CN114858892A - 一种β-淀粉样蛋白寡聚体检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种β‑淀粉样蛋白寡聚体检测方法，主要涉及生物化学及分析化学领域。包括将纳米多孔碳与亚甲基蓝溶液混合，获得混合溶液一；向混合溶液一中加入AβO适配体链，室温震荡，离心洗涤，溶于Tris‑HCl缓冲溶液，获得混合溶液二；将待测样品与混合溶液二混合后孵育，获得混合溶液三；将玻碳电极浸入电解质溶液中电沉积，获得修饰电极一；将修饰电极一浸入捕获探针溶液后孵育，获得修饰电极二；将修饰电极二浸入6‑巯基己‑1‑醇溶液后孵育，获得修饰电极三；将修饰电极三插入混合溶液三中，检测混合溶液三的电信号，即可测定AβO的含量；本发明有益效果在于：操作简单、价格低廉、特异性好。

Description

一种β-淀粉样蛋白寡聚体检测方法

技术领域

本发明涉及生物化学及分析化学领域，具体是一种β-淀粉样蛋白寡聚体检测方法。

背景技术

天然形式的Aβ单体(AβM)是通过b和γ-分泌酶对淀粉样前体蛋白(APP)进行蛋白水解切割得到的，AβMs通过自聚形成可溶性的小寡聚体(AβOs)，这些低聚物可通过进一步组装成不溶的线状原纤维。Aβ的错误折叠和自组装形成的具有神经毒性的聚集体在阿尔兹海默症(AD)的病情发展中起着重要作用。有充分的证据表明，可溶性AβOs是最重要的有毒物质，具有破坏膜功能的能力，从而可以诱导AD患者中的神经元损伤。AβOs因此被认为是诊断AD的可靠分子生物标志物。因此，对AβO的含量进行检测对AD的早期诊断、指导治疗具有重要的临床意义。

酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前临床检测AβO的常用方法。除此之外，在质谱(MS)、锰增强磁共振成像(MEMRI)、灵活的多分析物分析(xMAP)、免疫组织化学(IHC)、蛋白质印迹、荧光和位置发射断层扫描(PET)是目前用于确定AD生物标志物的技术。尽管有无可置疑的优点，但这些分析方法的主要缺点是耗时、相对昂贵、难以获得、需要大量样品和专用设备。门槛太高，检测的难度、效率、成本以及对专业人员的要求，都给其应用及推广带来多重阻力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种β-淀粉样蛋白寡聚体检测方法，它灵敏度高、特异性好，操作简单方便，成本低廉，更加适用于科学研究及日常检测的应用。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

一种β-淀粉样蛋白寡聚体检测方法，包括以下步骤：

将纳米多孔碳为载体和亚甲基蓝溶液按质量比1：0.2～1：2.0混合，震荡8～10h获得混合溶液一；

向混合溶液一加入浓度是2～20μmol/L的AβO适配体链ssDNA，在20～40℃温度下震荡30～100min，离心洗涤后溶于pH为7.0～8.0的Tris-HCl缓冲溶液，得到混合溶液二；

将待测样品与混合溶液二混合后进行孵育10～70min，获得混合溶液三；

将玻碳电极浸入电解液中电沉积，得到修饰电极一；

将修饰电极一浸入浓度为2μmol/L的捕获探针溶液中，孵育8～10h，得到修饰电极二；

将修饰电极二浸入浓度为2mmol/L的6-巯基己-1-醇溶液中，孵育1～3h，得到修饰电极三；

将修饰电极三插入到混合溶液三中，获得电流信号，基于该电流信号数据获得AβO的含量。

进一步的，所述纳米多孔碳为基于ZIF-8为模板，并在700℃下煅烧处理获得的多孔碳材料ZC-700。

进一步的，所述ZC-700的制作方法包括：

按体积比10:1向浓度为3.5moL/L的2-甲基咪唑溶液中加入浓度为0.5moL/L的Zn(NO₃)₂·6H ₂O溶液，将混合物在室温下搅拌，离心、洗涤、干燥，将得到的产物在700℃进行高温碳化，即得。

