CN113702464A - 一种P-tau检测免疫传感器及其制备和应用方法 - Google Patents
一种P-tau检测免疫传感器及其制备和应用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113702464A CN113702464A CN202111117596.XA CN202111117596A CN113702464A CN 113702464 A CN113702464 A CN 113702464A CN 202111117596 A CN202111117596 A CN 202111117596A CN 113702464 A CN113702464 A CN 113702464A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tau
- electrode
- immunosensor
- solution
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 48
- VTJUKNSKBAOEHE-UHFFFAOYSA-N calixarene Chemical class COC(=O)COC1=C(CC=2C(=C(CC=3C(=C(C4)C=C(C=3)C(C)(C)C)OCC(=O)OC)C=C(C=2)C(C)(C)C)OCC(=O)OC)C=C(C(C)(C)C)C=C1CC1=C(OCC(=O)OC)C4=CC(C(C)(C)C)=C1 VTJUKNSKBAOEHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 10
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 8
- OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N titanium oxide Inorganic materials [Ti]=O OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 7
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 6
- YHWCPXVTRSHPNY-UHFFFAOYSA-N butan-1-olate;titanium(4+) Chemical compound [Ti+4].CCCC[O-].CCCC[O-].CCCC[O-].CCCC[O-] YHWCPXVTRSHPNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- -1 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 claims description 5
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 claims description 5
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 15
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000000157 electrochemical-induced impedance spectroscopy Methods 0.000 description 8
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 description 6
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 108010015724 Prephenate Dehydratase Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 2
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000002371 ultraviolet--visible spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- APQHKWPGGHMYKJ-UHFFFAOYSA-N Tributyltin oxide Chemical compound CCCC[Sn](CCCC)(CCCC)O[Sn](CCCC)(CCCC)CCCC APQHKWPGGHMYKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000004159 blood analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000117 blood based biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000002593 electrical impedance tomography Methods 0.000 description 1
