TWI507689B

TWI507689B - Dust mite test specimen, detection kit and detection method

Info

Publication number: TWI507689B
Application number: TW100141862A
Authority: TW
Original assignee: Taichung Veterans General Hospital Vacrs
Priority date: 2011-11-16
Filing date: 2011-11-16
Publication date: 2015-11-11
Also published as: US8865165B2; US20130143242A1; TW201321752A

Description

塵蟎檢測試片、檢測套組與檢測方法

本發明係關於一種塵蟎檢測試片、檢測套組與檢測方法。

氣喘與過敏性鼻炎是台灣地區最常見的呼吸道過敏疾病，兩者的主要致病機轉是呼吸道上皮接觸到空氣中之過敏原所引起的發炎反應。常見的過敏原包括脊椎動物的毛髮、蛋、鼠尿、昆蟲毒液、塵蟎、蟑螂、蝦、植物花粉、花生與黴菌，其中由於蟎類主要分佈在食物、傢俱、室內裝潢、寢具、地毯與灰塵等室內環境中，加上蟎類體內富含有許多不同種類的過敏原蛋白，並且蟎類過敏原特別容易引發呼吸道以及皮膚過敏，因此被認為是室內環境中最主要的過敏原。

研究發現，蟎類過敏原依照生物特性、分子量以及與免疫球蛋白E結合的能力可以區分為22個群組，其中最主要的過敏原為歐洲室塵蟎(Dermatophagoides pteronyssiuns )第一群過敏原與第二群過敏原，對塵蟎過敏的病人中約有75%的病人其血清中的免疫球蛋白E會對歐洲室塵蟎第一群過敏原與第二群過敏原有結合反應。而降低環境中過敏原濃度可以有效預防過敏性疾病的發作，文獻指出尤其是在室內型過敏原，在氣喘或過敏性鼻炎好發時期，可以有效達到預防效果。因為歐洲室塵蟎第一群過敏原屬於酵素過敏原，在環境中不穩定，不能即時反應含量，而歐洲室塵蟎第二群過敏原有非酵素又穩定度高，與環境中之塵蟎數相關性佳，因此可以作為檢測居家環境中塵蟎過敏原濃度的主要標的。讓病患能夠自主在家裡檢測塵蟎含量，定期控制並有效降低居家環境中過敏原的濃度，往往比病患發病後再進行藥物治療更有經濟效益。

在檢測診斷的技術中，由於近來單株抗體技術已經相當成熟，利用單株抗體與抗原反應具有高度專一性、反應時間短以及敏感度高等優點，因此經常被使用在快速檢測試劑的開發。然而單株抗體的製備過程具有相當多的變數，因此是否能夠找到具有高度專一性與抗體活性的單株抗體，仍然是技術開發上的關鍵問題。

就先前技術而言，美國第6,132,734號專利「蟎類過敏原選殖」曾經揭露了歐洲室塵蟎第二群過敏原的胺基酸序列，但是並沒有進一步指出歐洲室塵蟎第二群過敏原上特定的抗原決定基(epitope)或是可以辨識歐洲室塵蟎第二群過敏原的單株抗體。

另外在台灣公開號第200414904號專利「對抗塵蟎過敏原之單株抗體」則是利用膠體電泳與免疫轉印法將塵蟎粉末中的蛋白質分離並且篩選出數種主要過敏原蛋白，再將這些過敏原蛋白注射至老鼠體內，而篩選出單株抗體WAN-108。這樣的方式不但難以確認單株抗體WAN-108所辨識的抗原種類及其抗原決定位，也難以確認其抗體活性。

綜上所述，先前技術所揭露關於塵蟎的檢測技術仍有可以加以改良之處。

本發明之主要目的在於提供一種塵蟎檢測試片、檢測套組與檢測方法，其可快速地檢測出環境中的塵蟎過敏原。

為達成前述目的，本發明提供一種塵蟎檢測試片，包含有：一固體基質、一抗體共軛物、一第二抗體以及一第三抗體，其中該固體基質包含有可使溶液依序流過之一樣本區、一結合區、一層析區以及一吸收區，該層析區設有一測試部以及一控制部，且該測試部與該結合區間之距離小於該控制部與該結合區間之距離；該抗體共軛物可流動地設於該結合區，且包含有一第一抗體以及一標定物，該第一抗體係由寄存編號BCRC 960427之融合瘤細胞所製備之單株抗體，該標定物與該第一抗體共價結合；該第二抗體固定於該測試部，且該第二抗體係由寄存編號BCRC 960428之融合瘤細胞所製備之單株抗體；該第三抗體固定於該控制部，且專一地與該第一抗體結合。

