JP4842478B2 - 生物学的試料における非通常伝達因子株によって引起こされる亜急性伝達性海綿状脳症の診断方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
この発明は、PrP-resを検出することによる、生物学的試料におけるUTA株によって引起こされるTSSEの診断方法、及び生物学的試料における種々のUTA株の区別診断に関連したその使用に関する。
【０００２】
亜急性伝達性海面状脳症(TSSE)は、その正確な性質が今日まで依然として論議されている、プリオンとも呼ばれる非通常伝達因子(unconventional transmissible agent, UTA)によって引起こされる。TSSEは、本質的に、ヒトでのクロイツフェルト-ヤコブ病(CJD)、ヒツジとヤギでのスクレイピー、及びウシでのウシ海綿状脳症(BSE)を含む。他の脳症は、ネコ科、ミンク又はシカもしくはヘラジカのようなある種の野生動物で認められている。
これらの疾患は常に致命的であり、現在のところ、有効な治療がない。
TSSEでは、宿主のタンパク質PrP(つまり、プリオンタンパク質)が、主に中枢神経系に異常形態(PrP-res)で蓄積される；PrP-resは、組織病変の外観に先行して、その感染及び蓄積を伴う。インビトロでは、それは神経の培養に毒性である。
【０００３】
2つのイソ型のPrPは同じアミノ酸配列を有する(図1参照)が、その二次構造において異なっている：PrP-resは、著しく高含量のβ-プリーツシートを有するが、正常なPrP(PrP-sen)は、多数のα-ヘリックスを有する。
2つの生化学的な特性により、一般に、これらの2つのイソ型を区別することができる。
- PrP-resは、そのN-末端の切断を引起こすプロテイナーゼ、特にプロテイナーゼK(PK)に部分的に耐性である。PKの作用後、PrP-resは、ジグリコシル化形態の見かけの分子量のために、しばしばPrP27-30と称される；PrP-resの切断部位は、通常の株に対し89〜90アミノ酸のあいだに位置することが一般に認められている(Prusinerら、Cell, 1984)。
- PrP-resは、Triton X100又はTriton 114のようなノニオン性洗剤に不溶性である。
【０００４】
プリオンタンパク質の正常形態(PrP-sen)は、原則として、プロテアーゼによって完全に分解され、ノニオン性洗剤の存在下で完全に可溶性である。
ハムスター、ヒト、ウシ及びヒツジのPrP-senのペプチド配列を図1に示す; それらは、特に種によって4回又は5回繰り返されたオクタペプチドモチーフ(P(H/Q)GGG(-/T)WGQ)を含む。このオクタペプチドモチーフ反復は、PrPの51-91(ヒトPrP配列の番号)アミノ酸に相当する (B. Oeschら、1991)。
感染因子の有無を検出するため、近年の方法の多くは、プロテアーゼに対するその部分的な耐性を利用することによる、感染因子に関連する異常なPrP (PrP-res)の選択的な検出に基づいている。
【０００５】
それは区別することができる:
- 正常なイソ型PrP(PrP-sen)を破壊するプロテアーゼでの抽出処理後の組織抽出物におけるPrP-resの免疫学的検出、電気泳動によるタンパク質抽出物の分離、ポリマー膜への転移及びPrPを認識する特異抗体での検出に基づくウエスタンブロッティング法(Schaller O.ら、1999)、
- プロテアーゼでの組織抽出処理も伴うELISA型試験。
プロテアーゼでの組織抽出処理を含むこれらの種々の試験のうち、以下が挙げられる:
- ニトロセルロース膜へのタンパク質の固定化、続くプロテアーゼ消化、変性及びモノクローナル抗体での免疫検出を含むPrP-resの検出試験を開発した、Serbanらにより記載された試験(Neurology, 1990, 40, 110)、
【０００６】
- PrP-res量を定量するための、PrP-resの精製用免疫濾過アッセイ(ELIFA 又は酵素結合免疫濾過アッセイ)を提案した、Oeschらにより記載された試験(Biochemistry, 1994, 33, 5926-5931)
- ELISA型アッセイを提案するGratwohlらにより記載された試験。プロテイナーゼKでの試料の処理及び遠心分離によるPrP-resの精製後に、後者はマイクロタイタープレートに吸着され、ウサギのポリクローナル抗体を用いて検出される。
- プロテイナーゼKを使用しないが、変性処理に付されるか否かによって、固体支持体に固定化されるPrP-resの免疫反応性を比較するSafarら(1998)によって記載された試験。
【０００７】
一般に、これらの種々の試験は感度を欠いている欠点があり、そのために擬陰性を生じる。
他の方法は、変性生成物での試料の処理(Oeschら、1994 及び1999; WO 00/22438, The Reagents of the University of California)、プロテイナーゼKでの限定的な処理(WO 00/29850, Wallac Oyら)又は潜伏抗原部位(この部位はPrPの109-112領域を認識するモノクローナル抗体3F4で検出できる(WO 00/29850 又はWO 00/22438))を利用できるメタロペプチドでの処理(WO 00/22438)を提案している。
WO 00/29850 (Wallac Oy ら)に記載された方法には、特に推奨される処理条件下でのPrP-senの不完全な除去に起因して、特異性を欠くという主たる欠点がある。一方、WO 00/22438に記載された方法(The Regents of the University of California)は、タンパク質上で唯一のモチーフに結合する検出抗体3F4を用いるために感度に欠けている(WO 00/22438)。
【０００８】
出願人は、最近、PrP-resの定量的な検出用試験を提供した。これは、極めて高感度の検出をもたらし、屠殺場でのPrP-resの医学的なモニターとアッセイに大きな進歩を果たす精製工程を含む。この方法は、特にPCT国際出願WO 99/41280 及びヨーロッパ委員会の全体理事会XXIV の予備報告に記載されている (consumer policy and consumer health protection; http://europa.eu.int/ comm/dg24/ health/)。
しかし、TSSEの診断のために特に信頼性ある試験が求められており、出願人は、その研究を続行した。
【０００９】
特に、
(i) 高感度であり、つまり非感染動物を正確に同定する能力を有し、
(ii) 特異的であり、つまり臨床的な症状を示す感染動物を正確に同定する能力を有し、
(iii) できる限り低い検出限界を有し、つまり 少量のPrP-resの検出(臨床的な症状が現れる前のPrP-resの検出)が可能であり、
(iv) 再現性がある
検出試験を行うために、分析される生物学的試料が、全て又は幾らかのオクタペプチドモチーフを排他的にPrP-resに保存し得る条件下で処理される必要のあることが、確立された。
特に、上記の4条件(i)-(iv)を効果的に満たすために、分析される試料を処理して試料からPrP-senを完全に除き、それと同時に所定の条件下でPrP-resの特異的な捕捉を可能にする正確な条件を明確にする必要のあることが見出された。
【００１０】
この発明の対象は、
(1) 生物学的試料を、どのようなUTA株であっても、PrP-senを完全に分解するが、同時にPrP-senのオクタペプチドモチーフ反復の全て又は幾らかを保存するように少なくとも1つのプロテイナーゼK(PK)で処理し;好ましくは、PK処理は10%のホモジネート(適当な緩衝液中でホモジネート形態の生物学的試料)について37℃で10分30〜200μg/mlの濃度、又は10%ホモジネートについて37℃で10分30〜200μg/mlの濃度に等しい期間かつ濃度で行われる、
(2) 該オクタペプチドモチーフについてのリガンド、特に該オクタペプチドモチーフ反復に対する抗体と該処理試料を接触させ、及び
(3) オクタペプチドモチーフ反復/リガンド複合体の潜在的な有無を検出する
ことからなるのを特徴とする、生物学的試料においてPrP-resを検出することによる、UTA株によって引起こされるTSSE又はプリオン疾患の診断方法(方法A)である。
【００１１】
この方法の有利な具体例によれば、プロテイナーゼKでの処理は、上記濃度で、80℃未満の温度で30秒〜2時間、好ましくは37℃で10〜30分、より好ましくは、10%ホモジネート(最終濃度)について30〜200μg/ml濃度で10分、又は10%ホモジネート(最終濃度)について10〜70μg/ml濃度、又は25%ホモジネート(最終濃度)について25〜175μg/ml濃度で30分である。
幾らかのパラメータが互いに密接に関連していることに留意すべきである:プロテイナーゼKの濃度は、直接、試料の処理期間(インキュベーション時間)による; 例えば37℃では、10%ホモジネートについて30〜200μg/ml濃度のPKでの10分のインキュベーションは、10%ホモジネートの10〜70μg/ml濃度のPKでの30分のインキュベーションに等しいと考えられる。例えば、25μg/mlのPKでの30分のインキュベーションは、75μg/ml濃度のPKでの10分のインキュベーションに等しい。
【００１２】
PKの濃度及びインキュベーション期間がどのようなものでも、処理される試料が未分解PrP-senを含むはずはないが、存在する可能性のあるPrP-resは、保存されたオクタペプチドモチーフを全て又は幾らか有している。
PKの活性濃度を確立する上で、他のパラメータがある程度(つまり、本質的ではなく)関与している可能性がある:これは、特にPKが溶解されている緩衝液を包含する; PKが試料のホモジネート緩衝液に溶解されている際には、使用されるホモジネート緩衝液に応じて、PKの最少濃度は上記濃度範囲内で変化し得る:
- グルコース緩衝液又はグアニジン(又は、その塩)では、PKの最少濃度は25μg/ml (30分のインキュベーション) 又は 75 μg/ml (10分のインキュベーション)であることが好ましい;
- PBS緩衝液では、PKの最少濃度は50μg/ml (30分のインキュベーション)又は150μg/ml (10分のインキュベーション)であることが好ましい。
【００１３】
有利には、PKは、ホモジネート緩衝液とは異なる緩衝液中で用いることができる; このような緩衝液は、少なくとも1つの界面活性剤及び/又は少なくとも1つのカオトロピック剤及び/又は少なくとも1つの塩からなることが有利である。
また、有利には、プロテイナーゼKでの試料の処理(又はインキュベーション)後に、得られた懸濁液を、国際出願99/41280に定義される条件下、つまり:
- 国際出願99/41280に記載された緩衝液B、特にC3-C6 アルコール及びアルコール混合物(その理論上の誘電定数は10〜25である)の該懸濁液への添加、
- 得られた懸濁液の遠心分離、及び
- 国際出願99/41280に記載された条件下で、少なくとも1つの界面活性剤及び/又は少なくとも1つのカオトロピック剤からなる緩衝液中でのペレットの可溶化で処理することが有利である。
【００１４】
このような試験は、種々のUTA株によって引起こされる同宿主におけるTSSEの区別診断、特にヒツジにおけるスクレイピーの通常の株に比較したBSE株の区別診断に特に適している利点がある。
例えば、UTA株に応じて移動上の違いを示す、PrP-resの電気泳動プロフィルを分析することによって、BSE株がヒトに感染することが英国では明らかにされている; 特徴的なプロフィル(タイプ4)は、BSE因子に感染したウシのヒト食物への流通に関連していると考えられるクロイツフェルト-ヤコブ病の新変種(vCJD)を発現した患者で認められた(Collingeら、Nature, 1996)。同様のプロフィルは、BSE因子に感染したマカーク(Lasmezasら、1996)及び恐らくはこの因子に汚染したネコ(Priolaら、Nature Med., 1996)で認められた。
【００１５】
しかし、それは、再現性ある結果が望ましいならば実施に手がかかる冗長な方法で、おそらく、種々のタイプのPrP-resの分類及びこの方法の使用に関して一部の議論を招く(Parchiら、Nature, 1997)。
また、BSE因子でのヒツジの汚染に関する疑いは大きい(Butler, Nature, 1998)。ヒツジには、密接で識別不能な臨床上かつ組織学上の特徴を有する風土病、スクレイピーがTSSEとは別にあるが、これらの動物は実際この因子に高感度である。BSE因子とスクレイピー因子との区別診断のために唯一基準となる方法は、マウスに接種し、病変プロフィルを研究することである。これは、約2年の待機を要し、数千万頭ものヒツジの群に対し9頭のヒツジでのみ英国で行われている。
【００１６】
