ES2280263T3 - Procedimiento de diagnostico de una encefalopatia subaguda esponjiforme transmisible (esst) provocada por una cepa de atnc en una muestra biologica. - Google Patents
Procedimiento de diagnostico de una encefalopatia subaguda esponjiforme transmisible (esst) provocada por una cepa de atnc en una muestra biologica. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de diagnóstico de una ESST o enfermedad de priones provocada por una cepa de ATNC mediante detección de la PrPres en una muestra biológica, caracterizado porque comprende: (1) el tratamiento de dicha muestra con al menos una proteinasa K, bien sea con una concentración comprendida entre 30 µg/ml y 200 µg/ml durante 10 minutos a 37ºC para un homogeneizado al 10%, bien sea durante un periodo y a una concentración equivalentes a la concentración comprendida entre 30 µg/ml y 200 µg/ml en las condiciones antes citadas y de modo todavía más preferido durante 10 minutos a una concentración comprendida entre 30 µg/ml y 200 µg/ml para un homogeneizado al 10% o durante 30 minutos a una concentración comprendida entre 10 µg/ml y 70 µg/mL, para un homogeneizado al 10%, poniéndose dicha proteinasa K en solución en una solución tampón selecciona en el grupo constituido por las soluciones tampones de homogeneización de la muestra biológica y soluciones tampones que comprenden al menos uno delos agentes siguientes: al menos un agente tensioactivo y/o al menos un agente caotropo y/o al menos una sal, de modo que se degrade completamente la PrPsens, conservando la totalidad o parte de los motivos octa-péptido repetidos de la PrPres, cualquiera que sea la cepa de ATNC (2) la puesta en contacto de dicha muestra tratada con un ligando de dichos motivos octa-péptido y (3) la detección de la presencia ocasional del complejo de motivos octa-péptido repetidos-ligando.
Description
Procedimiento de diagnóstico de una
encefalopatía subaguda esponjiforme transmisible (ESST) provocada
por una cepa de ATNC en una muestra biológica.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de diagnóstico de una encefalopatía subaguda
esponjiforme transmisible (ESST) provocada por una cepa de ATNC en
una muestra biológica mediante detección de la PrPres así como a su
utilización dentro del marco de un diagnóstico diferencial de las
diferentes cepas de ATNC en una muestra biológica.
Las encefalopatías subagudas esponjiformes
transmisibles (ESST) son provocadas por agentes transmisibles no
convencionales (ATNC), también denominados priones, cuya naturaleza
precisa queda impugnada en esta fecha. Las encefalopatías ESST
comprende esencialmente la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob, en el hombre (MCJ o CJD para la
enfermedad de Creutzfeldt-Jakob), la tembladera
(scrapie) en la oveja y la cabra y la encefalopatía
esponjiforme bobina (ESB o BSE para la encefalopatía esponjiforme
bobina) en los bovinos; otras encefalopatías se pusieron en
evidencia en los félidos, como en el caso del visón o algunos
animales salvajes, tales como el cerebro o el
alce.
alce.
Estas enfermedades son de evolución
constantemente fatal, y no existe, en el momento actual, ningún
tratamiento eficaz.
En las encefalopatías ESST existe una
acumulación de una proteína huésped, la PrP (o proteína del prion),
bajo una forma anormal (PrPres), principalmente en el sistema
nervioso central; la PrPres copurifica con la infecciosidad y su
acumulación precede a la aparición de las lesiones histológicas.
In vitro, es tóxica para cultivos de neuronas.
Las dos isoformas de la PrP presentan la misma
secuencia de aminoácidos (ver Figura 1), pero son diferentes en su
estructura secundaria: la PrPres presenta un contenido
significativamente más elevado en hojas \beta plisadas, mientras
que la PrP normal (PrPsens) presenta un mayor número de hélices
\alpha.
Dos propiedades bioquímicas permiten, en
general, distinguir estas dos isoformas:
- la PrPres es parcialmente resistente a las
proteasas, en particular a la proteinasa K (PK), que trae consigo
una separación de su extremidad N-terminal. Después
de la acción de la PK, la PrPres es frecuentemente denominada
Prp27-30 a causa del peso molecular aparente de la
forma biglicosilada; se admite, en general, que el emplazamiento de
separación de la PrPres se sitúa entre los amimoácidos 89 y 90
(Prusiner et al, Cell 1984) para las cepas
habituales
habituales
- la PrPres es insoluble en los detergentes no
iónicos, tales como el Triton X100 o el Triton 114.
La forma normal de la proteína del prión
(PrPsens) es, en principio, completamente degradada por las
proteasas y es perfectamente soluble en presencia de detergentes no
iónicos.
Las secuencias peptídicas de PrPsens del
hámster, seres humanos, bovinos y ovinos están representadas en la
Figura 1; permiten, en particular, un motivo
octa-péptido (P (H/Q) GGG (-/T) WGQ), repetido 4 o
5 veces, según las especies. Este motivo
octa-péptido repetido corresponde a los aminoácidos
51-91 de la PrP (numeración de la secuencia de la
PrP humana) (B. Oesch et al, 1991).
Para detectar la presencia del agente
infeccioso, los procedimientos más recientes están fundados en una
detección selectiva de la PrP anormal (Prpsens), ligada al agente
infeccioso, beneficiándose de su resistencia parcial a las
proteasas.
Se puede distinguir:
- los procedimientos de
Western-blot que se basan en la detección
inmunológica de la PrPres en un extracto de tejidos, después del
tratamiento del extracto por una proteasa de forma que se destruya
la isoforma nomal de la PrP (PrPsens), separación de las proteínas
del extracto por electroforesis, transferencia en una membrana de
polímero y detección por un anticuerpo específico que reconoce la
PrP (Schaller O. Et al 1999).
- los ensayos de tipo ELISA, que hacen
igualmente intervenir un tratamiento de los extractos de tejidos por
una proteasa.
Entre estos diferentes ensayos, que hacen
intervenir un tratamiento de los extractos de tejidos por una
proteasa, se puede citar:
- el descrito por Serban et al
(Neurology, 1990, 40, 110) que han desarrollado un ensayo de
detección de la PrPres que incluye la inmovilización de las
proteínas en una membrana de nitrocelulosa, seguida por una
digestión proteásica, por una desnaturalización y por una
inmunodetección con anticuerpos monoclonales.
- el descrito por Oesch et al
(Biochemistry, 1994, 33, 5926-5931) que han
propuesto, para cuantificar la cantidad de PrPres, un ensayo de
inmunofiltración para la purificación de la PrPres (ELIFA o ensayo
de inmunofiltración ligada a las enzimas).
- el descrito por Gratwohl et al, 1997,
que propone una dosificación de tipo ELISA. Después del tratamiento
de las muestras con la proteinasa K y la purificación de la PrPres
por centrifugación, es absorbida sobre placas de microtrituración y
detectadas con la ayuda de anticuerpos policlonales de conejo.
- el descrito por Safar et al, 1998, que
no utiliza la proteinasa K y compara la inmunoreactividad de la
PrPres inmovilizada sobre un soporte sólido según que se haya
sometido o no a un tratamiento desnaturalizante.
De manera general, estos diferentes ensayos
presentan el inconveniente de falta de sensibilidad y por lo tanto,
de arrastrar falsos negativos.
Otros métodos proponen tratamientos de la
muestra por productos desnaturalizantes (Oesch et al, 1994 y
1999, WO 00/22438, The Regents of the University of California), un
tratamiento limitado a la proteinasa K (WO 00/29850, Wallac Oy
et al) o un tratamiento por un ametalopeptidasa (WO
00/22438) que hacen accesibles lugares antigénicos ocultos,
detectables por el anticuerpo monoclonal 3F4 que reconoce la región
109-102 de la PrP (WO 00/29850 o WO 00/22438).
