KR101702117B1 - 광범위한 농도범위의 생체물질 농도 측정이 가능한 면역크로마토그래피 스트립 센서 - Google Patents

광범위한 농도범위의 생체물질 농도 측정이 가능한 면역크로마토그래피 스트립 센서 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광범위한 농도범위의 생체물질 농도 측정이 가능한 면역크로마토그래피 스트립 센서 및 이 센서를 사용한 광범위한 농도범위의 생체물질의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 센서를 이용하는 검출 방법은 광범위한 농도 범위에서 항원의 농도를 정확하게 측정할 수 있으며, 저비용, 신속성 및 간편성을 구현할 수 있으므로, 신속성 및 고민감도가 요구되는 POCT(point of care test, 현장검사)에 적합하다.

Description

광범위한 농도범위의 생체물질 농도 측정이 가능한 면역크로마토그래피 스트립 센서{Lateral Flow Assay Strip Senor for Measurement of Hihg Concentration of Biomolecule}
본 발명은 광범위한 농도범위의 생체물질 농도 측정이 가능한 면역크로마토그래피 스트립 센서 및 이 센서를 사용한 광범위한 농도범위의 생체물질의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
CRP(C-reactive protein)는 잘 알려진 급성 염증의 바이오마커로서, 펜트라신(pentraxin)의 형태로 5개의 반복 구조로 이루어지며, 인터루킨-1 및 인터루킨-6에 의해 자극되면 간에서 합성된다. 과거 수십년 동안, 혈장에서의 CRP의 수준을 측정함으로써 이를 심근경색, 암, 심혈관질환, 당뇨의 위험을 예측하는데 이용하거나 항생제 치료 지침에 사용하기 위한 연구가 진행되었다(1-9). 건강한 정상 성인에서 CRP의 수치는 평균적으로 0.8 μg/mL 이지만, 염증반응이 발생하면 이의 수치는 100 mg/L 이상으로 증가한다. 통상적으로 가벼운 염증이나 바이러스 감염의 경우 10-50 μg/mL 이며, 활성 염증 또는 박테리아의 감염의 경우 50-200 μg/mL 이고, 중증 염증 또는 손상의 경우 CRP 농도는 200 μg/mL을 초과하게 된다. FDA는 20-500 μg/mL의 농도 범위의 경우 염증에서의 CRP 측정 및 심혈관질환의 신뢰성 있는 바이오 마커이며 잠재적 위험 예측자인 hs-CRP(high sensitivity CRP) 측정을 권고하고 있다. 이의 측정에서 요구되는 농도 범위는 1-10 μg/mL이다.
급성 염증 또는 1차 진료의 경우, 신속한 진단 또는 인체 체액내에서 CRP 수준의 연속적인 모니터링을 위해서는, 측정 범위의 충족, 신속성, 정확성, 간편성 및 저비용 정량 측정 등이 요구된다(10-11). 통상적으로 신속한 정량적 CRP 분석으로서는 폴리스티렌 비드를 갖는 Immunoturbidimetric 방법 또는 Imunonephelometry 방법, 금 나노입자 응집(agglomeration) 분석법 등이 자주 이용된다. 또한, 최근에 광범위한 농도 범위의 CRP 테스트를 도입함으로써 광범위한 농도를 측정할 수 있도록 확장하였다. 예를 들어, DIAgam XS Cardio NanoGold C-reactive protein (CRP) 방법의 경우 DIAgam laboratory (Lille, France)으로부터 제공되는 시약을 사용하여 0.42 - 265 μg/mL의 범위 까지 측정이 가능하다. DIAgam 시약은 시료를 희석하는 단계와 Olympus AU640생화학 분석기를 사용하여 0.1 - 160 μg/mL의 농도범위에 걸친 전농도 범위를 측정한다. 이들 방법들은 자동화된 분석기를 사용하여 정확한 측정값을 제공하지만, 분석공정을 수행하기 위해 값비싼 장비와 숙련된 인력이 요구된다. 이러한 한계점을 극복하기 위한 방안으로서 현장 현시 시스템에 적합한 저비용, 짧은 분석 시간 및 간단한 조작 기술로 CRP를 검출하는 방법이 제안되어 왔다. 신속하고 고민감도의 POCT(point of care test, 현장검사) 기법 중의 하나로서, 미세유체역학칩(microfluidic chip)이 CRP를 측정하기 위한 도구로 광범위하게 연구되어 왔다. Gervais 등에 의한 연구에서(12), 미세유체역학칩은 3분 동안 10 ng/mL 농도의 CRP를 검출할 수 있었고, 14분 동안은 1 ng/mL 이하 농도의 CRP를 검출할 수 있었다. Jonsson 등이 수행한 연구에서(13), 측방 유동 폴리머 칩은 102의 동적 범위를 가지며 2.6 ng/mL의 검출 한계를 보유하였다. 또한, Gervais 등에 의한 보고에 따르면(12), 0.01 - 1.0 μg/mL 범위에서 CRP 농도가 증가하면 CRP 농도에서 형광신호 강도가 감소하게 된다. 상기한 연구결과들에서 나타난 바와 같이, 미세유체역학칩은 매우 신속하며 저농도에서 측정이 가능하지만, 고농도의 CRP 측정, 대량생산 및 상대적인 비용의 면에서 한계를 가지고 있다(14-15). 이러한 한계점을 극복하기 위해서, CRP 분석을 위해 수직 유동 분석법(vertical flow assay, VFA)을 개발하였다(16). 이 연구에서는 1분 내에서 측방 유동 분석법(lateral flow assay, LFA) 스트립 바이오 센서 보다 더 넓은 동적 범위를 사용하였으나, 더 넓은 범위의 CRP를 커버하지는 못하였다.
