KR101768146B1 - 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서 및 이를 이용한 베타아밀로이드의 검출방법 - Google Patents

베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서 및 이를 이용한 베타아밀로이드의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따르면, 금 나노입자와 아포리포단백질 E4를 포함하는 나노 플라즈모닉 센서는 시료 내에 존재하는 베타아밀로이드를 검출하기 위한 것으로, 특히, 베타아밀로이드 42에 특이적으로 반응하기 때문에, 베타아밀로이드 40과 베타아밀로이드 42를 효과적으로 구별할 수 있다.
본 발명에 따른 나노 플라즈모닉 센서는 시료 내에 존재하는 베타아밀로이드와 금 나노입자가 자기조립을 통해 응집되는 것을 유도하고, 이를 검출하는 것으로, 베타아밀로이드의 함량이 시료 내에 아주 미량 존재한다 하더라도 정량 혹은 정성적으로 측정할 수 있다.

Description

베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서 및 이를 이용한 베타아밀로이드의 검출방법{nanoplasmonic sensor for detecting of beta-amyloid and detecting method beta-amyloid using the sensor}
본 발명은 베타아밀로이드 응집 현상을 분석하고 검출할 수 있는 나노 플라즈모닉 센서 및 이를 이용한 베타 아밀로이드 검출방법에 관한 것이다.
일반적으로, 알츠하이머병은 두뇌의 신경 세포가 줄어들면서 인지능력 감퇴, 비가역적 기억손실, 방향감각 상실 및 언어능력 손상 장애를 특징으로 하는 진행성 신경퇴행성 질병이다. 현재까지 알려진 알츠하이머병의 가장 대표적인 증상 또는 예후는 베타아밀로이드(Aβ)의 집적에 의한 응집이 있다. 이러한 증상으로 인해 환자의 뇌에서는 베타아밀로이드 플라그(plaques)가 나타난다.
이때, 베타아밀로이드 중에서도 베타아밀로이드 40(Aβ40)은 병독성이 거의 없는데 반해, 베타아밀로이드 42(Aβ42)는 병독성이 매우 크고, 다량으로 생성될 경우 피브릴(fibril)을 형성하게 되고, 피브릴이 모여 플라크를 형성하게 되는 것으로, 아밀로이드 침전을 유발하기 때문에 알츠하이머병의 주요 원인이다.
이러한 알츠하이머병의 진단을 위하여, 상기 베타아밀로이드 응집물 또는 베타아밀로이드 피브릴을 비침습적 생체분자영상을 이용하여 정량적으로 검출할 수 있는, 형광을 가진 다양한 화합물들이 연구되어 왔다. 이들의 가장 대표적인 예로, 콩고 레드가 있는데, 효과적으로 베타아밀로이드 피브릴을 검출할 수는 있지만 살아있는 사람에게 사용시 뇌혈관장벽을 통과할 수 없어, 검출가능한 양을 뇌에서 얻는 것이 어려워 부검시에만 사용이 가능하다는 단점이 있다.
콩고 레드 외에 개발된 티오플라빈-T(Thioflavin T, ThT) 계통의 유도체들 역시, 양이온과 음이온으로 하전되어 있어, 뇌혈관장벽을 통과하는 것이 매우 제한적이여서 실제로 사용하기가 어려웠다. 게다가 살아있는 생체내에서 알츠하이머병을 진단할 수 없다.
알츠하이머병은 아직까지 치료제가 발견되지 않은 만큼 진행속도를 늦추는 요법이 유일하기 때문에, 상기 개발된 진단시약의 문제점을 보완함과 동시에 베타아밀로이드 피브릴이 형성되기 이전에 치매를 진단할 수 있는 조기 진단용 시약에 대한 관심이 증가하면서, 베타아밀로이드 올리고머도 알츠하이머병의 조기 진단을 위한 새로운 표적으로 떠오르게 되었다.
대한민국 등록특허 제10-1282885호
따라서 본 발명의 목적은 베타아밀로이드 특히, 베타아밀로이드 42를 국소 표면 플라즈몬 공명 현상을 이용하여 검출할 수 있는 나노 플라즈모닉 센서를 제공하는 것이다.
이는 알츠하이머 질환의 조기진단을 위해 나노입자를 활용하여 극미량의 베타아밀로이드 42를 검출할 수 있는 것으로, 실시간으로 모니터링이 가능하므로 질병 예방에 활용이 가능하다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서를 이용하여 베타아밀로이드를 고감도로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서를 포함하고 있는 베타아밀로이드 검출장치를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아민 또는 티올 또는 알킬 말단기를 포함하는 실란화합물로 표면처리된 기판; 및 상기 기판 상에 고정된 복수 개의 금 나노입자를 포함하는 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서를 제공한다.
상기 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서는 아포리포단백질 E4를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 금 나노입자의 평균 직경은 40 내지 60 ㎚인 것을 특징으로 한다.
상기 아포리포단백질 E4는 상기 금 나노입자와 이격되어 유동성을 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 기판 상에 고정된 복수 개의 금 나노입자는 서로 이격되어 배치되어 있고, 상기 금 나노입자 간의 이격거리는 금 나노입자 직경에 대해 1.5 내지 3.5 배인 것을 특징으로 한다.
상기 금 나노입자는 국소 표면 플라즈몬 공명 현상을 나타내는 것을 특징으로 한다.
상기 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서는 인 비트로(in vitro) 상태에서 시료를 분석하는 것을 특징으로 한다.
상기 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서는 검출한계가 1 내지 10 pM인 것을 특징으로 한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여,
ⅰ) 상기 나노 플라즈모닉 센서를 베타아밀로이드 응집물을 포함하는 시료에 노출시키는 단계;
ⅱ) 상기 ⅰ) 단계의 노출을 통해 상기 시료 내의 베타아밀로이드와 상기 나노 플라즈모닉 센서가 반응하여 금 나노입자-베타아밀로이드 복합체를 형성하는 단계; 및
ⅲ) 상기 ⅱ) 단계에서 형성된 금 나노입자-베타아밀로이드 복합체를 암시야 현미경과 레일리-산란 스펙트로스코피를 이용하여 광산란 스펙트럼을 측정하고 최대파장 이동도를 측정하는 단계;를 포함하는 베타아밀로이드의 검출방법을 제공한다.
상기 ⅱ) 단계는 30 내지 60 분 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.
상기 ⅲ) 단계에서 측정된 최대파장 이동도를 통해 베타아밀로이드를 정량적 혹은 정성적으로 검출하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 ⅰ) 단계는 인 비트로(in vitro) 상태에서 수행되는 것을 특징으로 한다.
상기 베타아밀로이드는 베타아밀로이드 42(Aβ42)인 것을 특징으로 한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여,
입사광을 제공하는 광원부;
상기 입사광에 의해 베타아밀로이드 응집물의 종류와 함량에 따라 표면 플라즈몬 공명 현상이 유도되는 상기 나노 플라즈모닉 센서; 및
상기 표면 플라즈몬 공명 현상에 의해 상기 금 나노입자들에서 방출되는 방출광의 공명 파장을 검출하는 검출부;를 포함하는 베타아밀로이드 검출장치를 제공한다.
본 발명에 따르면, 시료 내에 존재하는 베타아밀로이드를 검출하기 위한 것으로, 특히, 베타아밀로이드 42에 특이적으로 반응하기 때문에, 베타아밀로이드 40(Aβ40)과 베타아밀로이드 42(Aβ42)를 효과적으로 구별할 수 있다.
본 발명에 따른 나노 플라즈모닉 센서는 시료 내에 존재하는 베타아밀로이드와 금 나노입자가 자기조립을 통해 응집되는 것을 유도하고, 이를 검출하는 것으로, 베타아밀로이드의 함량이 시료 내에 아주 미량 존재한다 하더라도 정량 혹은 정성적으로 측정할 수 있다.
상술한 특징으로 인해, 상기 나노 플라즈모닉 센서를 이용한 검출 방법은 초고감도로 베타아밀로이드 특히 베타아밀로이드 42(Aβ42)를 검출할 수 있으므로, 피검사자의 뇌척수액으로부터 신속하고 간편하고 정확하게 알츠하이머병의 조기진단이 가능할 뿐만 아니라, 피검사자의 혈액을 통해서도 질환을 조기에 진단할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 나노 플라즈모닉 센서는 뇌척수액에 존재하는 다른 생체분자에는 반응하지 않고 특이적으로 베타아밀로이드에 대해서 반응하기 때문에, 상기 피검사자의 생체로부터 얻은 뇌척수액의 경우 별도의 정제과정 또는 처리과정 없이 바로 본 발명에 따른 나노 플라즈모닉 센서에 로딩함으로써 베타아밀로이드를 정량적 혹은 정성적으로 검출할 수 있다.
