KR101699578B1 - 생체 분자 분석 키트 및 이를 이용한 생체 분자 분석 방법 - Google Patents

생체 분자 분석 키트 및 이를 이용한 생체 분자 분석 방법 Download PDF

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Abstract

생체 분자 분석 키트 및 이를 이용한 생체 분자 분석 방법을 제공한다. 생체 분자 분석 키트는 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제1 결합 수단을 포함하는 자성 나노입자, 및 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제2 결합 수단을 포함하는 금속 산화물 나노입자를 포함하며, 생체 분자 분석 방법은 상기 분석 키트 및 유도결합 플라즈마 질량분석기를 이용하여 생체 분자의 농도를 측정하는 과정을 포함한다. 이에 따르면, 전립선 특이 항원을 비롯한 생체 분자의 검출 한계를 현저히 향상시킬 수 있다.

Description

생체 분자 분석 키트 및 이를 이용한 생체 분자 분석 방법{Kit for ananlyzing biomolecules and method for analyzing biomolecules using the same}
본 발명은 생체 분자 분석 키트 및 분석 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항생제 또는 암세포 등과 같은 생체 분자를 정밀하게 분석하기 위한 분석 키트 및 이를 이용한 생체 분자 분석 방법에 관한 것이다.
항생제 또는 암세포 등과 같은 생체 분자를 신속하고 정확하게 분석하는 것은 사회 전반의 의료 및 보건 측면에서 매우 중요하다. 항생제는 인간과 가축의 치료에 널리 사용되고 있으나, 적용 분야에 따라 부작용 및 위험성이 상존하므로 항생제 잔류물의 주의 깊은 모니터링이 필요하다.
또한, 암을 진단 또는 치료하기 위해서는 암의 원인이 되거나 암으로 과다 유발되는 인자를 선택적으로 구별할 수 있어야 한다. 기존의 암 진단 마커가 이러한 원리로 사용되고 있다. 예를 들어, 전립선암 마커인 전립선 특이 항원(prostate-specific antigen, PSA)은 전립선의 세포에서 합성되는 단백질로서, 전립선 이외의 조직에서는 거의 발현되지 않아 전립선암의 선별에 이용되는 유용한 종양 표지자이다. PSA는 건강한 인간의 혈청에 매우 낮은 수치로 존재하나, 전립선암 또는 다른 전립선 질환이 존재하는 경우 PSA 수치가 증가한다. 따라서, 혈청 PSA의 검출은 초기 단계의 전립선암의 진단 및 치료의 추적조사에 유용하게 사용될 수 있다.
그러나, 전립선염, 전립선 비대증 및 전립선 경색 등과 같은 양성 병변들뿐만 아니라, 사정, 전립선 마사지 및 세침생검을 포함한 전립선의 조작에 의해서도 PSA 수치가 증가될 수 있으므로, PSA 수치 테스트에 의한 전립선암 진단의 정확도를 높이는 것은 어려운 문제이다. 또한, PSA는 인간 혈액에서 유리형 또는 복합형 PSA와 같은 다양한 형태로 존재한다. 혈청에서 PSA는 대부분 α1-항키모트립신과 결합된 복합체를 형성하는데, 전립선암에서는 복합형 PSA의 분획이 더욱 높아지고, 유리형 PSA가 낮아진다는 사실이 밝혀졌다. 따라서, PSA의 총량에 대한 유리형 PSA의 비율을 결정하는 것이 진단 정확도를 향상시키기 위해 필요하다.
PSA에 관한 통상적인 검출법은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), SPR 바이오센서, 전기화학적 검출기 등을 이용한 방법으로서, 이들은 1.0 pg/mL 내지 0.1 μg/mL 범위의 검출 한계를 가지며, 약 10 μL 부피의 샘플을 사용한다. 최근에, 혈청 샘플에서 0.10 pg/mL의 검출 한계를 갖는 민감하면서도 특이적인 전기화학적 면역센서가 제안되었다(K. Chuah, L. M. H. Lai, I. Y. Goon, S. G. Parker, R. Amal, J. J. Gooding, Chem . Commun ., 2012, 48, 3503-3505). 이러한 검출 한계는 암 진단을 위한 현재의 PSA 수치보다는 낮지만, 이 방법은 정량화 한계를 보이는 낮은 재현성으로 인해 그 유용성이 제한되는 문제가 있다.
따라서, 우수한 진단 정확도 및 신뢰도를 위해 높은 감도를 갖는 생체 분자의 검출 방법이 여전히 요구되고 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 생체 분자를 높은 검출 감도로 분석할 수 있는 분석 키트 및 이를 이용한 분석 방법을 제공함에 있다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 일 측면은 생체 분자 분석 키트를 제공한다. 상기 분석 키트는 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제1 결합 수단을 포함하는 자성 나노입자; 및 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제2 결합 수단을 포함하는 분광분석용 나노입자를 포함한다.
상기 제1 결합 수단 및 상기 제2 결합 수단은 상기 표적 생체 분자를 항원으로 인식하는 항체일 수 있으며, 상기 항체는 단일클론 항체일 수 있다.
