ES2373762T3 - Ensayo de priones. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de ensayo, que comprende las etapas de: (a) obtener una muestra que se sospecha que contiene una forma patógena de proteína priónica (PrP Sc ) que tiene un núcleo resistente a proteasa y una región de octarrepetición, en el que dicha muestra puede contener o puede no contener una forma normal de proteína priónica (PrP C ); (b) tratar dicha muestra con al menos una proteasa específica del sitio en condiciones en las que la digestión proteolítica de dicha PrP Sc y dicha PrP C , si está presente, da como resultado dicha PrP Sc y dicha PrP C , si está presente, que está escindida en al menos el 90% de todos los sitios de escisión de proteasa disponible, en el que dicha proteasa específica del sitio es tripsina o S-V8, i. en el que dicha PrP Sc no tiene sitio de escisión para dicha proteasa dentro de dicha región de octarrepetición o entre dicha región de octarrepetición y dicho núcleo resistente a proteasa, de manera que un fragmento de la región amino-proximal que incluye dicha región de octarrepetición sigue estando conectado a dicho núcleo resistente a proteasa tras dicha digestión proteolítica, y ii. en el que dicha PrP C tiene al menos un sitio de escisión disponible para dicha proteasa dentro de la región de aminoácidos que corresponde a dicho núcleo resistente a proteasa, y dicho al menos un sitio de escisión disponible se escinde mediante dicha digestión proteolítica; (c) prevenir cualquier digestión proteolítica adicional tras dicha digestión proteolítica en (b) añadiendo un inhibidor de la proteasa o eliminando dicha proteasa; (d) desnaturalizar dicha PrP Sc tratada con proteasa específica del sitio proporcionando de ese modo PrP Sc desnaturalizada; y (e) detectar la presencia de dicha PrP Sc desnaturalizada usando al menos dos componentes de unión, un primer componente de unión y un segundo componente de unión, i. en el que dicho primer componente de unión se une específicamente a un primer epítopo que está ubicado dentro de dicho fragmento de la región amino-proximal que sigue estando conectado a dicho núcleo resistente a proteasa tras dicha digestión proteolítica, y ii. en el que dicho segundo componente de unión se une específicamente a un segundo epítopo que está ubicado dentro de dicho núcleo resistente a proteasa, en el que dicho segundo epítopo está en una región de dicha PrP C que está separada de dicho primer epítopo tras dicha digestión proteolítica.

Description

Ensayo de priones

Campo de la invención

La invención se refiere a un procedimiento de ensayo para detectar la presencia de priones patógenos en una muestra. La invención se refiere también a kits que comprenden reactivos usados en el procedimiento de ensayo.

Antecedentes

Las enfermedades amiloideas se originan por la transición de proteína soluble en un forma agregada insoluble. También existen pruebas de que esta conversión está asociada con un cambio conformacional en la estructura secundaria y terciaria. Existen pruebas en aumento de que la acumulación de depósitos de proteínas dañan células y tejidos conduciendo a enfermedades. Varias enfermedades están asociadas con la deposición de proteínas específicas.

Un grupo de enfermedades conformacionales se denomina “enfermedades priónicas” o “encefalopatías espongiformes transmisibles (EET)”. Estas enfermedades se manifiestan en seres humanos y animales. En seres humanos, las enfermedades priónicas incluyen la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), variante de ECJ (vECJ), síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), insomnio familiar fatal y kuru (véase por ejemplo, Isselbacher et al., eds. (1994). Harrison’s Principles of Internal Medicine. New York: McGraw.Hill, Inc.; Medori et al. (1992) N. Engl. J. Med. 326: 444-9). En animales, las enfermedades priónicas incluyen tembladera de las ovejas, encefalopatía espongiforme bovina (EEB), encefalopatía transmisible del visón y enfermedad consuntiva crónica de alce y ciervo mulo en cautividad (Gajdusek, (1990). Subacute Spongiform Encephalopathies: Transmissible Cerebral Amyloidoses Caused by Unconventional Viruses. En: Virology, Fields, ed., New York: Raven Press, Ltd. (pág. 22892324)).

Recientemente, la rápida propagación de EEB y su correlación con una elevada aparición de EET en seres humanos ha conducido a un aumento del interés en la detección de EET en mamíferos no humanos. Las consecuencias trágicas de la transmisión accidental de estas enfermedades (véase, por ejemplo, Gajdusek, Infectious Amyloids, and Prusiner Prions In Fields Virology. Fields, et al., eds. Philadelphia: Lippincott-Ravin, Pub. (1996); Brown et al. Lancet, 340: 24-27 (1992)), las dificultades de la descontaminación (Asher et al. (1986) En: Laboratory Safety: Principles and Practices, Miller ed., (pág. 59-71) Am. Soc. Micro.) y la preocupación sobre la EEB (British Med. J. (1995) 311: 1415-1421) son la base de la urgencia de tener tanto una prueba diagnóstica que identificaría seres humanos y animales con EET como terapias para sujetos infectados.

Los priones se diferencian significativamente de bacterias, virus y viroides. La hipótesis dominante es que, a diferencia de todos los otros patógenos infecciosos, la enfermedad se origina por una conformación anómala de la proteína priónica, que actúa como un molde y convierte conformaciones de priones normales en conformaciones anómalas, aberrantes. La proteína priónica, o PrP, se caracterizó por primera vez en los primeros años 1980. (véase, por ejemplo, Bolton et al. (1982) Science 218: 1309-1311; Prusiner et al. (1982) Biochemistry 21: 6942-6950; McKinley et al. (1983) Cell 35: 57-62). Los genes que codifican la proteína priónica completa desde entonces se han clonado, secuenciado y expresado en animales transgénicos. (véase, por ejemplo, Basler et al. (1986) Cell 46: 417428). La forma celular normal de la proteína priónica, que se denomina también PrPC, es una proteína de 33-35 kD de función indefinida y, en seres humanos, está transcrita por un gen en el brazo corto del cromosoma 20. La proteína priónica conformada de manera anómala también se denomina una proteína escrapie o una proteína priónica patógena (PrPSc). La deposición de PrPSc en el sistema nervioso central (SNC) está asociada con la degeneración de neuronas y es siempre letal. La PrPSc es infecciosa y la exposición a tejidos que contienen infectividad podría dar como resultado la enfermedad. La inoculación experimental de PrPSc en animales de laboratorio que incluyen primates, oveja, roedores y ratones transgénicos dieron como resultado la transmisión de la enfermedad priónica. (Véase, por ejemplo, Zhang et al. (1997) Biochem. 36(12): 3543-3553; Cohen & Prusiner (1998) Ann. Rev. Biochem. 67: 793-819; Pan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10962-10966; Safar et al. (1993) J Biol. Chem. 268: 20276-20284.)

La estructura sustancialmente de lámina 1 de PrPSc en comparación con las formas no enfermas plegadas predominantemente de hélice a de PrPC se ha revelado mediante estudios de espectroscopía óptica y cristalografía. (Véase, por ejemplo, Wille et al. (2001) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 99: 3563-3568; Peretz et al. (1997) J. Mol. Biol.

273: 614-622; Cohen & Prusiner, (1999) 5: Structural Studies of Prion Proteins. En Prion Biology And Diseases, S. Prusiner, ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold SpringHarbor Laboratory Press. (pág: 191-228). Los cambios estructurales de PrPC a PrPSc parecen estar seguidos por alteraciones en las propiedades bioquímicas: PrPC es soluble en detergentes no desnaturalizantes, PrPSc es insoluble y forma oligómeros que están compuestos de hasta 1000 moléculas; PrPC se digiere fácilmente por proteasas, mientras que PrPSc es parcialmente resistente, dando como resultado la formación de un fragmento truncado de manera amino-terminal conocido como núcleo o forma “PrP 27-30” (27-30 kDa), “PrPres” o “PK-resistant” (resistente a proteinasa K), que corresponde al fragmento de residuos de aminoácidos de aproximadamente 90 a aproximadamente 231, enumerados según la secuencia de longitud completa de PrP de hámster sirio o humana incluyendo el péptido señal. (Véase, por ejemplo, Baldwin et al.

(1995) J. Biol. Chem. 270:19197-19200; Prusiner et al. (1982) Biochemistry 21:6942-6950; Prusiner et al. (1983) Cell 35:349-358; Collinge, J. y Palmer, M.S. (1997) Prion Diseases, Oxford University Press, Nueva York). Adicionalmente, PrPSc puede convertir PrPC en la conformación patógena. (Véase, por ejemplo, Kaneko et al. (1995) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 92:11160-11164; Caughey (2003) Br Med Bull. 66: 109- 20; Telling et al. (1995) Cell 83:79-90; Kaneko et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10069-10074; DebBurman et al. (1997) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 94: 13938-13943;.Horiuchi et al. (1999) EMBO J. 18:3193-3203; Horiuchi et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 5836-5841; Kocisko et al. (1994) Nature 370:471-474).

Ha demostrado dificultad la detección de las isoformas patógenas de proteínas patológicas conformacionales en sujetos vivos, y las muestras obtenidas de sujetos vivos. Aunque la detección de amiloides en general puede conseguirse con tinción de rojo Congo, este tipo de tinción es impreciso y no sensible. La detección específica y de alta afinidad de una proteína dada en presencia de otras proteínas como en célula, tejido u homogeneizado se realiza normalmente con anticuerpos que son específicos para la proteína seleccionada como objetivo. No obstante, las proteínas que comparten la misma secuencia pero difieren en conformación complican la detección discriminatoria mediante anticuerpos. De hecho, la mayor parte de anticuerpos producidos frente a PrP se unen a PrPC o tanto a PrPC como a PrPSc (véase, por ejemplo, Matsunaga et al. (2001) Proteins: Structure, Function and Genetics 44: 110-118). Además, la agregación de PrPSc reduce las concentraciones de epítopo eficaces para un anticuerpo; impidiendo de ese modo la unión eficaz de anticuerpos específicos a PrP. Por tanto, la inmunodetección eficaz de PrPSc necesita la disociación y desnaturalización de PrPSc en confórmeros similares a PrPC mientras se discrimina en contra de las moléculas de PrPC originales.

Varios procedimientos de inmunoensayo publicados se basaron en la comparación del nivel de unión de anticuerpos que sólo se unen a PrPC nativa pero no a PrPSc nativa con el nivel de unión de anticuerpos que se unen tanto a PrPSc como PrPC nativas con el fin de determinar la presencia de PrPSc. (Véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.214.565 B1 y 6.406.864 B2.) Otro procedimiento de inmunoensayo se basó también en comparar los niveles de unión a anticuerpo, pero implicaba una etapa de desnaturalización para desnaturalizar PrPSc y PrPC antes de la unión de éstos al mismo anticuerpo que el usado para unirse a PrPC nativa. (Véase la patente estadounidense n.º 5.891.641.) Sin embargo, existen limitaciones en estos procedimientos de ensayo porque, usando estos procedimientos, la detección mediante anticuerpos eficaz de PrPSc puede obtenerse solamente cuando la cantidad de PrPC es muy baja. En un exceso de PrPC, por ejemplo, cuando se toman muestras de sujetos en las fases tempranas de la enfermedad priónica, es difícil o incluso imposible de observar un aumento de la inmunodetección debido a la presencia de PrPSc. Por ejemplo, la detección de PrPSc desnaturalizada en muestras plasmáticas con 1000 veces más PrPC no será posible debido a la señal excesiva de la detección de PrPC. Por tanto, no es muy factible la discriminación simple entre muestras con o sin PrPSc.

Para superar esta dificultad, con frecuencia se tratan muestras con proteasas no específicas tales como proteinasa K (PK) o dispasa antes de la desnaturalización y detección de PrPSc. (Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 7.163.798 B2 y patente europea 1 119 773 B1.) Debido a la estructura de la isoforma PrPSc, PrPSc es en gran parte resistente a la digestión por proteasa. La isoforma PrPC, por otra parte, se degrada completamente por el tratamiento con tales proteasas. Por tanto, el tratamiento de muestras con una proteasa no específica tal como PK en algunas condiciones (por ejemplo, 50 !g/ml durante 30 min. a 37ºC) puede eliminar cualquier PrPC presente y deja generalmente intacto el núcleo resistente a proteasa de PrPSc (residuos de aminoácidos desde aproximadamente 90 hasta aproximadamente 231).

Una limitación importante del tratamiento con PK es la degradación de los residuos amino-terminales o aminoproximales (desde aproximadamente 23 hasta aproximadamente 89) de PrPSc. Esta región de PrP puede ser útil para la inmunodetección puesto que contiene varios epítopos incluyendo epítopos en la región de octarrepetición. La región de octarrepetición contiene varias copias de la secuencia de octarrepetición GQPHGG(G/S)(-/G)W (SEC ID N.º: 11). Esta secuencia de octarrepetición se conserva altamente en proteínas priónicas de diferentes especies y se repite cuatro veces entre los residuos aproximadamente 58-89, enumerados según la secuencia completa de PrP de hámster sirio o humana, en la mayor parte de las especies excepto PrP bovina que tiene 5 repeticiones y PrP de mono que tiene 3 repeticiones. (Véase la figura 1 para un alineamiento de secuencias de PrP de varias especies.) Esta secuencia es única para PrP y se ha demostrado que varios anticuerpos específicos de PrP se unen a esta secuencia, por ejemplo, POM2, POM11, POM12, POM14, 3B5, 4F2, 13F10, SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35 y SAF-37. (Véase, por ejemplo, Polymenidou et al. (2005) Lancet Neurol. 4:805-814; Krasemann et al. (1996) Mol. Medicine 2:725-734; Féraudet, et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:11247-11258; patente estadounidense n.º 7.097.997 B1.)

En general, la mayor parte de los anticuerpos se unen a un epítopo que está sólo presente una vez en una proteína, aun cuando los anticuerpos contengan de manera inherente dos sitios de unión (es decir dos brazos de unión). Este tipo de unión se denomina unión monovalente. La unión monovalente es más débil que un acontecimiento en el que ambos sitios de unión a anticuerpo interaccionan de manera simultánea con dos epítopos en la misma proteína (es decir unión multivalente). La fuerza global de la unión multivalente, denominada avidez, es mayor que la afinidad, la fuerza de unión de un único sitio, puesto que ambos sitios de unión deben disociarse en el mismo momento para que el anticuerpo libere el antígeno. Por ejemplo, esta propiedad es muy importante en la unión de anticuerpos a bacterias o virus, que normalmente tienen múltiples epítopos idénticos en sus superficies. Por tanto, la región de octarrepetición de PrP permite un aumento de la señal mediante tanto la singularidad de múltiples epítopos de

octarrepetición como la unión multivalente. Puesto que PK digiere residuos 23-89 de la PrPSc madura de longitud completa (aminoácidos 23-231), el repertorio de anticuerpos útiles después de una digestión mediante PK completa está limitado a aquéllos que unen secuencias dentro del núcleo resistente a proteasa (aminoácidos 90-231), y no pueden usarse anticuerpos frente a la región de octarrepetición. Por tanto, los inmunoensayos que usan digestión mediante PK no son muy sensibles.

Una desventaja adicional de usar proteasas no específica como PK es que la PrPSc es sólo resistente de manera parcial; también se digerirán la mayor parte o todos los residuos 90-231 dadas altas concentraciones y tiempo suficiente. Se ha demostrado que algunos confórmeros de PrPSc son más sensibles a la digestión que otros y tal tratamiento reduce la sensibilidad de detección. (Véase, por ejemplo, Safar et al. (1998) Nat. Med. 4:1157-65). De acuerdo con esto se encuentra el hallazgo de que PK reduce los niveles de PrPSc y la infectividad priónica en varios log (véase McKinley et al. (1983) Cell 35:57-62).

Un procedimiento de inmunoensayo descrito recientemente se refiere a la limitación tratada anteriormente controlando las condiciones de la digestión mediante PK de modo que PrPC se digiere completamente pero PrPSc se digiere sólo parcialmente y se conserva toda o algo de la región de octarrepetición. (véase la patente estadounidense n.º 7.097.997 B1.) Sin embargo, esta solución no es ideal ya que la condición apropiada puede variar para diferentes muestras y por tanto puede ser laborioso de conseguir y duro de normalizar.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad de un procedimiento específico, sensible y relativamente sencillo o rápido y un kit que usa tal procedimiento para detectar la presencia de las proteínas priónicas patógenas en diversas muestras, por ejemplo en muestras obtenidas de sujetos vivos, en suministros de sangre, en animales de granja y en otros suministros de alimentos humanos y de animales. Esta invención se refiere a este, también como a otros fines importantes.

Sumario de la invención

La presente descripción proporciona un modo nuevo, simple, específico y sensible, en las formas de procedimientos de ensayo y kit según las reivindicaciones, para detectar la presencia de proteínas priónicas patógenas, que pueden usarse, entre otras cosas, en relación con procedimientos para diagnosticar una enfermedad relacionada con priones (por ejemplo, en sujetos animales no humanos o humanos), para garantizar un suministro de sangre, suministro de productos sanguíneos o suministro de alimentos sustancialmente libre de PrPSc, para analizar muestras de órganos y tejido para trasplante, para controlar la descontaminación de equipo e instrumentos quirúrgicos, también como cualquier otra situación en la que es importante el conocimiento de la presencia o ausencia del prión patógeno.

Los procedimientos de ensayo en la presente descripción se benefician de un tratamiento con una proteasa específica del sitio que no escinde en la región de octarrepetición de secuencias de PrP conocidas o en el núcleo resistente a proteasa de PrPSc tras la digestión sustancialmente completa, escindiendo continuamente al menos parte de los aminoácidos en PrPC que corresponden al núcleo resistente a proteasa en PrPSc, que hace posible y conveniente que se utilicen epítopos en la región de octarrepetición o incluso aquéllos más en el sentido 5’ en combinación con epítopos en la región del núcleo resistente a proteasa para una detección específica y sensible de PrPSc.

La presente invención se refiere, en parte, a un procedimiento para detectar la presencia de PrPSc en una muestra poniendo en contacto la muestra con una proteasa específica del sitio, en el que dicha proteasa específica del sitio es tripsina o proteasa V8 de Staphylococcus aureus (S-V8) en condiciones en las que la digestión proteolítica de proteínas priónicas es sustancialmente completa, previniendo además la digestión mediante proteasa de la muestra, y detectando la presencia de cualquier PrPSc mediante la unión a al menos dos componentes de unión, que incluyen pero no se limitan a anticuerpos y aptámeros, en el que un componente de unión se une específicamente a un epítopo en la región amino-proximal de PrP, preferentemente en la región de octarrepetición, y otro componente de unión se une específicamente a un epítopo dentro de la región de núcleo resistente a proteasa.

La invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una forma patógena de proteína priónica, o PrPSc, usando al menos una proteasa específica del sitio, en el que dicha al menos una proteasa específica del sitio es tripsina o proteasa V8 de Staphylococcus aureus (S-V8), para una digestión sustancialmente completa de las proteínas en una muestra que se sospecha que contiene la PrPSc, en el que la muestra puede contener o puede no contener una forma normal de proteína priónica (PrPC). La PrPSc no tiene sitio de escisión para la proteasa específica del sitio dentro de la región de octarrepetición o entre la región octarrepetición y el núcleo resistente a proteasa. Por tanto, un fragmento de la región amino-proximal que incluye la región de octarrepetición sigue estando conectado al núcleo resistente a proteasa de la PrPSc, núcleo resistente a proteasa que sigue estando intacto, tras la digestión proteolítica sustancialmente completa. La PrPC, si está presente, tiene al menos un sitio de escisión disponible para la proteasa específica del sitio dentro de la región de aminoácidos que corresponde al núcleo resistente a proteasa de PrPSc, y el al menos un sitio de escisión disponible se escinde mediante la digestión proteolítica sustancialmente completa.