為達成前述目的，本發明提供一種塵蟎檢測套組，包含有如前述之塵蟎檢測試片以及一樣本溶液。

為達成前述目的，本發明提供一種塵蟎檢測方法，包含有下列步驟：(a)將一待測樣本與一抗體共軛物進行反應，其中該抗體共軛物包含有一第一抗體以及一標定物，該第一抗體係由寄存編號BCRC 960427之融合瘤細胞製備的單株抗體具有相同特性之單株抗體，該標定物與該第一抗體共價結合；(b)將該抗體共軛物與抗原結合之複合物與固定於一固體基質之一第二抗體進行反應，其中該第二抗體係由寄存編號BCRC 960428之融合瘤細胞製備的單株抗體具有相同特性之單株抗體；(c)觀察該標定物於該固定基質上之呈色狀況。

藉由前述技術特徵，本發明所提供之塵蟎檢測試片、檢測套組與檢測方法，係利用歐洲室塵蟎第二群過敏原的單株抗體，而與環境樣本進行免疫反應，進而快速地檢測出環境中的塵蟎過敏原。

本發明之又一目的在於提供一種塵蟎檢測套組與檢測方法，其可準確地檢測出環境中的塵蟎過敏原及其含量。

為達成前述目的，本發明提供一種塵蟎檢測套組，包含有：一第一抗體、一第二抗體以及一抗體共軛物，該第一抗體固定於一固體基質，且該第一抗體係由寄存編號BCRC 960427之融合瘤細胞製備的單株抗體具有相同特性之單株抗體；該第二抗體係為歐洲室塵蟎第二群過敏原之多株抗體或由寄存編號BCRC 960428之融合瘤細胞製備的單株抗體具有相同特性之單株抗體；該抗體共軛物包含有一第三抗體以及一標定物，該第三抗體專一地與該第二抗體結合，該標定物與該第三抗體共價結合。

為達成前述目的，本發明提供一種塵蟎檢測方法，包含有下列步驟：(a)將一待測樣本與固定於一固定基質之一第一抗體進行反應，其中該第一抗體係由寄存編號BCRC 960427之融合瘤細胞製備的單株抗體具有相同特性之單株抗體；(b)將該第一抗體與抗原結合之複合物與一第二抗體進行反應，其中該第二抗體係為歐洲室塵蟎第二群過敏原之多株抗體或由寄存編號BCRC 960427之融合瘤細胞製備的單株抗體具有相同特性之單株抗體；(c)將該第一抗體、抗原以及第二抗體結核之複合物與一抗體共軛物進行反應，其中該第一抗體共軛物包含有一第三抗體以及一標定物，該第三抗體專一地與該第二抗體結合，該標定物與該第三抗體共價結合；(d)測定該標定物於該固定基質上之表現。

藉由前述技術特徵，本發明所提供之塵蟎檢測套組與檢測方法，係利用歐洲室塵蟎第二群過敏原的單株抗體，而與環境樣本進行免疫反應，進而準確地分析出環境中的塵蟎過敏原及其含量。

有關本發明之詳細構造、特點、組裝方式或使用方式，將於後續之詳細說明中予以描述。然而，在本發明領域中具有通常知識者應能瞭解，該等詳細說明以及實施本發明所列舉之特定實驗例，僅用於說明本發明，並非用以限制本發明之專利申請範圍。

以下將藉由所列舉之實驗例，配合隨附之圖式，詳細說明本發明之技術內容及特徵。在本實驗例中所使用的英文縮寫名詞如下：

ABTS：2,2'-聯氮雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid))

APS：過硫酸銨(ammonium persulfate)

BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸對甲苯胺鹽(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate p-toluidine salt)

BMGY：甘油複合培養基(buffered glycerol-complex med-ium)

BSA：小牛血清(bovine serum albumin)

Der f 2：美洲室塵蟎第二群過敏原(group 2 allergen ofDermatophagoides farine )

Der p 2：歐洲室塵蟎第二群過敏原(group 2 allergen ofDermatophagoides pteronyssiuns )

Df：美洲室塵蟎(Dermatophagoides farine )

Dp：歐洲室塵蟎(Dermatophagoides pteronyssiuns )

ELISA：酵素連結免疫吸附分析法(enzyme-linked immu-nosorbent assay)

GST：榖胱甘肽硫轉移酵素蛋白(glutathione S-transfer-ase)

Ig：免疫球蛋白(immunoglobin)

NBT：氯化硝基四氮唑藍(p-nitro blue tetrazolium chlori-de)

PBS：磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline)

PBST：含有Tween-20的PBS溶液

PCR：聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction)

PMSF：苯甲基磺醯化氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)

PVDF：聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride)

rDer f 2：歐洲室塵蟎第二群過敏原重組蛋白(recombina-nt group 2 allergen ofDermatophagoides ptero-nyssiuns )

rDer p 2：美洲室塵蟎第二群過敏原重組蛋白(recombina-nt group 2 allergen ofDermatophagoides fari-ne )

SDS-PAGE：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel eletrophore-sis)

TBS：三羥甲基氨基甲烷緩衝塩溶液(Tris Buffer Saline Tween Buffer)

TBST：含有0.05% Tween 20的TBS

Tris：三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)amino-methane)

