ES2185592T5 - Procedimiento para la identificacion y/o cuantificacion de un compuesto diana. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la identificación y/o cuantificación de un compuesto diana, obtenido a partir de una muestra preferentemente biológica, que comprende las etapas siguientes: poner en contacto el compuesto diana con una molécula de captura para que se pueda formar una ligadura específica entre dicho compuesto diana y una molécula de captura, que se ha fijado sobre una superficie de un soporte sólido según una red que comprende una densidad de por lo menos 20 regiones discretas por cm2, estando cada una de dichas regiones discretas unida a una especie de moléculas de captura; llevar a cabo una reacción que da lugar a la formación de un precipitado que se forma en la ubicación de dicha ligadura y se obtiene mediante la precipitación de un compuesto metálico sobre un compuesto diana ligado; determinar la posible formación y/o presencia de un(os) precipitado(s) o en una(s) región(es) discreta(s) y correlacionar la formación y/o presencia de dicho(s) precipitado(s) en la(s) región(es) discreta(s) con la identificación y/o cuantificación de dicho compuesto diana.
Description
Procedimiento para la identificación y/o
cuantificación de un compuesto diana.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la identificación y/o cuantificación de un
compuesto diana obtenido a partir de una muestra biológica por
medio de la ligadura a una molécula de captura fijada sobre
chips.
Asimismo, la presente invención se refiere a un
aparato de identificación y/o cuantificación basado en dicho
procedimiento y que permite la identificación y/o cuantificación de
ubicaciones positivas en los compuestos diana ligados que se han
fijado sobre dichos chips.
Los ensayos biológicos se basan principalmente
en la especificidad de interacción entre dos moléculas biológicas
tales como dos hebras de moléculas de ácido nucleico, un antígeno y
un anticuerpo, o un ligando y su receptor. El reto actual de los
ensayos biológicos consiste en realizar simultáneamente la detección
múltiple de las moléculas que se encuentran en una muestra. La
miniaturización y la formación de redes sobre la superficie de
"biochips" constituyen unas herramientas que permiten que
tengan lugar reacciones multiplex en formato microscópico, cuya
detección se realiza con un volumen limitado de muestra para el
apantallamiento y/o la identificación de múltiples compuestos diana
posibles. Dichas redes se componen de regiones discretas, que
contienen una determinada molécula de captura que se utiliza para
ligar el compuesto diana. Estas regiones discretas, que presentan
un tamaño de unos pocos micrómetros, permiten fijar varios miles de
moléculas de captura por cada cm^{2} de superficie (WO
95/11995).
Sin embargo, no resulta difícil detectar
compuestos diana ligados debido a que éstos se encuentran en
cantidades muy pequeñas como consecuencia de dicha miniaturización
(unos pocos fentomoles o incluso unos pocos altomoles). Debido a
ello, únicamente los procedimientos muy sensibles son apropiados
para dicha detección.
Se ha propuesto marcar un compuesto diana, como
el ADN, con moléculas fluorescentes después de su posible
amplificación genética. Si hay que detectar una molécula de ARN,
ésta se transforma primero en cADN, antes de su posible
amplificación. Si no fuese posible marcar directamente el compuesto
diana, entonces se puede optar por realizar una reacción doble
(reacción emparedada). Sin embargo, la cantidad de moléculas
fluorescentes es tan pequeña que se tendrían que desarrollar
escáneres de red específicos para la detección y/o cuantificación
del compuesto ligado que se ha fijado sobre los "chips de
hibridación". Dichos exploradores específicos muy costosos
comprenden un escáner láser para excitar las moléculas
fluorescentes, un diafragma de abertura muy pequeña para disminuir
el ruido de fondo fluorescente, y un fotomultiplicador para aumentar
la sensibilidad de la detección.
En los documentos US 5.821.060 y WO95/04 se
describen unos procedimientos alternativos de elevada sensibilidad,
que se basan en la detección por medio de unos dispositivos muy
costosos, como los espectrómetros de
masa.
masa.
Asimismo se han propuesto procedimientos
basados en la precipitación de determinados productos que se
obtienen a partir de un marcado colorimétrico
(documentos US 5.270.167, US 4.731.325,
EP-A-0.301.141), o como resultado de
una actividad enzimática (documentos
EP-A-0.393.868, WO 86/02.733,
EP-A-0063810), o mediante una
inmunodifusión e inmunoelectroforesis (documentos US 4.244.797;
US 4.244.803). Sin embargo, dichos procedimientos se caracterizan
por presentar una sensibilidad baja o por no ser apropiados para la
detección de compuestos diana fijados sobre "chips de
hibridación", debido a que la precipitación se produce a cierta
distancia de la ligadura por reacción y debido a que su ubicación no
puede correlacionarse fácilmente con un compuesto diana ligado en
particular. Además, la densidad del precipitado de dichas
reacciones enzimáticas no es suficientemente opaca como para poder
llevar a cabo la detección por medio de la absorción de luz.
Asimismo se ha propuesto mejorar la detección
fijando a un metal, antes de producirse la precipitación, un
producto soluble que se ha obtenido a partir de una reacción
enzimática. Sin embargo, dado que el resultado de dicha reacción
enzimática es un producto soluble, no se puede establecer ninguna
correlación entre la indicación del precipitado y la detección de
un determinado compuesto diana ligado.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención tiene como objetivo
proporcionar un nuevo procedimiento que, sin presentar los
inconvenientes del estado de la técnica actual, permita identificar
y/o cuantificar un compuesto diana o varios compuestos diana que se
encuentran (es posible que simultáneamente) en una muestra
biológica.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar dicho procedimiento que, además de ser sencillo y
económico, permite la detección de dichos compuestos diana mediante
el uso de moléculas de captura fijadas sobre unas redes que se
encuentran sobre la superficie de un soporte sólido.
Un último objetivo de la presente invención es
proporcionar asimismo un aparato sencillo y económico, basado en
dicho procedimiento y que mejora la identificación y/o
cuantificación de los compuestos diana ligados que se encuentran
sobre "chips de hibridación".
