DE102007025311A1

DE102007025311A1 - Quantitativer heterogener schneller Bindungsassay mit breitem dynamischen Bereich und einfacher photometrischer Detektion

Info

Publication number: DE102007025311A1
Application number: DE200710025311
Authority: DE
Inventors: Peter Miethe; Hans Hermann SÖFFING
Original assignee: Senova Gesellschaft fuer Biowissenschaft und Technik mbH
Current assignee: Senova Gesellschaft fuer Biowissenschaft und Technik mbH
Priority date: 2007-05-30
Filing date: 2007-05-30
Publication date: 2008-12-04
Also published as: EP2149048A1; WO2008145722A1; EP2149048B1

Abstract

Vorrichtung zur Durchführung von quantitativen affinitätschromatographischen Schnelltests durch photometrische Auswertung, in der mindestens ein Filterelement (2) vorhanden ist, gebildet aus einem in einem Behälter (1) mit Einlass (3) und Auslass (4) angeordneten porösen Füllmaterial (5), auf dem Rezeptoren immobilisiert sind, das Filterelement (2) eine reflektierende innere Oberfläche aufweist, gekennzeichnet dadurch, dass - das poröse Füllmaterial (5) zwischen zwei flüssigkeitsdurchlässigen Trennelementen (6) angeordnet ist, unter Ausbildung eines säulenförmigen Segmentes (8), - mindestens zwei säulenförmige Segmente (8) in der Vorrichtung angeordnet sind, - die Rezeptoren in einer spezifischen Konzentration im Bereich von 1 ng/ml bis 200 g/ml Filtervolumen vorliegen, - die Trennelemente (6) auf der zum porösen Füllmaterial angrenzenden Oberfläche reflektierende Eigenschaften aufweisen, - die Vorrichtung so ausgestaltet ist, dass die Vorrichtung der Analyten, die an der Oberfläche der porösen Füllmaterialien immobilisierten Rezeptoren bindbar sind, enthaltende Lösung mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 1,5 ml/min bis 0,01 ml/min durchströmbar ist, - die Vorrichtung eine Einrichtung (10) aufweist, mit der an der Oberfläche der porösen Füllmaterialien immobilisierten Rezeptoren gebundene Analyten, die auf einem oder mehreren Segmenten (8) durch Lichttransmissionsmessung oder/und Lichtstreumessung in einem Winkel zwischen 180° und 90°, entweder direkt ...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung von quantitativen affinitätschromatographischen Schnelltests durch photometrische Auswertung, mit porösen Füllmaterial das eine reflektierende innere Oberfläche aufweist und auf dem Rezeptoren immobilisiert sind und das in einem Behälter mit Einlass und Auslass angeordnet ist.
Affinitätschromatographische Schnelltests basieren auf biospezifischen Wechselwirkungen von Liganden und Rezeptoren. Typischerweise liegt der Rezeptor immobilisiert auf einer Festkörperoberfläche vor, während der zu bestimmende Ligand über eine Flüssigphase zugeführt und an der Oberfläche spezifisch gebunden wird. Eine bei Schnelltests gängige Bauform ist in dem US Patent 4,943,522 beschrieben. Derartige Schnelltests werden z. B. als Schwangerschaftsteststreifen eingesetzt. Sie werden auf Basis von Nitrozellulosestreifen hergestellt, über die im oberen Teil eine Glasfasermembran gesetzt wird. Die Probe wird am oberen Teil der Glasfasermembran aufgetragen und reagiert während der Wanderung durch das Flies mit dem dort eingebrachten Konjugat. In der Regel sind dies Antikörper-Goldpartikel. Der gebildete Immunokomplex migriert weiter durch die Nitrozellulosemembran und wird an dort immobiliserten „capture" Antikörpern gebunden. Im Resultat entsteht eine gefärbte Bande. Es hat in der Vergangenheit vielfältige Versuche gegeben diese Teststreifen quantitativ, entweder reflektometrisch oder durch Transmissionsmessung auszulesen. Die damit ereichbare Sensitivität, Präzision ist jedoch relativ schlecht und der dynamische Bereich dieser Messungen ist auf 2–2,5 Größenordnungen begrenzt.
Ein weiteres Schnelltestverfahren, wird in EP-A-0 557 288 , EP-0 634 015 oder PCT/EP94/00086 beschrieben. Es basiert auf einer Durchflusssäule in der sich poröses Material mit immobilisiertem Rezeptor befindet. Die Bindung eines Analyten erfolgt im Durchfluss. Der gebundene Analyt kann nachfolgend durch Zugabe eines zweiten markierten Rezeptors sichtbar gemacht. werden. Vorteilhaft hat sich der Einsatz eines Enzym-Antikörperkonjugates und anschließender Zugabe von präzipitierendem Tetramethylbenzidin erwiesen. In diesem Falle bildet sich ein blauer Niederschlag, der quantitativ durch Analyse des transmittierten Lichtes direkt durch Transmissionsmessung auf dem porösem Material detektiert werden kann. Besonders gute Sensitivität und Nachweisgrenzen werden damit erreicht, wenn dazu eine Messküvette entsprechend der DE 10 2004 006 470 A1 eingesetzt wird. Eine derartige Vorgehensweise ist in Gessler et al 2005 beschrieben. Dieses Verfahren ist dem oben beschriebenen Membranverfahren bezüglich Sensitivität deutlich überlegen, zeigt aber wie dieses nur einen sehr engen dynamischen Bereich von maximal 2,5 Größenordnungen. Streulichtmessungen zeigen bei der beschriebenen Methode ein prinzipiell vergleichbares Verhalten.
Alternative Auslesetechniken, wie Fluorometrie und Luminometrie weisen einen besseren dynamischen Bereich von bis zu 4 Größenordnungen auf. Generell gilt für diese Verfahren aber, dass die notwendige Messtechnik relativ aufwendig und damit teuer ist. Durch Quenching- und Bleaching Effekte können ausserdem Störungen auftreten. Diese Techniken sind daher im Gegensatz zur Photometrie zur Herstellung von einfachen preiswerten Messsystemen nicht geeignet.
Der enge dynamische Bereich der photometrischen Verfahren wiederum führt bei Analyten die in einem breiteren Konzentrationsgebiet auftreten, dazu dass bei einer Analyse mehrere Verdünnungen der Analyselösung hergestellt und untersucht werden müssten. Diese Vorgehensweise ist nicht anwenderfreundlich und führt in der Konsequenz dazu, dass das Schnelltestverfahren nicht eingesetzt werden kann.
Ein der Erfindung zu Grunde liegendes technisches Problem bestand darin, ein Verfahren und eine entsprechende Vorrichtung bereitzustellen, die auf Basis einer einfachen, preiswerten, optischen Transmissionsmesstechnik die schnelle und präzise affinitätschromatographische Bestimmung von Analyten in einem breiten dynamischen Bereich zulässt.
Gelöst wird das genannte technische Problem mit einer Vorrichtung nach Anspruch 1 und einem Verfahren nach Anspruch 10. Die Unteransprüche betreffen besondere Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist zur Durchführung von quantitativen affinitätschromatographischen Schnelltests durch photometrische Auswertung geeignet. In der Vorrichtung ist mindestens ein Filterelement 2, gebildet aus in einem Behälter 1 mit Einlass 3 und Auslass 4 angeordnetem porösen Füllmaterial 5 vorhanden, auf dem Rezeptoren immobilisiert sind. Das Filterelement 2 weist eine reflektierende innere Oberfläche auf. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist gekennzeichnet dadurch, dass