进一步的，所述电解液为氯金酸和硫酸的混合溶液，电沉积条件-0.25V(vs.Ag/AgCl),30s，氯金酸的浓度为5mmol/L，硫酸的浓度为0.5mol/L。

进一步的，所述将修饰电极三插入到混合溶液三中包括，使用修饰电极三做工作电极，铂电极做对电极，Ag/AgCl做参比电极。

进一步的，所述基于电流信号数据获得AβO的含量的方法包括：基于不同浓度的AβO标准溶液，得到不同浓度的AβO溶液标准品下的电流数值，按照此绘制标准曲线，得到线性方程。

进一步的，所述待测样品为生物样本，且包括脑脊液、全血、血浆或血清中的任一项。

对比现有技术，本发明的有益效果在于：

本公开的AβO检测方法灵敏度高、特异性好，操作简单方便，成本低廉，不需要昂贵的仪器及生物试剂，针对生物样品的检测具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是本发明ZIF-8的合成及其衍生多孔碳(ZC-T)的制备以及检测AβO的原理图。

图2是不同煅烧温度下获得的多孔碳的透射电镜照片和扫描电镜照片：a、ZIF-8的透射电镜照片和扫描电镜照片；b、ZC-300的透射电镜照片和扫描电镜照片；c、ZC-500的透射电镜照片和扫描电镜照片；d、ZC-700的透射电镜照片和扫描电镜照片；e、ZC-800的透射电镜照片和扫描电镜照片。

图3是不同温度下纳米多孔碳对亚甲基蓝负载量的检测图。

图4是本发明实施例1中ZIF-8的图谱：a、ZIF-8的红外光谱图，b、ZIF-8的X射线衍射光谱图。

图5是本发明实施例1中ZC-700的图谱：a、ZC-700的拉曼光谱图，b、ZC-700的X射线衍射光谱图

图6是本发明50fM-10nM范围内不同浓度的AβO与基于ZC-700的电化学适配体传感器反应释放出亚甲基蓝用于电化学检测得到的电流值随AβO浓度变化而变化的趋势图a以及工作曲线图b。

图7是本发明电化学适配体传感器的特异性检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所限定的范围。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

本申请涉及一种检测AβO的方法，对待测样品进行检测，所述待测样品可以是生物样品。生物样品可以来自哺乳动物受试者或非哺乳动物受试者。哺乳动物受试者可以是，例如，人或其它动物物种。生物样品包括生物体液，诸如全血、血清、血浆、脑脊液等；生物组织，诸如来自器官或其它机体部分的细胞；等等。在许多情况下，所述待测样品是脑脊液、全血、血浆或血清。

该方法的大体框架包括以下步骤：

(1)将纳米多孔碳与亚甲基蓝(MB)溶液混合后震荡，得到混合溶液一；

(2)向溶液一中加入AβO适配体链(ssDNA)，室温震荡，离心洗涤，溶于Tris-HCl缓冲溶液，得到混合溶液二；

(3)将待测样品与混合溶液二混合后进行孵育，获得混合溶液三；

(4)将玻碳电极浸入电解液中电沉积，得到修饰电极一；

(5)将修饰电极一浸入捕获探针溶液中，孵育，得到修饰电极二；

(6)将修饰电极二浸入6-巯基己-1-醇溶液中，孵育，得到修饰电极三；

(7)将修饰电极三插入到混合溶液三中，检测电流信号，将电流数值带入线性方程即可测定AβO的含量。

在步骤(1)中，纳米多孔碳可以通过现有常规步骤制得，也可以使用我方提供的以下优选方法：

按体积比10:1向浓度为3.5moL/L的2-甲基咪唑溶液中加入浓度为0.5moL/L的Zn(NO₃)₂·6H₂O溶液，将混合物在室温下搅拌，离心、洗涤、干燥，将得到的产物分别基于不同温度下进行高温碳化，所使用的温度包括300℃、500℃、700℃、800℃，获到纳米多孔碳材料。

