JP4598960B2 - 生物学的サンプルから得られた標的化合物のチップ上での同定及び／又は定量方法 - Google Patents

生物学的サンプルから得られた標的化合物のチップ上での同定及び／又は定量方法 Download PDF

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Description

【０００１】
発明の分野
本発明はチップ上に固定された捕獲分子への結合による生物学的サンプルから得られた標的化合物の同定及び／又は定量方法に関する。
【０００２】
本発明は前記方法に基づいた同定及び／又は定量装置にも関する。この装置は前記チップ上の結合された標的化合物の陽性の場所を同定及び／又は定量することを可能にする。
【０００３】
発明の背景及び従来技術
生物学的アッセイは二つの生物学的分子、例えば核酸分子の二つの鎖、抗原と抗体又はリガンドとその受容体の間の特異的相互作用に主に基づいている。生物学的アッセイの現在の挑戦はサンプル中に存在する分子の多数検出を同時に行うことである。「バイオチップ」の表面上のアレイのミニチュア化及び開発は顕微鏡形式における多重反応を可能にするツールであり、前記検出は多数の可能な標的化合物をスクリーニング及び／又は同定するため、限定された体積のサンプルを用いて行われる。これらのアレイは標的化合物の結合のために用いられる特異的捕獲分子を含む不連続領域を形成する。これらの不連続領域は数マイクロメートル程度の小ささであり、表面１ｃｍ２当たり数１０００の捕獲分子の固定を可能にする（ＷＯ ９５／１１９９５）。
【０００４】
しかし、結合された標的化合物の検出は困難である。というのも、それらの量は前記ミニチュア化のために極めて小さいからである（数フェムトモル又は数アトモルの場合もある）。従って、極めて感度の高い方法のみがかかる検出に適する。
【０００５】
ＤＮＡのような標的化合物をそれらのあり得る遺伝子増幅後に蛍光性分子でラベリングすることが提案されている。ＲＮＡ分子を検出する必要がある場合、それはそのあり得る増幅前にまずｃＤＮＡへと変換される。もし標的化合物を直接ラベリングすることが不可能であるならば、二重反応（サンドイッチ反応）を行うことができる。しかし、蛍光性分子の量はとても少ないので、「ハイブリダイゼーションチップ」上の結合化合物を検出及び／又は定量するためには特異的なアレイスキャナーを開発する必要がある。前記の高価な特異的スキャナーは、蛍光性分子を励起させるためのレーザースキャナー、ノイズ蛍光バックグラウンドを減少させるためのピンホール及び検出の感度を増大させるための光電子増倍管を含む。
【０００６】
高感度を示す他の検出方法は文献ＵＳ−５８２１０６０及びＷＯ ９５／０４１６０に記載されており、質量分析計の如き高価な装置を用いる検出に基づいている。
【０００７】
比色ラベリングを生ずる特定の生成物の沈澱に基づく方法（ＵＳ ５２７０１６７，ＵＳ ４７３１３２５，ＥＰ−Ａ−０３０１１４１）又は酵素活性の結果に基づく方法（ＥＰ−Ａ−０３９３８６８，ＷＯ ８６／０２７３３，ＥＰ−Ａ−００６３８１０）も提案されている。しかしながら、これらの方法は感度が低いか又は「ハイブリダイゼーションチップ」上での標的化合物の検出には適当でない。というのも沈澱が反応結合からいくらか離れた場所で生じてしまい、その場所は特異的な結合標的化合物と容易には相互に関連させることができないからである。加えて、かかる酵素反応の沈澱の密度は光吸収による検出を可能にするほどには十分不透明でない。
【０００８】
酵素反応から得られた可溶性生成物をその沈澱前に金属で固定させることによって検出を改良することも提案されている。しかし、前記酵素反応の結果は可溶性生成物であるため、沈澱の場所と特異的な結合標的化合物の検出の間には相関関係はない。
【０００９】
発明の目的
本発明は生物学的サンプル中に（所望により同時に）存在する一以上の標的化合物の新規な同定及び／又は定量方法であって、従来技術の欠点を有さない方法を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明は簡単で高価でない方法であって固体支持体の表面のアレイ上に固定された捕獲分子を用いた前記標的化合物の検出を可能にする方法を提供することを目的とする。
【００１１】
本発明の最後の目的は前記方法に基づいた簡単で高価でない装置を提供することであり、この装置は「ハイブリダイゼーションチップ」上の結合標的化合物の同定及び／又は定量を改良する。
【００１２】
発明の概要
本発明は生物学的サンプル中に存在する少なくとも一つの標的化合物の同定及び／又は定量方法に関する。この方法は固体支持体のアレイ（以後、「ハイブリダイゼーションチップ」と称する）上に固定された捕獲分子上に標的化合物を結合させることを含み、前記標的化合物のその対応する捕獲分子への結合は前記捕獲分子の場所での金属沈澱の形成を生ずる。
