KR101854240B1

KR101854240B1 - 후크 효과가 없는 면역크로마토그래피 스트립 센서

Info

Publication number: KR101854240B1
Application number: KR1020160060971A
Authority: KR
Inventors: 김민곤; 오주성; 정효암
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2016-05-18
Filing date: 2016-05-18
Publication date: 2018-06-14
Also published as: KR20170130196A

Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 면역크로마토그래피 스트립 센서는 버퍼 패드, 컨쥬게이트 패드, 샘플 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 순차적으로 연결된 구조를 가지는 면역크로마토그래피 스트립 센서로서, 상기 샘플 패드는 멤브레인의 테스트라인과 컨쥬게이트 패드의 사이에 위치하고, 분석하고자 하는 액상 시료를 수용하며, 상기 컨쥬게이트 패드는 상기 액상시료에 함유되어 있는 항원과 특이적으로 결합하는 검출항체와 나노입자가 연결된 나노입자-검출항체 컨쥬게이트가 함유되어 있고, 상기 버퍼 패드는 상기 컨쥬게이트를 상기 멤브레인 상으로 이동시키기 위한 버퍼를 공급할 수 있도록 상기 컨쥬게이트 패드의 일측에 연결되며, 상기 멤브레인은 상기 항원에 결합하는 포획항체가 고정된 테스트라인과 상기 검출항체에 결합하는 2차 항체가 고정되어 콘트롤라인이 형성되어 있는 것을 특징으로 한다.

Description

후크 효과가 없는 면역크로마토그래피 스트립 센서{Hook-effect free lateral flow assay strip sensor}

본 발명은 면역크로마토그래피 스트립 센서에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비교적 높은 항원 농도에서 후크 효과 없이 항원의 정량분석이 가능한 면역크로마토그래피 스트립 센서에 관한 것이다.

CRP(C-reactive protein)는 잘 알려진 급성 염증의 바이오마커로서, 펜트라신(pentraxin)의 형태로 5개의 반복 구조로 이루어지며, 인터루킨-1 및 인터루킨-6에 의해 자극되면 간에서 합성된다. 과거 수십년 동안, 혈장에서의 CRP의 수준을 측정함으로써 이를 심근경색, 암, 심혈관질환, 당뇨의 위험을 예측하는데 이용하거나 항생제 치료 지침에 사용하기 위한 연구가 진행되었다. 건강한 정상 성인에서 CRP의 수치는 평균적으로 0.8 μg/mL 이지만, 염증반응이 발생하면 이의 수치는 100 mg/L 이상으로 증가한다. 통상적으로 가벼운 염증이나 바이러스 감염의 경우 10-50 μg/mL 이며, 활성 염증 또는 박테리아의 감염의 경우 50-200 μg/mL 이고, 중증 염증 또는 손상의 경우 CRP 농도는 200 μg/mL을 초과하게 된다. FDA는 20-500 μg/mL의 농도 범위의 경우 염증에서의 CRP 측정 및 심혈관질환의 신뢰성 있는 바이오 마커이며 잠재적 위험 예측자인 hs-CRP(high sensitivity CRP) 측정을 권고하고 있다. 이의 측정에서 요구되는 농도 범위는 1-10 μg/mL이다.

