ES2324919T3 - Peptidos para la discriminacion de priones. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la detección in vitro de PrP Sc que comprende: en primer término poner en contacto una muestra con un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de WQPPRARI, después detectar PrP Sc .
Description
Péptidos para la discriminación de priones.
Las enfermedades priónicas o encefalopatías
espongiformes transmisibles (TSE) han captado el interés de la
comunidad científica, no sólo porque desafiaron el pensamiento
convencional acerca de la naturaleza de los agentes infecciosos,
sino también debido a la amenaza potencialmente grave que
representan para la salud pública en la seguridad de alimentos y
sangre. Además, en los últimos años se ha puesto de relieve
dramáticamente la posibilidad de la transmisión de la enfermedad
entre animales y seres humanos por la aparición epidémica de una
nueva forma de variante de la enfermedad: vCJD. La presente
invención describió el uso de péptidos sintéticos para el
diagnóstico de enfermedades de tipo Encefalopatías Espongiformes
Transmisibles (TSE) en animales y seres humanos.
Las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles
(TSEs) comprenden un grupo de enfermedades neurodegenerativas
fatales de rápido avance que afectan tanto a seres humanos como a
animales. Las TSEs poseen características clínicas y
neuropatológicas que incluyen demencia devastadora, signos
piramidales y extrapiramidales con mioclono, cambios espongiformes
multifocales, astrogliosis, placas de amiloide, pérdida neuronal,
ausencia de reacción inflamatoria y usualmente se caracterizan por
un largo período de incubación.
Una vez se sugirió que las enfermedades de tipo
TSE podrían ser causadas por "virus lentos" o viroides
(Gajdusek 1977). Sin embargo, la extrema resistencia de la
infectividad del scrapie a la radiación, las nucleasas y otros
reactivos que dañan los materiales genéticos no es coherente con la
teoría del "virus". Todas estas características
"inusuales" del agente infeccioso de TSE llevaron a que el Dr.
Stanley Prusiner propusiera el concepto de "priones" en 1982
(Prusiner 1982). El prion (PrP), que significa partícula infecciosa
proteica libre de ácidos nucleicos, es una glicoproteína presente
en seres humanos y animales. La forma celular de esta proteína
(PrP^{C}) posee dos sitios de glicosilación con enlace a N y un
ancla GPI en el extremo C-terminal. Se ha
encontrado más comúnmente en neuronas y, en mucho menor medida,
también se ha encontrado en otras células tales como leucocitos,
monocitos y plaquetas (Holada 2000). La forma de enfermedad
transmisible scrapie de la proteína priónica (PrP^{Sc}) es una
isoforma resistente a las proteasas de su precursor celular y se
encuentra predominantemente en el cerebro. En un nivel mucho menor,
también se ha encontrado en amígdala, bazo y ganglios linfáticos en
pacientes con vCJD (Parizek 2001). Como resultado del concepto de
Prusiner del "prion" como agente infeccioso responsable de la
enfermedad scrapie y, por extensión, de todas las enfermedades de
tipo TSE, surgió la noción de lo que comúnmente se denomina
Enfermedades Priónicas para describir una clase de patologías que
se cree están ligadas a esta proteína.
La enfermedad priónica humana se conoce como
enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) y usualmente
afecta a personas de edad avanzada. Dependiendo del fenotipo de
enfermedad, (sCJD) esporádica se refiere a la mayoría de los casos
de CJD, mientras que aproximadamente el 10% son CJD familiares
(fCJD). Sólo recientemente, ha surgido una nueva variante de CJD
(vCJD) que aparece en adultos jóvenes. Desde 1995, se han informado
más de 100 casos. Las Enfermedades Priónicas afectan a muchas
especies de animales domésticos y salvajes, a cuyas manifestaciones
a menudo se les dan nombres únicos, por ejemplo scrapie en ovejas y
cabras (McGowan 1922), enfermedad por consunción crónica (CWD,
Williams 1980) en cérvidos y encefalopatía espongiforme bovina (BSE,
o enfermedad de la "vaca loca", Wells 1987) en vacunos.
Conforme a la hipótesis de "sólo proteína"
de Prusiner, el agente patógeno transmisible que causa enfermedades
priónicas es una proteína. El principal componente del prion parece
ser el PrP plegado anormalmente, designado PrP^{Sc} (isoforma
"scrapie", específica de la enfermedad). Se cree que PrP^{Sc}
se genera a partir de su contraparte normal, PrP^{C}, a través de
un cambio en la conformación (Cohen, 1998). Aunque aún existe
ambigüedad con respecto al mecanismo de la conversión, aún se acepta
ampliamente que en presencia de PrP^{Sc}, el PrP^{C} normal,
actuando como sustrato, sufre un cambio en la estructura
conformacional, y se convierte en PrP^{Sc} a través de un proceso
autocatalítico y da como resultado una agregación de PrP^{Sc} y
formación de bastones de amiloide, causando por lo tanto la muerte
celular (Hope 1986, Horwich 1997). El cambio estructural de
PrP^{C} a PrP^{Sc} está respaldado en su mayor parte por un
cambio conformacional crucial, que involucra un aumento sustancial
en la proporción de estructura de lámina Beta de la proteína,
posiblemente con una pequeña reducción en la proporción de hélice
alfa, indicada por el dicroísmo circular y la espectroscopía
infrarroja (Pan 1993, Caughey 1991). Parece que la eficiencia de la
conversión de PrP^{C} en PrP^{Sc} depende del grado de
homología de secuencia entre los dos confórmeros de PrP. Debido a
este mecanismo singular, las enfermedades priónicas pueden
transmitirse fácilmente dentro de la misma especie, y cuando la
homología de secuencia de PrP es suficiente, de especie a especie
(Raymond, 2000). Por ello, si es correcto, el mecanismo de
transmisión propuesto de las enfermedades priónicas proporciona el
potencial para desencadenar epidemias por transmisión de estos
trastornos cerebrales entre animales y seres humanos.