- 238000007812 electrochemical assay Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000002610 neuroimaging Methods 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
- G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种P‑tau检测免疫传感器的制备方法,包括步骤:(1)合成花状TiO2;(2)将电极与杯芳烃衍生物溶液进行反应,使得杯芳烃衍生物附着在电极上;(3)将Anti‑tau抗体添加到附着有杯芳烃衍生物的电极表面上;(4)将电极与超分子化合物溶液进行反应,为抗体提供固定基底。
Description
技术领域
本发明涉及医疗器械领域,尤其涉及一种P-tau检测免疫传感器及其制备和应用方法。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是痴呆症的主要原因,也是世界上最大的医疗保健挑战之一,并造成严重的家庭和社会负担。鉴于目前尚无治疗AD的特效药,早期诊断、早期干预将为延缓AD进展、提高患者生活质量、减轻社会负担奠定基础。针对脑脊液(CSF) 中生物标志物的正电子发射断层扫描(PET)的使用彻底改变了AD的诊断工作。核心CSF生物标志物包括Aβ42、总tau(T-tau)和磷酸化tau(P-tau)。Aβ42减少和P-tau增加被认为反映了AD中的Aβ和tau病理。重要的是,脑脊液磷酸化tau蛋白对AD的特异性高于总tau蛋白和Aβ42。CSF分析和神经影像学可以在某些神经退行性疾病的最早阶段确定潜在的病理生理学,但不具备人群筛查所需的可扩展性。因此,基于血液的生物标志物对于AD的诊断和预后变得越来越重要。从未来的临床实践来看,低成本的血液常规检查有望取代昂贵的PET扫描。
最近的报告表明,血浆p-tau181可将AD痴呆与淀粉样蛋白β阴性的年轻人和认知功能未受损的老年人以及其他神经退行性疾病区分开来。其他位点的P-tau,如P-tau199、 P-tau217和P-tau231,对AD的诊断准确度相似。因此,血浆总P-tau是更可靠的AD血浆生物标志物。对于P-tau的临床检测对AD的早期诊断、诊疗方案的确定、治疗剂量的优化以及药物疗效的评价具有重要意义。
目前,P-tau开发的检测方法主要为ELISA试剂盒,但是现有方法依旧不能将P-tau低表达的患者与无患病人群有效区分,也不能预测大部分患者的临床结果,灵敏度还有待提高。重复性较差、易受非特异性蛋白的干扰出现假阳性、检测过程中干扰因素过多等缺点也制约了ELISA在血清P-tau检测中的应用。并且,磷酸化蛋白质的免疫分析仍然存在磷酸化蛋白质(P-蛋白质)丰度低和大量非P-蛋白质的信号抑制问题。因此,有必要在免疫分析之前富集P蛋白。目前常用超速离心等手段,然而,由于操作过程中的不确定因素过多,对实验结果可能造成较大影响。使检测所用到的样本的可靠性和可用性不能完全保证。对于P蛋白富集,已经开发了一些策略,例如基于适体或基于抗体的功能化磁珠。虽然基于功能磁珠的策略在P蛋白富集中应用最为广泛,但该方法存在磷酸化抗体修饰过程繁琐、加载效率低、抗体活性易破坏等缺陷。此外,为磷酸化而开发的抗体或适体通常可以特异性识别一个位点。相应的抗体作为富集和捕获的识别分子将无法实现全磷酸化识别。P-tau的多个位点,如P-tau199、P-tau217和 P-tau231,对AD的诊断准确性相似。单一的特异性识别分子会导致目标蛋白的漏检,降低AD分析的准确性。因此,开发一种快速、灵敏、准确的P-tau检测方法成为研究人员迫切需要解决的问题。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷,本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、准确的P-tau检测免疫传感器及其制备和应用方法。
为实现上述目的,本发明首先提供了一种P-tau检测免疫传感器的制备方法,包括步骤:
(1)合成花状TiO2;
(2)将芯片电极放入杯芳烃衍生物溶液中,使得杯芳烃衍生物附着在芯片电极上;
(3)将Anti-tau抗体添加到附着有杯芳烃衍生物的电极表面上;
(4)将芯片电极放入超分子化合物溶液中,为抗体提供固定基底。
进一步地,在步骤(1)中包括步骤:
(11)将钛酸四丁酯加入盐酸和去离子水的混合物中,搅拌1h;
(12)将上述混合物转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中,在160℃反应3小时;反应结束后,离心得到的沉淀用去离子水反复洗涤以除去未反应的试剂;
(13)最后,将沉淀物在80℃下干燥12h得到花状TiO2,并在4℃下储存备用。
进一步地,步骤(2)中的杯芳烃衍生物溶液为0.1mM的Prolinker溶液,将电极置于Prolinker溶液中反应8-12h,反应结束后将电极置于甲醇溶液中洗涤1h,洗涤之后用超纯水清洗并用氮气吹干电极表面的水分。
进一步地,步骤(3)中,将浓度为1μg/mL的Anti-tau抗体添加到附着有Prolinker的电极表面上,孵育2小时后,用缓冲液洗涤金片表面以洗脱未连接的抗体。
进一步地,步骤(4)中,将芯片与浓度为0.01mg/mL的BSA溶液反应半小时。
