CN109975378A - 构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法 - Google Patents

构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医学技术领域，公开了一种构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法，应用电极表面修饰技术，将抗体修饰到电极表面，适配体通过共价结合组装在金纳米颗粒上，利用抗体与tau蛋白的特异性结合作用将tau蛋白结合到电极表面，并在适配体的作用下增强其特异性吸附，构建出适配体‑抗体夹心模式的电化学生物传感器，用于检测阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量。本发明电化学生物传感器应用较为广泛，电化学生物传感器相较于传统的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法而言，具有制备简单、稳定性好、分析速度快、使用方便、成本低等优点。

Description

构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法
技术领域
本发明属于医学技术领域，尤其涉及一种构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease，简称AD)是最常见的慢性神经退行性疾病，AD研究领域的一个关键性进展是证明了两个经典的神经病理性改变老年斑块和神经原纤维缠结是AD病理进程中的最后结果。其中，老年斑的主要组成物质是β-淀粉样蛋白(Amyloidβ-protein，简称Aβ)，神经元纤维缠结主要成分是tau蛋白。
目前AD确诊仍需尸检发现老年斑，神经元纤维缠结及特定部位的神经元选择性减少，而这对于活着的患者是无法做到的。tau蛋白沉积是AD主要的病理学基础，其异常磷酸化在AD患者神经细胞变性和学习记忆障碍发生发展中起重要作用，AD患者脑内tau蛋白的含量越高其临床痴呆程度越严重。目前用于检测tau蛋白的主要检测技术是酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA)方法，此方法特异性较高，但敏感度较差，仍需进一步深入研究，这也促使了高灵敏度、高特异性的生物传感器在检测tau蛋白中的应用。其中，电化学生物传感器应用较为广泛，电化学生物传感器相较于传统的ELISA方法而言，具有制备简单、稳定性好、分析速度快、使用方便、成本低等优点，目前尚未有将适配体-抗体夹心模式结合电化学生物传感器用于检测阿尔茨海默病患者血液中低水平(pmol/L级别)的tau蛋白含量。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)现有阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测技术中，特异性较高，敏感度较差，而且现有技术有电化学生物传感器检测tau蛋白的研究了，但是没有结合适配体-抗体夹心模式的研究电化学生物传感器应用于阿尔茨海默病血液tau蛋白含量检测中，造成现有检测技术分析速度慢、使用不方便、成本高。
解决上述技术问题的难度：
本发明研发优势更为显著的适配体-抗体夹心电化学生物传感器用于检测较低浓度的tau蛋白。传统抗原抗体模式下，两者结合后，在空间上干扰了抗体与相应决定簇的结合，导致抗体非特异性识别，而适配体在抗原抗体的基础上再一次特异性识别，增强了抗原的特异性吸附能力。因此，将生物信号转化为电信号的适配体-抗体夹心电化学生物传感器，克服了传统模式的局限性，结合了适配体与抗体两者的强特异性，从而获得更加灵敏而真实的电信号用于检测血液中的tau蛋白，解决上述技术问题的难度较小。
解决上述技术问题的意义：
本发明构建了一种阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法，通过定量检测tau蛋白反映AD患者的痴呆程度，为诊断AD和评估患者病情提供指导；为疑似AD患者血液检测研究提供基础，从而提高AD筛查率；具有一定的医学临床实际应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法。