【００１３】
有利には、前記方法は以下のステップを含む：
− 標的化合物を捕獲分子と接触させて前記標的化合物と（対応する）捕獲分子の間の特異的結合を可能にさせ（ただし、前記捕獲分子は１ｃｍ２当たり少なくとも２０個の不連続領域の密度を含むアレイに従って固体支持体の表面上に固定されており、前記不連続領域の各々は一つの種類の捕獲分子で固定されている）、
− 前記結合の場所での沈澱の形成に導く反応、好ましくは（化学的又は生化学的）触媒反応を行わせ、
− 不連続領域における沈澱のあり得る存在を好ましくはスキャナーを用いて決定し、そして
− 不連続領域における沈澱の存在（沈澱パターン）を生物学的サンプル中の前記標的化合物の同定及び／又は定量と相互に関連させる。
【００１４】
本発明による「ハイブリダイゼーションチップ」は表面の一つ以上に捕獲分子のアレイ（特定パターン）の形成を可能にさせるあらゆる種類の固体支持体である。前記固体支持体はガラス、フィルター、電子装置、ポリマー又は金属材料等からなることができる。好ましくは前記アレイは特定の場所（有利には特定パターンに従って表されている）を含み、これらの各々は通常一つの種類の捕獲分子のみを含む。
【００１５】
タンパク質へのＤＮＡ鎖の固定（これはその後支持体上の特定場所に特異的に付着される）が文献ＵＳ−５５６１０７１に記載されている。捕獲化学物質がマイクロチューブに結合されることができ、それが次に空間的に配置されて文献ＧＢ−３３１９８３８に記載されているようにアレイを作り出すことができること、又は文献ＥＰ−０４７６０１４，ＵＳ−５５１０２７０，ＵＳ−５４４５９３４，ＷＯ ９７／２９２１２，ＵＳ−５６０５６６２，ＵＳ−５６３２９５７及びＷＯ ９４／２２８８９に記載の通りにフォトリソグラフィー技術を用いることによって特定の表面上でのオリゴヌクレオチドの直接合成を得ることができることも知られている。
【００１６】
上述のアレイを得るために固体支持体の表面上に捕獲分子を固定するためのこれらの方法はすべて本発明と両立できる。
【００１７】
本発明の生物学的標的化合物は血液、尿、糞便、唾液、膿、血清、組織、発酵溶液又は培養培地から抽出された臨床サンプルの如き生物学的サンプル（又は所望により非生物学的サンプル）中に存在することができる。前記標的化合物は「ハイブリダイゼーションチップ」上でのそれらの検出及び／又は定量の前にもし必要ならば当業者には知られている方法によって単離精製され、開裂され、複製され及び／又は増幅されることが好ましい。
【００１８】
好ましくは結合場所での沈澱の形成は結合標的化合物上への金属化合物の固定に伴って、又は酵素の存在下での金属の還元の結果として得られる。有利にはコロイド状の金の存在下での銀の還元が捕獲分子に結合された標的化合物から数マイクロメートルを越えない距離で沈澱を形成することを可能にする。
【００１９】
本発明によれば、アレイ上の特定場所は長さにおいて１０００μｍより小さい。これらの場所又はスポットは１０〜５００μｍの直径を有することが好ましく、同様の大きさの程度の距離によって分離されている。従って、固体支持体のアレイは１ｃｍ２の表面上に１００〜２５００００個のスポットを含む。しかし、１μｍ以下の小ささのスポットを調製し、その上に捕獲分子を固定することも可能である。前記スポット又は場所の形成は、共有結合又は非共有結合吸着による固体支持体の表面上への前記捕獲分子の固定を可能にする既知のマイクロエレクトロニクス又はフォトリソグラフィー方法又は装置によって得られるであろう。共有結合技術は捕獲分子固定の部位を特異的に制御してインキュベーション又は洗浄ステップ中に脱着することがあり得るいくつかの捕獲分子（核酸又は抗体の如き）を生じ得るあり得る欠点を回避するためには好ましい。
【００２０】
好ましい実施態様の一つは、活性化されたガラス担持アルデヒド部分上のアミノ基の結合によるタンパク質、ペプチド又は核酸配列の如き生物学的分子の固定である。核酸鎖中へのアミン基の組み込みはそれらの合成中にアミノ化ヌクレオチドを用いることによって容易に得ることができる。アミノ化されたアミノ酸はSchena等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, pp. 10614−10619(1996)）によって記載されているように、又は文献ＵＳ−５６０５６６２及びKrensky等の文献（Nucleic Acids Research, 15, pp. 2891−2909(1987)）において記載されているようにガラス担持アルデヒド基の如き固体支持体の表面上に固定することができる。アミノとカルボキシル基の間の結合はJoos等（Anal. Biochem., 247, pp. 96−101(1997)）によって記載されているようにカルボジイミド化合物の如きカップリング剤の存在によって得られる。チオール変性されたオリゴヌクレオチドも架橋分子の存在下で固体支持体の表面上でのアミノ基との反応を得るために用いることができる（Thrisey等，Nucleic Acids Research, 24, pp. 3031−3039(1996)）。同様に、オリゴヌクレオチドは文献ＵＳ−５５５２２７０及びＷＯ ９８／２８４４４に記載されているようにヒドロキシル基及びアルデヒド基を担持するポリアクリルアミドの如きゲルに固定することができる。