本发明还提供了一种P-tau检测免疫传感器,其使用花状TiO2作为Anti-tau抗体的富集材料,使用超分子化合物为抗体固定基底。
进一步地,其中,花状TiO2是采用如下步骤制备的:
(1)将钛酸四丁酯加入盐酸和去离子水的混合物中,搅拌1h;
(2)将上述混合物转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中,在160℃反应3小时;反应结束后,离心得到的沉淀用去离子水反复洗涤以除去未反应的试剂;
(3)最后,将沉淀物在80℃下干燥12h得到花状TiO2,并在4℃下储存备用。
进一步地,其中,超分子化合物为BSA。
本发明还提供了一种如上述的P-tau检测免疫传感器的应用方法,包括步骤:在靶标溶液中加入花状TiO2溶液,随后通过离心添加至电极表面,并通过电化学阻抗检测P-tau引起电化学信号变化。
本发明的有益效果有:
1、超分子化合物的主客体识别为固定抗体提供丰富的结合位点,并确保抗体活性;
2、花状TiO2实现一步法分离富集靶标分析物,且分离效率高,特异性强,并可作为检测的信号放大分子;
3、花状TiO2-靶标复合物对电化学阻抗信号有显著增强作用;
4、这种传感模式为开发更直接有效的生物传感器提供了实际的临床应用价值。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的P-tau检测原理示意图;
图2是本发明的一个较佳实施例中的合成的花状TiO2材料的表征图;
图3是本发明的一个较佳实施例中的不同浓度的P-tau引起的EIS图;
图4是本发明的一个较佳实施例中的电阻响应与P-tau浓度对数之间的线性关系图;
图5是本发明的一个较佳实施例中的一种P-tau检测免疫传感器的示意图;
图6是本发明的一个较佳实施例中的一种P-tau检测免疫传感器的使用示意图;
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例,使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现,本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
电化学阻抗谱(EIS)是目前最有效的分析方法之一,因为它可以表征不同改性层中的物理和化学过程,高频下的样品电荷转移和低频下的跟踪传质。在测量免疫相互作用方面,EIS比其他电化学方法的损失更小,因为它是在很窄的施加电位范围内进行的。因此,EIS在生物传感器设计领域引起了广泛关注。磷酸化蛋白质的EIS分析仍然存在磷酸化蛋白质(P-蛋白质)丰度低和大量非P-蛋白质的信号抑制问题。因此,有必要在EIS分析之前富集P蛋白。虽然基于功能磁珠的策略在P蛋白富集中应用最为广泛,但该方法存在磷酸化抗体修饰过程繁琐、加载效率低、抗体活性易破坏等缺陷。此外,为磷酸化而开发的抗体或适体通常可以特异性识别一个位点。相应的抗体作为富集和捕获的识别分子将无法实现全磷酸化识别。P-tau的多个位点,如P-tau199、 P-tau217和P-tau231,对AD的诊断准确性相似。因此,单一的特异性识别分子会导致目标蛋白的漏检,降低AD分析的准确性。
TiO2可以与P蛋白的磷酸基团形成配位键并稳定结合,不受抗体活性变化的干扰,实现高选择性富集。花状TiO2(F-TiO2)超结构,即具有分级结构的3D微纳米材料,具有较大的比表面积、优异的生物相容性和强大的电子转移能力。F-TiO2的大比表面积有助于P蛋白更灵敏地与其表面结合。良好的生物相容性将保持结合蛋白的天然活性不变。此外,较大的电子转移阻碍能力使得F-TiO2作为富集材料可以获得更好的信号放大效果,显著提高检测的灵敏度。
基于上述的机制,本发明设计了一种简便且灵敏的免疫传感器,通过电化学信号输出来定量总P-tau的水平。该传感器涉及F-TiO2和P-tau的配位结合作用,以及抗体的特异性识别,如图1所示。通过F-TiO2介导的免疫传感器的成功构建,一步法实现 P-tau富集及靶标信号放大。首先,杯芳烃衍生物用于将Anti-tau定向到金电极表面。超分子化合物通过主客体识别为固定抗体提供丰富的结合位点,并通过非共价相互作用确保Anti-tau活性。F-TiO2将作为信号放大标签,其独特的花形结构和高电子阻碍能力导致电荷转移电阻(Rct)的净变化。此外,夹心法中的F-TiO2不仅提供亲水性,可以减少非特异性结合,而且大的比表面积保证了P-tau结合的高灵敏度。这允许设计的电化学生物传感器在靶标检测期间输出放大的阻抗信号。Anti-tau和F-TiO2实现了P-tau的双重特异性识别,保证了总P-tau检测的高选择性。通过该模式,使得抗原被更多的捕获于界面,信号输出进一步增强,使得检测灵敏度更一步增加。
在根据本发明的一个优选实施例中,花状TiO2特异性检测P-tau的电化学测定方法和步骤如下:
(一)合成花状TiO2:
(1)将钛酸四丁酯(TBOT)加入37%盐酸和去离子水的混合物中,搅拌均匀,继续搅1h;
(2)然后将上述混合物转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中,在160℃反应3小时。反应结束后,离心得到的沉淀用去离子水反复洗涤以除去未反应的试剂。
(3)最后,将沉淀物在80℃下干燥12h得到F-TiO2,并在4℃下储存以备后续使用。