實驗一：Der p 2單株抗體之製備

材料與方法

1. Dp蛋白粗萃取物製備

將塵蟎蟲體研磨並加入含有蛋白脢抑制劑(aprotinin,0.1U/ml；Sigma Chemicals,St.Louis,Mo.,USA)與PMSF(1mmol/l,Sigma)的PBS再懸浮後進行均質化，以10,000g離心30分鐘，將上清液取出在0.05mol/l、pH 8.0的碳酸銨溶液中進行透析，最後將樣本等分並且冷凍乾燥，儲存在4℃下。使用小牛血清當標準，以Lowry’s法測定蛋白質含量。

2. 製備Der p 2單株抗體

以pGEX載體建構表現Der p 2胜肽片段的融合蛋白，係由蔡考圓博士(Dr.K.Y.Chua)在新加坡大學準備，方法簡略如下：根據胜肽大小及位置設計特殊之引子，並且區分為F1~F16片段，利用PCR放大增值各片段之產物，將產物放入會表現GST之載體，轉型後送入宿主大腸桿菌中表現，融合蛋白的胜肽片段圖譜如表一所示，胺基酸序列為SEQ ID NO：1。多胜肽片段被融合在GST後，由pGEX載體上的Sj26基因轉譯出來，利用榖胱甘肽洋菜膠(glutathione agarose)進行親和純化。純化所得的rDer p 2利用SDS-PAGE分析如第一圖所示，確認含有分子量為26kD的GEX蛋白片段的融合蛋白分子量為42kD。

將從rDer p 2免疫化的Balb/c小鼠脾臟細胞與小鼠骨髓癌細胞NS-1以聚乙二醇(polyethylene glycol；Merck,Hohenbrunn,Germany)進行融合後，利用ELISA、融合蛋白GST-Der p 2和GST初步篩選出能夠產生抗體的融合細胞，再以限數稀釋法將能夠製造Der p 2專一性單株抗體的融合瘤細胞次選殖至少兩個世代並且進一步擴大培養，最後利用ELISA與特定種類的抗血清(Southern Biotechnology Associates,Birmingham,Ala.,USA)來確認單株抗體的種型(isotype)。

3. ELISA

加入50μl的rDer p 2、Dp蛋白以及Df蛋白(Greer Laboratory,Lenoir,Calif.,USA)0.5μg/ml、pH 9.6的碳酸緩衝液，密封分析盤放置於4℃下靜置一夜，使rDer p 2、Dp以及Df分別附著在聚乙烯免疫分析盤的小孔(Costar,Cambridge,Mass.,USA)中。之後除去rDer p 2、Dp以及Df溶液，利用1%脫脂奶進行遮蔽，再將經培養的融合瘤細胞上清液加入各個小孔內以37℃培養1小時，用含有0.05% Tween 20的PBS清洗之後，加入二抗(peroxidase-conjugated goat antimouse IgG,Bio-Rad,Peroxidase Substrate Kit 172-1064,containing 2,2’-di-(3-ethyl benzthiazoline-6-sulfonic acid)and hydrogen peroxide)在37℃反應30分鐘，以ELISA讀值機(Titertek Multiskan,Flow Labtoratories,McLean,Va., USA)在波長415nm下測量每個孔槽的吸光值，測試兩次並且將兩個數值平均之後作為測量的結果，利用青黴素(Penicillium notatum)單株抗體P40(由台北榮總沈弘德教授提供)作為負控制組，吸光值高於負控制組1.2倍以上將ELISA活性視為有貢獻。

4. 利用單株抗體親和性管柱與親和性層析法製備Der p 2

以蛋白質A管柱從腹水中純化出單株抗體，並且與溴化氫活化瓊脂糖凝膠4B(CNBr-activated Sepharose 4B,Pharmacia,Uppsala,Sweden)在濃度4mg/ml下耦合。將反應後的膠體基質與乙醇胺(ethanolamine)反應，以醋酸鈉和碳酸氫鈉溶液清洗後，依照產出方向裝填至玻璃管柱。免疫吸附管柱(1.5×15公分)事先以PBS溶液平衡後，在5ml/hr的流速下，注入40mg塵蟎粗萃取物。未溶解的蛋白以PBS溶液沖洗掉，注入2流床體積(bed volume,BV)的沖提溶液(0.1mol/l,citric acid,pH 3.0)以2ml/hr流速進行純化。由管柱沖提出來的蛋白質溶液以1mol/l、pH 10的Tris緩衝液調整至pH 7.0，然後放入0.05mol/l、pH 8.0的碳酸氫銨溶液中進行透析並且冷凍乾燥，最後以SDS-PAGE分析純化所得的蛋白質。

5. 免疫染色分析

在SDS-PAGE分析中所使用的樣品濃度為20μl中含有200μg蛋白質。Dp粗萃取溶液在SDS-PAGE樣本溶液(2% SDS and 5% 2-mercaptoethanol)中加熱5分鐘，在 12.5%的SDS-PAGE內分離後轉漬到PVDF薄膜(0.45μm,Millipore,Bedford,Mass.,USA)，以含有1%脫脂奶的TBS(20mmol/l of Tris,500mmol/l of NaCl,pH 7.5)進行遮蔽，反應完成後以TBST清洗之後，分別加入單株抗體C1-C5進行一抗反應，再以TBST清洗後，加入二抗(alkaline phosphatase-conjugated monoclonal anti-human IgE antibodies,Parmingen,San Diego,Calif.,USA)在室溫下反應1.5小時，再次清洗之後，在含有1.35mol/l的BCIP和0.37mol/l的NBT內約30分鐘進行呈色，使用去離子水清洗之後，以照片紀錄呈色結果。