本发明是通过将生物信号转化为灵敏的电信号化学分析方法实现的，一种利用电化学生物传感器构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法，所述利用电化学生物传感器构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法应用电极表面修饰技术，将抗体修饰到电极表面，适配体通过共价结合组装在金纳米颗粒上，利用抗体与tau蛋白的特异性结合作用将tau蛋白结合到电极表面，并在适配体的作用下增强其特异性吸附，构建出适配体-抗体夹心模式的电化学生物传感器，用于检测阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量。
进一步，所述利用电化学生物传感器构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的具体包括：
步骤一，电极预处理：利用铝粉抛光，乙醇和纯水超声清洗电极表面各3分钟；将电极分别浸入2mol/L的氢氧化钾溶液、稀释20倍的浓硫酸和浓硝酸溶液中各15分钟；在0.5mol/L硫酸溶液中采用循环伏安法对电极进行活化，扫描范围0.4～1.7V，反复扫描获取稳定的循环伏安图；
步骤二，金纳米颗粒的制备与表征：在烧杯中加入18mL纯水，再分别加入0.01mol/L四氯金酸溶液、0.01mol/L柠檬酸钠溶液和0.1mol/L硼氢化钠溶液各0.5mL；搅拌混合呈淡橙色，静置2小时，制备成金纳米颗粒胶体溶液；利用透射电子显微镜分析金纳米颗粒的形状、大小，通过表征确定制备的4nm金纳米颗粒是否成功；
步骤三，固定抗体：将处理的金电极浸入250mmol/L的3-巯基丙酸乙醇溶液中24小时，再将电极在0.25mol/L EDC和0.05mol/L NHS的磷酸缓冲溶液中活化5小时；将5μL0.05mg/mL tau蛋白抗体滴加至金电极表面，于4℃下干燥12小时；加入1％牛血清白蛋白溶液封闭金电极表面；
步骤四，制备适配体与金纳米颗粒的共轭体：将1mL 0.03mol/L半胱胺加入10mL金纳米颗粒胶体溶液中，于50℃下超声处理1小时；再加入适配体于室温孵育4小时，制备成适配体与金纳米颗粒共轭体；
步骤五，电化学技术检测：循环伏安法和差分脉冲伏安法测定tau蛋白含量在CHI660E电化学工作站完成。
进一步，构建出适配体-抗体夹心模式的电化学生物传感器后还需进行样品采集，用EDTA抗凝管收集空腹静脉血4～5mL，2小时内进行离心处理取上清液得到血浆样本，待测，备用；
血浆样本分装到冷冻管并储存于-80℃待测；在测定前，将所有样品在含有PBS缓冲溶液中以1:100体积比稀释；离心处理条件为：4℃，15min，3000rpm。
进一步，构建出适配体-抗体夹心模式的电化学生物传感器后，以K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6作为氧化还原探针进行结果判定，在电解杯中加入K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6溶液与血液样本，利用差分脉冲伏安法检测样本。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述利用电化学生物传感器构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法构建的适配体-抗体夹心模式的电化学生物传感器。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明电化学生物传感器应用较为广泛，电化学生物传感器相较于传统的ELISA方法而言，具有制备简单、稳定性好、分析速度快、使用方便、成本低等优点。国内尚未见报道利用生物传感器测定tau蛋白的研究，国外对于这方面的研究也较少，相较于其他检测tau蛋白生物传感器的方法而言，本发明检出限较低，灵敏度较高，可用于检测血液中较低浓度的tau蛋白，如表1所示。
表1不同生物传感技术检测tau蛋白的比较
本发明优势在于：更为显著的适配体-抗体夹心电化学生物传感器进行检测tau蛋白，方法方便快捷，能在较短的时间内鉴别阿尔茨海默病与非阿尔茨海默病，且不需要昂贵的仪器设备。传统抗原抗体模式下，两者结合后，在空间上干扰了抗体与相应决定簇的结合，导致抗体非特异性识别，而适配体在抗原抗体的基础上再一次特异性识别，增强了抗原的特异性吸附能力；因此，适配体-抗体夹心电化学生物传感器，克服了传统模式的局限性，结合了适配体与抗体两者的强特异性来检测tau蛋白，能获得更加灵敏而真实的信号，灵敏度高，检出限为0.42pmol/L。特异性好，本发明通过干扰试验显示具有较高的特异性。本发明对于定量检测tau蛋白，从而为AD的早期诊断和临床分析提供新的思路和方法，适于推广应用。