最初の試みにより、試料における種々のUTA株の区別が試みられた; Kuczius T.ら(1999)は、グリコタイピング(glycotyping)技術を用いる種々のTSSE株(スクレイピー、BSE及びCJD)間に認められる変異によっては、各株を識別できないと考えた; 彼らはPrP-resに対する他の生化学的及び生物学的なマーカーを選択した。これは、より明確に互いの種々のプリオン株の識別が可能である。彼らが使用した分析パラメータは以下のとおりである: プロテイナーゼKに対する長期間の耐性、PrP-resの分子質量、トポロジー及びPrP-resの蓄積量。得られた結果は、BSE及びスクレイピーの種々の株のPrPs-resがプロテイナーゼKに対する長期間の耐性で著しい違いを示すことを明らかにしている。PKに対する耐性は、スクレイピーの株によって変化する:低耐性: チャンドラー(Chandler)株; 中間耐性: 22A 株; 相対的に安定: 87V株。同一条件下では、BSE株は中間的な耐性を示す。グリコタイピングはスクレイピー株87V とBSE株とを識別できないが、これらの2タイプの株は、PKでの長期間の処理後に明らかに識別できる。しかし、これらは、十分に信頼性があり、大規模にフィールドで使用できるプロトコルではない。
これに関連して、区別診断が可能で、比較的安価で、組織試料のような生物学的試料を用いて実施しやすいPrP-resの検出方法を、信頼性があり高感度なものとすることが重要である。
【００１７】
この結果、この発明の対象は、
(a) 上記のUTA株の診断方法(方法A)の工程(1)〜(3)により、生物学的試料の第一画分においてPrP-resを検出し、次いで:
(b) 各試料について、オクタペプチドモチーフ反復/リガンド複合体の有無を工程 (a)で検出する:
- オクタペプチドモチーフ反復の大多数が、条件下で、対象の少なくとも1つの株、特にBSE株に関連したPrP-resについて除かれ、他のUTA株に関連したPrPs-resの全てが全て又は幾らかのオクタペプチドモチーフ反復を保存するように、少なくとも1つのプロテイナーゼK(PK)で該試料の第二画分を処理し;好ましくは、この処理は、工程(1)又は(a)に規定されるのと同じ条件で、但し工程(1)又は(a)で使用されるよりも高いPK濃度で行われる、
- 処理された試料の第二画分を、オクタペプチドモチーフ反復を特異的に認識しうるリガンドと接触させ、かつ
- オクタペプチドモチーフ反復/リガンド複合体の潜在的な有無を検出することからなることを特徴とする、種々のUTA株に関連したPrPs-res を検出することによる、生物学的試料における、UTA株により引起こされるTSSEの区別診断方法(方法B)でもある。
【００１８】
また、この発明の対象は、各生物学的試料についてPrP-resの有無を検出し、
- 上記工程b)にしたがって、生物学的試料の別の画分を処理し、
- 処理された試料の第二画分を、該オクタペプチドモチーフ反復を特異的に認識し得るリガンドと接触させ、かつ
- オクタペプチドモチーフ反復/リガンド複合体の潜在的な有無を検出することからなることを特徴とする、PrP-resを含むと考えられる(検出試験はいずれかの方法で行った)生物学的試料におけるUTA株によって引起こされるTSSEの区別診断方法(方法Bの変形)である。
区別診断(方法B)に関連して、PKの濃度のほかに、株によっては他の条件がオクタペプチドモチーフの分解に影響を有し得る: 具体的には、PKが、少なくとも 1つの界面活性剤及び/又は少なくとも1つのカオトロピック剤及び/又は少なくとも1つの塩から有利になる緩衝液のようなホモジネート緩衝液と異なる緩衝液で用いられる場合には、分解されるオクタペプチドモチーフ数は、緩衝液の組成及び種々の剤の濃度に応じて変化し得る。
【００１９】
用語「対象の株」は、UTA株、特にBSE株を意味する。このため、例えばオクタペプチドモチーフ反復を除くことが意図される。
方法AとBの主たる特徴の1つは、オクタペプチドモチーフ反復の分解をコントロールするために、プロテアーゼ処理を行う条件を活用することである。 予定される用途に応じて、これらのモチーフが保存(方法A)又は破壊(方法B)されるように、方法は実施されるであろう:
- 方法Aに関して、このコントロールの目的は、PrP-resの極めて高感度な検出を促進するために、オクタペプチドモチーフ反復の全て又はいくつかを保存することであろう;
- 方法Bに関して、プロテアーゼによる分解のコントロールの目的は、全て又は幾らかのオクタペプチドモチーフ反復が全ての他のTSSE株に相当するPrPs-resについて保存される条件下で、対象の株に相当するPrP-resについてのオクタペプチドモチーフ反復の大多数及び任意には全てを、発現される種にかかわらず分解することであろう。この場合、この発明の利点は、他のUTA株に対する対象株の区別診断が可能なことである。
【００２０】
詳 細:
驚くべきことに、工程(1)又は工程(a)による条件下で、PKは、全てのUTA株又はプリオンに関連したPrPs-resのオクタペプチドモチーフ反復の全て又は幾らかの切断を生じない。一方、工程(b)の条件は、対象の株に関連したPrP-resのオクタペプチドモチーフ反復の切断をもたらすが、他のUTA株に関連した全 PrPs-resは、オクタペプチドモチーフ反復の全て又は幾らかを保存する。
また、驚くべきことに、このような試験は、特にリガンドが抗体である場合に、以下の利点を有する:
- 検出についての優れた感度。これらのオクタペプチドモチーフ反復に対する抗体は、PrP-res 27-30の他の領域に対する抗体よりもかなり大きな親和性を有し、使用される緩衝液にかなり耐性であるためである;具体的には、反復モチーフの認識は高い親和性の相互作用を促進し、単一のPrP分子に幾らかの抗体分子を結合させる可能性を生じる;
【００２１】
- UTA株又はプリオンの区別診断の可能性。これは、使用される条件に応じて、これらのモチーフを消化したり、又は消化できないためである; 特に、対象の株、例えばBSE因子に関連した疾患の全てについてモチーフを除くことができる。しかし、他の「プリオン」疾患については、それを保存できる。この結果として、この発明による方法は、2つの異なる条件(工程(1)又は(a)及び工程(b))を用いることにより、他の株に関し、BSE及び/又は対象の別の株についての区別診断のための簡単な試験を提供する。工程(1)又は(a) (全てのUTA株に関連したPrPs-resのオクタペプチドモチーフ反復を保存する)の条件により全ての株を検出でき、工程(b) (対象の株に関連したPrP-res でのみこれらのモチーフを除く)の条件により他の株のみを明らかにできる。
したがって、このような試験は、特にスクレイピーの通常株と普通には区別できないBSE株でのヒツジの汚染に関する調査での応用が見出されている。
【００２２】
この方法の有利な具体例によれば、PKは、好ましくは以下からなる緩衝液に溶解される:
a. - アニオン性界面活性剤、例えばSDS (ドデシル硫酸ナトリウム)、サルコシル (ラウロイルサルコシン)、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム又はタウロコール酸ナトリウム;
- 両性イオン性界面活性剤、例えばSB 3-10 (デシルスルホベタイン)、SB 3-12 (ドデシルスルホベタイン)、SB 3-14、SB 3-16 (ヘキサデシルスルホベタイン)、CHAPS 及びデオキシ-CHAPS;
- ノニオン性界面活性剤、例えばC12E8 (ドデシル-オクタエチレングリコール)、Triton X100、Triton X114、Tween 20、Tween 80、MEGA 9 (ノンアノイルメチルグルカミン)、オクチルグルコシド、LDAO (ドデシルジメチルアミンオキシド)又はNP40、又は
【００２３】
- 界面活性剤混合物、例えばイオン性界面活性剤とノニオン性界面活性剤の混合物、2つのイオン性界面活性剤の混合物又はイオン性界面活性剤と両性界面活性剤の混合物
からなる群から選択される、少なくとも1つの界面活性剤:及び/又は
b. ウレア及びグアニジン、又はその混合物からなる群から選択される少なくとも1つのカオトロピック剤、及び/又は
c. アルカリ金属であってもよく、又はそうでなくともよい金属塩から選択される少なくとも1つの塩。
【００２４】
この具体例の有利な例によれば、緩衝液は、少なくとも5%のアニオン性界面活性剤、好ましくは任意にSDSと組合わさったサルコシルからなる。
この方法の別の有利な具体例によれば、リガンドは、オクタペプチドモチーフ反復の領域に特異的に結合し得るアプタマー及び抗体からなる群から選択される。
また、この発明の対象は、上記のような少なくとも1つの界面活性剤及び/又は少なくとも1つのカオトロピック剤及び/又は少なくとも1つの塩及びプロテアーゼの組合せからなることを特徴とする、この発明による方法を実施するための診断キットである。
オクタペプチドモチーフ反復/抗体複合体(リガンドが抗体である場合)は、標準的な免疫学的方法で検出される。
【００２５】
上記の例のほかに、この発明は、この発明の対象である方法の実施例及び添付図面に言及する以下の記載から明らかになるであろう他の例も含む。
- 図1は、ヒト、ヒツジ、ウシ、マウス及びキヌゲネズミの種々のPrP配列を示す;
- 図2は、ウエスタンブロッティングによるPrP-resの検出を示す;
- 図3〜6は、オクタペプチドモチーフ反復の有無が2部位免疫測定アッセイ(two-site immunometric assay)によって検出される際の、ヒト(図3及び4)ならびに反芻動物(図5及び6)における、最初に工程(1)又は(a)、次いで工程(b)による種々の条件に相当する、
- 図7〜12は、BSE及びスクレイピーの区別検出における緩衝液の影響を例示する、
- 図13と14は、種々のタイプのCJDを検出するための、緩衝液の組成及びプロテイナーゼK(PK)濃度の影響を例示する、
- 図15は、プロテイナーゼKを用いる脳のホモジネートの直接的な消化で得られた結果を示す、
- 図16は、CJDタイプの機能としてのプロテイナーゼKに対するPrP-resの耐性上の相違を示す、
- 図17は、PKで消化され、SAF形態で精製された PrP-resのウエスタンブロッティングによる検出を示す。
【００２６】
しかし、これらの実施例が、この発明の対象を例示するものに過ぎず、いかなる方法でもそれを限定するものではないことは、明らかに理解されるべきである。
実施例 1: オクタペプチドモチーフ反復に特異的なモノクローナル抗体の生産と特徴づけ
- ペプチドの合成とラベル化
ヒトPrPの配列79〜92に相当するPrPオクタペプチドモチーフ反復を代表するペプチド、例えばモチーフ G-G-W-G-Q-P-H-G-G-G-W-G-Q-G-(NH2)は、自動合成器(Milligen 9050, Waters, Milford, MI)を用いて合成した。ペプチドは、他のペプチド又はタンパク質について以前に記載されているように(McLaughlinら、1987, Grassiら、1989)、ヘテロ二官能性試薬、スクシニミジル4-(N-マレ-イミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC, Calbiochem, France)を介して、アセチルコリンエステラーゼ(AchE)に共有結合させた。この方法は、SMCCとの反応で AchEに結合されたマレイミド官能性と、ペプチドに導入されたチオール基との反応を伴う。チオール基は、以前に記載されているように(McLaughlinら、1987)、N-スクシニミジルS-アセチルチオアセテート(SATA)との反応でペプチドに導入された。結合は、過剰なチオール化ペプチドとAchE-SMCCを反応させて得られた。
【００２７】
- モノクローナル抗体の免疫化と調製
スクレイピー関連フィブリル(SAF, PrP-res調製)の調製は、以前に記載されているように(Lasmezasら、1997)、感染したハムスター(263Kスクレイピー株)の脳から得た。この調製は、マウスを免疫化する前に、蟻酸での処理により不活化した。PrPノックアウトマウス(PrP遺伝子が除かれている) (PrP0/0マウス)を、これらのSAF調製物で免疫化し、ハイブリドーマ細胞を以前に記載されているようにして(Grassiら、1988, 1989)調製した。培養上清を上記のようにしてスクリーンした。57個のハイブリドーマを同定し、安定化できた;それらを、SAF-1〜SAF-90と命名した。これらの抗体は全てマイクロタイタープレート上で固定化されたSAFを認識することが明らかになったが、少数は、ペプチド-AchE接合体の認識能を示した。後者のうち、7個は明らかにオクタペプチドモチーフ反復(ペプチド79〜92)を認識する;それらは、抗体SAF-15、SAF-31、SAF-32、SAF-33、SAF-34、SAF-35 及び SAF-37である。得られた抗体のリスト、またその主な特徴を以下の表に示す。クローニング及び腹水液形態で展開(expansion)した後、モノクローナル抗体をタンパク質A-セファロースカラムでのアフィニティクロマトグラフィーで精製し、使用するまで−20℃で保存した。抗体のイソタイプを、オークタロニー法にしたがって、ラジカル免疫拡散法で測定した。
