KR20230005571A - 검출신호 세기를 증가시킨 측방 유동 면역분석 디바이스 및 이를 이용한 표적 물질 검출 방법 - Google Patents

검출신호 세기를 증가시킨 측방 유동 면역분석 디바이스 및 이를 이용한 표적 물질 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 멤브레인에 압력을 가하여 검출신호의 세기를 증가시킨 측방 유동 면역분석 디바이스에 대한 것으로, 본 발명에 따른 멤브레인에 압력을 가하여 제조된 측방 유동 면역분석 디바이스는 멤브레인에 압력을 가하지 않은 측방 유동 면역분석 디바이스 대비 월등히 높은 감도를 보임을 확인하였다. 따라서 본 발명은 화학적 처리가 필요없이 매우 간단하게 물리적인 방법으로 검출신호의 세기를 증가시킨 발명으로 대량 생산에 적용되기 적합하며, 추가적인 재료의 사용이 필요하지 않아 원감 절감의 효과도 얻을 수 있어 다양한 표적 물질 검출용 측방 유동 면역분석 디바이스에 대해 유용하게 활용할 수 있다.

Description

검출신호 세기를 증가시킨 측방 유동 면역분석 디바이스 및 이를 이용한 표적 물질 검출 방법{Lateral flow immunoassay device with increased detection signal strength and method for detecting target material using the same}
본 발명은 검출신호의 세기를 증가시킨 측방 유동 면역분석 디바이스에 대한 것으로, 보다 구체적으로 압력을 이용해 시료의 유량을 감소시켜 검출신호의 세기를 증가시킨 측방 유동 면역분석 디바이스 및 이를 이용한 표적 물질 검출 방법에 관한 것이다.
혈액 또는 뇨와 같은 생검물에 함유된 미량의 물질을 정성 분석 또는 정량 분석함으로써 이루어지는 진단 방법과 진단 기구의 개발이 진행되고 있다. 1950년대 방사선 동위 원소를 이용한 방사능면역분석법(Radio Immunoassay, RIA)이 처음으로 도입된 이래 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)이 70년대와 80년대에 개발되고 발전되었다. 현재 ELISA 면역분석법은 가장 많이 사용되고 있는 방법 중 하나이며 의학이나 생명과학의 연구에서 필수적인 도구가 되었다.
그러나, RIA나 ELISA를 포함하는 전형적인 면역진단법은 대개 시료 당 한 종류의 분석물을 복잡한 다단계과정을 거쳐 고가의 분석기기를 사용하여 정량화 한다. 따라서, 이러한 시설이나 설비가 갖추어 지지 않은 소규모의 병원, 응급실, 가정 등에서 사용하기 용이하지 않다. 이러한 약점을 보완하기 위하여 고안된 진단 제품이 면역크로마토그래피 방법을 이용한 간편한 진단 키트이다.
면역크로마토그래피 분석법의 대표적인 타입으로 측방유동 분석법(lateral flow assay, LFA)을 들 수 있다. 상기 LFA 타입의 키트 구조를 살펴보면 시료가 적용되는 샘플 패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 접합 패드(conjugation pad) 또는 방출 패드(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항체 항원 반응이 일어나는 전개용 멤브레인(주로, 니트로셀룰로스(nitrocellulose)) 또는 스트립(strip), 그리고 시료가 계속하여 이동하기 위한 흡수 패드(absorption pad)로 구성된다.
탐지용 항체는 표시를 위하여 예를 들면 콜로이드성 금입자에 결합되어 있다. 금 입자 대신 라텍스 비드(latex bead) 또는 탄소입자를 사용하기도 한다. 측방 유동 분석용 진단 키트는 대개 샌드위치 형태로 분석물을 탐지하도록 고안되어 있다. 즉, 액체 시료 속에 들어 있는 분석물은 샘플 패드에 적용되어 이동하기 시작하면서 먼저 방출 패드(또는 접합 패드)에 비고정적으로 코팅되어 있는 탐지용 항체와 반응을 하여 항원-항체 결합체 형태로 계속하여 전개된다. 이동하면서 전개막(멤브레인)에 고정되어 있는 포획 항체와 한번 더 반응을 하여 샌드위치 형태의 복합체를 만든다. 포획 항체는 전개막에 고정되어 있기 때문에 항원-항체 반응이 계속하여 일어나면 복합체의 축적이 포획 항체의 고정 면에서 이루어진다. 단백질은 육안으로는 투명하기 때문에 복합체의 생성 여부와 상대적인 양을 부착된 금 입자의 발색 세기로 판단한다. 이와 같은 측방 유동 분석법은 임신 진단, 암 진단, 미생물 탐지 등 다양한 분야에서 널리 사용되고 아주 간편하게 진단할 수 있다.