附图说明
图1是本发明实施例提供的利用电化学生物传感器构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法流程图。
图中(A)3-巯基丙酸在金电极表面形成自组装膜；(B)EDC/NHS活化和tau抗体的固定化；(C)用牛血清白蛋白封闭电极与tau蛋白之间的空白位点；(D)适配体-金纳米颗粒-半胱胺共轭体之间的相互作用；(E)差分脉冲伏安法(DPV)评估人体血液中tau蛋白水平。
图2是本发明实施例提供的图1中金纳米颗粒图。
图3是本发明实施例提供的图1中半胱胺图。
图4是本发明实施例提供的图1中适配体图。
图5是本发明实施例提供的图1中共轭体图。
图6是本发明实施例提供的图1中抗体图。
图7是本发明实施例提供的图1中tau蛋白图。
图8是本发明实施例提供的图1中牛血清白蛋白图。
图9是本发明实施例提供的图1中金电极图。
图10是本发明实施例提供的不同浓度的tau蛋白适配体-抗体模式DPV检测结果图。
图中：(A)在0.10mol/L PBS溶液中不同浓度的tau蛋白适配体-抗体模式DPV检测结果(a-j：0.00、0.50、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00和100.00pmol/L tau蛋白)；(B)0.10mol/L PBS溶液中tau蛋白溶液标准曲线。
图11是本发明实施例提供的选将阿尔兹海默病患者的血液在0.10mol/L PBS中稀释100倍，然后通过所构建的方法对其进行检测图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测技术中，特异性较高，敏感度较差，而且现有技术没有利用适配体-抗体夹心电化学生物传感器应用于阿尔茨海默病血液tau蛋白含量检测中，造成现有检测技术分析速度慢、使用不方便、成本高。
为解决上述问题，下面结合具体方法对本发明作详细描述。
如图1所示，本发明实施例提供一种利用电化学生物传感器构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法以tau蛋白为研究对象，应用电极表面修饰技术，将抗体修饰到电极表面，适配体通过共价结合组装在金纳米颗粒上，利用抗体与tau蛋白的特异性结合作用将tau蛋白结合到电极表面，并在适配体的作用下增强了其特异性吸附，从而构建出适配体-抗体夹心模式的电化学生物传感器来检测阿尔茨海默病患者血液中tau蛋白含量，通过定量检测tau蛋白反映AD患者的痴呆程度，从而为AD的早期诊断和临床分析提供新的思路和方法。
具体包括如下步骤：
(1)电极预处理：将电极进行物理和化学清洗，其目的是为了在金电极表面形成—COOH，—OH等活性基团，电极表面处于活化状态，而且易于电极的修饰。
(2)金纳米颗粒的制备与表征：金纳米颗粒一般通过静电吸附、共价键、电化学沉积等方法修饰电极，其修饰的电化学界面是电化学生物传感器增强信号响应的关键。本发明应用金纳米颗粒作为电化学生物传感器信号放大材料，金纳米颗粒的高表面能和界面可控性提高了修饰分子在其表面的固定率、增强了分析信号，良好的生物相容性促进了生物分子与电极之间的电荷传递。利用透射电子显微镜观察金纳米颗粒的形状、大小，通过表征可确定制备的金纳米颗粒是否成功。
(3)固定抗体：选用3-巯基丙酸修饰金电极表面形成自组装膜，3-巯基丙酸为短链硫醇化合物，可通过金-硫键形成稳定有序的二维结构，其末端基团—CO OH或者COO-表现出亲水性和化学活性，且由于链短表现出不同于长链硫醇的特殊性质和应用(如：电子在长链巯基化合物上的传递速度较慢,而在短链巯基化合物上传递速度相对较快等)，能较好的进行电催化的研究。将处理的金电极浸入250mmol/L的3-巯基丙酸乙醇溶液中24小时，其一端的巯基可利用金-硫之间的强相互作用与金电极结合，另一端的羧基与抗体结合，构建高有序性和高稳定性的传感平台。在EDC的介导作用下，3-巯基丙酸上的末端—COOH同NHS反应生成NHS活泼酯中间体，活泼酯中间体再同抗体—NH2反应形成稳定的酰胺键，从而实现抗体在金电极表面的共价固定化。
(4)制备适配体与金纳米颗粒的共轭体：在pH 1.0至6.0的范围内，半胱胺具有很好的电化学可逆性、稳定性以及快速的电子传递能力。发明中，以K3Fe(CN)6作为探针；在酸性条件下，半胱胺分子中的氨基质子化，与Fe(CN)6 3-/4-存在静电作用，同时自组装膜对其有加速电子传递的作用。半胱胺的—NH2可以和溶液中的H+结合形成—NH3+，—NH3+所带的正电荷对负离子的Fe(CN)6 3-/4-探针离子具有一定静电吸引作用，使Fe(CN)6 3-/4-离子在溶液中的传递速度加快，使峰电流增大。