【００２８】
- ハイブリドーマ培養上清のスクリーニング
ハイブリドーマ培養上清中のPrP-特異抗体の存在は、ペプチド-AchE 接合体又はハムスターSAF のいずれかに対する結合能を試験することによって、2つの方法で立証された。最初のケースでは、前に記載されたように(Creminonら、1993, Frobertら、1991)固定化した抗-マウスIgG抗体を含むプレートで、スクリーニングを行った。要約すれば、100μlの培養上清と100μlのペプチド-AchE接合体を、固定化したヤギ抗-マウスIgG抗体を含むプレートで+4℃で一晩反応させた。プレートを洗浄後、200μlのエルマン試薬(Ellmanら、1961)をウエルに加え、固相に付着したAchEの有無を検出した。二番目のケースでは、固定化SAF調製物を含むプレートを、0.05 Mリン酸緩衝液pH 7.4中に50μlの2μg/ml溶液を室温で一晩反応させることにより、調製した。洗浄後、プレートを+4℃で一晩EIA緩衝液(150 mM NaCl、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)及び0.01%アジ化ナトリウムを含む100 mM リン酸緩衝液pH 7.4)で飽和し、使用するまでこの温度で維持した。固定化SAFに対するモノクローナル抗体の結合は、前に記載されているように(Negroniら、1998)、AchEでラベルしたヤギ抗-マウスIgGを用いて明らかにした。
【００２９】
【表１】
【００３０】
79-92: ペプチド79-92を認識する抗体
142-160: ペプチド142-160を認識する抗体
エピトープX: 固定化SAFを認識しない抗体
エピトープA: ペプチド126-164を認識するが、ペプチド142-160に結合しない抗体
* 免疫測定アッセイに関連して、この研究中に試験した少なくとも1つの種(ヒト、ウシ、ヒツジ、マウス又はハムスター)についてPrP-senの認識能力を示したモノクローナル抗体
【００３１】
実施例 2: ウエスタンブロッティングによるPrP-resの検出
I: 試料の処理
(i) 種々の生物学的試料由来の組織ホモジネートの調製
- ウシのBSE、ヒツジのスクレイピー、ヒトのvCJD (タイプ4)、ヒトの散発型 CJD (タイプ1)及び対応する陰性のコントロール
ウシの脳350 mgを採取する: それをすりつぶし、5% グルコース溶液中20% (w/v)でホモジネートする。
ホモジネートを行うために、脳の試料(350 mg)と1.4 mlのグルコース溶液を、セラミックビーズからなるチューブに入れ、激しく攪拌する(Hybaid Ribolyser)。
陽性の試料を、以下のように、相当する種の健康な脳に由来するホモジネートに希釈した:
. ヒツジについて: 〜1/100
. ウシについて: 〜1/50
. ヒトについて: タイプ1又は 4: 〜1/40; タイプ3:〜1/80; タイプ2:〜1/20
【００３２】
(ii) 工程(I)についての条件
(i)で得た20%ホモジネートの第一画分(500μl)を、10% サルコシル(SK10)、10% Triton X100 (T10)、2Mユレア(U2)及び緩衝液60μg/mlでのプロテイナーゼK(PK)(PK1)からなる緩衝液500μlと10分37℃で (10%ホモジネートについて30μg/mlの最終濃度に相当)インキュベートする。
図3-6では、PK3は緩衝液180μg/mlのPK濃度に相当し、PK6は緩衝液360μg/mlのPKの濃度に相当する。
(iii) 1-ブタノールからなる緩衝液500μl(国際出願WO 99/41280に記載された緩衝液Bに相当)を加える; 混合物を5分15 000 rpm(約17 000 g)で遠心分離する。
【００３３】
(iv) PrP-resを含む遠心分離ペレットを、国際出願WO 99/41280に記載されたような80-100μlの緩衝液C、好ましくは4%のSDSを含むラエムリ緩衝液に溶解し、100℃で5分加熱し、ウエスタンブロッティングを行うか、又は連続的に6Mユレアと0.5%サルコシルからなる緩衝液C1に溶解し、続いて100℃で5分加熱し、次いで2Mグアニジンからなる緩衝液C2に溶解し、100℃で5分加熱して、免疫測定アッセイを行う。
(v) 工程(b)の条件
(i)で得た20%でのホモジネートの第二画分(500μl)を、10分37℃で、5%サルコシル(SK5)、5% SDS (SDS5)、1Mユレア(U1)及び180μg/mlでのプロテイナーゼK(PK)(PK6)からなる緩衝液500μlとインキュベートし、次いで上記工程(iii)と(iv)を行う。
【００３４】
II. ウエスタンブロッティング
得られた試料を用いてSDS-PAGE電気泳動を行い、上記国際出願WO 99/41280の実施例1及び実施例3に記載の条件下でニトロセルロース膜に移す。
PrP-resの免疫検出は、上記実施例1に記載されたモノクローナル抗体SAF70とSAF37、ならびにパーオキシダーゼ-共役抗-ウサギヤギIg (1/2500)を用いて行う。免疫反応性は、化学ルミネセンス(ECL, Amersham)により現し、定量し、図2に示すように放射能写真フィルムで視覚化する。
この図で:
* レーン1-5は、工程(1)又は(a)による条件に相当する(SK10+T10+U2+PK1)。
レーン1:陰性コントロール
レーン2:ウシのBSE
レーン3:ヒツジのスクレイピー
レーン4:ヒトのvCJD (タイプ4)
レーン5:ヒトのCJD (タイプ1)及び
* レーン6-10は、工程(b)による条件に相当する(SK10+SDS5+U1+PK6)。
レーン1:陰性のコントロール
レーン2:ウシのBSE
レーン3:ヒツジのスクレピー
レーン4:ヒトのvCJD (タイプ4)
レーン5:ヒトのCJD (タイプ 1)
【００３５】
得られた結果から、以下が示される:
- 工程(1)又は(a) (レーン1〜5)で、PrP-senは組織的に破壊されるが、PrP-resで得られるシグナルは、PrPの94-230領域に対する抗体を同じ試料に用いて得られるシグナルまで、オクタペプチドモチーフ反復に対する抗体を用いて組織的に大きい;
- 工程(b) (レーン6〜10)では、PrP-senは組織的に破壊される。一方、レーン8〜10 (オクタペプチドモチーフ反復に対する抗体の存在下) で得られるシグナルは、PrPの94-230領域に対する抗体を同じ試料に用いて得られたシグナルと似ているか、それより大きいが、少量で、レーン7及び9では検出不可能でさえある(BSEのPrP-res)。
【００３６】
実施例 3: オクタペプチドモチーフ反復を認識するモノクローナル抗体を捕捉抗体として用いる2-部位免疫測定アッセイでのPrP-resの検出
2-部位免疫測定アッセイを行うために、実施例2の(iv)で得たペレットを、例えばサルコシル(0.25-1%)及びユレア(0.25-8 M) 又は(0.25-1%)及びユレア(0.25-1 M)からなる緩衝液に溶解する;得られた試料は、好ましくは、加熱後、最終的なアルブミン濃度を0.1〜1%(w/v)とするアルブミン含有緩衝液、又は1%デオキシコラート含有緩衝液で希釈する(〜1/4 又は〜1/2)。
2-部位免疫測定アッセイは、他のタンパク質について既に記載された条件下(Grassiら、1989)で固定化した抗体を含むマイクロタイタープレートで行う。その原理は以下のとおりである:分析されたPrPは、固体支持体に付着した抗体(捕捉抗体)によって、また分子の別の部分を認識し、酵素でラベルされる第二抗体(この場合、アセチルコリンエステラーゼ、トレイサー抗体)により、5 エルマン単位/mlで認識される。
【００３７】
この発明に関連して、捕捉抗体はオクタペプチドモチーフ反復に対するものであり、トレーサー抗体は、PrPの94-230領域、例えばPrPの142-160領域に含まれる配列を認識する。固相を洗浄後、プレートに付着した酵素活性は、分析された試料中にオクタペプチドモチーフ反復を最初に有するPrP-resの量に比例する。
実際、アッセイは、以下のようにして行われる:
分析される100μlのPrP溶液を、オクタペプチドモチーフ反復を認識する抗体を含むマイクロタイタープレートのウエルに置く。室温で3時間反応後、トレーサー抗体(5エルマン単位/ml)溶液100μlを加える前に、プレートを洗浄する。+4℃で一晩反応後、プレートを再洗浄し、固相に付着したアセチルコリンエステラーゼの活性を測定し得る基質溶液200μl(エルマン試薬、Grassiら、1989)を加える。酵素反応の30分後、各ウエルの吸光度(414nmでN.D.)を測定する。
【００３８】
実施例 4: 種々の条件の比較研究: 工程(1) 又は(a) 及び工程(b)
試料を、実施例2に記載されたように調製する。
ホモジネートを、実施例2にあるように調製する。
- ヒトで
図3 及び4は、種々の緩衝液で得られた結果を示す:
* この発明による方法の工程(1)又は(a)による条件:
I: 20%+SK10+T10+U2+PK1でのホモジネート
III': 10%+SK5+T5+U1+PK0.5 でのホモジネート(図4)
* この発明による方法の工程(b)による条件:
II: 20%+SK10+T10+U2+PK3でのホモジネート
III: 20%+SK10+T10+U2+PK6でのホモジネート
III": 10%+SK5+T5+U1+PK6でのホモジネート(図4)
IV: 20%+SK20+PK3でのホモジネート
V: 20%+SK20+U1+PK3でのホモジネート
VI: 20%+SK20+U2+PK3でのホモジネート
VII: 10%+SK20+PK3でのホモジネート
VIII: 10%+SK20+U1+PK3でのホモジネート
IX: 10%+SK20+U2+PK3でのホモジネート
X: 10%+SK5+SDS5+U1+PK6でのホモジネート
X': 10%+SK2.5+SDS2.5+U2+PK6 でのホモジネート (図4)
【００３９】
(iv) PrP-resを含む遠心分離ペレットを、国際出願WO 99/41280に記載されたような80-100μlの緩衝液C、好ましくは4%のSDSを含むラエムリ緩衝液に溶解し、100℃で5分加熱し、ウエスタンブロッティングを行うか、又は連続的に6Mユレアと0.5%サルコシルからなる緩衝液C1に溶解し、続いて100℃で5分加熱し、次いで2Mグアニジンからなる緩衝液C2に溶解し、100℃で5分加熱して、免疫測定アッセイを行う。
(v) 工程(b)の条件
(i)で得た20%でのホモジネートの第二画分(500μl)を、10分37℃で、5%サルコシル(SK5)、5% SDS (SDS5)、1Mユレア(U1)及び360 μ g/mlでのプロテイナーゼK(PK)(PK6)からなる緩衝液500μlとインキュベートし、次いで上記工程(iii)と(iv)を行う。
【００４０】
- 反芻動物で、
図5 及び6は、種々の緩衝液を用いて得られた結果を示す:
* この発明による方法の工程(1)による条件:
I: 20%+SK10+T10+U2+PK1でのホモジネート
III': 10%+SK5+T5+U1+PK0.5 でのホモジネート(図 6)
* この発明による方法の工程(4)による条件:
II: 20%+SK10+T10+U2+PK3でのホモジネート
III: 20%+SK10+T10+U2+PK6 でのホモジネート
III": 10%+SK5+T5+U1+PK3 でのホモジネート(図6)
IV: 20%+SK20+PK3でのホモジネート
V: 20%+SK20+U1+PK3でのホモジネート
VI: 20%+SK20+U2+PK3でのホモジネート
【００４１】
VII: 10%+SK20+PK3 でのホモジネート
VIII: 10%+SK20+U1+PK3でのホモジネート
IX: 10%+SK20+U2+PK3でのホモジネート
X: 10%+SK5+SDS5+U1+PK6でのホモジネート
X': 10%+SK5+SDS5+U1+PK3でのホモジネート (図5)
XI: 20%+SK20+PK6でのホモジネート
XII: 20%+SK20+U1+PK6でのホモジネート
XIII: 20%+SK20+U2+PK6でのホモジネート
XIV: 10%+SK20+PK6 でのホモジネート
XV: 10%+SK20+U1+PK6でのホモジネート
XVI: 10%+SK20+U2+PK6でのホモジネート
【００４２】
