JP6878337B2 - 核酸反応具、核酸検出定量キット及び核酸検出定量方法 - Google Patents

核酸反応具、核酸検出定量キット及び核酸検出定量方法 Download PDF

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Description

本発明の実施形態は、核酸反応具、核酸検出定量キット及び核酸検出定量方法に関する。
現在、遺伝子検査技術の進展に伴い、臨床現場や犯罪捜査などの様々な場面で遺伝子検査が実施されている。検査対象の遺伝子は、リアルタイムＰＣＲ法やＬＡＭＰ法により検出又は定量される。例えば、リアルタイムＰＣＲ法は、核酸の増幅を伴うことから感度が高く、定量範囲が広い。ＬＡＭＰ法は、蛍光色素で標識することなく対象遺伝子を定量検出することが可能である。
遺伝子検査では、複数の対象遺伝子を検出し、それらの結果を総合することで初めて有用である場合が多い。例えば、臨床現場で行われる、患者に感染する病原菌の特定などにおいては、患者の症状に基づいて感染が疑われる複数種の微生物について検査が行われることが好ましい。また、犯罪捜査現場で行われる個人特定などにおいては、複数の遺伝子座における繰り返し配列について検査を行い、総合的に個人を特定する。それにより、高確率で個人を特定することができる。このように複数の対象遺伝子を検出する技術が非常に重要なものとなっている。
従来、複数の対象遺伝子を検出する際には、複数種類の対象遺伝子についてそれぞれ別の反応容器で増幅反応が行われ、それぞれについて対象遺伝子の有無が検出される。或いは、１つの反応容器内で増幅反応を行う場合には、全ての対象遺伝子を増幅するための試薬が収容された１つの反応容器でマルチ核酸増幅反応が行われる。増幅産物の検出は、一般的には、増幅産物をＤＮＡチップや電気泳動などに供することにより行われる。或いは、対象遺伝子の増幅及び検出は、複数種類のプライマーセットや複数種類のプローブ核酸を固定したマルチ核酸反応容器を用いても行われる。
上記のような状況において、現在、核酸を簡便かつ高感度に定量検出する方法の更なる開発が望まれている。
特許第５２１６９２８号公報
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ, Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２０１７．１０，０１９
本発明は、標的核酸を精度よく検出又は定量できる核酸反応具、キット及び核酸検出方法を提供することを目的とする。
実施形態に従う核酸反応具は、支持体と、被覆体と、プライマーセットとを備える。被覆体は、少なくとも一方の面に形成された溝部を有し、支持体の一方の面に溝部側の一方の面が接して支持体の一方の面と溝部とで囲まれた反応空間を形成している。かつ被覆体の溝部は、反応空間の内面に互いに対向する立ち上がり面と、立ち上がり面の一端を繋ぐ背面と、反応空間内の立ち上がり面と背面とが交差する隅部と、隅部に存在するプライマー固定領域とを有する。プライマーセットは、プライマー固定領域に固定されている。
実施形態の核酸反応具の一例を示す平面図及び断面図である。 実施形態の核酸反応具の一例を示す透視斜視図である。 実施形態の核酸反応具の一例を示す平面図及び断面図である。 実施形態の核酸反応具の一例を示す透視斜視図である。 実施形態の核酸検出定量方法の一例を示すフローチャートである。 実施形態の核酸検出定量方法の一例を示すフローチャートである。 実施形態の核酸検出定量方法の一例を示すフローチャートである。 実施形態の核酸反応具の一例を示す平面図及び断面図である。 実施形態の核酸検出定量方法の一例を示すフローチャートである。 実施形態の核酸反応具の一例を示す断面図である。 実施形態の核酸反応カセットの一例を示す斜視図である。 実施形態の核酸反応カセットの一例を示す斜視図である。 実施形態の核酸反応カセットの一例を示す斜視図である。 実施形態の核酸検出定量装置の一例を示す斜視図である。 例１に用いた核酸反応具を示す模式図である。 例１のプライマーセットを固定した被覆体の写真である。 例１の反応液流入後のプライマーセットの写真である。 例１の実験結果を示す図である。 例２の実験結果を示す図である。 例３の実験結果を示す図である。
実施形態に従う核酸反応具は、支持体と、被覆体と、プライマーセットとを備える。被覆体は、少なくとも一方の面に形成された溝部を有し、支持体の一方の面に溝部側の一方の面が接して支持体の一方の面と溝部とで囲まれた反応空間を形成している。かつ被覆体の溝部は、反応空間の内面に互いに対向する立ち上がり面と、立ち上がり面の一端を繋ぐ背面と、反応空間内の立ち上がり面と背面とが交差する隅部と、隅部に存在するプライマー固定領域とを有する。プライマーセットは、プライマー固定領域に固定されている。
核酸反応具が同時に複数種類の標的核酸を検出するためのものである場合、プライマーセットは複数種類であってもよい。複数種類のプライマーセットを備える場合、プライマー固定領域は複数配置されてもよい。その場合、複数のプライマー固定領域は、複数のプライマー固定領域に種類ごとに遊離可能に固定されている。
以下に、図面を参照しながら種々の実施形態について説明する。各図は実施形態とその理解を促すための模式図であり、その形状や寸法、比などは実際と異なる箇所があるが、これらは以下の説明と公知の技術を参酌して適宜、設計変更することができる。
・第１の実施形態
（核酸反応具）
第１の実施形態の核酸反応具の一例を図１に示す。図１の（ａ）は、核酸反応具１の平面図である。図１の（ｂ）は、核酸反応具１をＢ−Ｂ’に沿って切断したときの断面図である。図２は、図１の（ａ）の囲いＣを拡大した透視斜視図である。
以下、核酸反応具１の構成の概要を説明する。核酸反応具１は、例えば、矩形板状の支持体２と、矩形体をなすプレート状の被覆体３とを備える。被覆体３の少なくとも一方の面は、例えば細長状の溝部３ａを有する。当該支持体２の平坦な面２ａに、被覆体３の溝部３ａ側の面が当接し、固定されている。それにより、支持体２の面２ａと被覆体３の溝部３ａとで囲まれた細長状の反応空間４を形成している。
反応空間４は、蛇行した流路状である。反応空間４は、平面視した時、始端３ｂ側が内側に９０°屈曲され、更に途中４か所で互いに平行になるように１８０°屈曲され、終端３ｃ側が内側に９０°屈曲されている。被覆体３の溝部３ａの始端３ｂの位置には、反応液の流入口３ｄが、終端３ｃには流出口３ｅがそれぞれ開口されている。
被覆体３の溝部３ａは、図１の（ｂ）に示すように、反応空間４の内面に、溝部３ａの長さ方向に沿い互いに対向する立ち上り面４ａ，４ｂと、これらの立ち上り面４ａ，４ｂの一端（上端）を繋ぐ背面４ｃを有する。立ち上がり面４ａ、４ｂは、背面４ｃの両端から支持体２の平坦な面２ａに向けて垂直な方向に延出している。すなわち、反応空間４の断面は、長方形状をなしている。反応空間４の断面は、正方形状であっても良い。
複数のプライマー固定領域５は、２つの立ち上り面４ａ，４ｂと背面４ｃがそれぞれ交差する隅部６ａ，６ｂのうち、少なくとも一方の隅部、例えば隅部６ａの長さ方向にそれぞれ所望の間隔をあけて配置されている。複数のプライマーセット７は、複数のプライマー固定領域５にそれぞれ遊離可能に固定されている。
支持体２は、複数の検出部８を備える。複数の検出部８は、反応空間４に接する支持体２の平坦な面２ａに複数のプライマー固定領域５と近接してそれぞれ埋め込まれている。
以下、各構成について詳細に説明する。
支持体２は、被覆体３を支持する固体である。支持体２は、例えば、薄い板状である。支持体２の材料は、例えば、金属、ガラス、樹脂又はシリコンなどである。支持体２の大きさは、例えば、長さ０．１〜１００ｍｍ、幅０．１〜１００ｍｍ、厚さ０．１〜１０ｍｍであることが好ましいが、この大きさに限定されるものでははい。支持体２は、皿状又は容器状などであってもよい。支持体２は、例えば、商業的に入手可能なプレート、ディッシュ、シャーレ又はその他の容器などであってもよい。
被覆体３は、支持体２の１つの面２ａの少なくとも一部を被覆し、反応空間４を形成するための部材である。被覆体３の材料は可撓性を有することが望ましい。被覆体３の材料は、例えば、疎水性樹脂であることが好ましい。疎水性樹脂は、例えば、シリコーン樹脂などである。例えば、被覆体３の大きさは、長さ１〜１００ｍｍ、幅１〜１００ｍｍ、厚さ０．１〜１０ｍｍであることが好ましいがこの大きさに限定されるものではない。溝部３ａの深さ、即ち反応空間４の高さは、例えば０．０１〜１０ｍｍであることが好ましい。０．１〜５ｍｍであればより好ましい。
支持体２の１つの面２ａと、被覆体３の溝部３ａとで囲まれた１つの反応空間４が形成されている。反応空間４は、詳しくは後述するが、反応液が持ち込まれ、標的核酸の増幅反応が行われるための空間である。そのため、反応空間４は、液密な空間であることが好ましい。
反応空間４の形状は、溝部３ａの形状によって決定される。図１に示す例においては、反応空間４の形状は、蛇行した１本の流路である。反応空間４が流路であれば、使用する反応液の量が少なくてよく、かつプライマーセット７が他の種類のプライマーセット７による反応が起こる領域まで拡散しにくいため好ましい。流路の幅は、例えば０．０１〜１０ｍｍであることが好ましい。０．１〜５ｍｍであればより好ましい。
この例において流路は蛇行した１本の流路であるが、流路は、例えば、蛇行しない１本の流路であってもよいし、分岐した流路又は渦巻き状の流路などであってもよい。流路の断面は、長方形でなくともよく、例えば、正方形、台形であってもよい。
被覆体３は、隅部６ａ，６ｂを有する。隅部６ａ，６ｂについて図２を用いて説明する。隅部６ａ及び６ｂはそれぞれ、立ち上がり面４ａ，４ｂと背面４ｃとがそれぞれ交差する角部である。隅部６ａ及び６ｂは、反応空間４の内部に位置する。
隅部６ａには、複数のプライマー固定領域５が配置されている。例えば、プライマー固定領域５が隅部６ａに配置されているとは、プライマー固定領域５が、立ち上がり面４ａと背面４ｃとの交差線を含む、立ち上がり面４ａと背面４ｃと２面にまたがる領域に配置されていることを意味する。各プライマー固定領域５には、プライマーセット７が遊離可能に固定されている。
