ES2328027T3 - Deteccion y diagnostico de encefalopatias esponjiformes transmisibles. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para discriminar entre priones infecciosos y no infecciosos que comprende: poner en contacto una muestra con un anticuerpo anti-DNA capaz de unir PrP Sc y un anticuerpo específico de priones para formar un complejo entre el anticuerpo de ácido nucleico, el prion y el anticuerpo específico de prion y detectar los complejos.

Description

Detección y diagnóstico de Encefalopatías Espongiformes Transmisibles.

Campo de la invención

En la presente invención, los autores de la invención describen el uso de anticuerpo anti-DNA para la detección de priones y la diagnosis de las enfermedades Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (TSE) en animales y seres humanos.

Antecedentes de la invención

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE) comprenden un grupo de enfermedades que progresan rápidamente, mortales neurodegenerativas que afectan tanto seres humanos como animales. Las TSE tienen características clínicas y neuropatológicas que incluyen demencia devastadora, signos piramidales y extrapiramidales tales como mioclonus, cambios espongiformes multifocales, astrogliosis, placas amiloides, pérdida neuronal, ausencia de reacción inflamatoria y se caracterizan usualmente por un periodo de incubación largo.

En animales, un ejemplo comúnmente conocido de enfermedad TSE reconocida durante más de 200 años es la tembladera, que se encuentra en ovejas y cabras (McGowan 1922). Se han descrito otras enfermedades TSE de animales, tales como encefalopatía del visón transmisible (TME, Marsh 1976), enfermedad devastadora de ciervo mula y alce (CWD, Williams 1980), encefalopatía espongiforme bovina (BSE, comúnmente conocida como enfermedad de las vacas locas (Wells 1987)) y la descrita más recientemente encefalopatía espongiforme felina de gatos domésticos, pumas y guepardos (Wyatt 1991).

En seres humanos, las TSE se han clasificado tradicionalmente en enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CDJ), kuru, síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) e insomnio familiar mortal (FFI). Entre ellas, el Kuru se ha descrito sólo en el grupo lingüistico Fore de Nueva Guinea. Durante muchos años después de su primer reconocimiento en 1957, el kuru fue la causa más común de muerte entre mujeres en la población afectada, pero su incidencia ha declinado debido al cese del canibalismo que había facilitado la transmisión de la enfermedad. Hasta el día de hoy, sólo unos pocos casos tienen lugar aún debido a los periodos de incubación largos típicos de esta afección.

Aunque estos trastornos neurodegenerativos raros tienen lugar en aproximadamente 0,5 a una persona por millón a lo largo de todo el mundo (Brown 1987), las TSE atraen atención pública considerable debido a la biología única y preocupa la aparición de la epidemia de una encefalopatía espongiforme bovina (BSE) recién reconocida y sus potenciales efectos en ser humano. Hay evidencia creciente de que a través de la exposición en la dieta a tejidos infectados con BSE ello ha planteado una seria una seria amenaza para la salud pública y ha dado como resultado un número incrementado de casos de una forma variante reconocida recientemente de CJD (vCGD). Hasta ahora, han sido más de 100 casos de vCDG comunicados, una mayoría de los cuales se ha localizado en el Reino Unido.

Se cree que los priones son el agente patógeno que causa TSE. Se han dirigido muchos esfuerzos dirigidos a identificar el agente etiológico que causa TSE. Bien pronto, la transmisibilidad de la enfermedad de TSE se había demostrado experimentalmente en muchos casos, kuru y CDJ de seres humanos a chimpancés (Gajdusek 1966, Gibbs 1968), tembladera transmisible de oveja a oveja (Cuille 1936) y entre especies a cabra (Pattison 1957). El gran avance más significativo fue la transmisión exitosa de tembladera a ratones, por Richard Chandler en 1961 (Chandler 1961). El descubrimiento de Chandler facilitó enormemente la investigación de las TSE proporcionando un modelo experimental que era más barato y más fácil de manipular. Aunque todos los modelos anteriores de transmisión están demostrados experimentalmente, la causa de la BSE reciente en ganado vacuno y la nueva variante de CJD en ser humano (vCDJ) se consideraron una consecuencia de exposición en la dieta a la mezcla de reses muertas de oveja con tembladera presentadas para comida animal en el caso de BSE (Brown 1997) y a carne de ganado vacuno afectado con BSE en el caso de vCJD (Bruce 1997).

Se ha sugerido que las enfermedades de TSE debieron ser causadas por "virus lentos" o viroides (Gajdusek 1977). Sin embargo, la extrema resistencia de la infectividad de tembladera a radiacción, nucleasas y otros reaccionantes que dañan a materiales genéticos es inconsistente con la teoría del "virus". Además, el agente infeccioso de TSF podía tolerar niveles muy altos de calor y concentraciones altas de formaldehído (Pattinson 1965) mientras que aún era capaz de replicarse con el periodo de incubación variando de unos pocos meses a más de un año (Alper 1996).

Todas estas características "inusuales" del agente infeccioso de TSE condujeron al Doctor Stanley Prusiner a proponer el concepto de "priones" en 1982 (Prusiner 1982). El prion (PrP), que significa partícula infecciosa proteinácea libre de ácidos nucleicos, es una glicoproteína presente en seres humanos y animales. En seres humanos, está codificada por PRNP en el cromosoma 20 (Robakis 1986). La forma celular de esta proteína (PrP^{C}) tiene dos sitios de glicosilación de enlace N y un ancla de GPI en el extremo C-terminal. Se ha encontrado lo más comúnmente en neuronas y, en una extensión mucho menor, se ha encontrado también en otras células tales como leucocitos, monocitos y plaquetas (Holada 2000). Además, se detectó una forma soluble de PrP que carece del ancla glicolipídica en suero murino y humano. La enfermedad de tembladera transmisible de la proteína priónica (PrP^{Sc}) es una isoforma resistente a proteasas de su precursor celular y se encuentra predominantemente en el cerebro. A nivel mucho más bajo, se ha encontrado también en amígdala, bazo y nódulos linfáticos en pacientes de vCJD (Parizek 2001). Se cree que la conversión de PrP^{C} a PrP^{Sc} se logra por un cambio conformacional dentro de la proteína. Aunque hay aún ambigüedad con respecto al mecanismo de conversión, mucha evidencia experimental indica que en presencia de PrP^{Sc}, PrP^{C} normal, actuando como un sustrato, sufre un cambio de estructura conformacional y llega a ser PrP^{Sc}. Este proceso de propagación implica replicar la conformación de PrP^{Sc} en PrP^{C} y da como resultado agregación de PrP^{Sc} y formación de bastón amiloide, causando así muerte celular (Hope 1986, Hornwich 1997). Como un resultado del concepto de Prusiner del "prion" como un agente infeccioso responsable de la enfermedad de tembladera y por extensión, de todas las enfermedades TSE ocasionó la noción de que se refieran comúnmente como enfermedades Priónicas para describir una clase de patologías que se cree que están unidas a esta proteína.

Características de PrP^{C} y PrP^{Sc}

La propiedad principal que diferencia PrP^{C} y PrP^{Sc} es su conformación distinta. El cambio estructural de PrP^{C} a PrP^{Sc} está respaldado en su mayoría por un cambio conformacional crucial, que implica un incremento sustancial en la cantidad de estructura de lámina \beta de la proteína, con posiblemente un decrecimiento pequeño en la cantidad de hélice \alpha, indicado por dicroismo circular y espectroscopia de infrarrojos (Pan 1933, Caughey 1991). La estructura de solución de un fragmento del PrP^{C} de ratón ha permitido una determinación directa del contenido de estructura secundaria de una parte de PrP^{C} (121-231) por RMN (Riek 1996).