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la identificación y/o cuantificación de por lo
menos un compuesto diana, que se encuentra en una muestra
biológica, mediante su ligadura con una molécula de captura que se
ha fijado sobre la red de un soporte sólido (que se denominará en lo
que sigue "chips de hibridación"), resultando de dicha
ligadura del compuesto diana con la correspondiente molécula de
captura la formación de un precipitado metálico en la ubicación de
la molécula de captura.
Como se expone en la reivindicación 1, la
presente invención se refiere a un procedimiento para la
identificación y/o la cuantificación de un compuesto diana obtenido
a partir de una muestra, preferentemente una muestra biológica, que
comprende las etapas que consisten en:
- -
- poner en contacto el compuesto diana con una molécula de captura para que se pueda formar una ligadura entre dicho compuesto diana y la (correspondiente) molécula de captura, que se ha fijado sobre la superficie de un soporte sólido según una red que comprende una densidad de por lo menos 20 regiones discretas por cm^{2}, encontrándose cada una de dichas regiones discretas fijada a una sola especie de moléculas de captura;
- -
- llevar a cabo una reacción que da lugar a la formación de un precipitado formado en la ubicación de dicha ligadura y obtenido mediante el precipitado de un compuesto metálico sobre el compuesto diana ligado,
- -
- determinar la posible formación y/o presencia de precipitado(s) en la(s) región(es) discreta(s) utilizando preferentemente un escáner; y correlacionar la formación y/o la presencia de precipitado(s) en la(s) región(es) discreta(s) con la identificación y/o una cuantificación de dicho compuesto diana, con la condición de que como soporte sólido un disco compacto, en el que las moléculas de captura no divisibles sobre la superficie exterior del disco compacto son dirigidas mediante procedimientos físicos convencionales que utilizan técnicas microlitográficas y/o de micromecanización de incubación que mantendrán las moléculas de captura no divisibles en determinadas ubicaciones en las que éstas serán fijadas, sea excluido.
Preferentemente, dicho procedimiento comprende
además las etapas que consisten en:
- -
- correlacionar la presencia del precipitado o de los precipitado(s) metálico(s) en la(s) región(iones) discre-ta(s) (configuraciones de precipitado) con la identificación y/o cuantificación de dicho compuesto diana en la muestra biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
Los "chips de hibridación" según la
presente invención son un soporte sólido cualquiera que admite la
formación de redes de moléculas de captura (configuraciones
específicas) sobre una o más de una de sus superficies. Dicho
soporte sólido puede fabricarse con vidrios, rellenos, dispositivos
electrónicos, materiales poliméricos o metálicos, etc.
Preferentemente, dichas redes comprenden ubicaciones concretas
(distribuidas ventajosamente según una configuración concreta) que
contienen normalmente una sola especie de moléculas de captura.
La fijación de las hebras de ADN a las
proteínas, que después de ello se han adherido a determinados puntos
de ubicación concretos situados sobre el sustrato, se ha descrito
en el documento US-5.561.071. Como es bien
conocido, las sustancias de captura químicas pueden enlazarse con
microtubos que se ordenan espacialmente para formar una red, tal
como se describe en el documento GB-3.319.838, o
para obtener la síntesis directa de oligonucleótidos sobre
determinadas superficies mediante el uso de técnicas
fotolitográficas, como se describe en los documentos
EP-0.476.014, US-5.510.270,
US-5.445.934, WO97/29212,
US-5.605.662, US-5.632.957 y
WO94/22889.
Todos estos procedimientos para fijar moléculas
de captura sobre la superficie de un soporte sólido para obtener
las redes descritas anteriormente son compatibles con la presente
invención.
Los compuestos biológicos diana según la
invención pueden encontrarse en muestras biológicas (posiblemente
en no biológicas) como, por ejemplo, muestras clínicas extraídas de
sangre, orina, heces, saliva, pus, suero, soluciones de
fermentación de tejidos o medios de cultivo. Preferentemente, dichos
compuestos diana se aíslan, purifican, separan, copian y/o
amplifican, si es necesario, utilizando procedimientos bien
conocidos por cualquier experto en la materia antes de proceder a
su detección y/o cuantificación sobre los "chips de
hibridación".
Preferentemente, la producción de un precipitado
metálico en la ubicación de la ligadura se obtiene fijando un
compuesto metálico al compuesto diana ligado o bien como resultado
de la reducción de un metal en presencia de una enzima. La
reducción de plata en presencia de oro coloidal permite obtener de
forma ventajosa la producción de un precipitado a una distancia no
superior a unos pocos micrómetros del compuesto diana ligado a la
molécula de captura.
\newpage
Según la presente invención las ubicaciones en
la red presentan, una longitud inferior a 1.000 \mum.
Preferentemente, estas ubicaciones o puntos presentan un diámetro
comprendido entre 10 y 500 \mum y la distancia de separación
entre ellos es parecida, por lo que la red del soporte sólido
comprende entre 100 y 250.000 puntos en una superficie de
1 cm^{2}. Sin embargo, los puntos, en los que se fijan las moléculas de captura, pueden prepararse también de forma que presenten un tamaño inferior a 1 \mum o ser incluso más pequeños. La formación de dichos puntos o ubicaciones se consigue mediante procesos microelectrónicos o fotolitográficos bien conocidos y mediante el uso de dispositivos que permiten fijar dichas moléculas de captura en la superficie del soporte sólido mediante un enlace covalente o mediante una adsorción no covalente. La técnica del enlace covalente es la preferida debido a que permite controlar los lugares concretos en los que han de fijarse las moléculas de captura así como impedir los inconvenientes que pueden surgir con varias moléculas de captura (como ácidos nucleicos o anticuerpos) que pueden desorberse durante la etapa de incubación o lavado.