複数のプライマー固定領域５は、互いに独立して配置されている。「互いに独立して配置される」とは、反応空間４に反応液が持ち込まれ、プライマーセット７が反応液中に遊離した際に、そのプライマーセット７が、隣のプライマー固定領域５に固定されたプライマーセット７による増幅反応が起こる領域までほとんど拡散しない間隔で配置されることをいう。或いは、あるプライマー固定領域５に固定されたプライマーセット７によって起こる増幅反応やそれに伴う信号の検出を、別のプライマー固定領域５に固定されたプライマーセット７がほぼ妨げることのない間隔で配置されることである。例えば、隣り合うプライマー固定領域５間の距離は、１ｍｍ以上である。距離は、好ましくは、４ｍｍ以上８ｍｍ以下である。
複数のプライマー固定領域５は、互いに独立して配置されている限り、それぞれが隅部６ａのみに配置されていてもよいし、隅部６ｂのみに配置されていてもよいし、隅部６ａ及び６ｂの両方に配置されていてもよい。或いは、隅部６ａ及び６ｂ以外の何れかの隅部に配置されていてもよい。
複数のプライマー固定領域５には、複数種類のプライマーセット７が種類ごとに固定されている。即ち、１つのプライマー固定領域には１種類のプライマーセットが固定されている。１種類のプライマーセットは、それに対応する１種類の標的核酸を増幅するために必要なプライマーの集合体である。複数種類のプライマーセットはそれぞれ、互いに異なる複数の標的核酸を増幅するためのプライマーセットである。
プライマーセット７は、変温増幅反応用のプライマーセット又は等温増幅用プライマーセットなどである。変温増幅反応は、例えば、ＰＣＲなどである。等温増幅反応は、例えば、ＬＡＭＰ、ＲＴ−ＬＡＭＰ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＲＣＡ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）又はＩＣＡＮ（登録商標）などである。
プライマーセット７が、ＰＣＲ増幅用のものである場合、１種類のプライマーセットは、例えば、少なくともフォワードプライマーとリバースプライマーとを含む。プライマーセットがＬＡＭＰ用のものである場合、１つのプライマーセットは、例えば、少なくともＦＩＰプライマーと、ＢＩＰプライマーとを含む。更に、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＰプライマー、即ち、ＬＦプライマー及び／又はＬＢプライマーなどを含んでいてもよい。
複数種類のプライマーセット７に含まれるプライマーセットのそれぞれは、互いに同じ種類の増幅方法に用いられるプライマーセットであることが好ましい。
複数のプライマーセット７はそれぞれ、プライマー固定領域５に遊離可能に固定されている。「遊離可能に固定されている」とは、反応空間４に反応液が持ち込まれる前には、プライマーセット７がプライマー固定領域５に固定されており、反応空間４に反応液が持ち込まれた後は、反応液中にプライマーセット７が遊離できる状態であることをいう。例えば、反応空間４又は反応液に熱を加えた際にプライマーセット７が反応液に遊離する。
例えば、プライマーセット７を遊離可能に固定するには、プライマーセット７を含む液体（以下、「プライマー溶液」と称する）を所望のプライマー固定領域に滴下し、その後乾燥すればよい。被覆体３の材料が疎水性樹脂である場合、滴下したプライマー溶液が立ち上がり面４ａ及び背面４ｃを伝って広がらない。その結果、プライマー溶液を隅部６ａに留まらせることができるため、より精度よくプライマー固定領域５にプライマーセット７を固定することができる。
また、被覆体３は、少なくともプライマーセット７が固定される隅部（図２の例では隅部６ａ）の表面に界面活性剤膜を備えることが好ましい。隅部６ａに界面活性剤膜が設けられている場合、滴下したプライマー溶液が滴下された位置からズレにくく、より精度よくプライマー固定領域５にプライマーセット７を固定することができる。
界面活性剤膜は、例えば、界面活性剤を含む液体と被覆体３の所望の表面とを接触させた後、界面活性剤が全て除去されない程度にすすぎ、乾燥することなどによって形成することが可能である。界面活性剤は、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）、Ｂｒｉｊ（登録商標）又は非イオン性界面活性剤などである。界面活性剤を含む液体は、例えば、界面活性剤を水、塩水又は緩衝液などの液体に含ませたものである。
プライマー溶液は、例えば、プライマーセットと、溶媒とを含む。溶媒は、例えば、水であることが好ましい。プライマー溶液におけるプライマーセットの濃度は、例えば０．１〜２００μＭであることが好ましい。より好ましくは１〜５０μＭである。
更に、支持体２は検出部８を備える。検出部８は、支持体２の面２ａの反応空間４に接する領域に配置されている。検出部８は、プライマー固定領域５に対応して配置される。「対応して配置される」とは、検出部８が、対応するプライマー固定領域５に固定されているプライマーセット７による増幅反応に伴う信号を検出することができ、かつ隣のプライマーセットによる増幅反応で生じる信号を検出しないように、検出部８の位置又は大濃さが設定されていることをいう。例えば、検出部８ａは、対応するプライマー固定領域５ａに固定されたプライマーセットによって起こる増幅反応に関連する信号を検出することができる。加えて、検出部８ａは、例えば、プライマー固定領域５ｂに固定されたプライマーセットによって起こる増幅反応に関連する信号を検出しないような大きさ及び配置で形成される。
検出部８は、例えば、増幅産物の増加に伴う信号を検出するための部材を備える。増幅産物の増加に伴う信号は、例えば電気化学的信号である。電気化学的信号は、例えば、反応空間４内で生じる電流値、電位値、電気容量値又はインピーダンス値などである。信号が電気化学的信号である場合、信号を検出するための部材は、例えば、電極である。或いは、信号は光学的信号である。光学的信号は、反応空間４内で生じる蛍光若しくは化学発光である。或いは、光学的信号は、反応液の呈色、濁度若しくは吸光度（例えば、反応液に光を照射した際の吸収、散乱、反射強度）などである。信号が光学的信号である場合、信号を検出するための部材は、例えば、光学センサ又は検出窓である。
検出部８が電極を備える場合、例えば、電極は、反応空間４内で生じる電気化学的信号を検出できるように配置される。電極は、例えば、検出部８の反応空間４側表面にドット状などの所望の形状の金属パターンを形成することによって得ることができる。電極は、複数の金属膜が積層されて形成されてもよい。金属は、例えば金であれば感度が良好となるため好ましい。検出部８が電極で構成される場合、支持体２の検出部８以外の表面が、絶縁膜で被覆されてもよい。
検出部８が電極で構成される場合、支持体２は、パッド部を備えていてもよい。そのような核酸反応具１１の例を図３に示す。核酸反応具１１は、支持体１２の反応空間１４に接する面に、プライマー固定領域１５に対応して配置される電極１６を備える。更に、支持体１２は、被覆体１３で被覆されない面にパッド部１８を備える。パッド部１８は、複数のパッド１８ａを備える。パッド１８ａは、電極１６と配線などにより電気的に接続されており、電極１６で得られた電気化学的信号に関する情報を取り出すことができる。また、支持体１２は、更に参照極及び対極を備えていてもよい（図示せず）。またそれらに対応する更なるパッドを備えていてもよい。
図１に示される核酸反応具１の検出部８が光学センサを備える場合、例えば、光学センサは、反応空間４で生じる光学的信号を検出できるように配置される。光学センサは、例えば、上記光学的信号を検出できる公知の何れかのセンサであればよい。例えば、光学センサは、光学的信号を検出し、電気化学的信号に変換する素子などである。光学センサは、例えば、濁度センサであってもよい。
図１に示される核酸反応具の検出部８が検出窓を備える場合、検出窓は、光透過性の材料で構成されている。光透過性の材料は、例えば、樹脂などである。検出窓は、例えば、核酸反応具１とは別体の光学センサ又は目視などにより、核酸反応具１の外部から反応空間４で生じる信号を検出することができるように構成される。
検出部８により増幅産物の増加に伴う信号を検出することにより、その結果に基づいて標的核酸を検出又は定量することができる。
検出部８には、複数種類のプローブ核酸が種類ごとに固定されていてもよい。そのような例を図４に示す。図４は、図２と同様の透視斜視図である。この例において、核酸反応具は、検出部８にプローブ核酸９を備える。
プローブ核酸９は、検出部８の反応空間４に接する表面に固定されている。例えば、プローブ核酸９は、それが固定されている検出部８に対応するプライマー固定領域５に固定されているプライマーセット７（以下、「対応するプライマーセット」と称する。）によって起こる標的核酸の増幅反応によって生じる増幅産物（図示せず）とハイブリダイズすることができる。従って、固定されるプローブ核酸９の種類は、対応するプライマーセット７の種類に従って選択される。例えば、プライマーセット７ａによる増幅反応によって生成した増幅産物は、プローブ核酸９ａにハイブリダイズする。
例えば、プローブ核酸９は一本鎖核酸であり、対応する増幅産物と特異的にハイブリダイズすることができる配列を少なくとも含む。また例えば、プローブ核酸９は二本鎖核酸であり、その一方の鎖は対応する増幅産物と特異的にハイブリダイズすることができる配列を少なくとも含む。
プローブ核酸９の長さは、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、６０塩基〜７０塩基、７０塩基〜８０塩基、８０塩基〜９０塩基、９０塩基〜１００塩基、例えば、１０塩基〜５０塩基であり得る。
プローブ核酸９の検出部８への固定は、限定されるものではないが、例えば、メルカプト基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基及びビオチンなど末端修飾基を介して行ってもよい。これらの官能基の選択及びプローブ核酸９の固定は、公知の手段により達成することが可能である。
更に、核酸反応具は標識物質を含んでもよい。標識物質は、増幅産物の増加に伴って変化する検出可能な信号、例えば、電気化学的信号又は光学的信号を生ずる物質である。
電気化学的信号を生ずる標識物質（以下、「第１の標識物質」と称する）は、上記の何れかの電極を備える核酸反応具に含まれることが好ましい。その場合、第１の標識物質によって生じる電気化学的信号を電極で検出し、その結果に基づいて標的核酸を検出又は定量することができる。