El procedimiento comprende además una etapa de prevención de cualquier digestión proteolítica adicional tras la

digestión proteolítica sustancialmente completa, que puede realizarse añadiendo un inhibidor de la proteasa o eliminando la proteasa específica del sitio.

El procedimiento comprende además una etapa de desnaturalización de la PrPSc tratada con proteasa específica del sitio tras la etapa de prevención de digestión proteolítica adicional, proporcionando de ese modo PrPSc desnaturalizada.

El procedimiento comprende además una etapa de detección de la presencia de PrPSc, usando al menos dos componentes de unión, un primer componente de unión y un segundo componente de unión, que incluyen pero no se limitan a anticuerpos y aptámeros, en el que el primer componente de unión se une específicamente a un primer epítopo dentro del fragmento de la región amino-proximal de la PrPSc que sigue estando conectado al núcleo resistente a proteasa tras la digestión proteolítica sustancialmente completa, preferentemente en la región de octarrepetición, y el segundo componente de unión se une específicamente a un segundo epítopo dentro de la región del núcleo resistente a proteasa de la PrPSc, en el que el segundo epítopo está en una región de la PrPC que está separada del primer epítopo tras la digestión proteolítica sustancialmente completa.

En ciertas realizaciones, la PrPSc comprende una secuencia seleccionada de SEC ID N.os 1 a 10.

En una realización preferida, el primer componente de unión se une a un epítopo que está dentro de la región de octarrepetición. Los primeros componentes de unión a modo de ejemplo en estas realizaciones incluyen anticuerpos monoclonales tales como POM2, POM 11, POM12, POM14, 3B5, 4F2, 13F10, SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35 y SAF-37.

En otras ciertas realizaciones, el primer componente de unión se une a un epítopo que está fuera de la región de octarrepetición. Los primeros componentes de unión a modo de ejemplo en estas realizaciones incluyen anticuerpos monoclonales tales como BAR210, BAR231 y 14D3.

En ciertas realizaciones, la proteasa específica del sitio usada en el procedimiento es tripsina, que hidroliza específicamente enlaces peptídicos en el lado carboxilo de residuos de lisina (K) y arginina (R) a menos que el aminoácido en el lado carboxilo de K y R sea prolina (P). Para estas realizaciones, el segundo componente de unión puede ser específico para cualquier epítopo que está dentro del núcleo resistente a proteasa de PrPSc y que se ha escindido continuamente y de ese modo se separa del primer epítopo en PrPC mediante la digestión con tripsina. Los segundos componentes de unión a modo de ejemplo en estas realizaciones incluyen anticuerpos monoclonales tales como 3F4, POM1, POM4, POM5, POM6, POM7, POM8, POM9, POM10, POM 13, POM 15, POM 16, POM 17, POM19, SAF-2, SAF-4, SAF-8, SAF-9, SAF-10, SAF-12, SAF-13, SAF-14, SAF-22, SAF-24, SAF-53, SAF-54, SAF60, SAF-61, SAF-66, SAF-68, SAF-69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, SAF-82, SAF-83, SAF-84, SAF-95, Pri308, Pri917, BAR215, BAR221, BAR224, BAR233, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, D18, 6H4 y BDI 115.

En una realización preferida del procedimiento en el que se usa tripsina, el segundo componente de unión se une específicamente a un epítopo ubicado dentro del dominio globular de PrPC (es decir, desde aproximadamente el aminoácido 122 hasta aproximadamente el aminoácido 231 de PrPC). Los segundos componentes de unión a modo de ejemplo en estas realizaciones incluyen anticuerpos monoclonales tales como POM1, POM4, POM5, POM6, POM7, POM8, POM9, POM10, POM13, POM15, POM 16, POM17, POM19, SAF-2, SAF-4, SAF-8, SAF-9, SAF-10, SAF-12, SAF-13, SAF-14, SAF-22, SAF-24, SAF-53, SAF-54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-68, SAF-69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, SAF-82, SAF-83, SAF-84, SAF-95, Pri917, BAR215, BAR221, BAR224, BAR233, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, D18, 6H4 y BDI115.

En otras ciertas realizaciones, la proteasa específica del sitio usada en el procedimiento es S-V8 que escinde específicamente en el lado carboxilo de residuos ácido glutámico (E) y ácido aspártico (D). Para estas realizaciones, el segundo componente de unión puede ser específico para cualquier epítopo que se encuentra dentro del núcleo resistente a proteasa de PrPSc y que se ha escindido continuamente en PrPC mediante S-V8. Los segundos componentes de unión a modo de ejemplo en estas realizaciones incluyen anticuerpos monoclonales tales como SAF-53, SAF-54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, Pri917, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, 6H4 y POM5.

En ciertas realizaciones del procedimiento, la etapa de detección se lleva a cabo usando un ELISA, preferentemente un ELISA tipo sándwich. Una realización de este tipo usa un primer componente de unión que se une a un epítopo dentro de la región amino-proximal de PrP, particularmente dentro de la región de octarrepetición, como un componente de unión de captura y un segundo componente de unión que se une a un epítopo dentro del núcleo resistente a proteasa como un componente de unión de detección. En otra realización de este tipo, el segundo componente de unión que se une a un epítopo dentro del núcleo resistente a proteasa se usa como un componente de unión de captura y el primer componente de unión que se une a un epítopo dentro de la región amino-proximal se usa como un componente de unión de detección.

En ciertas realizaciones preferidas, los componentes de unión de detección tratados anteriormente están marcados. En ciertas realizaciones entre éstas, los componentes de unión de detección están marcados con un conjugado de fosfatasa alcalina (FA).

En ciertas realizaciones, los componentes de unión usados en el procedimiento son anticuerpos, preferentemente anticuerpos monoclonales, específicos para el primer epítopo y el segundo epítopo, pudiéndose seleccionar los anticuerpos de, pero sin limitarse a, los anticuerpos monoclonales a modo de ejemplo dados a conocer en el presente documento.

En otras ciertas realizaciones, los componentes de unión usados en el procedimiento son aptámeros específicos para el primer epítopo y el segundo epítopo.

En una realización del procedimiento, dicha proteasa específica del sitio está inmovilizada en un soporte sólido.

En otra realización, el inhibidor de la proteasa usado en el procedimiento para prevenir la digestión proteolítica adicional de la muestra mediante la proteasa específica del sitio tras la digestión proteolítica sustancialmente completa es fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF).

En ciertas realizaciones, la etapa de desnaturalización en el procedimiento comprende tratar las muestras digeridas con un compuesto de guanidinio, por ejemplo, clorhidrato de guanidina (GdnHCl) o tiocianato de guanidina (GdnSCN).

En ciertas realizaciones entre las que usan un compuesto de guanidinio como desnaturalizante, una etapa adicional de dilución de las muestras está implicada tras la desnaturalización.

En otras ciertas realizaciones, la etapa de desnaturalización en el procedimiento comprende tratar las muestras digeridas con pH alto o pH bajo y, opcionalmente, neutralizar dicho pH alto o dicho pH bajo tras dicha desnaturalización.

En ciertas realizaciones del procedimiento, las muestras se obtienen de un organismo vivo o que ha vivido alguna vez. Los organismos a modo de ejemplo en estas realizaciones incluyen ser humano, mono, hámster, bovinos, oveja, ratón, alce y ciervo.

En ciertas realizaciones, la muestra usada en el procedimiento se deriva del grupo que consiste en suministro de alimentos, sangre completa, productos sanguíneos, fracciones sanguíneas, componentes sanguíneos, plasma, plaquetas, suero, líquido cefalorraquídeo, órganos, células, tejido cerebral, tejido del sistema nervioso, tejido muscular, tejido graso, médula ósea, orina, lágrimas, tejido no del sistema nervioso, biopsias, necropsias e instrumentos contaminados.

En ciertas realizaciones, la muestra usada en el procedimiento se deriva del grupo que consiste en sangre completa, productos sanguíneos, fracciones sanguíneas, componentes sanguíneos, plasma, plaquetas, glóbulos rojos y suero.

En ciertas realizaciones, la muestra se obtiene de una biopsia, autopsia o necropsia.

La presente invención se refiere también, en parte, a un kit para detectar la presencia de una forma patógena de proteína priónica, o PrPSc, en una muestra que se sospecha que contiene la PrPSc, en el que la muestra puede contener o puede no contener a una forma normal de proteína priónica (PrPC), comprendiendo el kit reactivos que son útiles en el procedimiento tratado anteriormente.

Específicamente, el kit comprende al menos una proteasa específica del sitio en el que dicha al menos una proteasa específica del sitio es tripsina o S-V8, en el que la PrPSc no tiene sitio de escisión para la proteasa específica del sitio dentro de la región de octarrepetición o entre la región de octarrepetición y el núcleo resistente a proteasa, por tanto un fragmento de la región amino-proximal de la PrPSc que incluye la región de octarrepetición sigue estando conectado al núcleo resistente a proteasa tras una digestión proteolítica sustancialmente completa de PrPSc mediante la proteasa. La PrPC, si está presente, tiene al menos un sitio de escisión disponible para la proteasa específica del sitio dentro de la región de aminoácidos que corresponde al núcleo resistente a proteasa de la PrPSc.

El kit comprende además al menos dos componentes de unión, un primer componente de unión y un segundo componente de unión, que incluyen pero no se limitan a anticuerpos y aptámeros. El primer componente de unión se une específicamente a un primer epítopo que está ubicado dentro del fragmento de la región amino-proximal que sigue estando conectado al núcleo resistente a proteasa tras una digestión proteolítica sustancialmente completa de la PrPSc mediante la proteasa específica del sitio en el kit. El segundo componente de unión se une específicamente a un segundo epítopo que está ubicado dentro del núcleo resistente a proteasa, en el que el segundo epítopo está en una región de la PrPC que está separada del primer epítopo tras una digestión proteolítica sustancialmente completa de la PrPC mediante la proteasa específica del sitio en el kit.

El kit comprende además instrucciones para usar el kit para detectar la presencia de cualquier forma patógena de proteína priónica.

Opcionalmente, el kit comprende además un inhibidor de la proteasa que puede inhibir la actividad de la proteasa específica del sitio en el kit.

De nuevo opcionalmente, el kit comprende además un desnaturalizante que puede desnaturalizar la PrPSc.

En ciertas realizaciones del kit, la PrPSc comprende una secuencia seleccionada de SEC ID N.os 1 a 10.

En ciertas realizaciones preferidas del kit, los primeros componentes de unión se unen específicamente a un epítopo dentro de la región de octarrepetición. Los primeros componentes de unión a modo de ejemplo en estas realizaciones incluyen anticuerpos monoclonales tales como POM2, POM11, POM12, POM14, 3B5, 4F2, 13F10, SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35 y SAF-37.

En otras ciertas realizaciones del kit, el primer componente de unión se une específicamente a un epítopo que está fuera de la región de octarrepetición. Los primeros componentes de unión a modo de ejemplo en estas realizaciones incluyen anticuerpos monoclonales tales como BAR210, BAR231 y 14D3.

En ciertas realizaciones del kit, la proteasa específica del sitio en el kit es tripsina. Para estas realizaciones, los segundos componentes de unión a modo de ejemplo en estas realizaciones incluyen anticuerpos monoclonales tales como 3F4, POM1, POM4, POM5, POM6, POM7, POM8, POM9, POM 10, POM 13, POM15, POM 16, POM 17, POM19, SAF-2, SAF-4, SAF-8, SAF-9, SAF-10, SAF-12, SAF-13, SAF-14, SAF-22, SAF-24, SAF-53, SAF-54, SAF60, SAF-61, SAF-66, SAF-68, SAF-69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, SAF-82, SAF-83, SAF-84, SAF-95, Pri308, Pri917, BAR215, BAR221, BAR224, BAR233, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, D18, 6H4 y BDI115.

En una realización preferida del kit en el que tripsina es la proteasa específica del sitio, el segundo componente de unión se une específicamente a un epítopo ubicado dentro del dominio globular de PrPC (es decir, desde aproximadamente el aminoácido 122 hasta aproximadamente el aminoácido 231 de PrPC). Los segundos componentes de unión en estas realizaciones incluyen anticuerpos monoclonales tales como POM1, POM4, POM5, POM6, POM7, POM8, POM9, POM10, POM13, POM15, POM16, POM17, POM19, SAF-2, SAF-4, SAF-8, SAF-9, SAF-10, SAF-12, SAF-13, SAF-14, SAF-22, SAF-24, SAF-53, SAF-54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-68, SAF-69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, SAF-82, SAF-83, SAF-84, SAF-95, Pri917, BAR215, BAR221, BAR224, BAR233, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, D18, 6H4 y BDI11 15.

En otras ciertas realizaciones, la proteasa específica del sitio en el kit es S-V8. Para estas realizaciones, los segundos componentes de unión a modo de ejemplo en estas realizaciones incluyen anticuerpos monoclonales tales como SAF-53, SAF-54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, Pri917, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, 6H4 y POM5.

En ciertas realizaciones del kit, el kit comprende un kit de ELISA, preferentemente un kit de ELISA tipo sándwich. Entres estas realizaciones, ciertas realizaciones tienen el primer componente de unión como un componente de unión de captura y el segundo componente de unión como un componente de unión de detección. Aún otras ciertas realizaciones tienen el segundo componente de unión como un componente de unión de captura y el primer componente de unión como un componente de unión de detección.

En ciertas realizaciones del kit, los componentes de unión de detección tratados anteriormente están marcados. En ciertas realizaciones entre éstas, los componentes de unión de detección están marcados con un conjugado de fosfatasa alcalina (FA).

En ciertas realizaciones, los componentes de unión en el kit son anticuerpos, preferentemente anticuerpos monoclonales, específicos para el primer epítopo y el segundo epítopo, pudiéndose seleccionar los anticuerpos de, pero sin limitarse a, los anticuerpos monoclonales a modo de ejemplo mostrados anteriormente.

En otras ciertas realizaciones, los componentes de unión en el kit son aptámeros específicos para el primer epítopo y el segundo epítopo.

En una realización del kit, la proteasa específica del sitio está inmovilizada.

En otra realización del kit, el inhibidor de la proteasa opcional es fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF).

En ciertas realizaciones del kit, el desnaturalizante opcional es un compuesto de guanidinio.

En otras ciertas realizaciones del kit, el desnaturalizante opcional es un reactivo básico o un reactivo ácido.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A y la figura 1B representan un alineamiento de secuencias de aminoácidos y sitios de escisión de tripsina de proteínas priónicas de ser humano (SEC ID N.º:1), mono (SEC ID N.º:2), hámster sirio (hámster) (SEC ID N.º:3), bovinos (SEC ID N.º:4), oveja (SEC ID N.º:5), ratón (SEC ID N.º:6), alce (SEC ID N.º:7), ciervo gamo (gamo) (SEC ID N.º:8), ciervo mulo (mulo) (SEC ID N.º:9) y ciervo de cola blanca (blanco) (SEC ID N.º:10). Las regiones de octarrepetición están doblemente subrayadas. Las regiones de núcleo resistente a proteasa están indicadas con corchetes por encima y por debajo del alineamiento de secuencias. (Debe observarse que las ubicaciones de aminoácidos de inicio y terminación exactas de las regiones de núcleo resistente a proteasa varían ligeramente entre diferentes especies y diferentes cepas y con diferentes condiciones de digestión mediante proteasa.) Los sitios de escisión de tripsina, aminoácidos lisina (K) y arginina (R) que no tienen prolina (P) en sus lados carboxilo, están subrayados de manera simple.

La figura 2A y la figura 2B representan un alineamiento de secuencias de aminoácido y sitios de escisión de S-V8 de proteínas priónicas de ser humano (SEC ID N.º: 1), mono (SEC ID N.º:2), hámster sirio (hámster) (SEC ID N.º:3), bovinos (SEC ID N.º:4), oveja (SEC ID N.º:5), ratón (SEC ID N.º:6), alce (SEC ID N.º:7), ciervo gamo (gamo) (SEC ID N.º:8), ciervo mulo (mulo) (SEC ID N.º:9) y ciervo de cola blanca (blanco) (SEC ID N.º:10). Las regiones de octarrepetición están doblemente subrayadas. Las regiones de núcleo resistente a proteasa están indicadas con corchetes por encima y por debajo del alineamiento de secuencias. Los sitios de escisión de SV8, aminoácidos ácido aspártico (D) y ácido glutámico (E), están subrayados de manera simple.

La figura 3 ilustra el esquema de una realización de la invención. La línea simple representa la proteína priónica, la sección enrollada representa el núcleo resistente a proteasa de la PrPSc, y la sección ondulada representa las secciones más alfa-helicoidales de las isoformas PrPC y PrPSc. Los números en diversas ubicaciones de proteína PrPSc o PrPC representan los enlaces de aminoácidos de diferentes regiones. Las casillas indican las regiones de epítopo reconocidas por los anticuerpos anti-prion, las barras en negrita representan la región de octarrepetición, y los triángulos representan los sitios de escisión de la proteasa específica del sitio. Las casillas en blanco representan regiones de epítopo dentro de la región amino-proximal, preferentemente dentro de la región de octarrepetición, mientras que las casillas sombreadas representan regiones de epítopo dentro del núcleo resistente a proteasa de PrPSc o las mismas regiones de epítopo dentro de las secuencias de aminoácido de PrPC que corresponden al núcleo resistente a proteasa. Los triángulos en blanco representan sitios de escisión disponibles para la proteasa específica del sitio en forma nativa de PrPSc o PrPC. Los triángulos sombreados representan sitios de escisión no disponibles para la proteasa específica del sitio en forma nativa de PrPSc. Las Y representan anticuerpos.

La figura 4 ilustra la detección, mediante ELISA tipo sándwich, de PrP en muestras de homogeneizado de cerebro (BH) humano de vECJ o normal digeridas con tripsina o PK, usando SAF-32 como el anticuerpo de captura y 3F4 conjugado con fosfatasa alcalina (3F4AP) como el anticuerpo de detección. En el ejemplo 6 se dan a conocer detalles del experimento. Tras la digestión mediante proteasa, las muestras se dejaron o bien no desnaturalizadas o desnaturalizadas con GdnHCl 4 M antes de la detección de PrPSc. Se muestran cantidades relativas de señales detectadas en unidades relativas de luz (RLU).

La figura 5 ilustra la detección, mediante ELISA tipo sándwich, de PrPSc, en muestras de BH de hámster sirio (SHa) infectadas con escrapie digeridas con tripsina o PK en diversas condiciones, usando 3F4 como el anticuerpo de captura y POM2 conjugado con fosfatasa alcalina (POM2AP) como el anticuerpo de detección. En el ejemplo 7 se dan a conocer detalles del experimento. Se muestran proporciones de señales infectadas con escrapie con respecto señales de BH normal (valores S/N).

La figura 6 ilustra la detección, mediante ELISA tipo sándwich, de PrPSc en muestras de BH de SHa infectadas con escrapie con tripsina o PK en diversas condiciones, usando 3F4 como el anticuerpo de captura y POM 17 conjugado con fosfatasa alcalina (POM 17AP) como el anticuerpo de detección. En el ejemplo 7 se dan a conocer detalles del experimento. Se muestran proporciones de señales infectadas con escrapie son respecto a señales de BH normal (valores S/N).

