ES2229797T3 - Tiras reactivas bidireccionales de flujo lateral y procedimiento correspondiente. - Google Patents
Tiras reactivas bidireccionales de flujo lateral y procedimiento correspondiente.Info
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Abstract
Tira reactiva (100) adaptada para recibir una muestra y detectar un analito contenido en ella, que comprende: una zona de adición de muestra (106) a la que puede añadirse una muestra (120); una zona absorbente (108) proximal a la zona de adición de muestra; una o más zonas de ensayo (110, 112, 114) distales de la zona de adición de muestra, comprendiendo por lo menos una de las zonas de ensayo un primer agente aglutinante de analitos inmovilizado, que es capaz de aglutinar el analito que se va a detectar, y una zona de flujo de muestra terminal (116) distal de una o más zonas de ensayo, estando la zona absorbente situada relativa a la zona de adición de muestra y teniendo una capacidad de absorción relativa a las demás zonas de la tira reactiva, de tal modo que un frente de difusión distal (124) de una muestra añadida a la zona de adición de muestras sea objeto de difusión desde la zona de adición de muestra a un punto de difusión distal dentro de la zona de flujo de muestra terminal y a continuación sea objeto de difusión proximal relativa a una o más zonas de ensayo.
Description
Tiras reactivas bidireccionales de flujo lateral
y procedimiento correspondiente.
La presente invención se refiere a tiras
reactivas de flujo lateral y a procedimientos operativos para tales
tiras reactivas de flujo lateral.
Se proporciona una tira reactiva que está
adaptada para recibir una muestra y detectar un analito en ella.
Según una realización de la invención, la tira reactiva comprende:
una zona de adición de muestras a la que puede añadirse una
muestra; una zona absorbente próxima a la zona de adición de
muestras; una o más zonas de ensayo distantes respecto a la zona de
adición, comprendiendo, por lo menos una de las zonas de ensayo un
primer agente aglutinante de analitos, inmovilizado en dicha zona,
que es capaz de aglutinarse con el analito que se va a detectar y
una zona de flujo de muestra terminal a una o más de las zonas de
ensayo, estando la zona absorbente situada relativa a la zona de
adición de muestras y con una capacidad de absorción relativa a las
otras zonas de la tira reactiva, de tal modo que un frente de
difusión distal de una muestra, añadida a la zona de adición de
muestras, se difunda desde la zona de adición de muestras al punto
de difusión distal dentro de la zona de flujo de muestra terminal,
invirtiendo luego su dirección y difundiéndose proximal respecto a
una o más de las zonas de ensayo.
En otra realización, la tira reactiva comprende
además una zona de adición de solución tampón conjugada, distal a
la zona de flujo de muestra terminal, a la que se puede añadir la
solución tampón conjugada.
Según la realización de la tira reactiva
anterior, la zona de adición de solución tampón conjugada se puede
situar relativa a las zonas de ensayo, de tal modo que la solución
tampón conjugada, añadida a la zona de adición de solución tampón
conjugada al mismo tiempo que la muestra se añade a la zona de
adición de muestras, llegue al punto de difusión distal después de
que el frente de difusión distal de la muestra se haya difundido
hasta el punto de difusión distal y comenzado a difundirse en una
dirección próxima. La zona de adición de solución tampón conjugada
puede también situarse relativa a las zonas de ensayo, de tal modo
que la solución tampón, añadida a la zona de adición de solución
tampón conjugada al mismo tiempo que la muestra se añade a la zona
de adición de muestras, llegue a las zonas de ensayo después de que
el frente de difusión distal de la muestra se difunda proximal en
relación con las zonas de ensayo. La zona de adición de solución
tampón conjugada se puede situar también relativa a las zonas de
ensayo, de tal modo que la solución tampón conjugada se pueda
añadir a la tira reactiva antes que la muestra y, no obstante,
llegue al punto de difusión distal después de que el frente de
difusión distal de la muestra se haya difundido a la zona de
difusión distal, invertido su dirección y comenzado a difundirse en
una dirección proximal.
Según cualquiera de las anteriores realizaciones
de la tira reactiva, la tira reactiva puede comprender 1, 2, 3 o
más zonas de ensayo con uno o más agentes aglutinantes de control,
inmovilizados en ella. En una realización, la tira reactiva
comprende por lo menos una primera zona de control con un agente
aglutinante de control inmovilizado en ella. De forma opcional, las
zonas de ensayo comprenden, además, una segunda zona de control con
un mismo agente aglutinante de control inmovilizado que la primera
zona de control, conteniendo la primera zona de control una
cantidad diferente del agente aglutinante de control de la que
contiene la segunda zona de control.
Asimismo, según cualquiera de las realizaciones
anteriores de la tira reactiva, un segundo agente aglutinante de
analitos que es capaz de aglutinarse con el analito y difundirse a
una o más zonas de ensayo, se puede comprender en la tira reactiva.
Como alternativa, el segundo agente aglutinante de analitos se
puede proporcionar a la tira reactiva a través de la solución tampón
conjugada. El segundo agente aglutinante de analitos se puede
aglutinar con componentes de la muestra distintos al analito. Como
alternativa, el segundo agente aglutinante de analitos puede ser un
agente que no se aglutina con los componentes de la muestra
distintos al analito.
Con el fin de facilitar la detección, el segundo
agente aglutinante de analitos se etiqueta preferentemente con un
marcador detectable. Según aquí se describe, se puede usar
cualquiera de una amplia gama de marcadores detectables conocidos
en esta técnica. En una realización preferida, el segundo agente
aglutinante de analitos se agrega a una partícula que es capaz de
difundirse a una o más zonas de ensayo. La partícula puede servir
como el marcador detectable o puede, por sí misma, etiquetarse con
un marcador detectable.
Asimismo, se proporciona un procedimiento para
detectar un analito en una muestra. En una realización de la
invención, el procedimiento comprende depositar una muestra en una
zona de adición de muestra de una tira reactiva, comprendiendo
dicha tira reactiva una zona absorbente próxima a la zona de
adición de muestras y con una capacidad de absorción relativa a
otras zonas de la tira reactiva, que hace que un frente de difusión
distal de la muestra (a) se difunda en una dirección distal a una o
más zonas de ensayo, comprendiendo por lo menos una de dichas zonas
un primer agente aglutinante de analitos inmovilizado en ella, que
se aglutina con el analito en la muestra, (b) se difunda a una zona
de flujo de muestra terminal distal respecto a una o más zonas de
ensayo, cambie de dirección y (c) se difunda a una posición próxima
a una o más zonas de ensayo; añadiendo una solución tampón
conjugada a la tira reactiva en una posición distal respecto a la
zona de flujo de muestra terminal, causando la entrega de la
solución tampón conjugada que un segundo agente aglutinante de
analitos se difunda, de forma proximal, más allá de la zona de
flujo de muestra terminal a una o más de las zonas de ensayo,
después de que el frente de difusión distal de la muestra se
difunda proximal a una o más de las zonas de ensayo, aglutinando el
segundo agente aglutinante de analitos al analito inmovilizado en
las zonas de ensayo y detectando el segundo agente aglutinante de
analitos inmovilizado en las zonas de ensayo.
Según el procedimiento, se puede añadir una
solución tampón conjugada a la tira reactiva al mismo tiempo que la
muestra se añade a la tira reactiva, antes de que la muestra se
añada a la tira reactiva o después de que la muestra se añada a la
tira reactiva. Cuando la muestra se añade a la tira reactiva
relativa a la solución tampón conjugada depende del tiempo
necesario para que la muestra llegue a la zona de flujo de muestra
terminal que, a su vez, depende del diseño de flujo de la tira
reactiva.
Asimismo, según el procedimiento, el segundo
agente aglutinante de analitos puede estar contenido en la tira
reactiva cuando se proporciona la solución tampón conjugada,
causando la entrega de la solución tampón conjugada la difusión del
segundo agente aglutinante de analitos. Como alternativa, el
segundo agente aglutinante de analitos está contenido en la tira
reactiva proximal a donde se proporciona la solución tampón
conjugada, lo que hace que la entrega de la solución tampón
conjugada genere la difusión del segundo agente aglutinante de
analitos. La entrega de la solución tampón conjugada a la tira
reactiva puede comprender también la adición del segundo agente
aglutinante de analitos a la tira, dentro de la solución tampón
conjugada.
Según el procedimiento anterior, las zonas de
ensayo pueden comprender una primera zona de control con un agente
aglutinante de control inmovilizado en ella, causando la entrega de
la solución tampón conjugada que un agente de control se difunda,
de forma proximal, más allá de la zona de flujo de muestra
terminal, a la primera zona de control y allí se aglutine al agente
aglutinante de control inmovilizado. Como alternativa, las zonas de
ensayo pueden comprender primeras y segundas zonas de control, cada
una de las cuales comprende una cantidad diferente de un agente
aglutinante de control inmovilizado, causando la entrega de la
solución tampón conjugada que un agente de control se difunda, de
forma proximal, más allá de la zona de muestra terminal, a la
primera y segunda zonas de control y se aglutine al agente
aglutinante de control allí inmovilizado.
También según el procedimiento anterior, la
detección del segundo agente aglutinante de analitos puede
facilitarse mediante el etiquetado del segundo agente aglutinante
de analitos con un marcador detectable, comprendiendo la detección
del segundo agente aglutinante de analitos la detección del
marcador. El segundo agente aglutinante de analitos se puede añadir
a una partícula. La detección del segundo agente aglutinante de
analitos puede comprender la detección de la partícula.
Según cualquiera de las realizaciones anteriores,
la muestra entregada a la tira reactiva está, preferentemente,
dentro de una gama de volúmenes predeterminada para cuyo proceso se
ha diseñado la tira reactiva. La gama de volúmenes predeterminada
suele estar comprendida entre 10 y 250 \mul, preferentemente
entre 20 y 100 \mul y más preferentemente entre 30 y 50 \mul y
todavía más preferentemente entre 35 y 45 \mul. Cuando una muestra
se entrega a la tira reactiva dentro de la gama de volúmenes
predeterminada, la zona de flujo de muestra terminal se puede
diseñar para tener una longitud corta desde un extremidad proximal
a un extremidad distal. Por ejemplo, cuando una muestra se entrega a
la tira reactiva dentro de una gama de aproximadamente 35 a 45
\mul, la zona de flujo de muestra terminal puede tener una
longitud, desde un extremidad proximal a un extremidad distal, de
entre aproximadamente 1 a 25 mm, más preferentemente entre 2 y 15
mm y todavía más preferentemente entre 3 y 10 mm.
Además, según cualquiera de las realizaciones
anteriores, el primer agente aglutinante de analitos no aglutina
preferentemente componentes de la muestra distintos al analito.
Entre los tipos de moléculas que pueden servir como primer agente
aglutinante de analitos se puede comprender, sin limitación,
anticuerpos, proteínas producto de ingeniería, péptidos, haptenos,
lisatos que contengan mezclas homogéneas de antígenos con
aglutinación de analitos, ligandos y receptores. En una realización
particular, el primer agente aglutinante de analitos es un
anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.
La Figura 1 ilustra una vista desde arriba a
abajo de una realización de una tira reactiva de flujo lateral
según la presente invención.
Las figuras 2A-2H ilustran un
procedimiento de operación para una tira reactiva de flujo lateral,
según la presente invención.
La Figura 2A ilustra una muestra que se está
añadiendo a la tira reactiva.
La Figura 2B ilustra la muestra que fluye dentro
de la tira reactiva.
La Figura 2C ilustra la tira reactiva cuando la
muestra ha circulado una distancia dentro de la tira reactiva, en
la dirección opuesta a una zona absorbente dentro de una zona de
flujo de muestra terminal.
La Figura 2D ilustra la tira reactiva donde la
muestra está circulando de nuevo hacia la zona absorbente.
La Figura 2E ilustra la adición de una solución
tampón a la tira reactiva.
La Figura 2F ilustra el flujo de la solución
tampón dentro de la tira reactiva hacia la zona absorbente.
La Figura 2G ilustra el flujo de la solución
tampón dentro de la tira reactiva más allá de la zona de
ensayo.
La Figura 2H ilustra el flujo de la solución
tampón dentro de la tira reactiva hacia la zona absorbente
Las Figuras 3A-3H ilustran un
procedimiento de operación para una tira reactiva de flujo lateral
según la presente invención.
La Figura 3A ilustra una muestra y una solución
tampón que se están añadiendo a la tira reactiva.
La Figura 3B ilustra la muestra y la solución
tampón circulando dentro de la tira reactiva.
La Figura 3C ilustra la tira reactiva cuando la
muestra ha recorrido una distancia dentro de la tira reactiva en la
dirección opuesta a una zona absorbente dentro de una zona de flujo
de muestra terminal.
La Figura 3D ilustra la tira reactiva en donde la
muestra fluye en retroceso hacia la zona absorbente.
La Figura 2E ilustra la solución tampón que sigue
circulando hacia el flujo de muestra.