(5)电化学技术检测：采用电化学技术循环伏安法对电极表面的修饰情况进行表征，差分脉冲伏安法分析tau蛋白含量，以初步评估血液中tau蛋白的含量。循环伏安法是一种使工作电极以一定速率扫描，反映氧化还原过程的技术，当工作电极达到某一峰值时，电流迅速增大，产生强的伏安峰。循环伏安法进行扫描时，电极表面上发生可逆的氧化还原化学反应为： 差分脉冲伏安法是线性扫描伏安法和阶梯扫描伏安法的衍生方法，在电势改变之前测量电流，通过这种方式来减小充电电流的影响。本发明选用半胱胺作为氧化剂；半胱胺，又称氨基乙硫醇，其分子式为NH2CH2CH2SH。它是辅酶A的组成部分，是生物体内的生物活性物质，因含有活性巯基和氨基，在生物体内具有重要的生理作用。在酸性溶液中，半胱胺能发生电化学聚合，具有良好的电化学性能。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例(如图1-图9)
本发明实施例提供的利用电化学生物传感器构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法包括：
1)、适配体-抗体夹心模式的电化学生物传感器的准备：
(1)电极预处理：利用铝粉抛光，乙醇和纯水超声清洗电极表面各3分钟。将电极分别浸入2mol/L的氢氧化钾溶液、稀释了20倍的浓硫酸和浓硝酸溶液中各15分钟。在0.5mol/L硫酸溶液中采用循环伏安法对电极进行活化，扫描范围0.4～1.7V，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止。
(2)金纳米颗粒的制备与表征：在烧杯中加入18mL纯水，再分别加入0.01mol/L四氯金酸溶液、0.01mol/L柠檬酸钠溶液和0.1mol/L硼氢化钠溶液各0.5mL。搅拌混合呈淡橙色，静置2小时，制备成金纳米颗粒胶体溶液。利用透射电子显微镜观察金纳米颗粒的形状、大小，通过表征可确定制备的4nm金纳米颗粒是否成功。
(3)固定抗体：将处理的金电极浸入250mmol/L的3-巯基丙酸乙醇溶液中24小时，再将电极在0.25mol/L EDC和0.05mol/L NHS的磷酸缓冲溶液中活化5小时。将5μL 0.05mg/mL P-tau181蛋白抗体滴加上金电极表面，于4℃下干燥12小时。加入1％牛血清白蛋白溶液封闭金电极表面。
(4)制备适配体与金纳米颗粒的共轭体：将1mL 0.03mol/L半胱胺加入10mL金纳米颗粒胶体溶液中，于50℃下超声处理1小时；再加入适配体(上海生工生物工程股份有限公司购买)于室温孵育4小时(140转的速度)，制备成适配体与金纳米颗粒共轭体。
(5)电化学技术检测：循环伏安法和差分脉冲伏安法测定tau蛋白含量在CHI660E电化学工作站上完成，以K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6作为氧化还原探针。循环伏安法参数选用：初始电位-0.4V，上限电位0.8V，下限电位-0.4V，扫描段数2，灵敏度1.00E-6；差分脉冲伏安法参数选用：初始电位-0.1V，终点电位0.5V，电位增量0.004V，振幅0.05V，脉冲宽度0.05V，灵敏度1.00E-6。
用上述制备的电化学生物传感器按以下方法对tau蛋白定量分析，阿尔茨海默病与非阿尔茨海默病进行鉴定。本实施例的待检样品为已鉴定为阿尔茨海默病的血液，当然，也可以为已鉴定为阿尔茨海默病的其它样品。
2)、样品采集：用EDTA抗凝管收集空腹静脉血4～5mL，2小时内进行离心处理(4℃，15min，3000rpm)取上清液得到血浆样本，待测。暂时不用，血浆样品可分装到冷冻管并储存于-80℃待测。在测定前，将所有样品在含有PBS缓冲溶液中以1:100体积比稀释。
3)、结果判定：在电解杯中加入K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6溶液与血液样本，利用差分脉冲伏安法检测样本，样本检测峰值明显高于正常组峰值则为阿尔茨海默病。
本实施例中，差分脉冲伏安法样本检测峰值明显高于正常组，表明待检样品为阿尔茨海默病患者样本。
下面结合具体检测结果对本发明作进一步描述。