オクタペプチドモチーフ反復が保存されている PrP-resの量を、2-部位immunometric アッセイ(吸光度つまり414nmでのO.D.、実施例3参照)を用いて測定する;陰性のコントロール(□)、ウシのUTA
及びヒツジのUTA (■)。
- 図7 (ウエスタンブロッティング)と8 (2-部位免疫測定アッセイ):
. 比較は、実施例2に記載された条件下で得た健康なヒツジ、スクレピーに罹患しているヒツジ及びBSEに罹患しているウシ由来の脳の20%でのホモジネートを用いて行う。
. 試料の処理:
A: 10% サルコシル A + 10% Triton + 2M ユレア + 60 μg/ml プロテイナーゼK、10分
B: 10%サルコシル + 2M ユレア + 240 μg/ml プロテイナーゼK、10分
C: 10%サルコシル + 240μg/ml プロテイナーゼK、10分
. 検出
ウエスタンブロテッィング(図7)によれば:抗体Saf37及びSaf84 (実施例1参照);免疫測定分析(図8)によれば:Saf37での捕捉及びPrPの94-230領域に対する抗体での顕在化
【００４３】
- 図9 (ウエスタンブロテッィング)及び10 (2-部位免疫測定アッセイ):
. 比較は、実施例2に記載された条件下で得た健康なヒツジ、スクレピーに罹患しているヒツジ及びBSEに罹患しているウシ由来の脳の20%でのホモジネートを用いて行う。
. 試料の処理:
A: 10% サルコシル + 10% Triton + 2M ユレア + 60 μg/ml プロテイナーゼK、 10分
B: 10% SDS + 5% Triton + 2M ユレア + 180 μg/ml プロテイナーゼK、10分
. 検出
上記と同じ条件下
【００４４】
PK用量を単に増すことによって、ヒトではなくヒツジでのBSEとスクレイピー(タイプ1とタイプ4)とのオクタペプチドモチーフ反復領域について示差感度を示すことができる。
他方、界面活性剤及びカオトロピック剤の組成を変えることによっても、オクタペプチドモチーフ反復領域の示差感度をあらゆる場合に明らかにすることができる。
【００４５】
実施例 5: BSEとスクレイピーの区別検出における緩衝液の組成の影響
- 図11 (ウエスタンブロッティング)及び12 (2-部位免疫測定アッセイ):
. 比較は、実施例2に記載された条件下で得た健康なマウス、又はC506M3株(スクレイピー)もしくは6PBI株(BSE)に実験的に感染したマウス由来の脳の10%ホモジネートを実施例2に記載の条件下で得た。
. 試料の処理:
A: 10% サルコシル + 10% Triton + 2M ユレア + 30 μg/ml プロテイナーゼK、10分
B: 10% サルコシル + 10% Triton + 2M ユレア + 60 μg/ml プロテイナーゼK、 10分
C: 10% サルコシル+ 10% Triton + 2M ユレア + 180 μg/ml プロテイナーゼK、10分
D: 10% サルコシル+ 10% Triton + 2M ユレア + 360 μg/ml プロテイナーゼK、 10 分
E: 10% サルコシル + 2M ユレア+ 180 μg/ml プロテイナーゼK、10分
【００４６】
- 反芻動物で、
図5 及び6は、種々の緩衝液を用いて得られた結果を示す:
* この発明による方法の工程(1)による条件:
I: 20%+SK10+T10+U2+PK1でのホモジネート
III': 10%+SK5+T5+U1+PK0.5 でのホモジネート(図 6)
* この発明による方法の工程 (b)による条件:
II: 20%+SK10+T10+U2+PK3でのホモジネート
III: 20%+SK10+T10+U2+PK6 でのホモジネート
III": 10%+SK5+T5+U1+PK3 でのホモジネート(図6)
IV: 20%+SK20+PK3でのホモジネート
V: 20%+SK20+U1+PK3でのホモジネート
VI: 20%+SK20+U2+PK3でのホモジネート
【００４７】
実施例 6: 種々のCJDの検出に対する緩衝液及びプロテイナーゼK濃度の影響
- 図13 (ウエスタンブロッティング) 及び14 (2-部位免疫測定アッセイ):
. 比較は、実施例2に記載の条件下で得た健康なヒト及びCJD(タイプ1、2、3及び4)に罹患しているヒト由来の脳の10%のホモジネートを用いて行う。
. 試料の処理:
A: 10% サルコシル + 10% Triton + 2M ユレア + 30 μg/ml プロテイナーゼK、10分
B: 10% サルコシル + 10% Triton + 2M ユレア + 180 μg/ml プロテイナーゼK、10分
C: 10% サルコシル + 30 μg/ml プロテイナーゼK、10分
D: 10% サルコシル+ 60 μg/ml プロテイナーゼK、10分
E: 10% サルコシル + 180 μg/ml プロテイナーゼK、10分
F: 10% サルコシル + 360 μg/ml プロテイナーゼK、10分
【００４８】
. 検出
ウエスタンブロッティング(図13) によれば: 抗体Saf37 及びSaf70 (実施例 1参照);
免疫測定分析(図14)によれば: Saf37での捕捉及びPrPの94-230領域に対する抗体での顕在化
- 図15 (ウエスタンブロッティング) 及び16 (免疫測定分析)
. 比較は、実施例2に記載の条件下で得た健康なヒト及びCJD(タイプ1、2、3及び4)に罹患しているヒト由来の脳の10%のホモジネートを用いて行う。
. 試料の処理:
図15: プロテイナーゼK(150 μg/ml)、10分での消化
図16: 10% サルコシル + 2M ユレア + プロテイナーゼK(30〜360 μg/ml)、10分
【００４９】
. 検出
ウエスタンブロッティング(図15)によれば:抗体Saf37とPrPの94-230領域に対する抗体(実施例1参照);
免疫測定分析によれば(図16): Saf37 での捕捉及びPrPの94-230領域に対する抗体での顕在化
得られた結果は、PK用量の増加が、種々のタイプのCJDにおいてオクタペプチドモチーフ反復領域の示差感度を示し得ることを明らかにした。これらの条件下、タイプ1〜4には有意な相違は存在しない;同用量のPKで界面活性剤及びカオトロピック剤の組成を変えると(E、図13 及び14)、タイプ4ではオクタペプチドを破壊できると同時に、タイプ1ではペプチドを保存できる。
加えて、図16は、PK用量の作用(function)として、種々の株から得られるPrPs-resの同じ緩衝液に対する感度上の相違を示すことができる。
さらに、図15は、PKでのホモジネートの直接処理が、分解に対して感度が別タイプのPrP-resを現すことを示している。
【００５０】
実施例 7: SAF形態に精製された消化PrP-resのウエスタンブロッティングによる検出
実施例2による条件下で得られるホモジネートは、以下のように処理する:1時間、20% ホモジネート(500 μl) + 20% NaCl (500 μl) + [20% サルコシル + 2% SB314] (500 μl) + PK (20 μg/ml 最終濃度)。
図17は、結果を例示している:
b 及び d:
レーン1-7:スクレイピー株C506M3の種々の希釈物で得たマウスでの結果(希釈1/20、1/50、1/250、1/500、1/1000 及び 1/2000)。
レーン8: 分子量
レーン9-15: BSE株の種々の希釈物で得たマウスでの結果 (1/1000 〜1/10の希釈)。
BSEシグナルを完全に除くことができる。
【００５１】
a 及び c: 得られた結果は、オクタペプチドモチーフ反復に対する抗体の存在下でシグナルが有意に増加することを確証している。
e: この図は、サルとヒトの双方で、BSEでシグナルが低下することを示している(レーン4 及び7)。
【００５２】
参考文献
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. Serban D.ら、Neurology, 1990, 40, 110.
【００５３】
上記から明らかなように、この発明は、より詳細に記載したにすぎないその実施、調製及び応用の方法には全く限定されない;逆に、この発明は、この発明の関係又は範囲を逸脱しない限り、当業者に行い得る全ての変形を包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒト、ヒツジ、ウシ、マウス及びキヌゲネズミの種々のPrP配列を示す;
【図２】 ウエスタンブロッティングによるPrP-resの検出を示す;
【図３〜６】 オクタペプチドモチーフ反復の有無が2部位免疫測定アッセイによって検出される際の、ヒト(図3及び4)ならびに反芻動物(図5及び6)における、最初に工程(1)又は(a)、次いで工程(b)による種々の条件に相当する、
【図７〜１２】 BSE及びスクレイピーの区別検出における緩衝液の影響を例示する、
【図１３及び１４】 種々のタイプのCJDを検出するための、緩衝液の組成及びプロテイナーゼK(PK)濃度の影響を例示する、
【図１５】 プロテイナーゼKを用いる脳のホモジネートの直接的な消化で得られた結果を示す、
【図１６】 CJDタイプの機能としてのプロテイナーゼKに対するPrP-resの耐性上の相違を示す、
【図１７】 PKで消化され、SAF形態で精製された PrP-resのウエスタンブロッティングによる検出を示す。
この発明は、PrP-resを検出することによる、生物学的試料におけるUTA株によって引起こされるTSSEの診断方法、及び生物学的試料における種々のUTA株の区別診断に関連したその使用に関する。
【０００２】
亜急性伝達性海面状脳症(TSSE)は、その正確な性質が今日まで依然として論議されている、プリオンとも呼ばれる非通常伝達因子(unconventional transmissible agent, UTA)によって引起こされる。TSSEは、本質的に、ヒトでのクロイツフェルト-ヤコブ病(CJD)、ヒツジとヤギでのスクレイピー、及びウシでのウシ海綿状脳症(BSE)を含む。他の脳症は、ネコ科、ミンク又はシカもしくはヘラジカのようなある種の野生動物で認められている。
これらの疾患は常に致命的であり、現在のところ、有効な治療がない。
TSSEでは、宿主のタンパク質PrP(つまり、プリオンタンパク質)が、主に中枢神経系に異常形態(PrP-res)で蓄積される；PrP-resは、組織病変の外観に先行して、その感染及び蓄積を伴う。インビトロでは、それは神経の培養に毒性である。
【０００３】
2つのイソ型のPrPは同じアミノ酸配列を有する(図1参照)が、その二次構造において異なっている：PrP-resは、著しく高含量のβ-プリーツシートを有するが、正常なPrP(PrP-sen)は、多数のα-ヘリックスを有する。
2つの生化学的な特性により、一般に、これらの2つのイソ型を区別することができる。
- PrP-resは、そのN-末端の切断を引起こすプロテイナーゼ、特にプロテイナーゼK(PK)に部分的に耐性である。PKの作用後、PrP-resは、ジグリコシル化形態の見かけの分子量のために、しばしばPrP27-30と称される；PrP-resの切断部位は、通常の株に対し89〜90アミノ酸のあいだに位置することが一般に認められている(Prusinerら、Cell, 1984)。
- PrP-resは、Triton X100又はTriton 114のようなノニオン性洗剤に不溶性である。
【０００４】
プリオンタンパク質の正常形態(PrP-sen)は、原則として、プロテアーゼによって完全に分解され、ノニオン性洗剤の存在下で完全に可溶性である。
ハムスター、ヒト、ウシ及びヒツジのPrP-senのペプチド配列を図1に示す; それらは、特に種によって4回又は5回繰り返されたオクタペプチドモチーフ(P(H/Q)GGG(-/T)WGQ)を含む。このオクタペプチドモチーフ反復は、PrPの51-91(ヒトPrP配列の番号)アミノ酸に相当する (B. Oeschら、1991)。
感染因子の有無を検出するため、近年の方法の多くは、プロテアーゼに対するその部分的な耐性を利用することによる、感染因子に関連する異常なPrP (PrP-res)の選択的な検出に基づいている。
【０００５】
それは区別することができる:
- 正常なイソ型PrP(PrP-sen)を破壊するプロテアーゼでの抽出処理後の組織抽出物におけるPrP-resの免疫学的検出、電気泳動によるタンパク質抽出物の分離、ポリマー膜への転移及びPrPを認識する特異抗体での検出に基づくウエスタンブロッティング法(Schaller O.ら、1999)、
- プロテアーゼでの組織抽出処理も伴うELISA型試験。
プロテアーゼでの組織抽出処理を含むこれらの種々の試験のうち、以下が挙げられる:
- ニトロセルロース膜へのタンパク質の固定化、続くプロテアーゼ消化、変性及びモノクローナル抗体での免疫検出を含むPrP-resの検出試験を開発した、Serbanらにより記載された試験(Neurology, 1990, 40, 110)、