La figura 7A ilustra un esquema de la secuencia de PrP madura de longitud completa, el núcleo resistente a PK de PrPSc, y el mapa de sitios de escisión de tripsina. Los sitios de escisión de tripsina están indicados por triángulos, mostrándose los sitios que se encuentran dentro del núcleo resistente a PK como triángulos grises para indicar que generalmente no están disponibles para la escisión con tripsina en PrPSc.

La figura 7B ilustra el resultado de un análisis de inmunotransferencia tipo Western. En el ejemplo 8 se dan a conocer detalles del experimento. Se compararon digestiones con cincuenta !g/ml de tripsina o PK para muestras de BH normal, de vECJ MM (polimorfismo del codon 129, la cepa de vECJ blanca), de ECJe MM y de ECJe MV. Se separaron las muestras mediante SDS-PAGE y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos POM2, 3F4 o POM17. Se realizó una inmunotransferencia con actina como control de carga.

La figura 8 ilustra el resultado de otros análisis de inmunotransferencia de tipo Western. En el ejemplo 8 se dan a conocer detalles del experimento. Se digirió una muestra de BH normal o vECJ con 0, 25, 50, 75 o 100 !g/ml de tripsina y entonces se analizó mediante inmunotransferencia con anticuerpos POM2, 3F4 o POM 1.

La figura 9A ilustra un esquema de la secuencia de PrP madura de longitud completa con los sitios de escisión de tripsina y las ubicaciones de varios epítopos de anticuerpo marcados. Los sitios de escisión de tripsina en las regiones de epítopo de 3F4 y POM17 se muestran como triángulos grises, indicando que generalmente están no disponibles para la escisión con tripsina en PrPSc. La figura 9B y la figura 9C ilustran el resultado de un experimento ELISA directo “de revestimiento pasivo”. En el ejemplo 9 se dan a conocer detalles del experimento. Se digirieron BH normales o de ECJ con concentraciones crecientes de tripsina (símbolos en negros) o PK (símbolos en blanco). Se centrifugaron los productos de digestión y se desnaturalizaron los sedimentos de PrPSc y se detectaron mediante ELISA directo con anticuerpos POM2 (paneles superiores), 3F4 (paneles medios) o POM 17 (paneles inferiores). Se muestran cantidades relativas de señales detectadas en unidades relativas luminosas (RLU). La figura 9B ilustra los datos sin procesar del BH normal (triángulos) y el BH de vECJ MM (círculos). La figura 9C ilustra los datos normalizados de las muestras de BH de vECJ MM, de ECJe MM y de ECJe MV. Los resultados se expresan en “infecciosos – normal (RLU)”.

La figura 10 ilustra, en gráficos de barras, la detección, mediante ELISA tipo sándwich, de PrP en muestras de BH humano normal o diversas de ECJ digeridas con concentraciones crecientes de tripsina (la mitad izquierda de cada panel) o PK (la mitad derecha de cada panel), usando 3F4 como el anticuerpo de captura y POM2AP o POM17AP como el anticuerpo de detección. En el ejemplo 10 se dan a conocer detalles del experimento. Se muestran cantidades relativas de señales detectadas obtenidas como datos sin procesar en unidades relativas de luz (RLU). Las barras en negrita representan datos del BH normal, mientras que las barras en gris representan datos de diversos BH de ECJ.

La figura 11 ilustra, en gráficos de líneas, la detección, mediante ELISA tipo sándwich, de PrP en muestra de BH humano normal o de vECJ digerida con concentraciones crecientes de tripsina (círculos en negro) o PK (círculos en blanco), usando 3F4 como el anticuerpo de captura y POM2AP o POM17AP como el anticuerpo de detección. En el ejemplo 10 se dan a conocer detalles del experimento, que es una parte del experimento de la figura 10. Se muestran cantidades relativas de señales detectadas obtenidas como datos sin procesar en unidades relativas de luz (RLU) en los paneles izquierdo y central. Las cantidades de señales aportadas por PrPSc se estimaron restando las señales derivadas de BH normal de las señales derivadas de BH de vECJ y se mostraron en los paneles derechos como “vECJ - normal (RLU)”.

Descripción detallada

La práctica de la presente descripción empleará, a menos que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro del conocimiento de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo; Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18º edición (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); y Handbook of Experimental Immunology, volúmenes I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición, 1989); Short Protocols in Molecular Biology, 4ª edición (Ausubel et al. eds., 1999, John Wiley & Sons); Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press); Peters y Dalrymple, Fields Virology (2ª edición), Fields et al. (eds.), B.N. Raven Press, Nueva York, NY.

Definiciones

Los siguientes términos seleccionados se trataran en el contexto usado en el presente documento. Tanto las formas plural como singular de un término están incluidas independientemente de la forma tratada.

Se usan de manera intercambiable “prion”, “proteína priónica”, “proteína PrP” y “PrP” para referirse tanto a la forma de proteína priónica patógena (también denominada proteína escrapie, forma de proteína patógena, isoforma patógena, prion patógeno y PrPSc) como a la forma priónica no patógena (también denominada forma normal, forma de proteína celular, isoforma celular, isoforma no patógena, proteína priónica no patógena y PrPC), así como la forma desnaturalizada y diversas formas recombinantes de la proteína priónica que pueden no tener ni la conformación patógena ni la conformación celular normal.

El uso de las expresiones “prion”, “proteína priónica”, “proteína PrP”, “PrP” o “proteína patológica conformacional” no pretende limitarse a polipéptidos que tienen las secuencias exactas a las descritas en el presente documento. Es fácilmente evidente que las expresiones engloban proteínas patológicas conformacionales de cualquiera de las especies identificas o no identificadas (por ejemplo, ser humano, bovinos) o enfermedades (por ejemplo, de Alzheimer, de Parkinson, etc.). Véanse también las publicaciones de patente estadounidense del solicitante 20050118645 y 20060035242 y la publicación PCT WO 06/076687. Un experto en la técnica en vista de las enseñanzas de la presente descripción y la técnica puede determinar regiones que corresponden a las secuencias dadas a conocer en el presente documento en cualquier otra proteína priónica, usando por ejemplo, programas de comparación de secuencias (por ejemplo, herramienta para búsqueda de alineamiento local básico, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)) o identificación y alineamiento de motivos o características estructurales.

“Patógena” significa que la proteína origina realmente la enfermedad, o la proteína está asociada con la enfermedad y, por tanto, está presente cuando la enfermedad está presente. Por tanto, una proteína patógena, tal como se usa en el presente documento, no es necesariamente una proteína que es el agente causante específico de una enfermedad. Una “forma patógena” de una proteína significa una conformación de una proteína que está presente cuando la enfermedad está presente, pero puede ser o puede no ser infecciosa. Un ejemplo de una proteína patológica conformacional patógena, o una forma patógena de una proteína, es PrPSc. Por consiguiente, la expresión “no patógena” o “forma normal” describe una proteína que no origina normalmente la enfermedad o no está normalmente asociada con enfermedad causante. Un ejemplo de una forma no patógena o una forma normal de proteína patológica conformacional es PrPC.

“Enfermedad relacionada con prion” se refiere a una enfermedad originada en su totalidad o en parte por una proteína priónica patógena, o una forma patógena de proteína priónica (por ejemplo, PrPSc). Los ejemplos de enfermedad relacionada con prion incluyen, sin limitación, tembladera, encefalopatías espongiformes bovinas (EEB), enfermedad de las vacas locas, encefalopatías espongiformes felinas, kuru, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ),

nueva variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (nvECJ), enfermedad del desgaste crónico (EDC), enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker (GSS) e insomnio familiar fatal (IFF).

El término “desnaturalizar” o “desnaturalizado” tiene el significado convencional como se aplica a la estructura proteica y significa que la proteína ha perdido su estructura secundaria y terciaria nativa. Con respecto a la proteína priónica patógena, una proteína priónica patógena “desnaturalizada” no conserva ya la conformación patógena nativa y por tanto la proteína ya no es “patógena”. La proteína priónica patógena desnaturalizada tiene una conformación similar o idéntica a la proteína priónica no patógena desnaturalizada.

Las expresiones “etiqueta”, “marcado”, “etiqueta detectable” y “ marcado de manera detectable” se refiere a una molécula que puede detectarse, incluyendo pero sin limitarse a, isotopos radiactivos, agentes fluorescentes, agentes luminiscentes, agentes quimioluminiscentes, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, cromóforos, colorantes, iones metálicos, disoluciones metálicas, ligandos (por ejemplo, biotina o haptenos), nanopartículas fluorescentes, nanopartículas de oro y similares. Ciertos ejemplos particulares de etiquetas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a fluoresceína, rodamina, dansilo, umbeliferona, rojo Texas, luminol, ésteres de acridinio, NADPH, betagalactosidasa, peroxidasa de rábano, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina y ureasa. La etiqueta también pueden ser una etiqueta de epítopo (por ejemplo una etiqueta de His-His), un anticuerpo o un oligonucleótido que puede amplificarse o detectarse de otro modo.

“Digestión proteolítica” o “digestión con proteasa” se refiere a la digestión o degradación dirigida de una proteína mediante una proteasa, a través de hidrólisis, o escisión, de enlaces peptídicos en la proteína.

Una “proteasa específica del sitio” se refiere a una enzima que escinde enlaces peptídicos (una proteasa) en un tipo

o un pequeño número de diferentes residuos de aminoácidos en un sustrato de proteína. Los “sitios de escisión” para una proteasa específica del sitio se refieren a los residuos específicos de aminoácidos en un sustrato de proteína en el que los enlaces peptídicos adyacentes se hidrolizan, o “se escinden”, mediante la proteasa específica del sitio en condiciones de digestión proteolítica normal. La proteasa específica del sitio se distingue de las proteasas no específicas como proteinasa K (que escinde en residuos alifáticos, aromáticos e hidrófobos) y carboxipeptidasa Y (que escinde todos los residuos comenzando secuencialmente en el extremo carboxilo terminal). Por ejemplo, tripsina es una proteasa específica del sitio que escinde sólo en residuos Lys y Arg, especialmente cuando el aminoácido en el lado carboxilo de Lys y Arg no es Pro. (Véase, por ejemplo, Neurath y Schwert (1950) Chem. Rev. 46:70; Walsh y Neurath (1964) Proc. Natl. Acad Sci. USA 52:884-889; Walsh (1970) Meth. Enzymol. 19:41.) Por tanto, los sitios de escisión para tripsina significan residuos de Lys y Arg cuando el aminoácido en el lado carboxilo de Lys y Arg no es Pro. Los sitios de escisión para tripsina se denominan también “sitios trípticos”. Otro ejemplo es la proteasa S-V8, que escinde específicamente en residuos de Glu y Asp (véase, por ejemplo, Drapeau et al. (1972) J. Biol. Chem. 247:6720-6726 y Houmard y Drapeau (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3506-3509). Tripsina y S-V8 están disponibles comercialmente de compañías tales como Pierce, parte de Thermo Fisher Scientific Inc., o Sigma-Aldrich, Inc.

Una digestión “sustancialmente completa” o “sustancialmente digerido” significa una digestión en la que una proteína se ha escindido mediante una proteasa en al menos el 90%, preferentemente el 99%, de todos los sitios de escisión de proteasa disponible. Por “sitio de escisión disponible” se propone un sitio que tiene la secuencia de aminoácidos reconocida como el sitio de escisión por la proteasa y que está disponible para el contacto con la proteasa en la conformación de la proteína. Como ejemplo, los sitios de escisión por proteasa que se producen dentro del núcleo resistente a proteasa de la proteína priónica no están generalmente disponibles para la digestión con proteasa cuando la proteína priónica está en la conformación de PrPSc, y por tanto no son “sitios de escisión disponible” en PrPSc.

La “región de octarrepetición” se refiere a una región de secuencia repetida que se encuentra próxima al extremo Nterminal de proteínas priónicas de todas las especies hasta este momento identificadas. La octarrepetición generalmente contiene entre 3 y 5, normalmente 4, copias de una secuencia de 8 (o 9) aminoácidos normalmente escrita como GQPHGG(G/S)(-/G)W (SEC ID N.º: 11). Esta secuencia está sumamente conservada (aunque esta secuencia puede variar ligeramente en algunas de las repeticiones) y generalmente se produce dentro de aproximadamente 58-89 residuos, enumerados según especies de PrP humana y de hámster. La región de octarrepetición normalmente está adyacente, y próxima al extremo N-terminal, a la región resistente a proteasa.

El “núcleo resistente a proteasa” de la proteína priónica (a veces denominado el “núcleo resistente a proteinasa K”) se define mediante la región de la proteína priónica en la conformación de PrPSc que permanece tras la exposición de la PrPSc a proteinasa K en condiciones que son suficientes para digerir sustancialmente la proteína priónica en la forma PrPC. En general, para la mayor parte de las especies de proteína priónica, la región del núcleo resistente a proteasa incluye las regiones desde aproximadamente el aminoácido 90 hasta aproximadamente el aminoácido 231 enumerados según las especies de PrP humana y de hámster. Las figuras 1A, 1B, 2A y 2B muestran un alineamiento de varias proteínas priónicas de diferentes especies en el que la región entre corchetes indica la región del núcleo resistente a proteasa.

La “región de aminoácidos de PrPC que corresponde al núcleo resistente a proteasa” se refiere a la región de una PrPC que es la misma que la región que forma el núcleo resistente a proteasa en la forma patógena de la proteína

priónica con la misma secuencia de aminoácidos primaria de dicha PrPC. En general, para la mayor parte de especies de proteína priónica, esta región se refiere también a la región de aproximadamente el aminoácido 90 hasta aproximadamente el aminoácido 231 enumerada según las especies de PrP humana y de hámster.

El “dominio globular” de PrPC es aproximadamente desde el aminoácido 122 hasta el aminoácido 231 enumerados según especies de PrP humana.

Por “epítopo” se quiere decir en el presente documento la región de una proteína diana que se reconoce por (por ejemplo se une específicamente a) componentes de unión que incluyen sin limitación anticuerpos y aptámeros. Un epítopo puede comprender 3 o más aminoácidos en una conformación espacial única para el epítopo. Generalmente, un epítopo que consiste en al menos 5 aminoácidos de este tipo y, más habitualmente, que consiste en al menos 8-10 aminoácidos de este tipo. En la técnica se conocen procedimientos para determinar la conformación espacial de aminoácidos e incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear bidimensional. Además, la identificación de epítopos en una proteína dada se realiza fácilmente usando técnicas bien conocidas en la técnica, tales como mediante el uso de estudios de hidrofobicidad y mediante serología dirigida al sitio. Véase, también, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81:3998-4002 (procedimiento general para sintetizar rápidamente péptidos para determinar la ubicación de epítopos inmunógenos en un antígeno dado); la patente estadounidense n.º 4.708.871 (procedimientos para identificar y sintetizar químicamente epítopos de antígenos); y Geysen et al., Molecular Immunology (1986) 23:709-715 (técnica para identificar péptidos con alta afinidad para un anticuerpo dado).

La “región amino-proximal” se refiere a la región N-terminal de una proteína PrP madura que abarca desde el aminoácido 23 hasta aproximadamente el 89, enumerados según la secuencia de PrP humana o de hámster.

El “componente de unión” se refiere a una molécula que puede reconocer específicamente y unirse, de manera no covalente, a un ligando tal como un epítopo. Los componentes de unión tal como se tratan en la actual descripción incluyen sin limitación anticuerpos y aptámeros.

El “componente de unión de captura” se refiere a un componente de unión que reviste a un soporte sólido para unir y capturar específicamente un ligando, tal como una proteína PrP.

El “componente de unión de detección” se refiere a un componente de unión que se añade, en disolución, a muestras en un soporte sólido para detectar específicamente cualquier ligando que se ha unido y capturado mediante un componente de unión de captura.

En ciertas realizaciones del procedimiento de ensayo, los componentes de unión son “aptámeros”. Los aptámeros son ácidos nucleicos que tienen las propiedades de reconocimiento molecular de anticuerpos. Sin embargo, los aptámeros son más pequeños y menos complejos que los anticuerpos, y por tanto pueden ser más fáciles de fabricar y modificar. (Véase, por ejemplo, Osborne et al. (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:5-9; Bunka et al. (2006) Nat. Rev. Microbiol. 4:588-596.) Ciertos procedimientos para generar aptámeros específicos para epítopos de proteína están fácilmente disponible (véase, por ejemplo, Tuerk y Gold (1990) Science 249:505-510; Cox et al. (1998) Biotechnol Prog. 14:845-850; Cox et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:e108). Los aptámeros pueden estar ligados a enzimas que tienen una actividad que puede detectarse fácilmente (véase, por ejemplo, Drolet et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:1021).

“Tratar” o el “tratamiento” de una muestra con una proteasa significa que la muestra y la proteasa se ponen en contacto y permanecen juntos durante un periodo de tiempo suficiente para que se produzca una reacción, particularmente hidrólisis o escisión de enlaces peptídicos.

Visión general

Antes de la presente descripción, una patente publicada daba a conocer un procedimiento usando PK para digerir PrPSc y conservar la región de octarrepetición para la unión con un componente de unión (un ligando), que requiere una condición de digestión controlada para la digestión parcial de PrPSc pero una digestión completa de PrPC. (Véase la patente estadounidense n.º 7.097.997 B1.) Un problema con este procedimiento dado a conocer previamente es que la condición apropiada puede variar para diferentes muestras, y por tanto, puede ser trabajoso de alcanzar y difícil de normalizar. Este procedimiento dado a conocer previamente no implicaba ningún uso de un segundo componente de unión para unir el núcleo resistente a proteasa de PrPSc con el fin de diferenciarlo de PrPC.

Para evadir las limitaciones asociadas con el uso de proteasas no específicas como PK, los actuales inventores investigaron el uso de otras proteasas, particularmente proteasas específicas del sitio, que no tuvieran sitio de escisión dentro de la región de octarrepetición de PrP. Por tanto, incluso con una digestión sustancialmente completa, la región de octarrepetición no se digiere, lo que hace que esté disponible de manera constante para la unión específica y fuerte mediante un componente de unión. En comparación con una digestión parcial mediante PK, es fácil de llevar a cabo y normalizar una digestión sustancialmente completa mediante una proteasa específica del sitio. Además, la actual descripción incluye el uso de un segundo componente de unión que se une a PrPSc pero no a PrPC debido a la eliminación del correspondiente epítopo de PrPC mediante la proteasa, proporcionando el procedimiento dado a conocer actualmente una ventaja de alta selectividad entre las dos formas de PrP.

Por tanto, el procedimientos descrito en el presente documento se refiere a mejoras que pueden aumentar la especificidad, sensibilidad, facilidad de uso y reproducibilidad de la detección de PrPSc en una muestra que puede tener una gran cantidad de PrPC.

La proteasa específica del sitio usada es tripsina o S-V8, cuyos sitios de escisión específicos no están presentes en las regiones de octarrepetición de las secuencias de PrP conocidas tal como se muestra en las figuras 1A, 1B, 2A y 2B. Además, a diferencia del caso con PK, la digestión con tripsina o S-V8 no afecta la infectividad priónica, lo que sugiere que PrPSc es más resistente a estas proteasas que a PK (véase McKinley et al. (1983) Cell, vol. 35, 57-62, y Langeveld et al. (2003) J. Infec. Dis. 188:1782-1789). El tratamiento de PrPSc con tripsina o S-V8 dará como resultado fragmentos resistentes a proteasa con residuos 49-231 o 23-231, respectivamente (enumerados según especies humanas o de hámster sirio), debido a la protección de los posibles sitios de escisión dentro del núcleo resistente a proteasa de PrPSc. Por otra parte, el tratamiento de PrPSc con PK dará como resultado múltiples fragmentos resistentes a proteasa comenzando el extremo N-terminal de fragmentos resistente a PK aproximadamente en los residuos 80-100. El sitio de escisión exacto de PrPSc mediante PK variará puesto que PrPSc puede adoptar diferentes conformaciones (véase Telling et al. (1996) Science 274:2079-2082). Por tanto, el tratamiento de PrPSc con tripsina o S-V8 proporcionará un fragmento más constante, más largo y más útil que el tratamiento con PK.