그러나 판단이 육안으로 이루어지기 때문에 표적 물질이 생물학적 시료에 적게 포함되는 등의 다양한 이유로 발색 세기가 약하면 정확한 진단이 어려운 문제점이 있다.
따라서 이러한 문제점을 해결하기 위해, 고체 잉크 프린팅(wax ink printing) 기술을 이용하여 멤브레인 표면에 고체 잉크를 패터닝(patterning)하고, 이를 녹여 멤브레인상의 유체의 흐름을 방해하여, 검출신호 세기를 강화시킨 왁스 필러(wax pillar)가 개발된 바 있다(Merko
Figure pat00001
i Lab Chip, 2014, 14, 4406). 상기 기술은 여러 가지의 왁스 필러 패턴(wax pillar pattern)을 통해 면역복합체와 검출 항체간의 결합 시간을 늘리고 LFA의 신호 세기를 높이는 결과를 보였다. 하지만 왁스 패터닝이 균일하게 되지 않는 경우도 있으며, 패터닝 후 가열을 해야 하는 단점이 있다. 이 외에도 LFA 키트 검사에 은 염색법(silver staining)을 도입하여 신호의 세기를 강화시키는 시도가 있었다. 하지만 이러한 방법은 염색을 위한 추가 스텝이 필요하고, 이를 자동화하기 위해 기기의 디자인이 더 복잡해진다는 단점이 있다.
따라서 더 간단한 방법으로 검출신호의 세기를 강화시킨 측방 유동 면역분석 디바이스의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 측방 유동 면역분석 디바이스에 있어서 검출신호의 세기를 증가시키기 위하여 연구하던 중, 압력을 이용해 멤브레인의 기공 크기를 감소시킴으로써 검출신호의 세기를 증가시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 검출신호의 세기를 증가시킨 측방 유동 면역분석 디바이스를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 표적 물질 검출방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표적 물질을 포함하는 시료를 투입하는 샘플 패드; 표지자가 결합된 제 1 결합체를 포함하는 접합 패드; 표면 상에 제 2 결합체가 고정된 테스트 라인 및 제 3 결합체가 고정된 컨트롤 라인이 간격을 두고 위치한 멤브레인; 및 흡수 패드;를 포함하는 검출신호의 세기를 증가시킨 측방 유동 면역분석 디바이스를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 측면 유동 면역분석 디바이스의 샘플 패드에 표적 물질을 포함하는 시료를 투입하는 단계;를 포함하는 표적 물질 검출방법을 제공한다.
본 발명은 멤브레인에 압력을 가하여 검출신호의 세기를 증가시킨 측방 유동 면역분석 디바이스에 대한 것으로, 본 발명에 따른 멤브레인에 압력을 가하여 제조된 측방 유동 면역분석 디바이스는 멤브레인에 압력을 가하지 않은 측방 유동 면역분석 디바이스 대비 월등히 높은 감도를 보인다. 따라서 본 발명은 화학적 처리가 필요없이 매우 간단하게 물리적인 방법으로 검출신호의 세기를 증가시킨 발명으로 대량 생산에 적용되기 적합하며, 추가적인 재료의 사용이 필요하지 않아 원감 절감의 효과도 얻을 수 있어 다양한 표적 물질을 검출하기 위한 측방 유동 면역분석 디바이스에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 측방 유동 면역분석 디바이스를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 측방 유동 면역분석 디바이스에 있어서, 멤브레인 가압에 따른 유량 감소 및 감도 증가 효과를 이론적으로 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 측방 유동 면역분석 디바이스에 있어서, 멤브레인의 일부 영역에 20, 40, 60 또는 80 Kgf의 압력을 가하고 압력에 따른 시료의 유량을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 측방 유동 면역분석 디바이스에 있어서, 멤브레인의 일부 영역에 120 또는 160 Kgf의 압력을 가하고 압력에 따른 시료의 유량을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 CRP(C-Reactive Protein) 검출용 측방 유동 면역분석 디바이스의 압력에 따른 감도를 확인한 결과이다.
도 6 및 도 7은 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 스파이크(Spike) 단백질 펩타이드 검출용 측방 유동 면역분석 디바이스의 압력에 따른 감도를 확인한 결과이다.