La resistencia a proteasas es otra característica que distingue PrP^{Sc} de PrP^{C}. En células cultivadas y cerebro o en muestras de muchos pacientes con GSS, PrP^{Sc} es más pequeña que su precursor celular PrP^{C}. Aunque prion celular y prion de tembladera son dos isoformas del mismo producto genómico PRNP, PrP^{C} se degrada completamente por tratamiento con proteinasa K mientras que PrP^{Sc} sufre sólo digestión limitada. La digestión proporciona una forma de proteína referida como PrP 27-30 en la que el extremo N-terminal se ha eliminado. Se ha postulado que PrP 27-30 es el núcleo de PrP^{Sc} requerido para replicación de PrP^{Sc} alojado en PrP^{C}. La molécula priónica tratada con proteasa, PrP 27-30 o PRP^{res}, está unida estrechamente a la infectividad de tembladera (Gabizon 1988) y proporciona evidencia adicional de que PrP^{Sc} es una proteína infecciosa.

Un atributo adicional, quizás unido al incremento significativo en estructura en lámina \beta y a la resistencia a proteasas concomitante, es la diferencia observada en solubilidad entre PrP^{Sc} y PrP^{C}. Mientras que PrP^{C} es una proteína soluble, la isoforma PrP^{Sc} es altamente insoluble. Además, PrP^{C} se encuentra unida a la superficie de neuronas por una cola de GPI unida en la membrana (Shyng 1994) mientras que PrP^{res} se encuentra en el citoplasma de células afectadas (Tarabolulos 1990), lo más probablemente asociada con los últimos compartimentos endosomales y lisosomales (Arnold 1995) y PrP^{Sc} se localiza también en agregados amorfos en fracciones enriquecidas de cerebros infectados (Meyer 1986). De forma interesante, un PrP mutante asociado con enfermedad, el mutante PrP^{159stop} se encontró exclusivamente en el núcleo (Lorenz 2002).

Hay evidencia creciente que indica un vínculo estrecho entre infectividad de tembladera y PrP 27-30. Incluso en las muestras más puras, la relación estimada de moléculas PrP a unidades infecciosas es \sim 10^{4} a 10^{5} (Horwich 1997, Bolton 2001). A tales niveles bajos de infectividad, es posible que otros componentes, cofactores, o modificaciones covalentes, se requieran para infectividad. Los estudios transgénicos en la susceptibilidad de ratones que expresan PrP^{C} humano-ratón quiméricos sugieren la presencia de al menos un factor del huésped distinto de PrP^{C}, tentativamente llamado factor X, que puede funcionar como un chaperón molecular en la formación de PrP^{Sc} (Telling 1995).

Otras Moléculas Asociadas con Patógeno Priónico

Se han identificado aproximadamente 15 a 20 cepas de tembladera en base a su periodo de incubación y a patrones de lesión en los ratones endogámicos. Después de un paso de inoculación en serie en ratones endogámicos homocigotos para un genotipo PRNP individual, todas las cepas de tembladera mantuvieron su perfil de enfermedad original. Estas observaciones condujeron a los investigadores a preguntarse si diversas cepas fenotípicas estuvieron dominadas por diferentes isoformas de conformación del mismo precursor priónico celular, una posibilidad sugerida por inmunoensayo dependiente de conformación (Safar 1998) o si estas cepas fueron un resultado de diversas moléculas asociadas a PrP^{Sc}.

Muchos investigadores han identificado diversas moléculas no proteicas que están unidas a proteína priónicas. Los papeles biológicos y fisiológicos precisos mantienen el tópico de investigación adicional. Se ha demostrado que el cobre y el cinc se unen a PrP^{C}. In vitro, estos metales divalentes pueden contribuir a actividad similar a superóxido dismutasa (SOD) priónica. Tal actividad similar a SOD y tal contenido de cobre están espectacularmente reducidos en cerebro infectado con tembladera (Wong 2001).

Además, se encuentra que los bastones priónicos, compuestos principalmente de agregados insolubles de la proteína priónica truncada N-terminalmente (PrP 27-30) están asociados con unidades de glucosa unidas en 1,4. Esfingolípidos, polisacáridos y otros componentes de membrana se encontraron también en agregados priónicos (Appel 1999, Klein 1998). La interacción entre proteína priónica y membranas lipídicas podría jugar un papel en la conversión de PrP. Por ejemplo, la conformación insertada en la membrana lipídica cargada negativamente de PrP es más rica en estructura de lamina \beta mientras que la unión de PrP a membranas similares a dominios balsa induce la formación de estructura \alpha helicoidal (Shanghera 2002).

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En los primeros 90, Snow y col., estudiando el síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y la tembladera, han documentado la asociación de proteoglicano sulfatado a las placas de amiloides de proteína priónica (Snow 1990). En un estudio de inmunohistoquímica usando anticuerpos de heparán sulfato (anti-HS) y anticuerpos de proteoglicano de heparán sulfato (anti-HSPG), McBride ha demostrado la correlación y asociación entre HSPG y PrP anormal en cerebro de ratón infectado por tembladera. Esta correlación y asociación se observó tan pronto como 70 días tras la infección y durante todo el curso de la enfermedad (McBride 1998). En la conversión in vitro de PrP^{C} a PrP^{Sc} y en experimentos de reconstitución de infectividad priónica, los glicanos de sulfato han estado mostrando bien facilitar la conversión o bien intensificar la infectividad (Wong 2001, Shaked 2001a). Con GST-prion de longitud total y GST-fragmento de prion recombinantes, Warner demostró recientemente la unión directa de prion recombinante a heparina y a heparán sulfato (Warner 2002). La región peptídica 25-52 en la secuencia priónica fue positiva en todas las pruebas de unión de HS y de HSPG. Dado que el péptido falla al competir con prion de longitud total para unión a heparina, el autor sugiere que podría haber otro sitio de unión a GAG principal en PrP^{C} intacto. Otra observación digna de mención es que GAG de diferentes especies (bovina y porcina) o de diferentes órganos (pulmón, riñón e intestino) han mostrado afinidades diferentes para unión a priones. La diferencia en afinidad se puede deber a secuencia de priones por sí misma, o puede depender de la presencia de unidad de azúcares particular en las GAG probadas.

A través de un mecanismo que quizás es diferente de aquel por el que los glicanos participan en la conversión de PrP^{C} a PrP^{Sc}, el DNA pudo convertir también proteína priónica celular a conformación de láminas \beta (Cordeiro 2001). Nandi demostró que el péptido priónico 106-126 es la región que participa en la asociación de complejo de ácido nucleico-prion (Nandi 1998). De forma interesante, no sólo se obtuvo agregado amiloide resistente de la interacción entre proteína priónica y ácidos nucleicos, la morfología de ácido nucleico también cambió a estructuras globulares condensadas, similares a estructuras de ácidos nucleicos inducidas por la proteína NCp7 de VIH-1, pero no a la estructura inducida por histonas (Nandi 2002). En base a aquellos estudios de conformación y de conversión in vitro, se supuso que el DNA actuaría como un guardián de la conformación de PrP^{Sc}, así como un catalizador para facilitar la conversión y agregación de PrP^{Sc} (Cordeiro 2001).

Si alguien acepta o rechaza la hipótesis "proteína sólo" o "prion sólo", el esfuerzo para unir la información heredada a enfermedad de TSE o la búsqueda de estructura genética relacionada con enfermedad TSE nunca ha parado. Se propuso la presencia de una molécula de RNA o DNA estrechamente unida en la partícula priónica para explicar la propagación de las diferentes cepas de agente de tembladera con distintos fenotipos en animales homocigotos para el gen PNRP (Weissmann 1991). El análisis de priones de tembladera altamente purificados volviendo a centrar la electroforesis en gel reveló el pequeño tamaño de los ácidos nucleicos restantes, aunque el tamaño de los nucleótidos extraídos era demasiado pequeño para codificar cualquier proteína significativa (Kellings 1992). En una comunicación reciente, sin embargo, Narang indicó que los animales inoculados con DNA de cadena simple purificado de cerebros de hámsteres con tembladera mezclados con prion no patógeno desarrollaron la enfermedad clínica (Narang 2002). En base a estos hallazgos, postuló que la "proteína accesoria" codificada por el DNA de cadena simple puede estar implicada en la conversión PrP^{C} a PrP^{Sc}. Aunque el papel de los ácidos nucleicos en enfermedad asociada a priones es controvertido, está claro que los agregados de PrP^{Sc} están estrechamente asociados con estas moléculas pequeñas.