LFA 스트립 바이오센서는 신속하고, 저비용이며 1단계 면역분석법 중의 하나이다(17). CRP 테스트 스트립에 기초한 수 종류 타입의 LFA가 상업적으로도 구입이 가능하지만, 샌드위치 면역분석법에서 분석물의 매우 높은 농도에 기인한 위음성 결과가 나오는 후크 효과(hook effect) 때문에 인간 혈청 내에서 CRP 농도 범위를 커버할 수 없는 단점을 갖는다(18-19). 이러한 이유로, 대부분의 상업용 LFA 스트립 센서는 고민감도 CRP (hsCRP) 또는 심장 CRP (cCRP)의 진단에 사용된다. 그러나, Leung 등의 연구에서(20), 지시자로서 금나노입자(AuNPs)를 사용한 “디지털-스타일” 분석법 또는 “바코드-스타일”분석법은 15분 내에 테스트에서 붉은색 라인의 수를 계수함으로써 저농도의 CRP를 검출하여, 초기 CVD 위험도 또는 박테리아 및 바이러스 감염을 예측하는 반-정량(semi-quantitative) 측방 유동 분석법을 제공한다. 이 LFA 센서는 측정목적이 각 질병에 따라 상이하지만, 멀티-라인 측정법을 사용하여 동일한 CRP를 검출하였다. 광범위한 농도범위 0 - 500 mg/L를 커버할 수 있는 CRP 분석을 위한 1 단계 면역센서 개발이 요구된다. 또한, LFA 바이오센서는 사용편의성, 상업적 접근용이성 및 제조비용과 같은 신속한 진단 센서 또는 현장검사의 질을 평가하기 위한 중요한 요소를 갖는다(21).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
1. Triant VA, Meigs JB, Grinspoon SK. Journal of acquired immune deficiency syndromes 2009;51:268-73. 2. Patrick L, Uzick M. A Journal of clinical therapeutic 2001;6:248-71. 3. Ridker PM. Circulation 2003;107:363-9. 4. Kushner I, Broder ML, Karp D. The Journal of clinical investigation 1978;61:235-42. 5. Ridker PM. Cardiology patient page. Circulation 2003;108:e81-5. 6. Dufour JF. Hepatology 2013;57:2103-5. 7. Mazhar D, Ngan S. QJM : monthly journal of the Association of Physicians 2006;99:555-9. 8. Kasapis C, Thompson PD. Journal of the American College of Cardiology 2005;45:1563-9. 9. Rifai N, Ridker PM. Clinical chemistry 2001;47:403-11. 10. Junker R, Schlebusch H, Luppa PB. Deutsches Arzteblatt international 2010;107:561-7. 11. Pfafflin A, Schleicher E. Analytical and bioanalytical chemistry 2009;393:1473-80. 12. Gervais L, Delamarche E. T. Lab on a chip 2009;9:3330-7. 13. Jonsson C, Aronsson M, Rundstrom G, Pettersson C, Mendel-Hartvig I, Bakker J, et al. Lab on a chip 2008;8:1191-7. 14. Rivet C, Lee H, Hirsch A, Hamilton S, Lu H. Chemical Engineering Science 2011;66:1490-507. 15. Yager P, Edwards T, Fu E, Helton K, Nelson K, Tam MR, Weigl BH. Nature 2006;442:412-8. 16. Oh YK, Joung HA, Kim S, Kim MG. Lab Chip 2013; 13:768-72 17.Posthuma-Trumpie GA, Korf J, Amerongen Av. Anal Bioanal Chem 2009;393:569-82 18. Fernando SA, Wilson GS. Journal of immunological methods 1992;151:47-66. 19. Rodbard D, Feldman Y, Jaffe ML, Miles LE. Immunochemistry 1978;15:77-82. 20. Leung W, Chan CP, Rainer TH, Ip M, Cautherley GW, Renneberg R. Journal of immunological methods 2008;336:30-6. 21. Luong JH, Male KB, Glennon JD. Biotechnology advances 2008;26:492-500.
본 발명자들은 광범위한 농도 범위를 갖는 생체물질에 대해서도 정확한 농도의 측정이 가능한 바이오 센서를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 면역크로마토그래피 법을 기초로 한 측방 유동 분석 스트립 센서에서 콘트롤 라인(control line)과 테스트 라인(test line)의 사이에 항원 라인(antigen line)을 추가함으로써 광범위한 농도 범위의 항원의 농도를 정확하고 신속하게 측정할 수 있음을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 광범위한 농도 범위에서 항원의 농도를 측정하기 위한 측방 유동 분석 스트립 센서를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 측방 유동 분석 스트립 센서를 사용하여 광범위한 농도 범위에서 항원의 농도를 측정하기 위한 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 광범위한 농도 범위에서 항원의 농도를 측정하기 위한 측방 유동 분석 스트립 센서로서, 상기 측방 유동 분석 스트립 센서는 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 순차적으로 연결된 구조를 포함하고, 상기 컨쥬게이트 패드에는 나노입자와 상기 항원에 결합하는 검출항체가 연결된 나노입자-검출항체 컨쥬게이트가 포함되어 있고, 상기 멤브레인상에는 상기 컨쥬게이트 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 테스트 라인, 항원 라인 및 콘트롤 라인이 순차적으로 형성되어 있고, 상기 테스트 라인에는 상기 항원에 결합하는 포획항체가 고정되어 있고, 상기 항원 라인에는 상기 항원이 고정되어 있고, 상기 콘트롤 라인에는 상기 검출항체에 결합하는 2차 항체가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 측방 유동 분석 스트립 센서를 제공한다.
본 발명의 측방 유동 분석 (Lateral Flow Assay, LFA) 스트립 센서는 샘플 패드(sample pad), 컨쥬게이트 패드(conjugate pad), 멤브레인(membrane) 및 흡수 패드(Absorption pad)가 순차적으로 연결된 구조를 포함한다.
본 발명의 센서에서 상기 “샘플 패드”는 분석을 행할 샘플을 수용하여 확산 흐름이 가능한 패드를 의미하며, 분석을 행할 샘플을 수용하여 함유하기에 충분한 다공성을 갖는 물질로 구성된다. 이러한 다공성 물질로는 섬유성 종이, 셀룰로오스 물질로 된 미세 기공 멤브레인, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 유리섬유, 천연발생의 면(cotton), 나일론과 같은 직물 또는 다공성 겔 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 센서에서 상기 “컨쥬게이트 패드”는 샘플 패드로부터 확산되어 이동되는 샘플을 수용하며, 동시에 나노입자와 항원에 결합하는 검출항체가 연결된 “나노입자-검출항체 컨쥬게이트”가 포함되어 있는 패드이다. 컨쥬게이트 패드는 샘플 패드와 마찬가지로 확산 흐름이 가능한 물질로 구성된다.