급성 염증 또는 1차 진료의 경우, 신속한 진단 또는 인체 체액 내에서 CRP 수준의 연속적인 모니터링을 위해서는, 측정 범위의 충족, 신속성, 정확성, 간편성 및 저비용 정량 측정 등이 요구된다. 통상적으로 신속한 정량적 CRP 분석으로서는 폴리스티렌 비드를 갖는 Immunoturbidimetric 방법 또는 Imunonephelometry 방법, 금 나노입자 응집(agglomeration) 분석법 등이 자주 이용된다. 또한, 최근에 광범위한 농도 범위의 CRP 테스트를 도입함으로써 광범위한 농도를 측정할 수 있도록 확장하였다. 예를 들어, DIAgam XS Cardio NanoGold C-reactive protein (CRP) 방법의 경우 DIAgam laboratory (Lille, France)으로부터 제공되는 시약을 사용하여 0.42 - 265 μg/mL의 범위까지 측정이 가능하다. DIAgam 시약은 시료를 희석하는 단계와 Olympus AU640생화학 분석기를 사용하여 0.1 - 160 μg/mL의 농도범위에 걸친 전농도 범위를 측정한다. 이들 방법들은 자동화된 분석기를 사용하여 정확한 측정값을 제공하지만, 분석공정을 수행하기 위해 값비싼 장비와 숙련된 인력이 요구된다. 이러한 한계점을 극복하기 위한 방안으로서 현장 현시 시스템에 적합한 저비용, 짧은 분석 시간 및 간단한 조작 기술로 CRP를 검출하는 방법이 제안되어 왔다. 신속하고 고민감도의 POCT(point of care test, 현장검사) 기법 중의 하나로서, 미세유체역학칩(microfluidic chip)이 CRP를 측정하기 위한 도구로 광범위하게 연구되어 왔다. Gervais 등에 의한 연구에서, 미세유체역학칩은 3분 동안 10 ng/mL 농도의 CRP를 검출할 수 있었고, 14분 동안은 1 ng/mL 이하 농도의 CRP를 검출할 수 있었다. Jonsson 등이 수행한 연구에서, 측방 유동 폴리머 칩은 10²의 동적 범위를 가지며 2.6 ng/mL의 검출 한계를 보유하였다. 또한, Gervais 등에 의한 보고에 따르면, 0.01 - 1.0 μg/mL 범위에서 CRP 농도가 증가하면 CRP 농도에서 형광신호 강도가 감소하게 된다. 상기한 연구결과들에서 나타난 바와 같이, 미세유체역학칩은 매우 신속하며 저농도에서 측정이 가능하지만, 고농도의 CRP 측정, 대량생산 및 상대적인 비용의 면에서 한계를 가지고 있다. 이러한 한계점을 극복하기 위해서, CRP 분석을 위해 수직 유동 분석법(vertical flow assay, VFA)을 개발하였다. 이 연구에서는 1분 내에서 측방 유동 분석법(lateral flow assay, LFA) 스트립 바이오 센서 보다 더 넓은 동적 범위를 사용하였으나, 더 넓은 범위의 CRP를 커버하지는 못하였다.

한편, 면역크로마토그래피 분석법은 생물학적 물질 또는 화학적 물질이 서로 특이적으로 부착하는 성질을 이용하여 분석 물질을 단시간에 정성 및 정량적으로 검사할 수 있는 방법으로, 상기 면역 크로마토그래피 분석 기구는 분석 스트립 또는 상기 분석 스트립을 플라스틱 하우징 내부에 장착해 조립한 형태의 면역분석 키트가 일반적으로 사용된다.

도 1은 종래의 면역크로마토그래피 분석 스트립의 대표적 구현 예를 보여주는 도면이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 면역크로마토그래피 분석에 사용되는 분석 스트립은 접착성 플라스틱 지지체(60) 상에 검체 패드(40), 컨쥬게이트 패드(30), 신호검출 패드(20) 및 흡수 패드(50)를 포함하여 이루어진다. 상기 검체 패드(40)는 액상 검체(또는 분석시료)를 흡수하고 액상 검체의 균일한 유동을 보장한다. 상기 컨쥬게이트 패드(30)는 상기 액상 검체에 함유되어 있는 분석물질과 특이적으로 결합하는 유동성 컨쥬게이트를 포함하고 있으며, 상기 검체 패드(40)를 통해 도입된 액상 검체가 상기 컨쥬게이트 패드(30)를 통과하면서 분석물질과 유동성 컨쥬게이트 사이의 특이적 결합이 이루어진다. 상기 신호검출 패드(20)는 통상 검출영역(detection zone)(21)과 대조영역(control zone)(22)을 포함하여 이루어진다. 상기 검출영역(21)은 상기 액상 검체에 분석물질이 존재하는 지의 여부를 확인하기 위한 영역이며, 상기 대조영역(22)은 액상 검체가 상기 검출영역(21)을 정상적으로 통과하였는지의 여부를 확인하기 위한 영역이다. 상기 신호검출 패드(20)의 상부에, 흡수 패드(50)가 위치한다. 상기 흡수 패드(50)는 상기 신호검출 패드(20)를 통과한 액상 검체를 흡수하며, 상기 분석 스트립에서의 상기 액상 검체의 모세관 유동을 도와준다. 정리하면, 상기 분석 스트립은 접착성 플라스틱 지지체(60)에 검체 패드(40), 컨쥬게이트 패드(30), 신호검출 패드(20) 및 흡수 패드(50) 순서로 부착하여, 액상 검체를 검체 패드(40)로부터 신호검출 패드(20)를 경유해, 흡수 패드(50)까지 이동시키고, 신호검출 패드(20)에서의 신호검출을 통해 면역분석을 수행한다. 변형된 다른 방법으로는 상기 컨쥬게이트와 신호검출물질을 하나의 다공성 패드에 통합하기도 한다. 그리고, 검체 패드, 컨쥬게이트 패드, 신호검출 패드 및 흡수 패드는 서로 중첩되어 배치되거나 또는 일정한 간격을 두고 플라스틱 지지체에 배열되기로 한다. 후자의 경우, 액상검체가 다른 매개체를 이용하여 모세관 현상으로 검체 패드와 컨쥬게이트 패드, 신호검출 패드로 이동한다.

