KR100862318B1 - 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정용 칩 및트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법 - Google Patents

트랜스글루타미나아제의 활성도 측정용 칩 및트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 치매 등의 퇴행성 뇌질환, 퇴행성관절염, 자가면역 질환 등 다양한 질환에 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려진 트랜스글루타미나아제의 활성도를 분석하는 기술에 관한 것으로서, 본 발명에서는 방사선 동위원소를 이용하거나 웨스턴 블럿(Western blot)을 통해 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정하는 기존의 방법과는 달리 어레이 형태의 분석칩을 이용하여 간단하게 트랜스 글루타미나아제의 활성도 측정이 가능하여 분석시간을 현저하게 단축할 수 있고, 적은 시료로도 고감도로 측정할 수 있어 세포내에서 일어나는 기전을 규명할 수 있는 분석 방법에도 활용이 가능하며, 세포내 활성도 측정을 통한 세포의 조절 및 기능 연구에 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 혈액 등과 같은 체액을 이용한 각종 질환 검사에도 활용이 가능한 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정용 칩 및 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법을 제공한다.

Description

트랜스글루타미나아제의 활성도 측정용 칩 및 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법{Array-based transglutaminase activity assay chip and transglutaminase activity assay method}
도 1a와 도 1b는 본 발명의 실시예 1에 따라 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정한 결과와, 측정 결과의 형광세기를 그래프로 도식한 도면.
도 2a와 도 2b는 본 발명의 실시예 2에 따라 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정한 결과와, 측정 결과의 형광세기를 그래프로 도식한 도면.
도 3a와 도 3b는 본 발명의 실시예 3에 따라 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정한 결과와, 측정 결과의 형광세기를 그래프로 도식한 도면.
도 4a와 도 4b는 본 발명의 실시예 4에 따라 세포에서 분리한 세포추출물 내의 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정한 결과를 타나낸 그래프.
도 5a와 도 5b는 본 발명의 실시예 5에 따라 혈액에서 불리한 혈청내의 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정한 결과를 타나낸 그래프.
본 발명은 치매 등의 퇴행성 뇌질환, 퇴행성관절염, 자가면역 질환 등 다양 한 질환에 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려진 트랜스글루타미나아제의 활성도를 분석하는 기술에 관한 것으로서, 특히 다수의 시료를 빠르고 환경 친화적으로 분석이 가능할 뿐만아니라 적은 시료로도 고감도 분석이 가능하도록 한 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정용 칩 및 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법에 관한 것이다.
트랜스글루타미나아제(transglutaminase; TGase)는 라이신 (또는 폴리아민)과 글루타민의 공유 교호결합을 촉매하며, 다양한 질환, 특히 치매 등의 퇴행성 뇌질환, 퇴행성관절염, 자가면역질환 등과 같은 신경성 질환에 관여한다는 것이 알려져 있다. 이러한 TGase는 정상적인 상황에서는 혈액 응고나 상처 치유 등의 보호적 작용을 하는 효소이다.
그러나, TGase는 발현이 조절 받지 못하는 경우에는 많은 질병의 병리적 기전에서 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 염증을 동반하는 질병들에서 TGase의 활성이 증가되는데, 이러한 질병의 예로서 퇴행성 관절염, 당뇨병, 자가 면역 근육염, 동맥경화, 뇌졸중, 간경화, 악성유방암, 뇌막염, 염증성 위궤양 등이 있다. 뿐만 아니라 TGase의 활성도는 치매에서 상승되는 것이 보고된 바 있다.
그에 따라 TGase의 활성도를 분석하는 것이 매우 중요하게 작용된다. 종래 일반적으로 사용되는 TGase의 활성도 측정 방법은 크게 방사선 동위원소인 3H를 이용하는 방법과 웨스턴 블럿(Western blot) 방법이 사용되고 있다.
먼저 방사성 동위원소인 3H를 이용하는 방법은 TGase의 활성화에 의해 카제인 같은 기질 단백질 (substrate)과 [3H]퓨트레신(putrescine) 사이에 아민교환반응(transamidation)이 일어나면 [3H]를 측정하여 TGase 활성도를 분석하는 방법이다. 그러나, 이와 같은 TGase 활성도 측정방법은 방사선 동위원소를 이용하고 있어 환경오염을 시킬 수 있고 실험하는 과정에서 위험성이 따르기 때문에 많은 문제점을 가지고 있다.
웨스턴 블럿 방법은 기질 단백질과 5-(바이오틴아미도)펜틸아민(5-(biotinamido)pentylamine)을 아미드교환반응(transamidation)시키고, 이를 다시 HRP-스트렙타비딘(HRP-streptavidin; Horseradish Peroxidase-streptavidin)과 반응시킨 다음 스트렙타비딘의 검출을 통해 TGase의 활성도를 검출하는 것이다. 그러나, 이러한 방법은 SDS-PAGE와 면역 검색(immunoblot)의 과정을 거쳐야하기 때문에 시간이 오래 걸리고 시료 양 또한 많이 필요하고 여러 시료를 동시에 분석하기가 어렵다. 또한 감도가 떨어져 낮은 농도에서 TGase 활성도 분석이 어렵다는 단점을 가진다.
이에 본 발명은 트랜스글루타미나아제(transglutaminase; TGase)의 활성도를 측정하기 위하여 어레이(array) 칩을 제작하고, 이를 이용하여 TGase의 활성도를 분석할 수 있도록 함으로서, 친환경적이면서도 다수의 시료를 동시에 분석가능하며, 특히 소량의 시료만으로 고감도 측정이 가능하고, 최종분석까지 걸리는 시간을 획기적으로 단축할 수 있는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정용 칩의 제조방법과, 그 방법에 의해 제조된 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정용 칩을 제공하는데 그 목적이 있다.
아울러 본 발명은 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법을 제공하는 데 다른 목적이 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란을 기판의 표면에 도입하는 단계와; 상기 기판의 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿(spot)이 형성된 어레이(array) 칩을 제조하는 단계; 상기 스폿의 단부에 트랜스 글루타미나아제의 기질 단백질을 도입하는 단계;를 포함하는 하는 것을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제 활성도 측정용 칩의 제조방법을 제공한다.