第１の標識物質は、例えば、二本鎖認識物質である。二本鎖認識物質は、例えば、増幅産物同士又はプローブ核酸と増幅産物とにより形成される二本鎖核酸に結合する物質である。二本鎖認識物質の例は、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター及びポリインターカレーターなどである。これらの二本鎖認識物質を、電気化学的に活性な金属錯体で更に修飾してもよい。そのような金属錯体は、例えばフェロセン、ビオロゲンなどである。
或いは、第１の標識物質は、例えば、酸化剤などであってもよい。その場合、その酸化還元電位が電気化学的信号となる。第１の標識物質として用いることができる酸化剤は、例えば、レドックスプローブなどである。
レドックスプローブは、例えば、金属錯体である。金属錯体は、例えば、中心金属としてルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、白金（Ｐｔ）、コバルト（Ｃｏ）、クロム（Ｃｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、ニッケル（Ｎｉ）、亜鉛（Ｚｎ）、銅（Ｃｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、鉄（Ｆｅ）又は銀（Ａｇ）などを含む錯体である。当該錯体は、例えば、アンミン錯体、シアノ錯体、ハロゲン錯体、ヒドロキシ錯体、シクロペンタジエニル錯体、フェナントロリン錯体及びビピリジン錯体などである。錯体は、例えば、フェリシアン化物イオン、フェロシアン化物イオン又はルテニウムヘキサアミン（ＲｕＨｅｘ）などであることが好ましい。レドックスプローブは、例えば、色素であってもよい。色素の例は、メチレンブルー、ナイルブルー又はクリスタルバイオレットなどを含む。
光学的信号を生ずる標識物質（以下、「第２の標識物質」と称する）は、上記の何れかの光学センサ又は検出窓を備える核酸反応具に含まれることが好ましい。その場合、第２の標識物質によって生じる光学的信号を光学センサ又は目視などで検出し、その結果に基づいて標的核酸を検出又は定量することができる。
第２の標識物質の例は、限定されるものではないが、例えば、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５０／５６０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６９、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ６Ｇ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、ＣＡＳＣＡＤＥ ＢＬＵＥ（登録商標）、ＦＡＭ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｇａｔｅｗａｙ ＦＷ、Ｇａｔｅｗａｙ ＲＶ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８−Ｘ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ５００、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ−Ｘ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｒｈｏｄｏｌ Ｇｒｅｅｎ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−Ｘ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５などを含む。
標識物質は、プローブ核酸９（含む場合）に結合していてもよいし、プライマーセット７に含まれる何れかのプライマーに結合されていてもよいし、核酸反応具の反応空間４内の何れかの面に遊離可能に固定されていてもよい。或いは、好ましくは、標識物質は核酸反応具に含まれず、反応空間に持ち込まれる反応液に含まれる。
標識物質がプローブ核酸９に結合している場合、標識物質の結合している部位は、プローブ核酸９の支持体２への結合部であってもよく、プローブ核酸９の非結合末端であってもよく、プローブ核酸９の結合部及び非結合末端の間であってもよい。標識物質のプローブ核酸９への結合方法は、標識物質の種類に応じて選択されればよく、核酸と標識物質とを結合するための何れの方法が選択されてもよい。
標識物質がプライマーに結合されている場合、標識物質部位は、プライマーの端或いはプライマーの配列の間に結合していてもよいし、プライマーの少なくとも一部の配列に被さるように結合していてもよい。標識物質のプライマーへの結合方法は、標識物質の種類に応じて選択されればよく、核酸と標識物質とを結合するための何れの方法が選択されてもよい。
標識物質が反応空間４内の何れかの面に固定されている場合、標識物質は、例えば、支持体の反応空間に接する面に固定されている。
また、支持体２又は被覆体３の反応空間４に接する面には、増幅反応に必要な他の試薬が遊離可能に固定されていてもよい。他の試薬は、例えば、塩、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などの基質、増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤、アニーリング特異性を増大するイオン、及び／又は増幅酵素の補因子となるイオンなどである。しかしながら、上記他の試薬は被覆体３に固定せず、反応液に含ませて反応空間４に持ち込む方が好ましい。その場合、プライマーが反応液流入時に拡散しにくく、より精度よく複数の標的核酸を検出することができる。特に、ｄＮＴＰはプライマーセットとともに隅部に固定せず、プライマーセットと別の箇所に固定するか、反応液に含ませて反応空間４に持ち込む方が好ましい。その場合、プライマーがより拡散しにくく、より精度よく標的核酸を検出することができる。
被覆体３は、更に、反応液、洗浄液、その他の試薬及び廃液を別々に貯蔵できる貯蔵部を含んでもよい。また、貯蔵部と反応空間４とをつなぐ流路を備えていてもよい。
核酸反応具１は、上記のような複数種類の標的核酸を検出できる反応空間４を複数備えていてもよい。
以上に説明した核酸反応具１によれば、プライマーセット７が隅部６ａに固定されている。そのため、反応空間４に反応液を持ち込む際に、プライマーセット７が反応液の流れに沿ってきわめて流されにくい状態となる。したがって、プライマーセット７の望まれない範囲への拡散が抑制される。その結果、あるプライマーセットによる増幅反応が、他のプライマーセットの成分により干渉されず、精度の高い検出又は定量が可能となる。加えて、上記の理由からプライマー固定領域５間の距離を従来よりも短くし、プライマー固定領域５及びプライマーセット７をより高密度に配置することができる。例えば、ある実施形態によれば隣り合うプライマー固定領域間の距離を４〜８ｍｍとすることができる。その結果、１つの核酸反応具１でより多くの種類の標的核酸を一度に検出又は定量することができる。
以上に説明した核酸反応具は、１種類の標的核酸を検出するために用いられてもよい。その場合、プライマー固定領域が１つ設けられ、そこに１種類のプライマーセットが固定されて用いられる。このような核酸反応具によってもプライマーセットが反応液によって拡散することが防止され、例えばプライマー固定領域に対応した検出部において、標的核酸を精度よく検出又は定量することができる。
（核酸検出定量方法）
以下に、第１の実施形態の核酸反応具を用いた核酸検出定量方法について説明する。図５は、核酸検出定量方法の一例を示す概略フローである。
この例における核酸検出定量方法は、試料中の第１〜第ｎの標的核酸を検出又は定量する方法である。当該方法は、以下の工程を含む。核酸反応具を用意すること（Ｓ１）、核酸反応具の反応空間に、試料及び増幅試薬を含む反応液を持ち込むこと（Ｓ２）。反応空間を増幅条件に維持し、増幅産物を得ること（Ｓ３）、増幅産物の増加に伴って変化する信号をプライマー固定領域ごとに検出すること（Ｓ４）、前記検出の結果に基づいて、第１〜第ｎの標的核酸を検出又は定量すること（Ｓ５）を含む。ここで、ｎは２以上の整数である。
以下に、信号が電気化学的信号である場合の核酸検出定量方法、信号が光学的信号である場合の核酸検出定量方法及び信号が濁度に相関する信号である場合の核酸検出定量方法を順に説明する。
（電気化学的信号を用いる核酸検出定量方法）
図６は、電気化学的信号を用いる核酸検出定量方法の一例を示す概略フローである。
核酸検出定量方法は、試料中の第１〜第ｎの標的核酸を検出する方法である。当該方法は、以下の工程を含む。少なくとも第１〜第ｎの電極を備える核酸反応具を用意すること（Ｓ１１）核酸反応具の反応空間に、試料及び増幅試薬を含む反応液を持ち込むこと（Ｓ１２）。反応空間を増幅条件に維持し、増幅産物を得ること（Ｓ１３）、増幅産物の増加に伴って変化する電気化学的信号を第１〜第ｎの電極で検出すること（Ｓ１４）、前記検出の結果に基づいて、第１〜第ｎの標的核酸を検出又は定量すること（Ｓ１５）を含む。ここで、ｎは２以上の整数である。
各工程について以下に詳細に説明する。
工程（Ｓ１１）において、電極を備える核酸反応具を用意する。
核酸反応具は、上記の何れかの電極を備える核酸反応具であればよい。電極は、少なくともｎ個、即ち、検出又は定量する標的核酸の数と同数又はそれ以上の数で核酸反応具に含まれる。
核酸反応具に固定された複数種類のプライマーセットは、試料に含まれる第１〜第ｎの標的核酸にそれぞれ含まれる第１〜第ｎの配列をそれぞれ増幅するための第１〜第ｎのプライマーセットである。第１〜第ｎのプライマーセットは、反応空間内に位置する立ち上がり面と背面とが交わる隅部に独立して配置された第１〜第ｎのプライマー固定領域にそれぞれ遊離可能に固定されている。
工程（Ｓ１２）において、核酸反応具の反応空間に、反応液を持ち込む。
反応空間に持ち込む反応液は、試料と、増幅試薬とを含む。
試料は、標的核酸の存在の有無又は量が検査されるべき物質である。言い換えれば、試料は、実施形態の核酸検出定量方法における分析対象である。例えば、試料は、血液、血清、血球、尿、便、汗、唾液、口腔内粘膜、喀痰、リンパ液、髄液、涙液、母乳、羊水、精液、組織、バイオプシー、培養細胞などの生体物質、又は環境から採取された環境物質、人工核酸或いはそれらの混合物などであってもよい。或いはそれらを材料として用いて調製された調製物であってもよい。例えば、上記の何れかを本実施形態に従う試料として使用するために、例えば、細切、ホモジナイズ及び抽出などの公知の何れかの前処理を行ってもよい。また例えば、上記の何れかを生体又は環境などから採取し、核酸検出に適切な状態に調製してもよい。例えば、上記の何れかから公知の何れかの手段によって核酸を抽出し、得られた核酸成分を含む液体を試料としてもよい。