La Figura 3F ilustra la solución tampón que ha
circulado más allá de la zona de flujo de muestra.
La Figura 3G ilustra el flujo de la solución
tampón, dentro de la tira reactiva, más allá de la zona
absorbente.
La Figura 3H ilustra el flujo de la solución
tampón, dentro de la tira reactiva, hacia la zona absorbente.
La Figura 4 ilustra el diseño de una tira
reactiva en el que la zona de adición de la muestra está situada
contigua a la zona de adición de la solución tampón de lavado.
Las Figuras 5A-5C ilustran
diversos diseños de cartuchos en los que se puede situar una tira
reactiva según la presente invención
La Figura 5A ilustra un diseño de cartucho
adaptado para la tira reactiva ilustrada en las Figuras
2A-2H.
La Figura 5B ilustra un diseño de cartucho
adaptado para la tira reactiva ilustrada en las Figuras
3A-3H, en el que la zona de adición de la muestra
está situada a una distancia extendida desde la zona de adición de
la solución tampón de lavado, de tal modo que la muestra y la
solución tampón de lavado se puedan añadir al mismo tiempo.
La Figura 5C ilustra un diseño de cartucho
adaptado para la tira reactiva ilustrada en la Figura 4, en el que
la zona de adición de muestra se sitúa contigua a la zona de
adición de la solución tampón de lavado, estando la zona de ensayo
situada a una distancia extendida desde la zona de adición de la
solución tampón de lavado.
La Figura 6A ilustra la disposición general de
una tira reactiva FLEXPACK™ HP fabricada por Abbott.
La Figura 6B ilustra el funcionamiento de la tira
reactiva ilustrada en la Figura 6A.
La Figura 7 ilustra una vista en sección lateral
de la tira reactiva de flujo lateral ilustrada en la Figura 1.
La Figura 8 ilustra los resultados de un ensayo
de Herpes 2 de flujo de parada de ReLIA™ realizado en el Ejemplo
2.
La Figura 9 ilustra los resultados de un ensayo
de Herpes 2 de flujo de parada de ReLIA™ realizado en el Ejemplo
3.
La Figura 10 ilustra los resultados de un ensayo
de Helicobacter pylori de flujo de parada de ReLIA™,
realizado en el Ejemplo 4.
La presente invención se refiere a una tira
reactiva de flujo lateral que es capaz de hacer que una parte de
una muestra añadida a la tira reactiva, fluya desde una zona en la
que la muestra se añade a través de una o más zonas de ensayo hacia
una zona de flujo de muestra terminal y a continuación, con
independencia de cualquier intervención del usuario, invierte la
dirección y fluye hacia atrás a través de una o más zonas de ensayo
a la zona de adición de muestra. Inmovilizado en por lo menos una
de las zonas de ensayo se encuentra un primer agente aglutinante de
analitos que es capaz de aglutinarse con un analito en la muestra
para la que la tira reactiva está diseñada para detectarla.
Haciendo una parte de la muestra circule a través de una o más zonas
de ensayo y a continuación, de forma independiente, tenga un
reflujo en dirección a la zona de adición de muestras, se elimina
la necesidad de lavar una o más de las zonas de ensayo antes de
entrar en contacto con una o más zonas de ensayo con un segundo
agente aglutinante de analitos. También se elimina la necesidad de
tiempo cuando el segundo agente aglutinante de analitos se hace
difundirse a una o más zonas de ensayo. Como se examinará aquí con
más detalles, las características de autolavado y autotemporización
de las tiras reactivas, según la presente invención, proporcionan
varias ventajas significativas respecto a las anteriores tiras
reactivas.
Las características de autolavado y
autotemporización de las tiras reactivas, según la presente
invención, se consiguen mediante el ajuste de la posición de una
zona absorbente relativa a la zona de adición de muestras, de tal
modo que, cuando un volumen de muestra (dentro de una gama
predeterminada de volúmenes de muestras para dicha tira reactiva)
se añade a la tira reactiva, el frente de difusión de la muestra se
expande a través de una o más zonas de ensayo hasta una zona de
flujo de muestra terminal. Cuando la muestra llega a la zona de
flujo de muestra terminal, las propiedades absorbentes de la zona
absorbente hace que la muestra sea arrastrada hacia atrás a través
de las zonas de ensayo hacia la zona de adición de muestras y por
último, a la zona absorbente.
La Figura 1 ilustra una vista de
arriba-abajo de una realización de una tira
reactiva de flujo lateral 100 según la presente invención. Según se
ilustra, la tira reactiva 100 tiene extremidades proximal y distal
102, 104, respectivamente, y puede dividirse en varias zonas
diferentes. La tira reactiva comprende una zona de adición de
muestra 106 en donde una muestra se puede añadir a la tira reactiva
100. Una zona absorbente 108 está situada próxima a la zona de
adición de muestra 106. Distantes de la zona de adición de muestra
106 se encuentra una o más zonas de ensayo 110, 112, 114. La tira
reactiva 100 comprende también una zona de flujo de muestra
terminal 116, distal a una o más de las zonas de ensayo 110, 112,
114. Cada una de las zonas antedichas está en comunicación de
difusión de fluido entre sí.
Según se ilustra, la tira reactiva comprende
también una zona de adición de solución tampón conjugada 118,
distal con la zona de flujo de muestra terminal 116. La zona de
adición de solución tampón conjugada 118 puede ser una zona en la
que la solución tampón conjugada puede añadirse a la tira reactiva.
Como alternativa, la zona de adición de solución tampón conjugada
118 puede, simplemente, corresponder a una zona cuya solución
tampón conjugada se difunde desde un punto más distal en la tira
reactiva.
Debe hacerse notar que la configuración de la
tira reactiva ilustrada en la Figura 1 es lineal en diseño. Sin
embargo, configuraciones no lineales, tales como la configuración
ilustrada en la Figura 4, también están previstas para las tiras
reactivas según la presente invención.
Las Figuras 2A-2H ilustran un
procedimiento de operación de una tira reactiva de flujo lateral,
tal como se representa en la Figura 1. Antes de realizar un ensayo
usando una tira reactiva según la presente invención, se obtiene
una muestra de fluido que se considera que contiene el analito que
se va a detectar. La muestra puede comprender cualquier fluido que
humedezca la tira reactiva y tenga una viscosidad que sea
suficiente para permitir el desplazamiento de la muestra a través
de la tira reactiva. En una realización preferida, la muestra es
una solución acuosa (como, por ejemplo, un fluido corporal).
La Figura 2A ilustra la muestra 120 que se añade
a una zona de adición de muestra 106 de la tira reactiva 100. Debe
hacerse notar que la tira reactiva está diseñada para utilizarse
con una muestra que tenga un volumen dentro de una gama particular.
Más concretamente, la entrega de una muestra dentro de la gama
predeterminada hace que la muestra se difunda, de forma distal, más
allá de las zonas de ensayo, hacia la zona de flujo de muestra
terminal 116, pero no más allá de la zona de flujo de muestra
terminal 116 (según se ilustra en la Figura 2D).
Según se ilustra en la Figura 2B, la muestra 120
comienza a difundirse, tanto de forma proximal como distal, a
través de la tira reactiva después de añadirse a la tira reactiva.
Según se ilustra en la Figura 2C, el frente distal 124 de la
muestra 120 se difunde a través de una o más de las zonas de ensayo
110, 112, 114, hasta dentro de la zona de flujo de muestra terminal
116. Según se ilustra en la Figura 2D, el frente distal 124 de la
muestra 120, se extiende, por último, a un punto dentro de la zona
de flujo de muestra
terminal 116.
terminal 116.
Cuando el volumen de la muestra añadido a la tira
reactiva, dentro de una gama predeterminada de volúmenes para la
que está diseñada la tira reactiva, el frente distal 124 de la
muestra 120 alcanza un punto de difusión distal correspondiente a
un punto de flujo distal máximo, en un lugar dentro de la zona de
flujo de muestra terminal 116. En este punto, según se ilustra en la
Figura 2E, la acción capilar por la zona absorbente 108 dirige la
muestra, de forma proximal, hacia la zona absorbente 108. A medida
que la muestra se lleva hacia la zona absorbente 108, el frente
distal 124 de la muestra retrocede de forma proximal.
Como se ilustra en las Figuras
2A-2D, una característica de la presente invención
es el control de dónde y cómo la muestra fluye dentro de la tira
reactiva. La muestra entregada a la tira reactiva se encuentra,
preferentemente, dentro de una gama predeterminada de volúmenes
para cuyo proceso fue diseñada la tira reactiva. La gama de
volúmenes predeterminada se encuentra, preferentemente, entre 10 y
250 \mul, con preferencia entre 20 y 100 \mul, más
preferentemente entre 30 y 50 \mul, y con más preferencia todavía,
entre 35 y 45 \mul. Cuando una muestra se entrega a una tira
reactiva dentro de estas gamas, el flujo de la muestra se detiene
dentro de la zona de flujo de muestra terminal.
La zona de flujo de muestra terminal se puede
diseñar para tener una longitud corta desde una extremidad proximal
a una extremidad distal. Por ejemplo, cuando una muestra se entrega
a una tira reactiva dentro de una gama de 35 a 45 \mul, la zona
de flujo de muestra terminal puede tener una longitud, desde una
extremidad proximal a una extremidad distal, de entre 1 y 25 mm, más
preferentemente entre 2 y 15 y todavía más preferentemente, entre 3
y 10 mm.
Situado dentro de una de las zonas de ensayo (por
ejemplo, la zona 110), hay un primer agente aglutinante de analitos
que se aglutina a un analito en la muestra para el que la tira
reactiva está prevista para su detección. El analito presente en la
parte de la muestra que fluye a través de las zonas de ensayo se
inmoviliza en la zona de ensayo 110 por el primer agente aglutinante
de analitos.
La Figura 2E ilustra la adición de una solución
tampón conjugada 122 a la tira reactiva, en la zona de adición de
solución tampón conjugada 118, después de que la muestra haya
llegado a la zona de flujo de muestra terminal. La solución tampón
conjugada 122 puede contener uno o más diferentes segundos agentes
aglutinantes de analitos que pueden aglutinar al analito y permitir
que se inmovilice en las zonas de ensayo que se va a detectar. Se
hace constar que la zona de adición de solución tampón conjugada
118 puede comprender, de forma opcional, uno o más segundos agentes
aglutinantes de analitos utilizados para detectar el analito
inmovilizado. En tal caso, la adición de la solución tampón
conjugada 122 sirve para iniciar la difusión de uno o más segundos
agentes aglutinantes de analitos a través de las zonas de
ensayo.
Según se ilustra en las Figuras 2F y 2G, la
solución tampón conjugada 122 fluye, de forma proximal, a través de
la tira reactiva en dirección a la zona absorbente 108, haciendo
con ello que uno o más segundos agentes aglutinantes de analitos se
desplacen a través de las zonas de ensayo 110, 112, 114 y se
aglutinen con el analito inmovilizado.
Según se ilustra en la Figura 2H, la acción
capilar por la zona absorbente 108 hace que la muestra 120 se
difunda dentro de la zona absorbente 108. Mientras tanto, la
solución tampón conjugada 122 se sigue difundiendo, de forma
proximal, a través de las zonas de ensayo 110, 112, 114 y dentro de
la zona absorbente 108. Cualquiera de los segundos agentes
aglutinantes de analitos que no fueron inmovilizados en las zonas
de ensayo 110, 112 y 114, se desplazan con la solución tampón
conjugada 122 hacia la zona absorbente 108.
En lo que respecta a la realización ilustrada en
las Figuras 2A-2H, se hace constar que la solución
tampón conjugada 122 debe añadirse a la tira reactiva después de
que la muestra 120 haya alcanzado las zonas de ensayo 110, 112, 114
y, preferentemente, una vez que la muestra haya alcanzado la zona de
flujo de muestra terminal 118 y haya comenzado a difundirse hacia
atrás en dirección a la zona absorbente 108. Esto permite que la
parte de la muestra 120, que fluye a través de las zonas de ensayo,
entre en contacto con los primeros agentes aglutinantes de
analitos, en las zonas de ensayo, sin la presencia de la solución
tampón conjugada.
Las Figura 3A-3H ilustran un
diseño alternativo de tira reactiva y un procedimiento de operación
para la tira reactiva. En esta realización, la muestra y la
solución tampón conjugada se añaden al mismo tiempo. Con el fin de
que la muestra y la solución tampón conjugada se añadan al mismo
tiempo, es necesario que la solución tampón conjugada llegue a las
zonas de ensayo 210, 212, 214 después que la muestra haya entrado
en contacto con las zonas de ensayo. Se prefiere que la solución
tampón conjugada llegue a las zonas de ensayo después de que la
muestra haya comenzado a difundirse en retroceso a través de las
zonas de ensayo en dirección a la zona absorbente 208.
