ES2185592T5 - Procedimiento para la identificacion y/o cuantificacion de un compuesto diana. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para la identificación y/o cuantificación de un compuesto diana, obtenido a partir de una muestra preferentemente biológica, que comprende las etapas siguientes: poner en contacto el compuesto diana con una molécula de captura para que se pueda formar una ligadura específica entre dicho compuesto diana y una molécula de captura, que se ha fijado sobre una superficie de un soporte sólido según una red que comprende una densidad de por lo menos 20 regiones discretas por cm2, estando cada una de dichas regiones discretas unida a una especie de moléculas de captura; llevar a cabo una reacción que da lugar a la formación de un precipitado que se forma en la ubicación de dicha ligadura y se obtiene mediante la precipitación de un compuesto metálico sobre un compuesto diana ligado; determinar la posible formación y/o presencia de un(os) precipitado(s) o en una(s) región(es) discreta(s) y correlacionar la formación y/o presencia de dicho(s) precipitado(s) en la(s) región(es) discreta(s) con la identificación y/o cuantificación de dicho compuesto diana.

Description

Procedimiento para la identificación y/o cuantificación de un compuesto diana.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para la identificación y/o cuantificación de un compuesto diana obtenido a partir de una muestra biológica por medio de la ligadura a una molécula de captura fijada sobre chips.
Asimismo, la presente invención se refiere a un aparato de identificación y/o cuantificación basado en dicho procedimiento y que permite la identificación y/o cuantificación de ubicaciones positivas en los compuestos diana ligados que se han fijado sobre dichos chips.
Antecedentes de la invención y estado de la técnica
Los ensayos biológicos se basan principalmente en la especificidad de interacción entre dos moléculas biológicas tales como dos hebras de moléculas de ácido nucleico, un antígeno y un anticuerpo, o un ligando y su receptor. El reto actual de los ensayos biológicos consiste en realizar simultáneamente la detección múltiple de las moléculas que se encuentran en una muestra. La miniaturización y la formación de redes sobre la superficie de "biochips" constituyen unas herramientas que permiten que tengan lugar reacciones multiplex en formato microscópico, cuya detección se realiza con un volumen limitado de muestra para el apantallamiento y/o la identificación de múltiples compuestos diana posibles. Dichas redes se componen de regiones discretas, que contienen una determinada molécula de captura que se utiliza para ligar el compuesto diana. Estas regiones discretas, que presentan un tamaño de unos pocos micrómetros, permiten fijar varios miles de moléculas de captura por cada cm^{2} de superficie (WO 95/11995).
Sin embargo, no resulta difícil detectar compuestos diana ligados debido a que éstos se encuentran en cantidades muy pequeñas como consecuencia de dicha miniaturización (unos pocos fentomoles o incluso unos pocos altomoles). Debido a ello, únicamente los procedimientos muy sensibles son apropiados para dicha detección.
Se ha propuesto marcar un compuesto diana, como el ADN, con moléculas fluorescentes después de su posible amplificación genética. Si hay que detectar una molécula de ARN, ésta se transforma primero en cADN, antes de su posible amplificación. Si no fuese posible marcar directamente el compuesto diana, entonces se puede optar por realizar una reacción doble (reacción emparedada). Sin embargo, la cantidad de moléculas fluorescentes es tan pequeña que se tendrían que desarrollar escáneres de red específicos para la detección y/o cuantificación del compuesto ligado que se ha fijado sobre los "chips de hibridación". Dichos exploradores específicos muy costosos comprenden un escáner láser para excitar las moléculas fluorescentes, un diafragma de abertura muy pequeña para disminuir el ruido de fondo fluorescente, y un fotomultiplicador para aumentar la sensibilidad de la detección.
En los documentos US 5.821.060 y WO95/04 se describen unos procedimientos alternativos de elevada sensibilidad, que se basan en la detección por medio de unos dispositivos muy costosos, como los espectrómetros de
masa.
Asimismo se han propuesto procedimientos basados en la precipitación de determinados productos que se obtienen a partir de un marcado colorimétrico (documentos US 5.270.167, US 4.731.325, EP-A-0.301.141), o como resultado de una actividad enzimática (documentos EP-A-0.393.868, WO 86/02.733, EP-A-0063810), o mediante una inmunodifusión e inmunoelectroforesis (documentos US 4.244.797; US 4.244.803). Sin embargo, dichos procedimientos se caracterizan por presentar una sensibilidad baja o por no ser apropiados para la detección de compuestos diana fijados sobre "chips de hibridación", debido a que la precipitación se produce a cierta distancia de la ligadura por reacción y debido a que su ubicación no puede correlacionarse fácilmente con un compuesto diana ligado en particular. Además, la densidad del precipitado de dichas reacciones enzimáticas no es suficientemente opaca como para poder llevar a cabo la detección por medio de la absorción de luz.
Asimismo se ha propuesto mejorar la detección fijando a un metal, antes de producirse la precipitación, un producto soluble que se ha obtenido a partir de una reacción enzimática. Sin embargo, dado que el resultado de dicha reacción enzimática es un producto soluble, no se puede establecer ninguna correlación entre la indicación del precipitado y la detección de un determinado compuesto diana ligado.
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Objetivos de la invención
La presente invención tiene como objetivo proporcionar un nuevo procedimiento que, sin presentar los inconvenientes del estado de la técnica actual, permita identificar y/o cuantificar un compuesto diana o varios compuestos diana que se encuentran (es posible que simultáneamente) en una muestra biológica.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar dicho procedimiento que, además de ser sencillo y económico, permite la detección de dichos compuestos diana mediante el uso de moléculas de captura fijadas sobre unas redes que se encuentran sobre la superficie de un soporte sólido.
