DE102007052281A1 - Einschritt-Multiplex-Immuntest - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein System und ein Verfahren zum immunologischen Nachweis mehrerer Substanzen in einem Schritt, wobei die Nachweis-Reaktion auf einem Sandwich-ELISA basiert und sich insbesondere dadurch auszeichnet, dass sie einfach durchzuführen ist und als "Ein-Topf-Reaktion" konzipiert ist, was bedeutet, dass alle Nachweisschritte in einem Reaktionsansatz ohne Spülschritte und nur einmalige Hinzugabe von Reagenzien ausgeführt werden.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein System und ein Verfahren zum immunologischen Nachweis mehrerer Substanzen in einem Schritt, wobei die Nachweis-Reaktion auf einem Sandwich-ELISA basiert und sich insbesondere dadurch auszeichnet, dass sie einfach durchzuführen ist und als „Ein-Topf-Reaktion" konzipiert ist, was bedeutet, dass alle Nachweisschritte in einem Reaktionsansatz ohne Spülschritte und nur einmalige Hinzugabe von Reagenzien ausgeführt werden.
  • Immuntests, Enzym gekoppelte Immuntests (ELISA), Fluoreszenz-Markierung gekoppelte Immuntests (FLISA) oder mit einem anderen Label markierte Immuntests werden in der Routinediagnostik und Forschungsdiagnostik zur Detektion und Quantifizierung von Proteinen, zum Beispiel Antigenen, Liganden, Rezeptoren, Antikörpern sowie von chemischen Verbindungen inzwischen routinemäßig eingesetzt.
  • Beim „indirekten Immunoassay" wird das nachzuweisende Protein, d. h. das Antigen (AG), durch Adsorption an einen festen Träger, z. B. eine Polystyrol-Mikrotiterplatte, gebunden. Nach einem Waschschritt wird ein spezifischer Bindungspartner, der sogenannte Detektions-Antikörper (DAK), hinzugegeben.
  • Beim „Sandwich-Immunoassay" wird zuerst ein Antigen-spezifischer Bindungspartner, der sogenannte Fänger-Antikörper (FAK), am festen Träger adsorbiert. Nach einem Waschschritt kann die Probe zugegeben werden, nach einem weiteren Waschschritt dann der DAK. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass das Antigen durch den FAK selektiv aus der Probenlösung eingefangen wird, wodurch deutlich kleinere Mengen nachweisbar sind.
  • Beim „Enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA) ist an die DAKs ein Enzym gekoppelt, das in einem dritten Schritt eine Farbreaktion katalysiert (z. B. Meerrettichperoxidase (HRP) + Tetramethylbenzidin (TMB)) und so ein positives Testergebnis visualisiert.
  • Beim „fluorescent labelled immunoassay " (FLISA) sind die DAKs entweder direkt mit einem Fluoreszenzlabel versehen oder mit einem weiteren Bindungspartner, an den die Bindung eines sekundären Detektionssystems möglich ist (z. B. Biotin-Label + Cy5-Streptavidin).
  • Für die Durchführung eines „Sandwich-ELISA" oder „Sandwich-FLISA" ist es üblich, die FAKs durch Adsorption an einen festen Träger zu binden und die weiteren für die Versuchsdurchführung benötigten Reagenzien als separate Komponenten den Testkits hinzuzufügen. Diese Reagenzien sind üblicherweise ein Standard- und Probenverdünnungsmedium, der zweite spezifische Bindungspartner (= DAK) in gekoppelter Form (d. h. Konjugat) als Konzentrat oder Arbeitslösung und falls benötigt ein sekundäres Detektionssystem. Zum Herstellen der Arbeitslösungen für den zweiten spezifischen Bindungspartner sowie für das Sekundärreagenz steht ein Assaypuffer zur Verfügung, welcher meist als Konzentrat vorliegt. Da zwischen den Arbeitsschritten Waschschritte erforderlich sind, enthält ein herkömmlicher Immuntest-Kit auch einen Waschpuffer, üblicherweise in konzentrierter Form.
  • Die Notwendigkeit mehrerer Waschschritte während einem Immuno-Assay, egal auf welchem Nachweisprinzip er beruht, macht die Tests oft zeitaufwändig und personalintensiv. Dies stellt einen Nachteil bezüglich Automatisierung, Durchsatz einer hohen Probenanzahl und Kosten dar.
  • In der WO 02/090983 A2 ist aber schon eine in der Anwendung einfachere Form eines Immuno-Assays beschrieben. Dabei ist auf dem Träger (z. B. Mikrotiterplatte) nicht nur der FAK adsorbiert, sondern auch in lyophilisierter Form der DAK und eventuell das daran gekoppelte Enzym. Es muss nur noch die zu bestimmende Probe im Assaypuffer zugegeben werden, wodurch das Lyophilisat rekonstituiert und das Sandwich aus FAK, AG und DAK in einem Schritt aufgebaut wird. Der manuelle Aufwand reduziert sich auf einen einzigen Waschschritt nach der Inkubation und die sequentielle Zugabe der Substrat- und Stopplösung bei einer enzymatischen Farbreaktion. Die Quantifizierung erfolgt wie üblich in einem Plattenreader. Es findet aber keine „echte" parallele Reaktion statt und damit ist eine Vergleichbarkeit der Reaktionen nicht gewährleistet, was die Reproduzierbarkeit des Assays deutlich reduziert. Hinsichtlich gewünschter Automatisierung, erhöhtem Probendurchsatz und Kosten stellt diese Methode allerdings bereits eine Verbesserung zum Standard ELISA dar.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein Verfahren zum immunologischen Nachweis mehrerer Substanzen in einem Schritt bereitzustellen, das sich insbesondere dadurch auszeichnet, dass alle Nachweisschritte in einem Reaktionsansatz ohne Spülschritte und nur einmalige Zugabe von Reagenzien ausgeführt werden.
  • Diese Aufgabe wird durch die Gegenstände der Patentansprüche 1 und 8 gelöst.
  • Von den Erfindern wurde gefunden, dass der immunologische Nachweis mehrerer nachzuweisender Substanzen nebeneinander durch einen Multiplex-Nachweis unter Verwendung eines Bio-Chips (auch Microarray, Chip, Protein-(Bio)-Chip, Sondenarray genannt) durchgeführt werden kann. Die erforderlichen biochemischen Reaktionen und die Detektion finden in einer Kartusche nach einmaligem Füllen mit allen Reagenzien ohne weiteres Eingreifen des Anwenders, also in einer "one-tube"-Reaktion, oder auch „Eintopf-Reaktion" statt. Dies erfordert die Etablierung eines ELISA Nachweises, bei dem alle Nachweisschritte in einem Reaktionsansatz ohne Spülschritte und spätere Hinzugabe von Reagenzien ausführt werden. Über eine Software ist ein Layout für den Protein Bio-Chip festgelegt, wodurch eindeutig erklärt ist, welcher Bindungspartner (z. B. Antikörper) an welchem Platz (Spot) ist. Wenn die in der Probe enthaltenen nachzuweisenden Substanzen (z. B. Antigene) spezifisch mit einem Detektionspartner (z. B. Detektionsantikörper) reagieren und an den zugehörigen Fängerpartner (z. B. Fängerantikörper) auf dem Protein-Bio-Chip binden, wird durch das gekoppelte Label (z. B. Fluoreszenzfarbstoff) ein messbares Signal erzeugt. Über das Layout kann dann exakt bestimmt werden um welchen Bindungspartner (z. B. Antikörper) es sich handelt und auf die nachzuweisende Substanz rückgeschlossen werden (11).
  • Die Erfindung findet Anwendung zur Detektion von einer Vielzahl von Substanzen nebeneinander (Multiplex-Format) auf der Basis eines Sandwich-ELISA. Insbesondere kann der Test zum Nachweis von Proteinen (z. B. Antigenen, Antikörpern), Liganden, Rezeptoren, Steroiden, chemischen Substanzen, Medikamenten, Toxinen, Bakterien, Viren und ähnlichen Substanzen eingesetzt werden. Insbesondere eignet er sich zum Multiplex-Nachweis von biowaffenfähigen Toxinen, Mykotoxinen, Bakterien und Viren, insbesondere Rizin, Staphylococcus-Enterotoxin B (SEB), Botulismus-Toxine A und B.