El retardo con que la solución tampón conjugada
llega a las zonas de ensayo se consigue, en esta realización,
creando una distancia mayor entre la zona de adición de solución
tampón conjugada 218 y la zona de flujo de muestra terminal 216, en
comparación con el diseño de la tira reactiva que se ilustra en las
Figuras 2A-2H. Como alternativa, se puede utilizar
un material que haga que la solución tampón conjugada se difunda de
modo más lento.
La Figura 3A ilustra una muestra 220 que se añade
a una zona de adición de muestras 206 en la tira reactiva 200.
Mientras tanto, una solución tampón conjugada 222 se añade a la
zona de adición de solución tampón conjugada 218, aproximadamente
al mismo tiempo que se añade la muestra a la tira reactiva.
Según se ilustra en la Figura 3B, la muestra 220
comienza a difundirse, tanto de forma proximal como distal, dentro
de la tira reactiva, una vez añadida a dicha tira reactiva.
Mientras tanto, la solución tampón conjugada 222 se difunde
también, de forma proximal y distal, dentro de la tira reactiva.
Según se ilustra en la Figura 3C, el frente
distal 224 de la muestra 220 se difunde a través de una o más zonas
de ensayo 210, 212, 214 hacia la zona de flujo de muestra terminal
216. Mientras tanto, la solución tampón conjugada 222 sigue
difundiéndose, de forma proximal, dentro de la tira reactiva hacia
las zonas de ensayo.
Según se ilustra en la Figura 3D, el frente
distal 224 de la muestra 220 se extiende finalmente a un punto
dentro de la zona de flujo de muestra terminal 216. En el momento
en que la muestra está en la zona de flujo de muestra terminal 216,
la solución tampón conjugada 222 no ha llegado todavía a esa
zona.
Según se ilustra en la Figura 3E, la acción
capilar por la zona absorbente 208 dirige la muestra, de forma
proximal, hacia la zona absorbente 208. A medida que la muestra es
dirigida a la zona absorbente 208, el frente distal 224 de la
muestra fluye de forma proximal. Situado dentro de una de las zonas
de ensayo (por ejemplo, la zona de ensayo 210) hay un primer agente
aglutinante de analitos que aglutina al analito en la muestra, para
cuya detección fue diseñada la tira reactiva. El analito, presente
en la parte de la muestra que fluye a través de las zonas de
ensayo, se inmoviliza en la zona de ensayo 210 por el primer agente
aglutinante de analitos.
La Figura 3F ilustra la solución tampón conjugada
222 que llega a las zonas de ensayo. Como puede verse, en el
momento en que la solución tampón 222 llega a las zonas de ensayo,
el frente distal 224 de la muestra ya ha circulado, de forma
proximal, desde la zona de flujo de muestra terminal 216 y las zonas
de ensayo 210, 212, 214.
Según se ilustra en las Figuras 3G y 3H, la
acción capilar por la zona absorbente 208 hace que la muestra se
retire hacia la zona absorbente 208. Mientras tanto, la solución
tampón 222 sigue difundiéndose, de forma proximal, a través de las
zonas de ensayo 210, 212, 214 y hacia la zona absorbente 208.
Cualquiera de uno o más segundos agentes aglutinantes de analitos,
que no fueron inmovilizados en las zonas de ensayo 210, 212, 214,
se transportan con la solución tampón conjugada 222 hacia la zona
absorbente 208.
La solución tampón conjugada 222, añadida a la
tira reactiva, puede contener uno o más segundos agentes
aglutinantes de analitos que se pueden aglutinar con el analito y
permiten la detección del analito inmovilizado en las zonas de
ensayo. Como alternativa, la tira reactiva puede comprender una zona
conjugada, distal con la zona de flujo de muestra terminal 216, que
contiene uno o más segundos agentes aglutinantes de analitos. La
zona de adición de solución tampón conjugada 218 puede también
servir como zona conjugada. Cuando uno o más segundos agentes
aglutinantes de analitos son objeto de precarga en la tira
reactiva, la solución tampón conjugada 222 sirve para iniciar la
difusión de uno o más segundos agentes aglutinantes de analitos a
través de las zonas de ensayo hacia la zona absorbente.
Según se ilustra en las Figuras
3A-3H, la solución tampón conjugada se puede añadir
a la tira reactiva antes de que la muestra llegue a las zonas de
ensayo designando el recorrido de difusión de la tira reactiva, de
tal modo que la solución tampón conjugada no llegue a las zonas de
ensayo hasta después de que la muestra se haya difundido desde las
zonas de ensayo. Ha de advertirse que la difusión de la solución
tampón conjugada en las zonas de ensayo se puede retrasar
suficientemente para que se añada la solución tampón conjugada a la
tira reactiva antes de añadir la muestra a la tira reactiva.
La Figura 4 ilustra un diseño alternativo de la
tira reactiva para una tira reactiva de flujo lateral según la
presente invención. La operación de una tira reactiva es similar a
la operación descrita en las Figuras 3A-3H, Los
mismos números de referencia se emplean en la Figura 4 que en las
Figuras 3A-3H. Según se ilustra en la Figura 4, la
zona de adición de muestra 206 está situada contigua a la zona de
adición de la solución tampón conjugada 218. Esto permite un diseño
de tira reactiva más compacto, al mismo tiempo que permite que la
muestra y la solución tampón conjugada se añadan
simultáneamente.
Una característica del diseño de la tira
reactiva, ilustrada en la Figura 4, es que la muestra y la solución
tampón conjugada se añaden al mismo extremo de la tira reactiva.
Además, se advierte que las zonas de ensayo 210, 212, 214 están
situadas hacia un extremo opuesto de las zonas de adición de la
muestra y de la solución tampón conjugada 206, 218. Esto hace
posible que las zonas de ensayo se sitúen dentro del alcance de un
dispositivo lector de muestras, mientras que las zonas de adición
de muestra y de solución tampón conjugada están fuera del alcance
del lector de la muestra. Esto, a su vez, permite que la muestra y
la solución tampón conjugada se añadan a la tira reactiva, mientras
la tira reactiva está en un lector de tiras reactivas.
Las Figuras 5A-5C ilustran
diversos diseños de cartuchos en los que se pueden colocar las
tiras reactivas según la presente invención. En cada diseño de
cartucho, el cartucho comprende un orificio de adición de muestra
240 adyacente a la zona de adición de muestra 206 de la tira
reactiva. El cartucho comprende también un orificio de adición de
solución tampón conjugada 242 adyacente a la zona de adición de
solución tampón conjugada 218 de la tira reactiva. El cartucho
comprende, asimismo, una ventana de prueba 244 adyacente a las zonas
de ensayo 210, 212, 214 de la tira reactiva.
La Figura 5A ilustra un diseño de cartucho
adaptado para la tira reactiva ilustrada en las Figuras
2A-2H. La Figura 5B ilustra un diseño de cartucho
adaptado para la tira reactiva ilustrada en las Figuras
3A-3H, en donde la zona de adición de la muestra
está situada a una distancia extendida desde la zona de adición de
solución tampón conjugada, de tal modo que la muestra y la solución
tampón conjugada se puedan añadir a la tira reactiva, en
aproximadamente el mismo tiempo. La Figura 5C ilustra un diseño de
cartucho adaptado para la tira reactiva ilustrada en la Figura 4,
donde la zona de adición de muestra está situada adyacente a la
zona de adición de solución tampón, estando la zona de ensayo
situada en una distancia extendida desde la zona de adición de
solución tampón.
Debe advertirse, respecto a las Figuras
2-4, que una característica de las tiras reactivas
de la presente invención es la capacidad inherente de la tira
reactiva para exponer zonas de ensayo en la tira reactiva a una
parte de la muestra durante un período de tiempo y, a continuación,
hacer que la muestra se difunda alejándose de las zonas de ensayo,
antes de que la solución tampón conjugada llegue a las zonas de
ensayo. Esta característica se hace posible, adaptando (1) el
ajuste de la posición de la zona absorbente relativa a la zona de
adición de muestra con (2) la capacidad absorbente de la tira
reactiva, entre la zona de adición de la muestra y la zona de flujo
de muestra terminal, y (3) el volumen de la muestra que se va a
entregar a la tira reactiva. Si se entrega demasiada muestra, la
muestra no se difundirá más allá de la zona de flujo de muestra
terminal. Si se entrega muy poca muestra, la muestra no se difundirá
suficientemente lejos en la tira reactiva para llegar a las zonas
de ensayo.
La capacidad de la tira reactiva para exponer las
zonas de ensayo a la muestra por un período de tiempo limitado y a
continuación, hacer que la muestra sea retirada desde las zonas de
ensayo, confiere una independencia de temporización a la tira
reactiva, lo que aumenta la precisión de la tira reactiva y
facilita su uso. Por ejemplo, según se ilustra en el Ejemplo 2, los
resultados de los ensayos no dependen del momento en que la solución
tampón conjugada se añade a la muestra. Como resultado, las tiras
reactivas no necesitan controlarse a fondo con respecto a cuándo
ha de añadirse la solución tampón conjugada. A este respecto, la
ventana de tiempo, desde que se añade la muestra a cuando la
solución tampón conjugada debe añadirse a la tira reactiva, se
elimina por la presente invención.
La dinámica de utilización del volumen de la
muestra entregada a la tira reactiva, para controlar cómo la
muestra se difunde dentro de la tira reactiva, se ilustrará ahora
haciendo referencia a la Figura 1. Según se ha expuesto
anteriormente, la Figura 1 ilustra una tira reactiva que tiene
extremidades proximal y distal 102, 104, respectivamente, y se
divide en varias zonas bien distintas. La tira reactiva comprende
una zona de adición de muestra 106 en donde la muestra se añade a
la tira reactiva. Una zona absorbente 108 se sitúa próxima a la
zona de adición de muestra 106. Una zona de ensayo 110 está situada
distal a la zona de adición de muestra 106. Una zona de flujo de
muestra terminal está situada distal a la zona de ensayo 110. Una
zona de adición de solución tampón conjugada 118 está situada
distal con la zona de flujo de muestra terminal 116.
A modo ilustrativo, se supone que la zona de
ensayo 110 comprende un primer agente aglutinante de analitos y la
zona de adición de solución tampón conjugada 118 comprende un
segundo agente aglutinante de analitos etiquetado con un marcador
detectable. Asimismo, se supone que la tira reactiva está diseñada
de tal modo que un volumen de muestra de 30 \mul hará que la
muestra se difunda hasta, como máximo, la zona de ensayo 110.
Mientras tanto, un volumen de muestra de 50 \mul hará que la
muestra se difunda a la extremidad distal de la zona de flujo de
muestra terminal 116.
Si se entrega una muestra a la tira reactiva
dentro de la gama de volúmenes de 30 a 50 \mul, el frente distal
de la muestra se difundirá por más allá de la zona de ensayo 110.
El avance distal de la muestra se detendrá dentro de la zona de
flujo de muestra terminal 116. El analito en la parte de la muestra
que llega a la zona de ensayo 110 se aglutinará con el primer
anticuerpo y quedará inmovilizado en la zona de ensayo 110. Otros
componentes de la muestra no se aglutinan con el primer anticuerpo,
puesto que el primer anticuerpo es selectivo para el analito. A
continuación, la muestra fluye en retroceso en la dirección
proximal hacia la zona absorbente 108 más allá de la zona de ensayo
110. Cuando se añade la solución tampón conjugada, hace que el
segundo agente aglutinante de analitos se difunda a través de la
zona de ensayo 110 donde el segundo agente aglutinante de analitos
se aglutina con el analito inmovilizado en la zona de ensayo 110.
Puesto que la muestra se difunde alejándose de la zona de ensayo 110
antes de que la solución tampón llegue a la zona de ensayo 110, no
están presentes agentes de la muestra que pudieran, de otro modo,
aglutinarse con el segundo agente aglutinante de analitos. Como
resultado, el analito que se va a detectar en la muestra no tiene
que competir con otros agentes en la muestra, para poder
aglutinarse con el segundo agente aglutinante de analitos.
Si se entrega un volumen de muestra menor que 30
\mul (por ejemplo, 25 \mul) a la tira reactiva, la muestra no
se difunde nunca a la zona de ensayo 110. Como resultado, ninguno
de los analitos de la muestra llega a la zona de ensayo 110 y se
aglutina con el primer anticuerpo. Cuando se añade la solución
tampón, el segundo agente aglutinante de analitos se transporta con
la difusión de la solución tampón conjugada y atraviesa la zona de
ensayo 110 sin quedar inmovilizado, puesto que ningún analito está
presente en la zona de ensayo.
