PT1232395E

PT1232395E - Processo de diagnóstico de uma esst provocada por uma família de atnc numa amostra biológica

Info

Publication number: PT1232395E
Application number: PT00979723T
Authority: PT
Inventors: Jean-Philippe Deslys; Emmanuel Comoy; Jacques Grassi
Original assignee: Commissariat Energie Atomique
Priority date: 1999-11-12
Filing date: 2000-11-13
Publication date: 2007-04-30
Also published as: DZ3229A1; WO2001035104A1; JP2003530541A; EP1232395A1; CN1391652A; FR2801106A1; HU230068B1; JP4842478B2; DE60032932D1; BG106686A; CA2390891A1; US20060084130A1; CA2390891C; EP1232395B1; FR2801106B1; HUP0203691A2; US7097997B1; RO121829B1; US7429463B2; DE60032932T2

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO DE DIAGNÓSTICO DE UMA ESST PROVOCADA POR UMA FAMÍLIA DE ATNC NUMA AMOSTRA BIOLÓGICA" A presente invenção está relacionada com um processo de diagnóstico de uma ESST provocada por uma família de ATNC numa amostra biológica por detecção da PrPres, bem como a sua utilização no quadro de um diagnóstico diferencial das diferentes famílias de ATNC numa amostra biológica.

As encefalopatias subagudas espongiformes transmissíveis (ESST) são provocadas por agentes transmissíveis não convencionais (ATNC) também chamados priões, cuja natureza precisa continua contestada nos dias de hoje. As ESST compreendem essencialmente a doença de Creutzfeldt-Jakob no homem (MCJ ou CJD para a doença de Creutzfeldt-Jakob), o tremor na ovelha e na cabra e a encefalopatia espongiforme bovina (ESB ou BSE para bovine spongiform encephalopathy) nos bovinos; outras encefalopatias têm sido evidenciadas nos felídeos, nos visons ou em certos animais selvagens, por exemplo, o veado ou o alce.

Estas doenças são de evolução frequentemente fatal e não existe, no momento actual, qualquer tratamento eficaz.

Nas ESST, existe uma acumulação de uma proteína do hospedeiro a PrP (ou proteína do prião) , sob uma forma anormal (PrPres) principalmente no sistema nervoso central; A PrPres copurifica-se com a infecção e a sua acumulação precede o aparecimento das lesões histológicas. In vitro, é tóxica para as culturas de neurónios. 1

As duas isoformas da PrP apresentam a mesma sequência de ácidos aminados (ver figura 1) , mas diferente na sua estrutura secundária: a PrPres apresenta um conteúdo significativamente mais elevado de folhas β plissadas, enquanto que a PrP normal (PrPsen) apresenta um maior número de hélices a.

Duas propriedades bioquímicas permitem, de uma maneira geral, distinguir estas duas isoformas; a PrPres é parcialmente resistente às proteases, nomeadamente à proteinase K(PK) que tem uma clivagem na sua extremidade N-terminal. Após a acção da PK, a PrPres é muitas vezes chamada PrP27-30 por causa do peso molecular aparente da forma biglicosada; é geralmente admitido que o local da clivagem da PrPres se situa entre os ácidos aminados 89 e 90 (Prusiner et al, Cell, 1984) para as famílias habituais; a PrPres é insolúvel nos detergentes não iónicos, tais como o Triton X10Q ou o Triton 114. A forma normal da proteína do príão (PrPsens) é, em principio, completamente degradada pelas proteases e é perfeitamente solúvel na presença de detergentes não iónicos.

As sequências peptídicas de PrPsens de hamster, humanas, bovinas e ovinas estão representadas na figura 1; compreendem, nomeadamente, um motivo octapeptídeo (P(H/Q)GGG-/T)WGQ), repetido quatro ou cinco vezes, segundo as espécies. Este motivo octapeptídeo repetido corresponde aos ácidos aminados 51-91 da PrP (numeração da sequência da PrP humana) (B. Oesch et al 1991). 2

Para detectar a presença do agente ínfeccioso, os processos mais recentes apoiam-se num detecção selectiva da PrP anormal (PrPres) ligada ao agente ínfeccioso, tirando proveito da sua resistência parcial às proteases.

Podemos distinguir: os processos de Western-blot (defeito a ocidente) que se apoiam na detecção imunológica da PrPres num estrato de tecidos, após tratamento do estrato por uma protease de maneira a destruir a isoforma normal da PrP (PrPsens), separação das proteínas do estrato por electroforese, transferência para uma membrana de polímero, e detecção por um anticorpo específico que reconheça a PrP (Schaller 0. et al, 1999), os testes do tipo ELISA, que fazem intervir igualmente um tratamento de estratos de tecidos por uma protease.

Entre estes diferentes testes, que provocam a intervenção de um tratamento dos estratos de tecidos por uma protease, podemos citar: o descrito por Serban et al (Neurology, 1990, 40, 110) que desenvolve um teste de detecção da PrPres que incluí a imobilização das proteínas numa membrana de nitrocelulose, seguida de uma digestão proteãsica, de uma desnaturação e de uma imunodetecção com anticorpos monoclonais; o descrito por Oesch et al (Biochemestry, 1994, 33, 5926-5931), que propõe para quantificar a quantidade de PrPres um teste de iraunofiltragem para a purificação da PrPres (ELIFA ou enzyme-linked iimunofiltration assay) ; o descrito por Gratwohl et al, 1997, que propõe um doseamento dc tipo ELISA. Após o tratamento das amostras pela proteinase K e da purificação da PrPres por 3 centrifugação, esta é absorvida por placas de microfiltragem e detectada com a ajuda de anticorpos policolonais de coelho; o descrito por Safar et al, 1998, que não utiliza a protemase K e compara a imunorreactividade da PrPres imobilizada num suporte sólido segundo tenha sido ou não submetida a um tratamento desnaturante.

De uma maneira geral, estes diferentes testes apresentam o inconveniente de terem falta de sensibilidade e de assim arrastarem falsas negativas.

Outros métodos propõem tratamentos de amostras por produtos desnaturantes (Oesch et al, 1994 e 1999; WO 00/22438, The Regents of the University of Califórnia), um tratamento limitado à proteinase K (WO 00/29850, Wallac Oy et al) , ou um tratamento por uma metalopeptidase (WO 00/22438) que tornam acessíveis pontos antigénicos escondidos, detectáveis pelo anticorpo monoclonal 3F4 que reconhece a zona 109-112 da PrP (WO 00/29850 ou WO 00/22438). O método, descrito em WO 00/29850, Wallac Oy et al, apresenta o inconveniente principal de falta de especificidade, devido nomeadamente a uma eliminação incompleta da PrPsens, nas condições de tratamento preconizadas, uma vez que ao processo descrito em WO 00/22438, The Regents of the University of Califórnia falta sensibilidade por motivo da utilização do anticorpo de revelação 3F4 (WO 00/28438), que só se liga a um único motivo na proteína. O requerente propôs recentemente um teste para a detecção quantitativa da PrPres, que compreende um passo de purificação que conduz a uma detecção significativamente 4 mais sensível e que representa um grande avanço para a vigilância sanitária, e da dosagem da PrPres nos matadouros. Este processo é, nomeadamente, descrito no Pedido

Internacional PCT WO 99/41280 e num relatório preliminar da XXIV Direcção Geral da Comissão Europeia (Política dos Consumidores e Protecção da sua Saúde: http://europa.eu.int/comm/dg24/health/).

Todavia, tendo em conta a necessidade de se dispor de um teste de diagnóstico das ESST particularmente fiável, o requerente prosseguiu os seus trabalhos.