상기 컨쥬게이트 패드에 포함된 “나노입자-검출항체 컨쥬게이트”의 나노입자는 검출가능한 표지로서 작용하는 나노입자를 의미한다. 상기 나노입자는 바람직하게는 금속의 나노입자이며, 상기 금속으로는 예를 들어 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 이리듐(Ir), 로듐(Rh), 루테늄(Ru)의 귀금속; 티타늄(Ti), 지르코늄(Zr), 하프늄(Hf), 바나듐(V), 나이오븀(Nb), 탄탈럼(Ta), 크로뮴(Cr), 몰리브데늄(Mo), 텅스텐(W), 루테늄(Ru), 오스뮴(Os)의 전이금속; 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co)등의 금속; 산화마그네슘(MgO), 이산화티타늄(TiO2), 오산화바나듐(V2O5), 산화아연(ZnO)의 금속산화물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 나노입자는 가장 바람직하게는 금(Au) 나노입자이다.
상기 검출항체는 분석하고자하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 결합 특이성을 보유한다면 항체의 단편도 포함하는 의미이다.
상기 검출항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 모노클로날 항체를 사용한다.
상기 나노입자와 검출항체의 결합은 예컨대 이온결합, 공유결합, 금속결합, 배위결합, 수소결합, 및 반데르발스 결합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 센서에서 상기 “멤브레인”은 샘플 물질이 통과할 수 있는 어떠한 다양한 물질로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 천연, 합성, 또는 합성에 의해 변형된 천연 발생 물질, 예를 들어 폴리사카라이드(예: 셀룰로오스 물질, 종이, 셀룰로오스 아세테이트 및 니트로셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체); 폴리에테르 술폰; 폴리에틸렌; 나일론; 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF); 폴리에스테르; 폴리프로필렌; 실리카; 비닐 클로라이드, 비닐 클로라이드-프로필렌 공중합체 및 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트 공중합체와 같은 중합체와 함께 다공성 중합체 매트릭스에 균일하게 분산된 무기 물질, 예를 들어 불활성화된 알루미나, 규조토, MgSO4, 또는 다른 무기 미분 물질; 자연 발생(예: 면) 및 합성(예: 나일론 또는 레이온) 천; 다공성 겔, 예를 들어 실리카겔, 아가로스, 덱스트란 및 젤라틴; 중합체 필름, 예를 들어 폴리아크릴아미드; 등의 물질로부터 형성될 수 있다. 바람직하게는 상기 멤브레인은 중합체 물질, 예를 들어 니트로셀룰로오스, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 나일론, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리에스테르 및 폴리프로필렌을 포함한다.
본 발명의 센서에서 상기 “흡수패드”는 상기 멤브레인의 말단에 또는 그 가까이에 인접해서 위치할 수 있다. 흡수 패드는 일반적으로 전체 멤브레인을 통해 이동하는 유체 샘플을 받아들인다. 흡수 패드는 멤브레인을 통한 모세관 작용 및 유체의 확산 유동을 촉진하는 데 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 센서는 상기한 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 동일한 지지체상에 순차적으로 연결되어 구성된다.
상기 지지체는 상기한 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드를 지지 및 운반할 수 있다면 어떠한 물질로도 형성될 수 있으나, 일반적으로 상기 멤브레인을 통해 확산하는 샘플의 유체가 지지체를 통해 누출되지 않도록 액체 불투과성인 것이 바람직하다. 예컨대, 유리; 중합체물질 예를 들어 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리부타디엔, 폴리비닐클로라이드, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 에폭시드, 메타크릴레이트 및 폴리멜라민 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 센서에서 상기 멤브레인상에는 상기 컨쥬게이트 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 테스트 라인(test line), 항원 라인(antigen line) 및 콘트롤 라인(control line)이 순차적으로 형성되어 있다.
본 발명의 센서에서 상기 “테스트 라인”에는 상기 항원에 결합하는 포획항체가 고정되어 있다.
본 발명의 센서에서 상기 “항원 라인”에는 상기 항원이 고정되어 있다.
바람직하게는 상기 항원 라인에 고정된 항원은 멤브레인상에 고정된 포획항체를 매개로 하여 고정된다. 상기 항원 라인에서 항원을 멤브레인상에 직접 고정시키기 보다는 포획항체상에 결합시켜 고정시키게 되면 나노입자-검출항체와의 결합이 용이하게 되도록 항원을 적절한 방향으로 노출시킬 수 있어, 결과적으로 센서의 항원 검출 성능을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 센서에서 상기 “콘트롤 라인”에는 상기 검출항체에 결합하는 2차 항체가 고정되어 있다. 콘트롤 라인의 2차 항체는 나노입자-검출항제 또는 나노입자-검출항체-항원 복합체에 결합하여 이에 대한 검출 신호를 발생시킨다.
본 명세서에서 용어 “항원”은 농도 또는 존재 여부를 분석하고자 하는 대상물질을 지칭하는 의미이며, 예컨대 단백질, 펩타이드, 미생물, 아미노산, 핵산, 호르몬, 스테로이드, 비타민, 약물, 박테리아, 바이러스 입자 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 항원은 가장 바람직하게는 CRP(C-reactive protein)이다.