【００２１】
標的化合物のそれらの対応する特異的捕獲分子への結合（又は認識）は、最適条件で行われる場合は自発的な非共有結合反応である。それは非共有結合性化学結合に関する。媒体の組成及び他の物理的及び化学的要因は結合の速度及び強度に影響を与える。例えばヌクレオチド鎖の認識については低いストリンジェンシー及び高温は二つの相補的鎖の間の結合の速度及び強さを低下させる。しかし、これらの条件は二つの鎖（完全には相補的でない）の間の非特異的結合をも極めて低下させる。いくつかの配列が類似である場合、結合の特異性は少量の非ラベル分子を添加することによって増大させることができる。これらの非ラベル分子はそれらの相補的配列と競合するが、他の配列とは一層強く競合するので、交差反応のレベルを低下させる。
【００２２】
結合条件の最適化は抗原／抗体又はリガンド／受容体認識についても必要であるが、それらは通常かなり特異的である。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様は増幅を金の如き他の金属の接触下でＡｇ＋の触媒的還元によって行うことである。金のナノ粒子は容易に入手可能であり、それらはタンパク質の如き分子に容易に固定することができる。例えば、ストレプトアビジンでコートされた金粒子は市場で入手できる。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様によれば、ラベリングされた標的分子を用い、それは次にコンジュゲートによって認識される。このラベルされた分子（ビオチン、ハプテン、−−−）は結合対の第一メンバーとみなすことができる。ＤＮＡについては、ラベリングはそれらの増幅中のビオチン化されたヌクレオチドの組み込みによって容易に行うことができる。ＲＮＡについては、ビオチン化されたヌクレオチドはｃＤＮＡ又はその後の増幅ステップにおけるそれらのコピーのために用いられる。ヌクレオチド配列の増幅は一般的な習慣である。何故なら標的分子はしばしば極めて低い濃度で存在するからである。タンパク質はＮＨＳ−ビオチン又は他の反応を用いて容易にラベリングされる。ビオチン化された分子が一旦捕獲されると、ストレプトアビジン−金複合体（これは結合対の第二メンバーである）が添加され、ストレプトアビジンはビオチンを特異的に認識し、かくして複合体は標的が固定された場所で固定される。もしハプテンがラベルとして用いられるならば、抗体−金複合体が用いられるであろう。次にＡｇ＋及び還元剤を含む反応性混合物が表面上に添加され、Ａｇ層は金粒子上に沈澱し、結晶粒子の形成に導く。
【００２５】
金を用いた標的分子の直接ラベリングは金でラベリングされた抗原、抗体又はヌクレオチドを用いることによって可能である。
【００２６】
代替案は標的分子のいかなるラベリングをも回避し、次にラベリングされている第二のヌクレオチド配列を用いることである。それらは次に標的及びラベリングされたヌクレオチド配列を固定する捕獲分子とのサンドイッチハイブリダイゼーション又はサンドイッチ反応を形成し、検出を行うことを可能にする。上述のように、ラベリングされたヌクレオチド配列はそれ自体が金属の沈澱を触媒することができるか、又はそれは第二複合体を介してそれを行う。
【００２７】
Ａｇ沈澱はビオチン化されたヌクレオチド配列の結合の場所に対応する。前記場所は良く規定されているので、前記沈澱の存在（アレイの特定スポット）を同定することが可能である。
【００２８】
沈澱は小さい結晶の形態を有し、それは時間と共に約１μｍの直径に達する。これらの小結晶の形成はシグナルの真の増幅を表す。何故ならそれらは直径数ｎｍの金粒子の存在から生じたものだからである。
【００２９】
予期せぬことに、表面上に存在するラベリングされたヌクレオチド配列の所定範囲内では、濃度曲線が金でラベリングされたヌクレオチド配列の濃度と表面の沈澱量の間で得ることができた。アレイの一つの制約は、検出シグナルがそれが生ずる場所に相関関係を有する必要があるということである。
【００３０】
粒子状形態を有するため、沈澱は光の反射を有利には変更する。それは光の強い拡散（スポット検出される）にも導き、これは既知の検出手段によって記録可能である。かかる拡散アレイはフォトダイオードを用いて光ビームの反射から通常検出され、記録される。一つの予期せぬ観察は銀結晶の存在用のこのアッセイは極めて感度が高いということを発見したことである。
【００３１】