이러한 LFA 센서는 LFA 스트립 바이오센서는 신속하고, 저비용이며 1단계 면역분석법 중의 하나이다. CRP 테스트 스트립에 기초한 수 종류 타입의 LFA가 상업적으로도 구입이 가능하지만, 샌드위치 면역분석법에서 분석물의 매우 높은 농도에 기인한 위음성 결과가 나오는 후크 효과(hook effect) 때문에 인간 혈청 내에서 CRP 농도 범위를 커버할 수 없는 단점을 갖는다. 이러한 이유로, 대부분의 상업용 LFA 스트립 센서는 고민감도 CRP (hsCRP) 또는 심장 CRP (cCRP)의 진단에 사용된다. 그러나, Leung 등의 연구에서, 지시자로서 금나노입자(AuNPs)를 사용한 디지털-스타일 분석법 또는 바코드-스타일분석법은 15분 내에 테스트에서 붉은색 라인의 수를 계수함으로써 저농도의 CRP를 검출하여, 초기 CVD 위험도 또는 박테리아 및 바이러스 감염을 예측하는 반-정량(semi-quantitative) 측방 유동 분석법을 제공한다. 이 LFA 센서는 측정목적이 각 질병에 따라 상이하지만, 멀티-라인 측정법을 사용하여 동일한 CRP를 검출하였다. 광범위한 농도범위 0 - 500 mg/L를 커버할 수 있는 CRP 분석을 위한 1 단계 면역센서 개발이 요구된다. 또한, LFA 바이오센서는 사용편의성, 상업적 접근용이성 및 제조비용과 같은 신속한 진단 센서 또는 현장검사의 질을 평가하기 위한 중요한 요소를 갖는다.　

상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.

본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 고농도 범위를 갖는 항원을 후크 효과없이 정량분석이 가능한 면역크로마토그래피 스트립 센서를 제공하는 데 있다.

위 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 실시예에 따른 면역크로마토그래피 스트립 센서는 버퍼 패드, 컨쥬게이트 패드, 샘플 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 순차적으로 연결된 구조를 가지는 면역크로마토그래피 스트립 센서로서, 상기 샘플 패드는 멤브레인의 테스트라인과 컨쥬게이트 패드의 사이에 위치하고, 분석하고자 하는 액상 시료를 수용하며, 상기 컨쥬게이트 패드는 상기 액상시료에 함유되어 있는 항원과 특이적으로 결합하는 검출항체와 나노입자가 연결된 나노입자-검출항체 컨쥬게이트가 함유되어 있고, 상기 버퍼 패드는 상기 컨쥬게이트를 상기 멤브레인 상으로 이동시키기 위한 버퍼를 공급할 수 있도록 상기 컨쥬게이트 패드의 일측에 연결되며, 상기 멤브레인은 상기 항원에 결합하는 포획항체가 고정된 테스트라인과 상기 검출항체에 결합하는 2차 항체가 고정되어 콘트롤라인이 형성되어 있는 것을 특징으로 한다.

상기 컨쥬게이트 패드는 기공이 큰부분과 작은 부분이 비대칭 구조로 형성된 비대칭 멤브레인을 매개로 하여 상기 멤브레인과 연결될 수 있다.

상기 항원은 CRP(C-reactive protein)일 수 있다.

상기 나노입자는 금 나노입자일 수 있다.

상기 멤브레인은 　니트로셀룰로오스, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 나일론, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리에스테르 또는 폴리프로필렌으로 제조된 멤브레인일 수 있다.

상기 버퍼 패드, 컨쥬게이트 패드, 샘플 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 지지체상에 순차적으로 연결되어 압착할 수 있는 케이스에 위치하는 것일 수 있다.

본 발명에 의한 면역크로마토그래피 스트립 센서에 따르면 높은 농도 범위에서 항원의 농도를 정확하게 측정하는 것이 가능하며, 저비용, 신속성, 및 간편성을 구현할 수 있으므로, 신속성, 고민감도가 요구되는 현장검사(point of care test, POCT)에 적합하다.

