BRPI0510680B1

BRPI0510680B1 - Device and method for qualitative and / or quantitative detection of molecular interactions between probe molecules and target molecules, and, use of a device

Info

Publication number: BRPI0510680B1
Application number: BRPI0510680-0A
Authority: BR
Inventors: Dworrak Alexandra; Ellinger Thomas; Ermantraut Eugen; Schulz Torsten; Ullrich Thomas; Kaiser Thomas
Original assignee: Clondiag Chip Technologies Gmbh
Priority date: 2004-05-06
Filing date: 2005-05-06
Publication date: 2017-07-11
Also published as: CA2565679C; DK1761641T3; AU2005240757B2; EP2280267B1; ES2350638T3; EP2280267A2; EP3527287A1; CN102127595B; BRPI0510680B8; CN102121054B; JP4958770B2; PT2299257T; EP2290351A3; DE102004022263A1; WO2005108604A3; EP2280267A3; EP3171155A1; EP2299257A2; NZ551229A; EP2290351A2

Description

“DISPOSITIVO E MÉTODO PARA DETECÇÃO QUALITATIVA E/OU QUANTITATIVA DE INTERAÇÕES MOLECULARES ENTRE MOLÉCULAS DE SONDA E MOLÉCULAS ALVO, E, USO DE UM DISPOSITIVO” A invenção relaciona-se a dispositivos e métodos para detectar interações específicas entre moléculas alvo e de sonda.

Testes biomédicos são freqüentemente baseados na detecção de uma interação entre uma molécula, que está presente em quantidade conhecida e posição (a sonda molecular), e uma molécula desconhecida a ser detectada ou moléculas desconhecidas a serem detectadas (as moléculas alvo moleculares). Em testes modernos, sondas são dispostas na forma de uma biblioteca de substâncias em suportes, os denominados micro-arranjos ou chips, de forma que uma amostra possa ser analisada simultaneamente em várias sondas de uma maneira paralela (veja, por exemplo, J. Lockhart, E. A. Winzeler, "Genomics, gene expression and DNA arrays"; Nature 2000, 405, 827-836). As sondas são aqui imobilizadas normalmente em uma matriz adequada, como é por exemplo descrito em WO 00/12575 (veja, por exemplo, US 5.412.087, WO 98/36827), ou produzidas sinteticamente (veja, por exemplo, US 5.143.854) de uma maneira predeterminada para a preparação dos micro-arranjos. É um pré-requisito para ligar, por exemplo, uma molécula visada rotulada com um grupo de fluorescência na forma de uma molécula de DNA ou RNA a uma sonda de ácido nucleico do micro-arranjo, que ambas molécula visada e molécula de sonda estão presentes na forma de um ácido nucleico torcido único. Hibridização eficiente e específica só pode ocorrer entre tais moléculas. Moléculas alvo de ácido nucleico de filamento único e moléculas de sonda de ácido nucleico normalmente podem ser obtidas por meio de desnaturação a quente e seleção ótima de parâmetros como temperatura, força iônica, e concentração de moléculas desestabilizadoras de hélice, Assim, é assegurado que só sondas tendo seqüências virtualmente perfeitamente complementares, isto é, correspondendo uma a outra, permanecem casadas com a seqüência visada (A. A. Leitch, T. Schwarzacher, D. Jackson, I. J. Leitch, 1994, "In vitro Hybrídísierung, Spektrum Akademischer Verlag", Heidelberg/Berlim/Oxford).

Um exemplo típico para o uso de micro-arranjos em métodos de teste biológicos é a detecção de microorganismos em amostras em diagnósticos biomédicos. Aqui, é tirada vantagem do fato que os genes para RNA ribossomal (rRNA) são dispersados unipresentemente e têm porções de seqüência, que são características para as espécies respectivas. Estas seqüências de espécies características são aplicadas sobre um micro-arranjo na forma de oligonucleotídeos de DNA torcidos únicos. As moléculas de DNA visadas a serem examinadas são primeiro isoladas da amostra a ser examinada e são equipadas com marcadores, por exemplo marcadores fluorescentes. Subseqüentemente, as moléculas de DNA visadas rotuladas são incubadas em uma solução com as sondas fixadas no micro-arranjo; interações ocorrendo inespecificamente são removidas por meio de etapas de lavagem correspondentes e interações específicas são detectadas por meio de avaliação por fluorescência-óptica. Desta maneira, é possível detectar, por exemplo, vários microorganismos simultaneamente em uma amostra por meio de um único teste. Neste método de teste, o número de microorganismos detectáveis só depende teoricamente do número das sondas específicas, que foram aplicadas sobre o micro-arranjo.

Uma variedade de métodos e sistemas técnicos, alguns dos quais também estão comercialmente disponíveis, são descritos para a detecção de interações moleculares com a ajuda de micro-arranjos e arranjos de sonda, respectivamente, em superfícies sólidas.

Sistemas clássicos para a detecção de interações moleculares são baseados na comparação das intensidades de fluorescência de moléculas alvo excitadas espectralmente rotuladas com fluoroforos. Fluorescência é a capacidade de moléculas particulares emitirem sua própria luz quando excitadas por luz de um comprimento de onda particular. Aqui, um comportamento de absorção e emissão características resulta. Em análise, um aumento proporcional do sinal de fluorescência é assumido quando densidade de molécula rotulada na superfície funcionalizada aumenta, por exemplo, devido à eficiência crescente da interação molecular entre moléculas alvo e de sonda.

Em particular, detecção quantitativa de sinais de fluorescência é executada por meio de métodos modificados de microscopia de fluorescência. Aqui, a luz tendo o comprimento de onda de absorção é separada da luz tendo o comprimento de onda de emissão por meio de filtros ou dicroítas e o sinal medido é focado em detectores adequados, como por exemplo arranjos de CCD bidimensionais, por meio de elementos ópticos como objetivas e lentes. Em geral, análise é executada por meio de processamento de imagem digital.

Até agora, soluções técnicas conhecidas variam relativas a sua instalação óptica e aos componentes usados. Problemas e limitações podem resultar do ruído de sinal (o fundo) que é basicamente determinado por efeitos como descoramento e esfriamento dos corantes usados, autofluorescência dos meios, elementos de montagem, e componentes ópticos como também por dispersões, reflexões e fontes de luz secundárias dentro da instalação óptica.

Isto conduz a grande esforço técnico para a instalação de detectores de fluorescência altamente sensíveis para a comparação qualitativa e quantitativa de arranjos de sonda. Em particular, para blindar com processamentos médio e alto, sistemas de detecção especialmente adaptados são necessários, que exibem um certo grau de automatização.

Para otimizar instalações de epifluorescência padrão para leitura de arranjos moleculares, detectores baseados em CCD são conhecidos, que implementam a excitação dos fluoroforos no campo escuro por meio de luz incidente ou luz transmitida para a discriminação de efeitos ópticos como dispersão e reflexões (veja, por exemplo, C. E. Hooper et al,, ("Quantitative Photon Imaging in the Life Sciences Using Intensifíed CCD Câmeras", Diário de Bioluminescência e Quimio-luminescência (1990), pág. 337-344). Aqui, formação de imagem dos arranjos é executada tanto na exposição ou por meio de rasterização usando ótica de resolução mais alta. O uso de fontes de luz multiespectrais permite um acesso comparativamente fácil a fluoroforos diferentes por meio de usar filtros de excitação diferentes (combinações). Porém, é uma desvantagem que efeitos ópticos de autofluorescência e relacionados a sistema como a homogeneidade de iluminação sobre o arranjo necessitam de ótica de iluminação complicada e sistemas de filtro. Métodos adicionais para a detecção quantitativa de sinais de fluorescência são baseados em microscopia de fluorescência confocal. Sistemas de varredura confocais, como por exemplo descritos em US 5.304.810, são baseados na seleção de sinais de fluorescência ao longo do eixo óptico por meio de dois furos de alfinete. Isto resulta em um grande esforço de ajuste para as amostras ou estabelecimento de um sistema de autofoco eficiente. Tais sistemas são altamente complexos com respeito à sua solução técnica. Componentes requeridos como lasers, furos de alfinete, detectores opcionalmente esfriados, como por exemplo PMT, diodos de avalanche, ou CCD, elementos de translação mecânicos complexos e altamente exatos e ótica têm que ser otimizados e integrados com esforço considerável (veja, por exemplo, US 5.459.325; US 5.192.980; US 5.834.758). Grau de miniaturização e preço são limitados por multiplicidade e funcionalidade dos componentes.

Atualmente, análises baseadas em arranjos de sonda são normalmente lidas por fluorescência óptica (veja, por exemplo, A. Marshall e J. Hodgson, "DNA Chips: An array of possibilities", Nature Biotechnology, 16, 1998, 27-31; G. Ramsay, "DNA Chips: State of the Art", Nature Biotechnology, 16, Jan. 1998, 40-44). Porém, as desvantagens dos dispositivos e métodos de detecção acima descritos são o fundo de sinal alto conduzindo à precisão limitada, o esforço técnico às vezes considerável, e os altos custos com relação aos métodos de detecção.

Uma variedade de sistemas confocais em particular é conhecida, que são adequados para a detecção de bibliotecas de substâncias integradas em pequena escala em formato de arranjo, que são instaladas em câmaras fluidas (veja, por exemplo, US 5.324.633, US 6.027.880, US 5.585.639, WO 00/12759).

Porém, os métodos e sistemas acima descritos só podem ser adaptados de um modo muito limitado para a detecção de arranjos moleculares integrados em larga escala, que são, em particular, instalados em sistemas fluídicos, em particular devido às dispersões, reflexões e aberrações ópticas ocorrendo neles. Além disso, em tais arranjos integrados em larga escala, grandes demandas são feitas relativas à resolução espacial, que podia, porém, até agora não ser implementada tecnicamente.

Assim, há uma necessidade por arranjos altamente integrados, em que a interação entre sondas e alvos pode ser detectada qualitativamente e/ou quantitativamente com grande precisão e com esforço técnico comparativamente pequeno. O aumento em seletividade e o acesso a componentes alternativos motivam o estabelecimento de tecnologias de formação de imagem alternativas como polarização de fluorescência e fluorescência resolvida em tempo para ensaios limitados a corpos sólidos. O efeito de torcer o eixo de polarização por meio de fluoroforos excitados de uma maneira polarizada é usado para quantificação em formato de microtítulo. Além disso, há abordagens para estabelecer sistemas baratos tendo um alto processamento (sistemas de HTS) por meio de usar chapas de polímero modificadas correspondentemente como filtros de polarização (veja I. Gryczcynski et al., "Polarisation sensing with visual detection", Anal. Chem. 1999, 71, 1241-1251).

Desenvolvimentos mais recentes utilizam a fluorescência de materiais inorgânicos, como lantanídeos (M. Kwiatowski et al., "Solid-phase synthesis of chelate-labelled oligonucleotides: application in triple-color ligase-ediated gene analysis", Nucleic Acids Research, 1994,22,13) e pontos de quantum (Μ. P. Bruchez et al., "Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labeis", Science 1998, 281, 2013). Corantes exibindo longo tempo de emissão dentro de uma gama de microssegundos, como quelatos de lantanídeos, necessitam de uma conversão dos corantes a uma fase móvel, de forma que uma detecção localmente resolvida não é possível.

Instalações ópticas para a detecção de amostras rotuladas por meio de contas de ouro e sua visualização por meio de amplificação de prata são descritas no Pedido de Patente Internacional WO 00/72018. Os dispositivos descritos nele só são adequados para detecção em medição estática, porém. Em medição estática, subseqüentemente à interação dos alvos com as sondas dispostas no arranjo de sonda como também subseqüentemente ao começo da reação conduzindo à precipitação naqueles elementos de arranjo, onde uma interação ocorreu, uma imagem é gravada e designada às concentrações de valor de cinza medidas, que dependem do grau de formação de precipitação.

Um método para a detecção qualitativa e/ou quantitativa de alvos em uma amostra por meio de interações moleculares entre sondas e alvos em arranjos de sonda foi provido em WO 02/02810, em que o comportamento dependente de tempo de formação de precipitação nos elementos de arranjo é detectado na forma de intensidades de sinal, isto é, medição dinâmica é executada. Na base de uma função de curva descrevendo formação de precipitação como uma função de tempo, um valor quantificando a interação entre sonda e alvo em um elemento de arranjo e portanto a quantidade de alvos limitados é designada a cada elemento de arranjo.

Tal medição dinâmica requer a gravação de séries de imagem sob, por exemplo, condições térmicas particulares ou em uma fase particular de um procedimento, por exemplo na presença de soluções específicas na hora da gravação. Isto requer cooperação complexa dos componentes individuais de um arranjo altamente integrado, em particular em usos no campo de genotipificação.

Além disso, em muitos testes em diagnósticos biomédicos, o problema surge que as moléculas alvo não estão a princípio presentes em uma quantidade suficiente para detecção e portanto frequentemente primeiro têm que ser ampliadas da amostra antes do procedimento de teste atual. Tipicamente, a amplificação de moléculas de DNA é executada por meio da reação de cadeia de polimerase (PCR). Para a amplificação de RNA, as moléculas de RNA têm que ser convertidas para DNA complementar correspondentemente (cDNA) por meio de transcrição inversa. Dito cDNA pode então também ser ampliado por meio de PCR. PCR é um método de laboratório padrão (como, por exemplo, em Sambrook et al. (2001), "Molecular Cloning: A laboratory manual", 3a edição, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press). A amplificação de DNA por meio de PCR é comparativamente rápida, permite um alto processamento de amostra em volumes de instalação pequenos por meio de métodos miniaturizados, e é eficiente em operação devido à automatização.

Porém, uma caracterização de ácidos nucleicos por meio de mera amplificação não é possível. É em lugar disso necessário usar métodos de análise como determinações de seqüência de ácido nucleico, hibridização e/ou separação eletroforética e métodos de isolamento para a caracterização dos produtos de PCR subseqüentemente à amplificação.

Em geral, dispositivos e métodos para a amplificação de ácidos nucleicos e sua detecção deveríam ser projetados de tal modo que tão poucas intervenções dos experimentadores quanto possível sejam requeridas. As vantagens de métodos permitindo multiplicação de ácidos nucleicos e sua detecção, e no curso de qual o experimentador tem que intervir só minimamente, são óbvias. Por um lado, contaminações são evitadas. Por outro lado, a reprodutibilidade de tais métodos é substancialmente aumentada, como eles são acessíveis à automatização. Isto também é extremamente importante considerando admissão legal de métodos de diagnóstico, No presente, há uma multiplicidade de métodos para a amplificação de ácidos nucleicos e sua detecção, em que primeiro o material visado é ampliado por meio de amplificação por PCR e subsequentemente a identidade ou o estado genético das seqüências visadas é determinado por meio de hibridização contra um arranjo de sonda. Em geral, amplificação das moléculas de ácido nucleico ou das moléculas alvo a serem detectadas é necessária a fim de ter quantidades à disposição da suficientes para uma detecção qualitativa e quantitativa dentro da extensão da hibridização.

Ambas amplificação por PCR de ácidos nucleicos e sua detecção por meio de hibridização estão sujeitas a vários problemas elementares. Isto se aplica da mesma maneira a métodos combinando amplificação por PCR de ácidos nucleicos e sua detecção por meio de hibridização.

Se marcadores detectáveis, por exemplo na forma de iniciadores rotulados de fluorescência, forem inseridos nas moléculas de ácido nucleico a serem detectadas ou moléculas alvo a serem detectadas em um método, que combina amplificação por PCR e sua detecção por meio de hibridização, uma etapa de lavagem é executada normalmente antes da detecção atual. Tal etapa de lavagem serve para a remoção dos iniciadores não convertidos, que estão presentes em grande abundância comparado ao produto de amplificação, como também de tais riucleotídeos equipados com um marcador de fluorescência, que não participam na reação de detecção ou não hibridizam especifícamente com as sondas de ácido nucleico do micro-arranjo. Desta maneira, o fundo de sinal de alto nível causado por estas moléculas é suposto ser reduzido. Porém, uma tal etapa de procedimento adicional retarda consideravelmente o método de detecção. Além disso, o sinal detectável também é reduzido consideravelmente para aqueles ácidos nucleicos a serem detectados, que hibridizam especifícamente com as sondas de ácido nucleico do micro-arranjo. O anterior é grandemente baseado no fato que o equilíbrio entre os alvos limitados por meio de hibridização e os alvos dissolvidos não existem mais depois da etapa de lavagem. Ácidos nucleicos, que já hibridizados com as sondas de ácido nucleico localizadas no arranjo, são separados do local de ligação através de lavagem e são portanto lavados longe junto com as moléculas dissolvidas. Completamente, só permanece um sinal detectável, se a etapa de lavagem ou enxágüe das moléculas dissolvidas for executada mais rapidamente do que a separação dos ácidos nucleicos já hibridizados.

Portanto, há uma necessidade por arranjos altamente integrados, em que a interação entre sondas e alvos pode ser detectada qualitativamente e/ou quantitativamente com grande precisão e com esforço técnico comparativamente pequeno.

Além disso, há uma necessidade por dispositivos que permitem o desempenho de PCR e reação de análise, como por exemplo uma reação de hibridização, em um espaço de reação. É portanto um problema subjacente à presente invenção superar os problemas acima mencionados da arte, que em particular surgem devido à falta de compatibilidade do ensaio com o sistema de teste.

Em particular, é um problema subjacente à presente invenção prover métodos e dispositivos, respectivamente, em que interações moleculares entre sondas e alvos em arranjos de sonda podem ser detectadas qualitativamente e/ou quantitatívamente com grande precisão e alta sensibilidade como também de uma maneira fácil de fazer e eficiente em custo.

Além disso, é um problema subjacente à presente invenção prover métodos e dispositivos, respectivamente, para a amplificação e para a detecção qualitativa e quantitativa de ácidos nucleicos, em que intervenções dos experimentadores no procedimento de detecção podem ser minimizadas. E um problema adicional subjacente à presente invenção prover métodos e dispositivos, respectivamente, para a detecção qualitativa e quantitativa de ácidos nucleicos, em que uma alta relação de sinal para ruído na detecção de interações no mícro-arranjo é assegurada sem prejudicar a interação entre as moléculas alvo e as moléculas de sonda no arranjo. É um problema adicional subjacente à presente invenção prover dispositivos e métodos, respectivamente por meio dos quais uma alta resolução dinâmica em detecção é alcançada, isto é, a detecção de interações de sonda/alvo fracas entre sinais fortes permanece assegurada.

Além disso, é um problema subjacente à presente invenção prover dispositivos e métodos, respectivamente, que permitem a amplificação e caracterização quase simultânea de ácidos nucleicos a uma alta taxa de processamento.

Estes e problemas adicionais subjacentes à presente invenção são resolvidos por meio de prover as concretizações caracterizadas nas reivindicações de patente.

De acordo com a presente invenção, métodos para a detecção qualitativa e/ou quantitativa de interações moleculares entre moléculas de sonda e moléculas alvo são providos, em que a substituição e/ou a remoção de soluções, isto é, em particular etapas de lavagem ou enxágüe, podem ser omitidas.

Tais métodos de acordo com a presente invenção incluem em particular as etapas seguintes: a) alimentar uma amostra contendo moléculas alvo em uma câmara de reação tendo um micro-arranjo, em que o micro-arranjo inclui um substrato sobre o qual moléculas de sonda estão imobilizadas em elementos de arranjo; b) detectar uma interação entre as moléculas alvo e as moléculas de sonda imobilizadas no substrato, em que nenhuma substituição de soluções na câmara de reação e/ou remoção de soluções da câmara de reação é executada subsequentemente a alimentar a amostra contendo moléculas alvo como também antes e durante o procedimento de detecção.

Além disso, dispositivos são providos dentro da extensão da presente invenção, que são adequados para conduzir tais métodos.

Em particular, um dispositivo para a detecção qualitativa e/ou quantitativa de interações moleculares entre moléculas de sonda e alvo é provido dentro da extensão da presente invenção, incluindo: a) um micro-arranjo tendo um substrato, sobre o qual moléculas de sonda estão imobilizadas em elementos de arranjo, em que o micro-arranjo é arranjado em uma primeira superfície do dispositivo; e b) uma câmara de reação, que é formada entre a primeira superfície com o micro-arranjo arranjado sobre ela e uma segunda superfície, em que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície é variável.

Em particular, a variabilidade da distância entre micro-arranjo e segunda superfície, que forma normalmente o plano de detecção do dispositivo de acordo com a presente invenção, permite que o fundo de sinal, que é causado por moléculas alvo rotuladas, que não têm uma afinidade específica às moléculas de sonda do micro-arranjo e portanto não interagem com elas, é consideravelmente reduzido ou completamente evitado.

Além disso, de acordo com a presente invenção, um método para a detecção qualitativa e/ou quantitativa de interações moleculares entre moléculas de sonda e alvo é provido que inclui as etapas seguintes: a) alimentar uma solução de amostra incluindo moléculas alvo em uma câmara de reação de um dispositivo de acordo com a presente invenção como descrito acima; e b) detectar uma interação entre as moléculas alvo e as moléculas de sonda imobilizadas no substrato.

Os métodos e dispositivos de acordo com a presente invenção para detectar moléculas alvo são projetados de tal modo, que tão poucas intervenções dos experimentadores na câmara de reação quanto possível sejam requeridas para executar o método de detecção e, opcionalmente, uma amplificação das moléculas alvo. Isto oferece a vantagem essencial que contaminações são por esse meio evitadas. Além disso, a reprodutibilidade dos métodos de acordo com a presente invenção é consideravelmente aumentada comparada a métodos convencionais, como o método de acordo com a presente invenção é acessível à automatização devido à minimização de intervenções externas. As vantagens acima mencionadas desempenham um papel importante em termos da admissão de métodos de diagnóstico.

Além disso, as definições seguintes são usadas, inter alia, para a descrição da presente invenção: Dentro da extensão da presente invenção, uma sonda ou uma molécula de sonda ou uma sonda molecular é entendida denotar uma molécula, que é usada para a detecção de outras moléculas devido a uma característica particular ligando comportamento ou uma reatividade particular. Cada tipo de moléculas, que podem ser acopladas a superfícies sólidas, e tem uma afinidade específica, pode ser usado como sondas dispostas no arranjo. Em uma concretização preferida, estas são biopolímeros, em particular biopolímeros das classes de peptídeos, proteínas, antígenos, anticorpos, carboidratos, ácidos nucleicos, e/ou análogos deles e/ou polímeros misturados dos biopolímeros acima mencionados. Particularmente preferivelmente, as sondas são ácidos nucleicos e/ou análogos de ácido nucleico.

