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Die
Erfindung bezeichnet ein Verfahren und ein optisches Modul zum Auslesen
von Biochips.
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Der
Biochip (1), ein fingernagelgroßes Mikrolabor
mit zahlreichen winzigen Reaktionsfeldern ist das wichtigste Zukunftswerkzeug
für die
Analyse biologischer Proben.
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Auf
einem Biochip lässt
sich innerhalb kürzester
Zeit eine Probe auf das Vorhandensein einer Vielzahl nachzuweisender
Moleküle überprüfen.
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Die
Detektion des Biochips erfolgt optisch. In jedem Reaktionsfeld des
Biochips ist ein bekanntes Fängermolekül auf der
Chipoberfläche
fixiert, welches sich nur mit jeweils einem bestimmten Molekül aus der
zu untersuchenden Probe verbindet. Durch die chemische Kopplung
von Farbstoffen an die Probenmoleküle kann mit Hilfe eines optischen
Lesegerätes,
dem Biochip-Reader, festgestellt werden wo eine Bindung stattgefunden
hat.
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Auf
einem Biochip mit der Größe von einigen mm2 sind M×N
Spots Sn mit biologischen Informationen
aufgebracht. Diese Spots enthalten fluoreszierende Farbstoffe mit
unterschiedlichen Konzentrationen K (einschließlich K = 0). In einem so genanntem Biochipreader
soll die Anzahl der Farbstoffmoleküle auf den Spots vermessen
und bewertet werden.
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Der
Biochip mit den fluoreszierenden Spots wird dabei mit Anregungslicht
der Wellenlänge λE bestrahlt.
Die fluoreszie renden Spots senden Fluoreszenzlicht der Wellenlänge λF ab.
Mit einer Kamera wird das Bild des Biochips mit den M×N Spots
detektiert. Eine geeignete Software wertet das Bild bezüglich der
Fluoreszenzintensitäten
der Spots aus. Ziel ist es, eine ja/nein-Detektion der fluoreszierenden Spots
vorzunehmen. Damit erhält
man eine Aussage darüber
ob Farbstoffmoleküle
in den Spots enthalten sind. Weiterhin kann auch eine quantitative
Aussage über
die relative Anzahl der Farbstoffmoleküle und damit auch der Probenmoleküle getroffen
werden, indem die Fluoreszenzintensität der Spots detektiert wird.
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Bei
der Fluoreszenz handelt es sich um einen lichtschwachen Prozess.
Die Intensität
der Fluoreszenzstrahlung ist abhängig
von der Anzahl der auf dem Spot gebundenen Farbstoffe, von der Art
der Farbstoffe, von der Wellenlänge
der Beleuchtung λE und von der Beleuchtungsintensität I.
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Wird
ein flächenhafter
Detektor eingesetzt, z.B. ein Kamerachip mit R×C Pixeln, dann wird das gesamte
Biochip mit den fluoreszierenden Spots auf dem Kamerachip abgebildet.
Die Anregung der Spots auf dem Biochip erfolgt mittels einer oder
mehreren Hochleistungslichtquellen und der Ausfilterung der gewünschten
Anregungswellenlänge λE mittels Anregungssfilter.
Die Ausleuchtung des Objektes muss homogen erfolgen. Dazu benötigt man
voluminöse
Optiken und die Effizienz der Ausleuchtung wird gering. Nach der
Anregung der Spots wird das komplette Fluoreszenzbild des Biochips
mit einer Kamera detektiert. Die Belichtungszeit kann relativ groß gewählt werden
(einige Sekunden) und die optische Leuchtdichte auf dem Objekt kann
entsprechend gering ausfallen. Der Beleuchtungszeit sind durch die Kamera
allerdings Grenzen gesetzt. Abhängig
von der Kameratemperatur steigt das Dunkelrauschen und die Anzahl
der defekten Pixel mit zunehmender Belichtungszeit stark an. Mit
einer lichtstarken Ausleuchtung kann die Belichtungszeit der Kamera
reduziert werden und eine aufwändige
Kamera-Chipkühlung
entfällt.
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Für große Biochipflächen F kann
der Biochip auch mechanisch verschoben werden (z.B. mit einem y-x-Tisch)
und die n Einzelbilder der Teilflächen Fn werden
mit geeigneter Software aneinandergefügt.
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Bekannt
ist in diesem Zusammenhang der Array WoRx-Biochip Reader von Applied
Precision. Das Licht einer Halogenlampe wird in mehrere optische
Fasern eingekoppelt. Durch die Gestaltung eines Faserringes mit
diesem Faserbündel
kann eine homogene Ausleuchtung einer kleinen (1,4 mm2)
Fläche
erfolgen. Da der gesamte Biochip größer als die beleuchtete Fläche ist,
erfolgt nach der mechanische Positionierung des Biochips die Aufnahme
eines Teilbildes mit einer CCD-Kamera. Die Einzelbilder werden später zu einem
Gesamtbild zusammengesetzt. Ein Filterrad separiert die Fluoreszenzwellenlänge. Der
Nachteil dieses Verfahrens und Anordnung besteht insbesondere in
der voluminösen
Halogenlampe mit geringer Lebensdauer. Zudem hat man es hier mit
einem aufwändigem
mechanischen Verfahrsystem durch Zusammensetzen der Bilder zu tun.