또 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 것으로서, 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란이 도입된 기판의 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿(spot)을 형성하고, 상기 스폿의 단부에 트랜스 글루타미나아제의 기질 단백질을 도입하여서 된 것임을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제 활성도 측정용 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란을 기판의 표면에 도입하는 단계와; 상기 기판의 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿(spot)이 형성된 어레이(array) 칩을 제조하는 단계; 상기 스폿의 단부에 트랜 스 글루타미나아제의 기질 단백질을 도입하는 단계와; 활성도 측정용 트랜스글루타미나아제(transglutaminase) 함유 시료와 5-(바이오틴아미도)펜틸아민(5-(biotinamido)pentylamine) 및 CaCl2를 함유하는 측정액을 상기 기질 단백질 상에 적하하여 기질 단백질과 5-(바이오틴아미도)펜틸아민의 아민교환반응(transamidation)시키는 단계와; 상기 아민교환반응에 의해 단부에 위치한 바이오틴에 분석용 표지물질을 도입한 다음 이의 분석을 통해 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정하는 단계;를 포함함을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법을 제공한다.
이하 본 발명에 따른 트랜스글루타미나아제(transglutaminase;TGase)의 활성도 측정용 칩과 활성도 측정방법에 대하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명에서는 TGase의 활성도를 측정하기 위하여 종래 일반적으로 사용되는 방사선 동위원소인 3H를 이용하는 방법과 웨스턴 블럿(Western blot) 방법과는 전혀 다른 칩을 기반으로 한 측정방법을 제공한다.
이를 위하여 본 발명에서는 소정의 단계로 이루어지는 TGase 활성도 측정용 칩의 제조방법을 제공한다.
이를 위하여 먼저 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란을 기판의 표면에 도입하는 단계를 거치게 된다.
여기서 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란은 아미노알킬트리알콕시실란(aminoalkyltrialkoxysilane), 머캅토알킬트리알콕시실 란(Mercaptoalkyltrialkoxysilane) 또는 에폭시알킬트리알콕시실란(epoxyalkyltrialkoxysilane)에서 선택된 것을 사용할 수 있다.
아미노알킬트리알콕시실란은 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-amonopropyltrimethoxysilane), 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-amonopropyltriethoxysilane), 3-2-2-아미노에틸아미노에틸아미노프로필트리메톡시실란 (3-[2-(2-aminoethylamino)ethylamino]propyl-trimethoxysilane)에서 선택된 것을 사용할 수 있으며, 머캅토알킬트리알콕시실란으로는 3-머캅토프로필트리메톡시실란(3-Mercaptopropyltrimethoxysilane)을 사용할 수 있고, 에폭시알킬트리알콕시실란은 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane)을 사용할 수 있다.
이러한 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란은 다양한 공지된 방법을 적용하여 기판의 표면에 도입할 수 있는데, 본 발명에서는 에탄올과 같은 통상의 알코올류 용매에 알콕시실란을 용해시킨 다음 이 용액에 기판을 침적하여 기판의 표면에 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란이 도입되도록 하였다. 이때 작업의 편의성을 고려하여 에탄올에 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란은 1 내지 2중량%가 함유되도록 용해하였으나, 그 농도를 반드시 한정할 필요는 없다.
기판의 침적시간은 적어도 2시간 실시하면 충분하며, 2시간 정도 경과한 후에는 기판을 에탄올과 증류수 등으로 세척한 후 건조하게 되면 기판의 표면에 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란이 도입되게 된다.
이때, 기판은 당해분야에서 널리 사용되는 금속 기판이나 슬라이드 글라스 기판이 사용될 수 있으며, 상기 기판은 사용 전에 충분히 세정한 후 사용하면 된다. 세정은 당해분야에서 일반적으로 사용되는 방법이 적용될 수 있으며, 본 발명에서는 증류수 100중량부에 대하여 과산화수소 10 내지 40중량부와 암모니아수 10 내지 40중량부를 혼합한 세정액에 적어도 10분간 침적하여 세정한 슬라이드 글라스를 사용하였다.
기판의 표면에 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란이 도입되면, 그 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿(spot)이 형성된 어레이(array) 칩을 제조하는 단계를 거치게 된다.
스폿의 수는 임의 선택이 가능하며, 테이프는 반응성이 적은 테플론 테이프 등이 사용될 수 있다.
이후 상기 스폿의 단부에 트랜스 글루타미나아제의 기질 단백질을 도입하는 단계를 거치게 된다.
트랜스글루타미나아제의 기질 단백질로는 카제인(Casein), 알돌라아제 에이(Aldolase A), 3-글라이세알데히드포스페이트 디하이드로제나아제 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 포스포릴라아제 카이나아제(Phosphorylase kinase), 크리스달린스(Crystallins), 글루타치온 에스-트랜스퍼나아제(Glutathione S-transferase), 싸이토스켈레탈 단백질 (Cytoskeletal proteins), 액틴(Actin), 미오신(Myosin), 트로포닌(Troponin), 베타-튜불린(β-Tubullin), 타우(Tau), 로 (Rho A), 랙(Rac1), 히스톤(Histone H2B), 알파옥소글루타레이트 디하이드로제나아제 (α-Oxoglutarate dehydrogenase), 싸이토크 롬(Cytocromes), 에리트로싸이트(Erythrocyte band III), 씨디38(CD38), 아세틸콜린 에스터라아제 (Acetylcholine esterase), 콜라젠(Collagen), 피브로넥틴(Fibronectin), 피브리노젠(Fibrinogen), 비트로넥틴(Vitronectin), 오스테오폰틴(Osteopontin), 니도젠(Nidogen), 라미닌(Laminin), 엘티비피1(LTBP-10, 오스테오넥틴 (Osteonectin), 오스테오칼신(Osteocalcin), 섭스탄스 P(Substance P), 포스포리파아제 A2(Phopholipase A2), 미드카인(Midkine), 휘트 글리아딘 (Wheat gliadin), 레퍼런스 쓰레인(references therein), 훼이 단백질(whey proteins), 쏘이 단백질 (Soy protein), 피 레구민(Pea legumin), 캔디아 알비칸스 표면 단백질 ( Candida albicans surface proteins), 에이치아이브이 엔벨로프 당단백질 gp120과 gp41(HIV envelope glycoproteins gp120 and gp41), 에이치아이브이 아스파틸 프로테나아제(HIV aspartyl proteinase) 또는 C형간염바이러스 코어 단백질(Hepatitis C virus core protein) 등과 같이 주지된 트랜스글루타미나아제의 기질로 이용되는 단백질을 사용하면 된다. 필요에 따라서는 단백질 이외에 트랜스글루타미나아제의 기질로 이용될 수 있는 물질이 사용될 수 있으며, 반드시 단백질에 제한을 둘 필요는 없다.