도 8은 측방 유동 면역분석 디바이스에 있어서 멤브레인의 압력을 가하는 위치에 따른 감도를 확인한 결과로, 도 8 중 A 및 B는 압력을 가하는 위치를 나타낸 이미지이며(회색 박스는 가압 위치를 나타냄), 도 8 중 C는 압력을 가하는 위치에 따른 검출 신호를 비교한 결과이다((A)는 테스트 라인 위를 가압한 측면 유동 면역분석 디바이스의 결과이고, (B)는 테스트 라인 및 컨트롤 라인 사이를 가압한 측면 유동 면역분석 디바이스의 결과이다.).
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 표적 물질을 포함하는 시료를 투입하는 샘플 패드; 표지자가 결합된 제 1 결합체를 포함하는 접합 패드; 표면 상에 제 2 결합체가 고정된 테스트 라인 및 제 3 결합체가 고정된 컨트롤 라인이 간격을 두고 위치한 멤브레인; 및 흡수 패드;를 포함하는 검출신호의 세기를 증가시킨 측방 유동 면역분석 디바이스를 제공한다.
본 발명은 상기 테스트 라인 및 컨트롤 라인 간격의 멤브레인에 압력을 가하여 기공 크기를 감소시키는 것을 특징으로 한다. 즉 기공 크기를 감소시켜 시료의 흐름에 있어 저항(resistance)를 증가시킴으로써 유량을 감소시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 측방 유동 면역분석 디바이스는 도 1과 같이 샘플 패드, 접합 패드, 멤브레인 및 흡수패드가 지지체 상에 순차적으로 연결되어 있는 구조일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “멤브레인”은 시료가 통과할 수 있는 어떠한 다양한 물질로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 천연, 합성, 또는 합성에 의해 변형된 천연 발생 물질, 예를 들어 폴리사카라이드(예: 셀룰로오스 물질, 종이, 셀룰로오스 아세테이트 및 니트로셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체); 폴리에테르 술폰; 폴리에틸렌; 나일론; 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF); 폴리에스테르; 폴리프로필렌; 실리카; 비닐 클로라이드, 비닐 클로라이드-프로필렌 공중합체 및 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트 공중합체와 같은 중합체와 함께 다공성 중합체 매트릭스에 균일하게 분산된 무기 물질, 예를 들어 불활성화된 알루미나, 규조토, MgSO4, 또는 다른 무기미분 물질; 자연 발생(예: 면) 및 합성(예: 나일론 또는 레이온) 천; 다공성 겔, 예를 들어 실리카겔, 아가로스, 덱스트란 및 젤라틴; 중합체 필름, 예를 들어 폴리아크릴아미드; 등의 물질로부터 형성될 수 있고, 바람직하게는 중합체 물질, 예를 들어 니트로셀룰로오스, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 나일론, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리에스테르 및 폴리프로필렌을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 “샘플 패드”는 분석을 수행할 시료를 수용하여 확산 흐름이 가능한 패드를 의미하며, 분석을 수행할 시료를 수용하여 함유하기에 충분한 다공성을 갖는 물질로 구성된다. 이러한 다공성 물질로는 섬유성 종이, 셀룰로오스 물질로 된 미세 기공 멤브레인, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 유리섬유, 천연발생의 면(cotton), 나일론과 같은 직물 또는 다공성 겔 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 샘플 패드의 기공은 시료내 잉여 성분(예를 들면, 적혈구 세포)을 여과하는 기능을 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “접합 패드”는 표지자가 결합된 제 1 결합체를 포함하며, 상기 제 1 결합체는 표적 물질에만 특이적으로 결합하여 복합체를 형성할 수 있다. 상기 접합 패드는 테스트가 수행될 때까지 상기 제 1 결합체가 기능적으로 안정하도록 유지하는 역할을 담당할 수 있다. 구체적으로, 제 1 결합체가 건조된 상태로 존재하다가 표적 물질을 함유하는 시료(또는 시료 용액)이 흡수됨에 따라 유동성을 부여하여 하류에 위치하는 멤브레인 재질의 검출 영역으로 이동하도록 한다. 이를 위하여, 예를 들면 탄수화물(예를 들면, 수크로오스) 및 재용해제(resolubilization agent)를 함유하는 접합 완충액 조성을 이용할 수 있다. 이 경우, 결합체 입자가 당의 존재하에서 건조될 경우에는 당 분자가 입자 주변에 층을 형성하여 안정화시킬 수 있다. 시료가 접합 패드로 도입됨에 따라, 당 분자는 신속하게 용해되어 제 1 결합체 입자를 유체 흐름 내로 운반할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “흡수 패드”는 상기 멤브레인의 말단 또는 그 가까이에 인접해서 위치할 수 있다. 상기 흡수 패드는 일반적으로 전체 멤브레인을 통해 이동하는 유체 시료를 받아들이며, 멤브레인을 통한 모세관 작용 및 유체의 확산 유동을 촉진하는 데 도움을 줄 수 있다. 또한 과량의 시료 또는 완충용액을 흡수하여 제거해 결과 교란을 방지한다.