Estabeleceu especialmente que para a obtenção de um teste de detecção: (i) sensível, isto é, com capacidade de identificar correctamente os animais não infectados, (ii) específico, isto é, com a capacidade de identificar correctamente os animais infectados que apresentem sintomas clínicos, (iii) apresentando um limite de detecção o mais baixo possível, isto é, capaz de permitir a detecção de pequenas quantidades de PrPres (detecção da PrPres antes do aparecimento dos sintomas clínicos) e (iv) capacidade de reprodução, o tratamento da amostra biológica a analisar deve ser realizado em condições que permitam conservar no todo ou em parte motivos octapeptídeos exclusivamente na PrPres.

Verificou, em particular, que para responder efectivamente âs quatro condições (i)-(iv) enunciadas Í3 anteriormente, há lugar para definir condições precisas de tratamento da amostra a analisar, que eliminem totalmente a PrPsens da amostra, permitindo uma captura específica da PrPres nas condições definidas. A presente invenção tem por objecto um processo de diagnóstico (Processo A) de uma ESST ou doença de priões provocada por uma família de ATNC pela detecção da PrPres numa amostra biológica, caracterízado por compreender: (1) o tratamento da referida amostra com, pelo menos, uma proteinase K, quer com uma concentração compreendida entre 30 e 200 μg/ml durante 10 minutos a 37 °C para uma mistura homogeneizada a 10%, quer durante um período e com uma concentração equivalente à concentração compreendida entre 30 e 200 μg/ml nas condições prê-citadas e, de forma ainda mais preferida, durante 10 minutos a uma concentração compreendida entre 30 e 200 μg/ml para uma mistura homogeneizada a 10% ou durante 30 minutos a uma concentração compreendida entre 10 e 70 μg/ml para uma mistura homogeneizada a 10%, sendo a referida proteinase K dissolvida num tampão escolhido no grupo constituído pelos tampões de homogeneização da amostra biológica e tampões compreendendo, pelo menos, um dos agentes seguintes: pelo menos um agente tensioactivo e/ou, pelo menos, um agente caotrópíco e/ou, pelo menos um sal, de forma a degradar completamente a PrPsens, conservando no todo ou em parte os motivos octapeptídeos repetidos 6 da PrPres, qualquer que seja a família de ATNC, (2) estabelecimento de contacto da referida amostra tratada com um ligante dos referidos motivos octapeptídeos e (3) a detecção da presença eventual do complexo motivos octapeptídeos repetidos-ligante.

Deverá notar-se que vários parâmetros estão ligados entre si: a concentração em proteinase K depende dírectamente da duração do tratamento (tempo de incubação) da amostra: podemos considerar que a 37°C, por exemplo, uma incubação de 10 minutos com uma PK com uma concentração compreendida entre 30 e 200 μg/ml da mistura homogeneizada a 10% é equivalente a uma incubação de 30 minutos com uma PK a uma concentração compreendida entre 10 e 70 ^ig/ml de mistura homogeneizada a 10%. Por exemplo, uma incubação durante 3 0 minutos com uma PK a 25 ^ig/ml é equivalente a uma incubação de 10 minutos com uma PK a uma concentração de 75 μg/ml.

Qualquer que seja a concentração em PK e a duração da incubação, a amostra tratada já não deverá conter PrPrens não degradada, uma vez que a PrPres, eventualmente presente, conservou, no todo ou em parte, motivos octapeptídeos.

Outros parâmetros podem intervir a um grau inferior (ou seja, de forma não essencial) no estabelecimento da concentração activa de PK: trata-se, nomeadamente, do tampão no qual a referida PK é dissolvida; quando a PK é dissolvida no tampão de homogeneização da amostra, conforme o tampão de homogeneização utilizado, a concentração mínima 7 de PK poderá variar entre os valores de concentrações acima referidos: num tampão glucosado ou na guanidina (ou um dos seus sais) a concentração mínima de PK é, de um modo preferido, 25 μα/ml (incubação de 30 minutos) ou de 75 pg/ml (incubação de 10 minutos), no tampão PBS, a concentração mínima de PK é, de um modo preferido, de 50 pg/ml (incubação de 30 minutes) ou de 150 pg/ml (incubação de 10 minutos).

De uma forma vantajosa, a PK pode ser posta em prática num tampão diferente do tampão de homogeneização; um tal tampão compreende, com vantagem, pelo menos, um agente tensioactivo e/ou, pelo menos, um agente caotrõpico e/ou, pelo menos, um sal.

Também de maneira vantajosa, após o tratamento (ou a incubação) da amostra com a proteinase K, a suspensão obtida é, com vantagem, tratada nas condições definidas no Pedido Internacional 99/41280, a saber: adição â referida suspensão de um tampão B, tal como definido neste Pedido Internacional 99/41280 e, nomeadamente, os álcoois C3-C6 e as misturas de álcool cuja constante dieléctrica teórica média está compreendida entre 10 e 25, a centrifugação da suspensão obtida e a dissolução do resíduo num tampão compreendendo, pelo menos, um agente tensioactivo e/ou, pelo menos, um agente caotrópico, nas condições definidas no referido Pedido Internacional 99/41280. 8

Este teste tem a vantagem de se adaptar de uma forma particular ao diagnóstico diferencial das ESST num mesmo hospedeiro provocadas por diferentes famílias de ATNC e, nomeadamente, ao diagnóstico diferencial das famílias de ESB relativamente às famílias habituais de tremura nos ovinos.

Foi salientado, por exemplo, que a família BSE infectou humanos na Grã-Bretanha pela análise dos perfis electroforéticos da PrPres, que mostrou diferenças de migração em função das famílias de ATNC; um perfil caracterísico (tipo 4) foi encontrado nos doentes que desenvolveram uma nova variante da doença de Creutzfeldt-Jakob (vDCJ) que parece ligada à utilização na alimentação humana de bovinos infectados pelo agente da BSE (Ccllinge et al, Nature, 1996). Foi observado um perfil semelhante no macaco infectado pela BSE (Lasmezas et al, 1996) e num gato provavelmente contaminado por este agente (Priola et al, Nature Med., 1996).

Todavia, trata-se de um método longo e delicado de aplicar, se se pretender obter resultados que podem ser reproduzidos, o que constitui provavelmente um elemento da controvérsia que existe relativamente à classificação dos diferentes tipos de PrPres e â utilização deste método (Parchi et al, Nature, 1997) .

Existe igualmente uma forte suspeita de contaminação dos ovinos pelo agente da BSE (Butler, Nature, 1998). Estes animais são, com efeito, sensíveis a este agente uma vez que existe nos ovinos uma doença endémica, a tremura (scrapie dos anglo-saxões), uma outra ESST, que apresenta características clínicas e histológicas próximas e não diferenciáveis, 0 único processo de referência para um diagnóstico diferencial entre o agente da BSE e da tremura 9 é a inoculação em ratos e o estudo do perfil das lesões, o que necessita de cerca de dois anos de espera.

Foram efectuados primeiros ensaios para tentar distinguir as diferentes famílias de ATNC numa amostra; Kuczius T. et al, 1999 consideraram que as variantes observadas entre as diferentes famílias de ESST (tremura, BSE e DCJ) pela técnica de glicotipif icar não permitem distinguir cada família; foram escolhidas outros marcadores bioquímicos e biológicos da PrPres, que permitem distinguir melhor entre as diferentes famílias de priões. Os parâmetros de análise que forma utilizados são os seguintes: resistência de longa duração à proteinase K, massa molecular da PrPres, topologia e quantidade dos depósitos da PrPres. Os resultados obtidos mostram que a PrPres de diferentes famílias de BSE e de tremura apresentam diferenças significativas na sua resistência de longa duração à proteinase K. Segundo a família de tremura, a resistência à PK varia: resistência baixa: família Chandler; resistência intermédia: família 22A; estabilidade relativa: família 87V. Nas mesmas condições, as famílias de BSE apresentam uma resistência intermédia. Uma vez que glicotipificar não permite distinguir entre a família de tremura 87V e as famílias de BSE, estes dois tipos de famílias podem ser distinguidos claramente após tratamento de longa duração com a PK. Todavia, não se trata de protocolos suficientemente fiáveis e utilizáveis em grande escala e no terreno.