El método, descrito en el documento WO
00/29850, Wallac Oy et al, presenta el importante
inconveniente de carecer de especificidad, en razón, en particular,
de una eliminación incompleta de la PrPsens, en las condiciones de
tratamiento recomendadas, mientras que el método descrito en el
documento WO 00/22438, The Regents of the University of California
carece de sensibilidad, en razón de la utilización del anticuerpo de
detección 3F4 (WO 00/22438), que solamente está ligado por un solo
motivo en la proteína.
El solicitante ha propuesto recientemente una
prueba para la detección cuantitativa de la PrPres, que comprende
una etapa de purificación que conduce a una detección
significativamente más sensible y que representa un gran avance para
la vigilancia sanitaria y la dosificación de la PrPres en los
mataderos. Este procedimiento es descrito, en particular, en la
solicitud de patente internacional PCT WO 99/41280 y en un informe
preliminar de la Dirección General XXIV de la Comisión Europa
(Política de los consumidores y protección de su salud;
http://europa.eu.int/comm/dg24/health/).
Sin embargo, habida cuenta de la necesidad de
disponer de una prueba de diagnóstico de los ESST particularmente
fiable, el solicitante ha proseguido sus trabajos.
En particular, ha establecido que para la
obtención de una prueba de detección:
(i) sensible, es decir que tenga la capacidad
para identificar correctamente los animales no infectados;
(ii) específica, es decir que tenga la capacidad
para identificar correctamente los animales infectados que presentan
síntomas clínicos;
(iii) que presente un límite de detección lo más
bajo posible, es decir adecuado para permitir la detección de las
pequeñas cantidades de PrPres (detección de la PrPres antes de la
aparición de los síntomas clínicos) y
(iv) reproducible.
El tratamiento de la muestra biológica a
analizar se debe realizar en condiciones que permitan conservar la
totalidad o parte de los motivos octa-péptido
exclusivamente en la PrPres.
Se ha encontrado, en particular, que para
responder efectivamente a las cuatro condiciones (i)-(iv) antes
enunciada, hay que definir condiciones de tratamiento de la muestra
a analizar precisas que elimine totalmente la PrPsens de la muestra,
permitiendo una captura específica de la PrPres en las condiciones
definidas.
La presente invención tiene por objeto un
procedimiento de diagnóstico (procedimiento A) de una ESST o
enfermedad de priones provocada por una cepa de ATNC por detección
de la PrPres en una muestra biológica, caracterizado porque
comprende:
(1) el tratamiento de dicha muestra con al menos
una proteinasa K, bien sea con una concentración comprendida entre
30 \mug/ml y 200 \mug/ml durante 10 minutos a 37ºC para un
homogeneizado al 10%, bien sea durante un periodo y a una
concentración equivalentes a la concentración comprendida entre 30
\mug/ml y 200 \mug/ml en las condiciones antes citadas y de modo
todavía más preferido durante 10 minutos a una concentración
comprendida entre 30 \mug/ml y 200 \mug/ml para un homogeneizado
al 10% o durante 30 minutos a una concentración comprendida entre 10
\mug/ml y 70 \mug/mL, para un homogeneizado al 10%, poniéndose
dicha proteinasa K en solución en una solución tampón selecciona en
el grupo constituido por las soluciones tampones de homogeneización
de la muestra biológica y soluciones tampones que comprenden al
menos uno de los agentes siguientes: al menos un agente tensioactivo
y/o al menos un agente caotropo y/o al menos una sal, de modo que se
degrade completamente la PrPsens, conservando la totalidad o parte
de los motivos octa-péptido repetidos de la PrPres,
cualquiera que sea la cepa de ATNC
(2) la puesta en contacto de dicha muestra
tratada con un ligando de dichos motivos
octa-péptido y
(3) la detección de la presencia ocasional del
complejo de motivos octa-péptido
repetidos-ligando.
Hay que tener en cuenta que un cierto número de
parámetros están estrechamente ligados entre sí: la concentración en
proteinasa K depende directamente de la duración del tratamiento
(tiempo de incubación) de la muestra. Se puede considerar que a 37ºC
por ejemplo, una incubación de 10 minutos con un PK a una
concentración comprendida entre 30 y 200 \mug/ml de homogeneizado
al 10% es equivalente a una incubación de 30 minutos con una PK con
una concentración comprendida entre 10 \mug/ml t 70 \mug/ml de
homogeneizado al 10%. Por ejemplo, una incubación durante 30 minutos
con una PK a 25 \mug/ml es equivalente a una incubación de 10
minutos con una PK a una concentración de 75 \mug/ml.
Cualquiera que sea la concentración en PK y la
duración de incubación, la muestra tratada no debe contener PrPsens
no degradada, mientras que la PrPres, ocasionalmente presente, ha
conservado la totalidad o parte de los motivos
octa-péptido.
Otros parámetros pueden intervenir en menor
grado (es decir, de modo no esencial), en el establecimiento de la
concentración activa de PK: se trata, en particular, de la solución
tampón en la cual dicha PK está puesta en solución; cuando la PK se
pone en la solución tampón de homogeneización de la muestra, según
la solución tampón de homogeneización utilizada, la concentración
mínima en PK podrá variar, dentro de la horquilla de concentraciones
precisadas con anterioridad:
- en una solución tampón glucosada o en la de
guanidida (o una de sus sales), la concentración mínima en PK es,
preferentemente, de 25 \mug/ml (incubación de 30 minutos) o de 75
\mug/ml (incubación de 10 minutos).
- en una solución tampón PBS, la concentración
mínima en PK es, preferentemente, de 50 \mug/ml (incubación de 30
minutos) o de 150 \mug/ml (incubación de 10 minutos).
De forma ventajosa, la PK puede ponerse en
práctica en una solución tampón diferente de la de homogeneización;
tal solución tampón comprende, en una forma de realización
preferida, al menos un agente tensioactivo y/o al menos un agente
caotropo y/o al menos una sala.
Igualmente de forma ventajosa, después del
tratamiento (o la incubación) de la muestra con la proteinasa K, la
suspensión obtenida es ventajosamente tratada en las condiciones
definidas en la solicitud de patente internacional 99/41280, a
saber:
- adición a dicha suspensión de una solución
tampón B, tal como se define en esta solicitud de patente
internacional 99/41280 y en particular, los alcoholes en
C_{3}-C_{6} y las mezclas de alcohol, cuya
constante dieléctrica teórica médica está comprendida entre 10 y
25
- la centrifugación de la suspensión obtenida
y
- la solubilización del residuo en una solución
tampón que comprende al menos un agente tensioactivo y/o un agente
caotropo, en las condiciones definidas en dicha solicitud de patente
internacional 99/41280.
Una tal prueba tiene la ventaja de ser
particularmente adaptada al diagnóstico diferencial de las ESST en
un mismo huésped, provocadas por diferentes cepas de ATNC y en
particular, adaptada al diagnóstico diferencial de las cepas de ESB
con respecto a las cepas habituales de tembladera en la oveja.
Por ejemplo, se ha demostrado que la cepa ESB ha
infectado a seres humanos en Gran Bretaña por el análisis de los
perfiles electroforéticos de la PrPres que ha mostrado diferencias
de migración en función de las cepas de ATNC; un perfil
característico (tipo 4) se ha encontrado en los pacientes que
desarrollan una nueva variante de la enfermedad de Creutzfeldt -
Jakob (vMCJ) que parece ligada al paso a la alimentación humana de
bovinos infectados por el agente de ESB (Colligne et al,
Nature, 1996). Un perfil similar fue observado en el caso de un
macaco infectado por el agente de ESB (Lasmezas et al, 1996)
y un gato verdaderamente contaminado por este agente (Priola et
al, Nature Med., 1996).
Sin embargo, se trata de un método largo y
delicado para poner en práctica si se quieren obtener resultados
reproducibles, lo que constituye realmente un elemento de
controversia que existe con respecto a la clasificación de los
diferentes tipos de PrPres y la utilización de este método (Parchi
et al, Nature, 1997).
