KR101520084B1

KR101520084B1 - 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1에 특이적인 단클론 항체를 포함하는 뎅기열 바이러스 항체의 신속진단키트 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR101520084B1
Application number: KR1020140002947A
Authority: KR
Inventors: 정점규; 김학용; 이영기; 류제운; 이지후; 이현재; 이상철
Original assignee: 주식회사 젠바디
Priority date: 2014-01-09
Filing date: 2014-01-09
Publication date: 2015-05-29

Abstract

본 발명은 항 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1에 특이적인 단클론 항체와 이를 생산하는 융합 세포, 상기 단클론 항체를 이용한 뎅기열 바이러스 항체를 신속하게 정성적으로 진단하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 뎅기열 바이러스 자체를 상기 단클론 항체와 결합시켜서 혈액내의 항체를 측정하는 기술로서 기존의 재조합단백질이나 바이러스-유사 입자(VLP, virus-like particle)을 이용하는 것보다 훨씬 더 예민하게 측정할 수 있도록 한다. 또한, 상기 단클론 항체를 사용함으로서 뎅기열 바이러스의 표피단백질의 중성화 에피토프인 도메인3과 도메인2에 결합하는 항체들을 최대로 측정할 수 있도록 유도하여, 항체 진단키트의 민감도와 정확도를 획기적으로 높이는 데에 특징이 있다.

Description

뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1에 특이적인 단클론 항체를 포함하는 뎅기열 바이러스 항체의 신속진단키트 및 그 제조 방법{Rapid diagnostic kit for detecting anti-dengue virus antibodies using monoclonal antibody specific to the domain 1 of dengue envelope protein and its manufacturing method}

뎅기열 바이러스는 년간 5천만명에서 1억명이 고통을 받고 있는 세계적인 주요 질환으로서, 년간 25,000명이 사망한다고 알려져 있다. 뎅기(열)은 모기 매개성 질환이며, 감기증상을 보이다가 뎅기출혈열(DHF) 또는 뎅기쇼크증후군(DSS)으로 진행된다. 따라서, 뎅기열 바이러스 감염을 차단하기 위해서는 백신의 개발이 무척 중요하나 이 질환의 경우 중복감염(다른 타입의 뎅기열 바이러스에 의한 두 번째 감염)이 되면 훨씬 심각한 DHF/DSS 증세를 보이기 때문에 백신 개발에 어려움이 있어, 아직까지는 빠르고 정확한 진단을 통한 환자 증세 완화가 최선의 치료법으로 알려져 있다.

뎅기열 바이러스는 4가지 혈청형(serotype)이 있으며, 이 중에서 사람의 항체 형성에 주로 관여하는 표피단백질(envelope)은 약 70%의 상동성이 있다고 알려져 있다. 이 표피단백질은 도메인1(domain 1), 도메인2(domain 2), 도메인3(domain 3)으로 구별되고, 이 중에서 도메인3는 숙주세포의 고황화 헤파린(highly sulfated heparan sulfate; HSHS)에 결합하여 바이러스의 세포내 침투를 담당한다고 알려져 있다(Modis Y. et al. 2012). 때문에, 거의 모든 단클론항체 개발은 치료제 개발의 목적으로 이 도메인3에 집중되어져 왔다. 그리고, 표피단백질의 도메인3과 도메인2는 당화(glycosylation)되어 있으며, 중화 에피토프(neutrializing epitope)를 가지고 있어서, 뎅기 감염 시, 항체형성에 주요하게 작용한다(Moises L et al. 2013). 하지만, 도메인1은 주로 표피단백질의 구조적 역할을 담당하며 dimer 형성에 관여하며, 혈액내에서 낮은 수준의 항체를 형성시킨다고 알려져 있다(Li J, Shang Z, Zuo I, 2010).

이러한 뎅기열 바이러스의 감염여부를 진단하는 방법을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 대한민국특허공개 제2009-0028704호에는 뎅기열 바이러스의 특이적인 면역원성 성분을 이용하여 검체에 포함된 IgA 형태의 항체를 검출함으로써, 뎅기열 바이러스의 감염여부를 진단하는 방법이 개시되어 있고, 일본특허공개 제2012-504955호에는 뎅기열 바이러스의 표면항원에 결합할 수 있는 재조합 항체를 포함하는 뎅기열 바이러스 진단용 키트가 개시되어 있으며, 미국특허공개 제2013-0089543호에는 뎅기열 1형, 2형, 3형, 및 4형 바이러스에 각각 특이적인 단클론 항체를 이용하여 감염된 뎅기열 바이러스의 종류를 구별하기 위한 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상술한 뎅기열 바이러스 감염여부를 확인하는 기술은 대체로 뎅기열 바이러스의 표면항원을 검출할 수 있는 항체를 이용하는데, 상기 표면항원 전체를 이용할 경우, 3차원적 구조와 당화사슬 부분의 손상이 발생하여, 이러한 손상된 항원을 이용하여 제조된 항체는 정상적인 항원에 대한 민감성이 낮다는 문제점이 있어, 이를 개선하고자 하는 연구가 계속되고 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 보다 높은 민감도를 갖고 혈액내 뎅기열 바이러스에 대한 항체를 진단하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 뎅기열 바이러스 표면항원의 도메인1에 특이적인 단클론 항체를 뎅기열 바이러스와 함께 이용하면 높은 민감도로 뎅기열 바이러스 항체를 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1에 특이적인 단클론 항체를 포함하며, 뎅기열 바이러스에 대한 IgG 및 IgM 항체를 구별하여 검출할 수 있는 신속진단키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1과 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 생산하는 융합세포를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 보다 높은 민감도를 갖고 뎅기열 바이러스의 항체를 진단하는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 사람 혈액내에서 뎅기열 바이러스의 항체를 진단하기 위하여는 우수한 뎅기열 바이러스 항원이 중요함을 확인하였다.

즉, 뎅기 항원에 3차원 구조를 결정하는 부위 또는 당화사슬 부위가 존재할 경우, 항원을 정제하는 과정에서 상기 부위가 손상되고, 손상된 항원을 이용하여 제조된 항체는 정상적인 항원에 대한 민감도가 저하되므로, 3차원 구조를 결정하는 부위 또는 당화사슬 부위가 없거나 적게 포함된 항원을 선발하여야 함을 확인하였다. 이에, 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1의 아미노산 서열을 대상으로 3차원 구조를 결정하는 부위 또는 당화사슬 부위가 없거나 적게 포함된 영역을 선정하고, 상기 영역으로 구성된 펩타이드를 항원으로 인식하는 항체를 제조하고자 하였다. 그 결과, 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1에 해당하는, 아미노산 서열 280번에서 296번에 해당되는 펩타이드(N'-TGHLKCRLRMDKLQLKG-C', 서열번호 1)가 선발되었다. 이어, 상기 펩타이드를 이용하여 마우스로부터 단클론 항체를 생산하는 융합세포를 제작하였다. 그 결과, 6종의 단클론 항체를 생산하는 각각의 융합세포를 제작하였고, 상기 6종의 단클론 항체 중에서 상기 펩타이드 및 뎅기열 바이러스에 대한 가장 우수한 결합친화도를 나타내는 M5G6 단클론 항체를 선발하였다. 이에, 본 발명자들은 M5G6 상기 단클론 항체를 생산하는 융합세포를 "M5G6(hybridoma)"라 명명하고, 이를 2013년 6월 12일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 12421BP를 부여받았다.