Antes de la presente descripción, una publicación sugirió el uso de tripsina para desenmascarar un epítopo para PrPSc y eliminar la disponibilidad de un correspondiente epítopo de PrPC. (Véase la publicación de patente internacional n.º WO 99/19360 A1.) El procedimiento de inmunoensayo sugerido en el documento WO 99/19360 A1 difiere del procedimiento dado a conocer actualmente, ya que el fin o el resultado de usar tripsina en el procedimiento dado a conocer actualmente no es desenmascarar un epítopo para PrPSc. Además, el procedimiento sugerido en el documento WO 99/19360 A1 no dio a conocer la unión de PrPSc con un anticuerpo específico para la región de octarrepetición. Por tanto, el procedimiento dado a conocer actualmente ofrece una ventaja de alta sensibilidad debido a la alta avidez de la unión del componente de unión a la región de octarrepetición.

Otra publicación anterior a la presente descripción, publicación internacional n.º WO 03/00121 A1, dio a conocer un procedimiento para detectar la presencia de proteínas priónicas que implica una proteólisis limitada mediante una proteasa tal como PK. En una realización del procedimiento descrito en el documento WO 03/001211 A1, una proteasa tal como tripsina se usó brevemente, antes de las etapas de lisado de las células o tejidos y tratamiento del lisado con PK, y en una condición que no desestabilizará la membrana celular, para facilitar la disociación de tejido.

Además, otra publicación anterior a la presente descripción, la publicación internacional n.º WO 2006/088281A1, dio a conocer un procedimiento para detectar una forma multimérica de una forma monomérica de un polipéptido que forma multímeros (tal como prion) que implica un tratamiento con tripsina. El procedimiento dado a conocer en el documento WO 2006/088281 A1 difiere del procedimiento dado a conocer actualmente. El documento WO 2006/088281 A1 promovía específicamente el uso de anticuerpos frente a la secuencia no repetida en la proteína priónica con respecto a las secuencias repetidas tales como la secuencia de octarrepetición, ya que los anticuerpos frente a la secuencia de octarrepetición producían mayor fondo usando el procedimiento dado a conocer en esta publicación.

En una publicación reciente, se usó la proteasa termolisina para diagnosticar enfermedades priónicas (véase Owen et al., (2007) Mol. Biotechnol. 35:161-170). La termolisina escinde específicamente en varios residuos hidrófobos, residuos que están ausentes de la región amino-terminal de PrPSc accesible por la proteasa

La presente invención proporciona, por tanto, un procedimiento de ensayo, que comprende las etapas de:

(a)

obtener una muestra que se sospecha que contiene una forma patógena de proteína priónica (PrPSc) que tiene un núcleo resistente a proteasa y una región de octarrepetición, en el que dicha muestra puede contener o puede no contener una forma normal de proteína priónica (PrPC);

(b)

tratar dicha muestra con al menos una proteasa específica del sitio en el que dicha al menos una proteasa específica del sitio es tripsina o S-V8, en condiciones en las que la digestión proteolítica de dicha PrPSc y dicha PrPC, si está presente, es sustancialmente completa,

i. en el que dicha PrPSc no tiene sitio de escisión para dicha proteasa dentro de dicha región de octarrepetición o entre dicha región de octarrepetición y dicho núcleo resistente a proteasa de manera que un fragmento de la región amino-proximal que incluye dicha región de octarrepetición sigue estando conectado a dicho núcleo resistente a proteasa tras dicha digestión proteolítica sustancialmente completa, y

ii. en el que dicha PrPC tiene al menos un sitio de escisión disponible para dicha proteasa dentro de la región de aminoácidos correspondiente a dicho núcleo resistente a proteasa, y dicho al menos un sitio de escisión disponible se escinde mediante dicha digestión proteolítica sustancialmente completa;

(c)

prevenir cualquier digestión proteolítica adicional tras dicha digestión proteolítica sustancialmente completa en (b) añadiendo un inhibidor de la proteasa o eliminando dicha proteasa;

(d)

desnaturalizar dicha PrPSc tratada con proteasa específica del sitio proporcionando de ese modo PrPSc desnaturalizada; y(

e) detectar la presencia de dicha PrPSc desnaturalizada usando al menos dos componentes de unión, un primer componente de unión y un segundo componente de unión,

i. en el que dicho primer componente de unión se une específicamente a un primer epítopo que está ubicado dentro de dicho fragmento de la región amino-proximal que sigue estando conectado a dicho núcleo resistente a proteasa tras dicha digestión proteolítica sustancialmente completa, y

ii. en el que dicho segundo componente de unión se une específicamente a un segundo epítopo que está ubicado dentro de dicho núcleo resistente a proteasa, en el que dicho segundo epítopo está en una región de dicha PrPC que está separada de dicho primer epítopo tras dicha digestión proteolítica sustancialmente completa.

La presente invención también proporciona un kit para detectar la presencia de una forma patógena de proteína priónica (PrPSc) que tiene un núcleo resistente a proteasa y una región de octarrepetición en una muestra que se sospecha que contiene dicha PrPSc, en el que dicha muestra puede contener o puede no contener una forma normal de proteína priónica (PrPC), comprendiendo el kit:

(a)

al menos una proteasa específica del sitio, en el que dicha al menos una proteasa específica del sitio es tripsina o S-V8,

i. en el que dicha PrPSc no tiene sitio de escisión para dicha proteasa dentro de dicha región de octarrepetición o entre dicha región de octarrepetición y dicho núcleo resistente a proteasa de manera que un fragmento de la región amino-proximal que incluye dicha región de octarrepetición sigue estando conectado a dicho núcleo resistente a proteasa tras una digestión proteolítica sustancialmente completa de PrPSc mediante dicha proteasa, y

ii. en el que dicha PrPC tiene al menos un sitio de escisión disponible para dicha proteasa dentro de la región de aminoácidos correspondiente a dicho núcleo resistente a proteasa;

(b)

opcionalmente, un inhibidor de la proteasa que puede inhibir la actividad de dicha proteasa;

(c)

opcionalmente, un desnaturalizante que puede desnaturalizar dicha PrPSc;

(d)

al menos dos componentes de unión, un primer componente de unión y un segundo componente de unión,

i. en el que dicho primer componente de unión se une específicamente a un primer epítopo que está ubicado dentro de dicho fragmento de la región amino-proximal que sigue estando conectado a dicho núcleo resistente a proteasa tras una digestión proteolítica sustancialmente completa de dicha PrPSc mediante dicha proteasa, y

ii. en el que dicho segundo componente de unión se une específicamente a un segundo epítopo que está ubicado dentro de dicho núcleo resistente a proteasa, en el que dicho segundo epítopo está en una región de dicha PrPC que está separada de dicho primer epítopo tras una digestión proteolítica sustancialmente completa de dicha PrPC mediante dicha proteasa; y

(e)

instrucciones para usar dicho kit para detectar la presencia de cualquier forma patógena de proteína priónica.

Proteasa específica del sitio

Las proteasas específicas del sitio que son útiles en la presente invención son proteasas que escinden enlaces peptídicos de residuos de aminoácidos específicos, discretos. Las proteasas específicas del sitio escindirán una proteína en un tipo o un número pequeño de residuos de aminoácidos específicos permitiendo de ese modo la predictibilidad en la escisión de la proteína priónica. Dichas proteasas específicas del sitio son: tripsina que es una proteasa específica del sitio que escinde en el lado carboxilo de residuos de Lys (K) o Arg (R), cuando el aminoácido en el lado carboxilo de K y R no es Pro, y S-V8 que es una proteasa específica del sitio de la cepa V8 de S. aureus que escinde en el lado carboxilo de residuos de Asp (D) o Glu (E). Para la especificidad de la escisión con tripsina, véase, por ejemplo, Neurath et al. (1950) Chem. Rev. 46:70; Walsh y Neurath (1964) Proc. Natl. Acad Sci. USA 52:884-889; Walsh (1970) Meth. Enzymol. 19:41. Para la especificidad de la escisión con S-V8, véase, por ejemplo, Drapeau et al. (1972) J. Biol. Chem. 247:6720-6726, y Houmard et al. (1972) Proc. Natl. Acad Sci. USA 69:35063509. La tripsina y S-V8 están disponibles comercialmente a partir de diversos suministradores tales como Pierce, parte de Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford IL, y Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO.

Otras proteasas específicas del sitio de este tipo pueden seleccionarse fácilmente por un experto en la técnica.

Además de ser útil en el presente procedimiento, debe haber un sitio de escisión para la proteasa específica del sitio en la proteína priónica en la región entre los epítopos reconocidos por los dos componentes de unión usados en el procedimiento de ensayo. Al menos un sitio de escisión por proteasa estará dentro de la región del núcleo resistente a proteasa (aproximadamente los aminoácidos 90-231 de la proteína priónica) y este sitio se escindirá mediante la proteasa específica del sitio sólo cuando la proteína priónica está en la forma de PrPC y no cuando la proteína priónica está en la forma de PrPSc. Preferentemente al menos uno de los epítopos estará en la región del núcleo resistente a proteasa de la proteína priónica. Preferentemente, al menos otro epítopo estará ubicado dentro de la

región amino-proximal de la proteína priónica, y más preferentemente, dentro de la región de octarrepetición de la proteína priónica. Preferentemente, la proteasa específica del sitio no escinde en un sitio dentro de la región de octarrepetición de la proteína priónica. La secuencia repetida del núcleo de la región de octarrepetición es GQPHGG(G/S)(-/G)W (SEC ID N.º: 11), que puede variar ligeramente en priones de diferentes especies (véanse las figuras 1A y 1B o 2A y 2B para las secuencias de 10 proteínas priónicas diferentes que muestran las secuencias de octarrepetición). En alguna bibliografía, la secuencia repetida del núcleo de la región de octarrepetición se dio a conocer como P(H/Q)GGG(-/T)WGQ (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 7.097.997 B1) (SEC ID N.º: 12), que es un ligero desplazamiento y variación de la secuencia de octarrepetición dada a conocer en el presente documento, pero ambas secuencias de octarrepetición están aparentemente relacionadas a la misma región. La figura 3 muestra una representación esquemática de las formas PrPC y PrPSc que muestra las regiones de octarrepetición, los sitios de epítopo a modo de ejemplo y los sitios de escisión de proteasa específica del sitio a modo de ejemplo. La proteasa específica del sitio escindirá la forma PrPC en al menos un sitio entre los epítopos reconocidos por los dos componentes de unión, preferentemente los anticuerpos anti-priones usados en un ELISA. Por tanto, la forma PrPC no se detectará en el ELISA. La forma PrPSc, sin embargo, no se escindirá mediante la proteasa específica del sitio en la región entre los dos epítopos ya que la conformación de esta isoforma hace que los sitios no estén disponibles para la escisión con proteasa. Por tanto, la PrPSc podrá detectarse en el ELISA.

Tratamiento con proteasa

Tal como se describió anteriormente, las muestras que van a analizarse pueden contener de manera natural altos niveles de PrPC. Se ha usado PK en otras configuraciones para digerir la forma PrPC, dejando la forma PrPSc más resistente. Sin embargo, PrPSc no es completamente resistente a proteólisis si se usan altas concentraciones de PK y/o tiempos de exposición prolongados tal como se muestra por el hecho de que el tratamiento con PK reduce la infectividad de la forma patógena. Véase McKinley et al. (1983) Cell 35:57-62. Por tanto, el tratamiento con PK debe controlarse cuidadosamente con el fin de proporcionar la escisión completa de la forma PrPC pero dejar intacto el núcleo resistente de la forma PrPSc. Una digestión con PK demasiado pequeña dejará la forma PrPC residual que proporcionará un falso positivo en la fase de detección y demasiada digestión con PK escindirá el núcleo resistente de PrPSc haciendo que no pueda detectarse en la fase de detección. Además, aunque el(los) sitio(s) de digestión con PK particular(es) de PrPSc varían desde que la forma patógena puede adoptar múltiples conformaciones, la digestión con PK de PrPSc normalmente da como resultado múltiples fragmentos resistentes a proteasa aproximadamente en los residuos 90-231, que pueden reducir o eliminar la unión de anticuerpos anti-priones dirigidos frente a epítopos en esta región. Véase Telling et al. (1996) Science 274:2079-2082.

En la descripción actual, una muestra que se sospecha que contiene una forma patógena de proteína priónica se trata con la proteasa específica del sitio seleccionada en condiciones en las que cualquier proteína priónica no patógena se digeriría de manera sustancialmente completa. Un experto en la técnica es competente para determinar las condiciones apropiadas. Las condiciones de la digestión sustancialmente completa pueden determinarse fácilmente mediante pruebas usando PrP recombinante. Para la tripsina como proteasa específica del sitio, normalmente una concentración de tripsina de 50 !g/ml durante 1 hora a 37ºC en TBST (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,05% de Tween 20), preferentemente con el 1% de Triton X-100 y CaCl2 0,2 M, y una concentración de tripsina de 10 !g/ml durante 1 hora a 37ºC en TBSS (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 2% de sarcosil), son ambas adecuadas.

Tras la digestión sustancialmente completa de la proteína priónica no patógena, la proteasa específica del sitio debe eliminarse, inactivarse o inhibirse con el fin de evitar cualquier digestión con proteasa adicional, por ejemplo, de los anticuerpos anti-priones que se usarán para la detección. La proteasa puede inhibirse mediante la adición de uno o más inhibidores de la proteasa. Los inhibidores de la proteasa se conocen bien en la técnica e incluyen fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), aprotinina, fluorofosfato de diisopropilo (DFP) y 1-cloro-3-tosilamido-4-fenil-2-butanona (TLCK), entre otros. Como alternativa, algunas proteasas están disponibles en forma inmovilizada (por ejemplo, en una matriz de agarosa) que puede eliminarse fácilmente de la reacción mediante medios convencionales (por ejemplo, centrifugación, filtración, etc.).

Desnaturalización

Tras la digestión de la muestra mediante la proteasa específica del sitio y la inhibición/eliminación de la proteasa, la muestra digerida que se sospecha que contiene PrPSc se desnaturaliza con el fin de dar una detección sensible de epítopos.

La desnaturalización puede realizarse de varios modos. En una realización, un agente caotrópico, preferentemente un compuesto de guanidinio, por ejemplo, tiocianato de guanidina o clorhidrato de guanidina, se añade a una concentración de entre 3 M y 6 M. La adición del agente caotrópico en estas concentraciones hace que se desnaturalice la proteína priónica patógena. Para esta realización, el agente caotrópico debe eliminarse o diluirse antes de que se lleve a cabo la detección ya que interferirá con la unión de los componentes de unión a epítopos priónicos, por ejemplo, anticuerpos anti-priones usados en el ELISA.

En otra realización, la desnaturalización se realiza o bien elevando el pH hasta 12 o superior (“alto pH”) o bien disminuyendo el pH hasta 2 o inferior (“bajo pH”). Los detalles de la técnica desnaturalización/disociación por pH se

describen en el documento PCT/US2006/001437 y la solicitud estadounidense número 11/518.091.

La exposición de PrPSc no desnaturalizada a pH o bien alto o bien bajo da como resultado la desnaturalización de la proteína priónica patógena. En esta realización se prefiere la exposición de PrPSc a alto pH. Un pH entre 12,0 y 13,0 es suficiente generalmente; preferentemente se usa un pH de entre 12,5 y 13,0; más preferentemente, un pH de 12,7 a 12,9; lo más preferentemente un pH de 12,9. Como alternativa, la exposición de PrPSc a un bajo pH puede usarse para desnaturalizar la proteína priónica patógena. Para esta alternativa es suficiente un pH de entre 1,0 y 2,0. La exposición de la muestra digerida con proteasa a o bien un alto pH o bien un bajo pH se lleva a cabo durante sólo un tiempo corto por ejemplo de 60 minutos, preferentemente durante no más de 15 minutos, más preferentemente durante no más de 10 minutos. Las exposiciones más largas que ésta pueden dar como resultado el deterioro significativo de la estructura de la proteína priónica patógena de manera que se destruyen los epítopos reconocidos mediante los componentes de unión usados en las etapas de detección.

Tras la exposición durante un tiempo suficiente para desnaturalizar PrPSc, el pH puede reajustarse fácilmente a neutro (es decir, pH de entre aproximadamente 7,0 y 7,5) mediante la adición de o bien un reactivo ácido (si se usan condiciones de desnaturalización a alto pH) o un reactivo básico (si se usan condiciones de desnaturalización a bajo pH). Un experto en la técnica puede determinar fácilmente protocolos apropiados y se describen ejemplos en el presente documento. Ya que el alto pH o bajo pH usado en la etapa de desnaturalización puede reajustarse fácilmente a neutro mediante la adición de pequeños volúmenes de ácido o base adecuados, esta realización permite el uso directamente en la etapa de detección, por ejemplo, ELISA, sin ningún lavado adicional y sin aumentar los volúmenes de muestra de manera significativa.

En general, para efectuar una condición de desnaturalización de alto pH, es suficiente la adición de NaOH a una concentración de aproximadamente 0,05 N a aproximadamente 0,2 N. Preferentemente, se añade NaOH a una concentración de entre 0,05 N a 0,15 N; más preferentemente se usa NaOH 0,1 N. Una vez se ha realizado la desnaturalización de PrPSc, el pH puede reajustarse a neutro (es decir, entre aproximadamente 7,0 y 7,5) mediante la adición de cantidades adecuadas de una disolución ácida, por ejemplo, ácido fosfórico, fosfato de sodio monobásico.

En general, para efectuar una condición de desnaturalización de bajo pH, es suficiente la adición de H3PO4 a una concentración de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 0,7 M. Preferentemente, se añade H3PO4 a una concentración de entre 0,3 M y 0,6 M; más preferentemente se usa H3PO4 0,5 M. Una vez se ha realizado la desnaturalización de PrPSc, el pH puede reajustarse a neutro (es decir, entre aproximadamente 7,0 y 7,5) mediante la adición de cantidades adecuadas de una disolución básica, por ejemplo, NaOH o KOH.

Las muestras desnaturalizadas pueden usarse para la detección adicional PrPSc.

Detección

La PrPSc desnaturalizada puede detectarse con al menos dos componentes de unión específicos para secuencias priónicas, uniéndose un componente de unión específicamente a un epítopo en la región amino-proximal de PrPSc desnaturalizada, preferentemente en la región de octarrepetición, y uniéndose el otro componente de unión específicamente a un epítopo en la región del núcleo resistente a proteasa de PrPSc desnaturalizada que ya no está disponible en PrPC debido a la escisión con proteasa.

En ciertas realizaciones del procedimiento, los componentes de unión son anticuerpos, y una realización preferida entre éstas ha llevado a cabo su etapa de detección usando un ELISA.

En otras ciertas realizaciones, los componentes de unión usados en el procedimiento son aptámeros específicos para el primer epítopo y el segundo epítopo.