为了进一步提高ZIF-8的衍生多孔碳对亚甲基蓝的负载量，将上述经过不同温度煅烧的多孔碳材料基于比表面积、空体积和孔径进行比较，将在700℃下获得的多孔碳材料，即ZC-700，作为负载亚甲基蓝的容器，以进行下一步实验。

在步骤(1)中，所述ZC-700与亚甲基蓝的质量比为1：0.2～1：2.0，溶液体积为40～500μL，震荡时间为8～10h；为了更好地提高亚甲基蓝的负载量，增加电信号，提高检测的特异性，优选ZC-700与亚甲基蓝的质量比为1：1.25，溶液体积为200μL，震荡时间为10h。

在步骤(2)中，所述AβO的适配体链的浓度为2～20μmol/L，孵育温度为20～40℃，震荡时间为30～100min，Tris-HCl缓冲溶液的pH为7.0～8.0，Tris-HCl缓冲溶液的体积为40～1000μL；为了更好地保证AβO适配体链的活性，发挥更好的作用，优选AβO的适配体链的浓度为17.5μmol/L，孵育温度为37.5℃，震荡时间为60min。Tris-HCl缓冲溶液的pH为7.4,Tris-HCl缓冲溶液的体积为200μL。

在所述步骤(3)中，所述孵育时间为10～70min，为了更好地提高检测特异性，减少操作时间，优选孵育时间为50min。

在步骤(4)中，所述电解液为氯金酸和硫酸的混合溶液，电沉积条件-0.25V(vs.Ag/AgCl),30s，氯金酸的浓度为5mmol/L，硫酸的浓度为0.5mol/L。

在步骤(5)中，所述含捕获探针的溶液浓度为2μmol/L，孵育时间为8～10h。

在步骤(6)中，所述6-巯基己-1-醇溶液浓度为2mmol/L，孵育时间为1.5h。

在步骤(7)中，所述三电极体系中修饰电极做工作电极，铂电极做对电极，Ag/AgCl做参比电极。

对于标准曲线以及线性方程，我们采用以下步骤：

通过制备一系列不同浓度的AβO标准溶液，按照上述检测AβO的方法，得到不同浓度的AβO溶液标准品下的电流数值，按照此绘制标准曲线，得到线性方程。

需要注意的是，AβO的含量检测在生物体诊断中具有重要作用，比如，根据生物体中AβO的含量与阈值0.72μg/L进行比较。本方法满足对AβO的准确检测，从而对阿尔兹海默症进行早期诊断，进行有效治疗，本公开检测AβO的方法均为非诊断目的的检测方法。可以对阿尔兹海默症进行早期诊断，从而进行有效治疗，本公开检测AβO的方法均为非诊断目的的检测方法。

实施例：

1)样本的获得

制备健康人的血清：将人体血样室温下自然凝固2h，离心机10000r离心

10min。取上层清液用于AβO的含量检测，用血清对AβO进行溶解和稀释后再进行检测。

1)纳米多孔碳(ZC-700)的制备：

向80mL 2-甲基咪唑(3.5mol/L)溶液中缓慢加入8mL Zn(NO₃)₂·6H₂ O(0.5mol/L)溶液，室温下搅拌24h，离心，收集反应产物，用水和无水乙醇各洗涤三次，然后置于真空干燥箱60℃干燥48h制得白色产物ZIF-8；将ZIF-8置于管式炉中，氩气吹扫，在不同温度下制得的不同的多孔碳材料(ZC-T)，备用。

通过高温碳化制得的纳米多孔碳材料，如图2所示，为不同温度下获得的纳米多孔碳材料的扫描电镜和透射电镜照片，从图中可以看出，随着实验温度的升高，ZIF-8的结构逐渐坍塌，在700℃之后结构趋于稳定，为正十二面体，直径在100nm左右。如表1所示，为不同温度下的纳米多孔碳材料的比表面积和孔径大小，从表中可以看出ZC-700的孔径最大，负载能力最好。如图3所示，为ZIF-8的红外光谱和X射线衍射光谱。如图4所示，ZC-700的拉曼光谱和X射线衍射光谱。