1 cm^{2}. Sin embargo, los puntos, en los que se fijan las moléculas de captura, pueden prepararse también de forma que presenten un tamaño inferior a 1 \mum o ser incluso más pequeños. La formación de dichos puntos o ubicaciones se consigue mediante procesos microelectrónicos o fotolitográficos bien conocidos y mediante el uso de dispositivos que permiten fijar dichas moléculas de captura en la superficie del soporte sólido mediante un enlace covalente o mediante una adsorción no covalente. La técnica del enlace covalente es la preferida debido a que permite controlar los lugares concretos en los que han de fijarse las moléculas de captura así como impedir los inconvenientes que pueden surgir con varias moléculas de captura (como ácidos nucleicos o anticuerpos) que pueden desorberse durante la etapa de incubación o lavado.
Una de las formas de realización preferidas de
la presente invención es la fijación de moléculas biológicas, tales
como secuencias de proteínas, péptidos, o ácido nucleico, mediante
la ligadura de grupos amino sobre un soporte de vidrio activado que
comprende una capa molecular aldehídica. La incorporación de un
grupo amino en la hebra de ácido nucleico se realiza fácilmente
utilizando nucleótidos aminados durante su síntesis. Los ácidos
amino aminados pueden fijarse en la superficie de un soporte sólido
que puede consistir, por ejemplo, en un soporte de vidrio con
grupos aldehídos como el descrito por Schena et al. (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 93, páginas 10.614-10.619
(1996)) o el que se describe en el documento
US-5.605.662 y en la publicación de Krensky et
al. (Nucleic Acids Research, 15, páginas
2891-2909 (1987)). La ligadura entre un grupo amino
y un grupo carboxil se consigue mediante la presencia de un agente
de acoplamiento como, por ejemplo, los compuestos carbodiimida
descritos por Joos et al. (Anal. Biochem, 247, páginas
96-101 (1997)). Asimismo, se pueden utilizar
oligonucleótidos modificados con tiol para obtener, en la presencia
de moléculas con enlaces cruzados, una reacción con grupos amino
sobre la superficie de un soporte sólido (Thrisey et al.,
Nucleic Acids Research, 24, páginas 3.031-3.039
(1996)). De forma similar, se pueden fijar también oligonucleótidos
a un gel, como poliacrilamida con grupos hidroxil y aldehído, como
se describe en los documentos US-5.552.270 y
WO98/28444.
La ligadura (o el reconocimiento) del compuesto
diana con las correspondientes moléculas de captura específicas es
una reacción no covalente espontánea cuando se lleva a cabo en
condiciones óptimas. En ella intervienen ligaduras químicas no
covalentes. La composición del medio así como otros factores físicos
y químicos influyen sobre la velocidad y la resistencia de la unión
entre las dos hebras complementarias. Por ejemplo, en el caso de un
reconocimiento de hebras de nucleótidos, una tirantez baja y unas
temperaturas elevadas implican una disminución de la velocidad y de
la resistencia de la unión entre las dos hebras complementarias. Sin
embargo, disminuyen también enormemente la ligadura no específica
entre dos hebras (que no son totalmente complementarias). Cuando
hay varias secuencias similares, se tiene la posibilidad de aumentar
la especificidad de la ligadura mediante la adición de una pequeña
cantidad de moléculas sin marcar, que si bien es cierto que
competirán con su secuencia complementaria, lo harán mucho más con
las otras, por lo que se reducirá el nivel de las reacciones
cruzadas.
Asimismo, la optimización de las condiciones de
ligadura es necesaria para el reconocimiento de
antigenes/anti-
cuerpos o ligandos/receptores, aunque generalmente suelen ser bastante específicas.
cuerpos o ligandos/receptores, aunque generalmente suelen ser bastante específicas.
Una forma de realización preferida de la
presente invención consiste en aprovechar la amplificación que se
produce con la reducción catalítica de Ag+ en el contacto con otro
material como oro. Actualmente se puede disponer de nanopartículas
de oro que pueden fijarse fácilmente a moléculas como proteínas. Por
ejemplo, se pueden encontrar en el mercado partículas de oro
recubiertas de estreptavidina.
Según una forma de realización preferida de la
presente invención, se utiliza una molécula diana marcada que se
reconoce a continuación por medio de un conjugado. Esta molécula
marcada (biotina, haptenos, ...) puede considerarse como el primer
miembro del par de ligadura. En el caso del ADN, el marcado se
realiza fácilmente mediante la incorporación de nucleótidos
biotinilados durante su amplificación. En el caso del ARN se
utilizan nucleótidos biotinilados para copiarlos en cADN o, después
de ello, cuando se detiene la amplificación. La amplificación de
secuencias de nucleótidos es una práctica común debido a que las
moléculas diana se encuentran frecuentemente en concentraciones muy
bajas. Las proteínas se marcan fácilmente utilizando biotina NHS u
otras reacciones. Una vez se han capturado las moléculas
biotiniladas, se añade un compuesto de estreptavidina y oro, que
constituye el segundo miembro del par de ligadura. Dado que la
estreptavidina reconoce específicamente la biotina, dicho compuesto
se fija en el lugar donde se ha fijado el blanco. Si el marcado se
realiza con haptenos, entonces se utiliza un compuesto de
anticuerpos y oro. A continuación, se agrega sobre la superficie
una mezcla reactiva, que contiene Ag^{+} y un agente reductor,
para que las capas de Ag se precipiten sobre las partículas de oro
y formen partículas de cristal.
Se pueden marcar directamente las moléculas
diana con oro utilizando para ello antigenes, o anticuerpos, o
nucleótidos marcados con oro.
Una alternativa es evitar el marcado de la
molécula diana y utilizar entonces una segunda secuencia de
nucleótidos marcados. Estos forman entonces una hibridación
emparedada o una reacción emparedada con la molécula de captura,
fijando el blanco y la secuencia de nucleótidos marcados, de modo
que se puede proseguir con la detección. Como en el caso anterior,
la secuencia de nucleótidos marcados es capaz de catalizar por sí
sola la precipitación del metal o bien llevarla a cabo mediante
un segundo compuesto.
La precipitación de Ag coincide con la ubicación
de la ligadura de la secuencia de nucleótidos biotinilados. Dado
que dicha ubicación se encuentra bien definida, es posible entonces
reconocer la presencia de dicho precipitado (punto concreto de la
red).
