CN111471106A - 人源抗转甲状腺素蛋白抗体、多核苷酸、载体及其应用 - Google Patents

人源抗转甲状腺素蛋白抗体、多核苷酸、载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人源抗转甲状腺素蛋白抗体、多核苷酸、载体及其应用。提供了全新的特异性针对转甲状腺素蛋白(TTR)的人源抗体，优选地能够结合错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型，以及与其相关的方法。此外，提供了对与TTR淀粉样变相关疾病的诊断和/或监测的方法及其治疗。还公开了与特异性针对TTR或TTR沉积物和聚集体的抗体相关的测定和试剂盒。全新的抗TTR抗体可以用于药用和诊断组合物用于靶向TTR的免疫治疗和诊断。

Description

人源抗转甲状腺素蛋白抗体、多核苷酸、载体及其应用
本申请是申请日为2014年12月22日发明名称为“基于抗体的对转甲状腺素蛋白(TTR)淀粉样变性的疗法及其人源抗体”的申请号为201480076058.2的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明主要涉及对转甲状腺素蛋白(TTR)淀粉样变性的基于抗体的疗法。特别是，本发明涉及全新的特异性结合人转甲状腺素蛋白(TTR)和其抗原的分子，特别是识别错误折叠的、错误装配的、或聚集形式的TTR或其片段的人源重组抗体以及其片段、衍生物和变体，以及其在由这种致病性TTR同型引起的疾病和病症的治疗中是有用的。
此外，本发明涉及包含这样的结合分子、抗体和其模拟物的药物组合物和诊断组合物，两种组合物都作为有价值的诊断工具以鉴别与TTR淀粉样变性相关的疾病，也作为被动疫苗策略用于治疗与TTR淀粉样变性相关疾病的相关病症，诸如家族性淀粉样多发性神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)、老年性系统性淀粉样变性(SSA)、全身性家族性淀粉样变性、软脑膜/中枢神经系统(CNS)的淀粉样变性(包括阿尔茨海默病)、TTR相关的眼部淀粉样变性、TTR相关的肾淀粉样变性、TTR相关的高甲状腺素血症、TTR相关的韧带淀粉样变性(包括腕管综合症、肩袖撕裂和腰椎管狭窄症)和先兆子痫。
此外，本发明涉及由病原性TTR同型引起的疾病或病症的诊断方法，例如存在于淀粉样蛋白沉积物的错误折叠的和/或聚集的TTR，其中病理性TTR同型的水平在来源于施用抗TTR抗体后的受试者的体液样品中测定，其中当与给药前得到的对照样品比较，病理性TTR同型的存在或其水平改变(例如由TTR和抗TTR抗体的免疫复合物的存在而确定)表明所述疾病和/或病症。
背景技术
转甲状腺素蛋白(TTR)，以前称为前白蛋白，是127个氨基酸(NCBI参考序列：NP_000362.1)的可溶性蛋白，其在体内参与甲状腺素和视黄醇的转运。TTR在血液中由肝脏分泌，在脑脊液中由脉络丛分泌，也可以在像胰腺α细胞或视网膜上皮的特定组织中表达。TTR合成开始于胚胎时期和整个生命过程中持续。它以高浓度存在于血浆(3.6-7.2μM)和CSF(0.04-0.4μM)，并通常在生理条件下形成约55kDa的可溶性同源四聚体。
在尚未阐明，可能包括酸性pH、氧化压力和局部因素的特定条件下，TTR蛋白采取一种替代性的三围构象并变成具有毒性。
通过对一种罕见的常染色体显性遗传的名为家族淀粉样多发性神经病(FAP)的神经退行性病症(其在中年时影响成年人(Planté-Bordeneuve等人,Lancet Neurol.10(2011),1086–1097))的研究，发现了错误折叠的TTR蛋白的毒性。FAP的特点是渐进的导致诊断十年后死亡的感官、运动和植物神经障碍。神经的病变与无定形聚集体和TTR蛋白构成的淀粉样纤维沉积相关。Val30Met取代是造成FAP最常见的突变，特别是在该疾病流行的地区，如葡萄牙北部，但超过100种不同的突变已经在TTR基因中被鉴定；见下表IV。起作用的病理生理机制对于所有病理性突变都是相同的，在于该突变改变TTR四聚体的结构稳定性，促进TTR错误折叠，并导致有毒TTR类型(species)的形成(Saraiva等人,Curr.Med.Chem.19(2012),2304-2311)。
TTR的毒性也作为Val122Ile突变的结果被观察到，其以高频率(3-5％)在非洲裔美国人口和西非人口中被发现。这种突变与家族性淀粉样心肌病(FAC)相关，在该疾病中在心肌的大规模TTR堆积导致心脏衰弱，并最终导致心脏衰竭(Ruberg等人,Circulation.126(2012),1286-1300)。
TTR蛋白序列中的突变对于TTR毒性不是一个严格的要求，野生型TTR蛋白也容易产生错误折叠并形成有毒的聚集物。例如，老年性系统性淀粉样变性(SSA)的特征是心脏衰弱和在心肌内野生型TTR聚集物的积累(Ikeda,Amyloid.18Suppl 1(2011),155-156；Dungu等人,Heart.98(2012),1546-1554)。野生型TTR沉积物也在多例韧带及肌腱炎症(包括腕管综合症，肩袖撕裂和腰椎管狭窄症)病例中观察到，(Sueyoshi等人,Hum.Pathol.42(2011),1259-1264；Gioeva等人,Amyloid.20(2013),1-6)。此外，TTR淀粉样变性最近已经有报道在患有先兆子痫的母亲的胎盘中出现(Kalkunte等人,Am.J.Pathol.183(2013)1425-1436)。
对具有TTR淀粉样变性疾病的治疗是有限的，并且主要是侵入性的，其中治疗主要是对于症状的。在FAP的情况下，治疗依赖于止痛剂对神经性疼痛的管理，依赖于移除突变的TTR蛋白的主要来源的肝移植，并依赖于使用氯苯唑酸(Tafamidis)的治疗。氯苯唑酸(Tafamidis)是一种小分子，其与TTR四聚体结合并稳定其构象。它针对TTR四聚体的解离起作用，即导致毒性TTR类型形成的错误折叠通路的限速步。氯苯唑酸(Tafamidis)已被批准在欧洲用于治疗FAP，但尚未在美国批准，其治疗效果是有限的，在最好的情况下，减缓疾病的进展。目前还没有靶向于错误折叠的TTR蛋白的可用的治疗。
由于上述，对与TTR淀粉样变性相关疾病的有效和安全的治疗的全新治疗策略是需要的。
此技术问题是通过权利要求中表征的实施方式和在下面实施例和附图中进一步描述和说明而解决的。
发明内容
本发明提供用于预防或治疗与TTR淀粉样变性相关的疾病和病症的抗转甲状腺素蛋白(TTR)抗体和等效的TTR结合分子。更确切地，提供了治疗上有用的识别错误折叠、错误装配或聚集形式的TTR的人源重组抗体以及其片段和衍生物。
错误折叠的TTR聚集体与症状发作多年之前的细胞应激、氧化应激、炎症反应和细胞凋亡的标志物相关(Macedo等人,Mol.Med.13(2007),584-91)。人体识别异常折叠的蛋白质并降解它们的自然能力是一种保护因素，并且患者之间清除有毒TTR蛋白的能力的不同无疑促进了疾病发作和疾病进展速度的年龄差异。支持该假说的是，已经表明，接收来自FAP捐献者的肝移植的患者迅速发展了针对致病TTR蛋白的抗体(Ando等人,Transplantation.73(2002),751-755)，并且具有抗突变TTR蛋白高抗体效价的FAP患者比没有这种抗体的患者有更晚的疾病发作(Obayashi等人,Clin.Chim.Acta.419(2013),127-131)。此外，针对致病TTR构象的主动免疫被证明为几乎完全移除了FAP转基因小鼠中的TTR沉积物(Terazaki等人,Lab.Invest.86(2006),23-31)。
然而，尽管研究用于对此进行治疗干预的基于免疫的策略可能看起来很吸引人，迄今为止使用抗TTR抗体对相关疾病的治疗尚未进行。例如，在国际申请WO2010/030203中一个特定分离的对于TTR的小鼠单克隆抗体已经被描述并被建议在FAP筛选、以及研究和治疗相关疾病中使用。然而，由于小鼠单克隆抗体诱导人抗小鼠抗体(HAMA)反应，它们不适合用于人类的治疗。因此，自国际申请失效并且尚未没有后续发展发表，显然地基于抗体的治疗性方法未被继续使用。但是，到目前为止对于抗TTR抗体，只有对具有TTR淀粉样变性患者的诊断应用得到了进一步研究；见，例如，Phay M.等人,Rejuvenation Res.2013年10月28日。[先于纸质发表的电子版本]。
与此相反，在按照本发明进行的实验对人源单克隆TTR特异性抗体的分离是成功的，该单克隆抗体在人体内成熟，并特异性针对错误折叠的、错误装配的、突变的和/或聚集的TTR类型和/或其片段。分别作为B细胞(从其中分别已分离得到人源单克隆抗TTR抗体和编码它们的可变结构域的cDNA)来源的人类受试者和患者没有显示出显著量的错误折叠的TTR，并且没有与致病同型相关疾病的症状。然而，在本发明的另一个实施方式中，B细胞(从其中可能分别分离得到人源单克隆抗TTR抗体和编码它们的可变结构域的cDNA)的来源是显示出与TTR淀粉样变性相关疾病和/或病症的症状的患者。因此，期望本发明的人单克隆抗TTR抗体及其衍生物除了具有无免疫原性，在人体表现出治疗上有益的效果是谨慎的。
因此，本发明涉及人源重组抗体、抗原结合片段和能够特异性识别TTR的相似的抗原结合分子。如果不另外指出，否则，“特异性识别TTR”、“抗体特异于/用于TTR”和“抗TTR抗体”的抗体意指特异性地、一般地和共同地结合于TTR的天然单体形式；特异性结合于任一形式的TTR的抗体，例如突变的TTR、寡聚的、纤维状和/或非纤维状的TTR。本文提供的是对全长和/或片段和/或错误折叠的、错误装配的和/或聚合形式的TTR有选择性的的人源抗体。
如前面提到的，优选地本发明的抗TTR抗体是重组抗体，其中可变重链和/或轻链的至少一个、优选两个或更多个优选所有三个互补决定区(CDR)、和/或基本上整个可变区是由来源于mRNA的cDNA编码，所述mRNA从产生抗TTR抗体的人类记忆B细胞中获得。在一个优选的实施方式中，本发明的任何组合的抗TTR抗体显示出更多一种的结合和生物性质，正如为所附实施例和图中所示的主题抗体所证明的，优选更多一种结合和生物性质，正如为所附示例性抗体NI-301.59.F1、NI-301.35G11和NI-301.37F1证明的。
在本发明的一个特别优选实施例中，抗TTR抗体或其TTR结合片段证明了抗体的免疫学结合特性，其被如图1阐述的可变区VH和/或VL所表征。
所述抗体的抗原结合片段可以是单链Fv片段、F(ab')片段，F(ab)片段，和F(ab')2片段，或任何其他抗原结合片段。在一个具体实施方式下文中，抗体或其片段是人IgG同型抗体。可选的，该抗体是人类啮齿类嵌合抗体或啮齿类化的抗体，如鼠科或鼠科化的、大鼠或大鼠化的抗体，啮齿动物的版本对动物的诊断方法和研究是特别有用的。
此外，本发明涉及包含本发明的抗体或其活性片段的组合物，也涉及在预防、诊断或治疗与TTR淀粉样变性相关的病症中使用这样的组合物的免疫治疗和免疫诊断方法，其中有效量的组合物施用给需要的患者。
本发明还涉及编码本发明抗体的免疫球蛋白链的至少一个可变区的多核苷酸。优选地，所述可变区包含如图1所阐述可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。在本发明的优选实施方式中，所述多核苷酸为cDNA，优选来源于从产生与突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型反应的抗体的人类记忆B细胞中获得的mRNA。
因此，本发明还包括含有所述多核苷酸的载体和其转化的宿主细胞，以及它们生产抗体和对TTR有特异性的等价结合分子的用途。在本发明的进一步的实施方式中，所述抗体或结合分子能够结合错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型或其片段。用于重组生产抗体和其模拟物的方式和方法，以及用于可以是或可以不是抗体竞争结合分子的筛选方法在本领域是熟知的。然而，如本文所描述的，特别关于对人体的治疗应用，本发明的抗体是人类抗体，含义是，应用该抗体基本上没有针对这样抗体的免疫反应，而嵌合甚至是人源化抗体则观察到针对这样抗体的免疫反应。
此外，本文所公开的是用来识别TTR的组合物和方法，特别是样品中和/或体内的突变的、错误折叠的、错误装配的，或聚集的TTR类型或片段。所公开的抗TTR抗体及其结合片段可用于筛选人类血液、血浆、血清、唾液、腹膜液、脑脊髓液(“CSF”)、以及尿液样品中TTR和/或突变的、错误折叠的、错误装配的、或聚集TTR类型或其片段的存在，例如，通过使用基于ELISA或表面适应的测定。在一个实施方式中，本发明涉及诊断或监测与受试者体内突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型或其片段相关的病症的进展的方法，该方法包含确定在来自于受试者的样品中的突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型或其片段的存在，其中使用本发明的至少一种抗体或TTR结合分子和/或用于突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型或片段的具有其任一基本上相同的结合特异性的结合分子，其中突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型或片段是病症的指征。
此外，本发明的一个实施方式中，提供了用于制备一种组合物的包含本发明抗体的至少一个CDR的抗TTR抗体和TTR结合分子，组合物用于TTR的体内检测(也称为体内成像)或者靶向于TTR的治疗和/或诊断试剂，特别是人类和动物体内的突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型或其片段。本文公开的方法和组合物可以在与TTR淀粉样变性相关的和以例如通过TTR形式的发生为特征的疾病中提供帮助，并且可以用于监测疾病进展和提供给受试者治疗的治疗功效，例如体内成像相关的诊断方法。因此，在一个实施方式中，提供了本发明的抗TTR抗体和/或TTR结合分子其中所述体内检测(成像)包括显像、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射断层摄影(SPECT)、近红外(NIR)光学成像或磁共振成像(MRI)。
因此，提供用于治疗、诊断或预防与TTR淀粉样变性相关疾病的方法是本发明的一个特定目的。该方法包括对受试者施用有效浓度的优选的人抗体或抗体衍生物，其中所述抗体靶向于TTR或其片段，优选错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型或其片段。
在进一步的方面，本发明提供了具有由本发明的抗体特异性识别的TTR表位的肽，优选是错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR或其片段的表位。所述肽包含或由如下在详细说明和实施例中示出的氨基酸序列或其经修饰的序列组成，其中一个或多个氨基酸被取代、缺失和/或添加，附带条件是该肽仍然被同源抗体识别。如所提到的，这样的肽可被用作抗原，即作为免疫原，因此对于引发在受试者的免疫应答和在体内刺激产生本发明的抗体是有用的。因此，本发明的肽作为疫苗是特别有用的。
另外，本发明提供了在受试者中用于诊断与TTR淀粉样变性相关的疾病的方法，包括确定结合所述受试者的生物样品中的所述肽的抗体的存在的步骤。
在进一步的方面，本发明涉及诊断与TTR淀粉样变性相关的疾病、用抗TTR抗体监测疾病的治疗、或确定抗TTR抗体的诊断或治疗效用的方法，包括测定样品中错误折叠的和/或聚集的TTR的水平，例如从接受抗TTR抗体给药后的受试者获得的血液，其中与诸如从在抗TTR抗体给药之前的受试者获得的样品的对照相比，在受试者样品中错误折叠和/或聚集的TTR的存在或升高的水平显示与TTR淀粉样变性相关的疾病。
在本发明的一个优选实施方式中，特别是当使用非人的动物用于测试如实施例13中所示的重组人源性抗体和打算广泛用于人类的其他抗TTR抗体，通过确定抗TTR抗体和错误折叠和/或聚集的TTR之间形成的复合物来测定样品中错误折叠和/或聚集的TTR水平，例如通过用抗-人IgG或抗独特型抗体的免疫沉淀。
关于诊断方面，特别是对于人类受试者和患者，错误折叠的和/或聚集的TTR的存在和水平升高以及其与抗TTR抗体的复合物分别表明在人体中的TTR淀粉样蛋白沉积，例如在患者或受试者的心脏、外周神经系统(PNS)、眼睛、肌肉、胃肠道、肾脏、血管系统和中枢神经系统(CNS)。因此，本发明的方法一方面允许了受试者体内与TTR淀粉样变性相关的疾病的鉴别和确定，另一方面允许了从患者体内移除TTR沉积物，因此也显示给定治疗的治疗进程以及诸如抗TTR抗体的用于治疗TTR淀粉样变性的药物的疗效。
因此，如实施例13中所证明的，本发明的抗TTR抗体能够以足够的亲和力结合错误折叠和/或聚集的TTR，以改变病理性TTR沉积物的稳定性，诸如捕获和将错误折叠和/或聚集的TTR从沉积物中移除到体液，特别是血液。给药后的特定的时间间隔，即时间框架，在其后病理性TTR与抗TTR抗体复合物的水平，分别由执业医师测量和确定。通常情况下，使用的时间间隔不超过一周。在一个优选的实施方式中，来源于施用抗TTR抗体或其抗原结合片段后的患者或受试者的样品中的病理性TTR水平在小于或等于48小时内被测定；也参见实施例13。
本发明也涉及在上述方法中的任何抗TTR抗体和TTR结合分子的应用。然而，由于有利的特性，特别是因为是人源的，本文所公开的抗TTR抗体的应用是优选的。在一个优选的实施方式中，该抗体显示与任何下述抗体基本上相同的结合和生物活性，所述抗体选自NI-301.59F1，NI-301.35G11，NI-301.37F1，NI-301.2F5，NI-301.28B3，NI-301.119C12，NI-301.5D8，NI-301.9D5，NI-301.104F5，NI-301.21F10，NI-301.9G12，NI-301.12D3，NI-301.37F1-PIMC，NI-301.44E4，NI-301.18C4，NI-301.11A10，NI-301.3C9，NI-301.14D8，NI-301.9X4，和NI-301.14C3。抗TTR抗体也可以被改变以促进包括对如下面详细描述中的抗体的标记的诊断方法的处理。
本发明的进一步的实施方式将从描述和下面实施例显而易见。
附图说明
图1：人抗体NI-301.59F1、NI-301.35G11、NI-301.37F1、NI-301.2F5、NI-301.28B3、NI-301.119C12、NI-301.5D8、NI-301.9D5、NI-301.104F5、NI-301.21F10、NI-301.9G12、NI-301.12D3、NI-301.37F1-PIMC、NI-301.44E4、NI-301.18C4、NI-301.11A10、NI-301.3C9、NI-301.14D8、NI-301.9X4、和NI-301.14C3的可变区的氨基酸序列。
框架(FR)和互补决定区(CDR)其中CDR被下划线来表示。使用了Kabat编号方案(参见http://www.bioinf.org.uk/abs/)。
图2：通过直接ELISA结合聚合的、野生型和突变的TTR。
A，B，C：ELISA板用聚集的人野生型TTR(●)，聚集的重组V30M-TTR
Figure BDA0002393114180000101
和牛血清白蛋白(BSA)(■)(10μg/ml)包覆，并与下面的浓度为4pM至400nM范围内的人单克隆抗体孵育：A)NI-301.59F1，B)NI-301.35G11和C)NI-301.37F1。
EC50值通过用最小二乘法拟合数据点估计。
NI-301.59F1：聚集wt-TTR EC50＝3.0nM，聚集V30M-TTR EC50＝15.5nM
NI-301.35G11：聚集wt-TTR EC50＝3.9nM，聚集V30M-TTR EC50＝5.0nM
NI-301.37F1：聚集wt-TTR EC50＝0.35nM，聚集V30M-TTR EC50＝0.15nM
图3：斑点印迹中对聚集TTR的特异性。
天然(1)或聚合(2)构象的人野生型TTR蛋白，和聚集的重组V30M-TTR蛋白(3)沉积在硝酸纤维素膜，并与下列抗体孵育：a)商购的兔多克隆抗体抗TTR(DAKO-A0002；150ng/mL)中，B)NI-301.59F1 C)NI-301.35G11和D)NI-301.37F1(B，C和D：50nM的人单克隆抗体)。
图4：Western印迹法中对聚合TTR的特异性。
天然(1)或聚合(2)构象的人野生型TTR蛋白(300ng)，和野生型小鼠肝脏提取物(10μg总蛋白)(3)被上样到SDS-PAGE凝胶并处理用于使用下列抗体的Western印迹法：A)商购的兔多克隆抗TTR抗体(Dako-A0002；150ng/mL)，B)NI-301.59F1C)NI-301.35G11和D)NI-301.37F1(B，C和D：50nM的人单克隆抗体)。为了防止高分子量聚集体的解离，在上样到凝胶之前，聚集TTR样品用戊二醛(1％，5分钟)交联。
图5：Western印迹法中结合人血浆TTR的缺乏。
来自对照(n＝5)，无症状突变携带者(n＝5)和FAP患者(n＝4)的血浆样品(0.5μL)被上样到SDS-PAGE凝胶并处理用于使用下列抗体的Western印迹法：A)商购的兔多克隆抗TTR抗体(Dako-A0002；150ng/mL)，B)仅次级抗体(抗人IgG-HRP，1/10000稀释)，C)NI-301.35G11和D)NI-301.37F1(C和D：50nM的人单克隆抗体)。
图6：斑点印迹中结合人体血浆TTR的缺乏。
天然和聚合构象的纯野生型和突变的TTR蛋白和来自对照、无症状突变携带者和FAP患者的血浆样品沉积在硝酸纤维素膜上，并与下列抗体孵育：A)商购的兔多克隆抗TTR抗体(Dako-A0002；150ng/mL)，B)仅次级抗体(抗小鼠IgG2a-HRP，1/10000稀释)，和C)鼠嵌合抗体NI-301.mur35G11(10nM)。
试样1-6：150ng 1)聚集的wt-TTR，2)天然的wt-TTR，3)BSA，4)天然的V30M-TTR，5)天然的L55P-TTR和6)天然的Y78F-TTR。
样品7-18：收集自7-10)对照(n＝4)，11-14)无症状的突变携带者(n＝4)和15-18)FAP患者(n＝4)的2μL血浆。
图7：溶液中特异性结合聚集的TTR。
天然或聚合构象的人野生型和重组TTR蛋白，3种不同稀释的人血浆样品用于使用下列抗体TTR免疫沉淀(IP)：A)商购的兔多克隆抗TTR抗体(Dako-A0002)，B)NI-301.35G11和C)NI-301.37F1。免疫沉淀的蛋白质提交给SDS-PAGE，被使用Dako公司-A0002抗体(150ng/mL)的Western印迹法(WB)检测。
1-2道：WB加载对照：300ng的1)人wt-TTR，2)重组wt-TTR
3-6道：对纯TTR蛋白的IP：3)人天然野生型wt-TTR，4)人聚集的wt-TTR，5)重组天然wt-TTR和6)重组聚集wt-TTR
7-10道：对用PBS稀释了7)10倍，8)100倍，9)1000倍的人血浆和10)仅PBS的IP。
图8：对FAP小鼠组织中的TTR的特异性结合。
在TTR敲除(KO)背景的表达人V30M-TTR等位基因的转基因小鼠重现了FAP的组织病理学特点，包括在各种组织中的无定形和淀粉样TTR蛋白沉积。收集自A)FAP小鼠和B)TTR-KO小鼠的肝和肠组织切片被处理以用于使用下列抗体的免疫组织化学：1)商购的兔多克隆抗TTR抗体(Dako-A0002；1/1000稀释)，2)NI-301.35G11和3)NI-301.37F1(2和3：50nM的人单克隆抗体)。
图9：在人体组织内对错误折叠的TTR沉积物的特异性结合，而非天然TTR。
抗体的特征是它们结合FAP患者皮肤活检切片和健康对照胰腺切片上的TTR的能力：作为FAP特征的错误折叠的TTR聚集存在于病人皮肤活检物中，而胰腺α细胞显示的TTR内源表达。切片被处理以用于使用下列抗体的免疫组织化学：1A)商购的兔多克隆抗TTR抗体(Dako-A0002；1/1000稀释)1B)HRP偶联的抗兔IgG抗体(1/125稀释)，2A)小鼠嵌合抗体NI-301.mur35G11(50nM)，2B)HRP偶联的抗小鼠IgG2a抗体(1/125稀释)，3A)NI-301.37F1(50nM)，和图3B)HRP偶联的抗-人IgG(1/125稀释)。
图10：肽扫描分析的TTR结合表位。
TTR上的抗体结合表位是使用该肽扫描方法来确定的。除了覆盖人野生型TTR全序列(点1～29)的肽，选择的TTR突变也在膜上被表现出来(点30至44)。肽扫描膜与以下50nM的抗体孵育A)NI-301.59F1，B)NI-301.35G11和C)，NI-301.37F1。如归纳于表D)：
NI-301.59F1结合EEEFVEGIY(TTR 61-69)；NI-301.35G11结合GELHGLTTEEE(TTR53-63)；L55P突变阻止抗体结合；和
NI-301.37F1结合WEPFA(TTR 41-45)；所述E42G突变阻止抗体结合。为了确定所述的表位的序列要求，结合TTR上表位的抗体使用丙氨酸扫描法进一步鉴定。人野生型TTR蛋白的全序列在膜上表现为一组长度为15个氨基酸的151连续的肽，开始于TTR蛋白的每一个氨基酸。对于每种肽，10位的氨基酸被丙氨酸取代，或当起始氨基酸是丙氨酸时被甘氨酸或脯氨酸取代。肽扫描膜与20nM的以下的抗体孵育：E)NI-301.59F1，F)NI-301.35G11和G)NI-301.37F1。如表H)所总结的：
NI-301.59F1结合EEFXEGIY(TTR 62-69)。
NI-301.35G11结合ELXGLTXE(TTR 54-61)。
NI-301.37F1结合WEPFA(TTR 41-45)，其中，X表示氨基酸；将E42用丙氨酸取代并不干扰结合，但用鸟嘌呤取代防止如C中所报道的抗体结合。
图11：溶液中抗体对TTR蛋白的结合动力学通过表面等离子体共振来评估。
抗体NI-301.37F1对TTR蛋白的结合动力学通过表面等离子共振(SPR)测定。通过抗人IgG抗体的手段，抗体NI-301.37F1在传感器上被捕获，并且TTR蛋白溶液飞过传感器表面，在3.2至316nM浓度范围内。简单的1:1结合模型被用来拟合数据，并得出相应的结合(ka)和解离(kd)常数和亲和力(KD)。对于A)天然构象的人野生型TTR蛋白，B)变性的人野生型TTR蛋白(错误折叠的构象)，和C)重组突变的TTR-L55P蛋白的结合性质被确定。
天然野生型TTR：ka＝没有确定，kd＝没有确定，KD>316nM
变性的野生型TTR：ka＝2.1x 104M-1秒-1，kd＝2.6x 10-5秒-1，KD＝1.2nM
重组TTR-L55P：ka＝3.3x 104M-1秒-1，kd＝4.6x 10-5秒-1，KD＝1.4nM。
图12：使用抗TTR抗体的慢性治疗降低了FAP小鼠模型的病理性TTR沉积。
FAP的小鼠(Tg的(6.0hMet30)×muTTR-KO)接受12周剂量为3mg/kg的小鼠嵌合NI-301.37F1或同种型对照抗体的每周腹腔注射。在治疗期结束时，收集组织并通过免疫荧光对TTR沉积的程度进行定量。A)对7月龄的小鼠的治疗效果(每组n＝14-15只小鼠)；B)对17月龄的小鼠的治疗效果(每组n＝10只小鼠)。组间比较使用双尾、非配对t检验。
图13：抗体对体内病理性TTR沉积物的结合。
靶接合是在成年FAP小鼠(7月龄)在接受30mg/kg剂量抗体NI-301.37F1或PBS的单次腹腔注射后48小时表征的。采用免疫荧光法同时检测病理性TTR沉积物和注射的抗体的定位。
A，D)在(A)NI-301.37F1-或(D)PBS-注射的小鼠的肾脏中的病理性TTR沉积物。B，E)在(B)NI-301.37F1-或(E)PBS-注射的小鼠检测人类抗体。C，F)叠加的图像显示TTR和NI-301.37F1(C)共定位和(F)无特异性染色。
图14：在体内无组织地检测错误折叠TTR。
成年FAP小鼠接受以3mg/kg剂量抗体NI-301.37F1或同种型对照抗体的单次腹腔注射。血样在抗体注射之前(t＝0)和抗体注射之后48小时(t＝48小时)收集。血浆样品通过使用抗人IgG抗体的免疫沉淀处理，并通过Western印迹法分析，用于检测：A)构象独立的抗TTR多克隆抗体(Dako A0002，150ng/mL)，和B)NI 301.37F1(20nM)。平行地，在处理之前，从未注射的FAP小鼠获得的血浆样品在体外与抗体NI-301.37F1孵育。
图15：通过ELISA评价的抗体对聚集蛋白的特异性。
抗体对TTR蛋白的特异性通过直接ELISA测定对选定的聚集蛋白的结合来评价。抗体结合是在4nM和20nM评价的，并且信号强度是以相对于背景水平的倍数变化来表示的，在没有抗TTR抗体的情况下进行每次测定。
A-B)NI-301.37F1的结合在20nM(A)和4nM(B)测定
C-D)NI-301.44E4的结合在20nM(C)和4nM(D)测定。
具体实施方式
本发明一般涉及免疫和非侵入性的方法，用于检测与病理性的、通常是突变的和/或错误折叠的转甲状腺素蛋白(TTR)同型的存在相关的疾病和病症。更具体地，本发明涉及重组人源单克隆抗体及其抗原结合片段，其已基于从选择的人类供体人群获得的序列信息被生成，并能够结合到这样的TTR同型和其抗原。本发明的重组人源单克隆抗体有利地具有特异性结合错误折叠的、错误装配的、突变的和/或聚集的TTR或其片段的特征，允许以病理性变化的TTR类型的治疗和/或诊断为目标。由于它们的人源性，本发明所得到的重组抗体可以合理地预计作为治疗药物是有效和安全的，并作为检测病理性TTR的诊断试剂是高特异性的，而不给出假阳性。
此外，本发明的抗体以及其衍生物可用于在器官移植后仍然具有发展成TTR淀粉样变性(由于例如它们的沉积、例如TTR的遗传性突变或肝脏内产生TTR中的缺陷)的风险的患者的联合疗法。因此，作为一种特别有利的实施方式，本发明涉及人单克隆抗体和本文所述的其任何衍生物，单独用于患者的治疗或者用于在器官移植后接受例如免疫抑制剂或其他对与TTR淀粉样变性相关症状有效的药物的患者的治疗，其中本发明的抗体和其任何衍生物被设计为与免疫抑制剂和/或抑制进一步副作用的药物同时施用或在在给药之前或之后顺序施用。在这方面，本发明的抗TTR抗体和TTR结合片段对于人体优选是基本上非免疫原性的。在本发明的一个实施方式中，包含本发明的人单克隆抗体或其任意衍生物以及一种或多种免疫抑制剂的药用组合物被提供，和/或被用于与TTR淀粉样变性相关的症状。
一、定义
除非另有说明，如本文所使用的术语如在Oxford Dictionary of Biochemistryand Molecular Biology(《生物化学和分子生物学牛津词典》)，牛津大学出版社，1997年提供，2000年修订和2003年再版，ISBN 0 19 850673 2中给出的定义。
应该指出的是，术语“一个”或“一种”实体指的是一个/一种或多个/多种该实体；例如，“一种抗体”，应理解为代表一种或多种抗体。这样，术语“一个”(或“一种”)，“一个/一种或多个/多种”和“至少一个/至少一种”可以在本文中互换使用。
除非另有特别说明，术语“TTR”，可互换使用以具体指不同形式的转甲状腺素蛋白(TTR)。术语“TTR”也用于一般确认TTR的其他构象，例如，寡聚物和/或错误折叠的、错误装配的和/或聚集形式的TTR。术语“TTR”也被用于统指所有类型/种类和形式的TTR，如突变的TTR。在术语TTR前面添加的字母用来表示特定同源来源于的生物，例如，hTTR代表人类TTR或者mTTR代表鼠科来源。此外，除非另外指明，本文所用的对TTR氨基酸序列的编号系统指成熟TTR蛋白，即例如在信号肽切割之后被细胞分泌的TTR蛋白。该编号是用于定义在患者体内发现的TTR突变的编号，如TTR-V30M或TTR-L55P，但不同于用于转甲状腺素蛋白前体蛋白序列的编号系统(NCBI参考序列：NP_000362.1)。在这方面，在突变TTR中的位置和取代的氨基酸可以用不同但等效的方式来表示；见，例如，“TTR-V30M”和“V30M-TTR”。
本文公开的抗TTR抗体特异性结合TTR及其表位，以及结合TTR及其表位的各种构象。例如，本文公开的特异性结合病理性改变的TTR或其片段的抗体，如寡聚物/原纤和/或突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集形式的TTR或其片段。术语(病理性)突变的、错误折叠的、错误装配的、聚集的TTR/TTR聚集体可互换使用来专指上述形式。本文所用的术语(病理性)“聚集形式”或“聚集体”描述了由于彼此的TTR错误的/病理性的相互作用，累积或群集形成的产物。这些聚集体，集聚或群集形式可以是，基本上由或由TTR和/或TTR片段两者组成，和由非纤维状的寡聚体和/或纤维状的寡聚体和它们的原纤维组成。如本文中所使用的，提到“特异性结合”、“选择性地结合”或“优先结合”TTR的抗体指的是不结合其他不相关蛋白质的抗体。在一个实施例中，本文公开的TTR抗体可以结合的TTR或其表位，并以高于约2倍背景显示与其他蛋白质不结合。在一个优选的实施方式中，本发明的抗体基本上不识别选自由α-突触核蛋白(α-syn)、Tau、中介响应DNA结合蛋白43(TDP-43)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、亨廷顿蛋白(HTT)组成的组(参见，例如图15)的不相关的淀粉样形成的蛋白。“特异性结合”或“选择性地结合”TTR构象的抗体，是指不结合TTR的所有构象的抗体，即不结合至少一种其他TTR构象。
例如，本文所公开的是可以在体外和组织(来源于具有与TTR淀粉样变性相关疾病的或具有发展为与TTR淀粉样变性相关疾病危险的患者)内都优先结合错误折叠的、错误装配的和/或聚集形式的TTR的抗体。由于本发明的TTR抗体的序列已经从人类受试者获得，本发明的TTR抗体也可以称为“人自身抗体”或“人源抗体”，以便强调那些抗体确实最初由受试者表达而不是产生的合成的构建体，例如通过人免疫球蛋白表达噬菌体文库，其迄今代表一种试图提供类人抗体的常见方法。
术语“肽”应理解为包括术语“多肽”和“蛋白/蛋白质”(其中，有时在本文中可以互换使用)在其含义内。类似地，蛋白和多肽的片段也可被考虑并可在本文中称为“肽”。但是，术语“肽”优选表示包含至少5个连续氨基酸的氨基酸聚合物，优选至少10个连续氨基酸，更优选至少15个连续氨基酸，还更优选至少20个连续氨基酸，特别优选至少25个连续氨基酸。此外，根据本发明的肽通常具有TTR多肽的不超过100个连续氨基酸，优选少于80个连续氨基酸，更优选少于50个连续氨基酸，还更优选不超过15个连续氨基酸。
多肽：
如本文中所使用的，术语“多肽”意在包括单数个的“多肽”以及复数个的“多肽”，指的是通过酰胺键(也称为肽键)线性连接单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何链或多条链，并且不是指产物的特定长度。因此，“肽”，“二肽”，“三肽”，“寡肽”，“蛋白/蛋白质”，“氨基酸链”或用来指两个或更多个氨基酸的一条链或多条链的任何其他术语，包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以用来代替这些术语的任一个或可与这些术语的任一个互换。
术语“多肽”也意指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化和通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解裂解(或蛋白切割)、或被非天然存在的氨基酸修饰。多肽可以衍生自天然生物来源或通过重组技术产生，但不必要从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式产生，包括化学合成。
本发明的多肽可以是大小为约3个或更多、5个或更多、10个或更多、20个或更多、25个或更多、50个或更多、75或更多、100个或更多、200个或更多、500个或更多、1000个或更多、或2000个或更多个氨基酸。具有限定的三维结构的多肽被称为折叠的，而不具有限定的三维结构的多肽可以采用大量不同的构象，并且被称为非折叠的。如本文所使用的，术语糖蛋白是指偶联到至少一个糖基的蛋白，所述糖基通过氨基酸残基的含氧的或含氮的侧链(例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基)连接到蛋白上。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物指的是不处在其天然环境的多肽。不需要特别的纯化水平。例如，分离的多肽可以从它自然或天然的环境移除。重组产生的多肽和在宿主细胞中表达的蛋白被认为是为本发明的目的而被分离，正如是通过任何合适的技术被分离、分馏或部分或基本上纯化的天然或重组的多肽。
“重组肽、多肽或蛋白质/蛋白”是指通过重组DNA技术(即从细胞、微生物或哺乳动物产生，通过编码包含所需肽的融合蛋白的外源性重组DNA表达构建体转化)产生的肽、多肽或蛋白质/蛋白。在大多数细菌培养物中表达的蛋白或肽通常是不含聚糖的。在酵母中表达的蛋白或多肽可具有与在哺乳动物细胞中表达的蛋白或多肽不同糖基化模式。
作为本发明的多肽而被包括的是前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体以及它们的任何组合。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括具有足够类似于天然肽的氨基酸序列的氨基酸序列的肽和多肽。术语“足够类似”指的是第一个氨基酸序列，其包含足够的或最小数量的相对于第二个氨基酸序列相同的或等效的氨基酸残基，使得第一个和第二个氨基酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，包含至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％相同的共同结构域的氨基酸序列在本文被定义为足够类似。优选地，变体将是足够相似于本发明优选的肽的氨基酸序列，特别是足够相似于TTR、变体、衍生物或它们各自的类似物。此类变体通常保留了本发明的肽的功能活性。变体包括通过一个或多个氨基酸缺失、添加和/或取代的途径在氨基酸序列上分别不同于天然肽和WT肽的肽。这些可以是天然存在的变体以及人工设计的变体。
此外，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”当指的是本发明的抗体或抗体多肽时，包括任何保留至少一些相应的天然结合的分子、抗体或多肽的抗原结合特性的多肽。除了本文其他地方讨论的特定抗体片段，本发明的多肽片段包括蛋白水解片段，以及缺失片段。本发明的抗体的变体和抗体多肽的变体包括如上所述的片段，和具有由于氨基酸取代、缺失或插入改变的氨基酸序列的多肽。变体可天然存在或是非天然存在的。非天然存在的变体可以使用本领域已知的诱变技术产生。变体多肽可包含保守或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。诸如本发明抗体和抗体多肽的TTR特异性结合分子的衍生物，是已被改变从而显示出在天然多肽找不到的额外特性的多肽。实例包括融合蛋白。在本文中变体多肽还可以称为“多肽类似物”。如本文中所使用的结合分子或其片段、抗体或抗体多肽的“衍生物”是指具有由官能侧基的反应化学衍生的一种或多种残基的受试者多肽。也被包括作为“衍生物”的是那些含有二十种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；鸟氨酸可以取代赖氨酸。
分子的相似性和/或同一性的确定：
两个肽之间“相似度/相似性/类似性/类似度”是通过比较一个肽的氨基酸序列与第二个肽的序列而确定的。如果它是相同的或保守的氨基酸取代，则一个肽的氨基酸是相似/类似于第二个肽的相应的氨基酸。保守的取代包括那些在Dayhoff，M.O.编，The Atlasof Protein Sequence and Structure 5(《蛋白质序列和结构图集5》)，NationalBiomedical Research Foundation(国家生物医学研究基金会)，华盛顿特区(1978年)，并在Argos,EMBO J.8(1989),779-785中所说明的。例如，属于下列组中的一个的氨基酸代表保守的改变或取代：-丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸；-半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸；-缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸；-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；-苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸；和-天冬氨酸、谷氨酸。
两个多核苷酸之间的“相似度/相似性/类似性/类似度”是通过将一个多核苷酸的核酸序列与一个多核苷酸的序列进行比较而确定的。如果它是相同的或该核酸是编码序列的一部分，分别的三联体包含编码相同氨基酸的核酸或用于保守的氨基酸取代，则一个多核苷酸的核酸与第二个多核苷酸的相应的核酸类似/相似。
两个序列之间同一性或相似性百分比的判断优选使用是使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:5873-5877的数学算法实现。这样的算法并入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTn和BLASTp程序，其可在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge)获得。
同一性或相似性百分比的判断是使用用于BLAST多核苷酸搜索的BLASTn程序的标准参数和用于BLAST蛋白搜索的BLASTp程序的标准参数进行的，正如在NCBI网页上和在关于具有特定长度和组成的序列的“BLAST Program Selection Guide(BLAST程序选择指南)”所推荐的。
BLAST多核苷酸搜索是使用BLASTn程序进行的。对于一般的参数，“最大目标序列”框可以被设置为100，“短查询”框可以勾选，“期待阈”框可以被设置为1000，“字大小”框可被设置为7，正如NCBI网页为短序列(少于20个碱基)所推荐的。对于更长的序列，“期待阈”框可被设定为10，“字大小”框可被设定为11。对得分参数的“匹配/不匹配得分”可以设置为1，-2，“差距成本”框可被设置为线性的。对于过滤器和屏蔽参数，“低复杂性区域”框可以不勾选，“物种特异性重复”框可以不勾选，“仅用于查找表的掩码”框可以被勾选，“防尘过滤器设置”可以被勾选和“掩码小写字母”框中可以不勾选。一般而言，“搜索短近精确匹配”可能用于这方面，它提供了大部分的上述设置。这方面的更多信息可在发布于NCBI的网页上的“BLAST程序选择指南”中找到。
BLAST蛋白质搜索是使用BLASTp程序进行的。对于一般的参数，“最大目标序列”框可以被设置为100，“短查询”框可以勾选，“期待阈”框可被设定为10，“字大小”框可被设置为“3”。对于得分参数“矩阵”框可被设置为“BLOSUM62”，“落差费用”框可被设置为“存在：11扩展名：1”，“成分的调整”框可被设置为“有条件的成分得分矩阵调整”。对于过滤器和掩蔽参数“低复杂性区域”框可以不勾选，“仅用于查找表的掩码”框可以不勾选，“掩码小写字母”框中可以不勾选。
这两个程序的修改，例如，对于所搜索的序列的长度，根据发布在NCBI的网页上的HTML和PDF版本的“BLAST程序选择指南”中的推荐进行。
多核苷酸：
术语“多核苷酸”旨在包括单数个的核酸以及复数个的核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包括常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如，酰胺键，如在肽核酸(PNA)中发现)。术语“核酸”是指任何一个或多个核酸区段，例如，DNA或RNA片段，存在于多核苷酸中。“分离的”核酸或多核苷酸意指核酸分子，DNA或RNA，其已从其天然环境中取出。例如，编码的抗体的包含在载体中的重组多核苷酸被认为是分离的，以用于本发明的目的。分离的多核苷酸的其他实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中(部分或基本)纯化的多核苷酸。分离的RNA分子包括在体内或体外本发明多核苷酸的RNA转录物。根据本发明分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的这些分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件，例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，其由翻译为氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG，TGA或TAA)不翻译成氨基酸，它可以被认为是编码区的一部分，但任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等等，都不是编码区的一部分。本发明的两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体，例如，在一个单独的载体上，或者在分离的多核苷酸构建体，例如，在分离的(不同的)的载体上。此外，任何载体可含有一个单一的编码区，或者可包括两个或更多编码区，例如，一个单独的载体可分别编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，或者与编码结合分子、抗体、或其片段、变体、或衍生物的核酸融合或不融合。异源编码区域包括但不限于专门的元件或基序，例如分泌信号肽或异源功能性结构域。
在某些实施方式中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包括编码多肽的核酸的多核苷酸通常可能包含一个启动子和/或与一个或多个编码区相关联的可操作的其他转录或翻译控制元件。可操作关联是当基因产物(如多肽)的编码区与一个或多个调节序列以这样的方式相关，以便将基因产物的表达置于调节序列的影响或控制下。两个DNA片段(例如多肽编码区和与其相关联的启动子)是“可操作相关的”或“可操作地连接的”，如果启动子的功能的诱发导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调控序列指导基因产物的表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区将是与编码多肽的核酸可操作地相关联的。所述启动子可以是仅在预先确定的细胞中指导DNA大量转录的细胞特异性启动子。除了启动子，其他转录控制元件，例如增强子、调控子、阻抑子、和转录终止信号，可以是与指导细胞特异性转录的多核苷酸可操作地相关联的。合适的启动子和其他转录控制区都在本文公开。
多种转录控制区对于本领域技术人员是已知的。这些包括，但不限于，在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如，但不限于，来源于巨细胞病毒的启动子和增强子区段(立即早期启动子，与内含子-A结合)，猿猴病毒40(早期启动子)，和逆转录病毒(如劳斯肉瘤病毒)。其他的转录控制区包括那些来源于脊椎动物的基因，如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-内球蛋白，以及在真核细胞中能够控制基因表达的其他序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子，以及淋巴因子诱导的启动子(例如，由干扰素或白介素诱导的启动子)。
类似地，各种翻译控制元件对于本领域技术人员是已知的。这些包括，但不限于核糖体结合位点，翻译起始和终止密码子，和来源于小核糖核酸病毒(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也被称为CITE序列)的元件。
在其他实施方式中，本发明的多核苷酸是RNA，例如，以信使RNA(mRNA)的形式。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌肽或信号肽的附加编码区相关联，其指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长蛋白链跨越粗面内质网的的输出启动，所述信号肽或分泌前导序列就从成熟蛋白被切割。本领域的普通技术人员知道，由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合到多肽N-端的信号肽，其从完整的或“全长”多肽被切割以产生多肽的分泌形式或“成熟”形式。在某些实施方式中，天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽被使用，或保留指导与其可操作相关的多肽分泌的能力的序列的功能性衍生物被使用。可替换地，异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物可以被使用。例如，野生型前导序列可以被人组织纤维蛋白溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶的前导序列取代。
如在本发明上下文中使用的“结合分子”主要涉及抗体、及其片段，但也可以指结合TTR的其他非抗体分子，包括但不限于激素、受体、配体、主要组织相容性复合物(MHC)分子、分子伴侣如热休克蛋白(HSP)、以及细胞-细胞粘附分子如钙粘着蛋白、整合素、C-型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。因此，仅为清楚起见，而并非限制本发明的范围，下面的实施例的大多数是关于代表优选的用于治疗和诊断剂的开发的结合分子的抗体和抗体样分子的讨论。
抗体：