如图10所示，(A)在0.10mol/L PBS溶液中不同浓度的tau蛋白适配体-抗体模式DPV检测结果(a-j：0.00、0.50、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00和100.00pmol/L tau蛋白)，(B)0.10mol/L PBS溶液中tau蛋白溶液标准曲线。如图11所示，本发明选取了十组阿尔兹海默病患者血液和非阿尔兹海默病人的血液。首先将阿尔兹海默病患者的血液在0.10mol/L PBS中稀释100倍，然后通过所构建的方法对其进行检测。并使用相同的方法对未患阿尔茨海默病的人血清液进行处理和检测，将其作为对照组。示差分脉冲伏安法进行检测记录，结果显示阿尔兹海默病组的血液tau蛋白水平明显高于对照组。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种利用电化学生物传感器构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法，其特征在于，所述利用电化学生物传感器构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法应用电极表面修饰技术，将抗体修饰到电极表面；
适配体通过共价结合组装在金纳米颗粒上；利用抗体与tau蛋白的特异性结合作用将tau蛋白结合到电极表面，并在适配体的作用下增强tau蛋白特异性吸附，构建出适配体-抗体夹心模式的电化学生物传感器用于检测阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量。
2.如权利要求1所述的利用电化学生物传感器构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法，其特征在于，所述利用电化学生物传感器构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的具体包括：
步骤一，电极预处理：利用铝粉抛光，乙醇和纯水超声清洗电极表面各3分钟；将电极分别浸入2mol/L的氢氧化钾溶液、稀释20倍的浓硫酸和浓硝酸溶液中各15分钟；在0.5mol/L硫酸溶液中采用循环伏安法对电极进行活化，扫描范围0.4～1.7V，反复扫描获取稳定的循环伏安图；
步骤二，金纳米颗粒的制备与表征：在烧杯中加入18mL纯水，再分别加入0.01mol/L四氯金酸溶液、0.01mol/L柠檬酸钠溶液和0.1mol/L硼氢化钠溶液各0.5mL；搅拌混合呈淡橙色，静置2小时，制备成金纳米颗粒胶体溶液；利用透射电子显微镜分析金纳米颗粒的形状、大小，通过表征确定制备的4nm金纳米颗粒是否成功；
步骤三，固定抗体：将处理的金电极浸入250mmol/L的3-巯基丙酸乙醇溶液中24小时，再将电极在0.25mol/L EDC和0.05mol/L NHS的磷酸缓冲溶液中活化5小时；将5μL0.05mg/mL tau蛋白抗体滴加至金电极表面，于4℃下干燥12小时；加入1％牛血清白蛋白溶液封闭金电极表面；
步骤四，制备适配体与金纳米颗粒的共轭体：将1mL0.03mol/L半胱胺加入10mL金纳米颗粒胶体溶液中，于50℃下超声处理1小时；再加入适配体于室温孵育4小时，制备成适配体与金纳米颗粒共轭体；
步骤五，电化学技术检测：循环伏安法和差分脉冲伏安法测定tau蛋白含量在CHI660E电化学工作站完成。
3.如权利要求1所述的利用电化学生物传感器构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法，其特征在于，构建出适配体-抗体夹心模式的电化学生物传感器后还需进行样品采集，用EDTA抗凝管收集空腹静脉血4～5mL，2小时内进行离心处理取上清液得到血浆样本，待测，备用；
血浆样本分装到冷冻管并储存于-80℃待测；在测定前，将所有样品在含有PBS缓冲溶液中以1:100体积比稀释；离心处理条件为：4℃，15min，3000rpm。
4.如权利要求1所述的利用电化学生物传感器构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法，其特征在于，构建出适配体-抗体夹心模式的电化学生物传感器后，以K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6作为氧化还原探针进行结果判定，在电解杯中加入K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6溶液与血液样本，利用差分脉冲伏安法检测样本。
5.一种利用权利要求1所述利用电化学生物传感器构建阿尔茨海默病血液中tau蛋白含量检测系统的方法构建的适配体-抗体夹心模式的电化学生物传感器。
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