DE69921199T2

DE69921199T2 - Zweirichtungsquerflussteststreifen und verfahren

Info

Publication number: DE69921199T2
Application number: DE69921199T
Authority: DE
Inventors: M. Richard THAYER; J. Alan POLITO; K. Robert DINELLO; H. George SIERRA; J. Henry WIECK
Original assignee: Praxsys Biosystems San Ramon LLC; PraxSys BioSystems Inc
Current assignee: Praxsys Biosystems San Ramon LLC; PraxSys BioSystems Inc
Priority date: 1999-06-14
Filing date: 1999-11-17
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2019-11-18
Also published as: CA2375453C; US7229839B2; DE69921199D1; US6528323B1; ATE279726T1; ES2229797T3; EP1185870A1; AU1628100A; US20030157729A1; CA2375453A1; CN1135389C; EP1185870B1; WO2000077524A1; CN1277357A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Teststreifen für Querfluß und Verfahren für das Arbeiten der Querflußteststreifen.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Teststreifen wird bereitgestellt, der geeignet ist, eine Probe aufzunehmen und einen Analyten darin festzustellen. Gemäß einer Ausführungsform besitzt der Teststreifen eine Probenzugabezone, welcher eine Probe zugesetzt werden kann, eine Absorbenszone proximal zu der Probenzugabezone, eine oder mehrere Testzonen distal zu der Probenzugabezone, wobei wenigstens eine der Testzonen einen ersten Analyten enthält, der ein darin immobilisiertes erstes Analytenbindemittel einschließt, das man an den zu ermittelnden Analyten binden kann, und eine erste Probenflußzone distal zu der einen oder den mehreren Testzonen, wobei die Absorbenszone in Relation zu der Probenzugabezone ist und eine Absorptionskapazität in Relation zu den anderen Zonen des Teststreifens hat, so daß eine distale Diffusionsfront einer der Probenzugabezone zugesetzten Probe von der Probenzugabezone zu einem distalen Diffusionspunkt in der terminalen Probenflußzone und dann in umgekehrter Richtung und proximal in Bezug auf die eine oder mehreren Testzonen diffundiert.
Bei einer Ausführungsform umfaßt der Teststreifen weiterhin eine Konjugat-Pufferzugabezone distal zu der terminalen Probenflußzone, welcher ein Konjugat-Puffer zugegeben werden kann. Entsprechend der obigen Teststreifen-Ausführungsform kann die Konjugat-Pufferzugabezone in Relation zu den Testzonen derart angeordnet sein, daß zu der Konjugat-Pufferzugabezone zugesetzter Konjugat-Puffer gleichzeitig, während die Probe zu der Probenzugabezone zugegeben wird, den distalen Diffusionspunkt erreicht, nachdem die distale Diffusionsfront der Probe zu dem distalen Diffusionspunkt diffundiert ist und in einer proximalen Richtung zu diffundieren begann. Die Konjugat-Pufferzugabezone kann auch in Relation zu den Testzonen derart positioniert sein, daß der Konjugat-Puffer zu dem Teststreifen zugegeben werden kann und trotzdem den distalen Diffusionspunkt erreichen kann, nachdem die distale Diffusionsfront der Probe zu der distalen Diffusionszone unter Umkehr der Richtung diffundiert ist und das Diffundieren in einer proximalen Richtung begann.
Nach einer der obigen Ausführungsformen des Teststreifens kann der Teststreifen 1, 2, 3 oder mehr Testzonen enthalten, wobei ein oder mehrere Kontrollbindemittel darin immobilisiert sind. Nach einer Ausführungsform umfaßt der Teststreifen wenigstens eine erste Kontrollzone mit einem Kontrollbindemittel, das darin immobilisiert ist. Gegebenenfalls enthalten die Testzonen weiterhin eine zweite Kontrollzone mit einem gleichen darin immobilisierten Kontrollbindemittel, wie die erste Kontrollzone, wobei die erste Kontrollzone eine andere Menge des Kontrollbindemittels als die zweite Kontrollzone enthält.
Auch entsprechend einer der obigen Teststreifen-Ausführungsformen kann ein zweites Analytbindemittel, welches an den Analyten binden und zu einer oder mehreren Testznonen diffundieren kann, auf dem Teststreifen eingeschlossen sein. Alternativ kann das zweite Analytbindemittel an den Teststreifen über den Konjugat-Puffer abgegeben werden. Das zweite Analytbindemittel kann andere Komponenten als den Analyten in der Probe binden. Alternativ kann das zweite Analytbindemittel ein Mittel sein, welches nicht an andere Komponenten als den Analyten in der Probe bindet.
Um die Ermittlung zu erleichtern, wird vorzugsweise das zweite Analytbindemittel mit einem feststellbaren Marker markiert. Wie hier diskutiert, können irgendwelche aus einem weiten Bereich von feststellbaren Markern, die in der Technik bekannt sind, verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Bindemittel des zweiten Analyten an ein Teilchen gebunden, welches zu der einen oder zu mehreren Testzonen diffundieren kann. Das Teilchen kann als der feststellbare Marker dienen oder kann selbst mit einem feststellbaren Marker markiert werden.
Ein Verfahren ist auch zur Ermittlung eines Analyten in einer Probe vorgesehen. Bei einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Abgabe einer Probe an eine Probenzugabezone eines Teststreifens, wobei der Teststreifen proximal zu der Probenzugabezone eine Absorbenszone besitzt und eine Absorptionskapazität in Relation zu den anderen Zonen des Teststreifens hat, welche eine distale Diffusionsfront der Probe verursacht, um (a) in einer distalen Richtung zu einer oder zu mehreren Testzonen zu diffundieren, wobei wenigstens eine der Testzonen ein erstes darin immobilisiertes Analytbindemittel einschließt, welches Analyten in der Probe bindet, (b) zu einer terminalen Probenflußzone, distal zu einem oder mehreren Testzonen zu diffundieren, die Richtung zu verändern und (c) zu einer Position, proximal zu der einen oder den mehreren Testzonen zu diffundieren, einen Konjugat-Puffer an den Teststreifen in einer Position distal zu der terminalen Probenflußzone abgegeben, wobei die Abgabe des Konjugat-Puffers bewirkt, daß ein zweites Analytbindemittel proximal über die terminale Probenflußzone hinaus zu der einen oder den mehreren Testzonen diffundiert, nachdem die distale Diffusionsfront der Probe proximal zu der einen oder den mehreren Testznonen diffundiert, das zweite Analytbindemittel an in den Testzonen immobilisierten Analyten bindet und man den zweiten Analyten ermittelt, der in den Testzonen immobilisiertes Mittel bindet.
Gemäß dem Verfahren kann der Konjugat-Puffer zu dem Teststreifen gleichzeitig, während die Probe dem Teststreifen zugesetzt wird, bevor die Probe dem Teststreifen zugesetzt wird oder nachdem die Probe dem Teststreifen zugesetzt wird, zugegeben werden. Wenn die Probe dem Teststreifen zugesetzt wird, hängt in Relation zu dem Konjugat-Puffer dies von der Zeit ab, die erforderlich ist, damit die Probe die terminale Probenflußzone erreicht, was seinerseits von der Flußgestaltung des Teststreifens abhängt.
Auch gemäß dem Verfahren kann das zweite Analytbindemittel auf dem Teststreifen enthalten sein, wo der Konjugat-Puffer abgegeben wird, wobei die Abgabe des Konjugat-Puffers die Diffusion des zweiten Analytbindemittels bewirkt. Alternativ ist das zweite Analytbindemittel auf dem Teststreifen proximal zu der Stelle enthalten, an die der Konjugat-Puffer abgegeben wird, und wobei die Abgabe des Konjugat-Puffers die Diffusion des zweiten Analytbindemittels verursacht. Die Abgabe des Konjugat-Puffers an den Teststreifen kann auch eine Abgabe des zweiten Analytbindemittels an den Teststreifen in dem Konjugat-Puffer einschließen.
Gemäß der obigen Methode können die Testzonen eine erste Kontrollzone mit einem darin immobilisierten Kontrollbindemittel, Abgabe des Konjugat-Puffers, der ein Kontrollmittel dazu veranlaßt, proximal über die terminale Probenflußzone hinaus zu der ersten Kontrollzone zu fließen und an das darin immobilisierte Kontrollbindemittel zu binden. Alternativ können die Testzonen erste und zweite Kontrollzonen einschließen, die jeweils eine unterschiedliche Menge eines darin immobilisierten Kontrollbindemittels einschließen, Abgabe des Konjugat-Puffers, der ein Kontrollmittel dazu veranlaßt, proximal über die terminale Probenflußzone zu der ersten und zweiten Kontrollzone zu fließen und an das darin immobilisierte Kontrollbindemittel zu binden.
Auch gemäß der obigen Methode kann eine Ermittlung des zweiten Analytbindemittels durch Markierung des zweiten Analytbindemittels mit einem feststellbaren Marker erleichtert werden, der das zweite Analytbindemittel einschließlich einer Ermittlung des feststellbaren Markers ermittelt. Das zweite Analytbindemittel kann an ein Teilchen gebunden werden. Die Feststellung des zweiten Analytbindemittels kann eine Feststellung des Teilchens einschließen.
Gemäß jeder der obigen Ausführungsformen wird die Probe vorzugsweise in einem vorbestimmten Volumenbereich an den Teststreifen abgegeben, so daß der Teststreifen für ein bestimmtes Verfahren ausgelegt wurde. Der vorbestimmte Volumenbereich ist vorzugsweise zwischen etwa 10 und 250 μl, vorzugsweise zwischen etwa 20 und 100 μl, stärker bevorzugt zwischen etwa 30 und 50 μl und am meisten bevorzugt zwischen etwa 35 und 45 μl. Wenn eine Probe auf den Teststreifen innerhalb des vorbestimmten Volumenbereichs aufgegeben wird, kann die terminale Probenflußzone so gestaltet werden, daß sie eine kurze Länge von einem proximalen Ende zu einem distalen Ende hat. Beispielsweise wenn eine Probe an den Teststreifen in einem Bereich von etwa 35 und 45 μl abgegeben wird, kann die terminale Probenflußzone eine Länge von einem proximalen Ende zu einem distalen Ende zwischen etwa 1 und 25 mm, stärker bevorzugt zwischen 2 und 15 mm und am meisten bevorzugt zwischen 3 und 10 mm haben.
Auch gemäß irgendeiner der obigen Ausführungsformen bindet das erste Analytbindemittel vorzugsweise nicht an andere Komponenten in der Probe als den Analyten. Molekültypen, die als erste Analytbindemittel dienen können, sind beispielsweise, aber nicht ausschließlich Antikörper, aufgebaute Proteine, Peptide, Haptene, Lysate, die heterogene Gemische von Antigenen mit Analytbindungsstellen enthalten, Liganden und Rezeptoren. Bei einer speziellen Ausführungsform ist das erste Analytbindemittel ein Antikörper oder ein Bruchstück hiervon.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 erläutert eine Draufsicht auf eine Ausführungsform eines Querflußteststreifens nach der vorliegenden Erfindung.
Die 2A–2H erläutern ein Arbeitsverfahren für einen Querflußteststreifen nach der vorliegenden Erfindung.
2A erläutert eine Probe, die dem Teststreifen zugesetzt wird.
2B erläutert den Probenfluß in dem Teststreifen.
2C erläutert den Teststreifen, wenn die Probe über einen Abstand in dem Teststreifen in der Richtung entgegengesetzt zu einer Absorbenszone in einer terminalen Probenflußzone geflossen ist.
2D erläutert den Teststreifen, wenn die Probe zurück zu der Absorbenszone fließt.
2E erläutert die Zugabe eines Puffers zu dem Teststreifen.
2F erläutert den Fluß des Puffers in dem Teststreifen zu der Absorbenszone.
2G erläutert den Fluß des Puffers in dem Teststreifen über die Testzone hinaus.
2H erläutert den Fluß des Puffers in dem Teststreifen in der Absorbenszone.
Die 3A–3H zeigen ein Arbeitsverfahren für einen Querflußteststreifen nach der vorliegenden Erfindung.
3A erläutert eine Probe und einen Puffer, die auf den Teststreifen aufgegeben wurden.
3B erläutert die Probe und den Puffer, die in dem Teststreifen fließen.
3C erläutert den Teststreifen, wenn die Probe über einen Abstand in dem Teststreifen in der Richtung entgegengesetzt zu einer Absorbenszone innerhalb einer terminalen Probenflußzone geflossen ist.
3D erläutert den Teststreifen, bei dem die Probe zurück zu der Absorbenszone fließt.
3E erläutert den weiteren Fluß des Puffers zu dem Probenfluß.
3F erläutert den Puffer, der über die terminale Probenflußzone hinaus geflossen ist.
3G erläutert den Fluß des Puffers in dem Teststreifen über die Testzone hinaus.
3H erläutert den Fluß des Puffers in dem Teststreifen in die Absorbenszone hinein.
4 erläutert eine Teststreifengestaltung, bei der die Probenzugabezone in Nachbarschaft zu der Wasch- und Pufferzugabezone angeordnet ist.
Die 5A–5C erläutern verschiedene Kartuschengestaltungen, in welchen ein Teststreifen nach der vorliegenden Erfindung angeordnet werden kann.
5A erläutert eine Kartuschengestaltung, die für den in den 2A–2H erläuterten Teststreifen ausgebildet ist.
5B erläutert eine Kartuschengestaltung, die für den in den 3A–3H erläuterten Teststreifen angepaßt ist, wo die Probenzugabezone über einen ausgedehnten Abstand von der Wasch- und Pufferzugabezone derart angeordnet ist, daß die Probe und der Waschpuffer gleichzeitig zugegeben werden können.
