CN1391652A - 在生物样品中诊断由非传统性可传播性因子导致的可传播性亚急性海绵状脑病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及诊断由非传统性可传播性因子毒株引起的可传播性亚急性海绵状脑病的方法，该方法包括：(1)用至少一种蛋白酶K处理所述样品，以完全降解PrP－sen，同时保存PrP－res的八肽基序重复的全部或部分，而无论何种毒株；(2)用能特异鉴定所述八肽基序重复的配体接触所处理的样品，和(3)检测配体/八肽基序重复复合物的可能存在。本发明还涉及鉴别诊断方法。

Description

在生物样品中诊断由非传统性可传播性因子导致的 可传播性亚急性海绵状脑病的方法
本发明涉及通过检测PrP-res诊断由非传统性可传播性因子(UTA)毒株所引起的可传播性亚急性海绵状脑病(TSSE)的方法，也涉及它在生物样品中对不同的非传统性可传播性因子(UTA)毒株进行鉴别诊断的用途。
可传播性亚急性海绵状脑病(TSSEs)是由非传统性可传递因子(UTAs)即朊病毒所引起的，迄今为止，朊病毒的准确性质尚难确定。基本上可传播性亚急性海绵状脑病可包括人克-雅病(CJD)，绵羊和山羊的瘙痒病，牛海绵状脑病(BSE)。其他脑病已经被证明存在于猫科动物、水貂、以及某些野生动物如鹿或驼鹿中。
这些疾病总是致命的，并且现在无有效的治疗方法。
在可传播性亚急性海绵状脑病中，宿主蛋白质PrP(或朊病毒蛋白)以异常形式(PrP-res)主要蓄积在中枢神经系统。PrP-res与感染性共纯化，它的蓄积出现于组织学损害之前。体外培养发现，PrP-res对神经细胞的培养具有毒性作用。
朊病毒蛋白的二种同工型具有相同的氨基酸序列(见图1)，但它们的二级结构不同。PrP-res具有更多的β-折叠片层，而正常PrP(PrP-sen)含有更多的α-螺旋。
一般可以利用两种生化性质识别这二种同工型。
—PrP-res对蛋白酶有部分抗性，蛋白酶K可引起其N-末端的裂解。使用蛋白酶K处理之后，PrP-res通常根据其双糖基化形式的表观分子量而被称作PrP27-30。一般公认对于传统毒株，切割位点位于89和90氨基酸之间(Prusiner等，Cell，1984)。
-PrP-res不溶于非离子去污剂，例如Triton X100和Triton 114。
正常形式的朊病毒蛋白(PrP-sen)原则上可被蛋白酶完全降解，而且完全溶于非离子去污剂。
仓鼠、人、牛及羊的PrP-sen多肽序列如图1所示。它们都特别地具有一种八肽基序(P(H/Q)GGG(-/T)WGQ)，根据物种的不同，分别重复出现4或5次。八肽基序重复对应于PrP-sen的第51位至91位氨基酸(按人的PrP序列编号)(B.Oesch等，1991)。
为了检测感染性因子的存在，最新的方法是通过利用其对蛋白酶的部分抗性，根据对连接到感染性因子的异常PrP(PrP-res)进行选择性检测而进行的。
以下方法可能用于识别：
—Western印迹：它基于对组织提取物中的PrP-res进行免疫学检测。在用蛋白酶处理提取物以破坏朊病毒蛋白的正常同工型(PrP-sen)之后，电泳分离提取物中的蛋白质，将其转移到聚合物膜上，使用能够识别朊病毒蛋白的特异抗体进行检测(Schaller O.等，1999)。
—ELISA类试验：也需使用蛋白酶处理提取物。
在这些不同的试验中，需使用蛋白酶处理组织提取物的试验，可以提及：
—Serban等人(Neurology，1990，40，110)描述的方法，他发展了检测PrP-res的方法，包括在硝酸纤维素膜上固定蛋白质，继而用蛋白酶消化，变性及用单克隆抗体进行免疫检测。
—Oesch等人(Biochemistry，1994，33，5926-5931)描述的方法，他提出对PrP-res进行定量，用免疫过滤法(ELIFA或酶联免疫过滤试验)纯化PrP-res。
—Gratwohl等人1997年描述的方法，他们提出使用ELISA型试验。用蛋白酶K处理样品之后，用离心沉淀法纯化PrP-res，将纯化的蛋白吸附在微量滴定板上，使用兔多克隆抗体进行检测。
—Safar等人1998年描述的方法，他不使用蛋白酶K处理样品，但基于其是否遭受变性处理比较了固定在固相支持物上的PrP-res的免疫反应性。
总的来说，上述这些各种不同的方法具有缺乏敏感性和因此造成假阴性的缺点。
其它方法建议使用变性物质处理样品(Oesch等，1994和1999；WO 00/22438，加利福尼亚大学制剂)：用蛋白酶K有限处理样品(WO 00/29850，Wallac Oy等)和用金属肽酶处理样品(WO 00/22438)，使隐蔽的抗原位点暴露，这些位点可以用单克隆抗体3F4进行检测，它识别朊病毒蛋白109-112区域(WO 00/29850或WO 00/22438)。
Wallac Oy等在WO 00/2985描述的方法的主要缺点是缺乏特异性，特别是由于推荐条件下不能完全清除PrP-sen而导致检测方法缺乏特异性。而WO 00/22438中描述的方法，使用的是加州大学试剂，由于检测抗体3F4(WO 00/22438)仅能结合蛋白上的一个基序而缺乏敏感性。
本项专利申请人最近提供PrP-res的定量检测方法。此种方法使用了可明显提高检测敏感度的纯化步骤，代表了医学监控和在屠宰场中的分析PrP-res技术的巨大进步。该方法特别描述于PCT国际专利申请书WO 99/41280和欧洲委员会第XXIV次董事会全体会议的初步报告中(消费者政策和消费者健康保护；http：//europa.eu.int/comm/dg24/health/)。
然而，由于需要特别可靠的可传播性亚急性海绵状脑病的诊断实验，本申请者继续进行了研究。
为了创立检测试验，特别建立了以下几个方面的标准：
(i)敏感性：也就是要求具有能够正确鉴定非感染动物的能力。
(ii)特异性：也就是要求具有能够正确鉴定表现出临床症状的感染动物的能力。
(iii)尽可能低的检测下限：也就是能够允许对少量的PrP-res进行检测(在临床症状出现之前检测PrP-res)，和
(iv)可重复性：
待分析生物样品必须在能够保留所有或一些PrP-res专有的八肽基序的条件下进行处理。
我们特别发现：要有效地满足上述(i)-(iv)四个条件，必需精确地定义处理待分析样品的条件，在定义条件下可以完全去除样品中的PrP-sen，而同时能够特异捕捉PrP-res。