  • Die Detektion des Reaktionskomplexes erfolgt über die Intensitäts-Messung einer Markierung (Label). Dabei kann die Markierung direkt am Detektionsbindungspartner (z. B. Detektionsantikörper) angebracht sein oder mit Hilfe eines direkt gekoppelten Enzyms (z. B. Meerrettich-Peroxidase, Alkalische Phosphatase u. ä.) oder über eine enzymatische Reaktion, welche durch einen Sekundärschritt erfolgt (Biotin-Streptavidin-HRP, Neuramidin, Dioxigenin/Antidioxigenin, enzym-gekoppelter Antikörper gegen den Detektionsantikörper u. ä.). Jedes Label, das direkt an den Reaktionskomplex oder einen Sekundärpartner gekoppelt sein kann und für die Durchführung eines Immuntests geeignet ist, wie Fluorochrome, Chemilumineszenz-Label, radioaktive Label u. ä. kann benutzt werden.
  • Die in diesem Verfahren benutzten biochemischen Reagenzienmixe, Temperierung für den Ablauf der Reaktionen und ein abschließender Auswertealgorithmus werden im Folgenden erläutert, wobei eine Antigen-Antikörper-Reaktion und als Nachweis-Label die Messung der Fluoreszenz gewählt wurde, was aber wie oben gesagt, nicht die einzige Möglichkeit darstellt und nicht beschränkend auszulegen ist.
  • Zusammengefaßt läuft das Verfahren wie folgt ab:
    • 1. Die Probe, die die nachzuweisenden Substanzen enthält, wird, falls sie in fester Form vorliegt, in einem geeigneten Puffer aufgenommen und in den Biotestmix-Tube gegeben. Bei einer bereits flüssigen Probe kann die Zugabe zum Biotest-Mix sofort erfolgen,
    • 2. Diese Mischung wird mit einer Pipette in den Probenraum der Kartusche eingebracht,
    • 3. Die Kartusche wird ins Gerät eingelegt, der Prozess gestartet.
    • 4. Die Kartusche wird prozessiert. Die Prozessparameter sind in der Kartusche codiert und in der Software hinterlegt, es können Temperaturen im Bereich zwischen Raumtemperatur und 100°C für beliebige Zeitintervalle angesteuert werden.
    • 5. Nach abgeschlossener Inkubation wird der Biochip ans optische Fenster gedrückt, und ein Bild im Fluoreszenzkanal aufgenommen.
    • 6. Die Software wertet unter Anwendung des Array Layouts die Spotintensitäten aus und liefert eine Aussage über die Anwesenheit der nachzuweisenden Antigene in der Probe.
  • Die Schritte 4–6 laufen vollautomatisch ab.
  • Das gesamte Nachweis-System (s. 10) besteht aus:
    • – Biotestmix-Tube zum Ansetzen des Nachweises
    • – Einmal-Kartusche zur Probenaufnahme
    • – Gerät zur Prozessierung der Kartusche
    • – Software zur Prozessierung und Auswertung
  • Somit ist Bestandteil des Test ein vorkonfektioniertes Tube, in dem die für den Nachweis notwendigen DAK, das Antigen der Positivkontrolle und sonstige Pufferbestandteile in lyophilisierter Form stabilisiert vorliegen (Biotestmix). Die DAK können Fluoreszenz-gelabelt sein, es ist auch möglich über einen weiteren Bindungsschritt eine Nachweiskaskade aufzubauen (z. B. Biotin-gelabelter DAK und fluoreszenz-gelabeltes Streptavidin), alle hierfür notwendigen Reagenzien sind dann auch Bestandteil des lyophilisierten Biomixes.
  • Der Biotestmix enthält bevorzugt ein in der Immunologie übliches Assay-Puffer-System (z. B. PBS-Puffer), ein Protein zur Stabilisierung (z. B. Rinderserum-Albumin) und ein Detergenz (z. B. Triton-X) und Detektionsantikörper (direkt fluoreszenz-markiert oder ggf. biotinyliert). Ist der Detektionsantikörper biotinyliert, enthält der Biotestmix weiter einen Streptavidin markierten Fluoreszenzfarbstoff (für den Sandwich-Nachweis). Weiterhin sind im Biotestmix beliebige Antikörper (z. B. Interleukin-12 Antikörper) als Positiv Kontrolle enthalten, die als „Modellsystem" dienen, um die Funktionsfähigkeit des biologischen System zu überprüfen. Bei erfolgreicher Antiköper-Antigen-Antikörper Wechselwirkung (Mouse Interleukin-12 – Interleukin 12 – Anti Mouse Interleukin-12) während der Prozessierung entsteht ein Fluoreszenzsignal das als Positivkontrolle die Funktionsfähigkeit demonstriert. Tabelle 1: Bevorzugte Zusammensetzung des Biotestmix (Detektionsantikörper-Mix)
    Substanz Herkunft
    PBS Puffer Kommerziell erhältlich als standardisierte Produkte
    Triton-X Kommerziell erhältlich als standardisierte Produkte
    BSA (Rinder Serum Albumin) Kommerziell erhältlich als standardisierte Produkte
    Detektionsantikörper (DyLight 649) Eigenentwicklung oder kommerziell erhältlich
    Mouse-Interleukin-12, Anti-Mouse-Interleukin-12 Kommerziell erhältlich als standardisierte Produkte
  • Für die meisten nachzuweisenden Antigene (z. B. Toxine, Bakterien, Viren) existieren bereits verschiedene kommerziell erhältliche Antikörper (monoklonal und/oder polyklonal), welche für die Nachweisreaktion eingesetzt werden können. Für die Etablierung des Multiplex-Nachweises ist die Auswahl von geeigneten Antikörpern ein Schlüsselprozess, um Kreuzreaktionen zu verhindern, die aufgrund der Systemeigenschaften vermehrt auftreten können, da hier auf Waschschritte bewusst verzichtet wird.
  • Die Bestandteile des Biotestmixes werden in entsprechenden Konzentrationen zusammengemischt und für die Nachweisreaktion mit der entsprechend konfektionierten Probe versetzt.
  • Der eigentliche Immunoassay läuft so ab, daß auf dem Biochip Fängerantikörper in Spots immobilisiert sind, die spezifisch bestimmte Antigene in der zu analysierenden Probenflüssigkeit erkennen und binden. Die Reaktionslösung enthält Detektionsantikörper, die spezifisch bestimmte Antigene in der zu analysierenden Probe erkennen und binden, und die direkt oder indirekt mit einem Farbstoff gekoppelt sind. Die Probe wird mit der Reaktionslösung gemischt und in den Reaktionsraum mit Biochip eingebracht. Unter dem Einfluss eines definierten Temperaturprofils binden die Antigene der zu analysierenden Probe spezifisch an die entsprechenden Fängerantikörper auf der Bio-Chip-Oberfläche. Auf der Chipoberfläche bildet sich an den Spots damit ein Molekülkomplex genannt "Sandwich", bestehend aus immobilisiertem Fänger-Antikörper, gebundenem Proben-Antigen und Detektionsantikörper mit Farbstoff.
  • Der Immuntest läuft in einem abgeschlossenen Kompartiment (Probenraum) ab, in dem definierte Temperaturen zwischen Raumtemperatur und 100°C erzeugt werden können. Der Probenraum ist Bestandteil einer Einmal-Kartusche, und ist mit einer handelsüblichen Pipette befüllbar. Die Befülleinheit ist Bestandteil der Kartusche und so ausgeführt, dass für den Befüllvorgang eine temporäre Öffnung in den Probenraum eingebracht wird, die nach Abschluss der Befüllung wieder sicher verschlossen ist. Das Volumen des Probenraums beträgt etwa 20–80 μl, bevorzugt 30–60 μl, ganz bevorzugt ca. 40 μl.
  • Ein weiterer Bestandteil des Probenraumes ist ein fester Träger (Biochip), auf dem die FAK immobilisiert sind. Der Biochip kann z. B. aus Glas, Polypropylen, Polycarbonat, Polystyrol und/oder PMMA bestehen. Der Biochip ist ca. 2–4 × 2–4 mm groß, bevorzugt quadratisch ca. 3 × 3 mm, ganz bevorzugt 3,15 × 3,15 mm groß. Die Immobilisierung erfolgt bevorzugt durch kovalente Kopplung der FAK an eine funktionalisierte Beschichtung des Biochips, wie z. B. die Kopplung von Lysin-Aminogruppen an einen Epoxysilan-funktionalisierten Glasträger. Eine weitere Funktion der Beschichtung des Biochips besteht in der Verhinderung unspezifischer Bindung des Antigens an die Oberfläche des Biochips. Statt eines Epoxysilan-funktionalsierten Trägers könnte auch ein Aminopropylsilan-, Aldehyd- oder Poly-L-Lysin-funktionalisierter Träger eingesetzt werden.
