JP2003521477A - プリオン蛋白質ペプチドおよびその使用 - Google Patents

プリオン蛋白質ペプチドおよびその使用

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Abstract

(57)【要約】 全般的に、本発明はPrPScに対して特異的な抗体、ならびにその診断、治療および汚染除去での利用に関する。本発明はまた、PrPScに対して特異的な抗体を作製するための免疫原およびプリオン疾患を治療するための治療薬として有用な合成ペプチドを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 本発明は、PrPSc特異的抗体およびその作製に用いられるペプチドに関する。
これらの抗体は試料中のPrPScを検出するために、そしてPrPScを精製するために
適している。さらに、本発明は、PrPScを検出するための診断補助剤、PrPSc特異
的立体構造エピトープを含むまたは模倣する薬剤、およびプリオン汚染を除去す
る方法に関する。
【０００２】 プリオンは、海綿状変化（例えば、脳の微小空洞形成、通常、灰白質に多い）
、神経細胞喪失、神経の喪失と不釣り合いな星状細胞増殖、および異常なアミロ
イド原性蛋白質の蓄積を特徴とする神経変性症候群に関連する感染物質である。
プリオン疾患における神経変性は、アルツハイマー病、筋萎縮性測索硬化症、お
よびパーキンソン病のような他のより一般的な神経変性症候群と、特定の基礎と
なるメカニズムを共有する可能性がある。
【０００３】 これらの疾患を伝幡する物質は、感染材料において核酸成分に関する化学また
は物理的証拠が再現よく検出されないという点において、ウイルスおよびウイロ
イドとは著しく異なる（プルジナー（Prusiner）、Science 216：136〜144、198
2）。プリオンとそれらが引き起こす疾患の研究における主な段階は、プリオン
蛋白質（PrP）と呼ばれる蛋白質の発見と精製である（ボルトン（Bolton）ら、S
cience 218：1309〜11、1982；プルジナー（Prusiner）ら、Biochemistry 21：6
942〜50、1982；マッキンレー（McKinley）ら、Cell 35：57〜62、1983）。プロ
テナーゼK消化を用いて精製すると、27〜30 kDのプロテアーゼ抵抗性の蛋白質が
スクレイピーに罹患したハムスターの脳から発見され、PrP27-30と名付けられた
が、これは後にPrPScの断片であることが判明した（ボルトン（Bolton）ら、Sci
ence 218：1309〜1311、1982）。
【０００４】 プリオンの仮説によれば、プリオンの感染性はPrPScに存在する。PrPScは、感
染性に少なくとも強く関連しており、プリオン感染症の信頼できる代用物質であ
ると思われる。PrPScは、PrPCと呼ばれる宿主がコードする細胞蛋白質の立体構
造変種であり（オエシュ（Oesch）ら、Cell 40：735〜746、1985）、これは、分
子量33〜35 kDのグリコシルフォスファチジルイノシトール（GPI）結合細胞表面
蛋白質である。
【０００５】 PrPCは、正常な脳から単離されており、プロテアーゼ感受性であって、スクレ
イピー疾患発生活性とは関連しないことが判明した（ベンドハイム（Bendheim）
ら、Ciba Found. Symp. 164〜177、988）。プリオンの理論に従えば、PrPCは、P
rPScに自動触媒的に変換される（プルジナー（Prusiner）、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 95：13363〜83、1998）。より最近、PrPCは、インビトロでPrPScによ
ってプロテアーゼ抵抗型に変換されうると報告された（コシスコ（Kocisko）ら
、Nature 370：471〜473、1994）。PrPCは、実際の生物学的または生理学的機能
が不明である進化的に保存された膜蛋白質である。PrPCを欠損するマウスは、生
存して、神経学的および身体的な障害の明白な兆候を示さない（ビューラー（Bu
eler）ら、Nature 356：577〜582、1992）。さらに、これらのマウスはプリオン
感染に対して感受性がなく、感染性の複製におけるPrPの中心的重要性を強調す
る（ビューラー（Bueler）ら、Cell 73：1339〜1347、1993；プルジナー（Prusi
ner）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：10608〜10612、1993）。PrPノックア
ウトマウスを標的とした研究から、シナプス機能の障害（コリンジ（Collinge）
ら、Nature 370：295〜297、1994）および睡眠調節の変化（トブラー（Tobler）
ら、J. Neurosci. 17：1869〜79）が判明した。その上、PrPCは、コンカナバリ
ンA刺激によって誘導されるT細胞活性化を修飾することが示されており（キャッ
シュマン（Cashman）ら、Cell 61：185〜192、1990）、このことは、この蛋白質
の機能的役割を示している。
【０００６】 プリオン疾患は、急速に進行する致死性の治療不可能な神経変性症候群である
。ヒトプリオン疾患には、散発性、医原性、および家族性型があるクロイツフェ
ルト・ヤコブ病（CJD）、ならびにウシ海綿状脳症の原因物質に汚染された畜牛
組織の消費に由来する可能性がある変異型CJD（「vCJD」）が含まれる（キャッ
シュマン（Cashman）、Can. Med. Assoc. J. 157：1381〜5、1997において論評
）。CJDは、汚染された死体下垂体ホルモン、硬膜移植、神経外科器具、および
角膜移植によってヒトからヒトへ偶発的に伝幡している（ブラウン（Brown）ら
、Lancet 340：24〜7、1992）。血液および血液製品を通じてCJDが伝幡するリス
クは、世界中の懸念である。その上、ヒツジおよびヤギにおけるスクレイピーは
一般的であり、イギリスにおけるウシ海綿状脳症（BSE）と同様に、北米では経
済的に重要なプリオン関連疾患である。英国農業漁業食品省によれば、おそらく
感染物質を保有する年齢であると思われる畜牛4,347,380頭以上が殺処分されて
いる。農業省は流行の全体的な損失は、2002年までに71億3000万ポンドに達する
であろうと推定している。イギリス全土からウシ173,000頭以上の感染が確認さ
れ、何百何千頭ものウシが検出されないまま食品流通に入った可能性がある。
【０００７】 さらに、アメリカとカナダは現在、BSE流行の初期およびピーク年のあいだに
イギリスに滞在した人の献血の一時保留を実施している。そのような制限は、vC
JDを伝幡するリスクに対する予防策として採用されているが、vCJDは、1996年以
降今日までイギリス人60人以上が罹患している。カナダの血液局は、その現役の
ドナー600,000人中120,000人、即ち22％が1980年以降イギリスを訪問したと推定
している（モントリオールガゼット、1999年５月６日号）。その損失を埋めるた
めに新しいドナーが多く募集され、いくつかの懸念を生じている。そのような懸
念の一つは、新しいドナーの血液は、肝炎およびヒト免疫不全ウイルスのような
疾患に関するスクリーニングが一度に過ぎないために、安全ではないという点で
ある。
【０００８】 したがって、プリオン感染血液または疾患を大量にスクリーニングするために
適した診断方法が必要である。したがって、PrPCをPrPScと区別する抗体を利用
することは、プリオン疾患の検査を開発するために非常に重要であろう。さらに
、プリオン疾患を予防および／または治療する治療物質も必要である。
【０００９】発明の概要 本明細書において述べるように、PrPのYYX連続エピトープは、PrPScに対して
特異的な抗体を産生するために有用であることを示す証拠が存在する。特に、本
発明者らは、PrP配列からの短い連続的な合成ペプチドを利用する免疫プロトコ
ールによって、PrPScに対して特異的な高親和性ポリクローナル抗体とモノクロ
ーナル抗体が産生されることを証明した。その上、そのような抗体はまた、PrPC との検出可能な反応性がないことも認められた。一つの例において、PrPCからPr
PScへの立体構造変化の分子モデリング分析に基づいて、蛋白質のPrPScイソ型の
分子表面上で溶媒接触性である配列を予測するYYR配列を含むペプチドを選択し
た。
【００１０】 したがって、本発明は、哺乳類PrPScの連続YYXエピトープに対して高い結合親
和性で結合するエピトープ特異的抗PrP抗体またはその断片を特徴とする。好ま
しくは、抗体は、哺乳類PrPScのYYRエピトープ；YYQエピトープ；またはYYDエピ
トープに結合する。好ましい態様において、抗体はモノクローナル抗体またはポ
リクローナル抗体である。そのような抗体には、IgG、IgM、IgE、IgD、またはIg
A抗体と共に、Fab断片またはFv断片のような断片が含まれる。そのような抗PrP
抗体は特定のPrPScエピトープに対して作製することが都合がよい。さらに、PrP Sc に結合する抗体を用いて、標準的な診断アッセイ法においてPrPScを定量する
ことができる。
【００１１】 なおさらに関連する局面において、本発明は、感染疾患特異的プリオンを診断
するための免疫学的検出技法にエピトープ特異的抗PrP抗体を用いることを特徴
とする。PrPScと特異的に反応する抗PrP抗体は、本明細書に説明するように、適
当に適合させたPrPペプチドを用いることによって調製することができる。本発
明は特に、PrPペプチド、および／またはエピトープ特異的抗PrP抗体を含む診断
補助剤に関する。さらに、本発明は、疾患特異的プリオン蛋白質に選択的に結合
して正常なプリオン蛋白質には結合しない抗体に関する。
【００１２】 もう一つの局面において、本発明は、配列チロシン-チロシン-アルギニン（YY
R）を有するプリオン蛋白質ペプチドを特徴とする。好ましくは、ペプチドは、
ペプチドをより免疫原性にして、高親和性抗PrP抗体の調製を可能にする担体に
結合するトリペプチドである。そのようなトリペプチドの合成を本明細書に記載
する。本発明に従って、そのような短いペプチド（例えば、YYR、YYQ、またはYY
Dペプチド）は、プリオン蛋白質のPrPScイソ型において接触性であるが、正常な
PrPCイソ型では接触性でなく、および／または抗体検出を可能にするようにPrPS c において集合している決定因子を表す。例えば、YYRトリペプチドは３つのプリ
オン蛋白質エピトープの２つの中に含まれる；しかし、このトリペプチドは、Pr
PSc免疫反応性の特異的根拠としてこれまでに同定されていない。その上、その
ような配列は、ウシ、ヒト、ヒツジ、マウスおよびハムスターを含むがこれらに
限定されない多くの種に対して高度に保存されている（図２）。
【００１３】 さらにもう一つの局面において、本発明は下記の式を有する合成ペプチドを特
徴とする： 式中、Aは任意のアミノ酸であるか、または存在せず；Bは任意のアミノ酸である
か、または存在せず；およびnは０から10までの数である。好ましい態様におい
て、AおよびBの少なくとも１つはチロシンではない。他の好ましい態様において
、AまたはBは、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニ
ルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオ
ニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン
、バリン、またはトリプトファンから選択される。他の好ましい態様において、
ペプチドは免疫学的担体に結合している。そのようなペプチドには、A-Tyr-Tyr-
Arg（配列番号：12）；A-Tyr-Tyr-Gln（配列番号：13）；A-Tyr-Tyr-Asp（配列
番号：14）；またはそのいかなる薬学的に許容される塩も含まれるがこれらに限
定されることはない。
【００１４】 さらにもう一つの局面において、本発明は、下記の式を有する合成ペプチドを
特徴とする。 式中、Aは任意のアミノ酸であるか、または存在せず；Bは任意のアミノ酸である
か、または存在せず；Cは任意のアミノ酸であるか、または存在せず；Dは任意の
アミノ酸であるか、または存在せず；およびnは０から10までの数である。好ま
しい態様において、A、B、CまたはDの少なくとも１つはチロシンではない。他の
好ましい態様において、A、B、CまたはDは、アラニン、システイン、アスパラギ
ン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン
、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アル
ギニン、セリン、トレオニン、バリン、またはトリプトファンから選択される。
さらに他の好ましい態様において、Aは、アラニン、システイン、アスパラギン
酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、
リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギ
ニン、セリン、トレオニン、バリン、またはトリプトファンから選択され、B、C
およびDは、アルギニン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニ
ルアラニン、またはトリプトファンから選択される。例としてのペプチドには またはその薬学的に許容される塩が含まれるがこれらに限定されることはない。
他の態様において、ペプチドは免疫学的担体に結合している。
【００１５】 もう一つの局面において、本発明は、以下の一つまたはそれ以上を含む、PrPS c としての抗原性を有する短い合成プリオンペプチド（例えば、アミノ酸３〜10
個、またはアミノ酸４〜12個まで）に関する：マウスPrPのT189〜193に認められ
るトレオニン四反復、またはヒト、ヒツジ、ヤギ、もしくはウシPrPの対応する
アミノ酸残基；マウスPrPのM128、M133、もしくはM153アミノ酸残基、またはヒ
ト、ヒツジ、ヤギ、もしくはウシPrPの対応するアミノ酸残基；マウスPrPのH186
アミノ酸残基またはヒト、ヒツジ、ヤギ、もしくはウシPrPの対応するアミノ酸
残基；マウスPrPのQ159、Q167、Q185、もしくはQ216アミノ酸残基、またはヒト
、ヒツジ、ヤギ、もしくはウシPrPの対応するアミノ酸残基；マウスPrPのN158ア
ミノ酸残基、またはヒト、ヒツジ、ヤギ、もしくはウシPrPの対応するアミノ酸
残基；マウスPrPのM128、M133、もしくはM153アミノ酸残基、またはヒト、ヒツ
ジ、ヤギ、もしくはウシPrPの対応するアミノ酸残基；マウスPrPのL124もしくは
L129アミノ酸残基、またはヒト、ヒツジ、ヤギ、もしくはウシPrPの対応するア
ミノ酸残基；またはマウスPrPのI181もしくはI183アミノ酸残基、またはヒト、
ヒツジ、ヤギ、もしくはウシPrPの対応するアミノ酸残基。
【００１６】 本発明のペプチドは、当技術分野で既知の方法に従って化学合成によって調製
することができる。
【００１７】 さらに、本発明のPrPペプチドは、エピトープ特異的抗PrPSc抗体を調製するた
めに用いることができる。特に、本発明のペプチドは、非常に純粋な物質である