상기 자성 나노입자는 자성 물질을 함유하는 코어 및 상기 코어를 코팅하는 금속 산화물 쉘을 포함할 수 있으며, 상기 제1 결합 수단은 상기 금속 산화물 쉘 상에 위치할 수 있다.
상기 자성 물질은 철, 코발트, 니켈 및 이들의 산화물 중에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으며, 상기 금속 산화물 쉘은 실리카로 이루어질 수 있다.
한편, 상기 분광분석용 나노입자는 금속 또는 제1 금속 산화물을 함유하는 코어 및 상기 코어를 코팅하는 제2 금속 산화물 쉘을 포함할 수 있으며, 상기 제2 결합 수단은 상기 제2 금속 산화물 쉘 상에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 금속 또는 상기 제1 금속 산화물의 금속은 타이타늄, 알루미늄, 구리, 망간, 셀레늄, 아연, 안티몬, 카드뮴, 비소, 붕소, 나트륨, 칼슘, 크롬, 납, 리튬, 마그네슘, 수은, 이트륨, 몰리브덴, 비스무트, 금, 백금, 은, 스트론튬, 주석, 우라늄 및 란타노이드 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 제2 금속 산화물 쉘은 실리카로 이루어질 수 있다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위해 본 발명의 다른 측면은 생체 분자 분석 방법을 제공한다. 상기 분석 방법은 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제1 결합 수단을 포함하는 자성 나노입자를 준비하는 단계; 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제2 결합 수단을 포함하는 분광분석용 나노입자를 준비하는 단계; 상기 자성 나노입자 및 상기 분광분석용 나노입자를 표적 생체 분자와 접촉시켜 상기 표적 생체 분자에 상기 자성 나노입자 및 상기 분광분석용 나노입자가 결합된 복합체를 형성하는 단계; 상기 복합체에 외부 자력을 가하여 상기 복합체를 포집하는 단계; 및 상기 포집된 복합체에 포함된 상기 분광분석용 나노입자를 분광분석기로 분석하는 단계를 포함한다.
또한, 상기 자성 나노입자를 상기 표적 생체 분자와 접촉시키기 전에, 상기 자성 나노입자에 외부 자력을 가하여 상기 자성 나노입자를 포집하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 분광분석용 나노입자를 분광분석기로 분석하는 단계는, 상기 포집된 복합체에서 상기 자성 나노입자를 분리하고, 상기 분리된 자성 나노입자를 외부 자력을 가하여 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 분광분석기는 유도결합 플라즈마 질량분석기 또는 흑연로 원자흡수 분광분석기일 수 있다.
본 발명에 따르면, 종래의 분석 기법에 비해 항생제 및 암 바이오마커 등을 비롯한 생체 분자의 검출 한계를 현저히 향상시킬 수 있으며, 우수한 진단 정확도 및 신뢰도를 제공할 수 있다.
다만, 본 발명의 효과들은 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트(100)의 구성을 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트(100)와 표적 생체 분자(300)와의 결합 관계를 나타낸 개략도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 방법을 개략적으로 나타낸 흐름도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 아민-기능화된 나노입자들의 TEM 이미지들이다
도 5a 및 5b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 항체 고정된 나노입자들의 형광 이미지들이다.
도 6은 표면 개질된 TiO2 나노입자 상의 다양한 기능기들에 대한 FT-IR 스펙트럼이다.
도 7은 나노입자 태깅 및 유도결합 플라즈마 질량분석기(ICP-MS)를 이용하여 전립선 특이 항원(PSA)을 측정하기 위해 설계된 실험 과정의 일 예를 나타낸 개략도이다.
도 8a는 ICP-MS를 이용하여 측정된 TiO2 나노입자의 시간 분해 프로파일을 나타낸 것이며, 도 8b는 TiO2 나노입자 수에 대한 신호 세기를 나타낸 것이다.
도 9는 ICP-MS를 이용하여 측정된 49Ti 신호 세기를 스파이킹된 PSA 농도에 대해 플로팅하여 얻어진 검량선이다.
도 10은 ICP-MS를 이용하여 측정된 49Ti 신호 세기를 스파이킹된 살리노마이신 농도에 대해 플로팅하여 얻어진 검량선이다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예들을 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수 있으며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다. 또한, "포함하다", "함유하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 배제하는 것으로 이해되어서는 안 된다. 또한, "제1" 또는 "제2" 등의 용어는 구성요소들에 어떠한 한정을 가하려는 것이 아니라, 구성요소들을 구별하기 위해 사용되는 것으로 이해되어야 한다.
도면들에 있어서, 층 및 영역들의 두께는 명확성을 기하기 위하여 과장 또는 생략된 것일 수 있다. 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다.
또한, 하기에서 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략할 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트(100)의 구성을 나타낸 개략도이다. 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트(100)와 표적 생체 분자(300)와의 결합 관계를 나타낸 개략도이다.
도 1 및 2에 도시된 바와 같이, 본 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트(100)는 표적 생체 분자(300)와 특이적으로 결합하는 제1 결합 수단(111)을 포함하는 자성 나노입자(110), 및 표적 생체 분자(300)와 특이적으로 결합하는 제2 결합 수단(121)을 포함하는 분광분석용 나노입자(120)를 포함한다. 한편, 도 1 및 2에 도시된 바와는 달리, 자성 나노입자(110) 및 분광분석용 나노입자(120)에는 제1 결합 수단(111) 및 제2 결합 수단(121)이 각각 복수 개로 포함될 수 있다.