本发明一个主题是通过检测生物样品中的PrP-res，诊断由非传统性可传播性因子毒株引起的可传播性亚急性海绵状脑病或朊病毒疾病的方法(方法A)，其特征在于该方法包括：(1) 用至少一种蛋白酶K处理所说的样品，使得可以完全降解PrP-sen，
同时保留PrP-res的全部或一些八肽基序重复，而无论何种非传统
性可传播性因子毒株；所说的蛋白酶K处理优选在下列条件下完成：
蛋白酶K浓度在30μg/ml-200μg/ml之间，37℃处理10％的组
织匀浆物(生物样品在适宜的缓冲液中以匀浆物的形式存在)10分
钟，或在等同于用蛋白酶K浓度30μg/ml-200μg/ml，37℃处理
10％的组织匀浆物10分钟的反应浓度和时间的反应条件下完成。(2) 将上述的处理过的样品与上述八肽基序的配体进行接触，特别是与
针对八肽基序重复的抗体接触，以及(3) 检测八肽基序重复/配体复合物的可能的存在。
根据本方法的有利的具体方案，用上述浓度的所说蛋白酶K处理样品，时间为30秒至2小时，温度低于80℃，优选在37℃用上述浓度处理10-30分钟。甚至更优选蛋白酶K浓度为30μg/ml-200μg/ml，处理10％的组织匀浆物(终浓度)10分钟；或者蛋白酶K浓度为10μg/ml-70μg/ml，处理10％的组织匀浆物(终浓度)30分钟；或蛋白酶K浓度为25μg/ml-175μg/ml，处理组织匀浆物的浓度为25％(终浓度)30分钟。
需要注意的是某些参数是相互紧密关联的。蛋白酶K的浓度直接依赖于样品的处理时间(孵育时间)，可以认为，例如在37℃，用30μg/ml-200μg/ml的蛋白酶K孵育10％的组织匀浆10分钟等价于用10μg/ml-70μg/ml蛋白酶K孵育10％的组织匀浆30分钟。例如：用25μg/ml蛋白酶K孵育30分钟等价于用75μg/ml蛋白酶K孵育10分钟。
无论蛋白酶K浓度和处理时间如何，处理过的样品应该不再含有未降解的PrP-sen，而假如存在PrP-res，则PrP-res保留了全部或一些八肽基序。
其它参数也在较小程度上影响蛋白酶K的活性浓度的确定，其特别包括溶解所说的蛋白酶K的缓冲液。当蛋白酶K溶解于样品匀浆缓冲液时，蛋白酶K的最小浓度根据所使用的样品匀浆缓冲液的不同而在上述指明的浓度范围之内改变：-  在葡萄糖或胍类缓冲液(或它们的盐)中，蛋白酶K的优选最小浓度为25μg/ml(孵育30分钟)或75μg/ml(孵育10分钟)；-  对于PBS缓冲液，蛋白酶K的优选最小浓度为50μg/ml(孵育30分钟)或150μg/ml(孵育10分钟)。
有利的是，蛋白酶K也可在不同于匀浆缓冲液的溶液中使用，这种溶液有利地包括至少一种表面活性剂和/或至少一种离液剂和/或至少一种盐。
同样有利的是，在用蛋白酶K处理(或孵育)完样品后，所获得的悬浮液可以有利地在国际申请99/41280所定义的条件下进行处理，即：-  加入国际申请99/41280所定义的缓冲液B至悬浮液中，特别是C3-C6醇和醇的混合物，其平均理论介电常数在10-25之间。-  离心所获得的悬浮液，和-  在上述国际申请99/41280所定义的条件下，用包括至少一种表面活性剂和/或至少一种离液剂的缓冲溶液溶解沉淀物。
这样的试验具有的优势是：它特别适宜用于在同一宿主中对不同的非传统性可传播性因子毒株所引起的可传播性亚急性海绵状脑病进行鉴别诊断，特别是比较牛海绵状脑病毒株和绵羊瘙痒病传统毒株的鉴别诊断。
例如，通过分析PrP-res电泳图谱，有报道表明：在英国，牛海绵状脑病已经感染人类，PrP-res电泳图谱根据非传统性可传播性因子毒株的不同而在迁移率上有差异性；在发展出克-雅病新变种(vCJD)的患者中发现了特征性图谱(4型)，其看来与通过被牛海绵状脑病因子感染的牛而进入人类食物的过程有关(Collinge等，Nature，1996)。另外，在被牛海绵状脑病因子感染的短尾猿(Lasmezas等，1996)和可能被这种因子感染的猫(Priola等，Nature Med.，1996)中也发现了相似的图谱。
然而，这是有深远影响的方法，如果期望获得重复性结果，就需要谨慎实施；关于各种PrP-res的分类和这种方法的用途，它可能会成为争论的要素(Parchi等，Nature，1997)。
对于绵羊被牛海绵状脑病因子所感染也有强烈的质疑(Butler，Nature，1998)。事实上，这些动物对这种因子是敏感的，尽管在绵羊中也存在另一种可传播性亚急性海绵状脑病，称做羊瘙痒病。羊瘙痒病和牛海绵状脑病具有接近的和难以区别的临床及组织学特征。唯一的鉴别羊瘙痒病因子和牛海绵状脑病因子的诊断参考方法是将感染因子分别接种于小鼠，研究其损伤表现，这需等待大约2年。在英国目前仅对9例绵羊进行了这样的实验，而绵羊群体多达千万头。
人们首先努力设法分辨样品中不同的非传统性可传播性因子毒株。1999年，Kuczius T.等认为：使用糖分型(glycotyping)技术观察到的在不同的可传播性亚急性海绵状脑病毒株(瘙痒病、牛海绵状脑病和克-雅病)的差异性，并不足以分辨每个毒株，他们使用了能够更清楚地识别各种朊病毒毒株的PrP-res生化和生物标志物。他们使用以下分析参数：对蛋白酶K的长期抗性，PrP-res的分子量，PrP-res的拓扑结构和沉积量。获得的结果表明：羊瘙痒病和牛海绵状脑病各种毒株的PrP-res对蛋白酶K的长期抗性有显著差异。对蛋白酶K的抗性根据羊瘙痒病毒株的不同而改变：低抗性株有Chandler株，中等抗性有22A株；相对稳定株有87V株。在同样条件下，牛海绵状脑病毒株表现为中等抗性。虽然糖分型法不能分辨羊痒病87V毒株和牛海绵状脑病毒株，但当用蛋白酶K长期处理后，这两类毒株就可以明确分辨出来。然而，并没有充分可靠的、并可以大规模地使用和在野外使用的操作方案。
在此背景下，在使用生物样品——例如组织样品——时，拥有可靠、敏感的检测PrP-res的方法就显得非常重要，并且该方法同时还要允许进行鉴别诊断、相对廉价并容易执行。