따라서, 알츠하이머병의 대표적인 예후인 베타아밀로이드 특히 베타아밀로이드 42의 함량을 검출할 수 있기 때문에, 조기에 진단이 불가능했던 알츠하이머병을 초기에 검진할 수 있으므로, 고령화시대에 가장 중요한 질병인 알츠하이머의 예방뿐만 아니라 치료시기를 놓치지 않도록 할 수 있다.
도 1(A)는 본 발명의 원리를 보여주는 개략도이다.
도 1(B)는 본 발명에 따른 베타아밀로이드 응집물 검출 과정을 나타내는 도면으로, 베타아밀로이드 응집물에 따라 레일리 산란 최대파장 이동도가 발생하는 이유를 검출 과정을 통해 나타내고 있다.
도 2(A)는 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자(~50 nm)의 HR-TEM 이미지이다.
도 2(B)는 1000 배 배율에서 노출된 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자(~50 nm)의 다크필드(Dark image) 이미지이다.
도 2(C)는 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자(AuNPs)의 UV-vis 흡수 스펙트럼이다.
도 3(A)은 베타아밀로이드 42(Aβ42)를 포함되지 않은 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자(bare AuNP)와, 제조예 3으로부터 제조된 베타아밀로이드 42(Aβ42) 용액에 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자를 노출한 것(+Aβ42)과 제조예 3으로부터 제조된 베타아밀로이드 42(Aβ42) 용액에 제조예 1의 금 나노입자 및 제조예 2의 아포리포단백질 E4를 노출한 것(+Aβ42,ApoE4)을 각각 측정하여 나타낸 UV-vis 흡수 스펙트럼이다.
도 3(B)은 제조예 3으로부터 제조된 베타아밀로이드 42를 포함하는 시료에 제조예 1 금 나노입자와 제조예 2 아포리포단백질 E4을 혼합한 용액에 노출한 후, 형성된 AuNPs와 베타아밀로이드 42의 복합체를 촬영한 다크필드 이미지이다.
도 3(C)은 아포리포단백질 E4가 존재하지 않는 조건에서, 제조예 3으로부터 제조된 베타아밀로이드 42를 포함하는 시료에 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자(AuNPs)를 노출시킨 경우, 상기 금 나노입자(AuNPs)와 베타아밀로이드 42의 복합체를 촬영한 다크필드 이미지이다.
도 3(D)은 제조예 3 또는 4로부터 제조된 베타아밀로이드 42(Aβ42) 또는 베타아밀로이드 40(Aβ40)를 포함하는 시료에, 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자(AuNP) 및 제조예 1의 금 나노입자와 제조예 2의 아포리포단백질 E4를 혼합한 용액(AuNP+ApoE4) 각각을 노출한 후, 응집체 형성 여부를 관찰한 사진이다.
도 4(A)는 베타아밀로이드 40이 포함되지 않은 실시예 1로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서(bare gold), 제조예 4로부터 제조된 베타아밀로이드 40 용액에, 실시예 1로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서(Aβ40) 및 실시예 2로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서(Aβ40+ApoE4) 각각을 노출한 후, 측정한 레일리 광 산란 스펙트럼이다.
도 4(B) 베타아밀로이드 42를 포함하지 않는 실시예 1로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서(bare gold), 제조예 3으로부터 제조된 베타아밀로이드 42를 포함하는 시료에, 실시예 1로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서(Aβ42) 및 실시예 2로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서(Aβ42+ApoE4) 각각을 노출한 후, 측정한 레일리(Rayleigh)-산란 스펙트럼이다.
도 4(C)는 아포리포단백질 E4가 베타아밀로이드 42 또는 40의 응집에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 제조예 3 또는 4로부터 제조된 베타아밀로이드 42 또는 40을 포함하는 시료에 실시예 1로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서(Aβ42 또는 Aβ40) 및 실시예 2로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서(Aβ42+ApoE4 또는 Aβ40+ApoE4) 각각을 노출한 후, 측정된 도 4A, B의 결과로부터 유도된 LSPR 최대파장 이동치(△λmax)를 나타낸 그래프이다.
도 5(A)는 일정량의 베타아밀로이드 42와 조성별 아포리포단백질 E4을 혼합하여, 각 경우에 대한 LSPR 이동을 기록한 그래프이다.
도 5(B)는 실시예 3으로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서를 제조예 3 또는 4로부터 제조된 베타아밀로이드 42 또는 40의 조성에 따라 측정한 레일리-산란 스펙트럼이다.
이때, control은 실시예 1로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서에 BSA(초록색)를 혼합한 것, 실시예 3의 나노 플라즈모닉 센서에 BSA(보라색)를 혼합한 것 및 실시예 3의 나노 플라즈모닉 센서에 BSA와 베타아밀로이드 42(1pM)(파란색)를 혼합한 것에 대해 측정한 레일리-산란 스펙트럼이다.
도 6(A)은 실시예 1로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서와 제조예 3또는 4로부터 제조된 베타아밀로이드 42(Aβ42) 또는 베타아밀로이드 40을 혼합한 것(Aβ40)으로부터 유도된 LSPR 최대 이동치(△λmax)와 실시예 3로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서와 제조예 3 또는 4로부터 제조된 베타아밀로이드 42(Aβ42+ApoE4) 또는 베타아밀로이드 40(Aβ40+ApoE4)를 혼합한 것으로부터 유도된 LSPR 최대 이동치(△λmax)를 시간에 따라 나타낸 그래프이다. 이때, 그래프 상에서 베타아밀로이드를 Aβ와 Ab로 병행 표기하였다.
도 6(B)은 티오플라빈 T(thioflavin T; ThT)과 베타아밀로이드 42(Aβ42) 또는 베타아밀로이드 40(Aβ40)을 혼합한 것으로부터 유도된 형광 세기와, 티오플라빈 T(thioflavin T; ThT)과 제조예 2의 아포리포단백질 E4 용액 및 베타아밀로이드 42(Aβ42+ApoE4) 또는 베타아밀로이드 40(Aβ40+ApoE4)을 혼합한 것으로부터 유도된 형광 세기를 시간에 따라 나타낸 그래프이다.
도 7(A)은 Circular Dichroism 분석을 통하여 베타아밀로이드 42 또는 40에 대한 아포리포 단백질E4의 결합력에 따른 β-sheet 구조 형성의 활성도를 확인한 그래프이다.
이때, Aβ42는 제조예 3으로부터 제조된 베타아밀로이드 42 용액을, Aβ40은 제조예 4로부터 제조된 베타아밀로이드 40 용액을, Aβ42+ApoE4는 제조예 3으로부터 제조된 베타아밀로이드 42 용액에 제조예 2의 아포리포단백질 E4를 혼합한 용액을, Aβ40+ApoE4는 제조예 4로부터 제조된 베타아밀로이드 40 용액에 제조예 2의 아포리포단백질 E4를 혼합한 용액을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7(B)은 ThT-Fluorescence 분석에 의해, ApoE4 활성에 따른 β-sheet 구조의 결정을 확인하는 그래프로, Aβ40은 베타아밀로이드 40 용액을, Aβ42는 베타아밀로이드 42 용액을, Aβ42+ApoE4는 베타아밀로이드 42 용액에 제조예 2의 아포리포단백질 E4를 혼합한 용액을, Aβ40+ApoE4는 베타아밀로이드 40 용액에 제조예 2의 아포리포단백질 E4를 혼합한 용액 각각을 티오플라빈 T(thioflavin T; ThT)과 혼합하여 유도된 형광세기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 베타아밀로이드 42(Aβ42)와 베타아밀로이드 40(Aβ40)용액을 상대적 비율에 따라 혼합하여 제조한 베타아밀로이드 용액을 실시예 1로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서에 로딩하여 유도된 각 경우에 대한 LSPR 이동을 기록한 그래프이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 아민 또는 티올 또는 알킬 말단기를 포함하는 실란화합물로 표면처리된 기판 및 상기 기판 상에 고정된 복수 개의 금 나노입자를 포함하는 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서에 관한 것이다.
상기 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서는 지지체로서 기판을 포함하는데, 상기 기판은 아민 또는 티올 또는 알킬 말단기를 포함하는 실란 화합물로 표면처리된 것을 특징으로 한다.