實驗結果

1. 單株抗體的製備與免疫學特性

透過ELISA篩選和限數分析法選殖出5個穩定的細胞群落C1-C5，C1-C5所產出的5種單株抗體免疫學特性如表二所示，免疫球蛋白的種型為具有κ輕鏈的IgG1，所有單株抗體對於rDer p 2均顯示出高ELISA活性。對於Dp則是由C1、C3和C5顯示出高ELISA活性，而C2和C4則顯示出低ELISA活性。對於Df則均顯示出低反應活性。

融合蛋白Der p 2胜肽片段附著到免疫分析盤後進行單株抗體反應(抗原0.2μg與單株抗體C1、C3、C5各0.1μg/ml)，結果如表三所示，C3辨識F3和F5，C1和C5辨識F5和F15，藉此可知C1和C5所辨識的抗原決定位為第69至84個胺基酸之間，序列如SEQ ID NO：2所示。利用單株抗體C1-C5進一步偵測Dp轉漬於PVDF膜上的Der p 2，結果如第一圖所顯示，C1至C5都與Dp粗萃取物有明顯的反應，並且點漬的位置顯示所有單株抗體都是反應在Dp粗萃取蛋白分子量16kD的位置。

為了進一步確認單株抗體C4所辨認的位置，我們以西方墨點法，利用各種不同片段大小的rDer p 2及rDer f 2蛋白(製備方式如實驗一所述)來和C4結合用以確認其結合位置。結果如第二圖所示，結果顯示C1、C4抗體在DP2 28-40、PBS、BSA中是沒有反應，而在DP2及DF2-N中則有反應，由此可以推測C1的鍵結位置是在Der p 2的N端但不包含28到40這個區域，與先前實驗C1辨識第69至84個胺基酸的結果一致。C4的鍵結位置則是可以確認在Der p 2的N端但不包含28到40的區域，亦即是在第1到27個胺基酸，序列如SEQ ID NO：3所示，或者是在第41到84個胺基酸，序列如SEQ ID NO：4所示的兩個區域中。

2. Der p 2純化

rDer p 2與GST融合並且以榖胱甘肽洋菜膠進行親和純化，純化出來的rDer p 2蛋白以SDS-PAGE分析並且以銀染法呈色，結果如第三圖所示，融合蛋白的分子量為42kD，從Dp粗萃取物中以單株抗體親和性管柱純化出來的天然Der p 2蛋白分子量約為16kD。

實驗二：塵蟎檢測試片製作

材料與方法

1. 膠體金溶液與單株抗體C1混合比例之測試

將膠體金溶液(Evernew,Nano Gold-40,gold size 25-35nm，又鑫生物科技，台灣)分裝於9個試管內各500μl，以0.005mol/l、pH 9.0硼酸鹽緩衝液稀釋C1抗體溶液，使C1抗體在溶液中的濃度分別為0.1μg/ml、 0.5μg/ml、0.75μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml。以0.1M鹽酸溶液及0.1M碳酸鉀溶液調整膠體金溶液的pH值至8.2。稀釋之後的C1抗體溶液分別加入各管膠體金溶液中混合5分鐘，其中一組試管不添加C1抗體溶液作為負控制組。分別於各試管中加入500μl的10%氯化鈉，混合均勻後靜置2小時，以ELISA讀值機紀錄吸光值。

2. 膠體金標記單株抗體C1

以0.1M鹽酸溶液及0.1M碳酸鉀溶液調整膠體金溶液的pH值至8.2，取出膠體金溶液1ml放入試管，將C1抗體溶液緩慢加入膠體金溶液中均勻混合5分鐘。將C1/膠體金混合溶液置於4℃冰箱內反應2小時。將膠體金/C1抗體混合溶液於4℃、13,500rpm下離心30分鐘，待離心完畢後移除上層澄清液，加入0.05M、pH 8.2的Tris緩衝溶液(內含1% BSA)回溶沉澱物，再次於4℃、13,500rpm下離心30分鐘。結束後，移除上層澄清液，加入儲存緩衝液0.05M、pH 8.2的Tris緩衝溶液(內含1% BSA及0.05% NaN₃ )存放在4℃環境下保存。

3. 塵蟎檢測試片的製作

將底墊(0.5cm×5.9cm)、樣品墊(0.5cm×1.7cm，玻璃纖維，頗爾生命科學，台灣)、結合墊(0.5cm×0.7cm，玻璃纖維，頗爾生命科學，台灣)、硝化纖維膜(0.5cm×2.5cm，Vivid 170硝化纖維膜，頗爾生命科學，台灣)以及吸收墊(0.5cm×1.7cm，纖維吸收墊，頗爾生命科學，台灣)分別裁切成適當的尺寸。