El precipitado consiste en unos cristales
diminutos que alcanzan con el transcurso del tiempo un diámetro de
aproximadamente 1 \mum. La formación de estos cristales diminutos
constituye realmente una amplificación de la señal dado que se
origina a partir de unas partículas de oro que presentan un diámetro
de unos pocos nm.
De forma inesperada, se pudo obtener, para
determinadas cantidades de secuencias de nucleótidos marcados que
se encontraban sobre la superficie, una curva de concentración que
representa la concentración de secuencias de nucleótidos marcados
con oro en función de la cantidad de precipitado encontrada sobre la
superficie. Una limitación de la red es que la señal de detección
debe correlacionarse con el punto en el que se origina dicha
señal.
Debido a su forma granulada, el precipitado
modifica de forma ventajosa la reflexión de la luz. Asimismo es la
causa de una difusión de luz importante (detectada por puntos) que
puede registrarse mediante medios de detección bien conocidos.
Dichos ensayos de difusión se realizan y registran típicamente
utilizando fotodiodos y considerando la luz reflejada de un haz de
luz. Una observación inesperada es que este ensayo era muy sensible
a la presencia de cristales de plata.
El hecho de que el precipitado de plata aparece
sobre una superficie negra hace que sea posible utilizar un escáner
(absorción de la luz a través de la superficie transparente de la
red). Debido a la presencia de precipitado insoluble se absorbe la
luz, absorción que se detecta y registra a continuación. La ventaja
del escáner es que sólo se detecta de una vez una pequeña parte de
la red, por lo que se obtiene una resolución mucho mejor. Se
focaliza el haz de iluminación o la superficie de detección y se
registra la señal de forma que se puede reconstruir la imagen de la
red. Los medios de detección (detector) pueden consistir en una
cámara CCD o CMOS que permite tomar medidas de toda la red. La
resolución de la detección depende entonces del número de píxels de
la cámara. Alternativamente, el detector puede consistir en una
serie de fotodiodos dispuestos a lo largo de una línea, en cuyo
caso se escanea la imagen realizando movimientos delante de dicha
línea. Se pueden construir escáneres con una sensibilidad de 11
\mum por píxel, sensibilidad que es suficiente para analizar
puntos con un diámetro de 50 \mum o más.
Se puede optar también por iluminar
completamente toda la red y combinar esta iluminación con el
registro de la luz transmitida (más rápido que cuando se utiliza un
escáner, pero menos sensible).
La plata, por ser un metal, refleja la luz por
sí misma. Incluso cuando la eficiencia de la reflexión es baja,
dicha reflexión siempre existe y puede utilizarse para localizar el
precipitado de plata (puntos). Debido a su naturaleza metálica, se
pueden utilizar asimismo otros procedimientos que se basan, por
ejemplo, en variaciones de un campo electromagnético o de la
conductividad eléctrica.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un aparato de diagnóstico y/o cuantificación de un compuesto
diana o de varios compuestos diana idénticos o distintos obtenidos a
partir de una muestra, comprendiendo dicho aparato:
- -
- las moléculas de captura que están fijadas sobre una superficie de un soporte sólido según una red que comprende una densidad de por lo menos 20 regiones discretas por cm^{2}, estando cada una de dichas regiones discretas fijada con una especie de molécula de captura,
- -
- un precipitado metálico formado en una ubicación de la ligadura entre dicho compuesto diana con dicha molécula de captura,
- -
- un dispositivo de detección y/o cuantificación de precipitados (puntos) que se encuentran sobre la superficie de un soporte sólido como consecuencia de la ligadura de un compuesto diana con la correspondiente molécula de captura descrita anteriormente;
- -
- posiblemente un dispositivo de lectura de información(es) registrada(s) sobre dicho soporte sólido, y
- -
- un ordenador programado para:
- -
- reconocer posiblemente las regiones discretas en las que se encuentran las moléculas de captura,
- -
- reunir los resultados (resultantes de la formación de un precipitado metálico en una ubicación específica) obtenidos a partir de dicho dispositivo de detección y posiblemente la(s) información(es) obteni-da(s) a partir de dicho dispositivo de lectura, y
- -
- realizar el diagnóstico y/o la cuantificación de dicho(s) compuesto(s) diana, con la condición de que como soporte sólido un disco compacto, en el que las moléculas de captura no divisibles sobre la superficie exterior del disco compacto son dirigidas mediante procedimientos físicos convencionales que utilizan técnicas microlitográficas y/o de micromecanización de incubación que mantendrán las moléculas de captura no divisibles en determinadas ubicaciones en las que serán fijadas, sea excluido.
Por consiguiente, la resolución de la detección
y, en particular, la fiabilidad de la cuantificación final obtenida
dependen en gran parte de las características del dispositivo de
detección. En particular, si el dispositivo de detección incluye
una cámara CCD, la fiabilidad depende del número de píxels de la
cámara. Así pues, el número de píxels limita la sensibilidad
permitida de la cuantificación. Con una cámara CCD se puede obtener
típicamente una resolución de 10 \mum por píxel, que es suficiente
para analizar puntos con un diámetro de 100 \mum o más. Sin
embargo, dicha cuantificación está limitada por el número de
píxels, la resolución de cada píxel, y el hecho de que la
sensibilidad sólo está determinada por un punto de vista. Un punto
de vista depende de las tres configuraciones siguientes: la posición
del elemento de lectura como la cámara CCD, la posición del objeto
a detectar, y la posición de la iluminación del objeto.
Para responder a dichos objetivos, la presente
invención se refiere asimismo a un procedimiento (dedicado a la
detección y/o cuantificación de un precipitado según la presente
invención, metálico) para la cuantificación del volumen de un
precipitado (metálico) que se encuentra sobre una superficie
definida de un soporte sólido, estando definida dicha superficie
de un soporte sólido por una red con por lo menos 4, por lo menos
10, por lo menos 16, por lo menos 20 o más regiones discretas por
cm^{2}, comprendiendo cada región discreta posiblemente un
precipitado. Según la presente invención, las imágenes de dicha
superficie definida, comprendiendo un precipitado o varios
precipitados, corresponden a distintas vistas, conteniendo dichas
imágenes informaciones analógicas que se registran por una cámara
o varias cámaras utilizando la iluminación proporcionada por una
fuente de iluminación o por varias fuentes de iluminación
dispuestas espacialmente según una configuración predeterminada, en
el que las correspondientes informaciones analógicas de imagen de
dicha superficie definida, que comprende dicho(s)
precipitado(s), se transforman y convierten en forma digital
o en un conjunto de formas digitales y se comparan con un primer y
un segundo patrón de referencia para determinar el volumen del
precipitado o de los precipitados por cuantificar.