생체 분자는 생체 내에서 배출되거나 분리되는 물질로서, 생체에서 생성되는 물질뿐만 아니라, 생체에 투입되어 일정 시간 잔류하는 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 생체 분자는 항생제, 핵산, 호르몬, 효소, 세포, 종양, 암세포, 세균, 바이러스 및 이들의 분비물 등을 포함할 수 있다. 항생제의 예로는 살리노마이신, 엔로플록사신, 시프로플록사신, 페니실린, 세팔로스포린, 카바페넴, 암피실린, 세팔로스포린, 네오마이신, 겐타마이신, 이세파마이신, 시소마이신, 에리트로마이신, 클래리스로마이신, 반코마이신, 타이코플라닌, 린코마이신, 술파티아졸, 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 설파메라진 등을 들 수 있으며, 세포 분비물의 예로는 전립선 세포에서 합성되는 단백질인 전립선 특이 항원 등을 들 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 표적 생체 분자(300)는 적어도 그 일부가 자성 나노입자(110)에 포함된 제1 결합 수단(111) 및 분광분석용 나노입자(120)에 포함된 제2 결합(121) 수단과 특이적으로 결합할 수 있다. 여기서, 특이적으로 결합한다는 의미는 제1 결합 수단(111) 및 제2 결합 수단(121)이 적어도 분석 키트(100)의 필수 요소로 포함된 물질들 중에서는 표적 생체 분자(300)와 선택적으로 결합한다는 의미로 이해되어야 한다. 예를 들어, 표적 생체 분자(300)가 특정 항원으로 인식되는 부위를 포함하는 경우, 제1 결합 수단(111) 및 제2 결합 수단(121)은 표적 생체 분자(300)를 항원으로 인식하는 항체를 포함할 수 있으며, 항원-항체 반응에 의해 자성 나노입자(110)-표적 생체 분자(300)-분광분석용 나노입자(120)의 복합체를 형성할 수 있다. 이때, 항체는 단일클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있으나, 분석 민감도 측면에서 단일클론 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 예시적인 실시예에서, 표적 생체 분자(300)는 살리노마이신(salinomycin) 또는 전립선 특이 항원(PSA)일 수 있으며, 제1 결합 수단(111) 및 제2 결합 수단(121)은 단일클론 IgG(immunoglobulin G) 항체일 수 있다.
상기 자성 나노입자(110)는 자성 물질을 포함하는 수 내지 수십 나노미터 직경의 입자상 구조체로서, 외부 자력에 의해 유동하는 성질을 갖는 물질을 의미한다. 자성 나노입자(110)는 바람직하게는 30 nm 이하의 직경을 가질 수 있으며, 자성 물질은 철, 코발트, 니켈 및 이들의 산화물 중에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있다.
바람직한 예로서, 자성 나노입자(110)는 자성 물질을 함유하는 코어(112) 및 상기 코어(112)를 코팅하는 금속 산화물 쉘(113)을 포함할 수 있다. 즉, 자성 나노입자(110)는 코어-쉘 구조를 가질 수 있으며, 이 경우 금속 산화물 쉘(113)에 의해 자성 물질을 함유하는 코어(112)가 외부의 화학적 환경으로부터 보호될 수 있고, 수용액 분산성이 개선될 수 있다. 상기 금속 산화물 쉘(113)은 실리카로 이루어질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
자성 나노입자(110)가 코어-쉘 구조를 갖는 경우, 제1 결합 수단(111)은 금속 산화물 쉘(113) 상에 위치할 수 있다. 또한, 필요에 따라 금속 산화물 쉘(113)의 표면은 공지된 방법을 통해 아민기 또는 카복실기 등의 적절한 기능기로 개질될 수 있다. 이러한 기능기는 제1 결합 수단(111)과 화학적 결합을 형성하여 금속 산화물 쉘(113)에 제1 결합 수단(111)을 견고하게 고정시키는 역할을 할 수 있다. 또한, 고정화 효율을 향상시키기 위해 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드(EDC) 또는 다이사이클로헥실카보다이이마이드(DCC) 등을 포함하는 물질을 제로 길이 가교제(zero length cross linker)로 사용할 수 있다.
상기 분광분석용 나노입자(120)는 금속 또는 금속 산화물을 포함하는 입자상 구조체로서, 분광분석기에 의해 실질적인 분석 대상으로 사용되는 물질을 의미한다. 상기 분광분석기는 예를 들어, 유도결합 플라즈마 질량분석기(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS) 또는 흑연로 원자흡수 분광분석기(graphite furnace atomic absorption spectrometry, GFAAS)일 수 있으며, 상기 분광분석용 나노입자(120)는 이러한 분석 기기에 의해 그 존부 및 존재량이 확인될 수 있다.