– das poröse Füllmaterial 5 zwischen zwei flüssigkeitsdurchlässigen Trennelementen 6 angeordnet ist, unter Ausbildung eines säulenförmigen Segmentes 8,
– mindestens zwei säulenförmige Segmente 8 in der Vorrichtung angeordnet sind,
– die Rezeptoren in einer spezifischen Konzentration im Bereich von 1 ng/ml bis 200 g/ml Filtervolumen vorliegen,
– die Trennelemente 6 auf der zum porösen Füllmaterial angrenzenden Oberfläche reflektierende Eigenschaften aufweisen
– die Vorrichtung so ausgestaltet ist, dass die Vorrichtung für eine Analyten, die an der Oberfläche der porösen Füllmaterialien immobilisierten Rezeptoren bindbar sind, enthaltende Lösung mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 1,5 ml/min bis 0,01 ml/min durchströmbar ist,
– die Vorrichtung eine Einrichtung 10 aufweist, mit an der Oberfläche der porösen Füllmaterialien immobilisierten Rezeptoren gebundenen Analyten, die auf einem oder mehreren Segmenten 8 durch Lichttransmissionsmessung oder/und Lichtstreumessung in einem Winkel zwischen 180° und 90°, entweder direkt oder nach Zugabe von einem oder mehreren Sekundärreagenzien, die eine spezifische Bindung mit dem Analyten eingehen und dadurch direkt oder indirekt eine Färbung erzeugen, quantifiziert wird,
– wobei die Vorrichtung eine Auswertungseinheit aufweist, die mittels einer Kalbrationskurve, die die Transmission oder davon abgeleitete Werte von mindestens zwei Segmenten berücksichtigt, die Menge des Analyten bestimmbar macht.