Em particular, moléculas de ácido nucleico de sequência definida e conhecida, que são usadas para a detecção de moléculas alvo em métodos de hibridização, são referidas como sonda. Ambas as moléculas de DNA e RNA podem ser usadas como ácidos nucleicos. Por exemplo, as sondas de ácido nucleico ou sondas de oligonucleotídeo podem ser oligonucleotídeos tendo um comprimento de 10 a 100 bases, preferivelmente de 15 a 50 bases, e particularmente preferivelmente de 20 a 30 bases. Tipicamente, de acordo com a presente invenção, as sondas são moléculas de ácido nucleico de filamento único ou moléculas de análogos de ácido nucleico, preferivelmente moléculas de DNA de filamento único ou moléculas de RNA tendo pelo menos uma região de seqüência, que é complementar a uma região de seqüência das moléculas alvo. Dependendo do método de detecção e uso, as sondas podem ser imobilizadas em um substrato de suporte sólido, por exemplo na forma de um micro-arranjo. Além disso, dependendo do método de detecção, elas podem ser rotuladas radioativamente ou não radioativamente, de forma que elas sejam detectáveis por meio de métodos de detecção convencionais no estado da arte.

Dentro da extensão da presente invenção, um alvo ou molécula visada é entendida denotar uma molécula a ser detectada por meio de uma sonda molecular, Em uma concretização preferida da presente invenção, os alvos a serem detectados são ácidos nucleicos. Porém, o arranjo de sonda de acordo com a presente invenção também pode ser usada de uma maneira análoga para a detecção de interações de peptídeo/sonda, interações de proteína/sonda, interações de carboidrato/sonda, interações de anticorpo/sonda etc.

Se, dentro da extensão da presente invenção, os alvos forem ácidos nucleicos ou moléculas de ácido nucleico, que são detectadas por meio de uma hibridização contra sondas dispostas em um arranjo de sonda, dita moléculas alvo normalmente incluem seqüências de um comprimento de 40 a 10.000 bases, preferivelmente de 60 a 2.000 bases, também preferivelmente de 60 a 1.000 bases, particularmente preferivelmente de 60 a 500 bases e mais preferivelmente de 60 a 150 bases. Opcionalmente, sua seqüência inclui as seqüências de iniciadores como também as regiões de seqüência do modelo, que são definidas pelos iniciadores. Em particular, as moléculas alvo podem ser moléculas de ácido nucleico de filamento único ou torcidas duplas, um ou ambos os filamentos de quais estão rotulados radioativamente ou não radioativamente, de forma que eles sejam detectáveis por meio de um método de detecção convencional no estado da arte.

De acordo com a presente invenção, uma seqüência visada denota a região de seqüência do alvo, que é detectado por meio de hibridização com a sonda. De acordo com a presente invenção, isto também é referido como dita região sendo tratada pela sonda.

Dentro da extensão da presente invenção, uma biblioteca de substâncias é entendida denotar uma multiplicidade de moléculas de sonda diferentes, preferivelmente pelo menos duas a 1.000.000 de moléculas diferentes, partícularmente preferivelmente pelo menos 10 a 10.000 moléculas diferentes, e mais preferivelmente entre 100 a 1.000 moléculas diferentes. Em concretizações especiais, uma biblioteca de substâncias também pode incluir só pelo menos 50 ou menos ou pelo menos 30.000 moléculas diferentes. Preferivelmente, a biblioteca de substâncias está disposta na forma de um arranjo em um suporte dentro da câmara de reação do dispositivo de acordo com a presente invenção.

Dentro da extensão da presente invenção, um arranjo de sonda é entendido denotar uma disposição de sondas moleculares ou uma biblioteca de substâncias em um suporte, em que a posição de cada sonda é definida separadamente, Preferivelmente, o arranjo inclui locais definidos ou regiões predeterminadas, denominados elementos de arranjo, que são particularmente preferivelmente dispostos em um padrão particular, em que cada elemento de arranjo inclui normalmente só uma espécie de sondas. Aqui, a disposição das moléculas ou sondas no suporte pode ser gerada por meio de interações covalentes ou não covalentes. Aqui, as sondas estão dispostas no lado do suporte enfrentando a câmara de reação. Uma posição dentro da disposição, isto é, dentro do arranjo, é normalmente referida como ponto.

Dentro da extensão da presente invenção, um elemento de arranjo, ou uma região predeterminada, ou um ponto, ou um ponto de arranjo é entendido denotar uma área, que é determinada para a deposição de uma sonda molecular, em uma superfície; a totalidade de todos os elementos de arranjo ocupados é o arranjo de sonda.

Dentro da extensão da presente invenção, um elemento de suporte, ou suporte, ou suporte de biblioteca de substâncias, ou substrato é entendido denotar um corpo sólido, no qual o arranjo de sonda é instalado. Suporte, normalmente também referido como substrato ou matriz, pode por exemplo denotar um suporte de objeto ou uma pastilha ou materiais cerâmicos. Em uma concretização especial, as sondas também podem ser imobilizadas diretamente na primeira superfície, preferivelmente em uma partição da primeira superfície. A totalidade de moléculas dispostas na disposição de arranjo no substrato ou na superfície de detecção, ou a biblioteca de substâncias disposta na disposição de arranjo no substrato ou a superfície de detecção e do suporte ou substrato também é referida freqüentemente como "chip", "micro-arranjo", "chip de DNA", "arranjo de sonda", etc.

Dentro da extensão da presente invenção, um plano de detecção é entendido denotar a segunda superfície do dispositivo de acordo com a presente invenção. Preferivelmente, as sondas dispostas no micro-arranjo estão substancialmente localizadas no plano de detecção durante a detecção da interação entre sondas e alvo, em particular devido ao fato que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície é reduzida a aproximadamente zero.

Dentro da extensão da presente invenção, um corpo de câmara é entendido denotar o corpo sólido formando a câmara de reação. O suporte de biblioteca de substâncias ou o chip normalmente faz parte do corpo de câmara, em que o suporte de biblioteca de substâncias pode ser feito de um material diferente do resto do corpo de câmara.

Dentro da extensão da presente invenção, uma câmara de reação ou um espaço de reação é entendido denotar o espaço formado entre o micro-arranjo e a segunda superfície ou plano de detecção e preferivelmente projetado como um intervalo capilar variável. O espaço de reação é limitado lateralmente por paredes laterais, que podem, por exemplo, ser implementadas como vedações elásticas. As sondas imobilizadas no micro-arranjo estão localizadas no lado enfrentando o interior da câmara de reação. A base da câmara de reação ou do espaço de reação é definida pela primeira superfície ou pela segunda superfície do arranjo. Em particular, a distância entre a segunda superfície ou plano de detecção e a superfície do substrato ou do micro-arranjo é referida como espessura do espaço de reação ou da câmara de reação ou da intervalo capilar. Dentro da extensão da presente invenção, um espaço de reação só tem normalmente uma espessura pequena, por exemplo uma espessura de no máximo 1 cm, preferivelmente de no máximo 5 mm, particularmente preferivelmente de no máximo 3 mm e mais preferivelmente de no máximo 1 mm.

Dentro da extensão da presente invenção, a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície é entendida denotar a distância entre a superfície do substrato de micro-arranjo, isto é, o lado do micro-arranjo enfrentando o espaço de reação, e o lado da segunda superfície enfrentando o espaço de reação. Se a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície for aproximadamente zero, isto significa que a superfície do substrato se assenta uniformemente na segunda superfície.

Dentro da extensão da presente invenção, um intervalo capilar é entendida denotar um espaço de reação, que pode ser enchido por meio de forças capilares atuando entre o micro-arranjo e a segunda superfície. Normalmente, um intervalo capilar tem uma espessura pequena, por exemplo de no máximo 1 mm, preferivelmente de no máximo 750 pm e particularmente preferivelmente de no máximo 500 pm. De acordo com a presente invenção, uma espessura na faixa de 10 pm a 300 pm, de 15 pm a 200 pm e/ou de 25 pm a 150 pm é preferida como espessura da intervalo capilar. Em concretizações especiais da presente invenção, a intervalo capilar tem uma espessura de 50 pm, 60 pm, 70 pm, 80 pm ou 90 pm. Dentro da extensão da presente invenção, se o espaço de reação ou a câmara de reação tiver uma espessura de mais de 2 mm, o espaço de reação ou câmara de reação não será mais referido como um intervalo capilar.

Dentro da extensão da presente invenção, um cartucho ou cartucho de reação é entendido denotar a unidade da câmara de reação com um corpo de câmara e um invólucro correspondente.

Dentro da extensão da presente invenção, um sistema de detecção de fluorescência confocal é entendido denotar um sistema de detecção de fluorescência, em que o objeto é iluminado no plano focal da objetiva por meio de uma fonte de luz pontual. Aqui, fonte de luz pontual, objeto e detector de luz pontual estão localizados exatamente em planos opticamente conjugados. Exemplos para sistemas confocais estão descritos em A. Diaspro, "Confocal and 2-photon-microscopy: Foundations, Applications e Advances", Wiley-Liss, 2002.

Dentro da extensão da presente invenção, um sistema óptico de fluorescência focando o volume inteiro da câmara de reação é entendido denotar um sistema de detecção de fluorescência não confocal, isto é, um sistema de detecção de fluorescência, em que a iluminação por meio de uma fonte de luz pontual não está limitada ao objeto. Tal sistema de detecção de fluorescência portanto não tem nenhuma limitação focal.

Arranjos ou micro-arranjos convencionais dentro da extensão da presente invenção incluem cerca de 50 a 10,000, preferivelmente 150 a 2.000 espécies diferentes de moléculas de sonda em uma superfície, preferivelmente quadrada, de por exemplo, 1 mm a 4 mm x 1 mm a 4 mm, preferivelmente de 2 mm x 2 mm. Em concretizações adicionais dentro da extensão da presente invenção, micro-arranjos incluem cerca de 50 a cerca de 80.000, preferivelmente cerca de 100 a cerca de 65.000, particularmente preferivelmente cerca de 1.000 a cerca de 10.000 espécies diferentes de moléculas de sonda em uma superfície de vários mm a vários cm, 2 2 preferivelmente cerca de 1 mm a 10 cm , particularmente preferivelmente 2 mm a 1 cm, e mais preferivelmente cerca de 4 mm a 6,25 mm. Por exemplo, um micro-arranjo convencional tem 100 a 65.000 espécies diferentes de moléculas de sonda em uma superfície de 2 mm x 2 mm.

Dentro da extensão da presente invenção, um rótulo ou um marcador é entendido denotar uma unidade detectável, por exemplo um fluoroforo ou um grupo de âncora, ao qual uma unidade detectável pode ser acoplada.

Dentro da extensão da presente invenção, uma reação de amplificação normalmente inclui 10 a 50 ou mais ciclos de amplificação, preferivelmente cerca de 25 a 45 ciclos, particularmente preferivelmente cerca de 40 ciclos. Dentro da extensão da presente invenção, uma reação de amplificação cíclica preferivelmente é uma reação de cadeia de polimerase (PCR).

Dentro da extensão da presente invenção, um ciclo de amplificação denota um única etapa de aumento da reação de amplificação cíclica. Uma etapa de aumento da PCR também é referida como ciclo de PCR.

Dentro da extensão da presente invenção, um produto de amplificação denota um produto resultando da intensificação ou da cópia ou da amplificação das moléculas de ácido nucleico a serem ampliadas por meio da reação de amplificação cíclica, preferivelmente por meio da PCR. Uma molécula de ácido nucleico ampliada por meio de PCR também é referida como produto de PCR.

Dentro da extensão da presente invenção, a temperatura de desnaturação é entendida denotar a temperatura à qual o DNA torcido duplo é separado no ciclo de amplificação. Normalmente, a temperatura de desnaturação, em particular em uma PCR, é mais alta que 90°C, preferivelmente cerca de 95°C.

Dentro da extensão da presente invenção, a temperatura de anelamento é entendida denotar a temperatura à qual os iniciadores hibridizam ao ácido nucleico a ser detectado. Normalmente, a temperatura de anelamento, em particular em uma PCR, se acha em uma faixa de 50°C a 65°C e preferivelmente é cerca de 60°C.

Dentro da extensão da presente invenção, a temperatura de extensão de cadeia ou temperatura de extensão é entendida denotar a temperatura à qual o ácido nucleico é sintetizado por meio de inserção dos componentes de monômero. Normalmente, a temperatura de extensão, em particular em uma PCR, se acha dentro de uma faixa de cerca de 68 °C a cerca de 75°C e preferivelmente é cerca de 72°C.

Dentro da extensão da presente invenção, um iniciador de oligonucleotídeo ou iniciador denota um oligonucleotídeo, que liga ou hibridiza o DNA a ser detectado, também referido como DNA visado, em que a síntese do filamento complementar do DNA a ser detectado em uma reação de amplificação cíclica começa do local de ligação. Em particular, iniciador denota um oligonucleotídeo de DNA ou RNA curto tendo preferivelmente cerca de 12 a 30 bases, que é complementar a uma porção de uma molécula de DNA ou RNA maior e tem um grupo de 3-OH livre em sua extremidade 31. Devido a dito grupo de 3ΌΗ livre, o iniciador pode servir como substrato para qualquer polimerase de DNA ou RNA opcional, que sintetiza nucleotídeos ao iniciador na direção de 5'-3'. Aqui, a seqüência dos nucleotídeos recentemente sintetizados é predeterminada por essa seqüência do modelo hibridizado com o iniciador, que se acha além do grupo de 3ΌΗ livre do iniciador. Iniciadores de comprimento convencional incluem entre 12 e 50 nucleotídeos, preferivelmente entre 15 e 30 nucleotídeos.

Uma molécula de ácido nucleico de filamento duplo ou um filamento de ácido nucleico servindo como modelo para a síntese de filamentos de ácido nucleico complementares é normalmente referido como modelo ou filamento de modelo.

Dentro da extensão da presente invenção, uma interação molecular ou uma interação é entendida denotar uma ligação específica, covalente ou não covalente, entre uma molécula visada e uma molécula de sonda imobilizada. Em uma concretização preferida da presente invenção, a interação entre moléculas de sonda e alvo é uma hibridização, A formação de moléculas de ácido nucleico de filamento duplo ou moléculas dúplices de moléculas de ácido nucleico de filamento único complementares é referida como hibridização, Aqui, a associação preferivelmente sempre ocorre em pares de A e T ou G e C. Dentro da extensão de uma hibridização, por exemplo dúplices de DNA-DNA, dúplices de DNA-RNA, ou dúplices de RNA-RNA podem ser formadas. Por meio de uma hibridização, dúplices com análogos de ácido nucleico também podem ser formadas, como por exemplo dúplices de DNA-PNA, dúplices de RNA-PNA, dúplices de DNA-LNA, e dúplices de RNA-LNA. Experiências de hibridização são normalmente usadas para detectar a complementaridade de seqüência e portanto a identidade de duas moléculas de ácido nucleico diferentes.

Dentro da extensão da presente invenção, processamento é entendido denotar etapas de purificação, concentração, rotulagem, amplificação, interação, hibridização e/ou lavagem e enxágüe como também etapas de método adicionais executadas ao detectar alvos com a ajuda de bibliotecas de substâncias. A própria detecção não cai sob o termo processamento.

Dentro da extensão da presente invenção, uma amostra ou solução de amostra ou analito ou solução é um líquido a ser analisado, que contém em particular as moléculas alvo a serem detectadas e, opcionalmente, a serem ampliadas. Além disso, além de aditivos convencionais tais como, por exemplo, soluções tampão, uma tal solução pode, inter alia, também conter substâncias requeridas para executar reações de amplificação, como iniciadores.

Dentro da extensão da presente invenção, uma substituição de soluções na câmara de reação da câmara de reação se refere, em particular, às etapas de enxágüe ou lavagem. Uma substituição de soluções serve, por exemplo, para remover moléculas rotuladas com marcadores detectáveis, que especificamente não interagem com sondas no micro-arranjo, por meio de substituir a solução de amostra com uma solução não rotulada subseqüentemente à interação completada. Moléculas não interagindo especificamente com sondas no micro-arranjo são, por exemplo, iniciadores rotulados com um marcador detectável, que não foram convertidos durante a reação de amplificação, ou moléculas alvo rotuladas com um marcador detectável, que não têm uma sonda complementar no arranjo, que interage especificamente com dita molécula visada, Dentro da extensão da presente invenção, uma remoção de soluções da câmara de reação é entendida denotar etapas, por meio das quais moléculas rotuladas com marcadores detectáveis, que não interagem especifícamente com sondas no micro-arranjo, são removidas da câmara de reação. Moléculas não interagindo especifícamente com sondas no micro-arranjo são, por exemplo, iniciadores rotulados com um marcador detectável, que não foram convertidos durante a reação de amplificação, ou moléculas alvo rotuladas com um marcador detectável, que não têm uma sonda complementar no arranjo, que interage especifícamente com dita molécula visada.

Se, dentro da extensão da presente invenção, nenhuma substituição de soluções na câmara de reação e/ou remoção de soluções da câmara de reação for executada entre a alimentação da amostra contendo moléculas alvo em uma câmara de reação e detectar a interação, é, porém, concebível que durante este período de tempo soluções possam ser alimentadas adicionalmente na câmara de reação sem executar a substituição ou remoção das soluções já presentes na câmara de reação.

Assim, um primeiro alvo da presente invenção inclui um método para detectar qualitativamente e/ou quantitativamente interações moleculares entre moléculas de sonda e alvo incluindo, em particular, as etapas seguintes: a) alimentar uma amostra contendo moléculas alvo em uma câmara de reação tendo um micro-arranjo, em que o micro-arranjo inclui um substrato sobre o qual as moléculas de sonda são imobilizadas em elementos de arranjo; b) detectar uma interação entre as moléculas alvo e as moléculas de sonda imobilizadas no substrato, em que subseqüentemente a carregar a amostra contendo moléculas alvo e antes ou durante detecção nenhuma substituição de soluções na câmara de reação e/ou remoção de soluções da câmara de reação é executada.

Neste aspecto da presente invenção, é uma característica significativa do método de acordo com a presente invenção que a detecção de uma interação entre as moléculas alvo a serem detectadas e as moléculas de sonda imobilizadas no substrato do micro-arranjo é executada sem substituir soluções na câmara de reação ou remover soluções da câmara de reação. Isto é, detectar a interação entre alvos e sondas pode ser executado sem etapas de enxágüe ou lavagem serem requeridas subseqüentemente à reação de interação e/ou sem moléculas, que não interagem especifícamente com sondas no micro-arranjo, sendo removidas da câmara de reação subseqüentemente à reação de interação.

No método de acordo com a presente invenção, isto pode, em particular, ser assegurado por meio de métodos de detecção seletivos em foco, como por exemplo por meio de técnicas confocais ou por meio do desacoplamento evanescente de luz de excitação (TIRF) no substrato de amostra baseado no uso de uma iluminação de profundidade seletiva devido a, por exemplo, reflexão total, ou o uso de métodos baseados em guias de onda. Tais métodos seletivos em foco são para serem particularmente preferidos em casos quando uma exclusão adicional dos sinais de fundo causados pelas moléculas de fluorescência presentes no líquido, isto é, não hibridizadas, a fim de aumentar sensibilidade. Com o uso de moléculas alvo rotuladas por fluorescência, os sinais de interação específicos podem assim ser discriminados da fluorescência de fundo pelo uso de métodos como microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) ou microscopia de fluorescência confocal.

Exemplos para isto são detectores baseados em CCD, que implementam a excitação dos fluoroforos no campo escuro por meio de luz incidente ou luz transmitida para o propósito de discriminar efeitos ópticos como dispersão e reflexões (veja por exemplo C. E. Hooper et al., "Quantitative Photone Imaging in the Life Sciences Using Intensified CCD Câmeras", Journal of Bioluminescence and Chemoluminescence (1990), 337344). Alternativas adicionais para sistemas de detecção de fluorescência, que podem ser usados no método de acordo com a presente invenção, são instalações de luz branca, como por exemplo descritas em WO 00/12759, WO 00/25113 e WO 96/27025; sistemas confocais, como por exemplo descritos emUS 5.324.633, US 6.027.880, US 5.585.639 e WO 00/12759; sistemas de excitação confocais baseados em discos de Nipkow em formação de imagem confocal, como por exemplo descrito em US 5.760.950; sistemas baseados em distribuição de excitação estruturada, como por exemplo descrito em WO 98/57151; sistemas de detecção de fluorescência integrados em larga escala usando micro-ótica, como por exemplo descritos em WO 99/27 140; e sistemas de varredura a laser, como por exemplo descritos em WO 00/12759. Uma progressão geral de métodos de detecção de fluorescência usando tais sistemas de detecção de fluorescência convencionais é, por exemplo, descrita em US 5.324.633.

Os dispositivos descritos em WO 2004/087951, em que a câmara de reação é formada por um intervalo capilar, são particularmente adequados para executar um método de detecção de acordo com a presente invenção sem substituir soluções na câmara de reação e/ou remover soluções da câmara de reação. Os conteúdos pertinentes de WO 2004/087951 estão por este meio referidos explicitamente.

Em uma concretização adicional deste aspecto da presente invenção, substituir e/ou remover soluções da câmara de reação é evitado executando a detecção por meio de detectar a alteração de massa na superfície de arranjo, como descrito, por exemplo, em WO 03/004699. Os conteúdos pertinentes de WO 03/004699 estão por este meio referidos explicitamente.

Em uma concretização adicional deste aspecto da presente invenção, substituir e/ou remover soluções da câmara de reação é evitado executando a detecção por meio de detectar ondas de superfície acústicas, como é descrito, por exemplo, em Z. Guttenberg et al., Lab Chip. 2005; 5(3):308-17.

Em uma concretização adicional deste aspecto da presente invenção, substituir e/ou remover soluções da câmara de reação é evitado executando a detecção por meio de detecção eletroquímica por eletrodos na superfície do arranjo, como, por exemplo, por meio de medir a alteração de potenciais de redox (veja, por exemplo, X. Zhu et al., Lab Chip. 2004; 4(6):581-7) ou voltometria cíclica (veja, por exemplo, J. Liu et al., Anal. Chem. 2005; 77(9):2756-2761; J. Wang, Anal Chem. 2003; 75(15):3941-5).

Em uma concretização adicional deste aspecto da presente invenção, substituir e/ou remover soluções da câmara de reação é evitado executando a detecção por meio de detecção elétrica por eletrodos na superfície do arranjo, como, por exemplo, por meio de medição de impedância (veja, inter alia, S. M. Radke et al., Biosens Bioelectron. 2005; 20(8): 1662-7).