상기 기판에서 아민 또는 티올 또는 알킬 말단기를 포함하는 실란 화합물에 의해서 상기 금 나노입자가 기판 표면에 고정되어 있게 되는데, 상기 나노 플라즈모닉 센서에서 기판의 존재로 인해, 상기 금 나노입자 간 간격을 일정하게 고정시킬 수 있으므로, 베타아밀로이드 검출시 금 나노입자간의 간격이 가까울 때 발생되는 결합 효과(coupling effect)를 배제 시킬 수 있기 때문에, 단일 금 나노입자만으로 베타아밀로이드 검출이 가능하다.
구체적으로, 상기 기판 상에 고정된 복수 개의 금 나노입자는 서로 이격되어 배치되어 있고, 상기 금 나노입자 간의 이격거리는 금 나노입자 직경에 대해 1.5 내지 3.5 배인 것이 바람직한데, 상기 금 나노입자 간의 이격거리가 상기 금 나노입자 직경에 대해 1.5 배미만인 경우, 상기 금 나노입자 간에 결합 효과가 발생되어 베타아밀로이드를 검출함에 있어 정확성이 저하되는 문제가 발생한다. 또한, 상기 금 나노입자 간의 이격거리가 상기 금 나노입자 직경에 대해 3.5배를 초과할 경우에는 동일 면적대비 고정된 금 나노입자의 양이 작기 때문에 민감도가 저하되는 문제가 발생한다.
상기 기판은 상기 금 나노입자의 LSPR 광학특성에 영향을 미치지 않는 유전체라면 모두 가능하다.
본 발명에서 금 나노입자가 고정되지 않은 경우에는 베타아밀로이드를 포함하는 시료에 노출시킬 경우, 베타아밀로이드 뿐만 아니라 베타아밀로이드 응집물, 피브릴과 결합하는 과정에서 금 나노입자간에 서로 뭉침현상이 발생하게 되어, 서로 간 간섭 현상이 발생하기 때문에 단일 금나노입자를 이용한 측정이 불가능할 정도로 민감도가 낮을 뿐만 아니라, 재현성도 극히 낮다는 단점이 있다.
상기 실란 화합물은 아민 또는 티올 또는 알킬 말단기를 포함하는 것이면 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 아미노프로필트리에톡시실란, 아미노프로필트리메톡시실란, 아미노프로필다이에톡시메틸실란 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 것일 수 있다.
상기 금 나노입자는 나노 크기를 가지는 나노입자로, 외부에서 입사되는 빛에 의해 전도대에 있는 전자들이 집단적으로 진동하게 되어 전기 쌍극자 특성을 띄게 되고, 그 결과 해당 주파수 영역대의 빛을 강하게 산란 및 흡수하게 되는데 이를 국소 표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon resonance, LSPR)이라고 한다.
이때, 상기 기판 상에 고정된 금 나노입자를 포함하는 나노 플라즈모닉 센서는 인 비트로 상태에서 시료를 분석함에 있어서, 상기 시료 내에 존재하는 베타아밀로이드와 상기 금 나노입자가 결합을 형성하게 되므로, 상기 금 나노입자의 산란 및 흡수하는 국소 표면 플라즈몬 공명현상에 영향을 미치므로, LSPR 최대 파장에 변화가 발생하게 되는데, 본 발명에서는 이를 측정함으로써, 베타아밀로이드 특히 베타아밀로이드 42를 검출할 수 있다.
상기 시료는 생체 또는 환경으로 얻은 시료일 수 있는데, 보다 바람직하게는 알츠하이머병을 예방 및 진단하기 위해 뇌척수액을 사용할 수 있다.
상기 생체로부터 얻은 시료 특히 상기 뇌척수액에는 다른 다양한 생체분자들이 존재하는데, 본 발명에 따른 나노 플라즈모닉 센서는 이들에 대해 반응 하지 않고, 베타아밀로이드 특히 베타아밀로이드 42 단분자 혹은 응집체에 대해서만 LSPR 최대 파장에 변화가 발생하기 때문에, 생체로부터 얻은 시료에 별다른 처리없이 바로 베타아밀로이드 특히 베타아밀로이드 42를 정성적 혹은 정량적으로 검출할 수 있다.
LSPR의 산란과 흡수는 금 나노입자의 외부 입사광에 대한 흡광도 특성 즉, 표면 플라즈몬 흡수 밴드의 세기나 주파수가 나노 입자의 크기, 모양 입자 크기 분포, 나노입자가 놓여진 위치에 따라 민감하게 반응한다.
따라서, 본 발명에서의 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서에서 상기 베타아밀로이드 검출을 위한 플라즈몬 피크를 얻기 위해 상기 금 나노입자의 평균 직경이 40 내지 60 ㎚인 것이 바람직하다. 특히, 상기 금 나노입자의 평균 직경이 40 ㎚ 미만인 경우에는 광학적 측정 장비인 암시야 현미경을 통한 측정이 어렵다는 단점이 발생한다.
또한, 상기 금 나노입자는 500 내지 550 ㎚의 파장에서 0.03 내지 0.05의 OD의 양만큼 포함되는 것이 바람직한데, 상기 범위를 벗어날 경우 금 나노입자 간의 간격이 달라지기 때문에, 광이 흡수되거나 확산되는 파장 범위가 달라지는 문제가 발생할 수 있다.
상기 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서는 아포리포단백질 E4를 더 포함할 수 있는데, 구체적으로, 상기 아포리포단백질 E4는 5 내지 10 nM 포함되는 것이 바람직한데, 10 nM를 초과할 경우, 베타아밀로이드를 측정할 수 있는 한계에 도달하기 때문에, 베타아밀로이드를 정확히 정량할 수 없고, 5 nM 미만일 경우, 민감성이 저하되어 베타아밀로이드 42 또는 40을 명확히 구분할 수 없다는 문제가 발생할 수 있다. 이때 베타아밀로이드 42는 이하, Aβ42라고도 하며, 베타아밀로이드 40은 이하, Aβ40이라고도 한다.
이때, 상기 아포리포단백질 E4는 상기 금 나노입자와 이격되어 존재하며, 유동성을 갖는 고정되어 있지 않은 것을 특징으로 한다. 즉, 상기 아포리포단백질 E4는 시료 내에 존재하는 베타아밀로이드 특히, 베타아밀로이드 42가 상기 금 나노입자 표면에 자기조립을 통해 응집되도록 도와주는 샤프롱(chaperon;보호자)으로의 역할을 수행하고, 상기 금 나노입자 표면에 응집되어 결합된 베타아밀로이드에 의해, 상기 금 나노입자의 산란 및 흡수하는 국소 표면 플라즈몬 공명현상에 영향을 미치므로, LSPR 최대 파장에 변화가 발생하게 되는데, 본 발명에서는 이를 측정함으로써, 베타아밀로이드 특히 베타아밀로이드 42를 검출할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 나노 플라즈모닉 센서에 아포리포단백질 E4를 더 포함할 경우, 상기 금 나노입자 나노 플라즈모닉 센서에 아포리포단백질 E4을 이용하여 베타아밀로이드의 응집현상을 촉진시킴에 따라 시료에 베타아밀로이드가 소량(약 1 pM 이상) 존재하여도 검출이 가능할 정도로 민감도가 우수하며, 재현성 또한 현저히 우수하다.
하기 실험예에서 후술하겠지만, 베타아밀로이드 42를 포함하는 시료에 본 발명에 따른 나노 플라즈모닉 센서를 노출시키는 경우는, 동일한 양의 베타아밀로이드 42를 포함하는 시료에 금 나노입자만 노출시키는 경우보다 LSPR 최대 이동치(△λmax)가 5 배 이상 높다는 것을 확인할 수 있고, 이는 본 발명에 따른 나노 플라즈모닉 센서가 금 나노입자 또는 아포리포단백질 E4 각각을 단독으로 사용하는 경우보다 민감도가 5 배 이상 현저히 우수한 것을 나타내는 것이다.
특히, 아포리포단백질 E4의 경우, 종래 형광 시약인 티오플라빈 T와 혼합하여 ThT 분석방법으로 분석하게 되면, 티오플라빈 T를 단독으로 사용하여 분석하는 것 보다 1.5 배 세기가 증가하게 되는데 반해, 본 발명의 나노 플라즈모닉 센서는 5 배 이상 상승하고 있으므로, 본 발명에 따른 나노 플라즈모닉 센서는 각각을 단독으로 사용한 경우보다 그 상승효과가 각각을 단독으로 사용하여 발생한 효과를 합한 것보다 훨씬 현저하게 우수한 효과를 갖고 있음을 알 수 있다.