  • Die Immobilisierung erfolgt ortsaufgelöst für jede FAK-Sorte einzeln in getrennten Bereichen (Spots) auf dem Biochip. Die Spotgröße beträgt zwischen 50 und 200 μm, der Spotabstand von 100–300 μm. Der dabei benutzte Puffer enthält stabilisierende Bestandteile. Es ist dabei möglich, jeglichen in der Immunologie üblichen Puffer zu verwenden, bevorzugt PBS, Tris-HCl, SSC, TBE oder Tris-Glycin. Als stabilisierende Bestandteile seien beispielhaft Trehalose, BSA, Casein, PVP, Dextran, Maltose, Saccharose, Xylit, oder Sorbit genannt. Die stabilisierenden Bestandteile werden zugesetzt, da Antikörper als biologisch aktive Makromoleküle sehr anfällig sind, wenn sie sich nicht im Plasma befinden. Insbesondere beim Eintrocknen der Spots kann die Aktivität drastisch verringert werden und die Langzeit-Haltbarkeit ist meist schlecht (nur Tage). So wurde gefunden, dass die Trehalose im Spotting-Puffer einen schützenden Effekt auf die Stabilität und Aktivität der Antikörper hat. Durch Einlagerung von Kristallwasser beim Eintrocknen bietet die Trehalose-Matrix den eingebetteten Antikörpern maximalen Schutz. Die Hydrathülle wird erhalten und die native Konformation der Proteine bleibt bestehen. Die Haltbarkeit erhöht sich so auf 6–12 Monate.
  • Jede FAK-Sorte ist mehrfach vorhanden (Replikate), es können 2–24, bevorzugt 4–12, ganz bevorzugt 6, Positionen sein. Weiterhin gibt es Positionen, an denen Prozeßkontrollen stattfinden, wie z. B. Positiv- und Negativkontrollen.
  • Im nachfolgenden wird die Kartusche und der Meßvorgang ausführlicher beschrieben, wobei dies als mögliche beispielhafte Ausgestaltung zu verstehen ist und nicht beschränkend auszulegen ist. Hinsichtlich der Kartusche und dem Meßablauf sind mannigfaltige Variationen möglich, die ein erfolgreiche Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gewährleisten.
  • Beispielsweise wird eine kleine Menge (z. B. 2 μl) der Probe mir dem zu testenden Antigen zum mit einem Puffer rekonstituierten Biotestmix hinzugegeben (mit Standard Laborpipette). Der resultierende Reaktionsansatz (ca. 40 μl) wird komplett in den Reaktionsraum der Kartusche injiziert. Die Kartusche wird dann in das Lesegerät (Reader) eingelegt und der Analyseprozess wird gestartet.
  • Im geschlossenen Reaktionsraum der Kartusche erfolgt nun die Antikörper-Antigen Reaktion. Grundsätzlich funktioniert diese wie ein Sandwich-ELISA, wobei drei Bindungen zwischen vier "Proteinen" (allg. Peptiden) zustande kommen. Gespottet auf dem Bio-Chip befindet sich kovalent gebunden der Fänger-Antikörper (FAK), dieser bindet spezifisch an ein Epitop des Antigens (AG) (z. B. Ricin). Dann gibt es den Biotin-gelabelten Detektions-Antikörper (DAK), der wiederum spezifisch, aber an ein anderes Epitop des Antigens (AG) bindet. Um das Ganze sichtbar zu machen, gibt es Fluoreszenzfarbstoff-gelabeltes Streptavidin (SA) (z. B. als SA-DyLight647), das wiederum eine sehr stabile Bindung an Biotin macht, und somit dort Fluoreszenzdetektion erlaubt, wo die Kaskade (FAK)-(AG)-(DAK)-(SA) zustande gekommen ist.
  • Für die einfache Durchführung dieses auf einem klassischen Sandwich-ELISA Verfahren basierenden Tests ist eine Kartusche erforderlich, in der nach der Befüllung mit der Probenflüssigkeit unterschiedliche Temperaturverläufe eingestellt werden können, damit die entsprechende biologische Reaktion abläuft, und anschließend die optische Detektion erfolgt. Diese Kartusche ist ein biologisches Mikrolabor und ein wichtiges Zukunftswerkzeug für die Analyse biologischer Proben.
  • Die Kartusche (10) beinhaltet:
    • – einen Reaktionsraum in dem sich der Biochip mit aufgebrachten Reaktionsfeldern (Spots) mit bekannten fixierten Fängermolekülen befindet,
    • – ggf. eine Befüllvorrichtung zum Einbringen der Probenflüssigkeit in den Reaktionsraum
    • – eine Temperiervorrichtung zur Einstellung unterschiedlicher Temperaturen und deren schnelle Änderung im Reaktionsraum
    • – ein Detektionsfenster durch das eine optische Detektion der Spots auf dem Biochips, nach erfolgtem FLISA, mit einem Optikmodul erfolgt.
  • In der Kartusche befindet sich ein Inlay mit einem Biochip im Reaktionsraum. Auf dem Biochip sind M × N Spots (Reaktionsfelder) mit unterschiedlichen biologischen Informationen angeordnet. Auf jedem Spot sind bekannte Fängermoleküle fixiert, die sich nur mit jeweils einer bestimmten Molekülsorte aus der zu untersuchenden Probenflüssigkeit verbindet. Die biologische Nachweisreaktion wird nach dem Einfüllen der zu untersuchenden Probenflüssigkeit in den Reaktionsraum gestartet. Dazu wird ein definiertes Temperaturprofil gefahren und die Moleküle selektiv an den Spots auf dem Biochip gebunden. Die an diese Moleküle chemisch gebundenen Farbstoffmoleküle können dann mittels eines Optikmoduls und geeigneter optischer Fluoreszenz-Meßverfahren detektiert werden.
  • Mit Bezug auf die 1–9 und 12 kann die Kartusche und das Meßverfahren wie folgt beschrieben werden:
    Ein beispielsweise mittels Spritzguss hergestellter Grundkörper (1) enthält Aussparungen für den Befüllkanal (7) mit dem Rückschlagventil (8), die Befüllöffnung (9), den Reaktionsraum (5), den Verbindungskanal (4) zwischen Probenraum (5) und Ausgleichsraum (2), den Ausgleichsraum (5), und einem Sichtfenster (3). Das Rückschlagventil (8) wird in den Befüllstutzen (9) eingesetzt und fixiert (1).
  • Der Biochip (6) (2) enthält eine Anzahl M·N Reaktionsfelder (6.1). Zur Vermeidung von optischen Rückreflexen und unerwünschter (Fluoreszenz)strahlung von der Flex-Leiterplatte ist der Biochip auf der Rückseite optisch undurchlässig und nicht fluoreszierend, z. B. mit Schwarzchrom beschichtet (6.2)
  • Die Flex-Leiterplatte (10) enthält Kontaktflächen (10.1), ein Speichermedium (10.2) und eine interne Heizstruktur (10.3) (3).
  • Der Biochip (6) wird auf der Flex-Leiterplatte (10) fixiert und anschließend die Flex-Leiterplatte mit der Grundplatte (1) verbunden. Die Verbindung zwischen Flex-Leiterplatte und Biochip erfolgt mit einer Haftverbindungsschicht (17), wie z. B. einem geeigneten Klebeband (geeignet für biologische Reaktionen) oder mit einem Silikonkleber.
  • Anschließend wird die Flex-LP mit dem aufgebrachten Biochip zum Grundkörper justiert und fixiert und bildet das Inlay (11). Eine dauerhafte, temperatur- und wasserbeständige Verbindung kann z. B. mittels biologisch-verträglichem Klebeband, mit Silikonkleber, durch Laserschweißen, durch Ultraschallschweißen oder andere biologisch verträgliche Klebstoffe realisiert werden. Dabei gibt es die Möglichkeit, die ganze Flex-LP großflächig mit dem Klebeband (oder Klebstoff) zu beschichten, den Biochip über der Heizstruktur der Flex-LP aufzukleben, und dann den Grundkörper zum Biochip zu justieren und die Flex-LP über der gesamten Fläche des Grundkörpers zu fixieren (4).
  • Eine zweite Möglichkeit der Verbindung von Flex-LP, Biochip und Grundkörper besteht in der gezielten flächigen Verklebung des Biochips mit der Flex-LP (Kleber nur unter dem Biochip) und der anschließenden Fixierung des Grundkörpers nur außerhalb des Reaktionsraums (5). Mit dieser Art der Verklebung ist der Wärmeübergang von der Heizstruktur (10.3) in der Flex-LP in den Reaktionsraum effizienter.
  • Die so vormontierte Einheit des Inlays, bestehend aus Grundplatte, Biochip, Flex-Leiterplatte und Rückschlagventil wird zur einfacheren Handhabung und Stabilisierung in eine Kartusche (28) eingepresst.