이때, 분광분석용 나노입자(120)의 크기는 자성 나노입자(110)와 유사한 크기를 갖는 것이 바람직하다. 분광분석용 나노입자(120)의 크기가 자성 나노입자(110)의 크기보다 과도하게 큰 경우, 각 분광분석용 나노입자(120)당 다수의 표적 생체 분자가 결합될 수 있고 분광분석기에서 불완전한 해리 및 분무화가 일어날 수 있어 분석시 감도가 감소할 수 있기 때문이다. 또한, 자성 나노입자(110)-표적 생체 분자(300)-분광분석용 나노입자(120)의 복합체에 외부 자력을 가하였을 때 상기 복합체를 끌어당기는 자력이 약해져서 세척 및 포집 과정에서 샘플의 손실을 야기할 수 있다.
바람직한 예로서, 분광분석용 나노입자(120)는 금속 또는 제1 금속 산화물을 함유하는 코어(122) 및 상기 코어를 코팅하는 제2 금속 산화물 쉘(123)을 포함할 수 있다. 즉, 분광분석용 나노입자(120)는 코어-쉘 구조를 가질 수 있으며, 이 경우 제2 금속 산화물 쉘(123)에 의해 상기 금속 또는 제1 금속 산화물을 함유하는 코어(122)가 외부의 화학적 환경으로부터 보호될 수 있다. 상기 금속 또는 상기 제1 금속 산화물의 금속으로는 원소 주기율표상의 모든 금속 원소가 사용될 수 있다. 예시적인 실시예에서, 상기 금속 원소는 타이타늄, 알루미늄, 구리, 망간, 셀레늄, 아연, 안티몬, 카드뮴, 비소, 붕소, 나트륨, 칼슘, 크롬, 납, 리튬, 마그네슘, 수은, 이트륨, 몰리브덴, 비스무트, 금, 백금, 은, 스트론튬, 주석, 우라늄 및 란타노이드 중에서 선택될 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니며, 분광학적 검출이 가능한 다양한 금속 원소가 사용될 수 있고, 각 금속이 보유하는 고유한 동위원소 질량이 검출에 활용될 수 있다. 한편, 상기 제2 금속 산화물 쉘(123)은 실리카로 이루어질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
분광분석용 나노입자(120)가 코어-쉘 구조를 갖는 경우, 상기 제2 결합 수단(121)은 제2 금속 산화물 쉘(123) 상에 위치할 수 있다. 또한, 필요에 따라 제2 금속 산화물 쉘(123)의 표면은 공지된 방법을 통해 아민기 또는 카복실기 등의 적절한 기능기로 개질될 수 있다. 이러한 기능기는 제1 결합 수단(111)과 화학적 결합을 형성하여 금속 산화물 쉘(123)에 제1 결합 수단(121)을 견고하게 고정하는 역할을 할 수 있다. 또한, 고정화 효율을 향상시키기 위해 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드(EDC) 또는 다이사이클로헥실카보다이이마이드(DCC) 등을 포함하는 물질을 제로 길이 가교제로 사용할 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 방법을 개략적으로 나타낸 흐름도이다.
도 3을 참조하면, 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제1 결합 수단을 포함하는 자성 나노입자 및 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제2 결합 수단을 포함하는 분광분석용 나노입자를 각각 준비한다(S10, S20). 여기서, 표적 생체분자, 제1 결합 수단을 포함하는 자성 나노입자, 및 제2 결합 수단을 포함하는 분광분석용 나노입자는 도 1 및 2를 참조하며 설명한 바와 같다. 즉, 본 실시예에서 설명하는 생체 분자 분석 방법은 상술한 분석 키트를 사용하여 표적 생체 분자를 분석하는 과정을 포함한다.
상기 준비된 자성 나노입자 및 분광분석용 나노입자를 표적 생체 분자와 접촉시켜 상기 표적 생체 분자에 상기 자성 나노입자 및 상기 분광분석용 나노입자가 결합된 복합체를 형성한다(S30). 즉, 자성 나노입자 및 분광분석용 나노입자는 각각 제1 결합 수단 및 제2 결합 수단에 의해 표적 생체 분자와 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 표적 생체 분자가 살리노마이신 또는 전립선 특이 항원 등과 같이 항원으로 인식되는 부위를 포함하고, 제1 결합 수단 및 제2 결합 수단이 표적 생체 분자에 대한 항체로서 작용하는 경우, 항원-항체 반응을 통해 표적 생체 분자에 자성 나노입자 및 분광분석용 나노입자가 결합된 복합체를 형성할 수 있다.
한편, 자성 나노입자를 표적 생체 분자와 접촉시키기 전에, 자성 나노입자에 외부 자력을 가하여 자성 나노입자를 포집하는 단계를 더 수행할 수도 있다. 이에 의하면, 자성 나노입자의 준비 과정에서 포함될 수 있는 다른 불순물로부터 자성 나노입자만을 선택적으로 분리할 수 있다.
다음, 자성 나노입자 및 분광분석용 나노입자가 결합된 복합체에 외부 자력을 가하여 상기 복합체를 포집한다(S40). 예를 들어, 영구 자석 또는 전자석 등과 같은 자기장 발생 장치를 상기 복합체에 인접시키는 경우, 상기 복합체에 포함된 자성 나노입자에 자력이 가해질 수 있으므로 상기 복합체를 다른 물질로부터 선별하여 포집할 수 있다. 따라서, 외부 자력을 가하여 상기 복합체를 용이하게 수집하여 농축할 수 있으며, 불순물의 간섭을 최소화함으로써 표적 생체 분자에 대한 측정 민감도를 향상시킬 수 있다.