기질단백질을 도입하는 방법은 다양한 방법이 적용될 수 있는데, 본 발명에서는 기질 단백질을 용해시켜 제조한 기질 단백질 함유용액을 스폿에 적하하여 반응시키는 방법으로 기질 단백질을 도입하였다. 여기서, 반응은 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란의 작용기와 기질단백질이 서로 반응하여 이루어지는데, 반응은 기 질 단백질 함유 용액을 적하한 후 적어도 2시간 반응시키면 된다. 두 시간 정도 경과하여 반응이 완료되면 PBST나 증류수 등으로 세척한 후 건조하게 되면 기질 단백질이 도입되게 된다.
기질 단백질을 용해시키기 위한 용액으로는 대표적으로 완충용액을 사용할 수 있는데, 필요에 따라서는 다양한 용액이 적용될 수 있다. 본 발명에서는 pH 4∼9의 범위내로 제조된 인산완충용액이나 Tris-HCl 완충용액을 사용하였으나, 이는 필요에 따라 다양하게 변형이 가능한 것이며, 기질 단백질의 농도 역시 제한할 필요는 없으나, 본 발명에서는 0.1∼1중량% 함유되도록 용해시킨 것을 사용하였다.
필요에 따라서는 기질 단백질이 보다 용이하게 도입될 수 있도록 하기 위하여 기질 단백질을 도입하기 전에 테이프를 부착하여 형성된 스폿의 알콕시실란과 매개물을 반응시키고, 상기 매개물상에 기질 단백질을 도입할 수도 있다.
여기서 매개물은 카르복실기로 개질된 라텍스 비드(carboxylate modified latex bead)를 사용하거나 또는 양 말단에 작용기를 가지면서 적어도 하나의 말단에는 기질단백질과 반응하는 알데히드기를 갖는 화합물을 사용할 수 있다.
먼저 매개물로 카르복실기로 개질된 라텍스 비드를 사용하는 것에 대하여 설명하면 다음과 같다. 카르복실기로 개질된 라텍스 비드는 일반적으로 판매되는 것을 구입하여 사용하면 되고, 그 크기는 당해분야 즉, 단백질 분석칩 분야에서 일반적으로 사용되는 것을 적용하면 된다. 참고로 반응성을 주기 위해 시판되고 있는 개질 라텍스 비드는 아민 개질 라텍스비드, 카르복실기 개질 라텍스 비드, 설페이트 개질 라텍스 비드 등이 있으며, 본 발명에서는 500∼1000㎚ 크기의 카르복실기 개질 라텍스비드(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하였다.
원활한 반응을 위하여 카르복실기로 개질된 라텍스 비드를 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드 존재하에서 반응시켜 활성화시킨 다음 이 반응 용액을 스폿상에 적하여 반응시킴으로서 알콕시실란의 아민기 말단에 라텍스비드가 도입되도록 하는 것이 좋다.
여기서 카르보디이미드는 촉매로서의 역할로 카르복시기를 활성화시켜 라텍스비드의 카르복실기 말단(-OH)에 N-하이드록시쑥신이미드가 용이하게 치환될 수 있도록 도와주는 역할을 한다. 상기 카르보디이미드로는 당해분야에서 일반적으로 사용되는 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide;EDC)나 N,N'-디싸이클로헥실 카르보이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide; DCC) 또는 디이소프로필카르보디이미드(diisopropylcarbodiimide)에서 선택된 것을 사용할 수 있다.
반응은 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드의 혼합용액에 카르복실기로 개질된 라텍스 비드를 넣은 다음, 이 용액을 스폿에 적하하여 약 20분간 반응시키면 이루어진다. 이때 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드의 혼합용액에 첨가되는 카르복실기로 개질된 라텍스비드의 첨가량은 반드시 한정할 필요는 없으나, 본 발명에서는 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드의 혼합용액 100중량부에 대하여 카르복실기로 개질된 라텍스비드 20 내지 50중량부 첨가하여 사용하였다. 아울러 카르보디이미드는 N-하이드록시쑥신이미드와 다양한 당량비율로 혼합하여 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 2∼4:1의 당량비율이 되도록 혼합한 것을 사용하였으나, 필요에 따라서는 다양하게 변화가 가능하다.
반응 후 라텍스비드가 도입된 기판을 PBST(Phosphate buffered saline with 0.1중량% Tween 20; 인산완충식염수에 Tween 20을 0.1중량% 함유되도록 첨가하여 제조된 용액임)나 증류수 등으로 세척한 후 건조하게 되면 알콕시실란의 아미노기 말단에 라텍스비드가 도입되게 된다.
상기와 같이 라텍스비드가 도입되면 상기 라텍스비드상에 전술한 바와 같이 기질 단백질 함유용액을 적하하여 기질단백질을 도입하게 된다. 이때 라텍스 상에 기질 단백질이 도입되는 것은 기질 단백질에 포함된 아민기와 라텍스비드의 카르복실기와의 반응에 의해 이루어진다. 따라서 상술한 알콕시실란의 아민기와 라텍스비드의 카르복실기와의 반응과 마찬가지로 보다 용이하게 라텍스 비드에 기질 단백질을 도입하기 위해서는 라텍스 비드상에 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드 혼합용액을 적하하여 라텍스비드의 카르복실기를 활성화시킨 다음 여기에 기질 단백질을 용해시킨 것을 적하하는 것이 바람직하다.
기질 단백질을 도입하기 위한 매개물로 양 말단에 작용기를 가지면서 적어도 하나의 말단에는 기질단백질과 반응하는 알데히드기를 갖는 화합물을 사용할 수도 있다.