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。抗体或免疫球蛋白是至少包含重链的可变结构域，并通常至少包含重链和轻链的可变结构域的结合分子。脊椎动物系统中基本免疫球蛋白的结构是比较充分了解的；见，例如，Harlow等，Antibodies:ALaboratory Manual(《抗体：实验室手册》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，第2版，1988。
如将在下面更详细地讨论的，术语“免疫球蛋白”包括可以生化方式区分的各种广泛类型的多肽。本领域技术人员将理解，重链被分类为γ，μ，α，δ或ε，(γ，μ，α，δ或ε)，在其中有一些亚类(例如，γ1-γ4)。正是这种链的性质决定了抗体“类”分别为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等等，被很好地表征，并且已知赋予功能特化。每个这些类和同种型的修饰形式根据本发明的公开对于本领域技术人员是容易识别的，因此，是本发明的范围之内。所有免疫球蛋白的类别显然是本发明的范围内，下面的讨论将主要涉及免疫球蛋白分子的IgG类。对于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含两个相同的具有约23000道尔顿分子量的轻链多肽，和两个相同的具有约53000-70000道尔顿分子量的重链多肽。该四条链通常通过二硫键以“Y”构型连接，其中所述轻链支撑起始于“Y”嘴部的重链，并通过可变区延续。
轻链被分类为κ或λ(κ，λ)。每个重链类别可以与κ或λ轻链结合。在一般情况下，轻链和重链共价结合在一起，当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或遗传改造的宿主细胞产生时，两个重链的“尾”部通过共价二硫键或非共价键相互键合。在重链中，氨基酸序列从处于Y构型叉形端的N-端开始延伸至处于每条连底部的C-端。
轻链和重链均分为结构和功能同源性区域。术语“恒定”与“可变”是以功能使用的。在这方面，可以理解，轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域决定抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1，CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物特性，如分泌、经胎盘的移动性、Fc受体结合、补体结合等等。按照惯例，恒定区结构域的编号随着它们变得与抗原结合位点或抗体的氨基端更远端而增加。N端部分是可变区而在C端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包括重链和轻链的羧基末端。
如上所述，可变区允许抗体选择性地识别并特异性地结合抗原上的表位。即，抗体的VL结构域和VH结构域，或者互补决定区(CDR)的亚基(或亚群，subset)结合，以形成限定了三维抗原结合位点的可变区。这个四级的抗体结构形成了存在于Y的每个臂的末端的抗原结合位点。更确切地说，抗原结合位点是由在每个VH和VL链的三个CDR限定。含有足够的结构特异性结合TTR的任何抗体或免疫球蛋白片段在本文被可互换地表示为“结合片段”或“免疫特异性片段”。
在天然存在的抗体中，抗体包含六个高变区，有时被称为存在于每个抗原结合结构域的“互补决定区”或“CDR”，其是特定地定位以形成正如抗体在水环境中认定其三维构型的抗原结合结构域的短的、非连续的氨基酸序列。“CDR”侧面有四个显示较低分子间变异性的相对保守的“框架”的区域或“FR”。框架区主要采取-折叠构象，并且CDR形成环状结构，该环状结构连接，并在一些情况下形成所述-折叠结构的一部分。
因此，框架区起作用以形成通过链间非共价相互作用提供了使CDR以正确的方向定位的脚手架。由定位的CDR形成的抗原结合结构域限定了对免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补的表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。包含CDR和框架区的氨基酸，可以分别容易地被本领域普通技术人员确定用于任何给定的重链或轻链可变区，因为它们已被准确地定义；见，Sequences of Proteins of Immunological Interest(《免疫相关蛋白序列》)，Kabat，E等人，美国卫生和人类服务部(1983)，以及Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.,196(1987),901-917。
在某些情况下，存在本领域中使用和/或接受的对一个术语的两个或更多的定义，本文所使用的该术语的定义是指包括所有这些含义，除非明确说明有相反的。一个具体的例子是术语“互补决定区”(“CDR”)的使用来描述重链和轻链多肽的可变区内发现的不连续的抗原结合位点。这个特定区域已经在Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(《免疫相关蛋白序列》)，Kabat，E等人，美国卫生和人类服务部(1983)和Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.,196(1987),901-917描述，其通过引用并入本文，其中，当相互比较时定义包括重叠的或氨基酸残基的亚基。然而，任一定义的应用来指抗体或其变体的CDR旨在是所定义和本文所使用的术语的范围之内。其中包括上述每个引用的参考文献所定义的CDR的合适的氨基酸残基列于下表I作为比较。其中包含特定的CDR的准确残基数将随着CDR的序列和大小而变化。考虑到抗体的可变区氨基酸序列，本领域的技术人员可以按常规确定哪些残基包括抗体的人IgG子类的特定高变区或CDR。
表I:CDR定义<sup>1</sup> Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1表Ⅰ中所有CDR定义的编号是根据由Kabat等人提出的编号约定(见下文)。
Kabat等人还定义了可变结构域序列的编号系统，该系统适用于任何抗体。一个本领域的普通技术人员可以给任何可变结构域序列明确分配此系统“Kabat编号”，而无需依赖超出序列本身的任何实验数据。如本文所使用的，“Kabat编号”是指由Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(《免疫相关蛋白序列》)，美国卫生和人类服务部(1983)提出的编号系统。除非另外指明，在本发明的抗体或抗原结合片段、变体、或其衍生物中的具体氨基酸残基位置的编号引用根据Kabat编号系统，然而这是理论的，可能不是同样适用于本发明的每个抗体。例如，根据第一个CDR的位置，后面的CDR可能在任一方向移动。
本发明的抗体或抗原结合片段、免疫特异性片段、变体或其衍生物包括，但不限于，多克隆、单克隆、多特异性、人类、人源化、灵长、鼠源性或嵌合的抗体、单链抗体、表位结合片段，例如，Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段、以及抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，对本文所公开的抗体的抗Id抗体)。scFv分子在本领域是已知的并且描述于，例如，美国专利5,892,019。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或免疫球蛋白分子亚类。
在一个实施方式中，本发明的抗体不是具有五价结构的IgM或其衍生物。特别是，在本发明的特定应用中，特别是治疗用途，IgM比IgG和其他二价抗体或相应的结合分子有更低的有用性，由于其五价结构和缺乏亲和力成熟，IgM常表现出非特异性交叉反应性和非常低的亲和力。
在一个特别优选的实施方式中，本发明的抗体不是多克隆抗体，即，它基本上由一个特定抗体类型而不是从血浆免疫球蛋白样品获得的混合物构成。
抗体片段，包括单链抗体，可包括仅可变区或连同以下的全部或一部分：铰链区、CH1、CH2、和CH3结构域。TTR结合片段也包括在本发明中，其包括可变区与铰链区、CH1、CH2、和CH3结构域的任何组合。本发明的抗体或其免疫特异性片段可以是来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马、或鸡的抗体。在另一个实施方式中，可变区可以来源于软骨鱼类(condricthoid in origin)，例如，来源于鲨鱼。
在一个方面，本发明的抗体是从人分离的人单克隆抗体。任选地，人抗体的框架区根据在数据库中的有关人种系可变区序列被校准和采用；见，例如，由MRC蛋白质工程中心(英国剑桥)主办的Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。例如，被认为是潜在偏离真正的种系序列的氨基酸可能是由于在克隆过程中掺入的PCR引物的序列。相比人工产生的人样抗体(例如来源于噬菌体展示抗体文库的或异种小鼠的单链抗体片段(scFv))，本发明的人单克隆抗体具有以下特征：(1)使用人的免疫反应而获得，而不是动物替代品，即抗体是对人体内天然TTR相关构象的响应而产生的，(2)已经保护个体或者至少是对TTR的存在是显著性的，和(3)，因为抗体是人源的，针对自身抗原的交叉反应的风险被最小化。因此，按照本发明，术语“人单克隆抗体”，“人单克隆自身抗体”，“人抗体”等被用来表示人源的TTR结合分子，即其是从诸如B细胞或其杂交瘤的人类细胞中分离的，或者它的cDNA是从人类细胞的mRNA直接克隆的，例如人记忆B细胞。人抗体仍然是“人”的，即，人源的即使抗体内有氨基酸取代，例如，以改善结合特征。
在一个实施方式中，相比于天然存在的抗体，本发明的人源抗体包括异源区，例如在框架区的氨基酸取代，外源融合到可变区的恒定区，在C-端或N-端不同的氨基酸等等。
来源于人免疫球蛋白文库或来源于对于一个或多个人类免疫球蛋白转基因的动物的抗体和不表达内源性免疫球蛋白的抗体，如下文描述和，例如在Kucherlapati等人的美国专利5,939,598，被表示为人样抗体以将它们与本发明的真正的人抗体区分开来。
例如，人样抗体诸如通常从噬菌体展示中分离的合成和半合成的抗体的重链和轻链的配对不一定反映在原始人类B细胞中发生的原始配对。因此，现有技术中通常使用的从重组表达文库获得Fab和scFv片段可被认为是人工的，并具有对免疫原性和稳定性所有可能的相关影响。
与此相反，本发明提供了从选择的人类受试者分离的亲和力成熟的抗体，其特征为它们的治疗应用和它们在人体内的耐受性。
如本文所用的，术语“啮齿化抗体”或“啮齿化免疫球蛋白”是指包含来源于本发明人抗体的一个或多个CDR的抗体；以及基于啮齿动物抗体序列包含氨基酸取代和/或缺失和/或插入的人框架区。当提到啮齿动物，优选使用来源于小鼠和大鼠的序列，其中包含这样序列的抗体分别被称为“鼠科化的”或“啮齿化的”。提供的CDR人免疫球蛋白被称为“母体”或“受体”，提供框架变化的啮齿动物抗体被称为“供体”。恒定区不需要存在，但如果存在，它们通常与啮齿动物抗体恒定区基本相同，即至少约85％至90％，优选约95％或更多相同。因此，在一些实施方式中，全长度的鼠科化的人重链或轻链免疫球蛋白包含小鼠恒定区，人CDR，以及具有一些“鼠科化的”氨基酸取代的基本上人的框架。通常情况下，“鼠科化的抗体”是包含鼠科化的可变轻链和/或鼠科化的可变重链的抗体。例如，鼠科化的抗体将不包括典型的嵌合抗体，例如，因为嵌合抗体的整个可变区是非鼠的。通过“鼠科化”过程而被“鼠科化的”修饰的抗体结合到相同的抗原，如提供了CDR的母体抗体那样，并通常在小鼠中是免疫原性较低的，相比于母体抗体。就“鼠科化的”抗体的上述解释类似地适用于“啮齿化”抗体，例如“大鼠化抗体”，其中大鼠序列代替鼠科动物使用。
如本文所用，术语“重链部分”包括来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包括以下中的至少一个：CH1结构域，铰链(例如，上、中、和/或下铰链区)结构域，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。例如，用于本发明的结合多肽可包括：包含CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一个部分、和CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域，铰链结构域的至少一个部分，和CH3结构域的多肽链，或包含CH1结构域，铰链结构域的至少一个部分，CH2结构域，以及CH3结构域的多肽链。在另一个实施方式中，本发明的多肽包括包含CH3结构域的多肽链。另外，对于本发明中使用的结合多肽可缺少CH2结构域的至少一个部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。如上所述，本领域普通技术人员应当理解这些结构域(例如，重链部分)可被修改，使得它们不同于天然存在的免疫球蛋白分子的氨基酸序列。
在本文中公开的某些抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一条多肽链的重链部分与多聚体的第二条多肽链的相同。可替换地，本发明的重链部分包含的单体是不相同的。例如，每个单体可包含不同的靶结合位点，形成例如双特异性抗体或双抗体。
在另一个实施方式中，本文中公开的抗体或抗原结合片段、变体或衍生物是由多肽单链组成(例如scFv)并将要在细胞内表达(细胞内抗体)，用于潜在体内治疗和诊断应用。
用于本文公开的诊断和治疗方法中使用的结合多肽的重链部分可以由不同的免疫球蛋白分子衍生。例如，多肽的重链部分可包含来自IgG1分子的CH1结构域和来源于IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可包含部分来源于IgG1分子和部分来源于IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可包含部分来源于IgG1分子和部分来源于IgG4分子的嵌合铰链区。
如本文所用，术语“轻链部分”包括来源于免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链部分包含VL或CL结构域的至少一个。
对于抗体的肽或多肽表位的最小大小被认为是大约4至5个氨基酸。肽或多肽表位优选包含至少七个，更优选至少九个，最优选至少约15至约30个氨基酸之间。因为CDR可以识别以其三级形式的抗原性肽或多肽，包含的表位的氨基酸不需要是连续的，并且在某些情况下，甚至可能不在相同的肽链。在本发明中，被本发明的抗体所识别的肽或多肽表位包含TTR的至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，更优选至少8个，至少9个，至少10个，至少15个，至少20个，至少25个，或约15至约30个连续或非连续的氨基酸的序列。
本文中可互换使用的“特异性结合”或“特异性识别”，通常指的结合分子，例如，抗体通过其抗原结合结构域结合表位，并且该结合引起该抗原结合结构域和表位之间具有一些互补性。根据这个定义，抗体被叙述为“特异性结合”到表位，当它结合到该表位时，通过其抗原结合结构域比结合到随机的、不相关的表位更容易。术语“特异性”在本文中用于限定目标抗体结合某表位的相对亲和力。例如，抗体“A”可被认为具有比抗体“B”对给定表位的更高的特异性，或抗体“A”可以说成是相比相关的表位“D”，以更高的特异性结合表位“C”。
当存在时，术语“免疫结合特性”，或抗体与抗原的其他结合特性，以其所有语法形式，是指抗体的特异性、亲和力、交叉反应性、以及其他结合特性。
“优先地结合”是指结合分子，例如相比结合到相关的、相似的、同源的或类似的表位，抗体更容易地特异性结合到某个表位。因此，“优先地结合”到给定的表位的抗体更可能结合到该表位，而不是相关的表位，尽管这样的抗体可能与相关表位交叉反应。
通过非限制性示例的方式，结合分子，例如抗体可以被认为是优先地结合第一个表位，如果它是以比对第二个表位的抗体的解离常数(KD)更小的KD结合所述的第一个表位。在另一非限制性实例中，抗体可以被认为是优先地结合第一个表位，如果它是以比对第二个表位的抗体KD小至少一个数量级的亲和力结合第一个表位。在另一非限制性实例中，抗体可以被认为是优先地结合第一个表位，如果它是以比对第二个表位的抗体KD小至少两个数量级的亲和力结合第一个表位。
在另一非限制性实例中，结合分子，例如抗体可以被认为是优先地结合第一个表位，如果它是以比对第二个表位的抗体k(解离)更小的解离速率(k(解离))结合所述的第一个表位。在另一非限制性实例中，抗体可以被认为是优先地结合第一个表位，如果它是以比对第二个表位的抗体k(解离)小至少一个数量级的亲和力结合第一个表位。在另一非限制性实例中，抗体可以被认为是优先地结合第一个表位，如果它是以比对第二个表位的抗体k(解离)小至少两个数量级的亲和力结合第一个表位。
结合分子，例如本文公开的抗体或抗原结合片段、变体或衍生物可以说成以小于或等于5x 10-2秒-1,10-2秒-1,5x l0-3秒-1或l0-3秒-1的解离速率(k(解离))结合TTR或其片段、变体或特定的构象。更优选地，本发明的抗体可以说成以小于或等于5x 10-4秒-1,10-4秒-1,5x 10-5秒-1,或10-5秒-15x 10-6秒-1,10-6秒-1,5x 10-7秒-1或10-7秒-1的解离速率(k(解离))结合TTR或其片段、变体或特定的构象。
结合分子，例如本文公开的抗体或抗原结合片段、变体或衍生物可以说成以大于或等于103M-1秒-1,5x 103M-1秒-1,104M-1秒-1或5x 104M-1秒-1的结合速率(k(结合))结合TTR或其片段、变体或特定的构象。更优选地，本发明的抗体可以说成以大于或等于105M-1秒-1,5x105M-1秒-1,106M-1秒-1,or 5x 106M-1秒-1or 107M-1秒-1的结合速率(k(结合))结合TTR或其片段、变体或特定的构象。
结合分子，例如抗体被说成是竞争性抑制参考抗体与给定表位的结合，如果它优先结合该表位，在一定程度上，阻断该参考抗体与表位的结合。竞争性抑制可以通过本领域已知的任何方法确定，例如，竞争ELISA测定来确定。抗体可以说是以至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、或至少50％竞争性地抑制参考抗体与给定表位的结合。
如本文所用的，术语“亲和力”是指独立的表位与结合分子(例如免疫球蛋白分子)CDR的结合强度的度量；见，例如Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，第二版，(1988)，27-28页。如本文所用的，术语“抗体亲抗原性”指免疫球蛋白的群体和抗原的复合物的整体稳定性，也就是说，免疫球蛋白混合物与抗原的功能性结合强度；见，例如，Harlow，在29-34页。抗体亲抗原性与群体中群体中独立免疫球蛋白分子与特异性表位的亲和力相关，也与免疫球蛋白与抗原的价数相关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复的表位结构的抗原(如聚合物)之间的相互作用将是高抗体亲抗原性之一。对抗原的抗体亲和力或抗体亲抗原性可以通过实验使用任何合适的方法来确定；见，例如，Berzofsky等人，《基础免疫学》中的“Antibody-Antigen Interactions(抗体-抗原相互作用)”Paul,W.E.,Ed.,Raven出版社，纽约,纽约州(1984),Kuby,《Janis免疫性,W.H.Freeman和Company纽约,纽约州(1992)，以及本文描述的方法。用于测定抗体对抗原亲和力的一般技术包括ELISA，RIA，和表面等离子体共振。如果在不同的条件(例如例如，盐浓度，pH值)下测定，测得的特定抗体-抗原相互作用的亲和力可以不同。因此，亲和力和其他抗原结合参数(例如KD,IC50)的测定优选用抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲液进行。
结合分子，例如本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可以根据其交叉反应性来描述或规定。如本文所用的术语“交叉反应性”是指对一种抗原有特异性的抗体与第二种抗原反应的能力；两个不同的抗原性物质之间相关性的度量。因此，抗体是有交叉反应活性的，如果它结合到一个表位，而不是诱导其形成的那个表位。交叉反应活性表位通常含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下，实际上可能比原始的更适合。
例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，因为它们结合相关但不相同的表位，例如，对于参考表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、和至少50％同一性的表位(正如使用本领域已知的和本文所描述的方法计算的)。抗体可以说几乎没有或没有交叉反应性，如果它不结合对于参考表位具有小于95％、低于90％、低于85％、低于80％、低于75％、低于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％同一性的表位(正如使用本领域已知的和本文所描述的方法计算的)。对于一定的表位，抗体可被视为“高特异性的”，如果它不与任何其他该表位的类似物、直系同源物、或同源物结合。
结合分子，例如本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物也可以根据其对TTR和/或突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR或其片段的结合亲和力来描述或指明。优选的结合亲和力包括具有解离常数或Kd值小于5x 10-2M、10-2M、5x 10-3M、10-3M、5x 10-4M、10-4M、5x 10-5M、10-5M、5x 10-6M、10-6M、5x 10-7M、10-7M、5x 10-8M、10-8M、5x 10-9M、10-9M、5x 10-10M、10-10M、5x 10-11M、10-11M、5x 10-12M、10-12M、5x 10-13M、10-13M、5x 10-14M、10-14M、5x 10-15M、或10-15M的结合亲和力。
在一个实施方式中，本发明的抗体具有对不同TTR同型的Kd，正如下面的表V为示例性抗体示出的，即对野生型天然TTR>300nM的Kd，和/或对于变性的TTR≤15nM的Kd，优选≤5nM，最优选≤2nM，和/或对于天然的TTR-V30M Kd≤35nM，优选≤20nM，和/或对于天然TTR-L55P≤150nM的Kd，优选的≤5nM，最优选≤2nM。
如前面所指出的，各种免疫球蛋白类别的亚基结构和恒定区的三维结构是已知的。如本文所用的，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基端可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链第一个(最氨基端)恒定区的结构域。CH1结构域毗邻VH结构域，并且是对于免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基端。
如本文所用的术语“CH2结构域”包括重链分子的部分，其延伸，例如从使用常规的编号方案的抗体的约244位残基至360位残基(244位残基至360位残基，Kabat编号系统；残基231-340位，EU编号系统；参见Kabat EA等人同上)。CH2结构域的独特之处在于它不是与另一个结构域紧密配对。而是，有两个N-连接的有支链的糖链介于完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。也有记载CH3结构域从CH2结构域至IgG分子的C端延伸，并且包含约108个残基。
如本文所用，术语“铰链区”包括将CH1结构域加入的CH2结构域的重链分子的部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，因此允许这两个N端抗原结合区独立地移动。铰链区可以细分为三个不同的结构域：上，中，下铰链结构域；见Roux等人,J.Immunol.161(1998),4083-4090。
如本文所用的术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可以与与第二巯基形成二硫键或桥的巯基。在多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，两个重链通过两个位于相应于Kabat编号系统239和242位的二硫键(位置226或229，EU编号系统)连接。
如本文中所使用的，术语“连接的”，“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语指的是两个以上元件或组成接合在一起，通过任何手段，包括化学缀合或重组手段。“框内融合”是指两个或多个多核苷酸的开放阅读框(ORF)的接合，以形成连续的更长的ORF，以保持原始ORF的正确翻译阅读框的方式。因此，重组融合蛋白是含有对应于由原始ORF编码的多肽的两个或多个区段(在自然条件下，该区段通常不是如此接合)的单一蛋白质。虽然使阅读框在全部融合区段是连续的，但是这些区段可以是由，例如框内连接序列在物理上或空间上分离。例如，多核苷酸编码的免疫球蛋白可变区的CDR，可以被融合，在框内，但是被多核苷酸编码的至少一个免疫球蛋白框架区或附加CDR区分开，只要“融合的”CDR作为连续多肽的一部分被共翻译。
如本文所用的术语“表达”是指基因产生生化的，例如RNA或多肽的过程。该过程包括在细胞内基因功能性存在的任何表现，包括但不限于，基因敲除、以及既暂时表达和稳定表达。其包括但不限于基因转录进信使RNA(mRNA)，转运RNA(tRNA)，短发夹RNA(shRNA)，小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物，以及mRNA翻译为多肽。如果最终期望的产物是生化的，表达包括生化和任何前体的产生。基因的表达产生“基因产物”。如本文所使用的，基因产物可以是核酸，例如，通过基因转录产生的信使RNA，或者是从转录物翻译的多肽。本文所述的基因产物进一步包括具有转录后修饰的核酸，例如，多腺苷酸化，或具有翻译后修饰的多肽，例如，甲基化、糖基化、添加脂质、与其他蛋白亚基结合、蛋白水解裂解等等。
如本文所用，术语“样品”是指从受试者或患者获得的任何生物材料。一方面，样品可以包括血液，腹膜液，脑脊液，唾液或尿液。在其他方面，样品可以包括全血，血浆，血清，从血样富集的B细胞，和培养的细胞(例如，来自受试者的B细胞)。样品还可以包括活检组织或组织样品，包括神经组织。在其他方面，样品可以包括全细胞和/或该细胞的裂解物。血液样品可以通过本领域中已知的方法收集。一方面，颗粒可以通过在4℃下在200μL缓冲液(20mM Tris,pH.7.5,0.5％诺乃洗涤剂,1mM EDTA,1mM PMSF,0.1M NaCl,IX Sigma蛋白酶抑制剂,和IX Sigma磷酸酶抑制剂1和2)涡旋而悬浮。该悬浮液可在冰上保持20分钟，伴随间歇性涡旋。在约4℃以15,000×g旋转5分钟后，上清液的等分试样可在约-70℃被存储。
疾病：
除非另有说明，术语“病症”和“疾病”在本文可互换使用，并且包括受试者，动物，分离的器官、组织或细胞/细胞培养物的任何不期望生理变化。
转甲状腺素蛋白(TTR)淀粉样变性是在许多不同的疾病中起作用的病理生理机制，其特征是由TTR蛋白结构(即构象)改变造成的在各种组织中的TTR蛋白的异常沉积。错误折叠和错误装配的TTR蛋白是有毒的，并通常作为TTR基因突变的结果而发生。错误折叠的TTR的毒性导致局部组织损伤，随着时间推移的积累可能会导致器官功能障碍，甚至器官衰竭。有许多类型的组织和器官易于发生TTR淀粉样变性，如外周和自主神经系统，心脏，软脑膜，眼睛，肌腱，韧带或肾脏。可以被TTR淀粉样变性影响的组织的范围广泛，是有TTR淀粉样变性的患者表现出症状的多样性的原因。事实上，有TTR淀粉样变性的患者在临床上按照所患的不同疾病而被分类，这取决于是受TTR淀粉样变性影响最严重的组织或器官以及相应的症状。
在此基础上，TTR淀粉样变性被以神经性形式分类，其中所述外周神经系统和自主神经系统主要被影响，患者表现出主要是疼痛，感觉异常，肌肉无力和自主神经功能障碍。还存在TTR淀粉样变性的心脏形式，其中心脏被主要影响，患者表现出主要是体位性低张力或高张力，心律失常和心脏扩大。这两种形式并不相互排斥，许多病人呈现出两者的组合。当TTR淀粉样变性影响其他组织时，这可能会导致玻璃体混浊，干眼或青光眼，蛋白尿，高甲状腺素血症，腕管综合症或先兆子痫。
因此，在本发明的一个实施方式中，本发明的抗体、本发明的具有与其任一个基本相同的结合特异性的结合分子、多核苷酸、载体、细胞和/或多肽被用于制备药用或诊断组合物，其用于预防和/或治疗TTR淀粉样变性疾病、用于监测疾病进展和/或治疗响应，以及用于诊断与TTR淀粉样变性相关的疾病，包括家族性淀粉样多发性神经病(FAP)，家族性淀粉样心肌病(FAC)，老年性系统性淀粉样变(SSA)，软脑膜/中枢神经系统(CNS)淀粉样变性病，包括阿尔茨海默病，眼淀粉样变性，肾淀粉样变，高甲状腺素血症，腕管综合症，肩袖撕裂，腰椎椎管狭窄和先兆子痫。
治疗：
如本文所用，术语“进行治疗”或“治疗”都是指治疗性治疗和预防性或防范性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或病症，如心脏缺陷的发展。有益的或期望的临床结果包括，但不限于，症状的减轻，疾病程度的降低，稳定的(即不恶化的)疾病状态，延缓或减慢疾病进展，改善或缓和疾病状态，和缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以指延长了的存活，相较于如果不接受治疗的预期存活。需要治疗的对象包括已经具有所述病症或障碍或疾病的人，以及倾向于患上所述病症或障碍或疾病的人或要防止所述病症或障碍或疾病表现形式的人。
如果没有另外说明，术语“药品”、“药”或“药物”在本文中可互换使用，并且应包括但不限于用于内部或外部使用的所有(A)物品、药品和制剂，和打算用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人或其他动物的疾病的任何物质或物质的混合物；和(B)打算影响人体或其他动物的结构或任何功能的物品、药品和制剂(食品除外)；和(C)打算用作(A)条款和(B)条款规定的任何物品组分的物品。术语“药品”、“药”或“药物”包括用于人或其他动物的制剂的完整配方，含有一个或多个“试剂”、“化合物”、“物质”或“(化学)组合物”作为以及在其他一些情况下还包括其他药学上无活性的赋形剂如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、粘合剂或确保“药品”、“药”、或“药物”在人体或其他动物内的预定目标位置，例如，在皮肤、在胃或肠中易运输、崩解、解聚、溶解和生物可用性。术语“试剂”、“化合物”或“物质”在本文中可互换使用，并且在一个更具体的方面应包括，但不限于所有的药理学活性剂，即诱导所需生物学或药理学效果的试剂或研究或测试通过本发明的方法诱导可能的药理作用的能力的试剂。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指任何受试者，特别是哺乳动物受试者，例如人类患者，对他们来说，诊断、预后、预防或治疗是期望的。
药物载体：
药学上可接受的载体和给药途径可以从对本领域技术人员已知的相应文献中得到。本发明的药用组合物可以根据本领域中已知的方法来配制；参见例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy(《药学的科学与实践》)，由在费城的科学大学，ISBN0-683-306472，Robinson等人,Vaccine Protocols(《疫苗方法》)，第二版Humana出版社,Totowa,新泽西州,美国,2003；Banga,Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing,and Delivery Systems(《治疗性多肽和蛋白质：配方，加工和递送系统》)，第二版，Taylor and Francis出版社.(2006),ISBN:0-8493-1630-8。合适的药物载体的实例在本领域中是熟知的，包括磷酸盐缓冲溶液，水，乳剂，如油/水乳剂，各种类型的润湿剂，无菌溶液等。包含这样载体的组合物可以通过熟知的传统的方法配制。这些药用组合物可以以一个合适的剂量施用给受试者。合适的组合物的给药可以通过不同的方式来实现。实例包括通过口服、鼻内、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、真皮下、经皮、鞘内、以及颅内方法施用包含药学上可接受载体的组合物。诸如鼻喷雾制剂的气雾剂包括带有防腐剂和等渗剂的活性药剂的纯化水溶液或其他溶液。这种制剂优选调节至与鼻腔粘膜一致的pH和等渗状态。用于口服给药的药用组合物，例如单结构域抗体分子(例如，“nanobodiesTM”(“nM抗体TM”))等也在本发明中设想。例如口服制剂可以是片剂、胶囊、粉末、液体或半固体形式。片剂可以包含固体载体，如明胶或佐剂。用于直肠或阴道给药的制剂可呈现为具有合适载体的栓剂；也参见O'Hagan等人,Nature Reviews,Drug Discovery2(9)(2003),727-735。关于适合于不同类型给药的制剂的进一步指导可以在Remington'sPharmaceutical Sciences(《Remington's药物科学》),Mace出版公司,费城,宾夕法尼亚州,第17版(1985)和相应的更新中找到。对于药物递送方法的简要综述见Langer,Science249(1990),1527-1533。
二、本发明的抗体
本发明主要涉及人源抗TTR抗体与其抗原结合片段，其优选地体现免疫结合特性和/或如在实施例中说明的为抗体所列出的生物学性质。根据本发明的对TTR具有特异性的人单克隆抗体是从大量健康人受试者克隆的。但是，在本发明的另一个实施方式中，人单克隆抗TTR抗体也可能是从呈现出与TTR淀粉样变性病相关的疾病和/或病症的症状的患者克隆的。
在按照本发明进行的实验的过程中，对于存在于条件培养基的培养的人记忆B细胞的抗体，评价了它们结合TTR的能力和结合包括牛血清白蛋白(BSA)的其他10种以上蛋白的能力。仅能结合TTR蛋白而不能结合扫描中的其他蛋白的B细胞的上清液被选择用于进一步的分析，包括确定所述抗体种类和轻链亚类。所选B细胞然后用于抗体克隆处理。
简言之，这包括在从所选择的B细胞中萃取信使RNA，通过RT-PCR逆转录，通过PCR扩增抗体编码区，克隆进质粒载体和测序。然后所选择的人抗体通过在HEK293或CHO细胞中的重组表达和纯化而产生，并且随后表征它们结合人TTR蛋白的能力。各种测试的组合，例如在HEK293或CHO细胞的抗体的重组表达和随后的对人TTR蛋白结合特异性的表征，以及它们对其病理性错误折叠的、错误装配的和/或其聚集形式的区别性的结合，证实了对于TTR有高特异性并区别性识别和选择性结合TTR蛋白的病理性聚集形式(如TTR纤维)的人类抗体已经首次被克隆。在一些情况下，在本发明的人抗体可变结构域的基础上也产生了小鼠嵌合抗体。这些小鼠嵌合抗体对于人TTR显示出与人抗体(显示在图6和图9以及在实施例4和实施例8中)相同的结合亲和力、特异性和选择性。
因此，本发明主要涉及重组人源单克隆抗TTR抗体及其结合片段、衍生物和变体。在本发明的一个实施方式中，所述抗体能够结合人TTR。
在一个实施方式中，本发明涉及一种抗TTR抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中该抗体如选自由NI-301.59F1,NI-301.35G11，NI-301.37F1和NI-301.12D3组成的组的参考抗体那样特异性结合TTR的相同的表位。表位作图鉴定了人TTR内的序列包括氨基酸61-EEEFVEGIY-69(SEQ ID NO：49)，作为本发明的抗体NI-301.59F1识别的独特的线性表位，人TTR内的序列包括氨基酸53-GELHGLTTEEE-63(SEQ ID NO：50)，作为本发明的抗体NI-301.35G11识别的独特的线性表位，人TTR内的序列包括氨基酸41-WEPFA-45(SEQ ID NO：51)，作为本发明的抗体NI-301.37F1(参见图10和实施例9)识别的独特的线性表位。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体被提供，其中所述抗体特异性地结合包含氨基酸序列EEEFVEGIY(SEQ ID NO：49)，GELHGLTTEEE(SEQ ID NO：50)，或WEPFA(SEQID NO：51)的TTR表位。
在这种情况下，如实施例9中所解释的，通过使用29个连续肽15个氨基酸长和11个氨基酸重叠的面板(即第一个肽TTRaa1-15；第二个肽TTRaa5-19；等等)，对示例性抗体NI-301.59F1、NI-301.35G11和NI-301.37F1的结合表位进行了分析，其中，抗体NI-301.59F1和301.35G11分别识别两种重叠肽，(15和16)以及(13和14)，并且抗体NI 301.37F1识别三种重叠肽(9，10和11)；参见实施例9和图10。
因此，关于成熟TTR多肽的氨基酸序列和相应的肽作图，这意味着结合到表位EEEFVEGIY(SEQ ID NO：49)的抗体NI-301.59F1能够识别具有氨基酸序列GLTTEEEFVEGIYKV(SEQ ID NO:85)和EEEFVEGIYKVEIDT(SEQ ID NO:86)的肽。
同样地，结合到表位GELHGLTTEEE(SEQ ID NO：50)的抗TTR抗体NI-301.35G11能够识别具有氨基酸序列TSESGELHGLTTEEE(SEQ ID NO:87)和GELHGLTTEEEFVEG(SEQ ID NO:88)的肽。
类似地，结合到表位WEPFA(SEQ ID NO：51)的抗TTR抗体NI-301.37F1能够识别具有氨基酸序列FRKAADDTWEPFASG(SEQ ID NO:89)、ADDTWEPFASGKTSE(SEQ ID NO:90)和WEPFASGKTSESGEL(SEQ ID NO:91)的肽。
因此，在本实施例所示的本发明的受试者抗体不同于仅仅识别就额外的N-端和/或C-端氨基酸来说的所提及的表位的任何一种的抗体。因此，在本发明的一个优选实施方式中，对包含氨基酸序列EEEFVEGIY(SEQ ID NO：49)、GELHGLTTEEE(SEQ ID NO：50)、或WEPFA(SEQ ID NO：51)的TTR表位的抗TTR抗体的特异性结合按照实施例9和图10A至D用连续肽15个氨基酸长和11个氨基酸的重叠确定。
在这种情况下，根据本发明进行的和在实施例9所描述的，使用151连续肽15个氨基酸长和14个氨基酸重叠(其中对于每个肽，在10位的氨基酸的非丙氨酸氨基酸被丙氨酸取代，但丙氨酸被甘氨酸或脯氨酸取代)的面板的扩展的表位作图，表明抗体NI-301.59F1结合表位EEFXEGIY(TTRaa62-69)，并且抗体NI-301.35G11结合ELXGLTXE(TTRaa54-61)，而没有进一步的序列要求被确定为抗体NI-301.37F1的表位。因此，在另一个实施方式中，给定的抗体是否结合到和抗体NI-301.59F1、NI301.35G11和NI-301.37F1相同表位的判定是按照实施例9与图10E至图10H进行的。
不言而喻，表位作图与判定给定的抗体是否结合和实施例9使用的和图10中显示的受试者抗体相同的表位，也可以应用于在实施例中描述的具有图1A至1T中描绘的可变区的本发明的任何其他抗TTR抗体。
因此，本发明主要涉及任何抗TTR抗体和结合于与在实施例中显示的并具有至少如图1A-1T任一项所描述的CDR和/或可变重链和轻链区的抗体相同的表位的抗体样分子。
在进一步的实施方式中，抗体特异性结合氨基酸序列GELHGLTTEEE(SEQ ID NO：50)，但不结合GELHGPTTEEE，对应于TTR-L55P突变体的表位，或所述抗体特异性结合氨基酸序列WEPFA(SEQ ID NO：51)，但不结合WGPFA，对应于TTR-E42G突变体的表位。
此外，没有打算受实施例3至8所证明的和图2，3，4，7和9所显示的初步实验观察限制，本发明的人单克隆NI-301.59F1，NI-301.35G11，和NI-301.37F1抗TTR抗体，优选地特征在于特异性结合到病理性错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR而基本上不识别生理形式的TTR。因此，本发明提供具有特别用于诊断和治疗目的结合性质的一组人抗TTR抗体。因此，在一个实施方式中，本发明提供了能够特异性结合TTR的病理性聚集形式的抗体。
在一个实施方式中，本发明的抗体表现出如示例性实施例中描述的NI-301.59F1，NI-301.35G11，和NI-301.37F1抗体的结合性质。本发明的抗TTR抗体优先识别病理性改变的TTR，如突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型或其片段，而不是生理性TTR。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体基本上不识别生理性TTR类型。
当在本申请中用于描述组(包括抗体，其片段或对于特定靶分子的结合分子，抗原和/或靶分子的构象和/或抗原)的分子的结合亲和力时，术语“基本上不识别”指的是上述组的分子以比上述组的分子结合其他分子、抗原和/或构象的结合亲和力小至少2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍或9倍的结合亲和力结合所述分子、抗原和/或构象。很经常地，解离常数(KD)用作结合亲和力的量度。有时，在特定的测定法如ELISA测定法，EC50被用作结合亲和力的量度。优选地，在本申请中使用术语“基本上不识别”时，指的是上述组的分子以比上述组的分子结合其他分子、抗原和/或构象的结合亲和力小至少10倍，20倍，50倍，100倍，1000倍或10000倍的结合亲和力结合所述分子、抗原和/或构象。
此外，或可替代地，本发明的抗TTR抗体结合疾病引起的突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集形式的TTR。在这种情况下，结合亲和力可在正如图2、相应图10中所示的示例性NI-301.59F1，NI-301.35G11和NI-301.37F1抗体(即具有如NI-301.59F1和NI-301.35G11所示的对于人类聚集的TTR和聚集的重组TTR大约1pM至500nM的半数最大有效浓度(EC50)，优选约50pM至100nM的EC50，最优选约1nM至20nM的EC50，或者如NI-301.37F1所示的对于人类聚集的TTR和聚集的重组TTR约100pM至1nM的EC50)的范围内。
尤其是，抗TTR抗体、其结合片段或衍生物具有用于结合聚集的野生型的相应于≤5nM的EC50值的亲和力和/或用于结合聚集V30M-TTR的≤20nM、优选≤10nM、最优选≤1nM的EC50值；见实施例3和图2。
一些抗体能够结合到多种生物分子，例如，蛋白质。如本领域技术人员将理解的，所述术语“特异性的”在本文中用于表示不是TTR蛋白或其片段的其他生物分子不显著地结合到抗原结合分子，例如本发明的抗体中的一个。优选地，对不是TTR的生物分子的结合水平分别导致了至多仅为对TTR亲和力的20％或更低，10％或更少，仅为5％或更少，仅为2％或更少或仅为1％或更少(即至少低5倍、10倍、20倍、50倍或100倍，或超过此数的任何倍数)的结合亲和力；参见例如图2。
在一个实施方式中，本发明的抗TTR抗体优选结合聚集形式的TTR，错误折叠的TTR，错误装配的TTR，和/或其片段、衍生物、原纤维和/或寡聚物。在另一个实施方式中，本发明的抗TTR抗体优选结合天然TTR以及病理性错误折叠的、错误装配的或聚集形式的TTR。
如前面提到的，无定形和淀粉样TTR沉积物可导致不同的疾病，取决于错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型或其片段发生在身体的哪个部位。例如具有家族性淀粉样多发性神经病(FAP)患者主要是在小直径神经纤维表现出TTR沉积物，因此主要呈现诸如改变的感官知觉和自主功能障碍(包括胃肠功能障碍或阳萎)的症状；具有家族性淀粉样心肌病(FAC)或老年系统性淀粉样变性(SSA)的患者主要在心脏表现出TTR沉积，因此呈现诸如如心功能不全或心律失常的症状；具有在肾脏TTR沉积的患者可呈现肾功能障碍和蛋白尿。
因此，在一个实施方式中，本发明的抗体可用于治疗家族性淀粉样多发性神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)、老年性系统性淀粉样变性(SSA)、全身性家族性淀粉样变性、软脑膜/中枢神经系统(CNS)的淀粉样变性(包括阿尔茨海默病)、眼部淀粉样变性、肾淀粉样变性、高甲状腺素血症、韧带淀粉样变性(包括腕管综合症、肩袖撕裂和腰椎管狭窄症)和先兆子痫及其症状。
本发明还提出抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中该抗体包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域等同于选自由NI-301.59F1、NI-301.35G11、NI-301.37F1、NI-301.2F5、NI-301.28B3、NI-301.119C12、NI-301.5D8、NI-301.9D5、NI-301.104F5、NI-301.21F10、NI-301.9G12、NI-301.12D3、NI-301.44E4、NI-301.18C4、NI-301.11A10、NI-301.3C9、NI-301.14D8、NI-301.9X4和NI-301.14C3组成的组的抗体的抗原结合结构域。
本发明进一步举例说明了几种结合分子，例如抗体及其结合片段，其可以以在其可变区(如结合结构域)中包括包含图1中所描述的氨基酸序列中的任一个的VH和/或VL可变区的至少一个互补决定区(CDR)为特征。编码上述确证的可变区的相应核苷酸序列在下面的表II中阐述。VH和/或VL区的上述氨基酸序列的CDR的示例性组在图1中描绘。然而，如在下面所讨论的，本领域技术人员对下述实事是非常清楚的，即另外地或可替换地，与那些在图1中所阐述的序列不同的氨基酸序列的CDR可能被使用，在CDR2和CDR3的情况下，有一个、两个、三个或甚至更多氨基酸不同。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体或其TTR结合片段被提供，在其可变区包含至少一个如图1所描述的互补决定区(CDR)和/或其一个或多个CDR包含一个或多个氨基酸取代。
在一个实施方式中，本发明的抗体是包含如图1所描绘的VH和/或VL区氨基酸序列的抗体的任一种，或者其VH和/或VL区包含一个或多个氨基酸取代。优选地，本发明抗体的特征在于重链和轻链同源配对的保存，正如人B细胞中存在的。
在本发明的进一步的实施方式中，抗TTR抗体、其TTR结合片段、合成的或基于生物技术的变体可以被优化，以具有对靶合适的结合亲和力和药物动力学性质。因此，在CDR或可变区的至少一个容易发生选自由糖基化、氧化、脱氨基、肽键裂解、异天冬氨酸和/或非成对半胱氨酸的形成的组的改性的氨基酸被缺乏此类变化的突变的氨基酸取代或者其中至少一个糖基被缺失或化学地或酶促地加入到抗体。对于氨基酸优化的实例可在例如国际申请WO 2010/121140和WO 2012/049570中找到。优化抗体性能的另外的修饰在Gavel等人,Protein Engineering 3(1990),433-442and Helenius等人,Annu.Rev.Biochem.73(2004),1019-1049中描述。
或者，本发明的抗体是抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体，其与具有如图1A至图1T中任一个所描绘的VH和/或VL区的至少一个抗体竞争结合TTR。
图2和实施例3提供的实验结果表明，与生理形式的蛋白相比，本发明的一些抗TTR抗体优先结合疾病引起的错误折叠的、错误装配的或聚集形式的人抗TTR蛋白。在这样一个实施方式中，与生理的TTR相比，本发明的抗体优选地识别错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR或其片段和/或其衍生物。
本发明的抗体可以是人类的，特别用于治疗应用。或者，本发明的抗体是一种啮齿类、啮齿类化的或嵌合啮齿类人类抗体，优选鼠科、鼠科化的或嵌合鼠科人类抗体或者大鼠、大鼠化的或嵌合大鼠人类抗体，它们对于动物的诊断方法和研究是特别有用的。在一个实施方式中，本发明的抗体是嵌合啮齿类人类抗体或啮齿类的抗体。
此外，在一个实施方式中，本发明的嵌合抗体(即包含诸如NI-301.35G11的人抗体可变结构域和一般鼠科轻链和重链恒定结构域)表现出对如实施例中所描述的示例性的NI-301.mur35G11鼠嵌合抗体的结合性质。进一步地，本发明的小鼠嵌合抗体以高亲和力结合人类TTR，如实施例4和实施例8所述的。优选地，嵌合抗体的结合亲和力与其人类的对应物是相似的。
在一个实施方式中，本发明的抗体是由培养的单克隆或寡克隆B细胞的培养物提供的，并且其中包含由所述B细胞产生的抗体的培养物的上清液，被扫描其中抗TTR抗体的存在和亲和力。扫描过程包括对天然单体、纤维状或非纤维状聚集体(像源自合成的全长hTTR肽或例如从人血浆或重组表达中纯化的hTTR的寡聚体)的结合的扫描。
此外或可选地，对抗TTR抗体的存在和亲和力的扫描过程可以包括敏感组织淀粉样蛋白斑块免疫反应(TAPIR)测试的步骤，例如在国际申请WO2004/095031中描述的，该申请的公开内容通过引用并入本文。此外或可选地，在肾脏、心脏部分的对抗TTR的结合的扫描(例如在类似的国际申请WO2008/081008描述的脑和脊髓切片所描述的)可以进行。