In einer Ausführungsform weisen die das poröse Füllmaterial enthaltenden Segmente 8 eine Länge von 0.5–10 mm und einen Durchmesser von 0,5 bis 5 mm auf.
Die 1 zeigt eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Es kann vorteilhaft sein, dass mindestens zwei Behälter miteinander verbunden werden (2). Dabei kann der Auslass des einen in den Einlass des mindestens zweiten Behälter lösbar, z. B. durch stecken, miteinander verbunden werden.
Das Trennelement 6 in der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist insbesondere ein poröses Filterelement 2 mit einem mittleren Porendurchmesser von 1 bis 100 µm und einem Porenvolumenanteil von 20% bis 80% ist.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist die Auswertungseinheit zur Ermittlung der Transmission eine Photodioden-/Leuchtdiodenanordnung auf, die als eine Anordnung aus Leuchtdiodendioden und CCD Zeile oder CCD Array ausgestaltbar ist.
Eine spektrometrische Auswertung der Transmission ist ebenfalls durchführbar.
Zur Detektion des Analyten kann eine Färbung durch ein Rezeptor-Partikelkonjugat und/oder ein Rezeptor-Enzymkonjugat und anschließender Zugabe eines Enzymsubstrates bewirkt erfolgen.
In einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann die Rezeptorkonzentration in den Segmenten vom Einlass 3 zum Auslass 4 hin zunehmen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Durchführung von quantitativen affinitätschromatographischen Schnelltests auf das Vorhandensein von Analyten, unter Verwendung einer photometrischen Auswertung, wobei eine Lösung enthaltend einen Analyten oder in der ein Analyt vermutet wird, durch den Einlass 3 des Behälters 1 der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit dem Füllmaterial in den Segmenten 8 in Kontakt gebracht wird und nach Adsorption des Analyten an Rezeptoren, die eine Affinität zu dem Analyten aufweisen, die Anwesenheit des an die Rezeptoren gebundenen Analyten quantitativ und/oder qualitativ bestimmt wird.
Die Erfindung wird im Folgenden detailierter beschrieben.
Dabei wird explizit von dem oben beschriebenen Verfahren auf Basis einer photometrischen Messküvette mit heterogenen porösen Füllmaterial ausgegangen. Als poröses Füllmaterial wird vorzugsweise in Form von Filtersegmenten eingesetzt, auf dessen innerer Oberfläche Rezeptoren immobilisiert sind. Erfindungsgemäß können mindestens zwei dieser Elemente in einem Röhrchen hintereinander angeordnet und dabei durch flüssigkeitsdurchlässige Trennelemente separiert sein, die auf der Grenzfläche zum Filterelement reflektierende Eigenschaften aufweisen (1). Die lineare Anordnung wird nacheinander von der den zu bestimmenden Analyten (Liganden) enthaltenden Lösung durchströmt.
Die Figur zeigt eine Trennscheibe 6, die eine oder zwei reflektierende Hauptoberflächen aufweist.
Die eingesetzten Filterelemente (1) 2 weisen insbesondere eine reflektierende innere Oberfläche auf. Die mittleren Porendurchmesser sollten im Bereich von 1 µm bis 100 µm liegen und der Porenvolumenanteil soll 20% bis 80% betragen.
Erfindungsgemäß werden in einer Ausführungsform säulenförmige rezeptorhaltige Filterelemente 2 mit einer Länge im Bereich von 0.5–5 mm und einem Durchmesser im Bereich von 0,5 bis 5 mm eingesetzt. Die Trennelemente 6 weisen gleiche Durchmesser, jedoch geringere Dicken im Bereich von 10 µm bis 2,5 mm auf. Generell wird jeweils ein rezeptorhaliges Filterelement 2 von zwei Trennelementen 6 oben und unten begrenzt. In einer einfachen erfindungsgemäßen Ausführungsform ergibt sich die Abfolge:
Trennelement 6/aktives Filterelement 2/Trennelement 6/aktives Filterelement 2/Trennelement 6.
In einer weitergebildeten erfindungsgemäßen Vorrichtung in Form eines Analyseröhrchens können auch wesentlich mehr Filterelemente 2 und Trennelemente 6 hintereinander angeordnet werden. Durch die durchströmbare lineare Anordnung kann mit einer entsprechend dimensionierten Dosiervorrichtung oder durch hydrostatischen Druck allein, die den zu bestimmenden Liganden enthaltenden Lösung mit einer Geschwindigkeit von 1,5 ml/min bis 0,01 ml/min strömen, wobei die spezifische Konzentration des Rezeptors auf den aktiven rezeporhaltigen Filterelementen im Bereich von 2 µg/ml bis 200 mg/ml Filtervolumen gewählt werden sollte.
Die Quantifizierung des gebunden Liganden erfolgt separat auf den hintereinander geschalteten Filterelementen 2 in an sich bekannter Weise. Dazu können in der Regel zusätzlich vor der Messung ein oder mehrere an sich bekannte Markierungsreagenzien wie Immun, Gold-, Antikörper-Farbstoffkonjugate, Antikörper-Enzymkonjugate etc. zugegeben werden, die mit dem Liganden reagieren und einen insbesondere optisch gut detektierbaren Komplex bilden bzw. die Bildung eines detektierbaren Farbstoffes katalysieren. Erfindungsgemäß wird die Änderung der Transmission oder das in einem definierten Winkel gestreute Licht der einzelnen Filterlemente registriert. Daraus können auf Basis des Lambert Beerschen Gesetzes optische Dichten berechnet werden. Es gilt: Ig(Io/I) = OD = εdeffcmit:

OD: = optische Dichte
ε: = Extinktionskoeffizient
d: _eff = effektive Schichtdicke, hängt von den lichtstreuenden Eigenschaften der Filter ab
c: = Konzentration des zu bestimmenden Analyten
I: _o = Transmission vor der Anfärbung des Filterelementes mit der Markierungssubstanz
I: = Transmission nach Anfärbung des Filterelementes mit der Markierungssubstanz

Erfindungsgemäß werden zur Kalibration die Intensitätswerte der Transmission oder des gestreuten Lichtes oder davon abgeleitete Werte insbesondere die nach der angegebenen Gleichung berechneten optischen Dichten von mindestens zwei hintereinander liegenden Filtersegmenten 2 bestimmt. Nachfolgend werden durch Verknüpfung dieser Werte auf Basis einer geeigneten mathematischen Funktion abgeleitete Messwerte erzeugt, die zur Erstellung der Kalibration eingesetzt werden. Eine einfache Form der Verknüpfung stellt die Summenbildung oder Mittelwertbildung der OD-Werte der beiden Filter dar.
Es wurde gefunden dass sich durch Auftragung dieser abgeleiteten Werte über die Konzentration eine Eichfunktion generieren lässt, die einen breiteren dynamischen Bereich aufweist, als der der auf Basis der Auswertung eines einzelnen Filters, unter vergleichbaren Reaktionsbedingungen erhalten wird.
So lässt sich eine Messbereichserweiterung von bis zu 4 log Stufen, d. h. dynamische Bereiche von bis zu 6 log Stufen in der Konzentration realisieren. Dazu sollten in der Regel mehr als zwei Filtersegmente 2 hintereinander geschaltet werden, wobei diese sehr dünn ausgelegt werden können. Typische Messanordnungen zur Quantifizierung des transmittierten oder gestreuten Lichtes sind Photodioden/Leuchtdioden Anordnungen oder Leuchtdiodenzellen in Kombination mit CCD Zellen oder CCD Arrays.
Die beschriebene Vorgehensweise ist in 4 am Beispiel einer 3-lagigen Filteranordnung im Vergleich zu einer 1-lagigen konventionellen Anordnung illustriert. In dem gezeigten Beispiel entspricht das Volumen des einzelnen Referenzfilters der Summe der Filtervolumina der drei kleineren Filter in der Multifilteranordnung. Die Figur basiert auf den Daten, aus dem Ausführungsbeispiel 1.
Das Ausführungsbeispiel 2 zeigt an einem analogen 3-lagigen Aufbau, dass mit dem Verfahren auch sehr gute Variationskoeffizienten und sich damit eine Präzision erreichen lässt, welche die des konventionellen Aufbaus deutlich übertrifft.
Im Falle des Ausführungsbeispiel 3 erfolgte die optische Detektion mit einem CCD Array. Das Beispiel zeigt gleichzeitig, dass es möglich ist, mehrere Segmentanordnungen mit unterschiedlicher Spezifität hintereinander anzuordnen und damit Multiplexanalysen durchzuführen.
Im Ausführungsbeispiel 4 ist eine Anordnung gezeigt, bei der die Rezeptorkonzentration auf den Filtersegmenten vom Einlauf zum Auslauf hin zunimmt. In diesem Falle ist eine relativ gleichmäßige Färbung entlang der Segmentsäule zu verzeichnen, deren Länge mit der Analytkonzentration korreliert.
4: Photometrische Eichkurven für die immunologische Bestimmung von F.tularensis auf einem porösen Filterelement mit immobilisiertem anti- F.tularensis und Peroxidase/TMB Detektion (heterogener Immunoassay entsprechend Ausführungsbeispiel 1)