第１〜第ｎの標的核酸は、実施形態の核酸検出定量方法において検出又は定量されるべき核酸である。第１〜第ｎの標的核酸は、例えば、互いに異なる塩基配列を有する核酸であることが好ましい。第１〜第ｎの標的核酸は、互いに異なる生物に由来する核酸であってもよいし、同じ生物に由来する核酸であってもよい。
第１〜第ｎの標的核酸は、第１〜第ｎの配列をそれぞれ含む。ここで１〜ｎのうちの何れか１つの値をｔとすると、第ｔの標的核酸は、第ｔの配列を含む。第ｔの配列は、第ｔの標的核酸の存在の指標となる配列であり、核酸検出定量方法において増幅される配列である。第ｔの配列は、第ｔの標的核酸の全長に亘る配列から選択される配列であり、例えば、第ｔの標的核酸に特異的な配列であることが好ましい。
第１〜第ｎの標的核酸は、一本鎖核酸である。試料中での第１〜第ｎの標的核酸の状態は、一本鎖、又はそれと相補的な核酸鎖とによって形成されている二本鎖である。
第１〜第ｎの標的核酸の長さは、例えば、５０塩基〜５００塩基であることが好ましく、１００塩基〜３００塩基であることがより好ましい。
第１〜第ｎの配列の長さは、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、６０塩基〜７０塩基、７０塩基〜８０塩基、８０塩基〜９０塩基又は９０塩基〜１００塩基であり、好ましくは１０塩基〜５０塩基である。
増幅試薬は、例えば、第１〜第ｎの配列の増幅するための増幅反応に必要な試薬である。増幅試薬は、少なくとも増幅酵素を含む。
増幅酵素は、例えば、標的核酸の種類、使用される増幅方法の種類、プライマーセットの種類及び逆転写反応の有無などに基づいて選択される。増幅酵素は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼなどである。増幅酵素が変温増幅方法用のものである場合、増幅酵素の例は、例えば、Ｃｓａ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｇｅｎｅ Ｔａｑ、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｖｅｒ．２、ＯｎｅＴａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＰｉｃｏＭａｘｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎを含む。増幅酵素が等温増幅方法用のものである場合、増幅酵素の例は、例えば、Ｂｓｔ、Ｂｓｔ２．０、Ｂｓｔ３．０、ＧｓｐＳＳＤ、ＧｓｐＭ、Ｔｉｎ、Ｂｓｍ、Ｃｓａ、９６−７、ｐｈｉ２９、ＯｍｉｎｉＡｍｐ（登録商標）、Ａａｃ、ＢｃａＢＥＳＴ（登録商標）、ＤｉｓｐｌａｃｅＡｃｅ（登録商標）、ＳＤ、ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅ（登録商標）、ＴＯＰＯＴＡＱ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍ２Ｇ、Ｔａｑ又はこれらの何れかの組み合わせなどであることが好ましい。
また、増幅試薬は、増幅酵素の他にマグネシウム、塩、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などの基質、増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤、アニーリング特異性を増大するイオン、及び／又は増幅酵素の補因子となるイオンなどを更に含んでもよい。逆転写を同時に行う場合には、増幅試薬は、更に逆転写酵素及びそれに必要な基質などを含んでいてもよい。
上記の何れかの成分が核酸反応具に、例えば反応空間の何れかの面に遊離可能に固定されて含まれている場合は、反応液にこれらの成分を含まなくてもよい。
以上に説明した反応液を反応空間に持ち込む。反応液は、例えば、被覆体に形成された開口から反応空間に持ち込まれてもよいし、被覆体に形成された反応液貯蔵部から流路を介して持ち込まれてもよい。
第１の標識物質から生じる電気化学的信号を用いる場合、反応空間に反応液が持ち込まれた後、反応空間は、第１の標識物質を含む。第１の標識物質は、上記の何れかのものを用いることができる。例えば、第１の標識物質は、予め反応液に含まれていてもよい。或いは、第１の標識物質は、反応液とは別に用意された検出試薬に含まれ、反応液とは別に反応空間に持ち込まれてもよい。検出試薬は、例えば、第１の標識物質の他に、溶媒、塩類又は界面活性剤などを含む。或いは、第１の標識物質は、例えば、反応液に含めずに核酸反応具の反応空間に接する面にあらかじめ遊離可能に固定しておいてもよい。
以上に説明した反応液に含まれる成分は、同時に反応空間に持ち込まれなくともよい。例えば、試料、増幅試薬、検出試薬（含む場合）を別々に反応空間に持ち込み、反応空間内で反応液が形成されてもよい。
工程（Ｓ１３）において、反応空間を増幅条件に維持する。
増幅条件は、例えば、使用される増幅方法の種類、プライマーセットの種類、標的核酸の種類及び／又は増幅酵素の種類などに基づいて選択される。増幅条件は、等温増幅反応条件又は変温増幅反応条件である。しかしながら、温度変化による反応液の対流が生じにくいことから等温増幅反応条件であることが好ましい。反応場を等温増幅条件に維持する場合、例えば、反応場の温度を２５℃〜７０℃に維持してもよい。温度を５５℃〜６５℃に維持することがより好ましい。等温増幅条件は、例えば、ＬＡＭＰ反応条件であることが好ましい。
このような温度条件は、例えば、核酸反応具とは別体の加熱冷却装置によって行うことができる。
反応場を増幅反応条件下に維持することによって、試料中に第１〜第ｎの標的核酸のうち何れかが存在する場合、それらに対応するプライマーセットによって標的核酸を鋳型とする増幅反応が起こり、増幅産物が生成する。増幅産物は、プライマーセットが固定された位置、即ちプライマー固定領域の付近で生成し、増加しその付近に留まる。例えば、１つの標的核酸分子から増幅した増幅産物は、プライマー固定領域から１〜４ｍｍの範囲内に留まる。
工程（Ｓ１４）において、増幅産物の増加に伴って変化する電気的化学信号を第１〜第ｎの電極ごとに検出する。電気的化学信号は、例えば、第１の標識物質から生じるものである。或いは、電極付近への核酸（負の電荷を有する）の増加によるものである。
信号が増幅産物の増加に伴って変化するとは、例えば、増幅産物の存在又は存在量の増加により信号が発生、消滅、特性の変化、増加又は減少することをいう。信号の変化は、例えば、電気化学的信号である場合、電流値、電位値、電気容量値、インピーダンス値などの増加、減少、消失、又は特定時間内での積算値の変化などである。電気化学的信号は、例えば、反応空間内存在する第１の標識物質によって生ずるものである。例えば、検出部近傍における増幅産物（負の電荷を有する）の増加によって、第１の標識物質が検出部に近づく、又は遠ざかることによって信号が変化する。或いは、検出部に固定されたプローブ核酸に増幅産物が結合して形成された二本鎖核酸に、二本鎖核酸認識物質である第１の標識物質が結合することによって信号が変化する。これらの信号が変化する原理は、例示であり、これらに限定されるものではない。
電気化学的信号は、電極ごとに検出される。即ち、信号の検出は、第１〜第ｎの電極全てにおいて個別に行われる。それによって第１〜第ｎの標的核酸のそれぞれに関する電気化学的信号を個別に得ることができる。
検出は、例えば、増幅反応のエンドポイントにおいて行われる。或いは、検出は経時的に行われてもよい。経時的とは、連続的であってもよいし、間欠的、即ち所望の時間間隔で複数の時点で検出することであってもよい。例えば、連続的な検出は、信号のモニタリングであってもよい。増幅反応の開始から所望の時間に亘り経時的に検出することにより、増幅産物が存在する場合には、増幅産物が存在しない場合に比べて大きな値の信号が得られる。或いは、より早い時点で信号の立ち上がりが観察される。
工程（Ｓ１５）において、第１〜第ｎ標的核酸を検出又は定量する。
１〜ｎのうち何れかの１つの値をｔとすると、第ｔの標的核酸が検出とは、例えば、試料における第ｔの標的核酸の有無を判定することである。第ｔの標的核酸の定量とは、例えば、試料における第ｔの標的核酸の存在量、濃度などを判定することである。
第１〜第ｎ標的核酸の検出及び／又は定量は、工程（Ｓ１４）における検出の結果に基づいて行われる。即ち、第ｔの標的核酸が検出及び／又は定量は、第ｔの電極における検出の結果に基づいて行われる。例えば、第ｔの標的核酸が検出及び／又は定量は、第ｔの電極から検出された電気的信号が予め定められた閾値を超えるまでに要する時間（立ち上がり時間）を計測し、得られた結果に基づいて行われる。或いは、第ｔの標的核酸について、核酸の存在量が既知である異なる複数の標準試料核酸を用意すること、標準試料核酸を用いて測定し、各核酸の存在量に対して得られた測定結果から検量線を作成すること、及び第ｔの標的核酸の測定結果と作成された検量線とを比較することによって、試料中の第ｔの標的核酸の存在量を算出することによって行われてもよい。
このような検出及び／又は定量を第１〜第ｎの標的核酸について行うことによって１つの核酸反応具で複数の標的核酸の検出及び／定量が可能である。
（光学的信号を用いる核酸検出定量方法）
図７は、光学的信号を用いる核酸検出定量方法の一例を示す概略フローである。
核酸検出定量方法は、試料中の第１〜第ｎの標的核酸を検出する方法である。当該方法は、以下の工程を含む。少なくとも第１〜第ｎの光学センサを備える核酸反応具を用意すること（Ｓ２１）。核酸反応具の反応空間に、試料及び増幅試薬を含む反応液を持ち込むこと（Ｓ２２）。反応空間を増幅条件に維持し、増幅産物を得ること（Ｓ２３）、増幅産物の増加に伴って変化する光学的信号を第１〜第ｎの光学センサで検出すること（Ｓ２４）、前記検出の結果に基づいて、第１〜第ｎの標的核酸を検出又は定量すること（Ｓ２５）を含む。ここで、ｎは２以上の整数である。
各工程について以下に詳細に説明する。
工程（Ｓ２１）において、光学センサを備える核酸反応具を用意する。