이러한 종류의 알데히드 화합물로는 굴루타알데히드(glutaraldehyde), 벤젠-1-4-디카르복시알데히드(benzene-1,4-dicarboxyaldehyde) 에서 선택된 것을 사용할 수 있다.
이러한 알데히드 화합물을 도입하는 방법은 다양한 방법이 적용될 수 있는 데, 가장 간단한 방법으로 상기 알데히드 화합물을 희석시켜 제조한 용액을 스폿에 적하하여 반응시키는 방법이 사용될 수 있다. 반응은 용액을 적하한 후 적어도 30분간 반응시키면 되고, 약 30분 경과하여 반응이 완료되면 PBST나 증류수 등으로 세척한 후 건조하게 되면 알데히드 화합물을 용이하게 도입할 수 있다. 알데히드 화합물을 희석시키기 위한 용액으로는 대표적으로 완충용액을 사용할 수 있는데, 필요에 따라서는 다양한 용액이 적용될 수 있다. 아울러 용액내의 알데히드 화합물의 농도 역시 제한할 필요는 없으나, 본 발명에서는 0.1∼1중량% 함유되도록 용해시킨 것을 사용하였다.
상기와 같이 알데히드 화합물의 도입이 완료되면 상기 알데히드 화합물 상에 전술한 바와 같이 기질 단백질 함유용액을 적하하여 기질단백질을 도입하게 된다.
이때 본 발명에 따르면 측정치의 정확도를 높이기 위하여 기질 단백질을 도입한 후 기질 단백질이 결합되지 않은 스폿의 빈부분을 블로킹시키는 것이 바람직하다. 블로킹은 분석용 칩 제작 시 일반적으로 실시하는 것으로서, BSA(Bovine serum albumin), 표준혈청(normal serum) 또는 탈지유(skim milk) 등과 같은 통상의 블로킹 물질을 함유하는 용액을 적하하면 된다. 적하 후 한 시간 정도 경과하여 반응이 완료된 후 PBST나 증류수 등으로 세척한 다음 건조하게 되면 기질 단백질이 도입되지 않은 빈부분에 블로킹 물질이 도입되게 된다. 이러한 블로킹 물질은 후술하는 단계에서 비특이적 반응을 억제해서 측정치의 정확도를 높이는데 기여하게 된다. 일 예로 본 발명에서는 PBST(phosphate buffered saline with Tween 20)에 BSA가 1∼10중량% 포함되도록 용해시켜 얻은 블로킹 용액을 적하하여 1시간동안 방치하는 방법으로 블로킹을 실시하였으나, 필요에 따라서는 다양하게 변형이 가능하다.
상술한 바와 같이 실시하여 기질 단백질이 도입된 어레이 타입의 칩은 후술하는 단계를 통해 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정용 칩으로 유용하게 사용될 수 있으며, 사용자는 하기 단계를 통하여 간단하게 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정할 수 있게 된다.
특히 기질 단백질이 도입된 칩의 경우 다수의 시료 측정이 동시에 가능한 어레이 형태를 가짐에 따라 트랜스 글루타미나아제의 활성도 분석 시간이 획기적으로 단축되고, 분석 시 필요한 시료의 양이 극히 적게 소모되며, 민감도가 높기 때문에 세포내에서 일어나는 기전을 규명할 수 있는 분석 방법에도 활용이 가능할 뿐만 아니라, 혈액 등과 같은 체액을 이용한 각종 질환 검사에 활용이 가능하다는 장점이 있다.
활성도 측정을 위해서 먼저 활성도 측정용 트랜스글루타미나아제 함유 시료와 5-(바이오틴아미도)펜틸아민(5-(biotinamido)pentylamine), DTT 및 CaCl2를 함유하는 측정액을 상기 기질 단백질 상에 적하하여 기질 단백질과 5-(바이오틴아미도)펜틸아민의 아민교환반응(transamidation)시키는 단계를 거치게 된다.
여기서 활성도 측정용 트랜스글루타미나아제 함유 시료는 각종 세포에서 분리된 것이나 혈액시료를 포함하여 활성도를 측정하고자 하는 것의 총칭이다. 5- (바이오틴아미도)펜틸아민은 트랜스글루타미나아제에 의해 활성화되어 기질 단백질과 아민교환반응을 일으켜 기질 단백질 말단에 바이오틴이 위치하도록 하게 만든다. CaCl2와 DTT는 트랜스글루타미나아제의 활성을 돕기 위하여 첨가되는 것이며 측정 목적에 따라 Triton X-100 등과 같은 물질(cofactor)을 측정액에 추가할 수 있다. 완충용액은 전술한 바와 같이 단백질칩 당해에서 일반적으로 사용되는 것을 사용하면 된다.
이때 기질 단백질과 5-(바이오틴아미도)펜틸아민의 아민교환반응에 의해 기질 단백질 말단에 위치하게 되는 바이오틴은 주지된 바와 같이 분석용 표지물질인 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 아비딘(avidin)과 강하게 결합하는 물질로 이의 분석을 통해 트랜스 글루타미나아제의 활성도를 측정할 수 있게 된다. 즉, 트랜스글루타미나아제의 활성에 따라 아민교환반응의 정도가 결정되게 되며, 그에 따라 기질 단백질 말단에 위치하는 바이오틴의 량이 결정되게 된다. 결국 바이오틴에 표지물질로 널리 사용되고 있는 스트렙타비딘이나 아비딘을 결합시키고 이를 분석하게 되면 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정할 수 있게 되는 것이다.
트랜스글루타미나아제의 활성도 측정에 사용되는 시료의 함량과 성분은 필요에 따라 임의 변경이 가능하나, 본 발명에서는 활성도 측정용 트랜스글루타미나아제 함유 시료 1중량부당 5-(바이오틴아미도)펜틸아민 5∼7중량부, CaCl2 5∼7중량부, DTT 28∼45중량부, 완충용액 400∼600중량부 혼합하여 사용하였다. 그러나 이러한 함량은 분석조건이나 분석상황에 따라 다양하게 변형이 가능한 것임을 밝혀둔 다.