도 1은 종래 면역크로마토그래피 분석 스트립의 대표적 구현 예를 나타내는 도면이다.
도 2는 종래 면역크로마토그래피 분석 스트립의 단면도이다.
도 3은 종래 면역크로마토그래피 분석 스트립에서 항원 농도가 낮은 경우 테스트라인에서의 결합상태를 나타낸 도면이다.
도 4는 종래 면역크로마토그래피 분석 스트립에서 항원 농도가 높은 경우 테스트라인에서의 결합상태를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 면역크로마토그래피 분석 스트립을 간단하게 나타낸 도면이다.
도 6는 본 발명에 따른 면역크로마토그래피 분석 스트립에서 항원 농도가 높은 경우 테스트라인에서의 결합상태를 나타낸 도면이다.
도 7은 CRP 농도에 따른 검출 신호세기를 나타낸 그래프이다.
도 8은 CRP 시료의 투입 위치에 따른 검출 신호 세기를 나타낸 그래프이다.
도 9 (a)은 본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립 센서의 압축률에 따른 검출 신호세기를 나타낸 그래프이다.
도 9 (b)는 본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립 센서의 압축률에 따른 신호의 편차를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립 센서의 금 나노입자 크기에 따른 검출 신호세기를 나타낸 그래프이다.

여기서 사용되는 전문용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함하는"의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 성분 및/또는 군의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.

다르게 정의하지는 않았지만, 여기에 사용되는 기술용어 및 과학용어를 포함하는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다. 보통 사용되는 사전에 정의된 용어들은 관련기술문헌과 현재 개시된 내용에 부합하는 의미를 가지는 것으로 추가 해석되고, 정의되지 않는 한 이상적이거나 매우 공식적인 의미로 해석되지 않는다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 의한 면역크로마토그래피 분석 스트립에 대하여 설명하기로 한다.

도 2는 종래 면역크로마토그래피 분석 스트립의 단면도이다. 도 3은 종래 면역크로마토그래피 분석 스트립에서 항원 농도가 낮은 경우 테스트라인에서의 결합상태를 나타낸 도면이다. 도 4는 종래 면역크로마토그래피 분석 스트립에서 항원 농도가 높은 경우 테스트라인에서의 결합상태를 나타낸 도면이다. 도 2 내지 도 4를 참조하면, 종래의 면역크로마토그래피 분석 스트립을 사용하는 경우에는 샘플패드(30)를 통해서 시료가 주입되면 컨쥬게이트 패드(30)를 통하여 멤브레인(20)으로 전달이 된다. 이때 항원(27)의 농도가 작은 경우에는 적절하게 검출영역(21)에 고정되어 있는 포획항체(26)에 결합되어 항원(27)의 농도에 비례하여 나노입자(29)의 발광세기가 커지게 된다. 그러나, 항원(27)의 농도가 높은 경우에는 충분이 컨쥬게이트와 반응하지 못하여 검출되는 발색세기가 감소하는 후크효과가 발생하게 된다.

본 발명자들은 높은 농도 범위를 갖는 생체물질에 대해서도 정확한 농도의 측정이 가능한 바이오 센서를 개발하기 위해 노력하였다. 그 결과 면역크로마토그래피 스트립 센서에서 샘플 패드와 컨쥬게이트 패드의 위치를 바꾸고 버퍼용액을 별도로 투입할 수 있는 버퍼 패드를 도입하여 높은 농도 범위에서 항원의 농도를 정확하고 신속하게 측정할 수 있음을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성시켰다.

도 5는 본 발명에 따른 면역크로마토그래피 분석 스트립을 간단하게 나타낸 도면이다. 도 5의 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역크로마토그래피 스트립 센서(100) 은 버퍼 패드(140), 컨쥬게이트 패드(130), 샘플 패드(120), 멤브레인(110) 및 흡수 패드(150)가 순차적으로 연결된 구조를 가질 수 있다.

우선 멤브레인 (110)는 항원에 결합하는 포획항체가 고정된 테스트라인(111)과 검출항체에 결합하는 2차 항체가 고정되어 있는 콘트롤라인(112)이 형성되어 있다. 멤브레인(110)은 후술한 샘플 패드(120)와 컨쥬게이트 패드(130)의 하면에 결합할 수 있도록 일체형으로 형성될 수 있으며, 샘플 패드(120)를 매개로 하여 연결될 수 있도록 분리되어 형성될 수도 있다. 이러한 멤브레인(110)은 샘플 물질이 통과할 수 있는 어떠한 다양한 물질로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 천연, 합성, 또는 합성에 의해 변형된 천연 발생 물질, 예를 들어 폴리사카라이드(예: 셀룰로오스 물질, 종이, 셀룰로오스 아세테이트 및 니트로셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체); 폴리에테르 술폰; 폴리에틸렌; 나일론; 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF); 폴리에스테르; 폴리프로필렌; 실리카; 비닐 클로라이드, 비닐 클로라이드-프로필렌 공중합체 및 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트 공중합체와 같은 중합체와 함께 다공성 중합체 매트릭스에 균일하게 분산된 무기 물질, 예를 들어 불활성화된 알루미나, 규조토, MgSO₄, 또는 다른 무기 미분 물질; 자연 발생(예: 면) 및 합성(예: 나일론 또는 레이온) 천; 다공성 겔, 예를 들어 실리카겔, 아가로스, 덱스트란 및 젤라틴; 중합체 필름, 예를 들어 폴리아크릴아미드; 등의 물질로부터 형성될 수 있다. 바람직하게는 상기　멤브레인(110)은 중합체 물질, 예를 들어 니트로셀룰로오스, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 나일론, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리에스테르 및 폴리프로필렌을 포함한다.