La resistencia a las proteasas es otra
característica que distingue a PrP^{Sc} de PrP^{C}. En las
células cultivadas y en cerebro o en muestras de muchos pacientes
con GSS, PrP^{Sc} es más pequeño que su precursor celular
PrP^{C}. Aunque el prion celular y el prion scrapie son dos
isoformas del mismo producto genómico de PRNP, PrP^{C} es
completamente degradado por tratamiento con la Proteinasa K mientras
que PrP^{Sc} sufre sólo una digestión limitada. La digestión
produce una forma de proteína denominada PrP 27-30,
en la que se ha eliminado el extremo N-terminal. Se
ha postulado que PrP 27-30 es el núcleo PrP^{Sc}
requerido para la replicación de PrP^{Sc} albergado por
PrP^{C}. La molécula priónica tratada con proteasa, PrP
27-30 o PrP^{res}, está estrechamente ligada a la
infectividad de scrapie (Gabizon 1988) y proporciona evidencia
adicional de que PrP^{Sc} es una proteína infecciosa.
Un atributo adicional, quizás asociado al
aumento considerable en la estructura de lámina Beta y la simultánea
resistencia a las proteasas, es la diferencia observada en la
solubilidad entre PrP^{Sc} y PrP^{C}. Mientras PrP^{C} es una
proteína soluble, la isoforma PrP^{Sc} es sumamente insoluble.
Además, PrP^{C} se encuentra unida a la superficie de las
neuronas a través de una cola GPI con ancla en la membrana (Shyng
1994) mientras que PrP^{res} se encuentra en el citoplasma de las
células afectadas (Taraboulos 1990), muy probablemente asociada a
los compartimentos endosómico tardío y lisosómico (Arnold 1995), y
PrP^{Sc} también se localiza en agregados amorfos en fracciones
enriquecidas de cerebro infectado (Meyer 1986).
Existe evidencia cada vez mayor que indica una
conexión estrecha entre la infectividad de scrapie y PrP
27-30. Aún en las muestras más puras, la relación
estimada de moléculas de PrP a unidades infecciosas es de
\sim10^{4} a 10^{5} (Horwich 1997, Bolton 2001). Con
semejantes niveles bajos de infectividad, es posible que se
requieran para la infectividad otros componentes,
co-factores o modificaciones covalentes. Los
estudios transgénicos sobre la susceptibilidad de los ratones que
expresan PrP^{C} quimérico de ser humano-ratón-
sugieren la presencia de al menos un factor huésped distinto de
PrP^{C}, provisionalmente denominado factor X, que podría
funcionar como una chaperona molecular en la formación de PrP^{Sc}
(Telling 1995).
Las enfermedades priónicas son transmisibles. La
transmisibilidad de las enfermedades priónicas en animales se han
establecido experimentalmente hace tiempo por inoculación de
homogenatos cerebrales de animales afectados en animales
saludables, tal como el caso del scrapie de oveja a oveja (Cuille
1936) y entre especies a cabra (Pattison 1957), kuru y CJD de
seres humanos a chimpancés (Gajdusek 1966, Gibbs 1968). El avance
significativo fue la exitosa transmisión de scrapie a ratones
(Chandler 1961), que facilitó enormemente la investigación de TSE
proporcionando un modelo experimental. La causa de la BSE reciente
en bovinos y la nueva variante de CJD en el ser humano (vCJD) fue
considerada una consecuencia de la exposición dietaria a la mezcla
de cadáveres de ovejas con scrapie destinados a la alimentación de
animales en el caso de BSE (Brown 1997) y a la carne de ganado
vacuno afectado con BSE en el caso de vCJD (Bruce 1997). La conexión
entre vCJD y BSE está además respaldada por la evidencia
neuropatológica obtenida a partir de macacos adaptados a BSE, el
modelo más cercano a seres humanos, y del estudio sobre ratones
endogámicos inoculados con el agente causal de BSE y vCJD (Lasmezas
1996). Es de particular preocupación por una posible epidemia en
expansión de CWD en ciervo mula y alce en América del Norte si CWD,
como BSE, pudiera transmitirse a seres humanos que puedan estar
expuestos a la enfermedad a través de la caza o la manipulación e
ingestión de carne infectada. Se ha documentado la transmisión
trágica y no intencional de la enfermedad priónica en seres
humanos, tal como la epidemia de kuru causada por la ingestión
canibalística de tejido cerebral de personas muertas, y la
transmisión iatrogénica de CJD a través del uso de hormonas,
trasplantes de tejidos y dispositivos médicos contaminados.
No existe evidencia concluyente que indique que
alguna de las enfermedades CJD esté relacionada con TSEs en
animales que puedan haber cruzado las barreras entre especies. La
epidemia de kuru ha proporcionado el cuerpo de evidencia más
importante de enfermedad priónica humana adquirida. Aunque no se ha
documentado ningún paciente con vCJD como víctima de transmisión de
ser humano a ser humano, la conexión cercana entre BSE y vCJD atrajo
una considerable atención. Las preocupaciones acerca de la
infección en seres humanos se han basado en la observación de que
PrP^{Sc} es fácilmente detectable en tejidos linforreticulares con
BSE y vCJD, pero no en la CJD clásica (Hill 1997), seguida de la
presunción de que el agente patógeno de scrapie del pasaje de oveja
a bovino puede haber alterado el ámbito de los huéspedes y haberse
vuelto más adaptable al ser humano. Los precedentes experimentales
para tal comportamiento son bien conocidos: el pasaje de cepas de
scrapie adaptadas a ratones a través de hámsters alteró su
transmisibilidad en el pasaje de vuelta a ratones (Kimberlin 1987,
Kimberlin 1989); las cepas humanas de kuru o CJD no se transmitieron
a hurones o cabras hasta que se pasó a través de primates o gatos
(Gibbs 1979); y una cepa bovina de BSE no se transmitió a hámsters
hasta que se pasó a través de ratones (Foster 1994).