El primer patrón de referencia corresponde a la
forma digital o al conjunto de formas digitales obtenidas a partir
de las informaciones analógicas contenidas en las imágenes tomadas
de dicha superficie en ausencia de precipitados metálicos.
El segundo patrón de referencia corresponde a la
forma digital o al conjunto de formas digitales obtenidas a partir
de las informaciones analógicas contenidas en las imágenes tomadas
de dicha superficie con precipitados metálicos de volumen
conocido.
Por el término "volumen" debe entenderse en
la presente invención el volumen con el que se desea obtener
información de tipo dimensional. Dicho volumen es el resultado de
una reacción química o bioquímica seguida de la formación de una
ligadura entre un compuesto diana y el compuesto que le corresponde.
Por consiguiente, dicho volumen obtenido es la manifestación de
dicha reacción química o bioquímica seguida de la formación de una
ligadura entre un compuesto diana y el correspondiente compuesto de
captura.
Por el término "imagen" debe entenderse un
grupo de píxels que constituye una ilustración de una medida de
dicho volumen y que puede transmitirse directamente a un monitor y
registrarse con dicho monitor, que puede consistir en una pantalla
o una impresora.
Asimismo, la presente invención se refiere a un
aparato que comprende medios para aplicar dicho procedimiento, y
que comprende preferentemente un sensor o varios sensores dotados
con cámaras y con una fuente de iluminación o varias fuentes de
iluminación que se han dispuesto espacialmente según una
configuración predeterminada y que se encuentran asociadas a un
sistema de adquisición de información analógico, información que se
mide utilizando dichos sensores y que se convierte en forma digital
mediante una unidad de tratamiento de datos.
Preferentemente, la transformación y conversión
se realiza mediante una unidad de tratamiento que se encuentra en
el cuadro de la cámara o en un ordenador.
Preferentemente, las cámaras son cámaras CCD o
CMOS monocromáticas, de infrarrojo, o de una determinada gama
adyacente, o en algún dispositivo de lectura de tecnología
similar.
Preferentemente, la fuente de iluminación es luz
infrarroja cuya longitud de onda es similar al tamaño de los
cristales metálicos contenidos en el precipitado(s) y que se
obtiene de forma ventajosa utilizando un único diodo o bien varios
diodos que presentan la misma distribución espectral.
Ventajosamente, las fuentes de iluminación se
disponen alrededor del soporte sólido manteniendo una distancia
constante entre ellas, de modo que corresponden a puntos de luz que
pueden encenderse automáticamente de forma simultánea o
sucesiva.
Preferentemente, las imágenes se obtienen bien
por transparencia, por reflexión o bien por una combinación de
ambas.
Como se ilustra en los dibujos adjuntos, el
aparato y el procedimiento pueden estar constituidos por el uso de
una cámara y una fuente de iluminación situadas por encima del
soporte sólido de modo que dicha cámara y dicha fuente de
iluminación pueden moverse en las tres dimensiones del espacio.
Asimismo, el aparato y el procedimiento pueden
estar constituidos por el uso de una cámara o de varias cámaras
dispuestas en un plano de forma que quedan enfrentadas y por encima
del soporte sólido, y el de una o más de una fuente de iluminación
situada por debajo del soporte sólido.
Asimismo, el aparato y el procedimiento pueden
comprender el uso de tres o más cámaras situadas por encima del
soporte sólido y dispuestas de modo que forman un plano triangular u
otra configuración regular o irregular, así como el uso de una o
más de una fuente de iluminación situada por debajo del soporte
sólido.
El aparato y el procedimiento pueden estar
constituidos por el uso de una cámara situada por encima del soporte
sólido, una primera fuente de iluminación situada por encima del
soporte sólido, pero por debajo de dicha cámara, y una segunda
fuente de iluminación situada por debajo del soporte sólido, de modo
que las dos fuentes de iluminación se encuentran en posiciones casi
simétricas con respecto a la posición del soporte sólido.
Otras formas de realización preferidas de la
presente invención se basan en el uso de una o más de una fuente de
iluminación y de una o más de una cámara, que pueden utilizarse
según el procedimiento de la presente invención ya sea de forma
combinada o bien de forma consecutiva, mientras que dicha(s)
fuente(s) de iluminación y/o dicha(s)
cámara(s) pueden mantenerse en una posición fija durante la lectura o pueden moverse, según un movimiento traslacional o rotacional preferido, a lo largo o alrededor de dicho soporte que comprende un volumen específico de un precipitado.
cámara(s) pueden mantenerse en una posición fija durante la lectura o pueden moverse, según un movimiento traslacional o rotacional preferido, a lo largo o alrededor de dicho soporte que comprende un volumen específico de un precipitado.
Utilizando una o más de una fuente de
iluminación y/o una o más de una cámara se puede disponer también el
soporte sólido, que comprende un volumen específico de precipitado,
de forma que éste sea movible.
Otras formas de realización que pueden
utilizarse según la presente invención son aparatos que comprenden
ya sea (i) una cámara y varias fuentes de iluminación dispuestas
según distintas configuraciones simétricas o no simétricas, o (ii)
una fuente de iluminación y varias cámaras dispuestas según
distintas configuraciones simétricas o no simétricas, o bien (iii)
una combinación de las dos. La(s) fuente(s) de
iluminación consiste(n) en luz infrarroja cuya longitud de
onda es similar al tamaño de los cristales contenidos en el
precipitado.