Em uma concretização adicional deste aspecto da presente invenção, substituir e/ou remover soluções da câmara de reação é evitado empregando um micro-arranjo tendo sondas de FRET (FRET, transferência de energia por ressonância de fluorescência). O uso de tais sondas de FRET é baseado na formação de pares de extintores de fluorescência, de forma que um sinal de fluorescência só ocorra, se uma molécula visada se ligou à sonda complementar na superfície. O uso de sondas de FRET, por exemplo, é descrito em B. Liu et al., PNAS 2005, 102, 3, 589-593; K. Usui et al., Mol Divers. 2004; 8(3):209-18; J. A. Cruz-Aguado et al., Anal. Chem. 2004; 76(14):4182-8 e J. Szollosí et al., I Biotechnol. 2002;82(3):251-66.

Em uma concretização particularmente preferida adicional deste aspecto da presente invenção, substituir e/ou remover soluções da câmara de reação é evitado empregando um dispositivo de acordo com a presente invenção, como é descrito em detalhes no seguinte, para detectar qualitativamente e/ou quantitativamente interações moleculares entre moléculas de sonda e alvo, em que dito dispositivo inclui: a) um micro-arranjo tendo um substrato, sobre o qual as moléculas de sonda são imobilizadas em elementos do arranjo, em que o micro-arranjo é arranjado em uma primeira superfície do dispositivo; e b) uma câmara de reação formada entre a primeira superfície, sobre a qual o micro-arranjo é arranjado, e uma segunda superfície, e em que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície é variável.

Um alvo adicional da presente invenção relaciona-se ao uso de moléculas de sonda de FRET, como descrito acima, e/ou métodos de detecção selecionados do grupo consistindo em microscopía de fluorescência de reflexão interna total (TIRF), como descrito acima, microscopía de fluorescência confocal, como descrito acima, métodos para detectar alterações de massa, como descrito acima, métodos para detectar ondas de superfície acústicas, como descrito acima, métodos para a detecção eletroquímica e/ou elétrica como descrito acima, para evitar a substituição de soluções em uma câmara de reação e/ou remoção de soluções de uma câmara de reação durante ou depois de alimentar uma amostra contendo moléculas alvo na câmara de reação e antes ou durante a detecção em um método para detectar qualitativamente e/ou quantitativamente interações moleculares entre moléculas de sonda e alvo, em particular incluindo as etapas seguintes: a) alimentar uma amostra contendo moléculas alvo em uma câmara de reação tendo um micro-arranjo, em que o micro-arranjo inclui um substrato, sobre o qual as moléculas de sonda são imobilizadas em elementos de arranjo; b) detectar uma interação entre as moléculas alvo e as moléculas de sonda imobilizadas no substrato.

Um alvo adicional da presente invenção é, em particular, um dispositivo para detectar qualitativamente e/ou quantitativamente interações moleculares entre moléculas de sonda e alvo, incluindo: a) um micro-arranjo tendo um substrato, sobre o qual as moléculas de sonda são imobilizadas em elementos de arranjo, em que o micro-arranjo é arranjado em uma primeira superfície do dispositivo; e b) uma câmara de reação formada entre a primeira superfície, na qual o micro-arranjo é arranjado, e uma segunda superfície, em que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície é variável.

Subsequentemente à interação completada entre moléculas de sonda e moléculas alvo, um fundo indesejado é causado pelas moléculas rotuladas presentes na solução de amostra, que não interagem com as moléculas de sonda. No caso, as moléculas de sonda e/ou visadas são ácidos nucleicos e/ou análogos de ácido nucleico, dito fundo é causado, em particular, pelos iniciadores rotulados e/ou ácidos nucleicos rotulados presentes na solução de amostra, que não são hibridizados com as moléculas de sonda.

Uma possibilidade conhecida de remover sinais de fundo perturbadores é a substituição da solução de amostra depois de interação completada com uma solução não rotulada, por exemplo não fluorescente. Porém, esta variante é geralmente anti-econômica e propensa à interferência devido à corrosão, envelhecimento das soluções e problemas de impermeabilidade. É uma característica significativa do dispositivo de acordo com a presente invenção que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície é variável. Distância variável entre o micro-arranjo e a segunda superfície significa que a câmara de reação do dispositivo de acordo com a presente invenção é compressível. Em particular, a distância entre micro-arranjo e a segunda superfície é variável de tal modo que o micro-arranjo possa se assentar uniformemente e/ou reversivelmente na segunda superfície, ou possa ser apertado sobre dita superfície, com seu lado ativo, isto é, o lado sobre o qual as sondas de ácido nucleico são imobilizadas.

Uma câmara de reação compressível portanto permite deslocamento de solução de amostra contendo moléculas rotuladas, que não interagem com as moléculas de sonda e portanto constituem um fundo indesejado, reduzindo a distância entre o micro-arranjo e plano de detecção antes de executar a detecção. Desta maneira, uma detecção de interações entre moléculas de sonda e alvo usando qualquer sistema de detecção óptica é possível sem substituir a solução de amostra com uma solução não rotulada antes da detecção. Por exemplo, formação de imagem microscópica por fluorescência simples do chip de DNA para detectar os sinais de interação por meio do dispositivo de acordo com a presente invenção sem substituir a solução de amostra com um líquido não rotulado, em particular fracamente fluorescente, é possível. É assegurado finalmente, em particular por meio das concretizações do dispositivo de acordo com a presente invenção descrita no seguinte, que focalização de sistemas de detecção ópticos não é mais necessária. Assim, o dispositivo de acordo com a presente invenção permite, por exemplo, o uso de um dispositivo de microscópio de fluorescência simples sem função de autofoco como dispositivo de leitura para a detecção da hibridização entre alvos e sondas sem necessitar de etapas de manipulação de líquido como, em particular, etapas de lavagem, para remover moléculas alvo não ligadas ao arranjo, como por exemplo ácidos nucleicos visados não hibridizados, contrariamente aos sistemas de detecção de fluorescência óptica até agora usados para a detecção de ácidos nucleicos.

Apesar de tratamento e análise de amostra multifuncional, que é possível por meio do dispositivo de acordo com a presente invenção, um sistema muito eficiente em custo para detectar e, opcionalmente, ampliar moléculas alvo em uma amostra, é provido. Os dispositivos de acordo com a presente invenção, em particular com relação a um sistema de detecção óptica, são além disso robustos a uma tal extensão que eles também são adequados para uso móvel.

Por meio de selecionar adequadamente chip, protocolos de processamento, e substâncias químicas de análise, o dispositivo de acordo com a presente invenção pode ser empregado para os tipos mais diferentes de análises de gene, como por exemplo diagnósticos de predisposição, diagnósticos de germe e tipificação. Assim, uma análise genética completa é administrável com pouco esforço de equipamento no dispositivo de acordo com a presente invenção, que também pode ser implementada como um cartucho descartável. Portanto, o dispositivo de acordo com a presente invenção permite executar métodos de detecção no local, por exemplo durante doação de sangue. Um resultado medido pode ser obtido rapidamente, preferivelmente dentro de 0,5 a 2 horas. Todas as etapas praticáveis com o dispositivo de acordo com a presente invenção, como purificação, processamento, amplificação de ácidos nucleicos, e a hibridização atual podem ser conduzidas automaticamente, O operador só precisa estar familiarizado com retirada de amostra, alimentação de amostra no dispositivo de acordo com a presente invenção, e tomar conhecimento dos resultados de análise.

Preferivelmente, a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície é variável em uma faixa de cerca de 0 a cerca de 1 ram. Limites inferiores preferidos adicionais para a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície são cerca de 0,1 pm, cerca de 1 μηι, e cerca de 10 μιη. Limites superiores preferidos adicionais para a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície são cerca de 0,01 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 1 mm e mais preferivelmente cerca de 0,3 mm. Surpreendentemente, a interação entre sondas e alvos na superfície de arranjo não é mesmo afetada se a distância entre a superfície de substrato e a segunda superfície for aproximadamente zero ou quase zero.

Preferivelmente, o dispositivo de acordo com a presente invenção ademais inclui um sistema de detecção. Aqui, é preferido que o sistema de detecção seja um sistema óptico. Exemplos para sistemas adequados dentro da extensão da presente invenção são sistemas de detecção baseados em fluorescência, absorção óptica, transferência de ressonância, e similares. Preferivelmente, o sistema de detecção óptica é um sistema de fluorescência óptica. Particularmente preferivelmente, o sistema de fluorescência óptica é um microscópio de fluorescência sem autofoco, por exemplo um microscópio de fluorescência com foco fixo.

Em uma concretização adicional, o sistema de detecção está conectado com pelo menos um espaçador, que ajusta uma distância entre o sistema de detecção e a segunda superfície ao assentar sobre a segunda superfície. Se a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície for quase zero, o espaçador também determina a distância entre a superfície do chip e o sistema óptico do dispositivo de detecção. E assim possível manter a variância da distância entre o dispositivo de detecção óptico e a superfície de micro-arranjo muito pequena. A variância só inclui a variância de espessura da segunda superfície, em geral uma superfície de vidro, a deflexão da segunda superfície, e a espessura de uma camada causada por possíveis impurezas nas superfícies de aperto entre o chip e plano de detecção ou entre o espaçador e o plano de detecção. Isto produz re-focalização para trazer o sistema óptico em foco desnecessário, que simplifica consideravelmente a operação do dispositivo e/ou faz uma instalação de autofoco cara desnecessária.

Em uma concretização adicional, regiões de compensação lateralmente limitantes, que mantêm o volume na câmara de reação basicamente constante quando a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície é reduzida, são providas para o espaço de reação formado entre a primeira e a segunda superfícies.

Preferivelmente, o espaço de reação formado entre a primeira e a segunda superfícies é além disso limitado lateralmente por vedações elásticas. Particularmente preferivelmente, as vedações elásticas são feitas de borracha de silicone. A fim de assegurar a detecção de interações entre moléculas de sonda e alvo, a segunda superfície é, em particular, feita de um material opticamente transparente, preferivelmente vidro.

Em uma concretização adicional do dispositivo de acordo com a presente invenção, a primeira superfície é, pelo menos na região abaixo do micro-arranjo, desenvolvida de tal modo que o micro-arranjo possa ser guiado relativamente à segunda superfície de tal modo que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície seja variável.

Aqui, a primeira superfície pode, pelo menos na região abaixo do micro-arranjo, ser desenvolvida de tal modo que o micro-arranjo possa ser guiado na direção para a segunda superfície de forma que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície possa ser reduzida e/ou que o micro-arranjo possa ser guiado em uma direção longe da segunda superfície de forma que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície possa ser aumentada.

Nesta concretização, é preferido que a primeira superfície possa, pelo menos na região abaixo do micro-arranjo, ser deformada elasticamente. Particularmente preferivelmente, a primeira superfície é feita de um material sintético elástico, por exemplo uma membrana elástica.

Pode ser ademais preferido que a primeira superfície seja formada por duas camadas sobrepostas, em que uma camada exterior das duas camadas sobrepostas tem um rebaixo pelo menos na região abaixo do micro-arranjo. Nesta concretização, é preferido que uma camada interna das duas camadas sobrepostas seja formada por uma vedação elástica ou uma membrana de vedação, que normalmente também limita o espaço de reação lateralmente (veja Figura 6). A membrana de vedação pode ser guiada para a segunda superfície. A membrana de vedação fecha um rebaixo na camada exterior, que normalmente corresponde ao lado inferior do corpo de câmara. Durante o desempenho de uma PCR na câmara de reação, uma pressão interna, que faz a câmara de reação resistente à pressão apesar da membrana de vedação relativamente instável, é gerada devido às mais altas temperaturas prevalecendo em uma PCR. Esta concretização assim corresponde a uma válvula de auto-fechamento. A fim de assegurar a elasticidade da membrana de vedação, a membrana é preferivelmente provida com uma dobra de compensação (veja Figura 6).

Pode ser ademais provido que o dispositivo inclui pelo menos um meio, através do qual o micro-arranjo pode ser guiado relativamente à segunda superfície. No seguinte, dito meio será referido como meio para guiar a primeira superfície. Dito meio para guiar a primeira superfície é preferivelmente selecionado do grupo consistindo em uma haste, um pino, um ressalto e um parafuso.

Aqui, o dispositivo pode incluir pelo menos um meio para guiar a primeira superfície, através do qual o micro-arranjo pode ser guiado para a segunda superfície de tal modo que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície possa ser reduzida e/ou por meio do qual o micro-arranjo possa ser guiado longe da segunda superfície de tal modo que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície possa ser aumentada.

Particularmente preferivelmente, o micro-arranjo pode ser guiado relativamente à segunda superfície por meio de pressão e/ou tração, que é exercida na primeira superfície pelo meio.

Aqui, os espaçadores acima mencionados se assentando na segunda superfície podem servir como retentores para o meio para guiar a primeira superfície.

Pode ser preferido ademais que a primeira superfície possa ser feita vibrar pelo meio para guiar a primeira superfície, em particular para vibrar a uma ffeqüência de 10 a 30 Hz, particularmente preferivelmente de cerca de 20 Hz. Desta maneira, bolhas presentes sobre o chip, que impediríam uma detecção, podem ser removidas e/ou a velocidade de interação, por exemplo a velocidade de hibridização, pode ser aumentada por uma mistura completa devido à vibração do meio para guiar a primeira superfície.

Também pode ser preferido que a segunda superfície possa ser guiada relativamente à primeira superfície de tal modo que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície seja variável.

Aqui, a segunda superfície pode ser guiada relativamente à primeira superfície de tal modo que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície possa ser reduzida e/ou que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície possa ser aumentada.

Em particular, isto pode ser assegurado pela segunda superfície sendo guiável relativamente à primeira superfície por meio do espaçador exercendo pressão e/ou tração na segunda superfície, tal que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície seja variável.

Em uma concretização preferida adicional do dispositivo de acordo com a presente invenção, ambas a primeira superfície e a segunda superfície podem ser guiadas de tal modo que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície seja variável.

Em uma concretização adicional, o dispositivo de acordo com a presente invenção é desenvolvido de tal modo que, já no estado original, o micro-arranjo montado na primeira superfície se assente, preferivelmente uniformemente, na segunda superfície formando o plano de detecção. A primeira superfície pode ser guiada de tal modo que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície possa ser aumentada. Aqui, a primeira superfície é preferivelmente feita de um material elástico.

Em uma concretização adicional do dispositivo de acordo com a presente invenção, a primeira superfície é desenvolvida de uma maneira articulável ao redor de um eixo de rotação. O eixo de rotação divide a primeira superfície em dois lados. Nesta concretização, o micro-arranjo é arranjado em uma primeira porção de flanco da primeira superfície. Preferivelmente, o eixo de rotação para o movimento articulado corre pelo centro da primeira superfície, isto é, as duas porções de flanco preferivelmente são de tamanho igual. A primeira superfície é preferivelmente feita de um material elástico.

Em uma primeira posição da primeira superfície articulável, a primeira superfície é arranjada basicamente paralela à segunda superfície. Na primeira posição, a superfície do micro-arranjo contata a segunda superfície, basicamente uniformemente, isto é, a superfície de substrato com as moléculas de sonda imobilizadas nela é basicamente não umedecida pela solução de amostra. Em dita primeira posição, um espaço, que também é referido como câmara de processamento no seguinte, é formado entre a segunda porção de flanco da primeira superfície e da segunda superfície. Dita câmara de processamento pode servir como uma câmara para processar a solução de amostra.

Em uma segunda posição da primeira superfície articulável, a primeira superfície é arranjada a um ângulo diferente de 180° em relação à segunda superfície. Em dita segunda posição, a superfície do micro-arranjo não contata a segunda superfície, isto é, as moléculas de sonda imobilizadas no substrato do micro-arranjo são acessíveis livremente para as moléculas alvo presentes na solução de amostra e portanto podem interagir com a última. Na segunda posição, a câmara de processamento é comprimida. A primeira superfície articulável preferivelmente pode ser girada por meio de exercer tração na primeira porção de flanco da primeira superfície e/ou por meio de exercer pressão na segunda porção de flanco da primeira superfície. Pressão e/ou tração pode ser exercida através de um meio para guiar a primeira superfície, como descrito acima. O chip ou o substrato ou a primeira superfície preferivelmente pode consistir em silício, materiais cerâmicos como cerâmica de óxido de alumínio, vidros de boro, vidro de quartzo, cristal único CaF2, discos de safira, topázio, PMMA, policarbonato e/ou poliestireno. A seleção dos materiais também é para ser feita dependente do uso planejado do dispositivo ou do chip. Se, por exemplo, o chip for usado para caracterizar produtos de PCR, só esses materiais podem ser usados, que podem resistir a uma temperatura de 95°C.

Preferivelmente, os chips são funcionalizados por meio de moléculas de ácido nucleico, em particular por meio de moléculas de DNA ou RNA. Porém, eles também podem ser funcionalizados por meio de peptídeos e/ou proteínas, como por exemplo anticorpos, moléculas de receptor, peptídeos farmaceuticamente ativos e/ou hormônios, carboidrato e/ou polímeros misturados de ditos biopolímeros. , Em uma concretização preferida adicional, as sondas moleculares são imobilizadas na superfície de substrato por um ligador polimérico, por exemplo uma camada de silano modificada. Tal ligador polimérico pode servir para a preparação derivada da superfície de substrato e portanto para a imobilização das sondas moleculares. No caso de ligação covalente das sondas, polímeros, por exemplo silanos, são usados, que foram funcionalizados ou modificados por meio de funcionalidades reativas como epóxidos ou aldeídos. Além disso, a pessoa qualificada na arte também está familiarizada com a ativação de uma superfície por meio de isotiocianato, sucinimido e ésteres de imido. Para este fim, superfícies fiincionalizadas de amino são ífeqüentemente derivadas correspondentemente. Além disso, a adição de reagentes de acoplamento, como por exemplo diciclo-hexilcarbodiimido, pode assegurar imobilizações correspondentes das sondas moleculares. O corpo de câmara da câmara de reação preferivelmente consiste em materiais como vidro, material sintético e/ou metais como aço de alto grau, alumínio e latão. Para sua fabricação, por exemplo materiais sintéticos adequados para moldagem por injeção podem ser usados. Inter alia, materiais sintéticos como macrolon, náilon, PMMA, e teflon são concebíveis. Em concretizações especiais, materiais sintéticos eletricamente condutivos como poliamida com 5 a 30% de fibras de carbono, policarbonato com 5 a 30% de fibras de carbono, poliamida com 2 a 20% de fibras de aço inoxidável, e PPS com 5 a 40% de fibras de carbono e, em particular, 20 a 30% de fibras de carbono, são preferidos. Altemativamente e/ou além disso, o espaço de reação entre a primeira e segunda superfícies pode ser fechado por meio de paredes, que, por exemplo, permitem enchimento do espaço de reação por meio de seringas. Em uma concretização preferida, o corpo de câmara consiste em materiais opticamente transparentes como vidro, PMMA, policarbonato, poliestireno e/ou topázio. Aqui, a seleção de materiais é para ser ajustada ao uso planejado do dispositivo. Por exemplo, as temperaturas que o dispositivo estará exposto são para serem consideradas ao selecionar os materiais, Se, por exemplo, o dispositivo for para ser usado para executar uma PCR, por exemplo, só esses materiais sintéticos podem ser usados, que permanecem estáveis por períodos mais longos a temperaturas como 95°C.

Em particular, o corpo de câmara é desenvolvido de tal modo que o micro-arranjo possa ser apertado contra a segunda superfície uniformemente e/ou reversivelmente com seu lado ativo, isto é, o lado do arranjo, sobre o qual as sondas de ácido nucleico são imobilizadas.

Em uma concretização especial, o dispositivo de acordo com a presente invenção inclui módulos selecionados do grupo consistindo em um corpo de câmara, preferivelmente feito de um material sintético, uma parede ou uma vedação vedando a câmara de reação, um chip de DNA e/ou uma segunda superfície opticamente transparente, preferivelmente uma faceta de vidro, em que a segunda superfície pode opcionalmente também servir como chip simultaneamente (veja Figura 2 e Figura 3). Nesta concretização, o corpo de câmara e vedação são desenvolvidos elasticamente, de forma que o chip de DNA possa ser apertado uniformemente e reversivelmente à cobertura de vidro com seu lado ativo. Por esse meio, o líquido de análise rotulado localizado entre o chip de DNA e a superfície de detecção é deslocado completamente (veja Figura 5 e Figura 6). Desta maneira, uma detecção de fluorescência altamente sensível, por exemplo uma microscopia de fluorescência de formação de imagem por computador, pode ser conduzida sem ser prejudicada por uma fluorescência de fundo da solução de amostra.

Preferivelmente, a segunda superfície do corpo de câmara consiste em materiais transparentes como vidro e/ou materiais sintéticos opticamente permeáveis, por exemplo PMMA, policarbonato, poliestireno, ou acrílico.

Preferivelmente, a câmara de reação é desenvolvida entre a segunda superfície e o micro-arranjo na forma de um intervalo capilar tendo espessura variável. Formando um intervalo capilar entre o chip e o plano de detecção, forças capilares podem ser utilizadas para encher seguramente a câmara de reação. Ditas forças capilares já ocorrem no estado não comprimido da câmara de reação, elas podem, porém, ser aumentadas comprimindo a câmara de reação. Particularmente preferivelmente, a intervalo capilar tem uma espessura na faixa de cerca de 0 pm a cerca de 100 pm.

Da possibilidade de ser capaz de comprimir o espaço de reação e portanto reduzir a largura da abertura entre o micro-arranjo e o plano de detecção, possibilidades adicionais de operar o líquido dentro da câmara de reação surgem. Assim, em uma concretização adicional da presente invenção, várias sub-câmaras são providas em vez de uma única câmara, em que as partições entre ditas sub-câmaras não alcançam a altura da segunda superfície, de forma que uma conexão de fluido seja gerada entre as sub-câmaras em um estado não comprimido da câmara de reação. Comprimindo a câmara de reação, as câmaras podem ser separadas. Assim, comprimindo, as partições entre as câmaras podem ser operadas como válvulas.