Se han descrito anticuerpos, anticuerpos modificados y otros reactivos que se unen a priones, particularmente a PrPC o a la PrP desnaturalizada, y algunos de éstos están disponibles comercialmente (véase, por ejemplo, anticuerpos anti-priones descritos en Peretz et al. (1997) J. Mol. Biol. 273:614; Peretz et al. (2001) Nature 412:739; Williamson et al. (1998) J. Virol. 72:9413; Polymenidou et al. (2005) citado anteriormente; patente estadounidense n.º 6.765.088). Algunos de éstos y otros están disponibles comercialmente a partir de, entre otros, In Pro Biotechnology, South San Francisco, CA, Cayman Chemicals, Ann Arbor MI; Prionics AG, Zurich; también véase, el documento WO 03/085086 para la descripción de anticuerpos modificados.

Los anticuerpos anti-priones preferidos serán los que se unen a una forma desnaturalizada del prion patógeno.

Los primeros anticuerpos particularmente preferidos serán los de para el primer epítopo que está ubicado dentro de la región de octarrepetición de la proteína priónica. Ciertos ejemplos de tales anticuerpos son POM2, POM11, POM12, POM14, 3B5, 4F2, 13F10, SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35 y SAF-37. (Véase, por ejemplo, Polymenidou et al. (2005) Lancet Neurol. 4:805-814; Krasemann et al. (1996) Mol. Medicine 2:725-734; Féraudet, et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:11247-11258; patente estadounidense n.º 7.097.997 B1.)

En ciertas realizaciones, el primer anticuerpo se unirá a un epítopo que está fuera de la región de octarrepetición.

Los primeros componentes de unión a modo de ejemplo en estas realizaciones incluyen anticuerpos monoclonales tales como BAR210, BAR231 y 14D3 (véase, por ejemplo, Krasemann et al. (1996) Mol. Medicine 2:725-734; Féraudet, et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:11247-11258).

Los segundos anticuerpos preferidos serán los que reconocen los segundos epítopos que están dentro de la región del núcleo resistente a proteasa de PrPSc y que ya no están disponibles en PrPC debido a la escisión con proteasa. Ya que el primer sitio de escisión en la región del núcleo resistente a proteasa de PrPC para tripsina es diferente del de para S-V8 (K-106 para tripsina y D-144 para S-V8, enumerados según PrP humana), habrá epítopos más útiles para PrPSc digerida con tripsina que para S-V8.

Los segundos componentes de unión a modo de ejemplo en realizaciones que se digieren con tripsina incluyen anticuerpos monoclonales tales como 3F4 (patente estadounidense n.º 4.806.627), POM1, POM4, POM5, POM6, POM7, POM8, POM9, POM10, POM13, POM15, POM16, POM17, POM19 (para anticuerpos POM véase Polymenidou et al. (2005) Lancet Neurol. 4:805-814), SAF-2, SAF-4, SAF-8, SAF-9, SAF-10, SAF-12, SAF-13, SAF14, SAF-22, SAF-24, SAF-53, SAF-54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-68, SAF-69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, SAF82, SAF-83, SAF-84, SAF-95, Pri308, Pri917, BAR215, BAR221, BAR224, BAR233, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10 (Krasemann et al. (1996) Mol. Medicine 2:725-734; Féraudet, et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:11247-11258; patente estadounidense n.º 7.097.997 B1.), D18 (Peretz et al. (1997) J. Mol. Biol. 273:614), 6H4 (Liu et al. (2003) J. Histochem. Cytochem. 51:1065) y BDI115 (Biodesign International). El anticuerpo 3F4 reconoce un epítopo, MKHM, en los aminoácidos 109-112 de PrP humana. Otros anticuerpos reconocen diversos epítopos dentro de las regiones desde aproximadamente el aminoácido 107 hasta aproximadamente el aminoácido 231 enumerados según especies de PrP humana.

En ciertas realizaciones del procedimiento en las que se usa tripsina, los segundos componentes de unión se unen específicamente a epítopos ubicados dentro del dominio globular de PrP (es decir, desde aproximadamente el aminoácido 122 hasta aproximadamente el aminoácido 231 de PrP). Los segundos componentes de unión a modo de ejemplo en estas realizaciones incluyen anticuerpos monoclonales tales como POM1, POM4, POM5, POM6, POM7, POM8, POM9, POM 10, POM13, POM15, POM16, POM 17, POM 19, SAF-2, SAF-4, SAF-8, SAF-9, SAF-10, SAF-12, SAF-13, SAF-14, SAF-22, SAF-24, SAF-53, SAF-54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-68, SAF-69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, SAF-82, SAF-83, SAF-84, SAF-95, Pri917, BAR215, BAR221, BAR224, BAR233, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, D18, 6H4 y BDI115.

Los segundos componentes de unión a modo de ejemplo en realizaciones que se digieren con S-V8 incluyen anticuerpos monoclonales tales como SAF-53, SAF-54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-69, SAF-70, SAF-75, SAF76, Pri917, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, 6H4 y POM5.

Pueden generarse fácilmente otros anticuerpos anti-priones mediante procedimientos que se conocen bien en la técnica.

Un experto en la técnica apreciará a partir de la descripción en el presente documento que los primeros y segundos anticuerpos se seleccionan de manera que el primer anticuerpo se une específicamente a un primer epítopo en la región amino-proximal, preferentemente en la región de octarrepetición, y el segundo anticuerpo se une específicamente a un segundo epítopo dentro de una región del núcleo resistente a proteasa de PrPSc que se ha escindido continuamente en PrPC. De este modo, tras la digestión con la proteasa específica del sitio, los epítopos reconocidos por los primeros y segundos anticuerpos estará presente en diferentes fragmentos de la PrPC (y de ese modo no podrán detectarse en el ELISA tipo sándwich) pero estos epítopos estarán presentes en un único fragmento de la PrPSc (y de ese modo podrán detectarse en el ELISA tipo sándwich).

Algunos de los anticuerpos anti-priones son específicos para la proteína priónica de una o un número limitado de especies animales, otros pueden unirse a proteínas priónicas de muchas especies animales. Será evidente elegir anticuerpos anti-priones adecuados basándose en las muestras que van a analizarse y el fin de las pruebas.

Las proteínas priónicas patógenas digeridas con proteasa y desnaturalizadas se detectan preferentemente en un ensayo tipo ELISA, o bien como un ELISA directo o bien un ensayo tipo ELISA tipo sándwich de anticuerpos, que se describen de manera más completa a continuación. Aunque el término “ELISA” se usa para describir la detección con anticuerpos anti-priones, el ensayo no se limita a uno en el que los anticuerpos están “ligados a enzimas”. Los anticuerpos de detección pueden marcarse con cualquiera de las etiquetas detectables descritas en el presente documento y bien conocidas en la técnica de inmunoensayos.

En una realización preferida del procedimiento, las proteínas priónicas patógenas digeridas con proteasa y desnaturalizadas se detectan usando un ELISA tipo sándwich de anticuerpos. En esta realización, la proteína priónica desnaturalizada se captura en un soporte sólido que comprende un anticuerpo de captura, que puede ser el primer anticuerpo o el segundo anticuerpo en diferentes realizaciones. El soporte sólido con la proteína priónica capturada se lava opcionalmente para eliminar cualquier material no unido, y entonces se pone en contacto con un anticuerpo de detección, que puede ser el segundo anticuerpo o el primer anticuerpo, dependiendo de cual sea el anticuerpo de captura (el anticuerpo de captura es diferente del anticuerpo de detección), en condiciones que permiten al anticuerpo de detección unirse a la proteína priónica capturada. Se conocen bien los procedimientos

para llevar a cabo dichos ELISA tipo sándwich y se describen con los ejemplos en el presente documento.

Los soportes sólidos adecuados incluyen cualquier material que sea una matriz insoluble y tenga una superficie rígida o semi-rígida a la que el reactivo específico de prion patógeno puede ligarse o unirse. Los soportes sólidos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, sustratos tales como nitrocelulosa, poli(cloruro de vinilo), polipropileno, poliestireno, látex, policarbonato, nailon, dextrano, quitina, arena, sílice, piedra pómez, agarosa, celulosa, vidrios, metal, poliacrilamida, silicona, caucho, polisacáridos, poli(fluoruro de vinilo); papel diazotizado; perlas activadas, perlas que responden de manera magnética y cualquier material comúnmente usado para la síntesis de la fase sólida, separaciones por afinidad, purificaciones, reacciones de hibridación, inmunoensayos y otras aplicaciones de este tipo. El soporte puede ser particulado o puede estar en forma de una superficie continua e incluye membranas, malla, placas, microgránulos, portaobjetos, discos, capilares, fibras huecas, agujas, alfileres, chips, fibras sólidas, geles (por ejemplo geles de sílice) y perlas (por ejemplo, perlas de vidrio poroso, geles de sílice, perlas de poliestireno opcionalmente reticuladas con divinilbenceno, perlas de co-polímero injertadas, perlas de poliacrilamida, perlas de látex, perlas de dimetilacrilamida opcionalmente reticuladas con N-N’-bisacriloiletilendiamina, perlas magnéticas de óxido de hierro y partículas de vidrio revestidas con un polímero hidrófobo. Un soporte sólido preferido para el primer anticuerpo es una placa de microtitulación.

Preferentemente, o bien el anticuerpo de captura o bien el anticuerpo de detección en el ELISA tipo sándwich reconoce un epítopo dentro de la región de octarrepetición de la proteína priónica. En algunas realizaciones, el anticuerpo de detección está marcado de manera detectable; en realizaciones adicionales, el anticuerpo de detección está marcado enzimáticamente.

En otras ciertas realizaciones, los componentes de unión usados en el procedimiento son aptámeros. Los aptámeros son ácidos nucleicos que tienen las propiedades de reconocimiento molecular de anticuerpos. Los aptámeros son más pequeños y menos complejos que los anticuerpos, y por tanto pueden ser más fáciles de fabricar y modificar. (Véase, por ejemplo, Osbome et al. (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:5-9; Bunka et al. (2006) Nat. Rev. Microbiol. 4:588-596.) Ciertos procedimientos para generar aptámeros específicos para epítopos de proteína están fácilmente disponibles (véase, por ejemplo, Tuerk y Gold (1990) Science 249:505-510; Cox et al. (1998) Biotechnol Prog. 14:845-850; Cox et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:e108). Los aptámeros pueden estar ligados a enzimas que tienen una actividad que puede detectarse fácilmente (véase, por ejemplo, Drolet et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:1021).

Puede usarse cualquiera de los procedimientos de detección para un prion patógeno descrito anteriormente en el presente documento en un procedimiento para diagnosticar una enfermedad relacionada con priones en cualquier muestra.

Para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento, la muestra puede saberse de alguna manera que, o se sospecha de que, contiene una proteína priónica patógena. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra biológica (es decir, una muestra preparada a partir de un organismo vivo o que ha vivido alguna vez), o una muestra no biológica. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra biológica. Ciertos ejemplos no limitativos de muestras biológicas son órganos (por ejemplo, cerebro, hígado y riñón), células, sangre completa, fracciones sanguíneas, componentes sanguíneos, plasma, plaquetas, suero, líquido cefalorraquídeo (LCR), tejido cerebral, tejido del sistema nervioso, tejido muscular, músculo y tejido graso (por ejemplo, carne), médula ósea, orina, lágrimas, tejido del sistema no nervioso, biopsias, necropsias, alimentos que tienen como origen un organismo vivo o que ha vivido alguna vez, y cualquier otra materia orgánica tal como materiales vegetales. En algunas realizaciones, la muestra biológica comprende sangre completa, productos sanguíneos, fracciones sanguíneas, componentes sanguíneos, plasma, plaquetas, glóbulos rojos o suero. La muestra biológica puede obtenerse durante un procedimiento relacionado con la salud tal como un filtrado o una donación de sangre, biopsia, autopsia o necropsia,

o durante un proceso o procedimiento durante la preparación de alimentos tal como la selección y matanza de animales y pruebas de garantía de calidad de producto acabado. En algunas realizaciones, la muestra es no biológica. Ciertos ejemplos no limitativos de muestras no biológicas incluyen productos farmacéuticos, cosméticos y productos de cuidado personal, instrumentos contaminados y alimentos que no tienen como origen un organismo vivo o que ha vivido alguna vez, y similares.

También pueden usarse controles adecuados en los ensayos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede usarse en los ensayos un control negativo de PrPC. Un control positivo de PrPSc (o PrPres) también podría usarse en los ensayos. Opcionalmente, tales controles pueden marcarse de manera que pueden detectarse.

Kits

Los reactivos de ensayo descritos anteriormente, incluyendo las proteasas específicas del sitio, inhibidores de la proteasa (opcional), agentes desnaturalizantes (o desnaturalizantes, opcional), componentes de unión anti-priones tales como anticuerpos, etc., pueden proporcionarse en kits, con instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios para realizar los ensayos de detección tal como se describieron anteriormente. El kit puede contener además controles positivos y negativos adecuados, tal como se describieron anteriormente. El kit puede contener también, dependiendo del ensayo de detección particular usado, etiquetas adecuadas y otros materiales y reactivos envasados (es decir, tampón de lavado y similares).

Ejemplos

Para que pueda entenderse de manera más eficaz la invención dada a conocer en el presente documento, se proporcionan ejemplos a continuación. Debe entenderse que estos ejemplos son para fines ilustrativos solamente y no han de interpretarse como limitativos de la invención de ninguna manera.

5 Ejemplo 1

Revestimiento de placas liofilizadas de 3F4

Se usó el anticuerpo monoclonal 3F4 disponible comercialmente (Covance Research Products, Inc.) como anticuerpo de captura en varios ejemplos mostrados a continuación. Reconoce específicamente los residuos 109112 (aminoácidos MKHM) que están ubicados en la región del núcleo resistente a proteasa de proteína priónica 10 humana. Se diluyó a 2,5 !g/ml en tampón de revestimiento (NaHCO3 0,1 M, pH 8,9) y se incubó a temperatura ambiente (TA) durante 5 min. con agitación. Se añadió el anticuerpo 3F4 diluido a microplacas MicroLite 2+ de Thermo Labsystem en volúmenes de 150 !l/pocillo, y entonces se incubó a TA durante la noche en una bandeja sellada con film adherente con humedad. Se lavaron las placas 3 veces con solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (TBST, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,05%) en un lavador Elx450 de BioTek.

15 Entonces se distribuyó un tampón de bloqueo (0,01 x BlockerCasein en solución salina tamponada con Tris (TBS, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM) con sacarosa al 3%) en las placas en volúmenes de 300 !l/pocillo en el lavador Elx450 de BioTek, y se incubó a TA durante 1 h. Se liofilizaron las placas durante la noche a 16ºC, y cada placa se puso en una bolsita con 3 desecantes, se selló doblemente y se almacenó a 4ºC. En general, todas las placas revestidas se bloquearon con un 0,02% de caseína durante 1 h a 37ºC antes de su uso.

20 Ejemplo 2

Digestión con tripsina de muestras de plasma humano normal

(A) Digestión de plasma con tripsina

Para someter a prueba si la tripsina degrada la PrPC y la convierte en no detectable mediante ELISA, se trató un 10% de plasma humano normal en TBST con concentraciones crecientes de tripsina (tabla 1). La tripsina usada en

25 este y en ejemplos siguientes se obtuvo de Pierce (tripsina TPCK, n.º de catalogo 20233). La digestión se incubó a 37ºC durante 1 h con agitación a 200 rpm. Se detuvo la digestión mediante la adición del inhibidor de la proteasa fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, concentración final 1 mM) con incubación a TA durante 15 min. Se diluyeron las muestras tratadas con tripsina hasta el 1% (del plasma humano normal) y se usaron 150 !l en cada pocillo para ELISA.

30 (B) Análisis ELISA para determinar PrPC

Se sometieron a prueba las muestras para determinar la presencia de PrPC mediante un ELISA tipo sándwich usando 3F4 como anticuerpo de captura y detección con anticuerpo POM2 (Polymenidou et al., citado anteriormente) conjugado con fosfatasa alcalina (FA) usando un sustrato quimioluminiscente para la detección de luz. POM2 reconoce específicamente los epítopos de octarrepetición dentro de los residuos 59-91.

35 Brevemente, se diluyeron muestras de plasma tratadas con tripsina hasta un 1% (del plasma humano original) en TBST y se transfirieron a placas revestidas con 3F4 en volúmenes de 150 !l/pocillo. Las placas se incubaron a 37ºC durante 1 h con agitación a 400 rpm, y entonces se lavaron 6 veces con TBST. Se añadió anticuerpo de detección POM2 conjugado con FA (0,01 !g/ml) en las placas en volúmenes de 150 !l/pocillo y se incubaron a 37ºC durante 1

h. Se lavaron de nuevo las placas 6 veces con TBST. Finalmente, se añadieron 150 !l/pocillo de sustrato Lumi-Phos

40 Plus con SDS al 0,05% a las placas y se incubaron a 37ºC durante 30 min., y se leyeron las señales con un luminómetro para microplacas. Los resultados se muestran en la tabla 1, y las unidades de medición se definen en unidades relativas de luz (RLU).

TABLA 1

Tripsina (!g/ml)

Cantidad relativa de PrPC detectada en plasma humano (RLU)

Ave

DE CV (%)

0

195,4 3,1 1,6

100

70,5 1,6 2,3

200

10,0 0,3 2,6

(continuación)

Tripsina (!g/ml)

Cantidad relativa de PrPC detectada en plasma humano (RLU)

Ave

DE CV (%)

300

8,5 0,5 6,2

400

1,9 0,1 5,0

500

1,2 0,4 29,8

Ave: promedio. DE: desviación estándar. CV: coeficiente de variación.

El resultado muestra que PrPC digerida con tripsina en plasma humano y que la detección de PrPC se suprimió en muestras tratadas con concentraciones superiores de tripsina (tabla 1). Se encontró una respuesta a la dosis entre niveles de concentración de tripsina y PrPC detectada. A la concentración de tripsina de 400 !g/ml, los niveles de

5 PrPC disminuyeron 100 veces a niveles basales.

Ejemplo 3

Digestión con tripsina de muestras de homogeneizado cerebral de hámster sirio normal

En este ejemplo se sometió a prueba la digestión con tripsina de PrPC presente en homogeneizado cerebral (BH) de hámster sirio (SHa) normal.

10 Se mezclaron cinco microlitros de BH de SHa al 10% (p/v) con 5 !l de tripsina en TBST con un 1% de Triton X-100 y CaCl2 0,2 M, en concentraciones crecientes de tripsina (tabla 2), durante 1 h a 37ºC con agitación a 750 rpm. Cada muestra digerida se diluyó mediante adición de 140 !l de TBS, y se detuvo la digestión mediante adición de 1,5 !l/pocillo de PMSF 100 mM (para la concentración final de PMSF de 1 mM) e incubación a TA durante 10 min. con agitación a 750 rpm.

15 Se sometieron a prueba las muestras de BH de SHa digeridas con tripsina para determinar la presencia de PrPC mediante un ELISA tipo sándwich usando 3F4 como anticuerpo de captura y la detección con anticuerpo POM2 conjugado con FA tal como se describió en el ejemplo 2. Las disoluciones de digestión, 150 !l de cada una, se transfirieron a cada pocillo de las microplacas revestidas con 3F4 y se incubaron a 37ºC durante 1 h con agitación a 300 rpm. Se lavaron las placas con TBST, y se añadieron 150 !l/pocillo de 0,01 !g/ml de POM2 conjugado con FA

20 en 0,01 x caseína-TBST y se incubaron a 37ºC durante 1 h. Se añadió sustrato y se leyeron las placas con un luminómetro de microplacas tal como se describió en el ejemplo 2. Los resultados se muestran en la tabla 2.