表1 ZIF-8及其衍生多孔碳(ZC-T)的孔隙结构参数

2)待测样品中AβO的检测：

按以下步骤进行检测

(1)将前述获得的纳米多孔碳ZC-700与亚甲基蓝(MB)溶液混合后震荡，所述ZC-700与亚甲基蓝的质量比为1：1.25，溶液体积为200μL，震荡时间为10h，得到混合溶液一；

(2)向溶液一中加入浓度为17.5μmol/L的AβO适配体链(ssDNA)，37.5℃孵育，震荡60min，离心洗涤，溶于200μL pH为7.4的Tris-HCl缓冲溶液，得到混合溶液二；

(3)将待测样品与混合溶液二混合后进行孵育50min，获得混合溶液三；

(4)以氯金酸和硫酸的混合溶液作为电解液，氯金酸的浓度为5mmol/L，硫酸的浓度为0.5mol/L，将玻碳电极浸入电解液中电沉积，电沉积条件-0.25V(vs.Ag/AgCl),30s，得到修饰电极一；

(5)将修饰电极一浸入2μmol/L捕获探针溶液中，孵育10h，得到修饰电极二；

(6)将修饰电极二浸入2mmol/L 6-巯基己-1-醇溶液中，孵育1.5h，得到修饰电极三；

(7)将修饰电极三插入到混合溶液三中，所述三电极体系中修饰电极做工作电极，铂电极做对电极，Ag/AgCl做参比电极，检测电流信号，将电流数值带入线性方程，可计算得到待测样品中的AβO的浓度。将修饰电极三插入到混合溶液三中，所述三电极体系中修饰电极做工作电极，铂电极做对电极，Ag/AgCl做参比电极,检测电流信号，得到的电流数值为1.76μA，将Ip＝1.76μA代入工作曲线Ip＝0.3099lgc+0.8713，得到lgc为3，即c为1nM，所以AβO的含量为1nM。

检测结果得到的AβO的含量为107.14±1.54pmoL/L。

3)试验结果：

当加入的AβO浓度增大时，ZC-700释放出的亚甲基蓝数量增加，从图1可以看出，当AβO与aptamer结合后，会离开ZC-700表面，使得MB从孔中溢出，从而产生电信号，如图6所示，随着AβO浓度增加，则与AβO结合的aptamer越多，溢出的MB越多，相应的电流数值也增加；检测范围为1.58fM-10nM，检测限为1.58fM，满足实际检测应用。

实施例2：在实施例1的基础上进行的干扰性实验：

为考察本公开方法对AβO的选择性，设计了一系列干扰性试验。具体方案为：

将干扰物和AβO分别采用实施案例1的方法进行检测，所述干扰物AβM、AβF、α-突触核蛋白(α-syn)或Tau蛋白，所述干扰物溶液中，干扰物的浓度设置为10nM，通过试验可知，本公开的检测方法对AβO具有较强的特异性。

具体如图6所示，AβO的浓度为1nM，干扰物的浓度为10nM，干扰物的电流信号明显低于AβO的电流信号。由此可见AβM、AβF、α-突触核蛋白(α-syn)或Tau蛋白对体系构不成干扰。而实际检测时，生物体内AβM、AβF、α-突触核蛋白(α-syn)或Tau蛋白浓度一般低于AβO，更不会对体系构成干扰，影响结果的准确性。

待测样品中AβO的检测：

具体的检测方法如下：

A、将实施例1中已处理好的血清作为溶剂，对AβO进行溶解稀释后，置于离心管中，AβO浓度为100pmol/L；

B、将200mg ZC-700与200μL1.25mg/mL亚甲基蓝(MB)溶液混合后震荡，震荡过夜，加入14μL 17.5μmol/LssDNA，室温震荡60min后,以8000r离心三次，溶于200μLTris-HCl缓冲溶液；