  • Befüllvorgang:
  • Die Probenflüssigkeit wird mittels einer Spritze oder Pipette durch das Rückschlagventil über den Befüllkanal in den Reaktionsraum eingespritzt. Die Probenflüssigkeit füllt zunächst den Reaktionsraum aus und strömt dann in den Ausgleichskanal. Beim Befüllvorgang entsteht im Inlay-System ein Überdruck und die Luft im Ausgleichsraum wird komprimiert. Durch ein Kontrollfenster im Ausgleichskanal kann der Befüllstand überwacht werden. Da die Volumina des Befüllkanals, des Reaktionsraums und des Ausgleichskanals bekannt sind, kann mit einem konstanten Flüssigkeitsvolumen, auch ohne Betrachtung des optischen Fensters, befüllt werden.
  • Der druckdichte Abschluss mit dem Rückschlagventil erzeugt beim Befüllen der Kartusche einen Überdruck im Reaktionsraum. Die Luft im Ausgleichsvolumen wird komprimiert. Mit der Variation der Volumina von Reaktions- und Ausgleichsraum kann der Überdruck gezielt eingestellt werden. Bei gleichen Volumina des Reaktions- und des Ausgleichsraumes verdoppelt sich der Innendruck bei der Befüllung. Während der Durchführung der temperaturgesteuerten biologischen Nachweisreaktion können Temperaturen bis 100°C auftreten. Die thermische Ausdehnung der Probenflüssigkeit führt zu einem Ausweichen in den Ausgleichskanal. Beim Abkühlvorgang zieht sich die Probenflüssigkeit wieder zurück. Die Druckunterschiede bei Tmax und Tmin (im kalten und heißen Zustand) sind nur minimal, da die Luft im Ausgleichsraum komprimiert wird. Das Volumen des Ausgleichsraums ist deutlich größer als die Volumenzunahme der Probenflüssigkeit bei Erwärmung.
  • Eine in die Kartusche eingefügte Stabilisierungsscheibe (24) kann eine Ausdehnung der elastischen Flex-Leiterplatte beim Befüllvorgang minimieren ohne die Fähigkeit des elastischen Andrückens des Biochips an die Detektionsfläche zu verlieren (12).
  • Eine Druckerhöhung um 1 bar in der Kartusche hat den Vorteil, dass der Siedepunkt der Probenflüssigkeit von 100°C auf ca. 125°C ansteigt. Die Bildung von Luftblasen im Reaktionsraum wird damit minimiert.
  • Temperaturgesteuerter ELISA:
  • Der Ablauf einer temperaturgesteuerten biologischen Nachweisreaktion erfordert die Einstellung genauer Temperaturen der Probenflüssigkeit im Reaktionsraum, d. h. eine Reaktionskammer, deren Temperatur einjustierbar ist. Dabei werden bei der Durchführung eines ELISA z. B. Temperaturen zwischen 20°C und 98°C angesteuert. Die Temperaturverteilung der Probenflüssigkeit muss im Reaktionsraum homogen sein und Temperaturänderungen (Heizen, Kühlen) sollen schnell erfolgen.
  • Für die optimale Durchführung des Immuntests stellt die Temperatur eine wichtige Komponente dar. Sie ist im weitesten Sinn als die treibende Kraft, die die nötigen Aktivierungsenergien liefert, anzusehen. Vorteilhafterweise wird der Ansatz bei 37°C für 30 Minuten inkubiert und anschließend bei 37°C ein Bild erzeugt.
  • Auf der Flex-LP befindet sich eine Heizstruktur, die bei Stromführung durch den ohmschen Widerstand als Heizer wirkt. Damit wird die Probenflüssigkeit im Reaktionsraum auf die erforderliche Temperatur T erwärmt. Die Heizstruktur kann gleichzeitig als Temperaturdetektor eingesetzt werden, indem die Widerstandskennlinie R(T) zur Bestimmung der Temperatur verwendet wird. Die Flex-LP mit den integrierten Heizbahnen verursacht lokale Temperaturschwankungen. Direkt über den Heizstrukturen befinden sich Hotspots. Eine Temperaturhomogenisierungsschicht (21) (7) auf der Flex-Leiterplatte bewirkt eine Homogenisierung der Temperaturverteilung auf der Oberseite der Flex-LP.
  • Ein in die Flex-Leiterplatte integrierter Heizer hat eine niedrige eigene Wärmekapazität. Damit sind höhere Heizraten ☐T(t) der Probenflüssigkeit im Reaktionsraum realisierbar.
  • Die Kühlung der Probenflüssigkeit im Reaktionsraum erfolgt entweder mittels Luft, gekühlter Luft oder aufgesetzten Kühlkörpern.
  • Die Temperatursteuerung in der Reaktionskammer wird genauer in den Anmeldungen PCT/EP2007/056420 und PCT/EP2007/056430 beschrieben, worauf hier Bezug genommen wird und der Inhalt dieser Anmeldungen durch Bezugnahme hier integriert wird.
  • Bildaufnahme:
  • Nach durchgeführtem ELISA wird die Flex-Leiterplatte durch Andrücken des Stößels (12) elastisch verformt, so dass der aufgeklebte Biochip an die Detektionsfläche drückt (6). Um den Luftdruck im Ausgleichsraum zu überwinden, muss eine Kraft F0 aufgewendet werden. Bei einer Fläche von ca. 0,5 cm2 benötigt man nur ca. 5 N um einen Druck von 1 bar aufzubauen. Zusätzlich muss noch eine bestimmte Kraft F1 aufgewendet werden, um die elastische Flex-LP mit aufgebrachten Biochip mittels eines Stößels so zu verformen, dass der Biochip gleichmäßig an die Detektionsfläche gedrückt wird. Die Summe der Kräfte F0 + F1 soll nicht über 30 N liegen.
  • Das vorstehend erwähnte „Stößeln" ist in DE 102004 022 263 A1 beschrieben, um den Flüssigkeitsüberstand mit mechanischen Mitteln zu verdrängen, so dass sich zwischen dem Biochip und der Detektionsfläche keine (oder nur wenige) Farbstoffmoleküle befinden. Der Reaktionsraum ist dabei so ausgebildet, dass ein Stößel den Biochip an eine ebene Detektionsfläche drückt und dabei die dazwischenliegende Probenflüssigkeit, der Flüssigkeitsüberstand, verdrängt wird.
  • Beim Stößeln wird somit die überstehende, Farbstoffmoleküle enthaltende Probenflüssigkeit, der Flüssigkeitsüberstand (29), zwischen Biochip und Detektionsfläche weggedrückt. Sie füllt dabei den Ausgleichskanal und den Ausgleichsraum. Die Beleuchtungseinheit des Optikmoduls (30) regt nur noch die auf dem Biochip gebundenen Farbstoffmoleküle zur Fluoreszenz an. Die Detektionseinheit des Optikmoduls detektiert nach dem Stößeln nur das Fluoreszenzlicht der auf dem Biochip gebundenen Farbstoffmoleküle. Die Beleuchtung des Biochips erfolgt über eine geeignete Lichtquelle, die dem verwendeten Farbstoff in der Probenlösung angepasst ist. Als Lichtquelle eignen sich vorzugsweise Laser und LED. Eine Funktion des Optikmoduls ist die Realisierung der homogenen Biochipausleuchtung. Diese lässt sich mit einem geeigneten Optikmodul realisieren. Ohne spezielle Blendenausführung im Optikmodul erfolgt die Ausleuchtung des Biochips im Reaktionsraum dabei kreisförmig (5.1). Es wird nicht nur der rechteckige Biochip beleuchtet, sondern auch Bereiche des Reaktionsraumes neben dem Biochip in denen die farbstoffhaltige Lösung nicht verdrängt wurde (9). Diese Bereiche fluoreszieren intensiv. Bei der optischen Abbildung des Biochips durch das Optikmodul auf einen Detektor (CCD-Chip) erscheinen diese Bereiche zwar außerhalb des Biochips, aber infolge der hohen Farbstoffkonzentration der Probenflüssigkeit neben dem Biochip streut ein Teil des Fluoreszenzlichtes auch in Richtung Biochip und auf die Reaktionsfelder (Spots). Der CCD-Detektor detektiert neben der Fluoreszenzstrahlung der Spots durch die direkte Beleuchtung auch die indirekte Fluoreszenzstreustrahlung aus den Bereichen neben dem Biochip. Damit erhält das Bild der Spots auf dem Biochips eine inhomogene, die Bildauswertung störende Untergrundbeleuchtung.