【０００６】
- PrP-res量を定量するための、PrP-resの精製用免疫濾過アッセイ(ELIFA 又は酵素結合免疫濾過アッセイ)を提案した、Oeschらにより記載された試験(Biochemistry, 1994, 33, 5926-5931)
- ELISA型アッセイを提案するGratwohlらにより記載された試験。プロテイナーゼKでの試料の処理及び遠心分離によるPrP-resの精製後に、後者はマイクロタイタープレートに吸着され、ウサギのポリクローナル抗体を用いて検出される。
- プロテイナーゼKを使用しないが、変性処理に付されるか否かによって、固体支持体に固定化されるPrP-resの免疫反応性を比較するSafarら(1998)によって記載された試験。
【０００７】
一般に、これらの種々の試験は感度を欠いている欠点があり、そのために擬陰性を生じる。
他の方法は、変性生成物での試料の処理(Oeschら、1994 及び1999; WO 00/22438, The Reagents of the University of California)、プロテイナーゼKでの限定的な処理(WO 00/29850, Wallac Oyら)又は潜伏抗原部位(この部位はPrPの109-112領域を認識するモノクローナル抗体3F4で検出できる(WO 00/29850 又はWO 00/22438))を利用できるメタロペプチドでの処理(WO 00/22438)を提案している。
WO 00/29850 (Wallac Oy ら)に記載された方法には、特に推奨される処理条件下でのPrP-senの不完全な除去に起因して、特異性を欠くという主たる欠点がある。一方、WO 00/22438に記載された方法(The Regents of the University of California)は、タンパク質上で唯一のモチーフに結合する検出抗体3F4を用いるために感度に欠けている(WO 00/22438)。
【０００８】
出願人は、最近、PrP-resの定量的な検出用試験を提供した。これは、極めて高感度の検出をもたらし、屠殺場でのPrP-resの医学的なモニターとアッセイに大きな進歩を果たす精製工程を含む。この方法は、特にPCT国際出願WO 99/41280 及びヨーロッパ委員会の全体理事会XXIV の予備報告に記載されている (consumer policy and consumer health protection; http://europa.eu.int/ comm/dg24/ health/)。
しかし、TSSEの診断のために特に信頼性ある試験が求められており、出願人は、その研究を続行した。
【０００９】
特に、
(i) 高感度であり、つまり非感染動物を正確に同定する能力を有し、
(ii) 特異的であり、つまり臨床的な症状を示す感染動物を正確に同定する能力を有し、
(iii) できる限り低い検出限界を有し、つまり 少量のPrP-resの検出(臨床的な症状が現れる前のPrP-resの検出)が可能であり、
(iv) 再現性がある
検出試験を行うために、分析される生物学的試料が、全て又は幾らかのオクタペプチドモチーフを排他的にPrP-resに保存し得る条件下で処理される必要のあることが、確立された。
特に、上記の4条件(i)-(iv)を効果的に満たすために、分析される試料を処理して試料からPrP-senを完全に除き、それと同時に所定の条件下でPrP-resの特異的な捕捉を可能にする正確な条件を明確にする必要のあることが見出された。
【００１０】
この発明の対象は、
(1) 生物学的試料を、どのようなUTA株であっても、PrP-senを完全に分解するが、同時にPrP-senのオクタペプチドモチーフ反復の全て又は幾らかを保存するように少なくとも1つのプロテイナーゼK(PK)で処理し;好ましくは、PK処理は10%のホモジネート(適当な緩衝液中でホモジネート形態の生物学的試料)について37℃で10分30〜200μg/mlの濃度、又は10%ホモジネートについて37℃で10分30〜200μg/mlの濃度に等しい期間かつ濃度で行われる、
(2) 該オクタペプチドモチーフについてのリガンド、特に該オクタペプチドモチーフ反復に対する抗体と該処理試料を接触させ、及び
(3) オクタペプチドモチーフ反復/リガンド複合体の潜在的な有無を検出する
ことからなるのを特徴とする、生物学的試料においてPrP-resを検出することによる、UTA株によって引起こされるTSSE又はプリオン疾患の診断方法(方法A)である。
【００１１】
この方法の有利な具体例によれば、プロテイナーゼKでの処理は、上記濃度で、80℃未満の温度で30秒〜2時間、好ましくは37℃で10〜30分、より好ましくは、10%ホモジネート(最終濃度)について30〜200μg/ml濃度で10分、又は10%ホモジネート(最終濃度)について10〜70μg/ml濃度、又は25%ホモジネート(最終濃度)について25〜175μg/ml濃度で30分である。
幾らかのパラメータが互いに密接に関連していることに留意すべきである:プロテイナーゼKの濃度は、直接、試料の処理期間(インキュベーション時間)による; 例えば37℃では、10%ホモジネートについて30〜200μg/ml濃度のPKでの10分のインキュベーションは、10%ホモジネートの10〜70μg/ml濃度のPKでの30分のインキュベーションに等しいと考えられる。例えば、25μg/mlのPKでの30分のインキュベーションは、75μg/ml濃度のPKでの10分のインキュベーションに等しい。
【００１２】
PKの濃度及びインキュベーション期間がどのようなものでも、処理される試料が未分解PrP-senを含むはずはないが、存在する可能性のあるPrP-resは、保存されたオクタペプチドモチーフを全て又は幾らか有している。
PKの活性濃度を確立する上で、他のパラメータがある程度(つまり、本質的ではなく)関与している可能性がある:これは、特にPKが溶解されている緩衝液を包含する; PKが試料のホモジネート緩衝液に溶解されている際には、使用されるホモジネート緩衝液に応じて、PKの最少濃度は上記濃度範囲内で変化し得る:
- グルコース緩衝液又はグアニジン(又は、その塩)では、PKの最少濃度は25μg/ml (30分のインキュベーション) 又は 75 μg/ml (10分のインキュベーション)であることが好ましい;
- PBS緩衝液では、PKの最少濃度は50μg/ml (30分のインキュベーション)又は150μg/ml (10分のインキュベーション)であることが好ましい。
【００１３】
有利には、PKは、ホモジネート緩衝液とは異なる緩衝液中で用いることができる; このような緩衝液は、少なくとも1つの界面活性剤及び/又は少なくとも1つのカオトロピック剤及び/又は少なくとも1つの塩からなることが有利である。
また、有利には、プロテイナーゼKでの試料の処理(又はインキュベーション)後に、得られた懸濁液を、国際出願99/41280に定義される条件下、つまり:
- 国際出願99/41280に記載された緩衝液B、特にC3-C6 アルコール及びアルコール混合物(その理論上の誘電定数は10〜25である)の該懸濁液への添加、
- 得られた懸濁液の遠心分離、及び
- 国際出願99/41280に記載された条件下で、少なくとも1つの界面活性剤及び/又は少なくとも1つのカオトロピック剤からなる緩衝液中でのペレットの可溶化で処理することが有利である。
【００１４】
このような試験は、種々のUTA株によって引起こされる同宿主におけるTSSEの区別診断、特にヒツジにおけるスクレイピーの通常の株に比較したBSE株の区別診断に特に適している利点がある。
例えば、UTA株に応じて移動上の違いを示す、PrP-resの電気泳動プロフィルを分析することによって、BSE株がヒトに感染することが英国では明らかにされている; 特徴的なプロフィル(タイプ4)は、BSE因子に感染したウシのヒト食物への流通に関連していると考えられるクロイツフェルト-ヤコブ病の新変種(vCJD)を発現した患者で認められた(Collingeら、Nature, 1996)。同様のプロフィルは、BSE因子に感染したマカーク(Lasmezasら、1996)及び恐らくはこの因子に汚染したネコ(Priolaら、Nature Med., 1996)で認められた。
【００１５】
しかし、それは、再現性ある結果が望ましいならば実施に手がかかる冗長な方法で、おそらく、種々のタイプのPrP-resの分類及びこの方法の使用に関して一部の議論を招く(Parchiら、Nature, 1997)。
また、BSE因子でのヒツジの汚染に関する疑いは大きい(Butler, Nature, 1998)。ヒツジには、密接で識別不能な臨床上かつ組織学上の特徴を有する風土病、スクレイピーがTSSEとは別にあるが、これらの動物は実際この因子に高感度である。BSE因子とスクレイピー因子との区別診断のために唯一基準となる方法は、マウスに接種し、病変プロフィルを研究することである。これは、約2年の待機を要し、数千万頭ものヒツジの群に対し9頭のヒツジでのみ英国で行われている。
【００１６】
最初の試みにより、試料における種々のUTA株の区別が試みられた; Kuczius T.ら(1999)は、グリコタイピング(glycotyping)技術を用いる種々のTSSE株(スクレイピー、BSE及びCJD)間に認められる変異によっては、各株を識別できないと考えた; 彼らはPrP-resに対する他の生化学的及び生物学的なマーカーを選択した。これは、より明確に互いの種々のプリオン株の識別が可能である。彼らが使用した分析パラメータは以下のとおりである: プロテイナーゼKに対する長期間の耐性、PrP-resの分子質量、トポロジー及びPrP-resの蓄積量。得られた結果は、BSE及びスクレイピーの種々の株のPrPs-resがプロテイナーゼKに対する長期間の耐性で著しい違いを示すことを明らかにしている。PKに対する耐性は、スクレイピーの株によって変化する:低耐性: チャンドラー(Chandler)株; 中間耐性: 22A 株; 相対的に安定: 87V株。同一条件下では、BSE株は中間的な耐性を示す。グリコタイピングはスクレイピー株87V とBSE株とを識別できないが、これらの2タイプの株は、PKでの長期間の処理後に明らかに識別できる。しかし、これらは、十分に信頼性があり、大規模にフィールドで使用できるプロトコルではない。
これに関連して、区別診断が可能で、比較的安価で、組織試料のような生物学的試料を用いて実施しやすいPrP-resの検出方法を、信頼性があり高感度なものとすることが重要である。
【００１７】
この結果、この発明の対象は、
(a) 上記のUTA株の診断方法(方法A)の工程(1)〜(3)により、生物学的試料の第一画分においてPrP-resを検出し、次いで:
(b) 各試料について、オクタペプチドモチーフ反復/リガンド複合体の有無を工程 (a)で検出する:
- オクタペプチドモチーフ反復の大多数が、条件下で、対象の少なくとも1つの株、特にBSE株に関連したPrP-resについて除かれ、他のUTA株に関連したPrPs-resの全てが全て又は幾らかのオクタペプチドモチーフ反復を保存するように、少なくとも1つのプロテイナーゼK(PK)で該試料の第二画分を処理し;好ましくは、この処理は、工程(1)又は(a)に規定されるのと同じ条件で、但し工程(1)又は(a)で使用されるよりも高いPK濃度で行われる、
- 処理された試料の第二画分を、オクタペプチドモチーフ反復を特異的に認識しうるリガンドと接触させ、かつ
- オクタペプチドモチーフ反復/リガンド複合体の潜在的な有無を検出することからなることを特徴とする、種々のUTA株に関連したPrPs-res を検出することによる、生物学的試料における、UTA株により引起こされるTSSEの区別診断方法(方法B)でもある。
【００１８】
また、この発明の対象は、各生物学的試料についてPrP-resの有無を検出し、
- 上記工程b)にしたがって、生物学的試料の別の画分を処理し、
- 処理された試料の第二画分を、該オクタペプチドモチーフ反復を特異的に認識し得るリガンドと接触させ、かつ
- オクタペプチドモチーフ反復/リガンド複合体の潜在的な有無を検出することからなることを特徴とする、PrP-resを含むと考えられる(検出試験はいずれかの方法で行った)生物学的試料におけるUTA株によって引起こされるTSSEの区別診断方法(方法Bの変形)である。
区別診断(方法B)に関連して、PKの濃度のほかに、株によっては他の条件がオクタペプチドモチーフの分解に影響を有し得る: 具体的には、PKが、少なくとも 1つの界面活性剤及び/又は少なくとも1つのカオトロピック剤及び/又は少なくとも1つの塩から有利になる緩衝液のようなホモジネート緩衝液と異なる緩衝液で用いられる場合には、分解されるオクタペプチドモチーフ数は、緩衝液の組成及び種々の剤の濃度に応じて変化し得る。
【００１９】