結合墊裁切前以含有2% BSA、2.5%蔗糖溶液、1% Tween 20、0.3%聚乙烯吡咯烷酮k30(polyvinylpyrroli-done k30)、0.02%疊氮化鈉的混合溶液浸泡隔夜後，取出置於37℃烘乾後，裁切保存於乾燥櫃內。組裝結合墊之前，將5μl的C1/膠體金混合溶液滴入結合墊，並置於37℃烘乾之後使用。

硝化纖維膜裁切好後，將0.5ml的抗體溶液均勻塗抹在橡皮圖章上，以手工的方式，將控制線與測試線以間隔約1公分的距離分別壓印在硝化纖維膜上，控制線與測試線上的抗體分別為小鼠抗體IgG與單株抗體C4，濃度皆為0.9μg/λ，抗體壓上硝化纖維膜後置於陰涼處陰乾後使用。

準備好上述材料之後，依照第四圖所示組裝塵蟎檢測試片。先將硝化纖維膜固定在底墊上，再將吸收墊及結合墊分別放置在硝化纖維膜的左右兩端，使吸收墊及結合墊與硝化纖維膜相互接合，接合區域的長度約2mm，最後將樣品墊放置在結合墊上即可完成組裝。

4. 塵蟎檢測試片的檢驗測試

利用不同的測試樣本來測試檢測試片的專一性、靈敏度以及對於環境檢體的檢測能力。在檢體墊上分別滴入100μl至200μl溶於PBS溶液中的灰塵樣本、rDer p 2蛋白、rDer f 2蛋白與PBS溶液的測試樣本來做比較，並且利用不同濃度的C1/膠體金混合溶液、rDer p 2蛋白進行反應，尋找最適及最低濃度。

實驗結果

1. 單株抗體C1共價膠體金之最適濃度

在固定濃度的膠體金溶液中加入不同濃度的C1抗體後，之後再加入10%的氯化鈉溶液與C1抗體競爭。當C1與膠體金共價結合緊密時，則氯化鈉無法與之競爭，則膠體金不會沉澱；反之則會使得膠體金產生沉澱而導致液體轉變為無色，因此無色轉變成有色的濃度即為最佳濃度。結果如第五圖與第六圖所示，C1濃度在2.5μg/ml以下的時候，膠體金便會產生沈澱，而使得溶液顏色變得澄清，並且使得吸光值降低，因此可知C1濃度在2.5μg/ml至10μg/ml之間均為適合的濃度選擇。

2. 塵蟎檢測試片製作條件

測試結果如第七圖至十圖所示，C1/膠體金溶液濃度在2.5μg/ml、5μg/ml或10μg/ml時，在樣品墊上加入PBS後於測試線並無反應，但是控制線有呈色，顯示檢測試片均可有效運作，並且對於過敏原rDer p 2以及rDer f 2均有良好的檢測效果。並且比較第七圖與第九圖可以發現，在2.5μg/ml時測試線所呈現的檢驗訊號皆比在10μg/ml時強，表示C1抗體濃度2.5μg/ml為檢測試片的最適濃度。

靈敏度測試結果如第九圖所示，加入1μg或10μg的rDer p 2於樣品墊，rDer p 2濃度為10μg呈現的顏色明顯較rDer p 2濃度為1μg所呈現的顏色深，顯示樣品墊上的 rDer p 2濃度越高，呈現的顏色越深。另外可以發現在rDer p 2濃度1μg時仍然可以被檢測出來，表示本檢測試片的靈敏度佳。

環境測試結果如第七圖與第十圖所示，測試醫院收集之灰塵檢體，包含急診室與十樓值班室等兩個地點，發現測試線均有呈色，顯示皆可檢驗出灰塵檢體中含有塵蟎過敏原Der p 2或是Der f 2，表示此檢測試片可以有效檢測環境中的灰塵檢體。

實驗三：ELISA檢測平台檢測環境中塵蟎數量

1. 塵蟎粗萃取

Dp蛋白的粗萃取已如實驗一所述。

2. 製備rDer p 2

rDer p 2係利用發酵培養取得，發酵反應在體積1000ml的錐形瓶中進行。在錐形瓶中加入200ml的BMGY(Invitrogen,USA)，在30℃下晃動使溶氧濃度維持在35%，並且以15%氨水將培養基溶液的pH值調整至7，加入200μl種菌開始進行發酵反應。直到培養基溶液內的甘油消耗完畢之後，批次添加50%的甘油至培養基溶液中。當甘油再次消耗完畢時，加入甲醇誘發rDer p 2的表現，根據pH和溶氧量調整甲醇添加的速率。最後取出1ml培養液，以SDS-PAGE測定rDer p 2的表現狀況。