한편, 상기 M5G6 단클론 항체를 이용하여 보다 효과적으로 뎅기열 바이러스에 대한 IgG 및 IgM 항체를 구별하여 검출하기 위하여, 고형의 기판위에 M5G6 단클론 항체, 금입자, 뎅기열 바이러스 항원, 인간의 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 마우스의 항체 등을 적절하게 배열하여 뎅기열 바이러스에 대한 IgG 및 IgM 항체를 구별하여 검출할 수 있는 진단키트를 제작하였다. 상기 제작된 진단키트의 성능을 시험한 결과, 뎅기 IgG 양성 검체에 대해서는 100%의 민감도와 99.3%의 특이도를 나타내었고, 뎅기 IgM 양성 검체에 대해서는 99.4%의 민감도와 99.3%의 특이도를 나타내었다. 또한, 종래의 뎅기열 바이러스 진단키트와 진단효과를 비교한 결과, 종래의 뎅기열 바이러스 진단키트에 비하여 높은 민감도와 특이도를 갖고 뎅기열 바이러스에 대한 IgG 및 IgM 항체를 구별하여 검출할 수 있음을 확인하였다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 (a) 항-사람 IgG-단클론 항체 및 항-사람 IgM-단클론 항체가 고정화된 멤브레인; (b) 뎅기열 바이러스의 표피단백질에 대한 단클론 항체가 결합된 금 축합체를 포함하는 축합 패드; (c) 뎅기열 바이러스 배양액이 포함된 항원 패드; (d) 검체 패드; (e) 완충용액을 포함하는 버퍼 패드; 및 (f) 흡수 패드를 포함하고, 사람 혈액중의 뎅기열 바이러스에 대한 IgG와 IgM을 구별 측정할 수 있는 것을 특징으로 하는 뎅기열 바이러스 항체검출용 신속진단키트를 제공한다.

우선, 상기 키트에 포함된 멤브레인은 항-사람 IgG-단클론 항체(검사선 1) 및 항-사람 IgM-단클론 항체(검사선 2)를 포함하는데, 바람직하게는 상기 각 단클론 항체는 생쥐 유래의 단클론 항체가 될 수 있다.

상기 각 단클론 항체는 환자의 시료에 뎅기열 바이러스에 대한 항체가 존재하는 경우 상기 항체가 IgM 형태인지 아니면 IgG 형태인지를 확인할 수 있어, 뎅기열 바이러스에 대한 IgM 형태의 항체인지 아니면 IgG 형태의 항체인지를 확인하는데 사용할 수 있고, 상기 각 단클론 항체를 멤브레인에 고정시킴으로써, 환자의 시료에 뎅기열 바이러스에 대한 항체가 존재하는지의 여부를 보다 효과적으로 확인할 수 있다. 상기 진단키트에 포함되는 항-사람 IgG-단클론 항체(검사선 1) 및 항-사람 IgM-단클론 항체(검사선 2)의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 0.1 내지 5.0 mg/ml의 농도로 상기 멤브레인에 분주하여 고정화시킬 수 있다.

아울러, 상기 멤브레인은 상기 각 단클론 항체를 결합시키기 위하여 사용되는데, 상기 멤브레인은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 항체가 결합될 수 있는 니트로셀룰로오스 멤브레인, PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인 등이 될 수 있다.

다음으로, 상기 키트에 포함된 축합 패드는 뎅기열 바이러스의 표피단백질에 대한 단클론 항체가 금입자와 결합된 형태의 금 축합체를 포함하고, 하기의 버퍼 패드와 항원 패드의 사이에 위치하도록 구성될 수 있다. 상기 단클론 항체에 결합된 금입자는 상기 단클론 항체의 위치를 표시하는 표지물질로서 사용되며, 본 발명의 키트에서는 최종적으로 시료에 포함된 항체의 존재여부를 확인하기 위한 수단으로서 사용된다.

본 발명에 따른 단클론 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 하기 (a) 내지 (e)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체를 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다:

(a) 기탁번호 KCTC 12421BP 융합 세포에서 생산되는 단클론 항체;

(b) 기탁번호 KCTC 12421BP 융합 세포에서 생산되는 단클론 항체의 결합 특징을 가지고 있는 단클론 항체;

(c) 기탁번호 KCTC 12421BP 융합 세포에서 생산되는 단클론 항체에 결합할 수 있는 에피토프에 결합하는 단클론 항체;

(d) 경쟁적인 결합 분석에서 기탁번호 KCTC 12421BP 융합 세포에서 생산되는 단클론 항체와 경쟁하는 단클론 항체;

(e) 뎅기열 바이러스 표피단백질 도메인1에 특이적으로 결합하는 능력이 보존된 기탁번호 KCTC 12421BP 융합 세포에서 생산되는 단클론 항체의 변이체 또는 단편.

아울러, 본 발명에 따른 단클론 항체는 다음 단계를 포함하여 제조될 수 있다:

(a) 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1 펩타이드를 합성하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 항원에 대한 단클론 항체를 생산하는 융합 세포를 제조하고 이로부터 단클론 항체를 생산하는 단계;

(c) 상기 (b)단계의 단클론 항체에서 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1에 대한 반응성이 높은 항체를 선별하는 단계;

(d) 상기 (c)단계로 부터 선별된 단클론 항체를 생산 및 분리하는 단계.

상기 단클론 항체는 뎅기열 바이러스의 표피단백질에 특이적으로 결합할 수 있는데, 바람직하게는 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 단클론 항체는 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1(서열번호 1)에만 특이적으로 결합하기 때문에, 뎅기열 바이러스가 아닌 다른 바이러스에는 결합하지 않을 뿐만 아니라, 중화 에피토프(neutrializing epitope)를 포함하고 있는 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인 2와 도메인 3에도 결합하지 않으므로, 본 발명에서 제공하는 단클론 항체를 이용하면 뎅기열 바이러스의 표피단백질과 선택적으로 항원-항체 결합을 유도해 낼 수 있다. 또한, 이렇게 결합된 복합체를 이용하면, 상호 높은 상동성을 갖는 표피단백질을 포함하는 뎅기열 1형, 2형, 3형 또는 4형 바이러스와 같은 모든 뎅기열 바이러스에 대한 항체들을 검출해 낼 수 있다.