Neste contexto, é importante dispormos de um processo de detecção das PrPress fiável, sensível, permitindo um diagnóstico diferencial, barato e fácil de levar a cabo, a partir de uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra de tecido. 10 A presente invenção tem, em consequência, ígualmente por objecto um processo de diagnóstico diferencial (processo B) das ESST provocadas por famílias de ATNC, numa amostra biológica, por detecção das PrPress associadas às diferentes famílias de ATNC, caracterízada por compreender: (a) a detecção da PrPres de uma família de ATNC numa primeira fracção da referida amostra de acordo com os passos (1) a (3) seguintes: (1) tratamento da referida amostra com, pelo menos, uma proteínase K de maneira a degradar completamente a PrPsens, conservando, no todo ou em parte, os motivos octapeptídeos repetidos da PrPres, qualquer que seja a família de ATNC; (2) colocação em contacto da referida amostra tratada com um ligante dos referidos motivos octapeptídeos, e (3) detecção da presença eventual do complexo motivos octapeptídeos repetidos-ligante, depois: (b) para cada amostra, para a qual a presença de um complexo motivos octapeptídeos repetidos-ligante é detectada no passo (a): tratamento de uma segunda fracção da referida amostra com, pelo menos, uma proteínase K, de maneira que a maioria dos motivos octapeptídeos repetidos seja eliminada pela PrPres associada a, pelo menos, uma família de interesse, nomeadamente, a família da BSE e onde o conjunto das PrPres associadas às outras famílias de ATNC conservam, no todo ou em parte, os referidos motivos octapeptídeos repetidos, colocação em contacto da segunda fracção da referida amostra tratada com um ligante dos referidos motivos octapeptídeos repetidos, e 11 detecção da presença eventual do complexo motivos octapeptídeos repetidos-ligante. A presente invenção tem também por objecto um processo de diagnóstico diferencial (variante do processo B) das ESST provocadas pelas famílias de ATNC numa amostra biológica considerada como contendo a PrPres (teste de detecção efectuado por qualquer método), caracterizado por compreender para cada amostra, em relação à qual a presença de uma PrPres foi detectada, a execução do passo (b) , tal como acima definido, colocação em contacto da referida segunda fracção da referida amostra tratada com um ligante dos referidos motivos octapeptídeos repetidos, e detecção da presença eventual do complexo motivos octapeptídeos repetidos-ligante.

De acordo com um modo de execução vantajoso do referido processo, o tratamento com a referida proteinase K de acordo com o passo (a) ou (b) é realizado durante 30 segundos a 2 horas a uma temperatura inferior a 80°C, de um modo preferido, entre 10 minutos e 30 minutos.

De acordo com uma disposição vantajosa deste modo de execução, o tratamento com a referida proteinase K é realizado, quer a uma concentração compreendida entre 30 e 200 pg/ml durante 10 minutos a 37°C para uma mistura homogeneizada a 10%, quer durante um período e a uma concentração equivalente à concentração compreendida entre 3 0 e 200 pg/ml nas condições pré-citadas e, de um modo ainda mais preferido durante 10 minutos a uma concentração compreendida entre 30 e 200 μ9/τη1 para uma mistura homogeneizada a 10% ou durante 30 minutos a uma 12 concentração entre 10 e 30 pg/ml, para uma mistura homogeneizada a 10%,

De acordo com um outro modo de execução vantajoso do referido processo, a proteinase K é dissolvida num tampão escolhido num grupo constituído pelos tampões de homogeneização da amostra biológica e pelos tampões que compreendem, pelo menos, um dos agentes seguintes: pelo menos, um agente tensioactivo e/ou, pelo menos, um agente caotrópico e/ou, pelo menos, um sal.

No quadro do diagnóstico diferencial (processo B), além da concentração em PK, outras condições podem eventualmente intervir na degradação dos motivos octapeptídeos, em função da família: com efeito, quando a PK é concretizada num tampão diferente do tampão de homogeneização, por exemplo, um tampão que compreenda, pelo menos, um agente tensioactivo e/ou, pelo menos, um agente caotrópico e/ou, pelo menos, um sal, o número de motivos octapeptídeos degradados pode variar em função da composição do referido tampão e da concentração dos diferentes agentes.

Entende-se por família de interesse, a ou as famílias de ATNC, a família de BSE, nomeadamente, para aquelas em que se deseja eliminar, por exemplo, os motivos octapeptídeos repetidos.

Uma das características principais dos processos A e B é jogar com as condições em que é efectuado o tratamento com protease de maneira a controlar a degradação dos motivos octapeptídeos repetidos. De acordo com a utilização pretendida, proceder-se-ã de maneira que os motivos sejam conservados (processo A) ou destruídos (processo B): no quadro do processo A, este controlo terá como objectívo que todos ou parte dos motivos octapeptídeos 13 repetidos sejam conservados com o fim de favorecer uma detecção muito sensível da PrPress; no quadro do processo B, o controlo da degradação pela protease terá como objectivo que a maioria e eventualmente a totalidade dos motivos octapeptídeos repetidos seja degradada pela PrPres correspondente à/às família(s) de interesse, qualquer que seja a espécie em que é expressa, nas condições em que no todo ou em parte os motivos octapeptídeos repetidos são conservados pela PrPres correspondente a todas as outras famílias de ESST. Neste caso, o interesse da invenção é permitir um diagnóstico diferencial da família de interesse relativamente às outras famílias de ATNC.

Com efeito:

De forma surpreendente, nas condições de acordo com o passo (1) ou o passo (a) , a PK não arrasta a clivagem no todo ou em parte dos motivos octapeptídeos repetidos das PrPres associadas a todas as famílias de ATNC ou priões, enquanto que as condições do passo (b) arrastam a clivagem dos motivos octapeptídeos repetidos da PrPres associada à família de interesse, enquanto que o conjunto das PrPres associadas às outras famílias de ATNC conservam no todo ou em parte os referidos motivos octapeptídeos repetidos.

Igualmente de forma surpreendente, este teste, nomeadamente quando o ligante ê um anticorpo, apresenta as vantagens seguintes: uma grande sensibilidade de detecção uma vez que os anticorpos dirigidos contra estes motivos octapeptídeos repetidos têm uma muito maior afinidade que os anticorpos dirigidos contra as outras regiões da PrPres 27-30 e são mais resistentes aos tampões utilizados; com efeito o 14 reconhecimento de um motivo repetido favorece as interacções de elevada afinidade e oferece a possibilidade de fixar várias moléculas de anticorpos numa só molécula de PrP; a possibilidade de um diagnóstico diferencial das famílias de ATNC ou triÓes, uma vez que é possível de acordo com as condições concretizadas obter ou não a digestão destes motivos; é nomeadamente possível eliminã-los em todas as doenças ligadas à família de interesse, o agente da BSE, por exemplo, enquanto que é possível conservã-la noutras doenças ditas de príões. Por este facto, os métodos de acordo com a invenção propõem um teste simples de diagnóstico diferencial da BSE e/ou de uma outra família de interesse em relação às outras famílias, conseguindo criar duas condições diferentes (passo (1) ou (a) e passo (b)), permitindo as condições do passo (1) ou (a) (conservando os motivos octapeptídeos repetidos das PrPres associadas ao conjunto de famílias de ATNC) a detecção de todas as famílias e das condições do passo (b) (eliminando estes motivos apenas na PrPres associada a uma família de interesse), apenas revelando as outras famílias.