Asimismo, un experto en la materia podrá
proporcionar medios que permitan llevar a cabo las distintas etapas
de la presente invención y, en particular, la transformación y
conversión del volumen clave en una forma digital o un conjunto de
formas digitales utilizando medios o procedimientos bien conocidos
como los que se encuentran en las tecnologías de informática y
software.
Dichos medios permiten reunir los resultados
obtenidos con dicho dispositivo de detección y/o cuantificación y
posiblemente también la información obtenida con dicho dispositivo
de lectura, y dichos medios permiten realizar diagnósticos y/o
cuantificaciones de un determinado compuesto diana a partir del
análisis de dichos resultados posiblemente correlacionados con la
información leída.
Dichos medios correspondientes al producto de
programa de ordenador permiten realizar una discriminación entre
los puntos y el ruido de fondo que se pueda detectar. Esto puede
realizarse por ejemplo mediante la identificación de partes
homogéneas de una imagen a continuación de haber fusionado dos
clases utilizadas como conjuntos de formación. Esta discriminación
puede realzarse mediante técnicas de filtraje contextual de
postclasificación.
Asimismo, dichos medios permiten identificar el
propio contorno del punto que se superpondrá a la imagen original y
permitirá así la medida del nivel de intensidad de los píxels
contados e identificados en el punto.
Los medios de cuantificación permiten integrar
toda la intensidad de los píxels que se encuentran en el punto o
registrar el nivel de intensidad global de las partes homogéneas del
punto.
Además, dichos medios permiten realizar un
análisis estadístico comparativo entre los puntos de cada muestra y
un patrón de control o de referencia (compuesto diana patrón) o
entre dos o más puntos (preferentemente incluyendo una correlación
con la información del soporte sólido que se ha registrado). Se
podría obtener una correlación de imagen entre la imagen del punto
y la imagen del punto de dicho compuesto diana patrón para
discriminar los puntos que son estadísticamente distintos al
comparar un ensayo con otro.
La(s) señal(es)
registrada(s) mediante el dispositivo de detección y el
dispositivo de lectura pueden leerse, procesarse como datos
informatizados electrónicamente, y analizarse mediante dicho
producto informático apropiado (software).
Según una forma de realización particular de la
presente invención, la red soporta secuencias fijadas de nucleótidos
de captura de oligonucleótidos para poder realizar una detección,
amplificación, y posiblemente una cuantificación de las secuencias
de ácido nucleico que se encuentran sobre el mismo soporte sólido.
En una forma de realización alternativa, la red comprende
imprimaciones de PCR fijado para la producción de amplificaciones y
conseguir la fijación de dichas amplificaciones sobre la superficie
según el procedimiento descrito por Rasmussen et al. (Anal.
Biochem., 198, páginas 138-205 (1991)), mediante las
cuales se puede realizar a continuación su detección.
\newpage
La red según la presente invención se utiliza en
un aparato de diagnóstico y/o cuantificación que permite realizar
lecturas automáticas posiblemente después de un tratamiento previo
que consiste, por ejemplo, en una purificación, disociación, copia
y/o amplificación genética.
Preferentemente, el aparato de detección y/o
cuantificación según la presente invención consiste en un sistema
que combina múltiples etapas o subetapas en un sistema integrado
como, por ejemplo, un sistema automático de diagnóstico de ácido
nucleico (las etapas de purificación de las secuencias de ácido
nucleico en una muestra, de amplificación (mediante procedimientos
de amplificación genética bien conocidos), de diagnóstico y
posiblemente de cuantificación).
Las formas de realización preferidas de la
presente invención se describirán a continuación mediante ejemplos
no limitativos haciendo referencia a las figuras adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 compara la detección de moléculas
diana obtenidas sobre redes compuestas de secuencias de nucleótidos
de captura de ADN que se han fijado sobre vidrio y utilizado para
detectar 3 concentraciones de moléculas diana de ADN biotinilado
bien en fluorescencia o bien después de las concentraciones de
plata.
Las figuras 2 a 7 ilustran la disposición
espacial de algunos elementos en distintas formas de realización
del aparato previsto para aplicar el procedimiento de detección y/o
cuantificación según la presente invención.
En este experimento el ADN diana marcado se
detecta mediante la hibridación directa sobre secuencias de
nucleótidos de captura que se han fijado a la red. Las secuencias
de nucleótidos de captura se han fijado sobre vidrio por medio de
enlaces covalentes y la hibridación directa se ha realizado con ADN
complementario biotinilado. La hibridación positiva se detectó con
el precipitado de plata catalizado mediante partículas de oro
nanométricas ligadas a estreptavidina.
Se adquirieron soportes de vidrio dotados con
grupos de aldehídos de la empresa CEL Associates (USA). Las
secuencias aminatadas de nucleótidos de captura para ADN CMV se
construyeron por medio de la amplificación del PCR de ADN
utilizando imprimaciones aminatadas, tal como se describe en el
artículo de Zammatteo et al. (Anal. Biochem. 253, páginas
180-189 (1997)). Las imprimaciones de PCR se
adquirieron de la empresa Eurogentec (Liège, Bélgica). La
amplificación de los amplicones se realizó por medio de su absorción
a 260 nm.
Para formar la red sobre el vidrio, se calentó
primero una solución de amplicones aminatados a 0,2 \mum, con MES
0 1 M y pH 6,5, a una temperatura de 100ºC durante 5 min. y, a
continuación, se utilizaron agujas con un diámetro de 250 \mum
(Genetix, UK) para formar los distintos puntos con la ayuda de un
robot. Tras incubarlos durante 1 h a 20ºC, se procedió a lavarlos
con una solución de SDS al 0,1% y luego dos veces con agua. A
continuación, se incubaron durante 5 min. con una solución de 2,5
mg/ml de NaBH_{4}, y a continuación se procedió a lavarlos y a
calentarlos durante 3 min. a 95ºC, antes de secarlos.