分别通过紫外可见光谱(Uv-vis),动态光散射(DLS),Zeta电位和扫描电子显微镜(SEM)表征所得到的F-TiO2,并通过DLS分析了材料稳定性。材料的表征参见附图2。
(二)电化学方法测定P-tau:
(1)首先,配置0.1mM的Prolinker溶液,将电极置于Prolinker溶液中反应8-12h。Prolinker是一种可在市场上购买的杯芳烃衍生物,可以通过金-巯键与芯片表面结合反应,其杯芳烃空腔可以用来将抗体锚定到芯片表面。反应结束后将电极置于甲醇溶液中洗涤一小时,洗涤之后用超纯水清洗并用氮气吹干电极表面的水分。
(2)之后,将附着有Prolinker的电极安装到电化学工作站仪器上。而后,将100μL的浓度为1μg/mL的Anti-tau抗体添加到附着有Prolinker的电极表面上。孵育2小时后,用缓冲液洗涤金片表面以洗脱未连接的抗体。
(3)为了避免芯片表面上的非特异性吸附,将芯片与浓度为0.01mg/mL的BSA(牛血清白蛋白)溶液反应半小时。
(4)然后,在100μL的靶标溶液中加入F-TiO2溶液,由于TiO2与P-tau的配位结合能力,二者形成了相应的复合物,随后通过离心添加至电极表面。并通过电化学阻抗检测不同浓度P-tau引起电化学信号变化。
按照上述步骤对不同浓度的P-tau进行测试。
测试采用P-tau浓度分别为:1ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml。
测试条件:使用电化学工作站(AutolabPGSTAT128Nsystem),以10min作为孵育时间,在室温条件下进行不同浓度P-tau作用下的电化学阻抗测定。
参见附图3和4。图3为不同浓度的P-tau引起的EIS图。图4为电阻响应与P-tau 浓度对数之间的线性关系。
由图3和4可见:随着P-tau浓度的增大,导致的电化学信号也越大。因此可以对其进行灵敏的定量分析。
参见附图,图2为材料的表征,具体为:(A)和插图显示合成F-TiO2的SEM图像。 (B)F-TiO2的紫外-可见光谱。(C)F-TiO2的DLS和Zeta电位。(D)F-TiO2在不同时间条件下的稳定性(n=3)。由图可知,F-TiO2的整体形状为均匀分散的花状球形结构。粒径为350±50nm,分散性好,形状清晰。UV-vis吸收光谱中325nm左右的峰被认为是 F-TiO2的特征吸收峰。F-TiO2的均等效流体动力学直径为401±15.4nm。zeta电位为 23.2±0.51mV。上述的结果证明F-TiO2的成功合成;F-TiO2在4℃下放置20天后,粒径变化仅为7.59%,表明合成的纳米颗粒具有良好的稳定性。证明F-TiO2的稳定性较好,可用于后续试验。
图3和4为不同P-tau浓度与阻抗变化间的线性相关关系。由图可见:随着P-tau 浓度的增大,造成的阻抗变化也越大,并且P-tau浓度与阻抗变化间呈现出较好的线性相关关系。线性方程为:y=93.153+333.51×lgCP-tau,线性相关系数为0.98,检测限为25.1pg/mL,符合检测要求。
如图5和6所示,本发明还提供了一种P-tau检测免疫传感器,包括设置在PI基底1上的一对金电极2,金电极2导通至检测池4。金电极2预先经过Prolinker溶液和Anti-tau抗体附着及BSA溶液反应处理,然后再检测池4内滴入F-TiO2溶液,在 120℃干燥10min后在检测池4中得到花状TiO2沉积膜3后保存备用。检测时,通过在检测池4中滴入靶标溶液7,使得TiO2与P-tau结合,然后对传感器进行上述电化学检测。
本发明利用花状TiO2高特异性的配位结合P-tau,与Anti-tau的联合使用具有双重选择性,并且通过F-TiO2-P-tau复合物对阻抗值进行信号放大。该方法不仅就有高的特异性和选择性,而且具有高的灵敏度,能检测极微量的P-tau。另外,该方法双选择性的结合P-tau,改善了单一的抗原抗体特异性识别所出现的假阳性问题,检测结果高效可信。我们构建的高特异性和双重选择的简便的电化学免疫传感器为血液中的总P-tau的检测提供了一种更方便快捷和准确的方法。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种P-tau检测免疫传感器的制备方法,其特征在于,包括步骤:
(1)合成花状TiO2;
(2)将传感器电极与杯芳烃衍生物溶液进行反应,使得杯芳烃衍生物附着在电极上;
(3)将Anti-tau抗体添加到附着有杯芳烃衍生物的电极表面上;
(4)将芯片电极与超分子化合物溶液进行反应,为抗体提供固定基底。
2.如权利要求1所述的P-tau检测免疫传感器的制备方法,其中,在步骤(1)中包括步骤:
(101)将钛酸四丁酯加入盐酸和去离子水的混合物中,搅拌1h;
(102)将上述混合物转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中,在160℃反应3小时;
反应结束后,离心得到的沉淀用去离子水反复洗涤以除去未反应的试剂;
(103)最后,将沉淀物在80℃下干燥12h得到花状TiO2,并在4℃下储存备用。
3.如权利要求1所述的P-tau检测免疫传感器的制备方法,其中,步骤(2)中的杯芳烃衍生物溶液为0.1mM的Prolinker溶液,将电极置于Prolinker溶液中反应8-12h,反应结束后将电极置于甲醇溶液中洗涤1h,洗涤之后用超纯水清洗并用氮气吹干电极表面的水分。