Un último objetivo de la presente invención es proporcionar asimismo un aparato sencillo y económico, basado en dicho procedimiento y que mejora la identificación y/o cuantificación de los compuestos diana ligados que se encuentran sobre "chips de hibridación".
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para la identificación y/o cuantificación de por lo menos un compuesto diana, que se encuentra en una muestra biológica, mediante su ligadura con una molécula de captura que se ha fijado sobre la red de un soporte sólido (que se denominará en lo que sigue "chips de hibridación"), resultando de dicha ligadura del compuesto diana con la correspondiente molécula de captura la formación de un precipitado metálico en la ubicación de la molécula de captura.
Como se expone en la reivindicación 1, la presente invención se refiere a un procedimiento para la identificación y/o la cuantificación de un compuesto diana obtenido a partir de una muestra, preferentemente una muestra biológica, que comprende las etapas que consisten en:
-
poner en contacto el compuesto diana con una molécula de captura para que se pueda formar una ligadura entre dicho compuesto diana y la (correspondiente) molécula de captura, que se ha fijado sobre la superficie de un soporte sólido según una red que comprende una densidad de por lo menos 20 regiones discretas por cm^{2}, encontrándose cada una de dichas regiones discretas fijada a una sola especie de moléculas de captura;
-
llevar a cabo una reacción que da lugar a la formación de un precipitado formado en la ubicación de dicha ligadura y obtenido mediante el precipitado de un compuesto metálico sobre el compuesto diana ligado,
-
determinar la posible formación y/o presencia de precipitado(s) en la(s) región(es) discreta(s) utilizando preferentemente un escáner; y correlacionar la formación y/o la presencia de precipitado(s) en la(s) región(es) discreta(s) con la identificación y/o una cuantificación de dicho compuesto diana, con la condición de que como soporte sólido un disco compacto, en el que las moléculas de captura no divisibles sobre la superficie exterior del disco compacto son dirigidas mediante procedimientos físicos convencionales que utilizan técnicas microlitográficas y/o de micromecanización de incubación que mantendrán las moléculas de captura no divisibles en determinadas ubicaciones en las que éstas serán fijadas, sea excluido.
Preferentemente, dicho procedimiento comprende además las etapas que consisten en:
-
correlacionar la presencia del precipitado o de los precipitado(s) metálico(s) en la(s) región(iones) discre-ta(s) (configuraciones de precipitado) con la identificación y/o cuantificación de dicho compuesto diana en la muestra biológica.
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Los "chips de hibridación" según la presente invención son un soporte sólido cualquiera que admite la formación de redes de moléculas de captura (configuraciones específicas) sobre una o más de una de sus superficies. Dicho soporte sólido puede fabricarse con vidrios, rellenos, dispositivos electrónicos, materiales poliméricos o metálicos, etc. Preferentemente, dichas redes comprenden ubicaciones concretas (distribuidas ventajosamente según una configuración concreta) que contienen normalmente una sola especie de moléculas de captura.
La fijación de las hebras de ADN a las proteínas, que después de ello se han adherido a determinados puntos de ubicación concretos situados sobre el sustrato, se ha descrito en el documento US-5.561.071. Como es bien conocido, las sustancias de captura químicas pueden enlazarse con microtubos que se ordenan espacialmente para formar una red, tal como se describe en el documento GB-3.319.838, o para obtener la síntesis directa de oligonucleótidos sobre determinadas superficies mediante el uso de técnicas fotolitográficas, como se describe en los documentos EP-0.476.014, US-5.510.270, US-5.445.934, WO97/29212, US-5.605.662, US-5.632.957 y WO94/22889.
Todos estos procedimientos para fijar moléculas de captura sobre la superficie de un soporte sólido para obtener las redes descritas anteriormente son compatibles con la presente invención.
Los compuestos biológicos diana según la invención pueden encontrarse en muestras biológicas (posiblemente en no biológicas) como, por ejemplo, muestras clínicas extraídas de sangre, orina, heces, saliva, pus, suero, soluciones de fermentación de tejidos o medios de cultivo. Preferentemente, dichos compuestos diana se aíslan, purifican, separan, copian y/o amplifican, si es necesario, utilizando procedimientos bien conocidos por cualquier experto en la materia antes de proceder a su detección y/o cuantificación sobre los "chips de hibridación".
Preferentemente, la producción de un precipitado metálico en la ubicación de la ligadura se obtiene fijando un compuesto metálico al compuesto diana ligado o bien como resultado de la reducción de un metal en presencia de una enzima. La reducción de plata en presencia de oro coloidal permite obtener de forma ventajosa la producción de un precipitado a una distancia no superior a unos pocos micrómetros del compuesto diana ligado a la molécula de captura.
\newpage
Según la presente invención las ubicaciones en la red presentan, una longitud inferior a 1.000 \mum. Preferentemente, estas ubicaciones o puntos presentan un diámetro comprendido entre 10 y 500 \mum y la distancia de separación entre ellos es parecida, por lo que la red del soporte sólido comprende entre 100 y 250.000 puntos en una superficie de
1 cm^{2}. Sin embargo, los puntos, en los que se fijan las moléculas de captura, pueden prepararse también de forma que presenten un tamaño inferior a 1 \mum o ser incluso más pequeños. La formación de dichos puntos o ubicaciones se consigue mediante procesos microelectrónicos o fotolitográficos bien conocidos y mediante el uso de dispositivos que permiten fijar dichas moléculas de captura en la superficie del soporte sólido mediante un enlace covalente o mediante una adsorción no covalente. La técnica del enlace covalente es la preferida debido a que permite controlar los lugares concretos en los que han de fijarse las moléculas de captura así como impedir los inconvenientes que pueden surgir con varias moléculas de captura (como ácidos nucleicos o anticuerpos) que pueden desorberse durante la etapa de incubación o lavado.