테스트 라인(111)에는 항원에 결합하는 포획항체가 고정되어 있으며, 콘트롤 라인(112)에는 상기 검출항체에 결합하는 2차 항체가 고정되어 있다. 콘트롤 라인의 2차 항체는 나노입자-검출항제 또는 나노입자-검출항체-항원 복합체에 결합하여 이에 대한 검출 신호를 발생시킨다. 항원은 농도 또는 존재 여부를 분석하고자 하는 대상물질을 지칭하는 의미이며, 예컨대 단백질, 펩타이드, 미생물, 아미노산, 핵산, 호르몬, 스테로이드, 비타민, 약물, 박테리아, 바이러스 입자 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 항원은 가장 바람직하게는 CRP(C-reactive protein)이다. 또한, 샘플은 상기 분석하고자 하는 항원을 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 물질을 의미한다. 예컨대, 혈액, 간질액, 타액, 접안 렌즈 유체, 뇌척수액, 땀, 소변, 젖, 복수, 점액, 비강유체(nasal fluid), 객혈, 관절혈액, 복강액, 질액, 월경분비물, 양수, 및 정액을 포함하며, 생리적 유체와 같은 어떠한 생물학적 공급원으로부터도 유래될 수 있다.

샘플 패드(120)는 항원이 테스트라인(111)에 있는 포획 항체와 먼저 반응할 수 있도록 컨쥬게이트 패드(130)과 멤브레인(110)의 테스트라인(111) 사이에 위치하게 되며, 분석하고자 하는 액상시료를 수용하게 된다. 이러한 샘플 패드(120)는 분석을 행할 샘플을 수용하여 확산 흐름이 가능한 패드를 의미하며, 분석을 행할 샘플을 수용하여 함유하기에 충분한 다공성을 갖는 물질로 구성된다. 이러한 다공성 물질로는 섬유성 종이, 셀룰로오스 물질로 된 미세 기공　멤브레인, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 유리섬유, 천연발생의 면(cotton), 나일론과 같은 직물 또는 다공성 겔 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.

컨쥬게이트 패드(130)은 나노입자와 항원에 결합하는 검출항체가 연결된 나노입자-검출항체 컨쥬게이트가 포함되어 있는 패드이다. 컨쥬게이트 패드(130)의 위치가 샘플 패드(120)와 멤브레인(110) 사이에 위치하지 않아 샘플 패드(120)로 공급되는 항원이 미리 컨쥬게이트와 결합하는 것을 방지할 수 있다. 컨쥬게이트 패드(130)는　샘플 패드와 마찬가지로 확산 흐름이 가능한 물질로 구성된다. 또한 컨쥬게이트 패드(130)는 멤브레인과 연결될 때 멤브레인 방향으로 컨쥬게이트가 이동할 수 있도록 기공이 큰 부분과 작은 부분이 비대칭 구조로 형성된 비대칭 멤브레인을 매개로 하여 상기 멤브레인과 연결될 수 있다.

상기 컨쥬게이트 패드(130)에 포함된 나노입자-검출항체 컨쥬게이트의 나노입자는 검출 가능한 표지로서 작용하는 나노입자를 의미한다. 상기 나노입자는 바람직하게는 금속의 나노입자이며, 상기 금속으로는 예를 들어 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 이리듐(Ir), 로듐(Rh), 루테늄(Ru)의 귀금속; 티타늄(Ti), 지르코늄(Zr), 하프늄(Hf), 바나듐(V), 나이오븀(Nb), 탄탈럼(Ta), 크로뮴(Cr), 몰리브데늄(Mo), 텅스텐(W), 루테늄(Ru), 오스뮴(Os)의 전이금속; 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co)등의 금속; 산화마그네슘(MgO), 이산화티타늄(TiO₂), 오산화바나듐(V₂O₅), 산화아연(ZnO)의 금속산화물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 나노입자는 가장 바람직하게는 금(Au) 나노입자이다.