4.如权利要求1所述的P-tau检测免疫传感器的制备方法,其中,步骤(3)中,将浓度为1μg/mL的Anti-tau抗体添加到附着有Prolinker的电极表面上,孵育2小时后,用缓冲液洗涤金片表面以洗脱未连接的抗体。
5.如权利要求1所述的P-tau检测免疫传感器的制备方法,其中,步骤(4)中,将芯片与浓度为0.01mg/mL的BSA溶液反应半小时。
6.一种P-tau检测免疫传感器,其特征在于,其使用花状TiO2作为Anti-tau抗体的富集材料,使用超分子化合物为抗体固定基底。
7.如权利要求6所述的P-tau检测免疫传感器,其中,花状TiO2是采用如下步骤制备的:
(1)将钛酸四丁酯加入盐酸和去离子水的混合物中,搅拌1h;
(2)将上述混合物转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中,在160℃反应3小时;反应结束后,离心得到的沉淀用去离子水反复洗涤以除去未反应的试剂;
(3)最后,将沉淀物在80℃下干燥12h得到花状TiO2,并在4℃下储存备用。
8.如权利要求6所述的P-tau检测免疫传感器,其中,超分子化合物为BSA。
9.一种如权利要求1-8中任意一项中所述的P-tau检测免疫传感器的应用方法,其特征在于,包括步骤:在靶标溶液中加入花状TiO2溶液,随后通过离心添加至电极表面,并通过电化学阻抗检测P-tau引起电化学信号变化。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111117596.XA CN113702464A (zh) | 2021-09-23 | 2021-09-23 | 一种P-tau检测免疫传感器及其制备和应用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111117596.XA CN113702464A (zh) | 2021-09-23 | 2021-09-23 | 一种P-tau检测免疫传感器及其制备和应用方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113702464A true CN113702464A (zh) | 2021-11-26 |
Family
ID=78661656
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111117596.XA Pending CN113702464A (zh) | 2021-09-23 | 2021-09-23 | 一种P-tau检测免疫传感器及其制备和应用方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113702464A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT202200001490A1 (it) * | 2022-01-28 | 2023-07-28 | Biosensing S R L | Biosensori di tipo elettrochimico comprendenti resorcareni |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102830073A (zh) * | 2011-06-13 | 2012-12-19 | 同济大学 | 一种采用杯芳烃修饰电极的可见光电化学分析方法 |
CN103116023A (zh) * | 2013-01-25 | 2013-05-22 | 宁波大学 | 用于检测肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器及其制备方法和应用 |
CN107381632A (zh) * | 2017-08-15 | 2017-11-24 | 齐鲁工业大学 | 一种三维花状二氧化钛纳米材料的制备方法 |
US20180140585A1 (en) * | 2015-05-28 | 2018-05-24 | Electrophoretics Limited | Biomolecules involved in alzheimer's disease |
CN108279311A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-07-13 | 杭州电子科技大学 | 快速检测阿尔茨海默标志蛋白Tau的自组装免疫夹心阻抗传感器 |
CN108627556A (zh) * | 2018-05-16 | 2018-10-09 | 常州大学 | 一种用于识别色氨酸对映体的非离子表面活性剂自组装杯芳烃衍生物复合材料的制备方法 |
CN108645902A (zh) * | 2018-05-16 | 2018-10-12 | 常州大学 | 一种用于电化学法识别色氨酸对映体的手性杯芳烃衍生物修饰电极的制备方法 |
CN109540991A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-03-29 | 上海大学 | 功能化金属有机骨架材料、其构建的fkn传感器及其制备方法 |