La molécula diana se obtuvo por amplificación
mediante PCR en presencia de dUTP biotinilado a 1mM (Alexandre
et al., Biotechniques, 25, páginas 676-683
(1998)). Para el PCR se utilizaron plásmicos que contenían
secuencias de virus CMV. Tras la amplificación, se purificaron los
productos de PCR utilizando un equipo de purificación de productos
PCR muy puros (Boehringer, Mannheim, Alemania) y, a continuación, se
cuantificaron tiñéndolos con bromuro de etidio tras su separación
sobre un gel de agarosa al 2%.
Para la hibridación se añadieron varias
concentraciones de 0,67, 6,7 y 67 fm en 5 \mul de ADN diana
biotinilado a una solución de Denhard de SSC 2X que contenía 20
\mug de ADN de salmón. Se agregó una gota de esta solución (5
\mul) sobre la red y se procedió a incubar la red durante 2 h, a
65ºC, en una atmósfera húmeda. A continuación, se procedió a lavar
cuatro veces la red con una solución tampón de ácido maleico de 10
mM y pH 7,5 que contenía
15 mM de NaCl y 0,1% de Tween.
15 mM de NaCl y 0,1% de Tween.
Se incubó primero la red durante 45 min con 0,8
ml de un compuesto de oro coloidal y estreptavidina (Sigma) que se
había diluido 1.000 veces en una solución tampón de ácido maleico de
150 mM y pH 7,4 que contenía 100 mM de NaCl y 0,1% de polvo de
leche seco. A continuación, se lavaron las redes 5 veces durante 2
min en la solución tampón de ácido maleico de 10 mM y pH 7,4 que
contenía 15 mM de NaCl y 0,1% de Tween. Tras unos 10 min., y luego
tras otros 5 min., se agregó sobre la red un "reactivo
intensificador de plata" (40 \mul) de la empresa Sigma. A
continuación, después de lavar la red en la solución tampón de ácido
maleico, se procedió a secar la red.
Se escaneó la red y se trató la imagen
digitalizada con un software de reconocimiento de formas para
delimitar e identificar los puntos. Se integró el nivel de píxels
de cada punto y se dio un valor determinado a cada punto. Se
corrigieron dichos valores con el fondo que se detectó en tres
sitios distintos en los que no se habían fijado secuencias de
nucleótidos de captura.
Se activó el vidrio de la red según la
descripción presentada anteriormente para obtener grupos de
aldehídos sobre la superficie. Los anticuerpos utilizados en este
experimento se cultivaron contra albúmina de suero bovino para
controles positivos e IgG no específico para controles negativos.
Utilizando agujas de 250 \mum de diámetro, se procedió a formar
directamente sobre el vidrio los puntos con anticuerpos diluidos en
una solución de PBS a una concentración de 10 \mug/ml. Los grupos
amino de los anticuerpos podían reaccionar con los aldehídos que se
encontraban sobre el vidrio. La reacción se desarrolló durante 1 h
a temperatura ambiente. Se lavaron los vidrios con una solución
tampón de PBS.
Se agregó sobre la red una solución de 10
\mug/ml de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS, que contenía
0,1% de caseína, y se incubó la red durante 30 min. A continuación,
se procedió a lavar 3 veces la red 3 con PBS, que contenía 0,1% de
Tween 20, y a continuación se incubó la red con una solución de 20
\mug/ml de anti-BSA biotinilada en PBS, que
contenía 0,1% de caseina. La incubación se realizó durante 30 min. A
continuación, se incubó durante 30 min. un compuesto de oro y
estreptavidina diluido a una concentración de 1 \mug/ml en una
solución de PBS que contenía 0,1% de caseína. La presencia de oro
servía para controlar la reducción de la plata. La precipitación de
plata se produjo utilizando un "reactivo intensificador de
plata" de la empresa Sigma y efectuando un cambio de solución
tras unos 10 min. y luego otro tras otros 5 min. A continuación, se
escanearon los vidrios y se analizaron los datos del mismo modo que
en el ejemplo descrito anteriormente.
Las formas de realización preferidas del aparato
que aplica el procedimiento de cuantificación según la presente
invención vienen ilustradas en las figuras 2 hasta 7. El aparato
está constituido por un soporte sólido 1, varias fuentes de
iluminación 2 dispuestas a intervalos regulares sobre un soporte
circular 4, que se encuentra por debajo de dicho soporte sólido 1,
y dos cámaras, 3 y 3', que se han dispuesto por encima de dicho
soporte sólido 1 de tal forma que se encuentran enfrentadas entre
sí en un plano.
Asimismo, el aparato puede estar constituido por
un soporte sólido 1, varias fuentes de iluminación 2 dispuestas a
intervalos regulares sobre un soporte circular 4, que se encuentra
por debajo de dicho soporte sólido 1, y una cámara 3 que se ha
dispuesto por encima de dicho soporte sólido 1.
Asimismo, en otra forma de realización el
aparato puede estar constituido por un soporte sólido 1. Asimismo,
el aparato está constituido por un primer conjunto de fuentes de
iluminación 2 y un segundo conjunto de fuentes de iluminación 2.
Las fuentes de iluminación de cada uno de los conjuntos, 2 ó 2', se
han dispuesto a intervalos regulares sobre un plano formado
preferentemente por un soporte circular, 4 ó 4'. El primer conjunto
de fuentes de iluminación 2 se ha previsto por encima del soporte
sólido 1, mientras que el segundo conjunto de fuentes de
iluminación 2' se ha previsto por debajo de dicho soporte sólido 1,
de modo que dicho primer y segundo conjunto de fuentes de
iluminación, 2 y 2', se encuentran en posiciones simétricas con
respecto a la posición de dicho soporte sólido 1. Asimismo, el
aparato comprende una cámara 3 que se ha previsto por encima de
dicho soporte sólido 1 y por encima del primer conjunto de fuentes
de iluminación 2.
Asimismo, en otra forma de realización, el
aparato puede estar constituido por un soporte sólido 1 con o sin
varias fuentes de iluminación 2 dispuestas a intervalos regulares en
un plano formado preferentemente por un soporte circular 4, que se
encuentra por debajo de dicho soporte sólido 1. Asimismo, el aparato
incluye una cámara 3 en la parte superior. Dicho soporte circular 4
y dicha cámara 3 se han previsto simétricamente con respecto a la
posición del soporte sólido 1.