5C erläutert eine Kartuschengestaltung, die an den Teststreifen angepaßt ist, der in 4 erläutert ist, wo die Probenzugabezone in Nachbarschaft zu der Wasch- und Pufferzugabezone angeordnet ist, wobei die Testzone in einem engeren Abstand von der Wasch- und Pufferzugabezone entfernt angeordnet ist.
6A erläutert das Layout eines von Abbott hergestellten FLEXPACK^® HP-Teststreifens.
6B erläutert das Arbeiten des Teststreifens, der in 6A erläutert ist.
7 erläutert eine seitliche, weggebrochene Darstellung des Querflußteststreifens, der in 1 erläutert ist.
8 erläutert die Ergebnisse ReLIA^®-Stopfluß Herpes 2-Tests, der im Beispiel 2 durchgeführt wird.
9 erläutert die Ergebnisse aus einem ReLIA^® Stopfluß Herpes 2-Test, der in Beispiel 3 durchgeführt wird.
10 erläutert die Ergebnisse aus einem ReLIA^® Stopfluß Helicobacter pylori-Test, der in Beispiel 4 durchgeführt wird.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Querflußteststreifen, der einen Teil einer auf den Teststreifen aufgegebenen Probe dazu veranlassen kann, von einer Zone, wo die Probe zugegeben wird, quer über eine oder mehrere Testzonen in eine terminale Probenflußzone und dann, unabhängig von irgendeinem Eingreifen des Anwenders, in umgekehrter Richtung und zurück über die eine oder mehreren Testzonen zu der Probenzugabezone zu fließen. Immobilisiert in wenigstens einer der Testzonen ist ein erstes Analytbindemittel, welches in der Lage ist, an einen Analyten in der Probe zu binden, welchen der Teststreifen ermitteln soll. Dadurch, daß ein Teil der Probe dazu veranlaßt wird, quer über die eine oder mehrere Testzonen zu fließen und dann unabhängig zurück zu der Probenzugabezone zu strömen, wird die Notwendigkeit, die eine oder mehreren Testzonen vor Berührung der einen oder mehreren Testzonen mit einem zweiten Analytbindemittel zu waschen, ausgeschaltet. Der Zeitbedarf, wenn das zweite Analytbindemittel veranlaßt wird, zu der einen oder den mehreren Testzonen zu diffundieren, wird auch ausgeschaltet. Wie hier in weiteren Einzelheiten diskutiert wird, liefern das Selbstwaschen und Selbstzeitgeben des Teststreifens nach der vorliegenden Erfindung mehrere signifikante Vorteile gegenüber bisherigen Teststreifen.
Das Selbstwasch- und Selbstzeitgebermerkmal von Teststreifen nach der vorliegenden Erfindung erreicht man durch Positionierung einer Absorbenszone in Relation zu der Probenzugabezone derart, daß, wenn ein Probenvolumen (innerhalb eines vorbestimmten Probenvolumenbereichs für jenen Teststreifen) zu dem Teststreifen zugesetzt wird, die Diffusionsfront der Probe sich über die eine oder mehrere Testzonen bis zu einer terminalen Probenflußzone ausdehnt. Wenn die Probe die terminale Probenflußzone erreicht, bewirken die Absorbenseigenschaften der Absorbenszone, daß die Probe nach hinten über die Testzonen über die Probenzugabezone und schließlich in die Absorbenszone gezogen wird.
1 erläutert eine Draufsichtdarstellung einer Ausführungsform eines Querflußteststreifens 100 gemäß der vorliegenden Erfindung. Wie erläutert, hat der Teststreifen 100 proximale und distale Enden 102 bzw. 104 und kann in mehrere unterschiedliche Zonen geteilt werden. Der Teststreifen schließt eine Probenzugabezone 106 ein, wo eine Probe zu dem Teststreifen 100 zugegeben werden kann. Eine Absorbenszone 108 ist proximal zu der Probenzugabezone 106 angeordnet. Eine oder mehrere Testzonen 110, 112, 114 sind distal zu der Probenzugabezone 106 positioniert. Der Teststreifen 100 schließt auch eine terminale Probenflußzone 116 distal zu einem oder den mehreren Testzonen 110, 112, 114 ein. Jede der oben erwähnten Zonen steht in Fluid-Diffusionsverbindung mit jeder anderen.
Wie erläutert, schließt der Teststreifen auch eine Konjugat-Pufferzugabezone 118 distal zu der terminalen Probenflußzone 116 ein. Die Konjugat-Pufferzugabezone 118 kann eine Zone sein, wo Konjugat-Puffer dem Teststreifen zugesetzt werden kann. Alternativ kann die Konjugat-Pufferzugabezone 118 einfach einer Zone entsprechen, zu welcher Konjugat-Puffer von einem distaleren Punkt auf dem Teststreifen diffundiert.
Es wird festgestellt, daß die Gestaltung des Teststreifens, die in 1 erläutert ist, eine lineare Auslegung ist. Nicht-lineare Gestaltungen jedoch, wie die in 4 erläuterte, sind auch für die Teststreifen nach der vorliegenden Erfindung bestimmt.
Die 2A–2H erläutern ein Arbeitsverfahren eines Querflußteststreifens, wie desjenigen, der in 1 erläutert ist. Vor der Durchführung eines Tests unter Verwendung eines Teststreifens nach der vorliegenden Erfindung erhält man eine Fluidprobe, von der man annimmt, daß sie den zu ermittelnden Analyten enthält. Die Probe kann irgendein Fluid einschließen, das den Teststreifen benetzt und eine Viskosität hat, die ausreicht, um eine Bewegung der Probe über den Teststreifen hin zu erlauben. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Probe eine wäßrige Lösung (wie eine Körperflüssigkeit).
2A erläutert die Zugabe der Probe 120 zu einer Probenzugabezone 106 des Teststreifens 100. Es ist festzustellen, daß der Teststreifen für die Verwendung mit einer Probe bestimmt ist, die ein Volumen in einem bestimmten Bereich hat. Spezieller bewirkt die Zugabe einer Probe innerhalb des vorbestimmten Bereichs, daß die Probe distal über die Testzonen hinaus in die terminale Probenflußzone 116 diffundiert, aber nicht über die terminale Probenflußzone 116 hinaus (wie in 2D erläutert).
Wie in 2B erläutert, beginnt die Probe 120 proximal und distal über den Teststreifen zu diffundieren, nachdem sie dem Teststreifen zugesetzt wurde. Wie in 2C erläutert, diffundiert die distale Front 124 der Probe 120 über die eine oder mehreren Testzonen 110, 112 und 114 in die terminale Probenflußzone 116. Wie in 2D erläutert, erstreckt sich die distale Front 124 der Probe 120 schließlich bis zu einem Punkt in der terminalen Probenflußzone 116.
Wenn das Volumen der dem Teststreifen zugesetzten Probe innerhalb eines vorbestimmten Volumenbereichs liegt, für welchen der Teststreifen bestimmt ist, erreicht die distale Front 124 der Probe 120 einen distalen Diffusionspunkt entsprechend einem Punkt maximalen distalen Flusses irgendwo in der terminalen Probenflußzone 116. An diesem Punkt zieht, wie in 2E erläutert, Kapillarwirkung die Probe proximal zu der Absorbenszone 108 durch die Absorbenszone 108. Während die Probe in die Absorbenszone 108 gezogen wird, geht die distale Front 124 der Probe proximal zurück.
Wie man an den 2A–2D sehen ist, ist ein Merkmal der vorliegenden Erfindung die Kontrolle, von wo und wie die Probe in dem Teststreifen fließt. Die auf den Teststreifen aufgegebene Probe ist vorzugsweise in einem vorbestimmten Volumenbereich, so daß der Teststreifen auf das Verfahren zugeschnitten wurde. Der vorbestimmte Volumenbereich liegt vorzugsweise zwischen etwa 10 und 250 μl, vorzugsweise zwischen etwa 20 und 100 μl, stärker bevorzugt zwischen etwa 30 und 50 μl und am meisten bevorzugt zwischen etwa 35 und 45 μl. Wenn eine Probe auf einen Teststreifen innerhalb dieser Bereiche aufgegeben wird, hält der Probenfluß in der terminalen Probenflußzone an.
Die terminale Probenflußzone kann so gestaltet werden, daß sie eine kurze Länge von einem proximalen Ende zu einem distalen Ende hat. Beispielsweise wenn eine Probe auf den Teststreifen innerhalb eines Bereichs von etwa 35 und 45 μl aufgegeben wird, kann die terminale Probenflußzone eine Länge von einem proximalen Ende bis zu einem distalen Ende zwischen etwa 1 und 25 mm, stärker bevorzugt von 2 bis 15 mm und am meisten bevorzugt von 3 bis 10 mm haben.
In einer der Testzonen (zum Beispiel der Testzone 110) ist ein erstes Analytbindemittel angeordnet, welches in der Probe einen Analyten bindet, den der Teststreifen ermitteln soll. In dem Teil der Probe, der quer über die Testzonen fließt, vorhandener Analyt ist in der Testzone 110 durch das erste Analytbindemittel immobilisiert.
2E erläutert die Zugabe eines Konjugat-Puffers 122 zu dem Teststreifen bei der Konjugat-Pufferzugabezone 118, nachdem die Probe die terminale Probenflußzone erreicht hat. Der Konjugat-Puffer 122 kann eine oder mehrere unterschiedliche zweite Analytbindemittel enthalten, die an den Analyten binden können und es ermöglichen, daß Analyt in den Testzonen immobilisiert wird, um ermittelt zu werden. Es ist festzustellen, daß die Konjugat-Pufferzugabezone 118 gegebenenfalls das eine oder die mehreren zweiten Analytbindemittel einschließt, die benutzt werden, um immobilisierten Analyt zu ermitteln. In jenem Fall dient die Zugabe des Konjugat-Puffers 122 der Anfangsdiffusion des einen oder der mehreren zweiten Analytbindemittel quer über die Testzonen.
Wie in den 2F und 2G erläutert, fließt der Konjugat-Puffer 122 proximal über den Teststreifen zu der Absorbenszone 108 und bewirkt dabei, daß das eine oder die mehreren zweiten Analytbindemittel über die Testzonen 110, 112, 114 fließen und an immobilisierten Analyten binden.
Wie in 2H erläutert, bewirkt die Kapillarwirkung durch die Absorbenszone 108, daß die Probe 120 in die Absorbenszone 108 diffundiert. In der Zwischenzeit fährt der Konjugat-Puffer 122 fort, proximal über die Testzonen 110, 112, 114 und in die Absorbenszone 108 zu diffundieren. Von der einen oder den mehreren zweiten Analytbindemitteln wird derjenige Teil, der nicht in den Testzonen 110, 112, 114 immobilisiert wurde, mit dem Konjugat-Puffer 122 in die Absorbenszone 108 getragen.
Bezüglich der Ausführungsform, die in den 2A–2H erläutert ist, wird festgestellt, daß der Konjugat-Puffer 122 zu dem Teststreifen zugegeben werden sollte, nachdem die Probe 120 die Testzonen 110, 112, 114 erreicht hat, und vorzugsweise, nachdem die Probe die terminale Probenflußzone 116 erreicht hat und begonnen hat, zurück zu der Absorbenszone 108 zu diffundieren. Dies erlaubt, daß der Teil der Probe 120, der über die Testzonen fließt, die ersten Analytbindemittel in den Testzonen ohne vorhandenen Konjugat-Puffer berührt.
Die 3A–3H erläutern eine Alternativ-Teststreifengestaltung und ein Verfahren zum Bearbeiten dieses Teststreifens. Bei dieser Ausführungsform werden die Probe und der Konjugat- Puffer gleichzeitig zugegeben. Um die Probe und den Konjugat-Puffer etwa gleichzeitig zuzugeben, ist es erforderlich, daß der Konjugat-Puffer die Testzonen 210, 212, 214 erreicht, nachdem die Probe die Testzonen berührt hat. Es ist bevorzugt, daß der Konjugat-Puffer die Testzonen erreicht, nachdem die Probe begonnen hat, zurück über die Testzonen zu der Absorbenszone 208 zu diffundieren.
Verzögerung, wenn der Konjugat-Puffer die Testzonen erreicht, erzielt man bei dieser Ausführungsform durch Schaffung eines längeren Abstands zwischen der Konjugat-Pufferzugabezone 218 und der terminalen Probenflußzone 216 im Vergleich mit der Teststreifengestaltung, die in den 2A–2H erläutert ist. Alternativ kann man ein Material verwenden, welches den Konjugat-Puffer dazu bringt, mit geringerer Geschwindigkeit zu diffundieren.
3A erläutert eine Probe 220, die zu einer Probenzugabezone 206 des Teststreifens 200 zugesetzt wird. Ein Konjugat-Puffer 222 wird zu einer Konjugat-Pufferzugabezone 218 etwa gleichzeitig mit der Zugabe der Probe zu dem Teststreifen zugegeben.
Wie in 3B erläutert, beginnt die Probe 220 proximal und distal in dem Teststreifen zu diffundieren, wenn sie erst einmal zu dem Teststreifen zugegeben wurde. Der Konjugat-Puffer 222 diffundiert auch proximal und distal in dem Teststreifen.
Wie in 3C erläutert, diffundiert die distale Front 224 der Probe 220 über eine oder mehrere Testzonen 210, 212, 214 bis in eine terminale Probenflußzone 216. Der konjugierte Puffer 222 diffundiert weiter proximal in dem Teststreifen zu den Testzonen.
Wie in 3D erläutert, erstreckt sich die distale Front 224 der Probe 220 letztlich bis zu einem Punkt in der terminalen Probenflußzone 216. Zum Zeitpunkt, wenn die Probe in der terminalen Probenflußzone 216 sich befindet, hat der Konjugat-Puffer 222 noch nicht jene Zone erreicht.