Infectividad y Transmisibilidad de Enfermedades Priónicas

El CJD clásico en el ser humano se ha agrupado en tres tipos etiológicos: esporádico (CJD), heredado (GSS o FFI) y adquirido, que es muy raro e incluye enfermedades tales como kuru y CJD iatrogénico. No hay evidencia fuerte que indique que cualquiera de estas enfermedades esté relacionada con TSE de animales que puedan haber cruzado la barrera entre especies. La epidemia de kuru ha proporcionado el mayor cuerpo de evidencia de enfermedad priónica humana adquirida. La búsqueda de factores de riesgos y posibles fuentes de infección en pacientes de CJD esporádica no reveló ninguna correlación significativa de la enfermedad con la dieta, transfusión de sangre o recepción de otro producto sanguíneo. Sin embargo, después de inoculación intracerebral a ratones, la infectividad en sangre obtenida a partir de pacientes CJD indicó la posible presencia del agente CJD (Manuelidis 1985, Tateishi 1985).

BSE parece haberse originado por exposición dietética. Los suplementos nutricionales de carne procesada y harina ósea derivados de reses muertas infectadas con enfermedad de tembladera se usaron para alimentar ganado vacuno y otros animales cautivos. A pesar de que BSE se origina a partir de tembladera, no se ha comunicado ningún caso de infección de novo o de transmisión vaca a vaca.

Hay evidencia creciente, sin embargo, que une vCJD a BSE. Los datos epidemiológicos crecientes sitúan la mayoría de los casos de vCJD en el Reino Unido donde se ha comunicado también la mayoría aplastante de los casos de BSE. El vínculo entre vCJD y BSE está respaldado adicionalmente por la evidencia neuropatológica obtenida a partir de macacos afectados con BSE, el modelo más cercano a seres humanos (Bruce 1997) y a partir del estudio en ratones endogámicos inoculados con el agente que causa BSE y vCJD (Lasmézas 1996).

Aunque no se ha documentado ningún paciente de vCJD como una víctima de transmisión ser humano a ser humano, el vínculo estrecho entre BSE y vCJD atrae atracción considerable. Los asuntos sobre infección humana se han basado en la observación de que PrP^{Sc} es fácilmente detectable en tejidos linforreticulares de BSE y vCJD pero no en CJD clásico (Hill 1997), seguida por la presunción de que el paso del patógeno de tembladera de ovejas a ganado vacuno puede haber alterado el intervalo de huésped y llegar a ser éste más adaptable a ser humano. Los precedentes experimentales para tal conocimiento se conocen bien: el paso de cepas adaptadas a ratón de tembladera por hámsteres alteró su transmisibilidad en paso inverso a ratones (Kimberlin 1987, Kimberlin 1989); las cepas humanas de kuru y CDJ no se transmitieron a hurones ni a cabras hasta que se pasaron por primates o gatos (Gibbs 1979); y una cepa bovina de BSE no se transmitió a hámsteres hasta que se pasó por ratones (Foster 1994). Alternativamente, si BSE se originó a partir de una mutación espontánea en ganado, los estudios experimentales de susceptibilidad de especies a esta nueva cepa de encefalopatía espongiforme transmisible (TSE) no han avanzado suficientemente para predecir que los seres humanos no deberían ser susceptibles.

Además de la infectividad de CJD en sangre anteriormente descrita, se ha demostrado también otra infectividad de TSE en sangre en diversos animales experimentales. La mayoría de la sangre para estudios de infectividad se obtuvo a partir de roedores adaptados a TSE tales como ratones y hámsteres. La única excepción fue un estudio llevado a cabo en el modelo de oveja. En este experimento, una oveja sometida a transfusión con sangre completa, tomada de otra oveja inoculada con lisado cerebral de BSE, desarrolló síntomas de BSE (Houston 2000, Hunter 2002). Sin embargo, estos resultados experimentales necesitan aún evaluarse plenamente. La infectividad en sangre se ha establecido en animales roedores a través de transmisión intracerebral e intravenosa con BSE adaptada a ratones, vCJD adaptada a ratones y cepas de TSE adaptadas a otros animales roedor. Aunque la infectividad en linfa cuajada rica en linfocitos es mayor que en plasma, ello sólo da cuenta de una parte relativamente pequeña cuando se compara con inóculos de sangre completa. La definición molecular de este agente infeccioso presente en sangre está aún bajo investigación. Se anticipa que el hallazgo de tal agente infeccioso en sangre debería ayudar a los autores de la presente invención a entender mejor la relación entre PrP^{Sc} y la enfermedad TSE.

El estudio de enfermedad CJD y vCJD humana indicó que la susceptibilidad genómica puede ser también otro factor que puede influenciar la dispersión de la TSE en seres humanos. Se encontró que la mayoría de pacientes de CDJ esporádica son homocigotos para Met/Met o para Val/Val en el codón 129 (Belay, 1999). No obstante, todos los casos de vCJD comunicados se ha encontrado que son homocigotos para Met/Met.

El tamaño y duración de la epidemia de vCDJ permanece aún incierto. Dependiendo de las suposiciones hechas y de los cálculos de modelización empleados, se propusieron diferentes predicciones. Una estimación de vCJD total predijo tan pocos como 205 casos (Valleron 2001). Por otro lado, otra predicción de mortalidad de vCJD para los próximos 80 años varía de 50 a 50.000 si la infección viene sólo de BSE. Podría alcanzar hasta 150.000 si se prueba que BSE infecta ovejas y si subsiguientemente le está permitido entrar en la cadena alimentaria humana (Ferguson 2002). Aunque es imposible hacer predicciones seguras si los parámetros necesarios bien están equivocados o bien no están disponibles, una cosa es cierta, que si la infectividad de vCJD está presente en sangre, cualquier predicción será una subestimación. Además, vCJD ha demostrado ser una entidad de enfermedad nueva y no simplemente el resultado de vigilancia incrementada de CJD en seres humanos (Hillier 2002).

Se han tomado contramedidas por el gobierno para eliminar la dispersión de la incidencia de BSE. La comida de proteínas de rumiantes se ha prohibido en Estados Unidos y en Reino Unido (1988). Se han tomado también una serie de medidas para evitar que la carne potencialmente infectada entre en la cadena alimentaria humana. Para reducir adicionalmente el riesgo para humanos, la FDA y el CBER han expedido un nuevo reglamento en agosto de 2001, que retrasa indefinidamente a cualquier donante de sangre humana que haya permanecido de forma acumulativa \geq 6 meses durante 1980-1986 en el Reino Unido (FDA 2001).

Ensayo Diagnóstico para Enfermedad Priónica

Los síntomas clínicos de enfermedad priónica a menudo se solapan con aquellos de otras enfermedades degenerativas neuronales lo que hace difícil el diagnóstico. Hasta el momento, PrP 27-30 resistente a PK es el único marcador proteico ligado a enfermedad de TSE. Por lo tanto, la detección de este agente ha llegado a ser el centro del desarrollo de ensayos. Sin embargo el desarrollo de anticuerpo monoclonal específico para PrP^{Sc} es extremadamente difícil, no sólo debido a que la isoforma patógena de PrP^{Sc} y la PrP^{C} celular normal son dos conformadores de la misma proteína con una secuencia primaria idéntica, sino también debido a que el prion parece ser un inmunógeno débil. El único anticuerpo comunicado para ser capaz de reconocer PrP^{Sc} específicamente no es útil prácticamente (Korth 1997). Otros anticuerpos monoclonales y policlonales específicos de secuencia priónica son incapaces de distinguir PrP^{Sc} de PrP^{C}. No obstante, estos anticuerpos (tales como 3F4, 6H4 descritos en los documentos US4806627 y EP0861900) están aún comúnmente en uso para captura o para detección de proteína priónica en combinación con tratamiento de muestras y técnicas de separación en aislar PrP^{Sc} a partir de PrP^{C} (Korth 1997, Kaccsak 1987).