因此，本发明的主题也是通过检测与各种非传统性可传播性因子毒株有关的PrP-res在生物样品中鉴别诊断由非传统性可传播性因子毒株引起的可传播性亚急性海绵状脑病的方法(方法B)，其特征在于该方法包括：(a)按照上述定义过的诊断非传统性可传播性因子毒株的方法(方法A)的步骤(1)到(3)，在所说的样品的第一部分中检测PrP-res，然后：(b)对在步骤(a)中检测出存在八肽基序重复/配体复合物的每个样品：-  用至少一种蛋白酶K(PK)处理上述样品的第二部分，以使得对于与至少一个感兴趣的毒株——特别是牛海绵状脑病毒株——有关的PrP-res来说，大多数八肽基序重复被除去，并在上述条件下，使得与其他的非传统性可传播性因子毒株有关的所有PrP-res保留了所有或一些所述的八肽基序重复；上述的处理优选在与那些在步骤(1)或(a)中定义过的条件相同的条件下完成，但是蛋白酶K的浓度要比在步骤(1)或(a)中使用的浓度高。-  将上述处理过的样品的上述第二部分与能够特异地识别所述八肽基序重复的配体进行接触，和-  检测八肽基序重复/配体复合物的可能的存在。
本发明的主题也是在认为包含PrP-res的生物样品(检测试验可以通过任何方法完成)中，对由非传统性可传播性因子毒株引起的可传播性亚急性海绵状脑病进行鉴别诊断的方法(方法B的变种)，其特征在于该方法包括：对每个已经检测出存在PrP-res的样品：-  依照上面定义过的步骤(b)处理所说的生物样品的另外一个部分，-  将上述处理过的样品的上述第二部分与能够特异地识别所述八肽基序重复的配体接触，和-  检测八肽基序重复/配体复合物的可能的存在。
在鉴别诊断(方法B)中，除了蛋白酶K的浓度以外，根据毒株的不同，其他条件可能对八肽基序的降解有影响，特别是：当蛋白酶K在不同于匀浆缓冲液的缓冲液——例如有利地包含至少一种表面活性剂和/或至少一种离液剂和/或至少一种盐的缓冲液——中使用的时候，被降解的八肽基序的量可能根据上述的缓冲液组成和各种试剂的浓度而改变。
术语″感兴趣的毒株″意指非传统性可传播性因子毒株，特别是牛海绵状脑病毒株，例如目的是要除去八肽基序重复。
方法A和B的主要特征之一是充分利用执行蛋白酶处理的条件，以控制八肽基序重复的降解。根据设想的用途实施该方法，以使得这些基序被保存(方法A)或者被破坏(方法B)：-  在方法A中，这种控制的目的将会是保留全部或一些八肽基序重复，以促进对PrP-res进行非常敏感的检测；-  在方法B中，控制由蛋白酶引起的降解的目的将会是降解对应于感兴趣的毒株的PrP-res的大多数——任选全部——八肽基序重复，无论它(它们)在什么物种中表达，条件是：对应于所有其他的可传播性亚急性海绵状脑病毒株的PrP-res的全部或一些八肽基序重复被保留下来。在这种情况下，本发明的优点是允许相对于其他的非传统性可传播性因子株对感兴趣的毒株进行鉴别诊断。
具体地：
令人惊讶的是，在依照步骤(1)或者步骤(a)的条件下，蛋白酶K没有导致与所有非传统性可传播性因子毒株或者朊病毒相关的PrP-res的所有或一些八肽基序重复的切割，然而步骤(b)的条件却导致与感兴趣毒株相关的PrP-res八肽基序重复的切割，而所有与其他非传统性可传播性因子毒株相关的PrP-res都保留了所有或一些上述的八肽基序重复。
同样令人惊讶的是，这样的试验，尤其当配体是抗体的时候，有下列各项优点：-  高度的检测敏感性，因为针对这些八肽基序重复的抗体比针对PrP-res 27-30的其他区域的抗体有强得多的亲和性，并且对使用的缓冲液有更强的抵抗性；具体地，重复基序的识别提高了高亲和力的相互作用，并且提供了几个抗体分子粘附到单个朊病毒蛋白分子上的可能性；-  鉴别诊断非传统性可传播性因子毒株或者朊病毒的可能性，因为根据所使用的条件，可能获得或者不获得对这些基序的消化；特别有可能在与感兴趣毒株例如牛海绵状脑病因子相关的所有疾病中消除它们，然而在其他的“朊病毒”病中有可能保留它们。结果是：相对于其它毒株，本发明的方法提供了简单的试验来鉴别诊断牛海绵状脑病和/或其他感兴趣毒株，其中这种方法使用两种不同的条件(步骤(1)或(a)及步骤(b))，步骤(1)或(a)的条件(保留与所有非传统性可传播性因子毒株相关的PrP-res八肽基序重复)允许检测所有的毒株，步骤(b)的条件(仅消除与感兴趣毒株相关的PrP-res的这些基序)仅仅揭示其它毒株。
因此这些实验尤其适用于调查感染了牛海绵状脑病毒株的绵羊，而这种毒株通常不能与传统的瘙痒病毒株相互区别。
根据所说方法的一个有利的实施方案，蛋白酶K溶解在优选包含下列成分的缓冲液中：a.至少一种表面活性剂，选自：-  阴离子表面活性剂，例如SDS(十二烷基硫酸钠)，十二烷基肌氨酸钠(sarkosyl)(月桂基肌氨酸钠，lauroylsarcosine)，胆酸钠，脱氧胆酸钠，或牛磺胆酸钠；-  兼性离子表面活性剂，例如SB 3-10(癸基磺基甜菜碱)，SB 3-12(十二烷基磺基甜菜碱)，SB 3-14，SB 3-16(十六烷基磺基甜菜碱)，CHAPS和脱氧CHAPS；-  非离子型表面活性剂，如C12E8(十二烷基八乙二醇(dodecyloctaethylene glycol))，Triton X 100，Triton X 114，Tween20，Tween 80，MPEG 9(壬酰甲基葡萄糖胺)，辛基葡糖苷，LDAO(十二烷基二甲胺氧化物)或NP40，或-  表面活性剂的混合物，例如：离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂的混合物，二种离子型表面活性剂的混合物或离子型表面活性剂和兼性离子表面活性剂的混合物，和/或b.至少一种离液剂，选自尿素和胍，或它们的混合物，和/或c.至少一种盐，选自金属的盐，金属可以是或不是碱金属。
依照这个实施方案的有利的排列，上述的缓冲液包含至少5％的阴离子表面活性剂，优选十二烷基肌氨酸钠，可选地与SDS联合使用。
依照上述方法另外的有利的实施方案，配体选自能与八肽基序重复区域特异结合的aptamers和抗体。
本发明的一个主题是能实现本发明的方法的诊断试剂盒，其特征在于该方法包括如上所定义的至少一种表面活性剂和/或至少一种离液剂和/或至少一种盐和蛋白酶。
(当配体是抗体时)可应用标准的免疫学方法检测八肽基序重复/抗体复合物。
除了上面的排列，本发明也包括见于下列描述的一些其他排列，这些描述提到了也是本发明的主题的本发明方法的实施例及附图，其中