Una de las formas de realización preferidas de la presente invención es la fijación de moléculas biológicas, tales como secuencias de proteínas, péptidos, o ácido nucleico, mediante la ligadura de grupos amino sobre un soporte de vidrio activado que comprende una capa molecular aldehídica. La incorporación de un grupo amino en la hebra de ácido nucleico se realiza fácilmente utilizando nucleótidos aminados durante su síntesis. Los ácidos amino aminados pueden fijarse en la superficie de un soporte sólido que puede consistir, por ejemplo, en un soporte de vidrio con grupos aldehídos como el descrito por Schena et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, páginas 10.614-10.619 (1996)) o el que se describe en el documento US-5.605.662 y en la publicación de Krensky et al. (Nucleic Acids Research, 15, páginas 2891-2909 (1987)). La ligadura entre un grupo amino y un grupo carboxil se consigue mediante la presencia de un agente de acoplamiento como, por ejemplo, los compuestos carbodiimida descritos por Joos et al. (Anal. Biochem, 247, páginas 96-101 (1997)). Asimismo, se pueden utilizar oligonucleótidos modificados con tiol para obtener, en la presencia de moléculas con enlaces cruzados, una reacción con grupos amino sobre la superficie de un soporte sólido (Thrisey et al., Nucleic Acids Research, 24, páginas 3.031-3.039 (1996)). De forma similar, se pueden fijar también oligonucleótidos a un gel, como poliacrilamida con grupos hidroxil y aldehído, como se describe en los documentos US-5.552.270 y WO98/28444.
La ligadura (o el reconocimiento) del compuesto diana con las correspondientes moléculas de captura específicas es una reacción no covalente espontánea cuando se lleva a cabo en condiciones óptimas. En ella intervienen ligaduras químicas no covalentes. La composición del medio así como otros factores físicos y químicos influyen sobre la velocidad y la resistencia de la unión entre las dos hebras complementarias. Por ejemplo, en el caso de un reconocimiento de hebras de nucleótidos, una tirantez baja y unas temperaturas elevadas implican una disminución de la velocidad y de la resistencia de la unión entre las dos hebras complementarias. Sin embargo, disminuyen también enormemente la ligadura no específica entre dos hebras (que no son totalmente complementarias). Cuando hay varias secuencias similares, se tiene la posibilidad de aumentar la especificidad de la ligadura mediante la adición de una pequeña cantidad de moléculas sin marcar, que si bien es cierto que competirán con su secuencia complementaria, lo harán mucho más con las otras, por lo que se reducirá el nivel de las reacciones cruzadas.
Asimismo, la optimización de las condiciones de ligadura es necesaria para el reconocimiento de antigenes/anti-
cuerpos o ligandos/receptores, aunque generalmente suelen ser bastante específicas.
Una forma de realización preferida de la presente invención consiste en aprovechar la amplificación que se produce con la reducción catalítica de Ag+ en el contacto con otro material como oro. Actualmente se puede disponer de nanopartículas de oro que pueden fijarse fácilmente a moléculas como proteínas. Por ejemplo, se pueden encontrar en el mercado partículas de oro recubiertas de estreptavidina.
Según una forma de realización preferida de la presente invención, se utiliza una molécula diana marcada que se reconoce a continuación por medio de un conjugado. Esta molécula marcada (biotina, haptenos, ...) puede considerarse como el primer miembro del par de ligadura. En el caso del ADN, el marcado se realiza fácilmente mediante la incorporación de nucleótidos biotinilados durante su amplificación. En el caso del ARN se utilizan nucleótidos biotinilados para copiarlos en cADN o, después de ello, cuando se detiene la amplificación. La amplificación de secuencias de nucleótidos es una práctica común debido a que las moléculas diana se encuentran frecuentemente en concentraciones muy bajas. Las proteínas se marcan fácilmente utilizando biotina NHS u otras reacciones. Una vez se han capturado las moléculas biotiniladas, se añade un compuesto de estreptavidina y oro, que constituye el segundo miembro del par de ligadura. Dado que la estreptavidina reconoce específicamente la biotina, dicho compuesto se fija en el lugar donde se ha fijado el blanco. Si el marcado se realiza con haptenos, entonces se utiliza un compuesto de anticuerpos y oro. A continuación, se agrega sobre la superficie una mezcla reactiva, que contiene Ag^{+} y un agente reductor, para que las capas de Ag se precipiten sobre las partículas de oro y formen partículas de cristal.
Se pueden marcar directamente las moléculas diana con oro utilizando para ello antigenes, o anticuerpos, o nucleótidos marcados con oro.
Una alternativa es evitar el marcado de la molécula diana y utilizar entonces una segunda secuencia de nucleótidos marcados. Estos forman entonces una hibridación emparedada o una reacción emparedada con la molécula de captura, fijando el blanco y la secuencia de nucleótidos marcados, de modo que se puede proseguir con la detección. Como en el caso anterior, la secuencia de nucleótidos marcados es capaz de catalizar por sí sola la precipitación del metal o bien llevarla a cabo mediante un segundo compuesto.
La precipitación de Ag coincide con la ubicación de la ligadura de la secuencia de nucleótidos biotinilados. Dado que dicha ubicación se encuentra bien definida, es posible entonces reconocer la presencia de dicho precipitado (punto concreto de la red).
El precipitado consiste en unos cristales diminutos que alcanzan con el transcurso del tiempo un diámetro de aproximadamente 1 \mum. La formación de estos cristales diminutos constituye realmente una amplificación de la señal dado que se origina a partir de unas partículas de oro que presentan un diámetro de unos pocos nm.
De forma inesperada, se pudo obtener, para determinadas cantidades de secuencias de nucleótidos marcados que se encontraban sobre la superficie, una curva de concentración que representa la concentración de secuencias de nucleótidos marcados con oro en función de la cantidad de precipitado encontrada sobre la superficie. Una limitación de la red es que la señal de detección debe correlacionarse con el punto en el que se origina dicha señal.