Si el volumen de muestra entregado es mayor que
50 \mul (por ejemplo, 55 \mul), la muestra se difundirá más
allá de la zona de ensayo 110 y más allá de la zona de flujo de
muestra terminal 116 hacia la zona de adición de solución tampón
conjugada. Algunos de los analitos se aglutinarán con el primer
agente aglutinante de analitos en la zona de ensayo 110 y quedará
inmovilizado. Mientras tanto, algunos analitos se aglutinarán con
el segundo agente aglutinante de analitos en la zona de adición de
solución tampón conjugada 118, antes de fluir en retroceso y
aglutinarse con el primer agente aglutinante de analitos en la zona
de ensayo 110. Los analitos, que se aglutinan con dos copias del
segundo agente aglutinante de analitos, es poco probable que se
aglutinen con el primer agente aglutinante de analitos, debido a un
impedimento estérico. Además, puede ser más difícil que se aglutine
el analito con el primer agente aglutinante de analitos una vez que
el analito se haya aglutinado ya con el segundo agente aglutinante
de analitos. Como resultado, la sensibilidad de la tira reactiva
puede verse reducida si el analito se aglutina con el segundo
agente aglutinante de analitos, antes de aglutinarse con el primer
agente aglutinante. Otros componentes de la parte de la muestra que
llega a la zona de adición de solución tampón conjugada 118 se
pueden aglutinar también con el segundo agente aglutinante de
analitos. Estos otros componentes competirán con el analito para
aglutinarse con el segundo agente aglutinante de analitos.
Controlando el volumen de la muestra entregada y
por lo tanto (1) exponiendo el analito al primer agente aglutinante
de analitos antes de exponer el analito inmovilizado al segundo
agente aglutinante y (2) no exponiendo los segundos agentes
aglutinantes al analito antes de que sean expuestos a los demás
componentes de la muestra, se reduce la aglutinación no específica,
lo que mejora notablemente la sensibilidad del ensayo y la
precisión de la detección del analito.
Como se describió anteriormente, dos ventajas de
las tiras reactivas de la presente invención son sus propiedades de
autolavado y autotemporización. Con el fin de explicar la
importancia de estas propiedades, se efectuará ahora una
comparación con la tira reactiva FLEXPACK™ HP, fabricada por Abbot,
que se ilustra en las Figuras 6A y 6B.
La Figura 6A ilustra la configuración de la tira
reactiva. Según se ilustra, la tira reactiva comprende dos
secciones separadas 310, 312 que están unidas entre sí por una
charnela 314. La sección 310, a la derecha, comprende una tira
reactiva 316 que comprende una zona de adición de muestra 318, una
zona de ensayo 319, una sección límite 320 y una almohadilla de
transferencia de solución tampón conjugada 322. La sección 312, a
la izquierda, comprende una almohadilla absorbente 324 que está
situada opuesta a la zona de adición de muestra 318, una
almohadilla de adición de solución tampón conjugada 326 que está
situada opuesta a la almohadilla de transferencia de solución tampón
conjugada 322 y una ventana de prueba 328 situada en posición
opuesta a la zona de ensayo 319. Las posiciones opuestas de la
almohadilla absorbente 324, la almohadilla de adición de solución
tampón conjugada 326 y la ventana de prueba 328 permiten que la
almohadilla absorbente 324 entre en contacto con la zona de adición
de muestra 318 y que la almohadilla de adición de solución tampón
conjugada 326 entre en contacto con la almohadilla de transferencia
de solución tampón conjugada 322, cuando las secciones primera y
segunda, 310 y 312, se pongan en contacto entre sí. Además, la zona
de ensayo 319 puede verse a través de la ventana de prueba 328
cuando las secciones primera y segunda, 310, 312, se ponen
mutuamente en contacto.
La Figura 6B ilustra la operación de la tira
reactiva ilustrada en la Figura 6A. Según se ilustra, la solución
tampón conjugada 330 se añade a la almohadilla de solución tampón
conjugada 326. La almohadilla de solución tampón conjugada 326
comprende un segundo agente aglutinante de analitos (por ejemplo,
un anticuerpo) capaz de aglutinar un analito en la muestra que se va
a detectar. El segundo agente aglutinante de analitos se etiqueta
con un marcador detectable que permite la visualización del segundo
agente aglutinante. El segundo agente aglutinante no es específico
para el analito y, por ello, se puede aglutinar con otros
componentes en la muestra.
A continuación se toma una muestra 332 y se añade
a la zona de adición de muestra 318. Una vez añadida, la muestra se
difunde a través de la tira reactiva 316, desde la zona de adición
de muestra 318 a través de la zona de ensayo 319. La zona de ensayo
319 comprende un primer agente aglutinante de analitos inmovilizado
(por ejemplo, un anticuerpo) que se aglutina, de forma selectiva,
con un analito en la muestra para cuya detección fue diseñada la
tira reactiva. Cuando la muestra atraviesa la zona de ensayo 319,
el analito de la muestra se aglutina con el primer agente
aglutinante de analitos y queda inmovilizado en la zona de ensayo
319.
Cuando el frente de difusión de la muestra llega
a la línea límite 320, se supone que el usuario pone juntas las
secciones primera y segunda, 310 312. La reunión de las secciones
primera y segunda, 310, 312, hace que la almohadilla absorbente 326
dirija la muestra en retroceso hacia la zona de adición de muestra
318, Mientras tanto, la solución tampón conjugada se transfiere a la
almohadilla de transferencia de solución tampón conjugada 322 desde
la almohadilla de adición de solución tampón conjugada 320. La
solución tampón conjugada se difunde desde la almohadilla 322 a
través de la zona de ensayo 319. El segundo agente aglutinante de
analitos, que estaba almacenado en la zona de adición de solución
tampón conjugada 318, se difunde con la solución tampón conjugada y
entra en contacto con el analito inmovilizado en la zona de adición
de ensayo 319. La observación del marcador visualmente detectable en
el segundo agente aglutinante de analitos, una vez inmovilizado en
la zona 319, se utiliza para detectar el analito.
Según la descripción anterior del funcionamiento
de la tira reactiva FLEXPACK™ HP, se necesita determinar cuándo la
muestra llega a la línea límite 320 antes de hacer que la solución
tampón conjugada sea transferida desde la zona de adición de
solución tampón 318 a la almohadilla de adición de solución tampón
conjugada 320 y comience a fluir hacia la zona de ensayo 319.
También es necesaria la etapa afirmativa de poner en contacto la
zona de adición de muestra 318 con la almohadilla absorbente 324,
con el fin de hacer que la muestra sea retirada desde la zona de
ensayo 319. El diseño de las tiras reactivas de la presente
invención, por ejemplo las ilustradas en las Figuras
2-4, elimina la necesidad de controlar la tira
reactiva para determinar cuando comienza la extracción de la
muestra desde la zona de ensayo. Además, puesto que la muestra se
retira automáticamente, no se necesita controlar cuidadosamente la
tira reactiva con respecto a cuándo añadir la solución tampón
conjugada. En lugar de ello, según se ilustra en el Ejemplo 2, los
resultados de los ensayos, usando las tiras reactivas de la
presente invención, no dependen de cuando la solución tampón
conjugada llega a las zonas de ensayo, después de que la muestra se
difunda desde las zonas de ensayo.
Los ensayos de flujo lateral, según la invención,
se pueden utilizar en una amplia gama de aplicaciones. Por ejemplo,
los ensayos pueden usarse para aplicarse al estudio de enfermedades
humanas, tales como las enfermedades infecciosas, o cualesquiera
otras enfermedades humanas que impliquen epítopos reconocibles (por
ejemplo, cáncer, SIDA, episodios y patologías cardiovasculares).
Los ensayos se pueden usar también en aplicaciones veterinarias,
pruebas de alimentos, productos agrícolas o productos químicos de
síntesis. Los ensayos de flujo lateral, según la invención, se
pueden emplear en numerosas formas, comprendiendo el uso de un
aparato de prueba del ensayo de flujo lateral, tal como el de la
solicitud de patente número de serie 09/199.255, presentada el 23
de noviembre de 1998, que se incorpora aquí a efectos de
referencia. En una realización preferida, el aparato de prueba del
ensayo de flujo lateral comprende un aparato de prueba ReLIA™,
disponible a través de PraxSys BioSystems (San Ramon, CA).
Los procedimientos y materiales para la
construcción de las tiras reactivas, según la presente invención,
se expondrán ahora con más detalle. Debe advertirse que la
construcción particular de las tiras reactivas puede ser diversa,
dependiendo del ensayo particular que se pretende realizar con la
tira reactiva. Variaciones en la forma en que las tiras reactivas
pueden construirse, al margen de este ejemplo, se pretende que
caigan dentro del ámbito de la invención.
La Figura 7 ilustra una vista fragmentada de la
tira reactiva de la Figura 1. Según se ilustra en la Figura 7, la
tira reactiva 100 puede comprender una tira de respaldo 402 que se
extiende a lo largo de la tira reactiva. Una banda de membrana 404
está situada sobre la tira de respaldo 402 y sirve como un paso de
difusión para la tira reactiva. Sobre la banda de membrana 404 está
situada una almohadilla absorbente 408, dentro de la zona
absorbente 108 que se sitúa hacia una extremidad proximal de la
tira reactiva. También sobre la banda de membrana 404 está situada
una almohadilla de muestra 406, distal a la almohadilla absorbente
408. Se puede usar un adhesivo 409 para unir la almohadilla de
muestra 406 a la banda de membrana 404. Una o más zonas de ensayo,
410, 412, 414, pueden formarse en la banda de membrana 404 distal a
la almohadilla absorbente 406. Una almohadilla de adición de
solución tampón conjugada 416 está situada sobre la banda de
membrana 404, distal a las zonas de ensayo 410, 412, 414 y distal a
la zona de flujo de muestra terminal 116. Una cubierta protectora
418 está situada sobre las zonas de ensayo. Para permitir que
escapen las burbujas de aire atrapadas entre los frentes de fluidos,
se deja una holgura entre las zonas de ensayo y las zonas
conjugadas que no están cubiertas por la cubierta protectora 418.
La cubierta protectora 418 se puede situar también más ampliamente
sobre la banda de membrana 404, con el fin de proteger otras partes
de la tira reactiva.
La tira de respaldo puede fabricarse de cualquier
material no poroso estable, que sea suficientemente resistente
para soportar los materiales y las bandas que se le acoplen. Puesto
que muchos ensayos emplean agua como medio de difusión, la tira de
respaldo es, preferentemente, casi impermeable al agua. En una
realización preferida, la tira de respaldo está fabricada con una
película de polímeros, más preferentemente una película de cloruro
de polivinilo.
La tira de respaldo se puede fabricar de
cualquier sustancia que tenga porosidad suficiente para permitir la
acción capilar de fluido a lo largo de su superficie y a través de
su interior. La banda de membrana debe tener suficiente porosidad
para permitir el desplazamiento de partículas recubiertas de
antígenos o anticuerpos. La banda de membrana debe ser también
humectable por el fluido usado en la muestra que contiene el
analito que se va a detectar (por ejemplo, hidrofilicidad para
fluidos acuosos, hidrofobicidad para disolventes orgánicos). La
hidrofobicidad de una membrana se puede modificar para preparar la
membrana hidrofílica para su uso con líquidos acuosos, mediante
procesos tales como los descritos en la patente U.S. nº 4.340.482 o
en la patente U.S. nº 4.618.533 que se refiere a la transformación
de una superficie hidrofóbica en una superficie hidrofílica. Entre
los ejemplos de sustancias que se pueden usar para formar la banda
de membrana cabe incluir: celulosa, nitrocelulosa, acetato de
celulosa, fibra de vidrio, nylon, membrana de intercambio iónico de
polielectrolitos, copolímeros acrílicos/nylon y polietersulfona. En
una realización preferida, la banda de membrana está fabricada con
nitrocelulosa.
La almohadilla absorbente puede formarse a partir
de una sustancia absorbente, que puede absorber el fluido
utilizado como la muestra y la solución tampón. La capacidad de
absorción de la almohadilla absorbente debe ser suficientemente
grande para absorber los fluidos que se entregan a la tira
reactiva. Ejemplos de sustancias adecuadas para uso en una
almohadilla absorbente comprenden celulosa y fibra de vidrio.
La almohadilla de adición de solución tampón
puede estar formada por cualquier sustancia absorbente. Ejemplos de
sustancias que puedan utilizarse, comprenden celulosa, nitrato de
celulosa, acetato de celulosa, fibra de vidrio, nylon, membrana de
intercambio de iones de polielectrolito, copolímero/nylon acrílico
y polietersulfonas.
Como se expuso anteriormente, la almohadilla de
adición de solución tampón conjugada puede servir como una
almohadilla de conjugado y contiene un agente etiquetado con un
marcador detectable, que es capaz de aglutinarse con el analito que
se va a detectar en la muestra. Como alternativa, la tira reactiva
puede comprender una almohadilla de conjugado separada de la
almohadilla de adición de solución tampón, conteniendo un agente
etiquetado con un marcador detectable, que sea capaz de aglutinarse
con el analito que se va a detectar en la muestra.
La cubierta protectora puede estar formada de
cualquier material que sea impermeable al agua y es preferentemente
translúcida o transparente. La cubierta protectora puede tener una
sola capa o múltiples capas. Los materiales preferentes para
utilizar en la cubierta protectora comprenden materiales
ópticamente transmisores, tales como poliamida, poliéster,
polietileno, compuestos acrílicos, vidrio o similares. La cubierta
protectora puede ser transparente, o no, dependiendo del
procedimiento de detección utilizado. En una realización preferida,
la cubierta protectora es un poliéster ópticamente
transparente.
