KR101003124B1 - 금 나노입자를 이용한 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환의 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 베타 아밀로이드가 화학적으로 결합된 금 나노입자를 이용하여 피검시료 내 베타 아밀로이드 응집 저해제의 존재를 확인하는 방법, 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환의 진단 방법 및 베타 아밀로이드 응집 저해제의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환을 억제하는 베타 아밀로이드 응집 저해제의 존재 여부를 간단하게 육안으로 확인할 수 있으므로 상기 질환의 진단에 이용될 수 있으며, 상기 질환의 치료제로 개발 가능한 베타 아밀로이드 응집 저해제를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

금 나노입자를 이용한 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환의 진단 방법{Method for diagnosing Alzheimer's disease or dementia-related neurological diseases using gold nanoparticle}

본 발명은 금 나노입자를 이용한 치매 관련 신경계 질환의 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 화학적 결합을 통해 베타 아밀로이드가 결합된 금 나노입자를 이용하여 피검시료 내 베타 아밀로이드 응집 저해제의 존재를 확인하는 방법, 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환의 진단 방법 및 베타 아밀로이드 응집 저해제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

노화에 의해 발생하는 대표적 질병 중의 하나인 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 또는 치매 관련 신경계 질환은 신경세포의 퇴화와 이로 인한 인지, 기억능력의 상실을 가져오는 질환으로서, 가족력에 의한 유전적인 경우와 그 원인이 뚜렷하지 않은 산발적 경우로 나눌 수 있다. 상기 질환은 사회의 노령화에 따라 급속하게 증가하는 추세로서, 조기진단, 예방 및 치료에 대한 필요성이 시급한 실정이다. 하지만, 신경 세포 퇴화와 기억 및 인지 능력의 상실에 대한 정확한 원인이 밝혀지지 않아 확실한 진단의 기준도 제시되지 않고 있다. 다만, 사망한 환자의 사후 뇌조직 연구에 의하면 신경세포 주변에 비정상적인 노인성 플라그(senile plague)의 형성이 다량 검출되는 현상이 대표적 특징으로 알려져 있다. 특히, 상기 노인성 플라그는 베타 아밀로이드(β-Amyloid)라는 펩타이드의 비정상적인 축적과 그에 따른 베타 아밀로이드 응집(β-Amyloid aggregation)이 원인으로 알려지면서 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환의 연구 분야에서 가장 핵심적인 목표물질로 간주되어 주목을 받고 있으며, 이러한 질병의 진단, 예방 및 치료의 연구에 새로운 화두로 떠오르고 있다. 또한 알츠하이머병 또는 치매 관련 질환 환자의 혈액이나 뇌척수액내에 베타 아밀로이드의 응집 저해제(β-Amyloid aggregation inhibitor)의 농도 저하가 이들 베타 아밀로이드 응집체의 증가 원인으로 여겨지며 진단과 치료에 응용하고자 하는 많은 연구가 진행 중이다.

하지만, 이러한 질환의 진단은 현재까지 신경심리학적인 검사나 특화된 MRI 촬영과 같은 많은 시간과 경비가 소요되는 방법들만이 가능하였다. 생화학적 방법을 진단에 사용한 것으로는 뇌척수액에서 베타 아밀로이드 단백질의 감소와 베타 아밀로이드 40 형태에 대한 42 형태의 비율, tau 단백질 농도, 혈청내에서 베타 아밀로이드 단백질의 증가와 신경아교원섬유산성단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP)-항체의 증가 등이 가능성을 나타내고 있으나 진단의 간편성과 정확도 등의 문제가 제기되고 있다.