다음으로, 본 발명에 따른 항원 패드는 배양된 뎅기열 바이러스를 포함하고, 상기 축합 패드와 하기 검체 패드의 사이에 위치하도록 구성될 수 있다. 이때, 상기 배양된 뎅기열 바이러스는 초원심분리(ultracentrigation) 과정 등의 정제 기술을 통하여 정제된 형태의 뎅기열 바이러스를 사용할 수도 있고, 이와 같이 정제하지 않은 형태의 뎅기열 바이러스를 사용할 수도 있는데, 상기 축합 패드에 포함된 단클론 항체는 뎅기열 바이러스의 표피단백질에 대한 반응성이 우수하기 때문에, 경제성의 측면에서 정제하지 않은 뎅기열 2형 바이러스를 사용함이 바람직하다. 이때, 사용된 뎅기열 바이러스는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상호 높은 상동성을 갖는 표피단백질을 포함하는 뎅기열 1형, 2형, 3형 또는 4형 바이러스를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 축합 패드에 포함된 단클론 항체의 제조에 사용된 뎅기열 2형 바이러스를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 한국 병원성바이러스은행(KBPV, 서울)으로부터 입수한 뎅기열 2형 바이러스(KBPV-VR-29)를 사용할 수 있는데, 상기 바이러스는 Vero 세포(Monkey Kidney Cell)을 숙주세포로 사용하여 증식시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.

다음으로, 본 발명에 따른 검체 패드는 다공성 재질로 구성되고, 상기 멤브레인과 항원패드의 사이에 위치하도록 구성될 수 있다. 상기 검체 패드는 뎅기열 바이러스의 감염이 의심되는 개체로부터 얻어진 시료(혈액, 전혈, 혈장, 혈청 등)가 본 발명의 키트에 직접적으로 투입되는 투입구의 역할을 수행할 뿐만 아니라 다공성 재질로 인하여, 상기 시료에 포함된 혈구들은 상기 검체패드를 통해 여과되고, 상기 시료에 포함된 액상성분만을 상기 멤브레인으로 전달하는 역할을 수행할 수 있다. 이때, 상기 다공성 재질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 혈구를 통과시키지 않을 정도의 공극을 포함하는 다공성 알루미나, 다공성 실리케이트, 다공성 합성수지 등이 될 수 있다. 또한, 상기 검체 패드는 혈구를 분리하는 역할을 수행하기 때문에 다공성 재질 이외에도 혈구를 흡착시킬 수 있는 재질로 구성될 수도 있는데, 이러한 혈구를 흡착시킬 수 있는 재질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 니트로셀룰로오스 멤브레인, PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인 등이 될 수 있다.

상기 검체 패드는 본 발명에서 제공하는 키트의 중간에 위치하도록 구성되므로, 이에 혈액시료를 가하면, 혈액시료에 포함된 혈구는 검체 패드에 여과 또는 흡착되지만, 액상성분은 아래로 흘러가서 항원 패드 방향으로 이동하여, 항원 패드에서 분리된 뎅기열 바이러스가 검사선에 도달하는 것을 방해하는 문제점이 발생할 수 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 상기 검체 패드는 시료에서 혈구가 분리된 액상성분을 한쪽 방향으로만 이동시키는 단방향 자동혈구분리 장치의 형태로 구성될 수 있다(도 2b). 도 2b에서 보듯이, 상기 단방향 자동혈구분리 장치는 다공성 재질 또는 혈구 흡착성 재질의 혈액 적하부위와 비친수성 재질의 막으로 구성되는데, 상기 혈구 적하부위의 하부의 일부 영역이 비친수성 재질의 막으로 감싸여져 있어서, 상기 혈액 적하부위의 하부는 비친수성 재질의 막을 통해 외부와 단절된 영역과 비친수성 재질의 막으로 감싸여 있지 않아 외부와 소통할 수 있는 영역으로 구분되고, 상기 두 영역을 포함하는 혈구 적하부위의 하부는 상기 멤브레인 말단의 상단에 구비된다. 이때, 외부와 단절된 영역은 항원 패드가 위치한 방향에 구비되고, 외부와 소통할 수 있는 영역은 멤브레인의 검사선이 위치한 방향에 구비된다.

상기 단방향 자동혈구분리 장치의 혈액 적하부위에 혈액시료(전혈, 혈장, 혈청 등)를 가하면, 상기 혈액시료에 포함된 혈구는 혈액 적하부위에서 여과 또는 흡착되므로, 상기 혈액시료에 포함된 액상성분만이 혈액 적하부위의 하부로 이동하게 된다. 상기 혈액 적하부위의 하부로 이동된 액상성분은 외부와 단절된 항원 패드의 방향으로는 흘러가지 못하고, 비친수성 재질의 막으로 감싸여 있지 않아 외부와 소통할 수 있는 영역을 통해 멤브레인의 검사선으로 흘러가게 되므로, 결국, 시료가 원하는 단방향으로 이동하게 된다.

이때, 상기 혈액 적하부위는 상술한 바와 같은 다공성 재질 또는 혈구를 흡착시킬 수 있는 재질로 구성될 수 있고, 상기 비친수성 재질의 막의 제조에 사용되는 재질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 폴리비닐알코올 수지, 폴리에틸렌 수지, 폴리프로필렌 수지 등의 재질을 단독으로 또는 복합적으로 사용할 수 있다. 아울러, 상기 비친수성 재질의 막은 사용상 편의를 위하여 접착성을 갖도록 제조될 수 있다.

다음으로, 본 발명에 따른 버퍼 패드는 본 발명의 키트를 사용할 때, 상기 키트내에서 시료의 전달을 보조하고, 항원-항체 반응을 보조하기 위한 완충용액이 포함된 검체전개액을 포함할 수 있는 다공성 재질로 구성되며, 상기 축합패드와 연결되어 키트의 말단에 위치하도록 구성될 수 있다. 상기 다공성 재질은 상기 검체패드에서 정의한 바와 동일하다.

상기 검체전개액은 상기 버퍼 패드에 포함된 상태로 존재할 수도 있고, 본 발명의 키트에 시료를 가한 후에 검체전개액을 버퍼 패드에 가할 수도 있는데, 바람직하게는 본 발명의 키트에 시료를 가한 후에 검체전개액을 버퍼 패드에 가할 수 있다. 상기 검체전개액에 포함된 완충용액은 시료전달 및 항원-항체반응을 보조하는 효과를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 붕산염 완충용액, 트리스 완충용액, 인산염 완충용액 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 검체전개액은 비특이반응(non-specific reaction)을 억제할 수 있는 Triton X-100, Tween 20, 카제인 등을 포함할 수 있고, 보존제로서 아지드화나트륨 등을 포함할 수 있다.

