KR20030063167A - 질량 분광분석법에 의해 병원성 프리온 단백질을 검출하는방법 - Google Patents

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Abstract

본원에서는, 화학적으로 개질될 수도 있는 체액 샘플중에서, 프리온 단백질을 화학 시약과 반응시켜 공유 결합을 형성시키는 단계 및 이로 인해 화학적으로 개질된 프리온 단백질을 병원성 프리온이 존재하는 경우에 질량 스펙트럼에서 관찰되는 하나 이상의 추가의 피크를 사용하여 질량-분광분석법에 의해 분석하는 단계를 포함하여, 사람 또는 동물에서 기원하며 천연의 제1 비병리학적 배위 PrPc및 PrPSc로 지칭되는 제2 병리학적 배위로 추정되는 PrP 단백질을 함유하는 체액 샘플중에서 병원성 프리온 단백질을 검출하는 방법이 기술된다.

Description

질량 분광분석법에 의해 병원성 프리온 단백질을 검출하는 방법{Method for detecting pathogenic prion proteins by means of mass spectroscopy}
본 발명은 사람 또는 동물 기원의 체액 샘플중에서 병원성 프리온(prion) 단백질을 질량 분광분석법에 의해 검출하는 방법에 관한 것이다.
크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease : CJD)과 같은 프리온 질병은 유전되는 유전적 결함의 결과로서 발병되거나 아직 완전히 이해되지 않은 감염 경로에 의해 획득될 수 있다. 이외에도, 상기 질병은 프리온 단백질에 대한 유전자내 체세포 돌연변이에 인한 것으로 가정되는 자발적, 즉 산발적 형태로서 유발되기도 한다[참조 문헌: Prusiner, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 13363-13383 (1998)]. 원인 불명의 감염 경로는 예를 들어, 프리온-오염된 성장 호르몬이나 성 호르몬 또는 각막 및 수막 이식에 의한 치료로부터 기인한다. 부적절하게 멸균된 수술 재료의 사용도 대표적 감염 원인이다.
크기가 33 내지 35kD인 프리온 단백질(PrP로 약칭함)은 천연의 생리학적 이소형(PrPc) 및 병리학적 감염성 이소형(PrpSc)으로 발견되며, 감염성 이소형은 2차 및 3차 구조의 재폴딩(refolding)의 결과로서 비감염성 생리학적 형태로부터 유발된다. PrpSc는 프리온 질병의 감염 및 발병기전에 필요한 프리온의 유일한 물질 성분일 가능성이 크다[참조 문헌: Prusiner, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998)].
문헌[참조문헌: Prusiner et al., Cell 38, 127 (1984) 및 Biochemistry 21, 6942 (1982)]에는 프리온 단백질이 부분적으로 단백분해되기 쉽다는 것이 이미 공지되어 있다. 이후부터, PrPc가 사실상 완전히 단백분해되기 쉬운 반면에 PrpSc는 27 내지 30kD의 크기로만 분해될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 더이상 단백분해되기가 쉽지 않은 이러한 단백질 형태는 프로테아제-내성 코어, 즉 간단히 PrP27-30으로 지칭된다. 이는 NH2말단으로부터 약 67개의 아미노산이 탈착된 결과로서 형성되며 그 자체는 141개의 아미노산으로 이루어져 있다.
병리학적 프리온 이소형을 검출하는 몇가지 방법은 이미 공지되어 있다. 따라서, 문헌[참조문헌: Barry and Prusiner J. Infect. Dis. 154, 518-521 (1986)]에는 예를 들어, 모노클로날 항-프리온 단백질 항체(Mab) 13A5를 사용한 웨스턴 블롯(Western blot) 시험이 기재되어 있다. 상기 햄스터 PrP-특이적 Mab는 스크라피(scrapie)-감염된 햄스터로부터 분리된, 정제된 변성 Prp27-30으로 면역화된 마우스에서 분리되었다.
Mab 13A5와 마찬가지로 PrPc및 PrPSc둘다(단, PrPSc는 변성 형태로 존재한다)에 대해 지시된 다른 항체는 미국 특허 제4806627호에 기재되어 있다. 또한, 예를 들어 문헌[참조문헌: Zanusso et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 8812-8816 (1998)]에 기술되어 있는 바와 같이, 세균에서 발현된 재조합 프리온 단백질을 사용하여 면역화를 수행하였다. 마찬가지로, 예를 들어 문헌[참조문헌: Harmeyer et al., J. Gen. Virology, 79, 937-945(1998)]에 기술되어 있는 펩타이드 면역화 및 문헌[참조문헌: Krasemann et al., J. Biotechnology, 73, 119-129 (1999)]에 설명되어 있는 핵산 면역화에 의해 모노클로날 항체를 제조할 수 있었다.