이에 본 발명자들은 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환의 중요 지표인 베타 아밀로이드 응집 저해제의 존재 여부를, 베타 아밀로이드가 결합된 금 나노입자를 이용하여 간단하게 확인하는 방법을 개발하였고, 상기 방법이 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환의 진단뿐만 아니라 상기 질환의 예방 또는 치료를 위한 물질을 스크리닝하는데 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 피검시료 내 베타 아밀로이드 응집 저해제의 존재 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환의 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 베타 아밀로이드 응집 저해제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신경계 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라 본 발명은 금 나노입자와 베타 아밀로이드를 화학적으로 결합시키는 단계; 피검시료에 상기 금 나노입자-베타 아밀로이드를 혼합하는 단계; 및 베타 아밀로이드 응집체의 형성에 따른 금 나노입자의 침전을, 피검시료를 포함하지 않는 대조군과 육안으로 비교하거나 상등액의 흡광도로 비교하는 단계를 포함하는 피검시료 내 베타 아밀로이드 응집 저해제의 존재 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라 본 발명은 피험자로부터 체액 시료를 수득하는 단계; 상기 체액 시료에, 베타 아밀로이드가 화학적으로 결합된 금 나노입자를 혼합하는 단계; 및 베타 아밀로이드 응집체의 형성에 따른 침전을 체액을 포함하지 않는 대조군과 육안으로 비교하거나 상등액의 흡광도로 비교하는 단계를 포함하는, 체액 내 베타 아밀로이드 응집 저해제의 존재 여부를 통해 피험자에서의 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적에 따라 본 발명은 금 나노입자와 베타 아밀로이드를 화학적으로 결합시키는 단계; 상기 금 나노입자-베타 아밀로이드에 베타 아밀로이드 응집 저해 후보물질을 첨가하는 단계; 및 베타 아밀로이드 응집체의 형성에 의한 침전을 육안으로 대조군과 비교하거나 또는 상등액의 흡광도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 베타 아밀로이드 응집 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적에 따라 본 발명은 베타 아밀로이드가 결합된 금 나노입자를 포함하는, 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환의 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환을 억제하는 것으로 알려진 베타 아밀로이드 응집 저해제의 존재 여부를 간단하게 육안으로 확인할 수 있으므로 이를 통하여 상기 질환의 진단에 이용될 수 있으며, 상기 질환의 치료제로 개발 가능한 베타 아밀로이드 응집 저해제를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 스트렙타비딘이 부착된 금 나노입자에 바이오틴이 연결된 베타 아밀로이드를 첨가하지 않거나(P1), 첨가한(P2 및 P3) 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 스트렙타비딘이 부착된 금 나노입자에 바이오틴이 연결된 베타 아밀로이드를 첨가하지 않거나(Au+DMSO), 첨가한(Au+B-Ab1 및 Au+B-Ab2) 후, 상등액을 취하여 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 스트렙타비딘이 부착된 금 나노입자에 저농도에서 고농도의 바이오틴이 연결된 베타 아밀로이드를 첨가한 후 침전생성 여부를 나타낸 것이다.
도 4는 도 3의 시료에 베타 아밀로이드의 응집체 형성 여부를 확인하기 위하여 ThT 분석을 실행하고 이를 대조군 대비 백분율(%)로 나타낸 그래프이다.
도 5는 스트렙타비딘이 부착된 금 나노입자에 바이오틴-베타 아밀로이드 및 아밀로이드 응집 저해제인 TTR을 첨가한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 도 5의 시료의 상등액을 취하여 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 도 5의 시료를 ThT 분석에 의해 대조군 대비 백분율(%)로 나타낸 그래프이다.
도 8은 도 5의 시료(C1, P1 및 P2)를 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 촬영한 사진이다.

본 발명은 1) 금 나노입자와 베타 아밀로이드를 화학적으로 결합시키는 단계; 2) 피검시료에 상기 금 나노입자-베타 아밀로이드를 혼합하는 단계; 및 3) 베타 아밀로이드 응집체의 형성에 따른 금 나노입자의 침전을, 피검시료를 포함하지 않는 대조군과 육안으로 비교하거나 상등액의 흡광도로 비교하는 단계를 포함하는 피검시료 내 베타 아밀로이드 응집 저해제의 존재 여부를 확인하는 방법을 제공한다

상기 방법은 베타 아밀로이드 응집 저해제의 존재 여부를 금 나노입자의 침전 저해 여부로 확인하는데 특징이 있다.