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Bekannt
sind auch die Verwendung einer Avalanche Photo Diode (APD) oder
Photomultiplier Tube (PMT) als Detektor.
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Der
andere Extremfall einer Detektion besteht in der Erzeugung von sehr
kleinen Punkten mit sehr hohen optischen Leuchtdichten auf dem Biochip.
Der komplette Biochip wird mit geeigneten Mitteln abgescannt. Die
Abtastung erfolgt entweder über eine
mechanische Biochipbewegung oder über die optische Ablenkung
des Abtaststrahls über
das Objekt. Das von dem Bildpunkt ausgesandte Fluoreszenzlicht wird über eine
Abbildungsoptik auf einen Detektor abgebildet. Als Detektor kann
ein hochempfindlicher Detektor (APD, PMT) eingesetzt werden. Da
bei diesem Verfahren von N·M
Objektpunkten die Fluoreszenzintensitäten bestimmt werden, müssen die
Belich tungszeiten sehr klein sein, um in endlicher Zeit den komplette
Biochip zu detektieren. Der Detektor detektiert dann ein Signal
S(t). Über
die Zeit t wird das detektierte Signal S(t) anschließend zu
einem Intensitätsbild
I(x, y) des Biochips zusammengesetzt. In diesem Verfahren werden
in der Regel Punktlichtquellen verwendet. Diese können auf
einen kleinen Objektpunkt abgebildet werden. Für diese Art der Beleuchtung
werden vorrangig Laserlichtquellen eingesetzt. Die Laserwellenlänge muss
im Spektrum der Anregungswellenlänge
liegen.
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Bekannt
sind dabei der GeneChip-Scanner von Affymetrix, z.B. Scanner 3000;
GMS 417 Scanner von Affymetrix oder der Microarray Scanner von Perkin
Elmer distributed by Amersham Biosciences bzw. der GenePix 4100
von Axon.
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Das
kollimierte Licht eines Lasers wird über einen mechanischen x-y-Scanner
und eine Fokussieroptik auf den feststehende Biochip fokussiert.
Das Fluoreszenslicht wird von einem PMT zeitauflösend detektiert, und die Intensitäten I(t)
werden den Bildpunkten zugeordnet.
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Nachteile
dieser Ausführungen
sind sein sehr aufwändiges
mechanisches x-y-scanning System. Zudem sind ein Autofocus und Positionskontrolle
erforderlich. Das System ist relativ langsam.
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Ein
Sonderfall bildet die Verwendung einer CCD-Zeile als Detektor. Zur
optischen Anregung der Spots auf dem Biochip wird eine Laserlinie
auf den Biochip abgebildet. Das erfolgt mit geeigneten Linienoptiken.
Das Fluoreszenzlicht der Spots auf dieser Laserlinie wird auf eine
CCD-Zeile abgebildet. Die Erzeugung einer Linie und die Abbildung
der fluoreszierenden Linie auf die CCD-Zeile erfordern großen optischen
Aufwand. Kleine Linienbreiten sind nur schwer zu realisieren.
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In
Readern die nach dem TIRF-Verfahren (Total Internal Reflection Fluorescene)
arbeiten, wird ein Laserstrahl in die Glasplatte auf der sich die
biologischen Proben befinden eingekoppelt. Durch den optischen Tunneleffekt
strahlt das Licht einige nm aus der Glasplatte hinaus. Damit werden
die auf der Glasplatte gebundenen und markierten biologischen Proben
zum Fluoreszieren angeregt. Dies ist zum Beispiel beim TIRF-Biochipreader
der Fraunhofer IPM Freiburg der Fall.
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Nikon
verwendet zur Objektausleuchtung in optische Fasern eingekoppelte
Halogenlampen. Die Fasern gibt es auch als Ringausführung zur
homogeneren Beleuchtung. Solche Systeme zur Ausleuchtung haben ein
Gewicht von > 5 kg
bei einer Lebensdauer von ca. 100 h.
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Wenn
mit dem Ausgangslicht aus der Faser der Biochip direkt beleuchtet
werden soll, kann dies nur unter einem Winkel erfolgen damit die
Faser außerhalb
des Auslesestrahlengangs liegt. In Monomodefasern weist die Ausgangsstrahlung
ebenfalls ein Gaußprofil
auf und in Multimodefasern (Stufenindex- oder Kunststofffasern) erzeugt die
Kohärenz
der Lichtquelle Modenkonversionen in der Faser die zu schwankenden
Strahlprofilen führen.
Außerdem
führt die
große
NA des Ausgangsstrahls zu aufwändigen Optiken.
Wird die optische Stufenindexfaser über eine abbildende Optik und
einen dichroitischen Spiegel auf das Objekt abgebildet, wirkt sich
die hohe Numerische Apertur (NA) der Faser (NA ≈ 0,5) nachteilig auf die optische
Abbildung aus. Wird eine Laserlichtquelle verwendet, muss das „speckle"-Rauschen, verursacht
durch eine Vielzahl von geführten Moden
in der Faser, mit geeigneten Mitteln verhindert werden.