Dado el brote de BSE en 1986, todas las pruebas comercialmente disponibles para enfermedades priónicas usan, como su fuente de muestras, tejidos tomados de animales y seres humanos postmortem. Entre aquellos, un ensayo de PrP^{Sc} basado en homogenados, referido como DELFIA (fluoroinmunoensayo de lantánidos potenciado por disociación), se desarrolló para la detección de prion de tembladera (Barnard 2000 y un procedimiento descrito en el documento US20002013711A1). Ello requiere una etapa de desnaturalización de proteínas usando GdnHCl, en combinación con tratamiento con PK de muestras opcional y enriquecimiento en PrP^{Sc} por precipitación de sodio ácido fosfotúngstico (NaPTA). Dado que la transformación de PrP^{C} a PrP^{Sc} está acompañada por el entierro de epítopes cerca del extremo N terminal de PrP, en DELFIA, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el extremo N terminal de PrP se usan para medir la diferencia de afinidad de unión de mAb a las conformaciones \alpha-helicoidal y lámina \beta antes y después de desnaturalización de PrP (Peretz 1997). Se describió otro inmunoensayo dependiente de conformación (CDI) combinado con ELISA y detección de fluorescencia (Safar 1998, documentos US 20010001061A1, US20020001817A1) en estudios de conformación en cepas de PrP^{Sc}.

En un estudio de distribución tisular de PrP^{Sc} en pacientes de vCJD, se describió una precipitación de NaPTA incrementada para enriquecer PrP^{Sc} de homogenados de cerebro y de homogenados de otros tejidos periféricos (Wadsworth 2001). La modificación empleó tratamiento de endonucleasas para reducir la viscosidad de las muestras antes de precipitación de NaPTA. Se comunicó que la recuperación de PrP^{Sc} en la pella precipitada era consistentemente mayor del 90% mientras que la recuperación de PrP^{C} fue aproximadamente el 5%. Después de la digestión con PK, se verificó la presencia de prion resistente a PK en prueba de bandas de Western usando anticuerpo monoclonal 3F4.

En otro ensayo de inmunotransferencia similar, la digestión con PK se usó también para eliminar PrP^{C}. Se usó después 6H4 para determinar la presencia de PrP^{C} (Schaller 1999). En base a este ensayo de primera generación, se desarrolló un inmunoensayo de luminiscencia de segunda generación en el que 6H4 se recubrió en placas como un anticuerpo de captura. El anticuerpo de detección conjugado con peroxidasa de rábano picante (POD) usado fue un anticuerpo anti-PrP monoclonal de ratón, capaz de formar un complejo con PrP27-30 unido a 6H4 (Biffiger 2002).

La Comisión Europea en 1999 evaluó 4 kits de prueba de BSE de diferentes fabricantes (Moynagh 1999). Todos ellos usaron tejido cerebral bovino como una fuente de muestras y todos requirieron un procedimiento de preparación de muestras separado. Dependiendo de las instrucciones del kit, el homogenado de tejido cerebral necesitó ser procesado, incluyendo desnaturalización, digestión con PK o enriquecimiento con PrP^{Sc}. Los sistemas de detección de ensayo empleados en DELFA, inmunotransferencia, o en formatos de ELISA en placas usaron bien sustrato quimioluminiscente o bien sustrato colorimétrico.

Con el fin de controlar la dispersión de la enfermedad en ausencia de una prueba de rastreo para animales vivos, se llevó a cabo una matanza extensiva de ganado vacuno una vez se identificó un animal afectado dentro de un rebaño. La urgencia para un ensayo de diagnosis de animal vivo se reforzó cuando los primeros casos de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob variante se comunicaron en 1996.

El desarrollo de diagnosis de TSE antemortem presenta tres dificultades principales: (1) sensibilidad insuficiente -excepto en tejido cerebral, las concentraciones de PrP^{Sc} en otros tejidos y fluidos se considera que son muy bajas. Por lo tanto, se requiere para la detección una técnica altamente sensible. (2) Tratamiento de muestras apropiado -cualquier desnaturalización de proteínas o proceso de digestión con PK puede tener un impacto potencial en estructura PrP^{Sc} patógena, con la posibilidad de causar un resultado falso negativo. Por ejemplo, se ha sugerido que una forma intermedia de PrP^{Sc} puede no ser resistente a PK (Horiuchi 1999, Jackson 1999, Swietnicki 2000). Y (3), la carencia de anticuerpos específicos de PrP^{Sc} y la relación molecular no completamente caracterizada entre el agente patógeno y PrP^{Sc} en sangre hace difícil diseñar un formato de ensayo para diagnosis antemortem.

Una posible aproximación a dar empuje a la sensibilidad es la amplificación in vitro de PrP^{Sc}. Se ha comunicado que cuando PrP^{Sc} estuvo presente, los ciclos repetitivos de sonicación pudieron inducir PrP celular sensible a proteasas para formar agregados resistentes a proteasas. Los autores explicaron que en este proceso de "amplificación cíclica de plegamiento erróneo de proteínas" (PPMCA), la sonicación pudo desbaratar agregados recién formados y generar múltiples unidades más pequeñas para la formación continua de PrP^{Sc} nuevas (Saborio 2001, documento WO0204954). Al final de los 40 ciclos de PMCA, la mezcla se sometió a digestión con PK y se detectó mediante inmunotransferencia. Ello reivindicó que la amplificación generó más de 30 veces PrP resistente a proteasa. Dado que la PrP resistente a proteasa se generó a expensas de la proteína priónica normal como sustrato por ciclos de amplificación, se requirió una gran cantidad de priones normales de la misma especie. No se ha demostrado si el prion normal de otras especies podría trabajar también como sustrato, o si se podría usar la proteína priónica a partir de una fuente recombinante o de fuentes distintas del tejido cerebral. Tal evidencia sería útil cuando se desea la detección de vCJD.

Se ha descrito la inmunoquímica del tejido linfoide de tercer párpado para diagnóstico preclínico de tembladera ovino (O'Rourke 2000, documentos US6165784, US6261790). Contando con un procedimiento quirúrgico pequeño, el ensayo hace uso de tejido periférico de ovejas, el linfoide de tercer párpado para la detección de tembladera. La inmunohistoquímica usó un cóctel de anticuerpos monoclonales panespecíficos para diferenciar una isoforma de la otra. Tras la fijación de formalina para reducir la reactividad de PrP^{C}, la muestra se sometió a pretratamientos de ácido fórmico y de calor que potenciaron la reactividad de PrP^{Sc}. A pesar del hecho de que el ensayo está aún basado en tejido y de la observación de que PrP^{Sc} presentó inmunorreactividad pobre en tinción de inmunohistoquímica a menos que estuviera tratada con agentes desnaturalizantes, esta diagnosis preclínica antemortem ha creado una etapa hacia pruebas en animales vivos así como ha proporcionado una manera de identificación de ovejas afectadas por tembladera durante la fase temprana, preclínica de tembladera.