본 명세서에서 용어 “샘플”은 상기 분석하고자 하는 항원을 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 물질을 의미한다. 예컨대, 혈액, 간질액, 타액, 접안 렌즈 유체, 뇌척수액, 땀, 소변, 젖, 복수, 점액, 비강유체(nasal fluid), 객혈, 관절혈액, 복강액, 질액, 월경분비물, 양수, 및 정액을 포함하며, 생리적 유체와 같은 어떠한 생물학적 공급원으로부터도 유래될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 측방 유동 분석 스트립 센서를 사용하여 광범위한 농도 범위에서 항원의 농도를 측정하기 위한 방법으로서,
상기 측방 유동 분석 스트립 센서는 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 순차적으로 연결된 구조를 포함하고,
상기 컨쥬게이트 패드에는 나노입자와 상기 항원에 결합하는 검출항체가 연결된 나노입자-검출항체 컨쥬게이트가 포함되어 있고,
상기 멤브레인상에는 상기 컨쥬게이트 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 테스트 라인, 항원 라인 및 콘트롤 라인이 순차적으로 형성되어 있고,
상기 테스트 라인에는 상기 항원에 결합하는 포획항체가 고정되어 있고,
상기 항원 라인에는 상기 항원이 고정되어 있고,
상기 콘트롤 라인에는 상기 검출항체에 결합하는 2차 항체가 고정되어 있으며, 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다:
(a) 분석하고자 하는 항원을 기지의 농도로 포함하는 샘플을 상기 샘플 패드에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 테스트 라인, 항원 라인 및 콘트롤 라인에서 생성되는 신호를 측정하는 단계;
(c) 분석하고자 하는 항원을 상기 단계 (a)에서와 다른 기지의 농도로 포함하는 샘플들에 대하여 상기 단계 (a) 및 (b)를 행하는 단계;
(d) 상기 단계 (a) 내지 (c)를 통해 측정한 신호 값들을 처리하여 검량선을 산출하는 단계;
(e) 분석하고자 하는 항원이 미지의 농도로 포함된 샘플을 상기 샘플 패드에 접촉시키는 단계;
(f) 상기 테스트 라인, 항원 라인 및 콘트롤 라인에서 생성되는 신호를 측정하는 단계; 및
(g) 측정된 신호값과 상기 단계 (d)의 검량선을 사용하여 미지의 농도의 항원의 농도를 산출하는 단계.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 단계 (g)에서, 상기 항원 라인에서 측정된 신호값과 상기 콘트롤 라인에서 측정된 신호값을 비교하여, 항원 라인의 신호값이 콘트롤 라인의 신호값 보다 큰 경우 산출된 항원의 농도값 중에서 보다 낮은 값을 선택하고, 항원 라인의 신호값이 콘트롤 라인의 신호값 보다 작은 경우 산출된 항원의 농도값 중에서 보다 큰 값을 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 센서를 사용하여 광범위한 농도범위의 항원의 농도를 측정하고자 하는 경우, 후크 효과(hook effect) 때문에 테스트 라인에서의 신호는 종(bell) 모양의 신호 강도 곡선이 얻어진다. 즉, 테스트 라인의 신호 강도는 분석 항원의 농도가 증가할수록 증가하며, 임계점 보다 높은 농도에서 다시 감소하여 종 모양의 곡선을 형성한다. 따라서, 하나의 샘플 측정에 의해 생성되는 신호 강도는 2가지의 상이한 농도 결과를 지시할 수 있다(도 5의 패널 B 참조). 실제의 농도 값을 결정하기 위해서 콘트롤 라인 및 항원 라인의 신호 강도를 비교하였다. 최적의 조건하에서, 항원의 농도가 비교적 낮은 샘플의 경우 콘트롤 라인의 신호 강도가 항원 라인의 신호 강도 보다 낮게 되며, 반대로 항원의 농도가 높은 샘플에서는 이와 반대로 항원 라인의 신호 강도가 콘트롤 라인의 신호 강도보다 낮게 되는 신호 강도 패턴을 보여준다. 이러한 현상을 이용하여, 생물학적 샘플에서 광범위한 농도 범위를 갖는 항원의 농도를 정확하게 측정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 방법에서 분석 가능한 상기 항원의 농도범위는 1 ng/mL - 500 μg/mL이다.
본 발명은 광범위한 농도범위의 생체물질 농도 측정이 가능한 면역크로마토그래피 스트립 센서 및 이 센서를 사용한 광범위한 농도범위의 생체물질의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 센서를 이용하는 검출 방법은 광범위한 농도 범위에서 항원의 농도를 정확하게 측정할 수 있으며, 저비용, 신속성 및 간편성을 구현할 수 있으므로, 신속성 및 고민감도가 요구되는 POCT(point of care test, 현장검사)에 적합하다.
도 1은 항원이 도입된 LFA 스트립 센서의 모식도이다. 패널 A는 구조를, 패널 B는 검출 원리를, 패널 C는 데이터 프로세싱 과정을 보여준다.
도 2는 항원 라인상의 전-처리한 항체에 CRP를 직접 결합시킨 경우와 PEG-CRP를 결합시킨 경우 사이에서 1μg/mL CRP를 측정한 신호 강도를 비교한 결과이다. 패널 A를 이미지이고, 패널 B는 그래프이다.
도 3은 전-결합시킨 항체의 타입에 의한 항원 라인의 신호 강도를 비교한 결과이다.
도 4는 데이터 프로세싱의 전체의 과정을 보여준다.
도 5의 패널 A는 다양한 농도의 CRP를 측정한 이미지이다. 패널 B는 테스트 라인, 항원 라인 및 콘트롤 라인의 3가지 라인의 신호 강도를 로그 단위로 플로팅한 결과이다. 패널 C는 데이터를 프로세싱한 후의 측정 결과이다.
도 6은 10배 희석한 50개의 임상 샘플을 테스트한 결과이다.
도 7은 농도에 따른 혈청 내 미오글로빈 측정 결과이다. 패널 A는 이미지이고, 패널 B는 그래프이다.
도 8은 데이터 프로세싱이 완료된 후 로그 단위 미오글로빈 농도에 따른 분석 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 방법
1. 실험재료
CRP가 포함되지 않은 혈청(90R-100), surfactant 10G (95R-103), 및 우혈청알부민(BSA)은 Fitzerald Industries International (Acton, MA, USA)으로부터 구입하였다. CRP는 Wako Chemicals (309-51191; Osaka, Japan)으로부터 구입하였고, 항-CRP 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체는 Abcam Inc. (Cambridge, MA, USA)으로부터 구입하였다. 니트로셀룰로오스 멤브레인은 Millipore (HFB02404; Billerica, MA, USA)으로부터 구입하였다. 샘플 패드(P/N BSP-133-20) 및 흡수 패드는 Pall Co. (Port Washington, NY, USA)으로부터 구입하였다. 인터 패드 (Fusion5 8151-6621)는 Whatman (Kent, UK)으로부터 구입하였다. 각각의 금 콜로이드 용액은 BB International (EM.GC10, 15, 20, 40; Cardiff, UK)으로부터 구입하였다. 폴리비닐피롤리돈 (PVP10), 수크로오스 (S7903), 소디엄 아지드 (S8032) 및 다른 화합물들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 모든 완충액과 시약 용액들은 Milli-Q 정수시스템을 사용하여 만들어진 정제수로 제조하였다. 라미네이트된 카드는 Millipore (HF000MC100)로부터 얻었다.
2. AuNP-항체 컨쥬게이트 용액의 제조
AuNP 컨쥬게이트를 제조하기 위해, 항-CRP 항체를 포함한 PBS(1 mg/mL 농도) 10 를 1 mL의 20 nm AuNP 콜로이드와 보레이트 완충액 (0.1 M, pH 8.5)의 혼합물에 첨가하였다. 상온에서 30분간 인큐베이션한 후에 10 mg/mL의 BSA를 포함하는 PBS 0.1 mL를 AuNP 표면을 블로킹하기 위해 용액에 첨가하엿다. 4℃에서 60분간 인큐베이션한 후에 혼합물을 HANIL microcentrifuge(micro 17TR; Quasar Instruments, Colorado Springs, CO, USA)를 사용하여 12,000 rpm으로 10℃에서 15분간 원심분리를 행하였다. 상등액을 버리고, 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.4)를 AuNP 컨쥬게이트에 가하여 재현탁하였다. 원심분리 및 현탁 과정을 2회 반복하여 최종 현택용액으로서, 0.1％ BSA, 0.05％ NaN3, 1％ 수크로오스를 포함하는 10 mM Tris-HCl 완충액을 제조하였다.