-图1代表各种朊病毒蛋白序列：人的，羊的，牛的，鼠和Cricetidae的；-图2代表通过Western印迹法对PrP-res的检测；-图3到6对应于不同的条件，依照：第一，步骤(1)或(a)，和第二，步骤(b)，在人(图3和4)和反刍动物(图5和6)中，应用双位点法检测八肽基序重复的存在。-图7-12举例说明缓冲液在对牛海绵状脑病和绵羊瘙痒病的鉴别诊断中的影响。-图13和14举例说明缓冲液的组成和蛋白酶K(PK)的浓度对不同类型克-雅病检测的影响。-图15举例说明使用蛋白酶K对脑组织匀浆直接消化后所得的结果。-图16举例说明不同类型克-雅病的PrP-res对蛋白酶K的抵抗力的差异。-图17举例说明通过Western印迹法，对经蛋白酶K消化并纯化为瘙痒病相关纤维(Scrapie-associated fibrils，SAFs)形式的PrP-res的检测。
然而，应该清楚的认识到：这些实施例仅仅是说明本发明主题的举例说明，而不以任何方式限制本发明。实施例1：对八肽基序重复具有特异性的单克隆抗体的生产和表征---多肽的合成和标记
朊病毒蛋白八肽基序重复的多肽代表，如G-G-W-G-Q-P-H-G-G-G-W-G-Q-G-(NH2)基序，是与人类朊病毒蛋白的79-92序列相一致的，它是用自动合成仪(Milligen 9050，Waters，Milford，MI)合成的。同前面描述过的其它多肽和蛋白质一样(McLaughlin等，1987，Grassi等，1989)，该多肽通过异双功能试剂共价连接到乙酰胆碱酯酶(AchE)上，此试剂是4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC，Calbiochem，法国)。此方法包括将被引入到多肽中的巯基与顺丁烯二酰亚胺官能团进行反应，顺丁烯二酰亚胺官能团是通过与SMCC反应而连接到AchE上的。如前所述(McLaughlin等，1987)的，巯基是通过与S-乙酰硫代乙酸N-琥珀酰亚胺基酯(SATA)发生反应而引入多肽的。AchE-SMCC与过量的硫醇化肽反应可完成连接。---单克隆抗体的免疫和制备
按以前曾经报道的(Lasmezas等，1997)从感染的仓鼠脑(263K瘙痒病毒株)中获得瘙痒病相关纤维(SAFs，PrP-res制剂)的制备物。此制剂在免疫老鼠之前被蚁酸灭活。用这些瘙痒病相关纤维制剂免疫PrP敲除小鼠(此鼠朊病毒蛋白基因被除去)(PrP0/0小鼠)，杂交瘤细胞用前面所述方法(Grassi等，1988，1989)制备。培养物的上清用上述方法筛选。可识别和稳定57个杂交瘤，它们被命名为SAF-1到SAF-90。所有的抗体都证明能识别固定在微量滴定板上的瘙痒病相关纤维，而它们中的少数能够识别多肽-乙酰胆碱酯酶结合物。在后者中，有七种能明显地识别八肽基序重复(多肽79-92)，它们是抗体SAF-15，SAF-31，SAF-32，SAF-33，SAF-34，SAF-35和SAF-37。下表列出了所得到的抗体及其主要特征。在腹水中克隆和扩增后，单克隆抗体经过蛋白A-Sepharose柱亲和层析纯化并保存于-20℃直到使用。抗体的同种型依据奥脱洛尼技术用放射免疫扩散法来确定。---杂交瘤培养物上清的筛选
有两种方式可证明杂交瘤培养物上清中朊病毒蛋白特异抗体的存在，即检测它们与多肽-乙酰胆碱酯酶结合物或者仓鼠瘙痒病相关纤维结合的能力。在第一种情况下，筛选是在含有抗鼠IgG抗体的反应板中进行，此抗体是使用前述方法固定在反应板上的(Créminon等，1993，Frobert等，1991)。简而言之，100μl培养物上清和100μl多肽-乙酰胆碱酯酶结合物在固定有羊抗鼠IgG抗体的反应板中于+4℃反应过夜。为了检测结合在固相上的乙酰胆碱酯酶，洗涤反应板之后，向每孔中加入200μlEllman试剂(Ellman等，1996)。在第二种情况下，固定有瘙痒病相关纤维制剂的反应板是通过在0.05M磷酸盐缓冲液，pH7.4，中用50μl 2μg/ml的溶液室温下过夜反应而制备的，清洗反应板后，再用ETA缓冲液(100mM磷酸缓冲液，pH7.4，含150mM NaCl，0.1％牛血清白蛋白(BSA)及0.01％叠氮钠)饱和，+4℃过夜，并于使用前在此温度下保存。如前所述(Negroni等，1998)，单克隆抗体与固定的瘙痒病相关纤维的结合可应用乙酰胆碱酯酶标记的羊抗鼠IgG抗体显示出来。
单克隆抗体   同种型   识别的多肽 单克隆抗体   同种型 识别的多肽
    SAF 1               IgM                 XSAF 2                 ？                ASAF 3               IgG2a               XSAF 4               IgG2a               ASAF 5               IgG1                XSAF 7               IgG2a               XSAF 8               IgG1                ASAF 9               IgG1                ASAF 10              IgG1                ASAF 11              IgG2a               XSAF 12              IgM                 ASAF 13              IgM                 ASAF 14              IgG1                ASAF 15*            IgG3              79-92SAF 21              IgG1                XSAF 22               ？                 