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Der
Einsatz von Festkörperlasern
bietet jeweils nur ein begrenztes Spektrum λE für die Anregungswellenlänge und
ist sehr kostenintensiv. Laserdioden sind in verschiedenen Spektralbereichen
verfügbar,
auch mit Leistungen ≥ 100
mW, aber das Strahlprofil muss ebenfalls mit geeigneten Optiken gewandelt
werden um eine homogene Objektausleuchtung zu erreichen. Die Effizienz
geht dabei deutlich zurück.
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GeneXpert,
der Smart Cycler von Cepheid, weist biologische Moleküle in einem
Probenraum (disposable tube) nach. Dieses Gerät arbeitet mit mehreren LED
(max. 4 LED) zur multispektralen Anregung. Dabei soll die LED-Strahlung
nicht auf einer Fläche
homogen abgebildet werden sondern ein Volumen (disposable tube)
ausleuchten. Dazu sind gegenüber
der LED optische Reflektoren angebracht die eine gewisse optische
Durchmischung im Volumen vornehmen. Als Detektoren werden Fotodioden mit
entsprechend vorgeschalteten Bandpassfiltern verwendet. Diese detektieren
kein Fluoreszenzbild sondern werten das ganze Probenvolumen bezüglich Fluoreszenz
aus. Das ist auch der entscheidende Nachteil dieses Verfahrens.
Im Probenvolumen kann nur eine einzige Molekülart detektiert werden. Eine Vervierfachung
kann erreicht werden, wenn die 4 Farbkanäle unterschiedliche Biomoleküle detektieren.
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Weitere
Nachteile der vorhandenen Technik lassen sich wie folgt zusammenfassen:
In
der Fluoreszenzmikroskopie und in Biochipreadern werden HBO oder
XBO als Lichtquelle verwendet. Damit ist eine bestimmte Baugröße vorgegeben. Die
Beleuchtungseffizienz im interessierenden Spektralbereich ist gering,
weil aus dem breitbandigen Strahlungsspektrum der Lichtquelle nur
ein kleiner Bereich λE zur Ausleuchtung verwendet wird und die abbildende
Optik nur kleine NA verkraftet.
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Außerdem sind
diese voluminös
und teuer. Die Wärmequelle
Lampe hat zudem eine geringe Lebensdauer.
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Mit
einem Laser geeigneter Wellenlänge (passend
zur Anregungswellenlänge
des verwendeten Farbstoffes) können
hohe optische Leistungsdichten auf dem Objekt erzielt werden.
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Vorzugsweise
setzt man Laserdioden ein. Diese stehen in einem großen Frequenzspektrum
zur Verfügung,
haben eine hohe optische Leistung, sind klein, preiswert und entwickeln
wenig Wärme.
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Mit
einem Laser kann auf kleinen Flächen eine
hohe optische Leistungsdichte erzeugt werden. Die homogene Ausleuchtung
eines Biochips ist mit Lasern aber nur schwer zu erreichen. Laser
haben eine Gauß-
oder gaußähnliche
Abstrahlcharakteristik, so dass die Ausleuchtung ebenfalls ein Gaußprofil
aufweist. Zur Homogenisierung sind aufwändige optische Strahlumformungen
mit Strahlwandlern notwendig. Diese meist diffraktiven Strahlwandler
müssen
speziell an das Laserdesign angepasst werden. Bei Laserdioden kommt
noch ein elliptisches Strahlprofil erschwerend hinzu, so dass mehrstufige
Strahlformer eingesetzt werden müssen.
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Außerdem stört bei der
Ausleuchtung mit Lasern häufig
die Kohärenz
der Laserquelle bei Reflexionen an Glasflächen was zu Interferenzerscheinungen
und zum „speckle"-Rauschen führt.
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Ähnliche
Probleme gibt es bei der Beleuchtung des Objektes mit Hilfe optischer
Fasern.
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Aus
US 6,620,623 B1 ist
eine homogene Ausleuchtung eines Biochips mit seitlich angebrachten
Faserarrays bekannt. Hierbei wird versucht das Problem der inhomogenen
Ausleuchtung von Biochips zu umgehen. Dabei wird das Licht einer
Lichtquelle (LED oder Laser) in Faserbündel eingekoppelt. Die Enden
der Fasern werden dabei in einem Linsenarray angeordnet. Dieses
Faserarray wird an die Seitenfläche
des Biochips angebracht. Nach sehr kurzem optischen Weg im Biochip
erfolgt eine gute Durchmischung und damit eine gute Homogenisierung
der Ausleuchtung. Die Nachteile bestehen insbesondere darin, dass
die Justierung des einzulegenden Biochips zum Faserarray sehr aufwändig ist. Zudem
müssen
die Außenseiten
des Biochips frei zugänglich
sein.
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Deshalb
können
nur fertig prozessierte Biochips detektiert werden. Eine Prozessierung
auf dem Biochip ist nicht möglich.
Aus
US 6,403,970 B1 ist eine
Beleuchtung mit LED-Matrix und Mikrolinsenarray bekannt. Es wird
eine LED-Matrix, bestehend aus N·M Einzel-LED zur Beleuchtung
von N·M
Spots auf dem Biochip verwendet.
