CN108064248B - 人源抗二肽重复(dpr)抗体 - Google Patents

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Abstract

提供的是新的人源二肽重复(DPR)特异性抗体及其合成变体和生物技术衍生物，其优选地能够结合C9ORF72 DPR，以及与其相关的方法。还公开了与对DPR和DPR蛋白如C9ORF72 DPR特异性的抗体相关的测定法、试剂盒和固体支持物。可以在用于DPR蛋白靶向的免疫治疗和诊断的药物组合物和诊断组合物中使用本发明的抗体。

Description

人源抗二肽重复(DPR)抗体
技术领域
本发明总体涉及基于抗体的治疗和诊断方法。特别地，本发明涉及与非常规非ATG翻译特别是六核苷酸重复形成的二肽重复(DPR)和包括这种DPR的抗原特异性结合的新型分子，其可用于诊断分别由聚集的DPR和含有DPR的蛋白质所诱导的疾病和病症。在一种实施方式中，本发明提供了人源抗体以及其片段、衍生物和生物技术变体，它们识别如在染色体9开放阅读框72(C9ORF72)中发现的DPR(诸如聚-甘氨酸-丙氨酸重复、聚-甘氨酸-脯氨酸重复、聚-甘氨酸-精氨酸重复、聚-脯氨酸-丙氨酸重复或聚脯氨酸-精氨酸重复)，并且其可用于治疗和诊断由聚集的C9ORF72-DPR所诱导的疾病和病症。此外，本发明涉及包括这样的结合分子、抗体和其模拟物的药物组合物和诊断组合物，其用作鉴定与DPR或其聚集体相关的疾病的诊断工具以及还用作用于治疗这样的疾病(例如额颞叶变性(FTLD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、FTLD-ALS和脊髓小脑性共济失调36型)的被动疫苗接种策略都是有价值的。
背景技术
额颞叶变性(FTLD)属于与脑的额叶和颞叶中的萎缩相关的一组临床、病理和遗传学上异质的病症。这是痴呆早发的第二个最常见原因。认知症状是可变的并且包括痴呆、行为以及个性的改变、语言功能障碍和/或精神病同时是由于额皮层和颞皮层的退化。由于其症状，FTLD可以被分为三组：(i)行为变异型额颞叶痴呆(bvFTLD)、(ii)语义性痴呆(SD)或(iii)进行性非流利性失语(PNFA)。因为没有合适的治疗可用，因此患有FTLD的患者在症状发作后5-10年死亡。然而，50％的FTLD患者显示出具有阳性家族史，并且与肌萎缩侧索硬化(ALS)相比似乎代表具有共同的潜在发病机理的疾病连续体。尽管两种常染色体显性疾病都显示出在遗传上和病理上异质性，参见例如，Vance等人,Brain 129(2006),868-876，但是遗传分析鉴定了作为FTLD和ALS的最常见遗传原因的位于C9ORF72基因的非编码外显子1a和1b之间的杂合扩增的六核苷酸重复(GGGGCC)；参见例如，DeJesus-Hernandez等人,Neuron 72(2011),245-256和Renton等人,Neuron 72(2011),257-268。特别地，表明在三个交替阅读框中的正义转录本的(即扩增的六核苷酸重复的)非常规非ATG翻译，导致三种不同多肽的产生、生成和聚集，每种多肽由两种氨基酸的重复单元(二肽重复，DPR)(即聚-(甘氨酸-丙氨酸；GA)、聚-(甘氨酸-脯氨酸；GP)和聚-(甘氨酸-精氨酸；GR))组成。此外，相应的反义转录本的翻译导致聚-(脯氨酸-精氨酸；PR)、聚-(脯氨酸-丙氨酸；PA)和聚-(甘氨酸-脯氨酸；GP)的产生。显示出这些C9ORF72-二肽重复(DPR)扩增占在美国和欧洲白种人群体中所观察到的具有最高突变频率的高达30％的FTLD、50％的ALS和80％的FTLD-ALS患者。此外，与患有其他形式的FTLD和/或ALS的患者相比，患有超过19个重复的C9ORF72-DPR扩增的患者具有较低的发病年龄、增加的神经病症的发生率和倾向于精神病或幻觉；参见例如，Harms等人,Neurobiol.Aging 34(2013),e13-e19。
然而，还已经报道了似乎与六核苷酸重复扩增相关的其他疾病和/或病症，例如脊髓小脑性共济失调36型。实际上，这样的串联重复(作为微卫星或小卫星)是在真核生物和原核生物中的易发生突变的DNA。例如，细菌的细胞表面粘附素通常包含小卫星SD重复，其编码具有18个核苷酸重复阵列的丝氨酸-天冬氨酸的氨基酸对，其元件特别是在葡萄球菌菌株中遵循共有GAYTCNGAYTCN GAYAGY，其中N是任何碱基以及Y是T或C。已经发现丝氨酸-天冬氨酸重复(SDR)存在于这些粘附素的可变重复区域中，诸如聚集因子A(ClfA)的R结构域；参见例如，Hazenbos等人,PLOS Pathogens 9(2013),e1003653。
与二肽重复(DPR)扩增相关的疾病和/或病症的治疗(例如减缓疾病进展的药物)是找不到的。迄今为止医疗护理的主要焦点在于提供用于治疗经常非常有压力的伴随症状的药物。然而，迄今为止还不存在用于有效治疗的证据。
该技术问题通过在权利要求中表征的且在下文进一步描述的并且在实施例和附图中说明的实施方式来解决。
发明内容
本发明提供了能够结合二肽重复(DPR)和含有DPR的蛋白质(DPR蛋白质)的人源单克隆抗体以及等效的DPR蛋白结合分子(诸如本文所示例的抗体的DPR结合片段、合成变体和生物技术衍生物)，它们在与DPR蛋白及其聚集形式相关的疾病和病症的预防性或治疗性治疗中是特别有用的。更具体地，提供了治疗上有用的人源抗体和等效的DPR蛋白结合分子，它们识别由聚-甘氨酸-丙氨酸(甘氨酸-丙氨酸；GA)、聚-甘氨酸-脯氨酸(甘氨酸-脯氨酸；GP)、聚-甘氨酸-精氨酸(甘氨酸-精氨酸；GR)、聚-脯氨酸-精氨酸(脯氨酸-精氨酸；PR)或聚-脯氨酸-丙氨酸(脯氨酸-丙氨酸；PA)组成的DPR、包括这些DPR的重复和蛋白质。
根据本发明进行的实验在人源单克隆抗DPR特异性抗体的分离中是成功的，该人源单克隆抗DPR特异性抗体在人体中成熟并且能够特异性地识别非聚集的和聚集的C9ORF72-DPR蛋白质种类及其片段。成为B细胞来源的人类受试者没有神经病学和神经变性病症的症状，从该B细胞已经分别分离了人源单克隆抗DPR蛋白抗体和编码它们的可变结构域的cDNA。然而，在本发明的另一实施方式中，B细胞的来源是显示与DPR蛋白相关的疾病和/或病症的症状的患者，从该B细胞中可以分别分离人源单克隆抗DPR抗体和编码它们的可变结构域的cDNA。由于本发明的抗体是从人体分离的并且如实例中所证实的，显示出特异性地结合至FTLD患者中的DPR蛋白，因此明智地预期本发明的人单克隆抗DPR蛋白抗体及其衍生物除了是非免疫原性的以外，在人类中还表现出治疗上有益的效果。
额颞痴呆(FTD)，也称为皮克氏病，是与脑的额叶和/或颞叶中的进行性神经细胞变性相关的一组疾病(障碍)。与由于细胞损伤和组织收缩而导致的脑功能降低相关的症状被称为额颞叶变性(FTLD)。如在其公开内容已经并入本文的背景技术部分中已经解释的，位于C9ORF72(NC_000009.12,27546545-27573866，互补；NG_031977.1,5001-32322RefSeqGene)的非编码外显子1a和1b之间的杂合扩增的六核苷酸重复(GGGGCC)(即二肽重复(DPR))被鉴定为FTLD和肌萎缩性侧索硬化(ALS)的最常见原因。扩增的六核苷酸重复导致由两种氨基酸的重复单元(二肽重复，DPR)(特别是聚-(甘氨酸-丙氨酸；GA)、聚-(甘氨酸-脯氨酸；GP)、聚-(脯氨酸-精氨酸；PR)或聚-(脯氨酸-丙氨酸,PA)和/或聚-(甘氨酸-精氨酸；GR))组成的不同多肽的产生、生成和/或聚集。
本发明一般涉及能够特异性地识别DPR蛋白的人源抗体、抗原结合片段、其合成变体和生物技术变体以及等效的抗原结合分子，所述DPR蛋白特别是其中DPR由聚-(甘氨酸-丙氨酸；GA)、聚-(甘氨酸-脯氨酸；GP)、聚-(脯氨酸-精氨酸；PR)、聚-(脯氨酸-丙氨酸,PA)和/或聚-(甘氨酸-精氨酸；GR)组成的那些蛋白质。因此，本发明涉及选择性地识别一种特定二肽重复(例如聚-GA)的抗体以及能够识别多于一种二肽重复(例如聚-GA和聚-GP或聚-GR、聚-GA和聚-PR)的抗体二者，它们具有基本上相同或不同的亲和力但仍显著高于背景。如果没有另外指明，则所谓的“特异性地识别DPR”、“针对/对于DPR特异性的抗体”和“抗DPR抗体”的抗体是指其特异性地、通常地和共同地结合到在本文中可互换使用的“DPR蛋白”、“二肽重复”、“DPR”的天然或聚集形式。DPR是扩增的六核苷酸重复的结果，并且包含两种氨基酸的重复单元。重复单元可以包含任何氨基酸。然而，在本发明的优选实施方式中，DPR包含甘氨酸和丙氨酸(甘氨酸-丙氨酸；GA)、甘氨酸和脯氨酸(甘氨酸-脯氨酸；GP)、甘氨酸和精氨酸(甘氨酸-精氨酸；GR)、脯氨酸和精氨酸(脯氨酸-精氨酸；PR)或脯氨酸和丙氨酸(脯氨酸-丙氨酸,PA)。因此，本文提供的是对由GA、GP、GR、PR或PA组成的DPR蛋白具有选择性的人源抗体、蛋白结合片段、其合成变体和生物技术变体。在优选的实施方式中，本发明的DPR结合分子结合到含有更高数目重复的DPR蛋白，即由(GA)X、(GP)X、(GR)X、(PR)X或(PA)X组成的DPR。特别地，X表示重复的数目，例如将具有15个重复的DPR蛋白表示为(GA)15，也意味着例如六核苷酸扩增G4C2被重复15次。在本发明的一种实施方式中，抗体优选地识别(GA)15的DPR蛋白。
通常，使用结合到载体蛋白(诸如BSA或GST)的DPR肽来评估抗体结合DPR蛋白的能力；参见例如，Mori等人,Science 339(2013),1335-1338和Mackenzie等人,ActaNeuropathol.126(2013),859-879尤其是描述了重组GST-GA15蛋白在生成和表征小鼠单克隆抗GA抗体中的用途。然而，根据本发明进行的实验令人惊讶地揭示，一些缺乏与BSA偶联的DPR肽的显著结合或仅显示相当低的亲和力的抗DPR抗体结合未偶联的DPR肽，并且是以比BSA偶联的DPR肽实质上更高的亲和力；比较，例如，图3A中概括的抗聚GA抗体NI-308.45C2、抗聚PR抗体NI-308.24E11以及特别是抗聚GR抗体NI-308.6B11和NI-308.46F8的EC50值，这些抗体根本不结合至BSA偶联的(GR)15肽并且因此在用于生成小鼠单克隆抗DPR抗体的现有技术中使用的ELISA方法中很可能被错过。
例如，国际申请WO 2014/114303A1和WO 2014/114660A1分别描述了在兔中针对与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合的聚-GA(GA)15和聚-GP(GP)15所产生的多克隆抗体和针对与聚乙二醇(PEG)连接的聚集的聚GA(GA)10所产生的并识别与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合的聚GA(GA)15的小鼠单克隆抗体。然而，没有公开关于对无关淀粉样蛋白的结合特异性和与人C9orf72-FTLD脑组织中病理性DPR聚集体的结合的数据。因此，这些抗体的诊断效用和治疗效用尚未得到证实并且仍有待观察。
国际申请WO 2014/116865A1描述了在兔中针对各自偶联到氨基己酸(Ahx)并缀合到作为免疫载体的3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)(MBS)的聚-GA(GA)8、聚-GP(GP)8和聚-GR(GR)8的混合物所产生的多克隆抗体的生成。将一种称为MC-001的多克隆兔抗体描述为结合聚-GP(GP)8而不结合其他DPR。将多克隆MC-001抗体描述为检测C9+ALS患者的脑脊液(CSF)中的免疫反应性和具有C9ORF72遗传扩增的患者的脑中的聚-GP多肽的不溶性包涵体(inclusion)。此外，描述了使用具有不同重复数的个体DPR肽和免疫载体分别在兔和山羊中生成多克隆抗聚-GA、聚-GP、聚-GR和聚-PA抗体的尝试以及一个使用用于生成多克隆MC-001抗体的方法来产生小鼠单克隆抗聚-GP抗体的实验。然而，尽管描述了已获得仅结合聚-GP(GP)8的三种单克隆抗体克隆G2、G3和G4，但没有公开关于对无关淀粉样蛋白结合特异性和与人C9orf72-FTLD脑组织中病理性DPR聚集体的结合的数据。此外，除了产生单克隆抗体的方案的隐蔽描述之外，没有提供关于抗体可变区的序列信息或抗体的保藏。因此，同样这里的通过WO 2014/116865A1中教导的免疫方案可获得的单克隆抗体的诊断效用和治疗效用仍有待研究。
国际申请WO 2014/159247 A1描述了针对具有不同重复数和N端修饰和/或C端修饰(例如乙酰化和酰胺化)的合成DPR肽已经产生的多克隆兔和小鼠抗体。然而，没有描述单克隆抗DPR抗体的生成。此外，WO 2014/159247 A1尤其描述了C9ORF72ALS的转基因小鼠模型，以检验正义转录本和反义转录本均有助于ALS/FTD的假说。根据本发明，该小鼠模型可被用于检验本发明的抗体的治疗效用。
总之，现有技术没有教导或暗示更不用说提供如下的抗DPR抗体：其选择性地结合一种或多种源自C9orf72基因的不同阅读框的DPR，其能够结合人C9orf72-FTLD脑组织中的病理性DPR聚集体并且在诊断和治疗与DPR蛋白的积累和聚集相关的疾患中(诸如ALS/FTD中)都具有实用性。相比之下，本发明第一次提供了来自人记忆B细胞的一组单克隆人源抗DPR抗体，其特异性地识别一种或多种如从C9orf72基因在其正义和/或反义方向上翻译的DPR。如实施例中所证明的，本发明的单克隆人源抗DPR抗体具有高亲和力，其基本上不识别不相关的淀粉样蛋白并且能够结合到人C9orf72-FTLD脑组织中的病理性DPR聚集体。
因此，鉴于本发明的抗DPR抗体来源于人类自身抗体并且因此被认为在人类中基本上是非免疫原性的事实，谨慎地预期除了它们在实施例中所示的诊断价值之外它们还具有治疗效用。在这种背景下，必须注意的是，现有技术没有提及针对DPR蛋白的人类自身抗体的可能存在，而是教导了仅用合成的DPR肽和修饰的DPR肽对实验室动物进行免疫，并且注意的是，因为常见的免疫方法失败以及仅用PEG缀合的聚GA(GA)10肽免疫产生稳定的抗体克隆，所以小鼠单克隆抗-DPR抗体的生成是相当困难的；参见例如，国际申请WO2014/114660A1的实施例10中第80页第5行至第15行。因此，这使得本发明的发现，即人源抗DPR抗体的提供更加令人惊讶，因为提供本发明抗体的来源的记忆B细胞当然获自未免疫的人类患者/志愿者。
因此，本发明总体上涉及以下实施方式：
[1]能够结合二肽(XX')重复(DPR)的人源单克隆抗体或其DPR结合片段、合成变体或生物技术衍生物，它们识别至少一种如从染色体9开放阅读框72(C9orf72)基因在其正义和/或反义方向上所翻译的DPR，优选地其中抗体的一个或优选两个可变轻链和重链的至少一个CDR、优选两个CDR和最优选所有三个CDR来源于如由人记忆B细胞所表达的人抗体(人自身抗体)。优选地，抗体识别至少两种不同的DPR，优选地至少一种如从C9orf72基因在其正义方向上所翻译的DPR和至少一种如从C9orf72基因在其反义方向上所翻译的DPR；参见例如，实施例和图2A中的表中所示的受试抗体NI-308.6B11。为了清楚起见，应当理解，除非另有说明，否则在以下项目中仅提及抗体是为了简明的目的，并且当然包括抗体的所提及的DPR结合片段、合成变体和生物技术衍生物。
[2][1]的抗体，其中DPR包含在蛋白中或与蛋白缀合(DPR-蛋白)，优选地其中蛋白是牛血清白蛋白(BSA)并与DPR缀合。
[3][1]或[2]的抗体，其中DPR由聚-甘氨酸-丙氨酸(甘氨酸-丙氨酸；GA)、聚-甘氨酸-脯氨酸(甘氨酸-脯氨酸；GP)、聚-(甘氨酸-精氨酸；GR)、聚-(脯氨酸-精氨酸；PR)和/或聚-(脯氨酸-丙氨酸,PA)重复组成，优选地其中重复数为(XX')15。
[4][1]至[3]中任一项的抗体，该抗体识别DPR蛋白的组合，优选地其中DPR蛋白包括聚-(GA)或聚-(PA)、聚-(GP)或聚-(PA)或者聚-(GR)或聚-(PR)，优选地其中抗体识别聚-(GA)和聚(GP)；聚-(GA)和聚-(GR)；聚-(PA)和聚-(GA)；聚-(GA)、聚-(GR)和可选地聚-(PR)；聚-(PA)、聚-(PR)和可选地聚-(GR)；或聚-(PA)、聚-(GR)、聚-(PR)和可选地聚-(GA)。
[5][1]至[4]中任一项的抗体，其中所述抗体能够结合由(XX')15组成的DPR肽，可选地其中所述抗体不结合或至少极小地结合至偶联于BSA或另一载体蛋白(诸如壳多糖结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或谷胱甘肽-S转移酶(GST))的肽。
[6][1]至[5]中任一项的抗体，该抗体能够分别结合DPR和DPR蛋白的聚集形式。
[7][1]至[6]中任一项的抗体，其中DPR-蛋白为C9ORF72-DPR。
[8][1]至[7]中任一项的抗体，该抗体识别包含GA重复的DPR，在其可变区中包括：
(a)在图1A-1D中的任一个中所示出的并且分别在下述序列中所描述的抗体NI-308.18F7、NI-308.15O7、NI-308.28G1和NI-308.45C2中的任一种的VH和/或VL可变区氨基酸序列的至少一个互补决定区(CDR)，
(i)VH序列(SEQ ID NOs：2、8、22、26、30、34)；以及
(ii)VL序列(SEQ ID NOs：4、6、10、12、24、28、32、36)；
(b)如在图1A至1D中的任一个中所描述的VH和/或VL区的氨基酸序列；
(c)包括从(a)的氨基酸序列中的任一个的部分改变所得到的氨基酸序列的至少一个CDR；
(d)包括从(b)的氨基酸序列的部分改变所得到的氨基酸序列的重链和/或轻可变区；和/或
(e)所述抗体或其抗原结合片段可选地还包括与VH和/或VL区或者至少一个CDR异源的多肽序列，优选地其中多肽序列包括优选为IgG类型、最优选为IgG1类或同种型的人恒定域。
[9][1]至[7]中任一项的抗体，该抗体识别包括GP重复的DPR，在其可变区中包括：
(a)在图1F、1G和1K中所示出的并且分别在下述序列中所描述的抗体NI-308.5G2、NI-308.46E9和NI.308-12A3中的任一种的VH和/或VL可变区氨基酸序列的至少一个互补决定区(CDR)，
(i)VH序列(SEQ ID NOs：14、18、44、48、72、76)；以及
(ii)VL序列(SEQ ID NOs：16、20、46、50、74、78)；
(b)如在图1F、1G或1K中所描述的VH和/或VL区的氨基酸序列；
(c)包括从(a)的氨基酸序列中的任一种的部分改变所得到的氨基酸序列的至少一个CDR；
(d)包括从(b)的氨基酸序列的部分改变所得到的氨基酸序列的重链和/或轻可变区；和/或
(e)抗体或其抗原结合片段可选地还包括与VH和/或VL区或者至少一个CDR异源的多肽序列，优选地其中多肽序列包括优选IgG类型、最优选IgG1类或同种型的人恒定域。
[10][1]至[7]中任一项的抗体，该抗体识别包括GR重复的DPR，在其可变区中包括：
(a)在图1H和1I中所示出的并且分别在下述序列中所描述的抗体NI-308.6B11或NI-308.46F8的VH和/或VL可变区氨基酸序列的至少一个互补决定区(CDR)，
(i)VH序列(SEQ ID NOs：52、56、58、62)；以及
(ii)VL序列(SEQ ID NOs：54、60)；
(b)如在图1H或1I中所描述的VH和/或VL区的氨基酸序列；
(c)包括从(a)的氨基酸序列中的任一种的部分改变所得到的氨基酸序列的至少一个CDR；
(d)包括从(b)的氨基酸序列的部分改变所得到的氨基酸序列的重链和/或轻可变区；和/或
(e)抗体或其抗原结合片段可选地还包括与VH和/或VL区或者至少一个CDR异源的多肽序列，优选地其中，多肽序列包括优选为IgG类型、最优选为IgG1类或同种型的人恒定域。
[11][1]至[7]中任一项的抗体，该抗体识别包含PR重复的DPR，在其可变区中包括：
(a)在图1E中所示出的并且分别在下述序列中所描述的抗体NI-308.24E11的VH和/或VL可变区氨基酸序列的至少一个互补决定区(CDR)，
(i)VH序列(SEQ ID NOs：38)；以及
(ii)VL序列(SEQ ID NOs：40、42)；
(b)如图1E中所描述的VH和/或VL区的氨基酸序列；
(c)包括从(a)的氨基酸序列中的任一种的部分改变所得到的氨基酸序列的至少一个CDR；
(d)包括从(b)的氨基酸序列的部分改变所得到的氨基酸序列的重链和/或轻可变区；和/或
(e)抗体或其抗原结合片段可选地还包括与VH和/或VL区或者至少一个CDR异源的多肽序列，优选地其中多肽序列包括优选IgG类型、最优选IgG1类或同种型的人恒定域。
[12][1]至[7]中任一项的抗体，该抗体识别包括PA重复的DPR，在其可变区中包括：
(a)在图1J中所示并且分别在下述序列中所描述的抗体NI-308.4M1的VH和/或VL可变区氨基酸序列的至少一个互补决定区(CDR)，
(i)VH序列(SEQ ID NOs：64、68)；以及
(ii)VL序列(SEQ ID NOs：66、70)；
(b)如图1J中所描述的VH和/或VL区的氨基酸序列；
(c)包括从(a)的氨基酸序列中的任一种的部分改变所得到的氨基酸序列的至少一个CDR；
(d)包括从(b)的氨基酸序列的部分改变所得到的氨基酸序列的重链和/或轻可变区；和/或
(e)所述抗体或其抗原结合片段可选地还包含与VH和/或VL区或者至少一个CDR异源的多肽序列，优选地其中多肽序列包括优选为IgG类型、最优选为IgG1类或同种型的人恒定域。
[13][1]至[7]中任一项的抗体，该抗体识别包含PR重复的DPR，在其可变区中包括：
(a)在图1L中所示出的并且分别在下述序列中所描述的抗体NI-308.16C10的VH和/或VL可变区氨基酸序列的至少一个互补决定区(CDR)，
(i)VH序列(SEQ ID NOs：80、84)；以及
(ii)VL序列(SEQ ID NOs：82、86)；
(b)如在图1L中所描述的VH和/或VL区的氨基酸序列；
(c)包括从(a)的氨基酸序列中的任一个的部分改变所得到的氨基酸序列的至少一个CDR；
(d)包括从(b)的氨基酸序列的部分改变所得到的氨基酸序列的重链和/或轻可变区；和/或
(e)所述抗体或其抗原结合片段可选地还包括与VH和/或VL区或者至少一个CDR异源的多肽序列，优选地其中多肽序列包括优选IgG类型、最优选IgG1类或同种型的人恒定域。
[14][9]的抗体，该抗体还能够结合聚GA重复，优选地其中所述抗体是抗体NI-308.5G2或抗体源自抗体NI-308.5G2。
[15][10]的抗体，该抗体还能够结合聚GA重复，优选地其中所述抗体是抗体NI-308.6B11或所述抗体源自抗体NI-308.6B11。
[16][10]或[14]的抗体，该抗体还能够结合聚PR重复，优选地其中所述抗体是抗体NI-308.6B11或所述抗体源自抗体NI-308.6B11。
[17][12]的抗体，该抗体还能够结合聚GA重复，优选地其中所述抗体是抗体NI-308.4M1或所述抗体源自抗体NI-308.4M1。
[18][13]的抗体，该抗体还能够结合聚GA重复，优选地其中所述抗体是抗体NI-308.16C10或所述抗体源自抗体NI-308.16C10。
[19][1]至[18]中任一项的抗体，该抗体选择性地或优先地结合未偶联的DPR肽。
[20][1]至[19]中任一项所述的抗体，仅当重复数n≥6、优选≥10、更优选≥15时，该抗体结合到DPR。
[21][1]至[20]中任一项的抗体，该抗体能够以基本上相等的亲和力或在相同数量级内结合未偶联的DPR和BSA偶联的DPR，优选地其中结合未偶联的DPR和BSA偶联的DPR的EC50(半数最大有效浓度)值的差异不超过如通过间接ELISA所确定的≤20倍、优选≤15倍、更优选≤10倍、还更优选≤5倍和最优选不超过约≤2或3倍，其中重复数n为15。
[22][1]至[22]中任一项所述的抗DPR抗体，该抗体能够以基本上相等的亲和力或在相同数量级内结合两种或更多种不同的DPR，优选地其中结合DPR中的任一个的EC50为如通过间接ELISA所确定的结合DPRn或DPRn蛋白的至少≤200nM、优选≤150nM、更优选≤100nM、还更优选≤50nM和最优选≤25nM，其中重复数n为15。例如，抗体NI-308.5G2以约15.3的EC50结合(GA)15和以约0.88的EC50结合(GP)15，以及抗体NI-308.6B11，其以约38.4的EC50结合(GA)15、以约0.94的EC50结合(GR)15和以约119的EC50结合(PR)15；参见实施例3和图2。
[23][1]至[22]中任一项所述的抗体，该抗体对至少一种DPRn或DPRn蛋白具有对应于如通过间接ELISA所确定的≤25nM、优选≤2nM、更优选≤1nM和最优选≤0.5nM的EC50(半数最大有效浓度)值的结合亲和力，其中重复数n为15。
[24][1]至[23]中任一项的抗体，该抗体是嵌合鼠-人抗体或鼠源化抗体。
[25]一种抗体或抗原结合分子，其与[1]至[24]中任一项的抗体竞争以用于特异性结合如[1]至[24]中任一项中所限定的DPR或DPR-蛋白。
[26][1]至[25]中任一项的抗体，该抗体选自由单链Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')2片段组成的组。
[27]一种至少编码[1]至[26]中任一项的抗体的免疫球蛋白链的结合结构域或可变区的多核苷酸，优选地其中该多核苷酸是cDNA。
[28]一种包含[7]的多核苷酸的载体，[7]的多核苷酸可选地与编码所述结合分子的另一免疫球蛋白链的可变区的[27]的多核苷酸结合。
[29]一种包含[27]的多核苷酸或[28]的载体的宿主细胞。
[30][27]的cDNA、[28]的载体或[29]的宿主细胞在用于生产抗DPR抗体中的用途。
[31]一种用于制备抗DPR抗体或其生物技术衍生物或一个或多个免疫球蛋白链的方法，所述方法包括：
(a)培养[30]的细胞；以及
(b)从培养物中分离抗体或其一个或多个免疫球蛋白链。
[32]由[27]的多核苷酸所编码的或通过[31]的方法可获得的抗体或其一个或多个免疫球蛋白链。
[33][1]至[26]或[32]中任一项的抗体，所述抗体被可检测地标记。
[34][33]的抗体，其中可检测标记选自由酶、放射性同位素、荧光团和重金属组成的组。
[35]权利要求[1]至[26]或[32]中任一项的抗体，所述抗体附着于药物。
[36]一种包括[1]至[26]或[32]至[34]中任一项的抗体、[27]的多核苷酸、[28]的载体或[29]的细胞的组合物。
[37][36]的组合物，该组合物是药物组合物，并且还包含药学上可接受的载体。
[38][37]的组合物，该组合物是疫苗。
[39]一种制备用于治疗与DPR和DPR-蛋白聚集体相关的或由它们引起的病症的药物组合物的方法，所述方法包括：
(a)培养[29]的细胞；
(b)从培养物中将抗体、其生物技术衍生物或者一个或多个免疫球蛋白链纯化至药物级；以及
(c)将抗体或其生物技术衍生物与药学上可接受的载体混合。
[40][36]或[37]的药物组合物，该药物组合物还包括用于治疗与聚集的DPR蛋白(例如C9ORF72-DPR)相关的疾病和/或症状的另外的药剂。
[41][40]的组合物，该组合物是诊断组合物。
[42][41]的诊断组合物，其包括在基于免疫的诊断方法或基于核酸的诊断方法中常规使用的试剂。
[43][1]至[26]或[32]至[34]中任一项的抗体，或与其任一项具有基本上相同的结合特异性的DPR蛋白结合分子、[27]的多核苷酸、[28]的载体或[29]的细胞，用于制备用于预防性和治疗性处理与DPR蛋白及其聚集形式相关的疾病的药物组合物或诊断组合物中。
[44][43]的抗体，用于制备用于预防性和治疗性处理的药物或诊断组合物，其中疾病选自由额颞叶变性(FTLD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和FTLD-ALS组成的组。
[45]包括权利要求[1]至[26]或[32]至[35]中任一项的抗体的至少一个CDR的DPR蛋白结合分子，用于针对人类或动物体内聚集蛋白的治疗剂和/或诊断剂的体内检测或靶向中。
[46][45]的DPR蛋白结合分子，其中所述体内成像包括正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射断层摄影(SPECT)、近红外(NIR)、光学成像或磁共振成像(MRI)。
[47]一种用于诊断与DPR蛋白相关的病症的方法，该方法包括在所述受试者的生物样品中确定权利要求[1]至[26]或[32]至[35]中任一项的抗体的存在的步骤。
[49]一种在诊断或监测与DPR蛋白相关的病症中有用的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求[1]至[27]或[32]至[35]中任一项的至少一种抗体或与其任一项具有实质上相同的结合特异性的DPR蛋白结合分子、[27]的多核苷酸、[28]的载体或[29]的细胞，其可选地具有使用试剂和/或使用说明书。
重复扩增的毒性性质示于包括但不限于额颞叶变性(FTLD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、FTLD-ALS和脊髓小脑性共济失调36型的若干种疾病中。因此，在本发明的一种实施方式中，本发明的抗体能够结合选自由额颞叶变性(FTLD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、FTLD-ALS和/或脊髓小脑性共济失调36型组成的组的疾病和/或病症中的任一个中的DPR。由于C9ORF72-DPR显示出与FTLD相关，参见上文，因此在优选的实施方式中，本发明的抗体结合到C9ORF72二肽重复(DPR)。
如实施例和附图中所显示的，根据本发明所获得的抗体结合人类C9ORF72-FTLD患者中的C9ORF72-DPR的聚集形式；参见例如实施例10和12以及图9至12和图14。因此，在一种实施方式中，本发明的抗体能够结合C9ORF72-DPR的聚集形式。有趣的是，根据本发明所获得的抗体还结合人类C9ORF72-FTLD患者中C9ORF72-DPR的共聚集形式；参见实施例13和图15。因此，在另一实施方式中，本发明的抗体能够结合C9ORF72-DPR的共聚集形式。
在本发明的一种实施方式中，抗体或其结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物显示了通过如图1中所示的可变区VH和/或VL中的任一个所表征的抗体的免疫结合特征。在优选的实施方式中，本发明的抗体在其可变区中包含VH和/或VL可变区氨基酸序列的至少一个互补决定区(CDR)，所述氨基酸序列在(i)VH序列(SEQ ID NO：2、8、14、18、22、26、30、34、38、44、48、52、56、58、62、64、68、72、76、80、84)；以及(ii)VL序列(SEQ ID NO：4、6、10、12、16、20、24、28、32、36、40、42、46、50、54、60、66、70、74、82、86、88)中描述。
另外或可替换地，在本发明的一种实施方式中，抗体包含如图1A-1J中任一个所示的VH和/或VL区的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本发明的抗体另外地或可替换地包括由VH序列(SEQ ID NO：2、8、14、18、22、26、30、34、38、44、48、52、56、58、62、64、68、72、76、80、84)；和(ii)VL序列(SEQ ID NO：4、6、10、12、16、20、24、28、32、36、40、42、46、50、54、60、66、70、74、82、86、88)的氨基酸序列中任一个的部分改变所得到的氨基酸序列组成的至少一个CDR。在另一实施方式中，抗体包括重链和/或轻链可变区，该重链和/或轻链可变区包括由上述氨基酸序列的部分改变所得到的氨基酸序列。
在本发明的另一实施方式中，抗体或其抗原结合片段另外地或可替换地可选地还包括与VH和/或VL区或至少一个CDR异源的多肽序列，优选地其中多肽序列包括人恒定域。
在优选的实施方式中，以下抗体或其生物技术衍生物是人IgG同种型抗体，优选IgG1类或同种型。
如实施例和附图中所例示的，显示了抗DPR蛋白抗体特异性结合到具有(GA)15或(GP)15或(GR)15或(PA)15或(PR)15重复的C9ORF72-DPR。因此，在本发明的一种实施方式中，本发明的抗体或其生物技术衍生物具有对应于≤2nM、优选≤1nM和最优选≤0.5nM的EC50(半数最大有效浓度)值的结合亲和力以结合由(XX')15组成的DPR，优选地其中DPR是DPR蛋白(GA)15或DPR蛋白(GP)15DPR蛋白(GR)15或DPR蛋白(PA)15或DPR蛋白(PR)15。
由于对单个二肽重复具有高亲和力和特异性的抗DPR抗体通常是感兴趣的，并且实施例中所例示的受试抗体提供了用于获得等同抗体和类似DPR结合分子的方法，因此本发明还涉及与上文的抗体竞争对DPR蛋白的特异性结合的抗体或抗原结合分子。
抗体的抗原结合片段可以是单链Fv片段、F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')2片段或任何其他抗原结合片段。可替换地，抗体是人类-啮齿动物嵌合抗体或啮齿动物化的抗体，诸如鼠-人、鼠或鼠源化的、大鼠或大鼠源化的抗体，啮齿动物的版本对诊断方法和动物中的研究是特别有用的。