ASAF 23              IgG1                XSAF 24              IgG1                ASAF 31*            IgG2b             79-92SAF 32*            IgG2b             79-92SAF 33*            IgG2b             79-92SAF 34*            IgG2a             79-92SAF 35*            IgG2b             79-92SAF 37*            IgG2b             79-92SAF 42              IgG1                ASAF 44              IgM                 ASAF 50              IgM                 ASAF 51              IgM                 ASAF 53*            IgG2a               X     SAF 54*            IgG2b              142-160SAF 56              IgM                   ASAF 58              IgM                   ASAF 59              IgM                   ASAF 60*            IgG2b              142-160SAF 61              IgG2a              142-160SAF 63              IgM                   ASAF 65              IgG1(？)              ASAF 66              IgG2a              142-160SAF 67              IgG1                  XSAF 68              IgG2a                 XSAF 69*            IgG2b              142-160SAF 70*            IgG2b              142-160SAF 72              IgG2b                 ASAF 73              IgG1                  XSAF 75              IgG2a              142-160SAF 76              IgG2a              142-160SAF 77              IgG1                  XSAF 80              IgG1                  XSAF 81*            IgM                   ASAF 82              IgG1                  ASAF 83*            IgG1                  ASAF 84*            IgG2b                 ASAF 85              IgM                   ASAF 91              IgM                   ASAF 94              IgM                   ASAF 95              IgG1                  ASAF 96              IgM                   A
表：针对仓鼠瘙痒病相关纤维制剂的单克隆抗体79-92：识别肽79-92的抗体。142-160：识别肽142-160的抗体。表位X：不能识别固定瘙痒病相关纤维的抗体。表位A：能够识别肽126-164但不能结合肽142-160的抗体。*：在免疫测定法中能够识别实验物种(人、牛、羊、小鼠、大鼠)中至少一个物种的PrP-sen的单克隆抗体。实施例2：用Western印迹法检测PrP-resI：样品处理(i)从不同的生物样品制备组织匀浆--  牛海绵状脑病，羊瘙痒病，人克-雅病变种(4型)，人散发性克-雅病(1型)及相应的阴性对照
取350mg牛脑组织：磨碎，用5％的葡萄糖溶液制成20％匀浆(w/v)
为了进行匀浆，将脑样品(350mg)及1.4ml葡萄糖溶液加入到含有陶瓷珠的试管中，剧烈振摇(Hybaid Ribolyser)
将阳性样品在来自相应物种健康脑的匀浆中稀释：
羊：到1/100
牛：到1/50
人：1型或4型：到1/40；3型：到1/80；2型：到1/20。(ii)步骤(I)的条件
在(i)中获得的20％匀浆的第一部分(500μl)在500μl含有10％十二烷基肌氨酸钠(SK10)，10％ Triton X100(T10)，2M尿素(U2)，浓度为60μg/ml(PK1)的蛋白酶K(PK)的缓冲液中孵育，37℃，10分钟(对应于10％的匀浆，其终浓度为30μg/ml)。
在图3-6中，PK3对应浓度是180μg/ml蛋白酶K的缓冲液，PK6对应浓度是360μg/ml蛋白酶K的缓冲液。(iii)加入500μl包括1-丁醇的缓冲液(对应于缓冲液B，如国际申请WO 99/41280所描述)，混合物于15000rpm离心5分钟(大约17000g)。(iv)将包含PrP-res的离心沉淀物溶解于80-100μl的缓冲液C中(缓冲液C如国际申请WO 99/41280所描述)，优选包含4％的SDS的Laemmli缓冲液，在100℃加热5分钟，以便进行Western印迹实验，或者相继地在包含6M尿素和0.5％的十二烷基肌氨酸钠的缓冲液C1中溶解沉淀，接着在100℃加热5分钟，然后溶解在包含2M胍的缓冲液C2中，之后在100℃加热5分钟，以便进行免疫测定。(v)步骤(b)的条件
在(i)中获得的20％匀浆的第二部分(500μl)z在500μl含5％十二烷基肌氨酸钠(SK5)，5％ SDS(SDS5)，1M尿素(U1)，浓度为180μg/ml的蛋白酶K(PK)(PK6)的缓冲液中在37℃孵育10分钟，然后实施上述的步骤(iii)和(iv)。II.Western印迹
获得的样品用于进行SDS-PAGE电泳并转移到硝酸纤维素膜上，在实施例1和上述国际申请WO 99/41280的实施例3所展示的条件下进行。