という長所を提供し、例えば、免疫沈降、ELISA、およびフローサイトメトリー
のような標準的な免疫学的アッセイ法においてPrPScを検出するために用いるこ
とができる抗PrP抗体の調製に適している。本発明のPrPペプチド（例えば、YYR
）は、ポリクローナルエピトープ特異的抗PrPSc抗体（抗血清）およびモノクロ
ーナルエピトープ特異的抗PrP抗体の双方を調製するために用いることができる
。これらの抗体は、当技術分野で既知の標準的な方法によって調製され、好まし
くは抗体を産生するための担体材料と結合している。
【００１８】 その上、YYXのPrPSc特異的暴露を利用する化合物を合理的にデザインしてもよ
く、またはYYXと抗YYX抗体との相互作用を模倣する化合物をコンビナトリアルラ
イブラリーから得ることができる。これらの化合物は、プリオン診断において、
またはプリオン疾患の治療として有用である。
【００１９】 もう一つの局面において、本発明は、本発明のPrPペプチドもしくは構造的に
関連する化合物、またはポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体を薬学
的担体中に含む、プリオン疾患を治療および予防するための薬学的調製物を特徴
とする。そのような薬剤は、本発明のPrPペプチドまたはエピトープ特異的抗PrP
抗体を含む。
【００２０】 望ましければ、本発明のペプチドおよび抗体は、薬学的に許容される塩の形で
提供されうる。好ましい塩の例は、治療的に許容される有機塩、例えば、酢酸、
乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸
、サリチル酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはパモン酸と共に
、タンニン酸もしくはカルボキシメチルセルロースのような重合酸、および塩酸
のようなハロゲン化水素酸、硫酸もしくは燐酸のような無機酸の塩である。本発
明のペプチドまたは抗体は、従来の方法の一つにおいて（例えば、経口、非経口
、経皮、または経粘膜）、生体分解性の生体適合性ポリマーを用いる徐放性製剤
において、またはミセル、ゲル、およびリポソームを用いることによって、哺乳
類、特にヒトに投与してもよい。
【００２１】 さらにもう一つの局面において、本発明は、動物（例えば、ヒト、ウシ、ヒツ
ジ、ブタ、ヤギ、イヌ、またはネコ）におけるプリオン疾患を治療または予防す
る方法を特徴とする。一つの好ましい態様において、本方法は、PrPCからPrPSc
への変換を阻害するか、PrPSc：PrPSc凝集体形成を阻害するか、またはPrPCから
PrPScへの集合を阻害する、エピトープ特異的抗PrP抗体もしくはPrPペプチドの
治療的有効量を動物に投与することを含む。PrPペプチドはまた、PrPScに対して
特異的な宿主抗体の産生を刺激することによって、プリオン疾患に対して宿主を
免疫するために用いてもよい。
【００２２】 関連する局面において、本発明は、生体試料においてPrPScを検出する方法お
よびキットを特徴とする。
【００２３】 さらにもう一つの局面において、本発明は、生体試料においてPrPSc汚染を除
去する方法およびキットを特徴とする。好ましい態様において、方法は以下の段
階を含む：（a）生体試料をポリクローナルまたはモノクローナル抗体（または
その断片もしくは類似体）によって処理し、処理によって抗体：PrPSc複合体が
形成される段階；および（b）抗体：PrPSc複合体を生体試料から回収する段階。
そのような汚染除去技法はまた、PrPScを除去または不活化するために生体試料
を抗体（またはその断片もしくは類似体）によって潅流する方法を用いることを
含んでもよい。
【００２４】 もう一つの局面において、本発明は、プリオン疾患を治療する化合物を同定す
る方法を特徴とする。方法は、（a）試験化合物の存在下でPrPScに対する抗YYX
抗体の結合を測定する段階；および（b）試験化合物の非存在下でPrPScに対する
抗YYX抗体の結合を測定する段階を含み；試験化合物の存在下でのPrPScに対する
抗YYX抗体の結合レベルが、試験化合物の非存在下でのPrPScに対する抗YYX抗体
の結合レベルより低い場合に、試験化合物が、プリオン疾患を治療するための治
療用化合物である可能性を有することを示している。好ましくは、抗YYX抗体は
、抗YYR抗体、抗YYD抗体、または抗YYQ抗体である。
【００２５】 もう一つの局面において、本発明は、プリオン疾患を診断するための化合物を
同定する方法を提供する。方法は、（a）試験化合物の存在下でPrPScに対する抗
YYX抗体の結合を測定する段階；および（b）試験化合物の非存在下でPrPScに対
する抗YYX抗体の結合を測定する段階を含み；試験化合物の存在下でのPrPScに対
する抗YYX抗体の結合レベルが、試験化合物の非存在下でのPrPScに対する抗YYX
抗体の結合レベルより低い場合に、試験化合物が、プリオン疾患を診断するため
の化合物である可能性を有することを示している。
【００２６】 関連する局面において、本発明は、上記の方法のいずれかによって同定された
治療用化合物および診断用化合物を特徴とする。
【００２７】 「高い結合親和性」とは、親和性定数が10μM未満、好ましくは１μM未満、よ
り好ましくは100 nM未満、および最も好ましくは10 nM未満での結合を意味する
。
【００２８】 「プリオン疾患」とは、プリオン媒介性の急速に進行する致死性で治療できな
い脳変性障害群を意味し、ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）、
変異型CJD、医原性CJD、家族性CJD、クールー、ゲルストマン・ストラウスラー
症候群、および致死性家族性不眠症（プルシナー（Prusiner）、Science 252：1
515〜1522、1991）、ヒツジおよびヤギにおけるスクレイピー、ならびにウシに
おける海綿状脳症と共に、他の反芻類およびネコにおける最近記述されているプ
リオン疾患を含むがこれらに限定されることはない。
【００２９】 「プリオン疾患の治療」とは、プリオン疾患に関連した任意の症状、特に海綿
状の変化、神経細胞喪失、星状細胞増殖、PrPSc蛋白質の蓄積、痴呆、または死
亡に至る症状の発現を減少、予防、安定化、または遅延させることを意味する。
【００３０】 「精製抗体」とは、それが天然で会合する蛋白質および天然に存在する有機分
子を含まない重量で少なくとも60％の抗体を意味する。好ましくは調製物は、重
量で少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、および最も好ましくは少
なくとも99％の抗体、例えばYYX特異的抗体（例えば、YYR-、YYQ-、またはYYD-
特異的抗体）である。精製抗体は、例えば、基質結合YYXと標準的な技法を用い
るアフィニティクロマトグラフィーによって得てもよい。
【００３１】 「YYX」とは、配列チロシン-チロシン-Xを有するペプチドを意味し、式中、X
は任意のアミノ酸である。「YYR」は、配列「チロシン-チロシン-アルギニン」
を有するペプチドを意味する。「YYQ」は、配列「チロシン-チロシン-グルタミ
ン」を有するペプチドを意味する。「YYD」は、配列「チロシン-チロシン-アス
パラギン酸」を有するペプチドを意味する。
【００３２】 「治療的組成物」とは、動物、例えばヒト、家畜種（例えば、ウシ、ヤギ、ブ
タ、もしくはヒツジ）のような哺乳類、またはペット種に投与するために適当な
組成物を意味する。
【００３３】 「低分子」とは、分子量が10,000ダルトンより小さいまたはそれに等しい、好
ましくは1000ダルトンより小さいまたはそれに等しい、および最も好ましくは50
0ダルトンより小さいまたはそれに等しい化合物を意味する。
【００３４】 本発明の他の特徴および長所は、その好ましい態様に関する以下の詳細な説明
および特許請求の範囲から明らかとなると思われる。
【００３５】発明の詳細な説明 本発明者らは、PrPの一つまたはそれ以上の部位におけるYYXエピトープ（例え
ば、YYR）のチロシンの選択した芳香族側鎖の方向が、PrPScの分子表面に対して
特異的な連続的免疫エピトープを定義することを証明したが、公表されたPrPC N
MR構造解析によれば（リーク（Riek）ら、Nature 382：180、1996；ドネ（Donne
）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：13452〜7，1997；ザーン（Zahn）ら、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 97：145〜50、2000）、同じチロシン側鎖がPrPC立
体構造では接触性でないことが知られている。この発見によって、診断および治
療目的のために用いてもよいPrPSc特異的抗体の産生のみならず、プリオンとそ
の関連疾患および障害を検出または治療するために有用な新規化合物のスクリー
ニングの開発が促進される。
【００３６】PrPScに対するエピトープ特異的抗体の産生 抗体は、独自のアミノ酸決定因子またはエピトープによって蛋白質を特異的に
認識する。これらの決定因子またはエピトープは、直鎖状のアミノ酸配列である
か、または三次元空間においてアミノ酸によって形成される明確な立体構造であ
る可能性がある。PrPCからPrPScへの変換が、蛋白質の立体構造に大きい変化を
伴うことを考慮すれば、変換によって独自のエピトープが形成される、または出
現する可能性がある。したがって、本明細書において記載するように、本発明者
らはプリオン蛋白質変換に関するいわゆる側鎖仮説を展開した。このスキームに
よれば、PrPCの溶媒非接触性の内部構造に通常封鎖されている側鎖は、PrPScで
は溶媒接触性である可能性がある。したがって、安定なPrPSc様中間体における
疎水性残基の溶媒に対する暴露が増加していることから示されるように、新たに
暴露された側鎖の多数が疎水性であると予想される（スウィートニッキ（Swietn
icki）ら、J. Biol. Chem. 272：27517〜20、1997）。これらの疎水性側鎖の突
出は、単独またはPrPCの分子表面に通常存在する他の側鎖と組み合わさって、Pr
PScの抗体認識に関する独自のエピトープの基礎を形成する。その上、これらの
表面接触性の疎水性側鎖は、PrPScの溶解度と凝集特徴を変化させると予想され
、この構造的イソ型についてすでに知られている特性と釣り合う。新たな接触性
側鎖も同様に、PrPCからPrPScへの集合プロセスに関与する可能性がある。
【００３７】 この仮説を調べることは、その情報が蛍光分光試験によって得られる、２つの
疎水性アミノ酸側鎖であるトリプトファンとチロシン環の方向を調べることによ
ってインビトロで開始した。第一に、PrPCからPrPScへの変換の特徴を示す構造
変化をモデルとするために、マウス組換え型PrPCのβシート転移を低いpHによっ
て誘導した（ホルネマン＆グロックシュバー（Hornemann and Glockshuber）、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 95：6010、1998）。図1Aは、pH 7.0から3.0の円偏
光二色性による分子楕円性のシフトを示し、これはPrPCの優勢なαヘリックスか
ら優勢なβシートへの変化と一致する（適当なそれぞれの周波数での二重から一
重最小値へのスペクトルのシフト）。
【００３８】 第二に、組換え型PrPCにおけるチロシンとトリプトファン側鎖のpH滴定による
溶媒接触性を、標準的な蛍光分光法を用いて調べた（図1B）。この試験は他のア
ミノ酸側鎖に隣接する（すなわち、蛋白質の内部構造において）芳香族側鎖が、
水に暴露された芳香族側鎖とは異なる特異的蛍光を有するという原理に基づいて
いる（例えば、チン（Chin）ら、Biochemistry 31：1945〜51、1992）。組換え
型マウスPrPCを低いpHに供すると、トリプトファンとチロシン芳香族基は、異な
る溶媒暴露と一致して反対の挙動を示した。
【００３９】 ヒト、ウシ、およびマウスPrPCのアミノ酸配列を調べると、チロシン残基13個
が明らかになった（図２）。ヒトとウシPrPにおけるチロシン11個と、マウスPrP
における10個は、蛋白質のC末端2/3に含まれ、これはプリオンの感染性にとって
必要かつ十分であるプロテアーゼ抵抗性構造ドメインを含む。注目すべきことは
、このドメインにおけるチロシン６個は、異常な「YY」対モチーフに存在する点
である（図２）。３つの対の２つは、C-末端アルギニン（R）と結合するが、第
三のYYモチーフは、マウスおよびハムスターではC-末端のアスパラギン酸（D）
と結合しており、またはウシ、ヒツジ、およびヒトではグルタミン（Q）に結合
している。Rは、末端グアニド基を含むが、QおよびDは、カルボキサミドおよび
カルボニル結合を含み、これらは平面である。YYモチーフにおけるそのような末
端の平面アミノ酸は、暴露されたチロシン環と相互作用して、免疫認識にとって
それらを安定化させ、または安定にする可能性がある。
【００４０】 さらに、マウス、ハムスター、およびヒトPrPCのNMR解析構造を調べると、同
定されたチロシン対のいずれも、分子表面上で接触性の直交縦列立体配置におい
て双方の環の方向を有しないことが判明した（リーク（Riek）ら、Nature 382：
180、1996；ドネ（Donne）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：13452、1997；
ザーン（Zahn）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97：145〜50、2000）（図３）
。酸処理したPrPCまたはPrPScの表面上のチロシンの暴露の増加が、チロシン対
のいくつかに関連していると推測することは妥当である。チロシン環の一つの安
定な立体構造はパイスタッキング（pi-stacking）と呼ばれ、この場合、２つの
環がわずかにずれて平行となるように積み重ねられる（図４に略図で示す）。安
定であるが、チロシン環に接触性であるパイスタッキングされた表面に関して構
造データベースを予備的に検索したところ、類似の方向を有する他の蛋白質は４
個同定されたに過ぎず、そのいずれも膜蛋白質のエクトドメインに存在しない。
したがって、新規PrPSc-特異的エピトープは、アルギニン、グルタミン、および
アスパラギン酸の関与によって、またはそれらの関与なく、パイスタッキング方
向におけるチロシン対であると考えられる（これらは、平面であり、同様に、そ
の先行するチロシンとのパイスタッキング相互作用に関与する可能性がある）。
【００４１】 PrPScにおけるチロシン側鎖の方向の変化の他に、同様に、３つのYYRモチーフ
は、互いにその近位性がシフトするために、PrPScにおいてより免疫学的に接触
性となる可能性がある。典型的なIgG抗体は、フレキシブルなヒンジ領域によっ
て１つの定常領域に結合されている２つの同一の抗原結合領域を含む。PrPCから
PrPScへの立体構造の変化のあいだに、YYRモチーフはおそらく互いに相対的に移
動して（コース（Korth）ら、Nature 390：74〜77、1997）、相対的に離れてい
る場所から相対的に近い場所に移動する。さらに、PrPCにおけるYYRモチーフのI
gG認識は、２つの重要なモチーフが分子の異なる面に存在するために不都合とな