포집된 복합체에 포함된 분광분석용 나노입자를 분광분석기로 분석한다(S50). 상기 분광분석기는 유도결합 플라즈마 질량분석기 또는 흑연로 원자흡수 분광분석기일 수 있다. 다만, 다중 검출(multiplex detection)을 위해서는 유도결합 플라즈마 질량분석기를 사용하는 것이 바람직하다. 유도결합 플라즈마 질량분석기에서 분광분석용 나노입자는 아르곤 플라즈마에 의해 이온화되며, 생성된 이온들은 질량분석기에서 분리되고 정량화된다. 분석기로부터 측정된 신호는 생체 분자의 농도에 비례하므로, 이를 통해 분광분석용 나노입자와 결합된 표적 생체 분자의 농도를 측정할 수 있다.
또한, 상기 분광분석용 나노입자를 분광분석기로 분석하는 단계는 상기 복합체에서 상기 자성 나노입자를 분리하고, 상기 분리된 자성 나노입자를 외부 자력을 가하여 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 자성 나노입자의 분리는 질산 등과 같은 산 용액을 이용하여 수행할 수 있으며, 이 경우 분광분석용 나노입자를 이용한 측정 민감도를 더욱 향상시킬 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실험예를 제시한다. 다만, 하기의 실험예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1: 자성 나노입자의 제조>
FeCl3·6H2O와 FeCl2·4H2O의 알칼리 공침(alkaline co-precipitation)법을 이용하여 초상자성 Fe3O4 나노입자를 제조하였다. FeCl2·4H2O (0.5g)과 FeCl3·6H2O (1.35g)의 용액을 25mL의 탈이온수가 담긴 둥근 바닥 플라스크에서 불활성 조건 하에서 자석 교반기로 혼합하였다. 상기 용액을 80℃로 가열한 후, 상기 용액에 수산화암모늄(28~30%, Sigma-Aldrich Chem. Co., USA)을 첨가하고 나서 20분 동안 추가로 가열하였다. 실리카 코팅을 위해, 80mL의 무수 에탄올과 20mL의 탈이온수를 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 100mg의 Fe3O4 나노입자를 첨가하였다. 수산화암모늄을 사용하여 pH를 9로 조절한 후에, 200μL의 테트라에틸 오쏘실리케이트(TEOS; 99.999%, Sigma-Aldrich Chem. Co., USA)를 불활성 조건 하에서 첨가하였다. 이에 따라, Fe3O4 코어-SiO2 쉘 구조의 나노입자(Fe3O4@SiO2 NP)를 수득하였다.
<제조예 2: 분광분석용 나노입자의 제조>
에탄올에 녹인 타이타늄 이소프로폭사이드(TTIP, 97%, Sigma-Aldrich Chem. Co., USA)와 수산화암모늄(28~30%, Sigma-Aldrich Chem. Co., USA)을 사용하여 졸-겔법에 의해 TiO2 나노입자를 제조하였다. 9mL의 에탄올 용매에 녹인 6mL의 TTIP를 2.7mL의 수산화암모늄에 첨가하면서 2,000rpm으로 교반하며 반응시켰다. 용매를 증발시킨 후 분말형 TiO2 나노입자를 얻었다. 실리카 코팅을 위해, 0. 48 ㎖ 수산화암모늄의 첨가 후에, 에탄올 (50 ㎖), 물 (20 ㎖) 및 TEOS (0.8 ㎖)의 혼합물을 점적 첨가하였다. 이에 따라, TiO2 코어-SiO2 쉘 구조의 나노입자(TiO2@SiO2 NP)를 수득하였다.
<제조예 3: 나노입자들 상에 항체 고정>
전립선 특이 항원(PSA)의 항체로서 단일클론 IgG를 제조예 1에서 제조된 자성 나노입자 및 제조예 2에서 제조된 분광분석용 나노입자에 각각 고정시켰다. 이를 위해, 상기 나노입자들의 표면을 3-아미노프로필트라이에톡시실란(APTES; 99%, Sigma-Aldrich Chem. Co., USA), N,N-다이메틸포름아마이드(DMF; 무수 99.8%, Sigma-Aldrich Chem. Co., USA), 및 톨루엔(무수 99.8%, Sigma-Aldrich Chem. Co., USA)을 사용하여 아민기로 기능화하였다. 각각의 나노입자들을 톨루엔으로 세척한 후에 12mL의 DMF 및 8mL의 톨루엔에 현탁시켰다. 그 다음, APTES를 니들 시린지(needle syringe)를 이용하여 천천히 첨가하여 아민기로 기능화된 나노입자들을 제조하였다. 아민-기능화된 나노입자들을 톨루엔으로 세척한 후에, 인산완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS) 완충액(x10, Sigma-Aldrich)에 녹인 IgG(인간 혈장으로부터 수득, >95%, Abcam, UK) 20μL를 첨가하여 항체를 고정하였다. IgG 항체는 아마이드 결합을 통해 각각의 나노입자에 고정되었으며, 이러한 결합의 형성은 흡착과 비교하여 안정성을 향상시키고, 샘플 처리 과정 동안 샘플의 손실을 최소화하였다. 고정화 효율은 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드(EDC)와 N-하이드록시석신이미드(NHS)의 2:1 혼합물을 카복실기의 활성화를 위한 제로 길이 가교제로 사용하여 증가시켰다. 그 다음, IgG가 고정된 나노입자들을 원심분리하고 PBS 용액으로 세척하였다.