상기 검출항체는 분석하고자 하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 결합 특이성을 보유한다면 항체의 단편도 포함하는 의미이다. 상기 검출항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 모노클로날 항체를 사용한다. 상기 나노입자와 검출항체의 결합은 예컨대 이온결합, 공유결합, 금속결합, 배위결합, 수소결합, 및 반데르발스 결합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

흡수 패드(150)는 멤브레인(110)의 말단에 또는 그 가까이에 인접해서 위치할 수 있다. 흡수 패드(150)는 일반적으로 전체　멤브레인을 통해 이동하는 유체 샘플을 받아들인다. 흡수 패드(150)는　멤브레인을 통한 모세관 작용 및 유체의 확산 유동을 촉진하는 데 도움을 줄 수 있다.

상기 버퍼 패드(140), 컨쥬게이트 패드(130), 샘플 패드(120), 멤브레인(110) 및 흡수 패드(150)가 지지체상에 순차적으로 연결될 수 있다. 상기 지지체는 상기한　버퍼 패드(140), 컨쥬게이트 패드(130), 샘플 패드(120), 멤브레인(110) 및 흡수 패드(150)를 지지 및 운반할 수 있다면 어떠한 물질로도 형성될 수 있으나, 일반적으로 상기　멤브레인을 통해 확산하는 샘플의 유체가 지지체를 통해 누출되지 않도록 액체 불투과성인 것이 바람직하다. 예컨대, 유리; 중합체물질 예를 들어 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리부타디엔, 폴리비닐클로라이드, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 에폭시드, 메타크릴레이트 및 폴리멜라민 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

도 6는 본 발명에 따른 면역크로마토그래피 분석 스트립에서 항원 농도가 높은 경우 테스트라인에서의 결합상태를 나타낸 도면이다. 도 6에 도시한바와 같이 검출대상이 되는 항원(27)을 포함하는 시료가 컨쥬게이트 패드를 거치지 않아 우선적으로 테스트라인(111)에 포획항체(26)와 결합한 항원(27)과 컨쥬게이트가 결합되므로써 발색세기가 감소되지 않으므로 후크효과가 발생되지 않는다.

이하 실시예를 통하여 본 발명에 대하여 보자 자세하게 설명한다

1. 실험재료

CRP가 포함되지 않은 혈청(90R-100), surfactant 10G (95R-103), 및 우혈청알부민(BSA)은 Fitzerald Industries International (Acton, MA, USA)으로부터 구입하였다. CRP는 Millipore (233608; Billerica, MA, USA)으로부터 구입하였고, 항-CRP 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체는 Abcam Inc. (Cambridge, MA, USA)으로부터 구입하였다. 니트로셀룰로오스 멤브레인은 Millipore (HFB02404; Billerica, MA, USA)으로부터 구입하였다. 샘플 패드(P/N BSP-133-20) 및 흡수 패드는 Pall Co. (Port Washington, NY, USA)으로부터 구입하였다. 인터 패드 (Fusion5 8151-6621)는 Whatman (Kent, UK)으로부터 구입하였다. 각각의 금 콜로이드 용액은 BB International (EM.GC15, 20, 40; Cardiff, UK)으로부터 구입하였다. 폴리비닐피롤리돈 (PVP10) 및 다른 화합물들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 모든 완충액과 시약 용액들은 Milli-Q 정수시스템을 사용하여 만들어진 정제수로 제조하였다. 라미네이트된 카드는 Millipore (HF000MC100)로부터 얻었다.

2. AuNP -항체 컨쥬게이트 용액의 제조

AuNP 컨쥬게이트를 제조하기 위해, 항-CRP 항체를 포함한 PBS(2 mg/mL 농도) 5㎕ 를 1 mL의 15 nm AuNP 콜로이드와 보레이트 완충액 100㎕ (0.1 M, pH 8.5)의 혼합물에 첨가하였다. 상온에서 30분간 인큐베이션한 후에 10 mg/mL의 BSA를 포함하는 PBS 0.1 mL를 AuNP 표면을 블로킹하기 위해 용액에 첨가하엿다. 4℃에서 60분간 인큐베이션한 후에 혼합물을 HANIL microcentrifuge(micro 17TR; Quasar Instruments, Colorado Springs, CO, USA)를 사용하여 8,000 rpm으로 10℃에서 15분간 원심분리를 행하였다. 상등액을 버리고, 1mL의10 mM 보레이트 완충액 (pH 8.5)를 AuNP 컨쥬게이트에 가하여 재현탁하였다. 원심분리 및 현탁 과정을 2회 반복한 후, 마지막 상등액 제거 후 10 mM 보레이트 완충액으로 최종용액의 볼륨을 100 ㎕로 제조하였다. 이하, 10X AuNP conjugate 용액이라 지칭한다.