用語「対象の株」は、UTA株、特にBSE株を意味する。このため、例えばオクタペプチドモチーフ反復を除くことが意図される。
方法AとBの主たる特徴の1つは、オクタペプチドモチーフ反復の分解をコントロールするために、プロテアーゼ処理を行う条件を活用することである。 予定される用途に応じて、これらのモチーフが保存(方法A)又は破壊(方法B)されるように、方法は実施されるであろう:
- 方法Aに関して、このコントロールの目的は、PrP-resの極めて高感度な検出を促進するために、オクタペプチドモチーフ反復の全て又はいくつかを保存することであろう;
- 方法Bに関して、プロテアーゼによる分解のコントロールの目的は、全て又は幾らかのオクタペプチドモチーフ反復が全ての他のTSSE株に相当するPrPs-resについて保存される条件下で、対象の株に相当するPrP-resについてのオクタペプチドモチーフ反復の大多数及び任意には全てを、発現される種にかかわらず分解することであろう。この場合、この発明の利点は、他のUTA株に対する対象株の区別診断が可能なことである。
【００２０】
詳 細:
驚くべきことに、工程(1)又は工程(a)による条件下で、PKは、全てのUTA株又はプリオンに関連したPrPs-resのオクタペプチドモチーフ反復の全て又は幾らかの切断を生じない。一方、工程(b)の条件は、対象の株に関連したPrP-resのオクタペプチドモチーフ反復の切断をもたらすが、他のUTA株に関連した全 PrPs-resは、オクタペプチドモチーフ反復の全て又は幾らかを保存する。
また、驚くべきことに、このような試験は、特にリガンドが抗体である場合に、以下の利点を有する:
- 検出についての優れた感度。これらのオクタペプチドモチーフ反復に対する抗体は、PrP-res 27-30の他の領域に対する抗体よりもかなり大きな親和性を有し、使用される緩衝液にかなり耐性であるためである;具体的には、反復モチーフの認識は高い親和性の相互作用を促進し、単一のPrP分子に幾らかの抗体分子を結合させる可能性を生じる;
【００２１】
- UTA株又はプリオンの区別診断の可能性。これは、使用される条件に応じて、これらのモチーフを消化したり、又は消化できないためである; 特に、対象の株、例えばBSE因子に関連した疾患の全てについてモチーフを除くことができる。しかし、他の「プリオン」疾患については、それを保存できる。この結果として、この発明による方法は、2つの異なる条件(工程(1)又は(a)及び工程(b))を用いることにより、他の株に関し、BSE及び/又は対象の別の株についての区別診断のための簡単な試験を提供する。工程(1)又は(a) (全てのUTA株に関連したPrPs-resのオクタペプチドモチーフ反復を保存する)の条件により全ての株を検出でき、工程(b) (対象の株に関連したPrP-res でのみこれらのモチーフを除く)の条件により他の株のみを明らかにできる。
したがって、このような試験は、特にスクレイピーの通常株と普通には区別できないBSE株でのヒツジの汚染に関する調査での応用が見出されている。
【００２２】
この方法の有利な具体例によれば、PKは、好ましくは以下からなる緩衝液に溶解される:
a. - アニオン性界面活性剤、例えばSDS (ドデシル硫酸ナトリウム)、サルコシル (ラウロイルサルコシン)、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム又はタウロコール酸ナトリウム;
- 両性イオン性界面活性剤、例えばSB 3-10 (デシルスルホベタイン)、SB 3-12 (ドデシルスルホベタイン)、SB 3-14、SB 3-16 (ヘキサデシルスルホベタイン)、CHAPS 及びデオキシ-CHAPS;
- ノニオン性界面活性剤、例えばC12E8 (ドデシル-オクタエチレングリコール)、Triton X100、Triton X114、Tween 20、Tween 80、MEGA 9 (ノンアノイルメチルグルカミン)、オクチルグルコシド、LDAO (ドデシルジメチルアミンオキシド)又はNP40、又は
【００２３】
- 界面活性剤混合物、例えばイオン性界面活性剤とノニオン性界面活性剤の混合物、2つのイオン性界面活性剤の混合物又はイオン性界面活性剤と両性界面活性剤の混合物
からなる群から選択される、少なくとも1つの界面活性剤:及び/又は
b. ウレア及びグアニジン、又はその混合物からなる群から選択される少なくとも1つのカオトロピック剤、及び/又は
c. アルカリ金属であってもよく、又はそうでなくともよい金属塩から選択される少なくとも1つの塩。
【００２４】
この具体例の有利な例によれば、緩衝液は、少なくとも5%のアニオン性界面活性剤、好ましくは任意にSDSと組合わさったサルコシルからなる。
この方法の別の有利な具体例によれば、リガンドは、オクタペプチドモチーフ反復の領域に特異的に結合し得るアプタマー及び抗体からなる群から選択される。
また、この発明の対象は、上記のような少なくとも1つの界面活性剤及び/又は少なくとも1つのカオトロピック剤及び/又は少なくとも1つの塩及びプロテアーゼの組合せからなることを特徴とする、この発明による方法を実施するための診断キットである。
オクタペプチドモチーフ反復/抗体複合体(リガンドが抗体である場合)は、標準的な免疫学的方法で検出される。
【００２５】
上記の例のほかに、この発明は、この発明の対象である方法の実施例及び添付図面に言及する以下の記載から明らかになるであろう他の例も含む。
- 図1は、ヒト、ヒツジ、ウシ、マウス及びキヌゲネズミの種々のPrP配列を示す;
- 図2は、ウエスタンブロッティングによるPrP-resの検出を示す;
- 図3〜6は、オクタペプチドモチーフ反復の有無が2部位免疫測定アッセイ(two-site immunometric assay)によって検出される際の、ヒト(図3及び4)ならびに反芻動物(図5及び6)における、最初に工程(1)又は(a)、次いで工程(b)による種々の条件に相当する、
- 図7〜12は、BSE及びスクレイピーの区別検出における緩衝液の影響を例示する、
- 図13と14は、種々のタイプのCJDを検出するための、緩衝液の組成及びプロテイナーゼK(PK)濃度の影響を例示する、
- 図15は、プロテイナーゼKを用いる脳のホモジネートの直接的な消化で得られた結果を示す、
- 図16は、CJDタイプの機能としてのプロテイナーゼKに対するPrP-resの耐性上の相違を示す、
- 図17は、PKで消化され、SAF形態で精製された PrP-resのウエスタンブロッティングによる検出を示す。
【００２６】
しかし、これらの実施例が、この発明の対象を例示するものに過ぎず、いかなる方法でもそれを限定するものではないことは、明らかに理解されるべきである。
実施例 1: オクタペプチドモチーフ反復に特異的なモノクローナル抗体の生産と特徴づけ
- ペプチドの合成とラベル化
ヒトPrPの配列79〜92に相当するPrPオクタペプチドモチーフ反復を代表するペプチド、例えばモチーフ G-G-W-G-Q-P-H-G-G-G-W-G-Q-G-(NH2)は、自動合成器(Milligen 9050, Waters, Milford, MI)を用いて合成した。ペプチドは、他のペプチド又はタンパク質について以前に記載されているように(McLaughlinら、1987, Grassiら、1989)、ヘテロ二官能性試薬、スクシニミジル4-(N-マレ-イミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC, Calbiochem, France)を介して、アセチルコリンエステラーゼ(AchE)に共有結合させた。この方法は、SMCCとの反応で AchEに結合されたマレイミド官能性と、ペプチドに導入されたチオール基との反応を伴う。チオール基は、以前に記載されているように(McLaughlinら、1987)、N-スクシニミジルS-アセチルチオアセテート(SATA)との反応でペプチドに導入された。結合は、過剰なチオール化ペプチドとAchE-SMCCを反応させて得られた。
【００２７】
- モノクローナル抗体の免疫化と調製
スクレイピー関連フィブリル(SAF, PrP-res調製)の調製は、以前に記載されているように(Lasmezasら、1997)、感染したハムスター(263Kスクレイピー株)の脳から得た。この調製は、マウスを免疫化する前に、蟻酸での処理により不活化した。PrPノックアウトマウス(PrP遺伝子が除かれている) (PrP0/0マウス)を、これらのSAF調製物で免疫化し、ハイブリドーマ細胞を以前に記載されているようにして(Grassiら、1988, 1989)調製した。培養上清を上記のようにしてスクリーンした。57個のハイブリドーマを同定し、安定化できた;それらを、SAF-1〜SAF-90と命名した。これらの抗体は全てマイクロタイタープレート上で固定化されたSAFを認識することが明らかになったが、少数は、ペプチド-AchE接合体の認識能を示した。後者のうち、7個は明らかにオクタペプチドモチーフ反復(ペプチド79〜92)を認識する;それらは、抗体SAF-15、SAF-31、SAF-32、SAF-33、SAF-34、SAF-35 及び SAF-37である。得られた抗体のリスト、またその主な特徴を以下の表に示す。クローニング及び腹水液形態で展開(expansion)した後、モノクローナル抗体をタンパク質A-セファロースカラムでのアフィニティクロマトグラフィーで精製し、使用するまで−20℃で保存した。抗体のイソタイプを、オークタロニー法にしたがって、ラジカル免疫拡散法で測定した。
【００２８】
- ハイブリドーマ培養上清のスクリーニング
ハイブリドーマ培養上清中のPrP-特異抗体の存在は、ペプチド-AchE 接合体又はハムスターSAF のいずれかに対する結合能を試験することによって、2つの方法で立証された。最初のケースでは、前に記載されたように(Creminonら、1993, Frobertら、1991)固定化した抗-マウスIgG抗体を含むプレートで、スクリーニングを行った。要約すれば、100μlの培養上清と100μlのペプチド-AchE接合体を、固定化したヤギ抗-マウスIgG抗体を含むプレートで+4℃で一晩反応させた。プレートを洗浄後、200μlのエルマン試薬(Ellmanら、1961)をウエルに加え、固相に付着したAchEの有無を検出した。二番目のケースでは、固定化SAF調製物を含むプレートを、0.05 Mリン酸緩衝液pH 7.4中に50μlの2μg/ml溶液を室温で一晩反応させることにより、調製した。洗浄後、プレートを+4℃で一晩EIA緩衝液(150 mM NaCl、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)及び0.01%アジ化ナトリウムを含む100 mM リン酸緩衝液pH 7.4)で飽和し、使用するまでこの温度で維持した。固定化SAFに対するモノクローナル抗体の結合は、前に記載されているように(Negroniら、1998)、AchEでラベルしたヤギ抗-マウスIgGを用いて明らかにした。
【００２９】
【表１】
79-92: ペプチド79-92を認識する抗体
142-160: ペプチド142-160を認識する抗体
エピトープX: 固定化SAFを認識しない抗体
エピトープA: ペプチド126-164を認識するが、ペプチド142-160に結合しない抗体
* 免疫測定アッセイに関連して、この研究中に試験した少なくとも1つの種(ヒト、ウシ、ヒツジ、マウス又はハムスター)についてPrP-senの認識能力を示したモノクローナル抗体
【００３１】
実施例 2: ウエスタンブロッティングによるPrP-resの検出
I: 試料の処理
(i) 種々の生物学的試料由来の組織ホモジネートの調製
- ウシのBSE、ヒツジのスクレイピー、ヒトのvCJD (タイプ4)、ヒトの散発型 CJD (タイプ1)及び対応する陰性のコントロール
ウシの脳350 mgを採取する: それをすりつぶし、5% グルコース溶液中20% (w/v)でホモジネートする。
ホモジネートを行うために、脳の試料(350 mg)と1.4 mlのグルコース溶液を、セラミックビーズからなるチューブに入れ、激しく攪拌する(Hybaid Ribolyser)。
陽性の試料を、以下のように、相当する種の健康な脳に由来するホモジネートに希釈した:
. ヒツジについて: 〜1/100
. ウシについて: 〜1/50
. ヒトについて: タイプ1又は 4: 〜1/40; タイプ3:〜1/80; タイプ2:〜1/20
【００３２】
(ii) 工程(I)についての条件
(i)で得た20%ホモジネートの第一画分(500μl)を、10% サルコシル(SK10)、10% Triton X100 (T10)、2Mユレア(U2)及び緩衝液60μg/mlでのプロテイナーゼK(PK)(PK1)からなる緩衝液500μlと10分37℃で (10%ホモジネートについて30μg/mlの最終濃度に相当)インキュベートする。