Wie in 3E erläutert, zieht die Absorbenszone 208 die Probe proximal zu der Absorbenszone 208. Wenn die Probe in die Absorbenszone 208 gezogen wurde, fließt die distale Front 224 der Probe proximal. In einer der Testzonen (zum Beispiel Testzone 210) ist ein erstes Analytbindemittel, welches an Analyt in der Probe bindet, welchen der Teststreifen ermitteln soll. In dem Teil der Probe, der über die Testzonen fließt, enthaltener Analyt wird in der Testzone 210 durch das erste Analytbindemittel immobilisiert.
3F erläutert den Konjugat-Puffer 222, der die Testzonen erreicht. Wie ersichtlich, erreicht zu dieser Zeit der Puffer 222 die Testzonen, die distale Front 224 der Probe ist bereits proximal aus der terminalen Probenflußzone 216 und den Testzonen 210, 212 und 214 herausgeflossen.
Wie in den 3G und 3H erläutert, bewirkt Kapillarwirkung durch die Absorbenszone 208, daß die Probe in die Absorbenszone 208 abgezogen wird. Der Puffer 222 diffundiert weiter proximal über die Testzonen 210, 212, 214 und in die Absorbenszone 208. Von der einen oder den mehreren zweiten Analytbindemitteln wird jener Teil, der nicht in den Testzonen 210, 212, 214 immobilisiert wurde mit dem Konjugat-Puffer 222 in die Absorbenszone 208 geführt.
Der Konjugat-Puffer 222, der dem Teststreifen zugesetzt wurde, kann einen oder mehrere zweite Analytbindemittel enthalten, die an den Analyt binden und ermöglichen, daß in den Testzonen immobilisierter Analyt festgestellt wird. Alternativ kann der Teststreifen eine Konjugatzone distal zu der terminalen Probenflußzone 216 einschließen, welche ein oder mehrere zweite Analytbindemittel enthält. Die Konjugat-Pufferzugabezone 218 kann auch als die Konjugatzone dienen. Wenn das eine oder die mehreren zweiten Analytbindemittel auf dem Teststreifen vorbeladen werden, dient der Konjugat-Puffer 222 dazu, die Anfangsdiffusion des einen oder der mehreren zweiten Analytbindemittel quer über die Testzonen zu der Absorptionszone einzuleiten.
Wie in den 3A–3H erläutert, kann der Konjugat-Puffer auf den Teststreifen aufgegeben werden, bevor die Probe die Testzonen erreicht, indem man den Diffusionsweg des Teststreifens so gestaltet, daß der Konjugat-Puffer nicht die Testzonen erreicht, bevor die Probe aus den Testzonen diffundiert ist. Es ist festzustellen, daß die Diffusion des Konjugat-Puffers zu dem Testzonen ausreichend verzögert werden kann, daß man den konjugierten Puffer zu dem Teststreifen zugibt, bevor die Probe dem Teststreifen zugesetzt wird.
4 erläutert eine alternative Teststreifengestaltung für einen Querflußteststreifen nach der vorliegenden Erfindung. Das Arbeiten des Teststreifens ist ähnlich dem Arbeiten, das in den 3A–3H beschrieben ist. Die gleichen Bezugszeichen werden in 4 wie in den 3A–3H verwendet. Wie in 4 erläutert, ist die Probenzugabezone 206 in Nachbarschaft zu der Konjugat-Pufferzugabezone 218 angeordnet. Dies erlaubt eine kompaktere Teststreifengestaltung, während man auch die Probe und Konjugat-Puffer gleichzeitig zusetzen kann.
Ein Merkmal der in 4 erläuterten Teststreifengestaltung ist jenes, daß die Probe und der Konjugat-Puffer am gleichen Ende des Teststreifens zugegeben werden. Es ist auch festzustellen, daß die Testzonen 210, 212, 214 zu einem entgegengesetzten Ende der Proben- und Konjugat-Pufferzugabezonen 206 und 218 hin angeordnet sind. Dies macht es möglich, daß die Testzonen in einem Probenlesegerät positioniert werden, während die Proben- und Konjugat-Pufferzugabezonen außerhalb des gleichen Lesegeräts liegen. Dies erlaubt seinerseits, daß Probe und Konjugat-Puffer dem Teststreifen zugesetzt werden, während der Teststreifen in einem Teststreifenlesegerät sich befindet.
Die 5A–5C erläutern verschiedene Kartuschengestaltungen, in welchen Teststreifen nach der vorliegenden Erfindung positioniert werden können. In jeder Kartuschengestaltung enthält die Kartusche eine Probenaufnahmeöffnung 2140 in Nachbarschaft zu der Probenzugabezone 106 des Teststreifens. Die Kartusche enthält auch eine Konjugat-Pufferzugabeöffnung 242 in Nachbarschaft zu der Konjugat-Pufferzugabezone 218 des Teststreifens. Die Kartusche enthält auch ein Testfenster 244 nahe der Testzonen 210, 212, 214 des Teststreifens.
5A erläutert eine Kartuschengestaltung, die an den Teststreifen angepaßt ist, der in den 2A–2H erläutert ist. 5B erläutert eine Kartuschengestaltung, die an den in den 3A–3H erläuterten Teststreifen angepaßt ist, wo die Probenzugabezone über einen ausgedehnten Abstand von der Konjugat-Pufferzugabezone aus positioniert ist, so daß die Probe und der Konjugat-Puffer zu dem Teststreifen etwa gleichzeitig zugesetzt werden können. 5C erläutert eine Kartuschengestaltung, die für den Teststreifen in 4 erläutert ist, wo die Probenzugabezone in Nachbarschaft zu der Pufferzugabezone liegt, wobei die Testzone in einem ausgedehnten Abstand von der Pufferzugabezone liegt.
Es ist bezüglich der 2–4 zu bemerken, daß ein Merkmal der Teststreifen nach der vorliegenden Erfindung die inhärente Fähigkeit der Teststreifen ist, Testzonen auf dem Teststreifen zu einem Teil der Probe während einer Zeitdauer zu exponieren und dann die Proben dazu zu bringen, von den Testzonen weg zu diffundieren, bevor Konjugat-Puffer die Testzonen erreicht. Dieses Merkmal wird möglich gemacht durch Passen (1) der Positionierung der Absorbenszone in Relation zu der Probenzugabezone mit (2) der Absorbenskapazität des Teststreifens zwischen der Probenzugabezone und der terminalen Probenflußzone und (3) dem Volumen der Probe, die auf den Teststreifen aufgegeben wird. Wenn zu viel Probe aufgegeben wird, wird die Probe über die terminale Probenflußzone hinaus diffundieren. Wenn zu wenig Probe aufgegeben wird, diffundiert die Probe nicht weit genug in den Teststreifen, um die Testzonen zu erreichen.
Die Fähigkeit der Teststreifen, die Testzonen zu exponieren, um für eine begrenzte Zeitdauer Proben zu nehmen und dann zu bewirken, daß die Probe aus den Testzonen entfernt wird, verleiht dem Teststreifen eine Zeitgeberunabhängigkeit, was die Genauigkeit des Teststreifens und die Leichtigkeit seiner Verwendung verbessert. Beispielsweise, wie im Beispiel 2 im einzelnen gezeigt ist, sind Testergebnisse nicht abhängig von der Frage, ob Konjugat-Puffer zu der Probe zugegeben wird. Als ein Ergebnis hiervon brauchen die Teststreifen nicht sorgfältig bezüglich der Frage überwacht zu werden, wann Konjugat-Puffer zugesetzt werden sollte. In dieser Hinsicht wird das Zeitfenster, nachdem die Probe zugegeben wurde, durch die vorliegende Erfindung beseitigt, wenn Konjugat-Puffer dem Teststreifen zugegeben wird.
Die Dynamik der Verwendung des Volumens der Probe, die an den Teststreifen abgegeben wird, um zu kontrollieren, wie die Probe in dem Teststreifen streut, wird nun in Bezug auf 1 erläutert. Wie oben diskutiert, erläutert 1 einen Teststreifen, der ein proximales und ein distales Ende 102, 104 hat und der in verschiedene bestimmte Zonen aufgeteilt ist. Der Teststreifen schließt eine Probenzugabezone 106 einschließt, wo eine Probe zu dem Teststreifen zugesetzt wird. Eine Absorbenszone 108 ist proximal zu der Probenzugabezone 106 angeordnet. Eine Testzone 110 ist distal zu der Probenzugabezone 106 angeordnet. Eine terminale Probenflußzone 116 ist distal zu der Testzone 110 positioniert. Eine Konjugat-Pufferzugabezone 118 liegt distal zu der terminalen Probenflußzone 116.
Zum Zwecke einer Erläuterung wird angenommen, daß die Testzone 10 ein erstes Analytbindemittel enthält und die Konjugat-Pufferzugabezone 118 ein zweites Analytbindemittel, das mit einem feststellbaren Marker markiert ist, einschließt. Es sei auch angenommen, daß der Teststreifen so gestaltet ist, daß ein Probenvolumen von 30 μl bewirkt, daß die Probe zu der Testzone 110, aber nicht über diese hinaus diffundiert. Ein Probenvolumen von 50 μl wird bewirken, daß die Probe zu dem distalen Ende der terminalen Probenflußzone 116 diffundiert.
Wenn eine Probe auf den Teststreifen innerhalb des Volumenbereichs von 30 bis 50 μl aufgegeben wird, wird die distale Front der Probe über das Testvolumen 110 hinaus diffundieren. Das distale Vorrücken der Probe wird in der terminalen Probenflußzone 116 angehalten. Analyt in dem Teil der Probe, welcher die Testzone 110 erreicht, wird an den ersten Antikörper binden und in der Testzone 110 immobilisiert. Andere Komponenten in der Probe werden nicht an den ersten Antikör per binden, da der erste Antikörper selektiv für den Analyten ist. Die Probe fließt dann zurück in der proximalen Richtung zu der Absorbenszone 108 über die Testzone 110. Wenn der Konjugat-Puffer zugegeben wird, bewirkt dieser, daß das zweite Analytbindemittel über die Testzone 110 diffundiert, wo das zweite Analytbindemittel an den Analyten, der in der Testzone 110 immobilisiert ist, bindet. Da die Probe aus der Testzone 110 weg diffundiert, bevor der Puffer die Testzone 110 erreicht, sind keine Mittel aus der Probe vorhanden, die sonst an das zweite Analytbindemittel binden könnten. Als ein Ergebnis hiervor konkurriert der in der Probe zu ermittelnde Analyt nicht mit anderen Mitteln in der Probe, um an das zweite Analytbindemittel zu binden.
Wenn ein Probenvolumen von weniger als 30 μl (zum Beispiel 25 μl) an den Teststreifen abgegeben wird, diffundiert die Probe niemals zu der Testzone 110. Als ein Ergebnis hiervon erreicht nichts von dem Analyten in der Probe die Testzone 110 und bindet an den ersten Antikörper. Wenn der Puffer zugesetzt wird, wird das zweite Analytbindemittel mit der Diffusion des Konjugat-Puffers getragen und durchquert die Testzone 110, ohne immobilisiert zu werden, da in der Testzone kein Analyt vorhanden ist.
Wenn das Probenvolumen, das abgegeben wird, größer als 50 μl (zum Beispiel 55 μl) ist, diffundiert die Probe über die Testzone 110 und über die terminale Probenflußzone 116 hinaus in die Konjugat-Pufferzugabezone. Etwas von dem Analyt wird an das erste Analytbindemittel in der Testzone 110 binden und immobilisiert werden. Zwischenzeitlich wird etwas Analyt an das zweite Analytbindemittel in der Konjugat-Pufferzugabezone 118 binden, bevor der Analyt zurückfließt und an das erste Analytbindemittel in der Testzone 110 bindet. Analyt, der an zwei Kopien des zweiten Analytbindemittels bindet, bindet nicht wahrscheinlich an das erste Analytbindemittel infolge sterischer Hinderung. Es kann auch schwieriger sein, den Analyten an das erste Analytbindemittel zu binden, nachdem der Analyt bereits an das zweite Analytbindemittel gebunden wurde. Als ein Ergebnis kann die Empfindlichkeit des Teststreifens reduziert werden, wenn der Analyt an das zweite Analytbindemittel vor einer Bindung an das erste Analytbindemittel bindet. Andere Komponenten in dem Anteil der Probe, der die Konjugat-Pufferzugabezone 118 erreicht, können auch an das zweite Analytbindemittel binden. Diese anderen Komponenten werden mit dem Analyt für eine Bindung an das zweite Analytbindemittel konkurrieren.
Durch Steuerung des Volumens der abgegebenen Probe und dadurch (1) Freisetzen des Analyten für das erste Analytbindemittel, bevor der immobilisierte Analyt für das zweite Analytbindemittel freigelegt wird, und (2) durch Nichtfreilegen der zweiten Analytbindemittel für den Analyt, bevor er für andere Komponenten in der Probe freigesetzt wird, wird in der Probe eine nichtspezifische Bindung reduziert, was signifikant die Testempfindlichkeit und Analytermittlungspräzision steigert.
Wie oben bereits beschrieben wurde, sind zwei Vorteile der Teststreifen der vorliegenden Erfindung ihre Selbstwasch- und Selbstreitgebereigenschaften. Um die Signifikanz dieser Eigenschaften zu erklären, wird nun ein Vergleich mit dem Teststreifen „FLEXPACK^® HP durchgeführt, wobei dieser Teststreifen von Abbott hergestellt wird, welches sich in den 6A und 6B niederschlägt.