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Die
Strahlung der N·M
LEDs wird mittels eines Linsenarrays, bestehend aus N·M Einzellinsen auf
das Biochip abgebildet. Das von den N·M Spots ausgehende Fluoreszenzlicht
wird mit einem zweiten Linsenarray, bestehend aus N·M Einzellinsen
auf einen Detektor (PMT, APD, pin-PD) dargestellt.
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Die
LED werden seriell angesteuert: LED1 auf Spot 1, dann LED2 auf Spot
2, .... usw.
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Der
Detektor detektiert den zeitlichen Intensitätsverlauf I(t) und ein Rechner
ordnet die Intensitäten
den Spots zu. Nachteile dieser Methode sind insbesondere die sehr
aufwändige
Justierung LED-Linsenarray 1 – Biochip (Spots) – Linsenarray 2.
Es muss in Transmission gearbeitet werden, das heißt auf dem
Biochip können
kein Heizer oder andere Features angebracht werden. Eine Prozessierung
ist nicht möglich.
Es kann kein echtes Bild vom Spot gemacht werden, es gibt nur eine
Gesamtintensität
vom Spot. Das Anbringen von Filter in dieser Anordnung ist schwierig.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es eine robuste, kompakte, langlebige
und kostengünstige
optische Einheit zum Auslesen von Biochips zu schaffen, auf dem
sich fluoreszierende Spots mit biologischen Informationen befinden,
die die bekannten Nachteile des Standes der Technik beseitigen und eine
ausreichende homogene und lichtstarke Ausleuchtung des Biochips
bieten.
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Die
Aufgabe wird durch ein Optikmodul und ein Verfahren gelöst bei dem
das Optikmodul bestehend aus einem optischen Beleuchtungskanal mit
einer Lichtquelle, vorzugsweise einer LED mit geeigneter LED-Optik
als Lichtquelle zur homogenen Ausleuchtung verwendet wird, die den
Biochip ausleuchtet,
einem optischen Auslesekanal in dem das
Fluoreszenzlicht der Spots vom Biochip auf eine Kamera abgebildet
wird,
einem dichroitischen Spiegel zur Separierung des optischen
Beleuchtungskanals vom optischen Auslesekanalkanal,
geeigneten
Filtern die das Licht der Lichtquelle im optischen Beleuchtungskanal
spektral selektieren und das zu detektierende Fluoreszenzlicht im
Auslesekanal vom Anregungslicht spektral trennen,
mindestens
einer Blende zur Minimierung der optischen Abbildungsfehler bei
der Abbildung der Spots sowie geeigneter optischer Abbildungselemente.
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Die
Aufgaben die das erfindungsgemäße Verfahren
und das erfindungsgemäße Optikmodul
im Biochipreader löst
sind:
- – die
homogene und lichtstarke Ausleuchtung des Biochips mit einer dem
Farbstoff angepassten Wellenlänge λE in
einem Beleuchtungskanal
- – die
optimale Abbildung des Biochips auf eine Kamera, zum Beispiel eine
CCD-Kamera, mit einer optimalen Einstellung aus großer NA (hohe Lichtstärke, große Abbildungsfehler)
und kleiner NA (niedrige Lichtstärke,
kleine Abbildungsfehler) im Auslesekanal.
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Die
zu untersuchenden fluoreszierenden Spots auf dem Biochip werden
mit dem Anregungslicht der Wellenlänge λE ausgeleuchtet.
Das Fluoreszenzlicht mit der Wellenlänge λF der
leuchtenden Spots wird mittels geeigneter Abbildungsoptik auf einen
Detektor (Kamera) abgebildet. Bei Verwendung einer breitbandigen
Anregungslichtquelle (HBO, LED, ...) filtert ein Anregungsfilter
F1 zwischen der Lichtquelle und dem Biochip das gewünschte Anregungsspektrum λE aus.
Ein Emissionsfilter F2 vor dem Detektor (LCD-Kamera) separiert das
Fluoreszenzlicht vom Anregungslicht. Die geometrische Trennung von
Anregungslicht und Fluoreszenzlicht erfolgt in der Regel über einen
unter 45° angeordneten
dichroitischen Spiegel.
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Die
Signalgröße E der
Spot-Detektion hängt dabei
ab von:
- – der
Intensität
und der Wellenlänge
der Biochipausleuchtung: I(λE)
- – der
Anteil des Fluoreszenzlichtes der von den fluoreszierenden Spots
zur Kamera (CCD-Kamera) gelangt (NA der Empfangsoptik)
- – der
Transmission des Anregungsfilters T(F1)
- – der
Transmission des Emissionsfilters T(F2)
- – dem
Wirkungsgrad der Kamera·η (CCD)
- – der
Transmission der verwendeten Optiken To
- – der
Fluoreszenzeffizienz des Farbstoffes·η (Farbstoff)
- – der
Anzahl der Farbstoffmoleküle
auf den Spots N
E = I(λE)·NA·T(F1)·T(F2)·η(CCD)·To·η(Farbstoff)·N
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Die
Qualität
der Abbildung (Kontrast und Auflösung)
der Spots auf der Kamera ist abhängig
von der verwendeten Abbildungsoptik, dem Rauschen der Kamera, der
Numerischen Apertur im Auslesestrahlengang und von der Größe der abzubildenden Spots
auf dem Biochip. Ausgehend von Anzahl N·M der zu detektierenden Spots
auf dem Biochip mit der Fläche
F, wird die maximal mögliche
Spotgröße Amax bestimmt. Möglich sind z.B. Spotgrößen A von
16 μm·16 μm, 32 μm·32 μm und 64 μm·64 μm oder auch andere
Größen.