또한 본 발명에 따른 나노 플라즈모닉 센서는 단일 입자 측정에 기반하고 있어, 측정하고자 하는 시료의 부피가 0.5 내지 100 ㎕ 내의 극소량 존재하여도 베타아밀로이드를 검출할 수 있다는 장점이 존재한다.
아울러 후술하겠지만, 상기 시료 내에 1 pM 이하 극소량의 베타아밀로이드 특히, 베타아밀로이드 42가 포함되어 있더라도 본 발명에 따른 나노 플라즈모닉 센서는 상기 시료로부터 극소량의 베타아밀로이드를 정량 혹은 정성적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
따라서 상기 아포리포단백질 E4는 금 나노입자와 어떠한 결합 및 영향을 가지지 않으면서도 베타아밀로이드 42만을 특이적으로 응집하고, 이렇게 응집된 베타아밀로이드에 의해서 상기 금 나노입자의 산란 및 흡수하는 국소 표면 플라즈몬 공명 현상에 커다란 영향을 미치므로 상기 두 구성요소 중 어느 하나라도 빠진다면 하기 실험예에서 후술하는 바와 같이 베타아밀로이드를 검출하지 못하게 된다.
상기 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서는 베타아밀로이드 42(Aβ42)를 특이적으로 검출할 수 있다.
상기 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서는 검출한계가 1 내지 10 pM인데, 이는 종래 베타아밀로이드 응집물 또는 피브릴을 검출하기 위한 형광 시약에 비해 약 2 배 이상으로 높은 수치로, 본 발명의 나노 플라즈모닉 센서의 민감도가 현저히 우수함을 나타내는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 하기 단계를 포함하는 베타아밀로이드를 검출하는 방법을 제공한다.
ⅰ) 상기 나노 플라즈모닉 센서를 베타아밀로이드 응집물을 포함하는 시료에 노출시키는 단계;
ⅱ) 상기 ⅰ) 단계의 노출을 통해 상기 시료 내의 베타아밀로이드와 상기 나노 플라즈모닉 센서가 반응하여 금 나노입자-베타아밀로이드 복합체를 형성하는 단계; 및
ⅲ) 상기 ⅱ) 단계에서 형성된 금 나노입자-베타아밀로이드 복합체를 암시야 현미경과 레일리-산란 스펙트로스코피를 이용하여 광산란 스펙트럼을 측정하고 최대파장 이동도를 측정하는 단계;를 포함한다.
아래에서 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명에 따른 외부 입사광에 대한 산란 특성은 나노 크기의 상기 금 나노입자 표면에서의 굴절률 변화에 크게 영향을 받는다. 따라서, 본 발명에서 제안하고 있는 나노 플로즈모닉 센서를 이용할 경우, 기판 상에 고정되어 있는 금 나노입자에 베타아밀로이드가 결합하게 되어 상기 금 나노입자 굴절률이 변화하게 되므로, 이에 따른 레일리-산란 신호의 변화 즉, 최대파장 이동도를 측정함으로써 베타아밀로이드 특히 베타아밀로이드 42를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 한 단계 더 나아가 상기 나노 플라즈모닉 센서로 상기 금 나노입자외에 아포리포단백질 E4를 더 포함하는 구성을 제안하고 있는데, 이러한 구조의 상기 나노 플라즈모닉 센서를 이용할 경우, 베타아밀로이드 특히, 베타아밀로이드 42의 응집을 촉진함으로써, 형성된 베타아밀로이드 응집체 특히 베타아밀로이드 42의 응집체가 상기 금 나노입자와 결합되어 상기 금 나노입자 굴절률이 변화하게 되므로, 이에 따른 레일리-산란 신호의 변화 즉, 최대파장 이동도를 측정함으로써 베타아밀로이드 특히 베타아밀로이드 42를 기판 상에 금 나노입자만 고정되어 있는 경우보다 더욱 정확하고 민감하게 검출할 수 있다.
더욱 상세하게, 상기 금 나노입자는 음전하를 띄고, 상기 베타아밀로이드는 양전하를 띄므로, 이들 간에 형성되는 정전기적 상호작용에 의해 결합하게 되는데, 베타아밀로이드의 응집으로 인해 변화된 전하가 상기 금 나노입자와 이전 보다 더욱 강한 상호작용을 형성하도록 유도함으로써, 상술한 바와 같이 상기 나노 플라즈모닉 센서의 레일리-산란 신호의 변화가 크게 발생하게 되는 것이다. 아울러 이러한 과정으로 인해 상기 금 나노입자는 서로 응집하게 되어 결국 색상도 변화하고 침전하게 되고, 이는 육안으로도 시료 내에 베타아밀로이드 특히 베타아밀로이드 42의 존재여부를 확인할 수 있도록 한다.
구체적으로, 상기 나노 플라즈모닉 센서를 베타아밀로이드를 포함하는 시료에 노출시키고(ⅰ), 상기 ⅰ) 단계의 노출을 통해 상기 시료 내의 베타아밀로이드와 상기 나노 플라즈모닉 센서가 반응하여 금 나노입자-베타아밀로이드 복합체를 형성한 후(ⅱ), 상기 ⅱ) 단계에서 형성된 금 나노입자-베타아밀로이드 복합체를 암시야 현미경과 레일리-산란 스펙트로스코피를 이용하여 광산란 스펙트럼을 측정하고 최대파장 이동도를 측정한다.
상기 시료에 존재하는 베타아밀로이드의 농도에 의존적으로 상기 최대파장 이동도 세기가 달라지므로, 시료 내 베타아밀로이드 존재를 정성 또는 정량적으로 분석할 수 있다.
다만 상기 베타아밀로이드는 바람직하게는 알츠하이머병의 요인인 베타아밀로이드 42일 수 있다. 상기 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서는 베타아밀로이드 42(Aβ42)를 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 한다.
상기 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서는 검출한계가 1 내지 10 pM로 민감성이 우수함을 확인할 수 있다.
상기 ⅰ) 단계는 인 비트로(in vitro) 상태에서 수행되는 것일 수 있고, 상기 인 비트로 상태에서 수행되는 것은 생체 또는 환경으로부터 얻은 시료를 사용하는 것으로, 상기 시료는 베타아밀로이드의 존재여부를 확인하기 위한 환경으로부터 얻은 시료이거나, 동물 또는 사람의 체액, 혈액, 혈청, 혈장 및 소병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은
입사광을 제공하는 광원부;
상기 입사광에 의해 베타아밀로이드 응집물의 종류와 함량에 따라 표면 플라즈몬 공명 현상이 유도되는 제1항에 따른 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서; 및
상기 표면 플라즈몬 공명 현상에 의해 상기 금 나노입자들에서 방출되는 방출광의 공명 파장을 검출하는 검출부;를 포함하는 베타아밀로이드 검출장치를 제공한다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 베타아밀로이드 검출장치를 나타내는 도면으로, 이를 참고하면, 입사광을 제공하는 광원부(100), 나노 플라즈모닉 센서(200) 및 검출부(300)를 포함한다.
상기 나노 플라즈모닉 센서(200)는 검출장치에 주입되는 시료로부터 베타아밀로이드 특히 베타아밀로이드 42를 분석하기 위한 나노 플라즈모닉 센서(200)가 위치하고 있는 것으로, 상기 시료는 생체 또는 환경으로부터 얻은 것으로, 상기 시료는 베타아밀로이드의 존재여부를 확인하기 위한 환경으로부터 얻은 시료이거나, 동물 또는 사람의 체액, 뇌척수액, 혈액, 혈청, 혈장 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있는데, 바람직하게는 동물 또는 사람의 뇌척수액을 분석하여, 이로부터 베타아밀로이드를 정성적 혹은 정량적으로 파악하여 알츠하이머 병의 진단 및 예방을 도모할 수 있다.
상기 나노 플라즈모닉 센서(200)는 상기 검출장치의 외부로부터 주어지는 전자기파(즉, 에너지 또는 파장)에 의해 국소 표면 플라즈몬 현상이 발생하게 된다.
상기 국소 표면 플라즈몬 현상은 외부에서 입사되는 빛에 의해, 상기 금 나노입자(210)의 전도대에 있는 전자들이 집단적으로 진동하게 되어 전기 쌍극자 특성을 띄게 되고, 그 결과 해당 주파수 영역대의 빛을 강하게 산란 및 흡수하게 되는 현상을 말한다.