如上所述，因为基于人的免疫应答导致如下产生，本发明的人单克隆抗体将识别有特定病理相关性的表位，而这些表位分别在产生例如小鼠单克隆抗体的免疫过程和在噬菌体展示库的体外筛选中是难以接近的或较低免疫原性的。因此，为谨慎起见，规定本发明人抗TTR抗体的表位是独特的，没有其他能够结合于被本发明的人单克隆抗体识别的表位的抗体存在；也参见图10。本发明抗体的独特性的另一迹象是，如实施例8中显示的，本发明的抗体NI-301.59F1、NI-301.35G11和NI-301.37F1结合对错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR构象有特异性的表位，如上所显示的，所述表位是有特定病理相关性的，并且不能通过抗体产生的普通过程获得，如免疫接种或体外库筛选。
因此，在一个实施方式中，本发明还广泛延伸到抗TTR抗体和TTR结合分子，所述TTR结合分子与本发明的特异性结合TTR的人单克隆抗体竞争。本发明更具体地涉及一种抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体如选自由NI-301.59F1、NI-301.35G11、NI-301.37F1和/或NI-301.12D3组成的组的参考抗体TTR那样特异性地结合到TTR的相同的表位。
此外，在一个实施方式中，本发明还广泛延伸到抗TTR抗体和TTR结合分子，其与本发明的特异性结合错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR或其片段的人单克隆抗体竞争。因此本发明也更具体地涉及抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中所述抗体如选自由NI-301.59F1、NI-301.35G11、NI-301.37F1和/或NI-301.12D3组成的组的参考抗体那样特异性地结合到错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型或其片段的相同的表位。
抗体间的竞争通过一种测试来确定，其中被测免疫球蛋白抑制参考抗体的对普通抗原(例如TTR)的特异性结合。许多类型的竞争性结合测定是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定；参见Stahli等人，Methods in Enzymology 9(1983),242-253；固相直接生物素-亲和素EIA；参见Kirkland等人，J.Immunol.137(1986),3614-3619和Cheung等人，Virology 176(1990),546-552；固相直接标记测定，固相直接标记夹层测定；见Harlow和Lane，《抗体，实验室手册》，冷泉港出版社(1988年)；使用I125标签固相直接标记RIA；参见Morel等人,Molec.Immunol.25(1988),7-15和Moldenhauer等人,Scand.J.Immunol.32(1990),77-82。通常情况下，这样的测定包括使用纯化的TTR或错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR，例如结合到固体表面的其寡聚物和/或原纤维或具有其中任一的细胞、未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白(即本发明的人单克隆抗体)。竞争性抑制是通过测定在测试免疫球蛋白存在下结合至固体表面或细胞的标记的量来测量的。通常测试免疫球蛋白过量存在。优选地，竞争性结合测定法是在如所附实施例中为ELISA测定所描述的条件下进行。通过竞争测定(竞争抗体)鉴定的抗体包括结合到参考抗体相同表位的抗体和结合到足够接近参考抗体结合表位的邻近表位以便发生空间位阻的抗体。通常，当竞争性抗体过量存在时，它会以至少50％或75％抑制参考抗体对公共抗原的特异性结合。因此，本发明进一步涉及抗体、或其抗原结合片段、变体或其衍生物，其中该抗体竞争性抑制选自由NI-301.59F1、NI-301.35G11、NI-301.37F1、NI-305.2F5、NI-301.28B3、NI-301.119C12、NI-301.5D8、NI-301.9D5、NI-301.104F5、NI-301.21F10、NI-301.9G12、NI-301.12D3、NI.301.44E4、NI-301.18C4、NI-301.11A10、NI-301.3C9、NI-301.14D8、NI-301.9X4、和/或NI-301.14C3组成的组的参考抗体对TTR的结合。
此外，本发明进一步涉及抗体、或其抗原结合片段、变体或其衍生物，其中该抗体竞争性抑制选自由NI-301.59F1、NI-301.35G11、NI-301.37F1、NI-305.2F5、NI-301.28B3、NI-301.119C12、NI-301.5D8、NI-301.9D5、NI-301.104F5、NI-301.21F10、NI-301.9G12、NI-301.12D3、NI-301.44E4、NI-301.18C4、NI-301.11A10、NI-301.3C9、NI-301.14D8、NI-301.9X4、和/或NI-301.14C3组成的组的参考抗体对错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR或其片段的结合。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括免疫球蛋白重链可变区(VH)，或基本上是由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成、或是由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成，其中重链可变区的VH-CDR的至少一个或重链可变区的VH-CDR的至少两个与来自本发明公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列有至少80％,85％,90％或95％的相同。或者，VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区与来自本发明公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列有至少80％,85％,90％或95％的相同。因此，根据本实施方式，本发明的重链可变区有分别与在图1中所示的组相关的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3多肽序列。虽然图1示出了由Kabat系统定义的VH-CDR，其他的CDR定义(例如由Chothia系统定义的VH-CDR)也包括在本发明中，并可以被使用图1中展示的数据的本领域的普通技术人员容易地识别。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括免疫球蛋白重链可变区(VH)，或基本上是由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成、或是由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有分别与图1中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组相同的多肽序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括免疫球蛋白重链可变区(VH)，或基本上是由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成、或是由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有分别与图1中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组相同的多肽序列，除了在任何一个VH-CDR中的一个、二个、三个、四个、五个或六个氨基酸取代。在某些实施方式中，氨基酸取代是保守的。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括免疫球蛋白轻链可变区(VL)，或基本上是由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成、或是由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成，其中轻链可变区VL-CDR的至少一个或链可变区VL-CDR的至少两个与来自本发明公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列有至少80％,85％,90％或95％的相同。可替换地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区与来自本发明公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列有至少80％,85％,90％或95％的相同。因此，根据本实施方式，本发明的轻链可变区有分别与在图1中所示的多肽相关的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3多肽序列。虽然图1示出了由Kabat系统定义的VL-CDR，其他的CDR定义(例如由Chothia系统定义的VL-CDR)也包括在本发明中。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括免疫球蛋白轻链可变区(VL)，或基本上是由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成、或是由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有分别与图1中所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组相同的多肽序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括免疫球蛋白轻链可变区(VL)，或基本上是由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成、或是由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有分别与图1中所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组相同的多肽序列，除了在任何一个VL-CDR中的一个、二个、三个、四个、五个或六个氨基酸取代。在某些实施方式中，氨基酸取代是保守的。
免疫球蛋白或其编码的cDNA可以被进一步修饰。因此，在一个进一步的实施方式中，本发明的方法包括产生嵌合抗体的步骤中的任一个，鼠科化的抗体、单链抗体、Fab片段、双特异性抗体、融合抗体、标记的抗体或这些中的任一项的类似物。相应的方法对本领域技术人员是熟知的，并且在例如Harlow和Lane编著的Antibodies,A LaboratoryManual”(《抗体，实验室手册》)，CSH出版社，冷泉港(1988)描述。当所述抗体的衍生物由噬菌体展示技术获得，如在BIAcore系统中使用的表面等离子体共振可用于提高结合于本文描述的抗体中任一项的相同表位的噬菌体抗体的效率(Schier,Human AntibodiesHybridomas 7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods 183(1995),7-13)。生产嵌合抗体描述于，例如，国际申请WO89/09622。用于产生人源化抗体的方法描述于，例如，欧洲申请EP-A1 0 239 400和国际申请WO90/07861。按照本发明将被使用的抗体的进一步来源是所谓的异种抗体。用于在小鼠体内产生诸如类人抗体的异种抗体的一般原理描述于，例如，国际申请WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096和WO 96/33735。如上所述，本发明的抗体可以以多种形式存在除了完整的抗体；包括，例如，Fv、Fab和F(ab)2，以及在单链中；见例如国际申请WO88/09344。在一个实施方式，因此，提供了选自由单链Fv片段(scFv)，F(ab')片段，F(ab)片段和F(ab')2片段组成的组的本发明的抗体。
本发明的抗体或它们相应的免疫球蛋白链可以使用本领域中已知的常规技术进一步修饰，例如，通过单独或组合地使用氨基酸缺失、插入、取代、添加、和/或重组和/或本领域已知的任何其他修饰。用于向为免疫球蛋白链的氨基酸序列基础的DNA序列引入这种修饰的方法本领域技术人员是熟知的；参见，例如，Sambrook，Molecular Cloning ALaboratory Manual(《分子克隆实验手册》)，冷泉港实验室(1989)纽约和Ausubel，CurrentProtocols in Molecular Biology(《分子生物学方法》)，Green出版协会和WileyInterscience，纽约(1994)。本发明的抗体的修饰包括对一个或多个组成氨基酸化学和/或酶地衍生化，包括侧链修饰，骨架修饰，以及对N-端和C-端的修饰，包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化、以及糖类化合物或脂质部分、辅助因子的连接等等。同样地，本发明包括嵌合蛋白质的产生，嵌合蛋白质包括所描述的抗体或它的一些片段，其在氨基端融合至异源分子(如在羧基端免疫刺激配体)；见，例如，对相应的技术细节的国际申请WO00/30680。
另外，本发明包括肽，其包括如上所述含有结合分子的那些，例如含有提到抗体的任何一种的可变区的CDR3区域，特别是重链的CDR3，因为经常观察到重链CDR3(HCDR3)是具有更大程度可变性并在抗原-抗体相互作用中主要参与的区域。这些肽可以容易地被合成或通过重组方法产生，以产生根据本发明有用的结合剂。这样的方法对本领域中的普通技术人员是熟知的。肽可以被合成，例如使用可商购的自动肽合成仪。肽也可以通过重组技术通过将表达该肽的DNA引入到表达载体和使用表达载体转化细胞以产生肽来产生。
因此，本发明涉及任何结合分子，例如抗体或其结合片段，其指着本发明的抗TTR抗体和/或能够结合突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型或其片段的抗体，并显示上述性质，即其特异性识别TTR和/或突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型或其片段。这样的抗体和结合分子可通过ELISA和本文所述的免疫组织化学来测定它们的结合特异性和亲和力，参见，例如实施例。抗体和结合分子的这些特性也可通过Western印迹法(蛋白质印迹法)测定。
示例性的人类抗体NI-301.37F1显示了错误折叠的TTR对FAP患者皮肤活检切片显著的染色，但对健康对照胰腺(其中胰腺α细胞显示出TTR的内源性表达，即天然TTR(见实施例8和图9))没有染色。本发明示例性抗体NI-301.35G11和NI-301.37F1对于在各种组织(包括肠)中显示异常TTR积聚的FAP小鼠组织也给出了阳性结果，参见图8。该对于在人类和动物组织中的TTR病理形式的结合特异性强调除了本文显示的生化实验(参见图10)，在治疗和诊断与TTR淀粉样变性相关疾病(其优选地由于错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型和/或其片段、衍生物的发生而发生)中本发明抗体的可用性。
作为直接从B细胞或记忆B细胞的培养物获得的免疫球蛋白的替代物，细胞可被作为用于随后表达和/或基因操作的重排重链和轻链基因座的来源。重排抗体基因可以从适当的mRNA进行逆转录以产生cDNA。如果需要的话，重链恒定区可以被交换为不同同型的重链恒定区或完全消除。可变区可以链接以编码单链Fv区。多个Fv区可以被连接以赋予对于多于一个的靶的结合能力，或者嵌合重链和轻链组合也可以被使用。一旦遗传材料获得了，如上述的保留它们对所期望靶的结合能力的类似物的设计是简单直接的。克隆抗体可变区和产生重组抗体的方法对本领域技术人员是熟知的，并描述于，例如，Gilliland等人,Tissue Antigens 47(1996),1-20；Doenecke等人,Leukemia 11(1997),1787-1792。
一旦适当的遗传物质被获得和，如果需要的话，被修饰为编码类似物，包括编码至少重链和轻链的可变区的编码序列的编码序列可以插入到被包含在可被转染入标准重组宿主细胞的载体的表达系统中。各种这样的宿主细胞可以被使用；用于有效的处理，但是，哺乳动物细胞是优选的。用于此目的的典型的哺乳动物细胞系包括，但不限于，CHO细胞、HEK 293细胞或NSO细胞。
然后通过在适宜用于宿主细胞生长和编码序列表达的培养条件下，培养修饰的重组宿主来进行抗体或类似物的产生。然后所述抗体从该培养物中分离而被回收。表达系统优选地被设计为包括信号肽，以使产生的抗体被分泌到培养基中；然而，细胞内产生也是可能的。
根据上述情况，本发明也涉及编码本发明的抗体或等效结合分子的多核苷酸，在抗体的情况下，优选至少上述抗体的免疫球蛋白链的可变区。通常情况下，由所述由多核苷酸编码的可变区包括所述抗体可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。在本发明的一个实施方式中，多核苷酸是cDNA。
本领域技术人员的技术人员将容易理解，具有上述可变结构域的抗体的可变结构域可以用于所需特异性和生物功能的其他多肽或抗体的构建。因此，本发明还包括多肽和抗体，其包含上述可变结构域的至少一个CDR并且有利地具有与所附实施例中描述的抗体大致相同或相似的结合特性。本领域的技术人员在知道结合亲和性可以通过CDR内或与Kabat所定义的CDR部分重叠的高变环内氨基酸的取代来提高(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196(1987),901-917)；见，例如，Riechmann等人，Nature 332(1988)，323-327。因此，本发明还涉及其中一个或多个所述的CDR包括一个或多个，优选不超过两个氨基酸取代的抗体。优选地，本发明的抗体在其一个或两个免疫球蛋白链中包含可变区的两个或所有三个CDR，如图1阐述的。
结合分子，例如本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，正如本领域的普通技术人员所知的，可包含介导一种或多种效应子功能的恒定区。例如，补体的C1部分与抗体恒定区的结合可以活化补体系统。补体的活化在细胞病原体的调理作用和裂解中是重要的。补体的活化也刺激炎症反应，并且也可以参与自身免疫超敏性。此外，抗体经由Fc区，凭借结合到细胞上Fc受体(FcR)的抗体Fc区上的Fc受体结合位点而结合到各种细胞上的受体。有许多对于不同类型的抗体有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)，IgE的(ε受体)，IgA的(α受体)和IgM(μ受体)。抗体结合到细胞表面的Fc受体触发了许多重要和多样的生物反应，包括抗体包被颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、由杀伤细胞导致的抗体包被靶细胞的裂解(称为抗体依赖的细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移和免疫球蛋白产生的控制。
因此，本发明的某些实施方式包括抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中至少恒定区结构域的一个或多个的部分被缺失或改变，以便提供所需的生化特性，诸如当与完整的、未改变的、具有大致相同的免疫原性的抗体相比，降低的效应子的功能、非共价二聚化的能力，提高了的在TTR聚集和沉积的位点定位的能力，提高的血清半衰期或降低的血清半衰期。例如，用于本文所述的诊断和治疗方法的某些抗体是结构域缺失的抗体，其包含类似于免疫球蛋白重链的多肽链，但其缺乏一个或多个重链结构域的至少一部分。例如，在某些抗体中，修饰的抗体的恒定区的一个完整结构域将被缺失，例如，CH2结构域的全部或部分将被缺失。在其他实施方式中，用于本文所述的诊断和治疗方法的某些抗体具有被改变以消除糖基化(在本文别处称为糖基化的或“agly”抗体)的恒定区(例如IgG重链恒定区)。这样的“agly”抗体可酶促制备或者通过设计恒定区的共有糖基化位点来制备。虽然不受理论束缚，人们认为“agly”抗体可在体内具有提高了的安全性和稳定性特点。制备具有所需的效应子功能的糖基化抗体的方法，可在例如在国际申请WO 2005/018572中找到，其通过引用并入本文。
在本文所述的某些的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物中，可以使用本领域中已知的技术使所述Fc部分突变，以降低效应子功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他手段)可能降低Fc受体对循环修饰的抗体的结合，从而增强TTR的定位。在其他情况下，可以是与本发明一致的恒定区的修饰减轻补体结合，从而降低血清半衰期和共轭细胞毒素的非特异性缔合。然而恒定区的其他修饰可用于修饰二硫键或寡糖部分，其由于提高的抗原特异性或抗体柔性而允许增强的定位。所得的生理信息、生物利用度和修饰的其他生化效应(诸如TTR定位、生物分布和血清半衰期)可以使用众所周知的免疫学技术而无需过度的实验容易地测定和定量。
在本文所述的某些的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物中，所述Fc部分可以被突变或交换为替代的蛋白质序列以提高抗体的细胞摄取，通过经由Fcγ受体、LRP或Thy1受体或由“超级抗体技术”(据说使使抗体被穿梭进入活细胞而不伤害它们，ExpertOpin.Biol.Ther.(2005),237-241)增强抗体的受体介导的内吞作用。例如，抗体结合区融合蛋白和细胞表面受体的同源蛋白配体或具有结合TTR和细胞表面受体的特定序列的双特异性或多特异性抗体的产生可以使用本领域已知的技术进行设计。
在本文所述的某些的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物中，所述Fc部分可以被突变或交换为替代的蛋白质序列，或者所述抗体可以被化学修饰以提高其血脑屏障渗透。
本文所述的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的修饰形式可以从整个前体或母体抗体使用本领域中已知的技术制备。示例性技术在本文更详细地讨论。本文所述的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可以使用本领域中已知的技术制备或生产。在某些实施方式中，抗体分子或其片段是“重组产生的”，即，是使用重组DNA技术产生的。用于制备抗体分子或其片段的示例性技术在本文其他地方更详细地讨论。
本发明所述的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物也包括被修饰的衍生物，例如，通过对抗体共价连接任何类型的分子使得共价连接不阻止抗体对其同源表位的特异性结合。例如，但不限于，所述抗体衍生物包括已经通过，例如，糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解、与细胞配体或其他蛋白连接的修饰的抗体。许多化学修饰的任何方式都可通过已知的技术，包括，但不限于，特定化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等进行。另外，该衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。
特别优选的实施方式中，本文所述的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物也包括被修饰的衍生物不会引起在待治疗动物体内有害的免疫反应，例如在人类体内。在某些实施方式中，结合分子，例如本发明的抗体或其抗原结合片段来源于患者，例如人类患者，并且随后在它们来源的相同物种使用，例如，人，减轻或最小化有害免疫反应的发生。
去免疫也可用于降低抗体的免疫原性。如本文中所使用的，术语“去免疫”包括抗体的改变以修饰T细胞表位；见，例如，国际申请WO98/52976和WO00/34317。例如，来自起始抗体的VH和VL序列被分析，并且人T细胞表位从显示与互补决定区(CDR)和序列中的其他关键残基相关的表位定位的每个V区“作图”。来自T细胞表位图的单独的T细胞表位被分析，以便确定具有改变最终抗体活性的低风险的替代性氨基酸取代。一批替代的VH和VL序列被设计，包括氨基酸取代的组合，并且这些序列随后被引入一批结合多肽中，例如，在本文所公开的诊断和治疗方法中使用的TTR特异性抗体或其免疫特异性片段，然后将其用于功能测试。通常情况下，12个和24个之间的变体抗体被产生并测试。然后包含修饰的V区和人C区的完整重链和轻链基因被克隆到表达载体中，并且随后质粒被导入细胞系用于产生整个抗体。然后所述抗体在适当的生物化学和生物学测定中相比，最佳的变体被确定。
单克隆抗体可使用多种本领域已知的技术(包括使用杂交瘤、重组、和噬菌体展示技术、或它们的组合)来制备。例如，可使用包括本领域已知的并教授的(例如，Harlow等人,在Antibodies:A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》)冷泉港实验室出版社，第2版(1988)；Hammerling等人,在Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(《单克隆抗体与T细胞杂交瘤》)Elsevier,纽约,563-681(1981))杂交瘤技术来制备，所述文献通过引入并入本文。如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指源于单个克隆的抗体，包括任何真核、原核、或噬菌体克隆，而不是指其产生的方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。在某些实施方式中，本发明的抗体来源于已经通过用Epstein-Barr病毒转化被永生化的人类B细胞，如本文所述。
在众所周知的杂交瘤过程中(Kohler等人，Nature256(1975)，495)源于哺乳动物的相对短寿命的或即将死亡的淋巴细胞(例如本文所述的源于人类受试者的B细胞)与永生化的肿瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)融合，由此产生杂交细胞或“杂交瘤”，其既是永生化的，也能够产生基因编码的B细胞的抗体。通过选择、稀释、并用含有用于形成单个抗体的特定基因的每个单独的细胞株的再生，所得的杂交体被分离成单独的遗传株。它们产生针对所需抗原是同种的抗体，并参考它们纯的遗传谱系关系，被称为“单克隆”。
由此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和生长，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的一种或多种物质。本领域的技术人员将理解，用于杂交瘤的形成、选择和生长的试剂、细胞系和培养基可商购自许多来源，并且标准化的方案已很好地确立。一般地，在其中生长杂交瘤细胞的培养基被测定用于抗所期望的抗原的单克隆抗体的产生。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过诸如本文所述的免疫沉淀，放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的体外测试确定。杂交瘤细胞鉴定为产生具有所需特异性，亲和力和/或活性的抗体后，该克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆和通过标准方法生长；见，例如，Goding，Monoclonal Antibodies:Principles andPractice(《单克隆抗体：原理与实践》，Academic Press(学术出版社)(1986年)，59-103。还应该理解的是，由亚克隆分泌的单克隆抗体可以从培养基、腹水或血清中通过常规纯化方法(诸如蛋白A、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和层析色谱)分离。
在另一个实施方式中，淋巴细胞可通过显微操作来选择，并且可变基因被分离。例如，外周血单核细胞可以从经免疫化的或天然免疫的哺乳动物(例如人)分离，并在体外培养约7天。培养物可以筛选符合筛选标准的特定的IgG。源自阳性孔中的细胞可以被分离。单独的产生Ig的B细胞可以通过FACS或通过在补体介导的溶血斑测定中识别他们而分离出来。产生Ig的B细胞可以显微操作进入管中，并且VH和VL基因可使用例如，RT-PCR扩增。VH和VL基因可克隆进抗体表达载体并转染进细胞(例如，真核或原核细胞)中而表达。
可替换地，可以使用对于本领域有经验的技术人员是熟知的技术来选择并培养产生抗体的细胞系。这样的技术在各种实验室手册和主要出版物中有描述。在这方面，正如下面所描述的适合用于本发明的技术被描述于Current Protocols in Immunology(《现代免疫学方法》)，Coligan等人编，Green Publishing Associates和Wiley-Interscience,JohnWiley和Sons,纽约(1991)，其通过引用并入本文。
识别特异性表位的抗体片段可以通过已知的技术产生。例如，Fab和F(ab')2片段可以重组或通过免疫球蛋白分子的蛋白切割产生，使用诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生的F(ab')2片段)的酶。F(ab')2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。这样的片段对于使用是足够的，例如在涉及将免疫球蛋白的免疫特异性部分与检测试剂(诸如放射性同位素)偶联的免疫诊断过程。
在一个实施方式中，本发明的抗体包含抗体分子的至少一个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少两个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少三个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少四个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少五个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少六个CDR。包含至少一个CDR的示例性抗体分子可以包含于本文所描述的受试者抗体中。
本发明的抗体可通过本领域中已知的用于合成抗体的任何方法，尤其是通过化学合成或优选通过如本文所述的重组表达技术制备。
在一个实施方式中，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物包括合成的恒定区，其中一个或多个结构域被部分或完全缺失(“结构域缺失的抗体”)。在某些实施方式中，兼容的修饰的抗体将包含结构域缺失的构建体或变体，其中整个CH2结构域已被移除(CH2构建体)。对于其他实施例，短连接肽可以取代所缺失的结构域，以提供可变区的灵活性和活动自由。本领域的技术人员将理解，这样的构建体是特别优选的，因为CH2结构域对于抗体分解代谢速率的调节性能。结构域缺失的构建体可以用编码人IgG1恒定区的载体获得，参见，如，国际申请WO02/060955和WO02/096948A2。该载体被设计来缺失所述CH2结构域并提供表达结构域缺失的IgG1恒定区的合成载体。
在某些实施方式中，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物是微型抗体。微型抗体可以使用本领域描述的方法制备，参见，如，美国专利5837821或国际专利申请WO 94/09817。
在一个实施方式中，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物包含具有一些或甚至单个氨基酸取代或者缺失的免疫球蛋白重链，只要它允许单体亚基之间的缔合。例如，在CH2结构域的所选区域内单个氨基酸的突变可足以基本上减少Fc结合并因此增加TTR的定位。类似地，可以期望简单地缺失控制效应子功能(例如补体结合)的一个或多个恒定区结构域的部分，以进行调节。恒定区的这种部分缺失可改善抗体的所选择的性质(血清半衰期)，而同时使得与受试者恒定区结构域相关联的其他所需功能不被破坏。此外，如上面提到的，所公开抗体的恒定区可以是通过一个或多个氨基酸取代或者突变合成的，其提高了所得构建体的特性。在这方面，有可能破坏由保守结合位点(例如Fc结合)提供的活性，而基本上保持了修饰抗体的结构和免疫原性的特征。然而其他的实施方式包括向恒定区添加一种或多种氨基酸，以提高所期望的特性(例如效应子功能)，或者提供更多的细胞毒素或糖类化合物连接。在这种实施方式中，可能期望插入或复制源于选定的恒定区结构域的特定序列。
本发明还提供了包含，基本上由，或由本文中所描述的抗体分子(例如，VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)的抗体，其抗体或其片段免疫特异性地结合TTR。对于本领域技术人员熟知的标准技术可被用于引入编码抗体的核苷酸序列中的突变(包括但不限于位点定向诱变和PCR介导的诱变，其导致氨基酸取代)。优选地，相对于参考VH区、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL区、VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3，所述变体(包括衍生物)编码小于50个氨基酸的取代，少于40个氨基酸的取代，少于30个氨基酸的取代，少于25个氨基酸的取代，少于20个氨基酸的取代，少于15个氨基酸取代，小于10个氨基酸的取代，少于5个氨基酸的取代，少于4个氨基酸的取代，少于3个氨基酸的取代，或少于2个氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是一种其中氨基酸残基被以具有相似电荷侧链的氨基酸残基取代的氨基酸。具有相似电荷侧链的氨基酸残基家族在本领域中已被定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。可替换地，突变可以随机沿着所有或部分编码序列引入，例如通过饱和诱变，所得的突变体可用于生物活性的扫描以鉴定保留活性的突变体(例如，结合TTR和/或错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR类型和/或其片段的能力)。
例如，仅在抗体分子的框架区或仅在CDR区引入突变是可能的。引入的突变可以是沉默或中性的错义突变，例如，没有或具有很少对抗体结合抗原能力的影响，确实一些此类突变不改变任何氨基酸序列。这些类型的突变可能对优化密码子的使用是有用的，或者提高的杂交瘤的抗体产生。密码子优化的编码本发明抗体的编码区在本文的其他地方公开了。可替换地，非中性的错义突变可改变抗体结合抗原的能力。大多数沉默突变和中性错义突变的位置可能是在构架区中，而大多数非中性的错义突变的位置可能是在CDR，尽管这不是绝对的要求。本领域的技术人员将能够设计和测试具有所需的诸如没有改变抗原结合活性或改变结合活性(例如提高抗原结合活性或抗体特异性的变化)的性质的突变分子。诱变发生以后，所编码的蛋白质可以常规地被表达，并且编码的蛋白质的功能和/或生物活性(例如免疫特异性结合TTR和/或突变的，错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR或其片段的至少一个表位的能力)可以通过使用本文描述的技术或通过在本领域中已知的常规修饰技术来测定。
三、多核苷酸编码的抗体
编码抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸构成，其可以是未修饰的RNA或DNA，或者是修饰的RNA或DNA。例如，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由单链和双链DNA(其是单链和双链区的混合物的DNA)、单链和双链RNA(其是单链和双链区的混合物的RNA)、包含可以是单链的或者，更典型地是双链的或者单链和双链区的混合物的DNA和RNA的杂分子组成。此外，编码抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸，可以由包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域构成。编码抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸，也可含有一个或多个修饰的碱基或者为稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括，例如三苯甲基化碱基和稀有碱基如肌苷。可以对DNA和RNA进行各种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学、酶或代谢修饰的形式。
编码来自免疫球蛋白(例如免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的多肽的非天然变体的分离的多核苷酸可通过向免疫球蛋白的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失而创建，使得一个或多个氨基酸取代、添加或缺失被引入所编码的蛋白。突变可以通过标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变来引入。优选地，保守的氨基酸取代是在一个或多个非必需氨基酸残基处进行。
如众所周知的，RNA可以通过标准技术从原始B细胞、杂交瘤细胞或从其他转化的细胞，诸如异硫氰酸胍提取和沉淀随后离心或柱层析进行分离。如果需要，mRNA可以通过标准技术(如在寡聚dT纤维素柱层析)从总RNA分离出来。适合的技术在本领域中是熟悉的。在一个实施方式中，编码抗体的轻链和重链的cDNA可以使用逆转录酶和DNA聚合酶按照已知的方法同时或分别制备。PCR可以通过共同的恒定区引物或通过基于发表的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更具特异性的引物来启动。如上所述，PCR也可以用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，所述库可以用通用引物或更大的同源探针(如人恒定区探针)来筛选。
DNA，通常是质粒DNA，可以使用本领域中已知的技术从细胞中分离，并根据标准的已被详细阐述的众所周知的技术(例如涉及重组DNA技术的前述的引用)严格作图并测序。当然，DNA可以根据本发明在分离过程中或随后的分析中的任何点合成。
在此背景下，本发明还涉及编码本发明抗体的免疫球蛋白链的至少结合结构域或可变区的多核苷酸。在一个实施方式中，本发明提供了包含，基本上由，或由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸构成的分离的多核苷酸，其中重链可变区的至少一个CDR或重链可变区的至少两个VH-CDR与来自本发明公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列有至少80％、85％、90％或95％的相同。可替换地，VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区与来自本发明公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列有至少80％,85％,90％或95％的相同。因此，根据本实施方式，本发明的重链可变区有与在图1中所示的多肽序列相关的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3多肽序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含，基本上由，或由编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸构成的分离的多核苷酸，其中轻链可变区的至少一个VL-CDR或轻链可变区的至少两个VL-CDR与来自本发明公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列有至少80％、85％、90％或95％的相同。可替换地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区与来自本发明公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列有至少80％,85％,90％或95％的相同。因此，根据本实施方式，本发明的轻链可变区有与在图1中所示的多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3多肽序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含，基本上由，或由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸构成的分离的多核苷酸，其中，VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与图1中示出的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区相同的多肽序列。
如本领域中所知的，两个多肽或两个多核苷酸之间“序列同一性”是通过比较一种多肽或多核苷酸的氨基酸或核酸序列与第二多肽或多核苷酸的序列来确定的。当在本文中讨论时，任何特定多肽是否是与另一种多肽有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％的相同，可以使用本领域中已知的方法和计算机程序/软件来确定，例如但不限于，BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575ScienceDrive,Madison,WI 53711(Wisconsin序列分析软件包，用于Unix的第8版，遗传学计算机组，大学研究园，科学路575号，麦迪逊，威斯康星53711))。BESTFIT使用Smith和Waterman的局部同源性算法，Advances in Applied Mathematics 2(1981),482-489，去寻找两个序列之间的最佳同源性片段。当使用BESTFIT或任何其他序列比对/校准程序来确定特定序列是否与根据本发明的参考序列有，例如95％的相同时，参数被设置，当然，使得同一性的百分比是在参考多肽序列的全长度计算，并使得在参考序列中氨基酸总数的最高5％的同源性缺口/差距是允许的。
在本发明的一个优选实施方式中，所述多核苷酸包含，基本上由，或由具有抗TTR抗体和/或识别如表II中描述的错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR类型或其片段的抗体的VH或VL区的多核苷酸序列的核酸构成。在这方面，本领域的技术人员将容易理解，编码至少所述轻链和/或重链的可变结构域的多核苷酸可以编码免疫球蛋白的两个链或仅一个链的可变结构域。在一个实施方式中，因此所述多核苷酸包含，基本上由，或由具有识别如表II中描述的错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR和/或其片段的抗TTR抗体的VH或VL区的多核苷酸序列的核酸构成。
表II：识别突变的错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR类型和/或其片段的抗体的VH和VL区的多核苷酸序列
Figure BDA0002393114180000701
Figure BDA0002393114180000711
Figure BDA0002393114180000721
Figure BDA0002393114180000731
Figure BDA0002393114180000741
Figure BDA0002393114180000751
由于克隆策略，在重链和轻链的N-端和C-端的氨基酸序列可以潜在地包含在FR1和FR4的引物诱导的变化，然而其基本上不影响抗体的生物活性。为了提供共同人抗体，原始克隆的核苷酸和氨基酸序列可以根据数据库中的(见，例如Vbase2，如上所述)相关的人生殖细胞细胞系可变区序列校准和调节。人抗体的氨基酸序列以粗体显示，当N-端和C-端的氨基酸被认为是由于PCR引物而潜在地偏离共有生殖细胞系序列，而因此被引物诱导突变更正(PIMC)所取代，见表III。因此，在本发明的一个实施方式中，多核苷酸包含，基本上由，或由具有如表III中所示的VH的多核苷酸序列和如表II中所示的抗TTR抗体的相应VL区的多核苷酸序列的核酸构成。
表III：识别突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型和/或其片段的抗体的VH和VL区的核苷酸序列显示由PIMC(粗体)取代。
Figure BDA0002393114180000752
本发明也包括本发明的多核苷酸的片段，如在别处所述。此外，编码如本文所述的融合多核苷酸、Fab片段以及其他衍生物的多核苷酸也是本发明考虑的。
所述多核苷酸可以通过本领域已知的任何方法产生或制造。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，编码该抗体的多核苷酸可以从化学合成的寡核苷酸组装，例如在Kutmeier等人，BioTechniques 17(1994),242中描述的，简而言之，其涉及含有编码抗体序列的部分的重叠寡核苷酸的合成，那些寡核苷酸的退火和连接，然后通过PCR对连接的寡核苷酸的扩增。
可替换地，编码抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体的多核苷酸，可以由源于合适来源的核酸产生。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆是得不到的，但抗体分子的序列是已知的，编码该抗体的核酸可以被化学合成或从适当的来源(例如抗体cDNA文库或cDNA文库产生于，或者核酸，优选多聚A+RNA，分离于，任何表达的TTR特异性抗体的组织或细胞，例如被选择来表达抗体的杂交瘤细胞)通过使用对序列的3'和5'端可杂交的合成引物的PCR扩增，或者通过使用可被特定基因序列特异性识别的寡核苷酸探针的克隆(例如，来源于编码抗体的cDNA文库的cDNA克隆)来获得。使用本领域中已知的任何方法，由PCR产生的扩增的核酸然后可以被克隆进可复制的克隆载体中。因此，在本发明的一个实施例中，编码抗体、免疫球蛋白链，或其片段的cDNA被用于产生抗TTR抗体。
一旦核苷酸序列和抗体相应的氨基酸序列、或其抗原结合片段、变体或衍生物被确定，可以使用本领域已知的用于核苷酸序列的调控的方法(例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等，参见，例如描述于Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual(《分子克隆，实验室手册》)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，ColdSpring Harbor(冷泉港)，纽约(1990)和Ausubel等人编，Current Protocols inMolecular Biology(《现代分子生物学方案》)，John Wiley&Sons,纽约(1998)，这两者都通过引用并入本文)对其核苷酸序列进行调控，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失和/或插入。
五、抗体多肽的表达
在用于提供本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的分离的基因材料的调控后，编码抗体的多核苷酸通常被插入到表达载体，用于引入到可用于产生所需量抗体的宿主细胞内。抗体或其片段、衍生物或类似物的重组表达(例如结合到靶分子的抗体的重链或轻链)在本文中被描述。一旦获得了编码本发明的抗体分子或抗体的重链或轻链，或其部分(优选含有重链或轻链可变结构域)的多核苷酸，用于产生抗体分子的载体可以通过使用本领域众所周知的技术的重组DNA技术制备。因此，本文描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白的方法。对于本领域技术人员是众所周知的方法可用于构建含有抗体编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如体外重组DNA技术、合成技术，以及体内基因重组。因此，本发明提供了包含编码本发明的抗体分子、或其重链或轻链、或重链或轻链可变结构域的，可调控连接到启动子的核苷酸序列的可复制的载体。这种载体可包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(见，例如，国际申请WO 86/05807和WO89/01036；和美国专利5,122,464)，并且抗体的可变结构域可被克隆进用于表达整个重链或轻链的这样的载体。