본 발명에 있어서, 상기 “지지체”는 샘플 패드, 멤브레인 및 흡수 패드를 지지 및 운반할 수 있다면 어떠한 물질로도 형성될 수 있으나, 일반적으로 상기 멤브레인을 통해 확산하는 시료의 유체가 지지체를 통해 누출되지 않도록 액체 불투과성인 것이 바람직하다. 예컨대, 유리; 중합체물질 예를 들어 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리부타디엔, 폴리비닐클로라이드, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 에폭시드, 메타크릴레이트 및 폴리멜라민 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 멤브레인의 일부 영역에 0, 20, 40, 60 또는 80 Kgf의 압력을 가하고 유량을 확인한 결과 압력이 증가할수록 유량이 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 멤브레인의 일부 영역에 120 또는 160 Kgf의 압력을 가한 후 이에 따른 유량 변화를 확인한 결과, 앞선 결과와 마찬가지로 압력 증가와 비례하여 유량이 감소하였지만 재현성이 떨어지는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명은 상기 테스트 라인 및 컨트롤 라인 간격의 멤브레인에 20 내지 110 Kgf의 압력을 가하는 것을 특징으로 한다. 보다 바람직하게는 20 내지 80 Kgf의 압력을 가할 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 40 Kgf의 압력을 가할 수 있다.
더불어 상기 간격은 검사 결과 즉, 검출 신호 세기에 영향을 주지 않으나, 테스트 라인 및 컨트롤 라인의 결과를 육안으로 한 번에 확인할 수 있을 정도의 거리인 것이 바람직하다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 6mm 간격의 테스트 라인 및 컨트롤 라인 사이에 압력을 가하였다.
상기 간격은 2 내지 20 mm인 것일 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 10 mm일 수 있고, 보다 바람직하게는 3 내지 7 mm일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 6 mm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
멤브레인 전체에 압력을 가하게 되면 멤브레인 내 모든 기공이 변형되어 시료의 유량이 목적하는 바 이상으로 감소될 수 있다. 따라서 본 발명은 테스트 라인 및 컨트롤 라인 사이의 멤브레인에 가하는 압력을 조절하여 제 1 결합체가 결합된 복합체의 표적물질과 테스트 라인에 고정되어 있는 제 2 결합체의 결합 확률을 증가시켜 감도를 향상시킨 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 제 1 결합체, 제 2 결합체 또는 제 3 결합체는 항체, 항원, 핵산 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA-결합성 단백질 및 호르몬-수용체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더불어 상기 표지자는 나노입자, 발색 효소 및 형광 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 “나노입자”는 검출가능한 표지로서 작용하는 나노입자를 의미한다. 상기 나노입자는 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 이리듐(Ir), 로듐(Rh), 루테늄(Ru)의 귀금속; 티타늄(Ti), 지르코늄(Zr), 하프늄(Hf), 바나듐(V), 나이오븀(Nb), 탄탈럼(Ta), 크로뮴(Cr), 몰리브데늄(Mo), 텅스텐(W), 루테늄(Ru), 오스뮴(Os); 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co); 산화마그네슘(MgO), 이산화티타늄(TiO2), 오산화바나듐(V2O5), 산화아연(ZnO), 라텍스 비드(latex bead), 자성 입자(magnetic bead), 양자점(quantum dot), 상방전환나노입자(upconversion nanoparticle, UCNP), 그래핀(graphene)-나노입자 복합체 및 색염색 나노입자(color dyed particles)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 금(Au) 나노입자 또는 라텍스 비드(latex bead), 가장 바람직하게는 금(Au) 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 결합체와 표지자 간의 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있고, 핵산 하이브리드화(nucleic acid hybridization)가 포함될 수 있다. 상기와 같은 표지자는 시험 시료 내 표적 물질의 양과 직접 또는 간접적으로 관련된 검출 가능한 신호가 생성되게 한다.
본 발명에 있어서, 상기 제 1 결합체 및 제 2 결합체는 표적 물질에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서 제 2 결합체는 유체의 흐름에 따라 접합 패드에서 형성된 표적 물질 및 제 1 결합체 복합체의 표적 물질과 결합할 수 있다. 표적 물질의 양에 따라 테스트 라인내 제 2 결합체와 결합된 복합체의 양이 증가하고 축적된 표지자의 신호에 의해 테스트 라인의 발색이 증가된다.