본 발명의 방법에 있어서 단계 1)은 금 나노입자와 베타 아밀로이드를 화학적으로 결합시키는 단계이다. 상기 금 나노입자는 시판 중인 제품을 사용할 수 있으며, 입자 크기에 크게 제한이 없으나, 10 - 800 nm의 크기의 나노입자를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 베타 아밀로이드는 시판 중인 제품을 사용할 수 있다.

한편, 상기 단계 1)의 화학적 결합은 당해 분야에서 알려진 다양한 화학 결합, 예를 들면 적절한 링커(linker)를 사용하여 연결하거나 금 나노입자와 베타 아밀로이드에 적절한 화학물질을 고정화한 후 이들의 결합을 통해 연결할 수 있다. 바람직하게는 금 나노입자에 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 캡타비딘(captavidin)을 표면 부착시키고, 베타 아밀로이드에 바이오틴(biotin)을 연결시킨 후, 상기 아비딘 등과 바이오틴의 특이적 결합에 의해 금 나노입자와 베타 아밀로이드를 화학적으로 결합시킬 수 있다. 이 때 아비딘 등이 부착된 금 나노입자는 시판 중인 제품을 사용하거나 당해 기술분야의 숙련자에 의해 본 방법의 실시에 앞서 미리 제조할 수 있으며, 바이오틴이 연결된 베타 아밀로이드 역시 동일하다. 상기 금 나노입자와 베타 아밀로이드의 결합은, 구체적으로, 아비딘 등이 부착된 금 나노입자를 PBS와 같은 적절한 완충액에 분산시켜 제조한 금 나노입자 현탁액에 바이오틴이 연결된 베타 아밀로이드를 혼합하여 수행될 수 있다.

상기 단계를 통하여 베타 아밀로이드 응집체 형성이 금 나노입자의 침전으로 표시되며, 아비딘과 바이오틴의 결합을 이용하는 경우, 바이오틴-베타 아밀로이드와 금 나노입자-아비딘, -스트렙타비딘, -뉴트라비딘 또는 -캡타비딘이 반응하여 베타 아밀로이드 응집체를 형성하며, 이는 금 나노입자의 침전으로 표시된다.

본 발명의 방법에 있어서, 단계 2)는 피검시료에 상기 금 나노입자-베타 아밀로이드를 혼합하는 단계이다. 여기서, 피검시료는 베타 아밀로이드 응집 저해제의 존재 여부를 확인하고자 하는 시료로서 그 사용에 제한이 없으며, 예로서 베타 아밀로이드 응집 저해제의 존재가 예상되는 시료, 바람직하게는 혈액 시료와 같은 체액 시료일 수 있다.

혼합 후, 베타 아밀로이드 응집체의 형성에 의한 침전 또는 침전의 억제를 유도하기에 충분한 시간 동안 방치한다. 방치 시간은 1일 내지 3일 동안 상온에서 방치하는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 방법에 있어서 단계 3)은 베타 아밀로이드 응집체의 형성에 따른 금 나노입자의 침전을, 피검시료를 포함하지 않는 대조군과 육안으로 비교하거나 상등액의 흡광도로 비교하는 단계이다.

피검시료에 베타 아밀로이드 응집 저해제가 존재할 경우 금 나노입자 표면에 부착된 베타 아밀로이드가 응집체를 형성하지 못하고 이는 나노입자의 침전 형성을 유도하지 않으므로 베타 아밀로이드에 연결된 바이오틴과 금 나노입자에 부착된 아비딘 등의 결합에 의한 금 나노입자의 자주색 침전이 일어나지 않게 되는 반면, 피검시료에 베타 아밀로이드 응집 저해제가 존재하지 않는 경우 금 나노입자의 자주색 침전이 일어나게 된다. 한편, 피검시료를 포함하지 않은 대조군의 경우 베타 아밀로이드 응집 저해제가 존재하지 않으므로 자주색 침전이 일어나게 된다. 따라서, 피검시료를 이용한 실험군의 침전을 대조군과 육안으로 비교함으로써 피검시료 내 베타 아밀로이드 응집 저해제의 존재를 간단하게 확인할 수 있다. 또한, 실험군의 상등액의 흡광도와 대조군의 상등액의 흡광도를 비교하여 침전 여부를 판단할 수도 있다. 대조군의 상등액은 베타 아밀로이드 응집체의 형성으로 낮은 흡광도를 나타내고, 반면 베타 아밀로이드 응집 저해제를 포함하여 베타 아밀로이드 응집체가 형성되지 않은 실험군은 높은 흡광도를 나타낸다.