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Wenn
man annimmt, dass zwischen den Spots eine Spotbreite frei bleibt,
ergibt sich: Amax = F/(4·N·M)
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Bei
einer Biochipgröße von F ≈ 2·2 mm2 und einer Spotzahl von N·M = 1000
kann eine maximale Spotgröße von A
= 32 μm·32 μm verwendet
werden.
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Bei
einer Biochipgröße von F ≈ 2·2 mm2 und einer Spotzahl von N·M = 4000
kann eine maximale Spotgröße von A
= 16 μm·16 μm verwendet
werden.
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Die
zu detektierende Chipfläche
F, die Abbildungsoptik im Auslesekanal, die Größe des Kamerachips, die Anzahl
der Kamera (CCD)-Pixel und die Spotgröße A müssen zueinander angepasst werden.
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Entsprechend
der minimalen Spotgröße (z.B.
32 μm·32 μm) muss die
Ausleseoptik eine bestimmte Güte
aufweisen um diese Spots auf der LCD-Kamera mit einem guten Kontrastverhältnis auflösen zu können. Kamera-Objektive
sind für
diesen Fall nicht optimal, da diese vor allem Farbkorrekturen vornehmen.
Sie sind voluminös
und teuer. Ein Kamera-Objektiv wirkt nicht nur im Auslesekanal sondern auch
im Beleuchtungskanal. Eine Verkleinerung der NA dieses Objektivs
mit der Objektivblende verringert zwar die optischen Abbildungsfehler
im Auslesekanal, verringert aber auch gleichzeitig die Transmission
des Beleuchtungslichtes.
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Deshalb
ist es vorteilhaft, die Reader-Optik in zwei Teile aufzuspalten,
die Beleuchtungsoptik mit den Optiken 2 und 5 und
die Ausleseoptik mit den Optiken 5 und 9 (2). 2 zeigt
das erfindungsgemäße Optikmodul
insgesamt. 3 stellt den Beleuchtungskanal
des Optikmoduls dar. 4 zeigt den Auslesekanal des
Optikmoduls. Dabei wird die Optik 5 erfindungsgemäß im Beleuchtungs-
und im Auslesestrahlengang verwendet und mit einer hohen NA ausgeleuchtet.
Eine spezielle Ausführung
der Beleuchtungsoptik mit 2-Linsen.LED-Optik 2 (2a, 2b), 2-Linsen-Beleuchtungsoptik 5 (5a, 5b)
und eine 2-Linsen-Ausleseoptik 9 (9a, 9b)
ist in 7 dargestellt. Die Ausleseoptik mit einfachen
Optikelementen (4 Plankonvexlinsen) 5a, 5b und 9a, 9b kann
16 μm-Strukturen bei einer
NA < 0,15 mit einem
Kontrastverhältnis > 0,6 abbilden. Der
Vorteil der geteilten Abbildungsoptik liegt dabei in der Möglichkeit
der Variation der NA im Auslesestrahlengang unabhängig vom
Beleuchtungsstrahlengang. Im Beleuchtungsstrahlengang erhöht eine
große
NA (NA > 0,5) die
Beleuchtungsstärke
auf dem Biochip, die größeren optischen
Abbildungsfehler stören
im Beleuchtungskanal nicht. Im Abbildungsstrahlengang muss die NA
unabhängig
von der Beleuchtung mit einer Blende verkleinert werden, um die
optischen Abbildungsfehler bei der Abbildung der Spots zu minimieren.
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Bei
der Auslesung von Biochips wird nicht die ausgezeichnete Homogenität der Ausleuchtung wie
in einem Fluoreszenzmikroskop benötigt. Bei der Ausleuchtung
von Biochips geht es um den Nachweis von fluoreszierenden Spots
die sich an definierten Stellen des Biochips befinden. Jeder Spot
N hat eine definierte Position PN(xN, yN) und definierte
geometrische Größe a·b. Dieser
Spot wird mit Hilfe einer Ausleseoptik auf den CCD-Chip abgebildet
und belichtet n·m
Pixel. Kleinere Inhomogenitäten
bei der Objektausleuchtung werden durch eine Mittelwertbildung der
n·m ausgeleuchteten
Pixel und durch einen Vergleich der Spots mit der Spotumgebung abgeglichen.
Erstrebenswert ist eine Homogenität besser als 5%.
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Bei
dem EV erfolgt die homogene Ausleuchtung eines Biochips mittlerer
Größe (einige
mm2) und die gleichzeitige Abbildung der
fluoreszierenden Spots auf eine LCD-Kamera mit einem erfindungsgemäßen Optikmodul.