Debido a su forma granulada, el precipitado modifica de forma ventajosa la reflexión de la luz. Asimismo es la causa de una difusión de luz importante (detectada por puntos) que puede registrarse mediante medios de detección bien conocidos. Dichos ensayos de difusión se realizan y registran típicamente utilizando fotodiodos y considerando la luz reflejada de un haz de luz. Una observación inesperada es que este ensayo era muy sensible a la presencia de cristales de plata.
El hecho de que el precipitado de plata aparece sobre una superficie negra hace que sea posible utilizar un escáner (absorción de la luz a través de la superficie transparente de la red). Debido a la presencia de precipitado insoluble se absorbe la luz, absorción que se detecta y registra a continuación. La ventaja del escáner es que sólo se detecta de una vez una pequeña parte de la red, por lo que se obtiene una resolución mucho mejor. Se focaliza el haz de iluminación o la superficie de detección y se registra la señal de forma que se puede reconstruir la imagen de la red. Los medios de detección (detector) pueden consistir en una cámara CCD o CMOS que permite tomar medidas de toda la red. La resolución de la detección depende entonces del número de píxels de la cámara. Alternativamente, el detector puede consistir en una serie de fotodiodos dispuestos a lo largo de una línea, en cuyo caso se escanea la imagen realizando movimientos delante de dicha línea. Se pueden construir escáneres con una sensibilidad de 11 \mum por píxel, sensibilidad que es suficiente para analizar puntos con un diámetro de 50 \mum o más.
Se puede optar también por iluminar completamente toda la red y combinar esta iluminación con el registro de la luz transmitida (más rápido que cuando se utiliza un escáner, pero menos sensible).
La plata, por ser un metal, refleja la luz por sí misma. Incluso cuando la eficiencia de la reflexión es baja, dicha reflexión siempre existe y puede utilizarse para localizar el precipitado de plata (puntos). Debido a su naturaleza metálica, se pueden utilizar asimismo otros procedimientos que se basan, por ejemplo, en variaciones de un campo electromagnético o de la conductividad eléctrica.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un aparato de diagnóstico y/o cuantificación de un compuesto diana o de varios compuestos diana idénticos o distintos obtenidos a partir de una muestra, comprendiendo dicho aparato:
-
las moléculas de captura que están fijadas sobre una superficie de un soporte sólido según una red que comprende una densidad de por lo menos 20 regiones discretas por cm^{2}, estando cada una de dichas regiones discretas fijada con una especie de molécula de captura,
-
un precipitado metálico formado en una ubicación de la ligadura entre dicho compuesto diana con dicha molécula de captura,
-
un dispositivo de detección y/o cuantificación de precipitados (puntos) que se encuentran sobre la superficie de un soporte sólido como consecuencia de la ligadura de un compuesto diana con la correspondiente molécula de captura descrita anteriormente;
-
posiblemente un dispositivo de lectura de información(es) registrada(s) sobre dicho soporte sólido, y
-
un ordenador programado para:
-
reconocer posiblemente las regiones discretas en las que se encuentran las moléculas de captura,
-
reunir los resultados (resultantes de la formación de un precipitado metálico en una ubicación específica) obtenidos a partir de dicho dispositivo de detección y posiblemente la(s) información(es) obteni-da(s) a partir de dicho dispositivo de lectura, y
-
realizar el diagnóstico y/o la cuantificación de dicho(s) compuesto(s) diana, con la condición de que como soporte sólido un disco compacto, en el que las moléculas de captura no divisibles sobre la superficie exterior del disco compacto son dirigidas mediante procedimientos físicos convencionales que utilizan técnicas microlitográficas y/o de micromecanización de incubación que mantendrán las moléculas de captura no divisibles en determinadas ubicaciones en las que serán fijadas, sea excluido.
Por consiguiente, la resolución de la detección y, en particular, la fiabilidad de la cuantificación final obtenida dependen en gran parte de las características del dispositivo de detección. En particular, si el dispositivo de detección incluye una cámara CCD, la fiabilidad depende del número de píxels de la cámara. Así pues, el número de píxels limita la sensibilidad permitida de la cuantificación. Con una cámara CCD se puede obtener típicamente una resolución de 10 \mum por píxel, que es suficiente para analizar puntos con un diámetro de 100 \mum o más. Sin embargo, dicha cuantificación está limitada por el número de píxels, la resolución de cada píxel, y el hecho de que la sensibilidad sólo está determinada por un punto de vista. Un punto de vista depende de las tres configuraciones siguientes: la posición del elemento de lectura como la cámara CCD, la posición del objeto a detectar, y la posición de la iluminación del objeto.
Para responder a dichos objetivos, la presente invención se refiere asimismo a un procedimiento (dedicado a la detección y/o cuantificación de un precipitado según la presente invención, metálico) para la cuantificación del volumen de un precipitado (metálico) que se encuentra sobre una superficie definida de un soporte sólido, estando definida dicha superficie de un soporte sólido por una red con por lo menos 4, por lo menos 10, por lo menos 16, por lo menos 20 o más regiones discretas por cm^{2}, comprendiendo cada región discreta posiblemente un precipitado. Según la presente invención, las imágenes de dicha superficie definida, comprendiendo un precipitado o varios precipitados, corresponden a distintas vistas, conteniendo dichas imágenes informaciones analógicas que se registran por una cámara o varias cámaras utilizando la iluminación proporcionada por una fuente de iluminación o por varias fuentes de iluminación dispuestas espacialmente según una configuración predeterminada, en el que las correspondientes informaciones analógicas de imagen de dicha superficie definida, que comprende dicho(s) precipitado(s), se transforman y convierten en forma digital o en un conjunto de formas digitales y se comparan con un primer y un segundo patrón de referencia para determinar el volumen del precipitado o de los precipitados por cuantificar.