Las tiras reactivas de la presente invención
están previstas para utilizarse con una amplia gama de ensayos de
flujo lateral, implicando a dos agentes aglutinantes de analitos,
cada uno de los cuales puede aglutinar un analito que se va a
detectar. Por lo menos uno de los agentes aglutinantes debe
aglutinar, de forma selectiva, el analito. Más concretamente, uno de
los agentes aglutinantes debe aglutinar el analito y no
cualesquiera otros componentes de la muestra.
Tal como se utiliza en el presente, el término
"analito" se refiere a cualquier componente de una muestra
(por ejemplo, molécula, compuesto o agregado) que ha de detectarse
y, como opción, determinado de forma cuantitativa mediante un
ensayo con tira reactiva. Entre los ejemplos de "analitos" cabe
incluir proteínas, tales como hormonas y otras proteínas
secretadas, enzimas y proteínas superficiales de células;
glicoproteínas; péptidos; pequeñas moléculas; polisacáridos;
anticuerpos (comprendiendo anticuerpos monoclonales y policlonales y
sus fragmentos); ácidos nucleicos; fármacos, toxinas; virus o
partículas de virus; partes de una pared celular y otros compuestos
que posean epítopos.
El primero y segundo de los agentes aglutinantes
de analitos pueden ser cualesquiera agentes que puedan aglutinar el
analito que se va a detectar. Una amplia gama de diferentes tipos
de moléculas se puede usar como agentes aglutinantes de analitos,
comprendiendo, por ejemplo, anticuerpos, proteínas de diseño,
péptidos, haptenos y lisatos que contengan mezclas heterogéneas de
antígenos con sitios de aglutinación de analitos, P. Holliger et
al, Trends in Biotechnology 13:7-9 (1995); S.M.
Chamow et al, ''Trends in Biotechnology
14:52-60 (1996). Si el analito que se va a detectar
es un ligando, se puede usar un receptor que aglutine al ligando y
viceversa. En una realización particular, el primero y el segundo
agentes aglutinantes de analitos son anticuerpos que aglutinan una
parte inmunogénica del analito.
Se advierte que por lo menos uno del primer o
segundo agente aglutinante de analitos ha de aglutinar el analito y
no aglutinar cualquiera de los otros componentes de la muestra que
se va a analizar, a la que aquí se hace referencia como agente
aglutinante selectivo de analitos. En una realización, el primer
agente aglutinante de analitos, que se inmoviliza en una zona de
ensayo, es un agente aglutinante selectivo de analitos y el segundo
agente aglutinante de analitos, que se etiqueta con un marcador
detectable, es capaz de aglutinar, de forma no selectiva, el
analito. En otra realización, el primer agente aglutinante de
analitos, que se inmoviliza en una zona de ensayo, es capaz de
aglutinar, de forma no selectiva, el analito y el segundo agente
aglutinante de analitos, que está etiquetado con un marcador
detectable, es un agente aglutinante selectivo de analitos. En otra
realización, tanto el primero como el segundo de los agentes
aglutinantes de analitos son agentes aglutinantes selectivos de
analitos.
Entre los ejemplos de agentes aglutinantes
selectivos de analitos pueden citarse a los anticuerpos
(monoclonales, policlonales y sus fragmentos) que tengan una
estrecha afinidad aglutinante para solamente un tipo particular de
biomolécula, tal como una proteína o un receptor. El marcador
detectable, incorporado al segundo agente aglutinante de analitos,
puede comprender una amplia gama de materiales, en tanto en cuanto
el marcador pueda ser detectado. Ejemplos de marcadores detectables
comprenden, sin limitación, partículas, etiquetas luminiscentes;
etiquetas colorimétricas, etiquetas fluorescentes; etiquetas
químicas; enzimas; etiquetas radiactivas o etiquetas de
radiofrecuencia; coloides metálicos y etiquetas quimioluminiscentes.
Entre los ejemplos de metodologías de detección de más frecuente
uso cabe incluir, sin limitación, a procedimientos ópticos, tales
como medición de la dispersión de la luz, reflectancia simple,
luminómetro o tubo fotomultiplicador; radiactividad (medida con un
contador Geiger, etc.); conductividad eléctrica o dieléctrica
(capacitancia); detección electroquímica de agentes electroactivos
liberados, tales como iones de indio, bismuto, galio o telurio,
según se describe por Hayes et al (Analitical Chem.
66:1860-1865 (1994)) o ferrocianuro como fue
sugerido por Roberts y Durst (Analytical Chem
67:482-491 (1995)), en donde el ferrocianuro
encapsulado dentro de un liposoma se libera mediante la adición de
una gota de detergente en la zona de detección, con la subsiguiente
detección electroquímica del ferrocianuro liberado. Se puede usar
también otros procedimientos convencionales, cuando se considere
apropiado.
Puede ser deseable ensayar dos o más analitos
diferentes utilizando la misma tira reactiva. En tales casos, puede
ser recomendable emplear diferentes marcadores detectables en la
misma tira reactiva, donde cada marcador detectable detecte un
analito distinto. Por ejemplo, diferentes marcadores detectables se
pueden incorporar a diferentes agentes aglutinantes selectivos de
analitos. Los diferentes marcadores detectables pueden ser
diferentes agentes fluorescentes, que emiten fluorescencia a
diferentes longitudes de onda.
Cuando se detectan dos o más analitos diferentes
usando la misma tira reactiva, se pueden formar, de modo opcional,
zonas de ensayo separadas sobre la tira reactiva para cada analito
que se va a detectar. El mismo marcador detectable se puede emplear
para la totalidad de las analitos. Como alternativa, diferentes
marcadores detectables, tales como los antedichos, se pueden usar
para los diferentes analitos, con el fin de impedir que una zona se
confunda con otra.
En una realización preferida, el marcador
detectable es una partícula. Ejemplos de partículas que pueden
usarse comprenden, sin limitación, partículas coloidales de oro;
partículas coloidales de sulfuro; partículas coloidales de selenio;
partículas coloidales de sulfato de bario; partículas coloidales de
sulfato de hierro; partículas de yodatos metálicos; partículas de
haluro de plata; partículas de sílice; partículas coloidales de
óxido metálico (hidratadas); partículas coloidales de sulfuro
metálico; partículas coloidales de seleniuro de plomo; partículas
coloidales de seleniuro de cadmio; partículas coloidales de fosfato
metálico; partículas coloidales de ferrita metálica; cualquiera de
las partículas coloidales antedichas recubiertas con capas
orgánicas o inorgánicas; moléculas de proteínas o de péptidos;
liposomas o partículas de látex de polímeros orgánicos, tales como
perlas de látex de poliestireno.
Una clase preferente de partículas es la de
partículas coloidales de oro. Las partículas coloidales de oro se
pueden obtener por cualquier procedimiento convencional, tales como
los procedimientos expuestos en G. Frens, 1973 "Nature Physical
Science", 241:20 (1973). Procedimientos alternativos pueden ser
los descritos en las patentes U.S. nº 5.578.577, nº 5.141.850; nº
4.775.636; nº 4.853.335; nº 4.859.612; nº 5.079.172: nº 5.202.267;
nº 5.514.602; nº 5.616.467 y nº 5.681.775.
La selección del tamaño de la partícula puede
depender de factores tales como la estabilidad del reactivo de
coloide líquido (sol) a granel y sus conjugados, el rendimiento y
la integridad de la liberación de partículas de la almohadilla de
conjugados así como la velocidad e integridad de la reacción.
Asimismo, el área superficial de las partículas puede influir sobre
el impedimento estérico entre mitades moleculares aglutinadas. El
tamaño de la partícula también se puede seleccionar sobre la base
de la porosidad de la banda de membrana. Preferentemente, las
partículas han de ser suficientemente pequeñas para difundirse a lo
largo de la membrana por la acción capilar de la solución tampón
conjugada.
Las partículas se pueden etiquetar para facilitar
su detección. Entre los ejemplos de etiquetas puede citarse, sin
limitación, etiquetas luminiscentes, etiquetas colorimétricas tales
como colorantes; etiquetas fluorescentes o etiquetas químicas,
tales como agentes electroactivos (por ejemplo, ferrocianuros);
enzimas; etiquetas radiactivas o etiquetas de radiofrecuencias.
El número de partículas presentes en la tira
reactiva puede variar, dependiendo del tamaño y composición de las
partículas, de la composición de la tira reactiva y de la banda de
membrana así como del nivel de sensibilidad del ensayo. El número
de partículas suele variar entre aproximadamente 1\times10^{9}y
1\times10^{13} partículas, aunque también puede usarse menos de
1\times10^{9} partículas. En una realización preferida, el
número de partículas es de aproximadamente 1\times10^{11}.
Según se ilustra en la Figura 1, en la tira
reactiva puede existir una pluralidad de zonas de ensayo 110, 112,
114. Cada zona de ensayo está situada de tal modo que un
instrumento analítico, automático o semiautomático, o un lector
humano, pueda determinar algunos resultados del ensayo de flujo
lateral.
Según se expuso anteriormente, inmovilizado en
por lo menos una de las zonas de ensayo se encuentra un primer
agente aglutinante de analitos, que es capaz de aglutinarse con el
analito en la muestra para cuya detección la tira reactiva está
diseñada. En algunas realizaciones, puede ser recomendable, para
algunas de las otras zonas de ensayo, incluir una o más zonas de
control, en las que se hayan inmovilizado uno o más agentes
aglutinantes de control. Agentes de control capaces de aglutinarse
con el agente aglutinante de control se pueden incorporar en la
tira reactiva en diversas posiciones o añadirse a la tira reactiva
cuando se está realizando el ensayo. Los agentes de control son
etiquetados, preferentemente, con un marcador detectable, tal como
los marcadores detectables antedichos, para facilitar así la
detección del agente de control que se aglutina con el agente
aglutinante de control inmovilizado en una zona de control.
Los agentes de control y los agentes aglutinantes
de control se pueden utilizar de forma combinada para realizar una
amplia gama de funciones de control. Por ejemplo, los pares de
aglutinantes de control pueden usarse para confirmar si la muestra
y la solución tampón conjugada se han difundido adecuadamente
dentro de la tira reactiva. Los pares de aglutinantes de control
son también utilizables como patrones internos y permiten que los
resultados de la medición de analitos se puedan comparar entre
diferentes tiras reactivas. Esto puede emplearse para corregir la
variabilidad entre una tira y otra. Dicha corrección podría
resultar inviable con controles externos que se basen, por ejemplo,
en un muestreo estadístico de las tiras. Además, las variaciones
lote a lote y uso a uso entre diferentes tiras reactivas pueden
reducirse al mínimo utilizando pares de aglutinantes de control.
Además, los efectos de un aglutinante no específico, como se
revelará más adelante, también se pueden reducir. Todas estas
correcciones son difíciles de realizar utilizando controles externos
fuera de las tiras.
En esta técnica, se conoce una amplia gama de
agentes que pueden usarse como miembros del par de aglutinantes de
control. Por ejemplo, por lo menos un elemento del par de
aglutinantes de control puede ser una proteína natural o de diseño.
El par de aglutinantes de control puede ser también un par de
ligando-receptor. Además, por lo menos un elemento
del par de aglutinantes de control puede ser un antígeno, otra
molécula orgánica o un hapteno conjugado con una proteína no
específica para el analito objeto de interés. Descripciones de
otros elementos adecuados de pares de aglutinantes de control pueden
encontrarse en la patente US nº 5.096.837 e incluir IgG, otras
inmunoglobulinas, albúmina sérica bovina (BSA), otras albúminas,
caseína y globulina.
Las características deseables para los pares de
agente aglutinante de control-agente de control,
pero sin limitarse a la estabilidad en conjunto, son las de falta
de especificidad para el analito de interés, reproducibilidad y
previsibilidad del comportamiento en la prueba, tamaño molecular y
avidez de aglutinación entre sí.
En una realización preferida, los elementos del
par de aglutinantes de control no se aglutinan con nada que pueda
estar presente en la tira reactiva, por ejemplo, procedente de la
muestra. En una realización, el agente aglutinante de control
comprende un anti-dinitrofenol
(anti-DNP) de conejo y el agente de control
comprende un dinitrofenol conjugado con BSA (albúmina sérica
bovina).
En una realización preferida de la invención,
tanto el segundo agente aglutinante de analitos, que se difunde a
lo largo de la tira reactiva, como el agente de control se
incorpora a una especie única de partículas. La incorporación puede
ser por absorción no específica o por los procedimientos químicos
de conjugados tradicionales. Como alternativa, un sistema de
aglutinación no covalente, tal como
"biotina-avidina", o incluso un anticuerpo
específico para el segundo agente aglutinante de analitos, se puede
usar para incorporar el agente aglutinante de analitos a la
partícula. Los reactivos bifuncionales y multifuncionales pueden
usarse también para acoplar el segundo agente aglutinante de
analitos y el agente de control con la partícula.