Das Optikmodul soll neben den optischen Anforderungen kompakt, mit
geringem Stromverbrauch, langlebig und kostengünstig aufgebaut sein.
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Die
Entwicklung von LED ist weit vorangeschritten. Auf dem Markt gibt
es leistungsstarke LED mit hohem Wirkungsgrad in verschiedenen Wellenlängenbereichen.
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Die
Auswahl einer LED erfolgt für
ein Wellenlängenspektrum ΔλE der
für Fluoreszenzmessungen (z.B.
für Farbstoffe
Cy5, Cy3, Alexa, ...) benötigt
wird. LED sind klein, kompakt mit hohem Wirkungsgrad und haben eine
hohe Lebensdauer. Die Fa. Lumileds z. B. bietet eine Palette von
LED verschiedener Bauformen, Leistungen und Spektralbereiche an.
Die Abstrahlcharakteristik der LED ist aber für eine optische Abbildung nicht
angepasst. Das Problem ist deshalb die Realisierung einer homogenen
Ausleuchtung eines Biochips mit einer LED. Die ausgeleuchtete Fläche soll
ca. 3 × 3
mm2 betragen und eine Bestrahlungsstärke von > 1 mW/mm2 erzielt
werden.
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Erste
bereits genannte Aufgabe des Optikmoduls ist die homogene, lichtstarke
Objektbeleuchtung des Biochips. In anderen Branchen werden auch
LED für
eine homogene Objektausleuchtung eingesetzt. Hochleistungs-LED werden
mit speziell gestalteten Reflektoren eingesetzt. Oder eine Vielzahl
von Einzel-LED, in SMD-Technik günstig
zueinander platziert erzeugen eine homogene Ausleuchtung eines Objektes.
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Spezialreflektoren
erzeugen aus der LED-Strahlung, das im Fernfeld rotationssymmetrische
Intensitätsschwankungen
aufweist. Zudem sind diese Reflektoren auf ein spezielles LED-Design angewiesen.
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Viele
in SMD-Technik angeordnete einzelne LED (Spezialfall: Ring-Beleuchtung
mit LED) eignen sich nur für
kleine LED-Ströme und erzeugen
nicht die zur Beleuchtung von Biochips notwendige optische Leistung.
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Weiterhin
gibt es die Methode der diffusen Beleuchtung (auf eine Mattscheibe)
und der optischen Abbildung dieser beleuchteten Fläche auf
den Biochip. Je nach Körnung
der Mattscheibe wird aber ein Anteil des einfallenden Lichtes in
verschiedene Richtungen gestreut (Lambert-Strahler) und dieses Licht
steht für
die Abbildung auf das Biochip nicht mehr zur Verfügung. In
der vorliegenden Erfindung wird zum Beispiel eine Hochleistungs-LED
der Fa. Lumileds (Luxeon Star, Lambert) als Lichtquelle in einem
Optikmodul eingesetzt. Für
diese LED wird im Optikmodul eine spezielle LED-Optik zur Homogenisierung
verwendet. Die dabei erreichten Intensitätsdichten (optische Leistung/Fläche) sind > 1 mW/mm2 und übertreffen
die Bestrahlungsstärke
herkömmlicher
Lichtquellen auf kleineren Flächen
(einige mm2).
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Das
erfindungsgemäße optische
System des Optikmoduls im Biochipreader hat zwei Funktionen:
- – die
homogene Ausleuchtung des Biochips über die LED (1) die
LED-Optik (2), den Anregungssfilter 3, den dichroitischen
Spiegel (4) und die Beleuchtungsoptik (5) im Beleuchtungskanal
(3)
- – die
Abbildung des vom Biochip ausgehenden Fluoreszenzlichts auf den
Kamerachip über
die Beleuchtungsoptik (5), den dichroitischer Spiegel (4),
den Emissionsfilter (8) und die Abbildungsoptik (9)
im Auslesekanal (4)
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Die
vorzugsweise zu verwendende Leuchtdiode ist dadurch gekennzeichnet,
dass sie mindestens einen LED-Chip aufweist und mit einer Leistungsaufnahme
von mindestens 0,5 W/LED-Chip ausgebildet ist.
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Das
Optikmodul ist als kompakte Einheit ausgebildet. Die optische Abbildung
des fluoreszierenden Biochips auf den CCD-Chip mit entsprechenden Optiken soll
von hoher Güte
sein, so dass Strukturen von 16 μm × 16 μm noch mit
ausreichendem Kontrast abgebildet werden.