る可能性があり、そのため認識は、双方のIgG抗原結合領域が認識に関与してい
る高結合力相互作用よりむしろ結合力の低い単価特性となる。
【００４２】 ウシPrPcおよびPrPScでの本発明者らのデータは、抗YYR抗体が、免疫沈降およ
びELISAの試験によってPrPScを特異的に認識すること（下記参照）を示し、この
ことは、PrPScにおけるチロシン側鎖の接触性の変化および／またはYYRエピトー
プの近位性と一致する。アミノ酸残基アルギニンも同様に、YYR抗体の産生およ
び認識特異性において重要であると思われる。極性のチロシン側鎖とアルギニン
の非常に塩基性の側鎖との静電気的相互作用は、YYRトリペプチドによる免疫と
、誘導された抗体によるPrPScの認識の双方においてYYRペプチドの性質に関与す
る。末端のPrPループにおける第三のYY二量体モチーフは、いくつかの種（ヒト
およびウシを含む）においてグルタミンに関連していることは顕著であり、これ
はアルギニンによる部分的に保存的な置換であり、およびいくつかの他の種（マ
ウスおよびハムスターを含む）ではアスパラギン酸による置換であるが、これは
保存的置換ではない。平面側鎖を有する例としてのアミノ酸には、アルギニン、
アスパラギン酸、およびグルタミンが含まれる。
【００４３】 PrPCからPrPScへの立体構造の変換に付帯的なアミノ酸側鎖の暴露現象は、チ
ロシン対に独自に当てはまらない可能性がある。大型（bulky）側鎖を有する他
のアミノ酸は、これらの側鎖がPrPScの中心においてあまり認容されないことが
判明する可能性があり、そしてこれらの側鎖は、単独または他の局所部分と組み
合わせて、PrPScの独自の免疫反応性の基礎を形成する可能性がある。PrPCとPrP Sc のあいだで異なる免疫学的エピトープは、PrPScの診断試験の基礎となり、同
様に、プリオン疾患に対するヒトおよび動物の治療および免疫において有用であ
る。疎水性側鎖の暴露は、PrPCと比較すると、PrPScの疎水性の増加および凝集
の増強に関係すると考えられる。
【００４４】 PrPCにおいて溶媒非接触性の大型側鎖の例には、以下のものが含まれる（アミ
ノ酸残基は、マウスPrP配列に従って番号をつけている）： １．Y127、Y156、Y217を含むYYXモチーフに含まれないチロシン。 ２．部分的に溶媒に暴露されていないトレオニン四反復、T189〜193。 ３．ヒスチジンH186。 ４．グルタミンQ159、Q167、Q185、Q216。 ５．アスパラギンN158。 ６．メチオニンM128、M133、M153。 ７．ロイシンL124、L129。 ８．イソロイシンI181、I183。
【００４５】 下記のように、YYRエピトープを含むペプチドを合成した。これらのペプチド
を担体と結合して、これを用いてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体
を産生するためにウサギまたはマウスを免疫した。次に、ポリクローナル抗体お
よびモノクローナル抗体のPrPScに対する特異性を調べた。結果は、そのような
抗体がPrPScに対して高い結合親和性で特異的に結合することを示した。
【００４６】 以下に記載する実施例は、本発明を説明する目的で提供されるのであって、制
限するものとして解釈してはならない。
【００４７】PrPSc特異的抗体 ポリクローナル抗血清、pAbC2を、KLHに結合したYYRペプチドに対してウサギ
において作製した。血清を免疫レジメの後に各ウサギから採取して、総IgGをプ
ロテインAカラムを用いて精製した。次に、これらの試料の抗PrPSc活性を、正常
またはスクレイピー感染マウスからの脳ホモジネートを用いた免疫沈降反応にお
いて調べた。これらの試験において用いられた脳ホモジネートの初回分析から、
正常な脳抽出物においてPrPC（図５、レーン１）が、そして感染試料においてPr
P（図５、レーン３）が検出可能な量で存在することが判明した。予想されたよ
うに、PrPCは、プロテナーゼK（PK）（図５、レーン２）による消化に対して感
受性があったのに対し、PrPScではPK消化を行うと、プロテアーゼ抵抗性中心（P
rP 27〜30と呼ばれる）の特徴的な移動シフトが明らかとなった（図５、レーン
４）。これらの脳ホモジネートをBSAカップリングした磁気ビーズと共にインキ
ュベートしたところ、いかなる検出可能なPrPも沈殿しなかったのに対し（図５
、レーン５〜８）、試料を6H4（PrP特異的モノクローナル抗体）とカップリング
したビーズと共にインキュベートすると、正常な脳からPrPC（図５、レーン９）
、そして感染した脳からPrPSc（図５、レーン11）およびPrP27-30（図５、レー
ン12）が免疫沈降した。pAbC2 IgGをビーズにカップリングして、正常な脳ホモ
ジネートと共にインキュベートしても、検出可能なPrPは免疫沈降しなかった（
図６、レーン９および10）。顕著に、pAbC2 IgGカップリングビーズを感染試料
と共にインキュベートすると、PrPSc（図６、レーン11）およびPrP 27〜30（図
６、レーン12）を免疫沈降した。再度、PrPCとPrPScの検出可能な量（図６、レ
ーン１〜４）を有するこれらの組織と、BSAカップリングしたビーズは、いかな
るPrPも免疫沈降できなかった（図６、レーン５〜８）。
【００４８】 さらに、類似の実験によって、pAbC2 IgGが、6H4と比較してBSE感染脳からの
ウシPrPScを特異的に免疫沈降させることが示された（図７）。その上、pAbC2抗
体は、可溶性PC2を捕獲試薬として用いたELISA系においてウシPrPScを認識しう
るが、組換え型ウシPrPCをプレートに直接吸着させるELISA試験では、6H4モノク
ローナル抗体を用いたその検出可能性にもかかわらず、シグナルを生じない（図
16）。抗YYR IgGは、下記により詳細に示すマウス抗YYRモノクローナル抗体によ
る試験と同様に、ウェスタンブロッティングにおいて変性組換え型ウシPrPCを認
識しない（データは示していない）。
【００４９】 ヤギポリクローナル抗血清も同様に、KLHに結合したYYRに対して作製した。血
清を採取して、総IgGを硫酸アンモニウム沈殿によって単離した。YYR反応性IgG
も同様に、YYR結合カラムを用いるアフィニティクロマトグラフィーによって同
じ抗血清から精製した。これらの抗血清に類似の組のスクリーニングを行って、
上記のように免疫沈降反応を確認した。免疫したヤギ三匹中一匹がPrPScに特異
的な抗血清（p165）を産生し（図８）、さらにこの特徴付けを行った。これまで
の実験のように、6H4カップリングビーズは、感染マウスの脳からPrPCとPrPScの
双方を区別なく沈殿させた（図８、レーン10および11）。PrP 27-30の6H4免疫沈
降は、時によくわからない理由で認められるが、この実験では認めなかった（図
８、レーン12）。免疫したヤギからの総IgGをビーズにカップリングさせると、
正常および感染マウス脳ホモジネートから沈殿するのはたとえあったとしても少
量の材料であった（図８、レーン４、５および６）。対照的に、YYR-アフィニテ
ィ精製IgG（p165）を磁気ビーズにカップリングさせると、感染したマウス脳か
らPrPScのみが沈殿した（図８、レーン２）。ウサギからのpAbC2ポリクローナル
抗体とは異なり、ヤギの抗YYRポリクローナル抗体は、PrP 27-30を沈殿させなか
った（図８、レーン３）。これらの抽出物はPK消化を行っても検出可能なPrP 27
-30を含み、モノクローナル抗体（下記参照）を評価する同時の実験は同じホモ
ジネートを用いて、PrP 27-30がPK消化後に検出された（図９、レーン３、６、
および９）。その上、ウェスタンブロットによる脳ホモジネートの分析により、
感染マウスからの脳ホモジネートにおいて検出可能なPrPScおよびPrP 27-30が明
らかとなった（データは示していない）。
【００５０】 ヤギポリクローナル抗体産生の他に、同じPrPSc特異的エピトープに対するモ
ノクローナル抗体も同様に産生されたが、当初のYYRペプチドが１つの連続配列
の中に連結されている当初の抗原の誘導体であった。 は、ペプチド配列におけるYYRエピトープの数を増加させる試みで、そしてチロ
シンスタッキングの機会および／またはパイスタッキングの頻度を増加させる試
みで合成した。その上、プリオン蛋白質におけるYYR配列の一つは当該５種にお
いてアルギニンの後に続く（図２）。 ペプチドをKLHに結合させて、マウスを続いて抗原によって免疫した。これらの
マウスからの脾細胞を単離してFOマウスB細胞株（ATCC CRL-1646）と融合させて
、特異的ハイブリドーマクローンを産生した。ELISAにおいて、もう一つの担体8
mapと結合したYYRと反応したクローンから腹水を産生した。これらの腹水からの
IgGをプロテインAカラムを用いて精製して、標準的な方法でスクリーニングして
確認した。感染マウスからの脳ホモジネートを用いた免疫沈降反応においてPrPS c を特異的に認識するモノクローナル抗体５個を同定した（1A4、6B1、2B5、2C、
および18B）。図９は、これらのモノクローナル抗体の３つ、すなわち1A4、2C、
および6B1に関するPrPScの特異的沈殿を示す。p165に関して認められたように、
p165、1A4、2C、および6B1は、陰性対照抗体、19E（図９、レーン10および11）
および非識別抗体6H4（図９、レーン14および15）と比較してPrPScを特異的に沈
殿した（図９、レーン１、３、および５をそれぞれ、レーン２、４、および６と
比較する）。p165とは対照的に、これらのPrPSc特異的抗体は３つ全てがPrP 27-
30を沈殿した（図９、レーン３、６および９）。正常マウス脳ホモジネートを用
いた1A4、2C、および6B1沈殿（図９、レーン１、３および５）および19Eによる
沈殿において存在するかすかなバンドは、おそらくPrPCの非特異的バックグラウ
ンド沈殿と、磁気ビーズから溶出したマウスIgG軽鎖および重鎖との組み合わせ
を表し、これらはヤギ抗マウスIg-HRP結合体によってその後検出された（図10）
。
【００５１】 PrPSc特異的モノクローナル抗体の連続的な評価から、それらが立体構造依存
的エピトープを通じてPrPScの異なるマウス系統を認識することができることが
判明した。図11に示すように、1A4は、マウススクレイピーのME7または139A株の
いずれかに感染させた異なるマウスから調製した多数の抽出物についての免疫沈
降において用いた。これらの実験において、1A4は、株によらず、PrPScおよびPr
P 27-30を特異的に沈殿させることが判明した。これはまた、他のPrPScの特異的
モノクローナル抗体についても認められた（データは示していない）。脳ホモジ
ネート（正常、ME7および139A感染）を非還元条件においてSDS-PAGEゲルにおい
て電気泳動して、PrPSc特異的モノクローナル抗体の一つ（1A4もしくは6B1）ま
たは6H4によってPrPに関してプロービングすると、6H4のみが変性PrPCおよびPrP Sc を検出できることは明らかであった。1A4および6B1に関して、PrPSc特異的決
定因子は、試料を変性させると失われており、エピトープの立体構造感受性を確
立した。
【００５２】 さらに、YYR反応性モノクローナル抗体は、正常およびPrP-/-ノックアウトマ
ウスからの脾細胞または直ちに解離したエクスビボ脳細胞の表面上のいかなる細
胞表面蛋白質も認識しないことが判明した。生存マウス脾細胞および脳細胞は、
脾細胞と脳細胞浮遊液をフィコール勾配によって遠心することによって単離した
。図13に示すように、脾細胞を記載のFITC結合抗体（実線）またはアイソタイプ
マッチFITC標識対照抗体（破線）によって染色した。非生存細胞は、ヨウ化プロ
ピジウムによる分析から除外した。脾細胞（図13）または脳細胞（示していない
）上での表面免疫反応性がないことは、上記の構造検索によって示唆されるよう
に、YYR立体構造エピトープがまれであることを示している。その上、認識され
うるシグナルがないことは、脾細胞と他の試験細胞の細胞表面でのPrPSc免疫反
応性の試験に関して許容されるバックグラウンドを提供する。細胞表面PrPScの
検出は、ヒトおよび動物プリオン疾患感染症に関する診断試験として有用である
。最後に、細胞表面免疫反応性がないことは、脾細胞と脳細胞が6H4免疫組織化
学によって検出可能なPrPCを有する（示していない）ことから、抗YYR抗体がPrP C を認識しないという事実の独立した確認を提供する。
【００５３】 YYRエピトープの種特異性もまた調べた。スクレイピー感染ハムスターからの
脳ホモジネートを用いる試験において、上記のPrPSc特異的モノクローナル抗体
およびポリクローナル抗体は、ハムスターPrPScを免疫沈降することが判明した
（図14）。さらに、感染マウス組織による試験において明らかになったPrPScお
よびPrP 27-30に関する類似の特異性も認められた。例えば、モノクローナル抗
体1A4は、PrPScおよびPrP 27-30を特異的に免疫沈降するが（図14、レーン３お
よび４）、ポリクローナルヤギ抗体p165は、感染したハムスター脳（図14、レー
ン７、８、９および10）からのPrPScのみを特異的に免疫沈降する。ハムスター
の他に、感染したヒツジ、ウシ、およびヒト組織からのPrPScは、望ましければ
、本明細書に記載のいかなる技術も用いて特異的に沈降する可能性がある。
【００５４】材料および方法 上記のこれらのPrPSc特異的抗体は、以下の材料および方法を用いて得て試験
した。
【００５５】円偏光二色性 円偏光二色性は、ホルネマン＆グロックシュバー（Hornemann and Glockshube
r、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95：6010、1998）によって記載された方法に従
って実施した。遠紫外線円偏光二色性スペクトルは、アビブ円偏光二色性分光計
モデル62DS（レークウッド、ニュージャージー州）上で光路0.1 cmの石英のセル
を用いて25℃で記録した。1.0 nmステップで、1.0 nmバンド幅、および採取時間
４秒/ステップで、195 nmから260 nmまでのスペクトルを得た。実験データは、
平均残基楕円性として表記した（degθcm2mol-1）。
【００５６】蛍光分光光度計 蛍光分光法は、チンら（Chin、Biochemistry 31：1945〜51、1992）に記載さ
れた方法に従って実施した。
【００５７】YYRペプチドを免疫するための調製物 PrPScに対する抗体を作製するために、アミノ酸配列 を有するペプチドを合成して、KLHと結合させて、周知の技術を用いてウサギに
筋肉内注射した。
【００５８】 ペプチドのアミノ末端において、ペプチドを蛋白質担体と結合させるために、
システイン残基を付加した。ペプチドのアミノ基はアセチル化によってブロック
して、ペプチドのカルボキシル基はアミド化によってブロックした。
【００５９】ペプチド合成 ペプチドは、手動または自動（MPS396ペプチドシンセサイザー、アドバンスド
ケムテック社）の固相ペプチド合成法を用いて合成した。アミノ酸残基のカップ
リングは、Fmocペプチド合成化学を用いて行った（フィールズ（Fields）ら、19
90、IJPPR 35、161）。合成は、ワングまたはアミドリンク樹脂上で、アミノ酸
の側鎖を完全に保護して行った。アミノ酸のα-NH2基はFmoc基によって保護され