核酸反応具は、上記の何れかの光学センサを備える核酸反応具である。光学センサの数は、少なくともｎ個、即ち、検出又は定量する標的核酸の数と同数又はそれ以上の数配置されている。
核酸反応具に固定された複数種類のプライマーセットは、試料に含まれる第１〜第ｎの標的核酸にそれぞれ含まれる第１〜第ｎの配列をそれぞれ増幅するための第１〜第ｎのプライマーセットである。
工程（Ｓ２２）において、核酸反応具の反応空間に、反応液を持ち込む。
反応空間に持ち込む反応液は、上記の何れかの反応液と同じものを用いることができるが、この例における反応液は第１の標識物質を含まない。反応液の反応空間への持ち込みは、例えば、上記工程（Ｓ１２）と同じ方法により行うことができる。
光学的信号として第２の標識物質から生じる光学的信号を用いる場合、第２の標識物質が工程（Ｓ２２）を実行した後に反応空間に含まれればよい。例えば、第２の標識物質をプローブ核酸、プライマー、又は核酸反応具の反応空間に接する何れかの面に予め固定しておいてもよい。又は反応液に含ませることにより反応空間に持ち込んでもよい。
工程（Ｓ２３）は、上記工程（Ｓ１３）と同じ方法で行うことができる。
工程（Ｓ２４）において、増幅産物の増加に伴って変化する光学的信号を第１〜第ｎの光学センサごとに検出する。光学的信号は、例えば、第２の標識物質の存在によって生ずるもの、或いは反応液の増幅産物の増加による濁度である。この方法における信号の変化は、例えば、蛍光、化学発光の強度の増減、発生若しくは消失、波長の変化などであってもよい。或いは、濁度の上昇、又は反応液に光を照射した際の吸収、拡散、反射の増加であってもよい。例えば、第２の標識物質を結合したプローブ核酸に増幅産物が結合することにより、光学的信号が変化し得る。或いは、第２の標識物質を結合したプライマーが増幅産物の生成に使われることにより、光学的信号が変化し得る。これらの信号が変化する原理は例示であり、限定されるものではない。
光学的信号は、光学センサごとに検出する。即ち、信号の検出は、第１〜第ｎの光学センサ全てにおいて個別に行われる。それによって第１〜第ｎの標的核酸のそれぞれに関する光学的信号を得ることができる。検出は、例えば、上記工程（Ｓ１４）において説明した方法と同様に、増幅反応のエンドポイントで行われてもよいし経時的に行われてもよい。
工程（Ｓ２５）は、上記工程（Ｓ１５）と同様に、信号が閾値を超えるまでに要する時間（立ち上がり時間）を計測し、得られた結果に基づいて行われてもよいし検量線を作成し、検出結果を検量線と比較することによって行われてもよい。
光学的信号を用いる核酸検出定量方法は、第１〜第ｎの光学センサの代わりに、第１〜第ｎの検出窓を備える核酸反応具を用いて行ってもよい。この例においては、工程（Ｓ２４）の検出は、例えば、検出窓から核酸反応具とは別体の光学センサ又は目視により、第１〜第ｎの検出窓ごとに行われる。
以上に説明した核酸検出定量方法によれば、実施形態の核酸反応具を用いるため、反応液を持ち込む際のプライマーセットの拡散が抑制される。その結果、より精度の高い検出又は定量が可能である。加えて、プライマー固定領域を高密度に配置することができることから、１つの核酸反応具１でより多くの種類の標的核酸を検出又は定量することができる。
・第２の実施形態
（核酸反応具）
第２の実施形態に従う核酸反応具は、検出部を備えない支持体と、光透過性部材で構成された被覆体と、複数種類のプライマーセットとを備える。この例の核酸反応具の一例を図８に示す。図８の（ａ）は、核酸反応具２１の平面図である。図８の（ｂ）は、核酸反応具２１をＢ−Ｂ’に沿って切断したときの断面図である。核酸反応具２１は、支持体２２と被覆体２３と複数種類のプライマーセット２４とを備える。
支持体２２は、検出部を備えないこと以外は、上記の何れかの支持体と同じものを用いることができる。
被覆体２３は、上記の何れかの被覆体と同じ構造及び材料のものを用いることができる。しかしながら、被覆体２３は、光透過性の材料で構成されている。被覆体２３は、核酸反応具２１の外部から被覆体２３を通して反応空間２５に持ち込まれた反応液からの光学的信号を検出できる程度に透明又は半透明である。
複数種類のプライマーセット２４は、上述の何れかのものを用いることができる。複数種類のプライマーセット２４は、上述の何れかのものと同じように被覆体２３の隅部に固定されている。
以上に説明した核酸反応具２１は被覆体２３が光透過性部材であるため、検出部を備えなくとも光学的信号を検出することができる。
（核酸検出定量方法）
以下に、第２の実施形態の核酸反応具を用いた核酸検出定量方法について説明する。図９は、この例の核酸検出定量方法の一例を示す概略フローである。
核酸検出定量方法は、試料中の第１〜第ｎの標的核酸を検出する方法である。当該方法は、以下の工程を含む。被覆体が光透過性部材である核酸反応具を用意すること（Ｓ３１）。核酸反応具の反応空間に、試料及び増幅試薬を含む反応液を持ち込むこと（Ｓ３２）。反応空間を増幅条件に維持し、増幅産物を得ること（Ｓ３３）、増幅産物の増加に伴って変化する信号をプライマー固定領域ごとに検出すること（Ｓ３４）、前記検出の結果に基づいて、標的核酸を検出又は定量すること（Ｓ３５）を含む。ここで、ｎは２以上の整数である。
各工程について以下に詳細に説明する。
工程（Ｓ３１）では、被覆体が光透過性部材である核酸反応具を用意する。この核酸反応具は、第２の実施形態の核酸反応具である。被覆体は、第１〜第ｎのプライマー固定領域を備え、第１〜第ｎのプライマーセットがそれぞれ固定されている。第１〜第ｎのプライマーセットは、試料に含まれる第１〜第ｎの標的核酸にそれぞれ含まれる第１〜第ｎの配列をそれぞれ増幅するためのプライマーセットである。
工程（Ｓ３２）は、第２の実施形態の核酸反応具を用いて、上記工程（Ｓ２２）と同じ方法で行うことができる。
工程（Ｓ３３）は、上記工程（Ｓ２３）と同じ方法で行うことができる。
工程（Ｓ３４）において、増幅産物の増加に伴って変化する光学的信号を第１〜第ｎのプライマー固定領域ごとに検出する。光学的信号は、核酸反応具の外部から、被覆体を通して検出される。検出は、核酸反応具とは別体の光学センサ又は目視によって行うことができる。例えば、第１〜第ｎのプライマー固定領域ごとに、それぞれのプライマー固定領域から、例えば、４ｍｍ以内の範囲において得られる信号を個別に検出することによって、第１〜第ｎのプライマー固定領域ごとの信号を得ることができる。それによって、第１〜第ｎの標的核酸に関する信号が個別に得られる。検出は、例えば、上記工程（Ｓ２４）において説明した方法と同様に、増幅反応のエンドポイントで行われてもよいし経時的に行われてもよい。
工程（Ｓ３５）は、上記工程（Ｓ２５）と同じ方法で行うことができる。
以上に説明した方法によれば、検出部を備えなくとも複数種類の標的核酸を高い精度で検出又は定量することができる。
・第３の実施形態
第３実施形態の核酸反応具は、反応空間の形状が流路ではない。第３の実施形態の核酸反応具の一例を図１０に示す。図１０の（ａ）は、核酸反応具３１の平面図である。図１０の（ｂ）は、核酸反応具３１をＢ−Ｂ’に沿って切断したときの断面図である。
核酸反応具３１は、支持体３２と、被覆体３３と、複数種類のプライマーセット３４とを備える。支持体３２及びプライマーセット３４は、上記の何れかと同じものを用いることができる。
この例における被覆体３３の溝部３３ａは、間隔を置いて複数設けられている。最も外側に位置する溝部３３ａの外側の立ち上がり面３５ａは支持体３２の上面３２ａと当接している。しかしながら、他の立ち上がり面（例えば、立ち上がり面３５ｂ）は、その下端が支持体３２の上面３２ａに当接していない。従って、反応空間３５は複数の流路が下側でつながって一体となった形状である。被覆体３３の材料は、上記の何れかのものと同じであってよい。
例えば、被覆体３３の反応空間３５に接する何れかの面には、反応液を送液するための反応液の流入口３３ｂ及び反応液を排出する流出口３３ｃが開口されている。
プライマーセット３４は、例えば、反応空間３５内の、被覆体３３の立ち上がり面３５ｂと背面３５ｃとが交差する隅部３６に固定されている。プライマーセット３４は、他の立ち上がり面と背面とが交差する隅角に固定されていてもよい。
核酸反応具３１は、プライマー固定領域３７に対応する位置に上記の何れかと同様の検出部及び／又はプローブ核酸を備えていてもよい（図示せず）。
以上のような核酸反応具によっても、プライマーセット３４が隅部３６に固定されているため、プライマーセット３４が反応液の流れに沿って流されにくく、望まれない範囲への拡散が抑制される。その結果、より精度の高い検出又は定量が可能となる。
或いは、被覆体は、反応空間が一つの直方体の形状となるように１つの溝部を有してもよい。その場合、プライマーセットは、例えば、反応空間の周縁の立ち上がり面及び背面が交差する隅部に固定される。
・核酸検出定量キット
実施形態によれば、核酸検出定量キットが提供される。核酸定量検出キットは、上記の何れかの核酸反応具と増幅試薬を含む。増幅試薬は、核酸反応具の構成に応じて選択される上記の何れかの増幅試薬を用いることができる。
核酸反応具が検出試薬を含まない場合、キットは上記の何れかの検出試薬を更に含んでもよい。検出試薬の種類は、核酸反応具の構成に応じて選択される。例えば、核酸反応具が電極を備える場合、キットは、第１の標識物質を含む検出試薬を含んでもよい。核酸反応具が光学センサ又は検出窓を備える場合、キットは、第２の標識物質を含む検出試薬を含んでもよい。核酸反応具が検出部を備えず、被覆体が光透過性部材で構成される場合、キットは、第２の標識物質を含む検出試薬を含んでもよい。
キットは、洗浄液を含んでもよい。洗浄液は、反応空間を洗浄するための液体である。洗浄液は、例えば、蒸留水、滅菌水、緩衝液、又は界面活性剤溶液などである。
キットは、各構成成分が混合されて一つの容器に収容されていてもよい。又は各構成成分が別の容器に収容されていてもよいし、何れかが組み合わされて混合されて同じ容器に収容されていてもよい。
・核酸反応カセット
実施形態によれば、核酸反応カセットが提供される。図１１は、核酸反応カセットの一例を示す概略図である。核酸反応カセット４０は、核酸反応具４１を含み、核酸反応具４１を用いて標的核酸の増幅反応と検出又は定量を行うことができる。
核酸反応カセット４０は、核酸反応具４１、第１のカセット４２、第２のカセット４３を備える。核酸反応具４１は上述した何れかの核酸反応具であり、支持体４４と被覆体４５及び複数種類のプライマーセット（図示せず）を備える。