  • Mittels einer rechteckigen Blende, mechanisch aufgebracht auf den Grundkörper über dem Reaktionsraum (18), oder in diesen integriert, mit den geometrischen Abmessungen etwas kleiner als der Biochip (7, 8), wird die optische Fluoreszenzanregung des Farbstoffes im Reaktionsraum neben dem Biochip verhindert.
  • Diese Blende kann beim Spritzguss eines transparenten Grundkörpers als optisch absorbierende Blende (18) (8) oder beim Spritzguss eines nichttransparenten Grundkörpers als transparente optische Blende (19) eingebracht werden (7). Die Blende kann auch nachträglich auf das optische Beobachtungsfenster (Detektionsfläche) aufgebracht werden. Die Transmission der Blendenschicht sollte kleiner als 10–2 sein.
  • Das oben erwähnte Optikmodul wird genauer in der Anmeldung PCT/EP2007/054823 beschrieben, worauf hier Bezug genommen wird und der Inhalt dieser Anmeldung durch Bezugnahme hier integriert wird.
  • Real-Time-Detektion der temperaturgesteuerten biologischen Nachweisreaktion:
  • Im Gegensatz zu der Vorrichtung in DE 10 2004 022 263 A1 , bei der die Probenflüssigkeit vor der Bildaufnahme durch den Stößelvorgang irreversibel aus dem Reaktionsraum verdrängt wird, besteht in der erfindungsgemäß eingesetzten Kartusche die Möglichkeit, nach erfolgter Bildaufnahme den FLISA weiterzuführen. Wird der Stößel zurückgefahren, weicht die Flex-LP infolge des Überdrucks im Reaktionsraum zurück und die Probenflüssigkeit aus dem Ausgleichskanal fließt zurück in den Reaktionsraum, auch zwischen den Biochip und das Deckglas. Damit kann auch nach erfolgter Detektion der FLISA fortgeführt werden.
  • Prinzipiell kann mit der erfindungsgemäß eingesetzten Kartusche zu jedem Zeitpunkt der biologischen Reaktion eine Detektion der Spots auf dem Biochip vorgenommen werden.
  • Auslesen und Einschreiben von Daten:
  • Alle Informationen über die Kartusche, einschließlich Biochip, müssen vom Biochipreader ausgelesen werden. Zum Ansteuern exakter Temperaturen werden Daten des Heizers auf der Flex-LP benötigt. Auch die Informationen über die auf den Biochip aufgebrachten Reaktionsfelder (Spots), ID-Nummern, Belichtungszeiten für die Bildaufnahme, usw., müssen vom Reader ausgelesen werden, um die temperaturgesteuerte biologische Reaktion zu steuern und eine Protokollierung und Archivierung zu ermöglichen.
  • Die notwendigen Informationen können als Dot-Code oder als Bar-Code auf die Kartusche aufgebracht werden. Zum Auslesen dieser Codes benötigt man einen Dot-Code-Reader (oder Bar-Code-Reader). Flexibler ist der Einsatz von beschreibbaren und auslesbaren manipulationssicheren Speichermedien (10.2) die vorteilhafterweise auf der Flex-LP integriert sind.
  • Neben der Kontaktflächen (10.1) der Heizstruktur kann auch die Kontaktierung eines elektrisch programmierbaren nicht-flüchtigen Speichers auf der Flex-LP erfolgen (3). Damit können Informationen digital abgespeichert und zu jedem Zeitpunkt abgefragt werden. Die speicherbare Datenmenge ist dabei deutlich größer als bei aufgebrachten Bar- oder Dotcodes.
  • Die erhaltenen Informationen werden von einer geeigneten Software verarbeitet, wobei die räumliche Anordnung der FAK-Spots (Array Layout) ist in der Software bereits hinterlegt ist.
  • Bei einem kontaktierten elektrisch programmierbaren nicht-flüchtigen Speicher können auch Informationen während der Immunreaktion beim Auslesen des Biochips gespeichert werden. Außerdem können die Daten manipulationssicher gespeichert werden. Nach einer erfolgten Prozessierung kann die Kartusche auch als „prozessiert" markiert werden.
  • Zusammengefaßt sind die Vorteile des erfindungsgemäßen Vorgehens:
    • • Hochintegriertes System mit minimierter Anzahl an manuellen Schritten
    • • Keine Waschschritte, deshalb optimale Korrelation von Bindungspartnermenge (z. B. Antigen) und Signal
    • • Multiplexfähiges Nachweissystem: – Eine Kartuschensorte für den Nachweis mehrerer Substanzen – Nachweis mehrerer Substanzen gleichzeitig in einer „einzigen" Reaktion
    • • Einflussmöglichkeiten auf den Assay-Ablauf sehr hoch, durch Zeit-/Temperatursteuerung. Deshalb einfache Optimierung der Parameter für unterschiedliche Nachweise möglich, und:
    • • Einfache Umsetzung neuer Nachweise auf der Systemplattform. Es müssen nur die entsprechenden Bindungspartner (z. B. Antikörper) eingesetzt werden.
  • Es gibt zwei systembedingte Besonderheiten, die das beschriebene erfindungsgemäße System vom Standard ELISA Verfahren unterscheiden:
    • – die „Eintopfreaktion", d. h. der Verzicht auf Zwischenschritte (wie z. B. Waschen, Umpuffern, Lösungsmittelwechsel, ...)
    • – Das Abdrücken des Biochips an die Deckglasoberfläche zur Bildaufnahme, als mechanische Methode, um den Hintergrund zu verdrängen.
  • Vor allem der erste Punkt (die Eintopfreaktion) führt zu ganz grundlegenden Unterschieden im Verfahren.
  • Der Ablauf im Standard ELISA ist so, daß zwischen jeder spezifischen Bindungsreaktion ein Waschschritt vorgenommen wird. Als erstes wird nur das (AG) zugegeben, nach angemessener Zeit wird gewaschen, alles nicht gebundene Antigen wird entfernt. Dann wird der (DAK) zugegeben, der spezifisch ans (AK)-(AG) bindet, dann wird wieder gewaschen und die nicht gebundenen (DAK) entfernt. Nächster Schritt: Zugabe des "Visualisierungs-Proteins", beim Standard ELISA Verfahren, wird am Ende wieder gewaschen, um den Hintergrund für die Bildaufnahme zu minimieren. Die Selektion von Antikörpern für ein solches Nachweisverfahren, wird also neben der Spezifität vor allem darauf hinarbeiten, daß die Waschschritte möglichst gut überstanden werden. Die (FAK)-(AG)-Bindung muß dreimal die Waschprozedur aushalten, die (AG)-(DAK)-Bindung immerhin zwei Waschschritte, usw.
  • Im erfindungsgemäßen System liegen alle Bestandteile gleichzeitig vor! Es können sich (AG) und (DAK) verbinden, bevor das (AG) and den (FAK) gebunden hat. Während der Inkubationszeit läuft das dann so ab, daß diese Bindungen (weil nicht kovalent) sich ständig bilden und wieder lösen. Alle Bestandteile bilden ständig sich ändernde Koalitionen. Es wird sich aber, wenn genügend Zeit gelassen wird, ein thermodynamisches Gleichgewicht einstellen und das System sich ins Energieminimum bewegen. Die Geschwindigkeit, mit der dies passiert (also die benötigte Assay-Zeit), hängt wesentlich von der Temperatur und den Diffusionsgeschwindigkeiten ab, das Ergebnis aber hängt von den Bindungstärken ab, da im Gleichgewicht die stärkeren Bindungen bevorzugt sind.
  • Der Temperatureinfluß ist so, daß bei höherer Temperatur das Wieder-Aufbrechen einer suboptimalen Bindung leichter/schneller stattfindet, d. h. das Gleichgewicht wird schneller erreicht. Die Diffusionsgeschwindigkeit hängt u. a. von der Molekülgröße ab, insbesondere braucht ein Proteinkomplex wie (AG)-(DAK) länger, um zum (FAK) zu diffundieren, als wenn die Bestandteile sich einzeln dort hinbewegen. Das Detergenz (z. B. Triton-X) hat hier einen gewissen Einfluß, da es dazu beiträgt, die Bestandteile einigermaßen auseinander zu halten. Außerdem wirkt sich die Viskosität des Lösungsmittels natürlich auch direkt auf die Diffusion aus.
  • Beim erfindungsgemäßen System werden die Bindungen durch die fehlenden Waschschritte überhaupt nie auf die Probe gestellt, entscheidend ist die hinreichend schnelle Erzeugung der Kaskade (FAK)-(AG)-(DAK). Dementsprechend können Antikörper, die im Standard ELISA Verfahren optimale Ergebnisse liefern, für das erfindungsgemäße System ungeeignet sein und umgekehrt Antikörper, die im Standard ELISA Verfahren schlechte Ergebnisse liefern, möglicherweise optimal für das erfindungsgemäße System.