此外，本发明涉及包含本发明的抗体或其抗原结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物的组合物，并且涉及在预防、诊断或治疗与DPR蛋白和/或聚集的C9ORF72相关的疾病和/或病症中使用这样的组合物的免疫治疗和免疫诊断方法，其中有效量的组合物施用给需要其的患者。
本发明还涉及编码至少本发明抗体的免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸。优选地，所述可变区包含如图1A-L中任一个所述的可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。
因此，本发明还包括含有所述多核苷酸的载体和用其转化的宿主细胞，以及它们用于生产对DPR有特异性并优选地能够结合C9ORF72-DPR蛋白或其片段的抗体和等价结合分子的用途。用于重组生产抗体和其模拟物的方式和方法，以及用于竞争结合分子(其可以是或可以不是抗体)的筛选方法在本领域是熟知的。然而，如本文所描述的，特别关于对人体的治疗应用，本发明的抗体是人源抗体，含义是，应用所述抗体基本上没有针对这样抗体的免疫反应，而嵌合甚至是人源抗体则观察到这种免疫反应。
此外，本文公开了可用来在体外(例如样品中)和/或体内识别DPR，特别是C9ORF72-DPR或片段的组合物和方法。所公开的抗DPR蛋白抗体及其结合片段可以被用于例如通过使用基于ELISA或表面适应的测定法来筛选人类血液、血浆、血清、唾液、腹膜液、脑脊液(“CSF”)以及尿液样品中DPR和/或C9ORF72-DPR种类或其片段的存在。在一种实施方式中，本发明涉及诊断或监测与受试者体内DPR蛋白种类或其片段相关的疾病和/或病症的进展的方法，该方法包括用本发明的至少一种抗体或等同的DPR结合分子确定来自待诊断的受试者的样品中DPR蛋白种类或片段的存在，其中DPR蛋白种类或片段的存在指示病症。此外，在本发明的一种实施方式中，提供包含本发明抗体的至少一个CDR的所公开的抗DPR抗体和DPR结合分子用于制备一种组合物，组合物用于针对DPR(特别是人类和动物体内的C9ORF72-DPR种类)的治疗的和/或诊断的剂的体内检测(也称为体内成像)或者靶向。本文公开的方法和组合物可以在与DPR蛋白相关的和以例如通过DPR的聚集形式的发生为特征的疾病和/或病症中提供帮助，并且可以用于监测疾病进展和提供给受试者的治疗的治疗功效，在例如体内成像相关的诊断方法中。在一种实施方式中，体内检测(成像)包括显像、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射断层摄影(SPECT)、近红外(NIR)光学成像或磁共振成像(MRI)。
因此，提供用于治疗、诊断或预防与DPR蛋白、优选地与C9ORF72-DPR相关疾病和/或病症的方法是本发明的一个特定目的。该方法包括对受试者施用有效浓度的优选的人源抗体或生物技术抗体衍生物，其中所述抗体靶向于DPR和DPR蛋白，优选地C9ORF72-DPR蛋白种类或其片段。
本发明的另外的实施方式将从下面的说明书和实施例显而易见。
附图说明
图1：人抗体NI-308.18F7、NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2、NI.308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI308-6B11、NI-308.46F8、NI-308.4M1、NI-308.12A3和NI-308.16C10的可变区的氨基酸序列。显示了框架(FR)区和互补决定区(CDR)，其中CDR被划下划线。使用了Kabat编号方案(参见http://www.bioinf.org.uk/abs/)。框指示如由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services(美国卫生与人类服务部)，“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)所定义的在所提及的网页参考中的所指的和在下文的表1中给出的的VH CDR1。
图2：对于C9orf72二肽重复蛋白的结合特异性和EC50测定。(A)NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI308.45C2、NI-308.18F7、NI-308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI-308.6B11、NI-308.46F8、NI-308.4M1对C9orf72二肽重复蛋白的结合特异性和亲和力的总结。人源NI-308抗体对C9orf72二肽重复蛋白肽(GA)15(■)、(GP)15(▲)、(GR)15(▼)、(PA)15(◆)、(PR)15(●)和BSA对照(△)的EC50通过间接ELISA来测定。抗体NI-308.15O7(B)、NI-308.28G1(C)、NI-308.45C2(D)和NI-308.18F7(E)分别以0.48nM、1.1nM、1.1nM和1.5nM的结合亲和力特异性地识别C9orf72 DPR蛋白肽(GA)15。抗体NI-308.24E11(F)以12.8nM的EC50特异性地靶向C9orf72 DPR蛋白肽(PR)15，而抗体NI-308.16C10(M)显示出以3.5nM的结合亲和力优先结合到C9orf72 DPR蛋白肽(PR)15，但也以更低的结合亲和力识别C9orf72DPR蛋白肽(GA)15。抗体NI-308.5G2(G)、NI-308.12A3(L)和NI-308.46E9(H)显示分别以0.88nM、2.2nM和13.9nM的结合亲和力优先结合到C9orf72 DPR蛋白肽(GP)15，但也以更低的结合亲和力识别C9orf72 DPR蛋白肽(GA)15。抗体NI-308.6B11(I)和NI-308.46F8(J)分别以0.94nM和40.6nM的结合亲和力优先靶向C9orf72 DPR蛋白肽(GR)15，但也以更低的结合亲和力识别C9orf72 DPR蛋白肽(GA)15和(PR)15。抗体NI-308.4M1(K)显示以0.10nM的结合亲和力优先结合到C9orf72 DPR蛋白肽(PA)15，但也以更低的结合亲和力识别C9orf72 DPR蛋白肽(GA)15。
图3：对于BSA偶联的和未偶联的C9orf72二肽重复蛋白肽的EC50测定。(A)NI-308.18F7、NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI308.45C2、NI-308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI-308.6B11、NI-308.46F8、NI-308.4M1、NI-308.12A3和NI-308.16C10对BSA偶联的和未偶联的C9orf72 DPR肽的结合亲和力的总结。使用间接ELISA来测定人源NI-308抗体对BSA偶联的(▲)和未偶联的(■)的C9orf72二肽重复蛋白肽(GA)15、(GP)15、(GR)15、(PR)15、(PA)15或BSA对照(△)的半数最大有效浓度(EC50)。抗体NI-308.18F7(B)、NI-308.15O7(C)、NI-308.28G1(D)、NI-308.5G2(G)、NI-308.46E9(H)、NI-308.4M1(K)和NI-308.12A3(L)以类似的结合亲和力识别BSA偶联的和未偶联的C9orf72 DPR蛋白肽。与未偶联的肽相比，抗体NI-308.45C2(E)、NI-308.24E11(F)和NI-308.16C10(M)以更低的EC50靶向BSA偶联的DPR蛋白肽。对于抗体NI-308.6B11(I)和NI-308.46F8(J)，检测不到与BSA偶联的DPR蛋白肽(GR)15的结合。
图4：人源DPR抗体对不相关的聚集蛋白的结合特异性分析。通过间接ELISA测定抗体与正义((GA)15、(GP)15和(GR)15)和反义((PA)15和(PR)15)DPR蛋白肽混合物和六种不相关的淀粉样蛋白的结合。抗体NI-308.15O7(A)、NI-308.18F7(B)、NI-308.28G1(C)、NI-308.45C2(D)、NI-308.5G2(F)和NI-308.46F8(I)显示结合到正义DPR蛋白肽混合物而没有显著的脱靶结合到不相关的分析物。抗体NI-308.46E9(G)还靶向正义DPR蛋白肽混合物，并且另外地显示中度脱靶结合到不相关的分析物。抗体NI-308.24E11(E)显示特异性结合到反义DPR蛋白肽混合物，而抗体NI-308.6B11(H)靶向正义和反义DPR肽混合物二者。对于两种抗体，没有测定到显著的脱靶结合到不相关的淀粉样蛋白。在20nM浓度下检验NI-308抗体。
图5：NI-308抗体对C9orf72二肽重复蛋白的结合选择性。通过蛋白印迹分析来确定人源C9orf72 DPR抗体对BSA-偶联的C9orf72二肽重复蛋白肽(GA)15、(GP)15、(GR)15、(PA)15和(PR)15的结合选择性。抗体NI-308.15O7(A)、NI-308.18F7(B)、NI-308.28G1(C)和NI-308.45C2(D)识别C9orf72聚-GA DPR蛋白。聚-PR DPR蛋白被抗体NI-308.24E11(E)和NI-308.16C10(J)特异性地识别，同时抗体NI-308.16C10显示出较弱的还结合到聚-GA DPR蛋白。抗体NI-308.5G2(F)、NI-308.46E9(G)和NI-308.12A3(I)靶向聚-GP DPR蛋白，同时NI-308.5G2显示出较弱的也结合到聚-GA DPR蛋白。抗体NI-308.4M1(H)特异性识别C9orf72聚-PA DPR蛋白。
图6：在溶液中结合到C9orf72二肽重复蛋白。通过免疫沉淀分析来确定人源C9orf72 DPR抗体在溶液中结合到肽(GA)15、(PR)15和(GR)15。C9orf72聚-GA DPR蛋白在溶液中被抗体NI-308.15O7、NI-308.18F7、NI-308.45C2和NI-308.28G1捕获(A)。聚-PR DPR蛋白被抗体NI-308.24E11沉淀(B)，而抗体NI-308.6B11捕获聚-GR DPR蛋白。同种型对照抗体NI-43A11没有沉淀任何C9orf72 DPR蛋白(A-C)。
图7：所选的NI-308抗体的C9orf72 DPR蛋白重复长度依赖性结合。(A)所选的NI-308抗体的C9orf72聚-GA重复长度依赖性结合的总结。(B)所选的NI-308抗体的C9orf72聚-GP重复长度依赖性结合的总结。(C)所选的NI-308抗体的C9orf72聚-GR重复长度依赖性结合的总结。(D)所选的NI-308抗体的C9orf72聚-PR重复长度依赖性结合的总结。(E)所选的NI-308抗体的C9orf72聚-PA重复长度依赖性结合的总结。通过间接ELISA来确定人源NI-308抗体对C9orf72二肽重复蛋白肽的二肽重复长度依赖性结合特异性和半数最大有效浓度(EC50)。抗体NI-308.15O7(F)分别以>150nM、7.9nM、0.37nM和0.54nM的EC50的结合亲和力结合到DPR蛋白肽(GA)5、(GA)6、(GA)10和(GA)20。抗体NI-308.18F7(G)分别以>200nM、0.78nM和0.83nM的EC50的结合亲和力识别DPR蛋白肽(GA)6、(GA)10和(GA)20。抗体NI-308.28G1(H)分别以>200nM、6.3nM、0.9nM和1.1nM的EC50的结合亲和力靶向DPR蛋白肽(GA)5、(GA)6、(GA)10和(GA)20。抗体NI-308.45C2(I)分别以>200nM、7.6nM和9.6nM的EC50的结合亲和力结合到DPR蛋白肽(GA)6、(GA)10和(GA)20。抗体NI-308.5G2(J和K)分别以>200nM、26.8nM、0.94nM和0.47nM的EC50的结合亲和力识别DPR蛋白肽(GP)5、(GP)6、(GP)10和(GP)20并对DPR蛋白肽(GA)6、(GA)10和(GA)20分别具有>200nM、5.7nM和18.2nM的EC50的结合亲和力。抗体NI-308.6B11(L和M)分别以14.3nM、13.2nM、0.47nM、0.33nM、1.3nM和0.25nM的EC50的结合亲和力结合到DPR蛋白肽(GR)3、(GR)4、(GR)5、(GR)6、(GR)10和(GR)20并分别以>200nM、27.7nM和33.6nM的EC50的结合亲和力结合到DPR蛋白肽(GA)6、(GA)10和(GA)20。抗体NI-308.46E9(N)分别以63.3nM和15.5nM的EC50的结合亲和力靶向DPR蛋白肽(GP)10和(GP)20。抗体NI-308.24E11(O)分别以>200nM、31.7nM和11.3nM的EC50的结合亲和力识别DPR蛋白肽(PR)6、(PR)10和(PR)20。抗体NI-308.4M1(P)分别以26.9nM、4.3nM、0.06nM和0.06nM的EC50的结合亲和力结合到DPR蛋白肽(PA)5、(PA)6、(PA)10和(PA)20。
图8：所选的NI-308抗体的C9orf72聚-GA和聚-GP DPR蛋白重复长度依赖性结合。(A)所选的NI-308抗体的C9orf72聚-GA重复长度依赖性结合的总结。(B)所选的NI-308抗体的C9orf72聚-GP重复长度依赖性结合的总结。通过夹心ELISA来确定人源NI-308抗体对C9orf72聚-GA或聚-GP二肽重复蛋白肽的二肽重复长度依赖性结合特异性和半数最大有效浓度(EC50)。抗体NI-308.15O7(C)分别以>400nM和9.0nM的EC50的结合亲和力在溶液中结合到DPR蛋白肽(GA)10和(GA)20。抗体NI-308.18F7(D)分别以0.34nM和0.45nM的EC50的结合亲和力在溶液中识别DPR蛋白肽(GA)10和(GA)20。抗体NI-308.28G1(E)分别以0.46nM和0.40nM的EC50的结合亲和力在溶液中靶向DPR蛋白肽(GA)10和(GA)20。抗体NI-308.5G2(F)以38.2nM的EC50的结合亲和力在溶液中仅识别单个DPR蛋白肽(GP)20。
图9：NI-308.18F7和NI-308.15O7抗体对C9orf72(GA)20二肽重复蛋白肽单体的和聚集的制品的结合特异性和亲和力。
图10：通过透射电子显微镜来表征体外C9orf72(GA)20DPR蛋白肽制品。非聚集的(单体的，A)和淀粉样蛋白-原纤维样聚集的(聚集的，B)(GA)20DPR蛋白肽制品的代表性图像。放大率：66k。比例尺：0.5μm。
图11：通过间接ELISA结合测定法来确定NI-308.18F7和NI-308.15O7对单体的和聚集的C9orf72(GA)20DPR蛋白肽制品的结合特异性和EC50。使用间接ELISA来确定NI-308.18F7和NI-308.15O7抗体对单体的(●)和聚集的(■)C9orf72(GA)20DPR蛋白肽制品的结合特异性和EC50。抗体NI-308.18F7(A)分别以0.87nM和0.89nM的EC50的结合亲和力识别单体的和聚集的(GA)20制品。抗体NI-308.15O7(B)分别以0.53nM和0.78nM的EC50的结合亲和力结合于单体的和聚集的(GA)20制品。
图12：通过夹心ELISA结合测定法来确定NI-308.18F7和NI-308.15O7对单体的和聚集的C9orf72(GA)20DPR蛋白肽制品的结合特异性和EC50。使用夹心ELISA来确定NI-308.18F7和NI-308.15O7抗体对单体的(●)和聚集的(■)C9orf72(GA)20DPR蛋白肽制品在溶液中的结合特异性和EC50。抗体NI-308.18F7(A)分别以0.64nM和2.9nM的EC50的结合亲和力识别单体的和聚集的(GA)20制品。抗体NI-308.15O7(B)分别以6.3nM和8.1nM的EC50结合到单体的和聚集的(GA)20制品。在没有组氨酸标签(his-tagged)的(GA)20制品(△)的情况下没有检测到抗体结合。结合特异性和亲和力总结在图9的表中。
图13：NI-308抗体完整性分析。5μg重组人源NI-308抗C9orf72DPR抗体的SDS-PAGE分析，随后对其进行考马斯蓝染色。检测到对应于预期大小的抗体重链和轻链的两个主要条带。
图14：NI-308.18F7、NI-308.15O7、NI-308.5G2和NI-308.4M1检测FTLD患者中的病理性C9orf72二肽重复蛋白聚集体。(A)人源NI-308.18F7、NI-308.15O7和NI-308.5G2抗体显示在所有三种所检验的C9orf72-FTLD病例的小脑的颗粒细胞层中病理性神经元细胞质包涵体、神经元核内包涵体和营养不良性神经突。相比之下，非神经系统对照小脑对NI-308.18F7、NI-308.15O7和NI-308.5G2染色呈阴性。使用市售的抗体C9RANT作为对照抗体。显示了代表性图像。(B)由抗体NI-308.18F7、NI-308.15O7和NI-308.5G2检测的所选的C9orf72-FTLD病例的小脑的颗粒细胞层中神经元C9orf72 DPR包涵体的代表性高放大率图像。(C)由抗体NI-308.4M1检测的所选的C9orf72-FTLD病例的小脑的颗粒细胞层中神经元细胞质和核内C9orf72 DPR包涵体的代表性高放大率图像。相比之下，非神经系统对照小脑对NI-308.4M1染色呈阴性。
图15：C9orf72聚-GA和聚-GP DPR蛋白形成共聚集体。病理性C9orf72聚-GA和聚-GP DPR蛋白共聚集体在携带C9orf72六核苷酸重复扩增的人FTLD患者的小脑的颗粒层中的存在。NI-308.18F7识别C9orf72聚-GA，而抗体NI-308.5G2特异性地检测C9orf72聚-GP细胞质包涵体和核内包涵体。绝大多数聚-GP DPR蛋白聚集体与聚-GA聚集体共定位。显示了代表性图像。
具体实施方式
本发明一般涉及用于检测与二肽重复(DPR)蛋白和特别是其聚集形式的存在相关的疾病和病症的免疫治疗和非侵入性方法。更具体地，本发明涉及重组人源单克隆抗体及其抗原结合片段，它们基于从所选的人供体群获得的序列信息而产生，并且能够结合至这样的DPR，特别是聚-甘氨酸-丙氨酸(甘氨酸-丙氨酸；GA)-DPR、聚-甘氨酸-脯氨酸(甘氨酸-脯氨酸；GP)-DPR、聚-甘氨酸-精氨酸(甘氨酸-精氨酸；GR)-DPR、聚-脯氨酸-精氨酸(脯氨酸-精氨酸；PR)-DPR和/或聚-脯氨酸-丙氨酸(脯氨酸-丙氨酸；PA)-DPR以及它们的抗原。本发明的重组人源单克隆抗体及其合成衍生物和生物技术衍生物的有利特征在于特异性地结合到以扩增的六核苷酸重复形成C9ORF72-二肽重复(DPR)的改变的C9ORF72。如实施例中所示出的，本发明的重组抗体作为用于检测DPR和/或病理性C9ORF72的诊断试剂是高度特异性的，不给出假阳性，并且由于分别编码至少可变区和CDR的序列的人类来源以及原始抗体在人体中成熟可以合理地预期作为治疗剂是有效的和安全的。
此外，本发明涉及如本文所述的人源单克隆抗体(包括其任何生物技术衍生物)，其用于单独或与用于DPR相关的疾病、病症和/或症状的其他药剂组合来治疗患者，优选地其中本发明的抗体被设计成与抑制其他副作用的药剂同时施用或者在施用该药剂之前或之后顺序施用。在本文中，本发明的抗DPR抗体优选地在人类中基本上是非免疫原性的。在本发明的一种实施方式中，提供了包含本发明的人源单克隆抗体和用于与DPR相关的疾病、病症和/或症状的一种或多种药物的药物组合物。
I.定义
除非另有说明，否则如本文所使用的术语被给出如在Oxford Dictionary ofBiochemistry and Molecular Biology(《生物化学和分子生物学牛津词典》)，牛津大学出版社，1997，2000年修订和2003年再版，ISBN 0 19 850673 2中所提供的定义。
应该指出的是，术语“一个”或“一种”实体是指一个(种)或多个(种)该实体；例如，“一种抗体”应被理解为代表一种或多种抗体。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可以互换使用。
如果没有另外具体说明，则术语“DPR”，即“二肽重复”蛋白在本文中用于特定指两个氨基酸的重复单元，特别是由于基因中扩增的六核苷酸重复。术语“DPR”和“多种DPR”还被用于共同指代所有类型和形式的DPR，诸如GA、GR、GP、PA、PR等。在下文中，将关于特异性识别如下DPR的抗体来主要描述本发明：所述DPR包含在患有FLTD或ALS的患者的脑组织中发现的C9ORF72-DPR蛋白中通常观察到的GA(优选地具有15个重复(GA15))、GP(优选地具有15个重复(GP15))、GR(优选地具有15个重复(GR15))或PR(优选地具有15个重复(PR15))或PA(优选地具有15个重复(PA15))或者由其组成。然而，尽管抗C9ORF72-DPR抗体代表优选的实施方式，但是本发明通常提供抗DPR蛋白抗体和相应的实施方式。因此，强调原则上本文所公开的以及实施例和附图中所例示的任何实施方式和相应特征，除非特定地仅适用于抗C9ORF72-DPR，否则也意指通常适用于任何抗DPR蛋白抗体。
对于DPR相关疾病的另一实例是脊髓小脑性共济失调36型(慢性渐进性神经退行性病症(slowly progressive neurodegenerative disorder))和常染色体显性小脑性共济失调1型(autosomal dominant cerebellar ataxia type 1)(ADCA 1型)的亚型，其特征在于成人发作的步态和肢体共济失调、下肢痉挛、构音障碍(dysarthria)、肌肉痉挛、舌萎缩和反射亢进。一些受影响的个人还能形成听力损失；参见例如，Garcia-Murias等人,Brain 135(2012),1423-1435。显示了脊髓小脑性共济失调36型是由染色体20p13上的NOP56基因中的内含子GGCCTG六核苷酸重复的杂合扩增引起的；参见例如，Garcia-Murias等人,Brain 135(2012),1423-1435。Ikeda等人,Neurology 79(2012),333-341，Kobayashi等人,Am.J.Hum.Genet.89(2011),121-130。
如果没有另外具体说明，则术语“C9ORF72”是指染色体9开放阅读框72(C9ORF72)的改变形式。术语“C9ORF72”也用于一般鉴定C9ORF72六核苷酸扩增，从而导致C9ORF72-二肽重复(DPR)。因此，该术语也用于表示C9ORF72-DPR。术语“C9ORF72”还用于共同地指C9ORF72的所有类型和形式，诸如突变的C9ORF72。术语C9ORF72前面添加的字母用于指示特定直系同源物源自的生物体，例如用于人C9ORF72的hC9ORF72或用于鼠源的mC9ORF72。
本文公开的抗DPR抗体优选地结合C9ORF72-二肽重复(DPR)及其表位。例如，本文公开的是特异性地结合病理改变的C9ORF72种类或其片段(即从扩增的内含子C9ORF72六核苷酸重复的C9ORF72转录本非常规翻译的二肽重复以及C9ORF72-DPR的聚集形式或其片段)的抗体。术语(病理学上)聚集的C9ORF72-DPR/C9ORF72-DPR的聚集体在本文中用来特别指上述形式。如本文所用的术语(病理学)“聚集形式”或“聚集体”描述了由于从扩增的内含子C9ORF72六核苷酸重复的C9ORF72转录本的C9ORF72错误/病理翻译而产生的集聚(accumulation)或簇集(cluster)的产物。这些聚集体、集聚或簇集形式可以基本上包括C9ORF72-DPR蛋白和/或其片段或者由其组成。如本文所用的，提及“特异性地结合”、“选择性地结合”或“优先结合”C9ORF72-DPR的抗体是指不结合其他不相关蛋白的抗体；参见例如，图4。如图4和实施例5中所示的，本发明的抗体基本上不识别选自由配对螺旋样纤维(paired helical filament)(PHF)-tau、TAU、交互反应DNA结合蛋白43(transactiveresponse DNA binding protein 43)(TDP-43)、转甲状腺素蛋白(TTR)、全长淀粉样前体蛋白(flAPP)和/或亨廷顿蛋白(HTT)组成的组的不相关的淀粉样形成蛋白。
在一个实例中，本文公开的C9ORF72-DPR抗体可以结合DPR和/或C9ORF72-DPR或其表位，并且对于其他蛋白质在高于约2倍背景下不显示结合。“特异性地结合”或“选择性地结合”DPR和/或C9ORF72-DPR蛋白变体的抗体是指不结合C9ORF72-DPR蛋白的所有变体，即不结合至少一种其他C9ORF72构象异构体的抗体。例如，本文所公开的是可优先结合如下C9ORF72形式的抗体：其显示在体外和在从患有与C9ORF72相关疾病的或者具有发展C9ORF72相关疾病的风险的患者所获得的组织中形成DPR的扩增的六核苷酸重复；参见例如，实施例8和图7。
由于本发明的抗DPR抗体已经从人类受试者中分离，因此本发明的DPR抗体也可以被称为“人自身抗体”或“人源抗体”，以便强调那些抗体确实由受试者最初表达并且不是例如通过人免疫球蛋白表达噬菌体文库或在表达部分人免疫球蛋白谱系的转基因动物中所产生的异基因抗体(迄今代表一种试图提供类人抗体的常用方法)而产生的合成构建体。另一方面，本发明的人源抗体可以被表示为合成的、重组的和/或生物技术的，以便将其与人血清抗体本身区分开，其可以通过蛋白A或亲和柱纯化。
本发明的治疗方法的特别优点在于以下事实：本发明的抗体来源于健康人受试者的B细胞或B记忆细胞，该健康人受试者无显示DPR蛋白及其聚集形式的发生或与DPR蛋白及其聚集形式相关的疾病的体征，因此是，以一定的概率，能够预防与聚集的DPR蛋白(诸如C9ORF72-DPR)相关的临床表现的疾病，或者降低临床表现的疾病发生的风险，或者延缓临床表现的疾病的发作或进展。
典型地，本发明的抗体也已成功地通过体细胞成熟，即通过抗体的可变区的体细胞变异手段的关于在高亲和力结合靶DPR分子上的选择性和有效性的优化。关于这样的细胞在体内(例如在人体内)没有借助于相关的或其他生理蛋白质或细胞结构在自身免疫或过敏性反应的意义上活化的认识也是有很大医疗重要意义的，因为这意味着通过临床试验阶段成功存活的机会大大增加。可以这么说，效力、可接受性和耐受性已经在预防或治疗性抗体的临床前和临床开发之前已在至少一个人类受试者身上得到了证明。因此，可以预期的是，本发明的人源抗DPR抗体，其作为治疗剂的靶结构特异性效力和其降低了的副作用几率都显著增加了其临床成功的可能性。
相反，衍生自cDNA文库或噬菌体展示的抗体是人工分子，诸如仍然是鼠源的人源化抗体并且因此对人体是外来的。因此，治疗性抗体的临床效用和功效可受限于抗药物抗体(ADA)的产生，其可影响抗体的功效和药代动力学并且有时导致严重的副作用；参见例如，Igawa等人,MAbs.3(2011),243-252。特别地，人源化抗体或用最近的人抗体产生(human-antibody-generation)技术产生的抗体与人源抗体诸如本发明的倾向于诱导抗体应答的人源抗体形成对比，并且已报道这些源自例如噬菌体展示的类人抗体(诸如阿达木单抗)诱导ADA产生；参见例如，Mansour,Br.J.Ophthalmol 91(2007),274-276和Igawa等人,MAbs.3(2011),243-252。因此，不易于产生不期望的免疫应答的人源抗体比从文库或展示获取的人工分子对患者更有益。
术语“肽”应被理解为在其含义内包括术语“多肽”和“蛋白(质)”(其在本文中有时可以互换使用)。类似地，蛋白和多肽的片段也可被考虑并且在本文中可以被称为“肽”。然而，术语“肽”优选地表示包括至少5个连续氨基酸，优选至少10个连续氨基酸，更优选至少15个连续氨基酸，还更优选至少20个连续氨基酸，以及特别优选至少25个连续氨基酸的氨基酸聚合物。此外，根据本发明的肽通常具有不超过100个连续氨基酸，优选少于80个连续氨基酸以及更优选少于50个连续氨基酸。
如本文中所使用的，术语“多肽”旨在包括单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条链或多条链，并且不是指产物的特定长度。因此，“肽”、“二肽”、“三肽”、“寡肽”、“蛋白(质)”、“氨基酸链”或用来指两个或更多个氨基酸的一条链或多条链的任何其他术语被包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以用来代替这些术语中的任一个或可与这些术语的任一个互换。
术语“多肽”也意指多肽的表达后修饰的产物，该多肽的表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化和通过已知的保护基/保护基团衍生化、蛋白水解裂解、或被非天然存在的氨基酸修饰。多肽可以衍生自天然生物来源或通过重组技术产生，但不一定由指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式产生，包括通过化学合成。
本发明的多肽可以是大小为约3个或更多、5个或更多、10个或更多、20个或更多、25个或更多、50个或更多、75个或更多、100个或更多、200个或更多、500个或更多、1000个或更多或者2000个或更多个氨基酸。多肽可以具有限定的三维结构，尽管它们不一定具有这样的结构。具有限定的三维结构的多肽被称为折叠的，而不具有限定的三维结构的多肽确可以采用大量不同的构象，并且被称为非折叠的。如本文所使用的，术语糖蛋白是指偶联到至少一个糖部分的蛋白，所述糖部分通过氨基酸残基(例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基)的含氧侧链或含氮侧链而附着至蛋白。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物是指并非处于其天然环境中的多肽。不需要特别水平的纯化。例如，分离的多肽可以从其原生的或天然的环境中移除。为了本发明的目的，如已经通过任何合适的技术分离、分馏或者部分或基本上纯化的原生或重组多肽一样，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被视为是分离的。
“重组肽、多肽或蛋白(质)”是指通过重组DNA技术产生，即从被外源性重组DNA表达构建体转化的细胞、微生物或哺乳动物产生的肽、多肽或蛋白(质)，所述外源性重组DNA表达构建体编码包含所需肽的融合蛋白。在大多数细菌培养物中表达的蛋白或肽通常是不含聚糖的。在酵母中表达的蛋白或多肽可具有与在哺乳动物细胞中表达的蛋白或多肽不同糖基化模式。
作为本发明的多肽而被包括的是前述多肽以及合成变体或生物变体的片段、衍生物、类似物或变体以及它们的任何组合。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括具有足够类似于天然肽的氨基酸序列的氨基酸序列的肽和多肽。术语“足够类似”指的是第一氨基酸序列，其包含足够的或最小数量的相对于第二个氨基酸序列相同的或等效的氨基酸残基，使得第一和第二氨基酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，包含至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％相同的共同结构域的氨基酸序列在本文被定义为足够类似。优选地，变体将足够类似于本发明优选的肽的氨基酸序列，特别是足够类似于改变的C9ORF72蛋白，诸如病理性C9ORF72-DPR以及单独的DPR蛋白，它们任一个的变体、衍生物或类似物。这样的变体通常保留了本发明的肽的功能活性。变体包括通过一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的途径在氨基酸序列上分别不同于天然肽和野生肽的肽。这些可以是天然存在的变体以及人工设计的变体。
此外，当指代本发明的抗体或抗体多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括任何保留相应的天然结合的分子、抗体或多肽的至少一些抗原结合特性的多肽。除了本文其他地方讨论的特定抗体片段，本发明的多肽片段包括蛋白水解片段以及缺失片段。本发明的抗体的变体和抗体多肽的变体包括如上所述的片段并且还包括具有由于氨基酸取代、缺失或插入而改变的氨基酸序列的多肽。变体可天然存在或是非天然存在的。可以使用本领域已知的诱变技术来产生非天然存在的变体。变体多肽可以包括保守或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。DPR蛋白特异性结合分子的衍生物例如本发明抗体和抗体多肽已被改变从而显示出在天然多肽找不到的额外特征的多肽。实例包括融合蛋白。在本文中变体多肽还可以被称为“多肽类似物”。如本文中所使用的结合分子或其片段、抗体或抗体多肽的“衍生物”是指具有由官能侧基的反应化学地衍生的一种或多种残基的受试多肽。也作为“衍生物”被包括的是那些含有二十种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；以及鸟氨酸可以取代赖氨酸。
分子的相似性和/或同一性的确定：