Existe igualmente una fuerte sospecha de
contaminación de las ovejas por el agente del ESB (Butler, Nature,
1998). Estos animales son, en efecto, sensibles a este agente,
mientras que existe en los ovinos una enfermedad endémica, la
tembladera (scrapie para los anglosajones), otra ESST, que presenta
características clínicas e histológicas próximas y no
diferenciables. El único método de referencia para un diagnóstico
diferencial entre el agente del ESB y de la tembladera, es la
inoculación en el ratón y el estudio del perfil lesional, lo que
necesita aproximadamente dos años de espera y que fue realizado en
Gran Bretaña más que en 9 ovejas para una población de varias
decenas de millones de cabezas.
Se efectuaron primeros ensayos para tratar de
distinguir las diferentes cepas de ATNC en una muestra; Kuczius T,
et al 1999 han considerado que las variaciones observadas
entre las diferentes cepas de ESST (scrapie, ESB y CJD) mediante la
técnica del glicotipage no permite distinguir cada cepa; han
seleccionado otros marcadores bioquímicos y biológicos de la PrPres
que permiten distinguir mejor entre ellas las diferentes cepas de
priones. Los parámetros de análisis que han utilizado son los
siguientes: resistencia a largo plazo a la proteinasa K, masa
molecular de la PrPres, topología y cantidad de los depósitos de
PrPres. Los resultados obtenidos demuestran que las PrPres de
diferentes cepas de ESB y de scrapie presentan diferencias
significativas en su resistencia a largo plazo a la proteinasa K.
Según la cepa de scrapie, la resistencia a la PK varía:
pequeña resistencia: cepa Chandler; resistencia intermedia: cepa
22A; estabilidad relativa: cepa 87V. en las mismas condiciones, las
cepas de ESB presentan una resistencia intermedia, mientras que el
glicotipage no permite distinguir entre la cepa de scrapie
87V y las cepas de ESB, siendo estos dos tipos de cepas claramente
distinguibles después del tratamiento a largo plazo con la PK. Sin
embargo, no se trata de protocolos suficientemente fiables y
utilizables a gran escala y sobre el terreno.
Dentro de este contexto, es importe disponer de
un método de detección de las PrPres fiable, sensible, que permita
un diagnóstico diferencial, poco costoso y fácil de poner en
práctica, a partir de una muestra biológica, tal como una muestra
tisular.
La presente invención tiene, en consecuencia,
igualmente por objeto un procedimiento de diagnóstico diferencial
(procedimiento B) de las ESST provocadas por cepas de ATNC, en una
muestra biológica mediante detección de las PrPres asociadas a las
diferentes cepas de ATNC, caracterizado porque comprende:
(a) la detección de la PrPres de una cepa de
ATNC en una primera fracción de dicha muestra, de conformidad con
las etapas (1) a (3) siguientes:
- (1)
- el tratamiento de dicha muestra con al menos una proteinasa K, de modo que degrade completamente la PrPsens, conservando la totalidad o parte de los motivos octa-péptido repetidos de la PrPres, cualquiera que sea la cepa de ATNC
- (2)
- la puesta en contacto de dicha muestra tratada con un ligando de dichos motivos octa-péptidos y
- (3)
- la detección de la presencia ocasional del complejo de motivos octa-péptido repetidos-ligando y luego:
(b) para cada muestra para la cual se detecta en
la etapa (a) la presencia de un completo de motivos
octa-péptido repetidos-ligando:
- -
- el tratamiento de una segunda fracción de dicha muestra con al menos una proteinasa K, de modo que la mayoría de los motivos octa-péptido repetidos sean eliminados para la PrPres asociada a por lo menos una cepa de interés, en particular la cepa de ESB y donde el conjunto de las PrPres asociadas a las demás cepas de ATNC conservan la totalidad o parte de dichos motivos octa-péptido repetidos
- -
- la puesta en contacto de dicha segunda fracción de dicha muestra tratada, con un ligando de dichos motivos octa-péptido repetidos y
- -
- la detección de la presencia ocasional del complejo de motivos octa-péptido repetidos-ligando
La presente invención tiene, además, por objeto
un procedimiento de diagnóstico diferencial (variante del
procedimiento B) de las ESST provocadas por cepas de ATNC en una
muestra biológica considerada como que contiene la PrPres (prueba de
detección efectuada por cualquier método), caracterizado porque
comprende, para cada muestra para la cual fue detectada la presencia
de una PrPres, la puesta en práctica de la etapa (b) tal como se
definió con anterioridad.
- la puesta en contacto de dicha segunda
fracción de dicha muestra tratada con un ligando de dichos motivos
octa-péptido repetidos y
- la detección de la presencia ocasional del
complejo de motivos octa-péptido
repetidos-ligando.
Según un modo de puesta en práctica ventajosa de
dicho procedimiento, el tratamiento con dicha proteinasa K según la
etapa (a) o (b) se realiza durante 30 segundos a 2 horas, a una
temperatura inferior a 80ºC, preferentemente entre 10 minutos y 30
minutos.
Según una disposición ventajosa de este modo de
puesta en práctica, el tratamiento con dicha proteinasa K se realiza
a una concentración comprendida entre 30 \mug/ml y 200 \mug/ml
durante 10 minutos a 37ºC para un homogenizado al 10%, o durante un
periodo y a una concentración equivalentes a la concentración
comprendida entre 30 \mug/ml y 200 \mug/ml en las condiciones
antes citadas y de modo todavía más preferido, durante 10 minutos a
una concentración comprendida entre 10 \mug/ml y 70 \mug/ml para
un homogeneizado al 10%.
Según otro modo de puesta en práctica ventajosa
de dicho procedimiento, la proteinasa K se pone en solución en una
solución tampón seleccionada dentro del grupo constituidos por las
soluciones tampones de homogeneización de la muestra biológica y de
las soluciones tampones que comprenden al menos uno de los agentes
siguientes: al menos un agente tensioactivo y/o al menos un agente
caotropo y/o al menos una sal.
Dentro del marco del diagnóstico diferencial
(procedimiento B), además de la concentración en PK, otras
condiciones pueden intervenir ocasionalmente sobre la degradación de
los motivos octa-péptido, en función de la cepa: en
efecto, cuando la PK se pone en práctica en una solución tampón
diferente de la solicitud de homogeneización, tal como en una
solución tampón que comprende, en una forma de realización
ventajosa, al menos un agente tensioactivo y/o al menos un agente
caotropo y/o al menos una sal, el número de motivos
octa-péptido degradados puede variar en función de
la composición de dicha solución tampón y de la concentración de los
diferentes agentes.
Se entiende por cepa de interés, la o las cepas
de ATNC, la cepa de ESB en particular, para las cuales se desea
eliminar los motivos octa-péptido repetidos, por
ejemplo.
Una de las características principales de los
procedimientos A y B es considerar las diferentes condiciones en las
cuales se realiza el tratamiento proteásico de forma que se controle
la degradación de los motivos octa-péptido
repetidos. Según el uso considerado, se realizará de modo que estos
motivos sean conservados (procedimiento A) o destruidos
(procedimiento B):
- dentro del marco del procedimiento A, este
control considerará la posibilidad de que la totalidad o parte de
los motivos octa-péptido repetidos sean conservados
con el objeto de favorecer una detección muy sensible de la
PrPres.
- dentro del marco del procedimiento B, el
control de la degradación por la proteasa tendrá como objeto que la
mayoría, y ocasionalmente la totalidad, de los motivos
octa-péptido repetidos sean degradados para la
PrPres correspondiente a las cepas de interés, cualquiera que sea la
especie en la cual esté expresada, en condiciones en las que la
totalidad o parte de los motivos octa-péptido
repetidos sean conservados para las PrPres correspondientes a todas
las demás cepas de ESST. En este caso, el interés de la invención es
permitir un diagnóstico diferencial de la cepa de interés con
respecto a otras cepas de ATNC.