Estes testes encontram portanto aplicação, nomeadamente, na pesquisa da contaminação da ovelha pela família da BSE que não sabemos habitualmente distinguir das famílias clássicas de tremura (scrapie).

De acordo com uma forma de realização vantajosa dos referidos processos, a PK é dissolvida no tampão que compreende, de um modo preferido: a. pelo menos um agente tensíoactivo escolhido no grupo constituído por: 15 tensioactivos aniónicos, tais como o SDS (dodecilsulfato de sódio) o sarcosil (lauroil-sarcosina), o colato de sódio, o desoxicolato de sódio, o taurocolato de sódio; tensioactivos zwítteriónicos, por exemplo, o SB 3-10 (decil-sulfobetaína) , o SB 3-12 (dodecil-sulfobetaína) , o SB 3-14, ο 3B 3-16 (hexadecil-sulfobetaína) , o CHAPS e o desoxiCHAPS; tensioactivos não iónicos, por exemplo, o C12E8 (dodecil-octa-etílenoglicol), o Triton ®X100, o Triton X114, o Tween 20, o Tween 80, o MEGA9 (nonanoil-metilglucamina), o octilglucoside, o LDAO(õxido de dodecíldimetilamina) ou ο NP40 ou misturas de tensioactivos, por exemplo, uma mistura de um agente tensioactivo iónico e de um agente tensioactivo não iónico, uma mistura de dois agentes tensioactivos iónicos ou uma mistura de um agente tensioacivo iónico e de um agente tensioactivo zwitteriónico e/ou b. pelo menos um agente caltrópico seleccionado no grupo constituído pela ureia e pela guanidina ou por uma mistura destes dois e/ou c. pelo menos um sal escolhido entre os sais de metais alcalinos ou não.

De acordo com uma disposição vantajosa deste modo de realização, o referido tampão compreende, pelo menos, 5% de tensioactivo aniónico, de um modo preferido, sarcosil associado eventualmente ao SDS.

De acordo com uma outra forma de realização vantajosa dos referidos processos, o ligante é escolhido no grupo constituído por aptameros e anticorpos que se ligam à região dos motivos octapeptídeos repetidos. 16

De acordo com uma outra forma de realização vantajosa dos referidos processos, o tratamento do passo (b) é realizado nas mesmas condições que as definidas no passo (a) (1) , mas a uma concentração em PK superior autorizada no passo (a) (1). A presente invenção tem, por outro lado, como objecto um kit de diagnóstico para a prática dos processos de acordo com a invenção, caracterizado por compreender, pelo menos, um agente tensioactivo e/ou, pelo menos, um agente caotrópico e/ou, pelo menos, um sal e uma protease como acima definido. 0 complexo motivos octapeptídeos repetidos-anticorpos (no caso em que o ligante é um anticorpo) é detectado pelos processos imunológicos normais.

Além das disposições precedentes, a invenção compreende ainda outras disposições que serão salientadas pela descrição que se vai seguir, a qual se refere a exemplos de realização do processo objecto da presente invenção, bem como aos desenhos anexos, nos quais: a figura 1 representa as diferentes sequências de PRP: humana, ovina, bovina, murina e de cricetídíos (por exemplo, o hamster); a figura 2 representa a detecção da PrPres pelo Wester- blot ; as figuras 3 a 6 correspondem a diferentes condições de acordo com o passo (1) ou (a) , por um lado, e com o passo (b) , por outro, no homem (figuras 3 e 4) e nos ruminantes (figuras 5 e 6) , no caso em que a presença dos motivos octapeptídeos repetidos ê detectada por uma dosagem imunométrica em dois locais; 17 as figuras 7-12 ilustrara a influência dos tampões na detecção diferencial da BSE e da tremura; as figuras 13 e 14 ilustrara a influência da composição dos tampões e da concentração era proteinase K(PK) para a detecção dos diferentes tipos de DCJ; a figura 15 ilustra os resultados obtidos por uma digestão directa de misturas homogeneizadas de cérebro pela proteinase K; a figura 16 ilustra as diferenças de resistência da

PrPres à proteinase K em função dos tipos de DCJ; a figura 17 ilustra a detecção por Western-blot de

PrPres digerida pela PK e purificada sob a forma de SAF.

Deve ser bem entendido todavia que estes exemplos são dados unicamente a título de ilustração do objecto da presente invenção da qual não constituem de forma alguma uma limitação. EXEMPLO 1: Obtenção e caracterização dos anticorpos monoclonais específicos do motivo octapeptídeo repetitivo. Síntese e marcação do peptídeo

Um peptídeo representativo do motivo octapeptídeo repetido da PrP, por exemplo, o motivo G-G-W-G-Q-P-H-G-G-G-W-G-Q-G- (NH2), correspondente à sequência 79-92 da PrP humana, foi sintetizado com a ajuda de um síntetizador automático (Milligen 9050, Waters, Mílford, MI). O peptídeo foi acoplado de forma covalente com a acetilcolinaesterase (AchE) por intermédio de um reagente heterobifuncional, o sucinimídilo 4-(N-maleimidometilo) ciclohexano-1- carboxílato (SMCC, Calbiochem, França; , como descrito 18 anteriormente para outros peptídeos ou proteínas (McLaughlin et al, 1987, Grassi et al, 1989). Este processo implica a reacção de um agrupamento tiol introduzido no peptídeo com a função maleimida que foi fixada no AchE por reacção com o SMCC. 0 agrupamento tiol foi introduzido no peptídeo por reacção com o N-sucinimidilo S-acetiltioacetato (SATA) como anteriormente descrito (McLaughlin et al, 1987). 0 acoplamento foi obtido fazendo reagir o AchE-SMCC com um excesso de peptídeo tiolado.

Imunização e preparação dos anticorpos monoclonais

Uma preparação de "Scrapie-associated fíbríls" (SAFs, preparação de PrPres) foi obtida a partir de cérebros de Hamsters infectados (família de tremura 263K) como descrito anteriormente (Lasmezas et al, 1997). Esta preparação foi inactivada por tratamento com ácido fórmico antes da imunização dos ratos. Ratos invalidados (knock-out) pelo gene da PrP (ratos PrP0/0 ) foram imunizados com preparações de SAF, e células de hibridoma foram preparadas como foi descrito anteriormente (Grassi et al, 1988, 1989). A triagem dos subsistentes de cultura foi realizada como atrás descrito. Puderam ser identificados e estabilizados 57 hibridomas: foram chamados SAF-1 a SAF-90. Todos estes anticorpos revelaram reconhecer os SAF imobilizados nas placas de microdoseamento, enquanto que uma minoria de entre eles demonstrou uma capacidade de reconhecer conjuntos peptídeo-AchE. Entre estes últimos, sete reconhecem claramente o motivo octapeptídeo repetido (peptídeo 79-92); trata-se dos anticorpos SAF-15, SAF-31, SAF-32, SÃF-33, SAF-34, SAF-35 e SAF-37. A lista dos anticorpos obtidos, bem como as suas características principais, são apresentadas na Tabela que se segue. Após clonagem e expansão sob a forma de líquido de ascite, os anticorpos monoclonais foram purificados por cromatografia 19 de afinidade em coluna de Proteína A-SEPHAROSE e conservados a -20°C até à utilização. O isotopo dos anticorpos foi determinado por imunodifusão radial segundo a técnica de Ouchterlony.