銀沈澱が黒色表面として出現するという事実はスキャナーの使用を可能とする（アレイの透明表面を通した光の吸収）。不溶性沈澱の存在は光を吸収し、それが次に検出されて記録される。スキャナーの利点はアレイの小部分のみが一時に検出され、従ってずっと良好な解像度を得ることができるということである。照射ビーム又は検出表面のいずれかが焦点合わせされ、シグナルが記録され、かくしてアレイの像が再構築されることができる。検出手段（検出器）はＣＣＤ又はＣＭＯＳカメラであることができ、それはアレイ全体を測定する。検出の解像度は次にカメラの画素の数に依存する。他方、検出器は線へと配置されたフォトダイオードからなることができ、像はこの線の前部を移動させることによってスキャンされる。１画素当たり１１μｍの感度のスキャナーを構築することができ、これは直径５０μｍ以上のスポットを分析するのに十分である。
【００３２】
透過された光の記録と組み合わされたアレイの全照明も可能である（スキャナーよりも迅速であるが、感度は劣るようにみえる）。
【００３３】
金属として、銀はそれ自体光を反射することができる。たとえもしこの反射の効率が低いとしても、それは存在し、そして銀沈澱（スポット）の場所を突き止めるのに用いることができる。その金属としての性質のため、電磁場の変動又は電気コンダクタンスの変動の如き他の方法も可能である。
【００３４】
本発明の他の側面はサンプルから得られた一以上の同一の又は異なる標的化合物の診断及び／又は定量装置に関し、前記装置は以下のものを含む：
− 標的化合物のその対応する捕獲分子への結合から生ずる固体支持体の表面上の沈澱（スポット）を検出及び／又は定量する装置、
− 所望により前記固体支持体上に記録されている情報（例えばバーコード）を読み取る装置、及び
− 以下のことをプログラムされたコンピュータ：
−所望により捕獲分子を担持する不連続領域を認識し、
−前記検出装置から得られた結果（前記読み取り装置から得られた情報と所望により相関関係を有する）を収集し、そして
−前記標的化合物の診断及び／又は定量を行う。
【００３５】
従って検出解像度及び特に最終的定量の信頼性は検出装置の特性に大部分依存する。特に検出装置がＣＣＤカメラを含む場合、信頼性はその画素数に依存する。かくして画素数は定量の許容感度を制限する。通常、１画素につき１０μｍの解像度のＣＣＤを得ることが可能であり、これは直径１００μｍ以上のスポットを分析するのに十分である。しかし、かかる定量は画素数によって、各画素の解像度によって、及び感度は一つの視点のみによって与えられるという事実によって制限される。一つの視点は三つの以下のパターンに依存する：ＣＣＤカメラの如き撮影要素の位置、検出されるべき対象の位置及び対象の照明の位置。
【００３６】
前記目的に応答すべく、本発明は固体支持体の規定された表面上の沈澱（好ましくは金属結晶を含む沈澱）の体積を定量するための方法（本発明の沈澱の検出及び／又は定量に使用されることが好ましいが、かかる沈澱に限られない）にも関する。固体支持体の前記規定された表面は１ｃｍ２当たり少なくとも４個、少なくとも１０個、少なくとも１６個、少なくとも２０個又はそれ以上の不連続領域のアレイによって規定されており、それぞれの不連続領域は沈澱を含むことができる。本発明によれば一以上の沈澱を含む前記規定された表面の像は異なる視野に対応し、前記像は予め決められたパターンに従って相互に対して空間的に配置された一つ又は複数の光源による照明に基づいて及び一つ又は複数のカメラによって撮影されたアナログ情報を含み；前記沈澱を含む前記規定された表面の対応する像アナログ情報はディジタル形態又は一組のディジタル形態へと変換され、第一及び第二の参照標準と比較されて定量されるべき沈澱の体積が決定される。
【００３７】
第一の参照標準は沈澱を有さない前記表面上で撮影された像中に含まれるアナログ情報から得られたディジタル形態又は一組のディジタル形態に相当する。
【００３８】
第二の参照標準は既知の体積の沈澱を含む前記表面上で撮影された像中に含まれるアナログ情報から得られたディジタル形態又は一組のディジタル形態に相当する。
【００３９】
用語「体積」は次元型情報を得ることが望まれている体積を意味するものと理解すべきである。本発明においては前記体積は化学又は生化学反応及びそれに続く標的化合物とその対応する化合物の間の結合から生ずる。従って、前記の得られた体積は前記化学又は生化学反応及びそれに続く標的化合物とその対応する捕獲化合物の間の結合の表現である。
【００４０】
用語「像」は前記体積の測定の例証である一群の画素であって直接伝送されてスクリーン又はプリンターの如きモニター上に位置決めされることができる一群の画素を意味するものと理解されるべきである。
【００４１】