第１のカセット４２、第２のカセット４３は、核酸反応具４１を挟んで支持する外枠である。第１のカセット４２及び第２のカセット４３は、例えば硬質材料で構成される。この例では、支持体４４、被覆体４５、第１のカセット４２、第２のカセット４３は、それぞれ別体として構成されている。しかしながら、被覆体４５は、第２のカセット４３と一体で構成されていてもよい。或いは、被覆体４５、第１のカセット４２、第２のカセット４３が一体の容器型に構成されていてもよい。その場合、その容器に支持体４４を差し込むことによって核酸反応具４１が形成されてもよい。
核酸反応カセット４０は、例えば、装置に装着されて使用されてもよい。装置は、例えば、核酸反応具４１の反応空間に反応液を送り込み、反応空間を加熱及び冷却し、反応空間で生成した増幅産物の増加に伴って生じる信号を検出し、標的核酸を検出又は定量することができる装置である。
図１２は、核酸反応カセットの更なる例を示す分解斜視図である。核酸反応カセット１００は、被覆体１０１、上プレート１０２、支持体１０３を備える。図１３は、図１２に示す核酸反応カセット１００を上プレート１０２側（以下、表面と称する。図中（ａ））及び支持体１０３側（以下、裏面と称する。図中（ｂ））の２方向から見た斜視図である。
被覆体１０１は、反応液シリンジ１０４、洗浄シリンジ１０５、検出試薬シリンジ１０６、送液流路１０７、反応空間１０８、廃液流路１０９、廃液シリンジ１１０を備える。被覆体１０１は、表面と裏面を備える薄型の板状である。被覆体１０１には、反応液シリンジ１０４、洗浄シリンジ１０５、検出試薬シリンジ１０６、送液流路１０７、反応空間１０８、廃液流路１０９、廃液シリンジ１１０が一体として構成されている。
反応液シリンジ１０４は、反応液を貯めることができる。反応液は、少なくとも試料及び増幅試薬を含む上記の何れかの反応液である。反応液シリンジ１０４は、表面に開口部を備える。開口部は、反応液シリンジ１０４内に反応液を装填するための穴である。反応液シリンジ１０４の裏面は、変形可能な薄膜部を備える容器形状である。薄膜部は、外部からの加圧により容易に潰すことが可能である。反応液シリンジ１０４は、例えば初めは潰された状態であり、反応液が装填されることで薄膜部側が膨張する。
洗浄シリンジ１０５は、反応空間１０８の洗浄を行うための洗浄液を貯めることができる。洗浄液は、例えば、上記の何れかの洗浄液である。洗浄シリンジ１０５は、反応液シリンジ１０４と同様の構成を有する。
検出試薬シリンジ１０６は、検出試薬を貯めることができる。検出試薬は、例えば上記の何れかの検出試薬であり、標識物質などを含む。検出試薬シリンジ１０６は、反応液シリンジ１０４と同様の構成を有する。
送液流路１０７は、反応液シリンジ１０４、洗浄シリンジ１０５、検出試薬シリンジ１０６が貯める液体を反応空間１０８に送液するための流路である。送液流路１０７は、各シリンジに対応して３つに分岐し、各シリンジと反応空間１０８とを繋ぐ。また、反応液シリンジ１０４、洗浄シリンジ１０５、検出試薬シリンジ１０６それぞれと送液流路１０７の接続部には、逆止弁１１１ａ、１１１ｂ、１１１ｃがそれぞれ設けられている。各逆止弁はそれぞれ、送液流路１０７から対応するシリンジへの液体の流入、及び各シリンジからの送液時以外の液体の流出を防止する。
反応空間１０８は、送液流路１０７及び廃液流路１０９と繋がれている。反応空間１０８では、標的核酸の増幅を行うことができる。必要な場合、反応空間１０８で核酸抽出を行ってもよい。
廃液流路１０９は、反応空間１０８と廃液シリンジ１１０とを繋ぐ。廃液流路１０９は、廃液を反応空間１０８から廃液シリンジ１１０に送るための流路である。
廃液シリンジ１１０は、反応空間１０８から流出する廃液を貯めることができる。廃液シリンジ１１０は、反応液シリンジ１０４と同様の薄膜部を有する。廃液シリンジ１１０は、廃液が流入する前には、薄膜部が予め潰された状態である。
上プレート１０２は、注入口１１２ａ、１１２ｂ、１１２ｃ、検出口１１４、位置決め穴１１５を備える。上プレート１０２は、薄型形状であり、プラスチック、ガラス、金属等の硬質材料で構成されている。上プレート１０２は、上記被覆体１０１の表面と対向して密着する。それにより、上プレート１０２は、被覆体１０１の各シリンジ及び流路を密封する。
注入口１１２ａ、１１２ｂ、１１２ｃはそれぞれ、反応液シリンジ１０４、洗浄シリンジ１０５、検出試薬シリンジ１０６に液体を装填するための開口である。各注入口は、対応するシリンジに対向する位置に設けられている。各注入口は、液体がシリンジに装填された後、シール１１３を用いて封をされる。
検出口１１４は、被覆体１０１と対向することなく、支持体１０３に設けられたパッド部１２１と対向する。検出口１１４は、後述する基板１２４を挿入するための開口である。
位置決め穴１１５は、核酸反応カセット１００を後述する核酸検出定量装置２００に装着する際の位置決めに用いられる開口である。
支持体１０３は、上記の何れかの支持体と同じ材料で構成され、薄い板形状である。支持体１０３は、反応液シリンジ用穴１１６、洗浄シリンジ用穴１１７、検出試薬シリンジ用穴１１８、廃液用窪み１１９、複数の検出部１２０、温調穴１２２を備える。支持体１０３は、被覆体１０１の裏面と対向して密着する。それにより支持体１０３及び上プレート１０２で被覆体１０１を密封する。
反応液シリンジ用穴１１６、洗浄シリンジ用穴１１７及び検出試薬シリンジ用穴１１８はそれぞれ、反応液シリンジ１０４、洗浄シリンジ１０５、検出試薬シリンジ１０６と対向する。反応液シリンジ用穴１１６、洗浄シリンジ用穴１１７及び検出試薬シリンジ用穴１１８は、各シリンジに液体が貯められた場合に、支持体１０３が、各シリンジの薄膜部の膨張を妨げることを防止する。
廃液用窪み１１９は、廃液シリンジ１１０と対向する。廃液用窪み１１９は、廃液シリンジ１１０に廃液が貯められた場合に、支持体１０３が、廃液シリンジ１１０の薄膜部の膨張を妨げることを防止する。
複数の検出部１２０は、第１の実施形態の核酸反応具の説明における何れかの検出部と同様の構成を有する。複数の検出部１２０は、被覆体１０１の反応空間１０８と対向する。
温調穴１２２は、支持体１０３の裏面の検出部１２０に対応する位置に設けられている。温調穴１２２は、検出部１２０に対して直接的に高精度の加熱冷却を行うための穴である。
支持体１０３は、上プレート１０２の検出口１１４と対向する表面にパッド部１２１を備える。パッド部１２１は、複数の検出部１２０それぞれと電気的に接続された複数のパッドを含む。パッドから検出部１２０で得られた信号を取り出すことができる。
被覆体１０１、上プレート１０２及び支持体１０３は、上プレート１０２及び支持体１０３により被覆体１０１を挟んで支持するように組み合わされる。核酸反応カセット１００は、被覆体１０１の密閉した密封用器である。したがって、核酸反応カセット１００は、反応液が外部への流出を防止できる。なお、上プレート１０２及び支持体１０３の接合は、例えば、接着、溶接、ネジ止等、様々な方法が使用可能であり、これらに限定されるものではない。
図１４は、核酸反応カセット１００を使用する核酸検出定量装置２００の一例を示す斜視図である。なお、本実施形態では、核酸反応カセット１００と核酸検出定量装置２００を別構成として説明するが、核酸検出定量装置２００が核酸反応カセット１００を含むものとしてもよい。
核酸検出定量装置２００は、カセットスタンド１２３、基板１２４、位置決めピン１２５、基板移動機構１２６、加熱冷却装置１２７、加熱冷却装置移動機構１２８、反応液送液ロッド１２９、洗浄送液ロッド１３０、検出試薬送液ロッド１３１、ロッド移動機構１３２、バネ１３３ａ、１３３ｂ、１３３ｃを備える。
カセットスタンド１２３は、核酸検出定量装置２００の中央近傍に設けられている。カセットスタンド１２３は、核酸検出定量装置２００に核酸反応カセット１００を装着するための部材である。例えば、カセットスタンド１２３は、核酸反応カセット１００を抜挿することができ、核酸反応カセット１００を支持するスロットである。
基板１２４は、複数の検出部１２０で検出した各信号をパッド部１２１から取得するための基板である。基板１２４は、検出口１１４と対向し、検出口１１４に対して抜挿可能である。
基板移動機構１２６は、基板１２４、位置決めピン１２５を搭載する。基板移動機構１２６は、基板１２４及び位置決めピン１２５を同時に前後方向に移動する。なお、本実施形態では、核酸反応カセット１００に対して近づく方向、離れる方向をそれぞれ前方向、後方向とする。基板移動機構１２６により、基板１２４と位置決めピン１２５を核酸反応カセット１００の裏面に嵌め込む。それによって、基板１２４は支持体１０３のパッド部１２１と接触し、位置決めピン１２５は位置決め穴１１５に差し込まれる。
加熱冷却装置１２７は、カセットスタンド１２３を挟んで基板移動機構１２６と逆側に設けられている。加熱冷却装置１２７の加熱冷却部１２７ａは、支持体１０３に設けられた温調穴１２２と対向する。加熱冷却部１２７ａは、温調穴１２２に対して抜挿可能である。
加熱冷却装置移動機構１２８は、加熱冷却装置１２７を搭載し、加熱冷却装置１２７を前後方向に移動する。加熱冷却装置移動機構１２８は、温調穴１２２に加熱冷却装置１２７の加熱冷却部１２７ａを嵌め込む。その結果、加熱冷却部１２７ａは、検出部１２０と接触する。加熱冷却装置１２７は、検出部１２０及び反応空間１０８を最適な温度に制御する。
反応液送液ロッド１２９、洗浄送液ロッド１３０、検出試薬送液ロッド１３１、ロッド移動機構１３２は、カセットスタンド１２３を挟んで基板移動機構１２６と逆側に設けられている。ロッド移動機構１３２は、反応液送液ロッド１２９、洗浄送液ロッド１３０、検出試薬送液ロッド１３１を搭載する。ロッド移動機構１３２は、核酸反応カセット１００の裏面に対して反応液送液ロッド１２９、洗浄送液ロッド１３０、検出試薬送液ロッド１３１を押し当てる。
各ロッドとロッド移動機構１３２との間にバネ１３３ａ、１３３ｂ、１３３ｃがそれぞれ設けられている。バネ１３３ａ、１３３ｂ、１３３ｃは、ロッド移動機構１３２の移動方向に伸縮可能な弾性を備え、各ロッドと核酸反応カセット１００の接触により前後方向に縮む。なお、バネに代えて、他の弾性体又は前後方向に縮む機械的な構成を用いてもよい。バネ１３３ｃは設けられなくてもよい。
反応液送液ロッド１２９は、反応液シリンジ用穴１１６と対向する。反応液送液ロッド１２９は、核酸反応カセット１００と対向する先端部分に面を備える。この面は、反応液シリンジ用穴１１６の形状と略同じ形状である。反応液送液ロッド１２９は、反応液シリンジ用穴１１６に挿入される。それによって反応液シリンジ１０４の薄膜部を加圧し、薄膜部を完全に潰す。その結果、反応液シリンジ１０４内の反応液を送液流路１０７に送り出すことができる。