El primer patrón de referencia corresponde a la forma digital o al conjunto de formas digitales obtenidas a partir de las informaciones analógicas contenidas en las imágenes tomadas de dicha superficie en ausencia de precipitados metálicos.
El segundo patrón de referencia corresponde a la forma digital o al conjunto de formas digitales obtenidas a partir de las informaciones analógicas contenidas en las imágenes tomadas de dicha superficie con precipitados metálicos de volumen conocido.
Por el término "volumen" debe entenderse en la presente invención el volumen con el que se desea obtener información de tipo dimensional. Dicho volumen es el resultado de una reacción química o bioquímica seguida de la formación de una ligadura entre un compuesto diana y el compuesto que le corresponde. Por consiguiente, dicho volumen obtenido es la manifestación de dicha reacción química o bioquímica seguida de la formación de una ligadura entre un compuesto diana y el correspondiente compuesto de captura.
Por el término "imagen" debe entenderse un grupo de píxels que constituye una ilustración de una medida de dicho volumen y que puede transmitirse directamente a un monitor y registrarse con dicho monitor, que puede consistir en una pantalla o una impresora.
Asimismo, la presente invención se refiere a un aparato que comprende medios para aplicar dicho procedimiento, y que comprende preferentemente un sensor o varios sensores dotados con cámaras y con una fuente de iluminación o varias fuentes de iluminación que se han dispuesto espacialmente según una configuración predeterminada y que se encuentran asociadas a un sistema de adquisición de información analógico, información que se mide utilizando dichos sensores y que se convierte en forma digital mediante una unidad de tratamiento de datos.
Preferentemente, la transformación y conversión se realiza mediante una unidad de tratamiento que se encuentra en el cuadro de la cámara o en un ordenador.
Preferentemente, las cámaras son cámaras CCD o CMOS monocromáticas, de infrarrojo, o de una determinada gama adyacente, o en algún dispositivo de lectura de tecnología similar.
Preferentemente, la fuente de iluminación es luz infrarroja cuya longitud de onda es similar al tamaño de los cristales metálicos contenidos en el precipitado(s) y que se obtiene de forma ventajosa utilizando un único diodo o bien varios diodos que presentan la misma distribución espectral.
Ventajosamente, las fuentes de iluminación se disponen alrededor del soporte sólido manteniendo una distancia constante entre ellas, de modo que corresponden a puntos de luz que pueden encenderse automáticamente de forma simultánea o sucesiva.
Preferentemente, las imágenes se obtienen bien por transparencia, por reflexión o bien por una combinación de ambas.
Como se ilustra en los dibujos adjuntos, el aparato y el procedimiento pueden estar constituidos por el uso de una cámara y una fuente de iluminación situadas por encima del soporte sólido de modo que dicha cámara y dicha fuente de iluminación pueden moverse en las tres dimensiones del espacio.
Asimismo, el aparato y el procedimiento pueden estar constituidos por el uso de una cámara o de varias cámaras dispuestas en un plano de forma que quedan enfrentadas y por encima del soporte sólido, y el de una o más de una fuente de iluminación situada por debajo del soporte sólido.
Asimismo, el aparato y el procedimiento pueden comprender el uso de tres o más cámaras situadas por encima del soporte sólido y dispuestas de modo que forman un plano triangular u otra configuración regular o irregular, así como el uso de una o más de una fuente de iluminación situada por debajo del soporte sólido.
El aparato y el procedimiento pueden estar constituidos por el uso de una cámara situada por encima del soporte sólido, una primera fuente de iluminación situada por encima del soporte sólido, pero por debajo de dicha cámara, y una segunda fuente de iluminación situada por debajo del soporte sólido, de modo que las dos fuentes de iluminación se encuentran en posiciones casi simétricas con respecto a la posición del soporte sólido.
Otras formas de realización preferidas de la presente invención se basan en el uso de una o más de una fuente de iluminación y de una o más de una cámara, que pueden utilizarse según el procedimiento de la presente invención ya sea de forma combinada o bien de forma consecutiva, mientras que dicha(s) fuente(s) de iluminación y/o dicha(s)
cámara(s) pueden mantenerse en una posición fija durante la lectura o pueden moverse, según un movimiento traslacional o rotacional preferido, a lo largo o alrededor de dicho soporte que comprende un volumen específico de un precipitado.
Utilizando una o más de una fuente de iluminación y/o una o más de una cámara se puede disponer también el soporte sólido, que comprende un volumen específico de precipitado, de forma que éste sea movible.
Otras formas de realización que pueden utilizarse según la presente invención son aparatos que comprenden ya sea (i) una cámara y varias fuentes de iluminación dispuestas según distintas configuraciones simétricas o no simétricas, o (ii) una fuente de iluminación y varias cámaras dispuestas según distintas configuraciones simétricas o no simétricas, o bien (iii) una combinación de las dos. La(s) fuente(s) de iluminación consiste(n) en luz infrarroja cuya longitud de onda es similar al tamaño de los cristales contenidos en el precipitado.
Asimismo, un experto en la materia podrá proporcionar medios que permitan llevar a cabo las distintas etapas de la presente invención y, en particular, la transformación y conversión del volumen clave en una forma digital o un conjunto de formas digitales utilizando medios o procedimientos bien conocidos como los que se encuentran en las tecnologías de informática y software.
Dichos medios permiten reunir los resultados obtenidos con dicho dispositivo de detección y/o cuantificación y posiblemente también la información obtenida con dicho dispositivo de lectura, y dichos medios permiten realizar diagnósticos y/o cuantificaciones de un determinado compuesto diana a partir del análisis de dichos resultados posiblemente correlacionados con la información leída.