本発明は前記方法を実行するための手段を含む装置にも関し、前記装置は予め決められたパターンに従って相互に対して空間的に配置されかつアナログ情報獲得システムと関連されている一つ及び／又は複数の光源及びカメラを備えられた一つ又は複数のセンサーを含むことが好ましく、情報は前記センサーを用いて測定され、そして処理装置によってディジタル形態へと変換される。
【００４２】
好ましくは変換はカメラのボード上の又はコンピュータ中の処理装置によって行われる。
【００４３】
カメラは白黒、赤外、カラー、特別な隣接範囲ＣＣＤ又はＣＭＯＳカメラ又は類似の撮影技術であることが好ましい。
【００４４】
光源は沈澱中に含まれている金属結晶の直径と同様の波長を有する赤外光であることが好ましく、それは有利には単一ダイオード又は同一のスペクトル分布を有する複数のダイオードを用いることによって作り出される。
【００４５】
光源は有利には固体支持体の周りに規則正しく間隔を置いて配置されており、前記光源の各々は光スポットに相当し、これは同時に又は連続的に自動的にスイッチオンされることができる。
【００４６】
像は透過によって、反射によって又はそれらの組合せによって得られることが好ましい。
【００４７】
添付の図面に図示される通り、本発明の装置及び方法は固体支持体の上方に配置された一つの光源及び一つのカメラの使用を含むことができ、前記カメラ及び前記光源は空間中を三次元で移動可能である。
【００４８】
前記装置及び方法は平面内で相対して配置されかつ固体支持体の上方に配置された二つ以上のカメラ及び固体支持体の下方に配置された一以上の光源の使用をも含むことができる。
【００４９】
前記装置及び方法は三角形平面又は他の規則正しい又は不規則なパターンに従って配置されかつ固体支持体の上方に配置された三つ以上のカメラ及び固体支持体の下方に配置された一以上の光源の使用をも含むことができる。
【００５０】
前記装置及び方法は固体支持体の上方に配置された一つのカメラ及び固体支持体の上方であって前記カメラの下方に配置された第一の光源及び固体支持体の下方に配置された第二の光源の使用を含むことができ、二つの光源は固体支持体の位置に従ってほぼ対称的に配置される。
【００５１】
本発明の代替の好ましい実施態様は組合せて又は連続的に本発明の方法に従って用いることができる一以上のカメラ及び一以上の光源の使用に基づいている。前記光源及び／又は前記カメラは撮影中固定して維持されることができるか又は特定体積の沈澱を含む固体支持体に沿った又は固体支持体の周りの好ましい並進又は回転に従って移動されることができる。
【００５２】
一以上の光源及び一以上のカメラを用いて特定体積の沈澱を含む固体支持体の移動を可能にすることもできる。
【００５３】
本発明によって用いることができる他の実施態様は（ｉ）一つのカメラ及び複数の光源（異なる光源は異なる対称的又は非対称的パターンに従って相互から配置されている）、又は（ii）一つの光源及び複数のカメラ（前記カメラは異なる対称的又は非対称的パターンに従って相互から配置されている）、又は（iii）それらの組合せを含む装置である。光源は沈澱中に含まれている結晶の直径と同様の波長を有する赤外光である。
【００５４】
当業者は本発明の様々なステップ、特に主要体積のディジタル形態又は一組のディジタル形態への変換を、ソフトウェア及びコンピュータ技術において存在する手段又は方法の如き既知の手段又は方法によって行うための手段を提供することもできる。
【００５５】
本発明はコンピュータプログラムプロダクト（ソフトウェア）にも関し、それは前記プログラムがコンピュータで実行される場合に本発明による方法のステップの全部又は一部を行うためのプログラムコード手段を含む。
【００５６】
本発明はプログラムがコンピュータで実行される場合に本発明による方法を行うためのコンピュータ読み取り可能な媒体に記憶されているプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムプロダクトに関する。
【００５７】
前記手段は前記検出及び／又は定量装置から得られた結果及び所望により前記読み取り装置によって得られた情報を収集することができ、及び前記手段は（所望により読み取り情報と相互に関連された）前記結果の分析から生じた特異的標的化合物の診断及び／又は定量を行うことができる。
【００５８】
このコンピュータプログラムプロダクトの前記手段はスポットとあり得る検出されたバックグラウンドノイズの間の区別を得ることができる。これは例えばトレーニングセットとして用いられる二つのクラスにマージされた後の像の均質部分を同定することによって行うことができる。この区別は分類後の文脈フィルタ（contextual filters）技術によって増大することができる。
【００５９】
前記手段はスポット自体の輪郭を同定することも可能であり、これはオリジナルの像と重ね合わせられてスポット中の同定されて計数された画素の強度レベルの測定を可能にする。
【００６０】