또한, 본 발명은 1) 피험자로부터 체액 시료를 수득하는 단계; 2) 상기 체액 시료에, 베타 아밀로이드가 화학적으로 결합된 금 나노입자를 혼합하는 단계; 및 3) 베타 아밀로이드 응집체의 형성에 따른 침전을 체액을 포함하지 않는 대조군과 육안으로 비교하거나 상등액의 흡광도로 비교하는 단계를 포함하는, 체액 내 베타 아밀로이드 응집 저해제의 존재 여부를 통해 피험자에서의 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 방법에 있어서, 단계 1)은 피험자로부터 체액 시료를 수득하는 단계이다. 상기 체액 시료는 바람직하게는 혈액, 척수액, 뇌척수액 등일 수 있으며, 예를 들어, 피험자에게 해를 끼치지 않는 방법으로 채취할 수 있다.

본 발명의 상기 방법에 있어서, 단계 2)는 상기 체액 시료에, 베타 아밀로이드가 화학적으로 결합된 금 나노입자를 혼합하는 단계이고, 단계 3)은 베타 아밀로이드 응집체의 형성에 따른 침전을 체액을 포함하지 않는 대조군과 육안으로 비교하거나 상등액의 흡광도로 비교하는 단계이다. 상기 단계 2) 내지 3)은 앞서 언급한 방법과 동일하게 수행된다. 상기 단계 2)의 "베타 아밀로이드가 화학적으로 결합된 금 나노입자"는 앞에서 언급한 바와 같이 당해 분야에서 알려진 다양한 화학 결합, 예를 들면 적절한 링커(linker)를 사용하여 연결하거나 금 나노입자와 베타 아밀로이드에 적절한 화학물질을 고정화한 후 이들의 결합을 통해 연결한 것으로서, 바람직하게는 금 나노입자에 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 캡타비딘(captavidin)을 표면 부착시키고, 베타 아밀로이드에 바이오틴(biotin)을 연결시킨 후, 상기 아비딘 등과 바이오틴의 특이적 결합에 의해 금 나노입자와 베타 아밀로이드를 화학적으로 결합시킨 것일 수 있다.

상기 방법에 따라 체액 시료를 사용한 실험군에서 대조군과 달리 금 나노입자가 침전되지 않은 경우, 체액 시료 내에 베타 아밀로이드 응집 저해제가 존재하여 베타 아밀로이드 응집체가 형성되지 않았다는 것을 의미하므로, 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환의 가능성이 낮다고 진단할 수 있으며, 체액 시료를 사용한 실험군에서 대조군과 비슷하게 금 나노입자가 침전된 경우, 체액 시료 내에 베타 아밀로이드가 존재하거나 미약하여 베타 아밀로이드 응집체가 형성되었다는 것을 의미하므로, 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환의 가능성이 높다고 진단할 수 있다.