Alternativamente, si la BSE se originó en una mutación espontánea
en bovinos, los estudios experimentales de la susceptibilidad de las
especies a esta nueva cepa de encefalopatía espongiforme
transmisible (TSE) no habían avanzado lo suficiente para prever que
los seres humanos no serían susceptibles.
El estudio sobre la enfermedad CJD y vCJD humana
indicó que la susceptibilidad genómica podría ser aun otro factor
que puede influir sobre la propagación de TSE en seres humanos. Se
descubrió que la mayoría de los pacientes con CJD esporádico era
homocigota para Met/Met o para Val/Val en el codón 129 (Belay 1999).
No obstante, se ha descubierto que todos los casos informados de
vCJD son homocigotos para Met/Met.
El tamaño y duración de la epidemia de vCJD aún
sigue siendo incierto. Dependiendo de las presunciones realizadas y
los cálculos de modelado empleados, se propusieron diferentes
predicciones. Una estimación de vCJD total prevé una cantidad de
casos tan baja como 205 (Valleron 2001). Por otra parte, otra
predicción para la mortalidad por vCJD para los próximos 80 años
oscila entre 50 y 50.000 si la infección proviene sólo de BSE.
Podría elevarse hasta 150.000 si resulta que BSE infecta a la oveja
y si posteriormente se permite que ingrese en la cadena alimentaria
humana (Ferguson 2002). Aunque es imposible realizar predicciones
exactas si se confunden los parámetros necesarios o los mismos no
están disponibles, una cosa es cierta: si la infectividad de vCJD
está presente en la sangre, cualquier predicción se estimará por
defecto. Además, se ha comprobado que vCJD es una nueva entidad
patológica y no simplemente el resultado de la vigilancia
incrementada de CJD en seres humanos (Hillier 2002).
Los gobiernos han adoptado medidas preventivas
para eliminar la propagación de la incidencia de BSE. En Estados
Unidos y el Reino Unido se prohibieron los alimentos a base de
proteínas para rumiantes (1988). También se han adoptado una serie
de medidas para evitar que la carne potencialmente infectada ingrese
en la cadena alimentaria humana. Para reducir más el riesgo en
seres humanos, FDA y CBER han decretado una nueva política en agosto
de 2001, que posterga indefinidamente a cualquier donante que haya
permanecido \geq 6 meses acumulativos durante los años
1980-1996 en el Reino Unido (FDA 2001).
El desarrollo de ensayos sensibles y confiables
para la detección de priones es absolutamente esencial para la
vigilancia de la enfermedad, la evaluación de riesgos y cuando se
combina con productos terapéuticos futuros, para la prevención y
erradicación de la enfermedad. Actualmente, existen básicamente tres
formatos de ensayos para el diagnóstico de enfermedades priónicas.
(1) Los bioensayos de infectividad animal son por mucho el
procedimiento más sensible para la medición de prion infeccioso en
scrapie experimental en roedores, usualmente realizados mediante la
inyección intracerebral de homogenatos cerebrales de animales
enfermos en animales receptores. Sin embargo, la medición
cuantitativa de la infectividad de la enfermedad priónica en
diferentes especies animales es limitada debido a la "barrera de
especies" y existen diferentes "cepas" priónicas que
difieren en términos de patología, tiempo de incubación y
características moleculares de PrP^{Sc}. Por ello, este
diagnóstico pos-mortem costoso, que lleva mucho
tiempo de ejecución, mayormente se utiliza como herramienta de
investigación para distinguir diferentes cepas priónicas en
roedores, y sirve como referencia para la calibración del material
cerebral infeccioso. (2) Los inmunoensayos actuales de PrP se
basan en la detección del PrP^{Sc} resistente a las proteasas, el
único distintivo molecular conocido de todas las enfermedades
priónicas. Durante muchos años, la detección de PrP^{Sc} por
procedimientos inmunoquímicos (inmunohistoquímica y transferencia
Western) ha proporcionado el diagnóstico más exacto para las
enfermedades priónicas en animales y seres humanos (Schaller 1999,
Biffiger 2002). Estos se utilizan ampliamente para el diagnóstico
pos-mortem. Muchos anticuerpos monoclonales y
policlonales se han dirigido contra varias regiones de PrP para este
fin, tales como los 3F4, 6H4 ampliamente utilizados descritos en
las patentes US4806627 y EP0861900. Sin embargo, se asegura que sólo
pocos son capaces de discriminar entre PrP^{C} (a menudo presente
en cantidades mucho mayores) y PrP^{Sc}. Los anticuerpos
monoclonales informados por Korth en 1997 y por Paramithiotis en
2003 fueron ambos IgMs y estos anticuerpos no desarrollaron ningún
ensayo de diagnóstico. En consecuencia, casi todos los
procedimientos inmunoquímicos actuales requieren una etapa para
reducir o eliminar un PrP^{C}, usualmente por proteólisis no
específica tal como digestión con la proteinasa K (PK), previo a la
detección de PrP^{Sc}. Semejante pretratamiento escinde los
primeros 60 - 70 residuos de PrP^{Sc} para producir un núcleo PrP
de 27 kDa-30 kDa resistente a PK denominado
PrP^{res}. Después pueden utilizarse anticuerpos
anti-PrP que reconocen la región del extremo
C-terminal remanente de la proteína para detectar el
PrP^{Sc} truncado en el extremo N-terminal, o
PrP^{res}, presente sólo en muestras patológicas. Para la tinción
inmunohistoquímica, las secciones de tejidos también se pretratan,
usualmente mediante hidrólisis ácida para reducir el ambiente
relacionado con PrP^{C}. Por ello, PrP^{res} es un sustituto
del PrP^{Sc} precursor en estos inmunoensayos. Entre los
diferentes formatos de inmunoensayos, la transferencia Western tiene
la ventaja de revelar los patrones moleculares detallados de PrP
basados en la migración de bandas de PrP di-, mono- y no
glicosiladas. Este procedimiento también se ha utilizado
ampliamente para distinguir diferentes subtipos de PrP^{res}
cerebrales en enfermedades priónicas de seres humanos y animales.