En efecto:
De manera sorprendente, en las condiciones según
la etapa (1) o la etapa (a), la PK no trae consigo la discrepancia
de la totalidad o parte de los motivos octa-péptido
repetidos, de las PrPres asociadas a todas las cepas de ATNC o
priones, mientras que las condiciones de la etapa (b) traen consigo
la discrepancia de los motivos octa-péptido
repetidos de la PrPres asociada a la cepa de interés, mientras que
el conjunto de las PrPres asociadas a las demás cepas de ATNC
conservan la totalidad o parte de dichos motivos
octa-péptido repetidos.
Asimismo, de forma sorprendente, un tal ensayo,
en particular cuando el ligando es un anticuerpo, presenta las
ventajas siguientes:
- una gran sensibilidad de detección puesto que
los anticuerpos dirigidos contra estos motivos
octa-péptido repetidos tienen una mucho mayor
afinidad que los anticuerpos dirigidos contra otras zonas de la
PrPres 27-30 y son más resistentes a las soluciones
tampones utilizadas; en efecto, el reconocimiento de un motivo
repetido favorece las interacciones de alta afinidad y ofrece la
posibilidad de fijar varias moléculas de anticuerpo en una sola
molécula de PrP;
- la posibilidad de un diagnóstico diferencial
de las cepas de ATNC o priones, puesto que es posible, según las
condiciones puestas en práctica, obtener, o no, la digestión de
estos motivos; en particular, es posible eliminarlos para todas las
enfermedades ligadas a la cepa de interés, el agente de ESB por
ejemplo, mientras que es posible conservarla para las demás
enfermedades denominadas de priones. En consecuencia, los métodos
según la invención proponen una prueba simple de diagnóstico
diferencial de ESB y/o de otra cepa de interés con respecto a las
demás cepas poniendo en práctica dos condiciones diferentes etapa
(1) o (a) y etapa (b)), las condiciones de la etapa (1) o (a)
(conservando los motivos octa-péptido repetidos de
las PrPres asociadas al conjunto de cepas de ATNC) que permiten la
detección de todas las cepas y las condiciones de la etapa (b)
(eliminando estos motivos únicamente en la PrPres asociada a una
cepa de interés) que solamente revela las demás cepas.
Por lo tanto, dichas pruebas encuentran, en
particular, aplicación en la investigación de la contaminación de
la oveja por la cepa de ESB que no se sabe habitualmente distinguir
de las cepas clásicas de tembladera (scrapie).
Según un modo de puesta en práctica ventajoso de
dichos procedimientos, la PK se pone en la solución tampón que
comprende, preferentemente:
a. al menos un agente tensioactivo
seleccionado dentro del grupo constituido por:
- tensioactivos aniónicos, tales como el SDS
(dodecilsulfato de sodio), el sarkosilo
(lauroil-sarcosina), el colato de sodio, el
desoxicolato de sodio, el taurocolato de sodio;
- tensioactivos zwitteriónicos, tales como el SB
3-10 (decil-sulfobetaina), el SB
3-12 (dodecil-sulfobetaína), el SB
3-14, el SB 3-16
(hexadecil-sulfobetaína), el CHAPS y el
desoxiCHAPS,
- tensioactivos no iónicos, tales como el C12E8
(dodecil-octa-etilenoglicol), el
Triton ® X100, el Triton ® X114, el Tween ® 20, el Tween ® 80, el
MEGA 9 (nonanoil-metilglucamina), el octiglucósido,
el LDAO (dodecil-dimetilamina óxido) o el NP40 o
- mezclas de tensioactivos tales como una mezcla
de un agente tensioactivo iónico y de un agente tensioactivo no
iónico, una mezcla de dos agentes tensioactivos iónicos o una
mezcla de un agente tensioactivo iónico y de un agente tensioactivo
zwitteriónico y/o
b. al menos un agente chaotrope
seleccionado dentro del grupo constituido por la urea y la guanidina
o una mezcla de ellas y/o
c al menos una sal seleccionada entre las sales
de metales alcalinos o no.
Según una disposición ventajosa de este modo de
puesta en práctica, dicha solución tampón comprende al menos un 5%
de tensioactivo aniónico, preferentemente de sarkosilo,
ocasionalmente asociado al SDS.
Según otro modo de puesta en práctica ventajoso
de dichos procedimientos, el ligando se selecciona dentro del grupo
constituido por aptáremos y anticuerpos que se ligan a la zona de
los motivos octa-péptido repetidos.
Según otro modo de puesta en práctica ventajoso
de dichos procedimientos, el tratamiento de la etapa (b) se realiza
en las mismas condiciones que las definidas en la etapa (a) (1),
pero a una concentración en PK superior a la utilizada en la etapa
(a) (1).
La presente invención tiene, además, por objeto
un dispositivo de diagnóstico para la puesta en práctica de los
procedimientos según la invención, caracterizado porque comprende,
en asociación, al menos un agente tensioactivo y/o al menos un
agente caotropo y/o al menos una sal y una proteasa, tales como se
definieron antes.
El complejo de motivos
octa-péptido repetidos-anticuerpo
(en el caso de que el ligando sea un anticuerpo) es detectado por
métodos inmunológicos estándar.
Además de las disposiciones anteriores, la
invención comprende también otras disposiciones, que se deducirán de
la descripción dada a continuación, que se refiere a ejemplos de
aplicación del procedimiento objeto de la presente invención así
como a los dibujos adjuntos, en los cuales:
- la Figura 1 representa las diferentes
secuencias de PrP: humana, ovina, bovina y cricetidiana *;
- la Figura 2 representa la detección de la
PrPres por Western blot;
- las Figuras 3 a 6 corresponden a diferentes
condiciones según la etapa (1) o (a) de una parte y la etapa (b) de
otra parte, en el caso del hombre (Figuras 3 y 4) y en el caso de
los rumiantes (Figuras 5 y 6), en el caso de que la presencia de los
motivos octa-péptido repetidos sea detectada por una
dosis inmunométrica en dos lugares
- las Figuras 7 a 12 ilustran la influencia de
las soluciones tampones en la detección diferencial de la ESB y de
la tembladera
- las Figuras 13 y 14 ilustran la diferencia de
la composición de las soluciones tampones y de la concentración en
proteinasa K (PK) para la detección de los diferentes tipos de
MCJ.
- la Figura 15 ilustra los resultados obtenidos
por una digestión directa de los homogenizados de cerebro por la
proteinasa K
- la Figura 16 ilustra las diferencias de
resistencia de la PrPres a la proteinasa K en función de los tipos
de MCJ
- la Figura 17 ilustra la detección por
Western-blot de PrPres digerida por la PK y
purificada bajo la forma de
SAF.
SAF.
Sin embargo, debe quedar entendido que estos
ejemplos se proporcionan solamente a título ilustrativo del objeto
de la invención, de la que no constituyen, en modo alguno, una
limitación.
\newpage
Un péptido representativo del motivo
octa-péptido repetido de la PrP, por ejemplo el
motivo
G-G-W-G-Q-P-H-G-G-G-W-G-Q-G
(NH2), que corresponde a la secuencia 79-92 de la
PrP humana, fue sintetizado con la ayuda de un sintetizador
automático (Milligen 9050, Waters, Milford, MI). El péptido fue
enlazado, de forma covalente, con la acetilcolinestarasa (AchE) por
intermedio de un reactivo heterobifuncional, el succinimidil
4-(N-maleimidometil)
ciclohexano-1-carboxilato (SMCC,
Calbiochem, Francia), según se describió anteriormente para otros
péptido o proteínas (McLaughlin et al 1987, Grassi et
al 1989). Este método implica la reacción de un agrupamiento de
tiol introducido en el péptido con la función maleimida que fue
fijada en el AchE por reacción con el SMCC. El agrupamiento tiol fue
introducido en el péptido por reacción con el
N-succinimidil-S-acetiltioacetato
(SATA) como se describió anteriormente (McLaughlin, et al,
1987). El enlace fue obtenido haciendo reaccionar el
AchE-SMCC con un exceso de péptido tiolado.