两个肽之间的“相似性”是通过比较一个肽的氨基酸序列与另一个肽的序列而确定的。如果它是相同的或保守的氨基酸取代，则一个肽的氨基酸类似于另一个肽的相应的氨基酸。保守的取代包括那些在Dayhoff，M.O.编，The Atlas of Protein Sequence andStructure 5(《蛋白质序列和结构图集5》)，National Biomedical Research Foundation(国家生物医学研究基金会)，华盛顿特区(1978年)，并在Argos,EMBO J.8(1989),779-785中所说明的取代。例如，属于下列组中之一的氨基酸代表保守的改变或取代：-丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸；-半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸；-缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸；-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；-苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸；和-天冬氨酸、谷氨酸。
两个多核苷酸之间的“相似性”是通过将一个多核苷酸的核酸序列与一个多核苷酸的序列进行比较而确定的。如果它是相同的，则一个多核苷酸的核酸与另一个多核苷酸的相应的核酸相似，或如果该核酸是编码序列的一部分，则包含该核酸的分别的三联体编码相同氨基酸或编码保守的氨基酸取代。两个序列之间同一性或相似性百分比的确定优选地使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:5873-5877的数学算法来实现。这样的算法被并入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTn和BLASTp程序中，其可在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cge)获得。
同一性或相似性百分比的确定是使用用于BLAST多核苷酸搜索的BLASTn程序的标准参数和用于BLAST蛋白搜索的BLASTp程序的标准参数进行的，正如在NCBI网页上和在关于具有特定长度和组成的序列的“BLAST Program Selection Guide(BLAST程序选择指南)”中所推荐的。
使用BLASTn程序进行BLAST多核苷酸搜索是。
对于一般的参数，“最大目标序列(Max Target Sequences)”框可以被设置为100，“短查询(Short queries)”框可以勾选，“期待阈(Expect threshold)”框可以被设置为1000，“字大小(Word Size)”框可被设置为7，正如NCBI网页上为短序列(少于20个碱基)所推荐的。对于更长的序列，“期待阈”框可被设定为10，且“字大小”框可被设定为11。对得分参数“匹配/错配得分(Match/mismatch Scores)”可以设置为1、-2，且“空位罚分(GapCosts)”框可被设置为线性的。对于过滤器和屏蔽参数，“低复杂性区域(Low complexityregions)”框可以不勾选，“物种特异性重复(Species-specific repeats)”框可以不勾选，“仅用于查找表的掩码(Mask for lookup table only)”框可以被勾选，“尘过滤器设置(DUST Filter Settings)”可以被勾选且“掩码小写字母(Mask lower case letters)”框中可以不勾选。一般而言，“搜索短近精确匹配(Search for short nearly exactmatches)”可能用于这方面，它提供了大部分的上述设置。这方面的更多信息可在发布于NCBI的网页上的“BLAST Program Selection Guide(BLAST程序选择指南)”中找到。
BLAST蛋白质搜索是使用BLASTp程序进行的。对于一般的参数，“最大目标序列(Max Target Sequences)”框可以被设置为100，“短查询(Short queries)”框可以勾选，“期待阈(Expect threshold)”框可被设定为10，“字大小(Word Size)”框可被设置为“3”。对于得分参数“矩阵(Matrix)”框可被设置为“BLOSUM62”，“空位罚分(Gap Costs)”框可被设置为“存在(Existence)：11扩展(Extension)：1”，“组成的调整(Compositionaladjustments)”框可被设置为“有条件的成分得分矩阵调整(Conditional compositionalscore matrix adjustment)”。对于过滤器和掩蔽参数“低复杂性区域(Low complexityregions)”框可以不勾选，“仅用于查找表的掩码(Mask lower case letters)”框可以不勾选，“掩码小写字母(Mask lower case letters)”框中可以不勾选。
这两个程序例如对于所搜索的序列的长度的修改根据在NCBI的网页上以HTML和PDF版本发布的“BLAST Program Selection Guide(BLAST程序选择指南)”中的推荐进行。
多核苷酸：
术语“多核苷酸”旨在包括单数的核酸以及复数的核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包括常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如，如在肽核酸(PNA)中发现的酰胺键)。术语“核酸”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如，DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意指已从其天然环境中取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，包含在载体中的编码抗体的重组多核苷酸被认为是分离的，以用于本发明的目的。分离的多核苷酸的其他实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中(部分或基本)纯化的多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明多核苷酸的体内或体外RNA转录本。根据本发明分离的多核苷酸或核酸还包括经合成产生的这些分子。此外，多核苷酸或核酸可以是调节元件或者可以包括调节元件，例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
如本文所用的，“编码区”是由翻译为氨基酸的密码子组成的核酸的一部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不被翻译成氨基酸，它可以被认为是编码区的一部分，但任何侧翼序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等)都不是编码区的一部分。本发明的两个或更多个编码区可以存在于单个多核苷酸构建体中，例如，在单个载体上，或者在分开的多核苷酸构建体中，例如，在分开的(不同的)的载体上。此外，任何载体可以含有单个编码区，或者可包括两个或更多个编码区，例如，单个载体可分别编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，所述异源编码区与编码结合分子、抗体、或其片段、变体或衍生物的核酸融合或不融合。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能性结构域。
在某些实施方式中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包括编码多肽的核酸的多核苷酸通常可以包含启动子和/或与一个或多个编码区可操作地关联的其他转录或翻译控制元件。可操作的关联是当基因产物(如多肽)的编码区与一个或多个调节序列关联时以使得基因产物的表达置于一个或多个调节序列的影响或控制下这样的方式关联。如果启动子功能的诱发导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调控序列指导基因产物的表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(例如，多肽编码区和与其相关联的启动子)是“可操作关联的”或“可操作连接的”。因此，如果启动子能够影响编码多肽的核酸的转录，则启动子区将是与该核酸可操作地相关联的。启动子可以是仅在预先确定的细胞中指导DNA大量转录的细胞特异性启动子。除了启动子，其他转录控制元件，例如增强子、调控子、阻抑子、和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地关联以指导细胞特异性转录。合适的启动子和其他转录控制区在本文公开。
各种转录控制区对于本领域技术人员是已知的。这些包括，但不限于，在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如，但不限于，来源于巨细胞病毒的启动子和增强子区段(立即早期启动子，与内含子-A结合)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(诸如劳斯肉瘤病毒)。其他转录控制区包括那些来源于脊椎动物基因的转录控制区(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-内球蛋白)以及能够控在真核细胞中的基因表达的其他序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导的启动子(例如，由干扰素或白介素诱导的启动子)。
类似地，各种翻译控制元件对于本领域普通技术人员来说是已知的。这些翻译控制元件包括，但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子和来源于小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也被称为CITE序列)。
在其他实施方式中，本发明的多核苷酸是RNA，例如，以信使RNA(mRNA)的形式。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的另外编码区相关联，该分泌肽或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长蛋白链跨越粗面内质网的的输出启动，所述信号肽或分泌前导序列就从成熟蛋白被切割。本领域的普通技术人员能够知晓的是，由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合到多肽N-端的信号肽，其从完整的或“全长”多肽被切割以产生分泌形式或“成熟”形式的多肽。在某些实施方式中，使用天然信号肽，例如，免疫球蛋白重链或轻链的信号肽，或者使用保留指导与其可操作关联的多肽分泌的能力的序列的功能性衍生物。可替换地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤维蛋白溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶的前导序列取代。
如在本发明上下文中所使用的“结合分子”主要涉及抗体及其片段，但也可以指结合至二肽重复(DPR)蛋白、优选地结合到改变的C9ORF72特别是(病理性)改变的C9ORF72-DPR的其他非抗体分子，包括但不限于激素、受体、配体、主要组织相容性复合物(MHC)分子、分子伴侣(诸如热休克蛋白(HSP))以及细胞-细胞粘附分子如钙粘着蛋白、整合素、C-型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。因此，仅为清楚起见，而并非限制本发明的范围，关于代表用于治疗剂和诊断剂的开发的优选结合分子的抗体和抗体样分子讨论下面的实施方式的大多数。
抗体：
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。抗体或免疫球蛋白是至少包含重链的可变结构域，并且通常至少包含重链和轻链的可变结构域的结合分子。脊椎动物系统中基本免疫球蛋白的结构被较好地理解；参见例如，Harlow等人，Antibodies:ALaboratory Manual(《抗体：实验室手册》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，第2版，1988)。
如将在下面更详细地讨论的，术语“免疫球蛋白”包括能够可以生化方式区分的各种广泛类型的多肽。本领域技术人员将理解，重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，(γ、μ、α、δ、ε)，在其中具有一些亚类(例如，γ1-γ4)。正是这种链的性质决定了抗体“类”分别为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等，被很好地表征，并且已知赋予功能特化(functional specialization)。这些类和同种型中每一种的修饰形式根据本发明的公开对于本领域技术人员是容易识别的，并且因此在本发明的范围内。所有免疫球蛋白的类别显然是在本发明的范围内，下面的讨论将主要涉及免疫球蛋白分子的IgG类。对于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含两个相同的具有分子量约23,000道尔顿的轻链多肽，和两个相同的分子量53,000-70,000的重链多肽。该四条链通常通过二硫键以“Y”构型结合，其中轻链支撑起始于“Y”嘴部并延续通过可变区的重链。
轻链被分类为κ或λ(κ、λ)。每个重链类别可以与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链彼此共价地结合，并且当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或遗传改造的宿主细胞产生时，两个重链的“尾”部通过共价二硫键或非共价键相互结合。在重链中，氨基酸序列从处于Y构型叉形端的N-端延伸至处于每条连底部的C-端。
轻链和重链均被分为结构和功能同源性区域。术语“恒定”和“可变”功能性地被使用。在这方面，可以理解，轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域决定了抗原的识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予了重要的生物特性，诸如分泌、经胎盘的移动性、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随着它们更加远离抗体的抗原结合位点或氨基端而增加。N-端部分是可变区而在C-端部分的是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包括重链和轻链的羧基末端。
如上所述，可变区允许抗体选择性地识别并特异性地结合抗原上的表位。即，使抗体的VL结构域和VH结构域，或者互补决定区(CDR)的亚群组合以形成限定三维抗原结合位点的可变区。该四级抗体结构形成了存在于Y的每个臂的末端的抗原结合位点。更具体地，抗原结合位点由在每个VH和VL链的三个CDR限定。含有足够的结构以特异性地结合DPR特别是结合形成C9ORF72-DPR的改变的C9ORF72的任何抗体或免疫球蛋白片段在本文被可互换地表示为“结合片段”或“免疫特异性片段”。
如实施例11中所描述的和图13中所示的，本发明的抗体当在哺乳动物细胞特别是CHO-S细胞中表达为IgG、优选IgG1时，在轻链(VL)和重链(VH)链部分表现出高度完整性，而没有能够检测到显著的污染或蛋白水解降解产物。
在天然存在的抗体中，抗体包含存在于每个抗原结合结构域中的有时被称为“互补决定区”或“CDR”的六个高变区，当抗体在含水环境中呈现其三维构造时，上述高变区是被具体定位成形成抗原结合结构域的氨基酸的短的、非连续的氨基酸序列。“CDR”的侧面有四个显示较少分子间变异性的相对保守的“框架”的区域或“FR”。框架区主要采用了β-折叠构象，并且CDR形成连接β折叠结构或在一些情况下形成β折叠结构的一部分的环。因此，框架区起作用以形成提供了使CDR通过链间非共价相互作用以正确的方向定位的支架。由定位的CDR形成的抗原结合结构域限定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补的表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员可以容易地确定分别构成CDR和框架区的氨基酸，这因为它们已被准确地定义；参见，Sequences of Proteins of Immunological Interest(《免疫相关蛋白序列》)，Kabat，E等人，美国卫生和人类服务部(1983)，以及Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.,196(1987),901-917，其全部内容通过引用并入本文。
在本领域中使用的和/或接受的术语存在两种或更多种定义的情况下，除非有明确相反说明，否则如本文中使用的术语的定义旨在包括所有这样的含义。具体的实例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。Kabat，E等人，U.S.Dept.of Health and Human Services，“Sequences of Proteinsof Immunological Interest”(1983)和Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196(1987)，901-917已经描述了该特定区，上述文献通过引用并入到本文中，其中当彼此互相比较时，该定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指抗体或其变体的CDR旨在落入如本文中限定和使用的术语的范围内。作为比较，在表1中列出了包括如由上文引用的参考文献中的每一个定义的CDR的合适的氨基酸残基。包括特定CDR的确切残基数将随着CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员可以常规地确定在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下哪些残基包括该抗体的人IgG亚型的特定高变区或CDR。
表I：CDR定义1
Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1表I中所有CDR定义的编号是根据由Kabat等人提出的编号惯例(参见下文)。
Kabat等人还定义了应用于任何抗体的针对可变域序列的编号系统。本领域普通技术人员可以明确地将该“Kabat编号”系统分配至任何可变域序列，而无需依赖于超出序列本身的任何实验数据。如本文中所使用的，“Kabat编号”是指由Kabat等人U.S.Dept.ofHealth and Human Services，“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)列出的编号系统。除非另外指明，否则对本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中的特定氨基酸残基位置的编号的引用依据Kabat编号系统，然而该系统是理论上的并且不能等同地应用于本发明的每种抗体。例如，取决于第一个CDR的位置，后面的CDR可能在任一方向移动。
本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫特异性片段、变体或衍生物包括但不限于，多克隆、单克隆、多特异性、人类、人源化(humanized)、灵长源化(primatized)、鼠源化(murinized)或嵌合的抗体、单链抗体、表位结合片段，例如，Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段以及抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对本文所公开的抗体的抗Id抗体)。scFv分子在本领域是已知的并且描述于，例如，美国专利5,892,019中。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
在一种实施方式中，本发明的抗体不是具有五价结构的IgM或其衍生物。特别是，在本发明的具体应用中，特别是治疗用途，IgM比IgG和其他二价抗体或相应的结合分子有更低的有用性，这是因为IgM由于其五价结构和缺乏亲和力成熟而经常表现出非特异性交叉反应性和非常低的亲和力。在一种特别优选的实施方式中，本发明的抗体不是多克隆抗体，即其基本上由一种特定抗体种类组成而不是从血浆免疫球蛋白样品获得的混合物。
包括单链抗体的抗体片段可包括单独的或与以下项中的全部或部分组合的一个或多个可变区：铰链区、CH1、CH2、和CH3结构域。结合至本发明的感兴趣的分子的片段也包括在本发明中，所述片段包括一个或多个可变区与铰链区、CH1域、CH2域以及CH3域的任何组合。本发明的抗体或其免疫特异性片段可以是来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡的抗体。在另一实施方式中，可变区可以来源于软骨鱼类(condricthoid)(例如，来源于鲨鱼)。
在一个方面，本发明的抗体是从人分离的人单克隆抗体。可选地，人抗体的框架区根据在如下数据库中有关的人种系可变区序列被比对和采用；参见例如，由MRC蛋白质工程中心(英国剑桥)主办的Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。例如，被认为是可能从真正种系序列脱离的氨基酸可以是由于在克隆过程期间引入的PCR引物序列。相比人工产生的类人抗体(诸如来源于噬菌体展示抗体文库的或异种小鼠的单链抗体片段(scFv))，本发明的人单克隆抗体的特征在于：(i)使用人的免疫反应而不是动物替代品的免疫反应而获得，即抗体是以其相关构象响应于人体内天然DPR和DPR蛋白优选C9ORF72-DPR而产生的，(ii)已经保护个体或者至少是对DPR优选C9ORF72-DPR的存在是显著性的，以及(iii)因为抗体是人源的，针对自身抗原的交叉反应性的风险被最小化；也参见上文。因此，根据本发明，术语“人单克隆抗体”、“人单克隆自身抗体”、“人抗体”等被用来表示人源的DPR结合分子，即其是从诸如B细胞或其杂交瘤的人细胞中分离的，或者它的cDNA是从人细胞(例如人记忆B细胞)的mRNA直接克隆的。人抗体仍然是“人”的，即，人源的即使抗体内进行氨基酸取代，例如，以改善结合特性。在本上下文中，与人源化抗体和其他类人抗体相反，也参见下文的讨论，本发明的人源抗体的特征在于包含已经被人体看到的CDR，因此基本上没有成为免疫原性的风险。因此，如果抗体的可变轻链和重链的一个或两个中的至少一个、优选两个和最优选所有三个CDR来源于本文所例示的人抗体，则本发明的抗体仍然可以表示为人源的。
在一种实施方式中，与天然存在的抗体相比，本发明的人源抗体包括异源区，例如在框架区的氨基酸取代、外源融合到可变区的恒定区、在C-端或N-端不同的氨基酸等。
来源于人免疫球蛋白文库或来源于用于一个或多个人免疫球蛋白转基因的动物的抗体和不表达内源性免疫球蛋白的抗体，如下文描述和例如在Kucherlapati等人的美国专利5,939,598号中，被表示为类人抗体以便将它们与本发明的真正的人抗体区分开。例如，类人抗体(诸如通常从噬菌体展示中分离的合成抗体和半合成抗体)的重链和轻链的配对不一定反映在原始人B细胞中发生的原始配对。因此，现有技术中通常使用的从重组表达文库获得的Fab和scFv片段可被认为是人工的，并具有对免疫原性和稳定性所有可能的相关影响。与此相反，本发明提供了从所选的人类受试者分离的亲和力成熟的抗体，其特征为它们的治疗应用和它们在人体内的容许性。
如本文所用的，术语“啮齿动物源化抗体”或“啮齿动物源化免疫球蛋白”是指包含来源于本发明人抗体的一个或多个CDR以及包含基于啮齿动物抗体序列的氨基酸取代和/或缺失和/或插入的人框架区的抗体。当提到啮齿动物，优选使用来源于小鼠和大鼠的序列，其中包含这样序列的抗体分别被称为“鼠源化的”或“啮齿动物源化的”。提供的CDR的人免疫球蛋白被称为“母体”或“受体”，以及提供框架变化的啮齿动物抗体被称为“供体”。恒定区不需要存在，但如果存在，它们通常与啮齿动物抗体恒定区基本相同，即至少约85％至90％、优选约95％或更多相同。因此，在一些实施方式中，全长鼠源化人重链或轻链免疫球蛋白包含小鼠恒定区、人CDR以及具有一些“鼠源化的”氨基酸取代的基本上人的框架。通常情况下，“鼠源化抗体”是包含鼠源化的可变轻链和/或鼠源化的可变重链的抗体。例如，鼠源化抗体将不包括典型的嵌合抗体，例如，因为嵌合抗体的整个可变区是非小鼠的。通过“鼠源化”过程而被“鼠源化”的修饰的抗体结合到与提供了CDR的母体抗体相同的抗原，并且与母体抗体相比通常在小鼠中是免疫原性较低的。就“鼠源化”抗体的上述解释类似地适用于“啮齿动物源化”抗体，诸如“大鼠源化抗体”，其中大鼠序列代替鼠科动物使用。
如本文所用的，术语“重链部分”包括来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包括以下至少之一：CH1结构域、铰链(例如，上、中、和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体或片段。例如，用于本发明的结合多肽可包括：包含CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一个部分和CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一个部分和CH3结构域的多肽链，或者包含CH1结构域、铰链结构域的至少一个部分、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一实施方式中，本发明的多肽包括包含CH3结构域的多肽链。另外，对于本发明中使用的结合多肽可缺少CH2结构域的至少一个部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。如上所述的，本领域普通技术人员应当理解，这些结构域(例如，重链部分)可被修改，使得它们在氨基酸序列方面不同于天然存在的免疫球蛋白分子。
在本文中公开的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一条多肽链的重链部分与多聚体的另一条多肽链上的重链部分相同。可替换地，本发明的包含重链部分的单体是不相同的。例如，每个单体可包含不同的靶结合位点，从而形成例如双特异性抗体或双抗体。
在另一实施方式中，本文中公开的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物是由单一个多肽链(诸如scFv)组成，并且将要在细胞内表达(胞内抗体(intrabody))，以用于潜在的体内治疗性和诊断性应用。
在本文公开的诊断和治疗方法中使用的结合多肽的重链部分可以源自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可以包括源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链部分可以包括部分地来源于IgG1分子和部分地来源于IgG3分子的铰链区。在又一实例中，重链部分可以包括部分地来源于IgG1分子和部分地来源于IgG4分子的嵌合铰链区。
如本文所用，术语“轻链部分”包括来源于免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选地，轻链部分包含VL或CL结构域中的至少一种。
对于抗体的肽或多肽表位的最小大小被认为是大约四个至五个氨基酸。肽或多肽表位优选包含至少七个、更优选至少九个以及最优选至少约15至约30个氨基酸之间。因为CDR能够以其三级形式识别抗原性肽或多肽，所以包含表位的氨基酸不需要是连续的，并且在某些情况下，甚至可能不在同一肽链上。在本发明中，由本发明的抗体所识别的肽或多肽表位包含DPR(诸如在C9ORF72-DPR中发现的GA15)的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、更优选至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或者约15个至约30个之间的连续或非连续的氨基酸的序列。换句话说，本发明的抗体或其生物技术衍生物优选地识别具有由两种不同氨基酸X和X'(XXX和XXX'；XaaXaa')组成的二肽的重复数(例如3至50、优选10至40、更优选15至30以及最优选15)的DPR。因此，本发明的抗体或其生物技术衍生物所识别的表位或抗原如果由重复数为15的DPR组成则通常可指定为(XX')15。
本文中可互换使用的“特异性结合”或“特异性识别”通常是指结合分子例如抗体通过其抗原结合结构域结合表位，并且该结合引起该抗原结合结构域和表位之间具有某种互补性。根据这个定义，当抗体通过其抗原结合结构域比结合到随机的、不相关的表位更容易地结合一个表位时，该抗体被叙述为“特异性结合”到该表位。术语“特异性”在本文中用于限定某抗体结合某表位的相对亲和力。例如，抗体“A”可被认为具有比抗体“B”更高的对给定表位的特异性，或抗体“A”可以说成是以比对相关的表位“D”更高的特异性结合表位“C”。
当存在时，术语“免疫结合特性”，或抗体与抗原的其他结合特性，以其所有语法形式，是指抗体的特异性、亲和力、交叉反应性以及其他结合特性。
“优选地结合”是指结合分子(例如抗体)特异性地结合至表位比该抗体结合至相关的、类似的、同源的或者类似表位更容易。因此，“优先地结合”至给定表位的抗体将比结合至相关表位更容易结合至该给定表位，即使这样的抗体可能与相关表位交叉反应。
通过非限制性示例的方式，如果结合分子(例如抗体)以比该抗体针对第二表位的离解常数(KD)低的KD结合所述第一表位，则可以认为该抗体优选地结合第一表位。在另一非限制实例中，如果抗体以比该抗体针对第二表位的KD低至少一个数量级的亲和性结合至第一表位，则可以认为该抗体优选地结合至第一抗原。在另一非限制的实例中，如果抗体以比该抗体针对第二表位的KD低至少两个数量级的亲和性结合第一表位，则可以认为该抗体优选地结合第一表位。
在另一非限制实例中，如果结合分子(例如，抗体)以比第二表位的解离率(offrate)(k(off))低的k(off)结合第一表位，那么可以认为该抗体优选地结合第一表位。在另一非限制的实例中，如果抗体以比该抗体针对第二表位的k(off)低至少一个数量级的亲和性结合第一表位，那么可以认为该抗体优选地结合第一表位。在另一非限制的实例中，如果抗体以针对第二表位的k(off)低至少两个数量级的亲和性结合第一表位，那么可以认为该抗体优选地结合第一表位。
本文公开的结合分子(例如抗体或抗原结合片段、变体或衍生物)可以被认为以小于或等于5x 10-2秒-1、10-2秒-1、5x l0-3秒-1或l0-3秒-1的解离速率(k(off))结合DPR或其片段、变体或特定的构象。更优选地，本发明的抗体可以被认为以小于或等于5x 10-4秒-1、10-4秒-1、5x 10-5秒-1或10-5秒-1、5x 10-6秒-1、10-6秒-1、5x 10-7秒-1或10-7秒-1的解离速率(k(off))结合DPR蛋白或其片段、变体或特定的构象。在特别优选的实施方式中，DPR是与C9ORF72相关的DPR，即C9ORF72-DPR。
本文公开的结合分子(例如抗体或抗原结合片段、变体或衍生物)可以被认为以大于或等于103M-1秒-1、5x 103M-1秒-1、104M-1秒-1或5x 104M-1秒-1的结合速率(k(结合))结合DPR或其片段、变体或特定的构象。更优选地，本发明的抗体可以说成以大于或等于105M-1秒-1、5x 105M-1秒-1、106M-1秒-1或5x 106M-1秒-1或107M-1秒-1的结合速率(k(结合))结合DPR或其片段、变体或特定的构象。在一种实施方式中，结合分子可以被说成以大于或等于103M-1秒-1、5x 103M-1秒-1、104M-1秒-1或5x 104M-1秒-1的结合速率(k(结合))结合C9ORF72-DPR或其片段、变体或特定的构象。更优选地，本发明的抗体可以被说成以大于或等于105M-1秒-1、5x 105M-1秒-1、106M-1秒-1或5x 106M-1秒-1或107M-1秒-1的结合速率(k(结合))结合C9ORF72-DPR或其片段、变体或特定的构象。
如果结合分子(例如，抗体)优先结合到给定表位到这样的程度，使得在一定程度上阻止参考抗体与该表位的结合，则该抗体被认为竞争性抑制该参考抗体与该给定表位的结合。竞争性抑制可以通过本领域中已知的任何方法(例如，竞争ELISA测定)来确定。抗体可以被认为竞争性地抑制参考抗体与给定表位至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％的结合。