Uma concretização especial de ditas sub-câmaras separadas por válvulas é a subdivisão do espaço de reação do dispositivo de acordo com a presente invenção em câmaras de PCR diferentes. Em cada câmara, iniciadores individuais são apresentados. No princípio, as sub-câmaras são enchidas simultaneamente com o analito. Subseqüentemente, o espaço de reação é comprimido. Depois disso, o espaço de reação é sujeito ao ciclo de temperatura para a PCR. Como cada sub-câmara é enchida com iniciadores diferentes, uma reação de amplificação diferente acontece em cada câmara. Uma troca entre as câmaras não ocorre.

Depois que a PCR foi conduzida, hibridização acontece. Aqui, cada sub-câmara pode conter uma região de chip individual ou um chip individual. Porém, também é possível facilitar uma conexão de fluido entre as sub-câmaras aumentando a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície, de forma que as substâncias diferentes a serem ampliadas se misturem e desta maneira hibridizem a uma superfície de chip. A vantagem desta concretização ter sub-câmaras separadas por válvulas é o aumento em multiplexidade da PCR, isto é, o número de PCRs independentes com uma amostra, que está limitado por razões bioquímicas em uma reação de um estágio. Assim, é possível ajustar o número de PCRs ao número possível de sondas na superfície de chip.

Em uma concretização adicional da presente invenção, a câmara de reação assim inclui pelo menos duas sub-câmaras, em que em um primeiro estado não comprimido, as sub-câmaras estão em conexão fluida e em um segundo estado comprimido, não há nenhuma conexão fluida entre as sub-câmaras.

Particularmente preferivelmente, cada sub-câmara é nomeada a uma região definida do micro-arranjo.

Em particular, as sub-câmaras podem ser formadas equipando o micro-arranjo d ou a segunda superfície com cavidades, que servem como paredes entre as sub-câmaras.

Particularmente preferivelmente, as paredes entre as sub-câmaras são formadas por vedações elásticas.

Certamente, esta concretização da unidade de processo tendo sub-câmaras separadas por válvulas pode ser arbitrariamente combinada com quaisquer dos princípios de compressão acima descritos.

Em uma concretização adicional do dispositivo de acordo com a presente invenção, a primeira superfície é feita de um material elástico parcialmente deformável, por exemplo uma membrana elástica. Visto que só uma parte do espaço de reação pode ser comprimida, sub-câmaras, em que o chip é guiado para a segunda superfície, sub-câmaras, que não podem ser separadas uma da outra, e sub-câmaras que não podem ser alteradas, podem, inter alia, ser geradas. Por esse meio, sistemas de bomba simples, que podem, por exemplo, ser usados para bombear sais na câmara de hibridização ao término de uma reação de amplificação, podem ser implementados no espaço de reação. Isto pode, por exemplo, ser vantajoso para otimizar as condições de hibridização químicas da solução de PCR, em que a solução de PCR é otimizada só para a condução da PCR.

Ao subdividir a câmara de reação em várias sub-câmaras, é preferido usar vários meios para agitação. Normalmente, o meio para agitação é idêntico ao meio para guiar a primeira superfície. Por esse meio, câmaras individuais podem ser agitadas especifícamente. Isto pode, por exemplo, ser apropriado para implementar espaços de amplificação separados e/ou espaços de hibridização.

Certamente, esta concretização do dispositivo de acordo com a presente invenção tendo vários meios para agitação também pode ser combinada arbitrariamente com quaisquer dos princípios de compressão acima descritos.

Os componentes ou módulos acima descritos do dispositivo de acordo com a presente invenção selecionados do grupo consistindo em um corpo de câmara, vedações lateralmente limitando o espaço de reação, micro-arranjo, e plano de detecção formam a denominada unidade de processo do dispositivo de acordo com a presente invenção. Na unidade de processo, PCR, reações de hibridização, detecção e/ou avaliação podem ser conduzidas. Isto é semelhantemente verdade para sondas e alvos sendo, por exemplo, anticorpos e proteínas a serem detectadas, assim uma PCR não tem que ser efetuada. Porém, as explicações seguintes são particularmente feitas com respeito às técnicas de detecção usando alvos e sondas de ácido nucleico. Porém, está claro à pessoa qualificada na arte como modificar as unidades descritas no seguinte para adaptá-las para outras aplicações.

Preferivelmente, a unidade de processo do dispositivo de acordo com a presente invenção é construída de uma maneira modular. Isto significa que a unidade de processo pode incluir qualquer combinação arbitrária dos módulos. Os módulos também podem ser trocados durante análise, Em uma concretização preferida adicional, o dispositivo de acordo com a presente invenção alem disso inclui uma unidade de controle e/ou regulação de temperatura para controlar e/ou regular a temperatura na câmara de reação. Tal unidade de controle e/ou regulação de temperatura para controlar e/ou regular a temperatura na câmara de reação em particular inclui elementos de aquecimento e/ou esfriamento ou blocos de temperatura. Aqui, os elementos de aquecimento e/ou esfriamento ou os blocos de temperatura podem ser arranjados de tal modo que eles contatem a primeira superfície e/ou a segunda superfície. Por meio de contatar ambas a primeira e a segunda superfícies, controle e regulação de temperatura particularmente eficiente são assegurados.

Nesta concretização, o substrato do micro-arranjo ou a primeira superfície e/ou a segunda superfície está conectada com elementos de aquecimento e/ou esfriamento e/ou blocos de temperatura e deveríam então consistir preferivelmente de materiais com boas propriedades de condução de calor. Tais materiais condutivos de calor oferecem a vantagem considerável de assegurar um perfil de temperatura homogêneo ao longo da superfície inteira do espaço de reação e portanto permitindo reações dependentes de temperatura, como por exemplo uma PCR, ser conduzida homogeneamente ao longo da câmara de reação inteira, entregando altos rendimentos, e capacidade de controle ou regulação com alta exatidão.

Assim, em uma concretização preferida, o substrato do micro-arranjo ou a primeira superfície ou a segunda superfície consistem em materiais tendo uma boa condutividade de calor, preferivelmente tendo uma condutividade de calor em uma faixa de 15 a 500 Wm^K'1, particularmente preferivelmente em uma faixa de 50 a 300 ΨηΤ'Κ'1, e mais preferivelmente em uma faixa de 100 a 200 Wnff, em que os materiais normalmente não são transparentes opticamente. Exemplos para materiais condutivos de calor adequados são silício, materiais cerâmicos como cerâmicas de óxido de alumínio, e/ou metais como aço de alto grau, alumínio, cobre, ou latão.

Se o substrato do micro-arranjo ou a primeira superfície ou a segunda superfície do dispositivo de acordo com a presente invenção consistir substancialmente em materiais cerâmicos, o uso de cerâmica de óxido de alumínio é preferido. Exemplos para tais cerâmicas de óxido de alumínio são as cerâmicas A-473, A-476 e A-493 por Kyocera (Neuss, Alemanha), Preferivelmente, o substrato do micro-arranjo ou a primeira superfície ou a segunda superfície é equipada com sensores de temperatura opcionalmente miniaturizados e/ou eletrodos ou tem estruturas de aquecedor em seu lado traseiro, isto é, o lado enfrentando longe da câmara de reação, de forma que temperar o líquido de amostra e misturar o líquido de amostra por meio de um fluxo eletro-osmótico induzido seja possível.

Os sensores de temperatura, por exemplo, podem ser desenvolvidos como sensores de temperatura de resistência de filme fino de níquel-cromo.

Os eletrodos, por exemplo, podem ser desenvolvidos como eletrodos de ouro-titânio e, em particular, como quadripolo.

Os elementos de aquecimento e/ou esfriamento podem preferivelmente ser selecionados de tal modo que aquecimento e esfriamento rápido do líquido na câmara de reação seja possível. Aqui, aquecimento e esfriamento rápido é entendido denotar que alterações de temperatura em uma faixa de 0,2 K/s a 30 K/s, preferivelmente de 0,5 K/s a 15 K/s, particularmente preferivelmente de 2 K/s a 15 K/s, e mais preferivelmente de 8 K/s a 12 K/s ou cerca de 10 K/s, podem ser mediadas pelos elementos de aquecimento e/ou esfriamento. Preferivelmente, alterações de temperatura de 1 K/s a 10 K/s também podem ser mediadas pelos elementos de aquecimento e/ou esfriamento.

Os elementos de aquecimento e/ou esfriamento, por exemplo aquecedores de resistência, podem, por exemplo, ser desenvolvidos como aquecedores de resistência de filme fino de níquel-cromo.

Para detalhes adicionais sobre a especificação e dimensão dos sensores de temperatura, elementos de aquecimento e/ou esfriamento ou meio para aumentar a temperatura e os eletrodos, é referido aos conteúdos do Pedido de Patente Internacional WO 01/02094.

Em uma concretização preferida, têmpera da câmara de reação é assegurada usando um corpo de câmara consistindo em material eletricamente condutivo. Tal material eletricamente condutivo é preferivelmente um material sintético eletricamente condutivo, como por exemplo poliamida, opcionalmente tendo 5 a 30% de fibras de carbono, policarbonato, opcionalmente tendo 5 a 30% de fibras de carbono e/ou poliamida, opcionalmente tendo 2 a 20% de fibras de aço inoxidável. Preferivelmente, PPS (polifenilenessulfeto) com 5 a 40% de fibras de carbono, particularmente preferivelmente 20 a 30% de fibras de carbono, é usado como material sintético eletricamente condutivo. É ademais preferido que o corpo de câmara seja desenvolvido de tal modo que tenha intumescimentos e afilamentos. Tais intumescimentos ou afilamentos no corpo de câmara permitem aquecimento específico da câmara de reação ou das superfícies correspondentes. Além disso, o uso de tais condutores de volume tem a vantagem que, também com condutividade de calor opcionalmente mais baixa do material usado, têmpera homogênea da câmara ou das superfícies correspondentes é assegurada, como calor é liberado em cada elemento de volume.

Acoplar e extrair calor no espaço de reação pode ser conduzido de modos diferentes. Inter alia, é pretendido introduzir calor por radiação de microondas externa, aquecimento por resistência interna ou externa, bobinas de indução internas ou superfícies, esfriamento e aquecimento por água, fricção, irradiação com luz, em particular com luz de IR, esfriamento e/ou aquecimento de ar, fricção, emissores de temperatura e elementos de Peltier.

Medir a temperatura no espaço de reação pode ser conduzido de modos diferentes, por exemplo por meio de sensores de resistência integrados, sensores de semicondutor, sensores de guia de onda de luz, corantes policromáticos, cristais líquidos policromáticos, pirômetros externos como sensores de radiação de IR e/ou temperatura de todos os tipos, que são integrados no meio para guiar o micro-arranjo.

Medir a temperatura na câmara de reação podem ser além disso conduzido por meio de integrar um sensor de temperatura no corpo de câmara, por exemplo por meio de injeção no curso do processo de produção do corpo de câmara, por meio de medição sem contato com a ajuda de um pirômetro, um sensor de IR e/ou termopilhas, por meio de medição de contato, por exemplo com um sensor térmico integrado no dispositivo e contatando uma superfície adequada ou um volume adequado do corpo de câmara ou a câmara, por meio de medir a alteração dependente de temperatura do índice de refração no plano de detecção, por meio de medir a alteração dependente de temperatura da cor de moléculas específicas, por exemplo na solução, no arranjo de sonda, ou na vedação de câmara, e/ou por meio de medir a alteração dependente de temperatura do valor de pH da solução usada por meio de medir a alteração de cor de um indicador sensível a pH, por exemplo por meio de medir sua absorção.

Além disso, limitação automática de temperatura pode ocorrer devido a um surto da resistência do aquecedor, em que a temperatura de limiar correspondente preferivelmente se acha em uma faixa de 95°C a 110°C. Ao alcançar a temperatura de limiar, a resistência do aquecedor cresce, por meio de que virtualmente nenhuma corrente flui e portanto virtualmente nenhum calor é emitido mais. Em particular, polímeros, como poliamidas eletricamente condutivas, cuja resistência aumenta na temperatura de limiar devido à alteração da matriz do polímero ou uma alteração de fase, podem ser usadas para tais aquecedores.

Em uma concretização, a unidade de controle e regulação de temperatura pode ser integrada na primeira superfície e/ou na segunda superfície. Em dita concretização, a unidade de processo é, em particular, equipada com um aquecedor (veja Figura 4), que serve para implementar as alterações de temperatura em PCR e hibridização.

Preferivelmente, a unidade de processo tem uma baixa capacidade de calor, de forma que velocidades de alteração de temperatura máximas de, por exemplo, pelo menos 5 K/s sejam praticáveis a uma baixa demanda de potência. A fim de assegurar esfriamento rápido da unidade de processo, outra concretização preferida pretende prover um sistema de esfriamento, por exemplo um sistema de esfriamento de ar, Preferivelmente, esfriamento da unidade de processo também pode ser alcançado por meio de temperar permanentemente o espaço cercando a unidade de processo a uma temperatura abaixada e por esse meio esfriar passivamente o cartucho. Isto faz esfriamento ativo do cartucho de reação desnecessário.

Em uma concretização adicional, a unidade de controle e regulação de temperatura pode incluir blocos de temperatura, que é cada um pré-aquecido a uma temperatura definida. Em dita concretização, a unidade de processo, em particular, não tem nenhum aquecedor integrado. Devido à omissão de um sistema de aquecimento integrado, a unidade de processo pode ser provida até mesmo mais eficiente em custo.

Transferência de calor entre os blocos de temperatura da unidade de controle e regulação de temperatura é assegurada preferivelmente visto que os blocos de temperatura contatam a primeira superfície e/ou segunda superfície do dispositivo de acordo com a presente invenção. Preferivelmente, os blocos de temperatura podem ser arranjados linearmente ou em um disco rotativo e, por exemplo, ser integrados no dispositivo de detecção desta maneira. Figura 7 mostra um disco rotativo tendo vários blocos de temperatura, cada um dos quais está ajustado a uma temperatura definida. Por meio de trocar os blocos de temperatura debaixo da unidade de processo, a unidade de processo é trazida a uma temperatura específica definida pelo bloco de temperatura. Preferivelmente, os blocos de temperatura são fabricados de tal modo que eles tenham uma capacidade de calor significativamente mais alta do que a unidade de processo, de forma que velocidades de alteração de temperatura máxima de, por exemplo, pelo menos 5 K/s também sejam praticáveis nesta concretização. Preferivelmente, os blocos de temperatura são só controlados termostaticamente em vez de aquecidos ou esfriados, de forma que a demanda de energia também seja mínima neste caso. Nesta concretização, esfriar ou aquecer a unidade de processo pode ser omitido.

Em uma concretização adicional, a unidade de controle e regulação de temperatura é integrada no meio para guiar a primeira superfície e/ou no meio para agitar e/ou no espaçador. Nesta concretização, transferência de calor é conduzida por meio de contatar o meio e/ou espaçador com a primeira superfície e/ou a segunda superfície.

Preferivelmente, o dispositivo adicionalmente inclui uma unidade de re-processamento para purificar e/ou re-concentrar a solução de amostra e/ou para controlar o carregamento e descarregamento da câmara de reação com fluidos. Dentro da extensão da presente invenção, fluidos são entendidos denotarem líquidos e gases. Além disso, a solução de análise pode ser re-carregada na unidade de re-processamento. A unidade de re-processamento pode fmalmente também ser usada para prover as substâncias químicas de análise necessárias. A conexão dos recipientes de fluido com a câmara de reação pode, por exemplo, ser desenvolvida como descrito no Pedido de Patente Internacional WO 01/02094.

Nesta concretização, a câmara de reação e a unidade de re-processamento são particularmente preferivelmente conectadas por duas cânulas, em que as cânulas são arranjadas de tal modo que uma primeira cânula assegure a alimentação de fluidos da unidade de re-processamento na câmara de reação e uma segunda cânula assegure a fuga de ar deslocado pelos fluidos alimentados da câmara de reação. Uma amostra alimentada na unidade de re-processamento pode assim alcançar a câmara de reação da unidade de processo pelas cânulas. Para este fim, as cânulas são arranjadas de tal modo que elas alcancem na câmara de reação pelo guia de cânula. A unidade de re-processamento pode ser desenvolvida de tal modo que possa ser separada da unidade de processo. Depois de encher a câmara de reação com a solução de amostra e, opcionalmente, com líquidos de reação adicionais, a unidade de re-processamento pode assim ser separada da unidade de processo, preferivelmente ser desengatada, e, opcionalmente ser descartada.

No seguinte, concretizações de unidades integradas ou não integradas para encher a câmara de reação, que também será referida no seguinte como unidade de enchimento ou unidade de re-processamento, serão descritas.

Convencionalmente, a solução de reação é trazida em uma abertura específica da unidade de enchimento por meio de uma ferramenta adequada, por exemplo, uma pipeta. O transporte de líquidos no dispositivo é executado pela pressão exercida pela pipeta ou por meio de outra ferramenta geradora de pressão, como por exemplo uma seringa ou uma unidade automatizada, que é, por exemplo, um componente funcional de um autômato de processamento.

Preferivelmente, a unidade de enchimento é desenvolvida para operação manual de um modo ergonomicamente adequado. Além disso, preferivelmente tem aberturas adicionais facilmente acessíveis aos exteriores para alimentar as substâncias reativas.

Preferivelmente, uma unidade de enchimento além disso tem uma interface de fluido adequada para penetrar na vedação do corpo de câmara, Para este fim, cânulas específicas são usadas, que, por exemplo, consistem em aço de alto grau ou polímeros e normalmente têm um diâmetro de 0,05 mm a 2 mm. Preferivelmente, pelo menos uma ou mais cânulas são arranjadas, particularmente preferivelmente duas, em que uma pode ser usada para enchimento com um líquido reativo e outra para ventilação do espaço de reação e para colher fluídos de excesso. Tais cânulas podem ser conectadas com a unidade de enchimento de uma maneira fixa ou mtercamDiavei, em que preferivelmente uma conexão, que não pode ser separada pelo operador, para implementar itens de enchimento descartáveis, é implementada. A unidade de enchimento pode além disso incluir uma unidade para cobrir as cânulas, de forma que qualquer possível dano do operador ou contaminação do ambiente possa ser evitado depois de separação dos sistemas.

Preferivelmente, a unidade de enchimento além disso inclui uma interface mecânica adequada para contato de encaixe perfeito do cartucho de reação. Dita interface pode ser desenvolvida, por exemplo, na forma de encaixes de pressão específicos. Desta maneira, penetração da vedação do corpo de câmara em locais preferidos pode ser assegurada.

Ao processar o cartucho de reação em autômatos de processamento correspondentes, medidas mecânicas adequadas devem ser tomadas, que permitem ajuste e posicionamento preciso nos dispositivos. Isto se aplica particularmente ao posicionamento para substituição e/ou a alimentação de líquidos e o posicionamento do cartucho de reação para detecção dos sinais depois de condução das reações na câmara de reação. O dispositivo ou a unidade de enchimento pode além disso incluir um recipiente de rejeito integrado, que serve para colher meios gasosos ou líquidos de excesso ou deslocados, como por exemplo enchimentos de gás protetores ou soluções. O recipiente de rejeito pode, por exemplo, ser enchido com um meio gasoso, líquido, ou sólido adicional, que liga as substâncias líquidas ou gasosas reversivelmente ou irreversivelmente, como por exemplo celulose, materiais de filtro, géis de sílíca. Além disso, o recipiente de rejeito pode ter uma abertura de ventilação ou pode exibir uma pressão negativa para melhorar o comportamento de enchimento da unidade inteira.

Altemativamente, o recipiente de rejeito também pode ser desenvolvido como módulo separado. Neste caso, a unidade de enchimento é equipada com interfaces de fluido correspondentes que podem corresponder a padrões comerciais, como por exemplo LuerLock, e que conduzem ao exterior. Tais interfaces podem ter uma forma de conexão de força com sistemas continuados.

Em uma primeira concretização especial, enchimento é conduzido por meio de uma unidade de enchimento destacável tendo um recipiente de rejeito integrado. Em particular, a unidade de enchimento serve para enchimento não periódico da câmara de reação. A unidade de enchimento é, por exemplo, desenvolvida de tal modo que seja tampada ou temporariamente presa ao cartucho, as amostras sejam alimentadas no espaço de reação, e, depois que enchimento é completado, a unidade de enchimento é separada novamente do cartucho e é descartada. Nesta primeira concretização especial, a unidade de enchimento ademais inclui um recipiente de rejeito integrado, que pode ser desenvolvido como descrito acima. Um exemplo para esta concretização é mostrado na Figura 22. O procedimento para encher um cartucho de reação por meio de uma unidade de enchimento modular é mostrado na Figura 23.

Em uma segunda concretização especial, enchimento é conduzido por meio de uma unidade de enchimento integrada. Aqui, a unidade de enchimento é um componente integrado do cartucho de reação e portanto não é separada do anterior; descartar a unidade de enchimento e o cartucho é conduzido simultaneamente. Aqui, a unidade de enchimento é preferivelmente usada para enchimento não periódico da câmara de reação e possivelmente para etapas de fluido interno de processo adicional. Nesta concretização, a unidade de enchimento além disso inclui preferivelmente um dispositivo técnico, que implementa uma posição preferida das cânulas no sistema, em particular para prevenir perfuração inadvertida das cânulas na vedação do corpo de câmara. Porém, também é concebível que as cânulas perfurem a vedação do corpo de câmara em dita posição preferida. Dito dispositivo técnico pode, por exemplo, ser implementado por meio de estabelecer molas, elementos elásticos, on rebaixos específicos e bossas para implementar uma captura. Nesta concretização, a unidade de enchimento ademais inclui um canal de enchimento e rejeito, que inclui interfaces de fluido correspondentes, que também podem corresponder a padrões comerciais, como por exemplo LuerLock, e que conduzem ao exterior. Tais interfaces podem ter um íntertravamento positivo ou não positivo com sistemas continuados e servir para alimentar e/ou remover meios gasosos e/ou líquidos. Um exemplo para esta concretização é mostrado na Figura 24. O procedimento para encher um cartucho de reação tendo uma unidade de enchimento integrada é mostrado na Figura 25.