たため、三官能基アミノ酸の側鎖に関して以下の保護基を選択した：
【００６０】 BOP、PyBOP、またはTBTUは、カップリング反応の化学および難しさに応じて活
性化剤として用いた。化学物質は全て、アドバンスドケムテック社、バケム社、
およびカルビオケム／ノバビオケム社から購入した。配列の残基間の各ペプチド
結合の形成は、カップリング試薬３〜６倍過剰量を用いて、そしていわゆる二重
カップリングを用いて確実にした；このことは、成長しつつあるペプチド鎖に付
加される各アミノ酸に関して、カップリング反応を繰り返すことを意味する。
【００６１】樹脂からのフルオペプチドの切断 合成後、ペプチドを切断混合物として試薬Kを用いて樹脂から切断した：水（2
.5％）、TIS（2.5％）、EDT（2.5％）、TFA（92.5％）。次に、ペプチドを冷ジ
エチルエーテルによって沈殿させた。沈殿物を遠心して、ジエチルエーテルで３
回洗浄し、20〜50％AcCN/水混合液に溶解して、凍結乾燥した。粗産物の分析は
、分析的RP-HPLCおよびエレクトロスプレーMSを用いて実施した。
【００６２】HPLC精製 粗ペプチドは、バイダックC18カラム2.5×25 cm上で、0.06％TFA（勾配１％/
分、流速10 ml/分）を加えた10〜50％アセトニトリル水溶液の直線勾配を用いて
、UVを215 nmと254 nmでモニターするRP-HPLC（逆相高速液体クロマトグラフィ
ー）によって精製した。分析的HPLCを用いて、分画の純度を推定した。最終産物
は凍結乾燥ペプチドとして得て、これは分析的HPLC（バイダックC18、0.46×25
cm、10〜60％アセトニトリル水溶液の直線勾配、0.1％TFA、１％/分、流速１ml/
分、215 nmおよび254 nmでのUV吸収によって検出）によって、純度が少なくとも
95％であると推定された。純粋なペプチドは、標準的な技法に従って、SCIEX AP
I III質量分析計を用いて分子量分析によって同定した。
【００６３】分析データ ペプチドのRP-HPLC上での滞留時間は、21.215分であった。ペプチドの理論的
分子量は、644.74であると計算された；分子量分析による実際の分子量は646.5
であることが判明した（MW+H+）。
【００６４】ペプチドと担体とのカップリング ペプチドを担体、この場合、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）とカ
ップリングさせた。そのようなカップリングにとって有用な他の担体には、アル
ブミン、卵白アルブミン、8map、またはライソザイムが含まれるがこれらに限定
されることはない。カップリングは、システインのメルカプト基とのチオエーテ
ル結合によって行う。このタイプの結合は、ペプチドが担体蛋白質と明確にカッ
プリングされるという長所を有する。
【００６５】 KLHとのカップリングは以下のように実施した。ペプチド10 mgを燐酸緩衝液（
PBS１×）２mlに溶解した。KLH（ピアス社、製品番号77100）１mlをペプチド溶
液に加えて、攪拌した（ペプチド１モル/アミノ酸50個）。KLH濃度は10 mg/mlで
あった。グルタルアルデヒド（25％水溶液）20 μlを絶えず攪拌しながらペプチ
ド／担体溶液に加え、１時間インキュベートして、その後グリシン停止溶液を加
えた。PBSに対する透析によってペプチド／担体結合物をペプチドから分離した
。
【００６６】 さらなるYYRペプチド（例えば、 および は、標準的な方法、例えば、本明細書に記載の方法に従って合成した。他の合成
ペプチドは、上記の合成方法を適当に変更することによって調製することができ
る。そのようなペプチドはまた、当技術分野で既知の標準的な方法を用いて特徴
を調べる（例えば本明細書に記載の方法）。
【００６７】ウサギの免疫 標準的な方法を用いてポリクローナル抗体を調製し、３〜８週間間隔の反復追
加注射によって免疫応答を増強した。免疫の成功は、ウェスタンブロットまたは
ELISAまたはその両者において抗体濃度を決定することによって確認した。より
詳しく述べると、PrPScに対するポリクローナル抗体を産生するために、KLHに結
合したトリペプチドYYRを164日免疫レジメに従ってウサギに注射して、その後特
異的抗体を産生した動物から採血した。
【００６８】 免疫前血清を採取するために、ウサギ一羽あたり血液10 mlを免疫前対照とし
て採取した。フロイントの完全アジュバントによって予備的な免疫を行い、その
後フロイントの不完全アジュバント（IFA）（１ml/ウサギ、0.5 ml/大腿）によ
って追加免疫を行った。各注射は、精製ペプチド約200μgで構成された。21、42
、および70日目、IFAと共に追加免疫注射を行った。31、42、および80日目、滴
定のために中心耳動脈から血液10 mlを採取した（６ml/kg/ウサギ）。80日目、
血清の力価をチェックして、さらに４週間間隔で注射を３回行い（IFA）、その1
0日後に採血した。最後の追加免疫の10日後、麻酔したウサギを心穿刺によって
放血して、抗血清を採取した。
【００６９】ヤギの免疫 ヤギポリクローナル抗体を標準的な方法に従って作製した。ヤギ３匹を以下の
ように免疫した。１日目、全てのヤギにYYR-KLH結合体１mgをフロイントの完全
アジュバントと共に一次免疫を行った。追加免疫は、YYR-KLH１mgをフロイント
の不完全アジュバントと共にヤギ３匹中２匹に注射し、第三のヤギにはYYR-8map
結合体１mgをフロイントの不完全アジュバント共に注射することによって行った
。三匹の血液それぞれからの血清試料をYYR-BSA結合体に対する反応性をELISAに
よって調べた。第三の組の血液から、総IgGを硫酸アンモニウム沈殿によって精
製して、YYR-反応性IgGをYYRアフィニティカラムを用いて精製した。IgG分画を
、本明細書に記載のようにPrPScに対する反応性に関して調べた。正確な免疫ス
ケジュールは以下の通りであった：１日目、一次免疫；21日目、初回追加免疫；
30日目、初回採血；46日目、二回目の追加免疫；53日目、二回目の追加免疫；60
日目、二回目の採血；76日目、三回目の追加免疫；83日目、三回目の追加免疫；
および90日目、三回目の採血。
【００７０】 または、本明細書に記載の合成ペプチドおよび標準的なハイブリドーマ技術を
用いてモノクローナル抗体を調製してもよい（例えば、コーラー（Kohler）ら、
Nature 256、1975；コーラー（Kohler）ら、Eur. J. Immunol. 6：511、1976；
コーラー（Kohler）ら、Eur. J. Immunol. 6：292、1976；ハンメルリンク（Ham
merling）ら、「モノクローナル抗体とT細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antib
odies and T Cell Hybridomas）」、エルスビア、ニューヨーク州、1981年；ア
ウスユベール（Ausubel）ら、1999年「分子生物学の現行プロトコール（Current
Protocols in Molecular Biology）」、ウィリー・インターサイエンス、ニュ
ーヨークを参照のこと）。産生されると、モノクローナル抗体も同様に、免疫沈
降およびウェスタンブロット分析によって（例えば、上記のアウスユベール（Au
subel）らに記載の方法を用いて）、特異的PrP認識に関して調べる。
【００７１】マウスの免疫 モノクローナル抗体の産生は以下のように実施した。マウスを、マウスPrP-AP
融合蛋白質を含むバキュロウイルス上清によってフロイントの完全アジュバント
と共に免疫して、二週間後に同じ抗原をフロイントの不完全アジュバントと共に
追加免疫した。免疫２週間後、マウスをPrP-AP上清＋ 結合体100 μgおよび 結合体100 μgの混合物によって追加免疫した。これらのマウスからの脾細胞をF
OマウスB細胞株（ATCC CRL-1646）と融合させて、特異的ハイブリドーマクロー
ンを作製した。ハイブリドーマ上清をELISAによってスクリーニングした。PrP-A
Pまたは 配列に対して反応する上清はなかったが、YYR-8map結合体に反応するクローンが
存在した。
【００７２】抗体の精製 総ウサギIgGは、ファルマシア社のプロテインAハイトラップカラムを用いて、
製造元の推奨に従って血清から精製した。簡単に説明すると、ハイトラップカラ
ムを開始緩衝液（0.2 M燐酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0）のカラム３倍容量によ
って平衡にした。ルアーアダプターを通してシリンジを用いて血清をカラムに適
用した。次に、カラムを開始緩衝液５mlによって洗浄した。結合した蛋白質を0.
1 Mグリシン、pH 3.0によって溶出し、１Mトリス、pH 8.0を含む（50 μl/試料5
00 μl）エッペンドルフチューブに採取した。分画をSDS-PAGE上で分析した。
【００７３】 ヤギポリクローナル抗体は、上記のように血清試料から精製した。
【００７４】 マウスモノクローナル抗体は腹水として産生され、プロテインAカラムキット
（ピアス社）を用いて製造元の指示に従って精製した。簡単に説明すると、腹水
試料を最終比１：１で結合緩衝液によって希釈した。次に試料を、予め結合緩衝
液によって平衡にしたカラムの上部に加えて、マトリクスの中を通過させた。通
過した材料を採取して、結合緩衝液５倍容量によってカラムを洗浄した。マイル
ドな溶出緩衝液をカラムに加えて、マトリクスから結合IgG抗体を放出した。IgG
溶出緩衝液に切り替えることによって、他の抗体アイソタイプを回収した。抗体
は全て１ml分画において回収し、これをBCAによって分析して総蛋白質含有量を
決定し、SDS-PAGE電気泳動によって分析して抗体の純度を決定した。最も高いIg
G収量を含む分画を、これをD塩カラム（ピアス社）に通過させることによって脱
塩した。抗体分画を割付して、PBS中で−80℃で保存した。
【００７５】 次に、上記の技法を用いて産生された抗体を以下のように、高親和性結合に関
して調べた。
【００７６】ウシ脳ホモジネートの調製 ウシ脳ホモジネートを調製するために二つの方法を用いた。一つの方法におい
て（A）、脳の試料を、組織ホモジナイゼーション緩衝液（10％蔗糖、20 mM HEP
ES pH 7.5、２％サルコシル、および５mM EDTA）中でポリトロン（OMNI GLH）を
用いてホモジナイズした。ホモジネートは、最終濃度１％（w/v）で用いた。
【００７７】 第二の方法（B）において、脳ホモジネートは10％（w/v）溶液として調製した
。ウシ脳をダウンスホモジナイザー（テフロン（登録商標）の乳棒）において、
冷溶解緩衝液（100 mM NaCl、10 mM EDTA、0.5％ノニデットP-40、0.5％デオキ
シコール酸ナトリウムのトリスHCl溶液、pH 7.4）２容量中で破砕した。試料を
氷中で20分インキュベートしてから、ホモジナイザーにおいてさらに15回粉砕し
た。細胞破片を４℃、3000 rpmで15分間の遠心によって除去した。次に、上清の
蛋白質含有量を定量した。
【００７８】ハムスターおよびマウスホモジネートの調製 ハムスターまたはマウス脳組織を十分なホモジナイゼーション緩衝液（PBS 、
0.5％NP-40、0.5％デオキシコール酸塩）に加えて10％（重量／容積）ホモジネ
ートを得た。組織を18ゲージ針および22ゲージ針の中を繰り返し通過させること
によってホモジナイズした。細胞の破片を500gで20分を２回連続して遠心するこ
とによって除去した。上清中の総蛋白質は、BCAキット（ピアス社）によって定
量し、ホモジナイゼーション緩衝液を用いて濃度を最終濃度５mg/mlに調節した
。各200 μlを含むアリコットを調製して−80℃で保存した。
【００７９】磁気ビーズ結合体 精製抗体またはBSA 60〜150 μgを、製造元によって提供されたプロトコール
に従って、トシル活性化磁気ビーズ（ダイナル社）６×108個に結合させた。簡
単に説明すると、抗体あたり均一な非結合ビーズ浮遊液１mlを２回洗浄して、抗
体またはBSAを含むPBS pH 7.4に再浮遊させた。混合物をローター上で37℃で20
〜24時間インキュベートした。次に、混合物を回旋させながらPBS 0.1％BSA中で
５分間２回洗浄し、ブロッキング緩衝液（0.2 MトリスpH 8.5、0.1％BSA）中で
回旋させながら37℃で４時間インキュベートした。PBS 0.1％BSAによってさらに
５分間洗浄した後、抗体結合ビーズ結合体をPBS 0.1％BSA１％ツイーン-20中で1
0分間洗浄して、PBS 0.1％BSAによって再度洗浄し、４℃で保存した。
【００８０】プロテナーゼK消化 ウシ脳ホモジネートをプロテナーゼK溶液（100 μg/ml）と共に50℃で30分間
インキュベートした。消化は、プロテアーゼ阻害剤PMSF（２mM）によって停止さ
せた。
【００８１】 マウスおよびハムスター脳ホモジネートを最終濃度45 μg/mlのプロテナーゼK
と共に37℃で30分消化した。反応は19 mM PMSF最終濃度を加えることによって停
止させた。
【００８２】免疫沈降 脳抽出物10 μlを免疫沈降緩衝液（PBS３％NP-40、３％ツイーン20）950 μl
に加え、37℃で30〜60分インキュベートした。PrP 27-30のビーズ結合体との反
応性を評価する実験の場合、１ mg/mlプロテナーゼK50 μlを加えることによっ
て、インキュベーションを開始した。プロテナーゼKによって処理しない試料は
なお、適当な時間37℃でインキュベートした。インキュベートした後、100 mM P
MSF溶液60 μlを双方の組の試験管に加えた。次に、再浮遊させたビーズ結合物1
00 μlを混合物に加えて、室温で２時間回旋させながらインキュベートした。ビ
ーズを洗浄緩衝液（PBS２％NP-40２％ツイーン-20）によって３回洗浄して、各
洗浄後攪拌して再浮遊させた。最後に洗浄した後、ビーズを２×ローディング緩
衝液（100 mMトリスpH 6.8、４％SDS、0.015％ブロモフェノールブルー、20％グ
リセロール）20 μlに再浮遊させ、95℃で３分間加熱した。
【００８３】ウェスタンブロット 脳ホモジネートのPrPSc含有量は、標準的な方法に従ってウェスタンブロッテ
ィングによって決定した。蛋白質試料を２×試料緩衝液と１：１の比で混合し、
100℃で５分間沸騰させた。SDS-PAGE分析は標準的な方法に従って実施した。試
料を、予め染色した分子量マーカー（バイオラド社）と共に予め形成された15％
アクリルアミドゲル（バイオラド社）に適用した。ブロモフェノールブルー色素
の先端がゲルの底に達するまで、ゲルを100 Vで泳動させた。分離した蛋白質をP
VDFメンブレンに100 Vで１時間転写した。メンブレンをブロッキング緩衝液にお
いて30分ブロックし、その後これをTBSTによって３回洗浄した。次に、メンブレ
ンを変性PrPに特異的な抗体と共に室温で２時間インキュベートした。メンブレ
ンを上記のように洗浄してから、ヤギ抗マウスIgGアルカリホスファターゼ結合
二次抗体（TBSTによって5000倍希釈）と共にインキュベートした。洗浄後、化学
発光基質CDPスターによって発光させて、シグナルをX線フィルムに露出した。
【００８４】フローサイトメトリー 組織をワイヤーメッシュに通過させることによって、Balb/cマウスから脾細胞
浮遊液を調製した。細胞をCa2+またはMg2+を含まない冷ダルベッコPBSによって