如本文所用的，术语“亲和力”是指个体表位与结合分子(例如，免疫球蛋白分子)CDR的结合强度的度量；参见例如，Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，第二版，(1988)，27-28页。如本文所用的，术语“亲合力”是指免疫球蛋白的群体与抗原之间的复合物的整体稳定性，也就是说，免疫球蛋白与抗原的混合物的功能性结合强度；参见例如，Harlow，在29-34页。亲合力与群体中个体免疫球蛋白分子与特异性表位的亲和力以及免疫球蛋白与抗原的价数相关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复的表位结构的抗原(诸如聚合物)之间的相互作用将是高亲合力之一。抗体对抗原的亲和力或亲合力可以通过实验使用任何合适的方法来确定；参见例如，Berzofsky等人“Antibody-Antigen Interactions(抗体-抗原相互作用)”于Fundamental Immunology,Paul,W.E.,Ed.,Raven Press NewYork,N Y(1984),Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company New York,N Y(1992)，以及其中描述的方法。用于测量抗体对抗原的亲和力的一般技术包括ELISA、RIA和表面等离子体共振。如果在不同的条件(例如，盐浓度、pH)下测定，测得的特定抗体-抗原相互作用的亲和力可以不同。因此，亲和力和其他抗原结合参数(例如KD、IC50)的测量优选用抗体和抗原的标准化溶液和标准化的缓冲液进行。
结合分子(例如，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)也可以根据它们的交叉反应性进行描述或规定。如本文所用的，术语“交叉反应性”是指对一种抗原有特异性的抗体与第二种抗原反应的能力；两种不同的抗原性物质之间相关性的度量。因此，如果抗体结合到除诱导其形成的那个表位之外的一个表位，则该抗体是交叉反应性的。交叉反应性表位通常含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下，实际上可能比原始的更适合。
例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，这是因为它们结合相关但不相同的表位，例如，与参考表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％同一性(正如使用本领域已知的和本文所描述的方法计算的)的表位。如果抗体并不与与参考表位具有少于95％、少于90％、少于85％、少于80％、少于75％、少于70％、少于65％、少于60％、少于55％以及少于50％的同一性(如使用本领域已知的和本文中描述的方法计算得来的)表位结合，则可以认为该抗体具有较少的交叉反应性或不具有交叉反应性。如果抗体不与某一表位任何其他类似物、直系同源物或同系物结合，则可以认为该抗体针对该表位“高度特异性”。
结合分子例如本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可以根据其对DPR和/或显示C9ORF72-DPR的突变的C9ORF72种类和/或它们的片段的结合亲和力来描述或具体化。优选的结合亲和力包括具有解离常数或Kd小于5x 10-2M、10-2M、5x 10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x 10-5M、10-5M、5x 10-6M、10-6M、5x 10-7M、10-7M、5x 10-8M、10-8M、5x 10-9M、10- 9M、5x 10-10M、10-10M、5x 10-11M、10-11M、5x 10-12M、10-12M、5x 10-13M、10-13M、5x 10-14M、10- 14M、5x 10-15M或10-15M的结合亲和力。
如前面所指出的，各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维结构是众所周知的。如本文所用的，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基端可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链第一(最氨基端)恒定区的结构域。CH1结构域毗邻VH结构域，并且是对于免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基端。
如本文所用的，术语“CH2结构域”包括例如从使用常规的编号方案的抗体的约残基244延伸至残基360(残基244至360，Kabat编号系统；以及残基231-340，EU编号系统；参见Kabat EA等人同上)的重链分子的部分。CH2结构域的独特之处在于它不与另一个结构域紧密配对。相反地，在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间插入两个N-连接的分支糖链。也被很好地记载的是，CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C-端，并且包含大约108个残基。
如本文所用的，术语“铰链区”包括将CH1结构域连接至CH2结构域的重链分子的部分。该铰链区包括大约25个残基并且是柔性的，因此允许这两个N端抗原结合区独立地移动。铰链区可以被细分成三个不同的结构域：上铰链结构域、中铰链结构域和下铰链结构域；参见Roux等人,J.Immunol.161(1998),4083-4090。
如本文所用的，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可以与另一巯基形成二硫键或桥的巯基。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，并且两个重链通过两个位于相应于使用Kabat编号系统239和242位(226或229位，EU编号系统)的二硫键连接。
如本文中所使用的，术语“连接的”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语是指通过任何手段(包括化学缀合或重组手段)将两个以上元件或组分接合在一起。“框内融合”是指两个或更多个多核苷酸的开放阅读框(ORF)以保持原始ORF的正确翻译阅读框的方式形成连续的较长的ORF而进行的接合。因此，重组融合蛋白是含有对应于由原始ORF编码的多肽的两个或多个区段(在自然条件下，这些区段通常不是如此接合)的单一蛋白质。虽然因此使阅读框在全部融合区段是连续的，但是这些区段可以通过例如框内连接序列在物理上或空间被分开。例如，编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸可以在框内被融合，但是通过编码至少一个免疫球蛋白框架区或附加CDR区的多核苷酸分开，只要“融合的”CDR作为连续多肽的一部分被共翻译。
如本文所用的术语“表达”是指基因藉以产生生化物质(biochemical)，例如RNA或多肽的过程。该过程包括基因在细胞内的功能性存在的任何表现，包括但不限于，基因敲除以及暂时表达和稳定表达二者。其包括但不限于基因转录进入信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物，以及mRNA翻译为一种或多种多肽。如果最终期望的产物是生化物质，表达包括该生化物质和任何前体的产生。基因的表达产生“基因产物”。如本文所使用的，基因产物可以是核酸，例如，通过基因转录产生的信使RNA，或者是从转录本翻译的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰(例如，多腺苷酸化)的核酸，或具有翻译后修饰(例如，甲基化、糖基化、添加脂质、与其他蛋白亚基结合、蛋白水解裂解等等)的多肽。
如本文所用的，术语“样品”是指从受试者或患者获得的任何生物材料。在一个方面，样品可以包括血液、腹膜液、CSF(脑脊液)、唾液或尿液。在其他方面，样品可以包括全血、血浆、血清、从血样富集的B细胞和培养的细胞(例如，来自受试者的B细胞)。样品还可以包括活检组织或组织样品，包括神经组织。在又一个方面，样品可以包括全细胞和/或该细胞的裂解物。血液样品可以通过本领域中已知的方法来收集。
疾病：
除非另有说明，否则术语“病症”和“疾病”在本文中可互换使用，并且包括受试者、动物、分离的器官、组织或细胞/细胞培养物的任何不期望生理变化。
额颞叶变性(FTLD)是与大脑额叶和颞叶中的萎缩相关的发病机理。此外，50％的FTLD患者还显示具有阳性家族史并与肌萎缩性侧索硬化(ALS)相比。如上所述，发病机理的共同根本原因似乎是位于FTLD和ALS患者的C9ORF72中的杂合扩增的六核苷酸重复。特别地，显示了得到的两个氨基酸的重复单元(二肽重复，DPR)。
然而，在若干种其他疾病和/或病症中也已经报道了导致两个氨基酸重复(DPR)的扩增的六核苷酸重复。疾病包括但不限于额颞叶变性(FTLD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、FTLD-ALS和/或脊髓小脑性共济失调36型以及与其相关的症状。
由于本发明的抗体已显示能够与FTLD患者的组织切片中的DPR特别是C9ORF72-DPR结合，参见例如实施例12和图14，该人源抗体及其生物技术衍生物可用于治疗和诊断FTLD以及与DPR相关的其他疾病和/或病症及其症状。特别地，在基于细胞的模型中或在所选的C9orf72六核苷酸重复扩增小鼠模型中分别评价了本发明的抗体在调节疾病进展上的体外和体内治疗潜力；参见例如，实施例14和15。
因此，在本发明的一种实施方式中，本发明的抗体、具有与本发明的任何一种抗体基本上相同的结合特异性的结合分子、本发明的多核苷酸、载体或细胞用于制备用于预防性和/或治疗性处理与DPR相关的疾病的药物组合物或诊断组合物，用于监测疾病进展和/或治疗反应以及用于诊断包括额颞叶变性(FTLD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、FTLD-ALS和/或脊髓小脑性共济失调36型的与DPR淀粉样变性相关的疾病。
如实施例12和13以及图14和15中所示的，本发明的抗体与FTLD患者中的病理性C9ORF72-二肽重复蛋白聚集体结合。因此，在本发明的一种实施方式中，本发明的抗体、具有与本发明的任何一种抗体基本上相同的结合特异性的结合分子、本发明的多核苷酸、载体或细胞用于制备用于预防性和/或治疗性处理与C9ORF72-DPR相关的疾病的药物组合物或诊断组合物，用于监测疾病进展和/或治疗反应以及用于诊断包括额颞叶变性(FTLD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和/或FTLD-ALS的与C9ORF72-DPR聚集体相关的疾病和与其相关的症状。
治疗：
如本文所用的，术语“进行治疗”或“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防范性措施二者，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或病症，诸如心脏缺陷的发展。有益的或期望的临床结果，包括但不限于症状的减轻、疾病程度的降低、稳定的(即，不恶化的)疾病状态、延缓或减慢疾病进展、改善或缓和疾病状态和缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以指相较于如果不接受治疗的预期存活延长了的存活。需要治疗的那些对象包括已经患有所述病症或病症的那些对象，以及倾向于患上所述病症或病症的那些对象或要防止所述病症或病症的表现的那些对象。
如果没有另外说明，则术语则术语“药物(drug)”、“药品(medicine)”或者“药剂(药物，medicament)”在本文中互换使用，并且应该包括但不限于以下所有：(A)内用或外用的制品、药品以及制剂，以及旨在用于诊断、治愈、减轻、治疗或者防止人或者其他动物疾病的任何物质或者物质的混合物；以及(B)旨在影响人体或其他动物身体的结构或任何功能的制品、药品和制剂(除了食物)；以及(C)旨在用于(A)项和(B)项中规定的任何制品的组分的制品。术语“药物(drug)”、“药品(medicine)”或者“药剂(medicament)”应该包括旨在用于人或其他动物中的制剂的完整配方，其包括一种或多种“药剂”、“化合物”、“物质”或“(化学)组合物”并且在一些其他情况下还包括其他药学上无活性的赋形剂作为填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、粘合剂或者在人或其他动物的身体内的预定目标位置(例如，在皮肤上，在胃或肠中)确保“药物”，“药品”或“药剂”的容易运输，崩解，解聚，溶出和生物可用性。术语“试剂”、“化合物”或“物质”在本文中可互换使用，并且在更具体的上下文中，应当包括，但不限于所有的药理学活性剂，即诱导期望的生物学或药理学效果或研究或测试用于通过本发明的方法诱导这样的可能的药理作用的能力的试剂。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指任何受试者，特别是哺乳动物受试者(例如，人类患者)，对于他们来说，诊断、预后、预防或治疗是期望的。
药物载体：
可以从对本领域技术人员来说已知的相应文献中获取药学上可接受的载体和施用途径。本发明的药用组合物可以根据本领域中已知的方法来配制；参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿：药学的科学与实践》)(2000)，由在费城的科学大学，ISBN 0-683-306472，Robinson等人,Vaccine Protocols(《疫苗方法》)，第二版Humana出版社,Totowa,新泽西州,美国,2003；Banga,Therapeutic Peptides andProteins:Formulation,Processing,and Delivery Systems(《治疗性多肽和蛋白质：配方，加工和递送系统》)，第二版，Taylor和Francis出版社.(2006),ISBN:0-8493-1630-8。合适的药物载体的实例在本领域中是熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂(诸如油/水乳剂)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包含这样载体的组合物可以通过熟知的传统的方法来配制。这些药用组合物可以以合适的剂量施用给受试者。合适的组合物的施用可以通过不同的方式来实现。实例包括通过口服、鼻内、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、真皮下、经皮、鞘内以及颅内方法施用包含药学上可接受载体的组合物。诸如鼻喷雾制剂的气雾剂制剂包括带有防腐剂和等渗剂的活性剂的纯化水溶液或其他溶液。这种制剂优选调节至与鼻腔粘膜一致的pH和等渗状态。本发明中也设想用于口服施用的药用组合物，诸如单结构域抗体分子(例如，“nanobodiesTM”(“纳米抗体TM”))等。这种口服制剂可以是片剂、胶囊、粉末、液体或半固体形式。片剂可以包含固体载体，诸如明胶或佐剂。用于直肠或阴道施用的制剂可以呈现为具有合适载体的栓剂；也参见O'Hagan等人,NatureReviews,Drug Discovery 2(9)(2003),727-735。关于适合于不同类型施用的制剂的进一步指导可以在Remington's Pharmaceutical Sciences(《雷明顿氏药物科学》),Mace出版公司,费城,宾夕法尼亚州,第17版(1985)和相应的更新中找到。对于药物递送方法的简要综述，参见Langer,Science 249(1990),1527-1533。
II.本发明的抗体
本发明主要涉及人源抗DPR优选抗C9ORF72-DPR的抗体与其抗原结合片段以及生物技术衍生物，其优选地表明免疫结合特性和/或如在实施例中说明的为抗体所列出的生物学性质。根据本发明，对DPR特异性的人单克隆抗体是从健康人受试者的库(pool)克隆的。但是，在本发明的另一种实施方式中，人单克隆抗DPR抗体也可能是从呈现出与DPR聚集相关的疾病和/或病症的症状的患者克隆的。
在按照本发明进行的实验的过程中，对于来源于培养的人记忆B细胞(被初步筛选DPR结合)的条件培养基中存在的抗体的重组IgG抗体，评价了它们结合DPR的能力和结合包括牛血清白蛋白(BSA)的其他蛋白的能力；参见实施例3至7以及图2至6。在筛选中仅能结合DPR蛋白而不能结合任何其他蛋白的B细胞的上清液被选择用于进一步分析，包括确定所述抗体类和轻链亚类。然后对所选的B细胞进行处理以用于抗体克隆；参见实施例1和12以及图14。
简言之，该克隆方法包括从所选择的B细胞中提取信使RNA、通过RT-PCR逆转录、通过PCR扩增抗体编码区、克隆到质粒载体中和测序。然后通过在HEK293细胞或CHO细胞中的重组表达和纯化来产生所选择的人抗体，并且随后表征它们结合人DPR蛋白的能力。各种测试的组合，例如在HEK293细胞或CHO细胞中的抗体的重组表达和随后的其对人DPR蛋白结合特异性的表征，以及它们对人DPR蛋白的病理性突变的和/或聚集形式的区别性的结合，证实了对于DPR有高特异性并区别性识别和选择性结合DPR蛋白的病理性聚集形式(例如C9ORF72-DPR)的人抗体已经首次被克隆。在一些情况下，在本发明的人抗体可变结构域的基础上也产生了小鼠嵌合抗体。
因此，本发明主要涉及重组人源单克隆抗DPR抗体和其DPR结合片段、合成衍生物和生物技术衍生物以及变体。在本发明的一种实施方式中，抗体能够结合人C9ORF72-DPR。
在本发明的一种实施方式中，抗体结合DPR蛋白或肽，其中重复数为约10至20、优选15，如在实施例中对于C9ORF72的GA、GP、GR、PR和PA重复所用的；参见例如，实施例8和9以及图7和8。DPR蛋白可以基本上仅由DPR组成或在较大的多肽内包含DPR，例如在N-端、C-端或在C9ORF72中外显子1中的如GA或GP重复之间中。
此外，如实施例12和13中所论述的以及在图14和15中所示的，本发明的人源单克隆NI-308.18F7、NI-308.15O7、NI-308.5G2和NI-308.4M1抗DPR抗体优选地特征在于与病理性突变的和/或聚集的C9ORF72-DPR特异性结合并且基本上不识别生理形式的C9ORF72；参见例如图14和15。因此，本发明提供了一组具有对诊断和治疗目的特别有用的具有结合特性的人抗DPR抗体。因此，在一种实施方式中，本发明提供了能够特异性结合病理性聚集形式的DRP蛋白(例如C9ORF72-DPR)的抗体。
在一种实施方式中，本发明的抗体表现出如在实施例中所述的示例性NI-308.18F7、NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2、NI.308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI-308.6B11、NI-308.46F8、NI-308.4M1、NI-308.12A3和NI-308.16C10抗体中任一个的结合特性。本发明的抗DPR抗体优先识别病理性改变的C9ORF72，诸如C9ORF72-DPR种类及其片段，而不是生理性C9ORF72。因此，在一种实施方式中，本发明的抗体基本上不识别生理性C9ORF72种类。
当在本申请中用于描述包括抗体、其片段或结合分子的组的分子对于特定靶分子、抗原和/或靶分子和/或抗原的构象的结合亲和力时，术语“基本上不识别”是指上述组的分子以为上述组的分子结合另外的分子、抗原和/或构象的结合亲和力至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍小的结合亲和力结合所述分子、抗原和/或构象。很经常地，解离常数(KD)被用作结合亲和力的量度。有时，关于特定的测定法例如ELISA测定法的EC50被用作结合亲和力的量度。优选地，术语“基本上不识别”在本申请中使用时，指的是上述组的分子以为上述组的所述分子结合另外的分子、抗原和/或构象的结合亲和力至少10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或10000倍小的结合亲和力结合所述分子、抗原和/或构象。
如上所述，显示FTLD和ALS中C9ORF72聚集的最常见的遗传原因是由于位于C9ORF72基因的非编码外显子1a和1b之间的杂合扩增的六核苷酸重复(GGGGCC)。特别地，显示在三个交替阅读框(即扩增的六核苷酸重复的)中的正义转录本的这些非常规非ATG翻译导致不同多肽的产生、生成和聚集，每种多肽包含两种氨基酸的重复单元(二肽重复，DPR)，即聚-(甘氨酸-丙氨酸；GA)、聚-(甘氨酸-脯氨酸；GP)和/或聚-(甘氨酸-精氨酸；GR)。因此，在本发明的一种实施方式中，DPR包含聚-甘氨酸-丙氨酸(甘氨酸-丙氨酸；GA)、聚-甘氨酸-脯氨酸(甘氨酸-脯氨酸；GP)或聚-甘氨酸-精氨酸(甘氨酸-精氨酸；GR)重复。在优选的实施方式中，DPR由聚-甘氨酸-丙氨酸(甘氨酸-丙氨酸；GA)或聚-甘氨酸-脯氨酸(甘氨酸-脯氨酸；GP)重复组成。
尽管扩增的六核苷酸重复位于C9ORF72的非编码外显子1a和1b之间的事实以及突变的C9ORF72缺少起始密码子的事实，但所有阅读框架被翻译成二肽重复(DPR)蛋白，即聚-(甘氨酸-丙氨酸；GA)、聚-(甘氨酸-脯氨酸；GP)和/或聚-(甘氨酸-精氨酸；GR)。初步研究还显示，在按照本发明进行的实验中已鉴定和克隆的抗体不仅使与GA、GP或GP型的C9ORF72-DPR(即在正义链方向上翻译的(正义DPR))相关的小脑的颗粒细胞层中的神经元细胞质包涵体、神经元核内包涵体和营养不良性神经突染色，如实施例12和13以及图14和15中所示的，而且使能够识别双向翻译的DPR(即在其反义方向翻译的二肽重复蛋白，即聚-(脯氨酸-精氨酸；PR)和/或聚-(脯氨酸-丙氨酸；PA))的抗体染色。因此，提供了能够鉴定和结合来源于两条链(即，以正义和反义方向翻译的C9ORF72的外显子1a和1b之间的非编码区的扩增的六核苷酸重复产生的DPR)的C9ORF72蛋白产物的聚集的抗体。因此，在一种实施方式中，抗DPR抗体、DPR结合分子或其片段、合成变体或生物技术变体识别从C9ORF72基因在其正义和/或反义方向上翻译的DPR。在优选的实施方式中，DPR抗体识别聚-(甘氨酸-丙氨酸；GA)、聚-(甘氨酸-脯氨酸；GP)、聚-(甘氨酸-精氨酸；GR)、聚-(脯氨酸-精氨酸；PR)和/或聚-(脯氨酸-丙氨酸，PA)类型的DPR。
此外，在初步实验中，鉴定了可结合DPR的不同集群(即DPR蛋白的不同氨基酸组成)的DPR抗体。特别地，观察到了识别由(PA)n和(GA)n、(GP)n和(GA)n、(PR)n和(GA)n、或(GR)n和(GA)n和(PR)n两者组成的DPR蛋白的DPR抗体。因此，在本发明的一种实施方式中，DPR抗体可以识别由显示不同氨基酸组成的DPR蛋白的组合所组成的DPR蛋白。因此，如实施例中所论述的和图2A至M和7A至P中所示的，获得了以相同数量级特异性识别两种或甚至三种不同的二肽重复的人源抗体。在优选的实施方式中，抗DPR抗体可以识别由DPR蛋白组合组成的DPR蛋白，其中DPR蛋白是(PA)n或(GA)n、(GP)n或(GA)n、(PR)n或(GA)n、或(GR)n或(GA)n或(PR)n，即本发明的抗DPR抗体可以识别DPR的任何组合，优选如对抗体NI-308.5G2所示的(GP)n和(GA)n(参见图2A和G以及图7A、B、J和K)或如对抗体NI-308.6B11所示的(GR)n、(GA)n和(PR)n(参见图2A和I以及图7A、C、L和M)或如对抗体NI-308.4M1所示的(PA)n和(GA)n(参见图2A和K以及图7E和P)或如对抗体NI-308.16C10所示的(PR)n和(GA)n(参见图2A和M)。
可替换地或另外，本发明的抗体可以被基因改造成包含至少第一抗原结合位点和第二抗原结合位点，即来自具有不同表位的本发明的两种不同抗体的可变结构域，优选地其中一个或两个可变区来源于所附实施例和附图中所例示和如本文进一步所述的受试抗体中的任一个。例如，抗体NI-308.6B11和NI-308.4M1的可变区的组合将产生能够结合由(GA)n、(GR)n、(PR)n和(PA)n组成的DPR组合的抗体。因此，受试抗体使得能够提供能够识别DPR的任何组合的抗体。可以通过本领域熟知的方法来产生双特异性和多特异性抗体，例如通过如例如由Brennan等人,Science.229(1985),81-83所描述的单克隆免疫球蛋白G1片段的化学重组，或者重组同时共表达适当的重链和轻链以及相应的配对；参见例如，Lewis等人,Nature Biotechnology 32(2014),191-198)；综述参见例如，Kontermann,mAbs 4(2012),182-197和Kontermann和Brinkmann,Drug Discovery Today 20(2015),838-847。
在若干项研究中已经证明，DPR在患者中的聚集主要发生在具有更高数目的二肽重复的患者中。因此，在本发明的一种实施方式中，DPR结合分子结合至含有较高数目的重复的DPR蛋白，即由(GA)n、(GP)n、(GR)n、(PR)n和(PA)n组成的DPR。这里n表示重复的数目，例如，具有15个重复的DPR蛋白将表示为(XX)15，也意味着例如六核苷酸扩增G4C2被重复15次。在优选的实施方式中，重复数为10至30(XX')10-30。在特别优选的实施方式中，重复数为(XX')15。
然而，不受理论束缚，较小的重复尺寸(即<15个重复、优选<10个重复、更优选<5个重复)可以在表面致密包被时模拟较大的肽。因此，在本发明的一种实施方式中，DPR抗体结合到由(GA)n、(GP)n、(GR)n、(PR)n或(PA)n组成的DPR，其中重复数(n)低于15个重复。在优选的实施方式中，DPR抗体结合到由(GA)n、(GP)n、(GR)n、(PR)n或(PA)n组成的DPR，其中重复数(n)低于10个重复。在特别优选的实施方式中，DPR抗体结合到由(GA)n、(GP)n、(GR)n、(PR)n或(PA)n组成的DPR，其中重复数(n)低于5个重复。初步实验显示，本发明的DPR抗体结合到仅显示3个至4个重复的DPR蛋白也是可能的；参见例如，图7。因此，在本发明的一种实施方式中，3个至4个重复对于DPR抗体的结合是足够的。在一种实施方式中，本发明的抗体基本上没有或仅显著较低程度地结合到具有少于3个的上述二肽重复中个任一个(n<3)的表位；参见例如，实施例8和9以及图7和8。
如实施例中所示的，特别是在实施例3和4中所示出的，设计显示出更高数目的二肽重复的不同DPR构建体。特别地，构建了显示15个重复的DPR构建体，即(GA)15、(GP)15、(GR)15、(PA)15和(PR)15。利用这些构建体，进行按照本发明鉴定的抗体的表征研究；参见例如，实施例3和4。结果表明，抗体NI-308.18F7、NI-308.15O7、NI-308.28G1和NI-308.45C2以高亲和力特异性地结合至C9ORF72-DPR(GA)15，但不结合至由(GP)15、(GR)15、(PA)15或(PR)15组成的DPR；参见例如，图2A、B、C、D和E以及图3A、B、C、D和E。相比之下，抗体NI-308.5G2、NI-308.12A3和NI-308.46E9以高亲和力特异性地识别C9ORF72-DPR(GA)15和(GP)15，但不特异性识别由(GR)15、(PA)15或(PR)15组成的DPR；参见例如，图2A、G、H和L以及图3A、G、H和L。抗体NI-308.24E11仅识别C9ORF72-DPR(PR)15，而不识别由(GP)15、(GR)15、(GA)15或(PA)15组成的DPR；参见例如，图2A和F以及图3A和F。相比之下，抗体NI-308.16C10优先识别C9ORF72-DPR(PR)15并且还结合至(GA)15，但不结合至由(GP)15、(GR)15或(PR)15组成的DPR；参见图2A和M以及图3A和M。令人惊奇的是，抗体NI-308.6B11和NI.308.46F8显示出对(GR)15、(GA)15或(PR)15的高亲和力，而不是由(GP)15或(PA)15组成的DPR；参见例如，图2A、I和J以及图3A、I和J。抗体NI-308.4M1识别C9ORF72-DPR(PA)15和(GA)15，但不识别由(GP)15、(GR)15或(PR)15组成的DPR；参见例如，图2A和K以及图3A和K。因此，在一种实施方式中，本发明的抗体优选识别由(GA)15组成的DPR蛋白。在另一实施方式中，识别由(GA)15组成的DPR蛋白的本发明的抗体基本上不识别由(GP)15或(GR)15或(PA)15或(PR)15组成的DPR蛋白。在又一实施方式中，本发明的抗体优选识别由(GP)15或(GA)15组成的DPR蛋白，优选识别由(GP)15或(GA)15组成的DPR蛋白的抗体基本上不识别由(GR)15或(PR)15或(PA)15组成的DPR蛋白。在再一实施方式中，识别由(PR)15组成的DPR蛋白的本发明抗体基本上不识别由(GA)15、(GP)15或(GR)15或(PA)15组成的DPR蛋白。在又另一实施方式中，识别由(GA)15、(GR)15或(PR)15组成的DPR蛋白的本发明抗体基本上不识别由(GP)15或(PA)15组成的DPR蛋白。在另一实施方式中，本发明的抗体优选识别由(PA)15或(GA)15组成的DPR蛋白，优选识别由(PA)15或(GA)15组成的DPR蛋白的抗体基本上不识别由(GP)15或(GR)15或(PR)15组成的DPR蛋白。在又一实施方式中，本发明的抗体优选识别由(GA)15或(PR)15组成的DPR蛋白，优选识别由(PR)15或(GA)15组成的DPR蛋白的抗体基本上不识别由(GP)15或(GR)15或(RA)15组成的DPR蛋白。换句话说，那些实施方式中的抗体能够结合单个的或至少两种不同的DPR蛋白，参见例如，示例性的抗体NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2、NI-308.18F7、NI-308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI-308.6B11、NI-308.46F8、NI-308.4M1、NI-308.12A3和NI.308-16C10，如实施例3和4中以及图2和3中所例示的。
利用如实施例中描述的构建体，可以显示本发明的抗DPR抗体结合到人C9ORF72-DPR(GA)15或(GP)15，或(GR)15，或(PR)15，或(PA)15。在该上下文中，本发明的抗DPR抗体中任一个或其生物技术衍生物的结合亲和力可以在如在图2中对示例性NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2、NI-308.18F7、NI-308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI-308.6B11、NI-308.46F8、NI-308.4M1、NI-308.12A3和NI-308.16C10抗体所示的范围内，即具有对BSA-(GA)15、BSA-(GP)15或BSA-(PA)15构建体的约0.1nM至200nM、优选1pM至100nM的半数最大有效浓度(EC50)、更优选地约50pM至50nM的EC50、最优选地约0.1nM至0.5nM的EC50以及对BSA-(PR)15构建体的最优选约10nM至200nM的EC50；参见例如，图3A-M。
优选地，抗DPR抗体、其DPR结合片段或生物技术衍生物具有对应于用于结合DPR蛋白(GA)15、(GR)15或(PR)15的>200nM、优选≤100nM、更优选≤50nM、甚至更优选≤10nM和最优选≤0.5nM或者用于结合DPR蛋白(GP)15或(PA)15的≤10nM、优选≤2nM、甚至更优选≤1nM和最优选≤0.5nM的EC50(半数最大有效浓度)值的结合亲和力；参见例如，图2A-M。
一些抗体能够结合到多种生物分子，例如，蛋白质。如本领域技术人员将理解的，术语特异性的在本文中用于表示不是DPR的其他生物分子并不显著地结合到抗原结合分子，例如本发明的抗体中的一个。优选地，与不是DPR的生物分子结合的水平分别导致了至多仅为对DPR的亲和力的20％或更低、10％或更少、仅为5％或更少、仅为2％或更少或者仅为1％或更少(即为至少5倍、10倍、20倍、50倍或100倍低，或超过此数的任何倍数)的结合亲和力；参见例如，实施例3至5以及图2至4。
在一种实施方式中，本发明的抗DPR抗体优先结合至DPR的聚集形式，例如C9ORF72-DPR和/或其片段、衍生物、原纤维和/或寡聚体。在另一实施方式中，本发明的抗DPR抗体优先结合至与疾病和/或病症不相关的C9ORF72-DPR和C9ORF72-DPR的病理性聚集形式二者；参见例如，实施例10以及图9至12。在又一实施方式中，本发明的抗DPR抗体能够结合至溶液中的DPR(例如C9ORF72-DPR和/或其片段、衍生物、原纤维和/或低聚物)的形式；参见实施例7以及图6。在本上下文中，本发明的抗DPR抗体中的任一个或其生物技术衍生物可能能够捕获在溶液中的聚-GA DPR蛋白肽，如对示例性的抗体NI-308.15O7、NI-308.18F7、NI-308.45C2和NI-308.28G1所示的，或者本发明的抗DPR抗体中的任一个或其生物技术衍生物可能能够沉淀聚-PR和聚-GR，如对示例性的抗体NI-308.24E11和NI-308.6B11所示的；参见例如，图6(A)至(C)。
在图14和15以及实施例12和13中，显示了本发明的抗体能够染色与DPR的聚集体特别是C9ORF72-DPR蛋白的聚集体相关的FTLD患者的小脑颗粒细胞层中的病理性神经元细胞质包涵体、神经元核内包涵体和营养不良性神经突。因此，在一种实施方式中，本发明的抗体能够结合人组织中的聚集的C9ORF72。在特别优选的实施方式中，抗体能够结合人FTLD组织中的聚集的C9ORF72。如所提及的，聚集的C9ORF72意指突变的C9ORF72，其在其非编码区中显示如上所述的扩增的六核苷酸重复。这种重复导致ATG起始侧的缺失和该重复的翻译进入DPR，如上文所述的。