미국 특허 제4806627호에는 웨스턴 블롯팅 이외의 이들 항체의 또 다른 용도, 즉 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay; 효소-연관 면역흡착 검정법)이 기술되어 있다. 상기 ELISA에서는, 미세역가 플레이트 상에 고정된 프리온을 Mab 3F4와 결합시킨 다음, 상기 항체를 커플링되는 효소를 통해 발색 반응을 촉매하는 2차 항체를 사용하여 검출한다.
상기 모든 검출 방법에서, 항체가 당연히 높은 친화도로 정상 프리온 단백질과도 결합할 수 있기 때문에 샘플중에 존재하는 정상 프리온 단백질을 제거하고 프로테아제-내성 병원성 프리온 단백질만이 검출되는 것을 보장하기 위해, 샘플을 효소 프로테이나제 K로 예비처리한다.
마지막으로, 국제 특허 공보 제WO 98/37411호에는 샘플중의 프리온 단백질의병원성 배위를 검출하는데 사용할 수 있는 검출 방법이 이미 기술되어 있다. 상기 방법에서는, 샘플을 2개의 분획으로 나누고, 제1 분획을 고체 지지체에 결합시킨 다음, 표지된 항체와 접촉시킨다. 상기 항체는 비변성된 병원성 형태의 프리온 단백질에 결합하는 경우보다 높은 친화도로 비병원성 형태의 프리온 단백질에 결합한다. 이어서 샘플의 제2 분획을, 병원성 프리온 단백질의 배위를 변경시키는 처리에 도입하여 접근성을 증가시켜 표지된 항체에 대한 친화도를 급격하게 증가시킨다. 이어서, 이러한 방식으로 처리된 제2 샘플을 제2 지지체와 접촉되도록 하고 표지된 항체와 반응시킨다. 이후, 제1 분획 및 제2 분획중에서 결합된 표지 항체의 양을 측정하고 서로 비교한다. 두 처리 결과 간의 차이는 프리온 단백질의 병원성 형태가 샘플중에 존재하는지의 여부를 나타낸다. 이러한 검출 방법은 배위-의존성 면역검정법으로 지칭되며 CDI로 약칭된다. CDI의 민감성은 샘플이 단백분해 효소, 예를 들어, 프로테이나제 K 또는 디스파제로 예비처리할 경우에 증가될 수 있다. 프로테아제의 처리는 샘플중의 PrPc및 비관련 단백질을 파괴하여 프로테아제-내성 PrP27-30을 샘플중에 남겨놓는다.
병원성 프리온 단백질의 존재에 대한 사람 혈중 혈장의 조사는 자동화에도 적합한 매우 민감하고 특수한 검출 시스템을 요한다. 프리온의 병리학적 효과에 대한 생리학적 근거가 아직 공지되어 있지 않다는 사실로 인해 검출이 보다 어렵다.
최근에 독일 특허원 제101 52 677.6호에는 사람 기원의 병원성 프리온을 특이적으로 검출하기 위한 항체가 최초로 기술되었다. 상기 검출 방법은, 배위-의존성 면역검정 방법에서 사람 프리온 단백질의 비병리학적 배위를 사람 프리온 단백질의 병리학적 배위와 구별할 수 있는 하이브리도마 세포주 DSM ACC 2522, DSM ACC 2523 및 DSM ACC 2524로부터의 모노클로날 항체를 사용한다.
지금까지 개발된, 병원성 단백질의 모든 검출 방법에도 불구하고, 여전히 유용하며 신속히 실행가능하고 신뢰성이 높으며 고도로 민감한 병원성 프리온의 추가의 검출방법이 상당히 요구되고 있다.
놀랍게도, 병리학적 배위 및 비병리학적 배위를 지닌 프리온 단백질을 포함하는 혼합물과 프리온 단백질내에 추가의 공유 결합을 생성시키기에 적합한 화학 시약의 반응은 배위-의존성 방식으로, 질량 분광분석법에 의해 구별될 수 있는 시그널을 생성하는 분자를 생성한다는 것이 밝혀졌다.