Dichos medios correspondientes al producto de programa de ordenador permiten realizar una discriminación entre los puntos y el ruido de fondo que se pueda detectar. Esto puede realizarse por ejemplo mediante la identificación de partes homogéneas de una imagen a continuación de haber fusionado dos clases utilizadas como conjuntos de formación. Esta discriminación puede realzarse mediante técnicas de filtraje contextual de postclasificación.
Asimismo, dichos medios permiten identificar el propio contorno del punto que se superpondrá a la imagen original y permitirá así la medida del nivel de intensidad de los píxels contados e identificados en el punto.
Los medios de cuantificación permiten integrar toda la intensidad de los píxels que se encuentran en el punto o registrar el nivel de intensidad global de las partes homogéneas del punto.
Además, dichos medios permiten realizar un análisis estadístico comparativo entre los puntos de cada muestra y un patrón de control o de referencia (compuesto diana patrón) o entre dos o más puntos (preferentemente incluyendo una correlación con la información del soporte sólido que se ha registrado). Se podría obtener una correlación de imagen entre la imagen del punto y la imagen del punto de dicho compuesto diana patrón para discriminar los puntos que son estadísticamente distintos al comparar un ensayo con otro.
La(s) señal(es) registrada(s) mediante el dispositivo de detección y el dispositivo de lectura pueden leerse, procesarse como datos informatizados electrónicamente, y analizarse mediante dicho producto informático apropiado (software).
Según una forma de realización particular de la presente invención, la red soporta secuencias fijadas de nucleótidos de captura de oligonucleótidos para poder realizar una detección, amplificación, y posiblemente una cuantificación de las secuencias de ácido nucleico que se encuentran sobre el mismo soporte sólido. En una forma de realización alternativa, la red comprende imprimaciones de PCR fijado para la producción de amplificaciones y conseguir la fijación de dichas amplificaciones sobre la superficie según el procedimiento descrito por Rasmussen et al. (Anal. Biochem., 198, páginas 138-205 (1991)), mediante las cuales se puede realizar a continuación su detección.
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La red según la presente invención se utiliza en un aparato de diagnóstico y/o cuantificación que permite realizar lecturas automáticas posiblemente después de un tratamiento previo que consiste, por ejemplo, en una purificación, disociación, copia y/o amplificación genética.
Preferentemente, el aparato de detección y/o cuantificación según la presente invención consiste en un sistema que combina múltiples etapas o subetapas en un sistema integrado como, por ejemplo, un sistema automático de diagnóstico de ácido nucleico (las etapas de purificación de las secuencias de ácido nucleico en una muestra, de amplificación (mediante procedimientos de amplificación genética bien conocidos), de diagnóstico y posiblemente de cuantificación).
Las formas de realización preferidas de la presente invención se describirán a continuación mediante ejemplos no limitativos haciendo referencia a las figuras adjuntas.
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Breve descripción de los dibujos
La figura 1 compara la detección de moléculas diana obtenidas sobre redes compuestas de secuencias de nucleótidos de captura de ADN que se han fijado sobre vidrio y utilizado para detectar 3 concentraciones de moléculas diana de ADN biotinilado bien en fluorescencia o bien después de las concentraciones de plata.
Las figuras 2 a 7 ilustran la disposición espacial de algunos elementos en distintas formas de realización del aparato previsto para aplicar el procedimiento de detección y/o cuantificación según la presente invención.
Ejemplo 1 Detección de ADN sobre biochips
En este experimento el ADN diana marcado se detecta mediante la hibridación directa sobre secuencias de nucleótidos de captura que se han fijado a la red. Las secuencias de nucleótidos de captura se han fijado sobre vidrio por medio de enlaces covalentes y la hibridación directa se ha realizado con ADN complementario biotinilado. La hibridación positiva se detectó con el precipitado de plata catalizado mediante partículas de oro nanométricas ligadas a estreptavidina.
Ligadura de secuencias de nucleótidos de captura sobre vidrio
Se adquirieron soportes de vidrio dotados con grupos de aldehídos de la empresa CEL Associates (USA). Las secuencias aminatadas de nucleótidos de captura para ADN CMV se construyeron por medio de la amplificación del PCR de ADN utilizando imprimaciones aminatadas, tal como se describe en el artículo de Zammatteo et al. (Anal. Biochem. 253, páginas 180-189 (1997)). Las imprimaciones de PCR se adquirieron de la empresa Eurogentec (Liège, Bélgica). La amplificación de los amplicones se realizó por medio de su absorción a 260 nm.
Para formar la red sobre el vidrio, se calentó primero una solución de amplicones aminatados a 0,2 \mum, con MES 0 1 M y pH 6,5, a una temperatura de 100ºC durante 5 min. y, a continuación, se utilizaron agujas con un diámetro de 250 \mum (Genetix, UK) para formar los distintos puntos con la ayuda de un robot. Tras incubarlos durante 1 h a 20ºC, se procedió a lavarlos con una solución de SDS al 0,1% y luego dos veces con agua. A continuación, se incubaron durante 5 min. con una solución de 2,5 mg/ml de NaBH_{4}, y a continuación se procedió a lavarlos y a calentarlos durante 3 min. a 95ºC, antes de secarlos.
Hibridación de la molécula diana
La molécula diana se obtuvo por amplificación mediante PCR en presencia de dUTP biotinilado a 1mM (Alexandre et al., Biotechniques, 25, páginas 676-683 (1998)). Para el PCR se utilizaron plásmicos que contenían secuencias de virus CMV. Tras la amplificación, se purificaron los productos de PCR utilizando un equipo de purificación de productos PCR muy puros (Boehringer, Mannheim, Alemania) y, a continuación, se cuantificaron tiñéndolos con bromuro de etidio tras su separación sobre un gel de agarosa al 2%.