3. Der p 2單株抗體與多株抗體製備

單株抗體的製備如實驗一所述。多株抗體則是將rDer p 2與佛朗氏佐劑(10ml,Sigma,St.Louis,Mo.,USA)混合乳化後皮下注射至兔子體內進行第一次免疫，之後每兩週追加注射一次不完全佛朗氏佐劑(10ml,Sigma,St.Louis,Mo.,USA)，總共完成3次注射。將兔子採血取得血清之後，在負80℃下保存。

4. ELISA

將100μl單株抗體C1濃度0.4μg/ml、pH 8.0的PBS溶液加入聚乙烯免疫分析盤的小孔(Costar,Cambridge,Mass.,USA)中，於室溫下反應3小時，使單株抗體C1附著在分析盤的小孔內。用PBST(0.5%,Tween-20)清洗之後，利用1%脫脂奶進行遮蔽，放置在室溫下1小時。以PBST再次清洗之後分為兩組，一組加入已知濃度62.5ng/ml到1000ng/ml的rDer p 2溶液作為蛋白質濃度標準，另一組加入已知濃度的Dp粗萃取物溶液作為蛋白質濃度標準，在室溫下反應2小時。以PBST清洗之後，加入PBST稀釋1000倍的Der p 2多株抗體，在室溫下反應2小時。以PBST再次清洗之後，加入標定抗體(peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG,Bio-Rad,Peroxidase Substrate Kit 172-1064,containing 2,2-di-(3-ethyl benzthiazoline-6-sulfonic acid)and hydrogen peroxide)在37℃反應1小時後，加入含有ABTS酵素基質溶液(Invitrogen,USA)進行呈色，15分鐘後加入50μl、0.01%的疊氮化鈉(Sodium Azide,NaN3)終止反應。以ELISA讀值機(Sunrise,TECAN,Switzerland)在波長450nm下測量每個孔槽的吸光值。

5. 灰塵收集與灰塵樣本中塵蟎數的檢測

在2010年4月到2011年3月之間，每個月從8個醫院環境內的採樣點(6個位於會議室和圖書館的地毯以及2個位於值班室的床墊)隨機進行採樣，使用吸塵器在每個採樣點內選擇約1平方公尺的區域抽吸1分鐘，將收集到的灰塵樣本從吸塵袋中取出分析。每個樣本取出0.1克灰塵加入25ml氯化鈉溶液，將混合溶液搖晃後靜置10分鐘。混合溶液通過45μm孔徑的濾紙後，將濾紙上的殘留物沖下至培養皿內，以倒立式相位差顯微鏡(Olympus SZ-PT,Japan)計算塵蟎數量，並且用微針將塵蟎挑出至盛有聚乙烯醇溶液的載玻片上，蓋上蓋玻片後鑑定塵蟎種類，並且計算塵蟎數量。

實驗結果

1. 灰塵中的塵蟎數量

在台中榮民總醫院內選擇八個不同的採檢地區收集八個樣本數，統計結果如表四所示，從C1至C6係從地毯採集所得，M1、M2係從床墊採集所得。

2. ELISA檢測平台的檢測結果

經由Der p 2單株抗體C1與多株抗體所建構的ELISA檢測平台所設計之兩組標準曲線其結果如第十一圖A與B所示，合併統計後結果如第十一圖C所顯示，發現兩個標準曲線之間有非常好的相關性(R² =0.9715)，並且透過第十一圖C也證實，1克的Dp粗萃取物中約含有0.0544克的Der p 2。

3. 塵蟎數量與Der p 2濃度的相關性

從前述表四塵蟎取樣的結果中，隨機取出8個樣本以ELISA檢測平台進行相關性分析，結果如表五所示。此外統計學的分析如第十二圖所示，ELISA檢驗平台所檢測出的Der p 2濃度數值與傳統人工鏡檢所獲得的數據之間有非常好的相關性(R² =0.9652)。為了證明本實驗的ELISA檢驗平台所用的Der p 2專一性抗體(包含Der p 2單株抗體及Der p 2多株抗體)的品質，利用西方免疫轉漬法再次確認。結果如第十三圖A與B顯示，Der p 2單株抗體及Der p 2多株抗體對於Dp粗萃取物或是rDer p 2均有非常好的專一性。

在此必須說明者為，以上配合圖式所為之詳細描述，僅係為了說明本發明之技術內容及特徵而提供之一實施方式，凡在本發明領域中具有一般通常知識之人，在瞭解本發明之技術內容及特徵之後，於不違背本發明之精神下，所為之種種簡單之修飾、替換或構件之減省，皆應屬於以下所揭示之申請專利範圍之內。

第一圖為單株抗體C1-C5對於Dp粗萃取物的免疫點漬活性分析結果。B欄表示Dp粗萃取物在洋菜膠中被分離並且移轉至PVDF膜，蛋白質係利用卡馬斯藍染法(Coomassie blue stain)呈色；C-G欄係相同的蛋白質與單株抗體C1-C5反應的結果；H欄係與P40反應的結果，作為負控制組；A欄為蛋白質分子量標準。