끝으로, 본 발명에 따른 흡수 패드는 과량의 검체 또는 완충액을 흡수할 수 있는 재질로 구성되고, 상기 검체 패드의 반대편 방향에서 멤브레인과 연결되며, 버퍼 패드의 반대편 방향의 키트 말단에 위치하도록 구성된다. 상기 흡수패드는 과량의 검체 또는 검체전개액을 흡수하여 제거함으로써, 본 발명에서 제공하는 키트의 검사결과를 교란시키지 않도록 하는 역할을 수행하는데, 상기 흡수 패드의 재질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 면, 액체 흡수성 겔 등을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명에서 제공하는 진단키트를 이용하여 보다 효과적으로 뎅기열 바이러스에 대한 IgG 및 IgM 항체를 구별하여 검출할 수 있도록, 상기 진단키트는 진단방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치 등의 다양한 구성요소를 추가로 포함할 수 있다.

하나의 추가 구성요소로서, 본 발명의 키트는 본 발명에서 제공하는 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1에 특이적인 단클론 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 동물의 항체를 포함할 수 있다. 본 발명의 마우스로부터 유래된 단클론 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 동물의 항체를 이용하면, 본 발명의 진단키트로부터 얻어진 진단결과에 오류가 있는지의 여부를 확인할 수 있다. 즉, 상기 단클론 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 동물의 항체는 환자의 시료에 항체가 존재하는 지의 여부에 상관없이 본 발명의 단클론 항체에 특이적으로 결합하므로, 본 발명의 진단키트를이용하여 환자의 시료를 진단할 경우, 상기 동물항체와 단클론 항체의 결합체가 생성되지 않는다면, 상기 진단결과에 오류가 있는 것으로 판정할 수 있다.

다른 추가 구성요소로서, 본 발명의 키트는 상기 단클론 항체와 항원을 고정시킬 수 있는 지지체를 포함할 수 있다. 상기 지지체는 상기 단클론 항체와 항원을 일시적으로 또는 영구적으로 고정시킬 수 있는 지지체가 될 수도 있고, 상기 일시적으로 고정시킬 수 있는 지지체와 영구적으로 고정시킬 수 있는 지지체가 조합된 것이 될 수도 있다. 아울러, 상기 지지체는 상기 단클론 항체와 항원 이외의 추가 구성요소를 고정시키는데 사용될 수도 있고, 다른 지지체를 고정하키기 위하여 사용될 수도 있다. 이때, 상기 일시적으로 고정시킬 수 있는 지지체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 유리섬유, 면, 셀룰로오스 재질의 섬유성 물질이 될 수 있고, 상기 영구적으로 고정시킬 수 있는 지지체는 플라스틱 재질의 물질 등이 될 수 있다.

다른 추가 구성요소로서, 본 발명의 키트는 외부의 오염에 의한 진단오류를 최소화하기 위하여, 외부와의 접촉을 최소화 할 수 있도록 구성된 커버를 포함할 수 있다. 이때, 상기 커버에는 환자의 시료를 투입하기 위한 개구부, 과량의 시료를 방출시키기 위한 개구부, 진단결과를 육안으로 확인할 수 있는 투명창 등이 단독으로 또는 조합하여 구비될 수 있고, 상기 커버의 재질은 플라스틱이 될 수 있다.

한편, 본 발명의 진단 키트에 사용하기 위한 검정 시스템은 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱디바이스, 면역크로마토그래피법 및 방사 분할 면역검정 디바이스 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다. 바람직하게는 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 형태 또는 디바이스 형태의 진단 키트를 이용할 수 있다. 면역크로마토그래피법(immunochromatographic assay: ICA)을 이용한 진단은 그 신속함과 간편함 때문에 래피드 테스트(rapid test)라고도 불리는데, 이는 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1에 대한 단클론항체가 콜로이드성 금 입자에 축합되어 있고, 이 축합체가 이동하면서 항원 패드에 있는 뎅기열 바이러스와 결합을 하게 된다. 이 복합체가 검체(혈액)에 존재하는 뎅기 항체와 반응을 하면서 모세관 현상에 의해 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 멤브레인의 미세구멍(micropore)을 통하여 이동한다. 그 도중에 멤브레인의 미세구멍의 내부 표면에 고정되어 있는 항 사람 IgG 또는 항-사람 IgM-단클론 항체와 결합하여 발색 띠(band)를 형성하게 된다. 이 띠(band)의 발색 정도를 확인함으로서 항체의 존재 여부, 항체의 종류 및 항체의 양을 육안으로 판별할 수 있다.

본 발명의 상기 진단 키트에서, 항원-항체 복합체는 색채입자결합법으로 검출하며, 색채입자로는 예를 들어 콜로이드성 금 입자 또는 칼라 유리 또는 플라스틱(예: 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드(bead)를 포함한다. 본 발명에서는 바람직하게 금 콜로이드를 이용한다. 또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 진단 키트에서 콜로이드성 금 입자와 결합하는 축합체 (conjugate)로는 단클론 항체 M5G6을 이용하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 단클론 항체(M5G6)는 뎅기열 바이러스와 특이적으로 결합함을 알 수 있었다(도2). 도2에서는 단클론 항체(M5G6)이 B형 간염바이러스와는 반응하지 않고(lane 1), 뎅기열 바이러스의 표피단백질(envelope protein)에 특이적으로 반응하고 있음을 보여주고 있다 (lane 2). 또한, 이 단클론 항체는 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1 펩타이드와 뎅기열 바이러스와의 결합 친화도가 각각 2.02 x 10⁹및 1.82 x 10⁹임을 보여 항원-항체간 결합력이 매우 높음을 보여주었다(표1).

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 뎅기열 바이러스 항체검출용 신속진단키트를 이용하여 뎅기열 바이러스 감염이 의심되는 개체로부터 유래된 시료를 사용하여 뎅기열 바이러스의 감염여부를 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 키트에 포함된 검체 패드에 뎅기열 바이러스 감염이 의심되는 개체로부터 유래된 혈장, 혈청, 전혈 등의 혈액시료를 가하고, 검체전개액을 버퍼 패드에 가하면, 검체 패드에서 혈구가 분리된 액상성분과 검체전개액에 의해 항원 패드로부터 분리된 뎅기열 바이러스의 항원이 반응하여 항원-항체 복합체를 형성하고, 상기 검체전개액에 의해 축합 패드로부터 분리된 금 축합체가 추가로 결합하여, 금-단클론 항체(축합 패드)-뎅기열 바이러스 항원-항체(시료)의 복합체를 형성한 다음, 상기 복합체에 포함된 시료로부터 유래된 항체가 검사선 1 또는 2와 결합하고, 결합된 부위에서 금입자로 인하여 발색반응이 나타난다.