\vskip1.000000\baselineskip
Una preparación de
"Scrapie-associated fibrils" (SAFs, preparación
de PrPres) fue obtenida a partir de cerebros de hámster infectados
(cepa de tembladera 263K) según se describió anteriormente (Lasmezas
et al 1997). Esta preparación fue inactivada por tratamiento
con el ácido fórmico antes de la inmunización de los ratones.
Ratones invalidados (knock-out) para el gen de la
PrP (ratón PrP ^{0/00}) fueron inmunizados en estas preparaciones
de SAF y células de hibridoma fueron preparadas según se describió
anteriormente (Grassi et al, 1988, 1989). El cribado de los
sobrenadantes de cultivo fue realizado como se describió
anteriormente. 57 hibridomas han podido ser identificados y
estabilizados; son denominados SAF-1 a
SAF-90. Todos estos anticuerpos se ha demostrado que
reconocen los SAFs inmovilizados en las placas de microtrituración,
mientras que una minoría de ellos han de mostrado una capacidad para
reconocer conjugados péptido-AchE. Entre estos
últimos, 7 de ellos reconocen claramente el motivo
octa-péptido repetido (péptido
79-92); se trata de los anticuerpos
SAF-15, SAF-31,
SAF-32, SAF-33,
SAF-34, SAF-35 y
SAF-37. La lista de los anticuerpos obtenidos, así
como sus principales características son presentadas en el cuadro
siguiente. Después del clonado y expansión bajo la forma de líquido
de ascita, los anticuerpos monoclonales fueron purificados mediante
cromatografía de afinidad en columna de proteína
A-SEPHAROSE® y conservados a -20ºC hasta su
utilización. El isotipo de los anticuerpos fue determinado por
inmunodifusión radial según la técnica de Ouchterlony.
\vskip1.000000\baselineskip
La presencia de anticuerpo específico de la PrP
en los sobrenadantes de cultivo de hibridoma fue puesto en evidencia
de dos formas, probando su capacidad para ligar conjugados
péptido-AchE o SAFs hámster. En el primer caso, el
cribado fue realizado en placas conteniendo un anticuerpo
anti-IgG de ratón inmovilizado según se describió
anteriormente (Créminon et al 1993, Frobert et al
1991). En resumen, 100 \mul de sobrenadantes de cultivo y 100
\mul de conjugado péptido-AchE fueron puesto a
reaccionar una noche a +4ºC en placas conteniendo anticuerpos de
cabra anti-IgG de ratones inmovilizados. Después del
lavado de las placas, 200 \mul de reactivo de Eilman (Eilman
et al 1961) han sido añadidos en los pozillos con el fin de
detectar la presencia de AchE fijada en la fase sólida. En el
segundo caso, placas conteniendo una preparación de SAF inmovilizada
fueron preparadas accionado reaccionar 50 \mul de una solución
con 20 \mug/ml en una solución tampón de fosfato 0,05 M, pH 7,4,
durante una noche a la temperatura ambiente. Después del lavado, las
placas fueron saturadas con la solución tampón EIA (solución tampón
de fosfato 100 mM, pH 7,4, conteniendo NaCl 150 mM, 0,1% del suero
de albúmina bobina (BSA) y del azoturo de sodio al 0,01%) durante
una noche a +4ºC y fueron conservados a esta temperatura hasta su
utilización. El enlace de los anticuerpos monoclonales en los SAFs
inmovilizados fue puesto en evidencia con la ayuda de anticuerpo de
cabra anti-IgG de ratones marcados en AchE según se
describió anteriormente (Negroni et al 1998).
(i) Preparación de un homogeneizado de tejido, a
partir de las diferentes muestras biológicas
- vaca ESB, scrapie de la oveja, hombre vMCJ
(tipo 4), hombre MCJ esporádico (tipo 1) y controles negativos
correspondientes
Se extrajo 350 mg de cerebro de bovino: se le
tritura y se le homogeniza al 20% (p/v) en una solución de glucosa
al 5%
Para realizar la homogeneización, la extracción
de cerebro (350 mg) y 1,4 mL de solución de glucosa se introducen en
tubos que contienen bolas de cerámica y se agitan fuertemente
(Ribolyser Hybaid).
Se diluye las muestras positivas en un
homogeneizado procedente de cerebros sanos de la especie
correspondiente, como sigue:
- \bullet
- Para la oveja: al 1/100
- \bullet
- Para la vaca: al 1/50
- \bullet
- Para el hombre: tipo 1 o 4: al 1/40; tipo 3: al 1/80; tipo 2 al 1/20
(ii) condiciones de la etapa (1)
Se incuba una fracción (500 \mul) de
homogeneizado al 20% obtenido en (i) con 500 \mul de una solución
tampón que comprende sarkosilo al 10% (SK 10) del Triton ® X100 al
10% (T10), de la urea 2 M (U2) y de la proteinasa K (PK) a 60
\mug/ml de solución tampón (PK 1) durante 10 minutos a 37ºC
(correspondiente a 30 \mug/ml final para un homogeneizado al
10%).
En las Figuras 3 a 6, PK 3 corresponde a una
concentración en PK de 180 \mug/ml de solución tampón y PK 6 que
corresponde a una concentración en PK de 360 \mug/ml de solución
tampón.
(iii) se añade 500 \mul de una solución
tampón constituida por butanol-1 (correspondiente a
las soluciones tampones B, tal como se describen en la solicitud de
patente internacional WO 99/41280); a continuación se centrifuga a
15000 rpm durante 5 minutos (aproximadamente 17 000 g).
(iv) el residuo de centrifugación, que contiene
la PrPres es recuperado en 80-100 \mul de una
solución tampón C, tal como se describe en la solicitud de patente
internacional WO 99/441280, preferentemente una solución tampón de
Laemmli que contiene 4% de SDS y calentada a 100ºC durante 5 minutos
para realizar un Western blot o recuperada, para efectuar una
dosificación inmunométrica sucesivamente en una solución tampón C1
que comprende urea 6 M y sarkosilo 0,5%, seguido de un calentamiento
durante 5 minutos a 100ºC y luego, en una solución tampón C2 que
comprende la guanidina 2 M, seguido por un calentamiento durante 5
minutos a 100ºC.
(v) condiciones de la etapa (b)
Se incuba una segunda fracción (500 \mul) de
homogeneizado al 20% obtenido en (i) con 500 \mul de una solución
tampón que contiene sarkosilo al 5% (SK5), SDS al 5% (SDS 5), urea 1
M (U1) y la proteinasa K (PK) a 360 \mug/ml (PK 6) durante 10
minutos a 37ºC y luego, se realizan las etapas (iii) y (iv)
anteriores.
Las muestras obtenidas se utilizan para realizar
una electroforesis SDS-PAGE y se transfieren sobre
membrana de nitrocelulosa en las condiciones expuestas en el ejemplo
1 y en el ejemplo 3 de la solicitud de patente internacional WO
99/41280 antes citada.
La inmunodetección de la PrPres se realiza con
los anticuerpos monoclonales SAF 70 y SAF 37 tales como los
descritos en el ejemplo 1 anterior y la presencia de los IG de cabra
anti-conejo conjugadas con la peroxidada (1/2500).
La inmunoreactividad se detecta por quimioluminiscencia (ECL.
Amlersham), cuantificada y visualizada en películas
autoradiográficas, según se ilustra en la Figura 2.