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Das
kompakte Optikmodul enthält
in einer besonderen Ausführung:
- – eine
LED (1) mit angegossener Kunststoffoptik (vorzugsweise
Lambert-LED)
- – eine
LED-Optik (2)
- – eine
Beleuchtungsoptik (5)
- – einen
Anregungsfilter (3)
- – einen
dichroitischen Spiegel (4)
- – eine
NA-Blende (7)
- – einen
Emissionsfilter (8)
- – eine
Ausleseoptik (9)
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Für die hohe
Intensität
wird eine Hochleistungs-LED (1) mit hoher optischer Leistungsdichte und
einer hohen NA der LED-Optik
(2) verwendet. Die LED-Optik (2) soll von der
Strahlung der LED möglichst
viel Licht „einsammeln". Dabei sollten vorzugsweise
Linsen mit einer NA > 0,5
verwendet werden. Die LED-Optik (2) wirkt gleichzeitig
als optische Blende, die mit der Beleuchtungsoptik (5)
auf den Biochip abgebildet wird (3). Eine
LED mit einer Lambert-Abstrahlcharakteristik weist gegenüber einer
mit Batwing-Abstrahlcharakteristik deutliche Vorteile bezüglich der
homogenen Ausleuchtung und der Intensität auf. 5 zeigt
die Biochipausleuchtung mit einer LED mit Lambert Charakteristik. 6 stellt die
LED-Abstrahlcharakteristik
für Lambert
und Batwing-LED dar.
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Der
Vorteil der LED zur Ausleuchtung von Biochips liegt in der Variabilität der Wellenlänge. LED sind
im gesamten sichtbaren Spektrum mit hoher optischer Leistung verfügbar.
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Für die typischen
nachzuweisenden Farbstoffe in den Spots auf dem Biochip kann eine
spektral gut angepasste LED als Lichtquelle eingesetzt werden.
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Zum
Beispiel:
Farbstoff Cy5 Absorptionsmaximum bei 649 nm
- – Anregen
mit LED LUXEON LD3 (Farbe rot, max. bei 630 nm)
Farbstoff
Cy3 Absorptionsmaximum bei 514 nm - – Anregen
mit LED LUXEON LM3 (Farbe grün, max.
bei 530 nm)
Farbstoff Alexa Fluor 532 Absorptionsmaximum
bei 532 - – Anregen
mit LED LUXEON LM3 (Farbe grün, max.
bei 530 nm)
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Eine
HBO strahlt ein Grundkontinuum im gesamten sichtbaren Licht ab.
Um hohe Effizienzen zu erreichen, muss aber eine HG-Linie mit der
Absorptionslinie übereinstimmen
(z.B. 546 nm, 577 nm).
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Eine
XBO erzeugt ein reinweißes
Spektrum, strahlt aber im ganzen sichtbaren Bereich, so dass für die eigentliche
Absorptionswellenlänge
des Farbstoffes nur wenig Licht zur Verfügung steht.
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Die
aufgenommene elektrische Leistung solcher Lampen ist > 100 W (Erwärmung),
die Lebensdauer beträgt
nur einige 100 h. Außerdem
ist die spektrale Trennung des Fluoreszenzlichtes vom Anregungslicht
mit Hilfe von Interferenzfiltern schwerer zu realisieren.
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Es
werden LED mit Lambert- und Batwing-Abstrahlcharakteristika angeboten. Sie
unterscheiden sich durch verschiedene Plastik-Abschlusslinsen (Epoxy
Dome Lens). Dabei erweist sich die LED mit einer Plastiklinse die
eine Lambert-Abstrahlcharakteristik erzeugt als sehr vorteilhaft
bezüglich
der homogenen Ausleuchtung der zu beleuchtenden Fläche als
auch bezüglich
der Lichtintensität
die mit klassischer Optik auf das Biochip übertragen werden kann.
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Für spezielle
Beleuchtungsarten werden auch in SMD-Technik gefertigte LED-Array
oder LED-Matrix hergestellt. Die Einzel-LED haben dabei nur eine geringe Leistung,
können
aber als Beleuchtungseinheit für
größere Flächen verwendet
werden (z.B. als Scheinwerfer in Kraftfahrzeugen). Zur Beleuchtung
eines Biochips mit einer vergleichsweise kleinen ausgeleuchteten
Fläche
kommt diese Art der Beleuchtung nicht in Betracht. Bei der Auswahl
der LED ist darauf zu achten, dass Monochip-LED verwendet werden.
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Eine
LED hat gegenüber
anderen Lichtquellen entscheidende Vorteile zur homogenen Ausleuchtung
von Biochips.
- – weites Spektrum an Anregungswellenlängen
- – hohe
optische Leistung (Lichtstrom > 100
lm) bei niedriger elektrischer Ansteuerleistung (1 W oder 3 W)
- – hohe
optische Leistungsdichte auf dem Biochip (5–10 mW/mm2)
oder auf einem Chip mit 10 mm2 eine Gesamtleistung
von 50–100
mW
- – sehr
hohe Lebensdauer (100.000 h)
- – hoher
Wirkungsgrad, (geringe Wärmebelastung)
- – geringe
Kohärenz
(keine Interferenzerscheinungen wie Speckle oder Newtonringe)
- – sehr
kleines Volumen
- – sehr
niedriger Preis (< 10
EUR)
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Bei
der optischen Abbildung der fluoreszierenden Spots auf die CCD-Kamera
muss eine optimale Einstellung zwischen der NA der Ausleseoptik (transmittierte
Lichtintensität)
und dem Kontrast der Bildspots, verursacht durch Abbildungsfehler
der verwendeten Optiken 5 und 9, gefunden werden.