  • Die Erfindung wird weiter anhand der Abbildungen (Figuren) beschrieben, welche zeigen:
  • 1 Grundkörper (1) der Kartusche
  • 2 eine Ausführung der Reaktionsfelder (Spots) auf dem Biochip mit optisch undurchlässiger und nicht fluoreszierender Rückseite
  • 3 ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäß verwendeten flexiblen Leiterplatte mit interner Heizstruktur und integriertem EEPROM
  • 4 1. Alternative für einen auf einen Grundkörper (1) aufgebrachten Biochip mit Flex-LP
  • 5 2. Alternative für einen auf einen Grundkörper (1) aufgebrachten Biochip mit Flex-LP
  • 6 Anordnung des Inlays mit dem zugehörigen Optikmodul
  • 7 Anordnung, ausgestattet mit einer transparenten Blende in einem nicht transparenten Grundkörper
  • 8 Kartusche mit einem zugehörigen Optikmodul, ausgestattet mit einer nichttransparenten Blende in einem transparenten Grundkörper
  • 9 Ausschnitt der ausgeleuchteten Fläche im Probenraum des Inlays
  • 10 Multiplex-Detektions-System
  • 11 Entwicklung eines Multiplex-Sandwich-Assay
  • 12 Kartusche mit Inlay und dem Einsatz einer Flex-Leiterplatten-Stabilisierungsscheibe
  • 13 Array-Layout
  • 14 Bezeichungen der Antikörper
  • 15 Scan-Bild nach Spotting
  • 16 Reaktionsmechanismus der Epoxy-Kopplung
  • 17 Konstruktionszeichung Biochip-Slide
  • 18 In Software hinterlegtes Array Layout
  • 19 Alignment des Arrays
  • 20 Bild des Biochips im Gerät, Auswertung der Intensitäten
  • 21: Zeitkinetik der Rizin-Detektion (Single Plex)
  • 22: „4-Plex-Assay"
    • – Spotten verschiedener Fänger-Antikörper (mono- und polyklonal) pro Toxin
    • – ein Detektionsantikörper (mAb/pAb)
    • – gleichzeitige Detektion von Rizin, BoNT/A, BoNT/B und SEB innerhalb von 30 Minuten
    • – Detektion gereinigter Toxine oder Rohpräparationen/Kulturüberstände möglich
  • Die Erfindung wird weiter anhand der nachfolgenden Ausführungsbeispiele beschreiben, die eine beispielhafte Ausführung der Erfindung darstellen sollen, aber als nicht beschränkend für den Schutzumfang auszulegen sind.
  • Beispiel 1: Toxin-Nachweis
  • Mit dem Toxin-Assay ist der simultane Nachweis von drei biowaffenfähigen Toxinen möglich. Es handelt sich dabei um Rizin, Staphylococcus-Enterotoxin B (SEB) und die Botulismus-Toxine A und B (BoNT A/B). Die Toxine können in ihrer aktiven Form als Rohextrakt oder gereinigt vorliegen, als Probenmatrix ist Wasser etabliert.
  • 1. Biochip
    • • Der Glasträger für den Biochip besteht aus Floatglas (SCHOTT Borofloat 33, 0,7 mm dick). Dieses wird auf der Rückseite antireflektiv beschichtet („Schwarzchrom” bei POG Gera). Die Reflektivität ist bei der Anregungswellenlänge (630 nm) minimiert.
    • • Der beschichtete Glasträger wird auf der Vorderseite in einem quadratischen Raster 0,55 mm tief angesägt (Rastermaß: 3,3 mm). Die Sägerillen dienen später als Sollbruchstellen beim „Vereinzeln" der Biochips vor der Montage in die Kartusche (17).
    • • Der gesägte Glasträger (Außenabmessungen im Slide-Format 25 × 75,6 mm) wird mit einem Epoxysilan funktionalisiert (nach Ultraschall-Reinigung mit 3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan in Toluol für 3 h bei 80°C)
    • • Jede einzelne Biochip-Position des Slides wird mit einer identischen Anordnung von Antikörpern (Array Layout) bespottet. Die Spottinglösung besteht aus dem jeweiligen Antikörper in einer Konzentration von 0,5 mg/ml, in 1 × PBS und 20 mM Trehalose, sowie eventuell 0,025% BSA. Das Spotting geschieht mit einem kontaktfreien Piezo-Nanodispenser (Spotter). Die immobilisierten Antikörper befinden sich nach dem Spotting jeweils in einem runden Bereich von etwa 130 μm Durchmesser (Spot), die Spots sind in einem Abstand von 200 oder 240 μm aufgebracht. Durch Reaktion der Aminogruppen von Lysin-Aminosäuren an der Oberfläche der Antikörper mit den Epoxy-Gruppen der Silan-Beschichtung findet eine kovalente, irreversible Kopplung der Fängerantikörper an den Glasträger statt (16).
  • 2. Array Layout
  • Es gibt 4 Kategorien von Spots (83 Stück) im Array Layout (13, 14, 15).
    • • Marker (11 Spots): Hier werden aminomodifizierte Cy5-gelabelte Oligonukleotide gespottet, die dauerhaft leuchtende Spots ergeben. Diese Marker-Spots werden von der Software automatisch erkannt (Alignment) (19) und dienen zusammen mit dem in der Software hinterlegten Array Layout (18) der Zuordnung der ausgewerteten Signalintensitäten der Spots zu den entsprechenden Antikörper-Sorten.
    • • Fängerantikörper (7 Stück als 6fach-Replikate): Hier sind die für das jeweilige Toxin spezifischen Fängerantikörper gespottet. Ist ein entsprechendes Toxin vorhanden, leuchten nach der Prozessierung alle Spots dieser Sorte (Replikate). Es gibt jeweils 2 verschiedene Fänger-Antikörper für Ricin und SEB, sowie 1 Fängerantikörper für BoNT/A, 1 Fängerantikörper für BONT/B und 1 Fängerantikörper der BONT/A und BONT/B erkennt.
    • • Positiv-Kontrolle (1 als 6fach-Replikat): Hier ist ein Interleukin-Antikörper (anti-IL-12 rat) gespottet, der zusammen mit dem im Biomix vorhandenen Interleukin IL12 (mouse) und einem weiterem Ratten-Interleukin-Antikörper (verschiedene Klone) einen Sandwich aufbaut. Da dieser Sandwich bei jedem Nachweis aufgebaut werden kann, dient dies als Funktionalitäts-Kontrolle. Liefert die Positivkontrolle kein Signal, darf ein negatives Testresultat nicht bewertet werden. Somit können beim Nachweis falsch negative Ergebnisse ausgeschlossen werden.
    • • Negativ-Kontrolle (4 Stück als 6fach-Replikat): Hier sind die aus Serum issolierten IgGs gespottet, die aus den für die Antikörper-Produktion immunisierten Tierspezies stammen. Bindet ein in der zu untersuchenden Probe vorhandenes Agens etwa unspezifisch an alle Antikörper einer bestimmten Tierspezies, würde auch die entsprechende Negativ-Kontrolle ein Signal ergeben. Somit können beim Nachweis falsch positive Ergebnisse ausgeschlossen werden.
  • Die Biochip-Slides werden gekühlt unter Stickstoff-Atmosphäre gelagert.
  • 3. Kartusche
    • • Zentraler Teil ist ein Spritzguß-Körper („Inlay") aus einem Cycloolefincopolymer (Zeonex, Zeonor oder Topas). Das Material ist sehr hydrophob mit einer niedrigen Oberflächenenergie, deshalb gibt es keine Probleme mit der Adsorption der biologischen Bestandteile an die Oberfläche des Reaktionsgefäßes. Eingelassen in die Oberfläche sind Strukturen, die einen Probenraum (mit optischem Fenster), einen Druckausgleichsraum, eine Befüllöffnung und Kanäle als Verbindung zwischen diesen Kompartimenten definieren.
    • • Zweiter Bestandteil ist eine flexible Leiterplatte, die eine Heizstruktur enthält, sowie einen Speicherbaustein für Kartuschen-relevante Daten und Kontaktinseln zum elektronischen Ansteuern und Auslesen der Flex-Leiterplatte im Gerät.
    • • Diese flexible Leiterplatte wird mit einem doppelseitigen biologisch verträglichen Klebeband („ARcare 8932” von Adhesives Research) verklebt, der Biochip auf der Heizstruktur platziert und die Flex-Leiterplatte mit dem Inlay verklebt. Die Strukturen im Inlay ergeben somit einen hermetisch abgeschlossenen, den Biochip enthaltenden Innenraum, der über die Flex-Heizstruktur temperierbar ist.