Em uma terceira concretização especial, enchimento é conduzido por uma unidade de enchimento integrada tendo um recipiente de rejeito integrado. Em dita concretização, a unidade de enchimento é um componente integrado do cartucho de reação e portanto não é separada do anterior; unidade de enchimento e cartucho são descartados simultaneamente. Aqui, a unidade de enchimento é preferivelmente usada para enchimento não periódico da câmara de reação e possivelmente para etapas de fluido interno de processo adicionais. Nesta concretização, a unidade de enchimento além disso também inclui preferivelmente um dispositivo técnico, que implementa uma posição preferida das cânulas no sistema, preferivelmente para prevenir perfuração inadvertida das cânulas na vedação do corpo de câmara. Porém, também é concebível que as cânulas perfurem a vedação do corpo de câmara em dita posição preferida. Dito dispositivo técnico pode, por exemplo, ser implementado por meio de estabelecer molas, elementos elásticos, ou rebaixos específicos e bossas para implementar uma captura. Nesta concretização, a unidade de enchimento além disso inclui um recipiente de rejeito integrado, que pode ser desenvolvido como descrito acima. Um exemplo para esta concretização é mostrado na Figura 26. O procedimento para encher um cartucho de reação com uma unidade de enchimento integrada e recipiente de rejeito integrado pode, por exemplo, ser conduzido por meio de combinar os procedimentos descritos nas Figuras 23 e 25.

No seguinte, uma concretização especial para arranjar cânulas para equilíbrio de pressão durante o procedimento de compressão será descrita. As cânulas de uma ferramenta de enchimento para o cartucho podem, por exemplo, ser arranjadas de tal modo que ambos enchimento em um estado não comprimido e transferência de soluções de reação de excesso durante uma compressão do espaço de reação seja possível. Isto pode ser preferivelmente alcançado por meio de construção adaptada da vedação e um arranjo de cânula, em que as cânulas preferivelmente perfuram as regiões de compensação dentro da câmara de reação. Tal arranjo é particularmente adequado, se o volume de excesso não puder ser tirado por meio de um projeto de vedação especial. Um exemplo para um possível arranjo de cânula vertical com forma inalterada da vedação é mostrado na Figura 27. O dispositivo de acordo com a presente invenção pode ademais incluir uma unidade, que está conectada ao sistema de detecção, para controlar o procedimento de teste e/ou para processar os sinais registrados por meio do sistema de detecção. A unidade de controle e/ou processamento pode ser um micro-controlador ou um computador industrial. Este acoplamento de unidade de detecção e unidade de processamento, que assegura a conversão dos resultados de reação para o resultado de análise, permite, inter alia, o uso do dispositivo de acordo com a presente invenção como dispositivo segurado à mão, por exemplo, em diagnósticos médicos.

Além disso, o dispositivo de acordo com a presente invenção além disso preferivelmente tem uma interface para computadores externos. Inter alia, isto permite a transferência de dados para armazenamento externo.

Em uma concretização preferida adicional, o dispositivo é equipado com uma codificação, preferivelmente uma matriz de dados e/ou um código de barras, contendo informação sobre a biblioteca de substâncias e/ou a condução da amplificação e/ou reação de detecção. Por meio de tal número de identificação individual, o dispositivo de leitura ou detecção pode reconhecer automaticamente, qual teste foi conduzido. Para este fim, um registro de dados contendo informação sobre a biblioteca de substâncias, a condução da reação de detecção, e similares é armazenado em um banco de dados ao fabricar o dispositivo de acordo com a presente invenção. Assim, o registro de dados pode, em particular, conter informação sobre a disposição das sondas no arranjo e informação sobre como avaliação é para ser conduzida da maneira mais vantajosa. O registro de dados ou a matriz de dados pode ademais conter informação sobre o regime de temperatura-tempo de uma PCR a ser conduzida opcionalmente para ampliar as moléculas alvo. O registro de dados assim obtido é preferivelmente dado um número, que é anexado ao portador na forma da matriz de dados. Pelo número registrado na matriz de dados, o registro de dados colocado pode então opcionalmente ser chamado ao ler a biblioteca de substâncias. Finalmente, a matriz de dados pode ser lida pela unidade de controle ou regulação de temperatura e outros controladores, como por exemplo um controle para enchimento e descarrega da câmara de reação pelos recipientes de fluido, e uma condução automática da amplificação e reação de detecção assim pode ser assegurada, A codificação, como uma matriz de dados, não têm que conter obrigatoriamente a informação inteira. Também pode conter simplesmente uma identificação ou número de acesso, por meio do qual os dados necessários são então carregados de um computador ou um portador de dados. O dispositivo de acordo com a presente invenção pode ser fabricado muito facilmente. Na Figura 3, é mostrado que a unidade de processo pode consistir em só quatro componentes individuais, que são simplesmente encaixados um ao outro. Figuras 10 e 11 mostram concretizações, que também podem ser fabricadas facilmente devido à construção de acordo com a presente invenção, embora elas consistam em vários componentes. As tolerâncias geométricas das dimensões dos componentes individuais podem ser muito grandes com, por exemplo, 1/10 a 2/10 mm, de forma que, por exemplo, a moldagem por injeção em larga escala de vedação e corpo de câmara possa ser conduzida de uma maneira muito eficiente em custo. As baixas tolerâncias são facilitadas por meio de apertar o chip contra o plano de detecção, como por esse meio o caminho óptico ao microscópio de detecção é fortemente influenciado pelos componentes da unidade de processo. As únicas quantidades geométricas tendo uma baixa tolerância são a posição x, y do chip e a espessura do plano de detecção. A variância da posição z do chip, porém, só desempenha uma parte auxiliar. Apesar destes baixos requisitos técnicos, um dispositivo de focalização no sistema óptico, por exemplo um microscópio de detecção de fluorescência, não é requerido. Estas propriedades mostram claramente a conveniência do dispositivo de acordo com a presente invenção para uso no local móvel.

Em um aspecto adicional da presente invenção, um método para detectar qualitativamente e/ou quantitativamente interações moleculares entre moléculas de sonda e alvo é provido, que inclui as etapas seguintes: a) alimentar uma amostra, preferivelmente uma solução de amostra incluindo moléculas alvo, em uma câmara de reação de um dispositivo de acordo com a presente invenção como descrito acima; e b) detectar uma interação entre as moléculas alvo e as moléculas de sonda imobilizadas no substrato. O método de acordo com a presente invenção permite a detecção qualitativa e/ou quantitativa de interações moleculares entre moléculas de sonda e alvo em uma câmara de reação, sem necessitar de uma substituição da amostra ou líquidos de reação a fim de remover um fundo perturbador depois que a interação é completada e antes da detecção.

Dentro da extensão da presente invenção, a detecção de uma interação entre a molécula de sonda e a visada é conduzida normalmente como segue: Subseqüentemente a fixar a sonda ou as sondas a uma matriz específica na forma de um micro-arranjo de uma maneira predeterminada ou subseqüentemente a prover um micro-arranjo, os alvos são contatados com as sondas em uma solução e são incubados sob condições definidas. Como resultado da incubação, uma interação específica ou hibridização ocorre entre sonda e alvo. A ligação ocorrendo aqui é significativamente mais estável do que a ligação de moléculas alvo a sondas que não são específicas para a molécula visada. A detecção da interação específica entre um alvo e sua sonda pode ser executada por meio de uma variedade de métodos, que dependem normalmente do tipo do marcador, que foi inserido em moléculas alvo antes, durante ou depois da interação da molécula visada com o micro-arranjo. Tipicamente, tais marcadores são grupos fluorescentes, de forma que interações de alvo/sondas específicas possam ser lidas por fluorescência óptica com alta resolução local e, comparado a outros métodos de detecção convencionais, em particular métodos sensíveis à massa, com pequeno esforço (veja, por exemplo, A. Marshall, J. Hodgson, "DNA chips: An array of possibilities", Nature Biotechnology 1998, 16, 27-31; G. Ramsay, "DNA Chips: State of the art", Nature Biotechnology 1998,16,40-44).

Dependendo da biblioteca de substâncias imobilizada no micro-arranjo e da natureza química das moléculas alvo, interações entre ácidos nucleicos e ácidos nucleicos, entre proteínas e proteínas, e entre ácidos nucleicos e proteínas, podem ser examinadas por meio deste princípio de teste (para pesquisa veja F. Lottspeich, H. Zorbas, 1998, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlim, Alemanha), Aqui, bibliotecas de anticorpos, bibliotecas de receptores, bibliotecas de peptídeos, e bibliotecas de ácidos nucleicos são consideradas como bibliotecas de substâncias, que podem ser imobilizadas em micro-arranjos ou chips.

As bibliotecas de ácidos nucleicos desempenham o papel mais importante sem dúvida. Estes são micro-arranjos, nos quais moléculas de ácido desoxirribonucleico (DNA) ou moléculas de ácido ribonucleico (RNA) são imobilizadas.

Em uma concretização preferida do método de acordo com a presente invenção, a distância entre micro-arranjo e segunda superfície é mantida em uma posição, que permite processamento da solução de amostra e/ou a interação entre as moléculas alvo e as moléculas de sonda imobilizadas no substrato, por exemplo amplificação de ácidos nucleicos a serem detectados e/ou hibridização entre ácidos nucleicos a serem detectados e as sondas de ácido nucleico imobilizadas no substrato, antes de detecção na etapa b). É preferido ademais que na etapa b) a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície seja alterada, preferivelmente reduzida. Isto é, a detecção é preferivelmente conduzida com uma distância reduzida entre o micro-arranjo e o plano de detecção. Particularmente preferivelmente, a distância entre o micro-arranjo e o plano de detecção é cerca de zero durante detecção.

Em uma concretização, o micro-arranjo é guiado para a segunda superfície a fim de reduzir a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície. Preferivelmente, isto é assegurado por meio de empurrar a primeira superfície por meio de pressão exercida por pelo menos um meio para guiar a primeira superfície, por exemplo um ressalto, uma haste, um pino e/ou um parafuso, em que o ponto de pressão do meio está localizado, em particular, debaixo do micro-arranjo.

Apertar o micro-arranjo contra a segunda superfície ou o plano de detecção pode ser facilitado visto que a primeira superfície é deformável elasticamente pelo menos na região debaixo do micro-arranjo. Altemativamente, a primeira superfície pode ser desenvolvida por meio de duas camadas sobrepostas, em que uma camada exterior das duas camadas sobrepostas tem um rebaixo pelo menos na região debaixo do micro-arranjo, e uma camada interna das duas camadas sobrepostas é formada por uma vedação elástica. Pressão é então exercida na camada interna na redondeza do rebaixo pelo meio para guiar a primeira superfície. O meio para guiar a primeira superfície, por exemplo um pino, uma haste, um ressalto e/ou um parafuso, não só serve para exercer uma pressão na primeira superfície, porém. No evento que bolhas deveríam se formar no chip de DNA, que impediría a detecção, estas bolhas podem ser removidas por meio de agitação pelo meio para guiar a primeira superfície, por exemplo por meio de uma freqüência de vibração de cerca de 20 Hz aplicada à primeira superfície, em particular na forma de uma membrana elástica.

Além disso, há frequentemente o problema que a interação, por exemplo a hibridização, na superfície de chip leva um tempo muito longo. Entre outras razões, isto é devido ao fato que a velocidade de interação ou hibridização é determinada por difusão. Preferivelmente, a velocidade de interação ou hibridização pode ser aumentada por meio de agitação pelo meio para guiar a primeira superfície, por exemplo por meio de uma frequência de vibração de cerca de 20 Hz aplicada à primeira superfície, em particular na forma de uma membrana elástica, como a agitação ou vibração conduz à mistura na câmara de reação.

Em uma concretização adicional, a segunda superfície é guiada para a primeira superfície a fim de reduzir a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície, Em particular, isto pode ser assegurado visto que a segunda superfície é guiada para a primeira superfície por meio de pressão exercida na segunda superfície pelo espaçador.

Em uma concretização adicional, a primeira superfície é guiada para a segunda superfície e a segunda superfície é guiada para a mmeira superfície a fim de reduzir a distância, entre o micro-arranjo e a segunda superfície.

No seguinte, concretizações adicionais para guiar a primeira superfície relativamente à segunda superfície ou a segunda superfície •elativamente à primeira superfície serão descritas. Ditas concretizações não são só adequadas para posicionar a primeira superfície ou o arranjo de sonda ■elativamente à segunda superfície ou à superfície de detecção, mas podem, :m particular, também ser usadas para mover o arranjo de sonda elativamente à superfície de detecção. Por meio de tal movimento, por rxemplo uma agitação da solução na câmara de reação pode ser alcançada.

Em uma concretização, o arranjo de sonda é movido elativamente à superfície de detecção ou movido dentro da câmara por meio le um campo magnético. O arranjo de sonda e/ou a segunda superfície, por íxemplo, contém um material magnético ou contém um componente, aonde im material magnético foi adicionado e/ou está montado em um portador :onsistindo de um material inteiramente ou parcialmente magnético. Pode ser idemais preferido que o arranjo de sonda e/ou a segunda superfície seja novida passivamente movendo um corpo magnético, que é arranjado debaixo la superfície respectiva e é, por exemplo, conectado com dita superfície, por neio de um campo magnético.

Em uma concretização adicional, o arranjo de sonda é movido ;/ou posicionado relativamente à superfície de detecção por meio de impacto jravitacional.

Em uma concretização adicional, o arranjo de sonda é movido :/ou posicionado relativamente à superfície de detecção por meio de um fluxo gerado na câmara de reação. Para este fim, o dispositivo pode, por exemplo, ser desenvolvido de tal modo que, no caso que o arranjo de sonda é cercado por um fluxo de líquido, uma pressão negativa seja gerada em um lado da câmara de reação e uma pressão positiva seja gerada no lado oposto, que conduz a movimento do arranjo de sonda na câmara de reação. Tal fluxo pode, por exemplo, ser implementado por meio de convecção térmica, que é causada por diferenças de temperaturas locais na câmara.

Em uma concretização adicional, o arranjo de sonda é movido e/ou posicionado relativamente à superfície de detecção por meio de impacto de um campo elétrico.

Em uma concretização adicional, uma bolha de gás é gerada debaixo do arranjo de sonda por meio de sobre-aquecimento local, devido ao que o chip é movido na câmara ou é guiado para a superfície de detecção.

Por meio de reduzir a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície antes da detecção, a solução de amostra preferivelmente é removida substancialmente completamente da região entre o micro-arranjo e plano de detecção. Por este meio, sinais de fundo, que são causados por moléculas rotuladas, que não estão ligadas à superfície de arranjo, por exemplo por inicíadores rotulados e/ou ácidos nucleicos visados rotulados, que não estão ligados à superfície de arranjo, são reduzidos.

Assim, na detecção da etapa b), a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície é preferivelmente alterada de tal modo que a solução de amostra entre o micro-arranjo e a segunda superfície seja essencialmente removida. O micro-arranjo é então localizado essencialmente no plano de detecção e um fundo perturbador é virtualmente evitado.

Em uma concretização alternativa adicional, o micro-arranjo se assenta uniformemente na segunda superfície formando o plano de detecção já no estado original do dispositivo e não é só trazido no plano de detecção por meio de guiar a primeira superfície para a segunda superfície e/ou guiar a segunda superfície para a primeira superfície. Nesta concretização, o micro-arranjo não é umedecido pela solução de amostra durante as etapas de processamento. Para conduzir a reação de interação, por exemplo uma hibridização, a primeira superfície, que é feita preferivelmente de um material elástico, por exemplo uma membrana elástica, é guiada longe da superfície de detecção. Por esse meio, a superfície de chip é movida longe da superfície de detecção e é umedecida pela solução de amostra. A interação, por exemplo uma hibridização, pode acontecer. Para conduzir a detecção e processamento adicional, a primeira superfície, por exemplo na forma de uma membrana elástica, é liberada novamente, devido ao que salta atrás para sua posição originalmente ajustada, que pode ser acelerada por meio de pressão exercida por um meio para guiar a primeira superfície, por exemplo um pino, uma haste, um parafuso e/ou um ressalto. Por esse meio, o micro-arranjo é apertado contra o plano de detecção novamente e a detecção pode ser conduzida sem um fundo.

Em uma concretização adicional do método de acordo com a presente invenção, um dispositivo de acordo com a presente invenção, como descrito acima, é usado, a primeira superfície de qual é desenvolvida de uma maneira articulável ao redor de um eixo de rotação.

Em uma primeira posição, que também é referida como posição inicial, a superfície do micro-arranjo arranjada na primeira porção de flanco se assenta essencialmente uniformemente na segunda superfície, isto é, a superfície de substrato com as moléculas de sonda imobilizadas nela não é essencialmente umedecida pela solução de amostra. No espaço formado na primeira posição entre a segunda porção de flanco da primeira superfície e da segunda superfície, a câmara de processamento, o processamento da solução de reação é conduzido preferivelmente, isto é, em particular etapas de purificação, re-concentração, lavagem e enxágüe e/ou amplificação.

Subseqüentemente, a primeira superfície articulável é trazida a uma segunda posição, em que a primeira superfície é arranjada relativamente à segunda superfície a um ângulo diferente de 180°, preferivelmente a um ângulo de 45°. Preferivelmente, isto é conduzido por meio de tração exercida na primeira porção de flanco da primeira superfície e/ou pressão exercida na segunda porção de flanco da primeira superfície através de um meio para guiar a primeira superfície, como descrito acima. Por meio de guiar a primeira superfície à segunda posição, o micro-arranjo é guiado longe da segunda superfície e a solução de amostra penetra na cavidade formando entre o micro-arranjo e a segunda superfície. As moléculas de sonda imobilizadas no substrato do micro-arranjo são acessíveis livremente para as moléculas alvo presentes na solução de amostra, de forma que uma reação de interação entre moléculas de sonda e alvo possa ocorrer. Nesta concretização do método de acordo com a presente invenção, pressão e/ou tração exercida na primeira superfície tem a vantagem que, desta maneira, a solução de amostra é movida e assim a reação de interação pode ser acelerada, Para conduzir a detecção e, opcionalmente, processamento adicional, a primeira superfície articulável é guiada atrás à primeira posição, por exemplo por meio de pressão exercida na primeira porção de flanco da primeira superfície e/ou tração exercida na segunda porção de flanco da primeira superfície ou, no caso de desenvolvimento elástico da primeira superfície, por meio de liberar a primeira porção de flanco. Agora, o micro-arranjo novamente se assenta essencialmente uniformemente na segunda superfície, de forma que a solução de amostra entre a segunda superfície e o micro-arranjo seja deslocada essencialmente nesta posição e uma detecção essencialmente livre de fundo possa acontecer.

Os alvos a serem examinados podem estar presentes em qualquer tipo de amostra, preferivelmente em uma amostra biológica.

Preferivelmente, os alvos são isolados, purificados, copiados e/ou ampliados antes de sua detecção e quantificação por meio do método de acordo com a presente invenção. 0 método de acordo com a presente invenção ademais permite a amplificação e a detecção qualitativa e/ou quantitativa de ácidos nucleicos em uma câmara de reação, em que a detecção de interações moleculares ou hibridizações pode ser conduzida depois de conclusão de uma reação de amplificação cíclica sem necessitar de substituição da amostra ou líquidos de reação. O método de acordo com a presente invenção ademais também assegura uma detecção cíclica de eventos de hibridização em uma amplificação, isto é, uma detecção da hibridização até mesmo durante a reação de amplificação cíclica. Finalmente, com a ajuda do método de acordo com a presente invenção, os produtos de amplificação podem ser quantificados durante a reação de amplificação e depois de conclusão da reação de amplificação.

Normalmente, a amplificação é executada por meio de métodos de PCR convencionais ou por meio de um método para o desempenho paralelo de amplificação das moléculas alvo a serem analisadas por meio de PCR e detecção por meio de hibridização das moléculas alvo com o suporte de biblioteca de substâncias, como é descrito acima.

Em uma concretização adicional, a amplificação é executada como uma PCR de multiplex em um processo de duas etapas (veja também WO 97/45559). Em uma primeira etapa, uma PCR de multiplex é executada por meio de usar iniciadores de fusão, cujas extremidades 3' são genes específicos e cujas extremidades 5' representam uma região universal. O anterior é o mesmo em todos os iniciadores dianteiros e inversos usados na reação de multiplex. Neste primeiro estágio, a quantidade de iniciador é limitante. Por este meio, todos os produtos de multiplex podem ser ampliados até que um nível molar uniforme seja alcançado, dado que o número de ciclos é adequado para alcançar limitação de iniciador para todos os produtos. Em um segundo estágio, iniciadores universais idênticos às regiões 5' dos iniciadores de fusão estão presentes, Amplificação é executada até que a quantidade desejada de DNA seja obtida.

Em uma concretização preferida adicional do método de acordo com a presente invenção, detecção é executada durante a reação de amplificação cíclica e/ou depois de conclusão da reação de amplificação cíclica. Preferivelmente, detecção é executada durante a reação de amplificação, em todo ciclo de amplificação. Altemativamente, detecção também pode ser determinada em todo segundo ciclo ou todo terceiro ciclo ou em qualquer intervalo arbitrário.

Na condução de uma reação de amplificação linear, em que a quantidade visada aumenta por uma certa quantidade com cada etapa, ou uma reação de amplificação exponencial, por exemplo uma PCR, em que a quantidade visada de DNA se multiplica com cada etapa, na unidade de processo, o chip pode assim ser apertado contra o plano de detecção depois de toda etapa de amplificação e portanto a detecção pode ser conduzida. É assim possível executar vigilância on-line da reação de amplificação. Em particular no caso de reações de amplificação não lineares, é por esse meio possível determinar a concentração inicial da quantidade visada de DNA.

Desta maneira, o número de etapas de amplificação pode ser além disso otimizado on-line. Assim que a quantidade visada de DNA tenha alcançado uma concentração específica, a amplificação é descontinuada. Se a concentração visada inicial for baixa, o número de etapas de amplificação é aumentado a fim de ser capaz de conduzir uma análise assegurada dos produtos. No caso de tempo de reação reduzido de controles positivos, o processo de análise pode ser descontinuado muito cedo.

As substâncias químicas necessárias para conduzir uma reação de amplificação, como por exemplo polimerase, solução saturada, cloreto de magnésio, iniciadores, rotulados, em particular iniciadores rotulados por fluorescência, dNTPs e similares, podem ser providos na câmara de reação, por exemplo de forma seca congelada.

Preferivelmente, a reação de amplificação cíclica é uma PCR. Em uma PCR, três temperaturas para cada ciclo de PCR são normalmente passadas. Preferivelmente, os ácidos nucleicos hibridizados se separam do micro-arranjo na temperatura mais alta, isto é, a temperatura de desnaturação. Um valor preferido para a temperatura de desnaturação é 95°C. Portanto, um sinal de hibridização, que serve como valor zero ou valor de referência para os ácidos nucleicos detectados no ciclo de PCR respectivo, pode ser determinado nesta temperatura de desnaturação.