洗浄送液ロッド１３０は、洗浄シリンジ用穴１１７と対向する。洗浄送液ロッド１３０は、核酸反応カセット１００と対向する先端部分に面を備える。この面は、洗浄シリンジ用穴１１７の形状と略同じ形状である。洗浄送液ロッド１３０は、洗浄シリンジ用穴１１７に挿入される。それによって、洗浄シリンジ１０５の薄膜部に加圧し、洗薄膜部を完全に潰す。その結果、洗浄シリンジ１０５内の洗浄液を送液流路１０７に全て送り出すことができる。
検出試薬送液ロッド１３１は、検出試薬シリンジ用穴１１８と対向する。検出試薬送液ロッド１３１は、核酸反応カセット１００と対向する先端部分に面を備える。この面は、洗浄シリンジ用穴１１７の形状と略同じ形状である。検出試薬送液ロッド１３１は、検出試薬シリンジ用穴１１８に挿入される。それによって、検出試薬シリンジ１０６の薄膜部に加圧し、薄膜部を完全に潰す。その結果、検出試薬シリンジ１０６内の検出試薬を送液流路１０７に全て送り出すことができる。
反応液送液ロッド１２９、洗浄送液ロッド１３０、検出試薬送液ロッド１３１は長さが異なるため、全てのロッドを徐々に前進させることによって、反応液送液ロッド１２９、洗浄送液ロッド１３０、検出試薬送液ロッド１３１の順に対応するシリンジの薄膜部を加圧することができる。
次に、本実施形態に係る核酸反応カセット１００及び核酸検出定量装置２００の使用手順及びこれらを用いた核酸検出又は定量の手順の一例について説明する。なお、下記で説明する手順は一例であり、適宜入れ替えることは可能である。
はじめに、核酸反応カセット１００の準備手順の一例について説明する。核酸反応カセット１００の反応液シリンジ１０４に反応液を、洗浄シリンジ１０５に洗浄液を、検出試薬シリンジ１０６に検出試薬を、注入口１１２ａ、１１２ｂ、１１２ｃを介してそれぞれ装填する。注入口１１２をキャップシール７０１３で封をする。核酸反応カセット１００を、各シリンジが上側であって、上プレート１０２が基板１２４と対向するような方向でカセットスタンド１２３に差し込む。
次に、基板移動機構１２６によって、基板１２４、位置決めピン１２５を核酸反応カセット１００に向けて前進させる。そして、基板１２４をパッド部１２１と接触させ、同時に、位置決めピン１２５を位置決め穴１１５に差し込む。
次に、ロッド移動機構１３２によって、反応液送液ロッド１２９、洗浄送液ロッド１３０、検出試薬送液ロッド１３１を核酸反応カセット１００に向けて前進させる。そして、反応液シリンジ用穴１１６を通して反応液送液ロッド１２９を反応液シリンジ１０４に押し当てる。それによって全ての反応液を、送液流路１０７を経由して反応空間１０８に送り出す。反応空間１０８内の空気は反応液の送液により押し出され、廃液流路１０９を経由して廃液シリンジ１１０に流入する。なお、この時、洗浄送液ロッド１３０の先端部分、検出試薬送液ロッド１３１の先端部分はそれぞれ、洗浄シリンジ１０５、検出試薬シリンジ１０６と接していない。
次に、加熱冷却装置移動機構１２８によって加熱冷却装置１２７を核酸反応カセット１００に向けて前進させる。そして、温調穴１２２を通して加熱冷却部１２７ａを検出部１２０と接触させる。次に、加熱冷却装置１２７を作動させて反応空間１０８を加熱する。それによって、反応空間１０８内で核酸増幅が行われ、何れかの標的核酸が反応液中に存在する場合、その標的核酸が増幅される。検出部１２０にプローブ核酸が固定されている場合、増幅産物のプローブ核酸へのハイブリタイゼーションが行われる。
次に、ロッド移動機構１３２によって、各ロッドを核酸反応カセット１００に向けて前進させる。そして、洗浄シリンジ用穴１１７を通して洗浄送液ロッド１３０を洗浄シリンジ１０５に押し当てる。それによって、洗浄液は全て、送液流路１０７を経由して反応空間１０８に送り出される。そして、洗浄液は、反応空間１０８を洗浄する。このとき検出試薬送液ロッド１３１の先端部分は、検出試薬シリンジ１０６と接していない。洗浄剤が反応空間１０８に送液されると、反応空間１０８内の反応液は、廃液流路１０９を通して全て廃液シリンジ１１０に流入する。なお、洗浄工程は行わなくともよい。検出部１２０にプローブ核酸が固定される場合は洗浄工程を行ってもよい。
次に、ロッド移動機構１３２によって、各ロッドを核酸反応カセット１００に向けて前進させる。それによって、全ての検出試薬が、送液流路１０７を経由して反応空間１０８に送り出される。検出試薬の流入によって、反応空間１０８内の洗浄液は、廃液流路１０９を通して全て廃液シリンジ１１０に流入する。なお、検出試薬を使わない場合、又は反応液に検出試薬が含まれる場合、この工程は省いてもよい。
その後、検出部１２０で検出される増幅産物に伴う信号を、基板１２４を用いてパッド部１２１から取り出す。取り出された信号の情報に基づいて、上記の何れかの方法を用いて標的核酸を検出又は定量する。検出及び／又は定量は、例えば、基板１２４と電気的に接続されたコンピュータによって自動的に行ってもよい。また、例えば、コンピュータに内蔵される制御部によって、上記の全て又は一部の手順を制御し、自動的に行ってもよい。
洗浄を行わない場合、核酸反応カセット１００及び核酸検出定量装置２００は、洗浄シリンジ１０５、逆止弁１１１ｂ、注入口１１２ｂ、洗浄シリンジ用穴１１７、洗浄送液ロッド１３０、バネ１３３ｂを備えなくともよい。
反応液に検出試薬を含ませる場合、核酸反応カセット１００及び核酸検出定量装置２００は、検出試薬シリンジ１０６、逆止弁１１１ｃ、注入口１１２ｃ、検出試薬シリンジ用穴１１８、検出試薬送液ロッド１３１、バネ１３３ｃを備えなくともよい。
本実施形態によれば、核酸反応カセット１００及びこれを用いる核酸検出定量装置２００により、複数の標的核酸の増幅及び検出又は定量を１つの核酸反応具でより精度よく行うことができる。
［例］
［例１］（実施例）
・支持体及び被覆体の作製
Ｐｙｒｅｘ（登録商標）（ｄ＝０．８ｍｍ）のガラス表面にチタン（５００ｎｍ）及び金（２０００ｎｍ）の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、レジストＡＺＰ４６２０を用いてアレイ状の金電極（φ＝２００μｍ）（作用極）を形成した。作用極として、Ａ１〜Ａ６０の６０個の電極を、２つずつ間隔（２ｍｍ）をあけて配置されるように形成した。作用極２つごとにそれらに対応する参照極と対極とを形成した。また、シリコーン製の板にエッチングにより流路を形成し、被覆体を製造した。
・プライマーの固定
被覆体を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（８．０）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液に浸して軽くすすいだ後、風乾した。続いて、ＬＡＭＰプライマーミックス０．２５μＬを用意した。プライマーミックスは、ＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマー：１．６μＭ、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマー：０．２μＭ、ＦＩＴＣ−Ｌｂ：０．８μＭを含む。ＬＡＭＰプライマーミックスに含まれる各プライマーの配列を表１に示す。
Figure 0006878337
プライマーミックスを被覆体の流路の隅部にスポッティングした。図１５に、支持体の作用極の位置と、被覆体のプライマーセットをスポッティングした位置との関係を表す模式図を示す。図１５は、支持体と被覆体とを接着して核酸反応具を形成した状態を示す。スポッティングは、便宜上、蛇行する流路の１列につき１箇所（計５箇所）行った。スポッティングしたプライマーセットの位置は、作用極Ａ５及びＡ６、Ａ１９及びＡ２０、Ａ２９及びＡ３０、Ａ３９及びＡ４０に対応する。
次に、被覆体を室温に放置し、プライマーミックスを自然乾燥し、固定した。図１６に固定したプライマーミックスの写真を示す。（ａ）は被覆体全体を映した写真である。（ｂ）は固定された１つプライマーミックスを映した写真である。（ｃ）は、（ｂ）のプライマーミックスを更に拡大した写真である。青色の部分は、プライマーミックスを見やすくするために混合した色素である。これらの写真から、プライマーミックスが被覆体の流路の角部に固定されていることが確認された。
支持体及び被覆体を流路が密閉された反応空間を形成するように圧着し、核酸反応具を形成した。
・ＬＡＭＰ反応
パルボウイルスの人工配列（配列番号１）を含む反応液を用意した。パルボウイルスの人工配列の塩基配列を表２に示す。また、反応液の組成を表３に示す。
Figure 0006878337
Figure 0006878337
反応液を核酸反応具の反応空間に持ち込んだ。反応液を持ち込んだ後の被覆体の写真を図１７に示す。写真は、蛍光画像解析装置で撮影したものである。この写真から、反応液注入時、プライマーセットはほとんど液の流れ（図中矢印）に沿って溶解及び／又は拡散していないことが確認された。
反応液を６７℃の等温で加温し、増幅反応を開始した。増幅反応と並行して、電気的信号をＬＳＶ法で測定した（掃引速度：０．５Ｖ／ｓ）。測定は、経時的に１時間行った。
結果を図１８に示す。図１８は、各作用極で得られた電流値の１分ごとの信号の強度をエクセル表に入力し、時間に対する信号増加の変化値が１ナノアンペア／分を超えるセルを網掛けしたものである。変化値が１ナノアンペア／分を超えた場合、その作用極で信号の立ち上がりがある、即ち、その作用極付近で増幅産物が生成されたことを意味する。
電流値の立ち上がりは、プライマーミックスを固定した作用極又はその片側の隣の作用極において検出されただけであった。したがって、プライマーミックスの反応液への拡散は、片側２ｍｍ以内に留まることが明らかとなった。
［例２］（比較例）
プライマーミックスを、被覆体ではなく反応空間の支持体の表面に固定して例１と同様の実験を行った。プライマーミックスは、電極Ａ２及びＡ３、Ａ９及びＡ１０、Ａ１５及びＡ１６、Ａ２２及びＡ２３、Ａ２６及びＡ２７、Ａ３３及びＡ３４、Ａ３５及びＡ３６、Ａ４２及びＡ４３、Ａ５０及びＡ５１、Ａ５７及びＡ５８に対応する位置に固定した。結果を図１９に示す。全てのプライマーミックスにおいて、反応液流入の流れに沿って、電流値の立ち上がりが観察された電極がずれていた。また、電流値の立ち上がりが観察された電極が広範囲に広がっていた。