3. LFA (Lateral Flow Immunoassay) 센서의 제조( 도5참조 )

샘플패드는 Fusion 5 패드를 1% BSA, 1% PVP, 0.5% 10G(1 X PBS로 희석)으로 blocking 한 후 37℃에서 건조시킨 후 4 mm * 4 mm 크기로 재단하였다. 컨쥬게이트 패드로 glass fiber pad를 1% BSA로 blocking 처리한 후 37℃에서 건조시킨 후 4 mm * 4 mm 크기로 재단한 후, 10X AuNP conjugate 용액과 2% PVP, 1% S10G(1X PBS에 희석된)용액과 1:1의 비율로 섞어 최종 5X AuNP conjugate, 1% PVP, 0.5% S10G 용액을 준비하였다. 재단된 제작된 glass fiber pad에 준비된 10 ㎕의 용액을 주사한 후 37에서 15분간 건조시켜 컨쥬게이트 패드를 준비하였다. NC 멤브레인에 1mg/mL의 ployclonal CRP antibody 용액 (1x PBS 용액에 희석) 을 dispenser 장비를 이용하여 1 ㎕ /sec의 분사 속도로 5cm/sec 의 이동속도로 분사하여 테스트라인을 형성하고, 1mg/mL의 anti-mouse-IgG 용액(1x PBS 용액에 희석)을 dispenser 장비를 이용하여 1 ㎕ /sec의 분사 속도로 5cm/sec 의 이동속도로 분사하여 콘트롤 라인을 형성하였다. 컨쥬게이트 패드 밑에는 GX type의 비대칭 멤브레인을 위치하고 중간에 인터패드로는 fusion 5를 사용하여 컨쥬게이트 패드를 멤브레인 상에 위치시켰다.버퍼 패드와 흡수 패드는 각각 4 mm * 20 mm와 10 mm * 20 mm의 크기로 재단하여 준비하였다.

본 발명에 따른 스트립 센서와 비교할 수 있도록 종래 면역크로마토그래피 스트립 센서를 준비하였다(도2참조). 상기 스트립 센서와 동일하게 제조하되 샘플 패드와 컨쥬게이트 패드, NC 멤브레인을 순차적으로 연결하여 제조하였으며, 샘플 패드는 4 mm * 20 mm 의 크기로 흡수 패드를 재단하여 준비하였다.

3. CRP 분석 - CRP 농도에 따른 신호세기 측정

CRP가 포함되지 않은 인간 혈청을 사용하여 다양한 농도를 갖는 CRP 용액을 제조하였다. 제조한 샘플 용액을 LFA 센서상에 인큐베이션하였다. Chemi Doc TM XRS+ imaging system (Bio-rad)를 사용하여 이미지를 얻고, 이어서 Image lab TM 4.0 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 색깔강도를 측정하였다. 각 LFA에 대한 구체적인 실험방법은 다음과 같다.

종래 LFA(conventional LFA)에는 CRP(1mg/mL)을 CRP-free serum으로 농도별로 희석하고, 농도별로 희석된 sample을 120㎕ 씩 샘플 패드에 천천히 주입하고. 본 발명에 따른 LFA(Hook effect-free)에는 위 같은 샘플을 준비하여 2.5㎕씩 샘플 패드에 주입한 후 120㎕의 1% PVP, 0.5% S10G(1X PBS에 희석) 용액을 버퍼 패드에 천천히 주입하였다.

도 7은 CRP 농도에 따른 검출 신호세기를 나타낸 그래프이다. 도 6에 도시한 바와 같이 종래 LFA의 경우에는 1 ㎕/mL이상의 경우 신호 세기가 감소하는 후크효과가 발생하여 그 농도 이상의 범위에서 정량분석이 어려운 반면에 본 발명에 따른 LFA의 경우에는 0.1 ~ 100 ㎕/mL의 범위에서 CRP의 농도와 검출 신호세기가 비례하게 나타나기 때문에 정량분석이 가능한 것을 알 수 있다. 또한 100㎕/mL이상의 농도의 범위에서도 신호의 세기가 감소하는 후크 효과가 발생하지 않는 것을 확인할 수 있다.

4. CRP 분석 - 시료주입 위치에 따른 신호세기 측정

상기 실험과 마찬가지 시료를 준비하여 버퍼 패드, 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드 각각에 주입하고, 후 120㎕의 1% PVP, 0.5% S10G(1X PBS에 희석) 용액을 버퍼 패드에 주입한 후 검출 신호세기를 측정하였다.

도 8은 CRP 시료의 투입 위치에 따른 검출 신호 세기를 나타낸 그래프이다. 검출대상 시료를 각각 버퍼 패드와 컨쥬게이트 패드에 투입한 경우에는 10 ㎕/mL 이상의 범위에서는 신호 세기가 감소한 것을 알 수 있으며, 샘플 패드에 시료를 투입한 경우에는 0.1 ~ 100 ㎕/mL의 범위에서 CRP의 농도와 검출 신호세기가 비례하여 나타나는 것을 알 수 있다.