3. LFA(Lateral Flow Immunoassay) 센서의 제조-1
LFA 센서는 4 가지의 구성요소, 즉 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 니트로셀룰로오스 멤브레인 및 흡수 패드로 이루어진다. 대부분의 구성요소들은 전형적으로는 불활성 플라스틱 예컨대 폴리에스테르로 구성되는 통상적인 백킹 카드(backing card) 상에 고정된다. NC 멤브레인(0.25 cm x 30 cm) 상의 각각 다른 영역에 포획 항체 및 CRP 또는 PEG-CRP 또는 포획 항체, 콘트롤 항체들을 디스펜서(DCI100; Zeta Corporation, Kyunggi-do, South Korea)를 사용하여 고정시켰다. 항원 라인에서 항체(1 mg/mL)를 셀룰로오스 멤브레인에 1 μL/cm 양으로 고정시킨 후, 순차적으로 CRP(1 mg/mL) 항원을 그 위에 고정시켰다. 각 영역사이의 간격은 약 3 mm로 하였다. 로딩이 완료된 멤브레인은 Temperature & humid 챔버에서 28℃으로 1 시간 동안 건조시켰다. NC 멤브레인을 건조한 후에 멤브레인을 3.8-mm-너비의 스트립으로 커터를 사용하여 잘랐다. 농축한 2X AuNP-항체 컨쥬게이트(12)를 컨쥬게이트 패드(0.75 cm x 0.38 cm)상에 인큐베이션하고, Temperature & humid 챔버 (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd, Korea)를 사용하여 28℃ 온도 및 25％ 습도하에서 순차적으로 건조시킨 후에 보관하였다. 흡수 패드(1.5 cm x 0.38 cm)를 스트립의 상단부에 부착하고, 샘플 패드(1.5 cm x 0.38 cm)는 고정된 항체 및 흡수 패드를 갖는 NC 멤브레인을 포함하는 점착성의 플라스틱 백킹(6 cm x 0.38 cm) 상에 순차적으로 조립하였다. 각 세그먼트들은 분석 과정 동안의 용액 이동을 촉진하기 위해 1.5 mm 정도로 서로 오버랩핑시켰다.
4. LFA(Lateral Flow Immunoassay) 센서의 제조-2
NC 멤브레인(0.25 cm x 30 cm) 상의 각각 다른 영역에 포획 항체 및 myoglobin 항원, 콘트롤 항체들을 디스펜서(DCI100; Zeta Corporation, Kyunggi-do, South Korea)를 사용하여 고정시켰다. 컨트롤 라인과 테스트 라인은 각 포획항체 (1mg/mL)를 셀룰로오스 멤브레인에 1 μL/cm 양으로 고정시켰으며, 두 라인 사이에 항원라인을 고정시켰다. 항원 라인에서는 포획항체(1 mg/mL)를 셀룰로오스 멤브레인에 1 μL/cm 양으로 고정시킨 후, 순차적으로 myoglobin (0.5 mg/mL) 항원을 그 위에 고정시켰다. 각 영역사이의 간격은 약 3 mm로 하였다. 로딩이 완료된 멤브레인은 Temperature & humid 챔버에서 37℃으로 1 시간 동안 건조시켰다. NC 멤브레인을 건조한 후에 멤브레인을 3.8-mm-너비의 스트립으로 커터를 사용하여 잘랐다. 농축한 3X AuNP-항체 컨쥬게이트를 컨쥬게이트 패드(1 cm x 0.38 cm)상에 인큐베이션하고, Temperature & humid 챔버(Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd, Korea)를 사용하여 37℃ 온도 및 20％ 습도하에 건조시킨 후에 보관하였다. 흡수 패드(1.5 cm x 0.38 cm)를 스트립의 상단부에 부착하고, 샘플 패드(1.5 cm x 0.38 cm)는 고정된 항체 및 흡수 패드를 갖는 NC 멤브레인을 포함하는 점착성의 플라스틱 백킹(6 cm x 0.38 cm) 상에 순차적으로 조립하였다. 각 세그먼트들은 분석 과정 동안의 용액 이동을 촉진하기 위해 2 mm 정도로 서로 오버랩핑시켰다.
5. CRP의 분석
CRP가 포함되지 않은 인간 혈청을 사용하여 다양한 농도를 갖는 CRP 용액을 제조하였다. 제조한 샘플 용액을 LFA 센서상에 인큐베이션하였다. Chemi Doc TM XRS+ imaging system (Bio-Rad)를 사용하여 이미지를 얻고, 이어서 Image lab TM 4.0 소프트웨어 (Bio-Rad)를 사용하여 색깔 강도를 측정하였다.
6. 미오글로빈의 분석
미오글로빈이 포함되지 않은 인간 혈청을 사용하여 다양한 농도를 갖는 미오글로빈 용액을 제조하였다. 제조한 샘플 용액을 LFA 센서상에 인큐베이션하였다. ChemiDoc TM XRS+ imaging system(Bio-Rad)를 사용하여 이미지를 얻고, 이어서 Imagelab TM 4.0 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 색깔 강도를 측정하였다.
7. 환자 샘플의 제조
경북대학교 병원에서 50명 환자의 혈청 샘플을 얻었다. 환자에게 연구 프로토콜을 상세하게 설명한 후 동의를 받았다. 혈액 샘플은 정맥 천자를 사용하여 리튬 헤파린 항응고제(S-Monovette, Numbrecht, Germany)를 포함하는 튜브안에 채취하였다. 이어서, 혈액 샘플 튜브를 1000xg 으로 15분간 원심분리를 행하여 혈액내 세포를 제거하였다. 채취된 시료는 HITACHI 7180장비로 농도를 측정한 후, 혈장 부분을 추가 분석을 행할 때 까지 -80℃에서 보관하였다. 샘플은 측정하기 전에 CRP를 포함하지 않는 혈청을 사용하여 10배 희석하였다.