PrP-res的免疫检测用上述实施例1所描述的单克隆抗体SAF70和SAF37，以及与过氧化物酶偶联的羊抗兔Igs(1/2500)来完成。如图2所示，免疫反应性通过化学发光法(ECL，Amersham)显示、定量并在自放射自显影胶片上显现。
在此图中：*泳道1-5相应于根据步骤(1)或(a)的条件(SK10+T10+U2+PK1)。泳道1：阴性对照泳道2：牛海绵状脑病泳道3：羊瘙痒病泳道4：人克-雅病变种(4型)泳道5：人克-雅病(1型)，和* 泳道6-10对应于步骤(b)的条件(SK10+SDS5+U1+PK6)泳道1：阴性对照泳道2：牛海绵状脑病泳道3：羊瘙痒病泳道4：人克-雅病变种(4型)泳道5：人克-雅病(1型)获得的结果显示：
—在步骤(1)或(a)中(泳道1到泳道5)，PrP-sen被有系统地破坏，然而用针对八肽基序重复的抗体从PrP-res获得的信号，与用针对朊病毒蛋白的94-230区的抗体从同样的样品中所获得的信号相比，却系统地增强；
—在步骤(b)(泳道6到10)中，PrP-sen被有系统地破坏，从泳道8和泳道10(在存在针对八肽基序重复的抗体的情况下)中获得的信号与在相同的样品中用针对朊病毒蛋白的94-230区的抗体获得的信号相类似或更强，然而泳道7和9(牛海绵状脑病的PrP-res)的信号很少甚至几乎不能被检测到。实施例3：用一个能识别八肽基序重复的单克隆抗体作为捕获抗体，用双位点免疫检测法检测PrP-res
为了进行双位点免疫测定法(two-site immunometric assay)，将在实施例2的步骤(iv)中所得到的沉淀物溶解到例如含有十二烷基肌氨酸钠(0.25-1％)和尿素(0.25-8M)或含有SDS(0.25-1％)和尿素(0.25-1M)的缓冲液中，所得的样品经过加热后，优选用含有白蛋白的缓冲液稀释(到1/4或1/2)，白蛋白的终浓度在0.1到1％(w/v)，也可用含有1％去氧胆酸盐的缓冲液稀释。
双位点免疫测定法在含有抗体的微量滴定板中进行，抗体的固定是在已经在前面描述其它蛋白时所提到过的条件下进行的(Grassi，等，1989)。其原理如下：分析的朊病毒蛋白被一种固定在固相支持物上的抗体(捕获抗体)和第二种抗体所识别，第二种抗体识别此分子的另一部位，并被5个Ellman单位/ml的酶所标记(在本例中，乙酰胆碱酯酶，示踪抗体)。
本发明中，捕获抗体是针对八肽基序重复的，示踪抗体识别包含在朊病毒蛋白94-230区域中的序列，例如朊病毒蛋白的142-160区域。清洗固相后，结合到板上的酶的活性与样品中初始含有八肽基序重复的PrP-res的量成正比。
实际上，此测定方法是按照下列方式进行的：
将100μl待分析的朊病毒蛋白溶液加入含有能识别八肽基序重复的抗体的微量滴定板孔中。室温下反应3小时后，清洗该板，再加入100μl示踪抗体(5个Ellman单位/ml)。+4℃反应过夜，将该板再清洗一次，加入200μl底物溶液(Ellman试剂，Grassi等，1989)，该试剂能够检测结合到固相上的乙酰胆碱酯酶的活性。经过30分钟酶反应后，测定每个孔的吸光度(N.D.，414nm)。实施例4：不同条件的比较研究：步骤(1)或(a)和步骤(b)
样品按实施例2所描述的方法制备。
组织匀浆按实施例2所描述的方法制备。-- 在人体中图3和4举例说明用不同的缓冲液获得的结果：* 依照本发明方法的步骤(1)或(a)的条件：I：20％组织匀浆+SK10+T10+U2+PK1。III’：10％组织匀浆+SK5+T5+U1+PK 0.5(图4)。* 依照本发明方法的步骤(b)的条件：II：20％组织匀浆+SK10+T10+U2+PK3。III：20％组织匀浆+SK10+T10+U2+PK6。III″：10％组织匀浆+SK5+T5+U1+PK6(图4)。IV：20％组织匀浆+SK20+PK3。V：20％组织匀浆+SK20+U1+PK3。VI：20％组织匀浆+SK20+U2+PK3。VII：10％组织匀浆+SK20+PK3。VIII：10％组织匀浆+SK20+U1+PK3。IX：10％组织匀浆+SK20+U2+PK3。X：10％组织匀浆+SK5+SDS5+U1+PK6。X’：10％组织匀浆+SK2.5+SDS2.5+U2+PK6(图4)。XI：20％组织匀浆+SK20+PK6。XII：20％组织匀浆+SK20+U1+PK6。XIII：20％组织匀浆+SK20+U2+PK6。XIV：10％组织匀浆+SK20+PK6。XV：10％组织匀浆+SK20+U1+PK6。XVI：10％组织匀浆+SK20+U2+PK6。
使用双位点免疫测定法测量保留了八肽基序重复的PrP-res的量(414nm的吸收值或O.D.，见实施例3；测量黄色外观，Ellman试剂)：阴性对照(□)，散发性1型克-雅病(□)和4型克-雅病变种(■)--在反刍动物中图5和6举例说明用不同的缓冲液获得的结果：*依照本发明方法的步骤(1)的条件：I：20％组织匀浆+SK10+T10+U2+PK1。III’：10％组织匀浆+SK5+T5+U1+PK0.5(图6)。*依照本发明方法的步骤(4)的条件：II：20％组织匀浆+SK10+T10+U2+PK3。III：20％组织匀浆+SK10+T10+U2+PK6。III″：10％组织匀浆+SK5+T5+U1+PK3(图6)。IV：20％组织匀浆+SK20+PK3。V：20％组织匀浆+SK20+U1+PK3。VI：20％组织匀浆+SK20+U2+PK3。VII：10％组织匀浆+SK20+PK3。VIII：10％组织匀浆+SK20+U1+PK3。IX：10％组织匀浆+SK20+U2+PK3。X：10％组织匀浆+SK5+SDS5+U1+PK6。X’：10％组织匀浆+SK5+SDS5+U1+PK3(图5)。XI：20％组织匀浆+SK20+PK6。XII：20％组织匀浆+SK20+U1+PK6。XIII：20％组织匀浆+SK20+U2+PK6。XIV：10％组织匀浆+SK20+PK6。XV：10％组织匀浆+SK20+U1+PK6。XVI：10％组织匀浆+SK20+U2+PK6。