En esta Figura:
*las pistas 1-5 corresponden a
condiciones según la etapa (1) o (a) (Sk10 + T10 + U2 + PK 1):
- Pista 1: control negativo
- Pista 2: vaca ESB
- Pista 3: oveja scrapie
- Pista 4: hombre vMCJ (tipo 4)
- Pista 5: hombre MCJ (tipo 1) y
\newpage
*Las pistas 6 a 10 corresponden a condiciones
según la etapa (b) (SK 10 + SDS 5 + U1 + PK 6):
- Pista 1: control negativo
- Pista 2: vaca ESB
- Pista 3: oveja scrapie
- Pista 4: hombre vMCJ (tipo 4)
- Pista 5: hombre MCJ (tipo 1) y
Los resultados obtenidos demuestran que:
- en la etapa (1) o (a) (pistas 1 a 5), la
PrPsens es sistemáticamente destruida, mientras que la señal
obtenida con la PrPres es sistemáticamente superior, con el
anticuerpo dirigido contra los motivos octa-péptido
repetidos, a la señal obtenida en las mismas muestras con un
anticuerpo dirigido contra la zona 142-160 de la
PrP;
- en la etapa (b) (pistas 6 a 10), la PrPsens es
sistemáticamente destruida mientras que la señal obtenida en las
pistas 8 y 10 (en presencia del anticuerpo dirigido contra los
motivos octa-péptido repetidos) es similar o
superior a la señal obtenida en las mismas muestras con un
anticuerpo dirigido contra la zona 142-160 de la
PrP, mientras que es inferior e incluso indetectable en las pistas 7
y 9 (PrPres del ESB).
\vskip1.000000\baselineskip
Para realizar una dosificación inmunométrica en
dos lugares, el residuo obtenido en (iv) en el ejemplo 2 es, por
ejemplo, disuelto en una solución tampón que contiene sarkosilo
(0,25-1%) y urea (0,25 8 M) o SDS
(0,25-1%) y urea (0,25-1 M); la
muestra obtenida será preferentemente diluida (al 1/4 o al 1/2),
después del calentamiento con una solución tampón conteniendo
albúmina que conduce a una concentración final en albúmina
comprendida entre 0,1 y 1% (p/v) o con una solución tampón
conteniendo desoxicolato a 1%).
La dosificación inmunométrica en dos lugares se
realiza en placas de microtrituración conteniendo un anticuerpo
inmovilizado en las condiciones ya descritas para otras proteínas
(Grassi et al 1989). Su principio es el siguiente: la PrP
analizada se reconoce por un anticuerpo fijado sobre el soporte
sólido (anticuerpo de captura) y por un segundo anticuerpo, que
reconoce otra parte de la molécula, que está marcada con una enzima
(en este caso, la acetilcolinestarasa, anticuerpo trazador), en 5
unidades Eilman/ml (1 unidad Eilman = 7,35 x 10^{-2} unidades
enzimáticas).
Dentro del marco de la invención, el anticuerpo
de captura es dirigido contra los motivos
octa-péptido repetidos y el anticuerpo trazados
reconoce una secuencia comprendida dentro de la zona
94-230 de la PrP, por ejemplo, la zona
142-160 de la PrP. Después del lavado de la fase
sólida, la actividad enzimática fijada sobre la placa es
proporcional a la cantidad de PrPres que posee los motivos
octa-péptido repetidos inicialmente en la muestra
analizada.
En la práctica, la dosificación se realiza de la
forma siguiente:
100 \mul de la solución de PrP, que se va a
analizar, se depositan en los pozillos de la placa de
microtrituración que contiene el anticuerpo que reconoce los motivos
octa-péptido repetidos. Después de 3 horas de
reacción a la temperatura ambiente, la placa es lavada con la
adición de 100 \mul de una solución del anticuerpo trazador (5
unidades Eilman/ml (1 unidad Eilman = 7,35 x 10^{-2} unidades
enzimáticas). Después de una noche de reacción a +4ºC las palcas son
lavadas de nuevo antes de la adición de 200 \mul de una solución
de sustrato (reactivo de Eilman, Grassi et al 1989) que va a
permitir medir la actividad de la acetil - colinaesterasa fijada en
la fase sólida. Después de 30 minutos de reacción enzimática, la
absorbancia (D.O. a 414 nm) de cada pozillo es objeto de
medición.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras son preparadas según se describió
en el ejemplo 2.
Los homogeneizados son preparados según se
describió en el ejemplo 2.
- en el caso del hombre
\newpage
las Figuras 3 y 4 ilustran los resultados
obtenidos con diferentes soluciones tampones:
*condiciones según la etapa (1) o (a) del
procedimiento según la invención:
- I:
- homogeneizado al 20% + SK 10 + T10 + T10 + U2 + PK 1
- III':
- homogeneizado al 10% + SK 5 + T5 + U1 + PK 0,5 (Figura 4)
\vskip1.000000\baselineskip
*condiciones según la etapa (b) del
procedimiento según la invención:
- II:
- homogeneizado al 20% + SK10 + T10 + U2 + PK3
- III:
- homogeneizado al 20% + SK10 + T10 + U2 + PK6
- III'
- homogeneizado al 10% + SK5 + T5 + U1 + PF6 (Figura 4)
- IV:
- homogeneizado al 20% + SK20 + PK3
- V:
- homogeneizado al 20% + SK20 + U1 + PK3
- VI:
- homogeneizado al 20% + SK20 + U2 + PK3
- VII:
- homogeneizado al 10% + SK20 + PK3
- VIII:
- homogeneizado al 10% + SK20 + U1 + PK6
- X:
- homogeneizado al 10% + SK5 + SDS5 + U1 + PK6
- X':
- homogeneizado al 10% + SK2,5 + SDS 2,5 + U2 + PK6 (Figura 4)
- XI:
- homogeneizado al 20% + SK20 + PK6
- XII:
- homogeneizado al 20% + SK20 + U1 + PK6
- XIII:
- homogeneizado al 20% + SK20 +U2+ PK6
- XIV:
- homogeneizado al 10% + SK20 + PK6
- XV:
- homogeneizado al 10% + SK20 + U1 + PK6
- XVI:
- homogeneizado al 10% + SK20 + U2 + PK6
La cantidad de PrPres que ha conservado el
motivo octa-péptido repetido se mide con la ayuda de
la dosis inmunométrica en dos lugares (absorbancia o D.O. a 414 nm,
ver ejemplo 3; se mide la aparición de una coloración amarilla,
reactivo de Eilman): control negativo (\Box), MCJ esporádico de
tipo 1 (\Box) y vMCJ de tipo 4 (\blacksquare).
- en el caso de rumiantes
Las Figuras 5 y 6 ilustran los resultados
obtenidos con diferentes soluciones tampones:
*condiciones según la etapa (1) del
procedimiento según la invención:
- I:
- homogeneizado al 20% + SK10 + T10 + U2 + PK1
- III':
- homogeneizado al 10% + SK5 + T5 + U1 + PK0,5 (Figura 6)
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.990000\baselineskip
*condiciones según la etapa (b) del
procedimiento según la invención:
- II:
- homogeneizado al 20% + SL10 + T10 + U2 + PK3
- III:
- homogeneizado al 20% + SK10 + T10 + U2 + PK6
- III'':
- homogeneizado al 10% + Sk5 + t5 + u1 + PK3 (Figura 6)
- IV:
- homogeneizado al 20% + SK20 + PK3
- V:
- homogeneizado al 20% + SK20 + U1 + PK3
- VI:
- homogeneizado al 20% + SK20 + U2 + PK3
- VII:
- homogeneizado al 10% + Sk20 + PK3
- VIII:
- homogeneizado al 10% + SK20 + U1 + PK3
- IX:
- homogeneizado al 10% + SK20 - U2 + PK3
- X:
- homogeneizado al 10% + SK5 - SDS5 + U1 - PK6
- X':
- homogeneizado al 10% + SK5 +SDS5 + U1 + PK3 (Figura 5)
- XI:
- homogeneizado al 20% + SK20 + PK6
- XII:
- homogeneizado al 20% + SK20 + U1 + PK6
- XIII:
- homogeneizado al 20% + SK20 + U2 + PK6
- XIV:
- homogeneizado al 10% + SK 20 + PK6
- XV:
- homogeneizado al 10% + `SK20 + U1 + PK6
- XVI:
- homogeneizado al 10% + SK20 + U2 + PK6
La cantidad de PrPres que ha conservado el
motivo octa-péptido repetido se mide con la ayuda de
la dosis inmunométrica en dos lugares (absorbancia o D.O. a 414 nm,
ver ejemplo 3 control negativo (\Box) ATNC bovino (\Box) y ATNC
ovino (\blacksquare).