Triagem dos subsistentes de cultura de híbrídoma A presença específica de anticorpos da PrP nos subsistentes de cultura de hibridoma foi posta em evidência de duas maneiras, testando quer a sua capacidade de ligar conjuntos peptídeo-AchE quer SAFs de hamster. No primeiro caso, a triagem foi realizada em placas contendo um anticorpo anti-lgG de rato imobilizado, como descrito anteriormente (Creminon et al, 1993, Frobert et al, 1991). Em resumo, 100 μΐ de subsistentes de cultura e 100 μΐ de conjunto peptídeo-AchE foram postos a reagir durante uma noite a +4°C em placas contendo anticorpos de cabra anti-lgG de ratos imobilizados. Após a lavagem das placas, 200 μΐ de reagente de Ellman (Ellman et al, 1961) foram de novo juntos nos poços afim de detectar a presença de AchE fixado na fase sólida. No segundo caso, placas contendo uma preparação de SAF imobilizada foram preparadas fazendo reagir 5 0 μΐ de uma solução a 2 μ9/ιη1 num tampão fosfato 0,05 M, pH 7,4 durante uma noite à temperatura ambiente. Após a lavagem, as placas foram saturadas com o tampão EIA (tampão fosfato 100 mM, pH 7,4 contendo NaCl 150 mM, 0,1% do soro albumina bovino (BSA) e azotureto de sódio a 0,01%) durante uma noite a +4°C e foram conservadas a esta temperatura até à sua utilização. A ligação dos anticorpos monoclonais às SAF imobilizadas foi posta em evidência com a ajuda de anticorpos de cabra anti-lgG de rato marcados com AchE como anteriormente descrito (Negroní et al, 1998). 20

Tabela: Anticorpos monoclonais produzidos contra uma preparação de SAF de hamster.

AcMs Isotipo Peptídeo Reconhecido AcMs Isotipo Peptídeo Reconhecido SAF 1 IgM X SAF 54* IgG2b 142-160 SAF 2 ? A SAF 56 IgM A SAF 3 IgG2a X SAF 58 IgM A SAF 4 IgG2a A SAF 59 IgM A SAF 5 IgGl X SAF 60* IgG2b 142-160 SAF 7 IgG2a X SAF 61 IgG2a 142-160 SAF 8 IgGl A SAF 63 IgM A SAF 9 IgGl A SAF 65 IgGl(?) A SAF 10 X 0 X A SAF 66 IgG2a 142-160 SAF 11 IgG2a X SAF 67 IgGl X SAF 12 IgM A SAF 68 X Cj10 2 A SAF 13 IgM A SAF 69* IgG2b 142-160 SAF 14 IgGl A SAF 70* IgG2b 142-160 SAF 15* IÇfiaJ 79-92 SAF 72 IgG2b A SAF 21 IgGl X SAF 73 IgGl X SAF 22 2 A SAF 75 IgG2a 142-160 21

SAF 23 igGi X SAF 7 6 IgG2a 142-160 SAF 24 igGi A SAF 77 IeGl X SAF 31* IgG2b 79-92 SAF 80 IgGl X SAF 32* IgG2b 79-92 SAF 81 IgM A SAF 33* IgG2b 79-92 SAF 82 IgGl A SAF 34* IgG2a 79-92 SAF 83* IgGl A SAF 35* IgG2b 79-92 SAF 84* IgG2b A SAF 37* IgG2b 79-92 SAF 85 IgM A SAF 42 IgGl A SAF 91 IgM A SAF 44 IgM A SAF 94 IgM A SAF 50 igM A SAF 95 IgGl A SAF 51 X Cf 3SÍ A SAF 96 IgM A SAF 53 IgG2a X 22 79-92: Anticorpos reconhecendo o peptídeo 79-92. 142-160: Anticorpos reconhecendo o peptídeo 142-160. Epítope X: Anticorpos que apenas reconhecem os SAFs imobilizados. Epítope A: Anticorpos que reconhecem o peptídeo 126-174 mas não ligam os peptídeos 142-160. * Anticorpos mcnoclonais que demonstraram a sua capacidade para reconhecer a PrPres de pelo menos uma espécie testada durante este estudo (humana, bovina, ovina, rato e hamster) no quadro de uma dosagem imunométrica. EXEMPLO 2: Detecção da PrPres por Wester-blot 1. Tratamento de amostra (i) Preparação de uma mistura homogeneizada de tecido, a partir das diferentes amostras biológicas: vaca ESB, ovino com tremura, homem com DCJ (tipo 4) , homem com DCJ esporádica (tipo 1) e controlos negativos correspondentes.

Tomam-se antecipadamente 350 mg de cérebro bovino: trituram-se e faz-se a sua homogeneização a 20% (p/v) numa solução de glucose a 5%.

Para realizar a homogeneização, o cérebro (250 mg) antecipadamente tomado e 1,4 ml de solução de glucose são introduzidos em tubos, que compreendem pequenas esferas de cerâmica, e agitados fortemente (Ribolvser Hybaid). 23

Diluem-se as amestras positivas numa mistura homogeneizada proveniente de cérebros sãos da espécie correspondente como segue: para o ovino: no 1/100° para a vaca: no 1/50° para o homem: tipo 1 ou 4 no 1/40°; tipo 3 no 1/80°; tipo 2 no 1/20° (ii) condições do passo (1)

Incuba-se uma primeira fraeção (500 μΐ) de mistura homogeneizada a 20% obtida em (i) com 500 μΐ de um tampão que compreende sarcosil a 10% (SK10) do Triton X100 a 10% (T10), da ureia 2M (U2) e da proteinase K(PK) a 60 pg/ml de tampão (PK1) durante 10 minutos a 37°C (correspondendo a 30 μg/ml final para uma mistura homogeneizada a 10%).

Nas figuras 3-6, PK3 corresponde a uma concentração em PK de 180 μg/ml de tampão e PK6 corresponde a uma concentração em PK de 360 μg/ml de tampão. (iii) Juntam-se 500 μΐ de um tampão constituído por butanol-1 (correspondente aos tampões B, tais como vêm descritos no Pedido de Patente Internacional WO 99/41280) ; depois centrifugam-se a 15000 rpm durante 5 minutos (cerca de 17000 g). (iv) o depósito de centrifugação que contém a PrPres é retomado em 80-100 μΐ de um tampão C, tal como descrito no Pedido internacional de Patente WO 99/41280, de um modo preferido, um tampão de Laemmlí contendo 4% de SDS e aquecido a 100°C durante 5 min, para realizar um Wester-blot ou retomado, para efectuar uma dosagem 24 imunométrica, sucessivamente num tampão Cl que compreende ureia 6M e sarcosil a 0,5%, seguido de um aquecimento durante 5 min a 100GC, depois num tampão C2, que compreende a guanidina 2M, seguido de um aquecimento durante 5 min a 100°C. (v) condições do passo (b)

Incuba-se uma segunda fracção (500 μΐ de mistura homogeneizada a 20% obtida em (i) com 500 μΐ de um tampão que compreende sarcosil a 5% (SK5) , SDS a 5% (SDS5) ureia 1M (Ul) e proteinase K (PK) a 360 ^ig/ml (PK6) durante 10 min a 37°C, realizando-se depois os passos (iii) e (iv) acima referidos. II. Wester-blot

As amostras obtidas são utilizadas para realizar uma electroforese SDS-PAGE e transferidas para membrana de nitrocelulose nas condições expostas no exemplo l e no exemplo 3 do Pedido Internacional WO 99/41280 atrás citado. A imunodetecção da PrPres é realizada com os anticorpos monoclonais SAF70 e SAF37, tal como vem descrito no exemplo 1 acima, e Ig de cabra anti-coelho conjugados com a peroxidase (1/2500). A imunoreactividade é revelada pela quimioluminiscência (ECL. Amlersham), quantificada e visualizada em películas autorradiográficas, como ilustrado na figura 2.