El número de los segundos agentes aglutinantes de
analitos y los agentes de control incorporados a cada partícula se
puede variar, dependiendo de lo que resulte más apropiado para cada
ensayo. Por ejemplo, dos copias del segundo agente aglutinante de
analitos y una copia de agente de control se pueden incorporar a
cada partícula. Como alternativa, una copia del segundo agente
aglutinante de analitos y dos copias del agente de control pueden
incorporarse a cada partícula. Otras variaciones sobre las
relaciones entre el segundo agente aglutinante de analitos: agente
de control:partícula se pueden emplear dependiendo del ensayo
particular en el que se vayan a usar, estando estas variaciones
destinadas a entrar dentro del ámbito de la presente invención.
En una realización preferida, la tira reactiva
comprende más de una zona de control y se utiliza para crear una
curva de calibración con respecto a la cual pueden compararse una
amplia gama de los resultados de mediciones de analitos. Esta
realización se describe con más detalle en la solicitud de patente
número de serie 09/198.118, presentada el 23 de noviembre de 1998,
que se incorpora aquí a título de referencia. Hacer que la tira
reactiva posea más de una zona de control permite que los ensayos
de flujo lateral dispongan de un margen dinámico más amplio que los
ensayos de flujo lateral convencionales. En realizaciones
preferidas, las tiras reactivas con 2, 3 o más zonas de control se
usan con una metodología a escala reducida, examinada más adelante,
que permite la representación gráfica de cantidades de pares de
aglutinantes de control detectados en la misma escala en la que se
informa de las cantidades de analitos detectadas.
En una realización preferida, la tira reactiva
tiene por lo menos una zona de control alta y por lo menos una zona
de control baja. La diferencia entre las dos zonas suele consistir
en la concentración. La concentración del agente de control en la
zona de control alta es mayor que la concentración del agente de
control en la zona de control baja. Por lo tanto, la cantidad de
pares de aglutinantes de control será mayor en la zona de control
alta que en la zona de control baja. En realizaciones en las que la
cantidad de pares de aglutinantes de control, en una zona de
control dada, se pueda representar gráficamente con la misma escala
de medida que la empleada para indicar la cantidad de analitos, se
puede trazar una curva de calibración a través de los valores de los
pares de aglutinantes en las zonas de control alta y baja.
En otras realizaciones, más de dos zonas de
control pueden estar presentes. Esto permite generar una curva que
refleja mejor cualesquiera no linealidades presentes en el ensayo
entre la cantidad de analito detectada y la medición contra la que
podría representarse gráficamente la cantidad, según se expone más
adelante. Aunque dichas faltas de linealidad podrían afectar, de
algún modo, a los ensayos que suponen una relación relativamente
lineal, pueden corregirse para utilizar zonas de control múltiples.
Pueden utilizarse 2, 3 o más zonas de control.
En otra realización, una sola zona de control
puede comprender más de un tipo de agente de control. Esto se puede
emplear en realizaciones en las que existe más de una población de
agentes aglutinantes de analitos y agentes no específicos de
analitos acoplados a un agente de detección. Por ejemplo, cuando se
desea ensayar dos o más analitos de interés con la misma tira
reactiva, se puede preparar dos poblaciones de agentes aglutinantes
de analitos y de agentes no específicos de analitos acoplados a un
agente de detección. Pueden utilizarse diferentes agentes de
detección para cada población, permitiendo así establecer una
distinción entre los resultados para las dos diferentes analitos que
son de interés. En tales circunstancias, podría ser aconsejable
usar zonas de control que incluyan diferentes agentes de control o
pares de agentes aglutinantes de control.
Las zonas de control pueden situarse en una
amplia gama de localizaciones dentro del grupo de las zonas de
ensayo. Se advierte que las zonas de ensayo se pueden situar en
diversos lugares en la tira reactiva, dependiendo del diseño de
flujo de la tira reactiva compatible con la presente invención.
Los ensayos se realizan usando una tira reactiva
que comprende una o más zonas de control como parte de las zonas de
ensayo de la misma forma que se describen respecto a las Figuras
2A-2H, y 3A-3H. Se advierte que la
tira reactiva, o la solución tampón conjugada, comprende el agente
de control que se aglutina con el agente aglutinante de control
inmovilizado, por ejemplo, en las zonas de ensayo 112 y 114 de las
Figuras 2A-2H y en las zonas de ensayo 212 y 214 de
las Figuras 3A-3H. Cuando se añade la solución
tampón conjugada, el agente de control se difunde con la solución
tampón conjugada y se aglutina con el agente aglutinante de control
inmovilizado en las zonas de control.
Las cantidades de agentes de control
inmovilizados en las zonas de control, se detectan junto con la
detección de cantidades del segundo agente aglutinante de analitos
inmovilizado en la zona de ensayo. Como fue antedicho, es preferible
que los agentes de control y el segundo agente aglutinante de
analitos sean etiquetados con un marcador detectable, que facilite
su detección. La cantidad de marcador detectable en cada zona de
ensayo se puede determinar, con rapidez, mediante una amplia gama
de técnicas conocidas en esta técnica, dependiendo del tipo de
marcadores detectables que se están empleando. Ejemplos comunes de
técnicas de detección comprenden los procedimientos ópticos
(dispersión de la luz, reflectancia simple, luminómetro o tubo
fotomultiplicador); radiactividad; conductividad eléctrica;
capacitancia dieléctrica; detección electroquímica de agentes
electroactivos liberados, tal como se indicó con anterioridad.
Una vez que se haya medido la cantidad de
marcadores detectables en cada zona de ensayo, estas mediciones
puede utilizarse para detectar y, preferiblemente, cuantificar la
cantidad de analitos presente, preferentemente también mediante
calibración de la tira reactiva utilizando las cantidades de
marcadores detectables en las zonas de control. Por ejemplo, cuando
se emplean zonas de control altas y bajas, la cantidad de agente de
control inmovilizado en las zonas de control alta y baja se puede
utilizar para cuantificar la cantidad del segundo agente aglutinante
de analitos en relación con las zonas de control alta y baja. Estas
mediciones de intensidades relativas pueden usarse, más adelante,
para determinar con más precisión el número de copias de analito
presentes en el volumen de medición.
Una característica ventajosa de utilizar zonas de
control múltiples consiste en la capacidad para crear una escala
relativa para mediciones de analitos. Una vez que se hayan
cuantificado las cantidades de marcadores detectables, estas
cantidades de marcadores detectables se puede representar
gráficamente, a continuación, con otra escala de medida. Por
ejemplo, aun cuando los resultados de la medición del analito
pueden medirse sobre la base de una medición absoluta del analito,
los resultados obtenidos pueden ser más significativos en otras
unidades, tal como una intensidad relativa a la de una zona de
control, o zonas de control, mencionada aquí como Intensidad
Relativa o IR. Los resultados pueden también expresarse como el
número de copias de analito presentes en el volumen de medición. La
representación gráfica de la cantidad de analitos detectada, en
otras escalas de medida, es una realización preferida para informar
de los resultados del ensayo según la invención.
Por ejemplo, los resultados de los ensayos se
pueden representar gráficamente en una escala relativa. Utilizando
una escala relativa, tal como por ejemplo la Intensidad Relativa
(IR), para controles internos, los valores absolutos para el
analito detectado se pueden convertir en valores de IR. En una
realización preferida, a un control bajo puede asignarse un valor IR
de 1 y a un control alto se le puede asignar un valor IR de 3, aun
cuando la relación de valores absolutos de estos controles puede ser
diferente. En una realización preferida, la relación de valores
absolutos puede ser de por lo menos aproximadamente de 5:1,
mientras que la relación de IR puede estar en torno a 3:1.
Haciéndolo así, los cambios en las tiras reactivas individuales que
afecten al valor absoluto medido harán que la curva patrón se
desplace arriba y abajo de un eje de coordenadas Y, pero tendrá un
impacto menor sobre el valor de IR trazado a lo largo del eje X.
Esto atenúa sistemáticamente la variabilidad en el resultado
informado, es decir, se manifestará como una "ganancia
negativa".
Por ejemplo, si existe una ganancia negativa
entre la cantidad medida de analitos y la cantidad informada,
entonces, los grandes cambios en la cantidad de analito medida
tendrán una correlación gráfica con los cambios relativamente
pequeños en la cantidad informada de analito. Aunque no cambie la
variabilidad subyacente de la cantidad medida de analito, el
procedimiento puede ser de utilidad en determinadas circunstancias.
El efecto de ganancia negativa atenúa parte de la variabilidad del
ensayo y se puede emplear para mejorar la reproducibilidad de los
resultados informados del ensayo en comparación con la simple
información de un valor absoluto de lo que se ha medido.
Además de informar de los resultados de los
ensayos, en una escala continua, bien sea directamente como la
cantidad de analito detectada, bien sea indirectamente como escala
de medida en la que se haya representado gráficamente la cantidad
de analito detectada, los ensayos, según la invención pueden usarse
en un ensayo de tipo de "corte". Si el marcador detectable se
detecta en una zona de aglutinación de analitos, la cantidad de
marcador detectable detectada puede compararse con respecto a un
valor de corte. Un valor de corte es el valor por encima del cual
la prueba se puede considerar positiva; es decir, el analito de
interés está presente en la muestra de fluido en algún grado de
confianza estadística. Por debajo del valor de corte, la prueba se
suele considerar no positiva-el analito de interés
no está presente o el ensayo de flujo lateral, según la invención,
no detectó su presencia. Aunque se puede establecer un corte sobre
la base de un valor directamente medido, tal como la cantidad de
analito detectada, los resultados pueden ser más significativos si
se proporcionan en una escala indirecta o relativa.
Un ensayo de flujo lateral de corte es más
deseable puesto que aumenta la separación de medición entre un
valor negativo y un valor positivo. Un valor negativo es el valor
indicado en una escala continua, en el caso en que el analito de
interés no esté estadísticamente presente. Por el contrario, un
valor positivo es el valor indicado en una escala continua, en el
caso de que el analito de interés esté estadísticamente presente. A
medida que convergen estos valores, se reduce la probabilidad de
poder indicar, en términos estadísticos, los valores positivos y
negativos por separado.
Es también deseable un flujo lateral de corte con
una mayor precisión en el corte. Cuando hay menos variación en el
corte elegido, es más probable que un valor positivo pueda
considerarse exactamente un positivo y un valor negativo sea
considerado exactamente un negativo.
Los resultados de los ensayos pueden ser
representados en una escala "relativa", anteriormente
examinada o en una escala "absoluta". Las escalas absolutas se
miden en unidades físicas reales, tales como número de copias de
analitos por mililitro de fluido. La medición en la escala absoluta
puede ser preferible para la prueba de algunas enfermedades o
condiciones, tales como las pruebas de marcadores de cáncer. En
dichas realizaciones preferibles, el resultado puede expresarse en
unidades tales como ng/ml. En consecuencia, las zonas de control
pueden tener concentraciones con valor asignado de agente de
control. En una extensión del concepto de medición relativa, se
puede medir la densidad de los valores de la densidad de
reflectancia (DR) de una serie de patrones de concentración en
analitos conocida y se puede calcular, en la forma anteriormente
descrita, las intensidades relativas a los controles (valores de
IR). A continuación, los valores de IR pueden llevarse a un gráfico
con respecto a la concentración en analitos para construir una
curva patrón en la que los valores de IR sean asignados valores de
concentración del analito de interés. El valor de IR de una muestra
puede leerse entonces en esta curva patrón de valor asignado, que
proporciona un resultado etiquetado en las unidades deseadas.
Donde sea posible, es deseable emplear un agente
único como, a la vez, el agente aglutinante de analitos y el agente
de control. En comparación con ensayos donde el agente aglutinante
de analitos y el agente de control sean agentes separados, los
ensayos donde se utiliza un agente único proporcionan una más
amplia separación de medición de poblaciones muestras negativas y
positivas, junto con una mayor precisión en el corte.
Numerosas circunstancias pueden afectar a la
reactividad absoluta de ensayos de flujo lateral comprendiendo, sin
limitación, las variaciones derivadas de la fabricación, las
variaciones inducidas por el operador, las variaciones inducidas
por el medio ambiente y efectos de las muestras. Con ensayos de
flujo lateral convencionales, cualesquiera de estas variaciones
pueden actuar para reducir o ampliar supuestamente la reactividad de
una banda sobre la otra, dando lugar a posibles resultados negativos
o positivos falsos. No controlar estas u otras variaciones pueden
dar lugar a una importante imprecisión, falta de reproductividad,
falta de sensibilidad y falta de especificidad de los ensayos.