図3-6では、PK3は緩衝液180μg/mlのPK濃度に相当し、PK6は緩衝液360μg/mlのPKの濃度に相当する。
(iii) 1-ブタノールからなる緩衝液500μl(国際出願WO 99/41280に記載された緩衝液Bに相当)を加える; 混合物を5分15 000 rpm(約17 000 g)で遠心分離する。
【００３３】
(iv) PrP-resを含む遠心分離ペレットを、国際出願WO 99/41280に記載されたような80-100μlの緩衝液C、好ましくは4%のSDSを含むラエムリ緩衝液に溶解し、100℃で5分加熱し、ウエスタンブロッティングを行うか、又は連続的に6Mユレアと0.5%サルコシルからなる緩衝液C1に溶解し、続いて100℃で5分加熱し、次いで2Mグアニジンからなる緩衝液C2に溶解し、100℃で5分加熱して、免疫測定アッセイを行う。
(v) 工程(b)の条件
(i)で得た20%でのホモジネートの第二画分(500μl)を、10分37℃で、5%サルコシル(SK5)、5% SDS (SDS5)、1Mユレア(U1)及び180μg/mlでのプロテイナーゼK(PK)(PK6)からなる緩衝液500μlとインキュベートし、次いで上記工程(iii)と(iv)を行う。
【００３４】
II. ウエスタンブロッティング
得られた試料を用いてSDS-PAGE電気泳動を行い、上記国際出願WO 99/41280の実施例1及び実施例3に記載の条件下でニトロセルロース膜に移す。
PrP-resの免疫検出は、上記実施例1に記載されたモノクローナル抗体SAF70とSAF37、ならびにパーオキシダーゼ-共役抗-ウサギヤギIg (1/2500)を用いて行う。免疫反応性は、化学ルミネセンス(ECL, Amersham)により現し、定量し、図2に示すように放射能写真フィルムで視覚化する。
この図で:
* レーン1-5は、工程(1)又は(a)による条件に相当する(SK10+T10+U2+PK1)。
レーン1:陰性コントロール
レーン2:ウシのBSE
レーン3:ヒツジのスクレイピー
レーン4:ヒトのvCJD (タイプ4)
レーン5:ヒトのCJD (タイプ1)及び
* レーン6-10は、工程(b)による条件に相当する(SK10+SDS5+U1+PK6)。
レーン1:陰性のコントロール
レーン2:ウシのBSE
レーン3:ヒツジのスクレピー
レーン4:ヒトのvCJD (タイプ4)
レーン5:ヒトのCJD (タイプ 1)
【００３５】
得られた結果から、以下が示される:
- 工程(1)又は(a) (レーン1〜5)で、PrP-senは組織的に破壊されるが、PrP-resで得られるシグナルは、PrPの94-230領域に対する抗体を同じ試料に用いて得られるシグナルまで、オクタペプチドモチーフ反復に対する抗体を用いて組織的に大きい;
- 工程(b) (レーン6〜10)では、PrP-senは組織的に破壊される。一方、レーン8〜10 (オクタペプチドモチーフ反復に対する抗体の存在下) で得られるシグナルは、PrPの94-230領域に対する抗体を同じ試料に用いて得られたシグナルと似ているか、それより大きいが、少量で、レーン7及び9では検出不可能でさえある(BSEのPrP-res)。
【００３６】
実施例 3: オクタペプチドモチーフ反復を認識するモノクローナル抗体を捕捉抗体として用いる2-部位免疫測定アッセイでのPrP-resの検出
2-部位免疫測定アッセイを行うために、実施例2の(iv)で得たペレットを、例えばサルコシル(0.25-1%)及びユレア(0.25-8 M) 又は(0.25-1%)及びユレア(0.25-1 M)からなる緩衝液に溶解する;得られた試料は、好ましくは、加熱後、最終的なアルブミン濃度を0.1〜1%(w/v)とするアルブミン含有緩衝液、又は1%デオキシコラート含有緩衝液で希釈する(〜1/4 又は〜1/2)。
2-部位免疫測定アッセイは、他のタンパク質について既に記載された条件下(Grassiら、1989)で固定化した抗体を含むマイクロタイタープレートで行う。その原理は以下のとおりである:分析されたPrPは、固体支持体に付着した抗体(捕捉抗体)によって、また分子の別の部分を認識し、酵素でラベルされる第二抗体(この場合、アセチルコリンエステラーゼ、トレイサー抗体)により、5 エルマン単位/mlで認識される。
【００３７】
この発明に関連して、捕捉抗体はオクタペプチドモチーフ反復に対するものであり、トレーサー抗体は、PrPの94-230領域、例えばPrPの142-160領域に含まれる配列を認識する。固相を洗浄後、プレートに付着した酵素活性は、分析された試料中にオクタペプチドモチーフ反復を最初に有するPrP-resの量に比例する。
実際、アッセイは、以下のようにして行われる:
分析される100μlのPrP溶液を、オクタペプチドモチーフ反復を認識する抗体を含むマイクロタイタープレートのウエルに置く。室温で3時間反応後、トレーサー抗体(5エルマン単位/ml)溶液100μlを加える前に、プレートを洗浄する。+4℃で一晩反応後、プレートを再洗浄し、固相に付着したアセチルコリンエステラーゼの活性を測定し得る基質溶液200μl(エルマン試薬、Grassiら、1989)を加える。酵素反応の30分後、各ウエルの吸光度(414nmでN.D.)を測定する。
【００３８】
実施例 4: 種々の条件の比較研究: 工程(1) 又は(a) 及び工程(b)
試料を、実施例2に記載されたように調製する。
ホモジネートを、実施例2にあるように調製する。
- ヒトで
図3 及び4は、種々の緩衝液で得られた結果を示す:
* この発明による方法の工程(1)又は(a)による条件:
I: 20%+SK10+T10+U2+PK1でのホモジネート
III': 10%+SK5+T5+U1+PK0.5 でのホモジネート(図4)
* この発明による方法の工程(b)による条件:
II: 20%+SK10+T10+U2+PK3でのホモジネート
III: 20%+SK10+T10+U2+PK6でのホモジネート
III": 10%+SK5+T5+U1+PK6でのホモジネート(図4)
IV: 20%+SK20+PK3でのホモジネート
V: 20%+SK20+U1+PK3でのホモジネート
VI: 20%+SK20+U2+PK3でのホモジネート
VII: 10%+SK20+PK3でのホモジネート
VIII: 10%+SK20+U1+PK3でのホモジネート
IX: 10%+SK20+U2+PK3でのホモジネート
X: 10%+SK5+SDS5+U1+PK6でのホモジネート
X': 10%+SK2.5+SDS2.5+U2+PK6 でのホモジネート (図4)
【００３９】
(iv) PrP-resを含む遠心分離ペレットを、国際出願WO 99/41280に記載されたような80-100μlの緩衝液C、好ましくは4%のSDSを含むラエムリ緩衝液に溶解し、100℃で5分加熱し、ウエスタンブロッティングを行うか、又は連続的に6Mユレアと0.5%サルコシルからなる緩衝液C1に溶解し、続いて100℃で5分加熱し、次いで2Mグアニジンからなる緩衝液C2に溶解し、100℃で5分加熱して、免疫測定アッセイを行う。
(v) 工程(b)の条件
(i)で得た20%でのホモジネートの第二画分(500μl)を、10分37℃で、5%サルコシル(SK5)、5% SDS (SDS5)、1Mユレア(U1)及び360 μ g/mlでのプロテイナーゼK(PK)(PK6)からなる緩衝液500μlとインキュベートし、次いで上記工程(iii)と(iv)を行う。
【００４０】
- 反芻動物で、
図5 及び6は、種々の緩衝液を用いて得られた結果を示す:
* この発明による方法の工程(1)による条件:
I: 20%+SK10+T10+U2+PK1でのホモジネート
III': 10%+SK5+T5+U1+PK0.5 でのホモジネート(図 6)
* この発明による方法の工程(4)による条件:
II: 20%+SK10+T10+U2+PK3でのホモジネート
III: 20%+SK10+T10+U2+PK6 でのホモジネート
III": 10%+SK5+T5+U1+PK3 でのホモジネート(図6)
IV: 20%+SK20+PK3でのホモジネート
V: 20%+SK20+U1+PK3でのホモジネート
VI: 20%+SK20+U2+PK3でのホモジネート
【００４１】
VII: 10%+SK20+PK3 でのホモジネート
VIII: 10%+SK20+U1+PK3でのホモジネート
IX: 10%+SK20+U2+PK3でのホモジネート
X: 10%+SK5+SDS5+U1+PK6でのホモジネート
X': 10%+SK5+SDS5+U1+PK3でのホモジネート (図5)
XI: 20%+SK20+PK6でのホモジネート
XII: 20%+SK20+U1+PK6でのホモジネート
XIII: 20%+SK20+U2+PK6でのホモジネート
XIV: 10%+SK20+PK6 でのホモジネート
XV: 10%+SK20+U1+PK6でのホモジネート
XVI: 10%+SK20+U2+PK6でのホモジネート
【００４２】
オクタペプチドモチーフ反復が保存されている PrP-resの量を、2-部位immunometric アッセイ(吸光度つまり414nmでのO.D.、実施例3参照)を用いて測定する;陰性のコントロール(□)、ウシのUTA
- 図7 (ウエスタンブロッティング)と8 (2-部位免疫測定アッセイ):
. 比較は、実施例2に記載された条件下で得た健康なヒツジ、スクレピーに罹患しているヒツジ及びBSEに罹患しているウシ由来の脳の20%でのホモジネートを用いて行う。
. 試料の処理:
A: 10% サルコシル A + 10% Triton + 2M ユレア + 60 μg/ml プロテイナーゼK、10分
B: 10%サルコシル + 2M ユレア + 240 μg/ml プロテイナーゼK、10分
C: 10%サルコシル + 240μg/ml プロテイナーゼK、10分
. 検出
ウエスタンブロテッィング(図7)によれば:抗体Saf37及びSaf84 (実施例1参照);免疫測定分析(図8)によれば:Saf37での捕捉及びPrPの94-230領域に対する抗体での顕在化
【００４３】
- 図9 (ウエスタンブロテッィング)及び10 (2-部位免疫測定アッセイ):
. 比較は、実施例2に記載された条件下で得た健康なヒツジ、スクレピーに罹患しているヒツジ及びBSEに罹患しているウシ由来の脳の20%でのホモジネートを用いて行う。
. 試料の処理:
A: 10% サルコシル + 10% Triton + 2M ユレア + 60 μg/ml プロテイナーゼK、 10分
B: 10% SDS + 5% Triton + 2M ユレア + 180 μg/ml プロテイナーゼK、10分
. 検出
上記と同じ条件下
【００４４】
PK用量を単に増すことによって、ヒトではなくヒツジでのBSEとスクレイピー(タイプ1とタイプ4)とのオクタペプチドモチーフ反復領域について示差感度を示すことができる。
他方、界面活性剤及びカオトロピック剤の組成を変えることによっても、オクタペプチドモチーフ反復領域の示差感度をあらゆる場合に明らかにすることができる。
【００４５】
実施例 5: BSEとスクレイピーの区別検出における緩衝液の組成の影響
- 図11 (ウエスタンブロッティング)及び12 (2-部位免疫測定アッセイ):
. 比較は、実施例2に記載された条件下で得た健康なマウス、又はC506M3株(スクレイピー)もしくは6PBI株(BSE)に実験的に感染したマウス由来の脳の10%ホモジネートを実施例2に記載の条件下で得た。
. 試料の処理:
A: 10% サルコシル + 10% Triton + 2M ユレア + 30 μg/ml プロテイナーゼK、10分
B: 10% サルコシル + 10% Triton + 2M ユレア + 60 μg/ml プロテイナーゼK、 10分
C: 10% サルコシル+ 10% Triton + 2M ユレア + 180 μg/ml プロテイナーゼK、10分
D: 10% サルコシル+ 10% Triton + 2M ユレア + 360 μg/ml プロテイナーゼK、 10 分
E: 10% サルコシル + 2M ユレア+ 180 μg/ml プロテイナーゼK、10分
【００４６】
- 反芻動物で、
図5 及び6は、種々の緩衝液を用いて得られた結果を示す:
* この発明による方法の工程(1)による条件:
I: 20%+SK10+T10+U2+PK1でのホモジネート
III': 10%+SK5+T5+U1+PK0.5 でのホモジネート(図 6)
* この発明による方法の工程 (b)による条件:
II: 20%+SK10+T10+U2+PK3でのホモジネート
III: 20%+SK10+T10+U2+PK6 でのホモジネート
III": 10%+SK5+T5+U1+PK3 でのホモジネート(図6)
IV: 20%+SK20+PK3でのホモジネート
V: 20%+SK20+U1+PK3でのホモジネート
VI: 20%+SK20+U2+PK3でのホモジネート