术语“载体”或“表达载体”在本文中用来指如下载体：按照本发明作为用于在宿主细胞中引入并表达所需基因的运载工具。正如本领域技术人员所知的，这样的载体可以容易地从由质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒组成的组中选择。在一般情况下，与本发明兼容的载体将包含选择性标记物、促进所期望的基因的克隆和促进进入真核或原核细胞和/或在真核或原核细胞中复制的能力的适当的限制性位点。为了本发明的目的，许多表达载体系统都可以使用。例如，一类载体利用了来自动物病毒(如牛乳头状瘤病毒，多瘤病毒，腺病毒，牛痘病毒，杆状病毒，逆转录病毒(RSV，MMTV或MoMLV)或SV40病毒)的DNA元件。其他涉及具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的使用。此外，具有DNA整合入其染色体的细胞可以通过引入一个或多个允许转染的宿主细胞的选择的标记物来选择。该标记物可以向营养缺陷型宿主、生物杀灭剂抗性(例如抗生素)、或抗诸如铜的重金属的抗性提供原养型。选择标记物基因可以直接连接到DNA序列而被表达，或者通过共转化导入相同的细胞。可能还需要用于mRNA最佳合成的另外的元件。这些元件可包括信号序列、剪接信号、以及转录启动子、增强子和终止信号。
在特别优选的实施方式中，如上所讨论的，克隆的可变区基因与重链和轻链恒定区基因(优选人类)一起被插入到表达载体中。该载体含有巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β球主启动子、SV40复制起点、牛生长激素聚腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。该载体已被发现导致抗体的非常高的水平的表达，基于可变区和恒定区基因被掺入，在CHO细胞中转染，接着含有培养基和甲氨蝶呤扩增的G418的选择。当然，任何能够引发在真核细胞中表达的表达载体可以用于本发明中。合适的载体的实例包括，但不限于，质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、PEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、PSV40/Zeo2、pTracer-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可从Invitrogen公司获得，圣地亚哥，加州)以及质粒pCI(可从Promega公司获得，麦迪逊，威斯康星州)。一般而言，筛选大量的表达适当高水平的免疫球蛋白重链和轻链的转化细胞是常规化的实验，可通过，例如机器人系统进行。载体系统也被传授于美国专利5,736,137和5,658,570，其各自通过引用并入本文。该系统提供高的表达水平，例如，>30pg/细胞/天。其他示例性载体系统公开在，例如美国专利6413777。
在其他优选的实施方式中，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可以使用诸如在美国专利申请2003-0157641A1中公开的并且并入本文的多顺反子构建体来表达。在这些表达系统中，多个感兴趣的基因产物(例如抗体的重和轻链)可以由单个多顺反子构建体来制备。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)以提供相对高水平的抗体。兼容的IRES序列在美国专利6193980公开，也并入本文。本领域技术人员将理解，这样的表达系统可以用于有效地产生在本申请中公开的全范围的抗体。因此，在一个实施方式中，本发明提供了包含编码至少抗体免疫球蛋白链的结合结构域或可变区的多核苷酸的载体，任选地与编码的所述结合分子的其他免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸组合。
更一般地，一旦编码抗体单体亚基的载体或DNA序列已经制备，表达载体可被引入适当的宿主细胞。将质粒向宿主细胞的引入可以通过本领域技术人员已知的各种技术来完成。这些包括，但不限于，包括使用脂转染(例如
Figure BDA0002393114180000791
或脂质体)的转染、天然的质体融合、磷酸钙沉淀、细胞融合包膜的DNA、显微注射及用完整病毒感染。典型地，将质粒引入宿主是通过标准磷酸钙共沉淀法。携带该表达构建体的宿主细胞在适宜产生轻链和重链的条件下生长，并测定重链和/或轻链蛋白合成。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、或荧光激活细胞分类分析(FACS)、免疫组织化学等。
表达载体通过常规技术转移至宿主细胞，然后转染的细胞通过常规技术培养以产生在本文描述的方法中使用的抗体。因此，本发明包括含有编码本发明的抗体、或其重链或轻链、或至少是其免疫球蛋白的结合结构域或可变区的多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸优选可被调控连接至异源启动子。此外或备选地，本发明还包括含有编码抗体免疫球蛋白链的至少结合结构域或可变区的多核苷酸的如上文所定义的载体的宿主细胞，任选地与编码所述结合分子的其他免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸组合。在用于表达双链抗体的优选实施方式中，编码重链和轻链两者的单个载体或多个载体可以在用于表达整个免疫球蛋白分子的宿主细胞内共表达，如下文所详述的。
宿主细胞可以使用本发明的两个表达载体被共转染，第一个载体编码重链衍生的多肽，第二个载体编码轻链衍生的多肽。两种载体可含有相同的选择性标记物，其使重链和轻链多肽的同等表达。或者，一个单一的载体可以用于编码重链和轻链多肽。在这种情况下，轻链有利地被置于重链之前，以避免过量的有毒游离重链；见Proudfoot,Nature 322(1986),52；Kohler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980),2197。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
如本文所用的，“宿主细胞”指的是携带使用重组DNA技术构建的并编码至少一种异源基因的载体的细胞。在对从重组宿主分离抗体的过程的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用来表示抗体的来源，除非被明确规定。换言之，从“细胞”回收多肽可能意味着从旋降的完整细胞，或从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物回收。
各种宿主-表达载体系统可用于表达对在本文中所描述的方法中使用的抗体分子。这种宿主表达系统代表通过其感兴趣的编码序列可以产生并随后纯化的载体，但也表示，当转化或用适当的核苷酸编码序列转染时，可以在原位表达本发明的抗体分子的细胞。这些包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体DNA，质粒DNA或含抗体编码序列的粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母菌属、毕赤酵母属)；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带含有来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)的或来自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS，CHO，NS0，BLK，293，3T3细胞)。优选地，例如大肠杆菌(E.coli)的细菌细胞，更优选的真核细胞，尤其是用于整个重组抗体分子表达的，被用于重组抗体分子的表达。例如，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的哺乳动物细胞，与诸如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件的载体缀合，是抗体的有效表达系统；见，例如，Foecking等人,Gene 45(1986),101；Cockett等人,Bio/Technology 8(1990),2。
用于蛋白表达的宿主细胞系通常是哺乳动物来源的；本领域的技术人源被认为具有能力优先确定哪些是最适合于期望的基因产物在其中表达的特定宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括，但不限于，CHO(中国仓鼠卵巢)，DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR负)，HELA(人宫颈癌)，CVI(猴肾细胞系)，COS(CVI与SV40 T抗原的衍生物)，VERY，BHK(幼仓鼠肾)，MDCK，WI38，R1610(中国仓鼠成纤维细胞)BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)，HAK(仓鼠肾细胞系)，SP2/O(小鼠骨髓瘤)P3X63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)，BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)，RAJI(人类淋巴细胞)和293(人肾)。CHO和293细胞是特别优选的。宿主细胞系通常可以从商购服务、美国组织培养物保藏中心或者从发表的文献获得。
此外，宿主细胞株可以选择调节插入序列的表达，或以期望的特定的方式修饰和加工所需的基因产物的那些。蛋白产物的这种修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)可能对蛋白质的功能是重要的。不同的宿主细胞具有对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特定的机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此目的，可使用具有对基因产物的初级转录，糖基化，和磷酸化的适当处理的细胞机器的真核宿主细胞。
对于重组蛋白长期的、高产量的产生，稳定的表达是优选的。例如，稳定表达抗体分子的细胞系可被设计。宿主细胞可以用由合适的表达控制元件(例如，启动子，增强子，序列，转录终止子，聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择性的标记物进行转化，而非使用含有病毒复制来源的表达载体。在引入外源DNA后，设计的细胞可以在富集培养基中生长1-2天，然后转移到选择性培养基。在重组质粒中的选择性标记物赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定地整合到其染色体中并生长以形成可以反过来又可以克隆和扩大成细胞系的焦点/灶区。此方法可有利地用于设计稳定表达抗体分子的细胞系。
可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell11(1977),223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48(1992),202)、和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人,Cell 22(1980),817)基因可以分别在tk-,hgprt-or aprt-细胞中使用。此外，抗代谢抗性可以被用作下列基因选择性的基础：dhfr，其赋予对氨甲喋呤的抗性(Wigler等人,Natl.Acad.Sci.USA 77(1980),357；O'Hare等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981),1527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan and Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981),2072)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418抗性，Goldspiel等人，Clinical Pharmacy 12(1993),488-505；Wu和Wu，Biotherapy 3(1991),87-95；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32(1993),573-596；Mulligan,Science 260(1993),926-932；和Morgan and Anderson,Ann.Rev.Biochem.62(1993),191-217；TIB TECH 11(1993),155-215；和hygro，其赋予潮霉素抗性(Santerre等人,Gene 30(1984),147)。在重组DNA技术领域普遍熟知且可以使用的方法被描述于Ausubel等人编,Current Protocols inMolecular Biology(《现代分子生物学方法》),John Wiley&Sons,纽约(1993)；Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual(《基因转移和表达，实验室手册》),Stockton出版社,纽约(1990)；以及在Dracopoli等人编,Current Protocols inHuman Genetics(《现代人类遗传学方法》)的第12章和第13章,John Wiley&Sons,纽约(1994)；Colberre-Garapin等人,J.Mol.Biol.150:1(1981),其通过引用并入本文。
抗体分子的表达水平可通过载体扩增来提高，关于综述，参见Bebbington和Hentschel，《基于DNA克隆中用于哺乳动物细胞内克隆基因表达的基因扩增载体的使用》，学术出版社，纽约，卷3，(1987)。当表达抗体的载体系统中的标记物是可扩增的，提高在宿主细胞培养物中抑制剂的水平将将增加标记物基因的拷贝数。因为扩增区域与抗体基因相关，抗体产生量也将增加；参见Crouse等人，Mol.Cell.Biol.3(1983),257。
体外制备允许扩大规模提供大量所需的多肽。在组织培养条件下对哺乳动物细胞培养的技术是本领域已知的，包括均匀悬浮培养物，如在气升式反应器或连续搅拌反应器中，或固定化或包埋的细胞培养物，例如在空心纤维、微胶囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷墨盒上。如果必要和/或需要，多肽的溶液可以通过常规层析方法纯化，例如凝胶过滤、离子交换层析、DEAE-纤维素上的层析或(免疫)亲和层析，例如在优选的合成铰链区多肽的生物合成之后，或者在本文所述的HIC层析步骤之前或之后。
编码本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的基因也可以在非哺乳动物细胞例如细菌或昆虫或酵母或植物细胞中表达。可以容易吸收核酸的细菌包括肠杆菌科的成员，例如大肠杆菌(E.coli)或沙门氏菌菌株(Salmonella)；芽孢杆菌(Bacillaceae)，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。将进一步理解的是，在细菌中表达时，所述异源多肽典型地成为包涵体的一部分。该异源多肽必须被分离、纯化然后组装成功能性分子。其中，抗体的四价形式是需要的，然后该亚基将自组装成四价抗体；见，例如，国际申请WO02/096948。
在细菌系统中，许多表达载体可有利地被选择，取决于被表达的抗体分子打算的用途。例如，当大量的此种蛋白将要产生，对于抗体分子的药用组合物的产生，指导容易纯化的高水平的融合蛋白产物表达的载体可能是需要的。这种载体包括，但不限于，大肠杆菌(E.coli)表达载体pUR278(Ruther等人，EMBO J.2(1983)，1791)，其中抗体编码序列可以被单独连接到设计有(in frame with)lacZ编码区的载体，以便融合蛋白产生；pIN载体(Inouye and Inouye,Nucleic Acids Res.13(1985),3101-3109；Van Heeke andSchuster,J.Biol.Chem.24(1989),5503-5509)；等等。pGEX载体也可用于表达外源多肽，作为具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。总体而言，这类融合蛋白是可溶的，并且可以很容易地通过吸附和结合到谷胱甘肽-琼脂糖珠基质(随后在游离谷胱甘肽存在下的洗脱)从裂解的细胞中纯化得到。pGEX载体被设计为包括凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，以便克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。
除了原核生物，也可使用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是真核微生物中最常用的，虽然许多其他的菌株通常是可获得的，例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。为了在酵母属(Saccharomyces)中表达，例如质粒YRp7(Stinchcomb等人,Nature 282(1979),39；Kingsman等人,Gene 7(1979),141；Tschemper等人,Gene 10(1980),157)是常用的。该质粒已含有TRP1基因，它为诸如ATCC 44076号或PEP4-1(Jones,Genetics 85(1977),12)的缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株提供了选择性标记物。作为酵母宿主细胞基因组特征的trp1损伤的存在然后为检测通过在缺乏色氨酸条件下的生长的转化提供了有效环境。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus，AcNPV)通常用作载体以表达外源基因。该病毒生长在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中。抗体编码序列可被单独克隆进入病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)并被置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
一旦本发明的抗体分子被重组表达，所述的完整抗体、其二聚体、单独的轻链和重链或本发明的其他免疫球蛋白形式可根据本领域的标准程序被纯化，包括例如通过色谱(例如离子交换色谱，亲和色谱、特别是通过对蛋白A后的特异性抗原的亲和性的色谱，以及空间排阻柱色谱)，离心，差异溶解性，例如硫酸铵沉淀，或通过纯化蛋白质的任何其他标准技术；参见，例如，Scopes，Protein Purification(《蛋白质纯化》)，Springer Verlag，纽约，(1982)。可替换地，用于提高本发明抗体亲和力的优选方法在美国专利公开2002-0123057A1中公开。在一个实施方式中，因此本发明还提供了制备抗TTR抗体或识别突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型或其片段的抗体或其免疫球蛋白链的方法，所述方法包括：
(a)培养如上定义的宿主细胞，该细胞包含如上文所定义的多核苷酸或载体；和
(b)从培养物中分离所述抗体或其免疫球蛋白链。
此外，在一个实施方式中，本发明还涉及被上文所定义的多核苷酸编码的或可由用于制备抗TTR抗体的方法获得的抗体或其免疫球蛋白链。
五、融合蛋白与缀合物
在某些实施方式中，所述抗体多肽包含氨基酸序列或通常与抗体不相关的一个或多个部分。示例性修饰在下面更详细地描述。例如，本发明的单链Fv抗体片段可包含柔性连接序列，或者可以被修饰以添加功能性部分(例如，PEG、药物、毒素、或诸如荧光、放射性、酶、核磁性、重金属等的标记物)。
本发明的抗体多肽可包含，基本上由，或由融合蛋白构成。融合蛋白是包含例如具有至少一个靶结合位点的免疫球蛋白TTR结合结构域和至少一个异源部分(即在自然中不与之天然连接的部分)的嵌合分子。该氨基酸序列通常可存在于融合多肽中被带到一起的分离的蛋白中，或者它们通常可存在于相同的蛋白中，但在融合多肽中被置于新的排列方式。融合蛋白可以被创建，例如，通过化学合成，或通过创建和翻译多核苷酸(其中肽区域以所需的关系被编码)。
应用于多核苷酸或多肽的术语“异源的”，是指多核苷酸或多肽是源于与要与之比较的剩余的实体截然不同的实体。例如，如本文所使用的，将与抗体或其抗原结合片段、衍生物、变体或类似物融合的“异源多肽”来自相同种的非免疫球蛋白多肽，或不同种的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。正如本文在其他地方更详细讨论的，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可以在N-端或C-端进一步被重组融合到异源多肽，或者化学缀合(包括共价和非共价缀合)到多肽或其他组合物。例如，抗体可以重组融合或缀合到在检测测定中可用作标记物的分子中和诸如异源多肽、药物、放射性核素或毒素的效应分子中；见，例如，国际申请WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利5,314,995；和欧洲专利申请EP 0 396 387。
本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可以由通过肽键或修饰的肽键(即肽等排体)彼此连接的氨基酸构成，并且可含有除了20种基因编码的氨基酸以外的其他氨基酸。抗体可以通过天然过程修饰，如翻译后加工、或通过本领域已知的化学修饰技术修饰。此类修饰在基础教科书和更详细的专著以及大量的研究文献中被充分说明。修饰可以在抗体的任何部分发生，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基端，或在诸如糖的部分。应当理解，相同类型的修饰可以以相同或不同的程度存在于给定的抗体的几个位点。此外，给定的抗体可以含有许多类型的修饰。抗体可以是支链的，例如，作为泛素化的结果，并且它们可以是环状的，有或没有支链。环状的、支链的和支链环状的抗体可从翻译后的天然过程得到，或可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黄素的共价连接，血红素部分的共价连接，核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接，脂质或脂质衍生物的共价连接，磷脂酰肌醇的共价连接，交联，环化，二硫键形成，脱甲基化，形成共价交联，形成半胱氨酸，形成焦谷氨酸，甲酰化，γ-羧化，糖基化，GPI锚形成，羟基化，碘化，甲基化，豆蔻酰化，氧化，聚乙二醇化，蛋白水解加工的化，磷酸化，异戊烯化，外消旋化，硒化，硫酸化，转移RNA介导氨基酸添加到蛋白质如精氨酰化，和泛素化；见，例如，Proteins-Structure AndMolecular Properties(《蛋白质-结构和分子特性》)，T.E.Creighton,W.H.Freeman andCompany,纽约，第二版,(1993)；Posttranslational Covalent Modification OfProteins(《蛋白的翻译后共价修饰的》),B.C.Johnson编,Academic Press(学术出版社),纽约,(1983)1-12；Seifter等人,Meth.Enzymol.182(1990),626-646；Rattan等人,Ann.NYAcad.Sci.663(1992),48-62)。
本发明还提供了包含抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物以及异源多肽的融合蛋白。在一个实施方式中，本发明的融合蛋白包括，基本上由，或由具有本发明抗体或任何一个或多个VH区的氨基酸序列的多肽，或者具有本发明抗体或任何一个或多个VL区的氨基酸序列的多肽，或者其片段或变体以及异源性多肽序列构成的。在另一个实施方式中，在本文公开的诊断和治疗方法中使用的融合蛋白包括，基本上由，或由具有抗体的任意一个、两个、三个VH-CDR的氨基酸序列的多肽，或者其片段、变体或者衍生物，或者抗体的任意一个、两个、三个VL-CDR的氨基酸序列的多肽，或者其片段、变体或者衍生物，以及异源多肽序列构成。在一个实施方式中，所述融合蛋白包含具有本发明抗体VH-CDR3的氨基酸序列的多肽、或其片段、衍生物或变体，以及异源多肽序列，其中融合蛋白特异性地结合TTR。在另一个实施方式中，所述融合蛋白包含具有本发明抗体至少一个VH区的氨基酸序列和具有本发明抗体至少一个VL区的氨基酸序列的多肽，或者其片段、衍生物或变体，以及异源多肽序列。优选地，所述融合蛋白的VH和VL区对应于特异性结合TTR的单一来源抗体(或scFv或Fab片段)。但是在另一个实施方式中，在本文公开的诊断和治疗方法中使用的融合蛋白包括具有抗体的任意一个、两个、三个或更多个VH-CDR的氨基酸序列以及抗体的任意一个、两个、三个或更多个VL-CDR的氨基酸序列的多肽，或者其片段、变体或者衍生物，以及异源多肽序列。优选地，两个、三个、四个、五个、六个或更多的VH-CDR或VL-CDR对应于本发明的单一来源抗体(或scFv或Fab片段)。编码这些融合蛋白的核酸分子也包括在本发明中。
文献中报道的示例性融合蛋白包括T细胞受体的融合(Gascoigne等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987),2936-2940；CD4(Capon等人,Nature 337(1989),525-531；Traunecker等人,Nature 339(1989),68-70；Zettmeissl等人,DNA Cell Biol.USA 9(1990),347-353；和Byrn等人,Nature 344(1990),667-670)；L-selectin(homingreceptor(归巢受体))(Watson等人,J.Cell.Biol.110(1990),2221-2229；和Watson等人,Nature 349(1991),164-167)；CD44(Aruffo等人,Cell 61(1990),1303-1313)；CD28和B7(Linsley等人,J.Exp.Med.173(1991),721-730)；CTLA-4(Lisley等人,J.Exp.Med.174(1991),561-569)；CD22(Stamenkovic等人,Cell 66(1991),1133-1144)；TNF receptor(TNF受体)(Ashkenazi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991),10535-10539；Lesslauer等人,Eur.J.Immunol.27(1991),2883-2886；和Peppel等人,J.Exp.Med.174(1991),1483-1489(1991)；和IgE receptor(IgE受体)(Ridgway and Gorman,J.Cell.Biol.115(1991),Abstract No.1448)。
如本文其他地方所讨论的，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可被融合至异源多肽，以增加多肽的体内半衰期或用于使用本领域中已知方法的免疫测定。例如，在一个实施例中，PEG可缀合至本发明的抗体以增加其在体内的半衰期；见，例如，Leong等人,Cytokine16(2001),106-119；Adv.in Drug Deliv.Rev.54(2002),531；或Weir等人,Biochem.Soc.Transactions 30(2002),512。
此外，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可被融合至标记物序列，例如肽，以促进它们的纯化或检测。在优选的实施方式中，标记物氨基酸序列是六组氨酸肽(HIS)，例如在pQE载体中提供的标记(QIAGEN公司，伊顿大街9259号，Chatsworth，加州，91311)，等等，这些中的许多都是市售的。正如在Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989),821-824中所描述的，例如，六组氨酸提供了融合蛋白的方便纯化。用于纯化的其他肽标签包括，但不限于，“HA”标签，其对应于来自流感血细胞凝集素蛋白质的表位(Wilson等人,Cell 37(1984),767)，GST，C-mycand“flag(旗帜)”tag(标签)；见，例如，BillBrizzard,BioTechniques 44(2008)693-695关于表位标记技术的综述，和在694页的表I列出了本发明中使用的最常见的表位标签，主题被引入作为参考。
融合蛋白可使用本领域中已知的方法来制备；参见例如美国专利5,116,964和5,225,538。融合发生的精确位点可以根据经验选择，以优化融合蛋白的分泌或结合特征。然后编码融合蛋白的DNA被转染进用于表达的宿主细胞，其如前文所述进行。
本发明的抗体可以以非共轭形式使用，或者可偶联至各种分子中的至少一种，例如，来提高该分子的治疗性质，以促进靶点探测，或用于成像或患者的治疗。当进行纯化，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可以在纯化之前或纯化之后被标记或缀合。特别是，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可以可以缀合至治疗剂、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药用制剂、或PEG。
作为包括常规抗体的免疫毒素的缀合物已经在本领域得到了广泛的说明。所述毒素可以通过常规偶联技术偶联至抗体，或者含蛋白质毒素部分的免疫毒素可以制备为融合蛋白。本发明的抗体可以以相应的方式使用，以获得这样的免疫毒素。有代表性的这类免疫毒素是那些由Byers,Seminars Cell.Biol.2(1991),59-70和Fanger,Immunol.Today 12(1991),51-54所描述的。
本领域的专业技术人员将理解，共轭物也可以使用多种技术进行组装，这取决于所选的将要缀合的试剂。例如，具有生物素的共轭物通过，例如，将TTR结合多肽与生物素的活化酯(例如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯)反应而被制备。类似地，带有荧光标记的缀合物可以在偶联剂的存在下制备，例如本文所列的那些，或通过与异硫氰酸酯的反应，优选与荧光素-异硫氰酸酯的反应而制备。本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的缀合物以类似的方式制备。
本发明进一步包括缀合至诊断试剂或治疗试剂的本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物。该抗体可用于诊断，例如，证明TTR淀粉样变性的存在，以指出患上与错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR相关的疾病或病症的风险，以监测这样的疾病(即显示错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR的发生的疾病，或者与错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR相关的疾病)的发展或进展，或者作为临床测试步骤的部分来例如确定给定的治疗和/或预防方案效力。在一个实施方式中，因此本发明涉及抗体，其被可检测被标记了。此外，在一个实施方式中，本发明涉及被连接到药物的抗体。可以通过将抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物偶联到可检测的物质来促进检测。可检测的物质或标记一般可以是酶；重金属，最好是金；染料，优选的荧光或发光染料；或放射性标记。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、用各种正电子发射断层扫描的正电子发射金属、和非放射性顺磁金属离子；见，例如，美国专利4,741,900，关于可以与根据本发明用作诊断法的抗体缀合的金属离子。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、若丹明、二氯荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺(氨基苯二酰一肼)；生物发光材料的例子包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；合适的放射性材料的例子包括125I,131I,111In或99Tc。因此，在一个实施方式中，本发明提供了可检测地标记的抗体，其中所述可检测的标记选自由酶、放射性同位素、荧光团和重金属组成的组。
抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体也可通过将其偶联到化学发光化合物而被可检测地标记。然后化学发光标记的抗体的存在通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在而被确定。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺(氨基苯二酰一肼)、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
其中抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体可以被可检测地标记的方式之一是将抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体连接到酶，并在酶免疫测定(EIA)中使用连接产物(Voller,A.,The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)(《酶联免疫吸附测定(ELISA)》)Microbiological Associates Quarterly Publication(《微生物学协会季刊》),Walkersville,马里兰州,Diagnostic Horizons 2(1978),1-7；Voller等人,J.Clin.Pathol.31(1978),507-520；Butler,Meth.Enzymol.73(1981),482-523；Maggio编,Enzyme Immunoassay(《酶免疫测定》)，CRC出版社,博卡拉顿，佛罗里达州，(1980)；Ishikawa等人编,Enzyme Immunoassay(《酶免疫测定》)，Kgaku Shoin,东京(1981))。结合到抗体上的酶将与合适的底物反应，优选生色底物，以这样的方式以产生可检测的化学部分，例如通过分光光度法、荧光或通过可见(光)手段。可用于可检测地标记抗体的酶包括，但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、△-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，该检测可以通过其中使用用于酶的显色底物的比色法来完成。检测也可以通过与相似制备的标准比较底物酶促反应程度的视觉比较来完成。
检测也可以使用各种其他免疫测定的任何方法来实现。例如，通过放射性标记抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物，有可能通过使用放射免疫测定(RIA)检测到抗体(参见，例如，Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays(《放射免疫测定原理》),Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques(放射性测定技术的第七次培训课程),The Endocrine Society(内分泌学会),(三月,1986)，其通过引用并入本文)。放射性同位素可以通过包括，但不限于γ计数器、闪烁计数器或放射自显影的方式而被检测到。
抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体也可以使用诸如152Eu或其他镧系元素的荧光发射金属来可检测地标记。这些金属可以连接到使用诸如二亚乙基三乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的这些金属螯合基团的抗体。
对抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物缀合各种部分的技术是众所周知的，参见，例如Arnon等人,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy(用于癌症治疗药物的免疫靶向的单克隆抗体)”，在Reisfeld等人编的Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(《单克隆抗体与癌症治疗》)243-56页(AlanR.Liss有限公司(1985)；Hellstrom等人,“Antibodies For Drug Delivery(用于药物递送的抗体)”，在Controlled Drug Delivery(《控释药物递送》)(第二版)，Robinson等人(编),Marcel Dekkery有限公司,(1987)623-53页；Thorpe,“Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy:A Review(癌症治疗中细胞毒性药物的抗体载体：综述)”在Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications(《单克隆抗体'84：生物与临床应用》)，Pinchera等人编,(1985)475-506页；Analysis,Results,And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy(《放射性标记抗体在癌症治疗中治疗性应用的分析、结果与前景》)，在MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy(《用于癌症检测与治疗的单克隆抗体》)，Baldwin等人编,Academic Press(学术出版社)(1985)303-16页,以及Thorpe等人,“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates(抗体-毒素偶联物的制备和细胞毒性)”,Immunol.Rev.62(1982),119-158页。
正如所提到的，在某些实施方式中，增强结合分子的稳定性或效力的部分，例如结合多肽，例如抗体或其免疫特异性片段可以被缀合。例如，在一个实施方式中，PEG可以被缀合到本发明的结合分子以提高其在体内的半衰期。Leong等人,Cytokine16(2001),106；Adv.in Drug Deliv.Rev.54(2002),531；或Weir等人,Biochem.Soc.Transactions 30(2002),512。
六、组合物与使用方法
本发明涉及包含上述的TTR结合分子的组合物，例如，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物或者如前文所定义的多核苷酸、载体、细胞或肽。在一个实施方式中，本发明的组合物是药用组合物并且进一步包含药学上可接受的载体。此外，本发明的药用组合物可能包含诸如白介素或干扰素的另外的试剂，其取决于药用组合物预期的用途。为了用于显示突变的、错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR(例如TTR淀粉样变性)的发生的疾病和病症或者与突变的、错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR(例如TTR淀粉样变性)相关的疾病和病症的治疗，额外的试剂可以选自由有机小分子、抗TTR抗体以及它们的组合组成的组。因此，在一个特别优选的实施方式中，本发明涉及TTR结合分子的应用，例如，本发明的抗体或其抗原结合片段，或者具有与其任一个基本相同的结合特异性的结合分子的应用，本发明的多核苷酸、载体或细胞的应用，其用于制备用于预防和治疗与TTR淀粉样变性相关的疾病或病症的药用或诊断组合物，监测与TTR淀粉样变性相关的疾病或病症的进展或者受试者中对于TTR淀粉样变性治疗的受试者的反应或确定受试者的与TTR淀粉样变性相关的疾病或病症发展的风险。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及治疗疾病或病症的方法，所述疾病或病症的特征为在受影响的系统和器官(诸如外周神经系统、自主神经系统、中枢神经系统、肠胃系统、血管系统特别是软脑膜、淋巴系统尤其是淋巴结、肌肉骨骼系统特别是肌腱和韧带、心脏、眼睛、肾脏、肺、皮肤、舌、甲状腺和膀胱)的TTR异常的积累和/或沉积和/或突变的、错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR，该方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的前述的本发明的TTR结合分子、抗体、多核苷酸、载体、细胞或肽中的任一种。
本发明的治疗方法的一个特别的优点在于这样的事实，本发明的重组抗体来源于健康人受试者的B细胞或记忆B细胞，所述健康人受试者无疾病的迹象或症状，例如携带无症状的突变和/或突变、显示聚集的TTR的发生或与聚集的TTR相关，因此是，具有一定的概率，能够预防与错误折叠的、错误装配的、突变的、和/或聚集的TTR相关的临床表现的疾病，或者降低临床表现的疾病或病症发生的风险，或者延缓临床表现的疾病或病症的发作或进展。典型地，本发明的抗体也已成功地通过体细胞成熟，即通过抗体的可变区的体细胞变异手段的关于结合靶TTR分子的高亲和力的选择性和有效性的优化。
关于这样的细胞在体内(例如在人体内)，尚未借助于相关的或其他生理蛋白质或细胞结构在自免疫或过敏性反应的意义上活化的认识是有很大医疗重要意义的，因为这意味着显著增加的成功通过临床试验阶段的机会。可以这么说，效力、可接受性和耐受性已经在预防或治疗抗体的临床前和临床开发之前已在至少一个人类受试者身上得到了证明。因此，可以预期的是，本发明的人抗TTR抗体，其作为治疗剂的靶结构特异性效力和其降低了的副作用几率都显著增加了其临床成功的可能性。
本发明也提供了分别是药用的和诊断的包括一个或多个填充有一种或多种上述成分的容器的包装或试剂盒，成分例如是本发明的抗TTR抗体、其结合片段、衍生物或变体、多核苷酸、载体、细胞和/或肽。与这样的容器相关的可以由监管药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构开具通知，该通知反映了监管生产、使用或销售的机构批准用于人类给药。另外或替代地，该试剂盒包含试剂和/或指导说明，其用于适当的诊断测定法。所述组合物，例如本发明的试剂盒当然是特别适合于风险评估、诊断、预防和治疗伴随突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR存在的疾病或病症，尤其适用于治疗广泛地具有TTR淀粉样变性的病症，包括例如家族性淀粉样多发性神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)、老年性系统性淀粉样变性(SSA)、全身性家族性淀粉样变性、软脑膜/中枢神经系统(CNS)的淀粉样变性(包括阿尔茨海默病)、TTR相关的眼部淀粉样变性、TTR相关的肾淀粉样变性、TTR相关的高甲状腺素血症、TTR相关的韧带淀粉样变性(包括腕管综合症、肩袖撕裂和腰椎管狭窄症)和先兆子痫的疾病或病症。
本发明的药用组合物可以根据本领域中已知的方法来配制；参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(《药学的科学与实践》)，the University ofSciences in Philadelphia(在费城的科学大学)，ISBN 0-683-306472。合适的药物载体的实例在本领域中是熟知的，包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂(如油/水乳剂)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等等。包括这样载体的组合物可以通过众所周知的传统的方法配制。这些药用组合物可以以合适的剂量施用到受试者。合适组合物的给药可以通过不同的方式实现，例如通过静脉、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、局部或皮内给药或脊髓或脑递送。气雾剂制剂如鼻喷雾制剂含有带有防腐剂和等渗剂的活性药剂的纯化水溶液或其他溶液。这种制剂优选调节至与鼻腔粘膜相容的pH和等渗状态。用于直肠或阴道给药的制剂可呈现为具有合适载体的栓剂。
剂量方案将由主治医生和临床因素来确定。如在医学领域所熟知的，任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者的尺寸(体重，size)、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、给药时间和途径、一般健康状况、和其他同时给予的药物。典型的剂量可以是，例如，在0.001到1000微克范围内(或在此范围内核酸表达或抑制表达)；然而，剂量低于或高于该示例性范围是可以想到的，特别是考虑到前述因素。一般地，剂量范围可以，例如，按宿主体重从约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg(例如，0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，1mg/kg，2mg/kg，等等)。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内，优选至少1mg/kg。剂量在上述范围中间也意为在本发明的范围之内。受试者可以每天，隔日，每周，或根据通过经验分析确定的任何其他时间表给予这样的剂量。示例性治疗要求在延长的时间段内施用多剂量，例如，至少六个月。另外的示例性治疗方案要求施用每两周一次或每月一次或每3至6个月一次。示例性的剂量方案包括连续几天1-10mg/kg或15mg/kg，隔日30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体被同时施用，这种情况下施用的每种抗体的剂量落入所示范围内。进程可以通过定期评估来监测。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水性或非水溶液、悬浮液、和乳液。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，以及如油酸乙酯的可注射的有机酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬浮液、包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发性油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的电解质补充剂)等等。防腐剂和其他添加剂也可以以诸如、例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体等存在。此外，本发明的药用组合物可包含诸如多巴胺或精神药理药物的其他药剂，这取决于药用组合物打算的用途。
此外，在本发明的一个优选实施方式中，药用组合物可被配制成疫苗，例如，如果本发明的药用组合物包含用于被动免疫的TTR抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体。正如在背景部分中提到的，错误折叠的、错误装配的、突变的和/或聚集的TTR类型或其片段或衍生物是TTR淀粉样变性的主要触发物。因此，为谨慎起见，以期待利用本发明的人抗TTR抗体和等效TTR结合分子的被动免疫，将有助于避免主动免疫疗法概念的若干不良反应，并导致TTR聚集的减小。因此，本发明的抗TTR抗体及其本发明的等效物将特别有用地作为疫苗，用于预防或改善显示聚集TTR的存在或由聚集TTR造成的疾病或病症，例如家族性淀粉样多发性神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)、老年性系统性淀粉样变性(SSA)、全身性家族性淀粉样变性、软脑膜/中枢神经系统(CNS)的淀粉样变性(包括阿尔茨海默病)、TTR相关的眼部淀粉样变性、TTR相关的肾淀粉样变性、TTR相关的高甲状腺素血症、TTR相关的韧带淀粉样变性(包括腕管综合症、肩袖撕裂和腰椎管狭窄症)和先兆子痫。