TABLA 2

Tripsina !g/ml

Cantidad relativa de PrPC detectada en homogeneizado cerebral de hámster sirio (RLU)

Promedio

DE CV (%) Eliminación (%)

100

11,7 2,0 17,5 99,60

50

14,9 0,7 4,6 99,49

25

20,5 1,7 8,5 99,30

0

2937,9 71,1 2,4 0,00

De manera similar a los resultados con plasma humano, la PrPC digerida con tripsina en homogeneizado cerebral de

25 SHa y la detección de PrPC también se suprimió (tabla 2). A diferencia del plasma, se alcanzó la degradación eficaz de PrPC en homogeneizado cerebral con concentración de tripsina de 25 !g/ml, muy inferior a la concentración de tripsina necesaria para la degradación eficaz de PrPC en plasma.

Ejemplo 4

Digestión con tripsina y PK de muestras de homogeneizado cerebral de hámster sirio y detección con 30 anticuerpos POM y 3F4

En este ejemplo se compararon los efectos de la digestión con tripsina y PK en la detección de ELISA de PrPSc hámster sirio, una forma patógena de prion, usando 4 pares diferentes de anticuerpos monoclonales y una

concentración de PK y tripsina.

(A) Digestión de BH de SHa con tripsina o PK y desnaturalización de muestras digeridas

Se trataron dos microlitros de muestras de BH de SHa al 5% (normales o infecciosos) con tripsina o PK a la misma concentración de 25 !g/ml, cada una en volumen de reacción final de 2 !L, durante 1 h a 37ºC. Se detuvo la 5 digestión con PMSF (2 mM, a TA durante 10 min.).

Se desnaturalizaron las muestras con clorhidrato de guanidina (GdnHCl) para garantizar la unión máxima de anticuerpos a PrPSc (concentración final 3 M, 1 h a TA). Entonces se diluyeron las muestras desnaturalizadas hasta GdnHCl 0,1 M y se añadieron a placas de ELISA revestidas con diversos Acm.

(B) Análisis ELISA para PrPSc

10 Se revistieron microplacas con Acm 3F4, POM2 o POM17 a 150 !L de 2,5 !g/ml en NaHCO3 0,1 M, pH 8,9, a 4ºC durante la noche. Se bloquearon las placas con caseína al 0,02% a 37ºC durante 1 h antes de su uso. POM17 reconoce un epítopo dentro del fragmento resistente a proteasa de los residuos ~90-231, en particular un epítopo dentro del dominio globular de los residuos ~122-231.

Las muestras de BH de SHa digeridas con proteasa y posteriormente desnaturalizadas se transfirieron a placas

15 revestidas con 3F4, POM2 o POM17 en los volúmenes finales de 150 !l/pocillo. Se incubaron las placas a 37ºC durante 1 h con agitación a 300 rpm, y entonces se lavaron con TBST. Se añadió POM2 conjugado con FA (POM2AP) o POM17 conjugado con FA (POM17AP), ambos a concentración final de 0,01 !g/ml, en las placas en los volúmenes finales de 150 !l/pocillo y se incubaron a 37ºC durante 1 h. Se lavaron las placas de nuevo con TBST, se añadió sustrato Lumi-Phos Plus y se incubó a 37ºC durante 30 min., y se leyeron las señales tal como se

20 muestran en el ejemplo 2. Los resultados de este experimento ELISA tipo sándwich se muestran en la tabla 3.

TABLA 3

Combinación deanticuerpos

Anticuerpo Cantidad relativa de PrP detectada en homogeneizado cerebral normal (RLU) Cantidad relativa de PrP detectada en homogeneizado cerebral infeccioso (RLU)

Epítopo paracaptura

Anticuerpo de captura Anticuerpo de detección Tripsina PK Tripsina PK

Ave

SD Ave SD Ave SD Ave SD

1

109-112 3F4 POM2AP 21,4 1 10 0,1 2370,3 37,6 527 5,9

2

109-112 3F4 POM17AP 2 0,3 1,7 0,4 253,7 4,4 200,2 5,7

3

59-91 POM2 POM17AP 14,6 1,8 1,8 0,5 381 7,6 68,4 5,5

4

121-231 POM17 POM2AP 70,6 8,5 13,4 0,4 2248,3 24 596,2 40,3

Se encontró a partir de los resultados mostrados en la tabla 3 que PK reducía la señal de detección en todos los casos en comparación con muestras digeridas con tripsina. La reducción de más del 70% se observó entre muestras digeridas con tripsina y PK cuando se usó POM2 o bien como anticuerpo de detección o bien como anticuerpo de captura en los homogeneizados cerebrales infecciosos (filas 1, 3 y 4). Por ejemplo, la señal obtenida con

5 3F4/POM2AP (captura/detección) se redujo desde 2370 hasta 527 RLU. Se observó una proporción similar en la reducción de señal con POM2/POM17AP y POM17/POM2AP. La reducción de la señal se debe a la digestión con PK de los epítopos de octarrepetición reconocidos mediante POM2 dentro de los residuos 23-89.

También se observó una disminución del 20% en la señal cuando se trataron las muestras de homogeneizado cerebral infeccioso con PK y se detectaron con 3F4/POM17AP, aún cuando los epítopos para estos anticuerpos 10 están en el núcleo resistente a proteasa. Esta disminución de la señal sugiere que incluso la digestión con PK limitada puede afectar al fragmento resistente a proteasa 90-231. Es valioso observar que las lecturas más altas se observaron cuando POM2, que se une específicamente a la región de octarrepetición de PrP, se usó como el anticuerpo de detección tras la digestión de tripsina. La siguiente lectura más alta se observó cuando POM2 se usó como el anticuerpo de captura. Se concluye que en presencia de 4 octarrepeticiones, POM2 se une a más de un

15 epítopo y por tanto tiene una unión más fuerte que los anticuerpos que reconocen sólo un epítopo, tales como POM17 y 3F4.

Ejemplo 5

Selección de anticuerpos anti-PrP frente a PrP de diversas especies

Varios anticuerpos anti-PrP tal como se muestran en la tabla 4, que incluye SAF-32, un anticuerpo monoclonal frente

20 a la región de octarrepetición, se seleccionaron por sus capacidades de unión a PrP recombinante (rPrP) de diferentes especies animales y a PrPSc de ratón.

TABLA 4: Información de anticuerpos usados en la prueba de selección

Nombre de anticuerpo

Fabricante n.º de catalogo Huésped Inmunógeno (especificidad)

HuM D18

InPro ABR-0D18 humanizado AMSRPMMHFGNDWEDRYYRENMNRY (aminoácidos 133-157)

HuM D13

InPro ABR-0D13 humanizado HNQWNKPSKPK (aminoácidos 96-106)

Acm 6H4

Prionics 01-010 ratón DYEDRYYRE (aminoácidos 144-152)

Ratón anti Prion(MAB5424)

Chemicon MAB5424 ratón aminoácidos de PrP recombinante 23-237

Acm frente a prion 7D9

Biodesign Q06850M ratón PrP de ratón recombinante (aminoácidos 23-237)

Acm frente a prion BDI115

Biodesign Q65115M ratón péptido de PrP (a.a. 146-159 de proteína priónica bovina) acoplado a una proteína portadora

Ratón anti Prion (SAF-32)

Cayman Chemical 189720 ratón SAF de hámster inf (específico para la región de octarrepetición)

Ratón anti Prion (SAF-53)

Cayman Chemical 189730 ratón SAF de hámster inf (específico para aminoácidos 142-160)

Ratón anti Prion (SAF-61)

Cayman Chemical 189755 ratón SAF de hámster inf (específico para aminoácidos 142-160)

Ratón anti Prion (SAF-83)

Cayman Chemical 189765 ratón SAF de hámster inf (aminoácidos reconocidos 126-164 pero no 142-160a)

a Información de Feraudet, et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:11247-11258 y patente estadounidense n.º 7.097.997 B1.

(A) Revestimiento de placas con diversos PrP

25 Se revistieron algunas microplacas con PrP recombinantes (rPrP) de bovinos, ciervo, ser humano, oveja o ratón siguiendo estas etapas. Cada rPrP se diluyó y se desnaturalizó en tiocianato de guanidina (GdnSCN) 3 M hasta 1,

0,1, 0,01 y 0,001 !g/ml, se incubó a TA durante 10 min., y se añadieron 100 !l/pocillo de la rPrP desnaturalizada por duplicado a placas de 96 pocillos. Entonces, a cada pocillo, se añadieron 100 !l de NaHCO3 0,1 M, pH 8,8, y se incubaron las placas a 4°C durante la noche.

Se revistieron otras microplacas PrPSc de BH de ratón siguiendo estas etapas. Se descongeló BH de ratón infectado con PrPSc (400 !L de BH al 10%) en TBS con un 1% de Tween 20 y un 1% de Triton X-100, y se hizo precipitar mediante centrifugación a 20.000 rpm durante 1 h a 4ºC. Los precipitados se lavaron cada uno con 1 ml de TBS de pH 7,5, y se volvieron a precipitar mediante centrifugación a 20.000 rpm durante 10 min. a 4ºC. Los sedimentos se volvieron a suspender cada uno en 4 ml de GdnSCN 3 M para alcanzar la concentración final de un 1% de BH, y se desnaturalizaron a TA durante 15 min. Las muestras de BH desnaturalizadas se diluyeron hasta un 0,1%, 0,01% y un 0,001% en GdnSCN 3 M, y se añadieron 100 !l/pocillo de cada concentración de BH a las placas por duplicado. Entonces se añadieron 100 !l/pocillo de NaHCO3 0,1 M, pH 8,8, a cada pocillo de muestras de BH. Se llevó a cabo la incubación a 4ºC durante la noche.

(B) Ensayo ELISA para detectar la unión de diversos anticuerpos a las PrP revestidas

Se lavó cada placa 3 veces con TBST. Entonces se bloqueo cada pocillo con 200 !l de BSA al 3% en TBS y se incubó a 37ºC durante 1 h. Después de aspirar el tampón, se añadieron 100 !l/pocillo de anticuerpo primario que va a seleccionarse a 0,5 !g/ml en TBS con BSA al 1%, y se incubaron las placas a 37ºC durante 2 h. Después de lavar las placas 6 veces con TBST, se añadieron 100 !l/pocillo de anticuerpos secundarios conjugados con FA que se unen a los anticuerpos primarios seleccionados, diluidos 1:5000 en TBS con BSA al 1%. Se incubaron las placas a 37ºC durante 1 h, y se lavaron de nuevo 6 veces con TBST. Se añadieron cien !l/pocillo de sustrato Lumi-Phos Plus con SDS al 0,05% y se incubaron a 37ºC durante 30 min. Se leyó la señal con un luminómetro, y se muestran en la tabla 5 los resultados de dos de las diferentes cantidades revestidas de cada PrP, 0,1 ng y 1 ng por ensayo para cada rPrP, así como 0,1 mg y 1 mg por ensayo para determinar PrPSc de BH de ratón.

Los resultados en la tabla 5 muestran que SAF-32, que reconoce específicamente la región de octarrepetición, se unía a proteínas PrP de todas las especies animales sometidas a prueba (bovinos, ciervo, ser humano, oveja y ratón). Las uniones más fuertes de SAF-32 fueron a rPrP de bovinos, ciervo, ser humano y oveja. Los resultados también mostraron unión significativa entre SAF-32 y PrPSc de ratón en homogeneizados cerebrales.

TABLA 5: Cantidad relativa de PrP unida mediante diversos anticuerpos (RLU)

Anticuerpo

rPrP de bovino rPrP de ciervo rPrP humana rPrP de oveja rPrP de ratón PrPSc de BH de ratón

0,1ng/ensayo

1ng/ensayo 0,1ng/ensayo 1ng/ensayo 0,1ng/ensayo 1ng/ensayo 0,1ng/ensayo 1ng/ensayo 0,1ng/ensayo 1 ng/ensayo 0,1 mg deBH/ensayo 1 mg deBH/ensayo

1 ng/ml

10 ng/ml 1 ng/ml 10 ng/ml 1 ng/ml 10 ng/ml 1 ng/ml 10 ng/ml 1 ng/ml 10 ng/ml 0,001% p/v 0,01% p/v

D18

109,4 132,5 134,0 121,0 77,5 94,7 168,6 185,6 366,1 1766,6 375,6 2230,8

D13

75,1 93,1 231,7 129,8 89,5 69,9 179,4 161,2 117,0 293,9 238,8 664,0

6H4

89,1 690,6 92,4 221,6 72,7 192,5 125,0 160,5 104,4 332,0 177,9 609,9

MAB5424

84,6 827,1 104,5 117,9 76,1 67,6 213,8 899,4 90,1 604,9 167,0 601,4

7D9

148,6 961,1 120,6 117,0 81,4 66,1 230,0 992,6 118,0 769,2 158,7 614,1

BDI115

59,1 176,9 104,6 159,5 48,0 74,3 108,0 103,7 54,7 86,7 118,8 115,6

SAF32

449,5 2397,4 457,1 2315,0 285,3 1572,3 293,9 1435,8 97,6 73,3 175,8 551,0

SAF53

76,6 145,2 143,8 263,0 85,2 93,5 100,1 153,9 70,8 611,9 165,2 667,2

SAF61

67,6 136,4 150,5 190,4 90,4 101,3 114,7 112,8 141,7 463,6 169,0 578,8

SAF83

45,7 50,8 121,8 124,8 65,2 67,0 98,1 115,4 181,4 2234,0 273,8 1725,9

Ejemplo 6

Detección de PrP en muestras de BH normal o de vECJ humano tratadas con proteasa con o sin desnaturalización usando anticuerpos SAF-32 y 3F4AP

En este ejemplo se trataron muestras de BH normal o infectado con vECJ humano con tripsina o PK, y entonces o 5 bien se desnaturalizaron o bien se dejaron sin desnaturalizar antes de detectarse con SAF-32 como el anticuerpo de captura y 3F4AP como el anticuerpo de detección.

Se revistieron las microplacas con 150 !l de 3,3 !g/ml de SAF-32 diluido en NaH2CO3 0,1 M, pH 8,9. Se revistieron las placas durante la noche a 4ºC, se lavaron con TBST y se bloquearon con caseína al 1% durante 1 hora a 37ºC antes de su uso.

10 Se añadió un microlitro de muestra de BH normal o de vECJ humano al 10% (p/v) a 1 !l de TBSTT (TBS, un 1% de Tween20 y un 1% de Triton X-00) que tiene tripsina o PK para una concentración final de 25 pg/ml de tripsina o PK. Se llevaron a cabo las digestiones mediante las proteasas durante 10 min. a 37ºC y entonces se detuvieron mediante 2 mM de PMSF. Las muestras digeridas o bien se dejaron sin desnaturalizar o bien se desnaturalizaron con 4 M de GdnHCl a TA durante 1 hora. Las muestras sin desnaturalizar se diluyeron con TBST hasta 150 !l. Las

15 disoluciones desnaturalizadas se diluyeron con TBST hasta 150 ul para una concentración final de GdnHCl 0,1 M. Se añadieron las muestras a las microplacas revestidas con SAF-32 (Cayman Chemicals) en volúmenes de 150 !l/pocillo durante la noche a 4ºC. Se lavaron las placas con TBST, y se añadieron 150 !l de 0,1 !g/ml de 3F4 conjugado con FA (Covance Research Products/Signet Labs) a cada pocillo. Tras la incubación de 1 h a 37ºC, se lavaron las placas, se añadió sustrato Lumi-Phos Plus y se incubó durante 30 min. a 37ºC, y se midieron los niveles

20 de señales con un luminómetro tal como se mostró en los ejemplos anteriores. Las unidades de medición se definen en unidades relativas de luz (RLU). Los resultados se muestran en la tabla 6 y la figura 4, y la proporción de los resultados entre las muestras de vECJ y las muestras normales se calculan y se muestran en la tabla 7.

TABLA 6: Detección de PrP usando anticuerpos SAF-32 y 3F4AP

Condición antes de la detección

Cantidad relativa de PrP detectada en BH humano normal (RLU) Cantidad relativa de PrP detectada en BH humano infectado con vECJ (RLU)

Tripsina

PK Tripsina PK

Ave

SD Ave SD Ave SD Ave SD

Control (sin desnaturalizar)

6,1 0,2 7,7 0,8 15,1 1,6 10,0 2,4

GdnHCl 4 M (desnaturalizado)

50,4 1,5 18,1 0,4 1653,8 27,7 226,2 9,1

TABLA 7: Proporción de cantidades de PrP detectadas en muestras de vECJ frente a normales

Proporción de vECJ/Normal

Tripsina

PK

Control (sin desnaturalizar)

2,5 1,3

GdnHCl 4 M (desnaturalizado)

32,8 12,5

Tal como se muestra en los resultados, el tratamiento con tripsina o PK digirió la mayor parte o toda la PrPC en el tejido normal y la detección fue sólo de 50,4 RLU o inferior tras la desnaturalización. El tejido de vECJ desnaturalizado no proporcionó ninguna lectura significativa. Por tanto, puede concluirse que la detección eficaz de

30 PrPSc mediante la combinación de anticuerpo SAF-32 y 3F4 requiere la desnaturalización de PrPSc.

Además, los resultados en este ejemplo mostraron que el tratamiento de la muestra de BH de vECJ con tripsina seguido de desnaturalización dio como resultado una fuerte señal de 1653 RLU que es 32 veces superior que la señal detectada en la muestra de BH normal. El tratamiento similar de la muestra de vECJ con PK dio como resultado una señal muy inferior de 226 RLU en comparación con el tratamiento con tripsina, y la señal es 12,5 35 veces superior que la señal detectada en la muestra normal tratada con PK. Este ejemplo muestra de nuevo que la detección de PrPSc tras la digestión con PK que escinde dentro de la región de octarrepetición en el extremo Nterminal de PrPSc es inferior a la detección de PrPSc tras el tratamiento con tripsina que no afecta a la región de octarrepetición. Este efecto se observa ahora en este ejemplo y en el ejemplo 4 usando dos anticuerpos diferentes,

POM2 y SAF-32, uniéndose ambos a la región de octarrepetición. Este hallazgo sugiere que el uso de diversos anticuerpos frente a la secuencia de octarrepetición en combinación con el tratamiento con tripsina dará como resultado una sensibilidad superior de la detección de PrPSc que el uso de anticuerpos frente a epítopos singulares y/o tratamiento con PK.

Ejemplo 7

Comparación de la digestión de homogeneizados cerebrales de hámster sirio con tripsina y PK en diversas condiciones de digestión

Un informe reciente sugiere (véase la patente estadounidense n.º 7.097.997 B1) que el tratamiento cuidadoso con PK podría eliminar eficazmente PrPC mientras conserva todos o algunos de los epítopos de octarrepetición de PrPSc, proporcionando una detección mejorada a través del uso de anticuerpo que se une a las octarrepeticiones. El objetivo de los dos experimentos en este ejemplo es comparar la eficacia de la digestión con PK en la eliminación de PrPC a partir de homogeneizados cerebrales (BH) de hámster sirio (SHa), mientras se mantiene la sensibilidad de la detección de PrPSc de SHa, usando el procedimiento de la presente invención la digestión con tripsina en diversas condiciones de digestión.