Además de la transferencia Western, ahora se han desarrollado otros
formatos de ensayos para un rendimiento de muestras más alto,
sensibilidad incrementada y mejor cuantificación, que incluyen el
ELISA tradicional, inmunoensayo de fluorescencia de lantánidos
mejorada por disociación (DELFIA, Barnard 2000 y un procedimiento
descrito en la patente US20020137114A1) y un inmunoensayo
dependiente de la conformación (CDI) combinado con ELISA y
detección de fluorescencia (Safar 1998, US 20010001061A1,
US20020001817A1). Sin embargo, sin importar el formato, PrP^{Sc}
puede diferenciarse de PrP^{C} sólo después de la digestión
obligatoria con PK, que puede ser difícil de optimizar para las
muestras biológicas dispares. (3) También se han descrito otros
procedimientos para el tratamiento de muestras, que incluyen
inmunohistoquímica del tejido linfoide del tercer párpado para el
diagnóstico preclínico de scrapie ovino (O'Rourke 2000, US6165784,
US6261790), tratamiento químico con fosfotungstato de sodio para
enriquecer PrP^{Sc} del cerebro y de otros homogenatos tisulares
periféricos (Wadsworth 2001), y detección de una nueva isoforma de
la proteína priónica en la orina de animales y seres humanos
infectados (Shaked 2001b, WO0233420A2). También se documentaron
otros sistemas de detección, que incluyen electroforesis capilar y
espectroscopía infrarroja por transformadas de Fourier. Estos
procedimientos aún se encuentran en su etapa inicial de desarrollo y
son técnicamente complejos. Además de la identificación tradicional
del prion patógeno eliminando el prion celular seguido del
reconocimiento de anticuerpos anti-prion no
discriminatorios, se descubrieron otros reactivos capaces de
diferenciar PrP^{Sc} de PrP^{C}, tales como plasminógeno y
fibrinógeno. La evidencia suministrada sugirió que una propiedad
común al PrP^{Sc} de varias especies, en vez de la secuencia
primaria priónica o la estructura terciaria específica de las
moléculas individuales de PrP^{Sc}, podría ser responsable de la
unión al plasminógeno (Fischer 2000, Maissen 2001). La aplicación
para el uso de plasminógeno y otras proteínas séricas/plasmáticas
para la captación y detección de la proteína priónica patógena se
ha descrito en los documentos WO0200713 y US20010053533A1 (Aguzzi
2001).
Todos los ensayos de diagnóstico priónico
fabricados en la actualidad utilizan tejido cerebral como fuente de
muestra. La Comisión Europea en 1999 evaluó 4 kits de prueba de BSE
de diferentes fabricantes (Moynagh 1999). Todos requerían un
procedimiento de preparación de muestras separado. Dependiendo de
las instrucciones del kit, el homogenato del tejido cerebral
necesitaba ser procesado, incluyendo la desnaturalización, digestión
con PK o enriquecimiento en PrP^{Sc}. Los sistemas de detección
de ensayos empleados en DELFA, inmunotransferencia o en los
formatos de ELISA en placas utilizaban o bien quimioluminiscencia o
un sustrato colorimétrico.
La solicitud de patente internacional WO
02/065133 describe un procedimiento para la detección de PrP^{Sc}
mediante la digestión de PcP^{C} con proteinasa K, y la unión del
PrP^{Sc} no digerido a la fibronectina de longitud completa.
Un problema común a los ensayos
antemortem basados en PrP^{Sc} es si PrP^{Sc} está
presente en los tejidos periféricos o los fluidos corporales.
Debido a las dificultades técnicas, se dispone de pocos datos
experimentales sobre la presencia de PrP^{Sc} o su infectividad
asociada en líquidos corporales, y este asunto sigue siendo
controvertido. En el modelo de scrapie de hámster, puede detectarse
un bajo nivel de infectividad en sangre. Aunque la infectividad en
concentrado plaquetario rico en linfocitos procedente de la sangre
de hámsters enfermos es mayor que en plasma, esto sólo representa
una porción relativamente pequeña al compararse con los inóculos
sanguíneos totales. La definición molecular de este agente
infeccioso presente en la sangre no está clara. La búsqueda de
factores de riesgo y posibles fuentes de infección en pacientes con
CJD esporádico no reveló una conexión significativa entre la
enfermedad y la dieta, la transfusión sanguínea o recibir otro
producto sanguíneo. Aunque los primeros informes indicaron la
posible presencia de infectividad en sangre obtenida de pacientes
con CJD después de la inoculación intracerebral de ratones
(Manuelidis 1985, Tateishi 1985), la mayor cantidad de infectividad
o PrP^{res} invariablemente se encuentra en el sistema nervioso
central (SNC), pero no se encuentra coherentemente en los tejidos
periféricos en las enfermedades priónicas humanas clásicas, excepto
en el caso de vCJD. La presencia de PrP^{Sc} fácilmente detectable
en los tejidos linforreticulares periféricos tales como amígdalas,
bazo y ganglios linfáticos de pacientes con CJD ha dado lugar a una
seria preocupación de que cantidades abundantes de PrP^{res}
presentes en los tejidos linforreticulares podrían interactuar con
el sistema circulatorio y, en consecuencia, cantidades a nivel de
trazas de PrP^{Sc} pueden estar presentes en la sangre de
pacientes con CJD por la posible transmisión sanguínea. Otra
infectividad por TSE en sangre también se ha demostrado en diversos
animales experimentales. La mayor parte de la sangre para los
estudios de infectividad se obtuvo de roedores adaptados a TSE tales
como ratones y hámsters. La BSE adaptada a ratones y vCJD adaptada
a ratones se han establecido a través de la transmisión
intracerebral e intravenosa. El único modelo de excepción fue un
estudio realizado en la oveja. En este experimento, una oveja a la
que se le transfundió sangre total, tomada de otra oveja inoculada
con lisado cerebral con BSE, desarrolló síntomas de BSE (Houston
2000, Hunter 2002). Sin embargo, estos resultados experimentales aún
necesitan ser completamente evaluados. Se anticipa que el hallazgo
de dicho agente infeccioso en sangre nos ayudaría a entender mejor
la relación entre el PrP^{Sc} y la enfermedad TSE.