즉, 상기 나노 플라즈모닉 센서(200)에 특정 파장의 빛이 입사됨에 의해 흡수(absorbing) 및 산란(scattering)되어, 국소 표면 플라즈몬 공명 현상이 발생되는데, 이때, 상기 나노 플라즈모닉 센서(200)로 입사된 빛은 상기 나노 플라즈모닉 센서(200) 내에 존재하는 금 나노입자(210)로 흡수되며, 상기 금 나노입자(210)를 둘러싸는 물질에 따라 특정한 파장(즉, 공명 파장)의 빛이 산란된다.
그러므로, 상기 나노 플라즈모닉 센서(200)에 국소 플라즈몬 공명 현상이 발생할 때, 상기 금 나노입자(210)에서 방출되는 방출광의 공명 파장을 분석하여 베타아밀로이드 특히 베타아밀로이드 42를 정량 혹은 정성적으로 검출할 수 있다.
상기 광원부(100)로는 다색광을 출력하는 제논 램프가 이용될 수 있다, 또한 상기 광원부(100)로는 특정 파장의 단색 광원을 출력하는 레이저 다이오가 사용될 수 있다. 또는 백색 광원이나 발광 다이오드가 사용될 수도 있다.
상기 검출부(300)는 상기 나노 플라즈몬 센서(200)에서 국소 표면 플라즈몬 공명 현상에 의해 방출되는 국소 표면 플라즈몬 공명 파장을 검출하는데, 암시야 현미경을 이용하여 레일리-산란 신호를 측정하고, 측정된 신호에서 광산란 스펙트럼을 측정한 후, 최대파장 이동도를 얻음으로써 베타아밀로이드 특히, 베타아밀로이드 42를 높은 민감도로 감지할 수 있다.
상기 검찰장치는 여러 개의 기판을 따로 제작할 필요없이, 상기 나노 플라즈모닉 센서(200)를 시료에 노출시킴으로써, 간단히 분석 과정을 수행할 수 있다. 또한 분석에 사용되는 단위 입자 수준에서의 분석을 수행하기 때문에 측정에 요구되는 시료의 부피가 현저히 감소되므로, 소량의 시료로도 충분히 정량 혹은 정성적으로 검출할 수 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
실험 재료
테트라클로로금(Ⅲ)산(Hydrogen tetrachloroaurate(Ⅲ); HAuCl4·3H2O), 시트르산나트륨(sodium citrate), 용매 에탄올, 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane, APTES), BSA(bovine serum albumin), 베타아밀로이드 40(β-amyloid 1-40), 베타아밀로이드 42(β-amyloid 1-42), NaCl(sodium chloride), KCl(potassium chloride), CaCl2·2H2O(calcium chloride dihydrate), MgCl2·6H2O(magnesium chloride hexahydrate), Na2HPO4·7H2O(sodium monohydrogen phosphate heptahydrate)는 모두 Sigma Aldrich(korea)에서 구입한 것을 사용하였다.
nuclease-free water는 Progmega Corporatiion으로부터 구입한 것을 사용하였다.
실험에 사용된 모든 용기는 사용 직전에 준비된 aqua regia 용액(1:3=HNO3:HCl)으로 세척하고, 증류수(ultrapure water, 18.2 mΩ/cm)로 린스하여 사용하였다.
제조예 1. 금 나노입자
우선, 글라스웨어는 상술한 바와 같이 직전에 준비한 aqua regia 용액으로 세척한 후, 증류수로 밤새 린스해주었다. 이 과정을 열 번 반복한다.
10 ㎖의 1.0 mM HAuCl4을 가열하고, 1.0 ㎖의 0.4% 시트르산삼나트륨(Trisodium citrate)을 저어주면서 혼합한다. 상기 혼합액을 3 분간 가열해준 후, 15 분간 저어주고, 15 분간 700 rpm으로 상온에서 식혀준다.
다음으로, 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 응집된 입자는 제거하여 여과시켜, 평균 직경이 ~ 50 ㎚인 금 나노입자를 수득하였다.
제조예 2. 아포리포단백질 E4 용액
아포리포단백질 E4(이하, ApoE4라고도 한다.)는 Biovision 으로부터 구입한 것을 사용하였고, 아포리포단백질 E4을 인공뇌척수액(CSF)버퍼 pH7.4에 10 nM 또는 7.5 nM되도록 혼합하여 제조하였다.
제조예 3-4. 베타아밀로이드 40 또는 베타아밀로이드 42 용액
베타아밀로이드는 Sigma aldrich사에서 구입하여 사용하였다. 베타아밀로이드를 인공뇌척수액(CSF)버퍼 pH7.4에 50μM되도록 혼합하여 제조하였다. 이때, 베타아밀로이드 42 용액은 제조예 3, 베타아밀로이드 40 용액은 제조예 4이다.
이하에서, 별다른 언급이 없다면 베타아밀로이드 40 또는 베타아밀로이드 42 용액이라 함은 본 제조예 3 또는 4와 같이 제조된 용액을 의미한다.
실시예 1. 나노 플라즈모닉 센서(금 나노입자)
유리 기판(22 × 40 × 0.1 ㎜)을 30 분간 초음파를 이용하여 아세톤으로 세척하고, 에탄올로 세 번 세척하여 준비한다.
그 다음 상기 유리 기판에 piranha 용액(3:1 H2SO4:H2O2)으로 30분간 처리하고, 이후 에탄올과 증류수로 세척한다. 상기 세척된 유리기판을 질소 가스 내에서 건조하고, 표면을 에탄올(99.9%)에 용해된 2%(v/v) APTES 용액으로 20 분간 처리한다. 마지막으로 상기 유리 기판을 증류수로 3번 초음파 처리하고, 120 ℃에서 3 시간동안 건조하여, 실란 화합물로 표면 개질된 유리 기판을 제조한다.
센서를 제조하기 위해서, 상기 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자를 증류수로 OD(optical density at 530 ㎚)가 0.04 될 때까지 희석하여, 상기 실란 화합물로 표면 개질된 유기 기판의 중앙에 10 ㎕를 드롭-캐스팅법으로 도포한 후, 3 분간 처리한다.
이때, 상기 금 나노입자의 드롭 캐스팅 후, 처리되는 시간과 조성에 따라서 입자간 공간을 제어할 수 있다.
실시예 2. 나노 플라즈모닉 센서
상기 실시예 1의 기판 상에 금 나노입자가 고정된 나노 플라즈모닉 센서에 상기 제조예 2로부터 제조된 20㎕(10 nM)아포리포단백질 E4를 로딩하여 한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 모두 동일하게 나노 플라즈모닉 센서를 제조하였다.
실시예 3. 나노 플라즈모닉 센서
상기 제조예 2로부터 제조된 20㎕(10 nM)아포리포단백질 E4 대신에 20 ㎕(7.5 nM)아포리포단백질 E4를 로딩한 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 모두 동일하게 나노 플라즈모닉 센서를 제조하였다.
도 2(A)는 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자(~50 nm)의 HR-TEM 이미지이고, 도 2(B)는 1000 배 배율에서 노출된 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자(~50 nm)의 다크필드(Dark image) 이미지이며, 도 2(C)는 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자(AuNPs)의 UV-vis 흡수 스펙트럼이다.
이때, 상기 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자 10 ㎕가 포함된 현탁액(suspension)(0.04 OD at 531 ㎚ ~9.08×107 particles/㎖)을 아미노프로필트리에톡시실란(APTES)으로 표면처리된 유리기판 상에 분산시킨 후, 상온에서 3분간 방치한 후, 측정하였다.
또한, 상기 고해상도 전자 현미경(HR-TEM)은 JEOL JEM3011 기기를 사용하였고, 300 kV 전압에서 작동하여 측정하였고, UV-vis 흡수 스펙트럼은 Shimadzu UV3600 UV-VIS-NIR을 이용하여 얻었다. 별도의 변동사항이 기재되지 않는 이상 이하에서도 동일하게 사용하였다.
도 2A에 나타난 바와 같이, 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자는 염화금을 이용하여 합성하였고, 직경이 거의 일정히 유지된 금 나노입자를 수득하였다.
도 2B 및 도 2C에 나타난 바와 같이 제조예 1로부터 제조된 금 나노 입자는 초록색을 띄고 있음을 확인할 수 있다.
도 3(A)은 베타아밀로이드 42(Aβ42)를 포함되지 않은 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자(bare AuNP)와, 제조예 3으로부터 제조된 베타아밀로이드 42(Aβ42) 용액에 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자를 노출한 것(+Aβ42)과 제조예 3으로부터 제조된 베타아밀로이드 42(Aβ42) 용액에 제조예 1의 금 나노입자 및 제조예 2의 아포리포단백질 E4를 노출한 것(+Aβ42,ApoE4)을 각각 측정하여 나타낸 UV-vis 흡수 스펙트럼이다.