【００４７】
実施例 6: 種々のCJDの検出に対する緩衝液及びプロテイナーゼK濃度の影響
- 図13 (ウエスタンブロッティング) 及び14 (2-部位免疫測定アッセイ):
. 比較は、実施例2に記載の条件下で得た健康なヒト及びCJD(タイプ1、2、3及び4)に罹患しているヒト由来の脳の10%のホモジネートを用いて行う。
. 試料の処理:
A: 10% サルコシル + 10% Triton + 2M ユレア + 30 μg/ml プロテイナーゼK、10分
B: 10% サルコシル + 10% Triton + 2M ユレア + 180 μg/ml プロテイナーゼK、10分
C: 10% サルコシル + 30 μg/ml プロテイナーゼK、10分
D: 10% サルコシル+ 60 μg/ml プロテイナーゼK、10分
E: 10% サルコシル + 180 μg/ml プロテイナーゼK、10分
F: 10% サルコシル + 360 μg/ml プロテイナーゼK、10分
【００４８】
. 検出
ウエスタンブロッティング(図13) によれば: 抗体Saf37 及びSaf70 (実施例 1参照);
免疫測定分析(図14)によれば: Saf37での捕捉及びPrPの94-230領域に対する抗体での顕在化
- 図15 (ウエスタンブロッティング) 及び16 (免疫測定分析)
. 比較は、実施例2に記載の条件下で得た健康なヒト及びCJD(タイプ1、2、3及び4)に罹患しているヒト由来の脳の10%のホモジネートを用いて行う。
. 試料の処理:
図15: プロテイナーゼK(150 μg/ml)、10分での消化
図16: 10% サルコシル + 2M ユレア + プロテイナーゼK(30〜360 μg/ml)、10分
【００４９】
. 検出
ウエスタンブロッティング(図15)によれば:抗体Saf37とPrPの94-230領域に対する抗体(実施例1参照);
免疫測定分析によれば(図16): Saf37 での捕捉及びPrPの94-230領域に対する抗体での顕在化
得られた結果は、PK用量の増加が、種々のタイプのCJDにおいてオクタペプチドモチーフ反復領域の示差感度を示し得ることを明らかにした。これらの条件下、タイプ1〜4には有意な相違は存在しない;同用量のPKで界面活性剤及びカオトロピック剤の組成を変えると(E、図13 及び14)、タイプ4ではオクタペプチドを破壊できると同時に、タイプ1ではペプチドを保存できる。
加えて、図16は、PK用量の作用(function)として、種々の株から得られるPrPs-resの同じ緩衝液に対する感度上の相違を示すことができる。
さらに、図15は、PKでのホモジネートの直接処理が、分解に対して感度が別タイプのPrP-resを現すことを示している。
【００５０】
実施例 7: SAF形態に精製された消化PrP-resのウエスタンブロッティングによる検出
実施例2による条件下で得られるホモジネートは、以下のように処理する:1時間、20% ホモジネート(500 μl) + 20% NaCl (500 μl) + [20% サルコシル + 2% SB314] (500 μl) + PK (20 μg/ml 最終濃度)。
図17は、結果を例示している:
b 及び d:
レーン1-7:スクレイピー株C506M3の種々の希釈物で得たマウスでの結果(希釈1/20、1/50、1/250、1/500、1/1000 及び 1/2000)。
レーン8: 分子量
レーン9-15: BSE株の種々の希釈物で得たマウスでの結果 (1/1000 〜1/10の希釈)。
BSEシグナルを完全に除くことができる。
【００５１】
a 及び c: 得られた結果は、オクタペプチドモチーフ反復に対する抗体の存在下でシグナルが有意に増加することを確証している。
e: この図は、サルとヒトの双方で、BSEでシグナルが低下することを示している(レーン4 及び7)。
【００５２】
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【００５３】
上記から明らかなように、この発明は、より詳細に記載したにすぎないその実施、調製及び応用の方法には全く限定されない;逆に、この発明は、この発明の関係又は範囲を逸脱しない限り、当業者に行い得る全ての変形を包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒト、ヒツジ、ウシ、マウス及びキヌゲネズミの種々のPrP配列を示す;
【図２】 ウエスタンブロッティングによるPrP-resの検出を示す;
【図３〜６】 オクタペプチドモチーフ反復の有無が2部位免疫測定アッセイによって検出される際の、ヒト(図3及び4)ならびに反芻動物(図5及び6)における、最初に工程(1)又は(a)、次いで工程(b)による種々の条件に相当する、
【図７〜１２】 BSE及びスクレイピーの区別検出における緩衝液の影響を例示する、
【図１３及び１４】 種々のタイプのCJDを検出するための、緩衝液の組成及びプロテイナーゼK(PK)濃度の影響を例示する、
【図１５】 プロテイナーゼKを用いる脳のホモジネートの直接的な消化で得られた結果を示す、
【図１６】 CJDタイプの機能としてのプロテイナーゼKに対するPrP-resの耐性上の相違を示す、
【図１７】 PKで消化され、SAF形態で精製された PrP-resのウエスタンブロッティングによる検出を示す。
Claims (14)
- (１)プリオンを含有すると疑われる生物学的試料を、正常プリオンタンパク質(PrP-sen)は完全に分解するが異常プリオンタンパク質(PrP-res)はその中のP(H/Q)GGG(-/T)WGQ(配列番号１)を含むオクタペプチドモチーフ反復の全て又は幾らかが保持されるように部分的にのみ消化する時間及び条件で、プロテイナーゼＫで処理し；
(２)(１)からの試料を、オクタペプチドモチーフ反復と結合するリガンドと、該リガンドと該オクタペプチドモチーフ反復を含むポリペプチドとの間の複合体形成に十分な時間及び条件で接触させ、
(３)PrP-resの存在を示す前記複合体の形成を検出する
ことからなることを特徴とする、生物学的試料における非通常伝達因子(UTA)株に関連したPrP-resの検出法。 - (ａ)次の工程(１)〜(３)：
(１)プリオンを含有すると疑われる生物学的試料を、正常プリオンタンパク質(PrP-sen)は完全に分解するが異常プリオンタンパク質(PrP-res)はその中のP(H/Q)GGG(-/T)WGQ(配列番号１)を含むオクタペプチドモチーフ反復の全て又は幾らかが保持されるように部分的にのみ消化する時間及び条件で、プロテイナーゼＫで処理し；
(２)(１)からの試料を、オクタペプチドモチーフ反復と結合するリガンドと、該リガンドと該オクタペプチドモチーフ反復を含むポリペプチドとの間の複合体形成に十分な時間及び条件で接触させ、
(３)PrP-resの存在を示す前記複合体の形成を検出する
により、生物学的試料の第一画分においてPrP-resを検出し、次いで：
(ｂ)工程(ａ)でオクタペプチドモチーフ反復/リガンド複合体の存在が検出された各試料について：
− 対象の少なくとも１つのUTA株に関連したPrP-resはオクタペプチドモチーフ反復の全てが分解されるが、その他のUTA株に関連したPrP-resの全てはオクタペプチドモチーフ反復の全て又は幾らかが保持されるように、少なくとも１つのプロテイナーゼＫで該試料の第二画分を処理し；
− 処理された試料の第二画分を、オクタペプチドモチーフ反復を特異的に認識しうるリガンドと接触させ、
− オクタペプチドモチーフ反復/リガンド複合体の有無を検出することからなることを特徴とする、生物学的試料における種々のUTA株に関連したPrP-resの弁別検出法。 - PrP-resの存在が検出されている各生物学的試料について、請求項２に記載の工程(ｂ)を実施し、
− 処理された試料の第二画分を、オクタペプチドモチーフ反復を特異的に認識し得るリガンドと接触させ、
− オクタペプチドモチーフ反復/リガンド複合体の有無を検出することからなることを特徴とする、PrP-resを含むと考えられる生物学的試料における種々のUTA株に関連したPrP-resの弁別検出法。 - 請求項１における工程(１)、請求項２における工程(ａ)中の(１)若しくは工程(ｂ)又は請求項３における工程(ｂ)によるプロテイナーゼＫでの処理が、80℃未満の温度で30秒〜２時間行われることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
- 請求項１における工程(１)又は請求項２における工程(ａ)中の(１)のプロテイナーゼＫでの処理が10〜30分間行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
- 試料が脳組織であり、請求項１における工程(１)又は請求項２における工程(ａ)中の(１)のプロテイナーゼＫでの処理が、10％脳組織ホモジネートについて30〜200μg/mlのプロテイナーゼＫ濃度で37℃で10分で行われることを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
- 請求項１における工程(１)又は請求項２における工程(ａ)中の(１)のプロテイナーゼＫでの処理が、10％ホモジネート試料について10〜70μg/mlのプロテイナーゼＫ濃度で37℃で30分行われることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１つに記載の方法。
- リガンドが、オクタペプチドモチーフ反復の領域に特異的に結合し得るアプタマー及び抗体からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
- 請求項２における工程(ｂ)の処理が、請求項２における工程(ａ)中の(１)で使用した処理条件と同じ条件下で、但し請求項２における工程(ａ)中の(１)で使用したプロテイナーゼＫ濃度より高いプロテイナーゼＫ濃度で行われることを特徴とする請求項２、請求項４又は請求項５に記載の方法。
- プロテイナーゼＫが、生物学的試料のホモジネート化緩衝液と、少なくとも１つの界面活性剤及び/又は少なくとも１つのカオトロピック剤及び/又は少なくとも１つの塩のうちの少なくとも１つの剤を含む緩衝液とからなる群から選択される緩衝液に溶解されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
- 緩衝液が、
ａ．− アニオン性界面活性剤、例えばSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、サルコシル(ラウロイルサルコシン)、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム又はタウロコール酸ナトリウム；
− 両性イオン性界面活性剤、例えばSB 3-10(デシルスルホベタイン)、SB 3-12(ドデシルスルホベタイン)、SB 3-14、SB 3-16(ヘキサデシルスルホベタイン)、CHAPS及びデオキシ-CHAPS；
− ノニオン性界面活性剤、例えばC12E8(ドデシル-オクタエチレングリコール)、Triton X100、Triton X114、Tween 20、Tween 80、MEGA 9(ノナノイルメチルグルカミン)、オクチルグルコシド、LDAO(ドデシルジメチルアミンオキシド)又はNP40、又は
− 界面活性剤混合物、例えばイオン性界面活性剤とノニオン性界面活性剤の混合物、２つのイオン性界面活性剤の混合物又はイオン性界面活性剤と両性界面活性剤の混合物からなる群から選択される、少なくとも１つの界面活性剤、及び/又は
ｂ．ウレア及びグアニジン、又はその混合物からなる群から選択される少なくとも１つのカオトロピック剤、及び/又は
ｃ．アルカリ金属であってもよく、又はそうでなくともよい金属塩から選択される少なくとも１つの塩
を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。 - 緩衝液が、少なくとも５％のアニオン性界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
- アニオン性界面活性剤が任意にSDSと組み合わされたサルコシルであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
- 上記の少なくとも１つの界面活性剤及び/又は少なくとも１つのカオトロピック剤及び/又は少なくとも１つの塩、プロテイナーゼＫ及びオクタペプチドモチーフ反復と結合するリガンドの組合せからなることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか１つに記載の方法を実施するための診断キット。
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