如前面所提及的，DPR蛋白聚集体在脑的额叶和颞叶中的累积是神经变性疾患FTLD的标志。在小脑的颗粒细胞层的神经元细胞质包涵体、神经元核内包涵体和营养不良性神经突中具有DPR聚集体的患者，如本发明的图14和15以及实施例12和13中所示的，通常显示出改变的认知功能。特别地，患有FTLD的患者显示痴呆、行为的改变以及个性、语言功能障碍和/或精神病是由于前额和颞皮质的退化，如上文所述的。因此，在一种实施方式中，本发明的抗体可用于治疗与DPR相关的疾病和/或病症。在优选的实施方式中，本发明的抗体可用于治疗FTLD及其症状。
本发明还涉及抗体、其抗原结合片段、生物技术变体和衍生物，其中抗体包含与选自由以下组成的组中的抗体的抗原结合域相同的抗原结合域：NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2、NI-308.18F7、NI-308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI-308.6B11、NI-308.46F8、NI-308.4M1、NI-308.12A3和NI-308.46C10或能够与用于结合DPR(例如，(GA)15或(GP)15或(GR)15或(PR)15或(PA)15)的任一或所有抗体竞争。
本发明进一步举例说明了几种结合分子，例如，识别DPR的抗体及其结合片段，其可以被表征为在其可变区(如结合结构域)中包括包含图1A-L中任一个所描述的氨基酸序列中的任一个的VH和/或VL可变区的至少一个互补决定区(CDR)。
编码上述识别的可变区的相应核苷酸序列在下面的表II中阐述。VH和/或VL区的上述氨基酸序列的CDR的示例性组被描绘在图1A-L的任一个中。然而，如在下面所讨论的，本领域技术人员对下述事实是非常清楚的，即另外地或可替换地，氨基酸序列与在图1A-L中任一个所阐述的氨基酸序列的差别在CDR2和CDR3的情况下为一个、两个、三个或甚至更多氨基酸的CDR可能被使用。因此，在一种实施方式中，提供了本发明的抗体、其生物技术衍生物或DPR结合片段，在其可变区包含至少一个如图1A-L中任一个所描述的互补决定区(CDR)和/或其包含一个或多个氨基酸取代的一个或多个CDR。
在一种实施方式中，本发明的抗体是包含如图1A-L中任一个所描绘的VH和/或VL区氨基酸序列或其包含一个或多个氨基酸取代的VH和/或VL区的抗体的任一种。优选地，本发明抗体的特征在于重链和轻链同源配对的保存，正如人B细胞中存在的。在本发明的进一步的实施方式中，抗DPR抗体、其DPR结合片段、合成变体或生物技术变体可以被优化成具有对靶合适的结合亲和力和药物动力学性质以及稳定性。因此，CDR或可变区中的至少一个容易发生选自由糖基化、氧化、脱氨基、肽键裂解、异天冬氨酸的形成和/或非成对半胱氨酸组成的组中的修饰的氨基酸被缺乏此类变化的突变的氨基酸取代或者其中至少一个糖基被缺失或化学地或酶促地加入到抗体，参见例如，Liu等人,J.Pharm.Sci.97(7)(2008),2426-2447；Beck等人,Nat.Rev.Immunol.10(2010),345-352；Haberger等人,MAbs.6(2014),327-339。
可替换地，本发明的抗体是抗体或其抗原结合片段、生物技术衍生物或变体，其与具有如图1A-L中任一个所描绘的VH和/或VL区的至少一种抗体竞争结合DPR。
图4和实施例5中提供的实验结果表明，与其他淀粉样形成蛋白相比，本发明的一些抗DPR抗体优先结合至疾病引起的DPR的聚集形式(诸如C9ORF72-DPR)。因此，在一种实施方式中，与淀粉样形成蛋白相比，本发明的抗体优先识别C9ORF72-DPR。
在本发明的一种实施方式中，与生理性C9ORF72相比，抗DPR抗体、其DPR结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物优先识别突变的和/或C9ORF72-DPR的聚集形式。
本发明的抗体可以是人源的，特别地用于治疗性应用。可替换地，本发明的抗体是一种啮齿动物的、啮齿动物源化的或嵌合的啮齿动物-人抗体，优选鼠、鼠源化的或嵌合的鼠-人抗体或者大鼠、大鼠源化的或嵌合的大鼠-人抗体，它们对于动物中的诊断方法和研究是特别有用的。在一种实施方式中，本发明的抗体是嵌合的啮齿动物-人抗体或啮齿动物源化抗体。
此外，在一种实施方式中，本发明的嵌合抗体(即包含人抗体可变结构域和通用鼠轻链和重链恒定结构域)以高亲和力结合至人DPR。优选地，嵌合抗体的结合亲和力与其人源的对应物是相似的。
在一种实施方式中，本发明的抗体是由培养的单克隆或寡克隆B细胞的培养物提供的，并且包含由所述B细胞产生的抗体的培养物的上清液，被筛选其中抗DPR抗体的存在和亲和力。筛选过程包括对天然单体、原纤维或非原纤维聚集体(像源自合成的全长hDPR肽或例如从人血浆或重组表达中纯化的hDPR的寡聚体)的结合的筛选。相应的hDPR肽可以以其纯的形式使用或者可替换地偶联或缀合到合适的载体(诸如BSA)。
在优选的实施方式中，本发明通常还延伸到与本发明的人单克隆抗体竞争对突变的和/或聚集的C9ORF72-DPR种类或其片段的特异性结合的抗DPR抗体和DPR结合分子。
抗体间的竞争通过一种测定来确定，其中被测免疫球蛋白抑制参考抗体的对共同抗原(诸如DPR)的特异性结合。许多类型的竞争性结合测定是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定；参见Stahli等人，Methods in Enzymology 9(1983),242-253；固相直接生物素-亲和素EIA；参见Kirkland等人，J.Immunol.137(1986),3614-3619和Cheung等人，Virology 176(1990),546-552；固相直接标记测定，固相直接标记夹心测定；见Harlow和Lane，《抗体，实验室手册》，冷泉港出版社(1988年)；使用I125标记的固相直接标记RIA；参见Morel等人,Molec.Immunol.25(1988),7-15和Moldenhauer等人,Scand.J.Immunol.32(1990),77-82。通常，这样的测定包括使用纯化的DPR或突变的和/或聚集的C9ORF72-DPR，诸如其结合到固体表面的寡聚物和/或原纤维或具有其中任一的细胞，未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白(即本发明的人源单克隆抗体)。竞争性抑制是通过确定在测试免疫球蛋白存在下结合至固体表面或细胞的标记的量来测量的。通常，测试免疫球蛋白过量存在。优选地，竞争性结合测定法是在如所附实施例中为ELISA测定所描述的条件下进行的。通过竞争测定鉴定的抗体(竞争抗体)包括结合到参考抗体相同表位的抗体和结合到足够接近参考抗体结合表位的邻近表位以发生空间位阻的抗体。通常，当竞争性抗体过量存在时，它会以至少50％或75％抑制参考抗体对共同抗原的特异性结合。因此，本发明进一步涉及抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中该抗体竞争性抑制选自由NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2、NI-308.18F7、NI-308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI-308.6B11、NI-308.46F8、NI-308.4M1、NI-308.12A3和NI-308.16C10组成的组的参考抗体对DPR的结合。
本发明还涉及抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中该抗体竞争性地抑制选自由NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2、NI-308.18F7、NI-308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI-308.6B11、NI-308.46F8、NI-308.4M1、NI-308.12A3和NI-308.16C10组成的组的参考抗体与突变和/或聚集的C9ORF72-DPR种类或其片段结合。
在另一实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括如下免疫球蛋白重链可变区(VH)，或基本上由如下免疫球蛋白重链可变区(VH)组成、或由如下免疫球蛋白重链可变区(VH)组成，其中重链可变区的VH-CDR的至少一个或重链可变区的VH-CDR中的至少两个与来自本发明公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列是至少80％、85％、90％或95％相同的。可替换地，VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区与来自本发明公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列是至少80％、85％、90％或95％相同的。因此，根据本实施方式，本发明的重链可变区具有分别与在图1A-L中任一个所示的组相关的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3多肽序列。虽然图1A-L示出了由Kabat系统定义的VH-CDR，但是其他的CDR定义(例如，由Chothia系统定义的VH-CDR)也被包括在本发明中，并且可以使用图1A-L中任一个展示的数据由本领域的普通技术人员容易地识别。
在又一实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括如下免疫球蛋白重链可变区(VH)，或基本上由如下免疫球蛋白重链可变区(VH)组成、或由如下免疫球蛋白重链可变区(VH)组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有分别与图1A-L中任一个所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组相同的多肽序列。
在另一实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括如下免疫球蛋白重链可变区(VH)，或基本上由如下免疫球蛋白重链可变区(VH)组成、或由如下免疫球蛋白重链可变区(VH)组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有分别与图1A-L中任一个所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组相同的多肽序列，除了具有在任何一个VH-CDR中的一个、二个、三个、四个、五个或六个氨基酸取代。在某些实施方式中，氨基酸取代是保守的。
在另一实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括如下免疫球蛋白轻链可变区(VL)，或基本上由如下免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成、或由如下免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成，其中轻链可变区VL-CDR的至少一个或轻链可变区VL-CDR中的至少两个与来自本文公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列是至少80％、85％、90％或95％相同的。可替换地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区与来自本文公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列是至少80％、85％、90％或95％相同的。因此，根据本实施方式，本发明的轻链可变区具有分别与在图1(A)-1(J)中任一个所示的多肽相关的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3多肽序列。虽然图1(A)-1(L)中任一个示出了由Kabat系统定义的VL-CDR，但是其他的CDR定义(例如由Chothia系统定义的VL-CDR)也被包括在本发明中。
在另一实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括如下免疫球蛋白轻链可变区(VL)，或基本上由如下免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成、或由如下免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有分别与图1(A)-1(L)中任一个所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组相同的多肽序列。
在再一实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括如下免疫球蛋白轻链可变区(VL)，或基本上是由如下免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成、或是由如下免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有分别与图1(A)-1(L)中任一个所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组相同的多肽序列，除了具有在任何一个VL-CDR中的一个、二个、三个、四个、五个或六个氨基酸取代。在某些实施方式中，氨基酸取代是保守的。
免疫球蛋白或其编码的cDNA可以被进一步修饰。因此，在进一步的实施方式中，本发明的方法包括以下步骤中的任一个：产生嵌合抗体、鼠源化抗体、单链抗体、Fab片段、双特异性抗体、融合抗体、标记的抗体或这些中的任一个的类似物。相应的方法对本领域技术人员来说是熟知的，并且例如描述在Harlow和Lane“Antibodies,A Laboratory Manual”(《抗体，实验室手册》)，CSH出版社，冷泉港(1988)中。当所述抗体的衍生物由噬菌体展示技术获得时，如在BIAcore系统中使用的表面等离子体共振可用于提高结合于与本文描述的抗体中任一项的表位相同的表位的噬菌体抗体的效率(Schier,Human AntibodiesHybridomas 7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods 183(1995),7-13)。嵌合抗体的生产描述在例如国际申请WO89/09622中。用于产生人源化抗体的方法描述在例如欧洲申请EP-A1 0 239 400和国际申请WO90/07861中。按照本发明将被使用的抗体的其他来源是所谓的异种抗体。用于在小鼠体内产生诸如类人抗体的异种抗体的一般原理描述在例如国际申请WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096和WO 96/33735中。如上所述，本发明的抗体除了完整的抗体以外还可以以多种形式存在；包括，例如，Fv、Fab和F(ab)2，以及以单链形式存在；参见例如国际申请WO88/09344。在一种实施方式中，因此，提供了选自由单链Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')2片段组成的组中的本发明的抗体。
本发明的抗体或它们相应的一个或多个免疫球蛋白链可以使用本领域中已知的常规技术被进一步修饰，例如，通过单独或组合地使用一个或多个氨基酸缺失、插入、取代、添加和/或重组和/或本领域已知的一种或多种任何其他修饰。用于在作为免疫球蛋白链的氨基酸序列基础的DNA序列中引入这种修饰的方法对于本领域技术人员来说是熟知的；参见例如，Sambrook，Molecular Cloning A Laboratory Manual(《分子克隆实验手册》)，冷泉港实验室(1989)纽约和Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology(《分子生物学方法》)，Green出版协会和Wiley Interscience，纽约(1994)。本发明的抗体的修饰包括对一个或多个组成性氨基酸的化学和/或酶衍生化，包括侧链修饰、骨架修饰以及N-端和C-端的修饰，包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化以及糖或脂质部分、辅因子的连接等。同样地，本发明包括嵌合蛋白质的产生，嵌合蛋白质包括在氨基端的所描述的抗体或它的某种片段，其融合至在羧基端的异源分子(诸如免疫刺激配体)；对相应的技术细节参见例如国际申请WO00/30680。
本发明的抗体还可以包括优化它们的治疗潜力的其他修饰。这些修饰包括但不限于对抗体的氨基酸序列(例如，可变区)的修饰和翻译后修饰。翻译后修饰(PTM)是在功能蛋白质组学中起关键作用的化学修饰，这是因为它们调节活性、定位和与其他细胞分子(诸如蛋白质、核酸、脂质和辅因子)的相互作用。因此，抗体的优化可以提供若干个优点，诸如在储存期间改善的稳定性以及药物动力学和/或药效学特性，诸如抗体的体内或体外循环时间、增加的溶解性、稳定性、增加对靶标的亲和力、降低的解离速率、恒定区(Fc区)的改善的效应功能和抗体的安全性特征诸如降低的免疫原性或降低的对翻译后修饰的易感性，诸如在例如Igawa等人,MAbs 3(2011),243-52中所示的。因此，在本发明的一种实施方式中，可以优化抗DPR抗体、其DPR结合片段、合成的或生物技术的变体，其中倾向于包括但不限于以下的修饰的CDR或可变区中至少一个氨基酸被缺失这种改变的突变氨基酸取代或其中至少一个糖部分被删除或化学地或酶促地添加到抗体上：乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、脱酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、异构化、去甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、水解、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加(诸如精氨酰化)和泛素化(参见例如，Creighton,"Proteins:Structures and Molecular Properties,"(《蛋白质：结构和分子性质》)第二版,Freeman和Co.,N.Y.,1992；"Postranslational CovalentModification of Proteins,"(《蛋白质翻译后共价修饰》)Johnson编辑，学术出版社，纽约，1983；Seifter等人,Meth.Enzymol.182(1990),626-646；Rattan等人,Ann.NY.Acad.Sei.663(1992)48-62)。在优选的实施方式中，修饰选自由糖基化、氧化、脱氨基、肽键裂解、异天冬氨酸形成和/或未配对的半胱氨酸组成的组。优化抗DPR抗体或等同结合分子作为治疗剂的效用的其他修饰在本领域中是熟知的并且描述在例如Igawa等人,MAbs 3(2011),243-52中，将其公开内容并入本文中。添加或缺失糖部分的方法可以化学地或酶促地实现，并且详细地描述在例如Berg等人"Biochemistry"(《生物化学》)第5版W HFreeman，纽约2002；WO 87/05330；Aplin等人,CRC Crit.Rev.Biochem.,22(1981),259-306；Hakimuddin等人,Arch.Biochem.Biophys.259(1987),10-52；Edge等人,Anal.Biochem.118(1981),131；Thotakura等人,Meth.Enzymol.138.(1987),350中。
另外，本发明包括肽，其包括含有如上所述的结合分子的那些肽，例如含有所提到的抗体的任何一种的可变区的CDR3区域，特别是重链的CDR3，这是因为经常观察到重链CDR3(HCDR3)是具有更大程度可变性并在抗原-抗体相互作用中主要参与的区域。这些肽可以容易地被合成或通过重组方法而产生，以产生根据本发明有用的结合剂。这样的方法对本领域中的普通技术人员来说是熟知的。例如可以使用可商购的自动肽合成仪来合成肽。肽也可以通过重组技术通过将表达该肽的DNA引入到表达载体中并且使用表达载体转化细胞来产生肽而产生。
因此，本发明涉及针对本发明的抗DPR抗体并且能够结合可能存在于其他正常的蛋白质中的聚集的DPR(例如C9ORF72-DPR种类和/或其片段)的任何结合分子(例如，抗体或其结合片段)。如本文所述的，可以通过ELISA、SDS-PAGE和免疫组织化学来检验这样的抗体和结合分子的结合特异性和亲和力，参见例如，实施例3至13。也可以通过蛋白印迹来检验抗体和结合分子的这些特性；参见，特别是实施例6和图5。
作为直接从B细胞或记忆B细胞的培养物获得免疫球蛋白的替代方案，细胞可被用作用于随后表达和/或基因操作的重排重链和轻链基因座的来源。重排的抗体基因可以从适当的mRNA进行逆转录以产生cDNA。如果需要的话，重链恒定区可以被交换为不同同种型的重链恒定区或一起被消除。可变区可以被连接以编码单链Fv区。多个Fv区可以被连接以赋予对于多于一个靶的结合能力，或者也可以使用嵌合重链和轻链组合。一旦获得了遗传材料，则保留它们对所期望靶的结合能力的如上述的类似物的设计就是简单直接的。克隆抗体可变区和产生重组抗体的方法对本领域技术人员来说是熟知的，并且描述在例如，Gilliland等人,Tissue Antigens 47(1996),1-20；Doenecke等人,Leukemia 11(1997),1787-1792中。
一旦获得适当的遗传物质，并且如果需要的话被修饰为编码类似物，包括编码至少重链和轻链的可变区的编码序列的编码序列就可以插入到被包含在可被转染入标准重组宿主细胞的载体上的表达系统中。可以使用各种这样的宿主细胞用于有效的处理，但是，哺乳动物细胞是优选的。用于该目的的典型的哺乳动物细胞系包括但不限于CHO细胞、HEK293细胞或NSO细胞。
然后通过在适宜用于宿主细胞生长和编码序列表达的培养条件下，培养修饰的重组宿主来进行抗体或类似物的产生。然后通过将抗体从培养物中分离而回收抗体。表达系统优选地被设计为包括信号肽，以使产生的抗体被分泌到培养基中；然而，细胞内产生也是可能的。
根据上述情况，本发明也涉及编码本发明的抗体或等效结合分子的多核苷酸，在抗体的情况下，优选地至少上述抗体的免疫球蛋白链的可变区。通常，由多核苷酸编码的可变区包括所述抗体可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。
本领域技术人员将容易理解，具有上述可变结构域的抗体的可变结构域可以被用于所需特异性和生物功能的其他多肽或抗体的构建。因此，本发明还涵盖如下多肽和抗体，其包含上述可变结构域的至少一个CDR并且有利地具有与所附实例中描述的抗体大致相同或相似的结合特性。本领域的技术人员已知结合亲和性可以通过在CDR内或如Kabat所定义的与CDR部分重叠的高变环(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196(1987),901-917)内进行氨基酸取代来提高；参见例如，Riechmann等人，Nature 332(1988)，323-327。因此，本发明还涉及其中所述CDR的一个或多个包括一个或多个，优选不超过两个氨基酸取代的抗体。优选地，本发明的抗体在其一个或两个免疫球蛋白链中包含可变区的两个或所有三个CDR，如图1(A)-1(L)中的任一个所阐述的。
如本领域的普通技术人员所知的，结合分子例如，本发明的抗体或其抗原结合片段、合成的或生物技术的变体或衍生物可以包含介导一种或多种效应功能的恒定区。例如，补体的C1部分与抗体恒定区的结合可以活化补体系统。补体的活化在细胞病原体的调理和裂解中是重要的。补体的活化也刺激炎症反应，并且也可以参与自身免疫超敏性。此外，抗体经由Fc区结合至各种细胞上的受体，其中抗体Fc区上的Fc受体结合位点结合到细胞上的Fc受体(FcR)。存在许多对不同的抗体类特异性的Fc受体，所述抗体类包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体结合到细胞表面的Fc受体触发了许多重要和多样的生物反应，包括抗体包被颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、抗体包被的靶细胞被杀伤细胞裂解(称为抗体依赖的细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移和免疫球蛋白产生的控制。
因此，本发明的某些实施方式包括如下抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中恒定区结构域的一个或多个的至少一部分被缺失或以其他方式改变，以便提供所需的生化特性，诸如当与完整的、未改变的、具有大致相同的免疫原性的抗体相比时降低的效应功能、非共价二聚化的能力，提高了的在DPR蛋白聚集和沉积的位点定位的能力，降低的血清半衰期或提高的血清半衰期。例如，用于本文所述的诊断和治疗方法的某些抗体是结构域缺失的抗体，其包含类似于免疫球蛋白重链的多肽链，但其缺乏一个或多个重链结构域的至少一部分。例如，在某些抗体中，修饰的抗体的恒定区的一个完整结构域将被缺失，例如，CH2结构域的全部或部分将被缺失。在其他实施方式中，用于本文所述的诊断和治疗方法的某些抗体具有被改变以消除糖基化(在本文其他地方称为糖基化的或“agly”抗体)的恒定区例如IgG重链恒定区。这样的“agly”抗体可以酶促地以及通过改造恒定区的一个或多个共有糖基化位点而制备。虽然不受理论束缚，但是据信“agly”抗体可能在体内具有提高的安全性和稳定性分布。制备具有所需的效应功能的糖基化抗体的方法在例如在国际申请WO2005/018572中找到，将其全部内容通过引用并入本文。
在本文所述的某些的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，可以使用本领域中已知的技术使所述Fc部分突变，以降低效应功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他手段)可能降低循环修饰的抗体的Fc受体结合，从而增强DPR蛋白定位。在其他情况下，可以是与本发明一致的恒定区的修饰减轻补体结合，从而降低血清半衰期和共轭细胞毒素的非特异性缔合。还有恒定区的其他修饰可被用于修饰二硫键或寡糖部分，其由于提高的抗原特异性或抗体柔性而允许增强的定位。所得的生理特点(physiologicalprofile)、生物利用度和修饰的其他生化效应(诸如DPR蛋白定位、生物分布和血清半衰期)可以使用众所周知的免疫学技术而无需过度的实验容易地测定和定量。
在本文所述的某些的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物中，所述Fc部分可以被突变或交换为替代的蛋白质序列以提高抗体的细胞摄取，例如通过增强抗体的经由Fcγ受体、LRP或Thy1受体的受体介导的内吞作用或通过“超级抗体技术(SuperAntibodyTechnology)”(据说其使得抗体能够被穿梭进入活细胞而不伤害它们，ExpertOpin.Biol.Ther.(2005),237-241)。例如，可以使用本领域已知的技术来设计抗体结合区融合蛋白和细胞表面受体的同源蛋白配体或具有结合DPR和细胞表面受体的特定序列的双特异性或多特异性抗体的产生。
在本文所述的某些的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，Fc部分可以被突变或交换为替代的蛋白质序列，或者抗体可以被化学修饰以提高其血脑屏障渗透。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的修饰形式可以使用本领域中已知的技术由整个前体或母体抗体制备。示例性的技术在本文更详细地讨论。可以使用本领域中已知的技术来制备或生产本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。在某些实施方式中，抗体分子或其片段是“重组产生的”，即，是使用重组DNA技术产生的。用于制备抗体分子或其片段的示例性技术在本文其他地方更详细地讨论。
本发明的抗体或其抗原结合片段、生物技术变体或衍生物也包括被修饰的衍生物，所述修饰例如通过对抗体共价连接任何类型的分子使得共价连接不阻止抗体对其同源表位的特异性结合。例如，但不限于，抗体衍生物包括已经通过，例如，糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护基/保护基团衍生化、蛋白水解、与细胞配体或其他蛋白连接等修饰的抗体。许多化学修饰中的任何一种都可以通过包括但不限于以下的已知技术进行：特定化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，该衍生物可以包含一种或多种非经典氨基酸。
在特别优选的实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也包括被修饰的衍生物不会引起在待治疗动物体内(例如在人类体内)有害的免疫反应。在某些实施方式中，结合分子(例如，本发明的抗体或其抗原结合片段)来源于患者(例如，人类患者)，并且随后在它们来源的相同物种(例如，人类)使用，从而减轻或最小化有害免疫反应的发生。
去免疫也可用于降低抗体的免疫原性。如本文中所使用的，术语“去免疫”包括抗体的改变以修饰T细胞表位；参见例如国际申请WO98/52976和WO00/34317。例如，对来自起始抗体的VH和VL序列进行分析，并且对人T细胞表位从显示与互补决定区(CDR)和序列中的其他关键残基相关的表位定位的每个V区“作图”。对来自T细胞表位图的单独的T细胞表位进行分析，以便确定具有改变最终抗体活性的低风险的替代性氨基酸取代。对一批可替换的VH和VL序列进行设计，包括氨基酸取代的组合，并且将这些序列随后引入到一批结合多肽中，例如，在本文所公开的诊断和治疗方法中使用的DPR特异性抗体或其免疫特异性片段，其随后被测试功能。通常情况下，产生并测试12个和24个之间的变体抗体。然后，将包含修饰的V区和人C区的完整重链和轻链基因克隆到表达载体中，并且随后将质粒导入细胞系中以用于产生整个抗体。然后，对抗体在适当的生物化学和生物学测定中进行比较，并且确定最佳的变体。
单克隆抗体可以使用多种本领域已知的技术(包括使用杂交瘤、重组、和噬菌体展示技术或它们的组合)来制备。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术来制备，所述杂交瘤技术包括本领域已知的并且在例如，Harlow等人,在Antibodies:A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》)冷泉港实验室出版社，第2版(1988)；Hammerling等人,在MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas(《单克隆抗体与T细胞杂交瘤》)Elsevier,纽约,563-681(1981))中教导的杂交瘤技术，将所述文献的全部内容通过引入并入本文。如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指源于包括任何真核、原核或噬菌体克隆的单个克隆的抗体，而不是指其产生的方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。在某些实施方式中，本发明的抗体来源于已经通过用Epstein-Barr病毒转化被诱导产生抗体的人B细胞，如本文所述的。
在众所周知的杂交瘤过程中(Kohler等人，Nature 256(1975)，495)源于哺乳动物的相对短寿命的或非永生的淋巴细胞(例如，本文所述的源于人类受试者的B细胞)与永生化的肿瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)融合，由此产生杂交细胞或“杂交瘤”，其既是永生化的也能够产生B细胞的基因编码的抗体。通过选择、稀释并用含有用于形成单个抗体的特定基因的每个单独的细胞株的再生，将所得的杂交体分离成单独的遗传株。它们产生针对所需抗原是同种的抗体，并参考它们纯的遗传谱系(genetic parentage)，被称为“单克隆的”。