定量手段はスポット中に存在する全画素強度の統合又はスポットの均質部分の強度の全体レベルの記録を可能にする。
【００６１】
更に、これらの手段は各サンプルのスポットとコントロール又は参照標準（標準標的化合物）の間の統計的比較分析又は２以上のスポット（好ましくは固体支持体の記録された情報と相互に関連されている）の間の統計的比較分析を可能にする。像相関関係は他のテストと比較して一つのテストでは統計的に異なるスポットを区別するためにスポット像と前記標準標的化合物スポットの間で得ることができる。
【００６２】
検出装置及び読み取り装置によって記録されたシグナルは読み取られ、電子的に情報化されたデータとして処理され、前記の好適なコンピュータプログラムプロダクト（ソフトウェア）によって分析されることができる。
【００６３】
本発明の特定実施態様によれば、アレイは固定されたオリゴヌクレオチド捕獲ヌクレオチド配列を担持し、それによって同一固体支持体上での核酸配列の検出、増幅及び所望により定量を可能にする。実施の代替形態においてはアレイは固定されたＰＣＲプライマーを含み、それによってRasmussen等（Anal. Biochem., 198, pp. 138−205(1991)）によって記載されている方法に従って増幅物（amplicon）の生成及び表面上への増幅物の固定を行う。これはその後のそれらの検出を可能にする。
【００６４】
本発明によるアレイは精製、開裂、複製及び／又は遺伝子増幅の如き前処理を所望により行った後、診断キットにおいて、自動的撮影を可能にする診断及び／又は定量装置において用いられる。
【００６５】
好ましくは、本発明による検出及び／又は定量装置は自動核酸診断システムの如き統合されたシステム内に複数のステップ又はサブステップ（サンプル中の核酸配列の精製、増幅（既知の遺伝子増幅方法を介した）、診断及び所望により定量のステップ）を組み合わせたシステムである。
【００６６】
本発明の好ましい実施態様は以下の非限定的実施例において図面を参照して記述される。
【００６７】
図面の簡単な記述
図１はガラス上に共有結合的に固定され、かつ蛍光又は銀沈殿後のビオチン化された標的ＤＮＡの三つの濃度を検出するために用いられたＤＮＡ捕獲ヌクレオチド配列からなるアレイ上で得られた標的分子の検出を比較する。
【００６８】
図２〜７は本発明による検出及び／又は定量方法を行うための装置の様々な実施態様におけるいくつかの要素の空間配置を表す。
【００６９】
実施例１
バイオチップ上でのＤＮＡの検出
この実験においては、ラベリングされた標的ＤＮＡはアレイに結合された捕獲ヌクレオチド配列上での直接ハイブリダイゼーションによって検出される。捕獲ヌクレオチド配列はガラス上に共有結合的に結合され、直接ハイブリダイゼーションは相補的ビオチン化ＤＮＡを用いて行われた。陽性ハイブリダイゼーションはストレプトアビジンに結合されたナノ金粒子によって触媒される銀沈澱を用いて検出された。
【００７０】
ガラス上への捕獲ヌクレオチド配列の結合
アルデヒド基を担持する活性化されたガラスはＣＥＬ Associates（ＵＳＡ）から購入された。ＣＭＶ ＤＮＡ用の活性化捕獲ヌクレオチド配列はZammatteo等（Anal. Biochem., 253, pp. 180−189(1997)）によって記載されるように活性化されたプライマーを用いたＤＮＡのＰＣＲ増幅によって構築された。プライマーはEurogentec（Liege, Belgium）から購入された。増幅物の定量は２６０ｎｍでのそれらの吸収によって行われた。
【００７１】
ガラス上への移植のため、０．２μＭの活性化された増幅物を含有するＭＥＳ ０．１Ｍ ｐＨ６．５の溶液がまず１００℃で５分間加熱され、次に２５０μｍの直径のピンを用いてロボット（Genetix, UK）によってスポットされた。２０℃で１時間インキュベートされた後、それらは０．１％のＳＤＳ溶液で洗浄され、水で２回洗浄された。それらは次に２．５ｍｇ／ｍｌのＮａＢＨ４と共に５分間インキュベートされ、それから水で洗浄されて９５℃で３分間加熱された後、乾燥された。
【００７２】
標的分子のハイブリダイゼーション
標的分子は１ｍＭのビオチン化ｄＵＴＰの存在下でのＰＣＲ増幅によって得られた（Alexandre等，Biotechniques, 25, pp. 676−683(1998)）。ＣＭＶウィルスの配列を含むプラスミドがＰＣＲ用に用いられた。増幅後、ＰＣＲ生成物は高純度ＰＣＲ生成物の精製キット（Boehringer, Mannheim, Germany）を用いて精製され、２％アガロースゲル上での分離後、エチジウムブロマイド染色によって定量された。
【００７３】
ハイブリダイゼーション用に様々な濃度のビオチン化標的ＤＮＡ（０．６７，６．７及び６７ｆｍ／５μｌ）が２０μｇのサケＤＮＡを含むＳＳＣ ２Ｘ Denhard 溶液に添加された。この溶液の一滴（５μｌ）がアレイに添加され、湿潤雰囲気中で６５℃で２時間インキュベートされた。アレイは次にＮａＣｌ １５ｍＭ及びＴｗｅｅｎ ０．１％を含むマレイン酸緩衝液１０ｍＭ ｐＨ７．５で４回洗浄された。