이러한 발견에 기초하며 사람 또는 동물에서 기원하며 천연의 제1 비병리학적 배위 PrPc및 제2 병리학적 배위 PrPSc를 함유하는 체액 샘플중에서 병원성 프리온 단백질을 검출하는 것을 목적으로 하는 본 방법은, 화학적으로 개질될 수도 있는 체액 샘플 중에서, 프리온 단백질과 화학 시약을 반응시켜 공유 결합을 형성하고, 이로 인해 화학적으로 개질된 프리온 단백질을 병원성 프리온이 존재할 경우에 질량 스펙트럼에서 관찰되는 하나 이상의 추가 피크를 사용하여 질량-분광분석법에의해 분석하여 수행할 수 있다.
민감성을 증가시키고 가능한 간섭을 제거하기 위해, 샘플을 프리온 단백질을 흡착하는 지지체 기판과 접촉시키고, 흡착된 프리온 단백질을 샘플의 잔류물로부터 분리시키고, 프리온 단백질을 흡착된 상태로 또는 방출된 후에 화학 시약과 반응시켜 공유 결합을 형성시키고, 이로 인해 화학적으로 개질된 프리온 단백질을 질량-분광분석법에 의해 분석할 수 있다.
이와 관련하여, 병원성 프리온이 존재할 경우에 질량 스펙트럼에서 비병원성 프리온 단백질과 비교하여 하나 이상의 추가 피크가 관찰된다.
아가로스, 크로마토그래피 수지, 미세역가 플레이트 또는 니트로셀룰로스 또는 폴리아미드 막을 흡착용 지지체 기판으로서 사용할 수 있다. 당해 지지체 기판은 프리온 결합용 시약으로 피복시킨다. 이러한 적합한 천연 시약은 리소자임 또는 이의 단편중 하나, 프리온-결합 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 이의 단편중 하나 또는 프리온-결합 리간드를 지니는 기타 화합물이다.
이러한 천연의 지지체를 병원성 프리온의 존재에 대해 조사하고자 하는 체액, 예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, 뇨 또는 유즙 또는 유동화 기관(예: 뇌 조직, 림프절, 편도 또는 근육)과 접촉되도록 한다. 이어서, 지지체에 고정된 프리온을 직접적으로 또는 프리온 단백질이 당해 지지체로부터 용출된 후에 본 발명에 따르는 검출 방법에서 사용할 수 있다.
본 발명에 따르는 검출 방법은, 천연의 비병리학적 프리온이 동일한 분자 조성을 가지지만 병리학적 배위의 프리온, 즉 PrPSc와 부분적 구조가 상이하며 이러한 이유로 표면에 화학 시약과의 반응을 위한 정성적으로 또는 정량적으로 상이한 작용 그룹을 나타낸다는 식견에 기초한다. 따라서, 병리학적 프리온과 비병리학적 프리온의 혼합물이 예를 들어, 산화제, 환원제, 알킬화제 또는 아실화제와 접촉되는 경우, 화학 시약은 정성적으로 및 정량적으로 상이한, 프리온 표면의 작용 그룹과 충돌하여, 한편으로 비병리학적 프리온과 다른 한편으로는 병리학적 프리온과 상이한 수로 결합을 형성한다. 이 결과, 특정 화학 시약으로 수득한, 비병리학적 프리온의 반응 생성물의 질량은 질량-분광분석법으로 구별될 수 있는 병리학적 프리온의 반응 생성물의 질량과 현저하게 상이하다.
조사하고자 하는 사람 또는 동물 기원의 체액 샘플이 비병리학적 프리온만을 함유하는 경우 질량 스펙트럼에서 하나의 통합된 피크 또는 밀접하게 연관된 피크의 그룹만을 검출할 수 있다. 그러나, 조사하고자 하는 샘플이 병원성 프리온을 함유하는 경우에는 발산형 질량 스펙트로그램이 수득된다. 비병리학적 프리온에 대한 특징적 피크 이외에, 사용된 화학 시약과 병리학적 프리온의 반응에 대한 특징적인 하나 이상의 추가 피크 또는 추가 피크의 그룹이 나타난다.