실험결과 및 고찰
1. 스트립 센서의 분석 원리
LFA 스트립 센서는 샘플 주입 방향으로부터 각각 테스트 라인(test line), 항원 라인(antigen line) 및 콘트롤 라인(control line)의 순서로 구성되어 있다(도 1의 패널 A). 혈청 샘플을 샘플 패드상에 인큐베이션 하면 용액이 샘플 패드와 접촉한 후 수평방향으로 샘플 패드, 컨주게이션 패드, NC 멤브레인에 각각 습윤된다. 최초에는 테스트 라인에서 테스트 라인에 부착된 항체에 항원과 AuNP-모노클로날 항체 컨쥬게이트 복합체 사이에 샌드위치 반응이 발생하고, 테스트 라인에서 반응하지 않은 AuNP-항체 컨쥬게이트는 항원 라인에서 NC 멤브레인상에 고정화된 CRP 항원에 결합하게 된다. 낮은 농도의 항원을 분석하는 경우에는 항원 라인이 가장 높은 신호 강도를 나타내는 반면, 높은 농도의 항원을 분석하는 경우에는 항원 라인은 매우 낮은 신호 강도를 나타내거나 신호 강도가 전혀 없게 된다. 또한, 콘트롤 라인은 금 표지된 모노클로날 항체에 반응하는 영역으로서 사용된다. 전체 반응은 도 1의 패널 B에 나타내었다. 각기 다른 항원 농도에서 측정한 결과는 데이터 프로세싱 과정을 적용하여 나타내었다(도 1의 패널 C). 샘플을 주입한 후 AuNP 복합체와 만나는 첫 번째 위치인 테스트 라인은, CRP 항원과 결합한 AuNP-항체 컨쥬게이트-항원 복합체가 NC 멤브레인상에 고정된 항-CRP 폴리클로날 항체에 결합하면 붉은 신호를 나타낸다. 실험결과 테스트 라인에서 신호 강도는 0-1 μg/mL의 항원 농도 범위에서는 증가하였으나, 항원이 고농도인 경우에는 감소하였다(도 5 패널 A 및 B). 이러한 현상은 대부분의 고농도의 항원 분석시에 나타나는 후크 효과(hook effect)인 것으로 추정된다. 항원이 일정한 농도 이상으로 존재하는 경우, 컨쥬게이트 패드내에서 AuNP와 결합하지 않은 항원은 NC 멤브레인을 따라 빠르게 이동하여 테스트 라인에 존재하는 포획항체에 먼저 결합하게 되는데, 이는 비교적 큰 크기의 느린 이동 속도를 갖는 AuNP 항체 컨쥬게이트 복합체가 테스트 라인에 존재하는 포획항체와 결합할 수 있는 기회를 잃게 된 결과 때문이다. 이러한 후크 효과 때문에 테스트 라인의 신호 강도 값은 고농도의 항원을 측정하는 경우 실제로 요구되는 광범위한 항원 농도범위에 대해서는 한계를 가지게 된다. 따라서, 이러한 현상을 극복하기 위해, 항원 라인을 도입하여 테스트 라인, 항원 라인 및 콘트롤 라인의 상관관계를 이용하였다. 샘플을 주입한 후, 항원 라인은 샘플내의 항원의 농도에 따라 다른 양태의 신호를 만들어 내었다. 예를 들어, 항원 라인은 항원의 농도가 O인 경우 테스트 라인에서 나타내는 신호와 정반대로 가장 높은 신호값을 나타내는 결과를 보여준다. 반대로, 항원 라인의 신호 강도는 항원의 농도가 증가함에 따라 점차 감소하는 경향을 보였으며, 테스트 라인은 농도에 따라 신호강도가 점차 증가되다가, 1 μg/mL 이상의 항원 농도에서는 신호강도가 감소하는 경향을 나타내었다. 마지막으로, 2개의 라인은 500 μg/mL의 농도에서는 붉은 신호를 나타내지 않았다(도 5의 패널 A). 테스트 라인에서, AuNP 컨쥬게이트-항체(Ab)-항원(Ag) 복합체는 포획항체와 샌드위치 분석의 형태로 반응하는 반면, 반응하지 않은 AuNP 컨쥬게이트-항체(Ab)는 NC 멤브레인을 따라 상부방향으로 이동하여 항원 라인의 항원에 결합한다. 과량의 항원이 AuNP 컨쥬게이트-Ab-Ag 복합체를 형성하기 전에 테스트 라인의 포획 항체에 먼저 결합하게 되면, NC 멤브레인상에 고정화된 CRP와의 결합 친화도도 감소하였다. 결과적으로, 항원이 고농도로 존재하는 분석에서는 면역분석 반응이 억제되기 때문에 테스트 라인과 항원 라인 양쪽 라인의 신호 강도가 나타나지 않았고, 항-마우스 IgG 항체가 고정된 콘트롤 라인은 반응하지 않은 AuNP-컨쥬게이트-항원 복합체와 결합하기 때문에 가장 높은 신호를 나타내었다.