Además de la identificación tradicional de prion patógeno eliminando prion celular seguido por reconocimiento por anticuerpos antipriones no discriminatorio, se encontraron otros agentes que son capaces de diferenciar PrP^{Sc} de PrP^{C}, tales como plasminógeno y fibrinógeno. No está claro el mecanismo de interacción entre estas proteínas de componentes sanguíneos del ser humano y PrP^{Sc}. Sin embargo, cuando se inmobilizó en perlas magnéticas, el plasminógeno precipitó selectivamente PrP^{Sc} a partir de homogenados cerebrales de ratón, ser humano, ganado vacuno y ovejas. La evidencia proporcionada sugiere que una propiedad común a PrP^{Sc} de diversas especies, más que la secuencia primaria priónica o la estructura terciaria específica de las moléculas de PrP^{Sc} del individuo, podría ser responsable de unión a plasminógeno (Fischer 2000, Maissen 2001). Se ha descrito la aplicación para el uso de plasminógeno y otras proteínas de suero/plasma para la captura y detección de proteína priónica patógena en el documento WO0200713 y en el documento US20010053533A1 (Aguzzi 2001).

Las investigaciones recientes han identificado una nueva isoforma de la proteína priónica en la orina de animales y seres humanos con enfermedad priónica (Shaked 2001b, documento WO0233420A2). Esta isoforma, referida como UPrP^{Sc} por los investigadores, era precipitable, resistente a PK y detectable sólo en individuos infectados pero no en controles normales. Lo más importantemente, como indicaron en su publicación, UPrP^{Sc} apareció mucho tiempo antes de que se desarrollaran los signos clínicos en hámsteres inoculados. Sin embargo, cuando se volvió a inocular UPrP^{Sc} aislada de orina de hámsteres con tembladera en hámsteres normales intracerebralmente, ello no causó enfermedad incluso después de 270 días, bastante más allá del periodo de incubación en el que el animal desarrollaría signos clínicos si se le hubiera inoculado cantidad comparable de PrP^{Sc} derivada de cerebro. No es imposible que aquellos hámsteres, inoculados intracerebralmente con UPrP^{Sc}, estuvieran aún en un estado subclínico o de portador. Además, no se encontró PrP resistente a PK en los riñones, lo que implica que este UPrP^{Sc} podría haberse originado a partir de otros órganos y haber sido transportado a la orina por medio de la sangre. Esta observación importante conducirá indudablemente a una mejor comprensión del metabolismo de PrP.

Por lo tanto queda una necesidad insatisfecha de una manera mejor para detectar PrP^{Sc} y diagnosticar TSE en seres humanos y animales. El objetivo de la presente invención es proporcionar una manera no intrusiva para aislar, concentrar y hacer seguimiento de la proteína priónica patógena relacionada con la enfermedad de TSE. La invención, que incluye el uso de anticuerpo anti-DNA selectivo para unir la PrP^{Sc} por reconocimiento de un compañero de unión asociado, implica la captura discriminatoria de PrP^{Sc} pero no proteína priónica celular. Los autores de la presente invención proporcionan evidencia de una asociación de alta afinidad de ácido nucleico a PrP^{Sc} y demuestran que tal complejo ácido nucleico-PrP^{Sc} sobrevivió incluso después de digestión con PK y tratamiento con nucleasas.

Sumario de la invención

La evidencia proporcionada en apoyo de esta invención demostró que PrP^{Sc} está asociado con afinidad alta a DNA según se investiga. No se observó una asociación similar con DNA con PrP^{C} celular normal. La evidencia demostró también que la asociación era fuerte, resistente a digestión con PK y al tratamiento con nucleasas y que PrP^{Sc} podría aislarse fácilmente por anticuerpos anti-DNA selectivos.

Esta invención se refiere al uso de anticuerpos anti-DNA, para capturar PrP^{Sc} a través de ácidos nucleicos asociados con alta afinidad a PrP^{Sc}, en combinación con cualquier anticuerpo específico de secuencia de priones para la detección de PrP^{Sc}.

En otro aspecto, esta invención se refiere al anticuerpo de DNA selectivo, como se describe anteriormente, que se une preferiblemente a proteína priónica patógena, pero no a la forma celular normal de proteína priónica.

En otro aspecto, esta invención se refiere al anticuerpo selectivo de DNA, como se describe anteriormente, para la detección de PrP^{Sc} por reconocimiento de alta afinidad de ácidos nucleicos asociados en combinación de anticuerpos específicos de secuencia priónica.

En otro aspecto, esta invención se refiere al anticuerpo selectivo de DNA, como se describe anteriormente, para el aislamiento, purificación, captura, eliminación y realización de seguimiento de PrP^{Sc} en producción de reaccionantes biológicos.

En otro aspecto, esta invención se refiere a las composiciones y los kits para determinar la presencia de PrP^{Sc}, que comprenden el anticuerpo anti-DNA, como se describe anteriormente, bien para etapa de captura o bien para etapa de detección en el procedimiento del ensayo.

En otro aspecto, esta invención se refiere a las composiciones y los kits para determinar la presencia de anticuerpo de PrP^{Sc} producido en respuesta a DNA asociado con alta afinidad como un compañero de unión a proteína priónica patógena.

En aún otro aspecto, esta aplicación se refiere a anticuerpos anti-PrP^{Sc} y a su producción usando los ácidos nucleicos citados que pueden interaccionar con y/o asociarse a PrP^{Sc}, y a su uso en detectar complejo ácido nucleico- PrP^{Sc} e infección de enfermedad priónica (no reivindicado).

En otro aspecto, esta invención se refiere a un procedimiento de tratamiento de muestras no severo que implica digestión con nucleasas para el beneficio del uso de anticuerpo selectivo de DNA como se describe anteriormente.

Algunos ejemplos de realizaciones específicas de la invención son como sigue:

Un procedimiento para discriminar entre priones infecciosos y no infecciosos que comprende:

poner en contacto primero una muestra con un anticuerpo anti-DNA, añadir después un anticuerpo específico de priones para formar un complejo entre el anticuerpo anti-ácido nucleico, el prion y el anticuerpo específico de prion y

detectar los complejos.

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Un procedimiento para diagnosticar las encefalopatías espongiformes transmisibles en paciente que comprende:

poner en contacto una muestra con un anticuerpo anti-DNA, capaz de unir PrPSc,

después añadir un anticuerpo específico de prion para formar un complejo entre el anticuerpo anti-DNA, el prion y el anticuerpo específico de prion y

detectar los complejos, por lo que la detección de los complejos proporciona una indicación de encefalopatías espongiformes transmisibles en un paciente.

Un inmunoensayo para detectar priones infecciosos que comprende:

proporcionar un soporte sólido habiendo unido a el un anticuerpo anti-DNA,

poner en contacto el soporte sólido con una muestra,

lavar el soporte sólido con una muestra no unida,

poner en contacto el soporte sólido con un anticuerpo específico de priones y

llevar a cabo una etapa de detección para determinar si los priones están unidos al soporte sólido.

Un kit para la detección de priones infecciosos que comprende

un soporte sólido que tiene unido a él un anticuerpo anti-DNA y

un anticuerpo específico de prion marcado.

Un inmunoensayo para detectar priones infecciosos que comprende:

proporcionar un soporte sólido recubierto con un agente para unir un anticuerpo anti-ácido nucleico

poner en contacto el soporte sólido con una muestra,

lavar el soporte para eliminar cualquier muestra no unida,

poner en contacto el soporte sólido con un anticuerpo específico de priones y

llevar a cabo una etapa de detección para determinar si los priones están unidos al soporte sólido.

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Otra realización del inmunoensayo descrito anteriormente proporciona un soporte sólido recubierto por o que lleva un agente que es capaz de unir el anticuerpo anti-DNA. Por ejemplo, usar avidina o estreptavidina en el soporte sólido y biotinilar el anticuerpo anti-ácido nucleico de tal forma que ello una al soporte sólido por medio de la avidina o la estreptavidina.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Captura de IP anti-DNA e inmunotransferencia de PrP^{Sc} de hámster con tembladera. Se inmunocapturó PrP^{Sc} de hámster con tembladera por anticuerpos anti-DNA seguido por SDS-PAGE e inmunotransferencia de 3F4. Los resultados se obtuvieron a partir de tres experimentos separados (número de carril 1-4, 5-8 y 9-10).