프리온의 표면에 나타나는 작용 그룹과 반응할 수 있는 모든 물질이 화학 시약으로서 사용하기에 적합하다. 이러한 물질은 산화제 또는 환원제일 수 있다. 적합한 산화제의 예로는 H2O2, Cu++/아스코르베이트 또는 Fe+++/아스코르베이트가있으며, 환원제로서는 예를 들어 NaBH4를 사용할 수 있다.
그러나, 비병원성 프리온 및 병원성 프리온으로 수득된 반응 생성물의 질량에 있어서의 차이는 알킬화제 및 아실화제와 반응시켜 수득할 수도 있다. 적합한 알킬화제의 예로는 포름알데히드가 있으며, 석신산 무수물과 같은 디칼복실산 무수물이 바람직한 아실화제이다.
그러나, 프리온은 또한 이의 표면에 시스테인 또는 메티오닌 잔기, 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기, 또는 아스파라긴 또는 글루타민 잔기 및 라이신 또는 아르기닌 잔기를 특징으로 하는 특정 측쇄를 나타낸다.
이러한 방식으로 개질되는 측쇄와 반응시키기에 적합하고 언급할 수 있는 시약의 예로는 말레산 무수물(SH-시스테인 잔기를 개질시킬 경우), 디아조아세트아미드(글루탐산, 아스파르트산 에스테르 및 시스테인 잔기와 반응시키는 경우) 및 1,2-사이클로헥산디온(아르기닌 잔기와 반응시키는 경우)이 있다.
본 발명에 따르는 검출 방법의 신뢰성 및 민감성은 극소량의 비병원성 및 병원성 프리온을 10개 및 100개 혈장 샘플의 그룹에게 첨가함으로써 입증되며, 모든 경우에 질량 스펙트로그램에서 병원성 프리온과 함께 비병원성 프리온을 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명에 따르는 검출 방법의 실행은 하기 실시예에 의해 설명한다.
산화 후 프리온 단백질의 검출
실시예 1:
상이한 배위 및 상이한 기원의 프리온 단백질을 혈장 단백질 용액에 첨가한다. 프리온 단백질을 나노몰 내지 펨토몰 농도로 희석한다. 프리온 단백질을 프리온-특이적 항체의 혼합물로 면역침강시킨다. 면역침강된 단백질을 용해시키고(산화 완충액(50mM Hepes 완충액, pH 7.4; 100mM KCl; 10mM MgCl2)중 단백질 10mg/㎖) 이어서 금속-촉매된 산화(MCO)에 의해 처리한다. 이를 위해, 아스코르브산 25mM 및 FeCl3100μM을 단백질 용액 750㎕에 첨가한다. 반응 혼합물을 37℃에서 12시간 동안 항온처리한 다음, EDTA 용액을 첨가하여 산화 반응을 종결시킨다. 이어서 프리온 단백질을 질량-분광분석법에 의해 특성화한다. 이로써 프리온 유형-특이적 크로마토그램을 수득한다.
실시예 2:
상이한 배위 및 상이한 기원의 프리온 단백질을 혈장 단백질 용액(산화 완충액(50mM Hepes 완충액, pH 7.4; 100mM KCl; 10mM MgCl2)중 단백질 10mg/㎖)에 첨가한다. 프리온 단백질을 나노몰 내지 펨토몰 농도로 희석한다. 이어서 단백질 용액을 금속-촉매된 산화(MCO)에 의해 처리한다. 이를 위해, 아스코르브산 25mM 및 FeCl3100μM을 단백질 용액 750㎕에 첨가한다. 반응 혼합물을 37℃에서 12시간 동안 항온처리한 다음, EDTA 용액을 첨가하여 산화 반응을 종결시킨다. 프리온 단백질을 프리온-특이적 항체의 혼합물로 면역침강시킨 다음, 질량-분광분석법에 의해 특성화한다. 이로써 프리온 유형-특이적 크로마토그램을 수득한다.
실시예 3:
상이한 배위 및 상이한 기원의 프리온 단백질을 혈장 단백질 용액에 첨가한다. 프리온 단백질을 나노몰 내지 펨토몰 농도로 희석한다. 프리온 단백질을 프리온-특이적 항체의 혼합물을 사용하여 지지체에 결합시킨다. 결합된 단백질을 지지체 상에서 산화 완충액(50mM Hepes 완충액, pH 7.4; 100mM KCl; 10mM MgCl2) 및 금속-촉매된 산화(MCO)로 처리한다. 이를 위해, 아스코르브산 25mM 및 FeCl3100μM을 상기 지지체에 첨가한다. 반응 혼합물을 37℃에서 12시간 동안 항온처리한 다음, EDTA 용액을 첨가하여 산화 반응을 종결시킨다. 이어서, 결합된 산화 프리온을 질량-분광분석법에 의해 특성화한다. 이로써 프리온 유형-특이적 크로마토그램이 수득된다.