만일, 상기 시료에 뎅기열 바이러스에 대한 항체가 존재하지 않으면, 검사선 1 및 2의 어디에서도 금입자로 인한 발색반응이 나타나지 않고; 상기 시료에 뎅기열 바이러스에 대한 IgG 유형의 항체가 존재하면, 검사선 1에서 금입자로 인한 발색반응이 나타나며; 상기 시료에 뎅기열 바이러스에 대한 IgM 유형의 항체가 존재하면, 검사선 2에서 금입자로 인한 발색반응이 나타나게 된다.

또한, 상기 축합 패드에 존재하는 금 축합체에 포함된 단클론 항체와 특이적으로 결합할 수 있는 동물의 항체를 대조선으로 포함할 경우에는, 모든 반응시에 상기 대조선에서 금입자로 인한 발색반응이 나타나고, 만일 대조선에서 발색반응이 나타나지 않으면, 검사결과를 신뢰할 수 없다고 판정하게 된다.

따라서, 본 발명의 키트를 사용하면, 상기 시료에 뎅기열 바이러스에 대한 항체가 존재하는지를 확인할 수 있음은 물론, 상기 시료에 뎅기열 바이러스에 대한 항체가 존재하면, 상기 항체의 형태가 IgM인지 아니면 IgG인지를 확인할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1과 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 생산하는 융합세포를 제공한다.

본 발명자들은 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1에 해당하는 아미노산 서열 280번에서 296번에 해당되는 펩타이드(서열번호 1)를 합성하고, 이를 마우스에 복강주사하여 서열번호 1의 펩타이드에 대한 항혈청을 생성하는 마우스를 선발하였으며, 상기 선발된 마우스로부터 비장세포를 수득하고, 상기 수득한 비장세포와 골수종 세포를 융합시켜서 융합세포를 제작하였다. 상기 제작한 융합세포 중에서 서열번호 1의 펩타이드와 항원-항체 결합을 형성하는 단클론 항체를 생산하는 6종의 융합세포를 선별하고, 상기 선별된 각 융합세포에서 생산되는 각각의 단클론 항체(M5G6, M1G10, M1E4, M3F2, M3G8 및 M4D12)를 이용하여 상기 펩타이드 및 뎅기열 바이러스에 대한 결합친화도를 측정한 결과, M5G6 단클론 항체가 상기 펩타이드 뿐만 아니라 뎅기열 바이러스에 대하여 높은 결합친화도를 나타냄을 확인하였다(표 1). 이에, 본 발명자들은 M5G6 상기 단클론 항체를 생산하는 융합세포를 "M5G6(hybridoma)"라 명명하고, 이를 2013년 7월 12일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 12421BP를 부여받았다.

본 발명에서 제공하는 융합세포를 이용하면, 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1과 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 생산할 수 있다. 예를 들어, 상기 M5G6(hybridoma) 융합세포(KCTC 12421BP)를 배양하여 배양물을 수득하고, 상기 배양물로부터 단클론 항체를 회수함으로서, 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1과 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 생산할 수 있다.

상기 융합세포를 배양하는 방법은 상기 융합세포로부터 본 발명의 단클론 항체를 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있는데, 바람직하게는 상기 융합세포를 지지체에 고정시키고 배지를 교체하면서 배양할 수도 있고, 상기 융합세포를 배지에 현탁시키고 부유상태로 배양할 수도 있다. 상기 부유배양시에는 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 단클론 항체가 생산되는 한 계속적으로 수행함이 바람직하다.

상기 배양된 융합세포에서 생산된 단클론 항체는 상기 융합세포의 배양물로부터 회수할 수 있는데, 대체로 배양 배지 중으로 배출되므로, 바람직하게는 융합세포의 배양상층액을 수거하여 이로부터 단클론 항체를 회수할 수 있다. 상기 배양상층액으로부터 단클론 항체를 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 공지된 단클론 항체 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용함이 바람직하다.

본 발명에 따른 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1에 대한 단클론 항체를 이용하고 배양된 뎅기열 바이러스 자체를 항원으로 이용하게 되면, 뎅기열 바이러스의 표피단백질의 3차 구조가 본 모습 그대로 유지되고, 특히, 도메인2와 도메인3 부분에 대한 물리화학적 간섭이 없어지게 되어, 뎅기 감염 환자의 혈액내에 존재하는 뎅기 항체가 효과적으로 결합을 할 수 있게 된다. 뎅기 항체의 효과적인 결합은 진단의 예민성(민감성)과 정확성을 획기적으로 높여 줄 수 있다. 또한, 다양한 유형의 뎅기열 바이러스들 간의 상동성이 높기 때문에 뎅기열 2형 바이러스를 예시로서 사용하더라도, 이로부터 얻어진 결과를 모든 유형의 뎅기열 바이러스에 적용할 수 있다.

도 1은 뎅기열 바이러스 항원을 대상으로 M5G6 단클론 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진으로, 1번 레인은 대조군인 B형 간염 바이러스의 항원을 나타내고, 2번 레인은 뎅기열 바이러스의 표피단백질을 나타낸다.
도 2a는 본 발명의 뎅기열 바이러스 항체 진단키트의 구조를 나타내는 개략도이다.
도 2b는 본 발명의 뎅기열 바이러스 항체 진단키트에 포함된 단방향 자동혈구분리장치의 구성을 나타내는 개략도이다.
도 3은 본 발명의 뎅기열 바이러스 감염 진단키트의 진단결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 본 발명의 뎅기열 바이러스 감염 진단키트의 효과를 종래의 진단키트의 효과와 비교한 결과를 나타내는 사진이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1 제작 및 뎅기열 바이러스 배양

뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1에 해당하는, 아미노산 서열 280번에서 296번에 해당되는 펩타이드 (N'-TGHLKCRLRMDKLQLKG-C')를 (주)펩트론(대전)에서 합성하였다. 그 후, 펩타이드의 C-말단부분을 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)과 축합시켜서 면역원으로 사용하였다.

한국 병원성바이러스은행(KBPV, 서울)으로부터 분양받은 뎅기열 2형 바이러스(KBPV-VR-29)를 Vero 세포(Monkey Kidney Cell)에 감염시켜 증식시켰다. 바이러스 감염은 3시간 수행하였으며, 접종 후 세포변성(cytopathic effect, CPE)이 10일경에 나타나면 배양액을 취하였다. 수거한 바이러스 배양액을 0.3% 포르말린 용액을 1일간 상온에서 처리하여 바이러스를 불활성화한 후, 혈구응집법으로 역가를 측정하여 28HAU이상이 되도록 배양액을 농축 또는 희석하여 이용하였다.