이러한 비율의 혼합용액을 기질 단백질 상에 적하하여 1시간 동안 방치하면 기질 단백질과 5-(바이오틴아미도)펜틸아민의 아민교환반응이 일어나게 되는데, 이후 PBST나 증류수 등으로 세척한 후 건조하게 되면 단부에 바이오틴이 위치하게 된다.
상기한 바와 같이 아민교환반응에 의해 단부에 위치하게 되면 바이오틴에 분석용 표지물질을 도입한 다음 이의 분석을 통해 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정하는 단계를 거치게 된다.
전술한 바와 같이 바이오틴에 널리 사용되고 있는 표지물질로는 스트렙타비딘이나 아비딘을 사용할 수 있다. 특히 상기 분석용 표지물질로 Cy3, Cy5, Alexa, BODIPY, Rhodamine 또는 Q-dot에서 선택된 형광표지물질이 결합된 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 아비딘(avidin)을 사용함으로서 형광분석을 통해 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정할 수 있도록 하는 것이 좋다. 이외에도 상기 분석용 표지물질로 알칼라인 포스파타아제(Alkaline phosphatase), 호스라디쉬 퍼옥시다아제(Horseradish peroxidase) 또는 루시퍼라제(luciperase)에서 선택된 효소(enzyme)가 표지된 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 아비딘(avidin)을 사용하고, 이를 크로모제닉 기질(Chromogenic substrate)과 반응시켜 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정할 수도 있다. 이외에도 필요에 따라서는 다양한 공지된 분석용 표지물질이 사용될 수 있다.
전술한 바와 같은 방법에 따라 트랜스 글루타미나아제의 활성을 측정하게 되 면 종래 일반적으로 사용되는 방사선 동위원소인 3H를 이용하는 방법과 웨스턴 블럿(Western blot) 방법에 비하여 분석 시간을 현저하게 단축시킬 수 있으며, 소량의 시료를 사용하면서도 높은 감도로 측정이 가능할 뿐만 아니라 다수의 시료를 동시에 분석할 수 있게 된다.
이하 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하기로 하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
에탄올 용액에 3-아미노프로필트리메톡시실란이 1.5중량% 함유되도록 용해시켜 제조한 용액에 슬라이드 글라스를 2시간 동안 침적한 다음 에탄올과 증류수로 세척하고, 110℃의 오븐(oven)에서 1시간 동안 건조하여 슬라이드 글라스 표면에 3-아미노프로필트리메톡시실란을 도입하였다. 이때 슬라이드 글라스는 70℃의 세정액(H2O2 : NH4OH : dH2O = 1 :1 : 5)에서 10분간 침적하여 세정한 것을 사용하였다.
펀치를 이용하여 직경 1.5mm의 스폿을 형성한 테플론 테이프를 상기 3-아미노프로필트리메톡시실란이 도입된 슬라이드 글라스 표면에 부착하여 200개(8×25)의 스폿을 갖는 어레이 칩을 제조하였다. 그런 다음 인산완충용액(pH7.4)에 기질단백질의 하나인 카제인을 1mg/ml의 농도로 만들어 적하하고, 2시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 반응시켰다. 이후 0.1중량% Tween 20 포함된 PBS로 10분 동안 세척 해준 다음 다시 5분간 증류수로 세척해주고, 공기로 건조하여 3-아미노프로필트리메톡시실란이 부착된 어레이 칩에 카제인을 도입하였다.
PBST(0.1중량% Tween 20)에 BSA를 3중량%가 되도록 첨가한 블록킹 용액을 상기 카제인이 도입된 스폿상에 적하하고 1시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 방치하였다. 이후 0.1중량% Tween 20 포함된 PBS로 10분 동안 세척해준 다음 다시 5분간 증류수로 세척해주고, 공기로 건조하여 어레이 타입의 트랜스글루타미나아제 활성도 측정용 칩을 제조하였다.
상기에서 제조한 트랜스글루타미나아제 활성도 측정용 칩의 카제인 상에 24,220㎍/ml의 Tris-HCl 완충용액에 294㎍/ml CaCl2, 328㎍/ml 5-(바이오틴아미도)펜틸아민(BAPA), 1,542㎍/ml DTT 및 트랜스글루타미나아제를 도 1에 나타낸 양만큼 첨가하여 제조한 샘플을 적하하였다. 1시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 방치한 후 0.1중량% Tween 20 포함된 PBS로 10분 동안 세척해준 다음 다시 5분간 증류수로 세척해주고 공기를 불어주면서 건조하였다. 그런 다음 형광물질 Alexa546이 표지된 스트렙타비딘을 적하하여 바이오틴과 결합하도록 한 후 형광 스캐너(Scan Array Lite)로 스캐닝하여 세기를 측정한 다음 그 결과를 도 1a에 나타내었으며, 상기 도 1a에 나타난 측정 결과의 형광세기를 그래프로 도식화하여 도 1b에 나타내었다.
도 1a와 도 1b에서 보는 바와 같이 트랜스글루타미나아제의 농도에 따라 트랜스글루타미나아제의 활성화 정도가 변화되는 것을 확인할 수 있다. 형광의 강도가 높을수록 효소의 활성도가 높다는 것을 나타내고 있으며 강도가 낮을수록 효소 의 활성도가 늦다는 것을 나타내고 있다.
<실시예 2>
에탄올 용액에 3-아미노프로필트리메톡시실란이 1.5중량% 함유되도록 용해시켜 제조한 용액에 슬라이드 글라스를 2시간 동안 침적한 다음 에탄올과 증류수로 세척하고, 110℃의 오븐(oven)에서 1시간 동안 건조하여 슬라이드 글라스 표면에 3-아미노프로필트리메톡시실란을 도입하였다. 이때 슬라이드 글라스는 70℃의 세정액(H2O2 : NH4OH : dH2O = 1 :1 : 5)에서 10분간 침적하여 세정한 것을 사용하였다.
펀치를 이용하여 직경 1.5mm의 스폿을 형성한 테플론 테이프를 상기 3-아미노프로필트리메톡시실란이 도입된 슬라이드 글라스 표면에 부착하여 200개(8×25)의 스폿을 갖는 어레이 칩을 제조하였다.