La digestión de 1 !l de BH normal o infectado con escrapie de SHa al 10% (p/v) se realizó con cantidad creciente de tripsina o PK (de 0 !g/ml a 100 !g/ml) a 37ºC durante 10 min. en 50 !l de TBS con un 1% de Tween 20, un 1% de Triton X-100 y CaCl2 de 0,02 M. Cada digestión se detuvo con PMSF a 2 mM, TA durante 15 min., se desnaturalizó con 75 pl de NaOH 0,1 N durante 10 min., y entonces se neutralizó con 30 !l de NaH2PO4 0,3 M durante 5 min. a TA.

Se revistieron las microplacas con 150 !l de 2,5 !g/ml de 3F4 diluido en NaH2CO3 0.1 M, pH 8,9, a 4ºC durante la noche, se lavaron con TBST y se bloquearon con caseína al 0,1% antes de su uso.

Las muestras de digestión, 150 !l/pocillo de cada una, se añadieron a placas revestidas con 3F4 para un ensayo ELISA. Se incubaron las placas durante la noche a 4ºC, se lavaron con TBST, y se añadieron 150 !l de anticuerpo de detección POM2AP (0,01 !g/ml) o POM17AP (0,1 !g/ml, para determinar la sensibilidad del ensayo que va a compararse con POM2) por pocillo. Tras la incubación de 1 h a 37ºC, se lavaron las placas, se añadió sustrato (Lumi-Phos Plus) y se incubaron durante 30 min. a 37ºC, y se midieron los niveles de señales con un luminómetro tal como se mostró en ejemplos anteriores. Las unidades de medición se definen en unidades relativas de luz (RLU).

Los resultados del experimento realizado con POM2AP se muestran en la tabla 8 y la figura 5, mientras que los de POM17AP se muestran en la tabla 9 y la figura 6. El cálculo de la proporción de señal/normal para ambos experimentos (POM2AP y POM17AP) se realiza y se muestra en la tabla 10.

TABLA 8: Detección de PrPSc usando 3F4 y POM2AP de BH de SHa digerido mediante tripsina o PK en diversas condiciones

Muestra

Tripsina (!g/ml) PK (!g/ml)

0

5 10 20 50 100 0 5 10 20 50 100

normal

RLU 2137,7 33,2 19,7 8,5 3,4 3,4 1954,7 84,1 50,2 37,1 15,8 4,6

SD

7,8 3,6 0,6 1,0 0,7 1,1 150,4 1,3 2,8 4,2 4,5 2,0

infectada con escrapie

RLU 2319,7 2058,0 1900,3 1754,3 1544,3 1173,3 2291,0 2310,0 2242,0 2117,7 1154,0 79,7

SD

23,7 13,9 20,2 26,7 84,5 48,3 39,4 29,7 22,0 28,0 242,9 7,1

S/N

1,1 62,0 96,5 205,6 447,8 346,8 1,2 27,5 44,6 57,1 73,0 17,5

S/N: proporción de señal/normal o proporción de infectada con escrapie/normal.

TABLA 9: Detección de PrPSc usando 3F4 y POM17AP de BH de SHa digerido mediante tripsina o PK en diversas condiciones

Muestra

Tripsina (!g/ml) PK (!g/ml)

0

5 10 20 50 100 0 5 10 20 50 100

normal

RLU 1657,0 8,5 4,5 2,8 2,0 2,6 1676,0 11,4 7,2 5,5 3,3 2,8

SD

32,5 2,0 1,5 0,8 0,3 0,3 17,7 1,0 0,7 1,3 0,8 0,5

infectada con escrapie

RLU 2544,3 2185,3 1986,7 1576,0 812,1 345,2 3858,7 2480,7 1638,3 1112,0 55,9 4,7

SD

50,3 53,1 48,6 56,8 41,7 22,8 25,3 152,5 348,1 39,6 16,0 0,7

S/N

1,5 258,3 438,6 560,3 415,0 132,1 2,3 217,3 229,1 203,4 16,8 1,7

TABLA 10: Resumen de valores de señal infectada con escrapie con respecto a normal (S/N) de las tablas 8 y 9.

Proteasa !g/ml

POM2 POM17

Tripsina

PK Tripsina PK

S/N

S/N

S/N

S/N

5

62 28 258 217

10

97 45 438 229

20

206 57 560 203

50

448 73 415 17

100

347 18 132 2

Tal como se muestra en la tabla 8 y la figura 5, cuando se detectó con POM2AP, las muestras de BH normales no tratadas con ninguna proteasa tienen señales aproximadamente de 2000 RLU debido al alto contenido de PrPC. El

5 tratamiento con 50 !g/ml de tripsina reducía éste hasta niveles basales de 3 RLU. El tratamiento similar de muestras de BH infectadas con escrapie con 50 !g/ml de tripsina dio como resultado niveles de detección de 1544 RLU, con señal infectada con escrapie con respecto a normal (S/N) de 447 veces; el tratamiento con 100 !g/ml de tripsina proporcionaron un S/N de 346 veces. Cuando se trató con 50 !g/ml de PK, el S/N era sólo de 73 veces; a 100 !g/ml de PK la señal infectada con escrapie disminuyó en gran parte y la S/N era 17,5 veces.

10 Tal como se muestra en la tabla 9 y la figura 6, cuando se detectó con POM17AP (a una concentración 10 veces superior que POM2AP), la detección de PrPSc en muestras infectadas con escrapie se encontraba en el máximo tras el tratamiento con tripsina a 50 !g/ml, indicado por un S/N de 560, mientras que la mejor detección con PK se encontraba a 10 !g/ml de PK con S/N de 229. A 100 !g/ml de PK la señal infectada con escrapie disminuyó hasta 4,7 RLU, lo que sugiere la degradación completa del núcleo resistente a proteasa de PrPSc. A concentración similar

15 de tripsina, 100 !g/ml, la RLU era 345.

A partir de los resultados con o bien POM2AP o bien POM17AP tal como se resume en la tabla 10, la mejor detección de PrPSc se observó con tripsina que con PK a cualquier concentración dada de proteasas, indicado mediante los valores de S/N superiores de muestras digeridas con tripsina.

Cuando se digirió con PK y se detectó con POM2AP, el nivel de detección de PrPSc en BH de SHa infectado con

20 escrapie era el más bajo tal como se indica mediante los bajos valores de S/N. Cuando se detectaron las mismas muestras con POM17, la señal era aproximadamente 4 veces superior a concentración óptima de PK. Estos resultados concuerdan con lo que se conoce y se espera sobre las propiedades resistentes a proteasa de PrPSc; los residuos 90-231 son resistentes a la digestión leve con proteasa y por tanto pueden detectarse con anticuerpos con epítopo dentro de esta región, como POM17, mientras que el extremo N-terminal de 23-90 es sensible y los

25 anticuerpos que se unen a la región de octarrepetición, como POM2 y SAF-32, perderán sus sitios de unión. También es evidente que cuando se aumenta la concentración de PK, el extremo N-terminal y el núcleo resistente a proteasa de 90-231 se digieren de manera concomitante. Por tanto, con el fin de alcanzar el objetivo tal como se propone en la patente estadounidense n.º 7.097.997 B1, la concentración de PK ha de titularse cuidadosamente. Ya que el tiempo de incubación y la temperatura afectará a la actividad enzimática, cada estudio necesita ajustarse a

30 una condición específica, lo que lo hace un procedimiento laborioso e inestable. Otro nivel de complejidad son las variaciones en las actividades específicas enzimáticas asociadas con diferentes preparaciones, lotes y fuentes de PK.

El tratamiento con tripsina no tiene las mismas limitaciones que PK. Los anticuerpos con alta avidez como POM2 pueden usarse ya que la región de octarrepetición permanece intacta. Mientras que PK escinde dentro de los 35 residuos 23-89, tripsina escinde dentro de los residuos 23-48 únicamente, dejando los residuos 49-89, que contiene la región de octarrepetición, disponibles para la detección además del núcleo resistente a proteasa de 90-231 (figuras 1A y 1B). Por tanto, se sugiere que pueden mezclarse juntos diferentes anticuerpos de detección y usarse simultáneamente para dar una sensibilidad de detección superior. Por ejemplo, POM2 y POM17, cuando están conjugados ambos con etiquetas tales como FA, pueden usarse simultáneamente como anticuerpos de detección

40 cuando se usa otro anticuerpo, tal como 3F4, para capturar PrPSc digerida con tripsina.

Además, PrPSc parece ser más resistente a tripsina que a PK, ya que a 100 !g/ml de tripsina los valores de S/N están aún por encima de 100. Esto concuerda con estudios previos que demostraban que PK reducía los niveles de PrPSc y la infectividad con priones en varios logs mientras que la tripsina no lo hacía (McKinley et al. (1983) Cell 35:57-62). De las muestras detectadas con POM2AP, el S/N es 73 para muestras tratadas con 50 !g/ml de PK, 45 mientras que el S/N es 448 para muestras tratadas con la misma concentración de tripsina, lo que indica una mejora

de 6 veces cuando se usa tripsina en comparación con usar PK. Cuando se detecta con POM17AP, se observó una mejora de más de 25 veces (415 frente a 17 RLU) con 50 !g/ml de tripsina, y se observó una de más de 2 veces (560 frente a 203 RLU) con 20 !g/ml de tripsina. Por tanto, para ambos anticuerpos, el tratamiento con tripsina dio mejor detección. Debe observarse que aunque se usó POM2AP a 0,01 !g/ml, en comparación con POM17AP que se usó a 0,1 !g/ml, su detección era buena.

Ejemplo 8

Tripsina digiere PrPSc mientras conserva casi PrPSc de longitud completa

Con el fin de confirmar que la tripsina digiere PrPC y PrPSc de manera diferente, se llevó a cabo un ensayo de inmunotransferencia tal como se describe a continuación.

Un esquema de la secuencia de PrP madura de longitud completa, el núcleo resistente a PK de PrPSc, y el mapa de sitios de escisión de tripsina de PrP se muestra en la figura 7A.

Se adquirieron muestras de BH de vECJ y ECJe humano infeccioso del Centro de Investigación de ECJ del Instituto Nacional de Patrones Biológicos y Control (NIBSC) en R.U. y corresponden a cepas de vECJ blanca (MM), de ECJe roja (MM) y ECJ amarilla (MV), respectivamente. Se derivó el homogeneizado cerebral normal de un paciente con encefalopatía vascular de la Universidad de Zurich, que corresponde al paciente NRPE 327. Se digirieron veinticinco microgramos de muestra de BH humano normal o infeccioso con 50 !g/ml de tripsina o proteinasa K (PK) en 0,5xTBS con un 0,5% de Tween 20, un 0,5% de TritonX-100 y CaCl2 5 mM durante 1 h a 37ºC. Se separaron muestras mediante SDS-PAGE al 12% en paralelo con 10 !g de muestra no digerida para la comparación, y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos anti-PrP (3F4, POM2 o POM17). Se usaron anticuerpos antiratón de cabra conjugados con peroxidasa de rábano (HRP) para detectar las inmunotransferencias de tipo Western. Se adquirieron imágenes quimioluminiscentes mediante una estación de imágenes de Kodak 4000MM. El resultado se muestra en la figura 7B.

Además, se digirió una muestra de BH humano normal o de vECJ con concentraciones crecientes de tripsina y entonces se analizó mediante inmunotransferencia de manera similar tal como se describió anteriormente con anticuerpo POM2, 3F4 o POM1 se manera separada. POM1 reconoce un epítopo dentro del núcleo resistente a proteasa, en particular un epítopo dentro del dominio globular de residuos aproximadamente 122-231. El resultado se muestra en la figura 8.

El análisis de inmunotransferencia de las digestiones indicaban que fragmentos de PrPSc resistentes a tripsina (que se espera que sean 49-231) eran más grandes que los fragmentos resistentes a PK ( 90-231) con una fracción sustancial de moléculas conservadas (figura 7B, transferencias con 3F4 y POM17). De manera importante, la espectrometría de masas de PrP23-231 recombinante humana validaba que tripsina podía escindir todos los sitios predichos mediante la secuencia de PrP, confirmando de ese modo que los sitios trípticos estaban realmente protegidos de manera conformacional en PrPSc (datos no mostrados). Un examen adicional reveló que la digestión con tripsina pero no PK conservaba las repeticiones de octapéptidos de PrP reconocidas por el anticuerpo POM2 (figura 7B, transferencias POM2).

Por el contrario, PrPC se digirió mediante ambas proteasas, y ya no se detectó mediante POM2 (residuos 59-89) o 3F4 (residuos 109-112) (figura 7B y figura 8, carriles de muestra normal). Sin embargo, cuando se sometió a inmunotransferencia las digestiones de PrPC con POM17 o POM1 (frente a una hélice, residuos 144-155), se observó un fragmento resistente a tripsina de 25 kDa. Dado que la estructura de PrPC está compuesta por un dominio globular ( 122-231) tras un extremo amino-terminal no estructurado (Zahn, R., et al (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:145-150), el fragmento tríptico de 25 kDa probablemente incluía el dominio globular ya que era el peso molecular apropiado y se detectó mediante POM I y POM 17 pero no POM2 o 3F4 (figura 7B, 8). De manera interesante, esto sugeriría que el dominio globular está plegado de manera ajustada y que los sitios de escisión de tripsina dentro del epítopo de POM17/POM1 (R148 y R151) no están disponibles para la escisión, al contrario de cómo aparecen en la estructura de disolución (Zahn, R., et al (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:145-150). Para entender mejor la resistencia del dominio a la digestión, se digirieron BH tanto normal como de vECJ con cantidades crecientes de tripsina. Se encontró que las secuencias amino-terminales de PrPC eran extremadamente lábiles puesto que no se detectó ninguna PrP mediante o bien POM2 o bien 3F4 en cualquiera de las concentraciones de tripsina sometidas a prueba, pero el dominio globular de PrPC y PrPSc de BH de vECJ eran resistentes a la digestión (figura 8, POM1). Adicionalmente, los patrones de migración de PrPC y PrPSc digerida con tripsina diferían ampliamente, de modo que podrían distinguirse fragmentos de PrPC y PrPSc resistentes a tripsina. Por tanto, se concluye que la digestión con tripsina es un procedimiento viable de separación de PrPC de PrPSc.

Ejemplo 9

Medición de la estabilidad de cepas de ECJ frente a la digestión con tripsina

PK se ha usado comúnmente para caracterizar la diversidad dependiente de la cepa en conformaciones de PrPSc. Estas diferencias se manifiestan como la susceptibilidad a la digestión con proteasa y alteraciones en los sitios de

escisión amino-terminales, tal como se observó para los tipos 1 y 2 de ECJe. La digestión con tripsina, sin embargo, tiene la única ventaja de que se conocen los sitios de escisión, encontrándose varios sitios dentro de los epítopos de anticuerpo bien caracterizados (figura 9A). Por tanto, podría evaluarse la sensibilidad de las secuencias de PrP específicas a la escisión proteolítica. Como tal, se intentó detectar secuencias de PrP que permanecían tras la digestión con tripsina o PK para BH normales (129 MM), de vECJ (129 MM) y de ECJe (ECJe) (129 MM y 129MV) con cantidades crecientes de proteasa.

Se digirió un 1% de BH ( 1 mg/ml de proteína total) diluido en TBS con un 2% de sarcosil (TBSS) con 0, 1, 10 ó 100 !g/ml de tripsina o PK durante 1 h a 37ºC. Se detuvieron las digestiones con la adición de PMSF 2 mM y un cóctel inhibidor Complete Miniprotease (Roche, Indianapolis, IN) en cuatro volúmenes de TBS. Las muestras se detectaron entonces mediante ELISA directo. Aproximadamente 500 nl de BH al 10% digerido se centrifugaron a 14.000 rpm durante 30 minutos a 4ºC. Los sedimentos de PrPSc se volvieron a suspender en GdnSCN 6 M, se diluyeron con volumen igual de NaHCO3 0,1 M pH 8,9, y se revistieron de manera pasiva con los mismos placas para ELISA durante la noche. Las placas se bloquearon en 0,1 x BlockerCasein en TBS (Pierce) y se detectó PrP revestida mediante 0,1 !g/ml de anticuerpos 3F4, POM2 o POM17 y anticuerpos anti-ratón de cabra conjugados con fosfatasa alcalina (FA) (Pierce). Se analizaron todas las muestras mediante ELISA por triplicado y se lavaron seis veces con TBS, un 0,05% de Tween20 entre incubaciones de anticuerpos. Finalmente se añadió sustrato LumiphosPlus (Lumigen, Southfield, MI) con un 0,05% de SDS a los pocillos y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC antes de medir la luminiscencia por medio de un luminómetro Lumiskan (Thermo ElectronCorporation, Waltham, MA). Los datos sin procesar para las muestras de BH normales y de vECJ se muestran en la figura 9B, mientras que los datos normalizados para vECJ MM, ECJe MM y ECJe MV (infeccioso - normal, RLU) se muestran en la figura 9C.

Cabe destacar que estaba presente muy poca señal derivada de PrPC en los sedimentos de muestras no digeridas en BH tanto normales como infecciosos, que desaparecen completamente con sólo 1 !g/ml de proteasa (figura 9B). Además, el fragmento resistente a tripsina de -25 kDa de PrPC no se detectó en el sedimento, lo que sugiere que el dominio permanecía en disolución durante la centrifugación (figura 9B, POM 17).

Cuando se examinó PrPSc de un BH de vECJ, se encontró diferencias significativas en la exposición de epítopos a tripsina frente a PK. Mientras que el epítopo de 3F4 se conservó a la misma tasa cuando se usó o bien proteasa (figura 9B, 3F4), el epítopo de POM2 mostró resultados drásticamente diferentes. Las octarrepeticiones se escindieron únicamente a altas concentraciones de tripsina pero desaparecieron rápidamente con la digestión con PK (figura 9B, POM2). Para comparar directamente la cantidad de PrPSc conservada en cada proteasa, se restó la señal derivada de PrPC detectada en BH normal de cada una de las muestras infecciosas para obtener la señal normalizada (figura 9C, infeccioso - normal). Tal como se muestra en la figura, la cantidad de señal normalizada detectada mediante POM2 en vECJ o ECJe tras la digestión con 100 !g/ml de tripsina es superior o aproximadamente el mismo nivel que la cantidad detectada en la misma ECJ tras la digestión con sólo 1 !g/ml de PK. Mediante esta comparación, la digestión con tripsina conservaba claramente más PrPSc detectada con POM2 que PK puesto que no existe ningún sitio de escisión de tripsina dentro de la región de octarrepetición.

De manera interesante, la detección con POM17 de la partícula del núcleo de PrPSc reveló que la inmensa mayoría de la hélice, la región que contiene el epítopo reconocido por POM 17, era resistente a cada concentración de tripsina sometida a prueba (la figura 9C, POM17), lo que sugiere que R148 y R151 están protegidas de manera conformacional. PK, sin embargo, digirió PrPSc detectada con POM17 con concentraciones crecientes de proteasa, de acuerdo con informes previos (véase Aguzzi y Polymenidou, (2004) Cell 116: 313-327).

Tomados junto con los resultados de análisis de inmunotransferencia mostrados en el ejemplo 8, estos resultados sugieren que la digestión con tripsina de PrPSc, especialmente a concentraciones superiores de proteasa, genera dos poblaciones de fragmentos resistentes a tripsina, siendo una población los fragmentos largos esperados que abarcan los residuos de 49-231, abarcando la otra población residuos de 111-231, que carece del epítopo de 3F4 y las octarrepeticiones. En conclusión, se encuentra que el epítopo de 3F4 se expone igualmente a la escisión mediante tripsina o PK, pero que otras secuencias tales como las regiones de octarrepetición y la de hélice se conservan únicamente en la digestión con tripsina, haciendo de la tripsina una herramienta ideal para el análisis de PrPSc.