6A erläutert das Layout des Teststreifens. Wie erläutert, enthält der Teststreifen zwei separate Abschnitte 310, 312, die jeweils an eines oder an beide mit einem Gelenk 314 befestigt sind. Abschnitt 310 rechts enthält einen Teststreifen 316, der eine Probenzugabezone 318, eine Testzone 319, eine Grenzlinie 320 und ein Konjugat-Pufferüberführungspolster 322 einschließt. Abschnitt 312 links enthält ein Absorbens-Polster 324, das gegenüber der Probenzugabezone 318 liegt, ein Konjugat-Pufferzugabepolster 326, das gegenüber dem Konjugat-Pufferübertragungspolster 322 liegt, und ein Testfenster 328, das gegenüber der Testzone 319 liegt. Die einander gegenüberliegenden Positionen des Absorbens-Polsters 324, das Konjugat-Pufferzugabepolster 326 und das Testfenster 328 erlauben, daß das Absorbens-Polster 324 in Berührung mit der Probenzugabezone 318 kommt und das Konjugat-Pufferzugabepolster 326 in Berührung mit dem Konjugat-Pufferüberführungspolster 322 kommt, wenn der erste und der zweite Abschnitt 310, 312 in Berührung miteinander gebracht werden. Außerdem kann die Testzone 319 durch das Testfenster 328 eingesehen werden, wenn die ersten und zweiten Abschnitte 310, 312 zusammengebraucht werden.
6B erläutert das Arbeiten des Teststreifens, der in 6A beschrieben ist. Wie erläutert, wird ein Konjugat-Puffer 330 dem Konjugat-Pufferzugabepolster 326 zugeführt. Das Konjugat-Pufferzugabepolster 326 enthält ein zweites Analytbindemittel (zum Beispiel einen Antikörper), der in der Lage ist, an einen zu ermittelnden Analyten in der Probe zu binden. Das zweite Analytbindemittel ist mit einem feststellbaren Marker markiert, der es erlaubt, das zweite Analytbindemittel sichtbar zu machen. Das zweite Analytbindemittel ist nicht spezifisch für den Analyten und kann somit auch andere Komponenten in der Probe binden.
Eine Probe 332 wird dann genommen und der Probenzugabezone 318 zugeführt. Wenn zugegeben, diffundiert die Probe durch den Teststreifen 316 von der Probenzugabezone 318 über die Testzone 319. Die Testzone 319 enthält eine immobilisiertes erstes Analytbindemittel (zum Beispiel einen Antikörper), das selektiv an einen Analyten in der Probe bindet, den festzustellen der Teststreifen bestimmt ist. Wenn die Probe die Testzone 319 überquert, bindet in der Probe vorhandener Analyt an das erste Analytbindemittel und wird in der Testzone 319 immobilisiert.
Wenn die Diffusionsfront der Probe die Grenzlinie 320 erreicht, wird der Benutzer dazu gebracht, die ersten und zweiten Abschnitte 310, 312 zusammenzubringen. Wenn man die ersten und zweiten Abschnitte 310, 312 zusammenbringt, bewirkt man, daß das Absorbens-Polster 326 die Probe zurück zu der Probenzugabezone 318 zieht. Inzwischen wird Konjugat-Puffer zu dem Konjugat-Pufferüberführungspolster 322 von dem Konjugat-Pufferzugabepolster 320 überführt. Der Konjugat-Puffer diffundiert aus dem Konjugat-Pufferüberführungspolster 322 über die Testzone 319. Das zweite Analytbindemittel, das in der Konjugat-Pufferzugabezone 318 gespeichert wurde, diffundiert mit dem Konjugat-Puffer und tritt in Berührung mit immobilisiertem Analyten in der Testzone 319. Beobachtung des visuell feststellbaren Markers auf dem zweiten Analytbindemittel wird nach dem Immobilisieren in der Testzone 319 verwendet, den Analyten festzustellen.
Wie man aus der obigen Beschreibung des Betriebs des FLEXPACK^® HP-Teststreifens sehen kann, ist es erforderlich, zu bestimmen, wann die Probe die Grenzlinie 320 erreicht, bevor sie bewirkt, daß der Konjugat-Puffer von der Pufferzugabezone 318 zu dem Konjugat-Pufferzugabe polster 320 überführt wird und beginnt, zu der Testzone 319 hin zu fließen. Es ist auch erforderlich, die Bestätigungsstufe der Berührung der Probenzugabezone 318 mit dem Absorbens-Polster 324 zu nehmen, um zu bewirken, daß die Probe aus der Testzone 319 abgezogen wird. Die Gestaltung der Teststreifen nach der vorliegenden Erfindung, wie beispielsweise jene, die in den 2–4 erläutert sind, schalten die Notwendigkeit aus, den Teststreifen zu überwachen, um zu bestimmen, wann die Entfernung der Probe aus der Testzone beginnt. Außerdem braucht man, da die Probe automatisch abgezogen wird, nicht sorgfältig den Teststreifen bezüglich des Zeitpunktes, wann der Konjugat-Puffer zuzusetzen ist, zu überwachen. Vielmehr sind, wie in Beispiel 2 gezeigt, die Testergebnisse, welche die Teststreifen der vorliegenden Erfindung verwenden, nicht abhängig davon, wann der Konjugat-Puffer die Testzonen erreicht, nachdem die Probe aus den Testzonen diffundiert.
Querflußtests gemäß der Erfindung können für eine Vielzahl von Anwendungen benutzt werden. Beispielsweise können die Tests verwendet werden, um menschliche Krankheiten, wie infektiöse Erkrankungen oder irgendwelche anderen menschlichen Störungen aufzufinden, einschließlich erkennbarer Epitope (zum Beispiel Krebs, autoimmune Erkrankung, kardiovaskuläre Zustände und Pathologie). Die Versuche können auch in der Tiermedizin, bei Nahrungsmitteltesten, in der Landwirtschaft oder bei der Anwendung von Feinchemikalien verwendet werden. Die Querflußtests nach der Erfindung können auf verschiedenen Wegen durchgeführt werden, einschließlich der Verwendung einer Querflußassay-Testapparatur, wie jene, die in der Anmeldung Serien-Nummer 09/199,255, angemeldet am 23. November 1998, beschrieben ist und die hier durch Bezugnahme einbezogen wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform besitzt die Querflußassay-Testapparatur eine ReLIA^®-Testapparatur, die bei PraxSys Biosystems (San Ramon, CA) erhältlich ist.
1. Konstruktion von Teststreifen nach der vorliegenden Erfindung
Verfahren und Materialien zum Konstruieren von Teststreifen nach der vorliegenden Erfindung werden nunmehr in weiteren Einzelheiten diskutiert. Es ist festzustellen, daß die besondere Konstruktion des Teststreifens in Abhängigkeit von dem speziellen Assay variiert werden kann, der dazu bestimmt ist, den Teststreifen herzustellen. Veränderungen auf dem Weg, auf welchem die Teststreifen konstruiert werden können über dieses Beispiel hinaus, sind dazu bestimmt, innerhalb des Erfindungsgedankens zu fallen.
7 erläutert eine seitliche, weggebrochene Darstellung des Querflußteststreifens, der in 1 erläutert ist. Wie in 7 erläutert, kann der Teststreifen 100 einen Stützstreifen 402 einschließen, der über eine Länge des Teststreifens verläuft. Ein Membranstreifen 404 ist über dem Stützstreifen 402 angeordnet und dient als ein Diffusionsweg für den Teststreifen. Ein Absorbens-Polster 408 ist über dem Membranstreifen 404 in der Absorbenszone 408 positioniert, die zu einem proximalen Ende des Teststreifens hin angeordnet ist. Ein Probenpolster 406 ist über dem Membranstreifen 404 distal zu dem Absorbens-Polster 408 positioniert. Ein Klebstoff 409 kann verwendet werden, um das Probenpolster 406 an dem Membranstreifen 404 zu befestigen. Eine oder mehrere Testzonen 410, 412, 414 können in dem Membranstreifen 404 distal zu dem Probenpolster 406 ausgebildet sein. Ein Konjugat-Pufferzugabepolster 416 ist über dem Membranstreifen 404 distal zu den Testzonen 410, 412, 414 und distal zu der terminalen Probenflußzone 116 angeordnet. Eine Schutzabdeckung 418 ist über den Testzonen angeordnet. Um zu erlauben, daß Luftblasen, die zwischen den Fluidfronten eingeschlossen sind, entweichen können, ist ein Spalt zwischen der Test- und der Konjugatzone belassen, der nicht durch die Schutzabdeckung 418 bedeckt ist. Die Schutzabdeckung 418 kann auch breiter über dem Membranstreifen 404 angeordnet sein, um andere Abschnitte des Teststreifens zu schützen.
Der Stützstreifen kann aus irgendeinem beständigen, nicht-porösen Material bestehen, das ausreichend fest ist, um die Materialien und die mit ihm verbundenen Streifen ausreichend fest zu unterstützen. Da viele Assays Wasser als ein Diffusionsmedium verwenden, ist der Stützstreifen vorzugsweise im wesentlichen undurchlässig für Wasser. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht der Stützstreifen aus einem Polymerfilm, der stärker bevorzugt ein Poly-(vinylchlorid-)-Film ist.
Der Membranstreifen kann aus irgendeiner Substanz bestehen, die genügend Porosität besitzt, um Kapillarwirkung von Fluid entlang seiner Oberfläche und durch sein Inneres zu erlauben. Der Membranstreifen sollte genügend Porosität haben, um eine Bewegung von Antikörper- oder Antigen-beschichteten Teilchen zu erlauben. Der Membranstreifen sollte auch benetzbar für das Fluid sein, das in der Probe verwendet wird und das den aufzufindenden Analyten enthält (zum Beispiel Hydrophilizität für wäßrige Fluide, Hydrophobizität für organische Lösungsmittel). Hydrophobizität einer Membran kann geändert werden, um die Membran hydrophil für die Verwendung mit wäßrigem Fluid zu machen, wie beispielsweise nach den Verfahren, die in den US-Patentschriften 4,340,482 und 4,618,533 beschrieben sind. Diese beschreiben eine Umformung einer hydrophoben Oberfläche in eine hydrophile Oberfläche. Beispiele von Substanzen, die verwendet werden können, um einen Membranstreifen zu bilden, schließen Zellulose, Nitrozellulose, Zelluloseacetat, Glasfaser, Nylon, Polyelektrolytionenaustauschmembran, Acrylcopolymer/Nylon und Polyethersulfon ein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Membranstreifen aus Nitrozellulose gefertigt.
Das Absorbens-Polster kann aus einer Absorbens-Substanz gebildet werden, die das Fluid absorbieren kann, welches als die Probe und der Puffer verwendet wird. Die Absorptionskapazität des Absorbens-Polsters sollte ausreichend groß sein, um die Fluide zu absorbieren, die an den Teststreifen abgegeben werden. Beispiele von Substanzen, die für die Verwendung in einem Absorbens-Polster geeignet sind, schließen Zellulose und Glasfasern ein.
Das Pufferzugabepolster kann aus irgendeiner Absorbens-Substanz gebildet sein. Beispiele von Substanzen, die verwendet werden können, sind etwa Zellulose, Zellulosenitrat, Zelluloseacetat, Glasfaser, Nylon, Polyelektrolytionenaustauschmembran, Acrylcopolymer/Nylon und Polyethersulfon.
Wie oben diskutiert, kann das Konjugat-Pufferzugabepolster als ein Konjugat-Polster dienen und ein mit einem feststellbaren Marker markiertes Mittel enthalten, das in der Lage ist, an den Analyten zu binden, der in der Probe festgestellt werden soll. Alternativ kann der Teststreifen ein Konjugat-Polster getrennt von dem Pufferzugabepolster sein, welches ein mit einem feststellbaren Marker markiertes Mittel enthält, das in der Lage ist, den festzustellenden Analyten in der Probe zu entdecken.
Die Schutzabdeckung kann aus irgendeinem Material gebildet werden, welches für Wasser undurchlässig ist, und ist vorzugsweise durchscheinend oder transparent. Die Schutzabdeckung kann eine einzelne Schicht oder mehrere Schichten sein. Bevorzugte Materialien für die Verwendung in der Schutzabdeckung sind beispielsweise optisch überführbare Materialien, wie Polyamid, Polyester, Polyethylen, Acrylglas oder ähnliche Materialien. Die Schutzabdeckung kann aus durchsichtigem oder undurchsichtigem Material bestehen, entsprechend der anzuwendenden Methode. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Schutzabdeckung aus optisch klarem Polyester.
2. Assays für die Verwendung mit Teststreifen nach der vorliegenden Erfindung
Die Teststreifen nach der vorliegenden Erfindung sind dafür bestimmt, mit einer großen Vielzahl von Querflußtests einschließlich zwei Analytbindemitteln verwendbar zu sein, die jeweils an einen Analyten binden, der ermittelt werden soll. Wenigstens eines der Bindemittel sollte bindungsselektiv an den Analyten binden. Spezieller sollte eines der Bindemittel an den Analyten und nicht an irgendwelche anderen Komponenten der Probe binden.
Wie hier verwendet, soll der Begriff „Analyt" irgendeine Komponente einer Probe (zum Beispiel Molekül, Verbindung oder Aggregate hiervon) bedeuten, die ermittelt und gegebenenfalls quantitativ durch einen Assayteststreifen bestimmt werden sollen. Beispiele von Analyten schließen Proteine, wie Hormone und andere Sekretproteine, Enzyme und Zelloberflächenproteine, Glycoproteine, Peptide, kleine Moleküle, Polysaccharide, Antikörper (einschließlich monoklonaler oder polyklonaler Antikörper und Teile derselben), Nukleinsäuren, Arzneimittel, Toxine, Viren oder Virusteilchen, Teile einer Zellwand und andere Verbindungen ein, die Epitope besitzen.