在一个实施方式中，使用本发明抗体的重组的Fab(rFAB)和单链片段(scFv)可能有益的，其可能会更容易穿透细胞膜。例如，Robert等人,Protein Eng.Des.Sel.(2008)；S1741-0134,在线提前发表，描述了使用单克隆抗体WO-2的嵌合重组的Fab(rFAB)和单链片段(scFv)，其识别的Aβ的N-端区中的表位。该改造的片段能够(1)预防淀粉样蛋白纤维化，(2)分解预形成的Aβ1-42纤维和(3)在体外抑制Aβ1-42寡聚体介导的神经毒性，像整个IgG分子一样有效。使用小的Fab和scFv改造的缺乏效应子功能的抗体结构的感知优点包括更有效地通过血脑屏障和最小化触发炎性副反应的风险。此外，除了的scFv和单结构域抗体保留对全长度抗体的结合特异性，它们可以被表达为单个基因并在哺乳动物细胞内表达为胞内抗体，其具有改变其靶的折叠、相互作用、修饰、或亚细胞定位的可能性；参见综述，例如，Miller and Messer,Molecular Therapy 12(2005),394–401。
在一个不同的方法中，Muller等人,Expert Opin.Biol.Ther.(2005),237-241，描述了一个技术平台，所谓“超级抗体技术”，据说这是使抗体被穿梭进入活细胞而不伤害它们。这样的穿透细胞的抗体开放了诊断和治疗的新窗口。术语“TransMabs'已经创造了这些抗体。
在进一步的实施方式中，用于治疗与突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR发生相关的疾病或病症的其他抗体的共同给药或顺序给药可是期望的。在一个实施方式中，附加的抗体包含在本发明的药用组合物中。可用于治疗受试者的抗体的实例包括，但不限于，抗体靶向CD33、SGLT2、IL-6，和IL-1。
在进一步的实施方式中，用于治疗与突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR相关的疾病或病症的其他药剂的共同给药或顺序给药可是期望的。在一个实施方式中，附加的药剂包含在本发明的药用组合物中。可用于治疗受试者的药剂的实例包括，但不限于：稳定TTR四聚体试剂、如氯苯唑酸(Tafamidis)甲基葡胺、二氟苯水杨酸(diflusinal)、多西环素与熊去氧胆酸；抗炎剂如二氟苯水杨酸(diflusinal)、皮质类固醇、2-(2,6-二氯苯胺基)苯乙酸(双氯芬酸)、异丁基丙酸-酚酸(布洛芬)；利尿剂、表儿茶素酸酯、盐酸马法兰、地塞米松、硼替佐米、硼替佐米-美法仑、硼替佐米-地塞米松、美法仑-地塞米松、硼替佐米-地塞米松-美法仑；抗抑郁药、抗精神病药物、精神抑制药、抗痴呆药(antidementiva)(如NMDA-受体拮抗剂美金刚)、乙酰胆碱酯酶抑制剂(如多奈哌齐、HCI、利斯的明、加兰他敏)、谷氨酸拮抗剂和其他促智药降压药(如双肼屈嗪(Dihydralazin)、甲基多巴)、细胞抑制剂、糖皮质激素、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂；抗炎剂或它们的任意组合。可用于临床器官移植后治疗或预防器官排斥的药剂的实例包括但不限于导致免疫系统减弱即免疫抑制的药剂组，包括例如钙调磷酸酶抑制剂，例如环孢素(cyclosporine)和他克莫司，扩增抑制剂例如mTOR抑制剂，包括依维莫司和西罗莫司(雷帕霉素)，和抗代谢物，例如硫唑嘌呤、霉酚酸酯(Mycophenolat Mofetil)/MMF和霉酚酸，以及皮质类固醇如可的松、皮质醇以及合成的物质例如泼尼松或泼尼松龙都可以使用。另外抗体可以被使用，诸如抗-IL2受体单克隆抗体(例如巴利昔单抗，达利珠单抗)以及抗-CD3单克隆抗体(例如莫罗单抗CD3)，和诸如抗胸腺细胞球蛋白(ATG)的多克隆组合物；和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂(参见，例如，Noguchi等人,Acta Med.Okayama,60(2006)，以及国际申请WO2012/088157)。此外，另外的药剂可能包括用于器官移植后预防和或治疗感染和其他副作用的药剂，包括缬更昔洛韦、巨细胞(cytomegalie)免疫球蛋白、更昔洛韦、两性霉素B、乙胺嘧啶、雷尼替丁、雷米普利、速尿、苯溴马隆。因此，在一个实施方式中，进一步包括用于治疗TTR淀粉样变性和/或治疗或预防例如肝移植后的器官排斥额外的药剂的组合物被提供。可以伴随本发明的药用组合物使用的其他药剂的实例在本领域中描述了；参见，例如国际申请WO2009005672，WO2010128092，WO2012088157或欧洲申请EP11158212.8。
治疗有效剂量或治疗有效量是指足以改善症状或病症的活性成分的量。此类化合物的疗效和毒性可以通过标准药学方法在细胞培养或实验动物中测定，例如，ED50(对群体的50％治疗有效的剂量)和LD50(对群体的50％致死的剂量)。治疗和毒性效果之间的剂量比是治疗指数，并且它可以表示为比率LD50/ED50。
从上述内容，很明显的是，本发明包括包含上述抗体至少一个CDR的TTR结合分子和/或其片段的任何使用，特别是用于诊断和/或治疗与如上面提到的突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型或其片段相关的疾病或病症，例如TTR淀粉样变性。优选地，所述结合分子是本发明的抗体或其免疫球蛋白链。此外，本发明涉及上文所述抗体的任何一种的抗独特型抗体。这些是抗体或其他结合分子，其结合到位于抗原结合位点附近的抗体可变区的独特抗原性肽序列，并且它们是有用的，例如，用于从受试者获得的样品中抗TTR抗体的检测。在一个实施方式中，因此本发明提供了如上文和下文所定义的抗体或者具有与其任何一个基本相同的结合特异性的TTR结合分子、本文所定义的多核苷酸、载体或细胞，或者包含其任一的用于与TTR相关的疾病或病症的预防性治疗、治疗性治疗和/或监测其进展或对治疗的响应的药用或诊断组合物，优选地，其中所述疾病选自包括如下的组：例如家族性淀粉样多发性神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)、老年性系统性淀粉样变性(SSA)、全身性家族性淀粉样变性、软脑膜/中枢神经系统(CNS)的淀粉样变性(包括阿尔茨海默病)、TTR相关的眼部淀粉样变性、TTR相关的肾淀粉样变性、TTR相关的高甲状腺素血症、TTR相关的韧带淀粉样变性(包括腕管综合症、肩袖撕裂和腰椎管狭窄症)和先兆子痫。以上的疾病或病症组将被称为与TTR淀粉样变性相关的病症组。
在另一个实施方式中，本发明涉及包含本发明的上述的TTR结合分子、抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体、细胞和/或肽中任一种的诊断组合物以及诸如方便地用于基于免疫的或基于核酸的诊断方法的试剂的任选地对检测合适的措施。本发明的抗体是，例如，适合用于免疫测定，其中它们可在液相被使用或结合于固相载体。使用本发明抗体的免疫测定的实例是以直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫测定。此类免疫测定的实例是放射免疫测定(RIA)，夹心(免疫测定)，流式细胞术，以及Western印迹测定法。本发明的抗原和抗体可与许多不同的载体结合并用来分离与其特异性结合的细胞。众所周知的载体的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。为了本发明的目的，载体的性质既可以是可溶的，也可以是不溶的。有许多被本领域普通技术人员所熟知的不同的标记和标记方法。可在本发明中使用的标签类型的实例包括酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物；也参见上文讨论的实施方式。
在进一步的实施方式中，TTR结合分子，特别是本发明的抗体也可使用于如下方法中，所述方法用于通过从测试个体获得体液样品(可以是血液样品，血浆样品，血清样品，淋巴样品或任何其他体液样品，如唾液或尿液样品)并在能形成抗体-抗原复合物的条件下使体液样品与本发明的抗体接触，用于诊断个体的疾病或病症。然后这种复合物的水平通过本领域中已知的方法测定，与对照样品中形成的相比，显著更高的水平指出测试个体的疾病或病症。以相同的方式，也可以使用被本发明抗体特异性结合的抗原。因此，本发明涉及包含结合分子(例如本发明抗体或其抗原结合片段)的体外免疫测定法。
在本发明的进一步的实施方式中，TTR结合分子，特别是本发明的抗体也可使用在通过从测试个体获得活体检查样品(可以是皮肤、唾液腺、发根、心脏、结肠、神经、皮下脂肪活检样品、或来自任何受影响的器官的活检样品)来诊断个体的疾病或病症的方法中。
在此背景下，本发明还涉及专门为此目的而设计的手段。例如，基于抗体的阵列可以被使用，其例如负载有抗体或本发明的特异性识别TTR的等效的抗原结合分子。微阵列免疫测试的设计总结于Kusnezow等人，Mol.Cell Proteomics 5(2006),1681-1696。因此，本发明还涉及负载有按照本发明鉴定的TTR结合分子的微阵列。
在一个实施方式中，本发明涉及在受试者体内与突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型和/或其片段相关的疾病或病症的诊断方法，该方法包括使用至少一个本发明的抗体、其TTR结合片段或者具有与其任何一个基本相同的结合特异性的TTR结合分子来确定来自将被诊断的受试者的样品中TTR和/或错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR的存在，其中病理性突变的、错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR对于TTR淀粉样变性是有指征性的，并且与生理性TTR的水平相比，病理性突变的、错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR水平的提高对于所述受试者中TTR淀粉样变性的进展是有指征性的。
待诊断的受试者对于所述疾病可以是无症状的或处于潜伏期的。优选地，对照受试者具有与错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR相关的疾病，例如家族性淀粉样多发性神经病(FAP)，家族性淀粉样心肌病(FAC)或老年性系统性淀粉样变性(SSA)，其中病理性突变的、错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR的水平与参考标准之间的相似性表明待诊断的受试者具有TTR淀粉样变性或处于发展为TTR淀粉样变的风险中。可替代地，或者另外作为第二个对照，对照受试者不具有TTR淀粉样变性，其中生理性TTR和/或错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR的水平与参考标准之间的差异表明待诊断的受试者具有TTR淀粉样变性或处于发展为TTR淀粉样变的风险中。优选地，待诊断的受试者和对照受试者是年龄匹配的。待分析样品可以是任何怀疑含有病理性错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR的体液，例如血液，血浆，血清，尿液，腹膜液，唾液或脑脊髓液(CSF)。
生理性TTR和/或病理性错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR的水平可以通过本领域中已知的任何合适的方法来评估，包括，例如通过从如下中选择一种或多种技术分析TTR：Western印迹法，免疫沉淀，酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)，荧光激活细胞分选(FACS)，二维凝胶电泳，质谱(MS)，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，表面增强激光解吸电离飞行时间(SELDI-TOF)，高效液相色谱(HPLC)，快速蛋白液相色谱(FPLC)，串联质谱(MS/MS)之后的多维液相色谱(LC)，和激光光密度测定法。优选地，所述的TTR体内成像包括显像，正电子发射断层扫描(PET)，单光子发射断层摄影(SPECT)，近红外(NIR)光成像或磁共振成像(MRI)。
在另一方面，本发明涉及TTR淀粉样变性的诊断，对该疾病的监测治疗和确定抗TTR药物在不用组织和不用活检组织样品(即非侵入性)的方法中的诊断或治疗用途。
通常情况下，可以在体液(例如血浆)中检测到的TTR聚集体和/或错误折叠的TTR的浓度非常低，因此TTR淀粉样变性的诊断是困难和耗时的。特别是，TTR淀粉样变性疾病的诊断是困难而漫长的过程，由于各种疾病呈现出非常相似的症状和体征，使得家族淀粉样多发性神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)和老年性系统性淀粉样变性(SSA)的正式诊断通常需要收集组织活检样品和通过复杂的组织学染色技术手段的对TTR淀粉样蛋白沉积物的鉴定。因为组织活检样品是非常小的并且TTR淀粉样蛋白沉积物是分散的，TTR淀粉样变性的组织学测定通常与高频率的假阴性结果和对患者的耽误相关联。
然而，根据本发明，可以令人惊奇地表明，在对受试者单次施用抗TTR抗体后，对血液中聚集的和/或错误折叠的结合到抗TTR抗体的TTR的测定是可能的；见实施例13和图14。因此，由于本发明的抗TTR抗体从淀粉样TTR沉积物移除TTR并将其运送进血液的独特性质，全新的诊断与患者或受试者体内错误折叠的、突变的、和/或聚集的TTR相关的病症的方法被开发出来，该方法有取代TTR淀粉样蛋白病诊断过程中的组织活检和组织学分析的潜力。该方法依赖于对TTR蛋白病理性构象有特异性的抗体的使用，该抗体被注射进到患者体内，并用作在患者体内任何部位的错误折叠的和/或聚集的TTR蛋白的存在的探针。在抗体注射进患者体内后，在短暂的延迟之后，例如2天后，血液样品被获得并用于检测是否所述抗体已捕获和从TTR沉积物中分离错误折叠的和/或聚集的TTR颗粒。与组织学方法相比，本方法主要优点与所述抗TTR抗体向患者体内直接注射相关，其中血液循环允许其通过每个组织和器官循环，并独立于它们定位地检测错误折叠的和/或聚集的TTR蛋白沉积物。
因此，在进一步的方面，本发明涉及诊断与TTR淀粉样变性相关疾病的方法，其包括测定来源于给受试者施用抗TTR抗体后的该受试者的样品中错误折叠的和/或聚集的TTR的水平，其中与诸如在施用抗TTR抗体前从受试者获得的样品的对照相比，在受试者的样品中错误折叠的和/或聚集的TTR存在或其提高的水平表明与TTR淀粉样变性相关的疾病。此外，因为如实施例13中所示的，所述全新的方法分别对于表征抗TTR药物和TTR淀粉样变性的治疗过程也是有用的，本发明的新方法也适用于监测使用抗TTR抗体对疾病的治疗或确定TTR抗体的诊断或治疗用途。在这种情况下，本领域的技术人员将认识到，本发明的方法不限于研究抗TTR抗体的治疗应用和功效，但也适用于能够降解TTR淀粉样蛋白沉积的其他种类的抗TTR药物。例如，本发明的抗TTR抗体可结合其他抗TTR药物施用，并且已经被治疗的受试者的样品中的错误折叠的/或聚集的TTR的水平与在施用抗TTR抗体和抗TTR药物两者之前，但仅在抗TTR抗体治疗之后，从受试者获得的对照相比较。
在本发明的一个优选实施方式中，特别是当使用非人类动物用于测试如实施例13中所说明的重组人源性抗体，和打算用于人类的其他抗TTR抗体，一般来讲，样品中的错误折叠的和/或聚集的TTR水平通过确定抗TTR抗体和错误折叠和/或聚集的TTR之间形成的复合物而被测定，例如通过使用抗-人IgG或抗独特型抗体的免疫沉淀。可替换地，在本质上与候选药物抗TTR抗体的表位不同的表位识别TTR的第二抗TTR抗体可以被使用，以便结合候选药物抗TTR抗体与TTR的复合物，并因此被检测到它的存在，例如通过ELISA或免疫沉淀的方式。
关于诊断方面，特别是对于人类受试者和患者，错误折叠的和/或聚集的TTR的存在和水平升高以及其与抗TTR抗体的复合物分别表明在人体中的TTR淀粉样蛋白沉积的存在，例如在患者或受试者的心脏、外周神经系统(PNS)、眼睛、肌肉、胃肠道、肾脏、血管系统和中枢神经系统(CNS)。因此，本发明的方法一方面允许了与受试者体内TTR淀粉样变性相关的疾病的鉴别和确定，另一方面允许了从患者体内移除TTR沉积物，因此也显示给定治疗的治疗进程以及诸如抗TTR抗体的TTR淀粉样变性特异性的药物的疗效。
因此，如实施例13中所证明的，本发明的抗TTR抗体能够以足够的亲和力结合错误折叠和/或聚集的TTR，以改变病理性TTR沉积物的稳定性，诸如捕获错误折叠和/或聚集的TTR和将错误折叠和/或聚集的TTR从沉积物中移除到体液，特别是血液。
按照本发明的方法使用的抗TTR抗体可以是任何对TTR的病理构象(即错误折叠的、突变的、和/或聚集的TTR)有特异性的抗TTR抗体。然而，在一个优选的实施方式中，用于无需组织方法的抗TTR抗体是本文描述的并在实施例中说明的本发明的抗TTR抗体或TTR结合分子。
就此而论，抗TTR抗体可以被修饰并例如被连接至如任何上述的其他实施方式中所描述的可检测的标记物。此外，基于本发明的抗TTR抗体和肽的诸如Western印迹、斑点印迹、(夹心)ELISA等本领域中已知的并为其他的诊断方法和使用所描述的免疫测定，可以适合于全新的本发明的TTR淀粉样蛋白测定。
如使用TTR淀粉样蛋白测定的实施例13和图14所示，可以证明本发明的抗TTR抗体能够从TTR淀粉样蛋白沉积物中捕捉和分离错误折叠的和/或聚集的TTR，并且相应的免疫复合物可以在体液样品中进行测定，特别是患者或受试者的血液；见实施例13和图14。因此，在本发明的一个实施方式中，抗TTR抗体可以以足够的亲和力结合错误折叠的和/或聚集的TTR，以改变错误折叠的和/或聚集的TTR从例如心脏、周围神经系统(PNS)、眼睛、肌肉、胃肠道、肾脏、血管系统和中枢神经系统(CNS)净流出。
体液样品，优选从受试者获得的血液或脑脊液(CSF)(其中存在着被捕捉和分离的结合至抗TTR抗体的错误折叠和/或聚集的TTR)，在给药后特定的时间间隔获得。给药后的该特定的时间间隔通常是不到一个星期。在一个优选的实施方式中，在施用抗TTR抗体后的该时间间隔小于或等于48小时。
如前面所提到的，上文所述的无需组织的方法，也可以用于确定治疗的成功，即在治疗前后分别测定被抗TTR抗体捕获的错误折叠的和/或聚集的TTR类型捕获物。因此，在一个进一步或另外的实施方式中，本发明的无需组织的方法进一步包括体液样品中错误折叠和/或聚集的TTR的水平与施用抗TTR抗体之前从受试者获得的样品中错误折叠和/或聚集的TTR的水平的比较。因此，在一个实施方式中，本发明的方法被用于确定治疗TTR淀粉样变性的效果或者用于监测与患者和受试者体内病理性TTR相关的疾病或病症的进展。
如所提到的，上述的方法中所使用的受试者的样品可以在施用抗TTR抗体之前或之后获得。但是，样品也可从医疗设备或执业医师，以及从其可以获得受试者临床样品的其他的研究机构获得。所述设备或医生等不仅可以进行对受试者抗TTR抗体的给药和用于上面的方法的适合样品的收集，而且可以进行对患者的监测和/或治疗，即通过改变该抗体施用的量、时间、频率、中断治疗来用至少另一种抗TTR抗体或治疗药剂来取代或结合抗TTR抗体。TTR的水平可以通过本领域中已知的任何合适的方法来评估。合适的方法在下面和在国际申请WO2013/066818描述，其公开内容在此通过引用并入本文。
在本发明的一个方面，本发明的抗体具有与其任一个基本相同的结合特异性的TTR结合分子、上文所定义的多核苷酸、载体或细胞或包含其任一的药用或诊断组合物被提供用于预防性治疗、治疗性治疗、和/或监测与TTR相关的疾病或病症的进展或治疗反应。因此，总体而言，本发明涉及与受试者体内TTR(例如TTR淀粉样变性)相关的疾病或病症的进展的诊断或监测方法，该方法包括使用至少一个本发明的抗体或具有与其任何一个基本相同的结合特异性的TTR结合分子来确定来自要被诊断的受试者的样品中TTR的存在，其中突变的、错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR类型或其片段的存在对于疾病或病症是有指征性的。在一个实施例中，所述的诊断或监测受试者TTR淀粉样变性的进展的方法被提供，该方法包括使用至少一个本发明的抗体或具有与其任何一个基本相同的结合特异性的TTR结合分子来确定来自要被诊断的受试者的样品中突变的、错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR和/或其片段的存在，其中突变的、错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR和/或其片段的存在对于症状前的、前驱症状的或临床的TTR淀粉样变性是有指征性的，与生理性TTR水平相比，或与来自健康对照受试者的参考样品相比，或与来自同一受试者的对照样品相比，TTR寡聚体、聚集体或原纤维水平的提高对于症状前的、前驱症状的或已建立的TTR淀粉样变性的进展是有指征性的。本领域任何技术人员将理解，在一个实施方式中所述方法被用作以诊断或监测来自上文所定义的与TTR相关的病症的组的任何其他疾病或病症的进展。
如上所述，本发明的抗体、其片段以及与抗体和其片段具有相同结合特异性的分子不仅可以在体外，还可以在体内使用，而且诊断，治疗的应用也可以进行。因此，在一个实施方式中，本发明还涉及包含本发明抗体至少一个CDR的TTR结合分子，所述TTR结合分子用于制备用于在体内检测/成像的组合物或将治疗和/或诊断剂靶向于人体或动物体内TTR的组合物。潜在的治疗和/或诊断剂可以选自上文所显示的用于治疗TTR淀粉样变性的治疗剂和潜在的标记物的非穷尽枚举。在体内成像的方面，在一个优选的实施方式中，本发明提供了包含本发明抗体至少一个CDR的所述TTR结合分子，其中所述体内成像包括正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射断层摄影(SPECT)、近红外(NIR)光成像或磁共振成像(MRI)。在进一步的实施方式中，本发明还提供了包含本发明抗体的至少一个CDR的所述TTR结合分子或者用于制备用于上述特异性的体内成像方法的组合物的所述分子，以用于如上文所定义的诊断或监测受试者的TTR相关的疾病或病症的进展的方法。
七、具有聚集特异性TTR表位的肽
在进一步的方面，本发明涉及具有被本发明的任何抗体特异性识别的TTR表位的肽。优选地，这样的肽包含或由如在SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,或在SEQ ID NO:51中所显示的氨基酸序列组成，作为被抗体或其修饰的序列识别的独特的线性表位，其中一个或多个氨基酸被取代、缺失和/或添加，其中所述肽是由本发明的任何抗体所识别，优选由抗体NI-301.59F1，NI-301.35G11，NI-301.37F1，或NI-301.12D3识别。
在本发明的一个实施方式中，这样的肽可用于诊断或监测受试者中与突变的、错误折叠的、错误装配的或聚集的TTR类型和/或其片段相关的疾病或病症，例如TTR淀粉样变性，包括在所述受试者的生物样品中确定结合到肽的抗体的存在的步骤，并通过测定识别上述本发明肽的抗体水平以及与具有可比性年龄和性别的健康受试者得到的水平的测定进行比较而用于对所述受试者进行这种疾病的诊断。因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种用于诊断指示受试者症状前或临床FAP和/或FAC的TTR淀粉样变性的方法，包括在所述受试者的生物样品中确定结合到如上所述的肽的抗体的存在的步骤。根据该方法，升高的测定的对本发明所述的肽有特异性的抗体的水平对于诊断所述受试者症状前或临床FAP和/或FAC或诊断所述受试者任何其他的如上定义的与TTR相关的疾病的组的疾病或病症是有指征性的。另外，由于本发明的肽包含来自人的治疗有效性抗体的表位，这样的肽当然可以用作抗原，即用于引发受试者免疫应答的免疫原和刺激本发明的抗体的体内产生。本发明的肽可以被分别配制为阵列、试剂盒和组合物，例如疫苗，如前文所述。就这一点，本发明还涉及在诊断或监测TTR淀粉样变性进展中有用途的试剂盒，所述试剂盒包含本发明至少一种抗体或具有任何一项基本上相同的结合特异性的TTR结合分子、多核苷酸、载体或细胞和/或肽，分别如上定义，连同任选的试剂和/或说明一起使用。
这些和其他实施方式被公开并包含于本发明的说明书和实施例。关于根据本发明使用的材料，方法，用途，以及化合物中的任一种的文献可从公共图书馆和数据库中检索到，使用例如电子设备。例如，可以利用公共数据库“Medline”，其是由美国国家生物技术信息中心(NCBI)和/或美国国立卫生研究院国家医学图书馆(NLM.NIH)主办。进一步的数据库和网址，例如欧洲生物信息研究所(EBI)的，其作为欧洲分子生物学实验室(EMBL)的一部分是对本领域技术人员已知的，也可以使用互联网搜索引擎获得。对回溯检索和当前认识有用的生物技术专利信息的概述和对专利信息相关资源的调查在Berks,TIBTECH 12(1994),352-364中给出。
上述公开内容主要描述了本发明。除非另有说明，如本文所使用的术语如在theOxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology(《生物化学和分子生物学牛津词典》)，Oxford University Press(牛津大学出版社)，1997年提供，2000年修订和2003年再版，ISBN 0 19 850673 2给出的定义。几个文件在本说明书全文被引用。完整的书目文献引用可在权利要求书之前的说明书末尾找到。所有引用的参考文献(包括文献参考、授权的专利，公开的专利申请，如贯穿本申请所引用的，包括背景技术部分和生产者说明书、指南等)的内容通过引用并入本文；但是没有承认引用的任何文献对于本发明确实是现有技术。通过参考下面的特定实施例可以获得更完整的理解，本文提供的实施例仅用于说明的目的，而不是意在限定本发明的范围。
具体实施方式
实施例1：抗TTR抗体的分离与鉴定
以TTR和/或突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR类型和/或其片段为靶点的人源抗体使用在在国际申请WO 2008/081008中记载的方法被确定，其带有修改的公开内容在此通过引入并入本文。特别是，从人血浆通过纯化获得的人类野生型TTR蛋白以及通过重组表达获得的野生型和突变的TTR蛋白以天然的和错误折叠聚集的构象用于以TTR靶的抗体的鉴定。该错误折叠聚集的构象是利用，使用类似于Colon W.等人,Biochemistry,31(1992),8654-8660所描述的方法(稍作修改)，在体外酸性条件下产生的。
实施例2：抗体序列的测定
上述鉴定的抗TTR抗体可变区的氨基酸序列是在其mRNA序列的基础上确定的，参见图1。简言之，选定的非永生记忆B细胞培养物的活B细胞被收获。随后，来源于产生选择性抗TTR抗体细胞的mRNA被提取并转化为cDNA，并且编码抗体可变区的序列通过PCR扩增，克隆进质粒载体并测序。简言之，代表人类免疫球蛋白种系库(清单)的所有序列家族的引物组合用于前导肽、V-区段和J-区段的扩增。第一轮扩增使用前导肽特异性引物在5'-末端进行，使用恒定区域特异性引物在3'-末端进行(Smith等人,Nat Protoc.4(2009),372-384)。对于重链和κ轻链，第二轮扩增使用V-区段特异性引物在在5'-末端进行，使用J-区段特异性引物在3'-末端进行。对于λ轻链，第二轮扩增使用V-区段特异性引物在在5'-末端进行，使用C-区特异性引物在3'-末端进行(Marks等人,Mol.Biol.222(1991),581-597；de Haard等人,J.Biol.Chem.26(1999),18218-18230)。
具有所需特异性的抗体克隆的鉴定是通过在ELISA上对于完整抗体的重组表达的重新筛选进行的。完整的人类IgG1抗体的重组表达是通过将“在正确的阅读框内”的可变的重链和轻链序列插入表达载体实现的，所述表达载体与具有在5'-末端编码前导肽的序列和在3'-末端编码适当的恒定区序列的可变区序列互补。为了该目的，含有限制性位点的引物被设计以便于将可变重和轻链序列克隆进抗体表达载体。重链免疫球蛋白是通过将框内的免疫球蛋白重链RT-PCR产物插入带有信号肽和人或鼠免疫球蛋白γ1恒定结构域的重链表达载而被表达的。κ轻链免疫球蛋白是通过将框内的κ轻链RT-PCR产物插入提供信号肽和人类κ轻链免疫球蛋白恒定结构域的轻链表达载体而被表达的。λ轻链免疫球蛋白是通过将框内的λ轻链RT-PCR产物插入提供信号肽和人或鼠λ轻链免疫球蛋白恒定结构域的λ轻链表达载体而被表达的。
当共转染进Ig重链表达载体和κ或λIg轻链表达载体的HEK 293或CHO细胞(或者人或小鼠源的任何其他适合的受体细胞系)时，功能性重组单克隆抗体被获得。重组人单克隆抗体随后从条件培养基中使用标准蛋白A柱纯化而被纯化。重组人单克隆抗体可使用暂时性或稳定性转染的细胞无限量地产生。产生重组人单克隆抗体的细胞系可以通过直接使用Ig表达载体或通过将Ig可变区重新克隆进不同的表达载体而建立。衍生物诸如F(ab)、F(ab)2和scFv也可以从这些Ig可变区产生。
通过与诸如Abysis(http://www.bioinf.org.uk/abysis/)的数据库中可获得的参考抗体序列的比较，确定了框架和互补决定区，并使用Kabat编号方案注解(http://www.bioinf.org.uk/abs/)。受试者抗体NI-301.59F1、NI-301.35G11、NI-301.37F1、NI-301.2F5、NI-301.28B3、NI-301.119C12、NI-301.5D8、NI-301.9D5、NI-301.104F5、NI-301.21F10、NI-301.9G12、NI-301.12D3、NI-301.37F1-PIMC、NI-301.44E4、NI-301.18C4、NI-301.11A10、NI-301.3C9、NI-301.14D8、NI-301.9X4、和NI-301.14C3可变区的氨基酸序列，包括框架(FR)和互补决定区(CDR)的指征，显示在图1A-1T中。
在下文中，受试者抗体对错误折叠聚集的TTR构象的高亲和力与天然野生型TTR构象结合的缺乏(从而证明对于突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR的高选择性)为抗体NI-301.59.F1、NI-301.35G11和NI-301.37F1被示例性说明。然而，对于其他受试者抗体初步实验表明与生理性TTR类型基本上相同优先地结合突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR，像抗体NI-301.59.F1、NI-301.35G11和NI-301.37F1。
实施例3：利用直接ELISA和EC50测定抗TTR抗体的结合亲和力
抗体结合TTR和/或错误折叠，错误装配和/或聚集的TTR形式的能力在不同的抗体浓度通过直接ELISA测定进行评价。这允许在此测定中，确定每个抗体的最大半数有效浓度(EC50)，其是普遍使用的对抗体结合亲和力的代表，参见图2。简言之，ELISA板(高结合，透明聚苯乙烯，半区，平底)用错误折叠的聚集人野生型TTR、错误折叠聚集的重组V30M-TTR(都如实施例1中描述的制备)和在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中10μg/mL浓度的牛血清白蛋白(BSA)在37℃包覆1小时，随后用2％BSA和0.1％吐温20的PBS溶液(PBS-T)于室温封闭1小时。针对TTR的抗体在PBS中稀释至从4至400nM的11个不同浓度，并在4℃下在ELISA板孵育过夜。用PBS-T洗涤3次后，将ELISA板与HRP偶联的人IgG特异性次级抗体在室温一起孵育1小时(1/4000稀释)。用PBS-T洗涤3次后，将ELISA反应在室温用TMB显影精确的10分钟，并通过在450nm(OD450 nm)测量光密度来定量。
示例性抗体NI-301.59F1，NI-301.35G11，和NI-301.37F1表现出对错误折叠聚集的野生型和突变TTR的强结合，但对对照BSA不表现出此强结合，参见图2A-2C。随后，抗体的EC50通过使用以最小二乘法用非线性回归拟合数据来确定以估计在这些条件下，抗体的结合亲和力。
示例性抗体NI-301.59F1，NI.35G11，和NI-301.37F1分别表现出对错误折叠聚集的人野生型TTR对应于3.0nM，3.9nM和0.35nM的EC50的高亲和性。示例性抗体也分别表现出对错误折叠聚集的重组突变V30M-TTR对应于15.5nM,5.0nM,和0.15nM的EC50的高亲和性。
实施例4：利用斑点印迹法的抗TTR抗体的结合选择性
为评价TTR抗体和/或其片段对天然的或错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR构象的结合选择性，天然的或错误折叠聚集构象的人野生型TTR蛋白和错误折叠聚集构象的重组V30M-TTR蛋白在PBS中稀释成4个不同的浓度，并通过真空过滤在硝酸纤维素膜沉积。将膜短暂干燥(10分钟)，并用3％牛奶的PBS-T溶液在室温封闭1小时，随后在4℃与抗TTR抗体孵育过夜。用PBS-T在室温下用5分钟洗涤3次后，将膜与适当的次级抗体(HRP偶联的；1/10000稀释)在室温下孵育1小时。用PBS-T洗涤3次后，将膜用鲁米诺显影，并通过测定发光来定量信号强度。
示例性的商购抗TTR抗体以相似的亲和力结合到天然的以及错误折叠聚集的TTR构象，从而证明其对天然的或错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR构象的结合选择性的缺乏，参见图3A。相反，示例性抗体NI-301.59.F1，NI-301.35G11，和NI-301.37F1以高亲和力仅结合错误折叠聚集的TTR构象，并没有表现出对天然TTR构象的结合，从而证明了对错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR的高选择性(图3B2，C2，D2)。相应地，抗体NI-301.35G11和NI-301.37F1也表现出对错误折叠聚集的重组V30M-TTR蛋白的强结合，如图3C3和D3所示。
为了进一步表征抗体结合的选择性，对各种TTR制剂，包括野生型和突变的、天然和错误折叠的聚集的构象，和12种人血浆样品的集合进行类似的处理以用于斑点印迹分析，使用鼠嵌合抗TTR抗体和HRP偶联抗小鼠IgG2a次级抗体进行检测(图6)。
商购抗体表现出对所有TTR制剂的强结合，包括野生型和突变型，天然和错误折叠的聚集的TTR制剂，并能够检测到所有的人类血浆样本中的TTR。这进一步证明对天然的或聚集构象的选择性的缺乏，见图6A。相反，示例性鼠嵌合抗体NI-301.mur35G11表现出对错误折叠的聚集的野生型TTR样品(图6的C1)的强结合，以及对突变V30M-TTR蛋白(图6C 4)和突变Y78F-TTR蛋白(图6C6)的强结合。然而，NI-301.mur35G11抗体不结合人类血浆样品中的TTR。这进一步证明NI-301.mur35G11对突突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR蛋白的高选择性。
实施例5：使用Western印迹法的抗TTR抗体的结合特异性和选择性
抗TTR抗体的结合特异性和选择性是通过Western印迹法的手段评价的，见图4。简言之，天然或错误折叠聚集的构象的人野生型TTR蛋白(300ng)，和野生型小鼠肝脏提取物(10μg总蛋白)在SDS-PAGE凝胶上被上样，并使用半干转移系统转移到硝酸纤维素膜。该膜随后用含2％BSA的PBS-T在室温封闭1小时，并在4℃用在封闭缓冲液中稀释的抗TTR抗体孵育过夜。经过4次用PBS-T在室温下5分钟的洗涤，将膜与适当的次级抗体(HRP偶联的；在封闭缓冲液中1/10000稀释)在室温孵育1小时。在用PBS-T洗涤3次和最后一次在PBS中后，膜用鲁米诺显影，信号强度通过测定发光而定量。在使用前不久，错误折叠的聚集的TTR样品被提交与戊二醛(1％，5分钟，37℃)交联，以防止在对SDS-PAGE制备过程的TTR聚集体的解离。与此相反，天然TTR样品使用之前没有交联，使得该TTR同源四聚体(其在生理条件下是天然TTR构象)几乎完全离解成单体和二聚体。
商购的抗TTR抗体表现出非常强的对人天然TTR样品的TTR单体和二聚物的结合(图4A1)，以及对交联的错误折叠的聚集TTR样品类似的强结合(图4A2)，由此证明对天然的或错误折叠的、错误装配的和/或聚集TTR的构象的选择性的缺乏。相反，示例性抗TTR抗体NI-301.59F1，NI-301.35G11，和NI-301.37F1表现出对交联的错误折叠的聚集TTR样品非常强的结合(图4B2，C2，D2)，但对人天然TTR样品的TTR单体和二聚物根本不结合(图4B1，C1，D1)，从而表明相较天然TTR构象对错误折叠的、错误装配的和/或聚集TTR的构象的强选择性。
除此之外，商购的和示例性的抗TTR抗体具有对包含在小鼠肝脏提取物中的蛋白质很低的结合水平(图4的A3，B3，C3，D3)。鉴于用于实验的肝脏蛋白的高含量以及相对于其亲和力的高抗体浓度，这表明示例性抗体对TTR有明显的特异性，并且不显著结合其他蛋白质。另外，显示出该示例性抗体不结合小鼠肝脏提取物中高水平含有的小鼠TTR蛋白，这表明示例性抗体显示出对人错误折叠的TTR蛋白的特异性。然而，抗体NI-301.37F1的表位存在于大鼠和小鼠的TTR蛋白。因此，表位的一级氨基酸序列可能对于错误折叠的TTR的检测不一定是决定性的，而是构象。
为了进一步表征抗体对于天然TTR蛋白的结合能力，或它的缺乏，使用如上所述相同的Western印迹法评价示例性抗体对人血浆样品中含有的TTR蛋白的结合能力(图5)。唯一的技术差异在于在约25-30kDa修整凝胶的上部，并仅使用凝胶下部用于蛋白质转印到硝化纤维素膜。这是要除去血浆样品中存在的高浓度的人抗体重链和轻链，其可能干扰分析。
与用作参考的商购抗体相反，示例性抗体NI-301.35G11和NI-301.37F1根本没有检测到包含在人血浆样品中的TTR蛋白，因此表明对TTR构象的选择性，该构象不存在与这些条件下分析的样品中。
实施例6：利用免疫沉淀法在溶液中的抗TTR抗体的结合选择性
为了进一步验证本发明的抗TTR抗体的结合选择性，天然的或错误折叠聚集构象的人野生型TTR蛋白和重组的TTR蛋白和人血浆样品在PBS中在稀释成3个不同的浓度，用于TTR免疫沉淀(IP)。简言之，蛋白A包被的磁珠与在制造商结合缓冲液中稀释的抗TTR抗体在室温孵育30分钟。抗体/蛋白A复合物被回收并与TTR制剂和人血浆样品在4℃孵育过夜。洗涤后，将抗体/蛋白A复合物重新悬浮于SDS上样缓冲液，在90℃加热5分钟，并进行处理用于Western印迹分析。
如图7所示，与商购TTR抗体Dako A0002相反，示例性TTR抗体NI-301.35G11和NI-301.37F1显示出对该血浆样品没有结合(图7A7-9，B7-9，C7-9)，以及对天然的野生型和重组TTR样品没有结合(图7B3，C3，B5，C5)。然而，在存在错误折叠的聚集形式的TTR的样品中评估到了强结合(图7B4，C4，B6，C6)。
这些结果表明，在溶液中示例性抗体NI-301.35G11和NI-301.37F1能够结合错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR构象，并显示出对这些构象的高选择性。
实施例7：结合到FAP小鼠组织内的病理性TTR聚集物
通过免疫组织化学(IHC)，评价了示例性抗TTR抗体结合存在于只表达人V30M-TTR蛋白而非小鼠TTR蛋白(此后称为FAP小鼠)的转基因小鼠组织中的病理性和非病理性TTR蛋白的能力。也评价了这些抗体在不表达任何TTR蛋白的TTR敲除(TTR-KO)小鼠组织的非特异性结合，相应的转基因和基因敲除的小鼠品系最初被Suichiro Maeda教授制备并描述(Kohno K.等人,American Journal of Pathology140(4)(1997),1497-1508)。简言之，免疫组织化学在石蜡包埋的切割成3-5μm厚的切片的小鼠组织上进行。切片最初脱蜡和再水化，并在室温用3％H2O2的甲醇溶液处理20分钟。封闭缓冲液(PBS+5％血清(马/山羊)+4％BSA)在室温施用1小时，并用在PBS中稀释的抗TTR抗体取代，在4℃孵育过夜。在PBS中洗涤3次后，将切片依次与适当的生物素化的次级抗体(抗人IgG，抗兔IgG在PBS中稀释1/125，在室温孵育1小时)和抗生物素蛋白-HRP检测系统(在PBS中稀释1/125，在室温孵育1小时)孵育。将反应物用二氨基联苯胺在室温显影准确的15分钟。组织切片在室温用苏木精明矾(hemalun)复染1分钟，在升乙醇系列中脱水和盖片。
如图8所示，商购TTR抗体Dako A0002在FAP小鼠的肝和肠切片中产生了强染色，而在相应的TTR KO切片中未产生任何染色(图8 1A，1B)。示例性TTR抗体NI-301.35G11在FAP的小鼠的肝脏和肠切片(图8 2A)都产生了类似模式和强度的染色。相反，示例性抗体NI-301.37F1仅在FAP小鼠肠切片而不是在肝脏切片产生强染色(图8 3A)。这表明，NI-301.37F1抗体仅结合随时间累积在FAP小鼠的胃肠道的病理性的(即非生理性的)TTR聚集体，而不结合由肝脏合成的天然构象的TTR。
除此之外，这两个示例性抗体NI-301.35G11和NI-301.37F1在TTR-KO小鼠的肝和肠组织切片中都没有产生任何染色(图8 2B，3B)。鉴于关于所述抗体结合亲和力本实验所用的高抗体浓度，TTR-KO切片染色的缺乏表明对TTR蛋白的高结合特异性。
实施例8：对人体组织中错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR沉积物结合选择性
本发明的抗体也被评价了其在人体组织中结合病理性TTR沉积物的能力。来源于FAP患者的皮肤活检切片和来源于健康个体的胰腺组织切片被处理用于免疫组织化学，使用实施例7(见上)所述的相同方法。皮肤活检样品被选用于此实验，因为它包含重要量的病理性TTR淀粉样蛋白沉积物。与此相反，在本实验中使用胰腺组织，因为胰腺α细胞以较高水平表达TTR。
如图9所示，商购抗体Dako A0002对于皮肤中的病理性TTR沉积物和胰腺α细胞中的天然TTR(图9 1A)显示了相同强度的染色。类似地，示例性鼠嵌合抗体NI-301.mur35G11对于皮肤中的病理性TTR沉积物和胰腺α细胞中的天然TTR产生了相同强度的染色(9 1B图)。相反，抗体NI-301.37F1仅仅使皮肤中的病理性TTR沉积物染色，而非胰腺α细胞中的天然TTR(图9 3A)。这个结果表明，通过IHC，NI-301.37F1对病理性TTR沉积物是有高选择性的，其中包括突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的TTR构象。
呈现于板(图9的1B、2B和3B)中的“仅由次级抗体”的对照情况表明在缺乏初级抗体的情况下发生的组织染色。染色的缺乏(图2B)或非常低的水平(1B，3B)，表示在板1A、2A和3A中观察到的染色，确实是对相应初级抗体有特异性的。
实施例9：TTR抗体的结合表位的评估
为了确定示例性抗体NI-301.59F1、NI301.35G11、和NI-301.37F1的结合表位，整个TTR氨基酸序列是使用29顺序肽15个氨基酸长、11个氨基酸重叠的板进行分析，共价结合到膜上。包括选定的突变的另外的肽也绘制在膜上。该膜在4℃被封闭在Roti封闭缓冲液中过夜，首先与在封闭缓冲液中稀释的抗TTR抗体在室温孵育2小时，然后与HRP偶联的抗人IgG抗体在室温孵育45分钟(在TBS中稀释1/20000)。将反应物用鲁米诺显影并通过发光成像。
抗体NI-301.59F1识别对应于完整的人野生型TTR的序列61-EEEFVEGIY-69(SEQID NO：49)的点15、16和44，参见图10A。抗体NI-301.35G11识别对应于完整的人野生型TTR的序列53-GELHGLTTEEE-63(SEQ ID NO：50)的点13、14、42和44，参见图10B。但是，抗体NI-301.35G11不识别点43，表明该抗体不能结合对应于L55P-TTR变异体的序列53-GELHGPTTEEE-63。抗体NI 301.37F1识别对应于完整的人野生型TTR的序列41-WEPFA-45(SEQ ID NO：51)的点9、10、11、38和40，参见图10C。然而，抗体NI-301.37F1不识点43，表明该抗体不能结合对应于E42G-TTR变异体的序列41-WGPFA-4。
为改良示例性抗体NI-301.59F1，NI301.35G11，和NI-301.37F1的结合表位的确定，整个TTR氨基酸序列使用151顺序肽15个氨基酸长和14个氨基酸重叠的板分析，共价结合到膜。对于每种肽，在10位的氨基酸对于非丙氨酸的用丙氨酸取代，而丙氨酸被甘氨酸或脯氨酸取代。该膜在4℃被封闭在Roti封闭缓冲液中过夜，首先与在封闭缓冲液中稀释的抗TTR抗体在室温孵育2小时，然后与HRP偶联的抗人IgG抗体在室温孵育45分钟(稀释1/20000)。将反应物用鲁米诺显影并通过发光成像。
抗体NI-301.59F1只能识别点77和83，表明E61和V65对于59F1结合是非必需的，而E62，E63，F64，E66，G67，I68和Y69对于抗体结合都是必需的。K70的确切贡献是一个解读的问题：图10A所示的对肽44的强抗体结合清楚地表明在C端位置K70的缺少不阻止抗体结合；但是，在图10E所示的随后的实验中，对肽10位置的K70A的取代阻止了抗体结合。这些看似相反的结果表明，NI-301.59F1结合氨基酸序列62-EEFXEGIY-69(SEQ ID NO：58)的特定构象，其中X可以是任何氨基酸。
抗体NI-301.35G11识别点68,71,72,73,74和75，表明G53对于35G11结合是非必需的，而E54,L55,G57和L58对于抗体结合是必需的。35G11的结合模式也表明E61或E62的存在对于抗体结合是必需的。T59和T60的确切贡献不能在这个实验中确定，但假设为两个酪氨酸之一的存在对抗体结合是必需的。综合起来，在丙氨酸扫描的NI-301.35G11结合特性表明该抗体识别序列54ELXGLTXE 61(SEQ ID NO：59)，其中X可以包括所有已知的氨基酸，参见图10F。
抗体NI-301.37F1结合丙氨酸扫描膜上的点50、52、55、56和58-62，而不结合点51、53、54和57。这表明，W41，P43，F44和A45对抗体结合是必需的。结合早期的观察，突变E42G破坏了抗体结合(图10C)，这些结果表明，NI-301.37F1结合序列41WEPFA-45(SEQ ID NO：60)，参见图10G。
实施例10：通过表面等离子体共振测定抗体结合特征
抗体对各种水溶性TTR制剂的结合特性通过表面等离子体共振(SPR)手段测定，使用BioRad Proteon XPR36仪，见表V。
SPR分析是在配有GLM传感器芯片的BioRad ProteOn XPR36上进行的。针对Fcγ结构域的抗人抗体被共价偶联到检测表面并用所研究的抗体饱和。在天然和错误折叠构象的野生型和突变型TTR蛋白在HBS-T缓冲液中稀释为3.2至316nM的浓度范围。抗体-抗原的结合在180秒期间分析，解离在600秒期间分析。Langmuir结合模型(简单的1:1结合)被用于拟合数据并获得结合(ka)和解离(kd)常数，以及亲和力(KD)。
抗人IgG-Fcγ抗体被共价地包覆在检测表面，并用来捕捉人TTR-特异性抗体。该抗体使用4种不同的TTR制剂探测，包括天然的和错误折叠聚集的野生型TTR，和天然的V30M和L55P TTR突变体，所有都配置为HBS-T缓冲液中浓度为3.2到316nM(10mM Hepes,150mMNaCl,3mM EDTA,0.05％吐温20,pH 7.4)中。错误折叠聚集的野生型TTR通过在醋酸盐缓冲液中(50mM醋酸盐盐酸(acetate HCl),100mM KCl,1mM EDTA,pH 3.0)在65℃酸性变性80分钟制备，伴随随后的用HBS-T的缓冲液交换。59F1、35G11和37F1显示出线性结合和分离的特点，其与Langmuir模型最好地拟合。
结果表明，这三种抗体在溶液中以高亲和力结合V30M-和L55P-TTR变体，以及错误折叠聚集的野生型TTR制剂。相反，这些示例性抗体不结合溶液中的天然野生型TTR。
因此，该结果表明，NI-301.37F1在溶液中以高亲和力结合错误折叠的人野生型TTR蛋白，具有1.2nM的KD，而不结合处于其天然构象的相同的蛋白质。类似的结合亲和力(KD＝1.4nM)对于突变体TTR-L55P蛋白已被测定。
表V：通过表面等离子体共振测定抗体的结合特征。
Figure BDA0002393114180001221
实施例11：对呈现组织TTR沉积的人Val30Met TTR转基因小鼠，用嵌合人-鼠重组抗TTR抗体的被动免疫导致沉积的移除
类似于国际申请WO 2010/030203所述的，特别是实施例3，进行了被动免疫接种，其公开内容通过引用并入本文，以及Kohno等人,Am.J.Pathol.(1997),1497-1508andSousa等人,Am.J.Pathol.(2002),1935-48公开内容通过引用并入本文。
简言之，单克隆抗体以3mg/kg的剂量对7月龄和17月龄的FAP小鼠每周腹腔内给药进行12周，其是对于人类Val30Met-TTR等位基因是转基因的，并敲除了鼠科TTR基因(Kohno等人,(1997),见上文)。在最后一次给药后的五天内，处死动物，收集各种组织并固定在多聚甲醛溶液中，并包埋在石蜡中。切3-5μm切片，并使用上述的商购抗TTR抗体进行免疫组化处理。标准的免疫荧光方法被使用，其与实施例7中显示的非常相似，唯一的区别是将荧光次级抗体用于检测。被TTR沉积物侵入的组织的表面被定量，并表示为总组织面积的百分比。用双尾、非配对t检验对治疗效果进行统计分析。
这种转基因小鼠品系重现了对于包括TTR四聚体解离和TTR单体错误折叠成有毒且不溶的淀粉样蛋白的构象的TTR淀粉样蛋白疾病的共同的关键病理机制。像FAP患者一样，这些转基因小鼠典型地呈现出年龄依赖性TTR沉积。治疗效果的评价在治疗开始时为7月龄和17月龄的两组转基因小鼠中进行了研究；年龄对于TTR沉积是重要的，侵入许多胃肠组织。值得注意的是，用示例性抗体NI-301.37F1的被动免疫与当治疗开始于7月龄时TTR沉积侵入的组织表面的统计学显著降低是相关的，参见图12A。对于老年小鼠，治疗有类似的效果，导致TTR沉积几乎显著的减少，参见图12B。