Nesta figura: as pistas 1-5 correspondem a condições segundo o passo (1) ou (a) (SK10+T10+U2+PK1):

Pista l: controlo negativo 25

Pista 2: vaca ESB

Pista 3: ovino com tremura Pista 4: homem com DCJ (tipo 4}

Pista 5: homem com DCJ (tipo 1} e *as pistas 6-10 correspondem a condições segundo a etapa (b) (SK10+SDS5+U1+PK6):

Pista 1: controlo negativo

Pista 2: vaca ESB

Pista 3; ovino com tremura

Pista 4: homem com DCJ (tipo 4)

Pista 5: homem com DCJ (tipo 1) e

Os resultados obtidos mostram que: na etapa (1) ou (a) (pistas 1 a 5) , a PrPsens é sistematicamente destruída, enquanto que o sinal obtido com a PrPres é sistematicamente superior, com o anticorpo dirigido contra os motivos octapeptídeos repetidos, no sinal obtido nas mesmas amostras com um anticorpo dirigido contra a região 142-160 da PrP; na etapa (b) (pistas 6 a 10} , a PrPsens é sistematicamente destruída, enquanto que o sinal obtido nas pistas 8 e 10 (na presença do anticorpo dirigido contra os motivos octapeptídeos repetidos) é similar ou superior ao sinal obtido nas mesmas amostras com um anticorpo dirigido contra a região 142-160 da PrP, enquanto que é inferior e mesmo não detectável nas pistas 7 e 9 (PrPres do ESB). 26 EXEMPLO 3: Detecção da PrPres com uma dosagem imunomêtrica em dois locais utilizando como anticorpo de captura um anticorpo monoclonal que reconhece os motivos octapeptídeos repetidos.

Para realizar uma dosagem imunomêtrica em dois locais, o depósito obtido em (iv) do exemplo 2 é, por exemplo, dissolvido num tampão que compreende sarcosil (0,25-1%) e ureia (0,25-8 M) ou SDS (0,25-1%) e ureia (0,25-lM); a amostra obtida será, de um modo preferido, diluída (a 1/4 ou a 1/2) , após aquecimento com um tampão contendo albumina que conduza a uma concentração final de albumina compreendida entre 0,1 e 1% (p/v) ou com um tampão contendo desoxicolato a 1%. A dosagem imunomêtrica em dois locais é realizada em placas de microdoseamento contendo um anticorpo imobilizado nas condições jã descritas para as outras proteínas (Grassi et al, 1989). O seu princípio é o seguinte: a PrP analisada é reconhecida por um anticorpo fixado no suporte sólido (anticorpo de captura) e por um segundo anticorpo, que reconheça uma outra parte da molécula, que está marcada com uma enzima (aqui a acetilcolinaesterase, anticorpo marcador), de cinco unidades Ellman/ml (1 unidade Ellman = 7,35xl0~2 unidades enzimáticas).

No quadro da invenção, o anticorpo de captura é dirigido contra os motivos octapeptídeos repetidos e o anticorpo marcador reconhece uma sequência compreendida na região 94-230 da PrP, por exemplo, a zona 142-160 da PrP. Após a lavagem da fase sólida, a actividade enzimátíca fixada na placa é proporcional â quantidade de PrPres que possui motivos octapeptídeos repetidos inicialmente na amostra analisada.

Na prática, a dosagem é realizada da maneira seguinte: 27 ΙΟΟμΙ da solução de PrP a analisar são depositados nos poços da placa de mícrodoseamento contendo o anticorpo que reconhece os motivos octapeptídeos repetidos. Apôs 3 horas de reacção â temperatura ambiente, a placa é lavada antes de se acrescentarem 100 μΐ de uma solução do anticorpo marcador (5 unidades Hellman/ml; uma unidade Hellman = 7,35χ10"2 unidades enzimáticas). Após uma noite de reacção a +4 ° C, as placas são lavadas de novo antes de se lhes juntarem 200 μΐ de uma solução de substrato (reagente de Ellman, Grassi et al, 1989) que vai permitir medir a actividade da acetilcolinaesterase fixada à fase sólida. Após 30 minutos de reacção enzimática, a absorvência (D.O. a 414 nm) de cada poço é medida. EXEMPLO 4; Estudo comparativo de diferentes condições: passo (1) ou (a) e passo (b).

As amostras são preparadas como é descrito no exemplo 2.

As misturas homogeneizadas são preparadas como no exemplo 2. no homem

As figuras 3 e 4 ilustram os resultados obtidos com diferentes tampões: condições de acordo com o passo (1) ou (a) do processo de acordo com a invenção: I: mistura homogeneizada a 20%+SK10+T10+U2+PKl III': mistura homogeneizada a 10%+SK5+T5+U1+PK0,5 (figura 4) 28 condições de acordo com o passo (b) do processo de acordo com a invenção: II: mistura homogeneizada a 20%+SK10+T10+U2+PK3 III: mistura homogeneizada a 2Q%+SK10+T1Q+U2+PK6 III'': mistura homogeneizada a 10%+SK5+T5+U1+PK6 (figura 4} IV: mistura homogeneizada a 20%+SK20+PK3 V: mistura homogeneizada a 20%+SK20+U1+PK3 VI: mistura homogeneizada a 20%+SK20+U2+PK3 VII: mistura homogeneizada a 10%+SK20+PK3 VIII: mistura homogeneizada a 10%+SK20+U1+PK3 IX: mistura homogeneizada a 10%+SK20+U2+PK3 X: mistura homogeneizada a 10%+SK5+SDS5+U1+PK6 X': mistura homogeneizada a 10%+SK2,5+SDS2,5+U2+PK6 (figura 4) XI: mistura homogeneizada a 20%+SK20+PK6 XII: mistura homogeneizada a 20%+SK20+Ul+PXC6 XIII: mistura homogeneizada a 20%+SK20+U2+PK6 XIV: mistura homogeneizada a 10I+SK20+PK6 XV: mistura homogeneizada a 10%+SK20+U1+PK6 XVI: mistura homogeneizada a 101+SK20+D2+PK6 A quantidade de PrPres que tenha conservado o motivo octapeptídeo repetido é medida com a ajuda da dosagem imunométrica em dois locais (absorvência no D.O. a 414 nm, 29 ver exemplo 3; mede-se o aparecimento de uma cor amarela, reagente de Eilman): controlo negativo (□), DCJ esporádica de tipo 1 (Π) e DCJ de tipo 4 (p). nos ruminantes

As figuras 5 e 6 ilustram os resultados obtidos com diferentes tampões: condições de acordo com o passo (1) do processo de acordo com a invenção: I: mistura homogeneizada a 20%+SK10+T10+U2+PKl III': mistura homogeneizada a 10%+SK5+T5+U1+PKQ,5 (figura 6)

Condições de acordo com o passo (b) do processo de acordo com a invenção: II: mistura homogeneizada a 2Q%+SK10+T1Q+U2+PK3 III: mistura homogeneizada a 20%+SK10+T10+U2+PK6 III'': mistura homogeneizada a 10%+SK5+T5+U1+PK3 (figura 6) IV: mistura homogeneizada a 20%+SK20+PK3 V: mistura homogeneizada a 20%+SK20+Ul+PK3 VI: mistura homogeneizada a 20%+SK20+U2+PK3 VII: mistura homogeneizada a 10%+SK20+PK3 VIII: mistura homogeneizada a 10%+SK2Q+U1+PK3 IX: mistura homogeneizada a 10%+SK20+U2+PK3 X: mistura homogeneizada a Í0I+SK5+SDS5+U1+PK6 30 5) X': mistura homogeneizada a 10%+SR5+SDS5+U1+PK3 (figura XI: mistura homogeneizada a 20%+SK20+PK6 XII: mistura homogeneizada a 20%+SK2Q+Ul+PK6 XIII: mistura homogeneizada a 20%+SK20+U2+PK6 XIV: mistura homogeneizada a 10%+SK20+PK6 XV: mistura homogeneizada a 1G%+SK2G+U1+PK6 XVI: mistura homogeneizada a 10%+SK20+U2+PK6 A quantidade de PrPres que tenha conservado o motivo octapeptídeo repetido é medida com a ajuda da dosagem imunométrica em dois locais (absorvência no D.O. a 414 nm, ver exemplo 31 ATNC ovino (!) controlo negativo (□), ATNC bovino

Figuras 7 (Wester-blot) e 8 (dosagem imunométrica em dois locais): A comparação é efectuada a partir de misturas homogeneizadas a 20% de cérebros de ovinos sãos, de ovinos atingidos pela tremura e de bovinos atingidos por BSE, obtidos, nas condições expostas no exemplo 2.