CN109975378A (zh) * | 2019-04-16 | 2019-07-05 | 武汉科技大学 | 构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法 |
-
2021
- 2021-09-23 CN CN202111117596.XA patent/CN113702464A/zh active Pending
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102830073A (zh) * | 2011-06-13 | 2012-12-19 | 同济大学 | 一种采用杯芳烃修饰电极的可见光电化学分析方法 |
CN103116023A (zh) * | 2013-01-25 | 2013-05-22 | 宁波大学 | 用于检测肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器及其制备方法和应用 |
US20180140585A1 (en) * | 2015-05-28 | 2018-05-24 | Electrophoretics Limited | Biomolecules involved in alzheimer's disease |
CN107381632A (zh) * | 2017-08-15 | 2017-11-24 | 齐鲁工业大学 | 一种三维花状二氧化钛纳米材料的制备方法 |
CN108279311A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-07-13 | 杭州电子科技大学 | 快速检测阿尔茨海默标志蛋白Tau的自组装免疫夹心阻抗传感器 |
CN108627556A (zh) * | 2018-05-16 | 2018-10-09 | 常州大学 | 一种用于识别色氨酸对映体的非离子表面活性剂自组装杯芳烃衍生物复合材料的制备方法 |
CN108645902A (zh) * | 2018-05-16 | 2018-10-12 | 常州大学 | 一种用于电化学法识别色氨酸对映体的手性杯芳烃衍生物修饰电极的制备方法 |
CN109540991A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-03-29 | 上海大学 | 功能化金属有机骨架材料、其构建的fkn传感器及其制备方法 |
CN109975378A (zh) * | 2019-04-16 | 2019-07-05 | 武汉科技大学 | 构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
ARUNA SHARMA 等: "Novel Treatment Strategies Using TiO2-Nanowired Delivery of Histaminergic Drugs and Antibodies to Tau With Cerebrolysin for Superior Neuroprotection in the Pathophysiology of Alzheimer’s Disease", 《INTERNATIONAL REVIEW OF NEUROBIOLOGY》 * |
HARI SHANKER SHARMA 等: "Chapter 5 - Nanowired delivery of cerebrolysin with neprilysin and p-Tau antibodies induces superior neuroprotection in Alzheimer"s disease", 《PROGRESS IN BRAIN RESEARCH》 * |
YILAN XU 等: "The application of multifunctional nanomaterials in Alzheimer’s disease: A potential theranostics strategy", 《BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY》 * |
YU-JING TAN 等: "Phosphopeptide Enrichment with TiO2‑Modified Membranes and Investigation of Tau Protein Phosphorylation", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 * |
张晋瑄 等: "膜技术在生物检测中的应用研究进展", 《生物工程学报》 * |
薄冰: "Dicer酶活性的电化学研究以及与肺癌关系的初步探讨" * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT202200001490A1 (it) * | 2022-01-28 | 2023-07-28 | Biosensing S R L | Biosensori di tipo elettrochimico comprendenti resorcareni |