PBS로 세척한 500±100nm 크기의 카르복실기로 개질된 라텍스 비드를 50mM EDC와 200mM NHS 혼합용액에 넣은 다음 상기 어레이칩의 스폿에 적하하여 20분간 반응시켰다. 이후 0.1중량% Tween 20 포함된 PBS로 1시간 동안 세척해준 다음 다시 5분간 증류수로 세척해주고, 공기를 이용해 건조하여 3-아미노프로필트리메톡시실란의 아민기 말단에 라텍스 비드를 도입하였다.
라텍스 비드 위에 다시 200mM EDC와 50mM NHS 혼합용액을 적하한 후 10분간 방치하고, 증류수로 세척한 다음 공기를 불어주면서 건조하였다. 그런 다음 인산완충용액(pH7.4)에 카제인을 1mg/ml의 농도로 만들어 적하하고, 2시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 반응시켰다. 이후 0.1중량% Tween 20 포함된 PBS로 10분 동안 세척 해준 다음 다시 5분간 증류수로 세척해주고, 공기로 건조하여 라텍스비드에 기질단백질의 하나인 카제인을 도입하였다.
PBST(0.1중량% Tween 20)에 BSA를 3중량%가 되도록 첨가한 블록킹 용액을 상기 카제인이 도입된 스폿상에 적하하고 1시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 방치하였다. 이후 0.1중량% Tween 20 포함된 PBS로 10분 동안 세척해준 다음 다시 5분간 증류수로 세척해주고, 공기로 건조하여 어레이 타입의 트랜스글루타미나아제 활성도 측정용 칩을 제조하였다.
상기에서 제조한 트랜스글루타미나아제 활성도 측정용 칩의 카제인 상에 24,220㎍/ml의 Tris-HCl 완충용액에 50㎍/ml 트랜스글루타미나아제, 328㎍/ml 5-(바이오틴아미도)펜틸아민(BAPA), 1,542㎍/ml DTT 및 도 1에 나타낸 량의 CaCl2를 첨가하여 혼합한 샘플을 적하하였다. 1시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 방치한 후 0.1중량% Tween 20 포함된 PBS로 10분 동안 세척해준 다음 다시 5분간 증류수로 세척해주고 공기를 불어주면서 건조하였다. 그런 다음 형광물질 Alexa546이 표지된 스트렙타비딘을 적하하여 바이오틴과 결합하도록 한 후 형광 스캐너(Scan Array Lite)로 스캐닝하여 세기를 측정한 다음 그 결과를 도 2a에 나타내었으며, 상기 도 2a에 나타난 측정 결과의 형광세기를 그래프로 도식화하여 도 2b에 나타내었다.
도 2a와 도 2b에서 보는 바와 같이 칼슘이온의 농도에 따라 트랜스글루타미나아제의 활성화 정도가 변화되는 것을 확인할 수 있다. 형광의 강도가 높을수록 효소의 활성도가 높다는 것을 나타내고 있으며 강도가 낮을수록 효소의 활성도가 늦다는 것을 나타내고 있다.
<실시예 3>
에탄올 용액에 3-아미노프로필트리메톡시실란이 1.5중량% 함유되도록 용해시켜 제조한 용액에 슬라이드 글라스를 2시간 동안 침적한 다음 에탄올과 증류수로 세척하고, 110℃의 오븐(oven)에서 1시간 동안 건조하여 슬라이드 글라스 표면에 3-아미노프로필트리메톡시실란을 도입하였다. 이때 슬라이드 글라스는 70℃의 세정액(H2O2 : NH4OH : dH2O = 1 :1 : 5)에서 10분간 침적하여 세정한 것을 사용하였다.
3-아미노트리메톡시실란이 도입된 어레이 칩을 인산화완충용액에 글루타민알데히드를 1중량% 함유되도록 용해시켜 제조한 용액에 30분 동안 침적한 다음 증류수로 세척한 후 공기로 건조하여 3-아미노프로필트리메톡시실란이 도입된 어레이 칩에 알데히드를 도입하였다.
펀치를 이용하여 직경 1.5mm의 스폿을 형성한 테플론 테이프를 상기 알데히드가 도입된 슬라이드 글라스 표면에 부착하여 200개(8X25)의 스폿을 갖는 어레이 칩을 제조하였다. 그런 다음 인산완충용액(pH7.4)에 카제인을 1mg/ml의 농도로 만들어 적하하고, 2시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 반응시켰다. 이후 0.1중량% Tween 20 포함된 PBS로 10분 동안 세척해준 다음 다시 5분간 증류수로 세척해주고, 공기로 건조하여 3-아미노프로필트리메톡시실란이 도입된 어레이 칩에 기질단백질의 하나인 카제인을 도입하였다.
PBST(0.1중량% Tween 20)에 BSA를 3중량%가 되도록 첨가한 블록킹 용액을 상 기 카제인이 도입된 3-아미노프로필트리메톡시실란 어레이 칩에 적하하고 1시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 방치하였다. 이후 0.1중량% Tween 20 포함된 PBS로 10분 동안 세척해준 다음 다시 5분간 증류수로 세척해주고, 공기로 건조하여 어레이 타입의 트랜스글루타미나아제 활성도 측정용 칩을 제조하였다.
상기에서 제조한 트랜스글루타미나아제 활성도 측정용 칩의 카제인 상에 24,220㎍/ml의 Tris-HCl 완충용액에 294㎍/ml CaCl2, 328㎍/ml 5-(바이오틴아미도)펜틸아민(BAPA), 1,542㎍/ml DTT 및 도 1에 나타낸 량의 트랜스글루타미나아제를 첨가하여 혼합한 샘플을 적하하였다. 1시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 방치한 후 0.1중량% Tween 20 포함된 PBS로 10분 동안 세척해준 다음 다시 5분간 증류수로 세척해주고 공기를 불어주면서 건조하였다. 그런 다음 형광물질 Alexa546이 표지된 스트렙타비딘을 적하하여 바이오틴과 결합하도록 한 후 형광 스캐너(Scan Array Lite)로 스캐닝하여 세기를 측정한 다음 그 결과를 도 3a에 나타내었으며, 상기 도 3a에 나타난 측정 결과의 형광세기를 그래프로 도식화하여 도 3b에 나타내었다.