Figura 2: captura de IP e inmunotransferencia de PrP^{Sc} de BSE. Se detectó PrP^{Sc} de BSE por anticuerpos anti-DNA y por proteína de unión a DNA por inmunoprecipitación (IP) seguido por inmunotransferencia de 6H4. Los resultados se obtuvieron a partir de dos experimentos separados (número de carril 1-1 y 12-14).

Figura 3: IP e inmunotransferencia de prion de hámster con diversos tratamientos. Se llevaron a cabo IP e inmunotransferencia según diversas condiciones para cada anticuerpo de DNA. (1) Estándar: se llevó a cabo IP en tampón de IP con homogenado cerebral de hámster con tembladera o con homogenado cerebral de hámster normal (carril 1, 5, 9, 13, 17-20). (2) Inhibición de DNA: se añadieron 5 \mug/ml de DNA de salmón extraído con fenol-cloroformo, precipitado con etanol y sonicado (Sigma, MO, EE.UU., número de catálogo D7656) en el tampón de IP como inhibidor (carril 2, 6, 10, 14). (3) Digestión con Proteasa K: se trató homogenado cerebral de hámster con tembladera con Proteasa K a 50 \mug/ml a 37ºC durante 1 hora. La digestión se detuvo añadiendo Pefabloc a una concentración final de 4 mM. El homogenado digerido se fortaleció en tampón de IP seguido por IP estándar (carril 3, 7, 11, 15). (4) Digestión por nucleasas: se trató homogenado cerebral de hámster con tembladera con nucleasa Benzonasa® a 100 U/ml a 37ºC durante 1 hora. La digestión se detuvo añadiendo EDTA a una concentración final de 10 mM. El homogenado digerido se fortaleció en tampón de IP seguido por IP estándar (carril 4, 8, 12, 16).

Figura 4: Inmunocaptura de PrP^{Sc} de cerebros de sCJD y vCJD por OCD_{4}. Se usaron las perlas conjugadas de OCD4 para inmunoprecipitar PrP en homogenados cerebrales aclarados de pacientes afectados bien por sCJD o bien por vCJD y dos sujetos no afectados (controles normales). Los inmunoprecipitados se analizaron después por SDS-PAGE (gel al 12%) y realización de prueba de bandas de Western usando el anticuerpo anti-PrP 3F4. OCD4 captura específicamente PrP^{Sc} en cerebros de sCJD (carril 1) y de cerebros de CJD (carril 3) pero no PrP^{C} en cerebros normales (carriles 5 y 7). PrP capturadas por OCD4 de cerebros de sCJD y de cerebros de CJD son PrP^{Sc} auténticas dado que el tratamiento con PK (50 \mug/ml durante 1 hora a 37ºC) genera los fragmentos de PrP^{res} de núcleo resistente a PK (carriles 2 y 4).

Panel derecho. Los homogenados de cerebro aclarado de sCJD, vCJD y controles normales se incubaron en la ausencia (-) o presencia (+) de PK (50 \mug/ml durante 1 hora a 37ºC). Después de que se terminó la digestión con PK, las muestras se cargaron directamente en geles de SDS-PAGE (12%) y se analizaron en pruebas de bandas de Western usando el anticuerpo 3F4. Los tejidos cerebrales de sCJD de tipo 2 y de vCJD son materiales de referencia de TSE bien caracterizados a partir de WHO.

Figura 5. El inmunoensayo de captura basado en OCD4 para PrP^{Sc} en cerebros de pacientes de vCJD. Se usaron los homogenados cerebrales (10 \mul) de 10 casos de vCJD (v1-v10) en el ensayo de inmunoprecipitación de captura de OCD4/3F4. El experimento se llevó a cabo en el NCJDSU, Reino Unido, usando casos de vCJD proporcionados amablemente (números de caso: 95/052(1), 96/045(2), 97/049(3), 98/063(4), 98/148(5), 98/154(6), 99/082(7), 99/090(8), 00/066(9), 00/101(10)).

Figura 6. Inmunocaptura tanto de la PrP^{Sc} de longitud total como de los fragmentos nucleares resistentes a PK por OCD4. Se usaron alícuotas de homogenados cerebrales de tres casos de vCJD en este experimento y se llevaron a cabo en la NCJDSU, Reino Unido. La primera alícuota se digirió con PK (+PK). La segunda alícuota se digirió con PK y después se sometió a inmunoprecipitación por OCD4 (+PK +OCD4). La tercera alícuota sufrió inmunoprecipitación directa por OCD4 sin el tratamiento con PK (-PK +OCD4). Se analizaron todas las muestras anteriores en pruebas de bandas de Western usando el anticuerpo 3F4. Se recuperaron los fragmentos de PrP de PK-res (carriles 1-5) en los inmunoprecipitados de OCD4 (carriles 6-10). La PrP^{Sc} de longitud total en muestras no tratadas pudo capturarse eficientemente por OCD4 también (carriles 11-15). Nótese que el volumen de entrada de los homogenados cerebrales al 10% se varió en algunos casos para mejor resolución de las bandas de PrP.

Figura 7. Inmunocaptura de OCD4 de PrP resistente a PK en bazo de vCJD. Se preparó lisado de bazo a partir de un caso de vCJD (número de caso 96/045 y 96/048, proporcionado por la NCJDSU en Edimburgo) usando homogenado al 10% seguido por centrifugación breve para eliminar desechos. El tratamiento de PK se llevó a cabo a 50 \mug/ml durante 1 hora a 37ºC antes de que la reacción se terminara por Pefabloc 10 mM. Las alícuotas de cada 100 \mul de lisado de bazo digerido bien se centrifugaron por centrifugación a 14.000 x g durante 1 hora a 4ºC (carril 1), o bien se sometieron a inmunoprecipitación con OCD4 (carril 2 y 4) y con un mAb no relacionado (carril 3 y 5, como control para unión no específica). La detección de PrP resistente a PK en bazo se hizo en pruebas de bandas de Western usando el anticuerpo 3F4.

Figura 8. Inmunocaptura de OCD4 de PrP^{Sc} de BSE. Se prepararon lisados cerebrales (10%, p/v) a partir de cada BSE o a partir de cada control bovino (CON) mediante homogeneización en tampón de lisis seguida por centrifugación breve. Se usaron las alícuotas de lisados de cerebro aclarados (1 \mul cada una) en inmunoprecipitación (IP) antes de (carriles 1 y 2) o después de (carriles 3 y 4) digestión de PK (50 \mug/ml durante 1 hora a 37ºC). Las alícuotas adicionales (1 \mul) sin IP y sin digestión por PK (carriles 5 y 6) sirvieron como referencia para entrada total. Todas las muestras se depararon después por SDS-PAGE y se detectaron en prueba de bandas de Western usando el anticuerpo 6H4 capaz de reconocer PrP bovina. OCD4 inmunoprecipitaron PrP sólo a partir de cerebro de BSE en la ausencia o en la presencia de PK. Este experimento se llevó a cabo en la instalación P3 de la Veterinary Laboratories Agency en Wayubridge, Londres donde se proporcionaron amablemente los tejidos cerebrales de ganado afectado por BSE y de ganado normal.

Figura 9. Inmunocaptura con OCD4 de PrP^{Sc} en ovejas con tembladera. Inmunoprecipitación por OCD4 de PrP de cerebros de tembladera natural (Sc) y de control de ovejas normales (N) antes y después de tratamiento con PK (50 \mug/ml durante 1 hora a 37ºC). Se llevaron a cabo experimentos como se describe en el texto principal. Se probaron inmunoprecipitados en las perlas conjugadas con OCD4 en pruebas de bandas de Western con el anticuerpo 6H4 en pruebas de bandas de Western. Cada ensayo usó 1 \mul de homogenados cerebrales al 10%.