一度洗浄して、リンフォライト（チェダーレーン）を細胞浮遊液の下に敷いて、
1300 gで20分間遠心することによって生存細胞を単離した。細胞を、Ca2+または
Mg2+、2.5％ウシ胎児血清を含まない冷ダルベッコPBSによって１回洗浄し、丸底
96ウェルプレートにおいてウェルあたり細胞0.5×106個を加えた。細胞を遠心し
て、抗体-FITC結合体50 μlにCa2+またはMg2+、2.5％ウシ胎児血清を含まないダ
ルベッコPBS中で最終濃度1/10で再浮遊させて、氷中で15分間置いた。細胞を、C
a2+またはMg2+、2.5％ウシ胎児血清を含まないダルベッコPBSによって２回洗浄
して、ヨウ化プロピジウム１μg/mlを含む同じ培地に再浮遊させた。細胞をコー
ルターエピックスフローサイトメーターによって分析して、大きさと粒度（前方
および側方散乱）および生存率（ヨウ化プロピジウム蛍光の排除）によるゲート
で制御した。
【００８５】FITC抗体結合 蛍光標識mAbは、フルオロタグキット（シグマ社）を用いて、製造元の指示に
従って作製した。簡単に説明すると、各抗体0.5 mgを濃重炭酸緩衝液によってpH
９に上昇させ、FITC保存溶液を加えてFITC：抗体比20：１を得た。次に、バイア
ルを室温で２時間インキュベートした。混合物をセファデックスG-25Mカラムに
通過させることによって、標識抗体を遊離のFITCから分離した。LJLバイオシス
テムズアナリストを用いて535 nmでのFITC放出を測定することによって、結合抗
体の蛍光標識の成否を調べ、ELISAによって抗体がYYR-8map結合体に対するその
結合活性を保持しているか否かを調べた。
【００８６】脳ホモジネートのPrP含有量の測定 脳試料から調製した抽出物中のPrPCおよびPrPScの存在は、mAb 6H4（図３）を
用いるウェスタンブロッティングによって確認した。PrPC（33〜35 kDa）の分散
したバンドパターンは、正常およびBSE感染脳試料の双方から調製した抽出物に
おいて認められた。抽出物をプロテナーゼKによって処理した後、PrPCは完全に
消化されたが、PrPScは、27〜30 kDaのバンドとして出現した。
【００８７】 全ての脳は、PrPScの存在を特徴とし、これはプールした抽出物における総PrP
含有量の15〜20％を占めた（図15）。
【００８８】可溶性プロトカドヘリン-2（sPC2）発現 PrP結合蛋白質であるPC2を、PrPCおよびPrPScに対する捕獲試薬として用いて
、pAbC2のPrPSc特異性を証明した。カドヘリンドメイン６個全てをコードするが
、膜貫通ドメインの開始部位で切断されているヒトプロトカドヘリン-2配列を含
むプラスミド（HU-PC43 3' trunc/PC1nel）をCOS細胞にトランスフェクトさせた
。プロトカドヘリン-2の可溶性型を含む培養培地を回収して、抗PC2モノクロー
ナル抗体を用いたウェスタンブロットによってsPC2の存在を決定した。「プリオ
ン蛋白質結合蛋白質とその利用（Prion Protein Binding Proteins and Uses Th
ereof）」と題する国際公開公報第97/45746号は、プリオン蛋白質に対する受容
体としてのPC2の使用を記載しており、参照として本明細書に組み入れられる。
【００８９】ELISAにおけるpAbC2の試験 pAbC2が、組換え型PrP（rbPrP）を用いてPrPCと比較した場合にウシ脳抽出物
からのPrPScを特異的に認識するか否かを決定するために、ELISAアプローチを用
いた。PrPSc含有脳抽出物またはrbPrPのいずれかのプールを用いて、PrPScに対
するpAbC2の特異性を試験した。
【００９０】 イムノロンELISAプレート（ダイネックス社）のウェルを４℃で、PC2含有培養
上清の、50 mMトリス、pH 7.5、150 mM NaCl、１mM CaCl2を含むTBS緩衝液溶液
によって一晩コーティングした。BSE脳抽出物実験に関して、対照ウェルをMek-4
を含む上清によってコーティングした；rbPrP実験に関して、ウェルに対する抗
体の非特異的結合を調べるための対照として牛乳を用いた。ELISAプレートの可
溶性PC2によるコーティングは、抗PC2モノクローナル抗体によって確認した。SL
T「コロンブス」マイクロプレートウォッシャー（テカン社）を用いて0.05％ツ
イーン20を含むTBSによってウェルを４回洗浄し、ウェルに0.2％I-ブロック（ト
ロピクス社）のTBST溶液を満たし、37℃で１時間インキュベートした。プレート
を洗浄して、ウシ脳ホモジネート（１％w/vTBS溶液に希釈）またはrbPrPを指定
されたウェルに加えて、室温で１時間インキュベートした。ウェルをTBSTによっ
て４回洗浄した。pAbC2を適当なウェルに加えて、室温で１時間インキュベート
した後、抗ウサギまたはマウスIgG/西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（5000倍
希釈）の１％脱脂乳を含むTBST溶液100 μlと共にさらに45分間インキュベート
した。ウェルをTBSTによって４回洗浄した。ペルオキシダーゼに関する基質とし
てTMB/H2O2によってシグナルを検出した。２M燐酸100 μlを加えることによって
反応を15分後に停止させた。SLTマイクロプレートリーダーを用いて620 nmを参
照として450 nmでシグナルをモニターした。PC2に対するPrP結合を、陰性対照Me
k-4または牛乳に対するPrP結合と比較することによって、特異的陽性シグナルを
決定した。免疫前対照は結合を示さなかった。
【００９１】 BSE感染ウシ脳抽出物の全ての場合について、これらの点に関して記録された
絶対値は、プレート上でのsPC2の有無にかかわらず、正常な脳からの抽出物に関
する記録より高かった。BSE試料における凝集によって、ELISAプレートのウェル
に対する非特異的接着が起こり、したがってより高いシグナルが記録されると考
えられる。しかし、それにもかかわらずBSE試料の値は、Mek-4対照によってプロ
ービングした同じ試料において得られた値より大きかった。
【００９２】 pAbC2は、Mek-4結合材料よりPC2-結合材料に対して強く反応し、しばしばMek-
4対照に対する結合より1.5〜２倍高く、PrPScに対する特異的結合を示唆してい
る（図16）。二次検出試薬としてのpAbC2抗体は、ほとんどの場合、PrPSc陽性試
料のみに結合し、このことは、試薬のこの組み合わせによって、プロテアーゼ前
処理を行わなくともPrPSc検出が可能となる可能性があることを示唆している。
【００９３】免疫沈降を用いたPrP検出アッセイ法 pAbC2がELISAアッセイ法においてPrPScを認識することを確認した後、pAbC2が
ウシ脳抽出物からPrPを免疫沈降できるか否かを確認するために、次に、免疫沈
降を行った。特に明記していない限り、いくつかの正常またはBSE-感染脳抽出物
のプールを実験に用いた。脳の試料は全て、これまでPrPScの存在を特徴として
いた。簡単に説明すると、10％脳ホモジネート20 μlを、mAb6H4と共にpAbC2の0
.5 M GuHClを含むTBS溶液のような、PrPに結合することが知られている様々な抗
体と共に室温で２時間インキュベートした。磁気プロテインAまたはプロテインG
カップリングビーズ（ダイナビーズ）25 μlと共に室温で１時間インキュベート
した後、アガロースビーズを磁石を用いてペレットにした。ペレットを３回洗浄
した後、ウェスタンブロット上で分析のためにSDS-試料緩衝液中で沸騰させた。
PrPは、抗PrPポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体によって検出された
。
【００９４】 pAbC2を用いて、PrPは正常な脳からの抽出物を含む反応では検出されなかった
が、BSE感染試料からの抽出物を含む反応では、PrPと類似の位置で移動するバン
ドを認めた（図７）。これらの結果は、pAbC2がPrPScに対して特異的であるが、
PrPCに対して特異的でないことを示すELISA試験をさらに実証する。カップリン
グしていないビーズを陰性対照として用い、これはPrPScの沈降を示さなかった
。mAb6H4は免疫沈降反応における陽性対照として用いた。予想されるように、Pr
PCは、mAb 6H4を用いて正常脳から効率よく沈殿した。
【００９５】用途 本明細書において記載したPrPペプチドとPrPSc特異的抗体は、例えば、以下の
診断、治療、ワクチン、および汚染除去目的のためと共に、プリオン疾患を診断
または治療するために、またはプリオン試料の汚染を除去するために用いること
ができる新規化合物のスクリーニングに用いてもよい。
【００９６】プリオン疾患の診断のための試験キット エピトープ特異的抗PrP抗体は、プリオン疾患の検出またはモニタリングにお
いて一般的に診断に用いられる。例えば、抗PrP抗体は、標準的な検出アッセイ
法を用いて、生体試料（例えば、組織生検、細胞、または体液）においてPrPSc
の有無をモニターするために用いてもよい。免疫学的アッセイ法は、PrPScの直
接検出を含んでもよく、PrPScの存在に関して大量の試料をスクリーニングする
ために特に適している。例えば、YYR（上記）のような連続的なYYXエピトープに
対して産生されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を、複合体形成
を測定するために、いかなる標準的なイムノアッセイフォーマット（ELISA、ウ
ェスタンブロット、免疫沈降、フローサイトメトリー、またはRIAアッセイ法）
において用いてもよい。さらに、望ましければ、本明細書に記載した抗体のPrPS c に対する特異性のために、免疫学的分析の前の、試験試料のプロテアーゼによ
る前処置を省略してもよい。放射活性、蛍光、色素発生（例えば、アルカリホス
ファターゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）、化学発光標識、または標識
したハプテン特異的抗体もしくは他の結合パートナー（例えば、アビジン）を用
いて可視化してもよいハプテン（例えば、ジゴキシゲニンもしくはビオチン）を
含むがこれらに限定されることはない、直接または間接的に可視化してもよいい
かなる適当な標識もこれらの検出アッセイ法において用いてもよい。例としての
イムノアッセイ法は、例えばアウスユベールら（Ausubel、上記）、ハーロウ＆
レーン（Harlow and Lane、「抗体：実験アプローチ（Antibodies：A Laborator
y Approach）」コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク（1988））、
およびモイナー＆シンメル（Moynagh and Schimmel、Nature 400：105、1999）
に記載されている。例えば、本明細書に記載の抗体を用いて、PrPScは、本明細
書に記載のような標準的なフローサイトメトリー方法を用いて細胞表面（例えば
、白血球）において容易に検出される。適当な対照試料と比較して標識した化合
物レベルの増加を含むことが判明した試料を、PrPScの存在を示すものと見なし
、このように、プリオン関連疾患であることを示す。
【００９７】 さらに、プリオン疾患を診断するために有用な新規化合物は、本発明の抗体を
用いて同定してもよい。例えば、コンビナトリアル化学ライブラリーまたは低分
子ライブラリーをスクリーニングして、標準的な方法（例えば、平衡透析、ビア
コア分析、または拮抗阻害）に従ってYYXエピトープに対する一つまたはそれ以
上の抗YYX抗体の結合相互作用の阻害能を有する化合物を同定する。そのような
ライブラリーは、天然物、合成（もしくは半合成）抽出物、または当技術分野で
既知の方法による化学物質ライブラリーに由来してもよい。医薬品の研究開発分
野の当業者は、化合物の正確な起源が本発明のスクリーニング方法にとって重要
でないことを理解するであろう。天然化合物起源の例には、植物、真菌、原核細
胞、または動物起源と共に既存の化合物の改変が含まれるがこれらに限定される
ことはない。糖質、脂質、ペプチド、および核酸骨格の化合物を含むがこれらに
限定されることはないいかなる数の化学化合物のランダムまたは定方向合成（例
えば、半合成、または全合成）も得るために、多数の方法がまた利用可能である
。合成化合物ライブラリーは、購入して得てもよく、または当技術分野で既知の
方法に従って産生してもよい。さらに、望ましければ、いかなるライブラリーま
たは化合物も、標準的な化学、物理、または生化学的方法を用いて容易に改変さ
れる。
【００９８】 抗YYX抗体のYYXエピトープに対する結合を最低濃度で阻害する化合物は、「高
親和性競合物質」であると呼ばれ、本発明の診断方法において有用である。次に
、抗YYX抗体の活性を模倣する（例えば、抗YYX抗体の相補性決定領域（「CDR」
））そのような高親和性競合物質を、PrPScの効率的な認識および結合に関して
調べる。同定されれば、プリオン感染症に対する実質的にいかなる診断試験の捕
獲相においても用いるために、高親和性競合物質を固体基質（例えば、ELISAウ
ェルまたはビーズ）にカップリングさせてもよい。
【００９９】抗PrPScモノクローナル抗体のIgMへの変換 診断方法はまた、IgM抗体を用いて行ってもよく、これはPrPScに対する結合力
が増加している。PrPScに対する抗体の結合力を増加させるために、特異的結合I
gG Fab領域遺伝子を、以下のように５価IgM断片の中に構築してもよい。
【０１００】 免疫グロブリン（Ig）分子は、明確な構造および機能的ドメインで構成される
。各免疫グロブリンは、重鎖（それぞれ50〜80 kD）２個と軽鎖（それぞれ25 kD
）２個で構成される。重鎖は、４つのタイプの免疫グロブリン遺伝子、すなわち
VH、DH、JH、およびCHのうちの１つの再配列産物である。最初の３つの遺伝子は
、集合的に可変領域として知られ、これらが組合わさって、重鎖の結合部位を形
成する。第四の遺伝子、CHは、定常領域とも呼ばれ、結合部位の形成には関与し
ていないが、免疫系の他の成分による重鎖の認識に関与している。同様に、軽鎖
は、三つのタイプの免疫グロブリン遺伝子、VL、JL、およびCLの一つのコピーの
再配列に由来する。重鎖の場合と同様に、軽鎖の結合部位は、VLおよびJL遺伝子
の組み合わせによって形成されるが、CL遺伝子は関与していない。このように、
いかなる所定の抗体の結合部位も、２つの可変領域の相互作用によって形成され
る：VH-DH-LHポリペプチドとVL-JL-ポリペプチド。ほとんどの抗体は、そのよう
な結合部位を２個有する。
【０１０１】 免疫応答のあいだ、形成される第一のタイプの免疫グロブリンはIgMと呼ばれ
る。一般的に、IgMは、比較的低親和性の結合部位を含むが、抗体分子あたり結
合部位５個を発現することによってその特徴を代償している。免疫応答が進行す
ると、IgGのような他の抗体が産生され、これらは、先に存在するIgMよりかなり
高い親和性を含むが、１分子あたりの結合部位は２個に過ぎない。
【０１０２】 上記のように、トリペプチドYYRまたは関連モチーフは、PrP配列において３回
出現するように思われる。ウシ、齧歯類およびヒトPrPにおいて、モチーフはYYR
として２回、そしてYYXとして１回現れる。従って、これらの個々のモチーフの
より多くが特定の試薬によって検出されれば、試薬の感度はより高くなるであろ