2. 항원 라인의 최적화
스트립 센서의 제조를 위해서 가장 중요한 요소는 항원 라인에서 CRP를 고정화하는 것이다. 본 발명자들은 CRP의 방향과 안정화를 돕기 위해 항원 라인에서 먼저 포획 항체를 고정화시키고 이어서 여기에 CRP를 가하였다. CRP를 NC 멤브레인에 직접 고정시킬 경우, 고정된 항원과 AuNP 컨쥬게이트 항체 사이에 반응이 나타나지 않았다. 건조 공정 동안에 CRP가 분해될 것으로 예상하여 이러한 단점을 회피하기 위해 NHS-PEG를 사용하여 CRP를 페길레이션하였다. 그러나, 페길레이션된 CRP가 결합된 항원 라인은 신호를 나타내지 않았다(도 2). 항원라인에서 CRP 항원과 AuNP-검출항체 컨쥬게이트와의 결합 친화도를 유지시키기 위해, 포획 항체를 미리 결합시킨 후 여기에 항원을 부착시켜 사용하는 새로운 고정화 방법을 시도하였다. 먼저, NC 멤브레인의 항원라인에 포획항체를 로딩한 후에, 여기에 CRP를 가하여 CRP가 포획항체에 부착하도록 하여 스트립 센서를 제조하였으며, 이렇게 제조한 스트립 센서는 CRP 결합 친화도에 관한 문제가 발생하지 않았다. 따라서, AuNP-검출항체 컨쥬게이트와의 물리적 공간과 CRP의 방향에 따라 친화도가 감소한 것으로 추정하였으며, 건조 공정 중에 단백질의 분해에 영향을 미치지는 않는 것으로 판단하였다. 또한, CRP 라인과 페길레이션-CRP 라인 사이에서는 유사한 신호 강도가 관찰되었다. 이러한 현상은 미리 결합시키는 항체로서 포획항체가 아닌 다른 항체를 사용한 경우에는 나타나지 않았다. 본 발명자들은 2가지 종류의 다른 항체를 사용하여 실험을 수행하였는데, 하나는 농도의 변화 없이 균일한 신호 강도를 나타내었고, 다른 하나는 일정의 농도 까지 신호 강도가 감소하거나 또는 일정 농도 보다 더 높은 농도에서 일정한 신호를 유지함을 보여주었다(도 3). 항원 라인 및 테스트 라인에서 사용한 항체는 폴리클로날 항체를 사용하였으며, 각 라인의 제조의 편의성 및 항원 라인에 항원의 고정을 용이하게 하기 위해 테스트 라인 및 항원 라인에서의 폴리클로날 항체는 동일 회사의 제품을 사용하였다. 또한, 항원 라인에서 경쟁 반응의 효율을 증가시키기 위해 AuNP-검출항체 컨쥬게이트에서의 검출항체는 모노클로날 항체를 사용하였다. 도 3에서 Detection antibody 그래프의 경우 검출항체를 모노클로날 항체로 사용한 경우이며, Test antibody 1(Test1) 및 Test antibody 2(Test 2)의 경우는 검출항체를 폴리클로날 항체로 사용한 경우의 결과이다. 검출항체를 폴리클로날 항체로 사용한 경우 모노클로탈 항체를 사용한 경우와는 다르게 측정하고자 하는 CRP 농도에 따라 신호감소가 나타나지 않고 일정한 신호가 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
3. 광범위한 농도범위의 CRP 수준의 측정 및 데이터 프로세싱
광범위한 농도 범위의 CRP를 측정하기 위해, 테스트 라인에서 1 μg/mL 농도 이상에서는 신호 강도가 감소하는 후크 효과와, 항원 라인에서 항원의 농도 증가에 따라 감소하는 신호를 사용하여 항원 농도 결정 과정을 수행하였다. 이론적으로 1 단계 샌드위치 면역분석에서 신호 강도 곡선의 모양은 검출 및 포획 항체 농도에 의존한다(18). 한편, 본 발명의 시스템에서 로그 단위의 검량선은 2차 방정식에 매우 근접하게 매칭되었다. 따라서, 이러한 이유로, 2차 방정식의 형태로 검량선을 얻기 위해 항체 농도 또는 항체 스크리닝 테스트의 최적화 과정은 수행하지 않았다. 측정을 완료한 후에 검량선으로부터 2차 방정식을 사용하여 2개의 상이한 농도 결과를 얻을 수 있었고, 이어서 항원 라인과 콘트롤 라인 사이의 신호 강도를 비교하여 실제 값을 결정하였다. 즉, 항원 라인 신호 값이 콘트롤 라인의 값 보다 높다면, 보다 낮은 값을 선택하고, 그 반대의 경우라면 높은 값을 선택하였다.
데이터의 프로세싱 과정을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다. 각 스트립을 Chemi_Doc MP 장비를 이용하여 각각의 라인의 신호강도를 구하여 신호강도와 시료의 농도를 각각 로그로 전환하여 엑셀을 이용하여 2차 방정식 보정 곡선을 얻었다. 엑셀 프로그램을 통하여 얻은 보정곡선은 y=ax2+bx+c의 형태로 나타나고, 측정된 보정곡선에서 각각 a, b, c 코드값을 얻을 수 있었다. 미지의 시료를 측정하여 위와 동일한 방법으로 로그형태의 신호강도를 측정하고 위에서 얻은 보정곡선의 y 값에 도입하고 a, b, c값을 이용하여 2개의 서로 다른 x 값을 구할 수 있다. 이렇게 얻어진 두개의 x 값 중, 항원라인과 컨트롤라인의 상관관계를 분석하여 하나의 값을 선택하고, 실제값은 10의 제곱근으로 하여 얻어진다. 데이터 프로세싱의 전체의 과정은 도 4에 나타내었다.
도 5의 패널 C는 데이터 프로세싱 과정을 통해 다양한 농도의 CRP를 측정한 결과를 보여준다. 상기의 실험 결과들은 본 발명의 센서가 105 - 106 사이의 CRP 농도 수준도 측정할 수 있다는 것을 보여준다. 또한, 0.649 ng/mL의 검출한계(LOD, blank signal + 3 standard deviations)를 얻었다. 이 값은 가장 높은 농도로서 1.07 mg/mL CRP 농도를 측정할 수 있는 센서를 개발할 수 있다는 것을 의미한다.
4. 임상 샘플의 측정
실제적인 응용과 상업화 가능성을 확인하기 위해 50개의 임상 샘플을 평가하였다. 임상 샘플은 매트릭스 간섭을 피하기 위해 CRP를 포함하지 않는 혈청으로 10 배 희석한 후 개발한 스트립 센서를 사용하여 측정하였다. 시험 결과, 0.4 - 84.7 μg/mL의 범위 내에서 테스트한 샘플 사이의 선형의 상관관계를 얻었다(도 6). 실제 샘플 측정에서 전체 범위의 CRP 농도(1 ng/mL - 500 μg/mL)를 평가하지는 않았지만, 본 발명의 센서를 통해 인간 혈청에서 CRP 수준을 광범위한 농도범위에서도 정량적 측정이 가능하다는 것을 확인하였으며, 항원 라인 및 본 발명의 분석 방법이 실제 샘플 측정에서도 적용될 수 있다는 점을 확인하였다.
5. 미오글로빈 항원의 측정
본 발명에서 주장된 광범위한 농도범위를 측정하는 방법에 있어서, 상기 측정된 CRP 이외에 범용적인 모든 항원에 대한 적용이 가능함을 증명하기 위하여 심근경색 바이오마커 중의 하나인 미오글로빈을 상기 CRP에서 사용된 측정방법을 그대로 도입하여 분석하였다. 도 7에서 보는 바와 같이 미오글로빈에서도 측정라인, 항원라인 및 컨트롤 라인이 CRP에서 측정된 결고와 동일한 경향성을 보였으며, 이 결과를 이용하여 CRP에서 수행된 방법과 동일한 방법으로 분석한 결과 도 8에서 보는 바와 같이 1 ng/mL에서 500 μg/mL 사이의 농도범위에서 완벽한 선형성을 갖는 결과를 도출 할 수 있었다. 도 7 및 도 8의 미오글로빈 측정결과를 통하여 본 발명에서 주장된 측정 방법이 다양한 항원에 대하여 적용되는 것이 가능하다는 것을 확인하였다.