Figura 10. Inmunocaptura efectiva de PrP^{Sc} fortalecido en plasma humano por OCD4. El material fortalecido (S) usado fue 1 \mul de homogenado al 5% de cerebro de hámster de tembladera. Se mostró inmunocaptura de PrP^{Sc} estándar en tampón de IP (1 ml) en carriles 1 y 8. Para carriles 2-4, el material fortalecido (1 \mul) se añadió a 0,6 ml de tres preparaciones de plasma humano normal A, B y C (0,6 ml de plasma/S) con la adición de 400 \mul de tampón de IP. Los carriles 5-7 representan las alícuotas de plasma no fortalecido (0,6 ml de plasma) con 0,4 ml de tampón de IP. Para carriles 9-11, se preincubaron 5 ml de cada uno de plasma A, B y C con las perlas OCD4 seguido por breves lavados de las perlas en PBS. Las perlas tratadas con plasma se incubaron después con el material fortalecido (1 \mul) en 1 ml de tampón de IP (5 ml de plasma \rightarrow S). La inmunoprecipitación estándar por las perlas conjugadas OCD se hizo en un volumen total de 1 ml seguido por realización de prueba de bandas de Western usando el anticuerpo 3F4 como se describe en el texto principal. Según se compara con el control de entrada (carriles 1 y 8), se logró la recaptura significativa de PrP^{Sc} por OCD4 en plasma presente en gran exceso (600 \mul de plasma frente a 1 \mul de material reforzado) (carriles 2-4). Además, el hecho de la preincubación de perlas conjugadas OCD4 con gran volumen de plasma normal no compromete ni bloquea su capacidad de unión para capturar PrP^{Sc} como se indica en carriles 9-11, excluye la posibilidad de inhibidores de OCD4 potenciales presentes en plasma humano. OCD4 no captura PrP^{C} de plasma humano (carriles 5-7).

Descripción detallada de la invención

El término "muestra" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier sustancia, que puede contener el analito de interés. Una muestra puede ser fluido biológico, tal como sangre completa o componentes de sangre completa que incluyen células rojas de la sangre, células blancas de la sangre, plaquetas, suero y plasma, ascitis, orina, fluido cerebroespinal y otros constituyentes del cuerpo que pueden contener el analito de interés, tales como homogenado cerebral. Opcionalmente, las muestras se pueden obtener a partir de agua, suelo y vegetación. El término "paciente" como se usa en el presente documento, se refiere a seres humanos y/o a animales.

Se conocen y se podrían aplicar a la presente invención diversos protocolos de inmunoensayo. El ensayo se puede llevar a cabo usando cualquier marca enzimática que puede unirse al anticuerpo antipriónico para formar un ligando unido. Son marcas preferidas enzimas tales como oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, peroxidasas, por ejemplo peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina y galactosidasas. Esta dentro de la habilidad de alguien de habilidad ordinaria en la técnica determinar un sustrato adecuado para una marca dada. El sustrato puede ser un material que está actuando directamente basado en la marca enzimática o un material que está implicado en una serie de reacciones que implican reacción enzimática de la etiqueta. Otras marcas y medios para detección podrían ser por ejemplo, un ligando, un nucleótido, o biotina. La detección del anticuerpo marcado podría estar incluyendo por diversos procedimientos amplificación enzimática con conjugados poliméricos e inmuno PCR.

Los siguientes ejemplos se dan para ilustrar pero no para limitar el alcance de la invención.

Preparación de homogenado cerebral

Se obtuvieron lisado cerebral de hámster normal y lisado cerebral de hámster con tembladera de Baltimore Research and Education Foundation en forma de homogenado de tejido cerebral completo al 10% en PBS (p/v). El lisado se trató adicionalmente añadiendo 1/10 de volumen de tampón homogenado de detergente 10X, compuesto de deoxicolato de sodio al 5% y de Igpal CA-630 al 5% (equivalente a NP-40) en PBS, incubando a 4ºC durante 1 hora, seguido por centrifugación a 1000 g durante 10 minutos. El sobrenadante resultante se recogió y usó en el ensayo.

Se proporcionaron tejido cerebral bovino normal y tejido cerebral bovino con BSE por Veterinary Laboratories Agency (VLA), Reino Unido. Se proporcionaron tejido cerebral de oveja normal y tejido cerebral de oveja con tembladera por Animal Disease Research Unit of USDA, Estados Unidos. Se proporcionó tejido cerebral humano normal por Nacional Prion Disease Pathology Surveillance Center (NPDPSC) y por Nacional CJD Surveillance Unit (NCJD-SU), Reino Unido. El tejido cerebral se procesó por la misma manera (o similar) que la preparación de homogenado cerebral de hámster.

Anticuerpos anti-DNA y proteína de unión a DNA

Los anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de fuentes comerciales fueron (1) anticuerpo monoclonal murino que reconoce DNA de cadena simple, DNA de cadena doble, subclase IgM, número de catálogo 12403 y subclase IgG2b, número de catálogo 12404 de QED Bioscience, (2) anticuerpo monoclonal murino que reconoce DNA de cadena doble, clon AE-2, subclase IgG3, números de catálogo 2660-2308 y anticuerpo monoclonal murino que reconoce DNA de cadena simple, DNA de cadena doble, clon 49/4A1, subclase Ig2b, números de catálogo 2660-2308 de Biogenesis. Los inmunógenos usados para elevar estos anticuerpos fueron DNA de timo de ternera y núcleos de células de linfoma de Raji Burkitts como se indica por los fabricantes. Se evaluaron también los anticuerpos monoclonales adicionales de fuente distinta a la comercial. La Proteína de Unión a Cadena Simple (SSB) de E. coli se compró de Sigma (Sigma, MO, Estados Unidos, número de catálogo S3917).

Conjugación de anticuerpo y proteína a perlas magnéticas

Se lavaron dos veces 0,35 ml de Dynabeads® M-280 activada por tosilo (Dynal Biotech, NY, Estados Unidos, número de catálogo 142.03/04) con PBS y las perlas aisladas a partir de tampón con imán (Dynal Magnetic Particle Concentrador, MPC). Se añadieron 100 \mug de anticuerpo purificado o de proteína en 1 ml de PBS a las perlas lavadas. Se llevó a cabo la incubación con rotación a 37ºC durante 18-20 horas. Las perlas se aislaron a partir del tampón con el MPC, se lavaron dos veces con 1 ml de PBS (BSA al 0,1%) y se rotaron durante 5 minutos a temperatura ambiente mientras se lavaron. Las perlas conjugadas a anticuerpo se bloquearon después durante 3-4 horas, a 37ºC con Tris-HCl 0,2 M, pH 8,0, conteniendo BSA al 0,1%. Las perlas se lavaron subsiguientemente dos veces con 1 ml de PBS (BSA al 0,1%) y una vez con 1 ml de PBS (BSA al 0,1%, Tween 20 al 1%) y una vez con 1 ml de PBS (BSA al 0,1%, Tween 20 al 1%) incubando cada vez durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron después una vez con 1 ml de PBS (BSA al 0,1%) y después se almacenaron en 1 ml de PBS (azida de sodio al 0,05%) a 4ºC.

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Digestión con Proteasa K y con Nucleasa Benzonasa®

Condiciones para la digestión con PK de lisado cerebral: se suspendió el homogenado cerebral en tampón de PBS con o sin detergente no iónico. La concentración de proteínas del homogenado total no fue más de 2,5 mg/ml. Se añadió PK (Roche Diagnostics, IN, EE.UU., número de catálogo 1373196) a una concentración final de 50 \mug/ml. La incubación fue a 37ºC durante 0,5 a 1 hora. La digestión se detuvo añadiendo Pefabloc SC (Roche Diagnostics, IN, EE.UU., catálogo 1585916) a una concentración final de 4 mM.