将由此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和生长，该培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的一种或多种物质。本领域的技术人员将理解，用于杂交瘤的形成、选择和生长的试剂、细胞系和培养基可商购自许多来源，并且标准化的方案已被很好地确立。通常，在其中生长杂交瘤细胞的培养基被测定抗所期望的抗原的单克隆抗体的产生。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过诸如本文所述的免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的体外测试来确定。杂交瘤细胞被鉴定为产生具有所需的特异性、亲和力和/或活性的抗体后，该克隆可以通过有限稀释流程进行亚克隆和通过标准方法生长；参见例如，Goding，Monoclonal Antibodies:Principlesand Practice(《单克隆抗体：原理与实践》，Academic Press(学术出版社)(1986)，59-103。还应该理解的是，由亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规纯化方法(诸如例如蛋白A、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和层析色谱)从培养基、腹水或血清中分离。
在另一实施方式中，淋巴细胞可以通过显微操作来选择，并且对可变基因进行分离。例如，外周血单核细胞可以从经免疫化的或天然免疫的哺乳动物(例如，人类)分离，并在体外培养约7天。培养物可以筛选符合筛选标准的特异性IgG。可以对源自阳性孔中的细胞进行分离。单独的产生Ig的B细胞可以通过FACS或通过在补体介导的溶血斑测定中识别它们而分离出来。产生Ig的B细胞可以显微操作进入管中，并且VH和VL基因可以使用例如RT-PCR扩增。VH和VL基因可被克隆到抗体表达载体中并被转染到细胞(例如，真核细胞或原核细胞)中而表达。
可替换地，可以使用本领域技术人员熟知的技术来选择并培养产生抗体的细胞系。这样的技术描述在各种实验室手册和主要出版物中。在这方面，正如下面所描述的适合用于本发明的技术被描述在Current Protocols in Immunology(《现代免疫学方法》)，Coligan等人编，Green Publishing Associates和Wiley-Interscience,John Wiley和Sons,纽约(1991)中，将其包括补编的全部内容通过引用并入本文中。
识别特异性表位的抗体片段可以通过已知的技术来产生。例如，Fab和F(ab')2片段可以重组或通过免疫球蛋白分子的蛋白切割，使用诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生的F(ab')2片段)的酶产生。F(ab')2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。这样的片段对于例如，在涉及将免疫球蛋白的免疫特异性部分与检测试剂(诸如放射性同位素)偶联的免疫诊断过程中使用是足够的。
在一种实施方式中，本发明的抗体包含抗体分子的至少一个CDR。在另一实施方式中，本发明的抗体包含来自一种或多种抗体分子的至少两个CDR。在又一实施方式中，本发明的抗体包含来自一种或多种抗体分子的至少三个CDR。在再一实施方式中，本发明的抗体包含来自一种或多种抗体分子的至少四个CDR。在另一实施方式中，本发明的抗体包含来自一种或多种抗体分子的至少五个CDR。在又一实施方式中，本发明的抗体包含来自一种或多种抗体分子的至少六个CDR。在本文中描述了包含可以被包括在受试抗体中的至少一个CDR的示例性抗体分子。
本发明的抗体可以通过本领域中已知的用于合成抗体的任何方法，尤其是通过化学合成或优选通过如本文所述的重组表达技术来生产。
在一种实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括合成的恒定区，其中一个或多个结构域被部分或完全缺失(“结构域缺失的抗体”)。在某些实施方式中，相容的经修饰的抗体将包含结构域缺失的构建体或变体，其中整个CH2结构域已被移除(ΔCH2构建体)。对于其他实施方式，短连接肽可以取代所缺失的结构域，以提供可变区的灵活性和活动自由度。本领域的技术人员将理解，这样的构建体由于CH2结构域对于抗体分解代谢速率的调节性能是特别优选的。结构域缺失的构建体可以使用编码人IgG1恒定区的载体获得，参见例如，国际申请WO 02/060955和WO 02/096948A2。该载体被设计成使CH2结构域缺失并提供表达结构域缺失的IgG1恒定区的合成载体。
在某些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物是微型抗体。微型抗体可以使用本领域中描述的方法来制备，参见例如，美国专利5837821或国际申请WO94/09817。在一种实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包含具有一些或甚至单个氨基酸的缺失或者取代的免疫球蛋白重链，只要它允许单体亚基之间的缔合。例如，在CH2结构域的所选区域内单个氨基酸的突变可足以基本上减少Fc结合并由此增加DPR蛋白定位。类似地，可以期望简单地缺失控制待调节的效应功能(例如，补体结合)的一个或多个恒定区结构域的部分。恒定区的这种部分缺失可以改善抗体的所选的性质(血清半衰期)，而同时使得与受试恒定区结构域相关联的其他所需功能完好无损。此外，如上面提到的，所公开抗体的恒定区可以通过一个或多个氨基酸的突变或者取代来合成，其提高了所得构建体的特征。在这方面，有可能破坏由保守结合位点提供的活性(例如，Fc结合)，而基本上保持了修饰抗体的构型和免疫原性的特征。还有其他的实施方式包括向恒定区中添加一种或多种氨基酸，以提高所期望的特性(诸如效应功能)，或者提供更多的细胞毒素或糖连接。在这种实施方式中，可能期望插入或复制源于所选的恒定区结构域的特定序列。
本发明还提供了包含本文中所描述的抗体分子(例如，VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)、基本上由其组成、或由其组成的抗体，所述抗体或其片段免疫特异性地结合至DPR。本领域技术人员熟知的标准技术可被用于在编码抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于定点诱变和PCR介导的诱变，其导致氨基酸取代。优选地，相对于参考VH区、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL区、VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3，所述变体(包括衍生物)编码小于50个氨基酸取代、少于40个氨基酸取代、少于30个氨基酸取代、少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、小于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是一种其中氨基酸残基被以具有相似电荷侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。在本领域中已经定义了具有相似电荷侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。可替换地，突变可以随机沿着编码序列的全部或部分被引入，诸如通过饱和诱变，且所得的突变体可被筛选生物活性以鉴定保留活性(例如，结合DPR和/或突变的和/或聚集的C9ORF72-DPR种类和/或其片段的能力)的突变体。
例如，可以仅在抗体分子的框架区或仅在CDR区引入突变。引入的突变可以是沉默或中性的错义突变，例如，对抗体结合抗原能力没有或具有很少的影响，实际上一些这样的突变并不改变任何氨基酸序列。这些类型的突变可能对优化密码子的使用或者提高杂交瘤的抗体产生是有用的。在本文的其他地方公开了密码子优化的编码本发明抗体的编码区。可替换地，非中性的错义突变可改变抗体结合抗原的能力。大多数沉默突变和中性错义突变的位置可能处于构架区中，而大多数非中性的错义突变的位置可能处于CDR中，尽管这不是绝对的要求。本领域的技术人员将能够设计和测试具有所需的性质诸如没有改变抗原结合活性或改变结合活性(例如，提高抗原结合活性或抗体特异性的变化)的突变分子。在诱变以后，经编码的蛋白质可以被常规地表达，并且编码的蛋白质的功能活性和/或生物活性(例如，免疫特异性结合DPR和/或突变的和/或聚集的C9ORF72-DPR种类和/或其片段的至少一个表位的能力)可以使用本文描述的技术或通过在本领域中已知的常规修饰技术来确定。
III.编码抗体的多核苷酸
编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸构成，其可以是未修饰的RNA或DNA，或者是修饰的RNA或DNA。例如，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由单链和双链DNA、作为单链和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA以及作为单链和双链区的混合物的RNA、包含可以是单链的或者更典型地是双链的或者单链和双链区的混合物的DNA和RNA的杂分子组成。此外，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域构成。编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸也可以含有一个或多个修饰的碱基或者由于稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化碱基和稀有碱基如肌苷。可以对DNA和RNA进行各种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学地、酶促地或代谢地修饰的形式。
编码源自免疫球蛋白(例如，免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的多肽的非天然变体的分离的多核苷酸可以通过向免疫球蛋白的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失而创建，使得一个或多个氨基酸取代、添加或缺失被引入到所编码的蛋白中。突变可以通过标准技术，诸如定点诱变和PCR介导的诱变来引入。优选地，保守的氨基酸取代是在一个或多个非必需氨基酸残基处进行。
如众所周知的，RNA可以通过标准技术(诸如异硫氰酸胍提取和沉淀随后离心或柱层析)从原始B细胞、杂交瘤细胞或从其他转化的细胞分离。如果需要，mRNA可以通过标准技术(诸如寡聚dT纤维素柱层析)从总RNA分离出来。适合的技术在本领域中是熟悉的。在一种实施方式中，编码抗体的轻链和重链的cDNA可以使用逆转录酶和DNA聚合酶按照熟知的方法同时或分别制备。PCR可以通过通用的恒定区引物或通过基于发表的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更具特异性的引物来启动。如上所述的，PCR也可以被用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，文库可以通过通用引物或更大的同源探针(诸如人恒定域探针)来筛选。
DNA(通常是质粒DNA)可以使用本领域中已知的技术从细胞中分离，并且根据标准的已被详细阐述在例如涉及重组DNA技术的前述参考文献中的众所周知的技术严格作图并测序。当然，根据本发明在分离过程或随后的分析中的任何点，DNA可以是合成的。
在该背景下，本发明还涉及编码本发明抗体的免疫球蛋白链的至少结合结构域或可变区的多核苷酸。在一种实施方式中，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码如下免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸、基本上由该核酸组成或由该核酸组成，其中重链可变区的至少一个CDR或重链可变区的至少两个VH-CDR与来自本文公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列是至少80％、85％、90％或95％相同的。可替换地，VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区与来自本文公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列是至少80％、85％、90％或95％相同的。因此，根据本实施方式，本发明的重链可变区具有与在图1中所示的多肽序列相关的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3多肽序列。
在另一种实施方式中，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码如下免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸、基本上由该核酸组成或由该核酸组成，其中轻链可变区的至少一个VL-CDR或轻链可变区的至少两个VL-CDR与来自本文公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列是至少80％、85％、90％或95％相同的。可替换地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3区与来自本文公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列是至少80％、85％、90％或95％相同的。因此，根据本实施方式，本发明的轻链可变区具有与在图1A-L中任一者所示的多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列。
在另一实施方式中，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码如下免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸、基本上由该核酸组成或由该核酸组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与图1A-L中任一者所示出的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组相同的多肽序列。
如本领域中已知的，两个多肽或两个多核苷酸之间“序列同一性”是通过比较一种多肽或多核苷酸的氨基酸或核酸序列与第二多肽或多核苷酸的序列来确定的。当在本文中讨论时，任何特定多肽是否是与另一种多肽至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的，可以使用本领域中已知的方法和计算机程序/软件来确定，诸如但不限于，BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575ScienceDrive,Madison,WI 53711(Wisconsin序列分析软件包，用于Unix的第8版，遗传学计算机组，大学研究园，科学路575号，麦迪逊，威斯康星53711))。BESTFIT使用Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2(1981),482-489的局部同源性算法，去寻找两个序列之间的最佳同源性区段。当使用BESTFIT或任何其他序列比对程序来确定特定序列是否与根据本发明的参考序列例如95％相同时，对参数进行设置，当然，使得同一性的百分比在参考多肽序列的全长上进行计算，并使得在参考序列中氨基酸总数的最高5％的同源性空位是允许的。
在本发明的优选实施方式中，多核苷酸包含具有如在和表II中描述的抗DPR抗体的VH或VL区的多核苷酸序列的核酸、基本上由该核酸组成或由该核酸组成。在这方面，本领域的技术人员将容易理解，编码至少所述轻链和/或重链的可变结构域的多核苷酸可以编码免疫球蛋白的两个链或仅一个链的可变结构域。在一种实施方式中，因此多核苷酸包含具有如表II中描述的抗DPR抗体和/或其片段的VH和VL区的多核苷酸序列的核酸、基本上由该核酸组成或由该核酸组成。
表II：识别DPR优选C9ORF72-DPR的抗体的VH和VL区的核苷酸序列。
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本发明也包括本发明的多核苷酸的片段，如在其他地方描述的。此外，编码如本文所述的融合多核苷酸、Fab片段以及其他生物技术衍生物的多核苷酸也是本发明考虑的。
多核苷酸可以通过本领域已知的任何方法来产生或制造。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，则编码该抗体的多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸组装，例如，在Kutmeier等人，BioTechniques 17(1994),242中描述的，简而言之，其涉及含有编码抗体序列的部分的重叠寡核苷酸的合成，那些寡核苷酸的退火和连接，然后通过PCR对连接的寡核苷酸的扩增。
可替换地，编码抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体的多核苷酸可以由源于合适来源的核酸产生。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆是得不到的，但抗体分子的序列是已知的，则编码该抗体的核酸可以被化学合成或从适当的来源(例如，抗体cDNA文库或产生于任何表达DPR特异性抗体的组织或细胞，诸如被选择成表达抗体的杂交瘤细胞的cDNA文库，或者分离自任何表达DPR特异性抗体的组织或细胞，诸如被选择成表达抗体的杂交瘤细胞的核酸，优选多聚A+RNA)通过使用对序列的3'端和5'端可杂交的合成引物的PCR扩增，或者通过使用对要识别的特定基因序列特异性的寡核苷酸探针的克隆(例如，来源于编码抗体的cDNA文库的cDNA克隆)来获得。由PCR产生的扩增的核酸于是可以使用本领域中熟知的任何方法被克隆到可复制的克隆载体中。
一旦抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的核苷酸序列和相应的氨基酸序列被确定，则可以使用本领域熟知的用于操作核苷酸序列的方法(例如，重组DNA技术、定点诱变、PCR等，参见例如，描述于Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual(《分子克隆，实验室手册》)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，纽约(1990)和Ausubel等人编，Current Protocols inMolecular Biology(《现代分子生物学方案》)，John Wiley&Sons,纽约(1998)，这两者都通过引用并入本文)对其核苷酸序列进行操作，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失和/或插入。
IV.抗体多肽的表达
在操作用于提供本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的分离的基因材料后，编码抗体的多核苷酸通常被插入到表达载体中，以用于引入到可用于产生所需量抗体的宿主细胞内。在本文中描述了抗体或其片段、衍生物或类似物(例如，结合到靶分子的抗体的重链或轻链)的重组表达。一旦获得了编码本发明的抗体分子或抗体的重链或轻链，或其部分(优选含有重链或轻链可变结构域)的多核苷酸，则用于产生抗体分子的载体可以通过使用本领域众所周知的技术的重组DNA技术来制备。因此，在本文中描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白的方法。本领域技术人员众所周知的方法可用于构建含有抗体编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术以及体内基因重组。因此，本发明提供了包含编码本发明的抗体分子或其重链或轻链、或者重链或轻链可变结构域的、可操作地连接到启动子的核苷酸序列的可复制的载体。这样的载体可包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如，国际申请WO 86/05807和WO 89/01036；和美国专利5,122,464号)，并且抗体的可变结构域可以被克隆到用于表达整个重链或轻链的这样的载体中。
术语“载体”或“表达载体”在本文中用来指按照本发明用作用于在宿主细胞中引入并表达所期望的基因的媒介物(运载工具)的载体。如本领域技术人员已知的，这样的载体可以容易地从由质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒组成的组中选择。通常，与本发明相容的载体将包含选择性标记物、促进所期望的基因的克隆和能够促进进入真核或原核细胞和/或在真核或原核细胞中复制的适当的限制性位点。为了本发明的目的，可以使用许多表达载体系统。例如，一类载体利用了来自动物病毒(诸如牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒)的DNA元件。其他涉及具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的使用。此外，具有DNA整合入其染色体的细胞可以通过引入一个或多个允许选择转染的宿主细胞的标记物来选择。标记物可以向营养缺陷型宿主、生物杀灭剂抗性(例如，抗生素)或抗重金属(诸如铜)的抗性提供原养型。选择性标记物基因可以被直接连接至待被表达的DNA序列，或者通过共转化而被导入相同的细胞中。可能还需要用于mRNA最佳合成的另外的元件。这些元件可以包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。
在特别优选的实施方式中，如上所讨论的，克隆的可变区基因与重链和轻链恒定区基因(优选人类)一起被插入到表达载体中。在一种实施方式中，这使用Biogen IDEC公司的专有表达载体完成，其称为NEOSPLA并公开在美国专利6,159,730号中。该载体含有巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β球主启动子、SV40复制起点、牛生长激素聚腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。该载体已被发现在可变区和恒定区基因被掺入后，在CHO细胞中转染，接着在含有G418的培养基中选择和甲氨蝶呤扩增后导致抗体的非常高的水平的表达。当然，能够引发在真核细胞中表达的任何表达载体可以用于本发明中。合适的载体的实例包括但不限于，质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、PEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、PSV40/Zeo2、pTracer-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可获自Invitrogen，圣地亚哥，加州)以及质粒pCI(可获自Promega，麦迪逊，威斯康星州)。通常，筛选大量的表达适当高水平的免疫球蛋白重链和轻链的转化细胞是常规化的实验，该实验可以通过例如机器人系统进行。载体系统也被教导在美国专利5,736,137号和5,658,570号中，将其各自的全部内容均通过引用并入本文。该系统提供高的表达水平，例如，>30pg/细胞/天。其他示例性载体系统公开在例如美国专利6,413,777号中。
在其他优选的实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以使用诸如在美国专利申请公开号2003-0157641A1中公开的并且以全部内容并入本文的多顺反子构建体来表达。在这些表达系统中，多个感兴趣的基因产物(诸如抗体的重链和轻链)可以由单个多顺反子构建体来制备。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)以提供相对高水平的抗体。相容的IRES序列公开在美国专利6,193,980号中，将其也并入本文中。本领域技术人员将理解，这样的表达系统可以被用于有效地产生在本申请中公开的全范围的抗体。因此，在一种实施方式中，本发明提供了一种载体，所述载体包含编码至少抗体的免疫球蛋白链的结合结构域或可变区的多核苷酸，可选地连同编码所述结合分子的另一免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸。
更一般地，一旦已经制备了载体或编码抗体的单体亚基的DNA序列，则表达载体可以被引入到适当的宿主细胞中。将质粒引入到宿主细胞中可以通过本领域技术人员熟知的各种技术来完成。这些技术包括但不限于，包括使用例如
Figure BDA0001307886400000661
或脂质体的脂转染的转染、原生质体融合、磷酸钙沉淀、细胞融合包膜的DNA、显微注射及用完整病毒感染。典型地，将质粒引入宿主是通过标准磷酸钙共沉淀法。携带该表达构建体的宿主细胞在适宜产生轻链和重链的条件下生长，并且被测定重链和/或轻链蛋白合成。示例性的测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或荧光激活细胞分类分析(FACS)、免疫组织化学等。
通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞，然后通过常规技术来培养转染的细胞以产生在本文描述的方法中使用的抗体。因此，本发明包括含有编码本发明的抗体、或其重链或轻链、或至少是其免疫球蛋白的结合结构域或可变区的多核苷酸的宿主细胞，该多核苷酸优选地被可操作地连接至异源启动子。此外或可替换地，本发明还包括含有如上文所定义的载体的宿主细胞，所述载体含有编码抗体免疫球蛋白链的至少结合结构域或可变区的多核苷酸，可选地与编码所述结合分子的另一免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸组合。在用于表达双链抗体的优选实施方式中，编码重链和轻链两者的单个载体或多个载体可以在宿主细胞内被共表达以用于表达整个免疫球蛋白分子，如下文所详述的。
宿主细胞可以用本发明的两个表达载体共转染，第一个载体编码重链衍生的多肽，且第二个载体编码轻链衍生的多肽。两种载体可以含有使重链和轻链多肽能同等表达的相同的选择性标记物。可替换地，可以使用编码重链和轻链多肽的单个载体。在这种情况下，轻链有利地被置于重链之前，以避免过量的有毒游离重链；参见Proudfoot,Nature 322(1986),52；Kohler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980),2197。用于重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
如本文所用的，“宿主细胞”是指携带使用重组DNA技术构建的并编码至少一种异源基因的载体的细胞。在对从重组宿主分离抗体的过程的描述中，除非另外明确规定，否则术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用来表示抗体的来源。换言之，从“细胞”回收多肽可能意味着从旋降的完整细胞或者从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物回收。
各种宿主-表达载体系统可以被用于表达在本文中所描述的方法中使用的抗体分子。这种宿主表达系统代表通过其感兴趣的编码序列可以产生并随后纯化的载体，但还代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可以在原位表达本发明的抗体分子的细胞。这些包括但不限于微生物，诸如用重组噬菌体DNA、质粒DNA或含抗体编码序列的粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母属、毕赤酵母属)；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带含有来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS细胞、CHO细胞、NSO细胞、BLK细胞、293细胞、3T3细胞)。优选地，细菌细胞诸如大肠杆菌(E.coli)，以及更优选的真核细胞，尤其是用于整个重组抗体分子表达的细菌细胞，被用于重组抗体分子的表达。例如，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的哺乳动物细胞，与诸如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件的载体结合，是抗体的有效表达系统；参见例如，Foecking等人,Gene 45(1986),101；Cockett等人,Bio/Technology 8(1990),2。
用于蛋白表达的宿主细胞系通常是哺乳动物来源的；本领域技术人员被认为具有优先确定哪些是最适合于期望的基因产物在其中表达的特定宿主细胞系的能力。示例性的宿主细胞系包括但不限于，CHO(中国仓鼠卵巢)、DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR负)、HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI衍生物)、VERY、BHK(幼仓鼠肾)、MDCK、WI38、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3X63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。CHO细胞和293细胞是特别优选的。宿主细胞系通常可以从商业服务、美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection)或者从发表的文献获得。
此外，可以选择调节插入序列的表达，或以期望的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白产物的这种修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)可能对蛋白质的功能是重要的。不同的宿主细胞具有对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特定的机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以确保经表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此目的，可以使用具有对基因产物的初级转录本、糖基化和磷酸化的适当加工的细胞机器的真核宿主细胞。
对于重组蛋白长期的、高产量的产生，稳定的表达是优选的。例如，可以设计稳定表达抗体分子的细胞系。宿主细胞可以用由合适的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择性性标记物进行转化，而非使用含有病毒复制来源的表达载体。在引入外源DNA后，可以使经设计的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转移到选择性培养基。在重组质粒中的选择性标记物赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定地整合到其染色体中并且生长以形成可以进而又可以克隆和扩大成细胞系的焦点(灶区，foci)。该方法可有利地被用于设计稳定地表达抗体分子的细胞系。
可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell11(1977),223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48(1992),202)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人,Cell 22(1980),817)基因可以分别在tk-细胞、hgprt-细胞或aprt-细胞中使用。此外，抗代谢物抗性可以被用作下列基因选择的基础：dhfr，其赋予对氨甲喋呤的抗性(Wigler等人,Natl.Acad.Sci.USA 77(1980),357；O'Hare等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981),1527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan and Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981),2072)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418抗性，Goldspiel等人，Clinical Pharmacy 12(1993),488-505；Wu和Wu，Biotherapy 3(1991),87-95；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32(1993),573-596；Mulligan,Science 260(1993),926-932；和Morgan和Anderson,Ann.Rev.Biochem.62(1993),191-217；TIB TECH 11(1993),155-215；和hygro，其赋予潮霉素抗性(Santerre等人,Gene 30(1984),147)。在重组DNA技术领域普遍熟知且可以使用的方法被描述在Ausubel等人编,Current Protocols inMolecular Biology(《现代分子生物学方法》),John Wiley&Sons,纽约(1993)；Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual(《基因转移和表达，实验室手册》),Stockton出版社,纽约(1990)；以及在Dracopoli等人(编),Current Protocols inHuman Genetics(《现代人类遗传学方法》)的第12章和第13章,John Wiley&Sons,纽约(1994)；Colberre-Garapin等人,J.Mol.Biol.150:1(1981)中，将其全部内容通过引用并入本文。抗体分子的表达水平可以通过载体扩增来提高，关于综述，参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning(《基于DNA克隆中用于哺乳动物细胞内克隆基因表达的基因扩增载体的使用》)，学术出版社，纽约，卷3，(1987)。当表达抗体的载体系统中的标记物是可扩增的时，提高在宿主细胞培养物中抑制剂的水平将增加标记物基因的拷贝数。因为扩增区域与抗体基因相关，因此抗体的产生量也将增加；参见Crouse等人，Mol.Cell.Biol.3(1983),257。