Oben: Eichkurve und optischer Aufbau einer konventionellen Messanordnung auf Basis eines 5 × 5 mm Polyethylenfilterelement und einem Einstrahlphotometer
Mitte: Eichkurven und optischer Aufbau für die erfindungsgemäß vorgeschlagene Anordnung von drei durch Trennelemente separierte Filterelemente 1,6 × 5 mm und die entsprechende photometrische Dreistrahlanordnung; die Eichkurven wurden jeweils auf den Filterelementen ermittelt und können einzeln oder auf Basis von geeigneten mathematischen Verknüpfungen zur Auswertung der Messung verwendet werden.
Unten: Aus den 3 Eichkurven berechnete Summeneichkurve für die F.tularensis Bestimmung auf der erfindungsgemäß vorgeschlagenen Anordnung

Beispiel 1 Nachweis von LPS aus Franciscella tularensis:
Es wurden Sinterkörper bestehend aus HDPE mit einem mittleren Porendurchmesser von 40 um und einem Porenvolumenanteil von 50% in den Dimensionen (Durchmesser × Länge) 5 × 5 mm (Typ1), 5 × 1,65 mm (Typ 2) eingesetzt auf denen jeweils 9 µg bzw. 3 µg monoklonale anti Francescella tularensis Antikörper immobilisiert waren. Als porösen Trennelementen wurden analoge Filterelemente in den Dimensionen 5 × 0,5 mm (Typ 3) ohne Bindungsaktivität (Blockfilter) eingesetzt.
Durch Einstecken eines Filterelementes Typ 1 in Mikrosäulen (Di = 5 mm, V = 750 µl) wurde eine Anordnung entsprechend Schema 2 Oben hergestellt. Diese einlagige Anordnung entspricht dem oben beschriebenen Stand der Technik und diente als Referenzsystem.
Die Herstellung der erfindungsgemäß vorgeschlagenen mehrlagigen Anordnung entsprechend 2 Mitte und Unten erfolgte durch sequenzielles Einstecken nach dem Schema:
Filter Typ3/Typ2/Typ3/Typ2/Typ3/Typ2/Typ3.
Als Kontrollmaterial wurde F.tularensis extrahiertes Lipopolysccarid verwendet. Die Konzentrationsangabe erfolgte auf Basis der vor der Extraktion vorliegenden Keimzahlen in CFU/ml. Die Assays wurden in Pipetierständern mit eine Nullkontrolle und jeweils 6 Eichproben in Doppelbestimmung durchgeführt. Die Zugabe der Probe und aller nachfolgenden Reagenzien erfolgte direkt in den Einlauf der Mikrosäule. Die Flussraten lagen dabei im Bereich von 250–300 µl/min. Nach Bindung der Probe (500 µl) wurde durch Zugabe von anti-F.tularensis-POD Konjugat auf der Säule ein Immunkomplex gebildet, der mit präzipitierenden TMB nachgewiesen und anschließend durch Transmissionsmessung quantifiziert wurde. Das Assayschema stellt sich wie folgt dar:

• 500 µl Probe in PBS Puffer
• Inkubation 4 min
• 500 µl anti F.tularensis-Poly HRP Konjugat (8 µg/ml)
• Inkubation 4 min
• 2 × 750 µl PBS Buffer
• Bestimmung der Transmission Io
• 500 µl TMB Substratlösung präzipitierend
• Inkubation 6 min
• 500 µl PBS-Puffer
• Bestimmung der Transmission I