Na temperatura seguindo no ciclo de PCR, uma temperatura de anelamento de, por exemplo, cerca de 60°C, uma hibridização entre os ácidos nucleicos a serem detectados e os ácidos nucleicos imobilizados no substrato do micro-arranjo é facilitada. Portanto, em uma concretização do método de acordo com a presente invenção, a detecção de ácidos nucleicos visados presentes em um ciclo de PCR é executada na temperatura de anelamento. A fim de aumentar a sensibilidade do método de acordo com a presente invenção, pode ademais ser vantajoso abaixar a temperatura abaixo da temperatura de anelamento, de forma que a detecção seja executada preferivelmente a uma temperatura abaixo da temperatura de anelamento de um ciclo de amplificação. Por exemplo, a detecção pode ser executada a uma temperatura em uma faixa de 25°C a 50°C e preferivelmente em uma faixa de 30°Ca45°C.

Em uma concretização alternativa adicional do método de acordo com a presente invenção, a hibridização entre ácidos nucleicos a serem detectados e os ácidos nucleicos imobilizados no substrato do micro-arranjo é executada a princípio a uma baixa temperatura, a fim de subsequentemente elevar a temperatura de hibridização. Tal concretização tem a vantagem que o tempo de hibridização é reduzido comparado a hibridizações a temperaturas de mais de 50°C sem perder especificidade nas interações.

Se o valor zero ou valor de referência determinado na temperatura de desnaturação for subtraído do valor medido determinado a ou abaixo da temperatura de anelamento, um resultado medido livre de perturbações, em que flutuação e deriva são eliminados, pode ser obtido.

Normalmente, as moléculas alvo a serem detectadas são equipadas com um marcador detectável. No método de acordo com a presente invenção, a detecção é assim preferivelmente conduzida por meio de equipar os alvos ligados com pelo menos um rótulo, que é detectado na etapa b).

Como já mencionado acima, o rótulo acoplado aos alvos ou sonda preferivelmente é uma unidade detectável ou uma unidade detectável acoplada aos alvos ou sondas por um grupo de âncora. Com respeito às possibilidades para detecção ou rotulagem, o método de acordo com a presente invenção é muito flexível. Assim, o método de acordo com a presente invenção é compatível com uma variedade de métodos de detecção físicos, químicos ou bioquímicos. O único pré-requisito é que a unidade ou estrutura a ser detectada possa ser acoplada diretamente ou possa ser ligada por um grupo de âncora, que pode ser acoplado com o oligonucleotídeo, a uma sonda ou alvo, por exemplo um oligonucleotídeo. A detecção do rótulo pode ser baseada em fluorescência, magnetismo, carga, massa, afinidade, atividade enzimática, reatividade, um rótulo de ouro, e similares. Assim, o rótulo pode, por exemplo, ser baseado no uso de estruturas ou componentes rotulados por fluoroforos. Com relação à detecção de fluorescência, o rótulo pode ser um corante arbitrário que pode ser acoplado a alvos ou sondas durante ou depois de sua síntese. Exemplos são corantes Cy (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia), corantes Alexa, Texas Red, Fluorescein, Rhodamín (Sondas Moleculares, Eugene, Oregon, E.U.A.), lantanídeos como samário, itérbio e európio (EG&G, Wallac, Friburgo, Alemanha).

Particularmente preferivelmente, dito marcador detectável é um marcador de fluorescência. Como já mencionado acima, o uso do dispositivo de acordo com a presente invenção no método de acordo com a presente invenção assegura a detecção dos marcadores de fluorescência por meio de um microscópio de fluorescência sem autofoco, por exemplo um microscópio de fluorescência com foco fixo.

Além de marcadores de fluorescência, marcadores de luminescência, marcadores de metal, marcadores de enzima, marcadores radioativos e/ou marcadores poliméricos também podem ser usados dentro da extensão da presente invenção como unidade de rotulagem e/ou detecção, que é acoplada aos alvos ou às sondas.

Igualmente, um ácido nucleico, que pode ser detectado por meio de hibridização com um relator rotulado (hibridização de sanduíche), pode ser usado como rótulo (etiqueta). Reações de detecção biológicas moleculares diversas como extensão de iniciador, ligação, e RCA são usados para a detecção da etiqueta.

Em uma concretização alternativa do método de acordo com a presente invenção, a unidade detectável está acoplada com os alvos ou sondas por um grupo de âncora. Grupos de âncora preferivelmente usados são biotina, digoxigenina e similares. Em uma reação subseqüente, o grupo de âncora é convertido por meio de componentes ligadores especificamente, por exemplo conjugados de 'streptavidin' ou conjugados de anticorpo, que por sua vez são detectáveis ou ativam uma reação detectável. Com o uso de grupos de âncora, a conversão dos grupos de âncora a unidades detectáveis pode ser executada antes, durante ou depois da adição da amostra incluindo os alvos, ou, opcionalmente, antes, durante ou depois da divisão de uma ligação seletivamente divisível nas sondas. Tais ligações seletivamente divisíveis nas sondas são, por exemplo, descritas no Pedido de Patente Internacional WO 03/018838, os conteúdos pertinentes de qual estão por este meio explicitamente referidos.

De acordo com a presente invenção, rotulagem também pode ser executada por meio de interação de uma molécula rotulada com as moléculas de sonda, Por exemplo, rotulagem pode ser executada por meio de hibridização de um oligonucleotídeo rotulado como descrito acima com uma sonda de oligonucleotídeo ou um alvo de oligonucleotídeo. Métodos de rotulagem adicionais e sistemas de detecção adequados dentro da extensão da presente invenção são descritos, por exemplo, em Lottspeich e Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Yerlag, Heidelberg, Berlim, Alemanha 1998, capítulos 23.3 e 23.4.

Em uma concretização preferida do método de acordo com a presente invenção, métodos de detecção são usados, que em resultado produzem um aduto tendo um produto de solubilidade particular, que conduz a uma precipitação. Para rotulagem, em particular substratos ou extratos são usados, que podem ser convertidos a um produto dificilmente solúvel, normalmente manchado. Nesta reação de rotulagem, por exemplo, enzimas podem ser usadas, que catalisam a conversão de um substrato a um produto dificilmente solúvel. Reações adequadas para conduzir a uma precipitação nos elementos de arranjo como também possibilidades para a detecção da precipitação são, por exemplo, descritos no Pedido de Patente Internacional WO 00/72018 e no Pedido de Patente Internacional WO 02/02810, cujos conteúdos pertinentes estão por este meio referidos explicitamente.

Em uma concretização particularmente preferida do método de acordo com a presente invenção, os alvos ligados são equipados com um rótulo catalisando a reação de um substrato solúvel ou extrato para formar uma precipitação dificilmente solúvel no elemento de arranjo, onde uma interação de sonda/alvo ocorreu ou atuando como um núcleo de cristal para a conversão de um substrato solúvel ou extrato para uma precipitação dificilmente solúvel no elemento de arranjo, onde uma interação de sonda/alvo ocorreu.

Desta maneira, o uso do método de acordo com a presente invenção permite a análise qualitativa e quantitativa simultânea de uma variedade de interações de sonda e/ou alvo, em que elementos de arranjo individuais tendo um tamanho de < 1000 μιη, preferivelmente de < 100 μτη, e particularmente preferivelmente de < 50 μηι podem ser implementados. O uso de rótulos enzimáticos é conhecido em imunocitoquímica e em testes imunológicos baseados em placas de microtítulo (veja E. Lidell e I. Weeks, "Antibody Technology", BIOS Scientific Publishers Limited, 1995). Assim, por exemplo, enzimas catalisam a conversão de um substrato a um produto dificilmente solúvel, normalmente manchado.

Particularmente preferivelmente, a reação conduzindo à formação de precipitação nos elementos de arranjo é uma conversão de um substrato solúvel ou extrato a um produto dificilmente solúvel, catalisado por uma enzima. Em uma concretização especial, a reação conduzindo à formação de precipitação nos elementos de arranjo é uma oxidação de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, catalisada por uma peroxidase.

Preferivelmente, peroxidase de raiz-forte é usada para a oxidação de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina. Porém, a pessoa qualificada na arte conhece peroxidases adicionais, que podem ser usadas para a oxidação de 3,3,,5,5'-tetrametilbenzidina. E assumido que 3,3',5,5 ’-tetrametilbenzidina, sob o impacto catalítico de uma peroxidase, é oxidada em uma primeira etapa para formar um cátion de radical manchado de azul (veja por exemplo Gallati e Pracht, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1985, 23, 8, 454). Este cátion de radical manchado de azul é precipitado na forma de um complexo por meio de um poliânione, como por exemplo sulfato de dextrano. A reação de precipitação por meio de oxidação de peroxidase catalisada de 3,3',5,5'- tetrametílbenzidina, é por exemplo, descrita em EP 0 456 782, Sem reivindicar ser completa, a Tabela 1 seguinte oferece uma pesquisa de várias reações possivelmente adequadas para conduzir a uma precipitação em elementos de arranjo, onde uma interação entre alvo e sonda ocorreu: A detecção de interações de sonda/alvo por precipitados insolúveis é, em particular, descrito em WO 02/02810.

No seguinte, concretizações da presente invenção são descritas, que podem servir para superar problemas normalmente prováveis de surgir na detecção de interações moleculares em suportes sólidos, como por exemplo para prevenir a possível formação dos anéis de Newton entre plano de detecção e arranjo de sonda. A manifestação dos anéis de Newton é essencialmente determinada pelo tipo de iluminação, pelo comprimento de onda da luz usada para detecção, pela distância entre o plano de detecção e arranjo de sonda, e pelo índice de refração da solução localizada na câmara. Tais anéis de Newton podem, por exemplo, ser prevenidos por meio de alterar o comprimento de onda da luz usada para detecção, usando uma solução tendo o mesmo ou um índice de refração semelhante como o plano de detecção e/ou o arranjo de sonda e/ou usando um líquido de imersão entre o plano de detecção e arranjo de sonda.

Além disso, os anéis de Newton podem ser prevenidos por meio de aplicar espaçadores no chip e/ou no lado do plano de detecção enfrentando o chip.

Além disso, os anéis de Newton podem ser prevenidos por meio de aplicar os arranjos de sonda sobre uma superfície de suporte áspera.

Além disso, os anéis de Newton podem ser prevenidos por meio de aplicar os arranjos de sonda sobre uma superfície absorvedora de luz. É uma possibilidade adicional variar permanentemente a pressão de contato, por meio da qual o chip é guiado relativamente à superfície de detecção. Assim, a espessura da abertura entre o chip e a superfície de detecção, e portanto também a posição dos anéis de Newton, é alterada. Por meio de integrar o sinal de fluorescência a ser detectado com o passar do tempo, uma distorção dos valores medidos dos pontos em relação um ao outro é prevenida desta maneira. É uma possibilidade particularmente preferível adicional de prevenir os anéis de Newton usar várias fontes de luz de direções diferentes para iluminar e portanto agitar os fluoroforos dos alvos ligados.

Fluorescência de fundo, que foi causada por fluoroforos de alvos não ligados no líquido deslocado, pode conduzir à distorção do sinal detectado. Isto pode ser prevenido preferivelmente por meio de usar uma sombra, que é, por exemplo, montada na superfície de detecção ou no chip e/ou ao redor do chip ou na ótica de formação de imagem, e é desenvolvida de tal modo que só a superfície do arranjo de sonda seja iluminada ou focada.

Com o uso de fontes de luz correspondentes, como por exemplo lasers, pode surgir não homogeneidades em iluminação devido à coerência da luz. Tais não homogeneidades podem ser reduzidas ou prevenidas por meio de usar guias de onda e/ou combinar filtros e/ou luz de comprimentos de onda diferentes. Igualmente, movimento da fonte de luz a fim de eliminar tais efeitos também é concebível.

Por meio de usar uma camada absorvedora de luz orgânica ou inorgânica, que é não fluorescente na faixa selecionada de comprimentos de onda, no suporte do arranjo de sonda, sinal de fundo de fluorescência, que é causado pelo suporte de sonda e/ou elementos localizados atrás do anterior, pode ser reduzido ou prevenido. Preferivelmente, uma camada de cromo negra é empregada como camada protetora.

Em todas as concretizações acima descritas do método de acordo com a presente invenção, uma pré-amplificação do material a ser analisado não é requerida. Do material de amostra extraído de bactérias, sangue, ou outras células, partições específicas podem ser ampliadas e hibridizadas ao suporte com a ajuda de uma PCR (reação de cadeia de polimerase), em particular na presença do dispositivo de acordo com a presente invenção ou o suporte de biblioteca de substâncias, como é descrito em DE 102 53 966. Isto significa uma redução significativa de esforço de trabalho.

Assim, o método de acordo com a presente invenção é particularmente adequado para desempenho paralelo de amplificação das moléculas alvo a serem analisadas por meio de PCR e a detecção por meio de hibridização das moléculas alvo com o suporte de biblioteca de substâncias. Aqui, o ácido nucleico a ser detectado é primeiro ampliado por meio de uma PCR, em que preferivelmente pelo menos um competidor inibindo a formação de um dos dois filamentos de modelo ampliados por meio da PCR é adicionado à reação no começo. Em particular, uma molécula de DNA, que completa contra um dos iniciadores usados para a amplificação por PCR do modelo para ligar ao modelo e que não pode ser estendida enzimaticamente, é adicionada à PCR. As moléculas de ácido nucleico de filamento único ampliadas por meio da PCR são então detectadas por meio de hibridização com uma sonda complementar. Altemativamente, o ácido nucleico a ser detectado é primeiro ampliado em filamento único de excesso por meio de ama PCR e é detectado por meio de uma hibridização subseqüente com uma sonda complementar, em que um competidor, que é uma molécula de DNA au uma molécula de um análogo de ácido nucleico capaz de hibridizar a um dos dois filamentos do modelo, mas não à região detectada por meio de hibridização de sonda e que não pode ser estendido enzimaticamente, é adicionado à reação de PCR no começo.

Toda molécula causando uma amplificação preferida de só um dos dois filamentos de modelo presentes na reação de PCR pode ser usado como competidor na PCR. Assim, de acordo com a presente invenção, competidores podem ser proteínas, peptídeos, ligandos de DNA, intercaladores, ácidos nucleicos ou análogos deles. Proteínas ou peptídeos, que são capazes de ligar ácidos nucleicos torcidos únicos com especificidade de sequência e que têm as propriedades acima definidas, são usados preferivelmente como competidores. Particularmente preferivelmente, moléculas de ácido nucleico e moléculas de análogo de ácido nucleico são usadas como rompedores de estrutura secundária. A formação de um dos dois filamentos de modelo é inibida substancialmente por adição inicial do competidor à PCR durante a amplificação. "Substancialmente inibida" significa que dentro da extensão da PCR, um único filamento de excesso e uma quantidade do outro filamento de modelo é produzida, que é suficiente para permitir uma detecção eficiente do filamento ampliado por meio de hibridização. Portanto, a amplificação não segue cinética exponencial da forma 2n (com n = número de ciclos), mas em lugar disso cinética de amplificação atenuada da forma < 2n. O único filamento de excesso obtido por meio da PCR em relação ao filamento não ampliado tem o fator fila 1.000, preferivelmente o fator 1,1 a 300, também preferivelmente o fator 1,1 a 100, particularmente preferivelmente o fator 1,5 a 100, também particularmente preferivelmente o fator 1,5 a 50, em particular preferivelmente o fator 1,5 a 20, e mais preferivelmente o fator 1,5 a 10.

Tipicamente, a função de um competidor será ligar seletivamente a um dos dois filamentos de modelo e portanto inibir a amplificação do filamento complementar correspondente. Portanto, competidores podem ser proteínas de ligação de DNA ou RNA de filamento único tendo especificidade para um dos dois filamentos de modelo a serem ampliados em uma PCR. Eles também podem ser aptâmeros especificamente de seqüência ligando só a regiões específicas de um dos dois filamentos de modelo a serem ampliados. Ácidos nucleicos ou análogos de ácido nucleico são preferivelmente usados como competidores. Convencionalmente, os ácidos nucleicos ou análogos de ácido nucleico atuarão como competidores da PCR tanto competindo contra um dos iniciadores usados para a PCR para o local de ligação de iniciador ou sendo capaz de hibridizar com uma região de um filamento de modelo a ser detectado devido a uma complementaridade de seqüência. Esta região não é a seqüência detectada pela sonda. Tais competidores de ácido nucleico não são extensíveis enzimaticamente.

Os análogos de ácido nucleico podem, por exemplo, ser os denominados ácidos nucleicos de peptídeo (PNA). Porém, análogos de ácido nucleico também podem ser moléculas de ácido nucleico, nas quais os nucleotídeos são ligados entre si por uma ligação de fosfotioato em vez de uma ligação de fosfato. Eles também podem ser análogos de ácido nucleico, em que os componentes de açúcar ocorrendo naturalmente ribose ou deoxiribose foram substituídos com açúcares alternativos, como por exemplo arabinose ou trealose ou similares. Além disso, o derivado de ácido nucleico pode ser "ácido nucleico travado" (LNA). Análogos de ácido nucleico convencionais adicionais são conhecidos à pessoa qualificada na arte.

Moléculas de DNA ou RNA, em particular preferivelmente oligonucleotídeos de DNA ou RNA ou seus análogos, são preferivelmente usados como competidores.

Dependendo da seqüência das moléculas de ácido nucleico ou análogos de ácido nucleico usados como competidores, a inibição da amplificação de um dos dois filamentos de modelo dentro da extensão da reação de PCR é baseada em mecanismos diferentes. Por meio do exemplo de uma molécula de DNA, isto é discutido no seguinte.

Se, por exemplo, uma molécula de DNA for usada como competidor, pode ter uma seqüência, que é pelo menos parcialmente idêntica à seqüência de um dos iniciadores usados para a PCR de tal modo que uma hibridização específica da molécula de competidor de DNA com o filamento de modelo correspondente seja possível sob condições estritas. Como, de acordo com a presente invenção, a molécula de DNA usada para competição neste caso não é extensível por meio de uma polimerase de DNA, a molécula de DNA compete para ligar ao modelo contra o iniciador respectivo durante a reação de PCR. De acordo com a relação da molécula de competidor de DNA e o iniciador, a amplificação do filamento de modelo definida pelo iniciador pode assim ser inibida de tal modo que a produção deste filamento de modelo seja significativamente reduzida. Aqui, a PCR procede de acordo com cinética exponencial mais alta que seria esperada com as quantidades de competidores usados. Desta maneira, um único filamento de excesso emerge em uma quantidade, que é suficiente para a detecção eficiente das moléculas alvo ampliadas por meio de hibridização.

Nesta concretização, as moléculas de ácido nucleico ou análogos de ácido nucleico usados para competição não devem ser extensíveis enzimaticamente. "Não extensível enzimaticamente" significa que a polimerase de DNA ou RNA usada para a amplificação não pode usar o competidor de ácido nucleico como iniciador, isto é, não é capaz de sintetizar o filamento oposto correspondente do modelo 3' da seqüência definida pelo competidor.

Altemativamente à possibilidade acima descrita, a molécula de competidor de DNA também pode ter uma seqüência complementar a uma região do filamento de modelo a ser detectado que não é endereçada por uma das seqüências de iniciador e que não é extensível enzimaticamente. Dentro da extensão da PCR, a molécula de competidor de DNA então hibridizará a este filamento de modelo e bloqueará correspondentemente a amplificação deste filamento. A pessoa qualificada na arte sabe que as seqüências de moléculas de competidor de DNA ou, em geral, moléculas de competidor de ácido nucleico podem ser selecionadas correspondentemente. Se as moléculas de competidor de ácido nucleico tiverem uma seqüência, que não é substancialmente idêntica à seqüência de um dos iniciadores usados para a PCR, mas é complementar a outra região do filamento de modelo a ser detectado, esta seqüência é para ser selecionada de tal modo que não caia dentro da região da seqüência de modelo, que é detectada com uma sonda dentro da extensão da hibridização. Isto é necessário porque não tem que ocorrer uma reação de processamento entre a PCR e a reação de hibridização. Se uma molécula de ácido nucleico, que cai dentro da região a ser detectada, fosse usada como competidor, competiría para ligar à sonda contra a molécula visada torcida única.

Tais competidores preferivelmente hibridizam perto da seqüência de modelo detectada pela sonda. Aqui, de acordo com a presente invenção, a especificação de posição "perto" é para ser entendida do mesmo modo como dado para rompedores de estrutura secundária. Porém, os competidores de acordo com a presente invenção também podem hibridizar na proximidade imediata da seqüência a ser detectada, isto é, exatamente a distância de um nucleotídeo da seqüência visada a ser detectada.

Se ácidos nucleicos não extensíveis enzimaticamente ou análogos de ácido nucleico forem usados como moléculas competidoras, eles são para serem selecionados com respeito a sua seqüência e estrutura de tal modo que eles não possam ser estendidos enzimaticamente por polimerases de DNA ou RNA, Preferivelmente, a extremidade 3' de um competidor de ácido nucleico é projetada de tal modo que não tenha nenhuma complementaridade ao modelo e/ou tenha em sua extremidade 3' um substituinte diferente do grupo de 3-OH.

Se a extremidade 3' do competidor de ácido nucleico não tiver nenhuma complementaridade ao modelo, indiferente de se o competidor de ácido nucleico se liga a um dos locais de ligação de iniciador do modelo ou a uma das seqüências do modelo a ser ampliado por meio da PCR, o competidor de ácido nucleico não pode ser estendido pelas polimerases de DNA convencionais devido à falta de complementaridade de base em sua extremidade 3'. Este tipo de não extensibilidade de competidores de ácido nucleico por polimerases de DNA é conhecido à pessoa qualificada na arte. Preferivelmente, o competidor de ácido nucleico não tem nenhuma complementaridade a sua seqüência visada em sua extremidade 3' com respeito às últimas 4 bases, particularmente preferivelmente para às últimas 3 bases, em particular preferivelmente às últimas 2 bases, e mais preferivelmente à última base. Nas posições mencionadas, tais competidores também podem ter bases não naturais, que não permitem hibridização.

Competidores de ácido nucleico, que não são extensíveis enzimaticamente, também podem ter uma complementaridade de 100% a sua seqüência visada, se eles forem modificados em sua coluna vertebral ou em sua extremidade 3' de tal modo que eles sejam não extensíveis enzimaticamente.

Se o competidor de ácido nucleico tiver em sua extremidade 3' um grupo diferente do grupo OH, estes substituintes são preferivelmente um gmpo de fosfato, um átomo de hidrogênio (didesoxinucleotídeo), um grupo de biotina, ou um grupo de amino. Estes grupos não podem ser estendidos pelas polimerases convencionais. O uso de uma molécula de DNA, que compete para se ligar ao modelo contra um dos dois iniciadores usados para a PCR e que era equipado com uma ligação de amino em sua extremidade 3' durante síntese química, como um competidor em tal método é particularmente preferido. Tais competidores podem ter 100% de complementaridade a sua seqüência visada.