Ejemplo 10

Digestión con tripsina y PK de diversas muestras de homogeneizado cerebral de cepa de ECJ humano y detección con anticuerpos POM y 3F4

En este ejemplo, un experimento similar al descrito en el ejemplo 7 se llevó a cabo en varias muestras de BH humano en lugar de muestras de BH de hámster sirio. Se digirieron muestras de BH humano normal o diversas infectadas con ECJ, incluyendo vECJ (M/M), ECJe (M/M1) y ECJe (M/V2), con concentraciones crecientes de tripsina o PK y se detectaron mediante ELISA tipo sándwich. Con el fin de observar si la conservación de la región de octarrepetición mediante la digestión con tripsina puede aumentar la detección de PrP, se usó un anticuerpo de detección frente a la región de octarrepetición, POM2AP, a la misma concentración que y en comparación con otro anticuerpo de detección que es frente a una región de no octarrepetición, POM17AP. En el ejemplo 7, se usó POM2AP en un décimo de la concentración de POM17AP.

Se digirió un BH al 10% diluido 10 veces en TBS con un 2% de sarcosil (TBSS) con 0, 1, 10 ó 100 !g/ml de tripsina

o PK durante 1 h a 37ºC. Se detuvieron las digestiones añadiendo PMSF 2 mM y cóctel inhibidor Complete Mini protease (Roche, Indianapolis, IN) en cuatro volúmenes de TBS. Las muestras se detectaron entonces mediante ELISA tipo sándwich. Se desnaturalizaron doscientos cincuenta nl de BH al 10% digerido con NaOH 0,1 M durante 10 minutos a 25ºC, se neutralizaron con NaH2PO4 pH 4,3, y se capturó PrP con placas revestidas con 3F4 (375 ng/pocillo) y se detectó con 0,02 !g/ml de POM 17 o POM2 conjugado con FA. Todas las muestras se analizaron mediante ELISA por triplicado y se lavaron seis veces con TBS, un 0,05% de Tween20 entre incubaciones de anticuerpos. Finalmente, se añadió sustrato Lumiphos Plus (Lumigen, Southfield, MI) con un 0,05% de SDS a los pocillos y se incubó durante 30 minutos a 37ºC antes de medir la luminiscencia mediante un luminómetro Lumiskan (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA). Los datos sin procesar para muestras de BH normales y diversas de ECJ se muestran en la figura 10, mientras que las cantidades de PrPSc estimadas para vECJ (M/M) (vECJ - normal, RLU) se muestran en la figura 11.

Tal como se muestra en las figuras 10 y 11, a la concentración de digestión con tripsina de 10 !g/ml en TBSS, no pudo detectarse PrPC en la muestra de BH normal con POM2AP o POM17AP cuando se capturó con 3F4, mientras que PrPSc en las muestras de BH de ECJ había dejado cantidades significativas de los fragmentos largos resistentes a tripsina que pudieron detectarse con POM2AP o POM 17AP cuando se capturó con 3F4. Sin embargo la digestión con PK no conservaba la detección de la región de octarrepetición mediante POM2AP cuando la concentración de PK era lo suficientemente alta para eliminar la señal de fondo generada a partir de PrPC. Para ambas cepas de vECJ y ECJe, la cantidad de PrP detectada por POM17AP era comparable para muestras digeridas con tripsina o PK, aunque tripsina conservaba más epítopos a determinadas concentraciones de proteasa. Por el contrario, PrPSc detectada con POM2AP desapareció rápidamente con cantidades crecientes de PK en la digestión, pero disminuía de manera mucho más lenta con cantidades crecientes de tripsina. Además, a la misma concentración de detección de 0,02 !g/ml, POM2AP generó aproximadamente 10 veces la señal (RLU) que la generada por POM17AP en muestras de BH de las tres cepas de ECJ digeridas con diversas concentraciones de tripsina, un resultado que puede atribuirse a la avidez del anticuerpo POM2AP para la secuencia repetida de octapéptido. En conclusión, la conservación de la región de octarrepetición aumentó significativamente la detección de PrPSc.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Novartis AG Peretz, David Yam, Alice

<120> ENSAYO DE PRIONES

<130> PP028406.0003

<150> US 60/921.951

<151>

<150> US 61/066.704

<151>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 253

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína priónica humana

<400> 1

<210> 2

<211> 244

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína priónica de mono

<400> 2

<210> 3

<211> 254

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína priónica de hámster sirio

<400> 3

<210> 4

<211> 264 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificia

<220>

<223> Proteína priónica de bovino

<220>

10 <221> MISC_FEATURE

<222> (46)..(46)

<223> xaa puede ser cualquier aminoácido que se produzca de manera natural

<220>

15 <221> MISC_FEATURE

<222> (154)..(154)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produzca de manera natural

<400> 4

5 <210> 5

<211> 256

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Proteína priónica de oveja

<400> 5

<210> 6

<211> 254

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína priónica de ratón

<400> 6

<210> 7

<211> 256

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína priónica de alce

<400> 7

<210> 8

<211> 256

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína priónica de ciervo gamo

<400> 8

<210> 9

<211> 256

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína priónica de ciervo mulo

<400> 9

<210> 10

<211> 256

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína priónica de ciervo de cola blanca

<400> 10

<210> 11

<211> 9 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de octarrepetición

<220> 10 <221> MISC_FEATURE

<222> (7) .. (7)

<223> Xaa = Gly o Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE 15 <222> (8)..(8)

<223> Gly puede estar presente o ausente

<400> 11

<210> 12 5 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de octarrepetición

10 <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2) .. (2)

<223> Xaa = His o Gln

<220> 15 <221> MISC_FEATURE

<222> (6) .. (6)

<223> Thr puede estar presente o ausente

<400> 12

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de ensayo, que comprende las etapas de:

   (a)

   obtener una muestra que se sospecha que contiene una forma patógena de proteína priónica (PrPSc) que tiene un núcleo resistente a proteasa y una región de octarrepetición, en el que dicha muestra puede contener o puede no contener una forma normal de proteína priónica (PrPC);

   (b)

   tratar dicha muestra con al menos una proteasa específica del sitio en condiciones en las que la digestión proteolítica de dicha PrPSc y dicha PrPC, si está presente, da como resultado dicha PrPSc y dicha PrPC, si está presente, que está escindida en al menos el 90% de todos los sitios de escisión de proteasa disponible, en el que dicha proteasa específica del sitio es tripsina o S-V8,

   i. en el que dicha PrPSc no tiene sitio de escisión para dicha proteasa dentro de dicha región de octarrepetición o entre dicha región de octarrepetición y dicho núcleo resistente a proteasa, de manera que un fragmento de la región amino-proximal que incluye dicha región de octarrepetición sigue estando conectado a dicho núcleo resistente a proteasa tras dicha digestión proteolítica, y

   ii. en el que dicha PrPC tiene al menos un sitio de escisión disponible para dicha proteasa dentro de la región de aminoácidos que corresponde a dicho núcleo resistente a proteasa, y dicho al menos un sitio de escisión disponible se escinde mediante dicha digestión proteolítica;

   (c)

   prevenir cualquier digestión proteolítica adicional tras dicha digestión proteolítica en (b) añadiendo un inhibidor de la proteasa o eliminando dicha proteasa;

   (d)

   desnaturalizar dicha PrPSc tratada con proteasa específica del sitio proporcionando de ese modo PrPSc desnaturalizada; y

   (e)

   detectar la presencia de dicha PrPSc desnaturalizada usando al menos dos componentes de unión, un primer componente de unión y un segundo componente de unión,

   i. en el que dicho primer componente de unión se une específicamente a un primer epítopo que está ubicado dentro de dicho fragmento de la región amino-proximal que sigue estando conectado a dicho núcleo resistente a proteasa tras dicha digestión proteolítica, y

   ii. en el que dicho segundo componente de unión se une específicamente a un segundo epítopo que está ubicado dentro de dicho núcleo resistente a proteasa, en el que dicho segundo epítopo está en una región de dicha PrPC que está separada de dicho primer epítopo tras dicha digestión proteolítica.
2. 2. El procedimiento según la reivindicación 1,

   (a)

   en el que dicha PrPSc comprende una secuencia seleccionada de SEC ID N.os 1 a 10; o

   (b)

   en el que dicho primer epítopo está dentro de dicha región de octarrepetición; en el que opcionalmente dicho primer componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en POM2, POM11, POM12, POM14, 3B5, 4F2, 13F10, SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35 y SAF-37; o

   (c)

   en el que dicho primer epítopo está fuera de dicha región de octarrepetición; en el que opcionalmente dicho primer componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en BAR210, BAR231 y 14D3.

3. 3. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2,

   (a)

   en el que dicha proteasa específica del sitio es tripsina; o

   (b)

   en el que dicha proteasa específica del sitio es S-V8; en el que opcionalmente dicho segundo componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en SAF-53, SAF54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, Pri917, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, 6H4 y POM5; o

   (c)

   en el que dichos componentes de unión son aptámeros; o

   (d)

   en el que dichos componentes de unión son anticuerpos; en el que opcionalmente dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales; o

   (e)

   en el que dicha etapa de detección se lleva a cabo usando un ELISA.

4. 4. El procedimiento según la reivindicación 3(e),

   (a)

   en el que dicho primer componente de unión es un componente de unión de captura para capturar proteínas priónicas, y en el que dicho segundo componente de unión es un componente de unión de detección para detectar dicha PrPSc; o

   (b)

   en el que dicho segundo componente de unión es un componente de unión de captura para capturar proteínas priónicas, y en el que dicho primer componente de unión es un componente de unión de detección para detectar dicha PrPSc.

5. 5.

   El procedimiento según la reivindicación 4(a) o 4(b), en el que dicho componente de unión de detección está marcado; en el que opcionalmente dicho componente de unión de detección está marcado con un conjugado de fosfatasa alcalina.

6. 6.

   El procedimiento según la reivindicación 3(a),

   (a)

   en el que dicho segundo componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en 3F4, POM1, POM4, POM5, POM6, POM7, POM8, POM9, POM10, POM13, POM15, POM16, POM17, POM19, SAF-2, SAF-4, SAF-8, SAF-9, SAF-10, SAF-12, SAF-13, SAF-14, SAF-22, SAF-24, SAF53, SAF-54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-68, SAF-69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, SAF-82, SAF-83, SAF84, SAF-95, Pri308, Pri917, BAR215, BAR221, BAR224, BAR233, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, D18, 6H4 y BDI115; o

   (b)

   en el que dicha PrPC contiene un dominio globular dentro de secuencias de aminoácidos que corresponden a dicho núcleo resistente a proteasa, y en el que dicho segundo epítopo está ubicado dentro de dicho dominio globular.

7. 7.

   El procedimiento según la reivindicación 6(b), en el que dicho segundo componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en POM1, POM4, POM5, POM6, POM7, POM8, POM9, POM10, POM 13, POM15, POM 16, POM17, POM19, SAF-2, SAF-4, SAF-8, SAF-9, SAF-10, SAF-12, SAF-13, SAF-14, SAF22, SAF24, SAF-53, SAF-54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-68, SAF-69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, SAF-82, SAF83, SAF-84, SAF-95, Pri917, BAR215, BAR221, BAR224, BAR233, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, D18, 6H4 y BDI115.

8. 8.

   El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2(a),

   (a)

   en el que dicha proteasa específica del sitio está inmovilizada; o

   (b)

   en el que dicho inhibidor de la proteasa es fluoruro de fenilmetilsulfonilo; o

   (c)

   en el que dicha etapa de desnaturalización comprende tratar dicha muestra con un compuesto de guanidinio; y opcionalmente que comprende además una etapa de dilución de dicha muestra tras dicha etapa de desnaturalización; o

   (d)

   en el que dicha etapa de desnaturalización se lleva a cabo exponiendo dicha muestra a pH alto o pH bajo; y opcionalmente que comprende además la etapa de desnaturalización de dicho pH alto o dicho pH bajo tras dicha etapa de desnaturalización; o

   (e)

   en el que dicha muestra se obtiene de un organismo vivo o que ha vivido alguna vez; en el que opcionalmente dicho organismo vivo o que ha vivido alguna vez se selecciona del grupo que consiste en ser humano, mono, hámster, bovinos, oveja, ratón, alce y ciervo; o

   (f)

   en el que dicha muestra se deriva del grupo que consiste en suministro de alimentos, sangre completa, productos sanguíneos, fracciones sanguíneas, componentes sanguíneos, plasma, plaquetas, suero, líquido cefalorraquídeo, órganos, células, tejido cerebral, tejido del sistema nervioso, tejido muscular, tejido graso, médula ósea, orina, lágrimas, tejido del sistema no nervioso, biopsias, necropsias e instrumentos contaminados; o

   (g)

   en el que dicha muestra se deriva del grupo que consiste en sangre completa, productos sanguíneos, fracciones sanguíneas, componentes sanguíneos, plasma, plaquetas, glóbulos rojos y suero; o

   (h)

   en el que dicha muestra se obtiene de una biopsia, autopsia o necropsia.

9. 9.

   Un kit para detectar la presencia de una forma patógena de proteína priónica (PrPSc) que tiene un núcleo resistente a proteasa y una región de octarrepetición en una muestra que se sospecha que contiene dicha PrPSc, en el que dicha muestra puede contener o puede no contener una forma normal de proteína priónica (PrPC), comprendiendo el kit:

   (a)

   al menos una proteasa específica del sitio, en el que dicha proteasa específica del sitio es tripsina o S-V8,

   i. en el que dicha PrPSc no tiene sitio de escisión para dicha proteasa dentro de dicha región de octarrepetición o entre dicha región de octarrepetición y dicho núcleo resistente a proteasa de manera que un fragmento de la región amino-proximal que incluye dicha región de octarrepetición sigue estando conectado a dicho núcleo resistente a proteasa tras una digestión proteolítica de PrPSc mediante dicha proteasa que da como resultado dicha PrPSc que está escindida en al menos el 90% de todos los sitios de escisión de proteasa disponibles, y

   ii. en el que dicha PrPC tiene al menos un sitio de escisión disponible para dicha proteasa dentro de la región de aminoácidos que corresponde a dicho núcleo resistente a proteasa;

   (b)

   opcionalmente, un inhibidor de la proteasa que puede inhibir la actividad de dicha proteasa;

   (c)

   opcionalmente, un desnaturalizante que puede desnaturalizar dicha PrPSc;

   (d)

   al menos dos componentes de unión, un primer componente de unión y un segundo componente de unión,

   i. en el que dicho primer componente de unión se une específicamente a un primer epítopo que está ubicado dentro de dicho fragmento de la región amino-proximal que sigue estando conectado a dicho núcleo resistente a proteasa tras una digestión proteolítica de dicha PrPSc que da como resultado dicha PrPSc que está escindida en al menos el 90% de todos los sitios de escisión de proteasa disponible mediante dicha proteasa, y

   ii. en el que dicho segundo componente de unión se une específicamente a un segundo epítopo que está ubicado dentro de dicho núcleo resistente a proteasa, en el que dicho segundo epítopo está en una región de dicha PrPC que está separada de dicho primer epítopo tras una digestión proteolítica de dicha PrPC que da como resultado dicha PrPC que está escindida en al menos el 90% de todos los sitios de escisión de proteasa disponible mediante dicha proteasa; y

   (e)

   instrucciones para usar dicho kit para detectar la presencia de cualquier forma patógena de proteína priónica.

10. 10.

    El kit según la reivindicación 9, en el que dicha PrPSc comprende una secuencia seleccionada de SEC ID N.os 1 a

11. 10.

12. 11.

    El kit según la reivindicación 9 ó 10,

    (a)

    en el que dicho primer epítopo está dentro de dicha región de octarrepetición; en el que opcionalmente dicho primer componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en POM2, POM11, POM12, POM14, 3B5, 4F2, 13F10, SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35 y SAF-37; o

    (b)

    en el que dicho primer epítopo está fuera de dicha región de octarrepetición; en el que opcionalmente dicho primer componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en BAR210, BAR231 y 14D3; o

    (c)

    en el que dicha proteasa específica del sitio es tripsina; o

    (d)

    en el que dicha proteasa específica del sitio es S-V8; en el que opcionalmente dicho segundo componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en SAF-53, SAF54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, Pri917, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, 6H4 y POM5; o

    (e)

    en el que dichos componentes de unión son aptámeros; o

    (f)

    en el que dichos componentes de unión son anticuerpos; en el que opcionalmente dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales; o

    (g)

    en el que dicho kit comprende un kit ELISA.

13. 12. El kit según la reivindicación 11(g)

    (a)

    en el que dicho primer componente de unión es un componente de unión de captura para capturar proteínas priónicas, y en el que dicho segundo componente de unión es un componente de unión de detección para detectar dicha PrPSc; o

    (b)

    en el que dicho segundo componente de unión es como un componente de unión de captura para capturar proteínas priónicas, y en el que dicho primer componente de unión es como un componente de unión de detección para detectar dicha PrPSc.

14. 13.

    El kit según la reivindicación 12(a) o 12(b), en el que dicho componente de unión de detección está marcado; en el que opcionalmente dicho componente de unión de detección está marcado con un conjugado de fosfatasa alcalina.

15. 14.

    El kit según la reivindicación 11(c),

    (a)

    en el que dicho segundo componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en 3F4, POM1, POM4, POM5, POM6, POM7, POM8, POM9, POM10, POM 13, POM15, POM 16, POM 17, POM 19, SAF-2, SAF-4, SAF-8, SAF-9, SAF-10, SAF-12, SAF-13, SAF-14, SAF-22, SAF-24, SAF53, SAF-54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-68, SAF69, SAF-70, SAF-75, SAF-76, SAF-82, SAF-83, SAF84, SAF-95, Pri308, Pri917, BAR215, BAR221, BAR224, BAR233, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, D18, 6H4 y BDI115; o

    (b)

    en el que dicha PrPC contiene un dominio globular dentro de secuencias de aminoácidos que corresponde a dicho núcleo resistente a proteasa, y en el que dicho segundo epítopo está ubicado dentro de dicho dominio globular; en el que opcionalmente dicho segundo componente de unión es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en POM1, POM4, POM5, POM6, POM7, POM8, POM9, POM10, POM13, POM15, POM16, POM17, POM19, SAF-2, SAF-4, SAF-8, SAF-9, SAF-10, SAF-12, SAF13, SAF-14, SAF-22, SAF-24, SAF-53, SAF-54, SAF-60, SAF-61, SAF-66, SAF-68, SAF-69, SAF70, SAF75, SAF-76, SAF-82, SAF-83, SAF-84, SAF-95, Pri917, BAR215, BAR221, BAR224, BAR233, BAR234, Sha31, 11B9, 12F10, D18, 6H4 y BDI115.

16. 15.

    El kit según la reivindicación 9 ó 10,

    (a)

    en el que dicha proteasa específica del sitio está inmovilizada; o

    (b)

    en el que dicho inhibidor de la proteasa opcional es fluoruro de fenilmetilsulfonilo; o

    (c)

    en el que dicho desnaturalizante opcional es un compuesto de guanidinio; o

    (d)

    en el que dicho desnaturalizante opcional es un reactivo básico o un reactivo ácido.