Das optische Auslesen der Referenzsäulen erfolgte mit einem Miniphotometer (SENOVA Kat No 30010001RDR). Mit diesem können Transmissionsmessungen an einlagigen Säulen bei einer Wellenlänge von 532 nm und einem Blendendurchmesser von 3,6 mm realisiert werden. Die Multischichtsäulen wurden mit einem modifizierten Photometer gleicher Grundbauart durchgeführt. Dieses wies einen modifizierten Messkopf mit 3Strahlengängen (Blendendurchmesser 1,2 mm) jeweils auf der Höhe der aktiven Filterelemente auf.
Aus den gemessenen Transmissionen wurde auf Basis von Formel 1 die OD Werte berechnet. Diese und die daraus berechneten OD Mittelwerte sind in Abhängigkeit von der LPS Konzentration in 4 dargestellt. Dabei ist im oberen Teil die Kalibationskurve des einlagigen Systems, im mittleren Teil die Kalibration der einzelnen Filterschichten und im unteren Teil die Kalibration auf Basis der summierten OD Werte wiedergegeben.
Ausführungsbeispiel 2: Nachweis von Streptoccus Mutans
Es wurden Sinterkörper bestehend aus HDPE mit einem mittleren Porendurchmesser von 40 µm und einem Porenvolumenanteil von 50% in den Dimensionen (Durchmesser × Länge) 5 × 5 mm (Typ1), 5 × 1,65 mm (Typ 2') eingesetzt auf denen jeweils 15 µg bzw. 5 µg polyklonales affinitätsgereinigtes Serum aus Kaninchen gegen Streptococcus mutans immobilisiert wurde.
Als Trennelementen wurden Scheiben aus entsprechend 3 eingesetzt. Diese wiesen eine Metallic-Oberfläche mit teilreflektierenden Eigenschaften auf. Zusätzlich wurden Blockfilter entsprechend Typ 3 in Anwendungsbeispiel 1 eingesetzt.
Durch Einstecken eines Filterelementes Typ 1 in Mikrosäulen (d = 5 mm, V = 750 µl) wurde eine Anordnung entsprechend Schema 4 (oben) hergestellt. Diese einlagige Anordnung entspricht dem oben beschriebenen Stand der Technik und diente als Referenzsystem. Die Herstellung der erfindungsgemäß vorgeschlagene mehrlagigen Anordnung entsprechend 4 Mitte und Unten erfolgt durch sequenzielles Einstecken nach dem Schema:
Typ 3/Typ 2/Scheibe/Typ 2'/Scheibe/Typ 2/Typ 3'.
Als Kontrollmaterial wurde Zellkulturmaterial von S. mutans verwendet. Die Konzentration in CFU/m wurde durch Ausplattieren bestimmt. Die Assays wurden in Pipettierständern mit eine Nullkontrolle und jeweils 6 Eichproben in Doppelbestimmung durchgeführt. Die Zugabe der Probe und aller nachfolgenden Reagenzien erfolgte direkt in den Einlauf der Mikrosäule. Die Flussraten lagen dabei im Bereich von 180–200 µl/min. Nach Bindung der Probe (500 µl) wurde durch Zugabe von affinitätsgereinigten biotinyliertem anti S-mutans Serum (Kaninchen) auf der Säule ein Immunkomplex gebildet. Anschließend wurden zur optischen Detektion Strepatavidin-Magnetpartikel (0,5–1 µm, Chemagen GmbH, Baesweiler Deutschland) zugegeben. Die Magnetpartikel können auf den Filtern durch Transmissionsmessung bei 525 nm photometrisch gut detektiert werden. Das Assayschema stellt sich wie folgt dar:

• 500 µl Probe
• Inkubation 4 min
• 500 µl anti-S.-mutans-Biotin (IgG Fraktion 8 µg/ml)
• Inkubation 4 Minuten
• Bestimmung der Transmission I₀
• 500 µl Streptavidin-Magnetpartikel (Chemagen)
• 750 µl PBS Puffer
• Bestimmung der Transmission I*

Die Bestimmung der Transmissionen erfolgte wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben. Die nachstehende Tabelle 1 zeigt die erhaltenen Kalibrationsdaten als Mittelwerte.