Los ensayos de flujo lateral están también
sujetos a varias interferencias que podrían afectar a la magnitud
absoluta de aglutinación del agente aglutinante de analitos o
agente de control para las zonas de ensayo. Los factores
influyentes pueden comprender: 1) variabilidad en la liberación del
segundo agente aglutinante de analitos o el agente de control desde
un soporte conjugado, 2) variación de dispositivo a dispositivo en
la aglutinación no específica de la población aglutinante de
analitos para la tira reactiva, 3) variabilidad en el movimiento de
la población aglutinante de analitos a través o a lo largo de la
tira reactiva durante el ensayo debido a variación en el tamaño de
los poros de la tira reactiva o materiales de la banda de membrana o
agregación no específica del agente aglutinante de analitos. La
variabilidad de las mediciones absolutas de la aglutinación, debida
a estos u otros factores, puede, por lo tanto, ser inadmisiblemente
alta en los ensayos de flujo lateral convencionales.
Estas clases de variabilidades pueden reducirse
utilizando un agente único que comprende el segundo agente
aglutinante de analitos y el agente de control. Cualquier parte de
la matriz de ensayo de flujo lateral que ha sido expuesta al agente
de control es más probable que haya sido expuesta al segundo agente
aglutinante de analitos, en comparación con los ensayos de dos
poblaciones convencionales. Cualquier mecanismo que impida o evite
el movimiento del agente de control a lo largo o a través de la
matriz de flujo de lateral es más probable que impida o evite el
movimiento del segundo agente aglutinante de analitos, en
comparación con los ensayos de dos poblaciones convencionales. En
tercer lugar, el agente de control puede elegirse de modo que
reduzca la magnitud de la aglutinación no específica del segundo
agente aglutinante de analitos.
La reducción de la aglutinación no específica
puede producirse también debido a modificación del perfil de
hidrofobicidad/hidrofilicidad de la matriz de detección de
analitos. La reducción en la "autoasociación" de la agregación
de las partículas de la matriz de detección de analitos, que podría
impedir el movimiento de la matriz a lo largo de la banda, puede
conseguirse también seleccionando un agente de control con
propiedades adecuadas. Una ventaja final es que, debido a la
necesidad de preparar menos reactivos, se puedan reducir los gastos
de fabricación.
Las zonas de control múltiples, según aquí se
revela, ofrecen varias posibles ventajas en la práctica de los
ensayos de flujo lateral. Se pueden utilizar zonas de control
adicionales para ampliar el margen dinámico de la curva patrón de
ensayo si la curva es lineal o no lineal. Múltiples zonas de
control se pueden utilizar también para definir si un efecto de
enganche de alta dosis o prozona está presente en un ensayo dado.
Si dicho efecto está presente, entonces se puede recomendar al
usuario diluir la muestra para determinar, sin ambigüedad, la
concentración del analito en cuestión.
En este ejemplo, se describe la construcción de
una tira reactiva que tiene un diseño según se ilustra en las
Figuras 1 y 7. Láminas respaldadas de nitrocelulosa Milipore SRHF
(4,8 cm x 20 cm) (banda de membrana 404) fueron recubiertas
dispensando, en sentido longitudinal, una banda de antígeno (zona de
ensayo 410) y dos bandas de control (zonas de ensayo 412, 414) en
la nitrocelulosa 404 utilizando una plataforma dispensadora Bio Dot
XYZ3000 con Biojets funcionando a una frecuencia de 120 Hz, 20, 83
nl/gota y 0,5 \mul/cm. Las láminas de nitrocelulosa 404 fueron
luego secadas durante una hora a una temperatura de 37ºC en una
incubadora de aire forzado, bloqueada durante quince minutos en una
solución de PBS conteniendo 10 mg/ml BSA, 1% (en peso/volumen) PEG
8000, 3% (en peso/volumen) mannitol, 0,3% (en peso/volumen)
gelatina, 0,01% (en peso/volumen) de azida sódica y 0,05% (en
peso/volumen) de dodecil sulfato sódico y luego secada durante una
hora adicional en una incubadora de aire forzado a una temperatura
de 37ºC. Las láminas de nitrocelulosa recubiertas 404 fueron
almacenadas desecadas a la temperatura ambiente en bolsas de hoja
metálica.
Almohadillas de fibra de vidrio Gelman 8980 para
uso como almohadillas de solución tampón conjugada 416 fueron
prebloqueadas por inmersión en una solución de PBS 10 mg/ml BSA, 1%
(peso/volumen) de Tritón X-100, 2,5% (peso/volumen)
de sucrosa y 0,3% (peso/volumen) de polivinilpirrolidona
K-30 y luego un secado de 2 horas en una incubadora
de aire forzado. Una solución conjugada en PBS 10 mg/ml BSA, 1%
(peso/volumen) de Tritón X-100, 2,5% (peso/volumen)
de sucrosa y 0,3% (peso/volumen) de polivinilpirrolidona fue
dispensada, en sentido longitudinal, sobre las almohadillas de
solución tampón conjugada prebloqueadas 416 utilizando una
plataforma dispensadora Bio Dot XYZ3000 con un Biojet único
operando a una frecuencia de 120 Hz y proporcionando 104,17 nl/gota
y 2,5 \mul /cm. Las almohadillas de solución tampón conjugada 416
fueron recubiertas con conjugado en patrones de dos a seis líneas
por cm con tres patrones recubiertos sobre cada almohadilla de 3 cm
x 10 cm. Las almohadillas de solución tampón conjugada recubiertas
416 fueron secadas al vacío en 2 Torr durante dos horas a la
temperatura ambiente y luego se cortaron en tres secciones de 1 cm
x 20 cm conteniendo cada una un patrón.
Se prepararon tiras reactivas fijando una lámina
de nitrocelulosa respaldada 404 de 4,8 cm x 20 cm, una almohadilla
de solución tampón conjugada recubierta 416 de 1 cm x 20 cm y una
lámina 406 de Gelman Cytosep 1662 de 1,2 x 20 cm en una lámina de
respaldo de vinilo 402 de 0,010'' de espesor, 6 cm x 20 cm,
recubierta de adhesivo (corte por matriz de precisión de G&L).
Una almohadilla de aplicación de muestra 406 de 0,5 cm de anchura
fue fijada a la nitrocelulosa 404 utilizando un adhesivo de doble
cara 409. Se cortaron tiras de 0,5 cm de anchura a partir de la
lámina ensamblada con una cuchilla de tambor de corte de matriz de
precisión de G&L. Para ensamblar la tira reactiva en un
cartucho de ensayo (ilustrado en la Figura 5A), la tira fue colocada
en la mitad inferior del soporte, una almohadilla absorbente 408,
de 0,6 cm x 1,5 cm, fue colocada sobre la parte superior de la tira
y los pasadores de la mitad superior del soporte fueron alineados
con los agujeros de la mitad inferior y fueron presionados juntos
de forma hermética.
Las tiras utilizadas en este ejemplo fueron
construidas según se describe en el Ejemplo 1. Las tiras se
recubrieron con 800 \mug/ml de anti-dinitrofenilo
(anti-DNP) de conejo en la banda de control alta
(zona de ensayo 414), 200 \mug/ml de
anti-dinitrofenilo (Anti- DNP) de conejo en la
banda de control baja (zona de ensayo 412) y una solución de
antígeno de Herpes 2 gG_{2} teniendo una densidad óptica, a 280
nm, de aproximadamente 0,115 en la zona de ensayo 410. El orden de
las bandas dentro de la tira reactiva era la banda de antígeno más
próxima a la almohadilla de solución tampón conjugada, zona de
control baja entre la banda de antígeno y la banda de control alta
más alejada de la almohadilla de solución tampón conjugada y más
próxima a la almohadilla absorbente.
Las almohadillas de soluciones tampones
conjugadas prebloqueadas 416 fueron recubiertas con conjugado de
proteína A-OMNI^{TM} [proteína
A/BSA-DNP (2 x/0,5 X)]-8,5 nm de
oro, mezclando tres volúmenes de la solución conjugada de stock (OD
520 aproximadamente 63) con un volumen de PBS conteniendo 40 mg/ml
de BSA, 4% (peso/volumen) de Tritón X-100, 10%
(peso/volumen) de sucrosa y 1,2% (peso/volumen) de
polivinilpirrolidona K-30 y 0,15 volúmenes de 20 x
PBS. La mezcla fue dispensada sobre las almohadillas de soluciones
tampones conjugadas prebloqueadas según se describe en el Ejemplo
1.
En ensayo fue realizado colocando la casete sobre
el banco de laboratorio y añadiendo luego 32,5 \mul, 35 \mul,
40 \mul, 45 \mul o 50 \mul de muestra positiva moderada
705145 de Herpes 2 a la almohadilla de muestra 406 a través del
orificio de adición de muestra de la casete. A continuación, se
añadió 125 \mul de solución tampón conjugada (PBS, 10 mg/ml BSA,
0,1% azida sódica y 2 mM EDTA) a la almohadilla de adición de
solución tampón conjugada 416 a 0, 5 ó 15 minutos después de que la
muestra alcanzara la zona de flujo de muestra terminal 116. A
continuación, la casete conteniendo la tira fue colocada en una
máquina ReLIA^{TM} puesta a punto para funcionar y realizar la
lectura del ensayo de ReLIA^{TM} para la detección de anticuerpos
para Herpes 2. La temperatura de la tira fue ajustada a 40ºC y
luego las tiras fueron objeto de lectura transcurridos 10
minutos.
Como puede observarse a partir de los resultados
ilustrados en la Figura 8, los resultados del ensayo de Herpes 2 de
flujo de detención de ReLIA^{TM} fueron independientes del
volumen de muestra añadido y del tiempo de incubación, antes de la
iniciación del flujo inverso, para volúmenes de muestra desde 35 a
45 \mul y tiempos de incubación de hasta quince minutos, siendo
investigado el retraso más largo. Dentro de este margen de
volúmenes y tiempos de incubación, el resultado del CV en el ensayo
fue del 12%.
Las tiras utilizadas en este ejemplo fueron
recubiertas con 800 \mug/ml de anti-dinitrofenilo
de conejo (Anti-DNP) en la banda de control alta,
200 \mug/ml de anti-dinitrofenilo de conejo
(anti-DNP) en la banda de control baja y una
solución de antígeno de Herpes 2 gG_{2} teniendo una densidad
óptica, a 280 nm, de aproximadamente 0,115 en la banda de antígeno.
El orden de las bandas era la banda de antígeno más próxima a la
almohadilla de solución tampón conjugada, zona de control baja
entre la banda de antígeno y las bandas de control baja y la banda
de control baja más alejada de la almohadilla de solución tampón
conjugada y más próxima a la almohadilla absorbente. Se recubrieron
bandas de nitrocelulosa y se prepararon tiras reactivas según se
describe en el Ejemplo 1.
Se recubrieron almohadillas de solución tampón
conjugada prebloqueadas con conjugado de proteína
A-OMNI^{TM} [proteína A/BSA-DNP
(2X/0,5X)]-8,5 nm de oro mezclando tres volúmenes
de la solución conjugada de stock (OD 520 aproximadamente 63) con
un volumen PBS conteniendo 40 mg/ml de BSA, 4% (peso/volumen) de
tritón X-100, 10% (peso/volumen) de sucrosa y 1,2%
(peso/volumen) de polivinilpirrolidona K-30 y 0,15
volúmenes de 20 x PBS. La mezcla fue dispensada sobre almohadillas
de soluciones tampones conjugadas prebloqueadas según se describe en
el Ejemplo 1.
En ensayo fue realizado colocando la casete sobre
el banco de laboratorio y añadiendo luego 40 \mul de las muestras
positivas o negativas de Herpes 2, indicadas en la Figura 9, a la
almohadilla de muestras a través del orificio de adición de muestra
de la casete de muestras. Cuando el frente de líquido de la muestra
alcanzó la zona de flujo de muestra terminal, la casete conteniendo
la tira fue colocada en una máquina ReLIA^{TM} configurada para
realizar y leer el ensayo de ReLIA^{TM} para la detección de
anticuerpos para Herpes 2. Inicialmente se añadió 125 \mul de
solución tampón conjugada (PBS 10 mg/ml BSA, 0,1% de azida sódica y
2 mM de EDTA) al orificio de solución tampón conjugada de la
casete. La temperatura de la tira fue ajustada a 40º C y las tiras
fueron objeto de lectura transcurridos 10 minutos. Los valores de
intensidad relativa (IR) de las muestras fueron calculados según un
algoritmo que asigna la respuesta de control bajo del ensayo
(densidad de reflectancia) con un valor IR de 1, la respuesta de
control alto del ensayo (densidad de reflectancia) con un valor IR
de 3 y respuesta cero como un valor IR de 0.
Según se ilustra en la Figura 10, todas las
muestras positivas de Herpes 2 proporcionaron valores de intensidad
relativa (IR) de 0,58 o mayores mientras que todas las muestras
negativas de Herpes 2 proporcionaron valores de IR de 0,01 o más
bajos, demostrando que las poblaciones positivas y negativas están
bien separadas en este ensayo.