실시예 4:
상이한 배위 및 상이한 기원의 프리온 단백질을 혈장 단백질 용액에 첨가한다. 프리온 단백질을 나노몰 내지 펨토몰 농도로 희석한다. 프리온 단백질을 프리온-특이적 항체의 혼합물로 면역침강시킨다. 면역침강된 단백질을 용해시키고(산화 완충액(50mM Hepes 완충액, pH 7.4; 100mM KCl; 10mM MgCl2)중 단백질 10mg/㎖) 이어서 금속-촉매된 산화(MCO)에 의해 처리한다. 이를 위해, 아스코르브산 25mM 및 FeCl3100μM을 단백질 용액 750㎕에 첨가한다. 반응 혼합물을 37℃에서 12시간 동안 항온처리한 다음, EDTA 용액을 첨가하여 산화 반응을 종결시킨다. 산화된 단백질을 2,4-디니트로페닐히드라진을 사용하여 유도체화시킨다. 이어서 프리온 단백질을 질량-분광분석법에 의해 특성화한다. 이로써 프리온 유형-특이적 크로마토그램이 수득된다.
본 발명에 의해, 사람 또는 동물에서 기원하며 천연의 제1 비병리학적 배위 PrPc및 제2 병리학적 배위 PrPSc를 함유하는 체액 샘플중에서 병원성 프리온 단백질을 검출하는 방법이 제공된다.

Claims (13)

  1. 화학적으로 개질될 수도 있는 체액 샘플 중에서, 프리온 단백질과 화학 시약을 반응시켜 공유 결합을 형성시키는 단계 및 이로 인해 화학적으로 개질된 프리온 단백질을 병원성 프리온이 존재할 경우에 질량 스펙트럼에서 관찰되는 하나 이상의 추가의 피크를 사용하여 질량-분광분석법에 의해 분석하는 단계를 포함하여, 사람 또는 동물에서 기원하며 천연의 제1 비병리학적 배위 PrPc및 제2 병리학적 배위 PrPSc로 추정되는 PrP 단백질을 함유하는 체액 샘플중에서 병원성 프리온 단백질을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 샘플을 프리온 단백질을 흡착하는 지지체 기판과 접촉시키고, 흡착된 프리온 단백질을 샘플의 잔류물로부터 분리시키고, 프리온 단백질을 흡착된 상태로 또는 방출 후에 화학 시약과 반응시켜 공유 결합을 형성시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 사용되는 지지체 물질이 아가로스, 크로마토그래피 수지, 미세역가 플레이트 또는 니트로셀룰로스 또는 폴리아미드 막인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 지지체 물질이 라이소자임 또는 이의 단편중 하나, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 또는 이의 단편중 하나,또는 프리온 단백질-결합 리간드를 지니는 또 다른 화합물로 피복되는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 사용되는 체액이 혈액, 혈청, 혈장, 뇨 또는 유즙, 또는 뇌 조직, 림프절, 편도 또는 근육과 같은 유동화 기관인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 지지체에 흡착된 프리온 단백질이 검출 방법에서 사용되거나, 프리온 단백질이 먼저 지지체로부터 용출되고 용출된 프리온을 사용하여 검출 방법을 수행하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 프리온 단백질이 산화제 또는 환원제의 그룹으로부터의 화학 시약과 반응하는 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 프리온 단백질이 알킬화제의 그룹으로부터의 화학 시약과 반응하는 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 프리온 단백질이 아실화제의 그룹으로부터의 화학 시약과 반응하는 방법.
  10. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 프리온 단백질이 시스테인 및메티오닌 측쇄에서 특이적으로 개질되는 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 프리온 단백질이 아스파르트산 및 글루탐산 측쇄에서 특이적으로 개질되는 방법.
  12. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 프리온 단백질이 아스파라긴 및 글루타민 측쇄에서 특이적으로 개질되는 방법.
  13. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 프리온 단백질이 라이신 및 아르기닌 측쇄에서 특이적으로 개질되는 방법.
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