Die ersten und zweiten Analytbindemittel können irgendwelche Mittel sein, die an den Analyten binden können, der ermittelt werden soll. Eine Vielzahl unterschiedlicher Molekültypen kann als Analyt bindende Mittel verwendet werden, einschließlich beispielsweise Antikörper, gebaute Proteine, Peptide, Haptene und Lysate, die heterogene Gemische von Antigenen mit Analytbindungsstellen haben. P. Holliger et al., Trends in Biotechnology 13: 7–9 (1995), S. M. Charnow et al., Trends in Biotechnology 14: 52–60 (1996). Wenn der zu ermittelnde Analyt ein Ligand ist, kann ein Rezeptor, der an den Liganden bindet, verwendet werden und umgekehrt. In einer speziellen Ausführungsform sind die ersten und/oder zweiten Analytbindemittel Antiköper, die an einen Immunogenen Bereich des Analyten binden.
Es ist festzustellen, daß wenigstens eines der ersten und zweiten Analytbindemittel an den Analyten binden sollte und nicht an andere Komponenten in der Probe, die zu analysieren ist, hier so bezeichnet als ein analytselektives Bindemittel. Bei einer Ausführungsform ist das erste Analytbindemittel, welches in einer Testzone immobilisiert wird, ein analytselektives Bindemittel, und das zweite Analytbindemittel, welches mit einem feststellbaren Marker markiert ist, ist in der Lage, nicht selektiv an den Analyten zu binden. Bei einer anderen Ausführungsform kann das erste Analytbindemittel, welches in einer Testzone immobilisiert ist, nicht selektiv an den Analyten binden, und das zweite Analytbindemittel, welches mit einem feststellbaren Marker markiert ist, ist ein analytselekti ves Bindemittel. Bei noch einer anderen Ausführungsform sind beide, das erste und zweite Analytbindemittel, analytselektive Bindemittel.
Beispiele von analytselektivem Bindemittel schließen Antikörper (monoklonale, polyklonale und Bruchstücke derselben), die eine enge Bindungsaffinität nur an ein spezielles Biomolekül, wie ein Protein oder einen Rezeptor, haben. Der feststellbare Marker, der an dem zweiten Analytbindemittel befestigt ist, kann eine große Vielzahl von Materialien umfassen, solange der Marker festgestellt werden kann. Beispiele feststellbarer Marker sind, jedoch auf diese Teilchen begrenzt, lumineszente Markierung, kolorimetrische Markierung, fluoreszierende Markierungen, chemische Markierung, Enzyme, radioaktive Markierungen oder Hochfrequenzmarkierungen, Metallkolloide und chemolumineszente Markierungen. Beispiele üblicher Ermittelungsmethoden schließen, allerdings nicht auf optische Methoden begrenzt, solche Methode ein, wie Messung der Lichtstreuung, einfaches Reflexionsvermögen, Luminometer oder Photomultiplierröhre, Radioaktivität (gemessen mit einem Geigerzähler usw.), elektrische Leitfähigkeit oder dielektrische (Kapazitanz), elektrochemische Feststellung freigesetzter elektroaktiver Mittel, wie Indium-, Wismut-, Gallium- oder Telluriumionen, wie von Hayes et al. (Analytical Chem. 66: 1860–1865 (1994) beschrieben, oder Ferrocyanid, wie von Roberts und Durst (Analytical Chem. 67: 482–491 (1995)) vorgeschlagen, wobei in ein Liposom eingekapseltes Ferrocyanid durch Zugabe eines Tropfens Detergens bei der Ermittlungszone mit anschließender elektrochemischer Feststellung des freigesetzten Ferrocyanids freigesetzt wird. Andere herkömmliche Methoden können auch verwendet werden, wenn geeignet.
Es kann erwünscht sein, zwei oder mehr unterschiedliche Analyten unter Verwendung des gleichen Teststreifens zu testen. In solchen Fällen kann es erwünscht sein, unterschiedliche feststellbare Marker auf dem gleichen Teststreifen zu benutzen, wo jeder feststellbare Marker einen anderen Analyten ermittelt. Beispielsweise können unterschiedliche feststellbare Marker an unterschiedliche analytselektive Bindemittel binden. Die unterschiedlichen feststellbaren Marker können unterschiedliche fluoreszierende Mittel sein, deren Fluoreszenz bei unterschiedlichen Wellenlängen auftritt.
Bei Feststellung von zwei oder mehr unterschiedlichen Analyten unter Verwendung des gleichen Teststreifens können getrennte Testzonen gegebenenfalls auf dem Teststreifen für jeden zu ermittelnden Analyten gebildet werden. Der gleiche feststellbare Marker kann für alle der Analyten verwendet werden. Alternativ können, wie oben beschrieben, unterschiedliche feststellbare Marker für die verschiedenen Analyten benutzt werden, um eine Testzone zu verhindern, die mit anderen in Verwirrung gerät.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der feststellbare Marker ein Teilchen. Beispiele von Teilchen, die verwendet werden können, sind etwa, aber nicht ausschließlich kolloidale Schwefelteilchen, kolloidale Selenteilchen, kolloidale Bariumsulfatteilchen, kolloidale Eisensulfatteilchen, Metalliodatteilchen, Silberhalogenidteilchen, Siliciumoxidteilchen, kolloidale Metalloxidteilchen (wasserhaltig), kolloidale Metallsulfidteilchen, kolloidale Bleiselenidteilchen, kolloidale Cadmiumselenidteilchen, kolloidale Metallphosphatteilchen, kolloidale Metallferritteilchen, irgendwelche der oben erwähnten kolloidalen Teilchen, beschichtet mit organischen oder anorganischen Schichten, Protein- oder Peptidmoleküle, Liposomen oder organische Polymerlatexteilchen, wie Polystyrollatexperlen.
Eine bevorzugte Klasse von Teilchen sind kolloidale Goldteilchen. Kolloidale Goldteilchen können nach irgendeiner herkömmlichen Methode, wie nach Methoden, die von G. Frens, 1973, Nature Physical Science, 241: 20 (1973) beschrieben ist. Alternative Methoden können jene sein, die in den US-Patentschriften 5,578577, 5,141,850, 4,775,636, 4,853,335, 4,859,612, 5,079,172, 5,202,257, 5,514,602, 5,616,467 und 5,681,775 beschrieben sind.
Die Auswahl der Teilchengröße kann Faktoren, wie die Stabilität der Masse an Solreagenz und dessen Konjugate, Effizienz und Vollständigkeit der Abgabe von Teilchen von dem Konjugat-Polster, Geschwindigkeit und Vollständigkeit der Reaktion beeinflussen. Auch die Teilchenoberfläche kann sterische Behinderung zwischen gebundenen Resten beeinflussen. Die Teilchengröße kann auch so ausgewählt werden, daß sie auf der Porosität des Membranstreifens beruht. Die Teilchen sind vorzugsweise genügend klein, um entlang der Membran durch Kapillarwirkung des Konjugat-Puffers zu diffundieren.
Teilchen können markiert werden, um ihre Ermittlung zu erleichtern. Beispiele von Markierungen sind, doch nicht ausschließlich, lumineszente Markierungen, kolorimetrische Markierungen, wie Farbstoffe, fluoreszierende Markierungen oder chemische Markierungen, wie elektroaktive Mittel (zum Beispiel Ferrocyanid), Enzyme, radioaktive Markierungen oder Radiofrequenzmarkierungen.
Die Anzahl von in dem Teststreifen enthaltenen Teilchen kann variieren je nach der Größe und Zusammensetzung der Teilchen, der Zusammensetzung des Teststreifens und des Membranstreifens sowie der Empfindlichkeit des Assays. Die Anzahl von Teilchen liegt typischerweise im Bereich zwischen etwa 1 × 10⁸ und etwa 1 × 10¹³ Teilchen, obwohl weniger als etwa 1 × 10⁹ Teilchen verwendet werden können. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anzahl von Teilchen etwa 1 × 10¹¹ Teilchen.
3. Kontroll-Testzonen
Wie in 1 erläutert, kann eine Mehrzahl von Testzonen 110, 112, 114 auf dem Teststreifen vorliegen. Jede Testzone wird derart angeordnet, daß ein automatisches oder halbautomatisches analytisches Instrument oder ein Mensch als Ableser bestimmte Ergebnisse des Querfluß-Assays bestimmen kann.
Wie oben diskutiert, ist in wenigstens einer der Testzonen immobilisiert ein erstes Analytbindemittel, welches in der Lage ist, an einen Analyten in der Probe zu binden, welchen der Teststreifen ermitteln soll. In einigen Ausführungsformen kann es für einige der anderen Testzonen erwünscht sein, eine oder mehrere Kontrollzonen einzuschließen, wo ein oder mehrere Kontrollbindemittel immobilisiert wurden. Kontrollmittel, die an das Kontrollbindemittel binden können, können auf dem Teststreifen an verschiedenen Stellen positioniert sein oder dem Teststreifen zugefügt werden, wenn der Assay durchgeführt wird. Die Kontrollmittel sind vorzugsweise mit einem feststellbaren Marker markiert, wie den feststellbaren Markern, die oben beschrieben sind, um die Ermittlung des Kontrollmittels zu erleichtern, das an das Kontrollbindemittel bindet, welches in einer Kontrollzone immobilisiert ist.
Die Kontrollmittel und Kontrollbindungsmittel können in Kombination miteinander verwendet werden, um verschiedene Kontrollfunktionen zu bekommen. Beispielsweise können Kontrollbindungspaare verwendet werden, um zu bestimmen, ob die Probe und der Konjugat-Puffer ausreichend in dem Teststreifen diffundierten. Die Kontrollbindungspaare sind auch anwendbar als innere Standards und erlauben, daß Analyt-Messungsergebnisse zwischen unterschiedlichen Teststreifen verglichen werden. Dies kann angewendet werden, um die Veränderlichkeit von Streifen zu Streifen zu korrigieren. Eine solche Korrektur wäre unpraktisch mit äußeren Kontrollen, die beispielsweise auf einer statistischen Probennahme von Streifen basieren würde. Außerdem können von Menge zu Menge und Versuch zu Versuch Veränderungen zwischen unterschiedlichen Teststreifen durch die Verwendung von Kontrollbindungspaaren minimiert werden. Außerdem können die Effekte von nicht-spezifischer Bindung, wie weiter unten diskutiert wird, reduziert werden. Alle diese Korrekturen sind schwierig unter Verwendung äußerer Extraktionskontrollen durchzuführen.
Eine große Vielzahl von Mitteln ist in der Technik bekannt, die als Glied des Kontrollbindungspaares verwendet werden können. Beispielsweise kann wenigstens ein Glied des Kontrollbindungspaares ein natürlich vorkommendes oder konstruiertes Protein sein. Das Kontrollbindungspaar kann auch ein Rezeptor-Liganden-Paar sein. Außerdem kann wenigstens ein Glied des Kontrollbindungspaares ein Antigen, ein anderes organisches Molekül oder ein Hapten, konjugiert mit einem für den interessierenden Analyten nicht spezifischen Protein sein. Beschreibungen anderer geeigneter Glieder von Kontrollbindungspaaren können sich in dem US-Patent 5,096,837 finden und schließen IgG, andere Immunoglobuline, Rinderserumalbumin (BSA), andere Albumine, Kasein und Globulin, ein.
Erwünschte Eigenschaften für Kontrollmittel-Kontrollbindemittelpaare enthalten, doch nicht hierauf beschränkt, Massenstabilität, unspezifisches Verhalten für den interessierenden Analyten, Wiederholbarkeit und Voraussagbarkeit von Leistung im Test, Molekülgröße und Bindungsgier untereinander.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform binden Glieder des Kontrollbindungspaares nicht an etwas, das in dem Teststreifen vorhanden sein könnte, zum Beispiel die Probe. Bei einer Ausführungsform umfaßt das Kontrollbindemittel Kaninchen-Antidinitrophenol-(Anti-DNP)-Antikörper, und das Kontrollmittel schließt ein mit BSA (Rinderserumalbumin) konjugiertes Dinitrophenol ein.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden sowohl das zweite Analytbindemittel, welches entlang dem Teststreifen diffundiert, als auch das Kontrollmittel an ein Teilchen einer einzigen Art gebunden. Die Bindung kann durch nicht-spezifische Absorption oder durch herkömmliche Konjugatchemie erfolgen. Alternativ kann ein nicht-kovalentes Bindungssystem, wie Biotin-Avidin, oder sogar ein Antikörper, der spezifisch für das zweite Analytbindemittel ist, verwendet werden, um das Analytbindemittel an das Teilchen zu binden. Bifunktionelle und multifunktionelle Reagenzien können auch verwendet werden, um an das zweite Analytbindemittel anzukoppeln und das Kontrollmittel an das Teilchen zu binden.