5. LFA에 케이스에 의한 압축률에 따른 신호세기 측정

본 발명에 따른 LFA의 케이스에 의한 밀착하여 가압하여 압축정도에 따른 검출 신호세기를 측정하였다. 본 발명에 따른 LFA 구조로 제작된 스트립 센서를 컨쥬게이트 패드가 있는 부분(delay release structure)의 높이 기준, 각각의 비율의 내부공간높이를 가진 case로 케이싱하였다. 준비된 sample(CRP가 CRP-free serum에 농도별로 희석된 용액)을 2.5㎕씩 bridge membrane(sample pad)에 주입한 후 120㎕의 1% PVP, 0.5% S10G(1X PBS에 희석된) 용액을 buffer pad에 천천히 주입하였다. Triplet으로 상기 실험을 진행하여 내부공간높이 비율별로 test line의 signal intensity 과 coefficient of variation을 하였다.

도 9 (a)은 본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립 센서의 압축률에 따른 검출 신호세기를 나타낸 그래프이다. 도 9 (b)는 본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립 센서의 압축률에 따른 신호의 편차를 나타내는 그래프이다. 도 8에 도시된 바와 같이, 약 88%의 압축율을 보이는 경우 가장 큰 신호세기가 감지되는 것을 알 수 있으며, 편차도 제일 낮은 것을 알 수 있다.

6. 금 나노입자의 크기에 따른 신호세기 측정

본 발명에 따른 LFA의 금 나노입자의 사이즈에 따른 검출 신호세기를 측정하였다. AuNP size별로 AuNP conjugate 용액을 만든 후 conjugate pad를 각각 제작하였다. CRP(1mg/mL)을 CRP-free serum으로 농도별로 희석하고, 준비된 sample을 2.5㎕씩 샘플 패드에 주입한 후 120㎕의 1% PVP, 0.5% S10G(1X PBS에 희석) 용액을 버퍼 패드에 천천히 주입한 후에 각각의 Test line의 신호 세기를 분석하였다. 도 10은 본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립 센서의 금 나노입자 크기에 따른 검출 신호세기를 나타낸 그래프이다. 도 10에 도시된 바와 같이, 금 나노입자의 크기가 40 nm인 경우보다 15, 20nm의 경우에 신호세기가 크게 나타났으며, 민감도가 높은 것을 알 수 있다.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

110: 멤브레인 120: 샘플 패드
130: 컨쥬게이트 패드 140: 버퍼 패드
150: 흡수 패드

Claims

버퍼 패드, 컨쥬게이트 패드, 샘플 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 순차적으로 연결된 구조를 가지는 면역크로마토그래피 스트립 센서로서,
상기 샘플 패드는 멤브레인의 테스트라인과 컨쥬게이트 패드의 사이에 위치하고, 분석하고자 하는 액상 시료를 수용하며,
상기 컨쥬게이트 패드는 상기 액상시료에 함유되어 있는 항원과 특이적으로 결합하는 검출항체와 나노입자가 연결된 나노입자-검출항체 컨쥬게이트가 함유되어 있고,
상기 버퍼 패드는 상기 컨쥬게이트를 상기 멤브레인 상으로 이동시키기 위한 버퍼를 공급할 수 있도록 상기 컨쥬게이트 패드의 일측에 연결되며,
상기 멤브레인은 상기 항원에 결합하는 포획항체가 고정된 테스트라인과 상기 검출항체에 결합하는 2차 항체가 고정되어 콘트롤라인이 형성되며,
상기 컨쥬게이트 패드는 기공이 큰부분과 작은 부분이 비대칭 구조로 형성된 비대칭 멤브레인을 매개로 하여 상기 멤브레인과 연결되고,
상기 샘플패드는 상기 멤브레인 위에 위치 하되, 상기 샘플패드가 위치한 상기 멤브레인 부분은 단절된 상태로 상기 샘플패드를 매개로 하여 연결되는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립 센서.
삭제
청구항1에 있어서,
상기 항원은 CRP(C-reactive protein)인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립 센서.
청구항1에 있어서,
상기 나노입자는 금 나노입자인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립 센서.
청구항 1에 있어서,
상기 멤브레인은 　니트로셀룰로오스, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 나일론, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리에스테르 또는 폴리프로필렌으로 제조된 멤브레인인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립 센서.
청구항 1에 있어서
상기 버퍼 패드, 컨쥬게이트 패드, 샘플 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 지지체상에 순차적으로 연결되어 압착할 수 있는 케이스에 위치하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립 센서.