나아가, 본 발명의 방법은 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환의 치료제로 개발될 수 있는 베타 아밀로이드 응집 저해제를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 상기 스크리닝 방법은 1) 금 나노입자와 베타 아밀로이드를 화학적으로 결합시키는 단계; 2) 상기 금 나노입자-베타 아밀로이드에 베타 아밀로이드 응집 저해 후보물질을 첨가하는 단계; 및 3) 베타 아밀로이드 응집체의 형성에 의한 침전을 육안으로 대조군과 비교하거나 또는 상등액의 흡광도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)은 금 나노입자와 베타 아밀로이드를 화학적으로 결합시키는 단계이고, 단계 2)는 상기 금 나노입자-베타 아밀로이드에 베타 아밀로이드 응집 저해 후보물질을 첨가하는 단계이다. 상기 단계 1)은 앞에서 언급한 바와 같이 당해 분야에서 알려진 다양한 화학 결합, 예를 들면 적절한 링커(linker)를 사용하여 연결하거나 금 나노입자와 베타 아밀로이드에 적절한 화학물질을 고정화한 후 이들의 결합을 통해 연결할 수 있으며, 바람직하게는 금 나노입자에 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 캡타비딘(captavidin)을 표면 부착시키고, 베타 아밀로이드에 바이오틴(biotin)을 연결시킨 후, 상기 아비딘 등과 바이오틴의 특이적 결합에 의해 금 나노입자와 베타 아밀로이드를 화학적으로 결합시킬 수 있다. 한편, 상기 단계 2)에서 대조군에는 후보 물질을 첨가하지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)은 베타 아밀로이드 응집체의 형성에 의한 침전을 육안으로 대조군과 비교하거나 또는 상등액의 흡광도를 대조군과 비교하는 단계이다. 단계 2)에서 베타 아밀로이드 응집 저해 활성을 갖는 물질이 첨가된 경우, 베타 아밀로이드 응집체가 형성되지 않아 금 나노입자의 침전이 이루어지지 않는 반면, 베타 아밀로이드 응집 저해 물질이 첨가되지 않은 대조군의 경우 베타 아밀로이드 응집체가 형성되어 금 나노입자의 침전이 이루어지므로 상기 침전을 육안으로 비교하여 베타 아밀로이드 응집 저해 활성을 판단할 수 있다. 또한, 베타 아밀로이드 응집 저해 활성을 갖는 물질이 첨가된 실험군의 경우 상등액의 흡광도가 높게 나오는 반면, 대조군의 경우 상등액의 흡광도가 낮게 나오므로, 흡광도 비교에 의해 베타 아밀로이드 응집 저해 활성을 판단할 수 있다.

상기 방법에서 베타 아밀로이드 응집 저해 활성을 갖는 것으로 판단된 물질은 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환의 치료제로 사용될 수 있다.

한편, 본 발명은 베타 아밀로이드가 결합된 금 나노입자를 포함하는, 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환의 진단용 키트를 제공한다. 상기 진단용 키트는 피검시료(예를 들어, 혈액 시료) 내 베타 아밀로이드 응집 저해제의 존재 여부를 통해 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환을 진단할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 스토렙타비딘이 부착된 금 나노입자를 이용한 베타 아밀로이드 응집체 형성 확인(육안 관찰)

스트렙타비딘이 표면 부착된 40nm 크기의 금 나노입자(BA.STP 40, BBInternational, UK) 20 μL를 3차 증류수로 두 번 세척한 후, 20 μL의 PBS(phosphate-buffered saline) 용액에 분산시켰다. 그리고 나서, 상기 분산액에 바이오틴이 연결된 베타 아밀로이드(Biotin-Amyloid beta, Bachem, USA)를 1μg 첨가하여 금 나노입자의 표면에 베타 아밀로이드를 부착시켰다. 대조군의 경우, 바이오틴-베타 아밀로이드 대신에 용매(DMSO)만을 첨가하였다. 상기 혼합물 각각을 상온에서 이틀간 방치하여 베타 아밀로이드 응집체(β-Amyloid aggregation)의 형성을 유도하였다. 방치 후, 베타 아밀로이드 응집체 형성으로 의한 침전을 육안으로 관찰하였다. 관찰 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1의 P1은 스트렙타비딘이 부착된 금 나노입자를 PBS 용매에 분산한 후, 바이오틴이 연결된 베타 아밀로이드의 첨가 없이 DMSO 용매만을 첨가하고 배양한 대조군의 결과를 나타낸 것이고, P2 및 P3는 스트렙타비딘이 부착된 금 나노입자를 PBS 용매에 분산한 후, 바이오틴이 연결된 베타 아밀로이드를 첨가하여 배양한 실험군의 반복 결과를 나타낸 것이다. 도 1에서 보는 바와 같이, 대조군과 달리, 바이오틴이 연결된 베타 아밀로이드가 첨가된 실험군에서 침전이 육안으로 관찰되었다. 베타 아밀로이드 응집체의 형성은 그 자체로는 육안으로 관찰이 어려우나 본 발명에서와 같이 스트렙타비딘이 부착된 금 나노입자를 사용하는 경우, 베타 아밀로이드가 금 나노입자의 표면에 부착되어 적색의 금 나노입자의 침전을 일으킴으로써 이를 육안으로 확인할 수 있었다.