Tratamento das amostras: A: sarcosil a 10%+Triton a 10%+ureia 2M+proteinase K 60 pg/ml durante 10 minutos B: sarcosil a 10%+ureia 2M+proteinase K 240 pg/ral durante 10 minutos C: sarcosil a 101+proteínase K 240 yg/ml durante 10 minutos 31

Detecção por Wester-blot (figura 7} : anticorpo Saf 37 e Saf 84 (ver exemplo l)

por imunometria (figura 8): captura por Saf 37 e revelação por um anticorpo dirigido contra a região 94-230 da PrP

Figuras 9 (Wester-blot) e 10 (dosagem imunométrica em dois locais): A comparação é efectuada a partir de misturas homogeneizadas a 20% de cérebros de ovinos sãos, de ovinos atingidos pela tremura e de bovinos atingidos por BSE, obtidos, nas condições expostas no exemplo 2.

Tratamento das amostras:

A: sarcosil a 10%+Triton a 10%+ureia 2M+proteinase K 60pg/ml durante 10 minutos B: SDS a 10%+Triton a 5%+ureia 2M+proteinase K 180 gg/ml, durante 10 mintos

Detecção

Nas mesmas condições que anteriormente.

Apenas o aumento da dose em PK permite fazer aparecer uma sensibilidade diferencial da região dos motivos octapeptídeos repetidos, entre a BSE e a tremura nos ovinos mas não no homem (entre o tipo 1 e o tipo 4).

Pelo contrário, modificando igualmente a composição no que respeita ao agente tensíoactivo e ao agente caotrópico, é possível fazer aparecer uma sensibilidade diferencial da região dos motivos octapeptídeos repetidos em todos os casos. 32 EXEMPLO 5: Influência da composição dos tampões na detecção diferencial da BSE e da tremura

Figuras 11 (Wester-blot} e 12 (dosagem imunométrica em dois locais): A comparação é efectuada a partir de misturas homogeneizadas a 10% de cérebros de ratos sãos ou de ratos experimentalmente infectados com a família C506M3 (tremura) ou com uma família 5PB1 (BSE) obtidas nas condições expostas no exemplo 2.

Tratamento das amostras: A: sarcosil a 10%+Triton a 10%+ureia 2M+proteinase K 30 pg/ml durante 10 minutos B: sarcosil a 10%+Triton a 10%+ureia 2M+proteinase K 60 pg/ml durante 10 minutos

C: sarcosil a 10%+Tríton a 10%+ureia 2M+proteinase K 180 pg/ml durante 10 minutos D: sarcosil a 10%+Triton a 10%+ureia 2M+proteinase K 360 pg/ml durante 10 rninulos E: sarcosil a 10%+ureía 2M+proteinase K 180 pg/ml durante 10 minutos.

Detecção por Wester-blot (figura 11): anticorpos Saf 37 e Saf 70 (ver exemplo 1) por imunometria (figura 12) : captura por Saf 3 7 e revelação por um anticorpo dirigido contra a região 94-230 da PrP. 33

Os resultados obtidos mostram que apenas o aumento da dose de PK permite fazer aparecer uma sensibilidade diferencial da região dos motivos oetapeptídeos repetidos entre a BSE e a tremura nos ratos.

EXEMPLO 6: Influência dos tampões e da concentração de proteinase K na detecção das diferentes DCJ

Figuras 13 (Wester-blot) e 14 (dosagem imunométrica em dois locais) : A comparação é efectuada a partir de misturas homogeneizadas a 10% de cérebros de homens sãos e de homens atingidos pela DCJ (tipos 1, 2, 3 e 4) obtidas nas condições expostas no exemplo 2.

Tratamento das amostras: A: sarcosil a 10%+Triton a 10%+ureia 2M+proteinase K30 pg/ml durante 10 minutos B: sarcosil a 10%+Triton a 10%+ureia 2M+proteinase K180 pg/ml durante 10 minutos C: minutos sarcosil a 10%+proteinase K30 pg/ml durante 10 D: sarcosil a 10%+proteinase K60 pg/ml durante 10 minutos E: sarcosil a 10%+proteinase Kl 80 pg/ml durante i n J. \J minutos F: sarcosil d 10%+proteinase K360 pg/ml durante 1.0 minutos.

Detecção 34 por Wester-blot (figura 13}: anticorpos Saf 37 e Saf 70 (ver exemplo 1) por imunometria (figura 14) : captura por Saf 37 e revelação por um anticorpo dirigido contra a região 94-230 da PrP.

Figuras 15 (Wester-blot) e 16 (imunometria) A comparação ê efectuada a partir de misturas homogeneizadas a 10% de homens sãos e de homens atingidos por DCJ (tipos 1, 2, 3 e 4) obtidas nas condições expostas no exemplo 2.

Tratamento das amostras:

Figura 15: digestão por proteinase K (150 pg/ml) durante 10 minutos.

Figura 16: sarcosil a 10%+ureia 2M+proteinase K (de 30 a 360 pg/ml)f durante 10 minutos.

Detecção por Wester-blot (figura 15) : anticorpo Saf 37 e um anticorpo dirigido contra a região 94-230 da PrP (ver exemplo 1) por imunometria (figura 16) : captura por Saf 37 e revelação por um anticorpo dirigido contra a região 94-230 da PrP.

Os resultados obtidos mostram que o aumento da dose de PK permite fazer aparecer uma sensibilidade diferencial da região dos motivos octapeptídeos repetidos nos diferentes tipos de DCJ. Nestas condições não existe diferença significativa entre o tipo 1 e o tipo 4; o facto de alterar a composição de agente tensioactivo e de agente caotrõpico, 35 na mesma dose de PK (E, figuras 13 e 14) permite destruir os octapeptídeos no tipo 4, conservando-os no tipo 1.

Além disso, a figura 16 permite mostrar a diferença de sensibilidade das PrPres resultantes de diferentes famílias, por um mesmo tampão, em função da dose de PK.

Aliás, a figura 15 mostra que um tratamento directo da mistura homogeneizada pela PK põe em evidência um outro tipo de sensibilidade da PrPres à degradação.

EXEMPLO 7: Detecção por Western-blot da PrPres digerida e purificada sob a forma de SAF

Misturas homogeneizadas, obtidas nas condições do exemplo 2, são tratadas como a seguir se indica:

Mistura homogeneizada a 20% (500 pi)+NaCl a 20% (500μ1)+((sarcosil a 20%+SB314 2%)(500 μ!)+ΡΚ (20pg/ml final) durante 1 hora. A figura 17 ilustra os resultados: b e d: pistas 1-7: resultados obtidos com diferentes diluições de família C506M3 da tremura nos ratos (diluições 1/20, 1/50, 1/250, 1/500, 1/1000 e 1/2000) pista 8: pesos moleculares pistas 9-15: resultados obtidos com diferentes diluições de família BSE nos ratos (diluições 1/1000 a 1/10) . É possível eliminar inteiramente o sinal BSE. 36 a e c: os resultados obtidos confirmam que há um aumento significativo do sinal na presença de anticorpos dirigidos contra os motivos octapeptídeos repetidos. e: esta figura mostra que é possível obter uma diminuição do sinal com BSE, tanto no macaco como no homem (pistas 4 e 7} .