使用双位点免疫测定法测量保留了八肽基序重复的PrP-res的量(414nm的吸收值或O.D.，见实施例3)：阴性对照(□)，牛的非传统性可传播性因子(□)和羊的非传统性可传播性因子(■)。--图7(Western印迹)和8(双位点免疫测定法)：·使用来自健康的羊、罹患瘙痒病的羊和罹患牛海绵状脑病的牛的20％脑匀浆进行比较，这些匀浆是在实施例2中陈述过的条件下获得的。·样品的处理：A：10％十二烷基肌氨酸钠A+10％ Triton+2M尿素+60μg/ml蛋白酶K，10分钟。B：10％十二烷基肌氨酸钠+2M尿素+240μg/ml蛋白酶K，10分钟。C：10％十二烷基肌氨酸钠+240μg/ml蛋白酶K，10分钟。.检测通过Western印迹(图7)：抗体Saf37和Saf84(见实施例1)；通过免疫测定分析(图8)：用Saf37抗体捕获，用针对朊病毒蛋白94-230区的抗体显示。-图9(Western印迹)和10：(双位点免疫测定法).使用来自健康的羊、罹患瘙痒病的羊和罹患牛海绵状脑病的牛的20％脑组织匀浆进行比较，这些匀浆是在实施例2中陈述过的条件下获得的。.样品的处理：A：10％十二烷基肌氨酸钠+10％ Triton+2M尿素+60μg/ml蛋白酶K，10分钟B：10％ SDS+5％ Triton+2M尿素+180μg/ml蛋白酶K，10分钟.检测在上述同样条件下进行。
仅仅增加蛋白酶K的剂量就能够在绵羊中揭示羊瘙痒病和牛海绵状脑病之间的八肽基序重复区域的差别敏感性，但在人类中则不行(在1型和4型之间)。
另一方面，通过还改变表面活性剂和离液剂的组成，可以在所有的情况下揭示八肽基序重复区域的差别敏感性。实施例5：缓冲液成分对牛海绵状脑病和羊瘙痒病的鉴别检测的影响--  图11(Western印迹)和12(双位点免疫测定法)：.  使用来自健康的小鼠或者实验性感染C506M3毒株(羊瘙痒病)或者6PBI毒株(牛海绵状脑病)的小鼠的10％脑组织匀浆进行比较，这些匀浆是在实施例2中陈述过的条件下获得的。.样品的处理：A：10％十二烷基肌氨酸钠+10％ Triton+2 M尿素+30μg/ml蛋白K，10分钟B：10％十二烷基肌氨酸钠+10％ Triton+2M尿素+60μg/ml蛋白K，10分钟C：10％十二烷基肌氨酸钠+10％ Triton+2 M尿素+180μg/ml蛋白K，10分钟D：10％十二烷基肌氨酸钠+10％ Triton+2 M尿素+360μg/ml蛋白K，10分钟E：10％十二烷基肌氨酸钠+2M尿素+180μg/ml蛋白K，10分钟。.检测通过Western印迹(图11)：抗体Saf37和Saf70(见实施例1)；通过免疫测定分析(图12)：用Saf37抗体捕获，用针对朊病毒蛋白94-230区的抗体显示。
获得的结果显示：在小鼠中，仅仅增加蛋白酶K的剂量就能揭示出在牛海绵状脑病和羊瘙痒病之间的八肽基序重复区域的差别敏感性。实施例6：缓冲液和蛋白酶K浓度对不同的克-雅病的检测的影响-  图13(Western印迹)和14(双位点免疫测定法)：.使用来自健康人和来自患有克-雅病(1，2，3和4型)的人的10％脑组织匀浆进行比较，这些匀浆是在实施例2中陈述过的条件下获得的。.样品的处理：A：10％十二烷基肌氨酸钠+10％ Triton+2 M尿素+30μg/ml蛋白K，10分钟B：10％十二烷基肌氨酸钠+10％ Triton+2M尿素+180μg/ml蛋白K，10分钟C：10％十二烷基肌氨酸钠+30μg/ml蛋白K，10分钟D：10％十二烷基肌氨酸钠+60μg/ml蛋白K，10分钟E：10％十二烷基肌氨酸钠+180μg/ml蛋白K，10分钟F：10％十二烷基肌氨酸钠+360μg/ml蛋白K，10分钟。.检测通过Western印迹(图13)：抗体Saf37和Saf70(见实施例1)；通过免疫测定分析(图14)：用Saf37抗体捕获，用针对朊病毒蛋白94-230区的抗体显示。-  图15(Western印迹)和16(免疫测定分析).使用来自健康人和来自患有克-雅病(1，2，3和4型)的人的10％脑组织匀浆进行比较，这些匀浆是在实施例2中陈述过的条件下获得的。.样品的处理：图15：用蛋白酶K(150μg/ml)消化，10分钟。图16：10％十二烷基肌氨酸钠+2M尿素+蛋白酶K(从30到360μg/ml)，10分钟。.检测通过Western印迹(图15)：Saf37抗体和针对朊病毒蛋白中的94-230区的抗体(见实施例1)；通过免疫测定分析(图16)：用Saf37抗体捕获，用针对朊病毒蛋白94-230区的抗体显示。
获得的结果显示蛋白酶K的剂量增加能够在不同类型的克-雅病中显示八肽基序重复区域的差别敏感性。在这些条件下，在1型和4型之间不存在显著性差异；表面活性剂和离液剂组成的改变，在蛋白酶K(E，图13和14)的剂量相同的情况下，可能在4型中破坏八肽而同时在1型中保存它们。
除此之外，图16可能表明：对于相同的缓冲液，对来自不同毒株的PrP-res，随着蛋白酶K的剂量不同可显示敏感性的差异。
而且，图15显示，用蛋白酶K直接处理组织匀浆揭示了PrP-res对降解的另外类型的敏感性。实施例7：用Western印迹检测以瘙痒病相关纤维形式纯化的被消化的PrP-res
依照实施例2的条件而获得的组织匀浆，被下列方法处理：20％组织匀浆(500μl)+20％ NaCl(500μl)+[20％十二烷基肌氨酸钠+2％ SB314](500μl)+蛋白酶K(终浓度20μg/ml)，处理1小时。
图17举例说明结果：b和d：
泳道1-7：在小鼠中用羊瘙痒病C506M3毒株的不同稀释度所获得的结果(稀释度1/20，1/50，1/250，1/500，1/1000和1/2000)
泳道8：分子量
泳道9-15：在小鼠中用牛海绵状脑病的不同稀释度所获得的结果。(稀释度从1/1000到1/10)