【００７４】
銀沈殿後のアレイ上での銀沈澱
アレイはまず０．８ｍｌのストレプトアビジン−コロイド金（Sigma）（ＮａＣｌ １００ｍＭ及び０．１％の乾燥乳粉末を含むマレイン酸緩衝液１５０ｍＭ ｐＨ７．４中で１０００倍に希釈されたもの）と共に４５分間インキュベートされた。アレイは次に１５ｍＭのＮａＣｌ及びＴｗｅｅｎ ０．１％を含むマレイン酸緩衝液１０ｍＭ ｐＨ７．４中で２分間５回洗浄された。Ｓｉｇｍａからの「銀増強試薬（silver enhancement reagent）」（４０μｌ）がアレイに添加され、１０分後そして次は５分後に交換された。マレイン酸緩衝液中で洗浄した後、アレイは乾燥された。
【００７５】
アレイの検出及び分析
アレイはスキャニングされ、ディジタル化された像は形態認識ソフトウェアで処理されてスポットが範囲を定められて同定された。各スポットの画素のレベルは統合され、値が各スポットに与えられた。値は捕獲ヌクレオチド配列が固定されていない三つの場所で得られたバックグラウンドについて修正された。
【００７６】
実施例２
バイオチップ上でのタンパク質の検出
アレイ上への抗体の固定
アレイのガラスは表面上にアルデヒド基を得るため上述の通り活性化された。この実験において用いられた抗体は陽性コントロール用にはウシ血清アルブミンに対して生産された抗体であり、陰性コントロール用には非特異的ＩｇＧに対して生産された抗体であった。抗体（１０μｇ／ｍｌ ＰＢＳ溶液）は２５０μｍの直径のピンを用いてガラス上に直接スポットされた。抗体のアミノ基はガラス上に存在するアルデヒドと反応することができた。反応は室温で１時間行われた。ガラスはＰＢＳ緩衝液で洗浄された。
【００７７】
アレイ上でのＥＬＩＳＡによるウシ血清アルブミンの検出
０．１％のカゼインを含むＰＢＳ １ｍｌ当たり１０μｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液はアレイに添加され、３０分間インキュベートされた。アレイは次に０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで３回洗浄され、それから０．１％のカゼインを含むＰＢＳ １ｍｌ当たり２０μｇのビオチン化された抗ＢＳＡの溶液と共にインキュベートされた。インキュベーションは３０分間行われた。次に１μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−金複合体が０．１％のカゼインを含むＰＢＳ溶液中で３０分間インキュベートされた。金の存在は銀還元のためのセンターとして働いた。銀沈澱はＳｉｇｍａからの「銀増強試薬」を用いて行われ、溶液は１０分後にそして５分後に再び交換された。次にガラスはスキャンされ、データは上述の例で行ったのと同様に分析された。
【００７８】
実施例３
本発明による定量方法を行うための装置の好ましい実施態様は図２〜７に示されている。装置は固体支持体１、円形支持体４上に相互から規則正しく間隔を置かれているいくつかの光源２（前記円形支持体は前記固体支持体１の下方に配置されている）、及び二つのカメラ、３，３′（前記カメラは前記固体支持体１の上方に配置されており、平面内で相対して配置されている）を含む。
【００７９】
装置は固体支持体１、円形支持体４上に相互から規則正しく間隔を置かれているいくつかの光源２（前記円形支持体は前記固体支持体１の下方に配置されている）及び前記固体支持体１の上方に配置された一つのカメラ３を含んでもよい。
【００８０】
更に、装置は固体支持体１を含んでもよい。装置は第一の一組の光源２及び第二の一組の光源２をも含み、各組の光源２，２′は平面内で相互から規則正しく間隔を置かれており、好ましくは円形支持体４，４′上に配置されている。第一の一組の光源２は固体支持体１の上方に配置されており、第二の一組の光源２′は前記固体支持体１の下方に配置されており、前記第一及び第二の一組の光源２，２′は前記固体支持体１の位置に従って対称的に配置されている。装置はカメラ３をも含み、これは前記固体支持体１の上方であってかつ第一の一組の光源２の上方に配置されている。
【００８１】
更に、装置は固体支持体１、及び平面内で（好ましくは円形支持体４上で）相互から規則正しく間隔を置かれかつ固体支持体１の下方に配置されているいくつかの光源２（存在又は不在）を含んでもよい。装置は上方に配置されたカメラ３をも含む。前記円形支持体４及び前記カメラ３は固体支持体１の位置に従って対称的に配置されている。
【００８２】