Referências

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Lisboa, 10 de Abril de 2007 38

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo de diagnóstico de uma ESST ou doença de priões provocada por uma família de ATNC pela detecção da PrPres numa amostra biológica, caracterízado por compreender: (1) o tratamento da referida amostra com, pelo menos, uma proteinase K, quer com uma concentração compreendida entre 30 e 200 μ9/τη1 durante 10 minutos a 37 °C para uma mistura homogeneisada a 10%, quer durante um período e com uma concentração equivalente à concentração compreendida entre 3 0 e 200 ^ig/ml nas condições pré-citadas, de uma forma ainda mais preferida, durante 10 minutos a uma concentração compreendida entre 3 0 e 200 p.g/ml para uma mistura homogeneisada a 10% ou durante 30 minutos a uma concentração compreendida entre 10 e 70 μg/ml, para uma mistura homogeneisada a 10%, sendo a referida proteinase dissolvida num tampão escolhido entre o grupo constituído pelos tampões de homogeneisação de amostra biológica e tampões compreendendo, pelo menos, um dos agentes seguintes: pelo menos, um agente tensioactivo e/ou, pelo menos, um agente caotrópico e/ou, pelo menos, um sal de forma a degradar completamente a PrPsens, conservando no todo ou em parte motivos octapeptídeos repetidos da PrPres, qualquer que seja a família de ATNC, 1 (2} o estabelecimento do contacto da referida amostra tratada com um ligante com os referidos motivos octapeptídeos, e (3)a detecção da presença eventual do complexo de motivos octapeptídeos repetidos -ligantes.
2, Processo de diagnóstico diferencial das ESST provocadas por famílias de ATNC, numa amostra biológica por detecção das PrPres associadas às diferentes famílias de ATNC, caracterizado por compreender: (a) a detecção da PrPres de uma família de ATNC numa primeira fracção da referida amostra de acordo com os passos (1) a (3) seguintes: (1) o tratamento da referida amostra com, pelo menos uma proteinase K, de maneira a degradar completamente a PrPsens, conservando no todo ou em parte motivos octapeptídeos repetidos da PrPres, qualquer que seja a família de ATNC, (2) o estabelecimento do contacto da referida amostra tratada com um ligante dos referidos motivos octapeptídeos e (3) a detecção da presença eventual do complexo motivos octapeptídeos repetidos-ligante, depois: (b) por cada amostra na qual a presença do complexo motivos octapeptídeos repetidos - -ligante é detectada no passo: 2 (a)o tratamento de uma segunda fracção da referida amostra com, pelo menos, uma proteinase K de maneira que a maioria dos motivos octapeptídeos repetidos seja eliminada pela PrPres associada a, pelo menos, uma família de interesse, nomeadamente, a família da ESB ou do conjunto das PrPres associadas às outras famílias de ATNC conservando no todo ou em parte os referidos motivos octapeptídeos repetidos, o estabelecimento do contacto da referida segunda fracção da referida amostra tratada com um ligante dos respectivos motivos octapeptídeos repetidos e a detecção da presença eventual do complexo motivos octapeptídeos repetidos-ligante.
3. Processo de diagnóstico diferencial das ESST provocadas por famílias de ATNC numa amostra biológica considerada como contendo PrPres, caracterizado por compreender, para cada amostra na qual a presença de um PrPres foi detectada, a execução do passo (b) de acordo com a reivindicação 2, estabelecimento do contacto da referida segunda fracção da referida amostra tratada com um ligante dos referidos motivos octapeptídeos repetidos e a detecção da presença eventual do complexo motivos octapeptídeos repetidos-ligante.
4. Processo de acordo com a reivindicação 2 ou com a reivindicação 3, caracterizado por o tratamento com a referida proteinase K de acordo com o passo (a) ou (b) ser realizado durante 3 0 segundos a 2 3 horas, a uma temperatura inferior a 80°C, de um modo preferido, entre 10 minutos e 30 minutos.
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o tratamento com a referida proteinase K ser realizado, quer a uma concentração compreendida entre 30 e 200 pg/ml durante 10 minutos a 37 °C para uma mistura homogeneisada a 10% durante um período e uma concentração equivalentes à concentração compreendida entre 30 e 200 pg/ml nas condições pré-citadas e, de um modo ainda mais preferido, durante 10 minutos a uma concentração compreendida entre 30 e 200 μg/ml para uma mistura homogeneisada a 10% ou durante 3 0 minutos a uma concentração compreendida entre 10 e 70 μg/ml para uma mistura homogeneisada a 10%.
6. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 5, caracterizado por a proteinase K ser dissolvida num tampão seleccionado do grupo constituído pelos grupos de homogeneização da amostra biológica e tampões compreendendo, pelo menos, um dos agentes seguintes: pelo menos, um agente tensioactivo e/ou um agente caotrõpico e/ou, pelo menos, um sal.
7. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 6, caracterizado por o referido tampão compreender, de um modo preferido: (a)pelo menos, um agente tensioactivo, seleccionado no grupo constituído por: tensioctivos aniónicos, tais ccmo o SDS (dodecilsulfato de sódio), o sarcosil (lauroil- 4 - sarcosina) , o colato de sódio, o desoxicolato de sódio e o taurocolato de sódio; tensioactivos zwitteriónicos, tais como, o SB 3-10 (decil-sulfobetaina) o SB 3-12 (dodecil--sulfobetaína), o SB 3-14, o SB 3-16 (hexadecil-sulfobetaína), o CHAPS e o desoxiCHAPS; tensioactivos não iónicos, tais como o C12E8(dodecil-octa-etilenoglicol), o TRITON X 100, o Triton X 114, o TWEEN 20, o TWEEN 80, o MEGA 9 (nonanoil-metilglucamina), o octiglucoside, o LDAO (óxido de dodecil- -dimetilamina) ou ο NP40, ou misturas de tensioactivos, tais como uma mistura de um agente tensioactivo iónico e de um agente tensioactivo não iónico, uma mistura de dois agentes tensioactivos iónicos ou uma mistura de um agente tensioactivo iónico e de um agente tensioactivo zwitteriónico e/ou b. pelo menos um agente caotrópico seleccionado no grupo constituído pela ureia e pela guanidina ou uma mistura de ambos e/ou c. pelo menos um sal escolhido entre os sais de metais alcalinos ou não.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterízado por o referido tampão compreender, pelo menos, 5% de tensioactivo aniónico, de um modo preferido, sarccsil, eventualmente associado ao SDS. 5
9. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado por o ligante ser seleccionado de um grupo constituído por aptameros e anticorpos que se liguem â região dos motivos octapeptídeos repetidos.
10. Processo de acordo com a reivindicação 2, reivindicação 4 ou reivindicação 5, caracterizado por o tratamento do passo (b) ser realizado nas mesmas condições que as definidas no passo (a) (1) , mas com uma concentração em PK superior à utilizada no passo (a) (1).
11. Equipamento de diagnóstico para a execução dos processos de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado por compreender, pelo menos, em associação um agente tensioactivo e/ou, pelo menos, um agente caotrõpico e/ou um sal de uma protease, tais como definidos em qualquer das reivindicações 1 a 10. Lisboa, 10 de Abril de 2007 6