能完全地除去牛海绵状脑病信号。a和c：获得的结果证实，在针对八肽基序重复的抗体存在的情况下，信号有显著性增加。e：该图表明在猴子和在人中都可能获得牛海绵状脑病的信号的减少(泳道4和7)。参考文献.Butler D.，Nature，1998，395，6-7..Collinge J.等，Nature，1996，393，685-690..Créminon，C.等，J.Immunol.Methods，1993，162，179-192..Ellman，G.等，Biochem.Pharmacol.，1961，7，88-95..Frobert，Y等，Methods Mol.Biol.，1991，80，57-68..Grassi，J.等，Anal.Biochem.，1988，168，436-450..Grassi J.等，J.Immunol.Methods，1989，123，193-210..Grathwohl K.U.等，J.Virol.Methods，1997，64，205-216..Kuczius T.等，Mol.Med.，1999，5，406-418..Lasmezas C.等，Nature，1996，381，743-744..Lasmezas C.等，Science，1997，275，402-405..McLaughlin L.L.等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1987，144，469-476..Oesch B.等，Curr.Topics Microbiol.and Immunol.，1991，172，109-124.Oesch B.等，Biochemistry，1994，33，5926-5931..Parchi P.等，Nature，1997，386，232-234..Priola S.A.，Nature Med.，1996，2，12，1303-1304..Prusiner S.B.等，Cell，1984，38，127-134..Safar J.等，Nature Med.，1988，10，1157-1165..Schaller O.等Acta Neuropathol.1999，98，437-443..Serban D.等，Neurology，1990，40，110。
正如上述显示的那样，本发明不以任何方式限制其实施、制备和应用的方法，这些方法仅仅是更清楚地被描述；相反，它包含那些本领域技术人员可能想到的、不脱离本发明的范围或范畴的所有的变体。

Claims (11)

1.通过在生物样品中检测异常朊病毒蛋白(PrP-res)而诊断由非传统性可传播性因子毒株引起的可传播性亚急性海绵状脑病或朊病毒疾病的方法，其特征在于该方法包括：(1)用至少一种蛋白酶K处理所说的样品，使得可以完全降解正常朊病毒蛋白(PrP-sen)，同时保存PrP-res的全部或一些八肽基序重复，而无论何种非传统性可传播性因子，(2)将所述处理过的样品与所述八肽基序的配体进行接触，和(3)检测八肽基序重复/配体复合物的可能的存在。
2.通过检测与各种非传统性可传播性因子有关的PrP-res，而在生物样品中鉴别诊断由非传统性可传播性因子引起的可传播性亚急性海绵状脑病的方法，其特征在于该方法包括：(a)根据权利要求1的诊断非传统性可传播性因子毒株的方法的步骤(1)到(3)，在所说的样品的第一部分中检测PrP-res，然后，(b)对于在步骤(a)中检测到存在八肽基序重复/配体复合物的每个样品：-  用至少一种蛋白酶K处理所述样品的第二部分，使得对于与至少一个感兴趣的毒株——特别是牛海绵状脑病毒株——有关的PrP-res来说，大多数八肽基序重复被除去了，并且使得所有与其他非传统性可传播性因子毒株有关的PrP-res保存了全部或一些所述八肽基序重复，-  将所述处理过的样品的所述第二部分与能够特异地识别所述八肽基序重复的配体接触，和-  检测八肽基序重复/配体复合物的可能的存在。
3.在被认为包含PrP-res的生物样品中鉴别诊断由非传统性可传播性因子毒株引起的可传播性亚急性海绵状脑病的方法，其特征在于该方法包括：对每个已经检测到存在PrP-res的样品，实施权利要求2的步骤(b)，-  将所述处理过的样品的所述第二部分与能够特异地识别所述八肽基序重复的配体接触，和-  检测八肽基序重复/配体复合物的可能的存在。
4.权利要求1到3任何一项的方法，其特征在于依照步骤(1)、(a)或(b)的用所述蛋白酶K处理，在低于80℃的温度下进行30秒到2小时，优选10分钟到30分钟。
5.权利要求4的方法，其特征在于用所述蛋白酶K进行的处理是以30μg/ml到200μg/ml的浓度对10％的匀浆物在37℃下进行10分钟，或以等同于上述条件下30μg/ml到200μg/ml浓度的时间和浓度进行，并优选以30μg/ml到200μg/ml的浓度对10％的匀浆物进行10分钟，或以10μg/ml到70μg/ml的浓度对10％的匀浆物进行30分钟。
6.权利要求1到5任何一项的方法，其特征在于，蛋白酶K溶解在选自生物样品匀浆缓冲液和含有至少一种下列成分的缓冲液的缓冲液中：至少一种表面活性剂和/或至少一种离液剂和/或至少一种盐。
7.权利要求6的方法，其特征在于所述缓冲液优选包含：a.至少一种表面活性剂，其选自：-  阴离子表面活性剂，例如SDS(十二烷基硫酸钠)，十二烷基肌氨酸钠(月桂基肌氨酸钠)，胆酸钠，脱氧胆酸钠，或牛璜胆酸钠；-  兼性离子表面活性剂，例如SB 3-10(癸基磺基甜菜碱)，SB 3-12(十二烷基磺基甜菜碱)，SB 3-14，SB 3-16(十六烷基磺基甜菜碱)，CHAPS和脱氧CHAPS；-  非离子型表面活性剂，例如C12E8(十二烷基八乙二醇)，Triton X 100，Triton X 114，Tween 20，Tween 80，MEGA 9(壬酰甲基葡萄糖胺)，辛基糖苷，LDAO(十二烷基二甲胺氧化物)或NP40，或-  表面活性剂的混合物，例如离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂的混合物，二种离子型表面活性剂的混合物或离子型表面活性剂和兼性离子表面活性剂的混合物，和/或b.至少一种离液剂，其选自尿素和胍，或它们的混合物，和/或c.至少一种盐，其选自金属盐，金属可以是或不是碱金属。
8.权利要求7的方法，其特征在于所述缓冲液包含至少5％的阴离子表面活性剂，优选十二烷基肌氨酸钠，可选地联合SDS。
9.权利要求1到8任何一项的方法，其特征在于配体选自能够特异性结合八肽基序重复区域的aptamers和抗体。
10.权利要求2、权利要求4或权利要求5的方法，其特征在于步骤(b)的处理是在与步骤(1)或(a)中定义的那些条件相同的条件下，以高于步骤(1)或(a)中使用的蛋白酶K浓度的蛋白酶K浓度进行的。
11.用于实施权利要求1-10任何一项的方法的诊断试剂盒，其特征在于它联合地包含以上定义的至少一种表面活性剂和/或至少一种离液剂和/或至少一种盐和蛋白酶。
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