う。最高の親和性結合部位はIgG分子内に含まれる。しかし、それらが含む結合
部位は２個に過ぎないため、これらの抗体は、PrPScの検出にとって最適な試薬
ではないかもしれない。IgM分子は、十分な結合部位を含むが、それらは親和性
が低く、したがって、それらはPrPScを検出するために最適な試薬ではない。し
たがって、Ig分子のモジュール構築は、この問題に対する解決を提供し、PrPSc
を検出するために最適なIgを構築する方法を提供する。
【０１０３】 抗PrPScポリクローナル抗体を産生するために用いられるYYR-KLH抗原を用いて
マウスを免疫する。この分野において確立され、高親和性IgG抗体が得られるこ
とがわかっているプロトコールを用いて、マウスを免疫する。B細胞ハイブリド
ーマを標準的な方法によって作製し、これらの細胞から生成され、分泌されたモ
ノクローナル抗体を含む組織培養上清を、ELISAによって抗原のYYR部分に対する
免疫反応性に関して調べる。抗体を産生する再配列した免疫グロブリン遺伝子を
、ハインリクス（Heinrichsら、J. Immunol. Methods, 178：241〜51、1995）に
記載された片面PCRプロトコールを用いてクローニングする。重鎖と軽鎖の可変
領域のみをクローニングする必要がある。次に、これらを標準的な方法を用いて
、適当な定常領域、この場合IgM定常領域の分泌型であるが、他のIgアイソタイ
プとなりうる領域を含む発現ベクタープラスミドに挿入する。この領域は、マウ
スまたはヒト起源のいずれかから得てもよく、後者はヒトに対する投与後の副作
用を最小限にするために抗体をヒト化するために得てもよい（ウィンター＆ハリ
ス（Winter and Harris）、Immunol. Today, 14(6)：243〜6、1993；ボーガン（
Vaughan）ら、Nature Biotech. 16(6)：535〜9、1998の論評を参照）。次に、例
えばIgM分子に由来する定常領域にカップリングさせたIgG分子に由来する可変領
域を含むベクターを用いて、細菌、または真核細胞発現系のいずれかにおける組
換え型抗PrPSc抗体の産生を促進する。そのような戦略の例に関しては、ポウル
ら（Poul、Immunotechnology 1：189〜96、1995）を参照のこと。
【０１０４】 または、YYR-KLH抗原のYYR部分に対して最善の反応性を示す可変領域の組み合
わせは、単離および上記の完全長の抗体へのサブクローニングを行う前に、文献
に記載されているように（マークス（Marks）ら、J. Mol. Biol. 222：581〜597
、1991；ボーガン（Vaughan）ら、Nature Biotech.14：309〜14、1996）、ファ
ージディスプレイライブラリーから選択されるであろう。
【０１０５】抗PrPScモノクローナル抗体のIgEへの変換 試料（例えば、血液試料）においてPrPScを検出するもう一つの方法は、PrPSc モノクローナル抗体をIgEへ変換することを含む。PrPScは、様々な大きさの凝集
体を形成するが、通常これはPrPCでは形成されない。これらのPrPSc多量体は、
感染者の血液中に存在する可能性がある。この特徴を用いてバイオアッセイ法に
よってPrPScを検出してもよい。特に、PrPScに対して特異的であるか、またはPr
PCとPrPScとに交叉反応するモノクローナル抗体を、IgEアイソタイプにサブクロ
ーニングすることによって変換する。これは、IgM定常領域の代わりにIgE定常領
域を用いて、上記と同じ方法を含む。
【０１０６】 IgE抗体は、IgE定常領域に対して特異的な細胞表面受容体によって結合してい
る。これらの受容体は、体内に広く分布して、アレルギー反応において重要な役
割を有する。本発明において検討している受容体、IgEに対する高親和性受容体
（Fc RI）は、肥満細胞、好塩基球、好酸球、単球、およびランゲルハンス細胞
において認められる。これはポリペプチド鎖３個からなる細胞表面受容体であり
、IgEに対して強い親和性を示す（Ka＝10-10 M）。各Fc RIは、IgE１分子に結合
する（クルクジッキ＆メツガー（Kulczycki and Metzger）、J. Exp. Med. 140
：1676、1974；バルクレイ（Barclay）ら、「白血球抗原ファクツブック（The L
eukocyte Antigen Factsbook）」、サンジエゴ、アカデミックプレス、1997）。
しかし、シグナル伝達反応を開始させるためには、多数のFc RI受容体を多価抗
原によってクロスリンクさせる（メツガー（Metzger）ら、J. Immunol. 149：14
77、1992）。細胞内シグナル強度は、クロスリンクの程度と比例する。これが起
こると、Fc RIを発現する細胞は脱顆粒を起こして、ヒスタミンおよび他の貯蔵
されたメディエータを急速に放出する。
【０１０７】 本発明のバイオアッセイ方法において、血液試料を、PrPScに対して反応する
、またはPrPCおよびPrPScに対して交叉反応するモノクローナル抗体と共にイン
キュベートする。単量体PrPと多量体PrP（例えば、PrPSc凝集体）を結合させ、
次に混合物を、２〜３×105個Fc RI/細胞を発現することが知られているRBL-2H3
のようなFc RIを発現する細胞株と共にインキュベートする（バルスミアン（Bar
sumian）ら、Eur. J. Immunol. 11：317、1981）。そのような細胞株はATCCから
入手できる。Fc RIの凝集は脱顆粒が起こるために必要であるため、単量体PrPは
、抗体に結合しているか否かによらず、細胞の脱顆粒を起こさないが、多量体Pr
Pは引き起こすであろう。放出されたメディエータは、標準的な免疫学的アッセ
イ法、例えば、ELISAによって直接検出される。
【０１０８】PrPScワクチン 本発明のペプチド、ならびにその混合物および組み合わせはまた、感染症が疑
われるおよび／または感染症を有する宿主において、プリオン疾患に対する予防
的または治療的免疫応答を誘導することができるワクチンの活性成分として有用
である。投与経路、抗原量、注射回数および頻度は、種によって異なり、他の感
染疾患または癌に対する免疫または治療を提供するために、臨床および／または
実験的に現在用いられているものと同等であってもよい。例えば、ワクチンは、
本発明のペプチド、その類似体または混合物またはその組み合わせを、プリオン
感染症に対して、治療した哺乳類を保護するために十分な免疫を生じるために一
定期間その組成物によって治療される、ヒトを含む哺乳類において有効な量で含
む薬学的に許容される組成物である。同様に、YYX（YYR、YYD、もしくはYYQ）、
または関連化合物による免疫によって促進されるPrPSc特異的免疫は、脳および
その他の組織におけるPrPCの発現または機能に影響を及ぼすことなく、PrPScの
分解に有利となるため、または疾患の発現の緩和にとって有用である可能性があ
り、その結果、プリオン疾患を有する臨床的に症候性のヒトにおける臨床状態を
改善する。
【０１０９】 当技術分野で標準的な技法に従って、異なるタイプのワクチンを開発すること
ができる。例えば、ワクチンは、ペプチド骨格、核酸骨格、細菌骨格、またはウ
イルス骨格ワクチンであってもよい。より詳しく述べると、ペプチドワクチンに
関して、PrPSc特異的エピトープに対応するペプチドまたはその機能的誘導体を
、以下を含む多くの方面において予防的または治療的ワクチンとして利用するこ
とができる：1）同じ配列の単量体または多量体として、2）凝集を促進する、エ
ピトープの提示またはプロセシング（例えば、クラスI/IIターゲティング配列）
を促進する可能性があるさらなる配列、および／またはワクチンの有効性を増強
する手段としてPrPSc特異的エピトープの免疫原性を増加させるために、さらな
る抗体、TヘルパーもしくはCTLエピトープと連続的または非連続的に組み合わせ
て、3）ワクチンの免疫原性または輸送を増加させる物質（例えば、脂肪酸、ま
たはアシル鎖、KLH、破傷風毒素、コレラ毒素等）によって化学的改変または結
合して、4）上記の組み合わせ、5）上記と、アルミニウム塩、サポニンまたはト
リテルペン、MPL、およびコレラ毒素を含むがこれらに限定されることはないア
ジュバント、および／またはリポソーム、VPL、またはウイルス様粒子、微小乳
液、弱毒化もしくは殺菌細菌およびウイルスベクター、ならびに分解可能なミク
ロスフェアを含む輸送媒体との組み合わせ、6）エクスビボで抗原を細胞にロー
ディングする経路または手段としての投与。
【０１１０】 予防または治療物質として核酸骨格ワクチンを利用する例には以下が含まれる
：1）PrPSc特異的エピトープの発現（転写および／または翻訳）をコードする核
酸、2）翻訳融合体または独立した転写単位の、PrPSc特異的エピトープのプロセ
シングおよび提示、凝集、分泌、ターゲティング（特定の細胞タイプへの）を促
進するさらなる核酸配列、3）翻訳融合体または独立した転写単位の、アジュバ
ント／免疫調節物質として機能するさらなる核酸配列、4）翻訳融合体または独
立した転写単位の、PrPSc特異的エピトープの免疫原性またはワクチンの有効性
を増加させるさらなる抗体、Tヘルパー、またはCTLエピトープ、5）上記の組み
合わせ、6）生理食塩液（「裸のDNA」）またはアジュバント（例えば、アルミニ
ウム塩、QS-21、MPL）、免疫調節物質（例えば、rIL-2、rGM-CSF、rIL-12）、お
よび／または核酸輸送物質（例えば、ポリマー、脂質、ペプチド骨格の分解可能
な粒子、微小乳液、VPL、弱毒化細菌またはウイルスベクター）と組み合わせて
、いかなる経路またはエクスビボローディングによって投与される上記の物質。
【０１１１】 弱毒化または殺菌された細菌またはウイルスベクターを用いて、抗原の発現を
コードする抗原またはDNA/RNAのいずれかを輸送することができる。これらはま
た、エクスビボで抗原を細胞にローディングする手段としても用いることができ
る。
【０１１２】 ワクチンは、当技術分野で既知の標準的な方法に従って調製され、ワクチン産
生のためのいかなる新しいまたは改善された方法にも容易に適用可能であろう。
【０１１３】プリオンの汚染除去 本明細書に記載の方法および組成物は、例えば移植を意図した、プリオンに汚
染されていることがわかっているまたは疑われる生体試料を汚染除去するために
有用である。特に、生体試料は、抗PrPSc抗体と共にインキュベートしてもよく
、標準的な方法を用いて複合体を除去してもよい。または、抗PrPSc抗体は、プ
リオンと複合体を形成して、それによってプリオンの感染性を阻害するように生
体試料と共にインキュベートしてもよい。
【０１１４】プリオン疾患の治療 本発明の方法および組成物はまた、ヒト、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、イヌ、
ネコ、およびペット種を含むがこれらに限定されることはない哺乳類におけるプ
リオン疾患を治療または予防するための手段を提供する。上記のように、チロシ
ン二量体におけるチロシン側鎖の方向の変化、またはYYXエピトープ（例えば、Y
YR/D/Q）の集合は、疎水性および凝集傾向のような、PrPScへの変換時のPrPの物
理化学特性の変化に関与する可能性がある。同様に、これらの残基はPrPCからPr
PScへの変換反応において重要である可能性がある。このことを示すことができ
れば、プリオン疾患に対する治療は、PrPCからPrPScへの変換反応に関連した生
物学的事象を破壊、抑制、減弱、または中和する拮抗剤に基づくことができる。
YYX（例えば、YYR）ペプチド免疫によって能動的に産生された、またはYYXに対
するポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体の受動的移入によって産生
された抗体は、これらの疾患を治療するために有用である。その上、本発明には
、無傷のモノクローナル抗体のみならず、免疫学的に活性な抗体断片が含まれる
。そのような断片の例には、Fabまたは（Fab)2断片、操作された一本鎖Fv分子、
およびキメラ抗体（「ヒト化抗体」のような）が含まれる。本明細書において用
いられる「ヒト化抗体」という用語は、非抗原結合領域におけるアミノ酸配列が
、抗体がヒト抗体により類似するように変化しており、なおもその当初の結合能
を保持している抗体分子を意味する。ヒト以外（例えば、マウス）の抗体のヒト
化型は、構築されて当技術分野で既知の標準的な方法、例えばクテマイアーら（
Kutemeier、Biotechniques 17：242〜246、1994）；メジャーら（Major、Hum. A
ntibodies Hybridomas 5：9〜17、1994）；ジョリフら（Jolliffe、Int. Rev. I
mmunol. 10：241〜250、1993）；カーター（Carter、Biotechnology 10：163〜1
67、1992）；ミヤチら（Miyachi、J. Clin. Lab. Anal. 6：343〜50）；および
ロイングら（Leung、Mol. Immunol. 32：1413〜1427、1995）に記載の方法に従
って特徴が調べられている。ヒト化抗体は、免疫原性である可能性が低く、受動
免疫治療において有用である。さらに、本発明のキメラ抗体は、望ましければ、
ヒト以外の抗体の可変領域、例えば、マウス可変領域とヒト抗体の定常領域とを
含んでもよい。本発明のいくつかの態様において、抗体または抗体断片は、検出
可能な標識に結合している。検出可能な標識の例には、放射活性標識、非放射活
性同位元素標識、蛍光標識、酵素標識、および比色標識が含まれる。
【０１１５】 その上、チロシン側鎖誘導体を含むがこれらに限定されることはないYYRエピ
トープの構造に由来する低分子は、変換反応を阻害する可能性がある。最後に、
チロシン環の酵素的溶解、チロシン環の大型置換基による共有結合誘導体形成の
ような重要な残基の直接化学修飾もまた、YYRエピトープにおけるアミノ酸が変
換プロセスにおいて重要であることが判明すれば、PrPCからPrPScへの変換反応
を破壊する可能性がある。
【０１１６】 例えば、そのような化合物を、本発明の抗体を用いて同定してもよい。したが
って、コンビナトリアルライブラリーまたは低分子ライブラリーまたはその双方
（下記参照）をスクリーニングして、標準的な方法（例えば、平衡分析、ビアコ
ア分析、または拮抗阻害）に従って、YYXエピトープに対する一つまたはそれ以
上の抗YYX抗体の結合相互作用の阻害能を有する化合物を同定する。そのような
抗体の結合を阻害する化合物は、本発明の治療方法において有用である。同定さ
れれば、そのような化合物を、適当なモデル系においてプリオン疾患の治療能に
関して調べる。
【０１１７】 試験拮抗物質が、インビボでプリオン疾患の発症に対して保護を与えるか否か
の評価は、そのような疾患を発症することが知られている動物を用いることを含
む（例えば、チャンドラー（Chandler）ら、Lancet 6：1378〜1379、1961；エク
ルンド（Eklund）ら、J. Infectious Disease 117：15〜22、1967；フィールド
（Field）、Brit. J. Exp. Path. 8：129〜239、1969）。適当な動物（例えば、
マウスまたはハムスター）を標準的な方法に従って試験化合物によって処置し、
無処置対照動物と比較した場合のプリオン関連疾患の発生率の減少、発病または