第二圖為單株抗體C1與C4對於不同片段大小的Der p 2蛋白進行西方墨點法的分析結果。圖中rDer p 2代表Der p 2全長，總共為129個胺基酸；rDF2-N代表Der p 2的N端為第1個到第84個胺基酸；DP2 28-40代表Der p 2第28個到第40個胺基酸；PBS和BSA為控制組。

第三圖為Der p 2純化蛋白以SDS-PAGE分析的結果。利用單株抗體以及榖胱甘肽洋菜膠親和性管柱純化Der p 2，並且以銀染法呈色。A欄為蛋白質分子量標準；B欄和C欄分別為天然的Der p 2與rDer p 2。

第四圖為塵蟎檢測試片的組裝示意圖。編號1為檢體墊；編號2為結合墊；編號3為硝化纖維膜；編號4為吸收墊；T為測試線；C為控制線。

第五圖為膠體金溶液中加入不同濃度的C1抗體進行共價的結果。A列為C1抗體加入膠體金溶液，混合5分鐘後的情況；B列為C1/膠體金混合溶液加入500μl、10%的氯化鈉溶液；C列為溶液均勻混合靜置2小時後的情況。

第六圖為C1抗體和膠體金反應最適量的分析測定結果。使用ELISA讀值機於吸光值A405nm下，檢測加入不同濃度C1抗體後，C1/膠體金混合溶液的吸光值數據。

第七圖為塵蟎檢測試片結合墊上的C1抗體濃度為2.5μg/ml，加入100μl不同檢體的檢測結果。A為加入PBS溶液的檢測結果；B為加入1μg的rDer p 2蛋白溶液樣本的檢測結果；C為加入10μg的rDer p 2蛋白溶液樣本的檢測結果；D為加入急診室灰塵樣本的檢測結果；E為加入十樓值班室灰塵樣本的檢測結果。

第八圖為塵蟎檢測試片結合墊上的C1抗體濃度為5μg/ml，加入200μl不同檢體的檢測結果。A為加入PBS溶液的檢測結果；B為加入10μg的rDer f 2蛋白溶液樣本的檢測結果。

第九圖為塵蟎檢測試片結合墊上的C1抗體濃度為10μg/ml，加入100μl不同檢體的檢測結果。A為加入PBS溶液的檢測結果；B為加入1μg的rDer p 2蛋白溶液樣本的檢測結果；C為加入10μg的rDer p 2蛋白溶液樣本的檢測結果。

第十圖為塵蟎檢測試片結合墊上的C1抗體濃度為10μg/ml，加入100μl不同檢體的檢測結果。A為加入PBS溶液的檢測結果；B為加入急診室灰塵樣本的檢測結果；C為加入十樓值班室灰塵樣本的檢測結果。

第十一圖為Dp萃取物中Der p 2蛋白濃度測定結果。利用Der p 2小鼠單株抗體C1作為捕捉抗體，兔子多株抗體作為偵測抗體，rDer p 2作為蛋白質濃度標準。 A圖顯示Dp蛋白濃度與ELISA吸光度單位OD450nm下測定結果之間的關聯性；B圖顯示Der p 2蛋白濃度與吸光度單位OD450nm下測定結果之間的關聯性；C圖顯示Der p 2蛋白濃度與Dp萃取物蛋白濃度測定結果之間的關聯性。

第十二圖為Der p 2蛋白濃度與塵蟎數量的分析結果。總共選擇八個塵蟎樣本進行關聯性分析，利用Der p 2 ELISA套組測定Der p 2蛋白濃度(μg/ml)，塵蟎數量則在倒立式相位差顯微鏡下計數，透過線性迴歸分析得到關聯係數為R² =0.9652(p<0.001)。

第十三圖為Dp粗萃取物以及rDer p 2的蛋白質組態與西方墨點法實驗結果。A圖為蛋白質利用12% SDS-PAGE分析，並且在卡馬斯藍染法下呈色的結果，M為蛋白質分子量標準；Dp為歐洲室塵蟎粗萃取物；rDer p 2為重組蛋白Der p 2；BSA為小牛血清白蛋白。B圖為以不同抗體進行西方墨點法分析的結果，PolyAB為兔子抗Der p 2多株抗體；C1-AB為小鼠抗Der p 2單株抗體；P(+)為對Dp過敏的病人；N(-)為健康的病人。

<110> 行政院國軍退除役官兵輔導委員會臺中榮民總醫院

<120> 歐洲室塵蟎第二群過敏原之單株抗體、製備該單株抗體之融合瘤細胞株以及應用該單株抗體之塵蟎檢測試片、檢測套組與檢測方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 129

<212> PRT

<213>Dermatophagoides pteronyssinus

<400> 1

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213>Dermatophagoides pteronyssiuns