실시예 2: 스토렙타비딘이 부착된 금 나노입자를 이용한 베타 아밀로이드 응집체 형성 확인(흡광도 측정)

실시예 1에서 형성된 베타 아밀로이드 응집체의 형성을 정량적으로 나타내기 위하여, 흡광도 측정 방법을 이용하였다. 즉, 스트렙타비딘이 결합된 금 나노입자 현탁액에 바이오틴이 연결된 베타 아밀로이드의 첨가로 인해 생긴 침전의 생성 정도는 상등액의 희석정도와 비례하므로 상등액의 흡광도를 측정하면 형성된 베타 아밀로이드 응집체의 양을 정량적으로 나타낼 수 있다.

구체적으로, 실시예 1에서 침전이 형성된 후, 상기 용액 상등액을 취하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 보는 바와 같이, 베타 아밀로이드 응집체가 형성되지 않은 대조군의 상등액의 경우 0.2 정도의 흡광도를 나타낸 반면, 베타 아밀로이드 응집체가 형성된 실험군의 상등액의 경우 0.02 이하의 낮은 흡광도를 나타내었다. 상기 결과에 의해 실시예 1에서 육안으로 확인된 침전 존재 여부를 정량적으로 나타낼 수 있었다.

실시예 3: ThT 분석에 의한 금 나노입자 침전과 베타 아밀로이드 응집체 형성의 연관성 확인

실시예 2에서의 침전이 베타 아밀로이드 응집체에 의한 것인지 확인하기 위하여 베타 아밀로이드 응집체의 형성 확인 및 정량에 사용되는 ThT(thioflavin T) 분석을 수행하였다.

구체적으로, 스트렙타비딘이 부착된 금 나노입자를 PBS 용액에 분산시켜 아무것도 첨가하지 않은 대조군(C-PBS) 및 상기 분산액에 바이오틴-베타 아밀로이드 용매인 DMSO를 첨가한 대조군(C-DMSO)을 준비하였다. 한편, 상기 금 나노입자를 PBS에 분산시킨 분산액에 바이오틴이 연결된 베타 아밀로이드를 저농도에서 고농도까지 처리하였다. 상기 처리한 바이오틴-베타 아밀로이드의 농도는 각각 0.01 μM(#1), 0.05 μM(#2), 0.1 μM(#3), 0.5 μM(#4), 1 μM(#5), 10 μM(#6), 50 μM(#7), 100 μM(#8) 및 300 μM(#9)였다. 상기 처리 후, 베타 아밀로이드 응집체의 형성을 위하여 상온에서 이틀간 방치하였다. 상기 대조군 및 실험군에 사용된 금 나노입자의 분산액과 바이오틴-베타 아밀로이드의 양은 하기 표 1과 같다.

	금나노입자현탁액(μL)	바이오틴-베타 아밀로이드(μM)
대조군(C-PBS)	20	0
대조군(C-DMSO)	20	0
실험군 1	20	0.01
실험군 2	20	0.05
실험군 3	20	0.1
실험군 4	20	0.5
실험군 5	20	1
실험군 6	20	10
실험군 7	20	50
실험군 8	20	100
실험군 9	20	300