    • • Das Inlay wird in zwei Halbschalen aus Kunststoff-Spritzguss aufgenommen, dies ergibt zusammen die Kartusche. In die optikseitige Halbschale ist eine quadratische Blendenöffnung eingelassen, die zu dem im Probenraum befindlichen Biochip zentriert ausgerichtet ist. Auf der Außenseite der Halbschalen befinden sich Strukturen, die eine einfache und genaue automatische Positionierung der Kartusche beim Einlegen in das Gerät gewährleisten.
  • 4. Biomix-Tube
  • Der Biomix enthält die Detektionsantikörper, die PBS-Pufferbestandteile und Trehalose. Eine Mischung von 40 μl Wasser, das 10 mM PBS, 100 mM Trehalose und 0,5% BSA enthält, mit 4 Cy5-gelabelten Detektionsantikörpern (2–15 μg/ml), dem Cy5-gelabelten Interleukin-12-Antikörper (2 μg/ml) und Interleukin-12 (400 ng/ml) wird direkt in Eppendorf-Tubes lyophilisiert.
    DAK Antigen Antikörper
    R1 Ricin 1-RK1
    B8 BoNT/A 1688.2
    B14 BoNT/A Horse anti-A, B + E
    S9 SEB 2S4 (S222)
    P12 IL-12 anti-IL-12 (rat)
  • Auch hier ist wiederum Trehalose enthalten, um die Belastung der Antikörper durch den Lyophilisierungsvorgang zu minimieren sowie die Haltbarkeit des Lyophilisats zu gewährleisten.
  • 5. Assay-Puffer
  • Der Assay-Puffer besteht aus Wasser und 0,5% Triton-X. Er wird gebraucht, um das Lyophilisat vor der Probenzugabe zu rekonstituieren. Das Triton-X als nicht-ionisches Detergenz bewirkt die rasche Auflösung des Lyophilisats (Trehalose = ungeladenes Disaccharid) und in der befüllten Kartusche ebenfalls die rasche Auflösung der eingetrockneten Spots.
  • 6. Gerät
  • Das Gerät enthält einen eingebauten Kompakt-PC mit einer Software, welche vollautomatisch alle Komponenten des Gerätes steuert und die über den eingebauten Bildschirm bedienbar ist.
  • Hinter einer Frontklappe befindet sich eine Öffnung, um die Kartusche aufzunehmen. Um diese Kartuschenaufnahme herum ist ein opto-elektromechanisches Modul aufgebaut, welches die Temperierung des Probenraumes während der Prozessierung, das Andrücken des Biochips and das optische Fenster und die Bildaufnahme im Fluoreszenzkanal bewerkstelligt.
  • Bei Benutzung der auf dem Gerät laufenden Endanwendersoftware beschränkt sich die Benutzerinteraktion auf das Einlegen der Kartusche und das Starten der Prozessierung per Knopfdruck. Bis zur Anzeige des Endergebnisses ist keine weitere Interaktion erforderlich. Für Assayentwicklung und Service kann das Gerät per TCP/IP extern angesteuert werden.
  • Ein geeignetes Gerät ist bespielsweise von der Firma Zenteris GmbH käuflich erhältlich.
  • 7. Ablauf der Anwendung im Detail (Untersuchung einer Probe)
    • • Bereitstellung von Reagenzien (Biomix-Tube, Assay-Puffer), Gilson Microman-Pipette 100 μl, Pipettenspitze, Kartusche, Start des Gerätes
    • • Rekonstitution des lyophilisierten Biomixes mit 20 μl Assay-Puffer.
    • • Zugabe von 20 μl Probe (Probenmatrix: Wasser) zum Biomix, ⇒ Mischen
    • • Applikation der 40 μl mit der Pipette in die Kartusche
    • • Frontklappe öffnen, einlegen der Kartusche ins Gerät, Frontklappe schließen
    • • Start der Prozessierung, typische Prozessparameter sind: Inkubation für 30 min bei 37°C.
    • • Nach abgeschlossener Inkubation wird der Biochip ans optische Fenster gedrückt, und ein Bild im Fluoreszenzkanal aufgenommen. Typische Belichtungszeit: 10 sec.
    • • Hat das Gerät ein Bild erzeugt, beginnt die automatisierte Auswertung durch die Software. (18, 19) – Auffinden der Markerspots. – Alignment des Array Layouts anhand der Markerspots. – Auffinden der Antikörperspots anhand des platzierten Array Layouts. – Berechnung der Signalintensitäten jedes Spots (Medianwert). – Berechnung der Signalintensitäten des lokalen Hintergrunds jedes Spots (Median). – Differenzbildung Signal – Hintergrund. – Klassifizierung der Spotqualität. „Zweifelhafte" Spots werden von der weiteren Auswertung ausgeschlossen. – Zusammenfassung aller Replikate einer Antikörpersorte durch Mittelwertbildung – Zusammenfassung aller Antikörper eines nachzuweisenden Antigens durch Mittelwertbildung – Bewertung der Positiv- und Negativkontrollen für eine Aussage über die Validität des Nachweises: werden Toxine detektiert, muss die Negativkontrolle negativ sein, werden keine Toxine detektiert, muss die Positivkontrolle aktiv sein. – Die Signalhöhe des nachzuweisenden Antigens muss einen bestimmten Schwellenwert (assay-spezifisch, bei der Entwicklung eruiert) überschreiten und statistische Kriterien erfüllen, um als Positivnachweis zu gelten. – Dann wird dieses Ergebnis auf dem Bildschirm angezeigt. – Auswertung der Ergebnisse (20)
  • Der Vorteil des angewendeten Verfahrens gegenüber allen anderen bekannten Verfahren besteht darin, dass nach dem Start der Prozessierung keine weitere Interaktion mehr notwendig ist.
  • Beispiel 2: Zeitkinetik Rizindetektion
  • Die Durchführung des Experiments ist prinzipiell wie in Beispiel 1 beschrieben. Die gewählten Versuchsbedingungen sind:
  • Für alle 3 Experimente gleich:
    • • Detektionsantikörperansatz (lyophilisiert):
  • R1 (Endkonzentration 9 μg/ml)
    B8 (Endkonzentration 1,5 μg/ml)
    B14 (Endkonzentration 7,5 μg/ml
    S9 (Endkonzentration 1,9 μg/ml)
    Anti Interleukin 12 rat (Endkonzentration 3 μg/ml)
    Interleukin 12 (Endkonzentration 400 ng/ml)
    • • Lyophilisat in 0,5% Triton-X in dest. Wasser
    • • Zugabe von Rizin RCA 60 (Endkonzentration 100 ng/ml)
    • • 40 μl in Kartusche, Inkubation bei 37°C. Variation der Inkubationszeit: 10, 20, 30 Minuten
    • • Bildaufnahme und Ermitteln der Signalintenstität der Rizin-Fängerantikörper. Mitteln der Intensität (Median).
  • Die Ergebnisse sind in 21 gezeigt.
  • Beispiel 3: 4-Plex Assay
  • Leer Experiment:
    • • Detektionsantikörperansatz (frische Lösungen, keine Lyophilisat)
  • R1 (Endkonzentration 9 μg/ml)
    B8 (Endkonzentration 3 μg/ml)
    B14 (Endkonzentration 8,25 μg/ml
    S9 (Endkonzentration 1,2 μg/ml)
    • • Zugabe von PBS/0,5%BSA, Triton X-100 (0,25%)
    • • 40 μl in Kartusche, Inkubation bei 37°C, Inkubationszeit: 30 Minuten
    • • Bildaufnahme
  • 4-Plex Assay:
    • • Detektionsantikörper ansatz (frische Lösungen, keine Lyophilisat)
  • R1 (Endkonzentration 9 μg/ml)
    B8 (Endkonzentration 3 μg/ml)
    B14 (Endkonzentration 8,25 μg/ml
    S9 (Endkonzentration 1,2 μg/ml)
    Anti Interleukin 12 rat (Endkonzentration 1,25 μg/ml)
    Interleukin 12 (Endkonzentration 400 ng/ml)
    • • Zugabe von PBS/0,5%BSA, Triton X-100 (0,25%)
    • • Zugabe von RCA 60 (Endkonzentration 1 μg/ml), SEB (Endkonzentration 1 μg/ml), BONT A Komplex (Endkonzentration 1 μg/ml), BONT B Komplex (Endkonzentration 1 μg/ml)
    • • 40 μl in Kartusche, Inkubation bei 37°C, Inkubationszeit: 30 Minuten
    • • Bildaufnahme
  • Der 4-Plex Nachweis liefert vergleichbare Ergebnisse mit Rizin Rohextrakt, SEB, BONT A und BONT B Kulturüberständen.