도 3a와 도 3b에서 보는 바와 같이 트랜스글루타미나아제의 농도에 따라 트랜스글루타미나아제의 활성화 정도가 변화되는 것을 확인할 수 있다. 형광의 강도가 높을수록 효소의 활성도가 높다는 것을 나타내고 있으며 강도가 낮을수록 효소의 활성도가 늦다는 것을 나타내고 있다.
<실시예 4>
도 4에 나타낸 바와 같이 일반적으로 시판되고 있는 10종류의 세포에서 추출 한 단백질 추출물 250㎍/ml, 328㎍/ml 5-(바이오틴아미도)펜틸아민 1,542㎍/ml DTT 및 294㎍/ml의 CaCl2를 24,220㎍/ml의 Tris-HCl 완충용액에 첨가하여 혼합한 TGase 활성도 측정용액을 상기 실시예2에서 제조한 트랜스글루타미나아제 활성도 측정용 칩상에 적하하였다. 1시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 방치한 후 0.1중량% Tween 20 포함된 PBS로 10분 동안 세척해준 다음 다시 5분간 증류수로 세척해주고 공기를 불어주면서 건조하였다. 그런 다음 형광물질 Alexa546이 표지된 스트렙타비딘을 적하하여 바이오틴과 결합하도록 한 후 형광 스캐너(Scan Array Lite)로 스캐닝하여 혈액세포 추출물 속의 TGase 활성도를 분석하고 그 결과를 도 4a나타내었으며, 상기 도 4a에 나타난 측정 결과의 형광세기를 그래프로 도식화하여 도 4b에 나타내었다.
도 4a와 도 4b에서 보는 바와 같이 본 발명에 따른 TGase 활성도 측정용 칩을 이용하여 여러 세포 추출물에서 TGase 활성도를 측정한 결과, 본 발명에서 개발된 TGase 활성도 측정용칩을 이용해 다수의 세포에서 TGase 활성도를 초고속으로 측정할 수 있음을 확인할 수 있다.
<실시예 5>
도 5에 나타낸 바와 같이 10종류의 환자 혈액 추출물 10㎍/ml, 328㎍/ml 5-(바이오틴아미도)펜틸아민 1,542㎍/ml DTT 및 294㎍/ml의 CaCl2를 24,220㎍/ml의 Tris-HCl 완충용액에 첨가하여 혼합한 TGase 활성도 측정용액을 상기 실시예2에서 제조한 트랜스글루타미나아제 활성도 측정용 칩상에 적하하였다. 1시간 동안 37℃ 의 인큐베이터에서 방치한 후 0.1중량% Tween 20 포함된 PBS로 10분 동안 세척해준 다음 다시 5분간 증류수로 세척해주고 공기를 불어주면서 건조하였다. 그런 다음 형광물질 Alexa546이 표지된 스트렙타비딘을 적하하여 바이오틴과 결합하도록 한 후 형광 스캐너(Scan Array Lite)로 스캐닝하여 혈액세포 추출물 속의 TGase 활성도를 분석하고 그 결과를 도 5a나타내었으며, 상기 도 5a에 나타난 측정 결과의 형광세기를 그래프로 도식화하여 도 5b에 나타내었다.
도 5a와 도 5b에서 보는 바와 같이 본 발명에 따른 TGase 활성도 측정용 칩을 이용하여 여러 환자 혈액 추출물에서 TGase 활성도를 측정한 결과, 본 발명에서 개발된 TGase 활성도 측정용칩을 이용해 다수의 환자 혈액 추출물에서 TGase 활성도를 초고속으로 측정할 수 있음을 확인할 수 있다.
상기에서 설명한 바와 같이 본 발명은 방사선 동위원소를 이용하거나 웨스턴 블럿(Western blot)을 통해 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정하는 기존의 방법과는 달리 어레이 형태의 분석칩을 이용하여 간단하게 트랜스 글루타미나아제의 활성도 측정이 가능하여 분석시간을 현저하게 단축할 수 있고, 적은 시료로도 고감도로 측정할 수 있어 세포내에서 일어나는 기전을 규명할 수 있는 분석 방법에도 활용이 가능하며, 세포내 활성도 측정을 통한 세포의 조절 및 기능 연구에 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 혈액 등과 같은 체액을 이용한 각종 질환 검사에도 활용이 가능하다는 효과가 있다.

Claims (24)

  1. 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란을 기판의 표면에 도입하는 단계와;
    상기 기판의 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿(spot)이 형성된 어레이(array) 칩을 제조하는 단계;
    상기 스폿의 단부에 트랜스 글루타미나아제의 기질 단백질을 도입하는 단계와;
    활성도 측정용 트랜스글루타미나아제(transglutaminase) 함유 시료와 5-(바이오틴아미도)펜틸아민(5-(biotinamido)pentylamine) DTT 및 CaCl2를 함유하는 측정액을 상기 기질 단백질 상에 적하하여 기질 단백질과 5-(바이오틴아미도)펜틸아민의 아민교환반응(transamidation)시키는 단계와;
    상기 아민교환반응에 의해 단부에 위치한 바이오틴에 분석용 표지물질을 도입한 다음 이의 분석을 통해 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정하는 단계;를 포함함을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 기판 표면에 도입되는 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란은 아미노알킬트리알콕시실란(aminoalkyltrialkoxysilane), 머캅토알킬트리알콕시실란(Mercaptoalkyltrialkoxysilane) 또는 에폭시알킬트리알콕시실 란(epoxyalkyltrialkoxysilane)에서 선택된 것임을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 아미노알킬트리알콕시실란은 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-amonopropyltrimethoxysilane), 3-아미노프로필트리에톡시실란 (3-amonopropyltriethoxysilane) 또는 3-2-2-아미노에틸아미노에틸아미노프로필트리메톡시실란 (3-[2-(2-aminoethylamino)ethylamino]propyl-trimethoxysilane)에서 선택된 것을 사용하고, 머캅토알킬트리알콕시실란은 3-머캅토프로필트리메톡시실란(3-Mercaptopropyltrimethoxysilane)을 사용하며, 에폭시알킬트리알콕시실란은 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane)을 사용하는 것을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 기질단백질 도입단계가: 테이프를 부착하여 형성된 스폿의 알콕시실란과 카르복실기로 개질된 라텍스 비드(carboxylate modified latex bead)을 반응시키고, 상기 카르복실기로 개질된 라텍스 비드상에 기질 단백질(substrate)을 도입하는 것임을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법.