실시예 2: 금 축합체용 마우스 항 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1 단클론 항체 제작

실시예 2-1: 면역화 및 세포 융합

상기의 실시예 1에서 준비한 도메인1 특이 펩타이드 100 ㎍이 들어 있는 용액과 같은 부피의 컴플리트 프레운즈 아주번트 (complete Freund's adjuvant)가 섞인 현탁액을 만들어 생후 8주령 암컷 생쥐 (BALB/C, 대한바이오링크(주), 한국)의 복강 내에 주입하였다. 2주 후에 인컴플리트 프레운즈 아주번트 (incomplete Freund's adjuvant)를 사용하여 같은 요령으로 한 번 더 주사하고, 다시 2주 후에 같은 요령으로 한 번 더 주사하였다. 마지막 면역처리 후 2일 뒤에 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 인산염 완충액에 1/1,000으로 희석하여 엘리자 (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay) 방법으로 항체의 역가를 결정하였다. 만약 역가가 낮게 나오면 2주 후에 다시 면역화시켰다. 그 후, 면역화된 쥐에서 비장을 꺼내고, 조직분쇄기로 비장을 으깬 후, 세포 혼탁액을 용기에 담고 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 골수종 세포는 세포배양용 플라스크에서 회수하여 RPMI1640 배지에 현탁하고 세포수를 계수하였다. 비장세포 역시 세포수를 계수하였다. 1×10⁷개의 골수종 세포와 1×10⁸개의 비장세포를 50 ㎖ 용기로 옮겨 RPMI1640 배지를 적당량 첨가한 후 200 ×g로 5 분간 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 현탁시켜 RPMI1640 배지에 천천히 흔들어 주면서 1 ㎖의 PEG (50% polyethylene glycol) 용액을 1분 동안 가하였다. 5 분 후에 1 ㎖의 RPMI1640 배지를 30 초에 걸쳐 천천히 첨가하고, 다시 3 ㎖의 RPMI1640 배양액을 30 초에 걸쳐 첨가하였다. 또 다시 17 ㎖의 RPMI1640 배양액을 1 분에 걸쳐 넣은 다음 20 ㎖의 RPMI1640 배양액을 더 넣어주고, 5 분 동안 반응시켰다. 이를 200 ×g로 5 분간 원심분리한 후 배지는 제거하였다. 50 ㎖의 1% HAT (hypoxathine-aminopterin-thymidine)을 함유하는 RPMI1640 배양액에 주의하여 현탁한 후, 피더 세포 (feeder cell)가 들어있는 96웰 세포배양용 플레이트에 웰당 100 ㎕씩 상기 세포를 넣어준 후 37 ℃, 5% CO₂인큐베이터에서 배양하였다.

실시예 2-2: 융합 세포주의 클로닝 및 복수를 이용한 항체 생산

상기의 실시예 2-1와 같이 배양된 세포를 10일 간 배양한 후에, 융합 세포가 군락을 형성하여 자라는 것이 확인되면 96웰 세포배양용 플레이트에서 배지를 약 100 ㎕ 취하여 도메인1 펩타이드와 초원심분리를 통하여 정제된 뎅기열 바이러스가 각각 코팅(coating)된 플레이트를 이용하여 특이 항체를 생산하는 세포가 자라는 웰을 스크리닝하였다. 그 웰의 세포를 회수하여 24웰 세포배양용 용기로 옮긴 다음 배양한 후, 안정한 단클론 세포주가 얻어질 때까지 클로닝을 계속하였다. 클로닝이 완료되면 티 플라스크 (T flask)로 옮겨 대량으로 배양하여 얼린 후 액체 질소에 보관하였다. 본 발명에서 개발된 주요한 도메인1 펩타이드 특이 단클론 항체는 아래 표1과 같다. 이들 중에서 M5G6은 펩타이드 항원뿐만 아니라 뎅기열 바이러스에 대해서도 강한 반응성을 나타내어 본 발명품에 적용하였다. 도 1은 M5G6이 부분 정제된 뎅기열 바이러스 표피단백질(~60KDa)에 대해서 강한 반응성이 있음을 면역블롯(immunoblot)을 통하여 확인한 결과이다.

생후 6-8주령 생쥐 (BALB/C)의 복강에 인컴플리트 프레운즈 아주번트(incomplete Freund's adjuvant)를 0.5 ㎖ 주사하였다. 1 주일째 되는 날 융합 세포를 인산염 완충액에 현탁하고 계수하여, 쥐 한 마리당 1.5×10⁶개의세포를 0.5 ㎖ 인산염 완충액에 현탁한 후 복강에 주사하였다. 1-2 주가 지나면서 복수(ascitic fluid)가 적당히 차오르면 주사기를 이용하여 복수를 채취한 후 냉동 보관하였다. 본 발명을 통하여 개발된 주요 단클론 항체의 아형(isotype) 및 면역친화도 (K)는 표1에 정리를 하였다.

단클론 항체 및 그의 결합친화도

단클론 항체	아형(isotype)	결합친화도(K)
단클론 항체	아형(isotype)	펩타이드	뎅기열 바이러스
M5G6	IgG1	2.02 x 10⁹	1.82 x 10⁹
M1G10	IgG1	5.12 x 10⁸	1.51 x 10⁸
M1E4	IgG2b	5.23 x 10⁸	3.0 x 10⁷
M3F2	IgG1	1.12 x 10⁹	0.34 x 10⁵
M3G8	IgG2a	0.27 x 10⁹	반응성 없음
M4D12	IgG2a	1.52 x 10⁹	반응성 없음

상기 표 1에서 보듯이, 6종의 단클론 항체 중에서 M5G6은 뎅기열 바이러스에 대한 결합친화도가 가장 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.

이에, 본 발명자들은 M5G6 상기 단클론 항체를 생산하는 융합세포를 "M5G6(hybridoma)"라 명명하고, 이를 2013년 7월 12일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 12421BP를 부여받았다.