<분석예 1: 아민-기능화된 나노입자들의 크기 및 모양 측정>
제조된 나노입자들의 크기 및 모양을 투과전자현미경(transmission electron microscope. TEM)(JEM1010, JEOL, Japan)으로 확인하였다.
도 4는 제조예 3에서 제조된 아민-기능화된 나노입자들의 TEM 이미지들이다. 구체적으로, (a)는 아민-기능화된 Fe3O4 코어-SiO2 쉘 나노입자의 TEM 이미지이고, (b)는 아민 기능화된 TiO2 코어-SiO2 쉘 나노입자의 TEM 이미지이다. Fe3O4 나노입자 코어 및 TiO2 나노입자 코어 크기는 각각 10.1nm 및 11.2nm로 유사하였다. 그러나, 반응 제어의 어려움 때문에 TiO2 나노입자의 실리카 쉘(5.9nm)은 Fe3O4 나노입자의 실리카 쉘(2.8nm)보다 두꺼웠다. Fe3O4 코어-SiO2 쉘 나노입자 및 TiO2 코어-SiO2 쉘 나노입자에 대한 아민-기능화된 나노입자의 최종 크기는 각각 14.3nm 및 19.8nm이었다. Fe3O4 나노입자는 통상적으로 30nm보다 작은 직경을 나타내어 초상자성 특성을 가질 정도로 충분히 작았으며, TiO2 나노입자도 이와 유사한 크기를 가졌다.
<분석예 2: 항체 고정된 나노입자들의 형광 측정>
제조된 각 나노입자들에 존재하는 항체는 FITC(fluorescein isothiocyanate)로 태그된 이차 항체의 비특이적 결합을 통해 실험실에서 제작한 레이저 유도 형광 현미경(laser induced fluorescence microscope, LIFM)을 사용하여 확인하였다.
도 5a 및 5b는 제조예 3에서 제조된 항체 고정된 나노입자들의 형광 이미지들이다. 도 5a는 항체 고정된 Fe3O4 코어-SiO2 쉘 나노입자에 대해 얻어진 형광 이미지이며, 도 5b는 항체 고정된 TiO2 코어-SiO2 쉘 나노입자에 대해 얻어진 형광 이미지이다. 도 5a 및 5b를 참조하면, 레이저를 조사하지 않은 경우(각 도면의 왼쪽 이미지) 형광이 관찰되지 않았으나, 473nm DPSS 레이저(50mW, BL473T-050, SLOC)를 조사한 경우 태그된 항체로부터 521nm 파장의 강한 형광이 관찰되었다(각 도면의 오른쪽 이미지).
<분석예 3: 표면 개질된 TiO2 나노입자 상의 기능기 확인>
푸리에 변환 적외선 분광기(FT-IR; Spectrun100, PerkinElmer Co.)를 사용하여 표면 개질된 TiO2 나노입자 상의 다양한 기능기들을 확인하였다.
도 6은 표면 개질된 TiO2 나노입자 상의 다양한 기능기들에 대한 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 처음에, TiO2 나노입자 코어의 스펙트럼은 1634 cm-1 및 1428 cm-1에서 강한 피크를 나타내었다. TiO2 나노입자 코어를 실리카로 코팅한 경우에는 889 cm-1에서 강한 피크가 나타났으며, 이는 TiO2 나노입자 코어 상에 실리카층이 존재함을 보여주는 Si-OH 결합의 선형 진동의 특성 피크에 해당한다. 아민-기능화된 나노입자의 경우에는 이러한 특성 피크들은 사라졌으며, 아킬기의 sp3 C-H 신축 진동에 해당하는 새로운 피크가 2952 cm-1에서 나타났다. 미량의 일차 아민기(-NH2) 또한 1610 cm-1 및 1550 cm-1 사이의 지문 영역(fingerprint region)에서 관찰되었다. 항체를 고정시킨 경우 이러한 피크들은 사라졌으며, 항체의 작은 특성 피크들이 1645 cm-1에서 -NHCO-(아마이드)기에 관해 나타났다.
<분석예 4: 전립선 특이 항원(PSA) 측정>
도 7은 제조예 3에서 제조된 나노입자들 및 유도결합 플라즈마 질량분석기(ICP-MS)를 이용하여 전립선 특이 항원(PSA)을 측정하기 위해 설계된 실험 과정의 일 예를 나타낸 개략도이다.