Las tiras utilizadas en este ejemplo fueron
recubiertas con 800 \mug/ml de anti-dinitrofenilo
de conejo (anti-DNP) en la banda de control alta,
200 \mug/ml de anti-dinitrofenilo de conejo
(anti-DNP) en la banda de control baja y una
solución de antígeno de Helicobacter pylori teniendo una
densidad óptica, a 280 nm, de aproximadamente 1,157 en la banda de
antígeno. El orden de las bandas era la banda de antígeno más
próxima a la almohadilla de solución tampón conjugada, zona de
control baja entre la banda de antígeno y la banda de control alta
y la banda de control alta más alejada de la almohadilla de
solución tampón conjugada y más próxima a la almohadilla absorbente.
Fueron recubiertas láminas de nitrocelulosa y se prepararon tiras
reactivas según se describe en el Ejemplo 1.
Se recubrieron almohadillas de soluciones
tampones conjugadas prebloqueadas con conjugado de proteína
A-OMNI^{TM} [proteína A/BSA-DNP (2
X/0,5 X)]-8,5 nm de oro mezclando tres volúmenes de
la solución conjugada de stock (OD 520 aproximadamente 63) con un
volumen de PBS conteniendo 40 mg/ml de BSA, 4% (peso/volumen) de
tritón X-100, 10% (peso/volumen) de sucrosa y 1,2%
(peso/volumen) de polivinilpirrolidona K-30 y 0,15
volúmenes de 20 x PBS. La mezcla fue dispensada sobre almohadillas
de soluciones tampones conjugadas prebloqueadas según se describe
en el Ejemplo 1.
El ensayo fue realizado colocando la casete sobre
el banco de laboratorio y añadiendo luego 40 \mul de las muestras
positivas o negativas de Helicobacter pylori, indicadas en
la Figura 10, a la almohadilla de muestras a través del orificio de
adición de muestra de la casete de muestras. Cuando el frente
líquido de la muestra alcanzó la zona de flujo de muestra terminal,
la casete conteniendo la tira fue colocada en una máquina
ReLIA^{TM} configurada para funcionar y leer el ensayo de
ReLIA^{TM} para la detección de anticuerpos para Helicobacter
pylori. Inicialmente, se añadió 125 \mul de solución tampón
conjugada (PBS, 10 mg/ml de BSA, azida sódica al 0,1% y 2 mM de
EDTA) al orificio de solución tampón conjugada de la casete. La
temperatura de la tira fue ajustada a 40ºC y las tiras fueron
objeto de lectura transcurridos 10 minutos. Los valores de
intensidad relativa (IR) de las muestras fueron calculados según un
algoritmo que asigna a la respuesta de control bajo del ensayo
(densidad de reflectancia) un valor IR de 1, a la respuesta de
control alto del ensayo (densidad de reflectancia) un valor IR de 3
y a la respuesta cero como un valor IR de 0.
Según se ilustra en la Figura 9, todas las
muestras positivas de Helicobacter pylori proporcionaron
valores de intensidad relativa (IR) de 1,64 o mayores, mientras que
todas las muestras negativas de Helicobacter pylori
proporcionaron valores de IR de 1,14 o menores, demostrando así que
las poblaciones positivas y negativas están bien separadas en este
ensayo.
Resultará evidente para los expertos en la
materia que se pueden realizar varias modificaciones y variaciones
en el aparato y procedimientos de la presente invención sin
apartarse por ello del alcance de la invención. Por lo tanto, está
previsto que la presente invención cubra sus modificaciones y
variaciones, siempre que estén comprendidas dentro del alcance de
las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes. Además, los
siguientes ejemplos se han incluido con el fin de ilustrar la
invención reivindicada y no deben interpretarse como limitativos
del alcance de la invención reivindicada.
Claims (35)
1. Tira reactiva (100) adaptada para recibir una
muestra y detectar un analito contenido en ella, que comprende:
una zona de adición de muestra (106) a la que
puede añadirse una muestra (120);
una zona absorbente (108) proximal a la zona de
adición de muestra;
una o más zonas de ensayo (110, 112, 114)
distales de la zona de adición de muestra, comprendiendo por lo
menos una de las zonas de ensayo un primer agente aglutinante de
analitos inmovilizado, que es capaz de aglutinar el analito que se
va a detectar, y
una zona de flujo de muestra terminal (116)
distal de una o más zonas de ensayo, estando la zona absorbente
situada relativa a la zona de adición de muestra y teniendo una
capacidad de absorción relativa a las demás zonas de la tira
reactiva, de tal modo que un frente de difusión distal (124) de una
muestra añadida a la zona de adición de muestras sea objeto de
difusión desde la zona de adición de muestra a un punto de difusión
distal dentro de la zona de flujo de muestra terminal y a
continuación sea objeto de difusión proximal relativa a una o más
zonas de ensayo.
2. Tira reactiva según la reivindicación 1, en la
que la tira reactiva está adaptada para recibir una muestra dentro
de una gama de volúmenes predeterminada.
3. Tira reactiva según la reivindicación 1, en la
que la tira reactiva está adaptada para recibir una muestra dentro
de una gama de volúmenes predeterminada entre aproximadamente 10 y
250 \mul.
4. Tira reactiva según la reivindicación 1, en la
que la tira reactiva está adaptada para recibir una muestra dentro
de una gama de volúmenes predeterminada entre aproximadamente 20 y
100 \mul.
5. Tira reactiva según la reivindicación 1, en la
que la tira reactiva está adaptada para recibir una muestra dentro
de una gama de volúmenes predeterminada entre aproximadamente 30 y
50 \mul.
6. Tira reactiva según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la zona de flujo de muestra
terminal tiene una longitud desde un extremidad proximal a un
extremidad distal entre aproximadamente 3 y 10 mm.
7. Tira reactiva según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el primer agente aglutinante
de analitos no se aglutina a componentes en la muestra que no sea
el analito.
8. Tira reactiva según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el primer agente aglutinante
de analitos se selecciona de entre un grupo constituido por
anticuerpos, proteínas de diseño, péptidos, haptenos, lisatos
conteniendo mezclas heterogéneas de antígenos teniendo sitios
aglutinantes de analitos, ligandos y receptores.
9. Tira reactiva según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en la que las zonas de ensayo comprenden
además por lo menos una primera zona de control con un agente
aglutinante de control inmovilizado en dicha zona.
10. Tira reactiva según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en la que las zonas de ensayo comprenden
además una primera zona de control con un agente aglutinante de
control inmovilizado y una segunda zona de control con el mismo
agente aglutinante de control inmovilizado que la primera zona de
control, conteniendo la primera y segunda zonas de control una
cantidad diferente del agente aglutinante de control
inmovilizado.
11. Tira reactiva según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la tira reactiva comprende
además una zona distal respecto a la zona de flujo de muestra
terminal que comprende un segundo agente aglutinante de analitos,
que es capaz de aglutinar el analito y difundirlo a una o más zonas
de ensayo.
12. Tira reactiva según la reivindicación 11, en
la que el segundo agente aglutinante de analitos es capaz de
aglutinar componentes en la muestra que no sean el analito.
13. Tira reactiva según la reivindicación 11, en
la que el segundo agente aglutinante de analitos no aglutina los
componentes en la muestra que no sean el analito.
14. Tira reactiva según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en la que el segundo agente aglutinante de
analitos está etiquetado con un marcado detectable.
15. Tira reactiva según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en la que el segundo agente aglutinante de
analitos está unido a una partícula que es capaz de difundirse a
una o más zonas de ensayo.
16. Tira reactiva según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la tira reactiva comprende
además una zona de adición de solución tampón conjugada (118)
distal con la zona de flujo de muestra terminal a la que puede
añadirse una solución tampón conjugada (122).
17. Tira reactiva según la reivindicación 16, en
la medida en que esté subordinada a cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 15, en la que la zona que contiene el segundo
agente aglutinante de analitos es proximal a la zona de adición de
solución tampón conjugada.
18. Tira reactiva según la reivindicación 16, en
la medida en que esté subordinada a cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 15, en la que la zona que contiene el segundo
agente aglutinante de analitos es la zona de adición de solución
tampón conjugada.
19. Tira reactiva según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, en la que la zona de adición de solución
tampón conjugada está situada en relación con las zonas de ensayo,
de tal modo que la solución tampón conjugada añadida a la zona de
adición de solución tampón conjugada, al mismo tiempo que se añade
la muestra a la zona de adición de muestras, alcance el punto de
difusión distal después de que el frente de difusión distal de la
muestra se haya difundido al punto de difusión distal e iniciada la
difusión en una dirección proximal.
20. Tira reactiva según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, en la que zona de adición de solución
tampón conjugada está situada relativa a la zona de ensayo de modo
que la solución tampón conjugada añadida a la zona de adición de
solución tampón conjugada, al mismo tiempo que se añade la muestra a
la zona de adición de muestra, llegue a las zonas de ensayo después
de que el frente de difusión distal se difunda proximal en relación
con la zona de ensayo.
21. Procedimiento para detectar un analito en una
muestra, que comprende:
entregar una muestra (120) a una zona de adición
de muestras (106) de una tira reactiva (100), comprendiendo la tira
reactiva una zona absorbente (108) proximal a la zona de adición de
muestras y teniendo una capacidad de absorción relativas a las
demás zonas de la tira reactivas que cause que un frente de
difusión distal (124) de la muestra (a) se difunda en una dirección
distal a una o más zonas de ensayo (110, 112, 114), comprendiendo
por lo menos una de las zonas de ensayo un primer agente
aglutinante de analitos inmovilizado que se aglutina al analito en
la muestra, (b) difundir a una zona de flujo de muestra terminal
(116) distal para una o más zonas de ensayo y (c) difundir a una
posición proximal a una o más zonas de ensayo;
entregar una solución tampón conjugada (122) a la
tira reactiva en una posición distal respecto a la zona de flujo de
muestra terminal, causando la entrega de la solución tampón
conjugada que un segundo agente aglutinante de analitos se difunda
de forma proximal más allá de la zona de flujo de muestra terminal
a una o más zonas de ensayo después de que el frente de difusión
distal de la muestra se difunda proximal a una o más zonas de
ensayo aglutinándose el segundo agente aglutinante de analitos al
analito inmovilizado en la zona de ensayo, y
detectar el segundo agente aglutinante de
analitos inmovilizado en la zona de ensayo.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que la solución tampón conjugada se añade a la tira reactiva al
mismo tiempo que la muestra se añade a dicha tira reactiva.
23. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que la solución tampón conjugada se añade a la tira reactiva
antes de la que la muestra se añada a dicha tira reactiva.
24. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que la solución tampón conjugada se añade a la tira reactiva
después de que la muestra se añada a dicha tira reactiva.
25. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 24, en el que el primer agente aglutinante de
analitos no se aglutina a componentes en la muestra que no sea el
analito.
26. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 25, en el que el primer agente aglutinante de
analitos se seleccione entre el grupo constituido por anticuerpos,
proteínas de diseño, péptidos, haptenos, lisatos conteniendo las
mezclas heterogéneas de antígenos teniendo sitios aglutinantes de
analitos, ligandos y receptores.
27. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 26, en el que el segundo agente aglutinante de
analitos esté contenido en la tira reactiva donde se entrega la
solución tampón conjugada, causando la entrega de la solución
tampón conjugada la difusión del segundo agente aglutinante de
analitos.
28. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 26, en el que el segundo agente aglutinante de
analitos está contenido en la tira reactiva proximal a donde se
entrega la solución tampón conjugada, haciendo la entrega de la
solución tampón conjugada que se produzca la difusión del segundo
agente aglutinante de analitos.
29. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 26, en el que la entrega de la solución tampón
conjugada a la tira reactiva comprende la entrega del segundo
agente aglutinante de analitos a la tira reactiva dentro de la
solución tampón conjugada.
30. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 29, en el que las zonas de ensayo comprenden
por lo menos una primera zona de control con un agente aglutinante
de control inmovilizado, causando la entrega de la solución tampón
conjugada que un agente de control se difunda de forma proximal, más
allá de la zona de flujo de muestra terminal, a la primera zona de
control y aglutine el agente aglutinante de control
inmovilizado.
31. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 29, en el que las zonas de ensayo comprenden
la primera y segunda zona de control, comprendiendo cada una
cantidad diferente de un agente aglutinante de control
inmovilizado, haciendo la entrega de la solución tampón conjugada
que un agente de control se difunda de forma proximal, pasada la
zona de flujo de muestra terminal, a la primera y segunda zona de
control y aglutine al agente aglutinante de control
inmovilizado.
32. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 31, en el que el segundo agente aglutinante de
analitos es capaz de aglutinar los componentes en la muestra que no
sean el analito.
33. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 31, en el que el segundo agente aglutinante de
analitos no aglutine los componentes en la muestra que no sea el
analito.
34. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 33, en el que el segundo agente aglutinante de
analitos esté etiquetado con un marcador detectable, que detecte el
segundo agente aglutinante de analitos así como el marcador
detectable.
35. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 34, en el que el segundo agente aglutinante de
analitos esta unido a una partícula, detectando el segundo agente
aglutinante de analitos así como dicha partícula.
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