Finalmente, el aparato puede incorporar
asimismo un soporte sólido 1 con varias fuentes de iluminación 2
dispuestas a intervalos regulares en un plano formado
preferentemente por un soporte circular 4, que se encuentra por
debajo de dicho soporte sólido 1, y tres cámaras, 3, 3' y 3'',
previstas por encima de dicho soporte sólido 1 según una
distribución triangular en un plano.
Claims (13)
1. Procedimiento para la identificación y/o
cuantificación de un compuesto diana, obtenido a partir de una
muestra preferentemente biológica, que comprende las etapas
siguientes:
- -
- poner en contacto el compuesto diana con una molécula de captura para que se pueda formar una ligadura específica entre dicho compuesto diana y una molécula de captura, que se ha fijado sobre una superficie de un soporte sólido según una red que comprende una densidad de por lo menos 20 regiones discretas por cm^{2}, estando cada una de dichas regiones discretas unida a una especie de moléculas de captura;
- -
- llevar a cabo una reacción que da lugar a la formación de un precipitado que se forma en la ubicación de dicha ligadura y se obtiene mediante la precipitación de un compuesto metálico sobre un compuesto diana ligado;
- -
- determinar la posible formación y/o presencia de un(os) precipitado(s) o en una(s) región(es) discreta(s) y correlacionar la formación y/o presencia de dicho(s) precipitado(s) en la(s) región(es) discreta(s) con la identificación y/o cuantificación de dicho compuesto diana, con la condición de que como soporte sólido un disco compacto, en el que las moléculas de captura no divisibles sobre la superficie exterior del disco compacto son dirigidas mediante procedimientos físicos convencionales que utilizan técnicas microlitográficas y/o de micromecanización de incubación que mantendrán las moléculas de captura no divisibles en determinadas ubicaciones en las que son fijadas, sea excluido.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicho compuesto metálico es un compuesto
metálico magnético.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque la reacción que da lugar a la formación
del precipitado es una reducción de un metal en presencia de una
enzima.
4. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque la reacción que da lugar a la formación
del precipitado es una reducción química de plata en presencia de
partículas de oro coloidal unidas al compuesto diana ligado.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la ligadura
específica entre el compuesto diana y su correspondiente molécula
de captura es una hibridación entre dos secuencias de
nucleótidos.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la ligadura
entre el compuesto diana y su correspondiente molécula de captura
es una reacción entre una estructura antigénica y su anticuerpo
correspondiente o una parte hipervariable del mismo.
7. Pocedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la ligadura
entre el compuesto diana y su correspondiente molécula de captura
es una reacción entre un receptor y el ligando correspondiente.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la posible
presencia de un precipitado se determina a partir de la reflexión,
absorción o difusión de un haz de luz, preferentemente un haz láser
al incidir sobre dicho precipitado.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
presencia de un precipitado en una región discreta se determina a
partir de la variación de un campo electromagnético o la
conductancia de una corriente eléctrica.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, para la cuantificación del volumen de un
precipitado o varios precipitados que se han formado sobre una
superficie definida del soporte sólido, caracterizado porque
las imágenes de dicha superficie definida, que contienen un o más de
un precipitado, corresponden a distintas vistas y porque dichas
imágenes, que contienen información analógica, se han tomado
mediante una o más de una cámara bajo la iluminación proporcionada
por una fuente de iluminación o por varias fuentes de iluminación
dispuestas espacialmente según una configuración predeterminada, y
caracterizado porque la correspondiente información
analógica de las imágenes de dicha superficie definida, que contiene
dicho(s) precipitado(s), se transforma y convierte en
forma digital o en un conjunto de formas digitales y se compara con
un primer y un segundo patrón de referencia para determinar el
volumen del precipitado o de los precipitados a cuantificar.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque el primer patrón de referencia
corresponde a una forma digital o a un conjunto de formas digitales
obtenido a partir de la información analógica contenida en las
imágenes tomadas de la superficie de dicho soporte sólido (1) cuando
ésta no contenía ningún precipitado.
\newpage
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque el segundo patrón de referencia
corresponde a una forma digital o a un conjunto de formas digitales
obtenido a partir de las informaciones analógicas contenidas en las
imágenes tomadas de la superficie de dicho soporte sólido (1) cuando
ésta contenía un precipitado o varios precipitados de volumen
conocido.
13. Aparato de diagnóstico y/o cuantificación de
un o más de un compuesto diana idéntico que se ha obtenido a partir
de una muestra que comprende:
- -
- moléculas de captura que se han fijado sobre la superficie de un soporte sólido según una red que comprende una densidad de por lo menos 20 regiones discretas por cm^{2} encontrándose cada una de dichas regiones discretas unida a una especie de moléculas de captura,
- -
- un precipitado metálico formado en una ubicación de la ligadura entre dicho compuesto diana con dicha molécula de captura,
- -
- un dispositivo de detección y/o cuantificación de un precipitado metálico que se ha formado en la ubicación de la ligadura entre dicho compuesto diana y dicha molécula de captura,
- -
- posiblemente un dispositivo de lectura de información(es) registrada(s) sobre dicho soporte sólido, y
- -
- un ordenador programado para:
- -
- reconocer posiblemente las regiones discreta sobre las que se encuentran moléculas de captura,
- -
- reunir los resultados (que proceden de la información de un precipitado metálico en una ubicación concreta) obtenidos mediante dicho dispositivo de detección y posiblemente la(s) información(es) obtenida(s) mediante dicho dispositivo de lectura, y
- -
- efectuar el diagnóstico y/o la cuantificación de dicho(s) compuesto(s) diana, con la condición de que como soporte sólido un disco compacto, en el que la moléculas de captura no divisibles sobre la superficie exterior del disco compacto son dirigidas mediante procedimientos físicos convencionales que utilizan técnicas microlitográficas y/o de micromecanización de incubación que mantendrán las moléculas de captura no divisibles en determinadas ubicaciones en las que serán fijadas, sea excluido.
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