Die Anzahl zweiter Analytbindemittel und Kontrollmittel, die an jedes Teilchen gebunden werden, kann je nachdem, was für einen speziellen Test geeignet ist, variiert werden. Beispielsweise können zwei Kopien des zweiten Analytbindemittels und eine Kopie des Kontrollmittels an jedes Teilchen gebunden werden. Alternativ können eine Kopie des zweiten Analytbindemittels und zwei Kopien des Kontrollmittels an jedes Teilchen gebunden werden. Andere Variationen der Verhältnisse zwischen zweitem Analytbindemittel : Kontrollmittel : Teilchen könne je nach dem speziellen Assay, in welchem sie verwendet werden sollen, benutz werden, wobei diese Veränderungen in den Gedanken der vorliegenden Erfindung fallen sollen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Teststreifen mehr als eine Kontrollzone und wird verwendet, um eine Kalibrierungskurve zu erzeugen, auf welcher eine weite Vielzahl von Analyt-Messungsergebnissen verglichen werden kann. Die Ausführungsform ist in größeren Einzelheiten in der Patentanmeldung, Serien-Nummer 09/198,118, eingereicht am 23. November 1998, beschrieben und wird durch Bezugnahme hier eingeführt. Wenn der Teststreifen mehr als eine Kontrollzone besitzt, erlaubt er Querflußassays, um einen breiteren dynamischen Bereich als herkömmliche Querflußassays zu haben. In bevorzugten Ausführungsformen werden Teststreifen mit 2, 3 oder mehr Kontrollzonen mit einer relativ maßstäblichen Methodologie verwendet, die nachfolgend weiter diskutiert ist und eine Mengenaufzeichnung von ermittelten Kontrollbindungspaaren auf der gleichen Skala erlaubt, auf welcher auch Mengen von ermitteltem Analyt aufgezeichnet werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform hat der Teststreifen wenigstens eine Hochkontrollzone und wenigstens eine Niederkontrollzone. Der Unterschied zwischen den beiden Zonen ist allgemein einer der Konzentration. Die Konzentration von Kontrollmittel in der Hochkontrollzone ist größer als die Konzentration von Kontrollmittel in der Niederkontrollzone. So wird die Menge an Kontrollbindungspaaren in der Hochkontrollzone gegenüber der Niederkontrollzone höher sein. Bei Ausführungsformen, bei denen die Kontrollbindungspaarmenge in einer bestimmten Kontrollzone auf der gleichen Messungsskala aufgezeichnet werden kann, auf welcher die Analytmenge berichtet wird, kann eine Kalibrierungskurve durch die Werte der Bindungspaare in der Hochkontroll- und der Niederkontrollzone aufgezeichnet werden.
Bei anderen Ausführungsformen können mehr als zwei Kontrollzonen vorliegen. Dies erlaubt es, eine Kurve zu erzeugen, die besser irgendwelche Nichtlinearitäten reflektiert, die in dem Test zwischen der ermittelten Analytmenge und der Messung vorhanden sind, gegen welche die Menge, wie oben diskutiert, aufgezeichnet wird. Obwohl solche Nichtlinearitäten sonst Assays beeinträchtigen, die eine relativ lineare Beziehung annehmen, können sie für die Verwendung mehrfacher Kontrollzonen korrigiert werden, 2, 3 oder mehr Kontrollzonen können verwendet werden.
Bei einer anderen Ausführungsform kann eine einzelne Kontrollzone Kontrollmittel von mehr als einem Typ umfassen. Dies kann von Verwendung in Ausführungsformen sein, wo es mehr als eine Population von Analytbindemittel und unspezifischen Analytmitteln, gekoppelt mit einem Ermittlungsmittel gibt. Beispielsweise wenn es erwünscht ist, zwei oder mehr Analyten von Interesse auf dem gleichen Teststreifen zu testen, können zwei Populationen von Analytbindemittel und nicht-spezifischem Analytmitteln, gekoppelt mit einem Ermittlungsmittel, hergestellt werden. Verschiedene Ermittlungsmittel können für jede Population benutzt werden, was einen Unterschied zwischen Ergebnissen für die beiden unterschiedlichen Analyten von Interesse er gibt. Unter solchen Umständen kann es erwünscht sein, Kontrollzonen zu verwenden, die unterschiedliche Kontrollmittel oder Kontrollbindungspaare umfaßt.
Die Kontrollzonen können in einer Vielzahl von Stellen in der Gruppe der Testzonen angeordnet sein. Es ist festzustellen, daß die Testzonen auf verschiedenen Plätzen auf diesem Streifen plaziert sein können, je nach der Flußgestaltung des Teststreifens nach der vorliegenden Erfindung.
Assays werden unter Verwendung eines Teststreifens durchgeführt, der eine oder mehrere Kontrollbereiche als Teil der Testbereiche in der gleichen Weise wie in Bezug auf die 2A–2H und 3A–3H beschrieben wurde. Es ist festzustellen, daß entweder der Teststreifen oder der Konjugat-Puffer das Kontrollmittel enthält, welches an das immobilisierte Kontrollbindemittel bindet, wie beispielsweise in den Testzonen 112 und 114 der 2A–2H und den Testzonen 212 und 214 der 3A–3H. Wenn der Konjugat-Puffer zugegeben wird, diffundiert das Kontrollmittel mit dem Konjugat-Puffer und bindet an das Kontrollbindungsmittel, das in den Kontrollzonen immobilisiert ist.
Die Mengen von Kontrollmitteln, die in den Kontrollzonen immobilisiert sind, werden zusammen mit der Ermittlung von Mengen zweiter Analytbindemitteln, das in den Testzonen immobilisiert ist, gefunden. Wie oben festgestellt, ist es bevorzugt für die Kontrollmittel und die zweiten Analytbindemittel, mit einem feststellbaren Markier markiert zu sein, was ihre Auffindung erleichtert. Die Menge von feststellbarem Marker in jeder Testzone kann leicht mit verschiedenen bekannten Techniken ermittelt werden, je nach der Type der verwendeten feststellbaren Marker. Übliche Beispiele von Ermittlungstechniken schließen optische Methoden (Lichtstreuung, einfache Reflexion, Luminometer oder Photomultiplierröhre), Radioaktivität, elektrische Leitfähigkeit, dielektrische Kapazitanz, elektrochemische Ermittlung von freigesetzten elektroaktiven Mitteln, wie oben ausgeführt wurde.
Wenn die Menge an feststellbaren Marken in jeder Testzone gemessen wurde, können diese Messungen verwendet werden, um die Menge an vorhandenem Analyt zu ermitteln und vorzugsweise zu quantifizieren, vorzugsweise auch durch Kalibrieren des Teststreifens unter Verwendung der Mengen feststellbarer Marker in den Kontrollzonen. Beispielsweise, wenn Hochkontroll- und Niederkontrollzonen verwendet werden, kann die Menge an Kontrollmittel, das in den Hoch- und Niederkontrollzonen immobilisiert ist, verwendet werden, um die Menge an zweitem Analytbindemittel in Bezug auf die Hoch- und Niederkontrollzonen zu quantifizieren. Diese relativen Intensitätsmessungen können dann verwendet werden, um die Anzahl von Kopien von Analyt, die in dem gemessenen Volumen vorliegen, zu bestimmen.
Ein Merkmal für die Verwendung mehrfacher Kontrollzonen ist die Fähigkeit, einen relativen Maßstab für Analytmessungen zu erzeugen. Wenn die Mengen an feststellbaren Markern quantifiziert wurden, können diese Mengen dann auf einer anderen Meßskala eingezeichnet werden. Beispielsweise können, während die Ergebnisse aus Messungen des Analyten auf der Basis einer absoluten Messung des Analyten gemessen werden können, die berichteten Ergebnisse bedeutungsvoller in anderen Einheiten, wie einer Intensität in Bezug auf diejenige einer Kontrollzone oder von Kontrollzonen, was hier als relative Intensität oder RI bezeichnet wird. Ergebnisse können auch als die Anzahl von Kopien von Analyt, der in dem Messungsvolumen enthalten ist, ausgedrückt werden. Die Aufzeichnung der Menge von festgestelltem Analyt auf anderen Messungsskalen ist eine bevorzugte Ausführungsform zum Berichten von Ergebnissen des erfinderischen Assays.
Beispielsweise können die Assay-Ergebnisse auf einer relativen Skala aufgezeichnet werden. Unter Verwendung einer relativen Skala, wie der relativen Intensität (RI) für innere Kontrolle(n) können absolute Werte für den festgestellten Analyt in RI-Werte umgewandelt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann niedrige Kontrolle auf einen RI-Wert 1 und hohe Kontrolle auf einen RE-Wert 3 übertragen werden, selbst obwohl das Verhältnis der absoluten Werte dieser Kontrollen unterschiedlich sein kann. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann das absolute Werteverhältnis wenigstens etwa 5 : 1 sein, während das RI-Verhältnis absolut 3 : 1 sein kann. Wenn man so vorgeht, werden Veränderungen bei einzelnen Teststreifen, die den gemessenen absoluten Wert beeinflussen, bewirken, daß die Standardkurve auf einer Y-Achse auf und ab wechselt, aber einen kleineren Einfluß auf den RI-Wert ausübt, der entlang der X-Achse aufgetragen wird. Dies wird systematische die Veränderlichkeit im berichteten Ergebnis dämpfen, d.h. als einen „negativen Gewinn" behandeln.
Wenn beispielsweise ein negativer Gewinn zwischen der gemessenen Menge an Analyt und der berichteten Analytmenge vorliegt, dann werden große Veränderungen in der gemessenen Analytmenge in relativ kleiner Veränderungen in der berichteten Analytmenge erfaßt. Obwohl die zugrundeliegende Variierbarkeit der gemessenen Analytmenge sich nicht verändert, kann diese Methode unter bestimmten Bedingungen verwendbar sein. Der negative Gewinneffekt dämpft etwas von der Testvariierbarkeit und kann verwendet werden, um Reproduzierbarkeit der berichteten Ergebnisse des Tests im Vergleich mit einfacher Berichterstattung eines absoluten Wertes dessen, was gemessen wird, zu verbessern.
Zusätzlich zu einem Bericht der Testergebnisse auf einer kontinuierlichen Skala können diese direkt als die ermittelte Analytmenge oder indirekt als eine Messungsskala, auf welcher die ermittelte Analytmenge aufgezeichnet war, die Tests nach der Erfindung in einem Assay vom „weggeschnittenen Stil" verwendet werden. Wenn der feststellbare Marker in einer Analytbindungszone ermittelt wird, kann die Menge an feststellbarem Marker mit einem weggeschnittenen Wert verglichen werden. Ein weggeschnittener Wert ist der Wert, oberhalb welchem der Test als positiv angesehen werden kann, d.h. der interessierende Analyt in der Fluidprobe in einigen Graden von statistischem Vertrauen vorliegt. Unter dem weggeschnittenen Wert wird der Test allgemein als nicht positiv angesehen, entweder weil der interessierende Analyt nicht vorliegt oder der Querflußtest nach der Erfindung nicht seine Anwesenheit feststellte. Obwohl ein weggeschnittener Wert auf der Basis eines direkt gemessenen Wertes ermittelt werden kann, wie die Menge von festgestelltem Analyt, können die Ergebnisse bedeutungsvoller sein, wenn man auf einer indirekten oder relativen Skala berichtet.
Ein weggeschnittener Querflußassay ist erwünschter, wenn die Messung eine Trennung zwischen einem negativen Wert und einem positiven Wert zunimmt. Ein negativer Wert ist der be richtete Wert auf der kontinuierlichen Skala im Fall, wo der interessierende Analyt statistisch nicht vorhanden ist. Umgekehrt ist ein positiver Wert der berichtete Wert auf der kontinuierlichen Skala im Fall, wo der Analyt von Interesse statistisch vorliegt. Wenn diese Werte zusammenfallen, vermindert sich die Wahrscheinlichkeit, in der Lage zu sein, statistisch Positives und Negatives getrennt voneinander zu berichten.
Erwünscht ist auch ein Wegschnitt-Querfluß mit erhöhter Präzision an dem Wegschnitt. Wenn es weniger Veränderung an dem gewählten Wegschnitt gibt, ist es wahrscheinlicher, daß ein positives Ergebnis genau als positiv und ein negatives Ergebnis genau als negativ angesehen werden kann.
Assayergebnisse können entweder auf einer oben diskutierten „relativen" oder einer „absoluten" Skala aufgezeichnet werden. Absolute Skalen werden in tatsächlichen physikalischen Einheiten gemessen, wie einer Anzahl von Analytkopien je Milliliter Fluid. Messungen in dem absoluten Maßstab können beim Testen bezüglich bestimmter Krankheiten oder Symptome bevorzugt sein, wie Test hinsichtlich Krebs-Markern. In solchen bevorzugten Ausführungsform kann das Ergebnis in Einheiten, wie ng/ml, ausgedrückt werden. Demnach können die Kontrollzonen einen Wert haben, der auf Konzentrationen von Kontrollmittel übertragen werden kann. In einer Ausdehnung des relativen Messungskonzeptes können die Reflexionsdicht (DR)-Werte einer Reihe von Standards bekannter Analytkonzentration gemessen und die Intensitäten in Bezug auf die kontrollwerte (RI-Werte) wie oben beschrieben berechnet werden. Die RI-Werte können dann gegen die Analytkonzentration aufgezeichnet werden, um eine Standardkurve zu konstruieren, in welcher die RI-Werte übertragene Konzentrationswerte des interessierenden Analyts sind. Das RI einer Probe kann dann auf dieser Standardkurve mit übertragenem Wert abgelesen werden, was ein den erwünschten Einheiten markiertes Ergebnis ergibt.
Wenn möglich ist es erwünscht, ein einziges Mittel sowohl als Analytbindemittel als auch als Kontrollmittel zu verwenden. Im Vergleich mit Versuchen, wo das Analytbindemittel und das Kontrollmittel getrennte Mittel sind, ergeben Assays, die ein einzelnes Mittel verwenden, eine weitere Messungstrennung negativer und positiver Probenpopulationen zusammen mit erhöhter Präzision des abgeschnittenen Wertes.
Viele Umstände können die absolute Reaktivität von Querflußassays beeinflussen, einschließlich, aber nicht ausschließlich herstellungsbezogener Variationen, benutzerbezogener Variationen, umweltinduzierter Variationen und Probeneffekte. Mit herkömmlichen Querflußassays kann jede dieser Variationen so wirken, daß Reaktivität eines Streifens gegenüber einem anderen unterdrückt oder merklich verbessert wird, was zu gegebenenfalls falschen negativen oder falschen positiven Ergebnissen führt. Kein Kontrollieren dieser oder anderer Variationen kann zu einer signifikanten Ungenauigkeit, Nichtreproduzierbarkeit, Fehlen von Empfindlichkeit und Fehlen von Spezifiziertheit der Tests führen.