실시예 2-3: 단클론 항체의 정제

상기의 실시예 2-2과 같은 방법으로 채취한 복수에 황산 암모늄 (ammonium sulfate)을 10%의 농도로 첨가하여 30 분간 혼합한 후, 15,000 rpm에서 30 분간 원심분리하고 상층액을 취하였다. 다시 이 상층액에 황산 암모늄을 50%의 농도로 첨가한 후 4 ℃에서 30 분간 방치하였다. 다시 15,000 rpm에서 30 분간 원심 분리하여 상층액은 버리고 침전물을 20 mM 인산완충용액 (phosphate buffer, pH 7.0)에 현탁시켰다. 이 현탁액을 20 mM 인산완충용액에서 18 시간 이상 투석한 후, 20 mM 인산완충용액 (pH 7.0)으로 평형화된 단백질 G-결합 컬럼 (Protein G-coupled column)에 투석액을 주입하고, 모두 주입되고 나면 인산완충용액을 이용하여 흡착하지 않은 물질들을 제거해 주었다. 컬럼에 결합된 항체는 10 mM 글리신용액 (glycine solution, pH 2.8) 용액으로 용출(elution)시켰다. 이때 1 M 트리스(Tris, pH 9.0) 용액을 용출액의 10% 부피로 첨가해 주어 pH가 7.0 ~ 7.5가 되도록 보정해 주었다. 용출된 항체액을 농축한 후, 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)에서 투석하고, 투석이 끝나면 브래드포드법 (Bradford assay)을 이용하여 항체의 양을 확인하고 사용 전까지 냉동 보관하였다.

실시예 3: 신속 면역크로마토그래피 진단 키트의 제조

실시예 3-1: 단클론 항체 M5G6-금 축합체 및 축합 패드 제조

0.02% HAuCl4용액을 교반 가열하면서 끓기 시작하면 0.2% Sodium citrate 용액을 첨가하여 용액을 환원시켜 금 입자(gold particle)을 제작하였다. 이렇게 제작된 금 입자에 상기의 실시예 2-3에서 개발된 단클론 항체 M5G6을 금 입자용액 100㎖당 1mg을 첨가하여 축합시켰다. 축합된 단클론항체-금 축합체를 10,000g에서 원심분리하여 침전시키고 0.1% BSA를 함유하는 생리식염수(PBS)로 용해하여 OD450값이 10이 되도록 만들었다. 이렇게 제작된 용액을 0.05% Tween 20이 전처리된 폴리에스테르나 유리패드에 처리하고 건조시켜서 축합 패드를 완성하였다.

실시예 3-2: 검사선용 항 사람 IgG 및 항 사람 IgM 및 대조선용 항 마우스 IgG 분주

상기의 실시예 2에서 수행한 방법과 동일하게 수행하여 제작된 항-사람 IgG-단클론 항체와 항-사람 IgM-단클론 항체를 준비하여, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 0.5 ~ 4.0 mg/㎖의 농도로 검사선 1(항 사람 IgG)과 검사선 2(항 사람 IgM) 부위에 분주를 하였다. 또한, 멤브레인의 대조선 위치에는 산양 항 생쥐 IgG 다클론 항체를 Arista Biologicals Inc.(미국)로부터 구입하여 1.0 mg/㎖의 농도로 PBS로 희석하여 분주하였다.

실시예 3-3: 버퍼 패드, 흡수 패드 및 검체 패드

먼저, 유리 섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 패드에 0.1M Tris (pH 8.0)을 처리한 후, 건조하여 버퍼 패드로 사용하였다.

다음으로, 코튼 재질의 패드를 별도의 처리 없이 잘라서 흡수 패드로 사용하였다.

끝으로, 다공성 플라스틱 재질인 니트로셀룰로오스 멤브레인(또는 PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인)으로 구성된 패드에 0.1M Tris (pH 8.0)을 처리하고, 이를 건조하여 검체 패드로 사용하였다.

실시예 3-4: 단방향 자동혈구분리 장치

본 단방향자동혈구분리 패드는 전혈로된 검체를 사용할때에만 적용한다. 혈청 또는 혈장을 검체로 사용할 때는 본 패드의 장착이 필요하지 않다. 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 패드에 0.05M Tris (pH 8.0)을 처리한 후, 건조하여 멤브레인에 붙여서 사용하였다. 멤브레인에 부착시, 접착성 비닐막(adhesive vinyl)를 이용하여 흡수 패드 쪽의 면만 멤브레인과 접촉할 수 있도록 하여 검체의 흐름이 있도록 하고, 검체 패드 쪽의 면은 이 비닐막으로 막아서 혈액의 흐름이 없도록 고안하였다 (도 2b).

실시예 3-5: 신속 면역크로마토그래피 진단 키트의 제작

도 2a와 같이 스트립의 하단으로 완충용액이 처리된 버퍼 패드, 금축합체가 처리된 축합 패드, 뎅기열 바이러스 배양액이 처리된 항원 패드, 검체를 주입하는 검체 패드 및 검사선 1, 검사선 2, 대조선이 순서대로 부착 및 분주되어 있는 멤브레인을 순차적으로 부착시키고, 상단에는 흡수 패드를 부착시켜서 스트립을 제작하였다. 상기 제작된 스트립을 도 3에 도시된 형태의 플라스틱 카세트에 장착하고 조립을 하여 신속 면역크로마토그래피 진단 키트를 제작하였다.

또한, 상기 신속 면역크로마토그래피 진단 키트의 버퍼 패드에 가하기 위한 검체전개액(0.1M Tris, 0.2M NaCl 및 1% NaN₃, pH 8.5)을 제조하였다.

한편, 상기 제작된 단방향 자동혈구분리 장치는 전혈 검체를 사용할때 만 장착하였다. 장착위치는 도 2a에 표기되어 있는 혈액적하부위로서, 도 2b와 같은 형태로 장착하였다.

실시예 4: 신속 면역크로마토그래피 진단키트의 사용법

뎅기열 바이러스 항체가 존재하는 검액(전혈은 10㎕, 혈청/혈장은 5㎕)을 도 2a에 표기된 혈액적하부위에 넣고, 아랫쪽의 버퍼 패드에 검체전개액을 3방울(약 100㎕) 떨어뜨린다. 그러면, 검액이 혈구분리가 되고, 멤브레인으로 이동하여 고정화되어 있는 항 사람 IgG (검사선 1)와 항 사람 IgM (검사선 2)에 반응을 하게 된다. 다른 한편으로는 검체전개액이 축합 패드로 이동하여 항체-금축합체를 용해시킨 후, 항원 패드로 이동하여 뎅기열 바이러스-항체-금 축합체를 형성하게 되고, 이 복합체가 멤브레인으로 이동하여 "금 축합체-항체-뎅기열 바이러스-검액내 뎅기 항체-항 사람 IgG (또는 항 사람 IgM)"와 같은 형태로 반응을 하게 되어 색 띠를 형성하게 된다.

한편, 반응하지 않은 항체-금 축합체는 대조선 부위에 부착되어 있는 항 생쥐 면역글로블린 G와 반응을 하여 색 띠를 나타나게 된다.

실시예 5: 뎅기열 바이러스 감염 진단키트의 효과 검증

실시예 5-1: 뎅기열 바이러스 진단

상기 실시예 3에서 제작한 진단키트의 효과를 검증하기 위하여, General Hospital Kuala Lumpur(GHKL, 말레이시아)로 부터 혈액 660건(뎅기 IgG 양성 320건, 뎅기 IgM 양성 190건 및 뎅기 음성 150건)을 대상으로 민감도와 특이도를 측정하였다(표 2).