더불어 컨트롤 라인의 제 3 결합체는 표적 물질에는 특이적으로 결합하지 않으나, 제 1 결합체와 결합할 수 있다. 따라서, 제 1 결합체가 표적 물질과 결합되지 않은 관계로 테스트 라인을 지나치더라도 제 3 결합체와 결합되어 컨트롤 라인 상에서 포획될 수 있다. 따라서 상기 컨트롤 라인에서의 응답(response)은 액상 시료가 센서를 적절히 통과하고 있음(즉, 컨트롤 라인의 신호는 제 1 결합체가 존재하고 제 3 결합체가 이러한 제 1 결합체와 결합되어 있음을 지시하므로 면역 검출 센서가 적절히 작동하고 있음)을 의미한다. 결과적으로 표적 물질이 존재할 때는 테스트 라인과 컨트롤 라인이 모두 발색되어 2개의 뚜렷한 선을 확인할 수 있고, 표적 물질이 없을 때는 컨트롤 라인 1개만 발색되므로, 정성 분석이 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 “표적 물질”은 항체, 항원, 핵산 압타머(nucleic acid aptamer), 합텐(hapten), 항원 단백질, DNA, DNA-결합성 단백질(DNA-binding protein), 호르몬, 종양 특이적 마커(tumor-specific marker) 및 조직 특이적 마커(tissue-specific marker)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 "시료"는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 한편으로 이는 검체 또는 배양물(예를 들어 미생물 배양물)을 포함하는 의미이다. 다른 한편으로는 생물학적 및 환경적 시료 양자 모두를 포함하는 의미이다. 더불어 시료는 합성 기원의 검체를 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 측면 유동 면역분석 디바이스의 샘플 패드에 표적 물질을 포함하는 시료를 투입하는 단계;를 포함하는 표적 물질 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 측면 유동 면역분석 디바이스는 향상된 검출한계 및 증가된 세기의 검출신호를 보이는 바, 적은 양의 시료로도 정확하게 표적 물질을 검출할 수 있다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 멤브레인에 가하는 압력에 따른 효과 확인
니트로셀룰로스 멤브레인(mdi)의 일부 영역(멤브레인의 말단으로부터 10mm에 해당하는 영역)에 0, 20, 40, 60 또는 80 Kgf의 압력을 가하고 색소를 물에 용해시킨 용액을 흘려 이의 유량을 확인하였다. 이때 유량은 도 2 중 A에 기재된 식을 통해 산출한 저항(resistance)에 대비하여 확인하였다. 보다 구체적으로 상기 저항은 하기 수학식 1을 통해 산출하였다.
[수학식 1]
Figure pat00002
상기 수학식 1에 있어서, Rp은 압력을 가한 멤브레인의 저항성(resistance)를 나타내며, μ는 시료 용액의 점도(Viscosity)를 나타내고, L은 멤브레인의 길이(Length)를 나타내며, K2는 압력을 가한 멤브레인의 투과도(Permeability)를 나타내고, H2는 압력을 가한 멤브레인의 높이를 나타내며, W는 멤브레인의 너비(Width)를 나타낸다.
멤브레인의 기공의 크기(직경)는 시료의 유량을 결정짓는데 가장 큰 역할을 한다. 기공의 크기가 클수록 투과도(permeability)가 높으며 시료의 유량이 높다. 본 발명과 같이 멤브레인의 일부 영역에 압력을 주면 도 2 중 A와 같이, 멤브레인의 기공이 비탄력적으로 변형되고 압출된 부분의 기공 크기가 작아지며, 유체 투과도 또한 감소하게 된다. 감소된 멤브레인의 높이(H2)와 투과도(K2)는 흐르는 액체에 저항을 가하게 되며, 이로 인해 시료의 유량이 감소된다. 이 저항값은 초기에 가하는 압력의 세기에 비례하며, 압력을 조절함으로써 간단하고 재현성있게 저항값 및 유량을 조절할 수 있다.
따라서 멤브레인의 일부 영역에 20, 40, 60 또는 80 Kgf의 압력을 가하고 압력에 따른 시료의 유량을 확인한 결과, 도 3과 같이 압력이 증가할수록 유량이 감소하는 것을 확인하였다.