Porém, competidores de análogo de ácido nucleico, como por exemplo PNAs não têm que ter um grupo 3'-OH bloqueado ou uma base não complementar em sua extremidade 3' como eles não são reconhecidos pelas polimerases de DNA por causa da coluna vertebral modificada pelo peptídeo ligado e assim são não estendidos. Outras modificações correspondentes do grupo de fosfato, que não são reconhecidas pelas polimerases de DNA, são conhecidas à pessoa qualificada na arte. Entre essas estão, inter alia, ácidos nucleicos tendo modificações de coluna vertebral, como por exemplo ligações de amido 2-5' (Chan et al. (1999) J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 315-320), ligações de sulfeto (Kawai et al. (1993) Nucleic Acids Res., 1 (6), 14731479), LNA (Sorensen et al. (2002) J. Am. Chem. Soc., 124 (10), 2164-2176) e TNA (Schoning et al. (2000) Science, 290 (5495), 1347-1351). Vários competidores que hibridizando a regiões diferentes do modelo (por exemplo, inter alia, o local de ligação de iniciador) também podem ser usados simultaneamente em uma PCR. A eficiência da hibridização pode ser aumentada adicionalmente, se os competidores tiverem propriedades de rompedores de estrutura secundária.

Em uma concretização alternativa, a molécula de competidor de DNA também pode ter uma seqüência complementar a um dos iniciadores. Dependendo da relação de molécula de competidor de DNA contrária e iniciador, tais, por exemplo, moléculas de competidor de DNA contrárias então podem ser usadas para titular o iniciador na reação de PCR, de forma que não mais hibridizará com o filamento de modelo correspondente e, correspondentemente, só o filamento de modelo definido pelo outro iniciador é ampliado. A pessoa qualificada na arte está ciente do fato que, nesta concretização da invenção, o competidor de ácido nucleico pode, mas não tem, que ser extensível enzimaticamente.

Se, dentro da extensão da presente invenção, for comentado sobre competidores de ácido nucleico, isto inclui competidores de análogo de ácido nucleico, a menos que um significado diferente surja do contexto respectivo. O competidor de ácido nucleico pode se ligar ao filamento correspondente do modelo reversivelmente ou irreversivelmente. A ligação pode acontecer por interações covalentes ou não covalentes.

Preferivelmente, ligação do competidor de ácido nucleico acontece por interações não covalentes e é reversível. Em particular preferivelmente, ligação ao modelo acontece por formação de casamentos de base de Watson-Crick.

As seqüências dos competidores de ácido nucleico normalmente se adaptam à sequência do filamento de modelo a ser detectado. No caso de iniciadores contrános, entretanto, eles se adaptam às seqüências de iniciador a serem tituladas, que são por sua vez definidas pelas seqüências de modelo, porém.

Amplificação por PCR de ácido nucleico é um método de laboratório padrão, as várias possibilidades de variação e desenvolvimento de qual são familiares à pessoa qualificada na arte. Em princípio, uma PCR é caracterizada pelo fato de que o modelo de ácido nucleico torcido duplo, normalmente uma molécula de DNA torcida dupla, é primeiro sujeita a desnaturação a quente por 5 minutos a 95°C, por meio de que os dois filamentos são separados um do outro. Depois de esfriamento até a denominada temperatura de "anelamento" (definida pelo iniciador com a temperatura de derretimento mais baixa), os iniciadores dianteiro e inverso presentes na solução de reação se acumulam nesses locais nos filamentos de modelo respectivos, que são complementares à sua própria seqüência. Aqui, a temperatura de "anelamento" dos iniciadores adapta ao comprimento e composição de base dos iniciadores. Pode ser calculado na base de considerações teóricas. Informação sobre o cálculo de temperaturas de "anelamento" pode ser achada, por exemplo, em Sambrook et al. (vide supra).

Anelamento dos iniciadores, que é executado tipicamente na faixa de temperaturas entre 40 a 75°C, preferivelmente entre 45 a 72°C e em particular preferivelmente entre 50 a 72°C, é seguido por uma etapa de alongamento, em que desoxiribonucleotídeos são ligados com a extremidade 3' dos iniciadores pela atividade da polimerase de DNA presente na solução de reação. Aqui, a identidade dos dNTPs inseridos depende da seqüência do filamento de modelo hibridizado com o iniciador. Como normalmente polimerases de DNA termoestáveis são usadas, a etapa de alongamento normalmente corre entre 68 a 72°C.

Em uma PCR simétrica, uma amplificação exponencial da região de ácido nucleico do alvo definido pelas seqüências de iniciador é alcançada por meio de repetir o ciclo descrito de desnaturação, anelamento e alongamento dos iniciadores. Com respeito às condições de solução da PCR, as polimerases de DNA utilizáveis, a produção de modelos de DNA torcidos duplos, o projeto de iniciadores, a seleção da temperatura de anelamento, e variações da PCR clássica, a pessoa qualificada na arte tem numerosos trabalhos de literatura a sua disposição. A pessoa qualificada na arte está familiarizada com o fato que também, por exemplo, RNA torcido único, como por exemplo mRNA, pode ser usado como modelo. Normalmente, é transcrito previamente em um cDNA torcido duplo por meio de uma transcrição inversa.

Em uma concretização preferida, uma polimerase dependente de DNA termoestável é usada como polimerase. Em uma concretização particularmente preferida, uma polimerase de DNA dependente de DNA termoestável é usada, que é selecionada do gmpo consistindo em polimerase de Taq-DNA (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha e Qiagen, Hilden, Alemanha), polimerase de Pfu-DNA (Stratagene, La Jolla, E.U.A.), polimerase de Tth-DNA (Biozym Epicenter Technol., Madison, E.U.A.), polimerase de Vent-DNA, polimerase de Deep Vent-DNA (New England Biolabs, Beverly, E.U.A.), polimerase de Expand- DNA (Roche, Mannheim, Alemanha). O uso de polimerases, que foram otimizadas de polimerases naturalmente ocorrendo por meio de alteração específica ou evolutiva, também é preferido. Ao executar a PCR na presença do suporte de biblioteca de substâncias, o uso da polimerase Taq por Eppendorf (Alemanha) e da Mistura de Polimerase de cDNA Advantage por Clontech (Paio Alto, CA, E.U.A.) é preferido em particular.

Um aspecto adicional da presente invenção relaciona-se ao uso do dispositivo de acordo com a presente invenção para executar testes baseados em micro-arranjo.

No seguinte, concretizações especiais do dispositivo de acordo com a presente invenção ou o método de acordo com a presente invenção são descritos.

Na Figura 5 é mostrado que a primeira superfície, uma membrana elástica aqui, na qual preferivelmente um dispositivo de aquecimento está integrado, é deformada por meio de um pino ou um ressalto e o chip é por esse meio empurrado para o plano de detecção. Além disso, o plano de detecção é empurrado na câmara de reação por meio de um espaçador na segunda superfície e assim aproxima o chip de DNA de cima até que o líquido entre o chip de DNA e o plano de detecção seja quase inteiramente deslocado. As vedações elásticas vedando a câmara de reação são comprimidas por meio de guiar a superfície de detecção para o chip. O fluido deslocado deforma a vedação de tal modo que o ar seja comprimido em câmaras de compensação de ar.

Porém, a unidade de processo também pode ser desenvolvida de tal modo que tanto só a primeira superfície, por exemplo na forma de uma membrana elástica, seja deformada ou só o plano de detecção seja empurrado na câmara.

Na Figura 6, uma concretização técnica adicional para comprimir a unidade de processo é descrita. A câmara de reação está encerrada por uma membrana de vedação, sobre a qual um chip de DNA é fixado, lateralmente e no lado oposto ao plano de detecção. Ao nível do chip de DNA, a membrana de vedação veda um furo no lado inferior do corpo de câmara. O furo é ligeiramente menor do que o chip de DNA. Ao conduzir uma PCR na câmara de reação, o furo é vedado estanque pela pressão interna formando devido às temperaturas elevadas conectadas com a PCR. Portanto, apesar da membrana de vedação instável, a câmara é à prova de pressão (princípio da válvula de auto-fechamento). Para detecção, um pino ou um ressalto é empurrado pelo furo de lado inferior. A membrana de vedação é erguida e o chip de DNA é apertado contra o plano de detecção. A fim de assegurar a elasticidade requerida da membrana de vedação, a membrana pode ser provida com uma dobra de compensação. Nesta concretização, as câmaras de compensação de pressão também são comprimidas pelo líquido deslocado.

Os exemplos seguintes servem ao propósito de ilustrar a invenção e não são para serem interpretados restritivamente.

Exemplos Exemplo 1: Estrutura de um cartucho de reação tendo aquecimento integrado Nas Figuras 8 e 9, uma concretização de uma unidade de processamento sem aquecimento integrado e um dispositivo para guiar o chip de DNA para o plano de detecção são descritos. O chip de DNA no dispositivo mostrado pode ser lido por meio de um microscópio de fluorescência convencional (por exemplo, Axioskop, Zeiss, Jena, Alemanha).

Exemnlo 2; Estrutura de um cartucho de reação tendo um substrato de aquecimento de silício A variante da unidade de processamento do dispositivo de acordo com a presente invenção, que é mostrada nas Figuras 10 e 11, é um cartucho de reação miniaturizado tendo um arranjo de sonda integrado (chip de DNA), um substrato de aquecimento de silício tendo um sensor de temperatura integrado ("substrato de aquecimento") para ajustar temperaturas distintas na câmara de reação como também uma placa de circuito opcionalmente tendo uma EPROM para contatar eletricamente o substrato de aquecimento. Os componentes individuais estão embutidos em duas cascas feitas de material sintético. A unidade inteira é um sistema espacialmente fechado, em que todas as reações requeridas (por exemplo PCR) podem ser conduzidas de uma maneira controlada em temperatura.

Primeiro, a placa de circuito é inserida no eixo provido na casca inferior (com a EPROM enfrentando para baixo). No lado superior da placa de circuito, três blocos de contato elétrico estão arranjados, que asseguram a conexão elétrica com o substrato de aquecimento subsequentemente inserido, que por sua vez suporta os blocos de contato. Dito substrato de aquecimento tem um tamanho de 8 mm x 6 mm e uma espessura de cerca de 0,6 mm. O substrato de aquecimento assegura ajuste exato de temperaturas diferentes (por exemplo de 40°C a 95°C) dentro da extensão do exame conduzido. Aqui, medir a temperatura na câmara de reação pode ser conduzido tanto pelo sensor integrado no substrato de aquecimento ou por uma unidade de medição externa, que mede a temperatura diretamente na superfície do substrato de aquecimento. No caso anterior, o sensor integrado no substrato de aquecimento pode ser omitido. Os componentes integrados usados para aquecimento e/ou medição de temperatura podem, por exemplo, ser diodos ou também transistores. A superfície do substrato de aquecimento de silício, que está enfrentando para o espaço de reação, não contém nenhum sistema elétrico e é coberta com uma camada de passivação de Si02. O próximo componente é uma vedação elástica, que limita lateralmente o espaço de reação.

No centro do espaço de reação, o chip de DNA é fixado de tal modo que o arranjo de sonda esteja enfrentando para o plano de detecção. Depois de inserir o plano de detecção na forma de uma superfície de vidro, dita superfície ainda se salienta da casca inferior por 0,2 mm. Unindo subseqüentemente a casca superior, que é guiada por meio de pinos de localização, a superfície de vidro é apertada contra a vedação e assim assegura vedação ótima da câmara de reação.

Subseqüentemente, a câmara de reação pode ser enchida com a solução de reação. Aqui, é para ser notado que só o espaço interno contendo o chip é enchido, mas não as câmaras exteriores. Os líquidos requeridos são injetados no espaço de reação com cânulas pela guia de cânula provida.

Subseqüentemente, reações bioquímicas controladas pelo substrato de aquecimento de silício, como por exemplo PCR e/ou hibridização, podem ser conduzidas na câmara de reação.

Para detectar os resultados intermediários ou o resultado final, o plano de detecção é apertado contra o chip de DNA de cima por meio dos espaçadores da unidade de detecção, até que a distância entre o plano de detecção e o arranjo de sonda seja quase zero. Aqui, o líquido circundante é deslocado nas câmaras exteriores, onde comprime o ar local. Este processo é reversível e pode, por exemplo, ser conduzido depois de cada ciclo de PCR.

Devido a seu projeto compacto e a placa de circuito interna ter uma EPROM e o substrato de aquecimento integrado, esta variante do dispositivo de acordo com a presente invenção é particularmente adequada para uso móvel.

Exemplo 3; Detecção da diminuição do sinal de fundo deslocando o analito Todas as medições de fluorescência descritas neste exemplo foram conduzidas por meio de um microscópio de fluorescência (Zeiss, Jena, Alemanha). Excitação era conduzida em luz incidente usando uma fonte de luz branca e um conjunto de filtros adequado para Cianina 3. Os sinais eram registrados por meio de uma câmera de CCD (PCO-Sensicam, Kehlheim, Alemanha). No seguinte, a espessura da abertura denota a distância entre o micro-arranjo e o plano de detecção. a) Medindo o sinal de fluorescência do analito dependendo da espessura da abertura Cascas de canal tendo profundidade de canal definida (5 pm, 10 pm, 28 μιη) foram fundidas de Sylgard. Os canais tinham uma largura de 125 pm. Um chip de vidro era posto pelos canais desigualmente profundos. Os canais eram então enchidos com uma solução de 200 nM de um oligonucleotídeo rotulado Cy3 em 2 x SSC + 0,2% de SDS e o sinal era medido com um tempo de exposição de 1,5 s.

Na Figura 12, os resultados medidos estão descritos. O sinal aumenta linearmente quando profundidade de canal cresce. Uma linha de regressão reta podia ser calculada (Equação 1). (Equação 1) F(x) = 6,2468x + 50,016 Com a ajuda da equação de regressão obtida (Equação 1), as espessuras de camada entre o chip de DNA e plano de detecção podem ser agora determinadas por meio do sinal de fluorescência de fundo.

Isto era verificado por meio de empilhar duas superfícies de vidro (chips) tendo marcas estruturadas em seus lados superiores (cruzes, números e matriz de dados na Figura 14), que poderíam ser focalizadas. Os chips eram empilhados de tal modo que as marcas estruturadas fossem orientadas uma para a outra e eram só separadas por uma camada de líquido fina. Uma solução de 200 nM de um oligonucleotídeo rotulado Cy3 em 2 x SSC + 0,2% de SDS era usada como líquido. Com a ajuda de um dispositivo de focalização do microscópio, que era equipado com uma escala, a distância entre as marcas e portanto a espessura de camada do filme de líquido podería ser determinada diretamente. A intensidade do fundo é 158 valores de cinza com um tempo de exposição de 0,75 s. A espessura da abertura medida no microscópio de fluorescência é 40 pm. Assumindo que os valores de cinza medidos se comportam linearmente em relação a tempo de exposição (veja Figura 13), a espessura resultante da abertura, usando Equação 1, é 42,6 pm. Os valores para a espessura da camada de líquido assim obtida são bem casados. b) Experiências para reduzir ou eliminar a fluorescência de fundo por meio de comprimir a unidade de processo Em ditas experiências, o sinal de hibridização era medido dependendo do deslocamento do analito fluorescente por meio de pressão exercida por um ressalto. A instalação experimental está esboçada na Figura 15. Por meio de empurrar o ressalto, o chip de silício (3,15 x 3,15 mm) era apertado contra um chip de sonda (chip de DNA) e neste processo, o líquido localizado entre as duas superfícies era deslocado.

Para conduzir a experiência, a câmara era enchida com uma solução de hibridização, que é um sistema de modelo para as condições em uma hibridização de PCR. A solução de hibridização continha um oligonucleotídeo rotulado Cy3 (concentração final de 2 nM em 2 x SSC + 0,2% de SDS) que tinha complementaridade ao arranjo de sonda. Além disso, a solução de hibridização continha um oligonucleotídeo igualmente rotulado Cy3, que não hibridiza com o arranjo de sonda e portanto só contribui para o sinal de fundo de fluorescência na solução, mas não aos sinais específicos nos pontos.

Hibridização era conduzida por 10 minutos. Para ler subseqüentemente os sinais de hibridização, um tempo de exposição fixo de 1,5 s era selecionado. Na instalação experimental, o ressalto era empurrado mais próximo para o arranjo de sonda (plano de detecção) depois de cada registro, de forma que a abertura entre o arranjo e a segunda superfície, que está cheia com solução de hibridização, fosse reduzida.

Figura 16 mostra um registro do sinal de hibridização com uma espessura da abertura de 10 μηχ Os resultados medidos para sinal de fundo e sinal de hibridização nos pontos são descritos na Figura 17. De acordo com expectativas, ambos os sinais se comportam linearmente em relação à espessura da abertura. Assim, o sinal de ponto corrigido pelo fundo não muda com a espessura da abertura.

Quando um valor de cinza de 255 é alcançado, o instrumento de medição é sobrecarregado. Isto é, com uma espessura da abertura de cerca de 17 pm, medir a intensidade de ponto só é possível por meio de reduzir tempo de exposição. Portanto, sensibilidade de medição é então reduzida.

Assim, a faixa de medição dinâmica é aumentada reduzindo a espessura da abertura. Por meio de ajuste de fundo dos sinais de ponto (formação de diferença), a espessura da abertura pode ser variada em uma faixa ampla sem influenciar a medição e resultados medidos. Com espessuras muito grandes da abertura (> 20 pm). a medição é fortemente prejudicada devido à sobrecarga do detector. c) Amplificação, hibridização e detecção como reação de um estágio Duas unidades de processo tendo uma estrutura de acordo com a Figura 15 foram montadas e numeradas.

Duas instalações de reação idênticas tendo a composição seguinte foram preparadas: Instalação de reação: 20 miVl de dNTPs............................................0,5 μΐ 1 M de acetato de potássio (Kaac)..........................3 μΐ 25 mM de acetato de Mg Eppendorf............................5 μΐ Solução de PCR de C-DNA Clontech............................5 μΐ Taq-polimerase Eppendorf...................3 μΐ 10 μΜ de iniciador CMV_DP_Cy3..............Ιμΐ Cy3_5’TGAGGCTGGGAARCTGACA3' 10 μΜ de Iniciador CMV_UPJNH2..............0,66 μΐ 5'GGGYGAGGAYAACGAAATC3'_NH2 10 μΜ de iniciador CMV_UP..................0,33 μΐ 5 'GGGY GAGG AYAACGAAATC3' 10 μΜ de iniciador Entero_DP_Cy3...........1 μΐ Cy3_5'CCCTGAATGCGGCTAAT3' 10 μΜ de iniciador Entero_UP_NH2...........0,66 μΐ 5ATTGTCACCATAAGCAGCC3I_NH2 10 μΜ de iniciador Entero_UP...............0,33 μΐ 5ATTGTCACCATAAGCAGCC3' 10 μΜ de iniciador HSVl_DP_Cy3.............1 μΐ Cy3_5'CTCGT AAAATGGCCCCTCC3' 10 μΜ de iniciador HSV1JJPJNH2.............0,66 μΐ 5'CGGCCGTGTGACACTATCG3’_NH2 10 μΜ de iniciador HSV1_UP.................0,33μ1 5'CGGCCGTGTGACACTATCG 10 μΜ de iniciador HSV2_UP_Cy3.............1 μΐ Cy3_5'CGCTCTCGTAAATGCTTCCCT3' 10 μΜ de iniciador HSV2_DP.NH2.............0,66μ1 5'TCTACCCACAACAGACCCACG3'_NH2 10 μΜ de iniciador HSV2_DP.................0,33μ1 5TCTACCCACAACAGACCCACG3' 10 μΜ de iniciador VZV_DP_Cy3..............Ιμΐ Cy3_5'TCGCGTGCTGCGGC 10 μΜ de iniciador VZV_UP_NH2..............0,66μ1 5 'C GGC ATGGCCCGTCT AT3 '_NH2 10 μΜ de inicíador VZVJJP..............................0.33μ1 5'CGGCATGGCCCGTCTAT CMV de modelo..........................................Ιμΐ Água de grau de PCR.....................................22,5 μΐ Total..................................................50μ1 As unidades de processo eram cada uma enchida com 50 μΐ de reação instalada e processada de acordo com o regime de temperatura- tempo seguinte: 1. Desnaturação.......................................95°C

Duração................................................300s 2. Desnaturação.......................................95 °C

Duração................................................lOs 3. Anelamento/Extensão................................60°C

Duração................................................20s Repetir etapas 2 a 3...................................35 vezes 4. Desnaturação.......................................95 °C

Duração................................................300 s 5. Hibridização.......................................40 °C

Duração................................................3600 s Subseqüentemente, as duas unidades de processo eram sujeitas a tratamentos diferentes. No primeiro caso (unidade de processo 1), a fluorescência de fundo era reduzida por meio de deslocar o analito. Isto era assegurado por meio de empurrar o ressalto para cima na direção do plano de detecção, de forma que a abertura enchida com solução de reação seja reduzida até onde possível.

No segundo caso (unidade de processo 2), o analito era substituído por uma solução não fluorescente. A substituição da solução era conduzida com solução de 2 x SSC a uma taxa de flutuação de 300 μΐ/min e um volume de enxágüe de 900 μΐ. Este procedimento corresponde ao estado da arte.

Subseqüentemente, ambas as estratégias para reduzir fluorescência de fundo eram comparadas. Para este fim, os sinais de hibridização em ambas as unidades de processo eram detectados com a ajuda da instalação de câmera de microscópio de fluorescência descrita.

Tempo de exposição era 5 s (veja Figura 18 e Figura 19). Comparando as intensidades pontuais que era conduzido usando o ponto com a substância CMV_S_21-3 (5'-NH2TGTTGGGCAACCACCGCACTG-3'). O local das sondas está indicado nas Figuras 18 e 19.

Na Figura 20, o resultado da experiência está resumido. Por meio de enxaguar a câmara de reação na unidade de processo 2, o sinal de hibridização é reduzido comparado ao deslocamento na unidade de processo 1. É assumido que sangramento das sondas é responsável por isto.

Assim, o método de deslocamento de analito de acordo com o método da presente invenção é para ser preferido a substituição das soluções. A fim de obter detecção de quantidade e integridade do produto de amplificação, 5 μΐ de cada solução de reação era analisado adicionalmente em um gel de agarose de 2%. O resultado (gel manchado de brometo de etídio detectado com um trans-iluminador de UV) pode ser visto na Figura 21.