도 7에 나타내 바와 같이, 단일클론 IgG 항체가 고정된 자성 나노입자 및 TiO2 나노입자를 준비한 다음, 자성 나노입자는 샘플에서 표적 PSA를 추출하기 위해 사용하였으며, TiO2 나노입자는 입자 태깅(particle tagging)을 위해 사용하였다. 즉, 본 실험에서 두 종류의 나노입자는 서로 구별되어 사용되는데, 자성 나노입자의 사용은 샘플 농축에 의해 감도를 향상시키고 영구자석의 도움으로 세척을 위한 편의를 제공하는 장점이 있다. 상기 자성 나노입자에 항체를 고정시킨 후에, PBS 용액에 용해된 1% 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA, Sigma-Aldrich)을 첨가하여 미반응 아민기를 억제하였다. 그 다음, 두 가지 다른 나노입자들을 항원-항체 반응을 통해 PSA(abcam Inc., USA)와 결합시켜 샌드위치형 복합체를 형성하였다. ICP-MS 분석시 배경 감소(background reduction)를 위해, 복합체를 초음파 처리하고 탈이온수로 세척하였다. 정량화를 위해, 상기 자성 나노입자를 0.33 M 질산을 사용하여 TiO2 나노입자로부터 분리하고 영구자석을 사용하여 제거하였다. 태그된 TiO2 나노입자로부터의 49Ti 신호를 플로우 인젝터(flow injector)를 구비한 ICP-MS(Rheodyne, Analytical Injector 9725, USA)를 사용하여 측정하였으며, 이는 PSA의 농도에 비례하였다.
ICP - MS 를 사용하여 태그된 TiO 2 나노입자의 검출
PSA에 적용하기 전에, 질산에 녹인 항체 고정 TiO2 NPs를 ICP-MS에 주입하였다. 48Ti는 PBS 용액 내의 48Ca+, 31P17O+, 14N17O2 +, 36Ar12C+, 13C35Cl+, 32S16O+, 96Zr++ 이온들에 의해 상당히 간섭되기 때문에, 정량화를 위해 49Ti 신호를 사용하는 경우 모든 나노입자들을 0.33M HNO3에 녹였다. 또한, PBS 버퍼로부터의 31P18O+의 스펙트럼 간섭에 기인한 일정 수준의 배경 간섭(background interference)의 문제도 있으므로 배경 공제(background subtraction)를 수행하였다. 도 8a에 나타낸 바와 같이, 플로우 인젝션(flow injection)에 대한 시간-분해 피크의 모양은 작은 테일링(tailing)을 보이며 편향되었다. 피크들을 적분한 경우, 도 8b에 도시된 바와 같이, 검량선(calibration curve)은 0.9987의 선형 회귀 계수(linear regression coefficient)를 나타내었으며, 검량선으로부터 결정된 검출 가능한 최소 입자수는 5.7 × 105이었다. TiO2 입자수는 TEM 이미지에서 얻은 입자 크기 및 4.2 g/mL의 밀도로부터 추정하였다.
ICP - MS 를 사용하여 얻은 49 Ti 신호를 갖는 스파이킹된 PSA ( spiked PSA )의 검량선 분석
설계된 실험 과정을 인간 혈액의 혈청 샘플에 적용하였다. 혈청 샘플은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 사로부터 구입하였으며, 단백질과 지방을 제거하기 위해 처리하였다. 펨토몰(femtomole)의 범위에서 공지량의 PSA를 PBS 버퍼에 섞은 경우(spiking), 4회 반복 측정에 대해 2.5 fg/mL ~ 87 ng/mL PSA의 농도에서 15%의 상대 표준 편차를 갖는 0.928의 선형 회귀 계수가 검량선으로부터 얻어졌다. 이때, 항체 고정된 자성 나노입자는 표적 PSA에 대해 과량으로 사용하였으며, 그렇지 않으면 선형 동적 영역(linear dynamic region)이 짧아졌다. 혈청 매트릭스에서 실증하기 위해, 도 9에 도시된 바와 같이 PSA를 87 fg/mL 내지 3.5 ng/mL의 농도 범위에서 스파이킹하였다.
버퍼 내 TiO2 나노입자의 경우와는 달리, 항원-항체 반응 동안의 비특이적 결합으로 인해 상대적으로 높은 편차가 관찰되었다. BSA 억제제의 첨가에 이은 초음파 처리는 배경 간섭을 22% 이상 감소시켰으나, 여전히 높은 수치여서 배경 공제가 필요하였다. 49Ti의 신호 세기를 스파이킹된 PSA의 농도에 대해 플로팅한 경우, 항원-항체 반응에 대해 특성 곡선이 로그 함수적으로 얻어졌다. 도 9에 나타난 바와 같이, 상기 곡선의 선형 회귀 계수(R2)는 0.916이었으며, 검량선으로부터 1.16 fg/mL의 검출 한계가 얻어졌는데, 이는 암 진단을 위한 현재의 PSA 수치보다 3.44×106배 이상 낮은 값이다. 즉, 1.0 pg/mL to 0.1 ㎍/mL의 범위의 검출 한계를 갖는 것으로 알려진 ELISA 또는 전기화학적 검출과 같은 기존의 분석법과 비교하여 본 발명에 따른 분석법은 2,630배 이상 우수한 검출 능력을 제공함을 알 수 있다.