C、取20μL AβO(100pmol/L)与20μL B所述溶液于离心管中混合，在4℃条件下孵育50min，孵育50min完成后，加Tris-HCl缓冲溶液，稀释至500μL，置于烧杯中；

D、将玻碳电极浸入到10mL含有5mmol/L氯金酸和0.5mol/L硫酸的电解质溶液中，进行电沉积，电沉积条件为-0.25V(vs.Ag/AgCl),30s，得到修饰电极一；

E、将上述修饰电极浸入2μmol/L捕获探针溶液中孵育，孵育10h后，得到修饰电极二；

F、将修饰电极二浸入2mmol/L6-巯基己-1-醇溶液中孵育，孵育1.5h后,获得修饰电极三；

G、将修饰电极三插入到B所述烧杯中，修饰电极三做工作电极，铂电极做对电极，Ag/AgCl做参比电极，构建三电极体系，检测溶液电流信号。平行测试三次，将得到的电流值带入到按照该实验例同样方法得到的线性方程中即可计算得到AβO的浓度，检测到的AβO的浓度108.6±3.55pmoL/L。与实施例1相比，含量明显较高，两者结果差异显著。

Claims (7)

1.一种β-淀粉样蛋白寡聚体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

将纳米多孔碳为载体和亚甲基蓝溶液按质量比1：0.2～1：2.0混合，震荡8～10h获得混合溶液一；

向混合溶液一加入浓度是2～20μmol/L的AβO适配体链ssDNA，在20～40℃温度下震荡30～100min，离心洗涤后溶于pH为7.0～8.0的Tris-HCl缓冲溶液，得到混合溶液二；

将待测样品与混合溶液二混合后进行孵育10～70min，获得混合溶液三；

将玻碳电极浸入电解液中电沉积，得到修饰电极一；

将修饰电极一浸入浓度为2μmol/L的捕获探针溶液中，孵育8～10h，得到修饰电极二；

将修饰电极二浸入浓度为2mmol/L的6-巯基己-1-醇溶液中，孵育1～3h，得到修饰电极三；

将修饰电极三插入到混合溶液三中，获得电流信号，基于该电流信号数据获得AβO的含量。

2.根据权利要求1所述一种β-淀粉样蛋白寡聚体检测方法，其特征在于，所述纳米多孔碳为基于ZIF-8为模板，并在700℃下煅烧处理获得的多孔碳材料ZC-700。

3.根据权利要求2所述一种β-淀粉样蛋白寡聚体检测方法，其特征在于，所述ZC-700的制作方法包括：

按体积比10:1向浓度为3.5moL/L的2-甲基咪唑溶液中加入浓度为0.5moL/L的Zn(NO₃)₂·6H₂O溶液，将混合物在室温下搅拌，离心、洗涤、干燥，将得到的产物在700℃进行高温碳化，即得。

4.根据权利要求1所述一种β-淀粉样蛋白寡聚体检测方法，其特征在于，所述电解液为氯金酸和硫酸的混合溶液，电沉积条件-0.25V(vs.Ag/AgCl),30s，氯金酸的浓度为5mmol/L，硫酸的浓度为0.5mol/L。

5.根据权利要求1所述一种β-淀粉样蛋白寡聚体检测方法，其特征在于，所述将修饰电极三插入到混合溶液三中包括，使用修饰电极三做工作电极，铂电极做对电极，Ag/AgCl做参比电极。

6.根据权利要求1所述一种β-淀粉样蛋白寡聚体检测方法，其特征在于，所述基于电流信号数据获得AβO的含量的方法包括：基于不同浓度的AβO标准溶液，得到不同浓度的AβO溶液标准品下的电流数值，按照此绘制标准曲线，得到线性方程。

7.根据权利要求1所述一种β-淀粉样蛋白寡聚体检测方法，其特征在于，所述待测样品为生物样本，且包括脑脊液、全血、血浆或血清中的任一项。

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