또한 멤브레인의 상기와 동일한 영역에 120 또는 160 Kgf로 순차적으로 크게 압력을 가한 후, 이에 따른 유량 감소를 확인하여 도 4에 나타내었다. 그 결과 도 3과 마찬가지로 압력을 가함에 따라 유량이 감소되었으며 그 감소 정도가 도 3보다 더 큰 것을 확인하였다. 하지만 120 Kgf 또는 160 Kgf의 압력을 가한 경우, 앞선 도 3의 결과 대비 시료가 샘플 패드에서 흡수 패드까지 흐르는데 필요한 시간이 더 증가한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 120 Kgf 이상의 압력을 가하는 경우, 시료가 흐르는 데 필요한 시간이 증가되고 그 동안 시료의 증발량이 증가하는 문제점이 야기될 수 있다고 판단되었다.
실시예 2. 표적 물질별 측방 유동 면역분석 디바이스의 제조
2-1. CRP(C-Reactive Protein) 검출용 디바이스 제조
2-1-1. 결합체 합성
금 나노입자 콜로이드 용액(Sigma Aldrich, 20nm) 1.5 mL에 0.5M의 탄산칼륨 완충액(K2CO3 buffer, pH 12)을 넣고, 2mg/ml의 항-CRP 항체(Abcam)와 반응시켰다. 이후 제 1 결합체 표면을 코팅하기 위해 PBS(phosphate buffer saline) 버퍼에 희석된 3% BSA를 반응시켰다. 표면이 BSA로 코팅된 제 1 결합체를 원심분리하여 침전부를 제외한 상층부 액체를 제거하였다. 이에 현탁 완충액(suspension buffer)[PBS, 3% BSA, 0.25% Tween 20]를 넣어 침전물이 용액 내에 부유하게 만들었다.
2-1-2. 측방 유동 면역분석 디바이스의 제조
GFDX(Millipore)를 10X10 mm로 절단하고, 이의 표면에 상기 실시예 1-1-1에서 제조한 결합체를 60 μL 도포하고 건조하여 접합 패드를 제조하였다.
더불어 니트로셀룰로스 멤브레인(mdi)에 테스트 라인(test line)과 컨트롤 라인(control line)을 형성하기 위해, 디스펜서(Dispenser)를 사용하였다. 테스트 라인에는 1 mg/mL의 항-CRP 항체(Abcam)를 고정시켰고, 컨트롤 라인에는 1 mg/mL의 염소 항-마우스(goat anti-mouse) IgG 항체(Sigma Aldrich)를 고정시켜 건조하였다. 이때 상기 테스트 라인과 컨트롤 라인은 사이에 6mm의 간격을 주어 고정하였다.
상기 멤브레인을 3D 프린터로 제작한 지그(jig)에 올리고, 이를 로드셀(load cell) 위에 올렸다. 프레스기에 3D 프린터 및 아크릴로 제작한 스탬프와 지그를 조립시키고 테스트 라인과 컨트롤 라인 사이에 압력을 가할 수 있도록 지그가 올려진 로드셀의 위치를 조정한 후, 멤브레인에 압력을 가해주었다.
플라스틱 코팅지에 상기 멤브레인을 먼저 붙이고 접합 패드와 흡수 패드(Ahlstrom-Munksj
Figure pat00003
)를 적층하였다.
2-2. SARS-CoV-2 스파이크(Spike) 단백질 펩타이드 검출용 디바이스 제조
2-2-1. 결합체 합성
상기 실시예 2-1-1에 있어서, 2mg/ml의 항-CRP 항체(Abcam) 대신 1mg/ml의 항-SARS-CoV-2 스파이크 단백질 펩타이드 항체(Abcam)를 사용하여 동일한 방법으로 결합체를 합성하였다.
2-2-2. 측방 유동 면역분석 디바이스의 제조
상기 실시예 2-1-2에 있어서, 테스트 라인의 항-CRP 항체(Abcam) 대신 항-SARS-CoV-2 스파이크 단백질 펩타이드 항체(Abcam)를 사용하여 동일한 방법으로 측방 유동 면역분석 디바이스를 제조하였다.