Exemplo 4: Dispositivo para processar e detectar cartuchos de reação de acordo com a presente invenção Um dispositivo para processar e detectar cartuchos de reação de acordo com a presente invenção conforme este Exemplo é mostrado na Figura 28. O dispositivo para conduzir testes baseados em micro-arranjo com cartuchos de reação de acordo com a presente invenção consiste normalmente em vários componentes, que podem ser unidos em um dispositivo ou podem ser montados modularmente de vários dispositivos parciais. Aqui, o dispositivo pode opcionalmente ser ativado por um computador integrado ou por uma interface com um computador externo. A estrutura do dispositivo é ilustrada na Figura 28.

Um procedimento exemplar ocorre como segue: A interface de fluido do cartucho de reação é trazida manualmente na posição de enchimento, em que as cânulas perfuram a vedação do corpo de câmara, pelo operador. Subsequentemente, o operador alimenta a mistura de reação na câmara de reação por meio de uma pipeta de laboratório padrão. Ambas as etapas também podem ser assumidas por um dispositivo desenvolvido correspondentemente. A interface de fluido é então trazida novamente na posição inicial, em que dito procedimento também pode ser conduzido por um dispositivo desenvolvido correspondentemente. O cartucho de reação é então inserido no dispositivo. Um leitor de matriz de dados, que é arranjado no dispositivo, reconhece a matriz de dados bi-única presa ao cartucho de reação e, por meio de um registro de dados transmitido pelo usuário, carrega a característica de dados para o cartucho e para o teste ser conduzido no computador de controle. Dito computador então controla as etapas de processo individuais, que podem, por exemplo, incluir uma amplificação e hibridização. Pelo mecanismo de pressão integrado, a intervalo capilar na câmara de reação é reduzida subseqüentemente para detecção de acordo com a presente invenção.

Detecção pode ser conduzida com sistemas de formação de imagem de fluorescência óptica convencional ou não formação de imagem. Os dados obtidos são transmitidos subseqüentemente a um computador de controle, que os avalia e apresenta ou os armazena em uma interface interna ou externa. O cartucho de reação pode então ser tirado do dispositivo e ser descartado pelo operador.

Exemplo 5: Cartucho de Reação feito de material sintético eletricamente condutivo Um cartucho de reação como descrito na Figura 29 é preparado. A casca inferior (1) do cartucho de reação consiste em material sintético eletricamente condutivo formando a base da câmara de reação (Conduto 2, RKT, Alemanha). Um sensor de temperatura de chapa PT-100 é fixado ao lado inferior da base de câmara com a ajuda de um adesivo adequado, por exemplo Loctite 401 (Loctite, Alemanha). Junto com a vedação (3) e o vidro de cobertura (4), a casca inferior forma a câmara de reação do cartucho de acordo com a presente invenção. O cartucho ademais tem um furo roscado (2) para inserir parafusos para contato elétrico, uma casca superior (5) do cartucho de reação, por exemplo feita de acrílico, um furo (6) para prender a casca superior, e uma janela de detecção (7) na casca superior.

Uma mistura de reação de PCR padrão é preparada: 30,5 μΐ de água deionizada 5μ1 de solução de PCR 10 x (por exemplo solução de reação de PCR de cDNA lOx, Clontech, Alemanha) 5 μΐ de acetato de Mg, 25 mM (por exemplo Eppendorf, Alemanha) 0,5 μΐ de dNTP, 20 mM cada Ιμΐ de lósfDl (5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'), 10 mM Ιμΐ de 16sRa (5'TACCGTCACCATAAGGCTTCGTCCCTA- 3'), 10 mM 3 μΐ de polimerase de DNA Taq (por exemplo Genaxxon, Alemanha) Ιμΐ de modelo Por meio de uma seringa de insulina (Becton Dickinson, Alemanha), a câmara de reação é enchida com a mistura de reação. Para ventilação durante o procedimento de enchimento, uma segunda cânula é perfurada pela vedação do corpo de câmara. Depois de enchimento, a cânula de ventilação e seringa de insulina são descartadas habilmente. A câmara é então conectada a uma unidade reguladora (CLONDIAG chip technologies GmbH, Alemanha) pelos dois parafusos providos para este propósito. Igualmente, o sensor de temperatura é conectado a dita unidade reguladora no lado inferior da casca inferior. Dita unidade reguladora é capaz de regular temperaturas específicas na casca inferior de acordo com um programa de predefmido.

Desta maneira, o programa de PCR seguinte é conduzido: 5 min a 95°C, 30 x (30 s a 95°C, 30 s a 62°C, 50 s a 72°C).

Figura 30 mostra uma imagem do cartucho de reação registrada com uma câmera de formação de imagem térmica a uma temperatura de 95°C.

Depois de conclusão do programa, o produto de reação é removido da câmara de reação por meio de uma seringa de insulina.

Analogamente, uma cânula é perfurada pela vedação do corpo de câmara para ventilação durante o esvaziamento da câmara de reação. O produto de reação é agora analisado por meio de eletroforese de gel de agarose. Para este fim, 5 μΐ da solução de reação, junto com uma solução adequada (por exemplo, 5 μΐ de 250 mM em 50% de glicerina, azul de bromfenol), são aplicados no bolso de um gel de 2% de agarose e eletroforese é conduzida. O resultado está descrito na Figura 31.

Como pode ser visto claramente, um produto de amplificação de tamanho cometo e em uma quantidade comparável ao controle positivo podia ser obtido em todos os casos.

Figuras Figura 1: Pesquisa do dispositivo de acordo com a presente invenção incluindo um dispositivo de leitura e a unidade de processo.

Figura 2: Vista da unidade de processo de acordo com a presente invenção.

Figura 3: Vista explodida da unidade de processo de acordo com a presente invenção, incluindo o plano de detecção, vedação, chip de DNA, e corpo de câmara. O corpo de câmara tem uma membrana elástica deformável reversivelmente.

Figura 4: Vista do corpo de câmara tendo um meandro de aquecimento cercado por material sintético moldado por injeção na membrana elástica.

Figura 5: Vista do estado da unidade de processo de acordo com a presente invenção no dispositivo de leitura A) durante a PCR, B) antes da detecção, e C) durante a detecção.

Figura 6: Vista do modo de função da unidade de processo de acordo com a presente invenção tendo vedação de membrana, dobra de compensação e furo lateral inferior. Em A), a unidade de processo pode ser vista em posição normal. Em B), a unidade de processo pode ser vista em forma comprimida, em que a solução fluorescente entre chip de DNA e plano de detecção está deslocada.

Figura 7: Vista de um disco rotativo, sobre o qual quatro blocos de temperatura são instalados. Os blocos de temperatura são termo-fixados a uma temperatura cada um. Por meio de girar o disco e/ou a unidade de processo, a temperatura na câmara de reação pode ser alterada.

Figura 8: Vista de um exemplo de uma unidade de processo fresada e aparafusada.

Figura 9: Vista de um exemplo de um dispositivo de compressão ou aperto para a unidade de processo de acordo com a presente invenção para detectar os sinais de hibridização em um microscópio de fluorescência convencional.

Figura 10: Vista de uma unidade de processo de acordo com a presente invenção tendo uma placa de circuito como conexão elétrica para aquecedor e sensor de temperatura. O aquecedor é desenvolvido como componente de semicondutor, Figura 11: Vista explodida da unidade de processo mostrada na Figura 10.

Figura 12: Vista da linha de regressão reta para determinar a largura de uma abertura enchida com fluoroforo.

Figura 13: Vista do progresso linear do sinal de fluorescência quando tempo de exposição aumenta através da região medida.

Figura 14: Registro de fluorescência de dois chips sobrepostos, a abertura entre os quais é enchida com 200 NM de fluoroforo Cy3. A intensidade do fundo é 158 valores de cinza a um tempo de exposição de 0,75 s, A espessura da abertura medida no microscópio de fluorescência é 40,00 pm, Assumindo que os valores de cinza medidos se comportam linearmente em relação a tempo de exposição (veja Figura 13), a espessura resultante da abertura, usando Equação 1, é 42,6 pm. Os valores para a espessura da camada assim obtida são bem casados.

Figura 15: Vista da instalação experimental para detectar arranjos de DNA sem enxágüe.

Figura 16: Registro de fluorescência de um arranjo com chip apertado contra ele. Pelas bordas brancas, a radiação de fundo da solução de amostra deslocada pode ser vista.

Figura 17: Diminuição de intensidades absolutas de sinal e fundo quando a espessura da abertura é reduzida. A diferença de ambos os valores é constante ao longo da região medida.

Figura 18: Detecção dos sinais de sonda por meio de deslocar a fluorescência de fundo. Na borda esquerda, o líquido não deslocado pode ser visto.

Figura 19: Detecção dos sinais de sonda de um arranjo de DNA, que era ajustado por fundo por meio de enxágüe.

Figura 20: Resumo dos resultados medidos para comparação experimental de deslocamento e substituição do analito.

Figura 21: Analítica de referência da PCR em uma unidade de processo por meio de eletroforese de gel.

Figura 22: Vista diagramática de uma unidade de enchimento destacável para encher cartuchos de reação com substâncias reativas ou soluções. Em seguida, os números de referência seguintes são usados: 1 Unidade de enchimento 1.1 Unidade de enchimento de interface mecânica - cartucho 2 Cartucho 2.1 Cartucho de interface mecânica - unidade de enchimento 2.2 Vedação 2.3 Câmara de reação 2.4 Abertura preferida no cartucho para as cânulas 3 Canal de enchimento 3.1 Interface fluida e mecânica com ferramentas de adição de amostra 3.2 Cânula de enchimento 4 Canal de rejeito com recipiente de rejeito 4.1 Furo de ventilação 4.2 Cânula de rejeito Figura 23: Vista do procedimento para encher um cartucho de reação por meio de uma unidade de enchimento modular.

Figura 24: Vista diagramática de uma unidade de enchimento integrada para encher cartuchos de reação com substâncias reativas ou soluções na posição preferida sem penetração da vedação do corpo de câmara. Em seguida, os números de referência seguintes são usados: 1 Unidade de enchimento - cartucho 1.1 Cartucho de interface mecânica - unidade de enchimento 2 Cartucho de reação 2.1 Cartucho de interface mecânica - unidade de enchimento 2.2 Vedação 2.3 Espaço de reação 2.4 Abertura preferida para as cânulas no invólucro de cartucho 3 Canal de enchimento 3.1 Interface fluida e mecânica com ferramentas de alimentação de amostra 3.2 Cânula de enchimento 4 Canal de rejeito com recipiente de rejeito 4.1 Interface fluida e mecânica com unidades de dedução de amostra 4.2 Cânula de rejeito 5 Equipamento para posição preferida, aqui: mola Figura 25: Vista do procedimento para encher um cartucho de reação tendo uma unidade de enchimento integrada.

Figura 26: Vista diagramática de uma unidade de enchimento integrada tendo um recipiente de rejeito integrado para encher cartuchos de reação com substâncias reativas ou soluções na posição preferida sem penetração da vedação do corpo de câmara. Em seguida, os números de referência seguintes são usados além dos números de referência da Figura 24: 4 Canal de rejeito com recipiente de rejeito 4.1 Furo de ventilação Figura 27: a) Enchimento do espaço de reação ao deduzir o líquido de excesso em um recipiente ou canal de rejeito b) Dedução de líquido de excesso ao reduzir o espaço de reação paia detecção.

Aqui, os números de referência seguintes são usados: 1 Câmara de reação 2 Vedação 3 Mecanismo de pressão 4 Interface de fluido 4.1 Cânula de dedução 4.2 Cânula de alimentação Figura 28: Dispositivo para processar e detectar cartuchos de reação de acordo com a presente invenção conforme Exemplo 4. Aqui, os números de referência seguintes são usados: 1 Cartucho de reação 1.1 Câmara de reação com micro-arranjo 1.2 Interface de sistema de fluido 1.3 Vedação do corpo de câmara 1.4 Conexões elétricas para sistema de aquecimento, opcionalmente também sensores de temperatura 1.5 Chip 1.6 Sistema de fixação de posição para implementar uma posição preferida e guiar as cânulas 1.7 Cânulas 2 Mecanismo de pressão 3 Sistema de identificação, por exemplo código de barras ou matriz de dados 3.1 Óptica de identificação, por exemplo código de barras ou leitor de matriz de dados 4 Óptica de detecção 5 Conexões de fluido Figura 29: Cartucho de reação de acordo com Exemplo 5.

Figura 30: Registro do cartucho de reação de acordo com Exemplo 5 registrado com uma câmera de formação de imagem térmica a uma temperatura de 95°C.

Figura 31: Análise do produto de reação de acordo com Exemplo 5 por meio de eletroforese em gel de agarose. Aqui, os números de referência indicam: 1,5: Controle positivo do termo-ciclador 2-4: Produtos de reação dos cartuchos 6:100 pb padrão REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Dispositivo para detecção qualitativa e/ou quantitativa de interações moleculares entre moléculas de sonda e moléculas alvo em uma solução de amostra, compreendendo: um micro-arranjo (1.5) sobre um substrato, no qual moléculas de sonda são imobilizadas em elementos de arranjo, o micro-arranjo (1.5) sendo arranjado em uma primeira superfície do dispositivo; e uma câmara de reação (LI) que é formada entre a primeira superfície com o micro-arranjo arranjado nela, e uma segunda superfície, a distância entre o micro-arranjo (L5) e a segunda superfície sendo variável; caracterizado pelo fato de que o dispositivo ainda compreende um meio (2) para variar a distância entre o micro-arranjo (1.5) e a segunda superfície de tal modo que a solução de amostra entre o micro-arranjo e a segunda superfície é essencialmente removida substancial mente sem remover a solução de amostra da câmara de reação (1.1).

2. Dispositivo de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a distância entre dito micro-arranjo (1,5) e a segunda superfície é variável em uma faixa de cerca de 0 a cerca de l mm.

3. Dispositivo de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dispositivo ainda compreende uma unidade de controle de temperatura e/ou unidade reguladora de temperatura para controlar e/ou regular a temperatura dentro da câmara de reação (1.1).

4. Dispositivo de acordo com reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a unidade para controlar e regular a temperatura é integrada na primeira superfície.

5. Dispositivo de acordo com reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a unidade para controlar e regular a temperatura inclui blocos de temperatura, cada um pré-aquecido a uma temperatura definida.

6. Dispositivo de acordo com reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que os blocos de temperatura são arranjados linearmente ou em um disco rotativo.

7. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dispositivo inclui um sistema de detecção (4).

8. Dispositivo de acordo com reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o sistema de detecção (4) é um sistema óptico, preferivelmente um sistema de fluorescência óptica.

9. Dispositivo de acordo com reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o sistema de fluorescência óptica é um microscópio de fluorescência sem autofoco.

10. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o sistema de detecção (4) está conectado a um espaçador que, ao assentar sobre a segunda superfície, ajusta uma distância entre o sistema de detecção (4) e a segunda superfície.

11. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que em zonas de compensação lateralmente limitadas são providas para a câmara de reação (1.1) formada entre a primeira e segunda superfícies, as zonas de compensação mantendo o volume dentro da câmara de reação (1.1) após uma redução do espaçamento entre o micro-arranjo (1.5) e a segunda superfície essencialmente constante.

12. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que uma segunda superfície é feita de um material opticamente transparente, preferivelmente vidro.

13. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a câmara de reação (1.1) formada entre as primeira e segunda superfícies é delimitada lateralmente por vedações elásticas.

14. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a primeira superfície é configurada pelo menos na zona debaixo do micro-arranjo (1.5) tal que dito micro-arranjo (1.5) possa ser guiado relativo à segunda superfície de forma que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície seja variável.

15. Dispositivo de acordo com reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a primeira superfície é deformável elasticamente pelo menos na zona debaixo do micro-arranjo (1.5).

16. Dispositivo de acordo com reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a primeira superfície é feita de plástico elástico.

17. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que a primeira superfície é formada por duas camadas sobrepostas, a camada exterior das duas camadas sobrepostas tendo um rebaixo pelo menos na zona debaixo do micro-arranjo (1.5) .

18. Dispositivo de acordo com reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que uma camada interna das duas camadas sobrepostas é formada de uma vedação elástica (2.2).

19. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, caracterizado pelo fato de que o dispositivo pelo menos inclui um meio (2) para variar a distância, com o qual o micro-arranjo (1.5) pode ser guiado relativo à segunda superfície.

20. Dispositivo de acordo com reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o micro-arranjo (1.5) pode ser guiado relativo à segunda superfície por meio atuando na primeira superfície por compressão e/ou tensão.

21. Dispositivo de acordo com reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a primeira superfície pode ser colocada em vibração pelo meio.

22. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a segunda superfície pode ser guiada relativa à primeira superfície de forma que a distância entre o micro-arranjo e a segunda superfície seja variável.

23. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 22, caracterizado pelo fato de que a segunda superfície pode ser guiada relativa à primeira superfície pelo espaçador atuando na segunda superfície por compressão e/ou tensão de forma que a distância entre o micro-arranjo (1.5) e a segunda superfície seja variável.

24. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a primeira superfície e a segunda superfície podem ser guiadas de forma que a distância entre o micro-arranjo (1.5) e a segunda superfície seja variável.

25. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a câmara de reação (1.1) é um intervalo capilar entre o portador de câmara e o micro-arranjo.

26. Dispositivo de acordo com reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o intervalo capilar tem uma espessura em uma faixa de cerca de 0 μηι a cerca de 100 μηα.

27. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a câmara de reação (1.1) inclui pelo menos duas sub-câmaras, em que, em um primeiro estado não comprimido, as sub-câmaras estão em conexão fluida entre si e, em um segundo estado comprimido, nenhuma conexão fluida existe entre as sub-câmaras.

28. Dispositivo de acordo com reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que cada sub-câmara é designada a uma zona definida do micro- arranjo (1.5).

29. Dispositivo de acordo com reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o micro-arranjo (1.5) e/ou a segunda superfície é provido com cavidades servindo como paredes entre as sub-câmaras.

30. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado pelo fato de que as paredes entre sub-câmaras são formadas por vedações elásticas (2.2).

31. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dispositivo ainda inclui uma unidade de carregamento (1) e/ou uma unidade de re-processamento para purificar e/ou reconcentrar uma solução de amostra e/ou controlar o carregamento e/ou descarregamento da câmara de reação (1.1) com fluidos.

32. Dispositivo de acordo com reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a câmara de reação (1.1) e unidade de carregamento e/ou unidade de re-processamento estão conectadas uma a outra por duas cânulas, as cânulas sendo arranjadas de forma que uma primeira cânula assegure a alimentação de fluidos da unidade de carregamento e/ou unidade de re-processamento na câmara de reação (1.1), e uma segunda cânula assegure a fuga de ar da câmara de reação (1.1) expelido pelos fluidos providos.

33. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dispositivo inclui uma unidade associada com o sistema de detecção (4), para processar sinais recebidos pelo sistema de detecção (4).

34. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dispositivo ainda tem uma interface para computadores externos.

35. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dispositivo é provido com uma codificação, preferivelmente uma matriz de dados ou um código de barras contendo informação sobre a biblioteca de substâncias e/ou execução da reação de amplificação e/ou reação de detecção.

36. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as moléculas de sonda e/ou moléculas alvo são biopo lí meros selecionados do grupo incluído de ácidos nucleicos, peptídeos, proteínas, amígenos, anticorpos, carboidratos c/ou análogos deles, e/ou copolímeros dos biopolímeros acima mencionados.

37. Dispositivo de acordo com reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que as moléculas de sonda e/ou moléculas alvo são ácidos nucleicos e/ou análogos de ácido nucleico.

38. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dispositivo tem um corpo de câmara feito de material eletricamente condulivo,

39. Dispositivo de acordo com reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o material eletricamente condutivo é um plástico eletricamente condutivo,

40. Dispositivo de acordo com reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o plástico eletricamente condutivo é selecionado do grupo consistindo em poliamida com 5-30% de fibras de carbono, policarbonato com 5-30%' de fibras de carbono, poliamida com 2-20% de fibras de aço inoxidável, e PPS com 5-40%; de fibras de carbono.

41. Método para detecção qualitativa e/ou quantitativa de interações moleculares entre moléculas de sonda e moléculas alvo. compreendendo as etapas seguintes: a) introduzir uma solução de mostra compreendendo moléculas alvo em uma câmara de reação (1.1) que é formada entre uma primeira superfície com o micro-arranjo (1.5) arranjado nela, e uma segunda superfície, em que o mi cio-arranjo (1.5) compreende um substrato (1.5) com em elementos de arranjo tendo moléculas de sonda imobilizadas no mesmo; e b) detectar uma interação entre as moléculas alvo e as moléculas de sonda imobilizadas no substrato. caracterizado pelo fato de que entre introduzir a solução de amostra compreendendo moléculas alvo na câmara de reação (1.1) e detectar, remoção alguma de soluções da câmara de reação (1.1) ocorre, e em que na etapa b) a distância entre o micro-arranjo (1.5) e a segunda superfície é variada de forma que a solução de amostra entre o micro-arranjo (1.5) e a segunda superfície seja essencialmente removida.

42. Método de acordo com reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que, antes da detecção, a distância entre o micro-arranjo (1.5) e a segunda superfície é mantida em uma posição que permite a interação entre as moléculas alvo e as moléculas de sonda imobilizadas no substrato.

43. Método de acordo com a reivindicação 41 ou 42, caracterizado pelo fato de que as moléculas alvo são providas com um marcador detectável.

44. Método de acordo com reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o marcador detectável é um marcador de fluorescência.

45. Método de acordo com reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a detecção do marcador de fluorescência é efetuada por meio de um microscópio de fluorescência sem um autofoco.

46. Método de acordo com reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a detecção do marcador de fluorescência é efetuada por meio de um microscópio de fluorescência com um foco fixo.

47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, caracterizado pelo fato de que as moléculas de sonda e/ou moléculas alvo são ácidos nucleicos e/ou análogos de ácido nucleico.

48. Método de acordo com reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que as ditas moléculas alvo são ampliadas na câmara de reação (2.3) por meio de uma reação de amplificação cíclica.

49. Método de acordo com reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a detecção é efetuada depois de um ou vários ciclos durante a reação de amplificação cíclica e/ou depois de conclusão da reação de amplificação cíclica.

50. Uso de um dispositivo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizado pelo fato de ser para efetuar testes baseados em micro-arranjos.