Querflußassays sind auch Gegenstand einer Reihe von Störungen, welche die absolute Bindungsmenge eines jeden Analytbindungsmittels oder Kontrollmittels an die Testzonen beeinflußt. Beeinflussende Faktoren können einschließen: 1) Variierbarkeit in der Freisetzung des zweiten Ana lytbindemittels oder des Kontrollmittels aus einem Konjugat-Polster, 2) Einrichtung zur Vorrichtungsvariation in der nicht-spezifischen Bindung der Analyt bindenden Population an den Teststreifen, 3) Variierbarkeit der Bewegung der Analyt bindenden Population durch oder zusammen mit dem Teststreifen während des Assays infolge einer Veränderung der Porengröße des Teststreifens oder Membranstreifenmaterials oder nicht-spezifischer Aggregation des Analytbindemittels. Variierbarkeit absoluter Messungen des Bindens infolge dieser oder anderer Faktoren kann daher unannehmbar hoch bei herkömmlichen Querflußassays sein.
Diese Arten von Variierbarkeiten können durch Verwendung eines einzigen Mittels, welches das zweite Analytbindemittel und das Kontrollmittel einschließt, vermindert werden. Ein Teil der Querflußassaymatrix, der dem Kontrollmittel ausgesetzt wurde, wurde wahrscheinlicher dem zweiten Analytbindemittel ausgesetzt als herkömmliche Assays mit zwei Populationen. Ein Mechanismus, der eine Bewegung des Kontrollmittels entlag der oder durch die Querflußmatrix verhindert, verhindert wahrscheinlicher eine Bewegung des zweiten Analytbindemittels im Vergleich mit herkömmlichen Assays mit zwei Populationen. Drittens kann das Kontrollmittel so gewählt werden, daß die Menge an nicht-spezifischer Bindung des zweiten Analytbindemittels vermindert wird.
Reduktion von nicht-spezifischer Bindung kann auch infolge der Modifizierung von Hydrophobie/Hydrophilie-Profil der Analytauffindungsmatrix auftreten. Verminderung der Aggregation „Selbst-Assoziierung" der Analytermittlungsmatrixteilchen, welche eine Bewegung der Matrix entlang dem Streifen behindern könnte, kann auch durch Auswahl eines Kontrollmittels mit geeigneten Eigenschaften erreicht werden. Schließlich ist ein Vorteil der, daß infolge des Bedarfs, weniger Reagenzien zu bereiten, die Herstellungskosten reduziert werden können.
Mehrfachkontrollzonen, wie hier beschrieben, bieten eine Anzahl von potentiellen Vorteilen in der Praxis von Querfluássays. Zusätzliche Kontrollzonen können verwendet werden, um den dynamischen Bereich der Assay-Standardkurve auszudehnen, unabhängig davon, ob die Kurve linear oder nicht-linear ist. Mehrfachkontrollzonen können auch verwendet werden, um zu definieren, ob ein Prozon oder hoher Dosishakeneffekt in einem bestimmten Assay vorhanden ist. Wenn ein solcher Effekt vorliegt, dann kann der Verwender empfohlen bekommen, die Probe zu verdünnen, um die Konzentration des fraglichen Analyten unzweideutig zu bestimmen.
Beispiele
1. Konstruktion von Teststreifen
In diesem Beispiel ist die Konstruktion eines Teststreifens mit einer Gestaltung, wie in den 1 und 7 erläutert, beschrieben. Stützbögen von Millipore SRHF-Nitrozellulose (4,8 cm × 20 cm) (Membranstreifen 404) wurden durch Abgabe eines Antigenbandes (Testzone 410) in Längsrichtung beschichtet, und zwei Kontrollbänder (Testzonen 412, 414) auf der Nitrozellulose 404 unter Verwendung von einem Bio Dot XYZ3000 Abgabeplattform mit Biojets, die bei eine5r Frequenz von 120 Hz, 20,83 nl/Tropfen und 0,5 μl arbeitete. Die Nitrozellulosebögen 404 wurden dann 1 Stunde bei 37°C in einem Druckluftinkubator getrocknet, 15 Minuten in einer Lösung von PBS mit einem Gehalt von 10 mg/ml BSA, 1%/(Gewicht/Volumen) PEG 8000, 38 (Gewicht/Volumen) Mannitor, 0,3% (Gewicht/Volumen) Gelatine, 0,01% (Gewicht/Volumen) Natriumazid und 0,05% (Gewicht/Volumen) Natriumdodecylsulfat gehalten und dann eine weitere Stunde im Druckluftinkubator bei 37°C gelagert. Beschichtete Nitrozellulosebögen 404 wurden bei Raumtemperatur in Folientaschen entwässert.
Gelman 8980-Glasfaserpolster für eine Verwendung als Konjugat-Pufferpolster 416 wurde vorblockiert durch Eintauchen in eine Lösung von PBS 10 mg/ml BSA, 1% (Gewicht/Volumen) Triton X-100, 2,5% (Gewicht/Volumen) Sucrose und 0,3% (Gewicht/Volumen) Polyvinylpyrrolidon K-30 vorblockiert und dann 2 Stunden in einem Druckluftinkubator getrocknet. Eine Konjugat-Lösung in PBS 10 mg/ml BSA, 1% (Gewicht/Volumen) Triton X-100, 2,5% (Gewicht/Volumen) Sucrose und 0,3% (Gewicht/Volumen) Polyvinylpyrrolidon wurde in Längsrichtung auf den vorblockierten Konjugat-Pufferpolstern 416 unter Verwendung einer Bio Dot XYZ3000 Abgabeplattform mit einem einzigen Biojet, der bei einer Frequenz von 120 Hz arbeitete und 104,17 nl/Tropfen und 2,5 μl/cm abgab. Die Konjugat-Pufferpolster wurden mit Konjugat in Mustern von zwei bis sechs Linien je Zentimeter mit drei Mustern als Überzug auf jeweils einem Polster von 3 cm × 10 cm beschichtet. Beschichtete Konjugat-Pufferpolster 416 wurden im Vakuum bei 2 Torr während 2 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet und dann in drei Abschnitte von 1 cm × 20 cm zerschnitten, von denen jeder ein Muster besaß.
Teststreifen wurden durch Befestigung eines 4,8 × 20 cm eingebrannten Nitrozuellulosebogens 404, eines beschichteten Konjugat-Pufferpolsters 416 von 1 cm × 20 cm und eines Gelman Cytosep 1662-Bogen 406 von 1,2 cm × 20 cm auf einem Klebstoffüberzug 0,010 Inch Dicke, 6 cm × 20 cm Vinylstützbogen 402 (G & L Precision, Die Cutting) vorbereitet. Ein 0,5 cm breites Probenaufbringpolster 406 wurde auf der Nitrozellulose 404 unter Verwendung eines doppelseitigen Klebebands 409 aufgebracht. Streifen von 0,5 cm Breite wurden von dem zusammengesetzten Bogen mit einem G & L Precision Die Cutting Slitter abgeschnitten. Um die Teststreifen in einer Testkartusche (in 5A erläutert) zu vereinigen, wurde der Streifen in der Bodenhälfte des Halters plaziert. Ein Absorbens-Polster 408 von 0,6 cm × 1,5 cm wurde über der obersten Seite des Streifens angeordnet, und die Stifte der oberen Hälfte des Halters mit den Löchern zur Bodenhälfte ausgerichtet, und die Bodenhälften des Halters wurden fest zusammengepreßt.
2. Analyse von Pufferzugabezeit- und Volumenabhängigkeit von Teststreifen.
In diesem Beispiel verwendete Streifen wurden, wie im Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Die Streifen wurden mit 800 μg/ml Kaninchen-Anti-Dinitrophenyl (Anti-DNP) in dem Hochkontrollband (Testzone 414) beschichtet, 200 μg/ml Kaninchen-Anti-Dinitrophenyl (Anti-DNP) in dem Niederkontrollband (Testzone 412) und eine Lösung von Herpes 2gG₂-Antigen mit einer optischen Dichte bei 280 nm von etwa 0,115 in der Testzone 410 beschichtet. Die Reihenfolge der Bänder auf dem Streifen war: Antigenband am nächsten dem Konjugat-Pufferpolster, Niederkontrollzone zwischen dem Antigenband und dem Hochkontrollband, und das Hochkontrollband am weitesten von dem Konjugat-Pufferpolster entfernt und am nächsten dem Absorbens-Polster.
Die vorblockierten Konjugat-Pufferpolster 416 wurden mit Portein A-P; M^®-Konjugat [Protein A/BSA/DNP (2 x/0,5 x)]-8,5 nm Gold durch Vermischen von drei Volumenteilchen der Konjugat-Lagerlösung (OD 520 etwa 63) mit einem Volumenteil PBS, enthaltend 40 mg/ml BSA, 4% (Gewicht/Volumen) Triton X-100, 10% (Gewicht/Volumen) Sucrose und 1,2% (Gewicht/Volumen) Polyvinylpyrrolidon K-30 sowie 0,15 Volumenteile 20 X PBS. Das Gemisch wurde auf den vorblockierten Puffer-Konkugat-Pufferpolstern aufgebracht, wie in Beispiel 1 beschrieben ist.
Der Assay wurde in der Weise durchgeführt, daß die Kassette auf dem Labortisch plaziert wurde und dann jeweils 32,5 μl, 35 μl, 40 μl, 45 μl oder 50 μl Herpes-2 in mäßig positiver Probe 705145 zu dem Probenpolster 406 durch die Probenzugabeöffnung der Kassette zugegeben wurden. 125 μl Konjugat-Puffer (PBX, 10 mg/ml BSA, 0,1% Natriumazid und 2 mM EDTA) wurden dann zu Konjugat-Pufferzusatzpolster 416 0 Minuten, 5 Minuten oder 15 Minuten, nachdem der Probe die terminale Probenflußzone 116 erreichte, plaziert. Die den Streifen enthaltende Kassette wurde dann in einer ReLia^®-Maschine angeordnet, die so eingestellt war, daß sie den ReLia^®-Test laufen und für die Auffindung von Antikörpern zu Herpes 2 ablesen ließ. Die Streifentemperatur wurde auf 40°C eingestellt, und die Streifen wurden nach 10 Minuten abgelesen.
Aus den in 8 gezeigten Ergebnissen waren die Ergebnisse aus dem ReLia^®--Stopfluß Herpes 2-Test unabhängig von dem zugegebenen Probenvolumen und der Inkubationszeit vor der Einleitung des Umkehrflusses für Probenvolumina von 35 bis 45 μl und Inkubationszeiten von bis zu 15 Minuten, der längsten untersuchten Verzögerung. In diesem Bereich von Volumina und Inkubationszeiten war das CV auf dem Assay im Ergebnis 12,5%.
3. Herpes 2-Assay
In diesem Beispiel verwendete Streifen wurden mit 800 μg/ml Kaninchen-Anti-Dinitrophenyl (Anti-DNP) in dem Hochkontrollband, 200 μg/ml Kaninchen-Anti-Dinitrophenyl (Anti-DNP) in dem Niederkontrollband beschichtet, und eine Lösung von Herpes 2 gG₂-Antigen mit einer optischen Dichte bei 280 nm von etwa 0,115 in dem Antigenband beschichtet. Die Reihenfolge der Bänder auf dem Streifen war: Antigenband am nächsten dem Konjugat-Pufferpolster, die Niederkontrollzone zwischen dem Antigenband und dem Hochkontrollband und das Hochkontrollband am weitesten von dem Konjugat-Pufferpolster entfernt und am nächsten dem Absorbens-Polster. Nitrozellulosebögen wurden beschichtet und die Streifen hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben ist.
Vorblockierte Konjugat-Pufferpolster wurden mit Protein A-OMNI^®-Konjugat [Protein A/BSA-DNP (2 X/0,5 X)]-8,5 nm Gold durch Vermischen von drei Volumina der Konjugat-Lagerlösung (OD 520 etwa 63) mit einem Volumenteil PBS, welches 40 mg/ml BSA, 4% (Gewicht/Volumen) Triton X-100, 10% (Gewicht/Volumen) Sucrose und 1,2% (Gewicht/Volumen) Polyvinylpyrrolidon K-30 sowie 0,15 Volumenteile 20 X PBS enthielt. Das Gemisch wurde auf vorblockierte Konjugat-Pufferpolster verteilt, wie in Beispiel 1 beschrieben ist.
Der Assay wurde durch Anordnen der Kassette auf dem Laboratoriumstisch und anschließende Zugabe von 40 ml der positiven oder negativen Herpes-2-Proben, die in 9 angegeben sind, auf dem Probenpolster durch die Probenzugabeöffnung der Probenkassette zugegeben. Wenn die Flüssigkeitsfront der Probe die terminale Probenflußzone erreichte, wurde die Kassette, welche den Streifen enthielt in einer ReLia^®-Maschine plaziert, die zum Arbeiten und Ablesen des ReLia^®-Assays für die Feststellung von Antikörpern zu Herpes 2 eingestellt war. Sofort wurden 125 μl Konjugat-Puffer (PBS 10 mg/ml BSA, 0,1% Natriumazid und 2 mM EDTA) zu der Konjugat-Pufferöffnung der Kassette zugegeben. Die Ausstreiftemperatur war auf 40°C eingestellt, und die Streifen wurden nach 10 Minuten erneut abgelesen. Die relativen Intensitätswerte (RI) der Proben wurden nach einem Algorithmus berechnet, der die Assay-Niederkontrollreaktion (Dichte des Reflexionsvermögens), ein RI-1, die Assay-Hochkontrollreaktion (Dichte des Reflexionsvermögens), ein RI-3 sowie Null-Reaktion als ein RI von 0.
Wie in 9 gezeigt, ergaben alle Herpes-2-positiven Proben relativ intensive Werte (RI) von 0,58 oder höher, während alle Herpes-2-Negativproben RI-Werte von 0,01 oder niedriger ergaben, was demonstriert, daß die positiven und negativen Populationen in diesem Assay getrennt vorliegen.