도 3(B)은 제조예 3으로부터 제조된 베타아밀로이드 42를 포함하는 시료에 제조예 1 금 나노입자와 제조예 2 아포리포단백질 E4을 혼합한 용액에 노출한 후, 형성된 AuNPs와 베타아밀로이드 42의 복합체를 촬영한 다크필드 이미지이며,
도 3(C)은 아포리포단백질 E4가 존재하지 않는 조건에서, 제조예 3으로부터 제조된 베타아밀로이드 42를 포함하는 시료에 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자(AuNPs)를 노출시킨 경우, 상기 금 나노입자(AuNPs)와 베타아밀로이드 42의 복합체를 촬영한 다크필드 이미지이다.
도 3(D)은 제조예 3 또는 4로부터 제조된 베타아밀로이드 42(Aβ42) 또는 베타아밀로이드 40(Aβ40)를 포함하는 시료에, 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자(AuNP) 및 제조예 1의 금 나노입자와 제조예 2의 아포리포단백질 E4를 혼합한 용액(AuNP+ApoE4) 각각을 노출한 후, 응집체 형성 여부를 관찰한 사진이다.
이때, 베타아밀로이드 42(Aβ42)는 단분자로, 90 ㎕(50 μM)을 포함하는 시료를 사용하였다. 이는 상기 금 나노입자를 기준으로, 1:1(v/v%) 부피비를 갖는 함량이다.
이때, 베타아밀로이드 40(Aβ40) 및 베타아밀로이드 42(Aβ42)를 시그마 알드리치사로부터 구입하였다.
도 3A에 나타난 바와 같이, 아포리포단백질 E4가 존재하지 않는 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자(bare AuNP)는 응집현상이 관찰되지 않았고, 베타아밀로이드 42(Aβ42) 용액에 제조예 1로부터 제조된 금 나노입자를 노출한 것(+Aβ42)에서는 일부 응집현상이 관찰되었으나, 제조예 1의 금 나노입자에 제조예 2의 아포리포단백질 E4을 혼합한 용액(+Aβ42,ApoE4)에서 현저한 흡광도 변화를 관찰할 수 있었다. 즉, 베타아밀로이드 42는 아포리포단백질 E4와 금 나노입자가 존재하는 경우에 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
도 3B 및 도 3C에 나타난 바와 같이, 제조예 1 금 나노입자와 제조예 2 아포리포단백질 E4을 혼합한 용액에서는 베타아밀로이드의 존재에 의해 금 나노입자가 뭉치고, 밝게 관찰되는데, 이는 아포리포단백질 E4의 존재 하에서 베타아밀로이드 42가 응집되게 되고, 이로 인해 응집된 베타아밀로이드와 금 나노입자가 결합을 형성함으로써 밝게 관찰되는 것이다(도 3B).
반면, 아포리포단백질 E4가 존재하지 않는 경우에는 동일한 양 및 크기의 금 나노입자가 존재하더라도 밝게 관찰되는 부분이 현저히 낮음을 확인할 수 있다(도 3C).
또한, 도 3D에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 나노 플라즈모닉 센서의 구성인 제조예 1의 금 나노입자와 제조예 2의 아포리포단백질 E4를 혼합한 용액을 사용한 결과, 베타아밀로이드 응집체와 금 나노입자가 뭉쳐 침전됨으로써 눈으로도 베타아밀로이드 42를 검출할 수 있을 정도의 색변화를 나타내고 있음을 확인하였다.
바람직하게, 본 발명에 따른 나노 플라즈모닉 센서는 금 나노입자(제조예 1)와 아포리포단백질 E4(제조예 2)을 모두 포함하고 있어야 베타아밀로이드 42를 검출할 수 있고, 이들 중 어느 하나라도 제외된다면 도 3D에 보여지듯이 색변화를 나타내지 않음을 알 수 있다.
더욱이 본 발명에 따른 나노 플라즈모닉 센서의 구성인 제조예 1의 금 나노입자와 제조예 2의 아포리포단백질 E4를 혼합한 용액은 베타아밀로이드 40(Aβ40)는 색변화를 나타내지 않는, 오직 베타아밀로이드 42를 특이적으로 검출하는 우수한 선택성을 갖는 다는 것을 확인할 수 있다.
도 3의 결과를 종합하면 아포리포단백질 E4가 베타아밀로이드 42의 응집을 도와주는 보호자(chaperon)의 역할을 수행함을 알 수 있으며, 구체적으로, 아포리포단백질 E4의 유무에 따라 베타아밀로이드 42의 섬유(fibril) 형성 및 비 형성이 금 나노입자의 뭉침 현상으로 나타난 것을 알 수 있다.
도 4(A)는 베타아밀로이드 40이 포함되지 않은 실시예 1로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서(bare gold), 제조예 4로부터 제조된 베타아밀로이드 40 용액에, 실시예 1로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서(Aβ40) 및 실시예 2로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서(Aβ40+ApoE4) 각각을 노출한 후, 측정한 레일리 광 산란 스펙트럼이고, 도 4(B) 베타아밀로이드 42를 포함하지 않는 실시예 1로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서(bare gold), 제조예 3으로부터 제조된 베타아밀로이드 42를 포함하는 시료에, 실시예 1로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서(Aβ42) 및 실시예 2로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서(Aβ42+ApoE4) 각각을 노출한 후, 측정한 레일리(Rayleigh)-산란 스펙트럼이다.
이때, 다른 실험에서와 마찬가지로 본 실험 역시 실제 알츠하이머 환자의 조건과 유사한 조건으로 맞추기 위하여, 37 ℃에서 CSF(pH 7.4)를 이용하여 실험을 진행하였다.
이때, 레일리-산란 스펙트럼은 암시야 현미경을 이용하여 측정하였으며, 상기 암시야 현미경(Eclipse TE2000-U, Nikon, Japan)은 분광기(Microspec 2300i, Roper Scientifics)와 고감도 CCD 카메라(PIXIS: 400B, Princeton Instruments)와 연결하여 사용하였다.
도 4A 및 도 4B에 나타난 바와 같이, 베타아밀로이드 42가 아포리포단백질 E4와 더 특이적으로 반응하여 단시간에 응집되는 것을 확인할 수 있다.
도 4(C)는 아포리포단백질 E4가 베타아밀로이드 42 또는 40의 응집에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 제조예 3 또는 4로부터 제조된 베타아밀로이드 42 또는 40을 포함하는 시료에 실시예 1로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서(Aβ42 또는 Aβ40) 및 실시예 2로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서(Aβ42+ApoE4 또는 Aβ40+ApoE4) 각각을 노출한 후, 측정된 도 4A, B의 결과로부터 유도된 LSPR 최대파장 이동치(△λmax)를 나타낸 그래프이다.
상기 LSPR 최대파장 이동은 산란된 스펙트럼을 측정하여 기록하였고, LSPR 최대파장 이동치 △λmax는 다음과 같이 계산하였다.
△λmax=λmax(결합 후)-λmax(결합 전)
도 4C에 나타난 바와 같이, 아포리포단백질 E4는 베타아밀로이드 42(Aβ42)에 대해서만 특이적 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
도 5(A)는 일정량의 베타아밀로이드 42와 조성별 아포리포단백질 E4을 혼합하여, 각 경우에 대한 LSPR 이동을 기록한 그래프이다.
도 5A에 나타난 바와 같이, 현재까지 알츠하이머병의 플라크를 형성하는 초기 진행 단계를 형성할 수 있는 아포리포단백질 E4의 함량이 알려져있지 않으므로, 본 발명에 따른 나노 플라즈모닉 센서를 통해서 측정가능한 아포리포단백질 E4의 최소 감지농도를 정하기 위하여, 이와 같은 실험을 수행하였다.
우선, 아포리포단백질 E4의 조성을 0.1 nM에서 20 nM까지 변화하였고, 이때 베타아밀로이드 42는 90 ㎕(50 μM)을 사용하였다.
도 5A에 나타난 바와 같이, 아포리포단백질 E4가 5 nM에서 9 nM까지는 LSPR 이동이 증가하고 있으며, 10 nM부터 20 nM까지 한계에 도달하고 있음을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 적합한 감지를 위해 바람직한 아포리포단백질 E4 농도는 5-10 nM임을 알 수 있으며, 보다 바람직하게는 7.5 nM임을 확인할 수 있다.