Para la hibridación se añadieron varias concentraciones de 0,67, 6,7 y 67 fm en 5 \mul de ADN diana biotinilado a una solución de Denhard de SSC 2X que contenía 20 \mug de ADN de salmón. Se agregó una gota de esta solución (5 \mul) sobre la red y se procedió a incubar la red durante 2 h, a 65ºC, en una atmósfera húmeda. A continuación, se procedió a lavar cuatro veces la red con una solución tampón de ácido maleico de 10 mM y pH 7,5 que contenía
15 mM de NaCl y 0,1% de Tween.
Precipitación de plata sobre una red tras la precipitación de plata
Se incubó primero la red durante 45 min con 0,8 ml de un compuesto de oro coloidal y estreptavidina (Sigma) que se había diluido 1.000 veces en una solución tampón de ácido maleico de 150 mM y pH 7,4 que contenía 100 mM de NaCl y 0,1% de polvo de leche seco. A continuación, se lavaron las redes 5 veces durante 2 min en la solución tampón de ácido maleico de 10 mM y pH 7,4 que contenía 15 mM de NaCl y 0,1% de Tween. Tras unos 10 min., y luego tras otros 5 min., se agregó sobre la red un "reactivo intensificador de plata" (40 \mul) de la empresa Sigma. A continuación, después de lavar la red en la solución tampón de ácido maleico, se procedió a secar la red.
Detección y análisis de la red
Se escaneó la red y se trató la imagen digitalizada con un software de reconocimiento de formas para delimitar e identificar los puntos. Se integró el nivel de píxels de cada punto y se dio un valor determinado a cada punto. Se corrigieron dichos valores con el fondo que se detectó en tres sitios distintos en los que no se habían fijado secuencias de nucleótidos de captura.
Ejemplo 2 Detección de proteínas sobre biochips Fijación de anticuerpos sobre la red
Se activó el vidrio de la red según la descripción presentada anteriormente para obtener grupos de aldehídos sobre la superficie. Los anticuerpos utilizados en este experimento se cultivaron contra albúmina de suero bovino para controles positivos e IgG no específico para controles negativos. Utilizando agujas de 250 \mum de diámetro, se procedió a formar directamente sobre el vidrio los puntos con anticuerpos diluidos en una solución de PBS a una concentración de 10 \mug/ml. Los grupos amino de los anticuerpos podían reaccionar con los aldehídos que se encontraban sobre el vidrio. La reacción se desarrolló durante 1 h a temperatura ambiente. Se lavaron los vidrios con una solución tampón de PBS.
Detección mediante ELISA de albúmina de suero bovino sobre la red
Se agregó sobre la red una solución de 10 \mug/ml de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS, que contenía 0,1% de caseína, y se incubó la red durante 30 min. A continuación, se procedió a lavar 3 veces la red 3 con PBS, que contenía 0,1% de Tween 20, y a continuación se incubó la red con una solución de 20 \mug/ml de anti-BSA biotinilada en PBS, que contenía 0,1% de caseina. La incubación se realizó durante 30 min. A continuación, se incubó durante 30 min. un compuesto de oro y estreptavidina diluido a una concentración de 1 \mug/ml en una solución de PBS que contenía 0,1% de caseína. La presencia de oro servía para controlar la reducción de la plata. La precipitación de plata se produjo utilizando un "reactivo intensificador de plata" de la empresa Sigma y efectuando un cambio de solución tras unos 10 min. y luego otro tras otros 5 min. A continuación, se escanearon los vidrios y se analizaron los datos del mismo modo que en el ejemplo descrito anteriormente.
Ejemplo 3
Las formas de realización preferidas del aparato que aplica el procedimiento de cuantificación según la presente invención vienen ilustradas en las figuras 2 hasta 7. El aparato está constituido por un soporte sólido 1, varias fuentes de iluminación 2 dispuestas a intervalos regulares sobre un soporte circular 4, que se encuentra por debajo de dicho soporte sólido 1, y dos cámaras, 3 y 3', que se han dispuesto por encima de dicho soporte sólido 1 de tal forma que se encuentran enfrentadas entre sí en un plano.
Asimismo, el aparato puede estar constituido por un soporte sólido 1, varias fuentes de iluminación 2 dispuestas a intervalos regulares sobre un soporte circular 4, que se encuentra por debajo de dicho soporte sólido 1, y una cámara 3 que se ha dispuesto por encima de dicho soporte sólido 1.
Asimismo, en otra forma de realización el aparato puede estar constituido por un soporte sólido 1. Asimismo, el aparato está constituido por un primer conjunto de fuentes de iluminación 2 y un segundo conjunto de fuentes de iluminación 2. Las fuentes de iluminación de cada uno de los conjuntos, 2 ó 2', se han dispuesto a intervalos regulares sobre un plano formado preferentemente por un soporte circular, 4 ó 4'. El primer conjunto de fuentes de iluminación 2 se ha previsto por encima del soporte sólido 1, mientras que el segundo conjunto de fuentes de iluminación 2' se ha previsto por debajo de dicho soporte sólido 1, de modo que dicho primer y segundo conjunto de fuentes de iluminación, 2 y 2', se encuentran en posiciones simétricas con respecto a la posición de dicho soporte sólido 1. Asimismo, el aparato comprende una cámara 3 que se ha previsto por encima de dicho soporte sólido 1 y por encima del primer conjunto de fuentes de iluminación 2.
Asimismo, en otra forma de realización, el aparato puede estar constituido por un soporte sólido 1 con o sin varias fuentes de iluminación 2 dispuestas a intervalos regulares en un plano formado preferentemente por un soporte circular 4, que se encuentra por debajo de dicho soporte sólido 1. Asimismo, el aparato incluye una cámara 3 en la parte superior. Dicho soporte circular 4 y dicha cámara 3 se han previsto simétricamente con respecto a la posición del soporte sólido 1.