CFU/ml	OD einlagig	OD Filter 1	OD Filter 2	OD Filter 3	Summe	MW
0	0,53	0,036	0,037	0,033	0,106	0,035
1,00E + 03	0,097	0,088	0,061	0,039	0,188	0,063
1,00E + 04	0,177	0,184	0,11	0,42	0,714	0,238
1,00E + 05	0,586	0,552	0,411	0,214	1,177	0,392
1,00E + 06	1,129	1,022	0,673	0,341	2,036	0,679
1,00E + 07	1,86	1,682	1,249	0,663	3,594	1,198
1,00E + 08	2,0025	1,806	1,601	1,002	4,409	1,470
1,00E + 09	2,0965	1,917	1,722	1,239	4,878	1,626

Tabelle 1: Kalibrationswerte (Mittelwerte aus Doppelbestimmungen) für den S.mutans Test auf einem 1-lagigen Filter und (Typ 1) und der 3-lagigen Filteranordnung, sowie die daraus berechneten Summen und Mittelwerte

Ausführungseispiel 3: Simultanbestimmung von F.tularensis und Y.pestis
Es wurden Sinterkörper bestehend aus HDPE mit einem mittleren Porendurchmesser von 12 µm und einem Porenvolumenanteil von 40% in den Dimensionen (Durchmesser × Länge) 2,5 × 1,6 mm eingesetzt. Ein Teil der Filter wurden mit 2 µg monoklonalem Antikörper gegen – F.tularensis (Typ 1'') und und ein Zweiter mit 2 µg monoklonalen Antikörper gegen das F1 Antigen von Y.pestis (Typ 2'') beschichtet. Die Trennelemente wurden aus 0,15 mm dicker Alufolie hergestellt, die mit jeweils 3 Löchern (d = 0,2 mm) versehen wurden. Zusätzlich wurden Blockfilter in den Dimensionen 2,5 mm × 1,6 mm eingesetzt.
Es wurde eine Multischichtanordnung entsprechend 5 auf Basis von 2 parallelen Röhrchen, die über einen Kanal verbunden wurden, hergestellt. Die Probe (500 µl) wurde mit 4 µg anti-F.tularensis-POD Konjugat und 3 µg anti-Y.pestsis-POD Konjugat 6 Minuten vorinkubiert. Anschließend erfolgte die Dosierung mit einer Spritzenpumpe bei einer Flussrate von 1,2 ml/min Anschließend wurde über einen zweiten Kanal der Spritzenpumpe in 5 Sekunden 1,5 ml PBS Puffer, nachfolgend über einen dritten Kanal in 3 Sekunden 500 µl präzipitierendes TMB dosiert. Nach einer Inkubationszeit von 4 Minuten wurde wiederum über Kanal 2 PBS Puffer (500 μl) dosiert. Anschließend erfolgte die optische Auswertung in der in 5 gezeigten CCD Arrayanordnung.
Die 5 zeigt beispielhaft das Ergebnis in schematischer Form für eine Analyse mit hoher (5000 CFU/ml) F.tularensis Konzentration und niedriger Y.pestis Konzentration (0,2 ng/ml) sowie den umgekehrten Fall niedriger F.tularensis (425 CFU/ml) und hoher Y.pestsis Konzentration (10 ng/ml). Die erhaltenen Kalibrationen für die beiden Analyten auf Basis der Summen der berechneten OD-Werte der 6 Filter zeigt die 6.
Ausführungsbeispiel 4: Quantifizierung von Botulinus Toxin A über die Anzahl der verfärbten Segmente
Es wurden 11 Sinterkörper bestehend aus HDPE mit einem mittleren Porendurchmesser von 12 µm und einem Porenvolumenanteil von 40% in den Dimensionen (Durchmesser × Länge) 1 × 1,6 mm eingesetzt.
Die Filter wurden mit 7,5 µg monoklonalem Antikörper gegen Botulinus Toxin A beschichtet. Die Trennelemente wurden aus 0,15 mm dicker Alufolie hergestellt, die mit jeweils 3 Löchern (d = 0,2 mm) versehen wurden.
Es wurde eine Multischichtanordnung entsprechend 6 auf hergestellt.
Die Probe (900 µl) wurde mit 4 µg biotinyliertem Anti-BotA Antikörper 6 Minuten vorinkubiert. Anschließend erfolgte die Dosierung durch Aufgabe auf die Säule bei einer Flussrate von ca. 0,4 ml/min. Anschließend wurde 500 µl SA-PolyHRP pipettiert und nach 6 Minuten zwei mal mit 1,5 ml PBS Puffer gewaschen, nachfolgend in ca. 1,25 Minuten 500 µl präzipitierendes TMBN dosiert. Nach einer Inkubationszeit von 6 Minuten wurde erneut 1 ml PBS Puffer dosiert. Anschließend erfolgte die optische Auswertung mittels CCD Arrayanordnung.
Die 6 zeigt beispielhaft das Ergebnis in schematischer Form für eine Analyse mit niedriger (0,5 ng/ml) und hoher (5 ng/ml) Konzentration. Die Anzahl der verfärbten Filter gibt direkt Aufschluss über die detektierte Konzentration in der Probe.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- US 4943522 [0002]
- EP 0557288 A [0003]
- EP 0634015 [0003]
- EP 94/00086 [0003]
- DE 102004006470 A1 [0003]