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Bei
einer kontrastreichen Abbildung (K > 0,6) von 16 μm Strukturen und einer NA < 0,15 werden an die
Abbildungsoptik (5, 9) mittlere Anforderungen
gestellt. Normale Fotoobjektive sind hauptsächlich farbkorrigiert, während es
sich bei dem Optikmodul um fast monochrome Beleuchtung handelt.
Problematisch sind nur die auftretenden Bildfehler, hauptsächlich durch
die sphärische
Aberration verursacht.
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Deshalb
wird in einer besonderen Ausführung
der Erfindung für
die Abbildung des Objektes auf die CCD eine spezielle Ausleseoptik
verwendet. Sie besteht aus jeweils zwei Linsengruppen 5a, 5b und 9a, 9b (6).
Die Linsen 5a, 5b und 9a, 9b sind
plankonvex mit den gewölbten
Seiten zueinander. Bestformlinsen zeigen ähnliche Ergebnisse.
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Bei
hohen Leuchtdichten auf dem Objekt kann die NA der Ausleseoptik
kleiner gewählt
werden.
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Das
Licht einer LED (1), vorzugsweise einer Hochleistungs-LED
(1) mit Lambert-Abstrahlung wird mit einer LED-Optik (2)
gebündelt.
Diese Optik besteht aus einer Linse (2b) mit der Brennweite
f2 und dem Durchmesser D2,
die die Abstrahlcharakteristik der LED günstig beeinflusst und einer
Linse (2a), die im Zusammenwirken mit der Beleuchtungsoptik
(5) der Linse (2b) in die Biochipebene abbildet.
Die LED-Optik (2) in Verbindung mit der Beleuchtungsoptik 5 mit
der Brennweite f5 bildet die LED-Strahlung homogen
auf das Biochip ab. Die Wahl der Brennweiten f2 und
f5 bestimmt den Abbildungsmaßstab A
für die
ausgeleuchtete Fläche
auf dem Biochip. Die Optik (5) wird ebenfalls als Teil
der Ausleseoptik verwendet. Gemeinsam mit der Optik 9 bildet
diese die fluoreszierenden Spots des Biochip auf die LCD-Kamera ab.
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Dabei
zeigt sich, dass die Verwendung einer Linsenkombination von zwei
plankonvexen Linsen für
die Beleuchtungsoptik 5 (5a, 5b) und
die Ausleseoptik 9 (9a, 9b), sowohl die
homogene Chipausleuchtung als auch die kontrastreiche Spotabbildung
gewährleistet.
Zwei plankonvexe Linsen oder Bestformlinsen gegeneinander angeordnet
(3), ergeben eine einfache Möglichkeit für eine Kombination aus Beleuchtungs-
und Ausleseoptik.
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Da
der Abbildungsmaßstab
im Auslesekanal nahe 1 ist, können
die in 7 verwendeten Linsen 5a, 5b und 9a, 9b identisch
sein. Die genaue Abstimmung des Abbildungsmaßstabes erfolgt dann über die
Linsenabstände 5a–5b,
bzw. 9a–9b.
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Wird
als LED-Optik 2 eine Linsenkombination bestehend aus einer
Linse 2b (Plankonvex oder Bikonvex) nach der LED und einer
eine Plankonvexlinse 2a verwendet, erreicht man eine Homogenität der Ausleuchtung
von 8–10%.
Bei Verwendung einer Asphäre
anstelle 2a verbessert sich die Homogenität der Ausleuchtung
auf ≤ 5%.
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Die
Homogenität
der Ausleuchtung berechnet sich aus der Abweichung der Intensität der einzelnen
Pixel vom Mittelwert der Intensität über die gesamte ausgeleuchtete
Fläche.
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Vorteile:
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- – LED
als Lichtquelle: hohe optische Leistungsdichte, hoher Wirkungsgrad,
hohe Lebensdauer, kleines Volumen, kleine Ansteuerleistung, geringe Verlustleistung
- – Beleuchtungs-
und Abbildungsoptik gewährleisten
einen fast kollimierten Strahlengang (Interferenzfilter können im
kollimierten Strahlengang eingesetzt werden)
- – NA
im Beleuchtungs- und Abbildungskanal kann unabhängig voneinander variiert werden
- – Extrem
kompakte Bauweise ist durch entsprechende Auswahl der Linsen möglich
- – Homogenität der Ausleuchtung
kann mit einfachen Mitteln besser als 5% erreichen
- – Aufbau
mit 4 gleichen Linsen
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- 1
- Hochleistungs-LED
- 2
- Kollimationsoptik/LED-Optik
- 2b
- Bikonvexlinse
mit großer
NA
- 2a
- asphärische Linse
- 3
- Emissionsfilter
- 4
- dichroitischer
Strahlteiler
- 5
- Beleuchtungsoptik
- 5a
- plankonvexe
Linse (Bestformlinse)
- 5b
- plankonvexe
Linse (Bestformlinse)
- 6
- Biochip
- 7
- Blende
- 8
- Anregungsfilter
- 9
- Ausleseoptik
- 9a
- plankonvexe
Linse (Bestformlinse)
- 9b
- plankonvexe
Linse (Bestformlinse)
- 10
- Kamera