ThT 분석을 위하여, 상기 바이오틴-베타 아밀로이드가 처리된 각각의 혼합액 20 μL를 96-웰플레이트에 옮긴 후 150 μL의 ThT 용액(50 mM, pH 8.5 글리신 완충액, 1mM ThT 스톡 용액)을 첨가하여 15분간 반응시키고 형광측정기(Fluorescence reader; excitation: 437 nm, emission: 485 nm))에서 형광을 측정하였다. 측정결과는 도 3 및 도 4에 나타내었다. 도 3은 형광측정 전의 대조군 및 실험군의 사진이며, 도 4는 대조군(C-DMSO) 대비 ThT 분석 백분율(%)을 나타낸 것이다. 측정 결과, 금 나노의 침전과 ThT에 의한 베타 아밀로이드 응집체 모두 10μM 이상에서 확연한 차이를 볼 수 있었으며 침전여부와 베타 아밀로이드의 응집 정도 여부는 일치하는 것으로 나타났다.

실시예 4: 금 나노입자 현탁액을 이용한 베타 아밀로이드 응집 저해제의 스크리닝

실시예 1 내지 3을 통해 알 수 있는 바와 같이, 금 나노입자 표면에 베타 아밀로이드를 부착시켜 상온에서 방치하면 베타 아밀로이드의 응집체가 형성되며, 이는 금 나노입자의 침전으로 가시화된다. 따라서, 베타 아밀로이드의 응집 저해제를 첨가하면 베타 아밀로이드 응집체가 형성되지 않아 금 나노입자가 침전되지 않을 것이므로, 이를 이용하여 베타 아밀로이드 응집 저해제를 스크리닝하는데 사용할 수 있을 것으로 판단하였다.

상기 가정을 검증하기 위하여, 베타 아밀로이드의 응집을 저해하는 것으로 알려진 대표적인 물질인 트랜스티레틴(transthyretin, 이하 "TTR"이라 함)을 이용하여 응집 억제 작용과 나노입자 침전 유무의 상관관계를 확인하였다.

구체적으로, 스트렙타비딘이 부착된 금 나노입자를 PBS에 현탁시킨 후, 1 μL의 바이오틴-베타 아밀로이드(1 μg/μL)를 첨가하고, 각각 0, 1 및 2 μL의 TTR(3μg/μL)을 첨가하여 상온 배양한 후 상등액을 취하여 흡광도를 측정하였다. 금 나노입자 현탁액에 DMSO만 첨가한 군(C1) 및 금 나노입자 현탁액에 DMSO 및 2 μL의 TTR을 첨가한 군(C2)을 대조군으로 사용하였다. 상기 대조군 및 실험군에 사용한 물질 및 OD 측정결과를 하기 표 2에 정리하였다. 한편, 대조군 및 실험군의 사진을 도 5에 나타내었고, OD 측정결과를 도 6에 나타내었으며, ThT 분석 결과를 도 7에 나타내었다.

도 5에서 보는 바와 같이, TTR이 없이 배양된 실험군(P1)의 경우 금 나노입자들의 침전이 형성된 반면, 베타 아밀로이드 응집 저해제인 TTR과 함께 배양된 실험군(P2 및 P3)의 경우 금 나노입자의 침전이 형성되지 않았음을 육안으로 확인할 수 있었다. 또한 표 2 및 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, TTR이 없이 배양된 실험군(P1)의 경우 금 나노입자의 침전으로 인하여 상등액의 OD 값이 0.019로 낮은 반면, 저해제인 TTR을 첨가하여 침전이 형성되지 않은 실험군(P2 및 P3)의 경우 침전이 생성되지 않았던 대조군과 비슷한 수준의 높은 흡광도 수치를 나타내었으며, 이는 ThT 분석에 의하여도 베타 아밀로이드의 응집체가 형성되지 않았음을 재차 확인할 수 있었다(도 7 참조).

상기 결과를 검증하기 위하여, 투과전자현미경(TEM; JEM-1400)을 이용하여 ×20,000, ×100,000 및 ×300,000의 배율로 C1, P1 및 P2의 입자를 관찰하였다. 관찰 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, TTR이 없이 배양된 실험군(P1)의 경우 금 나노입자의 응집체가 관찰된 반면, 저해제인 TTR을 첨가한 실험군(P2)의 경우 응집체가 형성되지 않음을 역시 확인할 수 있었다.