WO2023144748A1 (en) * | 2022-01-28 | 2023-08-03 | Universita' Degli Studi Di Roma "La Sapienza" | Electrochemical type biosensors comprising resorcarenes |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Fathil et al. | Diagnostics on acute myocardial infarction: Cardiac troponin biomarkers | |
KR101702117B1 (ko) | 광범위한 농도범위의 생체물질 농도 측정이 가능한 면역크로마토그래피 스트립 센서 | |
US20130122485A1 (en) | Method of analyzing biomaterials using a magnetic bead | |
TWI698639B (zh) | 前列腺抗原標準品及其用途 | |
KR101486149B1 (ko) | 경쟁 면역반응을 이용한 표면-증강 라만 산란 기반의 질병 진단용 마커 검출 방법 | |
CN111505077B (zh) | 一种基于RGO-Hemin/Au NPs纳米复合材料检测GPC3的方法 | |
Liu et al. | Highly sensitive/selective 3D nanostructured immunoparticle-based interface on a multichannel sensor array for detecting amyloid-beta in Alzheimer's disease | |
Jiang et al. | Rapid and sensitive multiplex detection of COVID-19 antigens and antibody using electrochemical immunosensor-/aptasensor-enabled biochips | |
KR101699578B1 (ko) | 생체 분자 분석 키트 및 이를 이용한 생체 분자 분석 방법 | |
JP2019027952A (ja) | リン酸化タウタンパク質の測定方法 | |
CN114441760B (zh) | 一种用于肝癌诊断的生物标志物和试剂盒及检测方法 | |
Vairaperumal et al. | Optical nanobiosensor-based point-of-care testing for cardiovascular disease biomarkers | |
JP2022126690A (ja) | 心臓バイオマーカーのインピーダンス測定による検出のための垂直配向のプラチナワイヤ・アプタセンサアレイの作成およびパラメータ評価 | |
CN113702464A (zh) | 一种P-tau检测免疫传感器及其制备和应用方法 | |
Huang et al. | Electrochemical immunosensor based on superwettable microdroplet array for detecting multiple Alzheimer’s disease biomarkers | |
CN114487442A (zh) | 一种鼠单抗包被的磁珠、制备方法及测定高敏心肌肌钙蛋白ⅰ的试剂盒 | |
JP6998626B2 (ja) | 自己抗体-抗原結合体を利用した肺癌診断用免疫学的組成物、これを用いた肺癌診断方法及びこれを含む肺癌診断用キット | |
Deng et al. | A novel potentiometric immunoassay for carcinoma antigen 15-3 by coupling enzymatic biocatalytic precipitation with a nanogold labelling strategy | |
Wajs et al. | A novel split mode TFBAR device for quantitative measurements of prostate specific antigen in a small sample of whole blood | |
JPH07140144A (ja) | アレルゲン特異的IgE抗体の測定方法および抗原抗体複合体の測定方法 | |
CN114813862A (zh) | 一种电化学生物传感器及其应用 | |
Sadeghzadeh et al. | Tau Protein Biosensors in the Diagnosis of Neurodegenerative Diseases | |
Gevaerd et al. | Utilizing COVID-19 as a Model for Diagnostics Using an Electrochemical Sensor | |
US20240201121A1 (en) | Enzyme-linked immunosorbent sensor ("elis-s") | |
JP2020519895A (ja) | 多発性硬化症の進行を検出する、サブタイプ分類する、および/または評価するための、診断用バイオマーカー |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20211126 |