Finalmente, el aparato puede incorporar asimismo un soporte sólido 1 con varias fuentes de iluminación 2 dispuestas a intervalos regulares en un plano formado preferentemente por un soporte circular 4, que se encuentra por debajo de dicho soporte sólido 1, y tres cámaras, 3, 3' y 3'', previstas por encima de dicho soporte sólido 1 según una distribución triangular en un plano.

Claims (13)

1. Procedimiento para la identificación y/o cuantificación de un compuesto diana, obtenido a partir de una muestra preferentemente biológica, que comprende las etapas siguientes:
-
poner en contacto el compuesto diana con una molécula de captura para que se pueda formar una ligadura específica entre dicho compuesto diana y una molécula de captura, que se ha fijado sobre una superficie de un soporte sólido según una red que comprende una densidad de por lo menos 20 regiones discretas por cm^{2}, estando cada una de dichas regiones discretas unida a una especie de moléculas de captura;
-
llevar a cabo una reacción que da lugar a la formación de un precipitado que se forma en la ubicación de dicha ligadura y se obtiene mediante la precipitación de un compuesto metálico sobre un compuesto diana ligado;
-
determinar la posible formación y/o presencia de un(os) precipitado(s) o en una(s) región(es) discreta(s) y correlacionar la formación y/o presencia de dicho(s) precipitado(s) en la(s) región(es) discreta(s) con la identificación y/o cuantificación de dicho compuesto diana, con la condición de que como soporte sólido un disco compacto, en el que las moléculas de captura no divisibles sobre la superficie exterior del disco compacto son dirigidas mediante procedimientos físicos convencionales que utilizan técnicas microlitográficas y/o de micromecanización de incubación que mantendrán las moléculas de captura no divisibles en determinadas ubicaciones en las que son fijadas, sea excluido.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho compuesto metálico es un compuesto metálico magnético.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la reacción que da lugar a la formación del precipitado es una reducción de un metal en presencia de una enzima.
4. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la reacción que da lugar a la formación del precipitado es una reducción química de plata en presencia de partículas de oro coloidal unidas al compuesto diana ligado.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la ligadura específica entre el compuesto diana y su correspondiente molécula de captura es una hibridación entre dos secuencias de nucleótidos.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la ligadura entre el compuesto diana y su correspondiente molécula de captura es una reacción entre una estructura antigénica y su anticuerpo correspondiente o una parte hipervariable del mismo.
7. Pocedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la ligadura entre el compuesto diana y su correspondiente molécula de captura es una reacción entre un receptor y el ligando correspondiente.
8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la posible presencia de un precipitado se determina a partir de la reflexión, absorción o difusión de un haz de luz, preferentemente un haz láser al incidir sobre dicho precipitado.
9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la presencia de un precipitado en una región discreta se determina a partir de la variación de un campo electromagnético o la conductancia de una corriente eléctrica.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la cuantificación del volumen de un precipitado o varios precipitados que se han formado sobre una superficie definida del soporte sólido, caracterizado porque las imágenes de dicha superficie definida, que contienen un o más de un precipitado, corresponden a distintas vistas y porque dichas imágenes, que contienen información analógica, se han tomado mediante una o más de una cámara bajo la iluminación proporcionada por una fuente de iluminación o por varias fuentes de iluminación dispuestas espacialmente según una configuración predeterminada, y caracterizado porque la correspondiente información analógica de las imágenes de dicha superficie definida, que contiene dicho(s) precipitado(s), se transforma y convierte en forma digital o en un conjunto de formas digitales y se compara con un primer y un segundo patrón de referencia para determinar el volumen del precipitado o de los precipitados a cuantificar.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el primer patrón de referencia corresponde a una forma digital o a un conjunto de formas digitales obtenido a partir de la información analógica contenida en las imágenes tomadas de la superficie de dicho soporte sólido (1) cuando ésta no contenía ningún precipitado.
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12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque el segundo patrón de referencia corresponde a una forma digital o a un conjunto de formas digitales obtenido a partir de las informaciones analógicas contenidas en las imágenes tomadas de la superficie de dicho soporte sólido (1) cuando ésta contenía un precipitado o varios precipitados de volumen conocido.
13. Aparato de diagnóstico y/o cuantificación de un o más de un compuesto diana idéntico que se ha obtenido a partir de una muestra que comprende:
-
moléculas de captura que se han fijado sobre la superficie de un soporte sólido según una red que comprende una densidad de por lo menos 20 regiones discretas por cm^{2} encontrándose cada una de dichas regiones discretas unida a una especie de moléculas de captura,
-
un precipitado metálico formado en una ubicación de la ligadura entre dicho compuesto diana con dicha molécula de captura,
-
un dispositivo de detección y/o cuantificación de un precipitado metálico que se ha formado en la ubicación de la ligadura entre dicho compuesto diana y dicha molécula de captura,
-
posiblemente un dispositivo de lectura de información(es) registrada(s) sobre dicho soporte sólido, y
-
un ordenador programado para:
-
reconocer posiblemente las regiones discreta sobre las que se encuentran moléculas de captura,
-
reunir los resultados (que proceden de la información de un precipitado metálico en una ubicación concreta) obtenidos mediante dicho dispositivo de detección y posiblemente la(s) información(es) obtenida(s) mediante dicho dispositivo de lectura, y
-
efectuar el diagnóstico y/o la cuantificación de dicho(s) compuesto(s) diana, con la condición de que como soporte sólido un disco compacto, en el que la moléculas de captura no divisibles sobre la superficie exterior del disco compacto son dirigidas mediante procedimientos físicos convencionales que utilizan técnicas microlitográficas y/o de micromecanización de incubación que mantendrán las moléculas de captura no divisibles en determinadas ubicaciones en las que serán fijadas, sea excluido.
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