实施例12：人源的、重组抗TTR抗体结合体内病理性TTR沉积物
为了确定人源重组抗TTR抗体是否能够结合体内病理性TTR沉积物，7月龄的成年FAP小鼠以30mg/kg剂量腹腔注射抗体NI-301.37F1，或用PBS进行比较。48小时后，这些小鼠被提交给转心(transcardiac)灌注，并且组织被处理以用于组织学分析。兔多克隆抗TTR抗体与荧光标记的抗兔IgG抗体联合使用，检测到了病理性TTR沉积物，而使用荧光标记的抗人IgG抗体检测到了所注射的抗体NI-301.37F1的位置(定位)。尤其是，免疫沉淀按照如下进行。
NI-301.37F1和来源于小鼠血浆样品同种型对照抗体进行室温下2小时的免疫沉淀，使用装载有抗人IgG抗体(Jackson Immunoresearch#709-005-098)的蛋白A/G偶联的磁珠(Pierce#88803)。用PBS-T洗涤3次后，将样品从磁性珠洗脱，用0.2M甘氨酸缓冲液(pH2.5)，用1M Tris盐酸(pH 8.0)中和，与LDS载样的缓冲液(Life technologies公司#NP0007)混合，并在90℃加热10分钟。然后将样品上样到4-12％双-三凝胶(Lifetechnologies公司#WG1403A)在200V在MOPS流动缓冲液运行40分钟。蛋白质转到硝酸纤维素膜上后，使用构象独立的TTR抗体(Dako公司#A0002，150ng/ml)或使用抗体NI-301.37F1(20nM)，联合HRP偶联的蛋白A(Life technologies公司#10-1023，1/10000稀释)以及发光成像检测到了TTR蛋白。
如图13所描述的，体内靶接合在接受30mg/kg剂量抗体NI-301.37F1或PBS的单次腹腔注射的成年FAP小鼠(7月龄)体内进行。48小时后，将小鼠用PBS灌注，收集器官并处理用于组织学分析。通过商购的兔多克隆抗TTR抗体(Dako公司的#A0002，4.8μg/ml)与Cy5偶联的抗兔抗体(Jackson Immunoresearch#711-175-152，1/200稀释)联合使用的免疫荧光法检测到病理性TTR沉积物。使用Cy3缀合的抗人抗体(Jackson Immunoresearch#709-165-149，1/200稀释)，NI-301.37F1的存在(或不存在)同时被检测到。相同的扫描参数被用于注射NI-301.37F1的和注射PBS的组织的成像，并且图像接受了相同的显示调整。
如图13所示，NI-301.37F1依赖的染色与注射NI-301.37F1的小鼠体内TTR染色是高度共定位的，但正如预期的，在注射PBS小鼠的体内是完全缺乏的。这一结果表明，抗TTR抗体NI-301.37F1在体内结合病理性TTR沉积物。
实施例13：错误折叠的TTR蛋白沉积物的体内检测不需要组织活检
在对与聚集的、突变的、错误折叠的、和/或错误装配的TTR相关的TTR淀粉样蛋白疾病的诊断过程中，替代组织活检和组织学分析的此诊断过程在下文给出示例并示出于图14。特别是，实验是用7月龄的FAP小鼠进行的，如上所述；见实施例11，见上。这些小鼠再现了FAP的核心病理生理机制，并且像患者一样，呈现出在各种组织中年龄依赖性的TTR沉积。两个FAP小鼠接受人源重组抗TTR单克隆抗体NI-301.37F1的以3mg/kg剂量的单次腹膜内注射。抗体注射之前(t＝0)，和注射后两天(t＝48小时)，收集小血样和制备血浆用于分析。血浆样品提交到与抗人IgG抗体的免疫沉淀(以回收所注入的人抗TTR抗体)，t＝0的样品用作阴性对照。免疫沉淀的样品然后通过Western印迹法处理以检测注射进小鼠的抗TTR抗体是否已在48小时内捕获一些错误折叠的TTR蛋白，其中它在体内循环。构象特异性和独立于构象的抗TTR抗体都被使用来进行Western印迹法。使用同种型对照抗体(不能结合TTR蛋白)作为阴性对照进行了对照实验。额外的对照存在于来源于未用抗体NI-301.37F1进行体外治疗的FAP小鼠孵育的血浆样品，并如上所描述的处理。
呈现于图14中的结果表明抗体NI-301.37F1在体内培养48小时期间捕获了一些错误折叠的TTR蛋白。这被观察到是对抗体NI-301.37F1有特异性，而不是对同种型对照抗体。此外，被抗体NI-301.37F1捕获的错误折叠的TTR蛋白不存于从未经治疗的小鼠收集血浆样品中。总之，这些结果表明，抗体NI-301.37F1能够从体内不溶的TTR沉积物移除错误折叠的TTR蛋白，它的存在可以无需组织活检而被检测到。在人体使用该诊断测试的技术调整将在于用例如，生物素或组氨酸或链霉标签标记抗TTR抗体，允许其从人血浆样品被回收。可替换地，未修饰的抗TTR抗体可以从人血浆样品借助于抗独特型抗体被回收。
Figure BDA0002393114180001261
Figure BDA0002393114180001271
Figure BDA0002393114180001281
Figure BDA0002393114180001291
Figure BDA0002393114180001301
序列表
<110> 生物控股有限公司(NEURIMMUNE HOLDING AG)
<120> 人源抗转甲状腺素蛋白抗体、多核苷酸、载体及其应用
<130> PN19028140I
<150> EP 13199251.3
<151> 2013-12-20
<160> 91
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 378
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
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<223> NI-301.59F1 可变重链(VH)序列
<220>
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<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(195)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (292)..(345)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 1
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggg ttg gtc cag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gta gcc tct gga ttc act ttt agt aat tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
tgg atg agt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtg 144
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcc aat ata aat caa gat agt gag aaa tac tat gtg gac tct gtg aag 192
Ala Asn Ile Asn Gln Asp Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
50 55 60
ggc cga ttc gcc atc tcc aga gac aac tcc aag aac tca ctg tat ctg 240
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
caa atg aac agc ctg aga gtc gag gac acg ggc gtg tat tac tgt gcg 288
Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
aga gat cgc tat tgc agt ggt ggg aga tgc tcc cgg ggt aac aac tgg 336
Arg Asp Arg Tyr Cys Ser Gly Gly Arg Cys Ser Arg Gly Asn Asn Trp
100 105 110
ttc gac ccc tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 378
Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Asn Ile Asn Gln Asp Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Asp Arg Tyr Cys Ser Gly Gly Arg Cys Ser Arg Gly Asn Asn Trp
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR3
<400> 3
gaa att gtg ttg acg cag tct cca gcc act ctg tct ctg tct cca ggg 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gag aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt aga agc aac 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn
20 25 30
tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
tat ggt gca tcc acc agg gcc act gat atc cca gcc agg ttc agt ggc 192
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Asp Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt ggg tct ggg aca gaa ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag tct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
gag gat ttt gca gtt tat tac tgt cag caa tat aat aac tgg cct ccg 288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
tac act ttt ggc cag ggg acc aaa gtg gat atc aaa 324
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
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<213> 智人
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Asp Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
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<223> NI-301.35G11 可变重链(VH)序列
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<222> (91)..(105)
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<221> V_区
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<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (295)..(327)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 5
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtg cag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gta gcc tct gga ttc act ttt agc agc tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
gcc atg agc tgg gtc cgc cag gtt cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tca tct att agt ggt agt ggt gat aca aca aaa tac aca gac tcc gtg 192
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Asp Thr Thr Lys Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cgg ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg gtg ttt 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Phe
65 70 75 80
ctg caa atg agc agc ctg aga gcc gag gac acg gcc cta tat tac tgt 288
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
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gtg aaa gat ggt agt gga cgg atc gat cct ttt gct tta tgg ggc caa 336
Val Lys Asp Gly Ser Gly Arg Ile Asp Pro Phe Ala Leu Trp Gly Gln
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ggg aca atg gtc acc gtc tct tcg 360
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<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Asp Thr Thr Lys Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Asp Gly Ser Gly Arg Ile Asp Pro Phe Ala Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<223> NI-301.35G11可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (70)..(117)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (163)..(183)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (280)..(306)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR3
<400> 7
gaa att gtg atg aca cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc ctt gga 48
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
cag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cgt agt ctc gta tac agt 96
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val Tyr Ser
20 25 30
gat gga aac att tac ttg aat tgg ttt cag cag agg cca ggc caa tct 144
Asp Gly Asn Ile Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
cca agg cgc cta att tat aag gtt tct aac cgg gac tct ggg gtc cca 192
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
gac aga ttc agt ggc agt ggg tca gac act gac ttc aca ctg aga atc 240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
agc agg gtg gag gct gag gat gtt ggg gtc tat tac tgc atg cag ggt 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
aca cac tgg cct agg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa 336
Thr His Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Ile Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<223> NI-301.37F1 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(201)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(327)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 9
cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acc tgc agt gtc tct ggt ggc tcc atc atc agt agg 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Ile Ser Arg
20 25 30
agt tcc tac tgg ggc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag 144
Ser Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
tgg att ggg ggt atc tat cat agt ggg aac act tac gac aac ccg tcc 192
Trp Ile Gly Gly Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser
50 55 60
ctc aag agt cga ctc acc atg tcc gta gac acg tcg aag aac cag ttc 240
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
tcc ctg aat ctg agg tct gtg acc gcc gca gac acg gct gtg tat tac 288
Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
tgt gcg agg ata gtg ccg ggg ggt gat gct ttt gat atc tgg ggc caa 336
Cys Ala Arg Ile Val Pro Gly Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
ggg aca atg gtc acc gtc tct tcg 360
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Ile Ser Arg
20 25 30
Ser Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Gly Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Val Pro Gly Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> NI-301.37F1可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (70)..(102)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(168)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (265)..(291)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR3
<400> 11
gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc aca atc gct tgc cgg gcc agt cag agc gtt ggc acc tat 96
Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Tyr
20 25 30
tta aat tgg tat cag cag aaa aga ggg aaa gcc cct aaa ctc ctc atc 144
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Arg Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
ttt gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
gaa gac ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac agt tct cct cca 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Pro
85 90 95
acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa 321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Arg Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(363)
<223> NI-301.2F5 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(198)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (295)..(330)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 13
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cgg tct agg agg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Ser Arg Arg
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca acc tct gga ttc acc ttc agt aac tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
gcg atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcc att att tca tat gat gga aac aat aaa tac tac gca gac tcc gtg 192
Ala Ile Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
agg ggc cga ttc acc gtc tcc aga gac aat tcc aag aac aca ttc tat 240
Arg Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Phe Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aac agc ctg aga att gag gac acg gct gta tat ttt tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ile Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
gcg aga ggg agc ggt aga gca gct cgt cac tgg ttc gac ccc tgg ggc 336
Ala Arg Gly Ser Gly Arg Ala Ala Arg His Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
cag ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Ser Arg Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ile Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Gly Arg Ala Ala Arg His Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<223> NI-301.2F5可变轻链(VL)序列
<220>
<221> V_区
<222> (67)..(108)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(174)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (271)..(306)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR3
<400> 15
cag tct gcc ctg act cag cct gcc tcc gtg tct ggg tct cct gga cag 48
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
tcg atc acc atc tcc tgc act gga acc agc agt gac gtt ggt ggt tat 96
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
aac tat gtc tcc tgg tac caa caa tac cca ggc aaa gcc ccc aaa gtc 144
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val
35 40 45
atg att ttt gat gtt ttt aat cgg cct tca ggg gtt tct aat cgc ttc 192
Met Ile Phe Asp Val Phe Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg acc atc tct gga ctc 240
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
cag gca gag gac gag gct gat tat tac tgc agt tca tat aca agc agc 288
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
gtc act cct cac tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 336
Val Thr Pro His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val
35 40 45
Met Ile Phe Asp Val Phe Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Val Thr Pro His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 17
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<223> NI-301.28B3可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(111)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(201)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(348)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 17
cag ctg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tcc ggt ggc tcc atc act agt agt 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Ser
20 25 30
aat ttc tac tgg ggc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag 144
Asn Phe Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
tgg att ggg gct att tat tct agt gga aac acc tac tac aac ccg tcc 192
Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
ctc aag agt cga gtc acc ata tcc gta gac acg tcc aag aaa aag ttc 240
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Lys Phe
65 70 75 80
tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gct gac acg gct gtc tat tac 288
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
tgt gcg aga cac tct tgt agt agt gcc agc tgc tat cct ccc ggt ttc 336
Cys Ala Arg His Ser Cys Ser Ser Ala Ser Cys Tyr Pro Pro Gly Phe
100 105 110
tgg ttc gac ccc tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 381
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 18
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Ser
20 25 30
Asn Phe Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Lys Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg His Ser Cys Ser Ser Ala Ser Cys Tyr Pro Pro Gly Phe
100 105 110
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 19
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<223> NI-301.28B3可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (70)..(102)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(168)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (265)..(294)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR3
<400> 19
gaa att gtg atg aca cag tct cca gcc acc ctg tct gcg tct cca ggg 48
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag act gtt agt tac aac 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Tyr Asn
20 25 30
tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc cgg ctc ctc atc 144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
tat ggc gcg tcc acc agg gcc act ggt atc cca ggc agg ttc agt ggc 192
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Gly Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt ggg tct ggg aca gag ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag tct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag caa tat aat aac tgg cct ccg 288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 324
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Tyr Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Gly Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 21
<211> 384
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(384)
<223> NI-301.119C12 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(111)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(201)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(351)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 21
cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca aga ctg gtg aag cct tca cag 48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc agc agt ggt 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
gtt tac tac tgg agc tgg atc cgc cag cac cca ggg aag ggc ctg gag 144
Val Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
tgg att gga tat att tct aat act ggg aac acc tac tac aac ccg tcc 192
Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Asn Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
ctc aag agt cga gtt acc ata tcg ata gac acc tcc aag aac cag ttc 240
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
tcc ctc aac ctg cgc tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gac tat ttc 288
Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Asp Tyr Phe
85 90 95
tgt gcg aga gag tat tgt agt ggt ggt aat tgc tac tct cgc ttc tac 336
Cys Ala Arg Glu Tyr Cys Ser Gly Gly Asn Cys Tyr Ser Arg Phe Tyr
100 105 110
tac tac atg gac gtc tgg ggc aaa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 384
Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 22
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Asn Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Asp Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Tyr Cys Ser Gly Gly Asn Cys Tyr Ser Arg Phe Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 23
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<223> NI-301.119C12可变轻链(VL)序列
<220>
<221> V_区
<222> (67)..(108)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(174)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (271)..(306)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR3
<400> 23
cag tct gtg ctg acg cag ccg ccc tca gtg tct ggg gcc cca ggg cag 48
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
agg gtc acc atc tcc tgc act ggg agc agc tcc aac atc ggg gca ggt 96
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
tat ggt gta cac tgg tac cag caa ctt tca gga aca ccc ccc aaa ctc 144
Tyr Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Ser Gly Thr Pro Pro Lys Leu
35 40 45
ctc atc tat gga gac aac aat cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc 192
Leu Ile Tyr Gly Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
tct ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc act ggg ctc 240
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
cag gct gag gat gag gct cat tat tac tgc cag tcc tat gac acc acc 288
Gln Ala Glu Asp Glu Ala His Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Thr
85 90 95
ttg agt ggt tcg agg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 336
Leu Ser Gly Ser Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 24
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Ser Gly Thr Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala His Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Thr
85 90 95
Leu Ser Gly Ser Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 25
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(363)
<223> NI-301.5D8 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(195)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (292)..(330)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 25
cag gtg cag cta cag cag tgg ggc gca gga cgg ttg aag cct tcg gag 48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Arg Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acg tgc gct gtc tat ggt ggg tct ttc agt gct tac 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
tac tgg aat tgg atc cgc cag gcc cca ggg aag ggg ctg gag tgg att 144
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
ggt gaa gtc agt cat ggt ggc agc agc aac tac agc ccg tcc ctc agg 192
Gly Glu Val Ser His Gly Gly Ser Ser Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Arg
50 55 60
ggt cga gtc gcc att tct tta gac acg tcc aag agc cag ttc tcc ctg 240
Gly Arg Val Ala Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
agg ctg aat tct gtg acc gcc gcg gac acg gct gtt tat tac tgt gcg 288
Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
aga ggc agc cct gta gta cta cca ggt gcc aga ttc gac ccc tgg ggc 336
Arg Gly Ser Pro Val Val Leu Pro Gly Ala Arg Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Arg Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Val Ser His Gly Gly Ser Ser Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Arg
50 55 60
Gly Arg Val Ala Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Ser Pro Val Val Leu Pro Gly Ala Arg Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 327
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(327)
<223> NI-301.5D8可变轻链(VL)序列
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(108)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(174)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (271)..(297)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR3
<400> 27
cag tct gcc ctg act cag cct gcc tcc gtg tct ggg ttt cct gga cag 48
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Phe Pro Gly Gln
1 5 10 15
tcg atc acc atc tcc tgc act gga acc agc agt gat gtt ggg agt tat 96
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr
20 25 30
aac ctt gtc tcc tgg tac caa caa cac cca ggc aaa gcc ccc aaa ctc 144
Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
ttg att tat gag gtc aat aag cgg ccc tca gga gtt tct act cgc ttc 192
Leu Ile Tyr Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Thr Arg Phe
50 55 60
tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg acg atc tct ggg ctc 240
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
cag act gag gac gag gct gat tat tac tgc tgc tca tat gca ggt agt 288
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
act aag gtc ttc gga att ggg acc aag gtc acc gtc cta 327
Thr Lys Val Phe Gly Ile Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 28