실시예 3. 본 발명에 따른 측면 유동 면역분석 디바이스의 압력에 따른 효과 확인
3-1. CRP 검출용 측방 유동 면역분석 디바이스
LFA에 시료를 투입하면 접합 패드를 지나 멤브레인을 통해 흐르고, 흐르는 동안 시료 내에 있는 타겟은 제 1 결합체와 결합한 복합체를 형성한다. 상기 흐름은 대류 흐름(convective flow)이며, 상기 복합체는 이를 통해 멤브레인의 한쪽 끝에서부터 테스트 라인과 컨트롤 라인을 통과하여 반대편 끝까지 이동한다. 대류 흐름이 일어나는 동안 멤브레인의 기공 내에서는 확산(diffusion)으로 인한 복합체의 확산 이동(diffusive transport) 또한 발생하는데, 이 이동은 물 분자와의 충돌로 인한 브라운 운동(Brownian motion)에 의해 무작위하게 일어나며, 시간이 지날수록 확산으로 인해 원래 있었던 위치에서부터 이동하는 확산 거리(diffusion distance)가 길어진다. 도 2 중 B의 dx성분은 주로 주흐름(main flow)의 대류 이동(속도)(convective transport)에 의해 결정되고, dy성분은 확산 이동에 의해 결정되는데 주흐름의 대류 이동이 너무 빨리 일어나는 경우(유량이 높은 경우), 복합체가 dx방향으로 이동하는 동안 dy방향으로 분산될 시간이 부족하여 테스트 라인에 고정되어 있는 제 2 결합체와 결합할 확률이 감소한다. 반대로 주흐름의 대류 이동이 느리게 일어나는 경우에는(유량이 낮은 경우) 동일한 dy거리만큼 이동하는데 필요한 시간이 증가하기 때문에 복합체가 확산 이동으로 인해 이동할 수 있는 시간이 늘어나고 이로 인해 원래 있었던 위치에서 dy방향으로 움직이는 분산 거리(diffusion distance)가 증가한다. 결론적으로 테스트 라인에 고정되어 있는 제 2 결합체와 결합할 확률이 증가된다.
본 발명은 상기의 원리를 통해 LFA에 투입된 시료의 유량을 감소시켜 유효 농도를 높이는 효과를 얻고, 이로 인해 검출신호의 세기를 증가시켜, LFA의 검출한계를 낮출 수 있다.
이를 실제 확인하고자 상기 실시예 2-1의 CRP 검출용 측방 유동 면역분석 디바이스에 있어서 멤브레인에 가한 압력에 따른 감도를 확인하였다. 이때 20, 40 또는 60 Kgf의 압력을 가하여 제조한 디바이스의 샘플패드에 시료내 CRP의 농도별(0, 0.5 또는 10 μg/mL)로 포함하는 시료를 투입하여 테스트 라인의 발색 신호 세기(signal intensity)를 확인하였다. 그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이 멤브레인에 가한 압력이 증가함에 따라 테스트 라인의 발색 신호 세기가 더 강하게 나타남을 확인하였다.
더불어 0 내지 0.25 μg/mL의 CRP 농도를 선형 구간으로 설정하여 검출한계를 계산하였다. 멤브레인에 압력을 가하지 않은 실험군(0 Kgf)의 경우 검출한계가 0.00484 μg/mL였으나, 멤브레인에 압력을 가한 실험군은 압력이 20, 40 또는 60 Kgf로 증가함에 따라 0.0240, 0.0210 및 0.0298 μg/mL로 검출 한계가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 멤브레인에 가해지는 힘이 클수록 검출한계가 낮아지는 것은 아님을 뜻하며, 비교해본 조건들 중에서는 40 Kgf의 압력을 가한 실험군이 압력을 가하지 않은 실험군보다 약 2배 이상 향상된 검출한계를 보이는 것으로 확인되었다.
3-2. SARS-CoV-2 스파이크 단백질 펩타이드 검출용 디바이스
더불어 상기 실시예 2-2의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 펩타이드 검출용 디바이스에 있어서 멤브레인에 가한 압력에 따른 감도를 확인하였다. 이때 멤브레인에 0 또는 40 Kgf의 압력을 가하여 제조한 디바이스의 샘플패드에 시료내 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 펩타이드의 농도별(0, 50, 100, 200, 500, 1000 ng/mL)로 포함하는 시료를 투입하여 테스트 라인의 발색 신호 세기를 확인하였다. 그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이 멤브레인에 40 Kgf의 압력을 가한 실험군의 발색 세기가 더 강하게 나타남을 확인하였다. 더불어 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 펩타이드를 0, 0.1 또는 1μg/mL로 포함하는 시료를 투여하여 각 실험군의 검출 신호를 확인해 본 바, 도 6과 마찬가지로 40 Kgf의 압력을 가한 실험군이 더 강한 신호를 보이는 것을 확인하였다.
더불어 0.05부터 0.2 μg/mL의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 펩타이드 농도를 선형 구간으로 설정하여 검출한계를 계산하였다. 멤브레인에 압력을 가하지 않은 실험군(0 Kgf)의 경우 검출한계가 0.0240 μg/mL였지만, 멤브레인에 40 Kgf의 압력을 가함에 따라 검출 한계가 0.0178 μg/mL로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 멤브레인에 40 Kgf의 압력을 가한 실험군이 압력을 가하지 않은 실험군보다 약 1.3배 이상 향상된 검출한계를 보이는 것으로 확인되었다.