Claims

Vorrichtung zur Durchführung von quantitativen affinitätschromatographischen Schnelltests durch photometrische Auswertung, in der mindestens ein Filterelement (2) vorhanden ist, gebildet aus einem in einem Behälter (1) mit Einlass (3) und Auslass (4) angeordneten porösen Füllmaterial (5), auf dem Rezeptoren immobilisiert sind, das Filterelement (2) eine reflektierende innere Oberfläche aufweist, gekennzeichnet dadurch, dass – das poröse Füllmaterial (5) zwischen zwei flüssigkeitsdurchlässigen Trennelementen (6) angeordnet ist, unter Ausbildung eines säulenförmigen Segmentes (8), – mindestens zwei säulenförmige Segmente (8) in der Vorrichtung angeordnet sind, – die Rezeptoren in einer spezifischen Konzentration im Bereich von 1 ng/ml bis 200 g/ml Filtervolumen vorliegen, – die Trennelemente (6) auf der zum porösen Füllmaterial angrenzenden Oberfläche reflektierende Eigenschaften aufweisen – die Vorrichtung so ausgestaltet ist, dass die Vorrichtung für Analyten, die an der Oberfläche der porösen Füllmaterialien immobilisierten Rezeptoren bindbar sind, enthaltende Lösung mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 1,5 ml/min bis 0,01 ml/min durchströmbar ist, – die Vorrichtung eine Einrichtung (10) aufweist, mit der an der Oberfläche der porösen Füllmaterialien immobilisierten Rezeptoren gebundene Analyten, die auf einem oder mehreren Segmenten (8) durch Lichttransmissionsmessung oder/und Lichtstreumessung in einem Winkel zwischen 180° und 90°, entweder direkt oder nach Zugabe von einem oder mehreren Sekundärreagenzien, die eine spezifische Bindung mit dem Analyten eingehen und dadurch direkt oder indirekt eine Färbung erzeugen, quantifiziert werden, – wobei die Vorrichtung eine Auswertungseinheit aufweist, die mittels einer Kalbrationskurve, die die Transmission oder davon abgeleitete Werte von mindestens zwei Segmenten berücksichtigt, die Menge des Analyten bestimmbar macht.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die das poröse Füllmaterial enthaltenden Segmente (8) eine Länge von 0.5–10 mm und einen Durchmesser von 0,5 bis 5 mm aufweisen.
Vorrichtung nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Vorrichtungen miteinander verbunden werden.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, dass das Trennelement ein poröses Filterelement mit einem mittleren Porendurchmesser von 1 bis 100 µm und einem Porenvolumenanteil von 20% bis 80% ist.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4 gekennzeichnet dadurch, dass die Auswertungseinheit zur Ermittlung der Transmission eine Photodioden-/Leuchtdiodenanordnung aufweist.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, dass die Auswertungseinheit zur Ermittlung der Transmission eine Anordnung aus Leuchtdiodendioden und CCD Zeile oder CCD Array aufweist.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, dass die Färbung durch ein Rezeptor-Partikelkonjugat bewirkt ist.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, dass die Färbung durch ein Rezeptor-Enzymkonjugat und anschließender Zugabe eines Enzymsubstrates bewirkt ist.
Vorrichtung entsprechend Anspruch 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, dass die Rezeptorkonzentration in den Segmenten vom Einlass (3) zum Auslass (4) hin zunimmt.
Verfahren zur Durchführung von quantitativen affinitätschromatographischen Schnelltests auf das Vorhandensein von Analyten, unter Verwendung einer photometrischen Auswertung, wobei eine Lösung, enthaltend einen Analyten oder in der ein Analyt vermutet wird, durch den Einlass der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit dem porösen Füllmaterial in den Segmenten (8) in Kontakt gebracht wird und nach Adsorption des Analyten an Rezeptoren, die eine Affinität zu dem Analyten aufweisen, die Anwesenheit des an die Rezeptoren gebundenen Analyten quantitativ und/oder qualitativ bestimmt wird.