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Phe Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr
20 25 30
Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Thr Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Thr Lys Val Phe Gly Ile Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 29
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(372)
<223> NI-301.9D5 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(111)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(201)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(339)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 29
cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca ggc ctg gtg aag cct tca gag 48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acc tgc att gtc tct ggt gtc tcc atc aga agt ggt 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ile Val Ser Gly Val Ser Ile Arg Ser Gly
20 25 30
ggt tac tac tgg agc tgg atc cgg cag cac cca ggg aag ggc ctg gag 144
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
tgg gtt ggg ttc atc tat tac act ggg aac acc tac tac aac ccg tcc 192
Trp Val Gly Phe Ile Tyr Tyr Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
ctc aag agt cga gct acc ata tca gta gac acc tct aag aac cag ttc 240
Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
tcc ctg agg ctg acc gct gtg act gcc gcg gac acg gcc gtg tat tac 288
Ser Leu Arg Leu Thr Ala Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
tgt gcg aga gat tgt agt ggt ggc agc tgc ccc gag tcc tac ttt gac 336
Cys Ala Arg Asp Cys Ser Gly Gly Ser Cys Pro Glu Ser Tyr Phe Asp
100 105 110
tcc tgg ggt cgg ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 372
Ser Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ile Val Ser Gly Val Ser Ile Arg Ser Gly
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Gly Phe Ile Tyr Tyr Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Arg Leu Thr Ala Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Cys Ser Gly Gly Ser Cys Pro Glu Ser Tyr Phe Asp
100 105 110
Ser Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 327
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(327)
<223> NI-301.9D5可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (70)..(102)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(168)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (268)..(297)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR3
<400> 31
gaa att gtg atg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgt agg gcc agt cag agt gtt cgc agt ttc 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Phe
20 25 30
tta gcc tgg tac caa cag aaa tct ggc cag gct ccc cga ctc ctc atc 144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
tat gat gca tcc aag agg gcc act ggc atc cca gcc agg ttc agt gac 192
Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Asp
50 55 60
agt ggg tct gga aca gac ttc act ctc acc atc agc aga cta gag act 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Thr
65 70 75 80
gaa gac tct gcg gtt tat tac tgt cag cag cgt acc aac tgg cct cca 288
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Pro
85 90 95
cac ctc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gaa atc aaa 327
His Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 32
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Asp
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Pro
85 90 95
His Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<223> NI-301.104F5 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(198)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (295)..(324)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 33
cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct gag agg 48
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Glu Arg
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcg tct gga ttc acc ttc agg agc tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca gtt ata tgg ttt gat gga agt aat aaa tac tat gca gac tcc gtg 192
Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc acc gtc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtc tac tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca aga gat ggt ata gca gcc act tat gcg gac tac tgg ggc cag gga 336
Ala Arg Asp Gly Ile Ala Ala Thr Tyr Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Glu Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Ile Ala Ala Thr Tyr Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> NI-301.104F5可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (70)..(102)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(168)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (265)..(291)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR3
<400> 35
gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt cgc agc tac 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr
20 25 30
tta gcc tgg tac caa caa aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
tat ggt gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc agg ttc agt ggc 192
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc ctg gag cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag caa cgt agc aac tgg ccg atc 288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile
85 90 95
acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa 321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(375)
<223> NI-301.21F10 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(114)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (157)..(207)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (304)..(342)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 37
cag gtg cag ctg gtg gag tcg ggg gga ggt ttg gtc cag cct ggg ggg 48
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ttg aga ctg tcc tgt gcg gtc tct gga ttc acc ctt agt agt ctt 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Leu
20 25 30
agt tct tat tac atg agt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg 144
Ser Ser Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
gag tgg gtg gcc act ata aac cca ggt gga agt gag aag tcc tat gtg 192
Glu Trp Val Ala Thr Ile Asn Pro Gly Gly Ser Glu Lys Ser Tyr Val
50 55 60
gac tct gtg aag ggc cga ttc acc gtc tcc aga gac aac gcc agg agc 240
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Ser
65 70 75 80
tca gta tat ttg caa atg gac agc ctg aca gtc gag gac acg gct att 288
Ser Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Thr Val Glu Asp Thr Ala Ile
85 90 95
tat tac tgt gcg aga cca aga tat tgc act agt ggt ggt tgc tat ttt 336
Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Arg Tyr Cys Thr Ser Gly Gly Cys Tyr Phe
100 105 110
gac aac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 375
Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 38
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ser Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ala Thr Ile Asn Pro Gly Gly Ser Glu Lys Ser Tyr Val
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Ser
65 70 75 80
Ser Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Thr Val Glu Asp Thr Ala Ile
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Arg Tyr Cys Thr Ser Gly Gly Cys Tyr Phe
100 105 110
Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 39
<211> 327
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(327)
<223> NI-301.21F10可变轻链(VL)序列
<220>
<221> V_区
<222> (67)..(108)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(174)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (271)..(297)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR3
<400> 39
cag tct gcc ctg act cag cct cgc tca gtg tcc ggg tct cct gga cag 48
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
tca gtc acc atc tcc tgc act gca acc aat agt gat gtt ggc gat tat 96
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Ala Thr Asn Ser Asp Val Gly Asp Tyr
20 25 30
aag tct gtc tcc tgg tac caa caa cac cca ggc aaa gcc ccc aaa ctc 144
Lys Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
atg att tat gat gtc ggt agg cgg ccc tca ggg gtc cct gat cgc ttc 192
Met Ile Tyr Asp Val Gly Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
tct ggc tcc aaa tct gac aac acg gcc ttc ctg acc atc tct ggg ctc 240
Ser Gly Ser Lys Ser Asp Asn Thr Ala Phe Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
cag act gag gat gaa gct gat tac ttt tgc tgt ata tat gta ggc agg 288
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Cys Ile Tyr Val Gly Arg
85 90 95
tct tcg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ttg acc gtc ctg 327
Ser Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 40
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Ala Thr Asn Ser Asp Val Gly Asp Tyr
20 25 30
Lys Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Gly Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Asp Asn Thr Ala Phe Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Cys Ile Tyr Val Gly Arg
85 90 95
Ser Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 41
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(372)
<223> NI-301.9G12 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(108)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(198)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (295)..(339)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 41
cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tct ggt ttc tcc atc agc agt ggt 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
tac tac tgg ggc tgg atc cgg cag ccc cca ggg acg ggg ctg gag tgg 144
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Thr Gly Leu Glu Trp
35 40 45
att ggg agt atg tat cat agt ggg agg acc tac tac aac ccg tcc ctc 192
Ile Gly Ser Met Tyr His Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttg tcc 240
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser
65 70 75 80
ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg gcc gtg tat tac tgt 288
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg agg ggc ttc gat act agt ggt tcc cat cgg ccc ctc tcg act gac 336
Ala Arg Gly Phe Asp Thr Ser Gly Ser His Arg Pro Leu Ser Thr Asp
100 105 110
tac tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 372
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Thr Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Met Tyr His Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Asp Thr Ser Gly Ser His Arg Pro Leu Ser Thr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 43
<211> 330
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(330)
<223> NI-301.9G12可变轻链(VL)序列
<220>
<221> V_区
<222> (67)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(171)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (268)..(300)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR3
<400> 43
cag tct gtg ttg acg cag ccg ccc tca gtg tct gcg gcc cca gga cag 48
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
aag gtc acc atc tcc tgc tct gga agc agc tcc aac att ggg aat aat 96
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
tat gta tcc tgg tac cag cag ctc cca gga aca gcc ccc aaa ctc ctc 144
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
att tat gac aat aat aag cga ccc tca ggg att cct gac cga atc tct 192
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Ile Ser
50 55 60
ggc tcc aag tct ggc acg tca gcc acc ctg ggc atc acc gga ctc cag 240
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
act ggg gac gag gcc gat tat tac tgc gga acc tgg gat agc agc ctg 288
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
agt gct tat gtc ttc gga act ggg acc aag gtc acc gtc cta 330
Ser Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 44
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Ile Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 45
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<223> NI-301.12D3 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(198)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (295)..(324)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 45
gag gtg cag ctg gtg gag act ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gta gcg tct gga ttc acc ttc agg aac tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
ggc atg cac tgg gtc cgc cgg gcc cca ggc agg ggg ctg gag tgg gta 144
Gly Met His Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca gtt ata tgg tct gat gga agt gat aaa tac tat gca gac tcc gtg 192
Ala Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
gag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg gtg ttt 240
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Phe
65 70 75 80
ctc caa atg aac agc ctg aga gcc gac gac acg gct gta tac ttc tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
gcg aga gag ccg agc agc acc tgg gct ttt gac tac tgg ggc cag gga 336
Ala Arg Glu Pro Ser Ser Thr Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Pro Ser Ser Thr Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 330
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(330)
<223> NI-301.12D3可变轻链(VL)序列
<220>
<221> V_区
<222> (67)..(108)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(174)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (271)..(300)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR3
<400> 47
cag tct gcc ctg act cag cct gcc tcc gtg tct ggg tct cct gga cag 48
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
tcg atc acc atc tcc tgc act gga acc agc agt gat gtt ggg ggt tat 96
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
aac ctt gtc tcc tgg tac caa cag cac cca ggc aaa gcc ccc aaa ctc 144
Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
atg att tat gag gac att aag ggg ccc tca ggg gtt tct aat cgc ttc 192
Met Ile Tyr Glu Asp Ile Lys Gly Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg aca atc tct ggg ctc 240
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
cag gct gag gac gag gct gat tat ttc tgc tgc tca tat gca ggt act 288
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Thr
85 90 95
ggc act ctg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 330
Gly Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 48
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Asp Ile Lys Gly Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Thr
85 90 95
Gly Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由 NI-301.59F1 抗体识别的表位
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(9)
<223> NI-301.59F1 抗体的表位, aa 61to aa 69
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(9)
<223> NI-301.59F1抗体的表位, aa 61 to aa 69
<400> 49
Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr
1 5
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由 NI-301.35G11 抗体识别的表位
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(11)
<223> NI-301.35G11抗体的表位, aa 53 to aa 63
<400> 50
Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Glu
1 5 10
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由 NI-301.37F1 抗体识别的表位
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(5)
<223> NI-301.37F1 抗体的表位, aa 41 to aa 45
<400> 51
Trp Glu Pro Phe Ala
1 5
<210> 52
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<223> 在引物诱导突变更正后，NI-301.37F1-PIMC 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(201)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(327)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 52
cag ctg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acc tgc agt gtc tct ggt ggc tcc atc atc agt agg 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Ile Ser Arg
20 25 30
agt tcc tac tgg ggc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag 144
Ser Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
tgg att ggg ggt atc tat cat agt ggg aac act tac gac aac ccg tcc 192
Trp Ile Gly Gly Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser
50 55 60
ctc aag agt cga ctc acc atg tcc gta gac acg tcg aag aac cag ttc 240
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
tcc ctg aat ctg agg tct gtg acc gcc gca gac acg gct gtg tat tac 288
Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
tgt gcg agg ata gtg ccg ggg ggt gat gct ttt gat atc tgg ggc caa 336
Cys Ala Arg Ile Val Pro Gly Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
ggg aca atg gtc acc gtc tct tcg 360
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 53
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Ile Ser Arg
20 25 30
Ser Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Gly Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Val Pro Gly Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<223> NI-301.44E4 VH 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(198)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (295)..(327)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 54
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag ccg ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt agc agc tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
gcc atg atc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tca ggt att agt ggc agt ggc agt acg aca tac tac gca gac tcc gtg 192
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cgg ttc gcc atc tcc aga gac aaa tcc aag aac acg ctg tcc 240
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
cta caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gcc gta tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca aaa ggg gca tgg gag ata ccc acc tac ttt gac aac tgg ggc cag 336
Ala Lys Gly Ala Trp Glu Ile Pro Thr Tyr Phe Asp Asn Trp Gly Gln
100 105 110
gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 360
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 55
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ala Trp Glu Ile Pro Thr Tyr Phe Asp Asn Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 56
<211> 327
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(327)
<223> NI-301.44E4 VK 可变κ轻链 (VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (70)..(102)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(168)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (265)..(297)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR3
<400> 56
gaa att gtg ctg act cag tct cca gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt att agg aac aac 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Asn Asn
20 25 30
tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
tat ggt gca tcc acc agg gcc act ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc 192
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
act ggg tct ggg aca gag ttc act ctc atc gtc agc agc ctg cag tct 240
Thr Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile Val Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag tat aat aac tgg cct ccc 288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
acg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 327
Thr Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 57
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Asn Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Thr Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile Val Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NI-301.59F1抗体的表位, aa 62 to aa 69， 丙氨酸扫描后
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 58
Glu Glu Phe Xaa Glu Gly Ile Tyr
1 5
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NI-301.35G11抗体的表位, aa 54 to aa 61， 丙氨酸扫描后
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 59
Glu Leu Xaa Gly Leu Thr Xaa Glu
1 5
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NI-301.37F1 抗体的表位, aa 41 to aa 45， 丙氨酸扫描后
<400> 60
Trp Glu Pro Phe Ala
1 5
<210> 61
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(375)
<223> NI-301.18C4 VH 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(198)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (295)..(342)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 61
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga acc ttg gtc cag ccg ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Thr Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg agg ctc tcc tgc gca gcg tcg gga ttc aca ttc aac att tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ile Tyr
20 25 30
gcc atg acc tgg gtc cgc ctg tct cca gtg agg gga ctg gag tgg gtc 144
Ala Met Thr Trp Val Arg Leu Ser Pro Val Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tct act att act agt ggt ggc gtc agc ata tat tac gca gac tcc ata 192
Ser Thr Ile Thr Ser Gly Gly Val Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Ile
50 55 60
aag ggc cgc ttc acc gtc tcc aga gac aat gcc aag aac atg gtg ttt 240
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Phe
65 70 75 80
cta caa ctg gac aac ctg aca gtc gat gac acg gcc ata tat tac tgt 288
Leu Gln Leu Asp Asn Leu Thr Val Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
ggg aag gac gga aac tgc gat gag aca agt tgt tac tta agg ggg atg 336
Gly Lys Asp Gly Asn Cys Asp Glu Thr Ser Cys Tyr Leu Arg Gly Met
100 105 110
gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 375
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 62
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Thr Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ile Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Leu Ser Pro Val Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Ser Gly Gly Val Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Ile
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asp Asn Leu Thr Val Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Lys Asp Gly Asn Cys Asp Glu Thr Ser Cys Tyr Leu Arg Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 63
<211> 333
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(333)
<223> NI-301.18C4 VL可变轻链(VL)序列
<220>
<221> V_区
<222> (67)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(171)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (268)..(303)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR3
<400> 63
cag tct gtg ttg acg cag ccg ccc tca gtg tca gcg gcc cca gga cag 48
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
aag gtc acc atc tcc tgc tct ggt agc agg tcc gac att ggg tct aaa 96
