し、前記保護膜が、ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホン、並びにガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素および金属酸化物からなる群より選択される少なくとも１である核酸反応具。

［４４］前記保護膜が、ノボラック樹脂、エポキシ樹脂、ポリオレフィン樹脂およびシリコン樹脂を含む前記［３８］〜［４３］の何れか１項に記載の核酸反応具。

［４５］核酸検出流路と、核酸サンプルを貯める第１のシリンジと、核酸検出に用いる薬液を貯める第２のシリンジと、前記核酸検出流路から流出する液体を貯める第３のシリンジと、前記第１のシリンジ及び前記第２のシリンジ並びに前記核酸検出流路を繋ぐ第１の流路と、前記核酸検出流路と前記第３のシリンジを繋ぐ第２の流路とを備え、軟質材料で一体構成される流路パッキンと、
硬質材料で構成され、前記流路パッキンの第１の面と相対する第１のプレートと、
硬質材料で構成され、前記第１の面と逆側の第２の面と相対し、前記第１のプレートと共に前記流路パッキンを密封する第２のプレートと、
を備える核酸検出カセット。

［４６］前記第１のシリンジ及び前記第２のシリンジは、前記第２の面に容易に変形可能な薄膜部を備える、前記［４５］に記載の核酸検出カセット。

［４７］前記下プレートは、前記１のシリンジと相対する位置に第１の開口部を備え、前記第２のシリンジと相対する位置に第２の開口部を備え、前記核酸検出流路と相対する位置に、標的となる核酸を検出処理する核酸検出部を備える、前記［４６］に記載の核酸検出カセット。

［４８］前記第１のシリンジの容量及び前記第２のシリンジの容量は、前記核酸検出流路、前記第１の流路、前記第２の流路を満たす量と略同量である、前記［４７］に記載の核酸検出カセット。

［４９］前記第１の流路は、前記第１のシリンジ内への液体の流入を防ぐ第１の逆止弁と、前記第２のシリンジ内への液体の流入を防ぐ第２の逆止弁と、を備える、前記［４８］に記載の核酸検出カセット。

［５０］前記［４７］〜［４９］のいずれか１項に記載の前記核酸検出カセットを用いる核酸検出装置であって、
前記の核酸検出カセットを保持するスタンドと、
前記第１の開口部を介して前記第１のシリンジに加圧する第１のロッドと、
前記第２の開口部を介して前記第２のシリンジに加圧する第２のロッドと、
前記第１のロッドの先端部分が前記第２のロッドの先端部分よりも所定距離だけ前記核酸検出カセットの近くに位置するように前記第１のロッド及び前記第２のロッドを搭載し、前記第１のロッド及び前記第２のロッドを前記核酸検出カセットに対して移動可能な移動機構と、
を備える、核酸検出装置。

［５１］前記第１のロッド及び前記第２のロッド並びに移動機構の間に、前記移動機構の移動方向に弾性を有する弾性体を備える、前記［５０］に記載の核酸検出装置。

Claims

液相の反応場を支持するように構成された支持体と、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に互いに独立して配置された複数のプライマー固定化領域と、前記複数のプライマー固定化領域に種類毎に遊離可能に固定され、複数種類の標的配列をそれぞれに増幅するように構成された複数種類のプライマーセットとを具備するマルチ核酸増幅反応具。
前記支持体が容器形態または流路形態を有する請求項１に記載のマルチ核酸増幅反応具。
前記プライマー固定化領域に遊離可能に固定された増粘剤を更に具備する請求項１に記載のマルチ核酸増幅反応具。
前記支持体に取り付けられ、支持体と共に、反応液を維持するチャンバを構成する被覆体を更に具備する請求項１に記載のマルチ核酸増幅反応具。
前記支持体が基板からなる請求項１に記載のマルチ核酸増幅反応具。
前記支持体は、その第１の面に溝部を備え、
前記溝部は、核酸サンプルが反応するための流路型チャンバを備え、
前記流路型チャンバの断面積は、前記溝部における前記流路型チャンバ以外の断面積よりも大きい、
核酸検出用デバイスである請求項５に記載のマルチ核酸反応具。
前記支持体上に形成された核酸検出用のセンサ部と、
前記支持体上に形成され、前記センサと接続された配線と、
前記支持体上に形成された保護膜と、
を更に備える請求項５に記載のマルチ核酸増幅反応具であって、
マルチ核酸増幅反応具は、前記センサ部と核酸サンプルが反応するためのチャンバ内で核酸増幅反応を行った後に、前記センサ部によって核酸増幅産物の検出を行う核酸検出デバイスであり、
前記保護膜は、前記基板上における前記核酸サンプルの接液領域において、前記基板の一部を含む下層部を露出させる１以上の開口を備える、
マルチ核酸増幅反応具。
前記センサ部は電極である、請求項７に記載のマルチ核酸増幅反応具。
前記保護膜は、前記接液領域において、前記配線を覆う、請求項８記載のマルチ核酸増幅反応具。
前記保護膜が、ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホン、並びにガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素および金属酸化物からなる群より選択される少なくとも１である請求項７に記載のマルチ核酸増幅反応具。
前記保護膜が、ノボラック樹脂、エポキシ樹脂、ポリオレフィン樹脂およびシリコン樹脂を含む請求項７に記載のマルチ核酸増幅反応具。
前記支持体が、硬質材料で構成された第１のプレートからなり、
核酸反応流路と、核酸サンプルを貯める第１のシリンジと、核酸反応に用いる薬液を貯める第２のシリンジと、前記核酸反応流路から流出する液体を貯める第３のシリンジと、前記第１のシリンジ及び前記第２のシリンジ並びに前記核酸反応流路を繋ぐ第１の流路と、前記核酸反応流路と前記第３のシリンジを繋ぐ第２の流路とを備え、軟質材料で一体構成される流路パッキンと、
硬質材料で構成された第２のプレートとを更に具備する請求項１に記載のマルチ核酸反応具であって、
前記第１のプレートは、前記流路パッキンの第１の面と相対し、前記第２のプレートは、前記第１の面と逆側の第２の面と相対し、前記第１のプレートと共に前記流路パッキンを密封する、核酸反応カセットである請求項１に記載のマルチ核酸増幅反応具。
基体と、前記基体の少なくとも１つの面に互いに独立して配置された複数のプライマー固定化領域と、前記複数のプライマー固定化領域に種類毎に遊離可能に固定化され、複数種類の標的配列をそれぞれに増幅するように構成された複数種類のプライマーセットとを具備するマルチ核酸増幅反応担体。
液相の１つの反応場を支持するように構成された支持体の少なくとも１つの面であり、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する面の互いに独立した複数の固定化領域に、複数種類の標的核酸をそれぞれに増幅するための複数種類のプライマーセットを種類毎に遊離可能に固定することと、前記支持体に対して核酸増幅を行うための反応液を添加して１つの反応場を形成することと、前記１つの反応場において前記複数種類の標的核酸について増幅反応をそれぞれ行うことを具備するマルチ核酸増幅方法。