도 5(B)는 실시예 3으로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서를 제조예 3 또는 4로부터 제조된 베타아밀로이드 42 또는 40의 조성에 따라 측정한 레일리-산란 스펙트럼이다.
이때, control은 실시예 1로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서에 BSA(초록색)를 혼합한 것, 실시예 3의 나노 플라즈모닉 센서에 BSA(보라색)를 혼합한 것 및 실시예 3의 나노 플라즈모닉 센서에 BSA와 베타아밀로이드 42(1pM)(파란색)를 혼합한 것에 대해 측정한 레일리-산란 스펙트럼이다.
또한, 그래프에서 Aβ40+ApoE4, 즉 흑색 막대그래프는 실시예 3으로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서를 다양한 조성의 제조예 4로부터 제조된 베타아밀로이드 40과 혼합한 것이고, Aβ42+ApoE4 즉 적색 막대그래프는 실시예 3으로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서를 다양한 조성의 제조예 3으로부터 제조된 베타아밀로이드 42와 혼합한 것이다.
본 실험은 도 5A로부터 최적화된 아포리포단백질 E4(20㎕, 7.5 nM)를 포함하는 실시예 3의 나노 플라즈모닉 센서를 이용하여, 베타아밀로이드 42또는 40과 각각 혼합하여 측정함으로써, 센서의 민감도를 확인하기 위한 것으로, 상기 베타아밀로이드 42 또는 40은 1 pM 내지 100 μM 범위(1×100, 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 5×107, 1×10 8 pM)로 다양하게 혼합하여 측정하였다.
도 5B에 나타난 바와 같이, 실시예 3의 나노 플라즈모닉 센서가 감지할 수 있는 베타아밀로이드 42또는 40의 농도는 1 pM부터 100 μM까지이며, 검출한계(LOD)는 1 내지 10 pM이고, 자세히는 1.5 pM임을 확인하였다. 검출한계는 아래 식으로부터 계산되었다.
LOD(limit of detection) = (3*δ)/slope
여기서 δ는 stand deviation of the control
또한, 도 5B의 control에 나타난 바와 같이, 실시예 1로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서에 BSA(초록색)를 혼합한 것, 실시예 3의 나노 플라즈모닉 센서에 BSA(보라색)를 혼합한 것은 ~1.0 ㎚ 이하의 LSPR 이동이 관측되었고, 실시예 3의 나노 플라즈모닉 센서에 BSA와 베타아밀로이드 42(1pM)(파란색)를 혼합한 것은, BSA를 넣지 않는 것과 유사한 결과를 보이므로, 본 발명에 따른 실시예 3의 나노 플라즈모닉 센서는 BSA와는 반응하지 않고, 오직 베타아밀로이드 40와 베타아밀로이드 42 특히, 베타아밀로이드 42에 대해 특이적으로 반응한다는 것을 확인할 수 있다.
도 6(A)은 실시예 1로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서와 제조예 3또는 4로부터 제조된 베타아밀로이드 42(Aβ42) 또는 베타아밀로이드 40을 혼합한 것(Aβ40)으로부터 유도된 LSPR 최대 이동치(△λmax)와 실시예 3로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서와 제조예 3 또는 4로부터 제조된 베타아밀로이드 42(Aβ42+ApoE4) 또는 베타아밀로이드 40(Aβ40+ApoE4)를 혼합한 것으로부터 유도된 LSPR 최대 이동치(△λmax)를 시간에 따라 나타낸 그래프이다. 이때, 그래프 상에서 베타아밀로이드를 Aβ와 Ab로 병행 표기하였다
도 6(B)은 티오플라빈 T(thioflavin T; ThT)과 베타아밀로이드 42(Aβ42) 또는 베타아밀로이드 40(Aβ40)을 혼합한 것으로부터 유도된 형광 세기와, 티오플라빈 T(thioflavin T; ThT)과 제조예 2의 아포리포단백질 E4 용액 및 베타아밀로이드 42(Aβ42+ApoE4) 또는 베타아밀로이드 40(Aβ40+ApoE4)을 혼합한 것으로부터 유도된 형광 세기를 시간에 따라 나타낸 그래프이다.
이때, 8 ㎎의 티오플라빈 T을 10 ㎖ 인산 버퍼액(phosphate buffer, 10 mM phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4)에 혼합하여 티오플라빈 T 용액을 제조하고, 이를 0.2 ㎛ 필터로 여과한 후, 측정하고자 하는 시료에 5 ㎕ 티오플라빈 T 용액을 첨가하여 440 ㎚에서 여기(excitation)되고, 480 ㎚에서 방출하여 시료의 형광세기를 세 번 측정하여 그 평균을 기록하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 실시간으로 본 발명에 따른 실시예 3의 나노 플라즈모닉 센서와 종래 베타아밀로이드 응집물 또는 피브릴의 검출시약인 티오플라빈 T의 성능을 비교하였다.
베타아밀로이드 42만 존재하는 경우보다 실시예 3로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서를 혼합한 경우 LSPR 최대 이동치(△λmax)가 가장 높았다.
티오플라빈 T 역시 아포리포단백질 E4가 존재하는 경우, 베타아밀로이드에 대한 민감도가 더 상승하였으나, 그 세기의 차이가 약 1.5배에 불과하다.
상기 결과를 통해, LSPR 최대파장 이동치(△λmax)는 본 발명에 따른 나노 플라즈모닉 센서 중 금 나노입자의 표면에 결합된 베타아밀로이드 응집체에 비례한다는 것을 알 수 있고, 이는 결합 친화도 K와 관련이 있다.
상기 K(금 나노입자 표면과 베타아밀로이드 응집체와의 친화도)는 아포리포단백질 E4에 의해 응집된 베타아밀로이드 42의 양으로부터 아래 수학식 1을 이용하여 Kb(해리상수)를 계산할 수 있다.
Figure 112015110271495-pat00001
ka는 베타아밀로이드 42(Aβ42) 또는 베타아밀로이드 40(Aβ40)과 제조예 2의 아포리포단백질 E4 용액의 인식이고,
kd는 베타아밀로이드 42와 아포리포단백질 E4 복합체의 안정성을 의미한다.
시그마플롯(리간드 결합 모드)을 사용하여 도 6A에 삽입된 그래프로부터 ka와 kd를 계산하였다.
본 실험에서 측정된 ka와 kd는 각각 5.45 μM과 3이였다. 상기 식에 따라 KD를 계산한 결과 5.5 ㎚였다. 즉 형광 강도와 LSPR 파장 이동 그래프(도 6A, 6B)을 통해, 본 발명에 따른 나노 플라즈몬 센서가 시료에 노출되는 동안 센서 중에서 금 나노입자에 결합되는 베타아밀로이드 응집체가 증가하고 있음을 확인할 수 있다.
아울러, 베타아밀로이드는 1시간동안 빠르게 응집되어 4.33 ㎚ LSPR 최대파장 이동치(△λmax)에서 11.32 ㎚로 증가하게 된다. 이는 아포리포단백질 E4이 존재할 때, 더 많이 베타아밀로이드 42가 응집되기 때문으로, 아포리포단백질 E4가 존재하지 않는 경우보다 5 배 이상 증가하므로, 베타아밀로이드 42를 종래 베타아밀로이드 검출 시약에 비해 정확히 검출할 수 있다.
또한, 도 6A에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 3의 나노 플라즈모닉 센서는 검출시 30 내지 200 분의 시간이 소요되며, 바람직하게는 30 내지 60 분이면 충분히 시료 내에 존재하는 베타아밀로이드, 특히 베타아밀로이드 42를 빠르고 정확하게 검출할 수 있다.
게다가 본 발명에 따른 실시예 3의 나노 플라즈모닉 센서는 200 내지 400 분 까지 검출 결과가 유지되므로, 장시간, 수 많은 시료를 검출해야할 경우 대기시간이 길어져도 원 검출결과를 400 분까지 유지할 수 있기 때문에 대량 검출할 때 매우 유용하다.
아울러 본 발명에 따른 나노 플라즈모닉 센서는 실시간적으로 시료 내에 존재하는 베타아밀로이드 특히, 베타아밀로이드 42의 변화를 확인할 수 있습니다. 특히, 실시예 3로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서와 베타아밀로이드 42(Aβ42+ApoE4)의 경우 제일 빠르게 반응(베타아밀로이드 응집이 일어나, 상기 응집된 베타 아밀로이드와 금 나노입자와 결합되는 것)이 일어나는 것을 확인할 수 있다.