<400> 2

<210> 3

<211> 29

<212> PRT

<213>Dermatophagoides pteronyssiuns

<400> 3

<210> 4

<211> 44

<212> PRT

<213>Dermatophagoides pteronyssiuns

<400> 4

Claims

一種塵蟎檢測試片，包含有：一固體基質，包含有可使溶液依序流過之一樣本區、一結合區、一層析區以及一吸收區，該層析區設有一測試部以及一控制部，且該測試部與該結合區間之距離小於該控制部與該結合區間之距離；一抗體共軛物，可流動地設於該結合區，且包含有一第一抗體以及一標定物，該第一抗體係由寄存編號BCRC 960427之融合瘤細胞所製備之單株抗體，該標定物與該第一抗體共價結合，其中該第一抗體之抗原決定基的序列為SEQ ID NO：2；一第二抗體，固定於該測試部，且該第二抗體係由寄存編號BCRC 960428之融合瘤細胞所製備之單株抗體，其中該第二抗體之抗原決定基的序列為SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4；以及一第三抗體，固定於該控制部，且專一地與該第一抗體結合。
如申請專利範圍第1項所述之塵蟎檢測試片，其中該標定物為膠體金。
如申請專利範圍第1項所述之塵蟎檢測試片，其中該第一抗體的濃度約為2.5至10μg/ml。
如申請專利範圍第3項所述之塵蟎檢測試片，其中該第一抗體的最佳濃度約為2.5μg/ml。
如申請專利範圍第1項所述之塵蟎檢測試片，其中該第三抗體的濃度約為0.9μg/λ。
一種塵蟎檢測套組，包含有如申請專利範圍第1項所述之塵蟎檢測試片以及一樣本溶液。
一種塵蟎檢測方法，包含有下列步驟：(a)將一待測樣本與一抗體共軛物進行反應，其中該抗體共軛物包含有一第一抗體以及一標定物，該第一抗體係由寄存編號BCRC 960427之融合瘤細胞所製備之單株抗體，該標定物與該第一抗體共價結合，其中該第一抗體之抗原決定基的序列為SEQ ID NO：2；(b)將該抗體共軛物與抗原結合之複合物與固定於一固體基質之一第二抗體進行反應，其中該第二抗體係由寄存編號BCRC 960428之融合瘤細胞所製備之單株抗體，其中該第二抗體之抗原決定基的序列為SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4；以及(c)觀察該標定物於該固定基質上之呈色狀況。
如申請專利範圍第7項所述之塵蟎檢測方法，其中該標定物為膠體金。
如申請專利範圍第7項所述之塵蟎檢測方法，其中該第一抗體的濃度約為2.5至10μg/ml。
如申請專利範圍第8項所述之塵蟎檢測方法，其中該第一抗體的最佳濃度約為2.5μg/ml。
一種塵蟎檢測套組，包含有：一第一抗體，固定於一固體基質，且該第一抗體係由寄存編號BCRC 960427之融合瘤細胞所製備之單株抗體，其中該第一抗體之抗原決定基的序列為SEQ ID NO：2；一第二抗體，係為歐洲室塵蟎第二群過敏原之多株抗體或由寄存編號BCRC 960428之融合瘤細胞所製備之單株抗體，其中該第二抗體之抗原決定基的序列為SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4；一抗體共軛物，包含有一第三抗體以及一標定物，該第三抗體專一地與該第二抗體結合，該標定物與該第三抗體共價結合。
如申請專利範圍第11項所述之塵蟎檢測套組，其中該固體基質為聚乙烯。
如申請專利範圍第11項所述之塵蟎檢測套組，其中該標定物係為酵素。
如申請專利範圍第11項所述之塵蟎檢測套組，更包含有一歐洲室塵蟎第二群過敏原之蛋白質濃度標準溶液。
一種塵蟎檢測方法，包含有下列步驟：(a)將一待測樣本與固定於一固定基質之一第一抗體進行反應，其中該第一抗體係由寄存編號BCRC 960427之融合瘤細胞所製備之單株抗體，其中該第一抗體之抗原決定基的序列為SEQ ID NO：2；(b)將該第一抗體與抗原結合之複合物與一第二抗體進行反應，其中該第二抗體係為歐洲室塵蟎第二群過敏原之多株抗體或由寄存編號BCRC 960428之融合瘤細胞所製備之單株抗體，其中該第二抗體之抗原決定基的序列為SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4；(c)將該第一抗體、抗原以及第二抗體結合之複合物與一抗體共軛物進行反應，其中該抗體共軛物包含有一第三抗體以及一標定物，該第三抗體專一地與該第二抗體結合，該標定物與該第三抗體共價結合；以及(d)測定該標定物於該固定基質上之表現。
如申請專利範圍第15項所述之塵蟎檢測方法，其中該固體基質為聚乙烯。
如申請專利範圍第15項所述之塵蟎檢測方法，其中該標定物係為酵素。
如申請專利範圍第17項所述之塵蟎檢測方法，步驟(d)係於步驟(c)之產物中加入酵素基質後，在波長450nm下測量吸光值，並且根據一歐洲室塵蟎第二群過敏原之蛋白質標準溶液所建立之標準函數計算該待測樣本內之歐洲室塵蟎第二群過敏原蛋白濃度。
如申請專利範圍第18項所述之塵蟎檢測方法，更包含有下列步驟：(e)根據該待測樣本內之歐洲室塵蟎第二群過敏原蛋白濃度計算該待測樣本內之塵蟎數量。