결론
본 발명에서는 광범위한 농도범위의 CRP를 측정할 수 있는 하나의 스트립으로 구성된 다중 라인을 갖는 측방 유동 면역 센서를 개발하였다. 구별되는 방식으로 작동하는 3개의 면역학적 활성 라인으로부터의 신호들을 프로세싱하고 조합함으로써 고농도의 항원을 검출하는 경우에 통상적인 센서에서 공통적으로 발견되는 후크 효과를 회피할 수 있었다. 본 발명의 LFA 센서는 1 ng/mL - 500 μg/mL의 범위의 CRP 농도를 10분안에 분석을 완료할 수 있었다. 검출 가능한 농도범위는 0.67 ng/mL - 1.02 mg/mL이었으며, 이러한 범위는 LFA 스트립 센서를 사용하여 측정할 수 있는 가장 넓은 측정범위이다(약 106 배). 센서의 구조가 제조 및 공정에 있어서 비교적 싸고 가벼운 멤브레인과 패드로 구성되어 있기 때문에, 다중 라인 LFA 시스템은 알맞은 현장 검사 디바이스로의 개발에 특히 유리하다. 또한, 본 발명의 센서는 손쉽게 다룰 수 있으며 광범위한 동적 영역을 가짐으로써, 간편하고 감도 높게 CRP를 검출할 수 있을 뿐만 아니라 염증의 정도와 환자의 질환의 종류를 정확하게 진단할 수 있다. 또한 CRP 이외에 미오글로빈 측정에서도 CRP와 거의 동일한 수준의 측정 결과를 얻을 수 있었으며 이러한 결과를 통하여 본 발명에서 적용할 수 있는 항원은 CRP에 국한된 것이 아니라 샌드위치 면역반응이 가능하며 두 종의 항체 쌍을 갖는 항원에 대하여 광범위 하게 적용될 수 있다는 것을 확인 하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

  1. 광범위한 농도 범위에서 항원으로서 CRP(C-reactive protein) 또는 미오글로빈(myoglobin)의 농도를 측정하기 위한 측방 유동 분석 스트립 센서로서,
    상기 측방 유동 분석 스트립 센서는 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 순차적으로 연결된 구조를 포함하고,
    상기 컨쥬게이트 패드에는 나노입자와 상기 항원에 결합하는 검출항체로서 모노클로날 항체가 연결된 나노입자-검출항체 컨쥬게이트가 포함되어 있고,
    상기 멤브레인상에는 상기 컨쥬게이트 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 테스트 라인, 항원 라인 및 콘트롤 라인이 순차적으로 형성되어 있고,
    상기 테스트 라인에는 상기 항원에 결합하는 포획항체로서 폴리클로날 항체가 고정되어 있고,
    상기 항원 라인에는 멤브레인상에 고정된 상기 항원에 결합하는 포획항체인 폴리클로날 포획항체를 매개로 하여 항원이 고정되어 있고,
    상기 콘트롤 라인에는 상기 검출항체에 결합하는 2차 항체가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 측방 유동 분석 스트립 센서.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자인 것을 특징으로 하는 측방 유동 분석 스트립 센서.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 멤브레인은 니트로셀룰로오스, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 나일론, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리에스테르 또는 폴리프로필렌으로 제조된 멤브레인인 것을 특징으로 하는 측방 유동 분석 스트립 센서.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 지지체상에 순차적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 측방 유동 분석 스트립 센서.
  7. 삭제
  8. 측방 유동 분석 스트립 센서를 사용하여 광범위한 농도 범위에서 항원으로서 CRP(C-reactive protein) 또는 미오글로빈(myoglobin)의 농도를 측정하기 위한 방법으로서,
    상기 측방 유동 분석 스트립 센서는 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 순차적으로 연결된 구조를 포함하고,
    상기 컨쥬게이트 패드에는 나노입자와 상기 항원에 결합하는 검출항체로서 모노클로날 항체가 연결된 나노입자-검출항체 컨쥬게이트가 포함되어 있고,
    상기 멤브레인상에는 상기 컨쥬게이트 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 테스트 라인, 항원 라인 및 콘트롤 라인이 순차적으로 형성되어 있고,
    상기 테스트 라인에는 상기 항원에 결합하는 포획항체로서 폴리클로날 항체가 고정되어 있고,
    상기 항원 라인에는 멤브레인상에 고정된 상기 항원에 결합하는 포획항체인 폴리클로날 포획항체를 매개로 하여 항원이 고정되어 있고,
    상기 콘트롤 라인에는 상기 검출항체에 결합하는 2차 항체가 고정되어 있으며,
    다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 분석하고자 하는 항원을 기지의 농도로 포함하는 샘플을 상기 샘플 패드에 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 테스트 라인, 항원 라인 및 콘트롤 라인에서 생성되는 신호를 측정하는 단계;
    (c) 분석하고자 하는 항원을 상기 단계 (a)에서와 다른 기지의 농도로 포함하는 샘플들에 대하여 상기 단계 (a) 및 (b)를 행하는 단계;
    (d) 상기 단계 (a) 내지 (c)를 통해 측정한 신호 값들을 처리하여 검량선을 산출하는 단계;
    (e) 분석하고자 하는 항원이 미지의 농도로 포함된 샘플을 상기 샘플 패드에 접촉시키는 단계;
    (f) 상기 테스트 라인, 항원 라인 및 콘트롤 라인에서 생성되는 신호를 측정하는 단계; 및
    (g) 측정된 신호값과 상기 단계 (d)의 검량선을 사용하여 미지의 농도의 항원의 농도를 산출하는 단계.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 단계 (g)에서, 상기 항원 라인에서 측정된 신호값과 상기 콘트롤 라인에서 측정된 신호값을 비교하여, 항원 라인의 신호값이 콘트롤 라인의 신호값 보다 큰 경우 산출된 항원의 농도값 중에서 보다 낮은 값을 선택하고, 항원 라인의 신호값이 콘트롤 라인의 신호값 보다 작은 경우 산출된 항원의 농도값 중에서 보다 큰 값을 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 분석 가능한 상기 항원의 농도범위는 1 ng/mL - 500 μg/mL인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
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