進行の遅延を保護の指標として検出する。試験化合物は、プリオン物質を先に注
射した動物に投与してもよく、またはプリオンと化合物とを予めインキュベート
して、プリオン／化合物混合物を試験動物に投与することによって、試験物質の
プリオン物質の中和能を調べてもよい。プリオン疾患を治療または予防するため
に用いられる分子（例えば、上記のような拮抗物質）は、「抗プリオン治療物質
」と呼ばれる。
【０１１８】 または、PrPScに対して反応性の循環中の抗体は、PrPScの立体構造を安定化す
ることによって疾患を加速するように作用する可能性がある。したがって、これ
らの内因性抗体の作用を阻害すれば、疾患の進行を遅らせる、または他の有益な
作用を有する可能性がある。YYR特異的モノクローナル抗体を基質として用いて
、YYR特異的抗体の結合部位に反応するもうひとつの組のモノクローナル抗体を
産生してもよい。これらの第二の組の抗体は抗イディオタイプとして知られてい
る。抗イディオタイプ抗体は、循環中のPrPSc反応性抗体を中和するために有用
である。
【０１１９】 本発明の抗プリオン治療物質は、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦
形剤と共に単位投与用量で投与してもよい。例えば、従来の薬学の実践を用いて
、適した薬剤または組成物を提供して、そのような抗プリオン治療をプリオン疾
患を有する、または前症候を有する、またはプリオン疾患を発症するリスクがあ
る動物に投与してもよい。いかなる適した投与経路、例えば、非経口、静脈内、
皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼内、脳室内、嚢内、脊髄内、槽内、腹腔内、
鼻腔内、エアロゾル、または経口投与も用いることができる。
【０１２０】 製剤を作製するために当技術分野で周知の方法は、例えば、「レミントンの製
薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」に認められる。非経口投与
用製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、または生理食塩液、ポリエチレングリコー
ルのようなポリアルキレングリコール、植物性油、または硬化ナフタレンを含み
うる。化合物の放出を制御するために、生体適合性の生分解性ラクチドポリマー
、ラクチド／グリコリドポリマー、またはポリオキシエチレン-ポリオキシプロ
ピレンコポリマーを用いることができる。抗プリオン治療用化合物にとってのそ
の他のおそらく有用な非経口輸送系には、エチレン-酢酸ビニルコポリマー粒子
、浸透圧ポンプ、埋め込み型注入系、およびリポソームが含まれる。吸入のため
の製剤は、賦形剤、例えば乳糖を含むことができ、または例えばポリオキシエチ
レン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸塩およびデオキシコール酸塩を含む
水溶液となりうる、または点鼻液の形で、またはゲルとして投与される油性溶液
となりうる。
【０１２１】 本発明の方法は、いかなる動物、例えばヒト、家畜ペット、または家畜動物に
おいても本明細書に記載した疾患を減少または予防するために用いてもよい。ヒ
ト以外の動物を治療する場合、用いられる抗プリオン治療物質は、好ましくはそ
の種に対して特異的である。
【０１２２】 本明細書において言及した全ての出版物および特許出願は、個々の独立した出
版物または特許出願が特にそして個々に参照として組み入れられるのと同じ程度
に、参照として本明細書に組み入れられる。
【０１２３】 その他の態様は特許請求の範囲内である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 マウス組換え型PrPCにおけるpH関連立体構造変化の円偏光二色
性を示すグラフである。pH 7.0および3.0でのPrPCの遠紫外線円偏光二色性分光
法は、生理的pHで優勢なαヘリックスから低いpHで優勢なβシートへの立体構造
変化と一致する分子楕円性のシフトを示す。
【図１Ｂ】 マウス組換え型PrPCにおける芳香環方向のpH関連変化の蛍光分
光法を示すプロットである。チロシンとトリプトファン側鎖の特異的蛍光の変化
は、pHが低下すると、溶媒接触性が反対となる傾向と一致する。
【図２】 ウシ（配列番号：26）、ヒト（配列番号：27）、ヒツジ（配列番
号：28）、マウス（配列番号：29）、およびハムスター（配列番号：30）からの
PrPアミノ酸配列のアライメントを示す。四角の枠は、アミノ酸160〜162位と173
〜175位での非常に保存された２つのYYR配列、ならびにアミノ酸235〜237位での
YYQ/D配列（ウシ配列による）を強調する。
【図３】 マウスPrPCのNMR解像構造を示し、YYRおよびYYD配列の位置と方
向を強調する。いずれのYYモチーフも分子表面に対して芳香環のいわゆる直交縦
列方向を示さない。
【図４】 PrPScに対するPrPCの立体構造変化と共に起こるチロシン環方向
の変化に基づくエピトープ作製を示す略図である。図３に示すように、PrPCにお
ける２つのYYRモチーフは、１つのチロシン環が溶媒接触性となり、一方は分子
内部構造において溶媒非接触性となるような方向を有する（この図に示していな
い第三のYYモチーフは、チロシン環が相互作用できない方向を有する）。PrP立
体構造の変化により、一つまたはそれ以上のYYXモチーフにおけるチロシン環は
、直交縦列方向において分子表面で接触性となり、これはパイスタッキング相互
作用によって安定化される。末端の平面アルギニン（または第３のモチーフにお
けるアスパラギン酸／グルタミン）はさらに、チロシン・チロシン相互作用を安
定化させる可能性がある。
【図５】 対照蛋白質と結合した磁気ビーズを用いたマウスPrPScの免疫沈
降（IP）を示す。磁気ビーズにカップリングした非識別PrPモノクローナル抗体6
H4（レーン９〜12）、またはBSAにカップリングしたビーズ（ビーズ、レーン５
〜８）を、正常（N）またはME7スクレイピー感染（Sc）マウス脳ホモジネートと
反応させた。脳ホモジネートは免疫沈降の前にプロテナーゼKによって処理し（+
）、または処理しなかった（-）。レーン１〜４（ロード）に、免疫沈降におい
て用いた同じ量の脳ホモジネートの直接ウェスタンブロットを示す。免疫沈降物
を、非還元条件においてSDS-PAGEゲルで分離した。ブロットは6H4モノクローナ
ル抗体の後にヤギ抗マウスIg-HRP結合体をプローブとして調べた。
【図６】 抗YYRポリクローナル抗体pAbC2と結合した磁気ビーズを用いたマ
ウスPrPScの免疫沈降（IP）を示す。pAbC2にカップリングした磁気ビーズ（レー
ン９〜12）またはBSAにカップリングしたビーズ（ビーズ、レーン５〜８）を正
常（N）またはME7スクレイピー感染（Sc）マウス脳ホモジネートと反応させた。
脳ホモジネートは免疫沈降の前にプロテナーゼKによって処理し（+）、または処
理しなかった（-）。レーン１〜４（ロード）に、免疫沈降において用いた同じ
量の脳ホモジネートの直接ウェスタンブロットを示す。免疫沈降物を、非還元条
件においてSDS-PAGEゲルで分離した。ブロットは6H4モノクローナル抗体の後に
ヤギ抗マウスIg-HRP結合体をプローブとして調べた。
【図７】 pAbC2ウサギポリクローナル抗体と結合した磁気ビーズを用いた
ウシPrPScの免疫沈降を示す。6H4（レーン１および２）またはpAbC2カップリン
グ磁気ビーズ（レーン３および４）を用いて、正常またはBSE脳ホモジネートを
免疫沈降させた。免疫沈降物を、非還元条件においてSDS-PAGEゲルで分離した。
ブロットは6H4モノクローナル抗体の後にヤギ抗マウスIg-HRP結合体をプローブ
として調べた。
【図８】 抗YYR p165ヤギポリクローナル抗体と結合した磁気ビーズを用い
たマウスPrPScの免疫沈降を示す。抗体カップリング磁気ビーズを、正常（N）ま
たはME7スクレイピー感染（Sc）マウス脳ホモジネートと反応させた。スクレイ
ピー試料を、免疫沈降の前にプロテナーゼKによって処理し（+）、または処理し
なかった（-）。レーン１〜３（p165）アフィニティ精製ヤギpAb；レーン４〜６
（IgG）総ヤギIgG；レーン７〜９（BSA）BSA-結合ビーズ；レーン10〜12（6H4）
非識別抗PrPモノクローナル抗体6H4。免疫沈降物を、非還元条件においてSDS-PA
GEゲルで分離した。ブロットは6H4モノクローナル抗体の後にヤギ抗マウスIg-HR
P結合体をプローブとして調べた。
【図９】 抗YYRマウスモノクローナル抗体に結合した磁気ビーズを用いた
マウスPrPScの免疫沈降を示す。モノクローナル抗体カップリング磁気ビーズを
、正常（N）またはME7スクレイピー感染（Sc）マウス脳ホモジネートと反応させ
た。スクレイピー試料を、免疫沈降の前にプロテナーゼKによって処理し（+）、
または処理しなかった（-）。1A4（レーン１〜３）、2C（レーン４〜６）、およ
び6B1（レーン７〜９）は、スクレイピー反応性のモノクローナル抗体である。1
9E（レーン10〜12）はPrPと反応しないモノクローナル抗体である。6H4（レーン
13〜15）は、PrPCをPrPScと識別しない抗PrPモノクローナル抗体である。免疫沈
降物を、非還元条件においてSDS-PAGEゲルで分離した。ブロットは6H4モノクロ
ーナル抗体の後にヤギ抗マウスIg-HRP結合体をプローブとして調べた。19Eに対
応するレーン10〜12において、抗体ビーズ結合物からの免疫グロブリン重鎖（45
kDa）および軽鎖（30 kDa）はそれぞれ、PrP二量体およびPrPグリコシル化変種
の一つと共に移動する。
【図１０】 抗体ビーズ結合体からの免疫グロブリン軽鎖と重鎖の漏出を示
す。モノクローナル抗体1A4と6B1磁気ビーズ結合体をSDS-PAGE用に処理して、脳
ホモジネートの非存在下でウェスタンブロット分析を行った。SDS-PAGEゲルの泳
動は、これら２つの抗体ビーズ結合体に関しては非還元条件で行い、非結合6H4
モノクローナル抗体に関しては還元条件で行った。ブロットは、ヤギ抗マウスIg
-HRP結合体により検出された。
【図１１】 抗YYR 1A4モノクローナル抗体とカップリングした磁気ビーズ
を用いた多数のマウスPrPSc試料の免疫沈降を示す。1A4-磁気ビーズ結合体を正
常（N、レーン19）、４個のME7（レーン１〜８）、または５個の139A（レーン９
〜18）スクレイピー感染マウス脳ホモジネートと反応させた。スクレイピー試料
は、免疫沈降の前にプロテナーゼKによって処理し（+）、または処理しなかった
（-）。6H4磁気ビーズ結合体を、対照として正常（N、レーン20）マウス脳ホモ
ジネートと反応させた。免疫沈降物を非還元条件でSDS-PAGE上で分離した。ブロ
ットは6H4モノクローナル抗体の後にヤギ抗マウスIg-HRP結合体をプローブとし
て調べた。
【図１２】 PrPScに対する抗YYRモノクローナル抗体反応性の立体構造依存
性を示す。正常（N）、ME7、および139Aスクレイピー感染マウス脳ホモジネート
を非還元条件でSDS-PAGEゲルにおいて分離した。ブロットは1A4（レーン１〜３
）または6B1（レーン４〜６）の後にヤギ抗マウスIg-HRP結合体をプローブとし
て調べた。次に、ブロットを6H4（レーン７〜９）の後にヤギ抗マウスIg-HRP結
合体を用いて剥離せずに再度プロービングした。
【図１３】 蛍光標識抗PrPScモノクローナル抗体1A4、2B5、6B1、17B、お
よび18Bと反応させた解離正常マウス脾細胞のフローサイトメトリーを用いた分
析を示す。蛍光標識ヤギ抗マウスIg（GAMIg）を対照として用いた。細胞は、特
徴的な前方および側方散乱パラメータによって、そしてヨウ化プロピジウムの排
除に関して獲得時にゲートで制御した。破線はバックグラウンド蛍光を表し、実
線は抗体染色を表す。モノクローナル抗体は、96ウェルプレートリーダーにおけ
る蛍光放出によって測定すると首尾よく蛍光標識され、ELISAによる免疫抗原に
対するその反応性を維持した。
【図１４】 抗YYRマウスモノクローナル抗体およびヤギポリクローナル抗
体を用いたハムスターPrPSの免疫沈降を示す。1A4モノクローナル抗体およびp16
5ポリクローナル抗体磁気ビーズ結合体を正常（N）またはスクレイピー感染ハム
スター脳ホモジネート（Sc）と反応させた。スクレイピー試料は、免疫沈降の前
にプロテナーゼKによって処理し（+）、または処理しなかった（-）。免疫沈降
物を非還元条件でSDS-PAGE上で分離した。ブロットは6H4モノクローナル抗体の
後にヤギ抗マウスIg-HRP結合体をプローブとして調べた。
【図１５】 正常ウシ脳におけるプロテアーゼ感受性PrPC（レーン１および
４）、ならびにBSE脳におけるプロテアーゼ抵抗性PrPSc（レーン２および３）の
イムノブロット検出を示す。プロテナーゼKによって処理した（+）または処理し
なかった（-）脳ホモジネートをSDS-PAGE電気泳動によって分離して、イムノブ
ロッティングのためにPVDFメンブレンに転写した。メンブレンをmAb 6H14をプロ
ーブとして調べ、洗浄して、ECLによって発光させて、標準的な方法に従ってX線
フィルムに露出した。
【図１６】 抗YYRウサギポリクローナル抗体pAbC2による特異的ウシPrPSc
認識を示すELISA系を示す。ELISA吸着可溶性プリオン受容体エクトドメイン（PC
2）または対照蛋白質（Mek）と反応したBSE脳抽出物は、受容体と対照ウェルと
においてpAbC2による結合PrPScが統計学的に有意に検出されることを示した（パ
ネルA；p値＝0.008）。pAbC2またはmAb6H4との直接ELISAによる組換え型ウシPrP C （bPrP）の認識についても示す（パネルB）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 5/087 ４Ｃ０８５ Ｃ０７Ｋ 5/087 5/10 ４Ｈ０４５ 5/10 7/00 7/00 14/00 14/00 14/76 14/76 14/765 14/765 14/795 14/795 16/00 16/00 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 9/36 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/36 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 33/577 Ｂ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スロン−ウサキウィッツ ヤツェク カナダ国 ケベック州 ポアント−クレー ル バンガード アベニュー 151 (72)発明者 ハイガット アシュカン カナダ国 ケベック州 モントリオール ボナビスタ アベニュー ＃309 4655 (72)発明者 ピナール マーク カナダ国 ケベック州 モントリオール ドラモンド ＃ 103 3477 (72)発明者 ロートン トレバー アメリカ合衆国 メイン州 ゴーハム バ ーハム ロード ３ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 CB01 DA36 DA77 FA37 FB03 FB07 4B050 CC05 DD07 LL01 LL03 4B064 AG27 CA20 DA01 DA13 4B065 AA91X AB05 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 BA16 BA17 BA18 BA19 BA23 BA44 CA18 CA20 CA22 DC50 NA14 ZA011 ZA151 ZB211 ZC511 4C085 AA13 AA14 BB11 CC03 CC04 DD61 DD62 4H045 AA11 AA20 AA30 BA12 BA13 BA14 BA15 BA16 BA17 BA18 BA42 CA40 DA70 DA76 DA86 DA89 EA20 EA50 FA74