最後に、装置は固体支持体１及び平面内で相互から規則正しく間隔を置かれたいくつかの光源２（好ましくは円形支持体４上にあり、前記円形支持体は前記固体支持体１の下方に配置されている）、及び三つのカメラ３，３′、３′′（前記カメラは前記固体支持体１の上方に配置されており、平面内で三角形配置に従って配置されている）を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ガラス上に共有結合的に固定され、かつ蛍光又は銀沈殿後のビオチン化された標的ＤＮＡの三つの濃度を検出するために用いられたＤＮＡ捕獲ヌクレオチド配列からなるアレイ上で得られた標的分子の検出を比較する。
【図２】 本発明による検出及び／又は定量を行うための装置の一実施態様におけるいくつかの要素の空間配置を表す。
【図３】 本発明による検出及び／又は定量を行うための装置の一実施態様におけるいくつかの要素の空間配置を表す。
【図４】 本発明による検出及び／又は定量を行うための装置の一実施態様におけるいくつかの要素の空間配置を表す。
【図５】 本発明による検出及び／又は定量を行うための装置の一実施態様におけるいくつかの要素の空間配置を表す。
【図６】 本発明による検出及び／又は定量を行うための装置の一実施態様におけるいくつかの要素の空間配置を表す。
【図７】 本発明による検出及び／又は定量を行うための装置の一実施態様におけるいくつかの要素の空間配置を表す。

Claims (8)

  1. 以下のステップを含むサンプルから得られた標的化合物の同定及び／又は定量方法：
    − 標的化合物を捕獲分子と接触させて前記標的化合物と捕獲分子の間の特異的結合を可能にさせ、ただし、前記捕獲分子は１ｃｍ２当たり少なくとも２０個の不連続領域の密度を含むアレイに従って固体支持体の表面上に固定されており、前記不連続領域の各々は一つの種類の捕獲分子で固定されている、
    − 結合された標的化合物に連結されているコロイド状金粒子の存在下での銀の化学的還元反応を行って、前記結合の場所で沈澱を形成させ、
    − 不連続領域における沈澱のあり得る存在を決定し、そして
    − 不連続領域における沈澱の存在を前記標的化合物の同定及び／又は定量と相互に関連させる。
  2. 標的化合物とその対応する捕獲分子の間の特異的結合が二つのヌクレオチド配列の間のハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 標的化合物とその対応する捕獲分子の間の結合が抗原構造とその対応する抗体又はその超可変性部位の間の反応であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  4. 標的化合物とその対応する捕獲分子の間の結合が受容体とその対応するリガンドの間の反応であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
  5. 沈澱のあり得る存在が前記沈澱上での光ビームの反射、吸収又は拡散によって得られることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
  6. サンプルから得られた一以上の同一の標的化合物の診断及び／又は定量装置であって、前記装置が以下のものを含む装置：
    − １ｃｍ２当たり少なくとも２０個の不連続領域の密度を含むアレイに従った固体支持体の表面上に固定されている捕獲分子、ただし、前記不連続領域の各々は一つの種類の捕獲分子で固定されている、
    − 前記標的化合物と前記捕獲分子の間の結合の場所で形成される沈澱を検出及び／又は定量する装置、及び
    − 以下のことをプログラムされたコンピュータ：
    −前記検出装置から得られた、特定の場所における沈澱の形成から生ずる結果を収集し、そして
    −前記標的化合物の診断及び／又は定量を行う。
  7. コンピュータプログラムがコンピュータで実行される場合に、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法に従って不連続領域における沈澱のあり得る存在を決定し、そして不連続領域における前記沈澱の存在を標的化合物の同定及び／又は定量と相互に関連させるステップを行うためのプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム。
  8. コンピュータプログラムがコンピュータで実行される場合に、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法に従って不連続領域における沈澱のあり得る存在を決定し、そして不連続領域における前記沈澱の存在を標的化合物の同定及び／又は定量と相互に関連させるステップを行うためのコンピュータ読み取り可能な媒体に記憶されているプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムプロダクト。
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