  • Die Ergebnisse sind in 22 gezeigt.
    • 1
    Grundkörper
    1.1
    transparenter Grundkörper
    1.2
    nichttransparenter Grundkörper
    2
    Ausgleichsraum
    3
    Kontrollfenster
    4
    Ausgleichskanal
    5
    Reaktionsraum
    5.1
    ausgeleuchtete Fläche
    5.2
    Probenflüssigkeit
    6
    Biochip
    6.1
    Reaktionsfelder (Spots)
    6.2
    Rückbeschichtung
    7
    Befüllkanal
    8
    Rückschlagventil
    9
    Befüllöffnung
    10
    Flex-LP
    10.1
    Kontaktflächen Flex-LP
    10.2
    Speichermedium
    10.3
    Heizstruktur Flex-LP
    11
    Inlay
    12
    Stößel
    13
    Substratträger mit Heizelement
    14
    Detektionsebene
    15
    Beobachtungsfenster
    16
    Haftverbindungsschicht
    17
    Trägerschicht
    18
    Blende (nicht transparent)
    19
    Einfüllkanüle
    20
    Druckausgleichskanüle
    21
    Temperaturhomogenisierungsschicht
    22
    Dichtung
    23
    Deckglas
    24
    Stabilisierungsscheibe
    25
    Kartuschengrundkörper
    26
    Flüssigkeitsüberstand
    27
    Optikmodul
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • - WO 02/090983 A2 [0009]
    • - EP 2007/056420 [0050]
    • - EP 2007/056430 [0050]
    • - DE 102004022263 A1 [0052, 0057]
    • - EP 2007/054823 [0056]

Claims (8)

  1. System zum immunologischen Nachweis mehrerer Substanzen nebeneinander, das folgendes aufweist: – Biotestmix-Tube enthaltend einen für den Nachweis notwendigen Detektions-Bindungspartner und Pufferbestandteile in lyophilisierter Form, – Einmal-Kartusche aufweisend – einen Reaktionsraum in dem sich ein Biochip (Microarray) auf dem Fänger-Bindungspartner in Form von definierten Reaktionsfeldern (Spots) aufgebracht sind, befindet – eine Temperiervorrichtung zur Einstellung unterschiedlicher Temperaturen und deren schnelle Änderung im Reaktionsraum – ein Detektionsfenster durch das eine optische Detektion der Spots auf dem Biochip, nach erfolgter Immunreaktion, mit einem Optikmodul erfolgt.
  2. System nach Anspruch 1, wobei der Biotestmix-Tube weiter ein Detergenz, ein Protein und eine Positivkontrolle in lyophilisierter Form enthält.
  3. System nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Detektions-Bindungspartner ein gegen die nachzuweisende Substanz gerichteter Antikörper ist.
  4. System nach Anspruch 3, wobei der Antikörper mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert ist.
  5. System nach Anspruch 3, wobei der Antikörper biotinyliert ist und der Biotest-Mix weiter ein mit einer Markierung versehenes Streptavidin enthält.
  6. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Fänger-Bindungspartner ein Antikörper ist.
  7. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die nachzuweisenden Substanzen Proteine, Liganden, Rezeptoren, Viren, Bakterien, Medikamente, chemische Substanzen, Mykotoxine oder Toxine sind.
  8. Verfahren zum immunologischen Nachweis mehrerer Substanzen nebeneinander unter Verwendung des Systems gemäß einem der Ansprüche 1–7, aufweisend die folgenden Schritte: – eine Probe, die die nachzuweisenden Substanzen enthält, wird in den mit Puffer rekonstituierten Biotestmix-Tube gegeben, – diese Mischung wird in den Reaktionsraum der Kartusche eingebracht, – die Kartusche wird in ein geeignetes Gerät eingelegt und der Inkubations-Prozess gestartet, – nach abgeschlossener Inkubation wird der Biochip an das Detektions-Fenster gedrückt, und ein Bild mittels Optikmodul aufgenommen, – eine in dem Gerät vorhandene Software wertet unter Anwendung des Biochip-Layouts die Spotintensitäten aus und liefert eine Aussage über die Anwesenheit der nachzuweisenden Substanzen in der Probe.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012204413A1 (en) * 2011-01-05 2013-08-15 Zeus Scientific, Inc. Diagnostic methods
US8609355B2 (en) * 2011-07-26 2013-12-17 Indicator Systems International, Inc. Assays for the detection of microbes
EP3401665A1 (de) * 2017-05-12 2018-11-14 University College Dublin National University Of Ireland, Dublin System und vorrichtung zur analyse eines bestimmten materials in flüssigen proben durch optische mikroskopie
CN107619886A (zh) * 2017-11-06 2018-01-23 厦门华侨亚热带植物引种园 一种提高ic‑rt‑pcr技术检测能力的方法
CN110716046B (zh) * 2018-07-11 2023-03-28 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种基于温差的加速固相免疫反应技术
CN110736844A (zh) * 2019-12-07 2020-01-31 南京岚煜生物科技有限公司 一种心肌肌钙蛋白的检测方法
CN113720818B (zh) * 2021-08-27 2023-11-14 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 一种荧光免疫检测系统
CN115356479B (zh) * 2022-08-24 2023-11-28 厦门宇昊软件有限公司 一种金免疫层析检测方法和系统
CN117065816B (zh) * 2023-09-22 2024-01-30 北京芯迈微生物技术有限公司 一种微流控芯片及其检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002090983A2 (de) 2001-05-10 2002-11-14 Medsystems Diagnostics Gmbh Quantitaver einschritt immuntest in lyophilisierter form
DE102004022263A1 (de) 2004-05-06 2005-12-15 Clondiag Chip Technologies Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen
WO2007051861A1 (en) * 2005-11-04 2007-05-10 Clondiag Gmbh Device and method for the detection of particles
DE102005052713A1 (de) * 2005-11-04 2007-05-16 Clondiag Chip Tech Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4584268A (en) * 1981-10-13 1986-04-22 Ceriani Roberto Luis Method and compositions for carcinoma diagnosis
IL147227A0 (en) * 1999-07-02 2002-08-14 Clondiag Chip Tech Gmbh Microchip matrix device for duplicating and characterizing nucleic acids
US6653062B1 (en) * 2000-07-26 2003-11-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Preservation and storage medium for biological materials
US7723123B1 (en) * 2001-06-05 2010-05-25 Caliper Life Sciences, Inc. Western blot by incorporating an affinity purification zone
WO2003065146A2 (en) * 2002-01-25 2003-08-07 Applera Corporation Methods for placing, accepting, and filling orders for products and services
US20040137607A1 (en) * 2003-01-09 2004-07-15 Yokogawa Electric Corporation Biochip cartridge
EP2000481B1 (de) * 2003-02-01 2016-03-30 Tanox, Inc. Hochaffine Antikörper gegen menschliches IgE
DE10315074A1 (de) * 2003-04-02 2004-10-14 Clondiag Chip Technologies Gmbh Vorrichtung zur Vervielfältigung und zum Nachweis von Nukleinsäuren
US8916348B2 (en) 2004-05-06 2014-12-23 Clondiag Gmbh Method and device for the detection of molecular interactions
EP1888235A1 (de) * 2005-06-06 2008-02-20 Decision Biomarkers Incorporated Auf flüssigkeitsstrom über anordnungen basierende assays
DE102006023945A1 (de) 2006-05-18 2007-11-22 Jenoptik Instruments Gmbh Verfahren und optisches Modul zum Auslesen von Biochips
DE102006056540A1 (de) * 2006-11-28 2008-05-29 Zenteris Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur Untersuchung von biologischen und medizinischen Proben

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002090983A2 (de) 2001-05-10 2002-11-14 Medsystems Diagnostics Gmbh Quantitaver einschritt immuntest in lyophilisierter form
DE102004022263A1 (de) 2004-05-06 2005-12-15 Clondiag Chip Technologies Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen
WO2007051861A1 (en) * 2005-11-04 2007-05-10 Clondiag Gmbh Device and method for the detection of particles
DE102005052752A1 (de) * 2005-11-04 2007-05-10 Clondiag Chip Technologies Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen
DE102005052713A1 (de) * 2005-11-04 2007-05-16 Clondiag Chip Tech Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen

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Publication number Publication date
US9229000B2 (en) 2016-01-05
WO2009056350A1 (de) 2009-05-07
DE112008002776A5 (de) 2010-09-16
US20100285986A1 (en) 2010-11-11

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