실시예 4. 본 발명에 따른 측면 유동 면역분석 디바이스의 압력을 가하는 위치에 따른 효과 확인
본 발명에 따른 측방 유동 면역분석 디바이스에 있어서, 멤브레인의 압력을 가하는 위치에 따른 감도를 확인하였다. 이를 위하여 실시예 2-1의 CRP 검출용 측방 유동 면역분석 디바이스에 있어서, 멤브레인의 테스트 라인 위 또는 본 발명과 같이 테스트 라인 및 컨트롤 라인 사이에 40 Kgf의 압력을 가하여 제조하고(도 8 중 A 및 B 참고), 각 실험군의 검출 세기를 비교하였다.
그 결과 도 8 중 C에 나타낸 바와 같이, 테스트 라인 위에 동일한 압력을 가하여 제조한 측방 유동 면역 분석 디바이스((A))보다 본 발명의 테스트 라인 및 컨트롤 라인 사이에 40Kgf의 압력을 가하여 제조한 측방 유동 면역분석 디바이스((B))가 더 강한 세기의 검출 신호를 보이는 것을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 측방 유동 면역분석 디바이스에 있어서, 멤브레인에 압력을 가하는 위치는 테스트 라인 및 컨트롤 라인 사이가 가장 바람직한 것을 확인하였다.
종합적으로 본 발명은 멤브레인의 기공 크기 변화를 통해 투입된 시료의 유량을 조절하여 검출신호 세기를 증가시킨 측면 유동 면역분석 디바이스에 대한 것으로, 보다 구체적으로 상기 멤브레인의 기공 크기 변화는 멤브레인의 테스트 라인 및 컨트롤 라인 사이 영역에 20 내지 110 Kgf 압력을 가하여 야기하며, 이와 같이 멤브레인에 압력을 가하여 제조한 측면 유동 면역분석 디바이스의 감도가 압력을 가하지 않은 디바이스 대비 월등히 증가되었음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 검출신호의 세기를 증가시킨 측방 유동 면역분석 디바이스는 화학적 처리가 필요없이 매우 간단하게 물리적인 방법으로 검출신호의 세기를 증가시킨 발명으로 대량 생산에 적용되기 적합하며, 추가적인 재료의 사용이 필요하지 않아 원감 절감의 효과도 얻을 수 있어 다양한 표적 물질을 검출하기 위한 측방 유동 면역분석 디바이스에 유용하게 활용할 수 있다.

Claims (9)

  1. 표적 물질을 포함하는 시료를 투입하는 샘플 패드;
    표지자가 결합된 제 1 결합체를 포함하는 접합 패드;
    표면 상에 제 2 결합체가 고정된 테스트 라인 및 제 3 결합체가 고정된 컨트롤 라인이 간격을 두고 위치한 멤브레인; 및
    흡수 패드;를 포함하는 검출신호의 세기를 증가시킨 측방 유동 면역분석 디바이스.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 간격의 멤브레인에 압력을 가하여 기공 크기를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 측면 유동 면역분석 디바이스.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 압력은 20 내지 110 Kgf인 것을 특징으로 하는, 측면 유동 면역분석 디바이스.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 결합체, 제 2 결합체 또는 제 3 결합체는 항체, 항원, 핵산 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA-결합성 단백질 및 호르몬-수용체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 측면 유동 면역분석 디바이스.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 결합체 및 제 2 결합체는 표적 물질에 특이적으로 결합하며, 상기 제 3 결합체는 상기 제 1 결합체에 결합하는 것을 특징으로 하는, 측면 유동 면역분석 디바이스.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 표지자는 나노입자, 발색 효소 및 형광 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 측면 유동 면역분석 디바이스.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 표적 물질은 항체, 항원, 핵산 압타머(nucleic acid aptamer), 합텐(hapten), 항원 단백질, DNA, DNA-결합성 단백질(DNA-binding protein), 호르몬, 종양 특이적 마커(tumor-specific marker) 및 조직 특이적 마커(tissue-specific marker)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 측면 유동 면역분석 디바이스.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 시료는 전혈(whole blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 측면 유동 면역분석 디바이스.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 측면 유동 면역분석 디바이스의 샘플 패드에 표적 물질을 포함하는 시료를 투입하는 단계;를 포함하는 표적 물질 검출방법.
KR1020210086452A 2021-07-01 2021-07-01 검출신호 세기를 증가시킨 측방 유동 면역분석 디바이스 및 이를 이용한 표적 물질 검출 방법 KR102560727B1 (ko)

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