例１及び例２の結果から、プライマーセットを被覆体の隅部に固定することによって、プライマーセットが反応液の流れに沿って溶解、拡散しにくいことが分かった。したがって、実施形態の核酸反応具によれば、より精度よく複数の標的核酸を検出又は定量できることが示唆された。
［例３］（実施例）
・支持体及び被覆体の作製
Ｐｙｒｅｘ（登録商標）（ｄ＝０．８ｍｍ）のガラスを支持体として用いた。シリコーン製の板に流路を形成し、被覆体を製造した。
・プライマーの固定
シリコーン製の流路を有する被覆体を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（８．０）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０に浸して軽くすすいだ後、風乾した。続いて、ＬＡＭＰプライマーミックス０．２５μＬを用意した。ＬＡＭＰプライマーミックスは、ＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマー：１．６μＭ、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマー：０．２μＭ、ＦＩＴＣ−Ｌｂ：０．８μＭ、０．００５％キシレンシアノールを含む。ＬＡＭＰプライマーミックスの各プライマーの配列は、例１に用いたものと同じである。
例１と同様に、プライマーミックスを被覆体の流路の隅部に固定し、支持体及び被覆体を流路が密閉された反応空間を形成するように圧着し、核酸反応具を形成した。
・ＬＡＭＰ反応
パルボウイルスの人工配列（配列番号１）を含む反応液を用意した。反応液は、例１の反応液のＲｕＨｅｘの代わりに、蛍光色素ＥｖａＧｒｅｅｎを含む。
核酸反応具の反応空間に反応液を持ち込んだ。反応液を持ち込んだ後の被覆体の写真を図２０の上段に示す。この写真から、反応液注入時、プライマーセットはほとんど液の流れ（図中矢印）に沿って溶解及び／又は拡散していないことが確認された。
反応液を６７℃の等温で加温し、増幅反応を開始した。増幅後に、反応空間を蛍光画像解析装置で撮影した。
結果を図２０の下段に示す。増幅反応の進行に伴って生成する増幅産物由来の蛍光は、プライマーを固定した箇所の付近の左右均等な領域から得られた。したがって、固定したプライマーは反応液の流れに沿って移動せず、局所的な領域で拡散し、その範囲で増幅反応が進行していることが示された。
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
以下に、本出願の当初の特許請求の範囲に記載した発明を付記する。
［１］
支持体と、
少なくとも一方の面に形成された溝部を有し、前記支持体の一方の面に前記溝部側の一方の面が接して前記支持体の一方の面と前記溝部とで囲まれた反応空間を形成し、かつ前記溝部は前記反応空間の内面に互いに対向する立ち上がり面と、前記立ち上がり面の一端を繋ぐ背面と、前記反応空間内の前記立ち上がり面と前記背面とが交差する隅部と、前記隅部に存在するプライマー固定領域とを有する被覆体と、
前記プライマー固定領域に固定されたプライマーセットと、
を備える核酸反応具。
［２］
前記プライマーセットを複数種類備え、
前記プライマー固定領域を複数備え、
前記複数種類のプライマーセットは、前記複数のプライマー固定領域に、種類ごとに遊離可能に固定されている［１］に記載の核酸反応具。
［３］
前記複数のプライマー固定領域は、前記溝部に互いに１ｍｍ以上８ｍｍ以下離れて配置されている［２］に記載の核酸反応具。
［４］
前記被覆体は疎水性樹脂から形成されている［１］〜［３］の何れか１つに記載の核酸反応具。
［５］
前記疎水性樹脂がシリコーン樹脂である［４］に記載の核酸反応具。
［６］
前記反応空間が流路である［１］〜［５］の何れか１つに記載の核酸反応具。
［７］
前記支持体が前記プライマー固定領域に対応して検出部を備える［１］〜［６］の何れか１つに記載の核酸反応具。
［８］
前記検出部が電極を備える［７］に記載の核酸反応具。
［９］
前記検出部が光学センサを備える［７］に記載の核酸反応具。
［１０］
［１］〜［９］の何れか１つに記載の核酸反応具と、増幅試薬とを含む核酸検出定量キット。
［１１］
標識物質を含む検出試薬を更に含む［１０］に記載のキット。
［１２］
試料中の第１〜第ｎの標的核酸を検出又は定量する方法であって、
ｎは２以上の整数であり、
（Ｓ１）核酸反応具を用意すること、
（ここで、前記核酸反応具は、
支持体と、
少なくとも一方の面に形成された溝部を有し、前記支持体の一方の面に前記溝部側の一方の面が接して前記支持体の一方の面と前記溝部とで囲まれた反応空間を形成し、かつ前記溝部は前記反応空間の内面に互いに対向する立ち上がり面と、前記立ち上がり面の一端を繋ぐ背面と、前記反応空間内の前記立ち上がり面と前記背面とが交差する隅部と、前記隅部に存在する第１〜第ｎのプライマー固定領域とを有する被覆体と、
前記第１〜第ｎのプライマー固定領域にそれぞれ固定された第１〜第ｎのプライマーセットと
を備え、
前記第１〜第ｎのプライマーセットはそれぞれ、前記第１〜第ｎの標的核酸にそれぞれ含まれる第１〜第ｎの配列をそれぞれ増幅するためのプライマーセットである）、
（Ｓ２）前記核酸反応具の前記反応空間に、試料及び増幅試薬を含む反応液を持ち込むこと、
（Ｓ３）前記反応空間を増幅条件に維持し、増幅産物を得ること、
（Ｓ４）前記増幅産物の増加に伴って変化する信号を前記第１〜第ｎのプライマー固定領域ごとに検出すること、
（Ｓ５）前記検出の結果に基づいて、第１〜第ｎの標的核酸を検出又は定量すること
を含む核酸検出定量方法。
１…核酸反応具 ２…支持体 ２ａ…面 ３…被覆体 ３ａ…溝部 ４…反応空間
４ａ、４ｂ…立ち上がり面 ４ｃ…背面 ５、５ａ、５ｂ…プライマー固定領域
６ａ、６ｂ…隅部 ７、７ａ…プライマーセット ８、８ａ…検出部
１１…核酸反応具 １２…支持体 １３…被覆体 １４…反応空間
１５…プライマー固定領域 １６…電極
２１…核酸反応具 ２２…支持体 ２３…被覆体 ２４…プライマーセット
２５…反応空間
３１…核酸反応具 ３２…支持体 ３３…被覆体 ３３ａ…溝部
３４…プライマーセット ３５…反応空間 ３５ａ、３５ｂ…立ち上がり面
３５ｃ…背面 ３６…隅部 ３７…プライマー固定領域
４１…核酸反応具 ４４…支持体 ４５…被覆体
１０３…支持体 １０１…被覆体 １０８…反応空間 １２０…検出部

Claims (16)

  1. 支持体と、
    少なくとも一方の面に形成された溝部を有し、前記支持体の一方の面に前記溝部側の一方の面が接して前記支持体の一方の面と前記溝部とで囲まれた反応空間を形成し、かつ前記溝部は前記反応空間の内面に互いに対向する立ち上がり面と、前記立ち上がり面の一端を繋ぐ背面と、前記反応空間内の前記立ち上がり面と前記背面とが交差する隅部と、前記隅部に配置されたプライマー固定領域とを有する被覆体と、
    前記プライマー固定領域に固定されたプライマーセットと、
    を備える核酸反応具。
  2. 前記プライマーセットを複数種類備え、
    前記プライマー固定領域を複数備え、
    前記複数種類のプライマーセットは、前記複数のプライマー固定領域に、種類ごとに遊離可能に固定されている請求項１に記載の核酸反応具。
  3. 前記複数のプライマー固定領域は、前記溝部に互いに１ｍｍ以上８ｍｍ以下離れて配置されている請求項２に記載の核酸反応具。
  4. 前記被覆体は疎水性樹脂から形成されている請求項１〜３の何れか１項に記載の核酸反応具。
  5. 前記疎水性樹脂がシリコーン樹脂である請求項４に記載の核酸反応具。
  6. 前記反応空間が流路である請求項１〜５の何れか１項に記載の核酸反応具。
  7. 前記支持体が前記プライマー固定領域に対応して検出部を備える請求項１〜６の何れか１項に記載の核酸反応具。
  8. 前記検出部が電極を備える請求項７に記載の核酸反応具。
  9. 前記検出部が光学センサを備える請求項７に記載の核酸反応具。
  10. 前記反応空間の前記プライマー固定領域が配置された部分の断面積は、前記プライマー固定領域が配置されていな部分の断面積と同じである、請求項１〜９の何れか１項に記載の核酸反応具。
  11. 前記反応空間を複数備える、請求項１〜１０の何れか１項に記載の核酸反応具。
  12. 請求項１〜１１の何れか１項に記載の核酸反応具と、増幅試薬とを含む核酸検出定量キット。
  13. 標識物質を含む検出試薬を更に含む請求項１２に記載のキット。
  14. 試料中の第１〜第ｎの標的核酸を検出又は定量する方法であって、
    ｎは２以上の整数であり、
    （Ｓ１）核酸反応具を用意すること、
    （ここで、前記核酸反応具は、
    支持体と、
    少なくとも一方の面に形成された溝部を有し、前記支持体の一方の面に前記溝部側の一方の面が接して前記支持体の一方の面と前記溝部とで囲まれた反応空間を形成し、かつ前記溝部は前記反応空間の内面に互いに対向する立ち上がり面と、前記立ち上がり面の一端を繋ぐ背面と、前記反応空間内の前記立ち上がり面と前記背面とが交差する隅部と、前記隅部に配置された第１〜第ｎのプライマー固定領域とを有する被覆体と、
    前記第１〜第ｎのプライマー固定領域にそれぞれ固定された第１〜第ｎのプライマーセットと
    を備え、
    前記第１〜第ｎのプライマーセットはそれぞれ、前記第１〜第ｎの標的核酸にそれぞれ含まれる第１〜第ｎの配列をそれぞれ増幅するためのプライマーセットである）、
    （Ｓ２）前記核酸反応具の前記反応空間に、試料及び増幅試薬を含む反応液を持ち込むこと、
    （Ｓ３）前記反応空間を増幅条件に維持し、増幅産物を得ること、
    （Ｓ４）前記増幅産物の増加に伴って変化する信号を前記第１〜第ｎのプライマー固定領域ごとに検出すること、
    （Ｓ５）前記検出の結果に基づいて、第１〜第ｎの標的核酸を検出又は定量すること
    を含む核酸検出定量方法。
  15. 前記核酸反応具の前記反応空間の前記プライマー固定領域が配置された部分の断面積は、前記プライマー固定領域が配置されていな部分の断面積と同じである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記核酸反応具は、前記反応空間を複数備える、請求項１４又は１５に記載の方法。
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