본 발명의 뎅기열 바이러스 감염 진단키트를 사용한 진단결과

시료	본 발명 키트	ELISA		합계
시료	본 발명 키트	양성	음성	합계
N=320 (뎅기 IgG 시험)	양성	320	1	321
N=320 (뎅기 IgG 시험)	음성	0	149	149
합계		320	150	470
N=190 (뎅기 IgM 시험)	양성	189	1	190
N=190 (뎅기 IgM 시험)	음성	1	149	150
합계		190	150	340

상기 표 2에서 보듯이, 본 발명의 진단키트는 뎅기 IgG 양성 검체에 대해서는 100%의 민감도와 99.3%의 특이도를 나타내었고, 뎅기 IgM 양성 검체에 대해서는 99.4%의 민감도와 99.3%의 특이도를 나타내었다.

실시예 5-2: 종래 키트와의 효과 비교

상기 실시예 3에서 제작한 진단키트의 진단효과가 종래의 키트에 비하여 비교우위를 나타내는 지의 여부를 검증하기 위하여, 국제적으로 널리 유통되고 있는 미국 A사 계열사인 S사의 키트를 이용하여 비교하였다. 이때, 사용된 검체로는 Seracare 사(미국)에서 공급하는 표준 판넬(Anti-Dengue Mixed Titer Performance Panel, PVD201)을 사용하였다(표 3 및 도 4).

표준 판넬 PVD201을 이용한 기존 키트와의 비교 시험 결과

Panel Member	Country of Origin	Anti-Dengue IgG			Anti-Dengue IgM
Panel Member	Country of Origin	ELISA (s/co)	S사 키트	본 발명 키트	ELISA (s/co)	S사 키트	본 발명 키트
PVD201-01 PVD201-02 PVD201-03 PVD201-04 PVD201-05 PVD201-06 PVD201-07 PVD201-08 PVD201-09 PVD201-10 PVD201-11 PVD201-12 PVD201-13 PVD201-14 PVD201-15 PVD201-16 PVD201-17 PVD201-18 PVD201-19 PVD201-20 PVD201-21	Colombia Honduras Honduras Honduras Honduras Honduras Colombia Honduras Honduras Ecuador Honduras Honduras Honduras USA Honduras Ecuador Honduras Honduras Honduras Ecuador Ecuador	>8.9 1.6 1.1 음성 1.9 3.4 8.8 1.2 2.1 2.5 컷오프 음성 2.1 음성 음성 2.4 >8.9 음성 음성 3.0 >8.9	양성 음성 음성 음성 음성 음성 양성 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성 양성 양성 음성 음성 양성 양성	양성 양성 양성 음성 양성 양성 양성 양성 양성 양성 음성 음성 양성 음성 양성 양성 양성 음성 음성 양성 양성	6.0 음성 음성 음성 음성 2.6 >7.7 컷오프 1.2 >7.7 음성 음성 음성 음성 음성 6.8 5.5 음성 음성 >7.7 3.9	양성 음성 음성 음성 음성 음성 양성 음성 음성 양성 음성 음성 음성 음성 음성 양성 양성 음성 음성 양성 양성	양성 음성 음성 음성 음성 양성 양성 음성 양성 양성 음성 음성 음성 음성 음성 양성 양성 음성 음성 양성 양성

ELISA(효소면역측정법, enzyme-linked immunosorbent assay),

s/co(signal per cutoff value)

상기 표 3 및 도 4에서 보듯이, 항-뎅기 IgG(anti-dengue IgG)의 검출에 있어서, 종래의 키트(S사 키트)는 42.8%의 민감도와 100%의 특이도를 나타내었으나, 본 발명의 진단키트는 100%의 민감도와 86.7%의 특이도를 나타내었고; 항-뎅기 IgM(anti-dengue IgM)의 검출에 있어서, 종래의 키트(S사 키트)는 77.8%의 민감도와 100%의 특이도를 나타내었으나, 본 발명의 진단키트는 100%의 민감도와 100%의 특이도를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 진단키트는 종래의 키트에 비하여 우수한 뎅기열 바이러스에 대한 IgG 및 IgM 항체를 구별하여 검출하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

한국생명공학연구원 생물자원센터

KCTC12421BP

20130612

<110> GenBody Inc. <120> Rapid diagnostic kit for detecting anti-dengue virus antibodies using monoclonal antibody specific to the domain 1 of dengue envelope protein and its manufacturing method <130> PA130570/KR <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> viral envelop protein domain 1 <400> 1 Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys 1 5 10 15 Gly

Claims

(a) 항-사람 IgG-단클론 항체 및 항-사람 IgM-단클론 항체가 고정화된 멤브레인;
(b) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1과 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체가 결합된 금 축합체를 포함하는 축합 패드;
(c) 뎅기열 바이러스를 포함하는 항원 패드;
(d) 검체 패드;
(e) 완충용액을 포함하는 버퍼 패드; 및
(f) 흡수 패드를 포함하고,
사람 혈액중의 뎅기열 바이러스에 대한 IgG와 IgM을 구별 측정할 수 있는 것을 특징으로 하는 뎅기열 바이러스 항체검출용 신속진단키트.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1과 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체는 기탁번호 KCTC 12421BP로 기탁된 융합 세포에서 생산되는 단클론 항체인 것인 진단키트.
제1항에 있어서,
상기 항원 패드는 뎅기열 바이러스 배양액을 처리하고 건조하여 제작되는 것인 진단키트.
제1항에 있어서,
상기 검체 패드는 멤브레인 상에서 혈구가 분리된 혈액을 한쪽 방향으로만 이동시키는 단방향 자동혈구분리 장치의 형태인 것인 진단키트.
제4항에 있어서,
상기 단방향 자동혈구분리 장치는 접착성 비친수성 재질의 막을 한쪽 면만 멤브레인과 닿도록 하고, 다른 쪽 면은 약간 돌출되도록 접착하도록 구성되는 것인 진단키트.
제5항에 있어서,
상기 비친수성 재질의 막은 폴리비닐알코올 수지, 폴리에틸렌 수지, 폴리프로필렌 수지 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 재질의 막인 것인 진단키트.
제1항에 있어서,
상기 진단 키트는 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 형태인 것인 진단 키트.
제1항에 있어서,
상기 진단 키트는 ELISA 플레이트, 딥-스틱디바이스, 면역크로마토그래피법, 방사 분할 면역검정 디바이스, 또는 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스를 이용한 것인 진단 키트.
서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 뎅기열 바이러스의 표피단백질 도메인1과 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체를 생산하는 기탁번호 KCTC 12421BP로 기탁된 M5G6(hybridoma) 융합세포.