体外制备允许扩大规模提供大量所需的多肽。在组织培养条件下用于哺乳动物细胞培养的技术在本领域中是已知的，并且包括例如在气升式反应器或连续搅拌反应器中的均匀悬浮培养，或例如在空心纤维、微胶囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷墨盒(ceramiccartridges)上固定化或包埋的细胞培养。如果必要和/或需要，多肽的溶液可以例如在合成铰链区多肽的优先生物合成之后，或者在本文所述的HIC层析步骤之前或之后通过常规层析方法来纯化，例如凝胶过滤、离子交换层析、DEAE-纤维素上的层析或(免疫)亲和层析。
编码本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的基因也可以在非哺乳动物细胞诸如细菌或昆虫或酵母或植物细胞中表达。可以容易吸收核酸的细菌包括肠杆菌科的成员，诸如大肠杆菌或沙门氏菌属(Salmonella)菌株；芽孢杆菌属(Bacillaceae)，诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)；肺炎球菌属(Pneumococcus)；链球菌属(Streptococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。将进一步理解的是，当在细菌中表达时，异源多肽典型地变成包涵体的一部分。异源多肽必须被分离、纯化，然后被组装成功能性分子。在需要抗体的四价形式的情况下，然后该亚基将自组装成四价抗体；参见例如，国际申请WO 02/096948。
在细菌系统中，可取决于被表达的抗体分子打算的用途有利地选择许多表达载体。例如，当大量的这种蛋白要产生用于抗体分子的药用组合物的产生时，指导容易纯化的高水平的融合蛋白产物表达的载体可能是需要的。这样的载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，EMBO J.2(1983)，1791)，其中抗体编码序列可以被单独连接到该载体与lacZ编码区同框，以便融合蛋白产生；pIN载体(Inouye and Inouye,Nucleic AcidsRes.13(1985),3101-3109；Van Heeke and Schuster,J.Biol.Chem.24(1989),5503-5509)；等等。pGEX载体也可用于表达外源多肽，作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这样的融合蛋白是可溶的，并且可以很容易地通过吸附和结合到谷胱甘肽-琼脂糖珠基质(随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱)从裂解的细胞中纯化得到。pGEX载体被设计成包括凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，以便使经克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。
除了原核生物，也可使用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是真核微生物中最常用的，虽然许多其他的菌株通常是可获得的，例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。为了在酵母属(Saccharomyces)中表达，例如质粒YRp7(Stinchcomb等人,Nature 282(1979),39；Kingsman等人,Gene 7(1979),141；Tschemper等人,Gene 10(1980),157)是常用的。该质粒已含有TRP1基因，其为例如ATCC 44076号或PEP4-1(Jones,Genetics 85(1977),12)的缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株提供了选择性标记物。作为酵母宿主细胞基因组特征的trp1损伤的存在然后为检测通过在缺乏色氨酸条件下的生长的转化提供了有效环境。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus，AcNPV)通常被用作载体以表达外源基因。该病毒生长在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中。抗体编码序列可被单独克隆到病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)中并且被置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
一旦本发明的抗体分子被重组表达，该完整的抗体、其二聚体、单独的轻链和重链或本发明的其他免疫球蛋白形式可根据本领域的标准程序被纯化，包括例如通过色谱(例如，离子交换色谱，亲和色谱，特别是通过对蛋白A后的特异性抗原的亲和性的色谱以及空间排阻柱色谱)、离心、差异溶解性(例如硫酸铵沉淀)或通过纯化蛋白质的任何其他标准技术；参见例如，Scopes，"Protein Purification(《蛋白质纯化》)"，Springer Verlag，纽约，(1982)。可替换地，用于提高本发明抗体亲和力的优选方法公开在美国专利公开2002-0123057 A1中。在一种实施方式中，因此本发明还提供了制备抗DPR抗体或识别突变的和/或聚集的C9ORF72-DPR种类和/或其片段的抗体或其一个或多个免疫球蛋白链的方法，所述方法包括：
(a)培养如上定义的宿主细胞，该细胞包含如上文所定义的多核苷酸或载体；和
(b)从培养物中分离所述抗体或其一个或多个免疫球蛋白链。
此外，本发明还涉及被上文所定义的多核苷酸编码的或可由用于制备抗DPR抗体或识别突变的和/或聚集的C9ORF72-DPR种类和/或其片段的抗体或其一个或多个免疫球蛋白链的所述方法获得的抗体或其一个或多个免疫球蛋白链。
V.融合蛋白与缀合物
在某些实施方式中，抗体多肽包含通常与抗体不相关的氨基酸序列或一个或多个部分。示例性的修饰在下面更详细地描述。例如，本发明的单链Fv抗体片段可包含柔性连接序列，或者可以被修饰以添加功能性部分(例如，PEG、药物、毒素、或标记(诸如荧光、放射性、酶、核磁性、重金属等))。
本发明的抗体多肽可包含融合蛋白、基本上由融合蛋白构成或由融合蛋白构成。融合蛋白是包含例如具有至少一个靶结合位点的免疫球蛋白DPR结合结构域和至少一个异源部分(即在自然中不与其天然连接的部分)的嵌合分子。氨基酸序列通常可存在于在融合多肽中被带到一起的分离的蛋白中，或者它们通常可存在于同一蛋白中，但以新的排列方式被置于融合多肽中。融合蛋白可以例如通过化学合成或通过创建和翻译多核苷酸(其中肽区域以所需的关系被编码)来创建。
应用于多核苷酸或多肽的术语“异源的”，是指多核苷酸或多肽是源于与要与之比较的剩余的实体截然不同的实体。例如，如本文所使用的，待与抗体或其抗原结合片段、衍生物、变体或类似物融合的“异源多肽”来自相同种类的非免疫球蛋白多肽或不同种类的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
正如本文在其他地方更详细讨论的，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以在N-端或C-端进一步被重组融合到异源多肽中或者被化学缀合(包括共价和非共价缀合)到多肽或其他组合物中。例如，抗体可以被重组融合或缀合到在检测测定中可用作标记的分子和诸如异源多肽、药物、放射性核素或毒素的效应分子中；参见例如，国际申请WO 92/08495；WO 91/14438；WO89/12624；美国专利5,314,995号；和欧洲专利申请EP 0 396387。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以由通过肽键或修饰的肽键(即，肽等排体)彼此连接的氨基酸构成，并且可含有除了20种基因编码的氨基酸以外的其他氨基酸。抗体可以通过天然过程修饰，诸如翻译后加工或通过本领域熟知的化学修饰技术修饰。这样的修饰在基础教科书和更详细的专著以及大量的研究文献中被充分地说明。修饰可以在抗体的任何部分发生，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基端，或在诸如糖的部分发生。应当理解的是，相同类型的修饰可以以相同或不同的程度存在于给定的抗体的若干个位点。此外，给定的抗体可以含有许多类型的修饰。抗体可以是支链的，例如，作为泛素化的结果，并且它们可以是环状的、有或没有支链。环状的、支链的和支链环状的抗体可从翻译后的天然过程得到或可以通过合成方法来制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸添加到蛋白质如精氨酰化，和泛素化；参见例如，Proteins-Structure And Molecular Properties(《蛋白质-结构和分子特性》)，T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,纽约，第二版,(1993)；PosttranslationalCovalent Modification Of Proteins(《蛋白的翻译后共价修饰的》),B.C.Johnson编,Academic Press(学术出版社),纽约,(1983)1-12；Seifter等人,Meth.Enzymol.182(1990),626-646；Rattan等人,Ann.NY Acad.Sci.663(1992),48-62)。
本发明还提供了包含抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物与异源多肽的融合蛋白。在一种实施方式中，本发明的融合蛋白包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：具有本发明抗体的任何一个或多个VH区的氨基酸序列或本发明抗体或其片段或变体的任何一个或多个VL区的氨基酸序列的多肽，以及异源多肽序列。在另一实施方式中，在本文公开的诊断和治疗方法中使用的融合蛋白包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：具有抗体或者其片段、变体或者衍生物的任意一个、两个、三个VH-CDR的氨基酸序列或者抗体或者其片段、变体或者衍生物的任意一个、两个、三个VL-CDR的氨基酸序列的多肽以及异源多肽序列。在一种实施方式中，融合蛋白包含具有本发明抗体或其片段、衍生物或变体的VH-CDR3的氨基酸序列的多肽，以及异源多肽序列，其中融合蛋白特异性地结合至DPR蛋白或肽。在另一实施方式中，融合蛋白包含具有本发明抗体至少一个VH区的氨基酸序列和本发明抗体或者其片段、衍生物或变体的至少一个VL区的氨基酸序列的多肽以及异源多肽序列。优选地，融合蛋白的VH和VL区对应于特异性结合DPR的单一来源抗体(或scFv或Fab片段)。在又一实施方式中，在本文公开的诊断和治疗方法中使用的融合蛋白包括具有抗体的任意一个、两个、三个或更多个VH-CDR的氨基酸序列以及抗体或者其片段、变体或者衍生物的任意一个、两个、三个或更多个VL-CDR的氨基酸序列的多肽以及异源多肽序列。优选地，一个或多个VH-CDR或VL-CDR中的两个、三个、四个、五个、六个或更多个对应于本发明的单一来源抗体(或scFv或Fab片段)。编码这些融合蛋白的核酸分子也包括在本发明中。
文献中报道的示例性融合蛋白包括T细胞受体(Gascoigne等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987),2936-2940)；CD4(Capon等人,Nature 337(1989),525-531；Traunecker等人,Nature 339(1989),68-70；Zettmeissl等人,DNA CellBiol.USA 9(1990),347-353；和Byrn等人,Nature 344(1990),667-670)；L-选择素(归巢受体)(Watson等人,J.Cell.Biol.110(1990),2221-2229；和Watson等人,Nature 349(1991),164-167)；CD44(Aruffo等人,Cell 61(1990),1303-1313)；CD28和B7(Linsley等人,J.Exp.Med.173(1991),721-730)；CTLA-4(Lisley等人,J.Exp.Med.174(1991),561-569)；CD22(Stamenkovic等人,Cell 66(1991),1133-1144)；TNF受体(Ashkenazi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991),10535-10539；Lesslauer等人,Eur.J.Immunol.27(1991),2883-2886；和Peppel等人,J.Exp.Med.174(1991),1483-1489(1991))；和IgE受体(Ridgway and Gorman,J.Cell.Biol.115(1991),摘要编号1448)的融合。
如本文其他地方所讨论的，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可被融合至异源多肽，以增加多肽的体内半衰期或用于使用本领域中已知方法的免疫测定。例如，在一种实施方式中，PEG可缀合至本发明的抗体以增加其在体内的半衰期；参见例如，Leong等人,Cytokine16(2001),106-119；Adv.in Drug Deliv.Rev.54(2002),531；或Weir等人,Biochem.Soc.Transactions 30(2002),512。
此外，本发明的抗体或其抗原结合片段、合成变体或生物技术衍生物可被融合至标记物序列(诸如肽)以促进它们的纯化或检测。在优选的实施方式中，标记物氨基酸序列是六组氨酸肽(HIS)，诸如在pQE载体中提供的标签(QIAGEN公司，伊顿大街9259号，Chatsworth，加州，91311)，等，这些中的许多都是市售的。正如在Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989),821-824中所描述的，例如，六组氨酸提供了融合蛋白的方便纯化。用于纯化的其他肽标签包括但不限于，“HA”标签，其对应于来自流感血细胞凝集素蛋白质的表位(Wilson等人,Cell 37(1984),767)、GST、C-mycand“flag(旗帜)”标签；参见例如，Bill Brizzard,BioTechniques 44(2008)693-695关于表位标签技术的综述，并在694页的表1列出了本发明中使用的最常见的表位标签，其主题被通过引用明确地在此并入。
可使用本领域中熟知的方法来制备融合蛋白；参见例如美国专利5,116,964和5,225,538号。进行融合的精确位点可以根据经验选择，以优化融合蛋白的分泌或结合特征。然后编码融合蛋白的DNA被转染到宿主细胞中以用于表达，其如前文所述的进行。
本发明的抗体可以以非缀合形式使用或者可偶联至各种分子中的至少一种，例如，以提高该分子的治疗性质，促进靶标探测或用于患者的成像或治疗。当进行纯化时，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以在纯化之前或纯化之后被标记或缀合。特别是，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以被缀合到治疗剂、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药用制剂或PEG中。
作为包括常规抗体的免疫毒素的缀合物已经在本领域得到了广泛的说明。毒素可以通过常规偶联技术偶联至抗体，或者含蛋白质毒素部分的免疫毒素可以被制备为融合蛋白。本发明的抗体可以以相应的方式使用，以获得这样的免疫毒素。有代表性的这类免疫毒素是那些由Byers,Seminars Cell.Biol.2(1991),59-70和由Fanger,Immunol.Today 12(1991),51-54所描述的。
本领域的专业技术人员将理解的是，缀合物也可以使用多种技术进行组装，这取决于所选的将要缀合的试剂。例如，具有生物素的缀合物通过，例如，将DPR结合多肽与生物素的活化酯(诸如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯)反应而制备。类似地，带有荧光标记物的缀合物可以在偶联剂(例如本文所列的那些)的存在下制备，或通过与异硫氰酸酯的反应，优选与荧光素-异硫氰酸酯的反应而制备。本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的缀合物以类似的方式来制备。
本发明还包括缀合至诊断试剂或治疗试剂的本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。抗体可用于诊断以例如证明DPR的存在，来指示患上与DPR相关的、优选的与形成DPR的突变的C9ORF72(即C9ORF72-DPR)相关的疾病或病症的风险，以监测这样的疾病(即显示聚集的DPR的发生的疾病，或者与聚集的DPR相关的疾病)的发展或进展，或者作为临床测试步骤的部分来例如确定给定的治疗和/或预防方案的效力。在一种实施方式中，因此本发明涉及被可检测标记的抗体。此外，在一种实施方式中，本发明涉及被连接到药物的抗体。可以通过将抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物偶联到可检测的物质来促进检测。可检测的物质或标记一般可以是酶；重金属，优选地是金；染料，优选地是荧光或发光染料；或放射性标记。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、用各种正电子发射断层筛选的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子；参见例如，美国专利4,741,900号，关于可以与根据本发明用作诊断剂的抗体缀合的金属离子。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、若丹明、二氯荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；以及合适的放射性材料的实例包括125I、131I、111In或99Tc。因此，在一种实施方式中，本发明提供了可检测地标记的抗体，其中可检测的标记选自由酶、放射性同位素、荧光团和重金属组成的组。
抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可通过将其偶联到化学发光化合物而被可检测地标记。然后化学发光标签的抗体的存在通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在而被确定。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺、温热的吖啶酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
其中抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体可以被可检测地标记的方式之一是将抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体连接到酶，并在酶免疫测定(EIA)中使用连接产物(Voller,A.,“The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)”(《酶联免疫吸附测定(ELISA)》)Microbiological Associates Quarterly Publication(《微生物学协会季刊》),Walkersville,马里兰州,Diagnostic Horizons 2(1978),1-7)；Voller等人,J.Clin.Pathol.31(1978),507-520；Butler,Meth.Enzymol.73(1981),482-523；Maggio(编),Enzyme Immunoassay(《酶免疫测定》)，CRC出版社,博卡拉顿，佛罗里达州，(1980)；Ishikawa等人(编),Enzyme Immunoassay(《酶免疫测定》)，Kgaku Shoin,东京(1981))。结合到抗体上的酶将与合适的底物(优选生色底物)反应，以这样的方式以产生可例如通过分光光度法、荧光或通过目测手段检测的化学部分。可用于可检测地标记抗体的酶包括但不限于，苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，检测可以通过其中使用用于酶的显色底物的比色法来完成。检测还可以通过将底物酶促反应程度与相似制备的标准品进行视觉比较来完成。
检测还可以使用各种其他免疫测定中的任何一种来实现。例如，通过放射性标记抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物，可以通过使用放射免疫测定(RIA)检测到抗体(参见例如，Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays(《放射免疫测定原理》),Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques(放射性测定技术的第七次培训课程),The Endocrine Society(内分泌学会),(三月,1986)，其通过引用并入本文)。放射性同位素可以通过包括但不限于，γ计数器、闪烁计数器或放射自显影的方式而被检测到。
抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体也可以使用诸如152Eu或其他镧系元素的荧光发射金属来可检测地标记。这些金属可以使用如二亚乙基三乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的这些金属螯合基团而连接至抗体。
对抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物缀合各种部分的技术是众所周知的，参见例如，Arnon等人,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy(用于癌症治疗药物的免疫靶向的单克隆抗体)”，在MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy(《单克隆抗体与癌症治疗》)，Reisfeld等人(编)，243-56页(Alan R.Liss有限公司(1985)；Hellstrom等人,“Antibodies For Drug Delivery(用于药物递送的抗体)”，在Controlled Drug Delivery(《控释药物递送》)(第二版)，Robinson等人(编),Marcel Dekkery有限公司,(1987)623-53页；Thorpe,“Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review(癌症治疗中细胞毒性药物的抗体载体：综述)”在Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications(《单克隆抗体'84：生物与临床应用》)，Pinchera等人(编),(1985)475-506页；Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody InCancer Therapy(《放射性标记抗体在癌症治疗中治疗性应用的分析、结果与前景》)，在Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy(《用于癌症检测与治疗的单克隆抗体》)，Baldwin等人(编),Academic Press(学术出版社)(1985)303-16,以及Thorpe等人,“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates(抗体-毒素偶联物的制备和细胞毒性)”,Immunol.Rev.62(1982),119-158。
正如所提到的，在某些实施方式中，增强结合分子的稳定性或效力的部分可以被缀合，所述结合分子例如，结合多肽，例如，抗体或其免疫特异性片段。例如，在一种实施方式中，PEG可以被缀合到本发明的结合分子以提高其在体内的半衰期。Leong等人,Cytokine16(2001),106；Adv.in Drug Deliv.Rev.54(2002),531；或Weir等人,Biochem.Soc.Transactions 30(2002),512。
VI.组合物与使用方法
本发明涉及包含本发明的上述DPR结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体或生物技术衍生物)或者本发明如前文所定义的多核苷酸、载体或细胞的组合物。在一种实施方式中，本发明的组合物是药用组合物并且进一步包含药学上可接受的载体。此外，取决于药用组合物预期的用途，本发明的药用组合物可能包含诸如白介素或干扰素的另外的试剂。为了用于治疗显示聚集的DPR特别是C9ORF72-DPR的发生或与之相关的疾病和病症(诸如FTLD)，额外的试剂可以选自由有机小分子、抗DPR抗体以及它们的组合组成的组。因此，在特别优选的实施方式中，本发明涉及DPR结合分子(例如，本发明的抗体或其抗原结合片段)的应用或者具有与其任一个基本相同的结合特异性的结合分子的应用，本发明的多核苷酸、载体或细胞的应用，其用于制备用于预防性和治疗性治疗与DPR蛋白相关的疾病或病症的药用或诊断组合物，监测与DPR蛋白和/或聚集的C9ORF72相关的疾病或病症的进展或者受试者中对于DPR治疗的反应或确定受试者的与DPR蛋白和/或聚集的C9ORF72-DPR相关的疾病或病症发展的风险。
因此，在一种实施方式中，本发明涉及治疗以DPR和DPR蛋白的异常积累和/或沉积(诸如由于C9ORF72-DPR的聚集的C9ORF72)为特征的疾病或病症的方法，该方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的前述本发明的DPR结合分子、抗体、多核苷酸、载体或细胞中的任一种。
本发明的治疗方法的特别的优点在于以下事实：本发明的重组抗体来源于无疾病的体征或症状(例如携带无症状的一种突变和/或多种突变，从而显示出聚集的DPR发生或与聚集的DPR相关)的健康人受试者的B细胞或记忆B细胞，并因此具有一定的概率能够预防与DPR(例如，具有扩增的六核苷酸重复的突变C9ORF72导致在C9ORF72蛋白中形成二肽重复(DPR)(由于C9ORF72-DPR的聚集的C9ORF72))相关的临床显性疾病，或者能够降低临床表现的疾病或病症发生的风险，或者能够延缓临床表现的疾病或病症的发作或进展。典型地，本发明的抗体也已成功地通过体细胞成熟，即通过抗体的可变区的体细胞变异手段的关于高亲和力结合靶DPR分子的选择性和有效性的优化。
关于这样的细胞在体内(例如在人体内)，尚未借助于相关的或其他生理蛋白质或细胞结构在自身免疫或过敏性反应的意义上活化的认识是有很大医疗重要意义的，因为这意味着显著增加的成功通过临床试验阶段存活的机会。可以这么认为，效力、可接受性和耐受性已经在预防性或治疗性抗体的临床前和临床开发之前已在至少一个人类受试者身上得到了证明。因此，可以预期的是，本发明的人源抗DPR抗体，其作为治疗剂的高靶结构特异性亲和力和其降低了的副作用几率都显著增加了其临床成功的可能性。
本发明还提供了包括一个或多个填充有一种或多种上述成分的容器的分别是药物和诊断包装或试剂盒，该成分例如是本发明的抗DPR抗体、其结合片段、生物技术衍生物或变体、多核苷酸、载体或细胞。与一个或多个这样的容器相关的可以是由监管药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映了监管生产、使用或销售的机构批准用于人类施用。另外或可替换地，试剂盒包含用于适当的诊断测定法的试剂和/或说明书。组合物，例如本发明的试剂盒，当然特别适用于伴随DPR存在的疾病或病症的风险评估、诊断、预防和治疗，并且特别地可适用于治疗通常以DPR存在为特征的疾患。特别地，组合物可用于治疗与DPR聚集(例如具有扩增的六核苷酸重复的突变C9ORF72导致形成由于C9ORF72-DPR的聚集的C9ORF72)相关的病症。与DPR相关的疾病和/或病症包括但不限于额颞叶变性(FTLD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、FTLD-ALS和/或脊髓小脑性共济失调36型。
本发明的药用组合物可以根据本领域中熟知的方法来配制；参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿：药学的科学与实践》)，theUniversity of Sciences in Philadelphia(在费城的科学大学)，ISBN 0-683-306472。合适的药物载体的实例在本领域中是熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂(诸如油/水乳剂)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等等。包括这样的载体的组合物可以通过众所周知的传统方法来配制。这些药用组合物可以以合适的剂量被施用给受试者。合适组合物的施用可以通过不同的方式来实现，例如，通过静脉、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、局部或皮内施用或脊髓或脑递送。气雾剂制剂(诸如鼻喷雾制剂)含有带有防腐剂和等渗剂的活性药剂的纯化水溶液或其他溶液。这样的制剂优选被调节至与鼻腔粘膜相容的pH和等渗状态。用于直肠或阴道施用的制剂可呈现为具有合适载体的栓剂。
剂量方案将由主治医生和临床因素来确定。如在医学领域中所熟知的，用于任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者的尺寸(体重，size)、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用的时间和途径、一般健康状况和待同时给予的其他药物。典型的剂量可以例如在0.001到1000μg的范围内(或者具有在该范围内用于表达或者用于抑制表达的核酸)；然而，特别是考虑到前述因素，还预想低于或者高于该示例性范围的剂量。通常，剂量范围可以为例如按宿主体重从约0.0001至100mg/kg，更通常地为0.01至5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等等)。例如剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内，优选地至少为1mg/kg。剂量在上述范围中间也意为在本发明的范围之内。受试者可以每天、隔日、每周或根据通过经验分析确定的任何其他时间表给予这样的剂量。示例性治疗要求在例如至少六个月的延长的时间段内施用多剂量。另外的示例性治疗方案要求施用每两周一次或每月一次或每3至6个月一次。示例性的剂量时间表包括连续几天1-10mg/kg或15mg/kg、隔日30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体被同时施用，这种情况下施用的每种抗体的剂量落入所示范围内。进程可以通过定期评估来监测。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水性或非水溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)以及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬浮液、包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发性油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏葡萄糖的电解质补充剂)等。防腐剂和其他添加剂也可以存在，诸如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，根据药物组合物的预期用途，本发明的药用组合物可包含其他药剂(诸如多巴胺或精神药理药物)。