Es importante observar que el tratamiento
riguroso de muestras para eliminar cantidades de fondo de PrP^{C}
puede no ser apropiado para otros especímenes de tejidos periféricos
o líquidos corporales debido al contenido proteico distinto, a la
dificultad de aplicar este ensayo a un gran número de muestras, a la
eliminación inevitable de intermediarios con plegamientos de
PrP^{Sc} sensibles a proteasas o aún una fracción de PrP^{Sc}
auténtico, reduciendo de este modo la sensibilidad de detección.
Esto puede ser especialmente importante para los ensayos que
utilizan tejidos periféricos y líquidos corporales, ya que sólo
pueden estar presentes bajos niveles de PrP^{Sc} (Horiuchi 1999,
Jackson1999, Swietnicki 2000). Estos temas necesitan el desarrollo
de reactivos inmunológicos con una alta afinidad por PrP^{Sc},
permitiendo la detección específica sin necesidad de tratamiento
proteolítico.
Se acepte o no la hipótesis de "sólo
proteína" o "sólo prion", existen esfuerzos continuos en
marcha por buscar agentes o moléculas distintas del prion que
puedan contribuir con la patogénesis de la enfermedad priónica.
Esta búsqueda está impulsada por muchas preguntas sin respuestas.
Por ejemplo, la proteína priónica sintetizada, libre de cualquier
contaminación, no provoca la enfermedad; el mecanismo que
desencadena la conversión de PrP^{C} normal a la isoforma
patógena PrP^{Sc} no se conoce. Otra pregunta no resuelta incluye
los diferentes fenotipos de la enfermedad priónica observados en
animales y seres humanos, definidos por el período de incubación de
la enfermedad, el nivel de glicosilación y los patrones de lesión.
Después de un pasaje serial en ratones endogámicos homocigotos
para un único genotipo de PRNP, todas las cepas de scrapie
retuvieron su perfil de enfermedad original. Estas observaciones
llevaron a los investigadores a preguntarse si las cepas fenotípicas
variadas fueron dominadas por diferentes isoformas conformacionales
del mismo precursor priónico celular, o si existe otro factor que
determine el fenotipo de la cepa heredable. En realidad, el
PrP^{res} de los modelos de conversión in vitro formados
en reacciones libres de células nunca ha demostrado constituir
nueva infectividad por TSE en animales (Caughey 2003). Estas
preguntas llevaron a muchos a creer que existe un elemento
faltante, apodado "proteína X" según sugirió Prusiner, aún no
descubierto.
Se propuso la presencia de una molécula de ARN o
ADN fuertemente unida en la partícula del prion para explicar la
propagación de diferentes cepas del agente de scrapie con diferentes
fenotipos en animales homocigotos para el gen PRNP
(Weissmann 1991). El análisis de priones de scrapie altamente
purificados mediante electroforesis en gel con reenfoque de retorno
reveló el pequeño tamaño de los ácidos nucleicos remanentes
(Kellings 1992). En un informe reciente, sin embargo, Narang indicó
que animales inoculados con ADNss purificado de cerebros de hámster
con scrapie mezclados con prion no patógeno desarrollaron la
enfermedad clínica (Narang 2002). Sobre la base de estos hallazgos,
postuló que la "proteína accesoria" codificada por el ADNss
puede estar involucrada en la conversión de PrP^{C} a PrP^{Sc}.
Sobre la base de esos estudios de conformación y conversión in
vitro, se llegó a la hipótesis de que el ADN actuaría como un
guardián de la conformación de PrP^{Sc} así como un catalizador
para facilitar la conversión y agregación de PrP^{Sc} (Cordeiro
2001). Muy recientemente, se informó que la transformación
estequiométrica in vitro de PrP^{C} en PrP^{res} requiere
moléculas de ARN específicas (Deleault 2003). El anticuerpo
monoclonal anti-ácido nucleico desarrollado por
Ortho-Clinical Diagnostics que puede capturar de
forma discriminada PrP^{Sc} pero no PrP^{C} (documentos
US60/434.627, US60/446.217) es otra evidencia que demuestra la
asociación de PrP^{Sc} con los ácidos nucleicos.
Se sabe que el PrP^{Sc} aislado de cerebro
enfermo está también asociado con una variedad de glicanos. Ellos
incluyen unidades de glucosa unidas por enlaces 1,4 en bastones de
priones, esfingolípidos, polisacáridos y otros componentes de
membrana de agregados de PrP^{Sc} (Appel 1999, Klein 1998), y
proteoglicano sulfatado en placas priónicas de amiloide (Snow
1990), una propiedad que se ha explotado en la inmunohistoquímica,
donde se ha demostrado que la unión mediante anticuerpos contra
sulfato de heparano (anti-HS) y anticuerpos contra
el proteoglicano de sulfato de heparano (anti-HSPG)
se correlaciona con el PrP anormal tan pronto como 70 días después
de la infección y a lo largo del transcurso de la enfermedad
(McBride 1998). A través de un mecanismo que tal vez es diferente
de aquél mediante el que los ácidos nucleicos participan en la
conversión del PrP^{C} a PrP^{Sc}, el glicano también convierte
la proteína priónica celular a la conformación de
lámina-Beta. La conversión in vitro
de PrP^{C} a PrP^{Sc} y en experimentos de reconstitución de la
infectividad priónica, los glicanos sulfatados han demostrado que o
bien facilitan la conversión o intensifican la infectividad (Wong
2001, Shaked 2001a, Diaz-Nido 2002). Con el prion
recombinante de longitud completa GST y el fragmento priónico GST,
Warner recientemente demostró la unión directa del prion
recombinante a la heparina y al sulfato de heparano (Warner 2002).