Condiciones para la digestión con Nucleasa Benzonasa® de lisado cerebral: se suspendió el homogenado cerebral en tampón de Tris-HCl, con o sin detergente no iónico, conteniendo Mg^{++} 2 mM. La concentración de proteínas del homogenado total no fue más de 2,5 mg/ml. Se añadió Nucleasa (CN Biosciences CA, EE.UU., número de catálogo 70664) a una concentración final de 100 U/ml. La incubación fue a 37ºC durante 0,5 a 1 hora. La digestión se detuvo añadiendo EDTA a una concentración final de 10 mM.

Inmunoprecipitación (IP), electroforesis no reductora y detección por inmunotransferencia de PrP^{Sc}

Se usaron perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti-DNA capturando PrP^{Sc} a partir de homogenado cerebral por inmunoprecipitación. El procedimiento de IP consiste en el siguiente protocolo: mezclar 100 \mul de perlas conjugadas con anticuerpos con 1-5 \mul de homogenado cerebral en un total de 1 ml de tampón de IP (Tween 20 al 3% e Igpal CA-630 al 3% en PBS) e incubar a 25ºC durante 2,5 horas con rotación. \rightarrow Separar perlas usando dispositivo MPC y lavar perlas 3 veces de 30 segundos de agitación con tampón de lavado de IP (Tween 20 al 2% e Igpal CA-630 al 2% en PBS). \rightarrow Eluir PrP^{Sc} capturado calentando perlas con tampón de muestra NuPAGE durante 10-15 minutos. La muestra eluida de captura con IP se cargó sobre un Gel de NuPAGE® Bis-Tris al 4-12% (Invitrogen, CA, EE.UU., número de catálogo NP0302) y se sometió a electroforesis no reductora a 200 V durante 45 minutos. El procedimiento de inmunotransferencia se llevó a cabo como sigue: transferir proteínas separadas en el gel a una membrana de PVDF 0,2 \mum (Invitrogen, número de catálogo LC2002) a 30 V durante 60 minutos. \rightarrow Bloquear la membrana con Caseína Bloqueada^{TM} en TBS (Tween 20 al 0,05%) (Pierce Chemical Corp., IL, EE.UU., número de catálogo 37532) bien a 25ºC durante 1 hora con agitación o a 4ºC durante toda una noche. \rightarrow Como anticuerpo primario, usar 3F4 (Signet, MA, EE.UU., número de catálogo 9620-02) a dilución de 1:3000 detectando PrP^{Sc} de hámster y de ser humano o usando 6H4 (Prionics AG, Suiza, número de catálogo 01-011) a dilución 1:5000 o detectando respectivamente PrP^{Sc} bovina u ovina. Incubar la membrana con anticuerpo primario diluido en Caseína Bloqueada^{TM} al 10% en tampón de TBST (Tri-Cl 25 mM, NaCl 0,2 M, Tween 20 al 0,2%, pH 8,0) a 25ºC durante 1 hora con agitación. \rightarrow Lavar 3X 5 minutos con tampón de TBST con agitación. \rightarrow Incubar membrana con IgG antirratón policlonal de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratorios, PA, EE.UU., número de catálogo 115-035-003) a dilución 1:10.000 hasta 1:30.000 en Caseína Bloqueada^{TM} al 50% en tampón TBST a 25ºC durante 1 hora con agitación. \rightarrow Lavar 6X 5 minutos con tampón TBST con agitación. \rightarrow Añadir sustrato de quimioluminiscencia ECL (Amersham Biosciences, NJ, EE.UU., número de catálogo RPN2109) o sustrato de quimioluminiscencia SuperSignal West Dura (Pierce) en membrana desarrollando durante 5 minutos. \rightarrow Tomar imagen mediante exposición bien a película Bio
Max MR-2 (Kodak, NY, EE.UU.) o bien al Sistema de Documentación de Geles Chemi-Doc (Bio-Rad, CA, EE.UU.).

Ventajas

La presente invención usa anti-DNA para capturar PrP^{Sc} por reconocimiento de ácido nucleico asociado con alta afinidad en el complejo ácido nucleico-PrP^{Sc}. Debido a la estrecha asociación de ácido nucleico sólo a PrP^{Sc} y no a PrP^{C}, la presente invención proporcionó un medio no intrusivo para la detección de PrP^{Sc} dado que no se requiere digestión con PK ni otro procedimiento de modificación de proteínas. Se anticipa que las condiciones suaves preservarán la estructura y la conformación originales de la proteína priónica patógena, ofreciendo de este modo oportunidad para determinar la presencia de PrP^{Sc} verdadera minimizando mientras la generación de PrP^{Sc} debido a tratamiento de muestras severo.

La evidencia proporcionada de que la digestión con nucleasa Benzonasa no compromete unión anti-DNA selectiva a ácido nucleico-PrP^{Sc}, incluyendo el tratamiento de endonucleasas limitado en preparación de muestras o comprendido en el tampón de muestras pudo eliminar la interferencia de ácido nucleico endógeno.

El uso de anticuerpos anti-DNA ofrece ventajas en que ellos presentan la especificidad de unión pero pueden también manejarse fácilmente en recubrimiento directo a una fase sólida así como conjugarse para unir a reactivos que dan señal tales como peroxidasa de rábano picante (HRP), o adoptarse en otro formato de ensayo de diagnosis deseado.

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Claims (10)

1. Un procedimiento para discriminar entre priones infecciosos y no infecciosos que comprende:

poner en contacto una muestra con un anticuerpo anti-DNA capaz de unir PrP^{Sc} y un anticuerpo específico de priones para formar un complejo entre el anticuerpo de ácido nucleico, el prion y el anticuerpo específico de prion y detectar los complejos.

2. Un procedimiento para diagnosticar encefalopatías espongiformes transmisibles en un paciente que comprende:

poner en contacto una muestra con un anticuerpo anti-DNA capaz de unir PrPSc y un anticuerpo especifico de prion para formar un complejo entre el anticuerpo anti-DNA, el prion y el anticuerpo específico de prion y

detectar el complejo, en el que detectar el complejo proporciona una indicación de encefalopatías espongiformes transmisibles en el paciente.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo anti-DNA o el anticuerpo específico de prion está unido a un soporte sólido, comprendiendo el procedimiento la etapa adicional de lavar el soporte para eliminar cualquier muestra no unida después de poner en contacto la muestra con el soporte.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el soporte sólido está recubierto con un agente para unir el anticuerpo anti-DNA o el anticuerpo específico de prion.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que el agente es avidina o estreptavidina y el anticuerpo anti-DNA o el anticuerpo especifico de prion se ha biotinilado.

6. Un kit para la detección de priones infecciosos que comprende un soporte sólido que tiene unido a él uno de un anticuerpo anti-DNA capaz de unir PrP^{Sc} y un anticuerpo específico de prion y

el otro del anticuerpo anti-DNA y el anticuerpo específico de prion, marcado para detección.

7. El kit de la reivindicación 6, en el que el soporté sólido tiene unido a él el anticuerpo anti-DNA y el anticuerpo específico anterior está marcado.

8. El kit de la reivindicación 6, en el que el soporté sólido tiene unido a él el anticuerpo específico de prion y el anticuerpo anti-DNA está marcado.

9. El kit de la reivindicación 6, en el que el soporté sólido está recubierto con un agente para unir uno del anticuerpo anti-DNA capaz de unir PrP^{Sc} o el anticuerpo específico anterior.

10. El kit de la reivindicación 9, en el que el agente es avidina o estreptavidina y uno del anticuerpo anti-DNA o del anticuerpo específico anterior está biotinilado.