따라서, 스트렙타비딘이 부착된 금 나노입자를 이용하여 베타 아밀로이드의 응집을 저해하는 물질을 간편하게 스크리닝할 수 있을 것으로 판단되며, 상기 저해 물질은 알츠하이머 병 및 치매 관련 신경계 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims (14)

1) 금 나노입자와 베타 아밀로이드를 화학적으로 결합시키는 단계;
2) 피검시료에 상기 금 나노입자-베타 아밀로이드를 혼합하는 단계;
3) 베타 아밀로이드 응집체의 형성에 따른 금 나노입자의 침전을, 피검시료를 포함하지 않는 대조군과 육안으로 비교하거나 상등액의 흡광도로 비교하는 단계
를 포함하는 피검시료 내 베타 아밀로이드 응집 저해제의 존재 여부를 확인하는 방법.

제1항에 있어서, 상기 금 나노입자가 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 캡타비딘(captavidin)이 표면 부착된 금 나노입자인 것을 특징으로 하는 방법.

제2항에 있어서, 상기 금 나노입자가 스트렙타비딘이 표면 부착된 금 나노입자인 것을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서, 상기 베타 아밀로이드가 바이오틴(biotin)이 연결된 베타 아밀로이드인 것을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서, 금 나노입자와 베타 아밀로이드의 화학적 결합이 금 나노입자에 부착된 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘 또는 캡타비딘과 베타 아밀로이드에 연결된 바이오틴과의 특이적 결합에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 금 나노입자가 스트렙타비딘이 표면 부착된 금 나노입자를 인산완충액(PBS)에 분산시킨 현탁액인 것을 특징으로 하는 방법.

1) 피험자로부터 체액 시료를 수득하는 단계;
2) 상기 체액 시료에, 베타 아밀로이드가 화학적으로 결합된 금 나노입자를 혼합하는 단계; 및
3) 베타 아밀로이드 응집체의 형성에 따른 침전을 체액을 포함하지 않는 대조군과 육안으로 비교하거나 상등액의 흡광도로 비교하는 단계
를 포함하는, 체액 내 베타 아밀로이드 응집 저해제의 존재 여부를 통해 피험자에서의 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환을 진단하는 방법.

제7항에 있어서, 상기 단계 2)의 베타 아밀로이드가 화학적으로 결합된 금 나노입자는 베타 아밀로이드에 연결된 바이오틴이, 금 나노입자에 부착된 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘 또는 캡타비딘과 반응하여 결합된 것을 특징으로 하는 방법.

제7항에 있어서, 상기 단계 2)의 베타 아밀로이드가 화학적으로 결합된 금 나노입자가 인산완충액(PBS)에 분산시킨 현탁액인 것을 특징으로 하는 방법.

1) 금 나노입자와 베타 아밀로이드를 화학적으로 결합시키는 단계;
2) 상기 금 나노입자-베타 아밀로이드에 베타 아밀로이드 응집 저해 후보물질을 첨가하는 단계; 및
3) 베타 아밀로이드 응집체의 형성에 의한 침전을 육안으로 대조군과 비교하거나 또는 상등액의 흡광도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 베타 아밀로이드 응집 저해제의 스크리닝 방법.

제10항에 있어서, 상기 단계 1)의 금 나노입자와 베타 아밀로이드의 화학적 결합이 금 나노입자에 부착된 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘 또는 캡타비딘과 베타 아밀로이드에 연결된 바이오틴과의 특이적 결합에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.

제10항에 있어서, 상기 단계 1)의 금 나노입자가 스트렙타비딘이 표면 부착된 금 나노입자를 인산완충액(PBS)에 분산시킨 현탁액인 것을 특징으로 하는 방법.

베타 아밀로이드가 결합된 금 나노입자를 포함하는, 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환의 진단용 키트.

제13항에 있어서, 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘 또는 캡타비딘이 표면 부착된 금 나노입자; 및 바이오틴이 연결된 베타 아밀로이드를 포함하는, 알츠하이머병 또는 치매 관련 신경계 질환의 진단용 키트.

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