La región peptídica 23-52 de la secuencia priónica
fue positiva en todos las pruebas de unión de HS y HSPG. Debido a
que el péptido no logró competir con el prion de longitud completa
por la unión a la heparina, el autor sugirió que podría haber otro
sitio de unión al GAG importante en el PrP^{C} intacto. Otra
observación interesante es que se ha informado que el plasminógeno
se une al PrP^{Sc} obtenido de cerebro, pero no al PrP^{C}.
Aunque no se ha demostrado que el plasminógeno posea una directa
interacción con PrP^{Sc}, se sugiere un sitio de unión dentro de
la región Kringle del plasminógeno, una región que posee una
conocida afinidad por la heparina. Otra observación digna de
destacar es que los GAGs de diferentes especies (bovina y porcina)
o de diferentes órganos (pulmón, riñón e intestino) han mostrado
diferentes afinidades por la unión al prion. La diferencia en
afinidad puede deberse a la propia secuencia priónica, o puede
depender de la presencia de una unidad de azúcar particular en los
GAGs probados.
En vista de estas observaciones, se propuso que
un número de péptidos fuera diseñado para capturar selectivamente
PrP^{Sc} pero no PrP^{C} a través de la afinidad de los péptidos
por la conformación única de PrP^{Sc} o a moléculas asociadas con
PrP^{Sc}. Estos se detectaron por su capacidad para identificar y
capturar PrP^{Sc} de homogenatos de cerebros enfermos mediante
inmunoprecipitación sin pretratamiento con proteasa.
Glicanos (GAG) tales como la heparina y el
sulfato de heparina se asociaron con agregados amiloides de
PrP^{Sc}. Debido a que la afinidad de asociación fue mucho mayor
en GAG::PrP^{Sc} que en GAG::PrP^{C} es posible utilizar
péptidos caracterizados como dominio de unión a glicanos para
capturar selectivamente PrP^{Sc} pero no PrP^{C}. Por esta
razón, se sintetizaron péptidos descritos como dominio de unión a la
heparina o al sulfato de heparina: (1) WQPPRARI de fibronectina
carboxilo-terminal (Woods 1993, Hines 1994) (2)
NWCKRGRKNCKTH del precursor de la proteína amiloide (Small 1994),
(3) NYKKPKLG del factor de crecimiento de fibroblastos
N-terminal (FGF)-1 (Lou 1996) y (4)
KDFLSIELVRGRVK del dominio G C-terminal de la
cadena alfa 1 de laminina (Yoshida 1999).
La región Kringle estuvo involucrada en la unión
selectiva del plasminógeno al PrP^{Sc}. También se supo que la
región Kringle tuvo una actividad de unión a la heparina/sulfato de
heparina (Mizuno 1994) para la que estuvieron involucrados
aminoácidos cargados positivamente (tales como Arg y Lys) (Soeda
1989).
En una publicación separada, se descubrió que
dos tripéptidos conservados "YYR", o más bien tres "YYX"
discontinuos de la secuencia priónica según se sugirió,
interactuaron con PrP^{Sc} pero no interactuaron con PrP^{C}
(Paramithiotis 2003, WO0078344A1). Resultó interesante descubrir que
en la secuencia del plasminógeno humano había cuatro secuencias
Tyr-Arg-Gly en cuatro de cinco
regiones Kringle (regiones Kringle 1, 3, 4 y 5); había seis
secuencias Tyr-Arg o Arg-Tyr o
Arg-Lys en el plasminógeno. Además, varios residuos
de Tyr, Arg o Lys distantes se acercaron estrechamente mediante
puentes disulfuro formados en las asas Kringle (Figura 1). Sobre la
base de estas observaciones, se postuló que los aminoácidos Tyr, Arg
y Lys de la región Kringle del plasminógeno y de la secuencia
priónica, posiblemente a través de una interacción con el glicano
que estaba asociado con el complejo PrP^{Sc}, podrían explicar la
unión selectiva al PrP^{Sc}. Por esta razón, se sintetizaron dos
péptidos "condensados Kringle" YRGYRGYRGYRG e
YRGRYGYKGKYGYRG.
Los ácidos nucleicos son otra categoría de
moléculas que se asocian con los agregados de PrP^{Sc}.
Se han utilizado anticuerpos
anti-ADN de manera efectiva para captar el
PrP^{Sc}. Las histonas son un grupo de proteínas que se sabe se
unen al ADN nuclear. Por ello, se sintetizaron tres péptidos (1)
AQKKDGKKRKRSRKESYSIYV de H2B(21-41), (2)
ARTKQTARKSTGGKAPRKQLA de H3(1-21) y (3)
SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLR de H4(2-24) para
evaluar su capacidad para captar PrP^{Sc}.
El objeto de la presente invención es
proporcionar una manera pertinente de aislar, concentrar y
monitorear la proteína priónica patógena relacionada con la
enfermedad TSE. La descripción desveló ocho péptidos
(péptido-1, péptido-2,
péptido-3, péptido-5,
péptido-6, péptido-7,
péptido-8 y péptido-9) y su
capacidad de capturar PrP^{Sc} de un homogenato cerebral de un
animal y un ser humano infectado con la enfermedad priónica. Estos
ocho péptidos no captan la proteína priónica celular del individuo
que no padece la enfermedad priónica. La evidencia provista en
apoyo de esta invención demostró que el PrP^{Sc} está asociado con
gran afinidad a muchas otras moléculas tales como ácidos nucleicos
y glicanos, según se investigó. La evidencia también demostró que la
asociación era fuerte, resistente al tratamiento de digestión con
PK, y que PrP^{Sc} pudo aislarse fácilmente mediante péptidos a
través del reconocimiento de tal pareja de unión asociada.
La invención se refiere a un procedimiento para
la detección in vitro de PrP^{Sc} que comprende:
en primer término poner en contacto una muestra
con un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de
WQPPRARI,
después detectar PrP^{Sc}.