Claims (80)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳類PrPScのYYXエピトープに対して高い結合親和性で結合
    する抗体またはその断片。
  2. 【請求項２】 抗体がPrPCに実質的に結合しない、請求項１記載の抗体。
  3. 【請求項３】 抗体が哺乳類PrPScのYYRエピトープに結合する、請求項１記
    載の抗体。
  4. 【請求項４】 抗体がPrPScのYYRエピトープに対して作製されたポリクロー
    ナル抗体である、請求項１記載の抗体。
  5. 【請求項５】 YYXエピトープがCYYR（配列番号：32）の一部である、請求
    項４記載の抗体。
  6. 【請求項６】 抗体がPrPScのYYRエピトープに対して作製されたモノクロー
    ナル抗体である、請求項１記載の抗体。
  7. 【請求項７】 YYRエピトープが の一部である、請求項６記載の抗体。
  8. 【請求項８】 抗体がIgG、IgM、IgE、IgD、またはIgAである、請求項１記
    載の抗体。
  9. 【請求項９】 抗体断片がFabまたはFv断片である、請求項１記載の抗体。
  10. 【請求項１０】 哺乳類PrPScのYYXエピトープに対して高い結合親和性で結
    合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
  11. 【請求項１１】 抗体がPrPCに実質的に結合しない、請求項10記載のハイブ
    リドーマ。
  12. 【請求項１２】 抗体が哺乳類PrPScのYYRエピトープに結合する、請求項10
    記載のハイブリドーマ細胞株。
  13. 【請求項１３】 YYRエピトープが の一部である、請求項12記載のハイブリドーマ細胞株。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物。
  15. 【請求項１５】 組成物が担体をさらに含む、請求項14記載の組成物。
  16. 【請求項１６】 組成物が治療的組成物である、請求項14記載の組成物。
  17. 【請求項１７】 請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体と該抗体を検出
    する手段とを含む免疫学試験キット。
  18. 【請求項１８】 以下の段階を含む、生体試料中のPrPScを検出する方法： （a） 該生体試料を、抗体とPrPScとのあいだに複合体が形成される条件で、請
    求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体と接触させる段階；および （b） PrPScが該生体試料中に存在する指標として該複合体を検出する段階。
  19. 【請求項１９】 抗体がPrPCに実質的に結合しない、請求項18記載の方法。
  20. 【請求項２０】 抗体がポリクローナル抗体またはその断片である、請求項
    18記載の方法。
  21. 【請求項２１】 抗体がモノクローナル抗体またはその断片である、請求項
    18記載の方法。
  22. 【請求項２２】 生体試料が、組織、細胞、組織抽出物、細胞抽出物、体液
    、または生検を含む、請求項18記載の方法。
  23. 【請求項２３】 PrPScがヒト、家畜種、またはペット種に由来する、請求
    項18記載の方法。
  24. 【請求項２４】 複合体がELISA、RIA、ウェスタンブロッティング、免疫沈
    降、またはフローサイトメトリーを用いて検出される、請求項18記載の方法。
  25. 【請求項２５】 薬学的に許容される担体において請求項１〜９のいずれか
    一項に記載の有効量の抗体を哺乳類に投与する段階を含む、哺乳類におけるPrPS c 疾患を治療または予防する方法。
  26. 【請求項２６】 PrPScとしての抗原性を有する、YYX、YYR、YYD、またはYY
    Qアミノ酸配列を含むペプチド。
  27. 【請求項２７】 18個またはそれより少ない数のアミノ酸で構成される、請
    求項26記載のペプチド。
  28. 【請求項２８】 12個またはそれより少ない数のアミノ酸で構成される、請
    求項26記載のペプチド。
  29. 【請求項２９】 ８個またはそれより少ない数のアミノ酸で構成される、請
    求項26記載のペプチド。
  30. 【請求項３０】 ５個またはそれより少ない数のアミノ酸で構成される、請
    求項26記載のペプチド。
  31. 【請求項３１】 免疫原性担体と融合される、請求項26記載のペプチド。
  32. 【請求項３２】 免疫原性担体が血清アルブミン、卵白アルブミン、キーホ
    ールリンペットヘモシアニン、8map、またはライソザイムである、請求項26記載
    のペプチド。
  33. 【請求項３３】 アミノ酸配列YYRを有するトリペプチドである、請求項26
    記載のペプチド。
  34. 【請求項３４】 下記の式を有する合成ペプチド： 式中、Aは任意のアミノ酸であるか、または存在せず； Bは任意のアミノ酸であるか、または存在せず；および nは０から10までの数である。
  35. 【請求項３５】 AおよびBの少なくとも１つがチロシンではない、請求項34
    記載のペプチド。
  36. 【請求項３６】 AまたはBがアラニン、システイン、アスパラギン酸、グル
    タミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、
    ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セ
    リン、トレオニン、バリン、またはトリプトファンより選択される、請求項34記
    載のペプチド。
  37. 【請求項３７】 A-Tyr-Tyr-Arg（配列番号：12）またはその薬学的に許容
    される塩である、請求項34記載のペプチド。
  38. 【請求項３８】 A-Tyr-Tyr-Gln（配列番号：13）またはその薬学的に許容
    される塩である、請求項34記載のペプチド。
  39. 【請求項３９】 A-Tyr-Tyr-Asp（配列番号：14）；またはその薬学的に許
    容される塩である、請求項34記載のペプチド。
  40. 【請求項４０】 免疫学的担体に結合している、請求項34記載のペプチド。
  41. 【請求項４１】 下記の式を有する合成ペプチド： 式中、Aは任意のアミノ酸であるか、または存在せず； Bは任意のアミノ酸であるか、または存在せず； Cは任意のアミノ酸であるか、または存在せず； Dは任意のアミノ酸であるか、または存在せず；および nは０から10までの数である。
  42. 【請求項４２】 A、B、CおよびDの少なくとも１つがチロシンではない、請
    求項41記載のペプチド。
  43. 【請求項４３】 A、B、CまたはDが、アラニン、システイン、アスパラギン
    酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、
    リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギ
    ニン、セリン、トレオニン、バリン、またはトリプトファンより選択される、請
    求項41記載のペプチド。
  44. 【請求項４４】 Aが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミ
    ン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイ
    シン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン
    、トレオニン、バリン、またはトリプトファンであって、且つB、CおよびDが、
    アルギニン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、
    またはトリプトファンより選択される、請求項41記載のペプチド。
  45. 【請求項４５】 ペプチドが、 またはその薬学的に許容される塩である、請求項41記載のペプチド。
  46. 【請求項４６】 免疫学的担体に結合している、請求項41記載のペプチド。
  47. 【請求項４７】 以下の段階を含む、哺乳類のPrPScに対して高い結合親和
    性で結合する抗体を産生する方法： （a） 二つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖を有する接触性のエピトープを含む
    プリオン蛋白質ペプチドを提供する段階； （b） 段階（a）の該プリオン蛋白質ペプチドによって哺乳類を免役する段階；
    および （c） 該哺乳類の組織または該組織を用いて作製されたハイブリドーマから該
    抗体を精製する段階。
  48. 【請求項４８】 抗体がPrPCに実質的に結合しない、請求項47記載の方法。
  49. 【請求項４９】 抗体がポリクローナル抗体またはその断片である、請求項
    47記載の方法。
  50. 【請求項５０】 抗体がモノクローナル抗体またはその断片である、請求項
    47記載の方法。
  51. 【請求項５１】 プリオン蛋白質ペプチドがYYXアミノ酸配列を含む、請求
    項47記載の方法。
  52. 【請求項５２】 プリオン蛋白質ペプチドが、YYR、YYQ、またはYYDアミノ
    酸配列を含む、請求項51記載の方法。
  53. 【請求項５３】 プリオン蛋白質ペプチドが18個またはそれより少ない数の
    アミノ酸で構成される、請求項47記載の方法。
  54. 【請求項５４】 プリオン蛋白質ペプチドが12個またはそれより少ない数の
    アミノ酸で構成される、請求項47記載の方法。
  55. 【請求項５５】 プリオン蛋白質ペプチドが８個またはそれより少ない数の
    アミノ酸で構成される、請求項47記載の方法。
  56. 【請求項５６】 プリオン蛋白質ペプチドが５個またはそれより少ない数の
    アミノ酸で構成される、請求項47記載の方法。
  57. 【請求項５７】 プリオン蛋白質ペプチドが請求項34または41記載のペプチ
    ドを含む、請求項47記載の方法。
  58. 【請求項５８】 請求項26、34、または41のいずれか一項に記載のペプチド
    と、薬学的に許容される担体とを含む、PrPSc疾患に対するワクチン。
  59. 【請求項５９】 請求項58記載の有効量のワクチンを投与する段階を含む、
    PrPSc疾患に対して哺乳類を免疫する方法。
  60. 【請求項６０】 請求項26〜46のいずれか一項に記載のペプチドを含む組成
    物。
  61. 【請求項６１】 組成物が治療的組成物である、請求項60記載の組成物。
  62. 【請求項６２】 以下の段階を含む、生体試料からPrPScの汚染を除去する
    方法： （a） 生体試料を、抗PrPSc抗体：PrPSc複合体が形成されるために十分な期間
    、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体によって処理する段階；および （b） 該生体試料から該抗PrPSc抗体：PrPSc複合体を回収する段階。
  63. 【請求項６３】 生体試料が組織、体液、または臓器である、請求項62記載
    の方法。
  64. 【請求項６４】 生体試料が抗体によって潅流される、請求項62記載の方法
    。
  65. 【請求項６５】 以下の段階を含む、生体試料においてPrPScを阻害する方
    法： 生体試料を、抗PrPSc抗体：PrPSc複合体が形成されるために十分な期間、請求
    項１〜９のいずれか一項に記載の抗体によって処理する段階。
  66. 【請求項６６】 生体試料が体液、組織、または臓器である、請求項65記載
    の方法。
  67. 【請求項６７】 生体試料が抗体によって潅流される、請求項65記載の方法
    。
  68. 【請求項６８】 プリオン疾患を治療するための候補化合物を同定する方法
    であって、 （a） 試験化合物の存在下でPrPScに対する抗YYX抗体の結合を測定する段階と
    、 （b） 該試験化合物の非存在下で、PrPScに対する該抗YYX抗体の結合を測定す
    る段階とを含み、 該試験化合物の存在下でのPrPScに対する該抗YYX抗体の結合レベルが、試験化
    合物の非存在下でのPrPScに対する該抗YYX抗体の結合レベルより低い場合に、該
    試験化合物がプリオン疾患を治療するための治療用化合物である可能性を有する
    ことが示される方法。
  69. 【請求項６９】 抗YYX抗体が、抗YYR抗体、抗YYD抗体、または抗YYQ抗体で
    ある、請求項68記載の方法。
  70. 【請求項７０】 プリオン疾患がヒト、家畜動物種、またはペット種で発症
    する、請求項68記載の方法。
  71. 【請求項７１】 プリオン疾患がヒト、ウシ、ヒツジ、またはヤギで発症す
    る、請求項68記載の方法。
  72. 【請求項７２】 試験化合物が低分子である、請求項68記載の方法。
  73. 【請求項７３】 請求項68記載の方法に従って同定された化合物。
  74. 【請求項７４】 プリオン疾患を診断するための化合物を同定する方法であ
    って、 （a） 試験化合物の存在下でPrPScに対する抗YYX抗体の結合を測定する段階と
    、 （b） 該試験化合物の非存在下で、PrPScに対する該抗YYX抗体の結合を測定す
    る段階とを含み、 該試験化合物の存在下でのPrPScに対する該抗YYX抗体の結合レベルが、試験化
    合物の非存在下でのPrPScに対する該抗YYX抗体の結合レベルより低い場合に、該
    試験化合物がプリオン疾患を診断するための治療用化合物である可能性を有する
    ことが示される方法。
  75. 【請求項７５】 抗YYX抗体が、抗YYR抗体、抗YYD抗体、または抗YYQ抗体で
    ある、請求項74記載の方法。
  76. 【請求項７６】 プリオン疾患がヒト、家畜動物種、またはペット種で発症
    する、請求項74記載の方法。
  77. 【請求項７７】 プリオン疾患がヒト、ウシ、ヒツジ、またはヤギで発症す
    る、請求項74記載の方法。
  78. 【請求項７８】 試験化合物が低分子である、請求項74記載の方法。
  79. 【請求項７９】 請求項74記載の方法に従って同定された化合物。
  80. 【請求項８０】 請求項47記載の方法に従って産生された抗体。
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