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asp Ile Gly Ser Lys
20 25 30
ctt gtt tcc tgg tac cag gta atc cca gga aga gcc ccc cgg ctc gtc 144
Leu Val Ser Trp Tyr Gln Val Ile Pro Gly Arg Ala Pro Arg Leu Val
35 40 45
att ttt gac act tat aag cgg ccc tca ggg gta cct gcc cgc ttc tct 192
Ile Phe Asp Thr Tyr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
gcc tcc aag tct ggc acg tca gcc acc ctg gac atc gcc ggg ctc cag 240
Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Asp Ile Ala Gly Leu Gln
65 70 75 80
cct ggg gac gag gcc gaa tat ttc tgc gga tca tgg ggt aac agt gag 288
Pro Gly Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Gly Ser Trp Gly Asn Ser Glu
85 90 95
aat ttt tat tat gtc ttc gga tct ggg acc cgg gtc acc gtc ctg 333
Asn Phe Tyr Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 64
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asp Ile Gly Ser Lys
20 25 30
Leu Val Ser Trp Tyr Gln Val Ile Pro Gly Arg Ala Pro Arg Leu Val
35 40 45
Ile Phe Asp Thr Tyr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Asp Ile Ala Gly Leu Gln
65 70 75 80
Pro Gly Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Gly Ser Trp Gly Asn Ser Glu
85 90 95
Asn Phe Tyr Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 65
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(354)
<223> NI-301.11A10 可变重链(VH)序列 (PIMC 默认)
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(201)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(321)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 65
cag ctg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acc tgc act gtg tct ggt ggc tcc atc agc agt aga 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Arg
20 25 30
agt tac tac tgg ggc tgg atg cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag 144
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Met Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
tgg att ggg agt att tat tat agt ggg agc acc ctc tac aat ccg tcc 192
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
ctc aag agt cga gtc acc atg tca ata gtc acg tcg agg aac cag ttc 240
Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Ile Val Thr Ser Arg Asn Gln Phe
65 70 75 80
tcc ctg aag ctg agt tct gtg acc gcc gcg gac acg gcc gtg tat tat 288
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
tgt acc cga atg ggg gag ggg ggg cgg gac tac tgg ggc cag gga acc 336
Cys Thr Arg Met Gly Glu Gly Gly Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
ctg gtc acc gtc tcc tcg 354
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 66
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Arg
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Met Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Ile Val Thr Ser Arg Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Thr Arg Met Gly Glu Gly Gly Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> NI-301.11A10可变κ轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (70)..(102)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(168)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (265)..(291)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR3
<400> 67
gac atc cag atg acc cag tct cct tcc acc ctg tct gca tct gta gga 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gcc agt cag agt att agt agt tgg 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
ttg gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag gtc ctg atc 144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
tat gat gcc tcc agt ttg gaa aga ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt ggg tct ggg aca gaa ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
gat gat tct gca act tat tac tgc caa cac tat aat ggt tat tca agg 288
Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Gly Tyr Ser Arg
85 90 95
acg ttc ggc cgc ggg acc aag gtg gaa atc aaa 321
Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 68
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Gly Tyr Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 69
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(372)
<223> NI-301.3C9 可变重链(VH)序列 (PIMC 默认)
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(111)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(201)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(339)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 69
cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag tct tcg cag 48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Ser Ser Gln
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt gcc tcc ttc acc agg ggt 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Phe Thr Arg Gly
20 25 30
gat ttc tac tgg agt tgg atc cgc cag gtc cca ggg aag ggc ctg gaa 144
Asp Phe Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
tgg att ggt tac ata tat tcc act ggg gac gtc tac tac aat ccg tct 192
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Ser Thr Gly Asp Val Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
ctc aag agt cga gca aac atc tcg gtc gac acg ccc aag aag cag ttc 240
Leu Lys Ser Arg Ala Asn Ile Ser Val Asp Thr Pro Lys Lys Gln Phe
65 70 75 80
ttc ctg aaa ttg acc tct ttg act gcc gca gac acg gcc gtc tat ttt 288
Phe Leu Lys Leu Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
85 90 95
tgt gcc agg gaa gga caa tat tgt agc ggt ggt agt tgc tac cct gaa 336
Cys Ala Arg Glu Gly Gln Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Pro Glu
100 105 110
tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 372
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 70
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Ser Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Phe Thr Arg Gly
20 25 30
Asp Phe Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Ser Thr Gly Asp Val Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Ala Asn Ile Ser Val Asp Thr Pro Lys Lys Gln Phe
65 70 75 80
Phe Leu Lys Leu Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Gln Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Pro Glu
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 71
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(318)
<223> NI-301.3C9可变轻链(VL)序列 (PIMC 默认)
<220>
<221> V_区
<222> (67)..(99)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (145)..(165)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (262)..(288)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR3
<400> 71
tcc tat gag ctg act cag cca ccc tca gtg tcc gtg tcc cca gga cag 48
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
aca gcc acc atc acc tgc tct gga gat aat ttg gga cat aaa ttt act 96
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly His Lys Phe Thr
20 25 30
tgc tgg tat cag cag aag cca ggc cag tcc cct gtc ctg gtc atc tat 144
Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
caa gat cac aag cgg ccc tca ggg atc cct gag cga ttc tcc ggc tcc 192
Gln Asp His Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
aac tct ggg gac aca gcc act ctg acc atc agc ggg acc cag gct atg 240
Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
gat gag gct gag tat tac tgt cag gcg tgg gcc ttc ccc tat gtg gtc 288
Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Ala Phe Pro Tyr Val Val
85 90 95
ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 318
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 72
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly His Lys Phe Thr
20 25 30
Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp His Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Ala Phe Pro Tyr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 73
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(372)
<223> NI-301.14D8 可变重链(VH)序列 (非 PIMC)
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(198)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (295)..(339)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 73
gag gtg cag ctg gtg gag act ggg gga cgc ttg gtc cag ccg ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc gtg aga ctc tcc tgt ata gcc tct gga ttt ccc ttt agg aat tat 96
Ser Val Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
tgg atg agt tgg gtc cgc cag cct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtg 144
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcc aac ata aag gaa gat ggc agt gac aga tac tat gtg gac tct gtg 192
Ala Asn Ile Lys Glu Asp Gly Ser Asp Arg Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cgc ttc acc atc ttt aga gac aac gcc aag aat ttt ctg agt 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ala Lys Asn Phe Leu Ser
65 70 75 80
cta caa atg aat cgc ctg aga gcc gag gac acg gcg gta tac ttc tgt 288
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
gcg aga att gta ggg gta atc ccg tcc gct gac cca tac tac ctt gac 336
Ala Arg Ile Val Gly Val Ile Pro Ser Ala Asp Pro Tyr Tyr Leu Asp
100 105 110
tcc tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 372
Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 74
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Glu Asp Gly Ser Asp Arg Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ala Lys Asn Phe Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Val Gly Val Ile Pro Ser Ala Asp Pro Tyr Tyr Leu Asp
100 105 110
Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 75
<211> 330
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(330)
<223> NI-301.14D8可变轻链(VL)序列 (PIMC 默认)
<220>
<221> V_区
<222> (67)..(108)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(174)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (271)..(300)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR3
<400> 75
cag tct gcc ctg act cag cct gcc tcc gtg tct ggg ttt gct gga cag 48
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Phe Ala Gly Gln
1 5 10 15
tcg gtc acc atc tcc tgc act gga acc agc ctt aac att ggg act tac 96
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Leu Asn Ile Gly Thr Tyr
20 25 30
aac ctt atc tcc tgg tac caa caa cac cca ggc aga gcc ccc aga ctc 144
Asn Leu Ile Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Arg Ala Pro Arg Leu
35 40 45
atc att ttt gag ggc aat agg cgg ccc ccc ggg att tct aat cgc ttc 192
Ile Ile Phe Glu Gly Asn Arg Arg Pro Pro Gly Ile Ser Asn Arg Phe
50 55 60
tct gcc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ttg aca gtc tct ggg ctg 240
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
ctg gct ggc gac gag gct gat tat tac tgt tgc tca ttt gca gga aga 288
Leu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Phe Ala Gly Arg
85 90 95
gtc tct ttg gtg ttt ggc gga ggg acc aag ttg acc gtc cta 330
Val Ser Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 76
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Phe Ala Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Leu Asn Ile Gly Thr Tyr
20 25 30
Asn Leu Ile Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Arg Ala Pro Arg Leu
35 40 45
Ile Ile Phe Glu Gly Asn Arg Arg Pro Pro Gly Ile Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Leu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Phe Ala Gly Arg
85 90 95
Val Ser Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 77
<211> 348
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(348)
<223> NI-301.9X4 可变重链(VH)序列 (PIMC 默认)
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(195)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (292)..(315)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 77
cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aaa cct tcg gag 48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acc tgc agt gtc tct gct ggc tcc atc agt agt cac 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Ala Gly Ser Ile Ser Ser His
20 25 30
tac tgg aac tgg atc cgg cag ccc cca ggg aag gga ctg gaa tgg att 144
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
ggg tct atc tat cac agt ggg agc acc aac tac aac ccc tcc ctc aag 192
Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cac gtc tcc ctg 240
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Val Ser Leu
65 70 75 80
agg ttg acg tct gtg acc gcc gca gac acg gcc gtg tat tac tgt gcg 288
Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
aga gac tac tac tac tac atg gac gtc tgg ggc aaa ggg acc acg gtc 336
Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val
100 105 110
acc gtc tcc tcg 348
Thr Val Ser Ser
115
<210> 78
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Ala Gly Ser Ile Ser Ser His
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Val Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 79
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<223> NI-301.9X4可变轻链(VL)序列 (PIMC 默认)
<220>
<221> V_区
<222> (67)..(99)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (145)..(165)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (262)..(294)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR3
<400> 79
tcc tat gag ctg act cag cca ccc tcg gtg tca gtg tcc cca gga cag 48
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
acg gcc agg atc acc tgc tct gga gat gcg ttg cca gac aag tat gct 96
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Asp Lys Tyr Ala
20 25 30
tat tgg tac cag cag aag cca ggc cag gcc cct atg ttg gtt ata tat 144
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Met Leu Val Ile Tyr
35 40 45
aag gac agt gag agg ccc tca ggg atc cct gag cga ttc tct ggc tcc 192
Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
agt ttg ggg aca aca gtc atg ctg acc atc agt gga gtc cag gca gag 240
Ser Leu Gly Thr Thr Val Met Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
gac gag gct gac tat tac tgt aaa tca gca gac agc agt ggt act tat 288
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Ala Asp Ser Ser Gly Thr Tyr
85 90 95
tgg gtg ttc ggc ggg ggg acc aag ctg acc gtc cta 324
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 80
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 80
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Asp Lys Tyr Ala
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Met Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Thr Val Met Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Ala Asp Ser Ser Gly Thr Tyr
85 90 95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 81
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(363)
<223> NI-301.14C3 可变重链(VH)序列 (PIMC 默认)
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(195)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (292)..(330)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 81
gag gtg cag ctg gtg gag act gga gga ggc ttg atc cag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct ggg ttc acc gtc agt agc cac 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser His
20 25 30
tac atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tca att att tat agc ggt ggt ggc aca tac tac gca gac tcc gtg aag 192
Ser Ile Ile Tyr Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat ctt 240
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gcc gtg tat tac tgt gcg 288
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
aag atc tac agg tcg ggt aat act ggt tat tct tac gac tac tgg ggc 336
Lys Ile Tyr Arg Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 82
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser His
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile Tyr Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Ile Tyr Arg Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 83
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<223> NI-301.14C3可变轻链(VL)序列
<220>
<221> V_区
<222> (67)..(99)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (145)..(165)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (262)..(294)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR3
<400> 83
tcc tat gag ctg act cag cca ccc tca gtg tcc gtg tcc cca ggg cag 48
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
aca gcc agc atc acc tgc tct gga gat aaa ttg ggg agt aaa tat gct 96
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Ser Lys Tyr Ala
20 25 30
tgc tgg tat cag cag aag cca ggc cag tcc cct gta ctg gtc atc tat 144
Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
gaa gat aag aag cgg ccc tca ggg atc cct gag cga ttc tct ggc tcc 192
Glu Asp Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
aac tct ggg aac aca gcc act ctg acc atc agc ggg acc cag gct atg 240
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
gat gag gct gac tat ttc tgt cag gcg tgg gac agc agc act tct cat 288
Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ser His
85 90 95
gtg gta ttc ggc gga ggg acc agg ctg acc gtc cta 324
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 84
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Ser Lys Tyr Ala
20 25 30
Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Glu Asp Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ser His
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 85
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在表位作图中被NI-301.59F1识别的肽序列
-点15
<400> 85
Gly Leu Thr Thr Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val
1 5 10 15
<210> 86
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在表位作图中被NI-301.59F1识别的肽序列
-点16
<400> 86
Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr
1 5 10 15
<210> 87
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在表位作图中被NI-301.35G11识别的肽序列
-点13
<400> 87
Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Glu
1 5 10 15
<210> 88
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在表位作图中被NI-301.35G11识别的肽序列
-点14
<400> 88
Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly
1 5 10 15
<210> 89
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在表位作图中被NI-301.37F1识别的肽序列
-点9
<400> 89
Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly
1 5 10 15
<210> 90
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在表位作图中被NI-301.37F1识别的肽序列
-点10
<400> 90
Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu
1 5 10 15
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在表位作图中被NI-301.37F1识别的肽序列
-点11
<400> 91
Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu
1 5 10 15

Claims (36)

1.一种人源抗转甲状腺素蛋白(TTR)抗体或其抗原结合片段。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中至少互补性决定区(CDR)和/或可变区是被来源于从人记忆B细胞中获得的mRNA的cDNA编码的，所述人记忆B细胞产生抗转甲状腺素蛋白抗体。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，所述抗体能够结合突变的、错误折叠的、错误装配的和/或聚集的转甲状腺素蛋白类型或其片段，而基本上不识别生理性转甲状腺素蛋白类型。
4.根据权利要求1至3的任一项所述的抗体，其中所述抗体能够结合
(i)包含氨基酸序列EEEFVEGIY(SEQ ID NO：49)、GELHGLTTEEE(SEQ ID NO：50)、或WEPFA(SEQ ID NO：51)的或由氨基酸序列EEEFVEGIY(SEQ ID NO：49)、GELHGLTTEEE(SEQ IDNO：50)、或WEPFA(SEQ ID NO：51)组成的转甲状腺素蛋白表位，和/或
(ii)非线性的、构象的表位。
5.根据权利要求4所述的抗体，其中所述抗体结合转甲状腺素蛋白表位
(i)GELHGLTTEEE(SEQ ID NO：50)而非相应的L55P突变体的表位或
(ii)WEPFA(SEQ ID NO：51)而非相应的E42G突变体。
6.根据权利要求1至5的任一项所述的抗体或转甲状腺素蛋白结合分子，在其可变区或结合结构域包含
(a)在图1A到1T的任一个中描述的VH和/或VL可变区氨基酸序列的至少一个互补决定区(CDR)；
(b)在图1A到1T的任一个中描述的VH和/或VL区的氨基酸序列；
(c)由(a)的氨基酸序列的任一个的部分改变产生的氨基酸序列构成的至少一个互补决定区；或
(d)包含由(b)的氨基酸序列的部分改变产生的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段进一步包含对于所述VH和/或VL区或者所述至少一个互补决定区是异源的多肽序列，优选其中多肽序列包括恒定结构域。
8.根据权利要求7所述的抗体，其中所述恒定结构域是人恒定结构域，优选IgG型的人恒定结构域，最优选是IgG1类或同型的人恒定结构域。
9.一种抗转甲状腺素蛋白抗体或转甲状腺素蛋白结合分子，其结合到与权利要求6所述的抗体相同的表位。
10.根据权利要求5至9的任一项所述的抗体，其是嵌合鼠-人或鼠源性的抗体。
11.根据权利要求1至10的任一项所述的抗体，其是选自由单链Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段、和F(ab')2片段组成的组的抗体片段。
12.一种编码权利要求1至11的任一项所述的抗体的多核苷酸，优选其中所述多核苷酸是cDNA。
13.一种包含权利要求12所述的多核苷酸的载体。
14.一种包含权利要求12所述的多核苷酸或权利要求13所述的载体的宿主细胞。
15.一种使用权利要求12所述的多核苷酸、权利要求13所述的载体、或权利要求14所述的宿主细胞来产生抗转甲状腺素蛋白抗体的应用。
16.一种用于制备抗转甲状腺素蛋白抗体或其生物技术衍生物的方法，所述方法包括
(a)培养权利要求14所述的细胞；和
(b)从培养物分离所述抗体。
17.一种由权利要求12所述的多核苷酸编码的或能够由权利要求16所述的方法获得的抗体。
18.根据权利要求1至11或17中任一项所述的抗体，其
(i)包含可检测的标记物，优选其中所述可检测的标记物选自由酶、放射性同位素、荧光团和重金属组成的组；和/或
(ⅱ)被连接到药物。
19.一种具有被权利要求1至11、17或18中任一项所述的抗体特异性识别的转甲状腺素蛋白的表位的肽，优选其中所述肽包含如权利要求4中所定义的氨基酸序列或其修饰的序列，其中一个或多个氨基酸被取代、缺失和/或添加，其中所述肽被权利要求4至6中任一项所述的抗体识别，优选其中所述肽是抗原。
20.一种包含权利要求1至11、17或18中任一项所述的抗体、权利要求12所述的多核苷酸、权利要求13所述的载体、权利要求14所述的细胞或权利要求19所述的肽的组合物，优选其中所述组合物
(i)是药用组合物，并且还包含药学可接受的载体，优选其中所述组合物是疫苗和/或包括用于预防或治疗与转甲状腺素蛋白淀粉样变性相关的疾病的附加药剂；或者
(ii)诊断组合物，优选进一步包含在免疫或基于核酸的诊断方法中常规使用的试剂。
21.一种根据权利要求1至11、17或18中任一项所述的具有其任一基本相同的结合特异性的抗转甲状腺素蛋白抗体或转甲状腺素蛋白结合片段，权利要求12所述的多核苷酸，权利要求13所述的载体，权利要求14所述的细胞，权利要求19所述的肽或权利要求20所述的组合物，用于与转甲状腺素蛋白淀粉样变性相关的疾病的预防性或治疗性治疗，优选其中所述疾病选自由以下组成的组：家族性淀粉样多发性神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)、老年性系统性淀粉样变性(SSA)、全身家族性淀粉样变性、软脑膜/中枢神经系统(CNS)的淀粉样变，包括阿尔茨海默病、转甲状腺素蛋白相关的眼部淀粉样变性、转甲状腺素蛋白相关的肾淀粉样变、转甲状腺素蛋白相关高甲状腺素血症、转甲状腺素蛋白相关的韧带淀粉样变性病，包括腕管综合症、肩袖撕裂和腰椎椎管狭窄、以及先兆子痫。
22.一种转甲状腺素蛋白结合分子，其包含权利要求1至11、17或18中的任一项所述的抗体的至少一个互补决定区，用于体内检测或体内成像人体或动物体内的转甲状腺素蛋白或者将治疗和/或诊断药剂靶向于人体或动物体内的转甲状腺素蛋白，优选其中所述体内成像所述包括显像、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射断层摄影(SPECT)、近红外(NIR)、光学成像或磁共振成像(MRI)。
23.一种用于诊断与转甲状腺素蛋白淀粉样变性有关的疾病的体外方法，包括在受试者的生物样品内确定结合至权利要求19所述肽的抗体的存在的步骤。
24.一种在与转甲状腺素蛋白淀粉样变性相关的疾病的诊断或监测中有用的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种权利要求1至11、17或18中任一项所述的抗体或具有其任一的基本相同的结合特异性的转甲状腺素蛋白结合分子、权利要求12所述的多核苷酸、权利要求13所述的载体或权利要求14所述的细胞和/或权利要求19所述的肽，任选地与试剂和/或使用说明一起使用。
25.一种用抗转甲状腺素蛋白抗体诊断如权利要求21中所限定的与转甲状腺素蛋白淀粉样变性相关的疾病、监测所述疾病的治疗、或确定抗转甲状腺素蛋白抗体的诊断或治疗效用的方法，包括将抗转甲状腺素蛋白抗体给药给受试者后测定从所述受试者获得的体液的样品中错误折叠的和/或聚集的转甲状腺素蛋白的水平，其中与对照相比，受试者样品中错误折叠和/或聚集的转甲状腺素蛋白的存在或水平的升高表明与转甲状腺素蛋白淀粉样变性相关的疾病。
26.根据权利要求25所述的方法，其中通过确定抗转甲状腺素蛋白抗体和错误折叠和/或聚集的转甲状腺素蛋白之间形成的复合物来测定样品中错误折叠和/或聚集的转甲状腺素蛋白的水平。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述对照是从施用抗转甲状腺素蛋白抗体之前的受试者得到的样品。
28.根据权利要求25至27中的任一项所述的方法，其中所述体液是血液，并且所述样品是其衍生的和/或所述对照是从施用抗转甲状腺素蛋白抗体之前的受试者得到的体液的对应样品。
29.根据权利要求25至28中的任一项所述的方法，其中所述受试者是非人动物或人。
30.根据权利要求25至30中的任一项所述的方法，其中来自受试者的样品是在给药后特定时间间隔获得的。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述时间间隔小于一周，优选小于或等于48小时。
32.根据权利要求25至31中的任一项所述的方法，其中所述抗转甲状腺素蛋白抗体是权利要求1至11、17或18中任一项所述的抗转甲状腺素蛋白抗体或抗原结合片段。
33.一种抗转甲状腺素蛋白抗体在权利要求25至32中任一项所述的方法中的应用，优选其中所述抗体是权利要求1至11、17或18中任一项所述的抗转甲状腺素蛋白抗体或抗原结合片段。
34.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与至少一种具有图1A到T的任一个中描述的VH和VL区的参考抗体竞争结合转甲状腺素蛋白。
35.根据权利要求34所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与所述参考抗体竞争特异性结合错误折叠的、错误装配的和/或聚集的转甲状腺素蛋白类型或其片段。
36.根据权利要求34或35所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段竞争性抑制至少50％的所述参考抗体与转甲状腺素蛋白的结合。
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