<분석예 5: 살리노마이신 측정>
표적 생체 분자로서 살리노마이신을 사용한 것을 제외하고는, 상기 분석예 4와 동일한 방법을 통해 항생제로서 사용되는 살리노마이신의 농도를 측정하였다.
도 10은 ICP-MS를 이용하여 측정된 49Ti 신호 세기를 스파이킹된 살리노마이신 농도에 대해 플로팅하여 얻어진 검량선이다. 살리노마이신은 20 fg/mL 내지 200 ng/mL의 농도 범위에서 측정하였으며, 선형 회귀 계수(R2)는 0.83이었다.
이상 살핀 바와 같이, 본 발명에 따른 분석법을 적용하는 경우 바이오마커 및 항생제 등과 같은 생체 분자의 검출을 fg/mL 단위의 매우 낮은 농도에서 가능하도록 해주며, 우수한 진단 정확도 및 신뢰도를 바탕으로 생물학적 샘플 내 다양한 형태의 생체 분자의 임상적 연구에 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있다.
이상, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않고, 본 발명의 기술적 사상 및 범위 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형 및 변경이 가능하다.
100: 생체 분자 분석 키트 110: 자성 나노입자
111: 제1 결합수단 120: 분광분석용 나노입자
121: 제2 결합수단 300: 생체 분자

Claims (13)

  1. 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제1 결합 수단을 포함하는 자성 나노입자; 및
    표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제2 결합 수단을 포함하는 분광분석용 나노입자를 포함하고,
    상기 자성 나노입자는 자성 물질을 함유하는 제1 코어 및 상기 제1 코어를 코팅하는 제1 실리카 쉘을 포함하며,
    상기 제1 결합 수단은 상기 제1 실리카 쉘 상에 위치하고,
    상기 분광분석용 나노입자는 티타늄 산화물을 함유하는 제2 코어 및 상기 제2 코어를 코팅하는 제2 실리카 쉘을 포함하며,
    상기 제2 결합 수단은 상기 제2 실리카 쉘 상에 위치하고,
    상기 표적 생체 분자는 전립선 특이 항원 또는 살리노마이신이고,
    상기 분광분석용 나노입자는 유도결합 플라즈마 질량분석을 위한 나노입자이며,
    상기 제1 결합 수단 및 제2 결합 수단은 각각, 상기 표적 생체 분자를 항원으로 인식하는 항체이고,
    상기 제1 실리카 쉘은 표면이 아민기로 개질되어 상기 제1 결합 수단이 고정되되, 소혈청 알부민에 의해 미반응 아민기가 억제되어 있으며,
    상기 자성 나노입자는, 상기 표적 생체 분자에 대해 결합된 상기 자성 나노입자 및 상기 분광분석용 나노입자의 복합체로부터 초음파 처리된 후 분리되는 생체 분자 분석 키트.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 단일클론 항체인 생체 분자 분석 키트.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 자성 물질은 철, 코발트, 니켈 및 이들의 산화물 중에서 선택되는 적어도 어느 하나인 생체 분자 분석 키트.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제1 결합 수단을 포함하는 자성 나노입자를 준비하는 단계;
    표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제2 결합 수단을 포함하는 분광분석용 나노입자를 준비하는 단계;
    상기 자성 나노입자 및 상기 분광분석용 나노입자를 표적 생체 분자와 접촉시켜 상기 표적 생체 분자에 상기 자성 나노입자 및 상기 분광분석용 나노입자가 결합된 복합체를 형성하는 단계;
    상기 복합체에 외부 자력을 가하여 상기 복합체를 포집하는 단계; 및
    상기 포집된 복합체에 포함된 상기 분광분석용 나노입자를 유도결합 플라즈마 질량분석기로 분석하는 단계를 포함하고,
    상기 자성 나노입자를 상기 표적 생체 분자와 접촉시키기 전에,
    상기 자성 나노입자에 외부 자력을 가하여 상기 자성 나노입자를 포집하는 단계를 더 포함하고,
    상기 분광분석용 나노입자를 분광분석기로 분석하는 단계는, 상기 포집된 복합체에서 상기 자성 나노입자를 분리하고, 상기 분리된 자성 나노입자를 외부 자력을 가하여 제거하는 단계를 더 포함하며,
    상기 자성 나노입자는 자성 물질을 함유하는 제1 코어 및 상기 제1 코어를 코팅하는 제1 실리카 쉘을 포함하고,
    상기 분광분석용 나노입자는 티타늄 산화물을 함유하는 제2 코어 및 상기 제2 코어를 코팅하는 실리카 쉘을 포함하며,
    상기 표적 생체 분자는 전립선 특이 항원 또는 살리노마이신이고,
    상기 제1 결합 수단 및 제2 결합 수단은 각각, 상기 표적 생체 분자를 항원으로 인식하는 항체이며,
    상기 제1 실리카 쉘을 표면이 아민기로 개질되어 상기 제1 결합 수단이 고정되되, 소혈청 알부민에 의해 미반응 아민기가 억제되어 있으며,
    상기 자성 나노입자는, 상기 포집된 복합체로부터 초음파 처리된 후 분리되는 생체 분자 분석 방법.
  11. 삭제
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