En otro aspecto, la invención se refirió a un
procedimiento para la detección in vitro de PrP^{Sc} que
comprende:
proporcionar un soporte sólido que tiene unido
al mismo un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de
WQPPRARI,
poner en contacto el soporte sólido con una
muestra,
lavar el soporte para eliminar cualquier muestra
no unida,
poner en contacto el soporte sólido con un
anticuerpo específico del prion, y
realizar una etapa de detección para determinar
si PrP^{Sc} está unido al soporte sólido.
Aun en otro aspecto, la presente invención se
refiere a un kit para la detección de PrP^{Sc} que comprende:
un soporte sólido que posee unido al mismo un
péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de WQPPRARI, y
un anticuerpo marcado específico del prion.
Se obtuvieron lisados cerebrales de hámster
normal y con scrapie de Baltimore Research y Education Foundation
como homogenatos de tejido de cerebro completo al 10% en PBS (p/v).
El lisado además se trató añadiendo 1/10 volumen de tampón de
homogenato con detergente 10X, compuesto por desoxicolato de sodio
al 5% e Igpal CA-630 al 5% (equivalente a
NP-40) en PBS, incubando a 4ºC durante 1 hora,
seguido de centrifugación a 1000 g durante 10 minutos. Se
recolectó el sobrenadante resultante y se utilizó en el ensayo.
Tejido de cerebro bovino normal y con BSE fue
provisto por Veterinary Laboratories Agency (VLA), RU. Tejido
cerebral de vCJD humana y de demencia de cuerpos de Lewy fue
provisto por National CJD Surveillance Unit (NCJDSU), RU. El tejido
cerebral fue procesado de la misma manera (o en forma similar) que
la preparación del homogenato de cerebro de hámster.
Nueve péptidos fueron sintetizados mediante
ResGen (actualmente una división de Invitrogen Corporation), o se
adquirieron de Upstate Group, Inc. Cada péptido se marcó con biotina
en la Lisina C-terminal portadora de un espaciador
de aminohexanoílo (K(Lc)), o en el extremo
N-terminal a través de un espaciador de
aminohexanoílo (AMCAP).
El péptido biotinilado se disolvió en PBS a
razón de 1mg/mL y se conservó a -20ºC hasta su uso.
Se lavaron dos veces con PBS 0,5 ml de cuentas
de Estreptavidina Dynabeads® M-280 (Dynal Biotech,
NY, EEUU, Cat. # 112,06) y las cuentas se aislaron del tampón con
el imán (Dynal Magnetic Particle Concentrator, MPC). Se añadieron
100 ug de péptido y 1 mL de PBS a las cuentas lavadas. Se realizó la
incubación con rotación a 37ºC durante 1-2 horas.
Las cuentas se aislaron del tampón con el MPC, se lavaron dos veces
con 1 ml de PBS (BSA al 0,1%), y se sometieron a rotación durante 5
minutos a temperatura ambiente mientras se lavaban. Las cuentas
conjugadas al péptido se bloquearon posteriormente durante 2 horas,
a 37ºC con Biotina 1 mM en Tris-HCl 0,2 M, pH 8,0,
que contenía BSA al 0,1%. Las cuentas posteriormente se lavaron 2
veces con 1 ml de PBS (BSA al 0,1%) y una vez con 1 ml de PBS (BSA
al 0,1%, Tween 20 al 1%), incubando cada vez durante 10 minutos a
temperatura ambiente. Las cuentas después se lavaron una vez con 1
ml de PBS (BSA al 0,1%) y después se conservaron en 1ml de PBS
(azida de sodio al 0,05%) a 4ºC.
Condiciones para la digestión con PK del lisado
cerebral: se suspendió el homogenato cerebral en tampón PBS con o
sin detergente no iónico. La concentración total de proteína del
homogenato no superó los 2,5 mg/ml. Se añadió PK (Roche
Diagnostics, IN, EEUU, Cat. # 1373196) a una concentración final de
50 ug/mL. La incubación se realizó a 37ºC durante 0,5 a 1 hora. La
digestión se interrumpió añadiendo Pefabloc SC (Roche Diagnostics,
IN, EEUU, Cat.# 1585916) a una concentración final de 4 mM.
Las cuentas magnéticas conjugadas al péptido se
utilizaron para capturar PrP^{Sc} del homogenato cerebral
mediante inmunoprecipitación. El procedimiento de IP consiste en el
siguiente protocolo: mezclar 50 uL de las cuentas conjugadas al
péptido con el homogenato cerebral tratado con PK o no tratado con
PK en un total de 1 ml de tampón IP (Tween20 al 3% e Igpal
CA-630 al 3% en PBS) e incubar a 25ºC durante 2,5
horas con rotación \rightarrow Separar las cuentas utilizando el
dispositivo MPC y lavar las cuentas 3 veces de 30 segundos
generando remolinos con tampón de lavado IP (Tween20 al 2% e Igpal
CA-630 al 2% en PBS) \rightarrow Eluir el
PrP^{Sc} capturado calentando las cuentas con tampón de muestra
NuPAGE durante 10-15 minutos. La muestra eluída de
la captura por IP se cargó en un gel Bis-Tris
NuPAGE® al 4-12% (Invitrogen, CA, EE.UU., Cat. #
NP0302) y se sometió a electroforesis no reductora a 200 V durante
45 minutos. El procedimiento de inmunotransferencia se realizó de
la siguiente manera: transferir las proteínas separadas en el gel a
una membrana de 0,2 um de PVDF (Invitrogen, Cat. # LC2002) a 30 V
durante 60 minutos \rightarrow Bloquear la membrana con Caseína en
TBS Blocker^{TM} (Tween20 al 0,05%) (Pierce Chemical Corp., IL,
EE.UU., Cat. # 37532) a 25ºC durante 1 hora con agitación o a 4ºC
durante toda la noche. \rightarrow Como anticuerpo primario, usar
3F4 (Signet, MA, EEUU, Cat. # 9620-02) a una
dilución de 1:3000 o 6H4 (Prionics AG, Suiza, Cat. #
01-011) a una dilución de 1:5000 para detectar
PrP^{Sc}. Incubar la membrana con anticuerpo primario diluido en
Caseína Blocker^{TM} al 10% en tampón TBST
(Tri-Cl 25 mM, NaCl 0,2 M, Tween20 al 0,2%, pH 8,0)
a 25ºC durante 1 hora con agitación. \rightarrow Lavar 3X 5
minutos con tampón TBST con agitación. \rightarrow Incubar la
membrana con IgG (H+L) anti-ratón policlonal de
cabra conjugada con peroxidasa de rábano (Jackson ImmunoResearch
Laboratories, PA, EE.UU., Cat. #
115-035-003) a una dilución de
1:10.000 a 1:30.000 en Caseína Blocker^{TM} al 50% en tampón TBST
a 25ºC durante 1 hora con agitación. \rightarrow Lavar 6X 5
minutos con tampón TBST con agitación. \rightarrow Añadir
sustrato para quimioluminiscencia ECL (Amersham Biosciences, NJ,
EE.UU., Cat.# RPN2109) o sustrato para quimioluminiscencia
SuperSignal West Dura (Pierce) en la membrana para desarrollar
durante 5 minutos. \rightarrow Tomar la imagen mediante
exposición a película Bio Max MR-2 (Kodak, NY,
EE.UU.) o al sistema ChemiDoc Gel Documentation System
(Bio-Rad, CA, EEUU).