- las Figuras 7 (Western blot) y 8 (dosificación
inmunométrica en dos lugares):
- \bullet
- La comparación se realiza a partir de homogeneizados al 20% de cerebros de oveja sana, de oveja en espera de la tembladera y de bovino alcanzado de ESB, obtenidos, en las condiciones expuestas en el ejemplo 2
- \bullet
- Tratamiento de las muestras:
- A: sarkosilo 10% + Triton 10% + urea 2 M + proteinasa K 60 \mug/mL, 10 minutos
- B: sarkosilo 10% + urea 2 M + proteinasa K 240 \mug/mL, 10 minutos
- C: sarkosilo 10% + proteinasa K 240 \mug/ml, 10 minutos
- \bullet
- Detección
- Por Western blot (Figura 7): anticuerpo SAF 37 y SAF 84 (ver ejemplo 1)
- Por inmunométrica (Figura 8): captura por SAF 37 y revelación por un anticuerpo dirigido contra la zona 94-230 de a PrP.
- Figuras 9 (Western blot) y 10 (dosificación
inmunométrica en dos lugares):
La comparación se efectúa a partir de los
homogeneizados al 20% de cerebros de oveja sana, de oveja a la
espera de tembladera y de bovino alcanzado de ESB, obtenidos, en las
condiciones expuestas en el ejemplo 2:
Tratamiento de las muestras:
A: sarkosilo 10% + Triton® 10% + urea 2 M +
proteinasa K 60 \mug/ml, 10 minutos
B: SDS 10% + Triton® 5% + urea 2 M + proteinasa
K 180 \mug/ml, 10 minutos.
- \bullet
- Detección
en las mismas condiciones anteriores
El aumento solamente en la dosis de PK permite
hacer aparecer una sensibilidad diferencial de la zona de los
motivos octa-péptido repetidos, entre ESB y la
tembladera en el caso de la oveja, pero no en el caso del hombre
(entre el tipo 1 y el tipo 4).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Por el contrario, modificando igualmente la
composición en agente tensioactivo y agente caotropo, ello permite
hacer aparecer una sensibilidad diferencial de la zona de los
motivos octa-péptido repetido en todos los
casos.
- Figuras 11 (Western blot) y 12 (dosificación
inmunométrica en dos lugares):
La comparación se realiza a partir de los
homogeneizados al 10% de cerebros de ratones sanos o de ratones
experimentalmente infectados con la cepa C506M3 (tembladera) o con
la cepa 6PB1 (ESB) obtenidos, en las condiciones indicadas en el
ejemplo 3.
Tratamiento de las muestras:
A: sarkosilo 10% + Triton® 10% + urea 2 M +
proteinasa K 30 \mug/ml, 10 minutos
B: sarkosilo 10% + Triton® 10% + urea 2 M +
proteinasa K 60 \mug/ml, 10 minutos
C: sarkosilo 10% + Triton® 10% + urea 2 M +
proteinasa K 180 \mug/ml, 10 minutos
D: sarkosilo 10% + Triton® 10% + urea 2 M +
proteinasa K 360 \mug/ml, 10 minutos
E: sarkosilo 10% + urea 2 M + proteinasa K 180
\mug/ml, 10 minutos
\vskip1.000000\baselineskip
Detección
Por Western blot (Figura 11): anticuerpo SAF 37
y SAF 70 (ver ejemplo 1)
Por inmunometría (Figura 12): captura por SAF 37
y revelación por un anticuerpo dirigido contra la zona
94-230 de la PrP.
Los resultados obtenidos demuestran que el
aumento solamente de la dosis en PK permite hacer aparecer una
sensibilidad diferencial de la zona de los motivos
octa-péptido repetidos entre ESB y la tembladera, en
el caso del ratón.
- Figuras 13 (Western blot) y 14 (dosificación
inmunométrica en dos lugares):
La comparación se realiza a partir de
homogeneizados al 10% de cerebros de hombres sanos y de hombres
alcanzados por MCJ (tipos 1, 2, 3 y 4) obtenidos en las condiciones
expuestas en el ejemplo 3.
Tratamiento de las muestras:
A: sarkosilo 10% + Triton® 10% + urea 2 M +
proteinasa K 30 \mug/ml 10 minutos
B: sarkosilo 10% + Triton® 10% + urea 2 M +
proteinasa K 180 \mug/ml 10 minutos
C: sarkosilo 10% + proteinasa K 30 \mug/ml 10
minutos
D: sarkosilo 10% + proteinasa K 60 \mug/ml 10
minutos
E: sarkosilo 10% + proteinasa K 180 \mug/ml 10
minutos
F: sarkosilo 10% + proteinasa K 360 \mug/ml 10
minutos
\vskip1.000000\baselineskip
Detección
Por Western blot (Figura 13): anticuerpo SAF 37
y SAF 70 (ver ejemplo 1)
Por inmunometría (Figura 14): captura por SAF 37
y revelación por un anticuerpo dirigido contra la zona
94-230 de la PrP.
- figuras 15 (Western blot) y 16
(inmunometría)
La comparación se realiza a partir de
homogeneizados al 10% de cerebros de hombres sanos y de hombres
alcanzados por MCJ (tipos 1, 2, 3 y 4) obtenidos en las condiciones
expuestas en el ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Tratamiento de las muestras:
Figura 15: digestión por medio de la proteinasa
K (150 \mug/ml) 10 minutos
Figura 16: sarkosilo 10% + urea 2 M + proteinasa
K (de 30 a 360 \mug/ml durante 10 minutos)
\vskip1.000000\baselineskip
Detección
Por Western blot (Figura 15): anticuerpo SAF 37
y un anticuerpo dirigido contra la zona 94-230 de la
PrP (ver ejemplo 1)
Por inmunometría (Figura 16): captura por SAF 37
y revelación por un anticuerpo dirigido contra la zona
94-230 de la PrP.
Los resultados obtenidos demuestran que el
aumento de la dosis en PK permite hacer aparecer una sensibilidad
diferencial de la zona de los motivos octa-péptido
repetidos en los diferentes tipos de MCJ. En estas condiciones, no
existe diferencia significativa entre el tipo 1 y el tipo 4; el
hecho de cambiar la composición en agente tensioactivo y en atente
caotropo, con la misma dosis de PK (E, Figuras 13 y 14) permite
destruir los octa-péptido en el tipo 4
conservándolos en el tipo 1.
Además, la Figura 16 permite demostrar la
diferencia de sensibilidad de las PrPres procedentes de diferentes
cepas, para una misma solución tampón, en función de la dosis en
PK.
Por otra parte, la Figura 15 demuestra que un
tratamiento directo del homogeneizado mediante la PK pone en
evidencia otro tipo de sensibilidad de la PrPres a la
degradación.
Los homogeneizados, obtenidos en las condiciones
según el ejemplo 2, son tratados como sigue:
Homogeneizado 20% (500 \mul) + NaCl 20% (500
\mul) + [sarkosilo 20% + SB314 2%] (500 \mul) + PK (20 \mug/ml
final) durante 1 hora.
La Figura 17 ilustra los resultados:
b y d:
pistas 1-7: resultados obtenidos
con diferentes diluciones de cepas C506M3 de la tembladera en el
caso del ratón (diluciones 1/20, 1/50, 1/250, 1/500, 1/1000 y
1/2000)
Pista 8: pesos moleculares
Pistas 9-15: resultados
obtenidos con diferentes diluciones de cepa ESB en el caso del ratón
(diluciones de 1/1000 a 1/10).