4. Helicobacter pylori Assay
Streifen, die in diesem Beispiel verwendet wurden, wurden mit 800 μg/ml Kaninchen-Anti-Dinitrophenyl (Anti-DNP) in dem Hochkontrollband, 200 μg/ml Kaninchen-Anti-Dinitrophenyl (Anti-DNP) in dem Niederkontrollband und einer Lösung von Helicobacter pylori-Antigen mit einer optischen Dichte bei 280 nm von etwa 1,157 in dem Antigenband beschichtete. Die Reihenfolge der Bänder auf dem Streifen war folgende: Antigenband am nächsten dem Konjugat-Pufferpolster, die Niederkontrollzone zwischen dem Antigenband und dem Hochkontrollband und das Hochkontrollband am weitesten entfernt von dem Konjugat-Pufferpolster und am nächsten dem Absorbens-Polster. Nitrozellulosebögen wurden beschichtet, und Streifen wurden hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Vorblockierte Konjugat-Pufferpolster wurden mit Protein A-OMNI^®-Konjugat [Protein A/BSA-DNP (2 X/0,5 X)]-8,5 nm Gold durch Vermischen von drei Volumina der Konjugat-Lagerlösung (OD 520 etwa 63) mit einem Volumen PBS, das 40 mg/ml BSA, 4& (Gewicht/Volumen) Triton X-100, 10% (Gewicht/Volumen) Sucrose und 1,2% (Gewicht/Volumen) Polyvinylpyrrolidon K-30 und 0,15 Volumina 20X PBS beschichtet. Das Gemisch wurde auf vorblockierten Konjugat-Pufferpolstern, wie in Beispiel 1 beschrieben, verteilt.
Der Assay wurde in der Weise durchgeführt, daß die Kassette auf dem Laboratoriumstisch plaziert wurde und dann 40 μl der Helicobacter pylori-positiv- oder -negativ-Proben, die in 10 angegeben sind, zu dem Probenpolster durch die Probenzugabeöffnung der Probenkassette zugegeben wurden. Wenn die Flüssigkeitsfront der Probe die terminale Probenflußzone erreichte, wurde die Kassette, die den Streifen enthielt, in einer ReLia^®-Maschine plaziert, die darauf eingestellt war, den ReLia^®-Assay für die Feststellung von Antikörpern zu Helicobacter pylori arbeiten und ablesen zu lassen. Sogleich wurden 150 μl Konjugat-Puffer (PBS, 10 mg/ml BSA, 0,1% Natriumazid und 2 mM EDTA) zu der Konjugat-Pufferöffnung der Kassette zugesetzt. Die Streifentemperatur wurde auf 40°C eingestellt, und die Streifen wurden nach 10 Minuten abgelesen. Die relativen Intensitäts werte (RI) der Proben wurden nach einem Algorithmus berechnet, der die Assay-Niederkontrollreaktion (Dichte des Reflexionsvermögens), ein RI-1, die Assay-Hochkontrollreaktion (Dichte des Reflexionsvermögens), ein RI-3 sowie Nullreaktion als ein RI-0 überträgt.
Wie in 10 gezeigt, ergaben alle Helicobacter pylori-positiv-Proben relative Intensitätswerte (RI) von 1,64 oder höher, während alle Helicobacter pylori-negativ-Proben RI-Werte von 1,14 oder niedriger ergaben, was demonstriert, daß die positiven und negativen Populationen in diesem Assay voneinander getrennt sind.
Für den Fachmann wird ersichtlich sein, daß verschiedene Abwandlungen und Variationen in der Apparatur und den Verfahren nach der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können, ohne den Erfindungsgedanken zu verlassen. So ist beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung die Abwandlungen und Variationen dieser Erfindung abdeckt, soweit sie innerhalb des Gedankens der beigefügten Ansprüche und ihrer Äquivalente liegen. Außerdem dienen die Beispiele dem Zweck einer Erläuterung der beanspruchten Erfindung und sollten nicht als eine Beschränkung des Schutzumfangs der beanspruchten Erfindung angesehen werden.

Claims

Teststreifen (100) zur Aufnahme einer Probe und Feststellung eines Analyten darin, wobei der Teststreifen eine Probenzugabezone (106), der eine Probe (120) zugesetzt werden kann, eine Absorbenszone (108) proximal zu der Probenzugabezone, eine oder mehrere Testzonen (110, 112, 114) distal zu der Probenzugabezone umfaßt, wobei wenigstens eine der Testzonen ein erstes darin immobilisiertes Analytbindemittel enthält, welches den festzustellenden Analyten binden kann, und eine endständige Probenflußzone (116) distal zu der einen oder den mehreren Testzonen besitzt, wobei die Absorbenszone in Beziehung zu der Probenzugabezone derart angeordnet ist und eine solche Absorptionskapazität in Bezug auf die anderen Zonen des Teststreifens hat, daß eine distale Diffusionsfront (124) eine der Probenzugabezone zugesetzten Probe von der Probenzugabezone zu einem distalen Diffusionspunkt in der endständigen Probenflußzone diffundiert und dann proximal in Bezug auf die eine oder die mehreren Testzonen diffundiert.
Teststreifen nach Anspruch 1, wobei der Teststreifen so ausgebildet ist, daß er eine Probe in einem vorbestimmten Volumenbereich aufnimmt.
Teststreifen nach Anspruch 1, wobei der Teststreifen so ausgebildet ist, daß er eine Probe in einem vorbestimmten Volumenbereich zwischen etwa 10 und 250 μl aufnimmt.
Teststreifen nach Anspruch 1, wobei der Teststreifen so ausgebildet ist, daß er eine Probe in einem vorbestimmten Volumenbereich zwischen etwa 20 und 100 μl aufnimmt.
Teststreifen nach Anspruch 1, wobei der Teststreifen so ausgebildet ist, daß er eine Probe in einem vorbestimmten Volumenbereich zwischen etwa 30 und 50 μl aufnimmt.
Teststreifen nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem die endständige Probenflußzone eine Länge von einem proximalen Ende zu einem distalen Ende zwischen etwa 3 und 10 mm hat.
Teststreifen nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem das erste Analytbindemittel nicht an andere Komponenten in der Probe als an den Analyten bindet.
Teststreifen nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem das erste Analytbindemittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Antikörpern, aufgebauten Proteinen, Peptiden, Haptenen, Lysaten, die heterogene Gemische von Antigenen mit Analytbindungsstellen enthalten, Liganden und Rezeptoren besteht.
Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die Testzonen weiterhin wenigstens eine erste Kontrollzone mit einem darin immobilisierten Kontrollbindemittel enthalten.
Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die Testzonen weiterhin eine erste Kontrollzone mit einem darin immobilisierten Kontrollbindemittel und eine zweite Kontrollzone mit dem gleichen darin immobilisierten Kontrollbindemittel wie in der ersten Kontrollzone einschließen, wobei die erste und zweite Kontrollzone eine unterschiedliche Menge des darin immobilisierten Kontrollbindemittels enthalten.
Teststreifen nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem der Teststreifen zusätzlich eine Zone distal zu der endständigen Probenflußzone einschließt, die ein zweites Analytbindemittel enthält, das an den Analyten binden und zu der einen oder den mehreren Testzonen diffundieren kann.
Teststreifen nach Anspruch 11, bei dem das zweite Analytbindemittel an andere Komponenten in der Probe als den Analyten binden kann.
Teststreifen nach Anspruch 11, bei dem das zweite Analytbindemittel nicht an andere Komponenten in der Probe als den Analyten binden kann.
Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem das zweite Analytbindemittel mit einem feststellbaren Marker markiert ist.
Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem das zweite Analytbindemittel an ein Teilchen gebunden ist, welches zu der einen oder den mehreren Testzonen diffundieren kann.
Teststreifen nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem der Teststreifen weiterhin eine Konjugatpufferzugabezone (118) distal zu der endständigen Probenflußzone umfaßt, welcher ein Konjugatpuffer (122) zugesetzt werden kann.
Teststreifen nach Anspruch 16, bei Rückbeziehung auf einen der Ansprüche 11 bis 15, bei dem die das zweite Analytbindemittel enthaltende Zone proximal zu der Konjugatpufferzugabezone ist.
Teststreifen nach Anspruch 16, bei Rückbeziehung auf einen der Ansprüche 11 bis 15, bei dem die das zweite Analytbindemittel enthaltende Zone die Konjugatpufferzugabezone ist.
Teststreifen nach einem der Ansprüche 16 bis 18, bei dem die Konjugatpufferzugabezone in Beziehung zu den Testzonen derart angeordnet ist, daß zur gleichen Zeit, wie Probe zu der Probenzugabezone zugegeben wird, zu der Konjugatpufferzugabezone zugegebener Konjugatpuffer den distalen Diffusionspunkt erreicht, nachdem die distale Diffusionsfront der Probe zu dem distalen Diffusionspunkt diffundiert ist und begonnen hat, in einer proximalen Richtung zu diffundieren.
Teststreifen nach einem der Ansprüche 16 bis 19, bei dem die Konjugatpufferzugabezone in Beziehung zu den Testzonen derart angeordnet ist, daß zu der Konjugatpufferzugabezone zur gleichen Zeit, wie Probe zu der Probenzugabezone zugesetzt wird, zugesetzter Konjugatpuffer die Testzonen erreicht, nachdem die distale Diffusionsfront proximal in Bezug auf die Testzonen diffundiert.
Verfahren zur Ermittlung eines Analyten in einer Probe, indem man eine Probe (120) einer Probenzugabezone (106) eines Teststreifens (100) zuführt, wobei der Teststreifen eine Absorbenszone (108) proximal zu der Probenzugabezone und eine Absorptionskapazität in Bezug auf andere Zonen des Teststreifens hat, welche eine distale Diffusionsfront (124) der Probe veranlaßt, (a) in einer distalen Richtung zu einer oder mehreren Testzonen (110, 112, 114) zu diffundieren, wobei wenigstens eine der Testzonen ein erstes darin immobilisiertes Analytbindemittel enthält, welches an Analyt in der Probe bindet, (b) zu einer endständigen Probenflußzone (116) distal zu der einen oder den mehreren Testzonen zu diffundieren und (c) zu einer Position proximal zu der einen oder den mehreren Testzonen zu diffundieren, einen Konjugatpuffer (122) zu dem Teststreifen in einer Position distal zu der endständigen Probenflußzone überführt, wobei die Überführung des Konjugatpuffers ein zweites Analytbindemittel verursacht, proximal über die endständige Probenflußzone zu der einen oder den mehreren Testzonen zu diffundieren, nachdem die distale Diffusionsfront der Probe proximal zu der einen oder den mehreren Testzonen diffundierte, das zweite Analytbindemittel an in den Testzonen immobilisierten Analyten bindet und das zweite in den Testzonen immobilisierte Analytbindemittel feststellt.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem der Konjugatpuffer dem Teststreifen gleichzeitig zugegeben wird, wie die Probe dem Teststreifen zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem der Konjugatpuffer dem Teststreifen zugesetzt wird, bevor die Probe dem Teststreifen zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem der Konjugatpuffer dem Teststreifen zugesetzt wird, nachdem die Probe dem Teststreifen zugesetzt wurde.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, bei dem das erste Analytbindemittel nicht an andere Komponenten in der Probe als an den Analyten bindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 25, bei dem das erste Analytbindemittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Antikörpern, aufgebauten Proteinen, Peptiden, Haptenen, Lysaten, die heterogene Gemische von Antigenen mit Analytbindungsstellen enthalten, Liganden und Rezeptoren besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 26, bei dem das zweite Analytbindemittel auf dem Teststreifen enthalten ist, wo der Konjugatpuffer aufgegeben wird, wobei das Aufgeben des Konjugatpuffers die Diffusion des zweiten Analytbindemittels bewirkt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 26, bei dem das zweite Analytbindemittel auf dem Teststreifen proximal zu der Stelle enthalten ist, wo der Konjugatpuffer aufgegeben wird, wobei das Aufgeben des Konjugatpuffers die Diffusion des zweiten Analytbindemittels bewirkt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21, bis 26, bei dem ein Aufgeben des Konjugatpuffers auf den Teststreifen einschließt, daß das zweite Analytbindemittel mit dem Konjugatpuffer auf den Teststreifen aufgegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 29, bei dem die Testzonen wenigstens eine erste Kontrollzone mit einem darin immobilisierten Kontrollbindemittel einschließen, wobei man den Konjugatpuffer aufgibt und so bewirkt, daß ein Kontrollmittel proximal über die endständige Probenflußzone zu der ersten Kontrollzone diffundiert und an das darin immobilisierte Kontrollbindemittel bindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 29, bei dem die Testzonen erste und zweite Kontrollzonen einschließen, die jeweils eine unterschiedliche Menge eines darin immobilisierten Kontrollbindemittels enthalten, man den Konjugatpuffer aufgibt, was bewirkt, daß ein Kontrollmittel proximal über die endständige Probenflußzone zu der ersten und zweiten Kontrollzone diffundiert und an das darin immobilisierte Kontrollbindemittel bindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 31, bei dem das zweite Analytbindemittel an andere Komponenten in der Probe als an den Analyten binden kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 31, bei dem das zweite Analytbindemittel nicht an andere Komponenten in der Probe als an den Analyten bindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 33, bei dem das zweite Analytbindemittel mit einem feststellbaren Marker markiert wird, wobei man das zweite Analytbindemittel einschließlich der Feststellung des feststellbaren Markers feststellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 34, bei dem das zweite Analytbindemittel an ein Teilchen gebunden ist und man das zweite Analytbindemittel einschließlich einer Feststellung des Teilchens ermittelt.