Figura 1: Secuencia de Plasminógeno Humano y
regiones Kringle. Existen 4 secuencias YRG en 4 de 5 regiones
Kringle (rectángulos negros). Existen 6 secuencias YK, RY, RK
(rectángulos blancos). Existen muchos Y, R o K alrededor de varios
puentes disulfuro de asa Kringle (círculos negros).
Figura 2: Captura por IP e
inmunotransferencia de PrP^{Sc} de hámster. Se cargaron
homogenato de cerebro de hámster normal (4 ul) y con scrapie (3 ul)
directamente en gel o se sometieron a inmunoprecipitación utilizando
perlas magnéticas de estreptavidina conjugadas con péptido
biotinilado. Se detectó el PrP mediante inmunotransferencia
utilizando 3F4. El lisado con scrapie se digirió con PK para carga
directa. El homogenato para la captura por IP no se trató con
PK.
Figura 3: Captura por IP e
inmunotransferencia de PrP^{Sc} de BSE. Se añadió homogenato
de cerebro de vacuno normal (10 ul) o de BSE (5 ul) en 1 mL de
tampón IP, sometiéndose a inmunoprecipitación con cuentas de
péptido. El PrP inmunoprecipitado después se trató con PK y se
analizó mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia, se
detectó mediante 6H4. El PrP capturado del homogenato de cerebro con
BSE fue PrP^{Sc} auténtico ya que el tratamiento con PK (50 ug/ml
durante 1 hora a 37ºC) genera los fragmentos de PrP^{res} del
núcleo resistente a PK. Los homogenatos cerebrales clarificados de
BSE y los de control normales también se incubaron en ausencia (-)
o presencia (+) de PK (50 ug/ml durante 1 hora a 37ºC) y se cargaron
directamente en gel de SDS como controles.
Figura 4: Inmunocaptación de PRP^{Sc} de
cerebros de vCJD mediante péptidos. Se utilizaron las cuentas
conjugadas al péptido para la inmunoprecipitación de PrP en 5 ul de
homogenatos cerebrales clarificados de pacientes afectados por
demencia de cuerpos de Lewy (LBD) o por vCJD (99/090). Los
inmunoprecipitados después se analizaron mediante
SDS-PAGE (gel al 4-12%) y
transferencia Western utilizando anticuerpo anti-PrP
3F4. Se cargaron directamente 5 ul de homogenato de LBD no tratado
y 5 ul de homogenato cerebral de vCJD tratado o no tratado con PK en
gel de SDS para indicar el contenido priónico.
La presente invención utiliza un péptido para
capturar PrP^{Sc} mediante el reconocimiento de moléculas
asociadas de alta afinidad en el complejo PrP^{Sc} tales como
glicanos y ácidos nucleicos. Debido a la estrecha asociación de
estas moléculas sólo con PrP^{Sc} pero no con PrP^{C}, la
presente invención proporcionó un medio pertinente para la
detección de PrP^{Sc} sin requerir la digestión con PK u otro
procedimiento de modificación de proteínas. Se anticipa que las
condiciones suaves conservarán la estructura original y la
conformación de la proteína priónica patógena, brindando de este
modo la oportunidad de determinar la presencia del verdadero
PrP^{Sc}, minimizando la generación de PrP^{Sc} debido al
tratamiento riguroso de las muestras.
El uso de péptidos sintéticos ofrece ventajas en
cuanto a que muestran la especificidad de unión pero también se
pueden manipular fácilmente en el recubrimiento directo de una fase
sólida como así también pueden conjugarse para ligarse a ciertos
reactivos de señalización dados, tales como peroxidasa de rábano
(HRP), o pueden adoptarse en otro formato de ensayo de diagnóstico
deseado.
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Claims (3)
1. Un procedimiento para la detección in
vitro de PrP^{Sc} que comprende:
en primer término poner en contacto una muestra
con un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de
WQPPRARI,
después detectar PrP^{Sc}.
2. Un procedimiento para la detección in
vitro de PrP^{Sc} que comprende:
proporcionar un soporte sólido que posee unido
al mismo un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de
WQPPRARI,
poner en contacto el soporte sólido con una
muestra,
lavar el soporte para eliminar cualquier muestra
no unida,
poner en contacto el soporte sólido con un
anticuerpo específico del prion, y
realizar una etapa de detección para determinar
si PrP^{Sc} está unido al soporte sólido.
3. Un kit para la detección de PrP^{Sc} que
comprende
un soporte sólido que posee unido al mismo un
péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de WQPPRARI,
y
un anticuerpo marcado específico del prion.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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