Es posible eliminar completamente la señal de
ESB
a y c: los resultados obtenidos confirman que
existe un aumento significativo de la señal en presencia de
anticuerpos dirigidos contra los motivos
octa-péptido repetidos.
e: esta Figura demuestra que es posible obtener
una disminución de la señal con ESB tanto en el mono como en el
hombre (pistas 4 y 7)
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Claims (11)
1. Procedimiento de diagnóstico de una
ESST o enfermedad de priones provocada por una cepa de ATNC mediante
detección de la PrPres en una muestra biológica,
caracterizado porque comprende:
(1) el tratamiento de dicha muestra con al menos
una proteinasa K, bien sea con una concentración comprendida entre
30 \mug/ml y 200 \mug/ml durante 10 minutos a 37ºC para un
homogeneizado al 10%, bien sea durante un periodo y a una
concentración equivalentes a la concentración comprendida entre 30
\mug/ml y 200 \mug/ml en las condiciones antes citadas y de
modo todavía más preferido durante 10 minutos a una concentración
comprendida entre 30 \mug/ml y 200 \mug/ml para un homogeneizado
al 10% o durante 30 minutos a una concentración comprendida entre 10
\mug/ml y 70 \mug/mL, para un homogeneizado al 10%, poniéndose
dicha proteinasa K en solución en una solución tampón selecciona en
el grupo constituido por las soluciones tampones de homogeneización
de la muestra biológica y soluciones tampones que comprenden al
menos uno de los agentes siguientes: al menos un agente tensioactivo
y/o al menos un agente caotropo y/o al menos una sal, de modo que se
degrade completamente la PrPsens, conservando la totalidad o parte
de los motivos octa-péptido repetidos de la PrPres,
cualquiera que sea la cepa de ATNC
(2) la puesta en contacto de dicha muestra
tratada con un ligando de dichos motivos
octa-péptido y
(3) la detección de la presencia ocasional del
complejo de motivos octa-péptido
repetidos-ligando.
2. Procedimiento de diagnóstico de una
ESST o enfermedad de priones provocada por una cepa de ATNC mediante
detección de la PrPres en una muestra biológica,
caracterizado porque comprende:
(a) la detección de la PrPres de una cepa de
ATNC en una primera fracción de dicha muestra, de conformidad con
las etapas (1) a (3) siguientes:
- (1)
- el tratamiento de dicha muestra con al menos una proteinasa K, de modo que degrade completamente la PrPsens, conservando la totalidad o parte de los motivos octa-péptido repetidos de la PrPres, cualquiera que sea la cepa de ATNC
- (2)
- la puesta en contacto de dicha muestra tratada con un ligando de dichos motivos octa-péptidos y
- (3)
- la detección de la presencia ocasional del complejo de motivos octa-péptido repetidos-ligando y luego:
(b) para cada muestra para la cual se detecta en
la etapa (a) la presencia de un completo de motivos
octa-péptido repetidos-ligando:
- -
- el tratamiento de una segunda fracción de dicha muestra con al menos una proteinasa K, de modo que la mayoría de los motivos octa-péptido repetidos sean eliminados para la PrPres asociada a por lo menos una cepa de interés, en particular la cepa de ESB y donde el conjunto de las PrPres asociadas a las demás cepas de ATNC conservan la totalidad o parte de dichos motivos octa-péptido repetidos
- -
- la puesta en contacto de dicha segunda fracción de dicha muestra tratada, con un ligando de dichos motivos octa-péptido repetidos y -la detección de la presencia del complejo de motivos octa-péptido repetidos-ligando
3. Procedimiento de diagnóstico
diferencial de las ESST provocadas por cepas de ATNC en una muestra
biológica considerada como contenedora de la PrPres,
caracterizado porque comprende, para cada muestra para la
cual se haya detectado la presencia de una PrPres, la puesta en
práctica de la etapa (b) según la reivindicación 2.
- la puesta en contacto de dicha segunda
fracción de dicha muestra tratada con un ligando de dichos motivos
octa-péptido repetidos y
- la detección de la posible presencia del
complejo de motivos octa-péptido
repetidos-ligando.
4. Procedimiento según la
reivindicación 2 o la reivindicación 3, caracterizado porque
el tratamiento con dicha proteinasa K según la etapa (a) o (b) se
realiza durante 30 segundos a 2 horas, a una temperatura inferior a
80ºC, preferentemente entre 10 minutos y 30 minutos.
5. Procedimiento según la
reivindicación 4, caracterizado porque el tratamiento con
dicha proteinasa K se realiza a una concentración comprendida entre
30 \mug/ml y 200 \mug/ml durante 10 minutos a 37ºC para un
homogeneizado al 10% o bien, durante un periodo a una concentración
equivalentes a la concentración comprendida entre 30 \mug/ml y 200
\mug/ml en las condiciones antes citadas y de modo todavía más
preferente, durante 10 minutos a una concentración comprendida entre
30 \mug/ml y 200 \mug/ml para un homogeneizado al 10% o durante
30 minutos a una concentración comprendida entre 10 \mug/ml y 70
\mug/ml para un homogeneizado al 10%.
\newpage
6. Procedimiento según una cualquiera
de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque la
proteinasa k es puesta en una solución tampón seleccionada en el
grupo constituido por las soluciones tampones de homogeneización de
la muestra biológica y de las soluciones tampones que comprenden al
menos uno de los agentes siguientes: al menos un agente tensioactivo
y/o al menos un agente caotropo y/o al menos una sal.
7. Procedimiento según la
reivindicación 1 o la reivindicación 6 caracterizado porque
dicha solución tampón comprende preferentemente:
a. al menos un agente tensioactivo seleccionado
dentro del grupo constituido por:
- -
- tensioactivos aniónicos, tales como el SDS (dodecilsulfato de sodio), el sarkosilo (lauroil-sarcosina), el colato de sodio, el desoxicolato de sodio, el taurocolato de sodio;
- -
- tensioactivos zwitteriónicos, tales como el SB 3-10 (decil-sulfobetaina), el SB 3-12 (dodecil-sulfobetaína), el SB 3-14, el SB 3-16 (hexadecil-sulfobetaína), el CHAPS y el desoxiCHAPS,
- -
- tensioactivos no iónicos, tales como el C12E8 (dodecil-octa-etilenoglicol), el TRITON X100, el TRITON X114, el TWEEN 20, el TWEEN 80, el MEGA 9 (nonanoil-metilglucamina), el octiglucósido, el LDAO (dodecil-dimetilamina óxido) o el NP40 o
- -
- mezclas de tensioactivos tales como una mezcla de un agente tensioactivo iónico y de un agente tensioactivo no iónico, una mezcla de dos agentes tensioactivos iónicos o una mezcla de un agente tensioactivo iónico y de un agente tensioactivo zwitteriónico y/o
b. al menos un agente caotropo seleccionado
dentro del grupo constituido por la urea y la guanidina o una mezcla
de ellas y/o
c. al menos una sal seleccionada entre las sales
de metales alcalinos o no.
8. Procedimiento según la
reivindicación 7, caracterizado porque dicha solución tampón
comprende al menos un 5% de tensioactivo aniónico, preferentemente
de sarkosilo, ocasionalmente asociado al SDS.
9. Procedimiento según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el
ligando está seleccionado dentro del grupo constituido por aptámeros
y anticuerpos que se ligan a la zona de los motivos
octa-péptido repetidos.
10. Procedimiento según la reivindicación
2, la reivindicación 4 o la reivindicación 5, caracterizado
porque el tratamiento de la etapa (b) se realiza en las mismas
condiciones que las definidas en la etapa (a) (1) pero con una
concentración en PK superior a la utilizada en la etapa (a) (1).
11. Dispositivo de diagnóstico para la
puesta en práctica de los procedimientos según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque comprende en
asociación al menos un agente tensioactivo y/o al menos un agente
caotropo y/o al menos una sal y una proteasa, tales como las
definidas en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
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