  5. 삭제
  6. 청구항 4에 있어서,
    상기 알콕시실란과 카르복실기로 개질된 라텍스 비드의 반응은 카르복실기로 개질된 라텍스비드를 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드 존재하에서 반응시켜 활성화시킨 다음 이 반응 용액을 알콕시실란에 적하하여 이루어지는 것임을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 라텍스 비드상에 기질 단백질을 도입하는 것이: 라텍스비드 상에 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드 혼합용액을 적하하여 라텍스 비드의 카르복실기를 활성화시킨 다음 여기에 기질 단백질 함유용액을 적하하는 것임을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 기질단백질 도입단계가: 테이프를 부착하여 형성된 스폿의 알콕시실란과 양말단에 작용기를 가지면서 적어도 하나의 말단에는 기질단백질과 반응하는 알데히드기를 갖는 화합물을 반응시키고, 상기 화합물에 기질 단백질(substrate)을 도입하는 것임을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 화합물이 glutaraldehyde, benzene-1,4-dicarboxaldehyde에서 선택된 것임을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법.
  10. 청구항 1 내지 4, 6 내지 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기질단백질 도입단계가: 기질 단백질을 도입한 후 기질 단백질이 결합되지 않은 스폿의 빈 부분을 블로킹(blocking) 용액으로 처리하여 블로킹시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법.
  11. 청구항 1에 있어서,
    바이오틴에 분석용 표지물질을 도입하는 단계가; 형광물질 또는 효소가 결합된 스트렙타비딘 또는 아비딘을 이용하는 것을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 분석용 표지물질은 Cy3, Cy5, Alexa, BODIPY, Rhodamine 또는 Q-dot에서 선택된 형광표지물질이 결합된 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 아비딘(avidin)을 사용하고, 형광분석을 통해 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정하는 것임을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법.
  13. 청구항 11에 있어서,
    상기 분석용 표지물질은 알칼라인 포스파타아제(Alkaline phosphatase), 호스라디쉬 퍼옥시다아제(Horseradish peroxidase) 또는 루시퍼라제(luciperase)에서 선택된 효소(enzyme)가 표지된 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 아비딘(avidin)을 사용하고, 이를 크로모제닉 기질(Chromogenic substrate)과 반응시켜 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정하는 것임을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법.
  14. 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란을 기판의 표면에 도입하는 단계와;
    상기 기판의 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿(spot)이 형성된 어레이(array) 칩을 제조하는 단계;
    상기 스폿의 단부에 트랜스 글루타미나아제의 기질 단백질을 도입하는 단계;를 포함하는 하는 것을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제 활성도 측정용 칩의 제조방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 기판 표면에 도입되는 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란은 아미노알킬트리알콕시실란(aminoalkyltrialkoxysilane), 머캅토알킬트리알콕시실란(Mercaptoalkyltrialkoxysilane) 또는 에폭시알킬트리알콕시실란(epoxyalkyltrialkoxysilane)에서 선택된 것임을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정용 칩의 제조방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 아미노알킬트리알콕시실란은 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-amonopropyltrimethoxysilane) 또는 3-2-2-아미노에틸아미노에틸아미노프로필트리메톡시실란 (3-[2-(2-aminoethylamino)ethylamino]propyl-trimethoxysilane)에서 선택된 것을 사용하고, 머캅토알킬트리알콕시실란은 3-머캅토프로필트리메톡시실란(3-Mercaptopropyltrimethoxysilane)을 사용하며, 에폭시알킬트리알콕시실란은 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane)을 사용하는 것을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정용 칩의 제조방법.
  17. 청구항 14에 있어서,
    상기 기질단백질 도입단계가: 테이프를 부착하여 형성된 스폿의 알콕시실란과 카르복실기로 개질된 라텍스 비드(carboxylate modified latex bead)을 반응시키고, 상기 카르복실기로 개질된 라텍스 비드상에 기질 단백질(substrate)을 도입하는 것임을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정용 칩의 제조방법.
  18. 삭제
  19. 청구항 17에 있어서,
    상기 알콕시실란과 카르복실기로 개질된 라텍스 비드의 반응은 카르복실기로 개질된 라텍스비드를 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드 존재하에서 반응시켜 활성화 시킨 다음 이 반응 용액을 알콕시실란에 적하하여 이루어지는 것임을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정용 칩의 제조방법.
  20. 청구항 19에 있어서,
    상기 라텍스 비드상에 기질 단백질을 도입하는 것이: 라텍스비드 상에 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드 혼합용액을 적하하여 라텍스 비드의 카르복실기를 활성화시킨 다음 여기에 기질 단백질 함유용액을 적하하는 것임을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정용 칩의 제조방법.
  21. 청구항 14에 있어서,
    상기 기질단백질 도입단계가: 테이프를 부착하여 형성된 스폿의 알콕시실란과 양말단에 작용기를 가지면서 적어도 하나의 말단에는 기질단백질과 반응하는 알데히드기를 갖는 화합물을 반응시키고, 상기 화합물상에 기질 단백질(substrate)을 도입하는 것임을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정용 칩의 제조방법.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 화합물이 glutaraldehyde 또는 benzene-1,4-dicarboxaldehyde에서 선택된 것임을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정용 칩의 제조방법.
  23. 청구항 14 내지 17, 19 내지 22 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기질단백질 도입단계가: 기질 단백질을 도입한 후 기질 단백질이 결합되지 않은 스폿의 빈부분을 블로킹(blocking) 용액으로 처리하여 블로킹시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정용 칩의 제조방법.
  24. 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란이 도입된 기판의 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿(spot)을 형성하고, 상기 스폿의 단부에 트랜스 글루타미나아제의 기질 단백질을 도입하여서 된 것임을 특징으로 하는 트랜스글루타미나아제 활성도 측정용 칩.
KR1020070037582A 2007-03-19 2007-04-17 트랜스글루타미나아제의 활성도 측정용 칩 및트랜스글루타미나아제의 활성도 측정방법 KR100862318B1 (ko)

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