도 7(A)은 Circular Dichroism 분석을 통하여 베타아밀로이드 42 또는 40에 대한 아포리포 단백질E4의 결합력에 따른 β-sheet 구조 형성의 활성도를 확인한 그래프이다.
이때, Aβ42는 제조예 3으로부터 제조된 베타아밀로이드 42 용액을, Aβ40은 제조예 4로부터 제조된 베타아밀로이드 40 용액을, Aβ42+ApoE4는 제조예 3으로부터 제조된 베타아밀로이드 42 용액에 제조예 2의 아포리포단백질 E4를 혼합한 용액을, Aβ40+ApoE4는 제조예 4로부터 제조된 베타아밀로이드 40 용액에 제조예 2의 아포리포단백질 E4를 혼합한 용액을 측정하여 나타낸 그래프이다.
본 실험 역시 인공뇌척수액(CSF)을 버퍼로 사용하였다.
도 7(B)은 ThT-Fluorescence 분석에 의해, ApoE4 활성에 따른 β-sheet 구조의 결정을 확인하는 그래프로, Aβ40은 베타아밀로이드 40 용액을, Aβ42는 베타아밀로이드 42 용액을, Aβ42+ApoE4는 베타아밀로이드 42 용액에 제조예 2의 아포리포단백질 E4를 혼합한 용액을, Aβ40+ApoE4는 베타아밀로이드 40 용액에 제조예 2의 아포리포단백질 E4를 혼합한 용액 각각을 티오플라빈 T(thioflavin T; ThT)과 혼합하여 유도된 형광세기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
이때, Circular Dichroism(CD) 검출기(Chirascan™-plus CD Spectrometer)로 베타아밀로이드의 응집 구조를 측정하였다. 그래프는 260-190 ㎚ 범위에서 측정된 두 측정치의 평균을 나타내었다.
도 7A에 나타난 바와 같이, 아포리포단백질 E4의 활동에 의해 베타-시트 구조가 확인되었다. 즉, 아포리포단백질 E4가 없는 것보다 아포리포단백질 E4가 존재할 경우 베타아밀로이드 42 내에 단단한 베타-시트가 형성됨을 알 수 있다.
베타아밀로이드 42가 접힘구조를 형성할 때, 아포리포단백질의 아형들 중에서 아포리포단백질 E4만이 베타아밀로이드 42와의 결합함에 있어 잘못된 접힘을 형성하는 것으로 확인되었다.
게다가, 도 7B에서 제조예 3 또는 4로부터 제조된 베타아밀로이드 42 또는 40과 제조예 2로부터 제조된 아포리포단백질 E4 및 제조예 3 또는 4의 베타아밀로이드 42 또는 40과 제조예 2의 아포리포단백질 E4를 혼합한 용액에 대해 티오플라빈-T(ThT) 분석한 결과, 아포리포단백질 E4가 존재할 때, 형성된 베타아밀로이드 42 응집체에서 베타-시트가 존재함을 확인하였다. 즉, 알츠하이머 초기단계에서 인식의 기능이 저하되는데 있어 아포리포단백질 E4이 베타아밀로이드 올리고머의 형성을 촉진시키기 때문인 것을 유추할 수 있다.
도 8은 베타아밀로이드 42(Aβ42)와 베타아밀로이드 40(Aβ40)용액을 상대적 비율에 따라 혼합하여 제조한 베타아밀로이드 용액을 실시예 1로부터 제조된 나노 플라즈모닉 센서에 로딩하여 유도된 각 경우에 대한 LSPR 이동을 기록한 그래프이다.
도 8에 나타난 바와 같이, 베타아밀로이드 42와 베타아밀로이드 40의 상대적인 비율은 베타아밀로이드와 아포리포단백질 E4의 응집을 형성함에 있어 중요한 인자이다.
베타아밀로이드의 응집을 관찰하기 위하여, 제조예 3 또는 4로부터 제조된 베타아밀로이드 42와 베타아밀로이드 40을 1:1, 0.5:1, 0.25:1, 0.1:1, 1:0.1, 1:0.25, 1:0.5의 몰농도비로 혼합하여 용액을 각각 제조하였다.
아포리포단백질 E4의 농도는 7.5 nM(제조예 2로 제조된)인 것을 사용하였고, 상기 베타아밀로이드 42(Aβ42)와 상기 베타아밀로이드 40(Aβ40)용액은 제조예 3 또는 제조예 4로부터 제조된 용액을 인공뇌척수액 버퍼액을 사용하여 100 pM로 희석하여 제조한 것을 사용하였다.
상기 베타아밀로이드 42와 상기 베타아밀로이드 40를 1:1, 0.5:1, 0.25:1, 0.1:1로 혼합한 경우, 즉 베타아밀로이드 42의 농도가 100 pM 에서 10 pM으로 낮아지는 동안(이때 베타아밀로이드 40은 100 pM으로 고정) LSPR 파장 이동이 8.8 ㎚에서 5.0 ㎚로 감소하였다(검은 점).
이와 반대로 베타아밀로이드 42와 베타아밀로이드 40을 1:0.1, 1:0.25, 1:0.5, 1:1로 혼합한 경우, 즉 베타아밀로이드 42는 100 pM으로 고정되고 베타아밀로이드 40의 농도가 100 pM에서 10 pM으로 감소할 때, LSPR 파장 이동이 관찰되지 않았다.
이로부터 베타아밀로이드 40은 베타아밀로이드 42의 응집을 형성함에 영향을 전혀 미치지 않음을 알 수 있다(붉은 점). 게다가 아포리포단백질 E4의 활성은 베타아밀로이드 40과의 상호작용이 약함을 확인할 수 있으며, 베타아밀로이드 42와 결합을 안정적으로 형성하며, 베타아밀로이드 40 대신에 베타아밀로이드 42로부터 특이적으로 프로토 피브릴(protofibrils)을 형성함을 알 수 있다.

Claims (15)

  1. 아민 또는 티올 또는 알킬 말단기를 포함하는 실란화합물로 표면처리된 기판; 및
    상기 기판 상에 고정된 복수 개의 금 나노입자; 및
    아포리포단백질 E4;를 포함하고,
    상기 아포리포단백질 E4는 상기 금 나노입자와 이격되어 유동성을 가지도록 로딩된 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 금 나노입자의 평균 직경은 40 내지 60 ㎚인 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 기판 상에 고정된 복수 개의 금 나노입자는 서로 이격되어 배치되어 있고,
    상기 금 나노입자 간의 이격거리는 금 나노입자 직경에 대해 1.5 내지 3.5 배인 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 금 나노입자는 국소 표면 플라즈몬 공명 현상을 나타내는 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서는 베타아밀로이드 42(Aβ42)를 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서는 검출한계가 1 내지 10 pM인 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서는 인 비트로(in vitro) 상태에서 시료를 분석하는 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서.
  10. ⅰ) 제1항에 따른 나노 플라즈모닉 센서를 베타아밀로이드를 포함하는 시료에 노출시키는 단계;
    ⅱ) 상기 ⅰ) 단계의 노출을 통해 상기 시료 내의 베타아밀로이드와 상기 나노 플라즈모닉 센서가 반응하여 금 나노입자-베타아밀로이드 복합체를 형성하는 단계; 및
    ⅲ) 상기 ⅱ) 단계에서 형성된 금 나노입자-베타아밀로이드 복합체를 암시야 현미경과 레일리-산란 스펙트로스코피를 이용하여 광산란 스펙트럼을 측정하고 최대파장 이동도를 측정하는 단계;를 포함하는 베타아밀로이드의 검출방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 ⅱ) 단계는 30 내지 60 분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드의 검출방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 ⅲ) 단계에서 측정된 최대파장 이동도를 통해 베타아밀로이드를 정량적 혹은 정성적으로 검출하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드의 검출방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 ⅰ) 단계는 인 비트로(in vitro) 상태에서 수행되는 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드의 검출방법.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 베타아밀로이드는 베타아밀로이드 42(Aβ42)인 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드의 검출방법.
  15. 입사광을 제공하는 광원부;
    상기 입사광에 의해 베타아밀로이드 응집물의 종류와 함량에 따라 표면 플라즈몬 공명 현상이 유도되는 제1항에 따른 베타아밀로이드 검출용 나노 플라즈모닉 센서; 및
    상기 표면 플라즈몬 공명 현상에 의해 상기 금 나노입자들에서 방출되는 방출광의 공명 파장을 검출하는 검출부;를 포함하는 베타아밀로이드 검출장치.
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