此外，在本发明的优选实施方案中，药物组合物可以被配制为疫苗，例如，如果本发明的药物组合物包含用于被动免疫的抗DPR抗体或其DPR结合片段或合成的或生物技术的变体或衍生物。如背景技术部分中所述的，聚集的DPR种类是疾病和/或病症(诸如FTLD和ALS)的主要触发因素。因此，谨慎的是期望用本发明的人源抗DPR抗体和等同的DPR结合分子的被动免疫将有助于规避主动免疫治疗概念的几种不良作用并且导致DPR聚集的减少。因此，本发明的抗DPR抗体及其等同物将特别地可被用作用于预防或改善显示聚集的DPR(特别是C9ORF72-DPR)的存在或由其引起的疾病或病症(诸如FTLD)的疫苗。
在一种实施方式中，使用本发明抗体的重组的Fab(rFab)和单链片段(scFv)可能是有益的，其可能会更容易地穿透细胞膜。例如，Robert等人,Protein Eng.Des.Sel.(2008)；S1741-0134，在线提前发表，描述了使用识别的Aβ的N-端区中的表位的单克隆抗体WO-2的嵌合重组的Fab(rFab)和单链片段(scFv)。改造的片段能够(1)预防淀粉样蛋白纤维化，(2)分解预形成的Aβ1-42纤维和(3)在体外抑制Aβ1-42寡聚体介导的神经毒性，像完整IgG分子一样有效。使用小的Fab和scFv改造的缺乏效应功能的抗体结构的感知优点包括更有效地通过血脑屏障和最小化触发炎性副反应的风险。此外，除了scFv和单结构域抗体保留全长度抗体的结合特异性，它们可以被表达为单个基因并且在哺乳动物细胞内被胞内表达为胞内抗体，其具有改变其靶的折叠、相互作用、修饰或亚细胞定位的可能性；参见综述，例如，Miller和Messer,Molecular Therapy 12(2005),394–401。
在不同的方法中，Muller等人,Expert Opin.Biol.Ther.(2005),237-241，描述了称作“超级抗体技术(SuperAntibody Technology)”的技术平台，据说这是使抗体能够被穿梭进入活细胞中而不伤害它们。这样的穿透细胞的抗体打开了诊断和治疗的新窗口。术语“TransMabs”已经克隆了这些抗体。
在另外的实施方式中，用于治疗与DPR特别是聚集的DPR(诸如C9ORF72-DPR)的发生相关的疾病、病症或症状的其他抗体的共同施用或顺序施用可能是期望的。在一种实施方式中，附加的抗体被包括在本发明的药用组合物中。可用于治疗受试者的抗体的实例包括，但不限于，靶向CD33、SGLT2、IL-6和IL-1的抗体。
在另外的实施方式中，用于治疗与DPR特别是聚集的DPR(诸如突变的C9ORF72，即C9ORF72-DPR)相关的疾病、病症或症状的其他药剂的共同施用或顺序施用可以是期望的。在一种实施方式中，附加的药剂被包括在本发明的药用组合物中。可用于治疗受试者的药剂的实例包括但不限于：靶向意外肌肉运动的VMAT2抑制剂，诸如抗炎剂(诸如二氟苯水杨酸(diflusinal)、皮质类固醇、2-(2,6-二氯苯胺基)苯乙酸(双氯芬酸)、异丁基丙酸-酚酸(布洛芬))；利尿剂、表儿茶素酸酯、盐酸马法兰、地塞米松、硼替佐米、硼替佐米-美法仑、硼替佐米-地塞米松、美法仑-地塞米松、硼替佐米-地塞米松-美法仑；抗抑郁药、抗精神病药物、精神抑制药、抗痴呆药(antidementiva)(例如NMDA-受体拮抗剂美金刚)、乙酰胆碱酯酶抑制剂(例如多奈哌齐、HCI、利斯的明、加兰他敏)、谷氨酸拮抗剂和其他促智药降压药(例如双肼屈嗪(Dihydralazin)、甲基多巴)、细胞抑制剂、糖皮质激素、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂；抗炎剂或它们的任意组合。
治疗有效剂量或治疗有效量是指足以改善症状或病症的活性成分的量。这样的化合物的疗效和毒性可以通过标准药学方法在细胞培养或实验动物中确定，例如，ED50(对群体的50％治疗有效的剂量)和LD50(对群体的50％致死的剂量)。治疗和毒性效果之间的剂量比是治疗指数，并且其可以被表示为比率LD50/ED50。
根据上述内容，很明显的是，本发明包括包含上述抗体至少一个CDR的DPR结合分子的任何应用，特别是用于诊断和/或治疗与DPR特别是聚集的DPR种类(诸如C9ORF72-DPR)相关的疾病或病症(诸如FTLD)。优选地，所述结合分子是本发明的抗体或其生物技术衍生物。此外，本发明涉及上文所述所提及抗体的任何一种的抗独特型抗体。这些是结合到位于抗原结合位点附近的抗体可变区上的独特抗原性肽序列的抗体或其他结合分子，并且它们是有用的，例如，用于从受试者获得的样品中抗DPR抗体的检测。在一种实施方式中，因此本发明提供了如上文和下文所定义的抗体或者具有与其任何一个基本相同的结合特异性的DPR结合分子、本文所定义的多核苷酸、载体或细胞，或者包含其任一的用于与DPR相关的疾病或病症的预防性治疗、治疗性治疗和/或监测其进展或对治疗的响应的药用或诊断组合物。在本发明的优选实施方式中，疾病和/或病症与聚集的DPR相关。在特别优选的实施方式中，疾病和/或病症与C9ORF72-DPR相关，诸如在FTLD和ALS中。
在另一实施方式中，本发明涉及包含本发明的上述的DPR结合分子、抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体或细胞中任一种的诊断组合物以及任选地合适的检测手段(工具)，诸如方便地用于基于免疫的或基于核酸的诊断方法的试剂。本发明的抗体例如适合用于免疫测定，其中它们可在液相被使用或结合于固相载体。使用本发明抗体的免疫测定的实例是以直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫测定。这样的免疫测定的实例是放射免疫测定(RIA)、夹心(免疫测定)、流式细胞术以及蛋白印迹测定法。本发明的抗原和抗体可以与许多不同的载体结合并用来分离与其特异性结合的细胞。众所周知的载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。为了本发明的目的，载体的性质既可以是可溶的也可以是不溶的。存在许多被本领域普通技术人员所已知的不同的标记和标记方法。可用于本发明中的标记类型的实例包括酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物；也参见上文讨论的实施方式。
在另外的实施方式中，DPR结合分子，特别是本发明的抗体也可以被用于如下的方法中，该方法用于通过从测试个体获得体液样品(可以是血液样品、血浆样品、血清样品、淋巴样品或任何其他体液样品(诸如唾液或尿液样品))并且在能够形成抗体-抗原复合物的条件下使体液样品与本发明的抗体接触，从而诊断个体的疾病或病症。然后，通过本领域中已知的方法来测定这种复合物的水平，与对照样品中形成的相比，显著更高的水平指示测试个体的疾病或病症。以相同的方式，也可以使用被本发明抗体结合的特异性抗原。因此，本发明涉及包含结合分子(例如，本发明抗体或其抗原结合片段)的体外免疫测定法。
在本发明的进一步的实施方式中，DPR结合分子，特别是本发明的抗体也可以被用于通过从检验的个体获得活体检查样品来诊断个体的疾病或病症的方法中。
在该背景下，本发明还涉及专门为此目的而设计的工具(means)。例如，可以使用基于抗体的阵列，其例如加载有本发明的特异性识别DPR的抗体或等效的抗原结合分子。微阵列免疫测试的设计总结在Kusnezow等人的Mol.Cell Proteomics 5(2006),1681-1696中。因此，本发明还涉及加载有按照本发明鉴定的DPR结合分子的微阵列。
在一种实施方式中，本发明涉及诊断与受试者体内的DPR特别是聚集的DPR种类(诸如C9ORF72-DPR)相关的疾病或病症的方法，该方法包括使用至少一个本发明的抗体、其DPR结合片段或者具有与其任何一个基本相同的结合特异性的DPR结合分子来分别确定来自待被诊断的受试者的样品中DPR和聚集的DPR的存在，其中病理性聚集的DPR(优选C9ORF72-DPR)的存在对于FTLD和/或ALS是有指征性的，并且与生理性C9ORF72(即其不显示重复区翻译成DPR蛋白)的水平相比，病理性聚集的DPR特别是C9ORF72-DPR的水平的提高对于所述受试者中FTLD和/或ALS的进展是有指征性的。
待诊断的受试者对于所述疾病可以是无症状的或处于潜伏期。优选地，对照受试者具有与DPR、聚集的DPR和优选C9ORF72-DPR相关的疾病，例如FTLD、ALS和FTLD-ALS以及如上文所述的其他疾病，其中DPR(例如聚集的C9ORF72-DPR)的水平与参考标准之间的相似性表明待诊断的受试者具有FTLD、ALS和/或FTLD-ALS或处于发展为与DPR聚集相关的疾病和/或病症的风险中。可替换地，或者另外地，作为第二对照，对照受试者不具有DPR聚集，其中生理性C9ORF72或由于在其基因(如突变的C9ORF72基因)中的突变而倾向于具有插入的DPR的另一蛋白和/或聚集的C9ORF72-DPR的水平与参考标准之间的差异表明待诊断的受试者具有与DPR相关的疾病和/或病症(诸如FTLD、ALS和/或FTLD-ALS)或处于发展为与DPR相关的疾病和/或病症的风险中。优选地，待诊断的受试者和一个或多个对照受试者是年龄匹配的。待分析的样品可以是任何怀疑含有病理性DPR蛋白(诸如聚集的C9ORF72-DPR)的体液，例如血液、血浆、血清、尿液、腹膜液、唾液或脑脊液(CSF)。
生理性C9ORF72或类似蛋白和/或聚集的DPR(诸如C9ORF72-DPR)的水平可以通过本领域中已知的任何合适的方法来评估，包括，例如通过从如下中选择的一种或多种技术分析DPR和/或掺入DPR的蛋白(诸如C9ORF72)：蛋白印迹法、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分选(FACS)、二维凝胶电泳、质谱(MS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)、表面增强激光解吸电离飞行时间(SELDI-TOF)、高效液相色谱(HPLC)、快速蛋白液相色谱(FPLC)、串联质谱(MS/MS)之后的多维液相色谱(LC)和激光光密度测定法。优选地，DPR的所述体内成像包括显像、正电子发射断层筛选(PET)、单光子发射断层摄影(SPECT)、近红外(NIR)光成像或磁共振成像(MRI)。
在一种实施方式中，因此本发明的抗体具有与其任一种基本相同的结合特异性的DPR结合分子、上文所定义的多核苷酸、载体或细胞或包含其任一的药用或诊断组合物被提供用于预防性治疗、治疗性治疗和/或监测与聚集的DPR蛋白相关的疾病或病症的进展或治疗反应。因此，本发明涉及与受试者体内DPR蛋白相关的疾病或病症(诸如FTLD和ALS)的进展的诊断或监测方法，该方法包括使用至少一种本发明的抗体或具有与其任一种基本相同的结合特异性的DPR结合分子来确定来自待被诊断的受试者的样品中DPR蛋白的存在，其中DPR诸如在突变的C9ORF72和聚集的C9ORF72-DPR种类中的存在对于疾病或病症是有指征性的。在一种实施方式中，提供了所述的诊断或监测受试者DPR相关的疾病和/或病症的进展的方法，该方法包括使用至少一种本发明的抗体或具有与其任一种基本相同的结合特异性的DPR结合分子来确定来自待被诊断的受试者的样品中DPR诸如在突变的C9ORF72和其聚集形式中的存在，其中DPR(诸如突变的C9ORF72和/或聚集的C9ORF72-DPR)的存在对于症状前的、前驱症状的或临床的与DPR相关的疾病和/或病症是有指征性的，与不具有DPR的生理性C9ORF72水平相比，或与来自健康对照受试者的参考样品相比，或与来自同一受试者的对照样品相比，DPR聚集体特别是C9ORF72-DPR水平的提高对于症状前的、前驱症状的或已确立的与DPR相关的疾病和/或病症(诸如FTLD和ALS)的进展是有指征性的。本领域任何技术人员将理解，在一种实施方式中，所述方法也被用于诊断或监测来自上文所定义的分别与DPR和含有DPR的蛋白相关的病症的组的任何其他疾病或病症的进展。
如上所述，本发明的抗体以及与抗体具有相同结合特异性的分子不仅可以在体外使用，而且还可以在体内使用，其中除了诊断以外，也可以进行治疗性应用。因此，在一种实施方式中，本发明还涉及包含本发明抗体的至少一个CDR的DPR结合分子，该DPR结合分子用于制备用于在体内检测的组合物或将治疗和/或诊断剂靶向于人体或动物体内DPR优选C9ORF72-DPR的组合物。潜在的治疗和/或诊断剂可以选自上文所显示的用于治疗与DPR相关的疾病和/或病症的治疗剂和潜在的标记的非穷尽枚举。在体内成像方面，在一种优选的实施方式中，本发明提供了包含本发明抗体至少一个CDR的所述DPR结合分子，其中所述体内成像包括正电子发射断层筛选(PET)、单光子发射断层摄影(SPECT)、近红外(NIR)光成像或磁共振成像(MRI)。在进一步的实施方式中，本发明还提供了包含本发明抗体的至少一个CDR的所述DPR结合分子或者用于制备用于上述特异性的体内成像方法的组合物的所述分子，以用于如上文所定义的诊断或监测受试者的DPR蛋白相关的疾病或病症的进展的方法。
在该背景下，本发明还涉及在诊断或监测与DPR和含有DPR的蛋白相关的疾病和/或病症的进展中有用的试剂盒，所述试剂盒包含分别如上定义的本发明至少一种抗体或具有与其任何一种基本上相同的结合特异性的DPR结合分子、多核苷酸、载体或细胞和/或肽，任选的连同试剂和/或使用说明。
上述公开内容主要描述了本发明。除非另有说明，否则如本文所使用的术语被给予如在Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology(《生物化学和分子生物学牛津词典》)，Oxford University Press(牛津大学出版社)，1997年提供，2000年修订和2003年再版，ISBN 0 19 850673 2中所提供的定义。在本说明书全文引用了若干个文件。完整的书目文献引用可在权利要求书之前的说明书末尾找到。所有引用的参考文献(包括文献参考、授权的专利，公开的专利申请，如贯穿本申请所引用的，包括背景技术部分和生产者说明书、指南等)的内容通过引用明确并入本文；但是没有承认引用的任何文献对于本发明确实是现有技术。
通过参考下面的具体实施例可以获得更完整的理解，本文提供的实施例仅用于说明的目的，而不是意在限定本发明的范围。
实施例
实施例1：抗二肽重复(DPR)蛋白抗体的分离与鉴定
使用在国际申请WO 2008/081008(其公开内容在此通过引入并入本文)中记载的方法(具有修改)来确定靶向二肽重复(DPR)蛋白、其片段、C9ORF72-DPR和/或其片段的人源抗体。特别地，由Schafer-N(哥本哈根，丹麦)合成和纯化二肽重复蛋白：GA15：H-CHHHHHH(GA)15-OH；GP15：H-C(GP)15-OH；GR15：H-C(GR)15-OH；(PA)15：H-C(PA)15-OH；(PR)15：H-C(PR)15-OH。然后通过双功能接头(SMCC)将二肽重复蛋白与牛血清白蛋白(BSA)缀合。随后，使用包被有非偶联的或BSA偶联的二肽重复蛋白或者包被有在包被缓冲液(15mM Na2CO3、35mMNaHCO3，pH 9.42)中5μg/ml浓度的BSA(Sigma-Aldrich公司，布克斯，瑞士)的96孔微板(Corning公司)进行直接ELISA。在室温下，用含有2％BSA的PBS/0.1％
Figure BDA0001307886400000851
-20(Sigma-Aldrich公司，布克斯，瑞士)封闭非特异性结合位点1小时。将B细胞条件培养基从记忆B细胞培养板转移至ELISA板，并且在室温下孵育1小时，随后与HRP缀合的驴抗人IgG Fcγ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories有限公司，西格罗夫，美国)和HRP缀合的山羊抗人IgA特异性抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories有限公司，西格罗夫，美国)一起孵育。通过在标准比色测定中测量HRP活性来确定结合。将仅显示培养基中包含的抗体与DPR而不与BSA结合的B细胞培养物进行抗体克隆。
实施例2：抗体序列的确定
上述鉴定的抗DPR抗体可变区的氨基酸序列是在其mRNA序列的基础上确定的，参见图1A-J。简言之，收获所选的非永生记忆B细胞培养物的活B细胞。随后，对来源于产生选择性抗DPR抗体的细胞的mRNA进行提取并将其转化为cDNA，并且编码抗体可变区的序列通过PCR被扩增、克隆到质粒载体中并进行测序。简言之，代表人免疫球蛋白种系组库(germline repertoire)的所有序列家族的引物组合用于前导肽、V-区段和J-区段的扩增。使用在5'-末端的前导肽特异性引物和在3'-末端的恒定区特异性引物进行第一轮扩增(Smith等人,Nat Protoc.4(2009),372-384)。对于重链和κ轻链，使用在5'-末端的V-区段特异性引物和在3'-末端的J-区段特异性引物进行第二轮扩增。对于λ轻链，使用在5'-末端的V-区段特异性引物和在3'-末端的C-区特异性引物进行第二轮扩增(Marks等人,Mol.Biol.222(1991),581-597；de Haard等人,J.Biol.Chem.26(1999),18218-18230)。
具有所需特异性的抗体克隆的鉴定是通过在ELISA上对于完整抗体的重组表达的重新筛选进行的。通过将“在正确的阅读框内”的可变的重链和轻链序列插入表达载体中来实现完整的人IgG1抗体的重组表达，所述表达载体为所述可变区序列在5'-末端补充编码前导肽的序列和在3'-末端补充编码适当的一个或多个恒定区的序列。为了该目的，引物含有被设计以便于将可变重链和轻链序列克隆进抗体表达载体的限制性位点。通过将框内的免疫球蛋白重链RT-PCR产物插入带有信号肽和人或小鼠免疫球蛋白γ1恒定结构域的重链表达载体来表达重链免疫球蛋白。通过将框内的κ轻链RT-PCR产物插入提供信号肽和人κ轻链免疫球蛋白恒定结构域的轻链表达载体来表达κ轻链免疫球蛋白。通过将框内的λ轻链RT-PCR产物插入提供信号肽和人或小鼠λ轻链免疫球蛋白恒定结构域的λ轻链表达载体来表达λ轻链免疫球蛋白。
当将Ig重链表达载体和κ或λIg轻链表达载体共转染到HEK 293细胞或CHO细胞(或者人或小鼠源的任何其他适合的受体细胞系)中时，获得了功能性重组单克隆抗体。重组人单克隆抗体随后使用标准蛋白A柱纯化而从条件培养基中被纯化。可以使用瞬时性或稳定性转染的细胞无限量地产生重组人单克隆抗体。产生重组人单克隆抗体的细胞系可以通过直接使用Ig表达载体或通过将Ig可变区重新克隆到不同的表达载体中而建立。也可以由这些Ig可变区产生衍生物诸如F(ab)、F(ab)2和scFv。
通过与诸如Abysis(http://www.bioinf.org.uk/abysis/)的数据库中可获得的参考抗体序列的比较，确定了框架和互补决定区，并且使用Kabat编号方案注解(http://www.bioinf.org.uk/abs/)。
实施例3：对C9orf72二肽重复蛋白的ELISA EC50分析
为了确定重组人源C9orf72抗体NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2、NI-308.18F7、NI-308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI-308.6B11、NI-308.46F8、NI-308.4M1、NI-308.12A3和NI-308.16C10对C9orf72二肽重复蛋白的结合特异性和半数最大有效浓度(EC50)，进行了ELISA EC50分析。简言之，二肽重复蛋白由Schafer-N(哥本哈根，丹麦)合成和纯化：(GA)15：H-CHHHHHH(GA)15-OH；(GP)15：H-C(GP)15-OH；(GR)15：H-C(GR)15-OH；(PA)15：H-C(PA)15-OH；(PR)15：H-C(PR)15-OH。在包被缓冲液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3，pH9.42)中以5μg/ml或20μg/ml浓度的二肽重复蛋白肽包被96孔微板(Corning股份有限公司，Corning公司，美国)。在室温下用含有2％BSA的PBS/0.1％
Figure BDA0001307886400000871
-20(Sigma-Aldrich公司，布克斯，瑞士)封闭非特异性结合位点1小时。将一抗稀释至指定浓度，并且在室温下孵育1小时，随后与HRP缀合的驴抗人IgG Fcγ特异性抗体(Jackson ImmunoResearchLaboratories有限公司，西格罗夫，美国)一起孵育。通过在标准比色测定中测量HRP活性来确定结合。使用GraphPad Prism软件(San Diego公司，美国)通过非线性回归来估计EC50值。通过间接ELISA来确定人源抗体对C9orf72二肽重复蛋白肽(GA)15、(GP)15、(GR)15、(PA)15和(PR)15的结合特异性和EC50。抗体NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2和NI-308.18F7仅以亚纳摩尔或低纳摩尔范围内的结合亲和力识别聚-GA DPR蛋白(图2A-E)。抗体NI-308.24E11以低纳摩尔EC50特异性结合聚-PR DPR蛋白(图2A和F)，而抗体NI-308.16C10以低纳摩尔EC50优先识别DPR蛋白聚-PR，并且还以较低的亲和力结合聚-GA DPR蛋白(图2A和M)。抗体NI-308.5G2、NI-308.12A3和NI-308.46E9以亚纳摩尔和低纳摩尔EC50优先分别识别DPR蛋白聚-GP，并且还以较低的亲和力结合聚-GA DPR(图2A、G、L和H)。抗体NI-308.6B11显示结合多种DPR蛋白、靶向聚-GR、聚-GA和聚-PR，对聚-GR DPR蛋白具有最高的亲和力(图2A和I)。对于NI-308.46F8观察到类似的结合模式，但亲和力较低(图2A和J)。抗体NI-308.4M1以亚纳摩尔EC50优先识别DPR蛋白聚-PA，并且还以较低的亲和力结合聚-GA DPR蛋白(图2A和K)。总之，通过RTMTM筛选，健康的老年人供体群体的高通量免疫组库分析导致以高亲和力靶向C9orf72六核苷酸扩增相关的DPR的人单克隆抗体的成功的克隆和重组生产。重组人抗体对单个DPR是选择性的或靶向多个种类-可能是由于重复中共同的共有氨基酸。
实施例4：对BSA偶联的DPR肽的结合亲和力
为了确定重组人源C9orf72抗体NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2、NI-308.18F7、NI-308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI-308.6B11、NI-308.46F8、NI-308.4M1、NI-308.12A3和NI-308.16C10对与牛血清白蛋白(BSA)偶联的C9orf72二肽重复蛋白的结合特异性和半数最大有效浓度(EC50)，进行ELISA EC50分析。简言之，二肽重复蛋白由Schafer-N(哥本哈根，丹麦)合成和纯化：(GA)15：H-CHHHHHH(GA)15-OH；(GP)15：H-C(GP)15-OH；(GR)15：H-C(GR)15-OH；(PA)15：H-C(PA)15-OH；(PR)15：H-C(PR)15-OH。然后通过双功能接头(SMCC)将DPR蛋白肽与牛血清白蛋白(BSA)缀合。在包被缓冲液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3，pH 9.42)中以5μg/ml或20μg/ml浓度的BSA偶联的或BSA未偶联的二肽重复蛋白肽包被96孔微板(Corning股份有限公司，Corning公司，美国)。在室温下用含有2％BSA的PBS/0.1％
Figure BDA0001307886400000881
-20(Sigma-Aldrich公司，布克斯，瑞士)封闭非特异性结合位点1小时。将一抗稀释至指定浓度，并在室温下孵育1小时，随后与HRP缀合的驴抗人IgG Fcγ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories有限公司，西格罗夫，美国)一起孵育。通过在标准比色测定中测量HRP活性来确定结合。使用GraphPad Prism软件(San Diego公司，美国)通过非线性回归来估计EC50值。对于抗体NI-308.18F7、NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI-308.4M1和NI-308.12A3，测定了对BSA偶联和未偶联DPR的相当的结合亲和力(图3A-D、G、H、K、L)。抗体NI-308.45C2、NI-308.24E11和NI-308.16C10显示对各自BSA偶联的DPR肽的亲和力降低(图3A、E、F和M)，而抗体NI-308.6B11和NI-308.46F8在这些实验条件下不结合BSA偶联的DPR(图3A、I和J)。总之，大多数人DPR抗体可以以对疏水性包被的肽相当的亲和力识别与BSA载体蛋白偶联的DPR肽。对单个候选物观察到的较低的结合亲和力可能是由于单个DPR肽与BSA的偶联效率差、在BSA偶联后的不同构象或在位点定向化学偶联至载体之后表位的空间不可接近性。
实施例5：对不相关的淀粉样蛋白的结合特异性分析
为了确定NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2、NI-308.18F7、NI-308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI-308.6B11和NI-308.46F8重组抗体的靶特异性，如下进行间接ELISA。在包被缓冲液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3，pH 9.42)中以1-10μg/ml的浓度的不同的靶蛋白包被96孔微板(Corning公司)。在室温下用含有2％BSA的PBS/0.1％
Figure BDA0001307886400000882
-20(Sigma-Aldrich公司，布克斯，瑞士)封闭非特异性结合位点1小时。以20nM浓度稀释NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2、NI-308.18F7、NI-308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI-308.6B11和NI-308.46F8抗体并在室温下孵育1小时。使用与HRP缀合的驴抗人IgG Fcγ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories有限公司，西格罗夫，美国)来确定结合，随后在标准比色测定中测量HRP活性。以高于中值的倍数增加来计算靶蛋白的信号。通过间接ELISA确定NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2、NI-308.18F7、NI-308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI-308.6B11和NI-308.46F8人源抗体的靶特异性评估了抗体与C9orf72二肽重复蛋白和六种不相关的淀粉样蛋白形成蛋白(PHFTau、Tau、TDP-43、TTR、flAPP和HTT)的结合。如图4中所示的，人源抗体NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2、NI-308.18F7、NI-308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.6B11和NI-308.46F8显示其对DPR肽的高结合特异性，同时对于大多数候选物，与不相关的淀粉样蛋白没有交叉反应性或具有最小交叉反应性(图4A-F、H和I)。对于抗体NI-308.46E9，检测到对于若干种分析物升高的脱靶信号(图4G)。
实施例6：C9orf72二肽重复蛋白的蛋白质印迹分析
为了确定重组人源C9orf72抗体NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2、NI-308.18F7、NI-308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI-308.6B11、NI-308.46F8、NI-308.4M1、NI-308.12A3和NI-308.16C10对于C9orf72二肽重复蛋白的结合特异性，进行了免疫印迹分析。二肽重复蛋白由Schafer-N(哥本哈根，丹麦)合成和纯化：(GA)15：H-CHHHHHH(GA)15-OH；(GP)15：H-C(GP)15-OH；(GR)15：H-C(GR)15-OH；(PA)15：H-C(PA)15-OH；(PR)15：H-C(PR)15-OH。然后通过双功能接头(SMCC)将DPR蛋白肽与牛血清白蛋白(BSA)缀合。简言之，通过使用补充有抗氧化剂(Life Technologies Europe B.V.公司，楚格，瑞士)的
Figure BDA0001307886400000891
MES SDS运行缓冲液的梯度SDS-PAGE(
Figure BDA0001307886400000892
Bis-Tris
Figure BDA0001307886400000893
4-12％；Life Technologies Europe B.V.公司，楚格，瑞士)分辨BSA-缀合的二肽重复蛋白肽(0.5μg)。然后通过使用
Figure BDA0001307886400000894
转移缓冲液2x(LifeTechnologies Europe B.V.公司，楚格，瑞士)将分辨的蛋白电印迹(
Figure BDA0001307886400000895
Semi-DryBlotter(半干印迹仪)，1小时，25V)在甲醇活化的PVDF膜(
Figure BDA0001307886400000896
-P TransferMembrane(转移膜)，Merck&Cie，沙芙豪森，瑞士)上。在4℃下用含有2％BSA的PBS/0.1％
Figure BDA0001307886400000897
-20(Sigma-Aldrich公司，布克斯，瑞士)(PBST)封闭非特异性结合位点过夜(或者可替换地在室温下封闭1小时)。将NI-308抗体以10nM或100nM浓度稀释，并在室温下孵育1小时(或者可替换地在4℃下过夜)。将膜在室温下PBST中洗涤3次，持续15分钟，然后与缀合有HRP的驴抗人IgG Fcγ特异性抗体(1：20000或1：10000稀释，Jackson ImmunoResearchLaboratories有限公司，西格罗夫，美国)在室温下一起孵育1小时。通过使用ECL和ImageQuant 350检测(GE Healthcare，Otelfingen，瑞士)的膜显影来确定抗体结合。
通过蛋白质印迹分析来确定人源抗体对BSA偶联的C9orf72二肽重复蛋白(GA)15、(GP)15、(GR)15、(PA)15和(PR)15的结合特异性。抗体NI-308.15O7、NI-308.18F7、NI-308.28G1和NI-308.45C2仅识别DPR蛋白聚-GA(图5A-D)。抗体NI-308.24E11和NI.308-16C10特异性地结合至单一DPR蛋白聚-PR(图5E和J)，同时抗体NI-308.16C10另外识别聚-GA DPR(图5J)。抗体NI-308.5G2、NI.308-12A3和NI-308.46E9特异性地靶向聚-GP(图5F、G和I)，同时抗体NI-308.5G2另外识别聚-GA DPR(图5F)。抗体NI-308.4M1仅识别DPR蛋白聚-PA(图5H)。对于抗体NI-308.6B11和NI-308.46F8，在所选的实验条件下通过蛋白印迹检测不到对BSA偶联的DPR的结合(数据未显示)。总之，大多数人源C9orf72 DPR抗体可以在SDS PAGE和蛋白印迹后识别BSA偶联的DPR肽。所观察到的结合模式与通过ELISA分析所获得的结果一致。
实施例7：通过免疫沉淀对C9orf72 DPR的溶液中结合分析
通过免疫沉淀来评估重组人源C9orf72 DPR抗体NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2、NI-308.18F7、NI-308.24E11和NI-308.6B11的溶液中结合。简言之，二肽重复蛋白由Schafer-N(哥本哈根，丹麦)合成和纯化：(GA)15：H-CHHHHHH(GA)15-OH；(GP)15：H-C(GP)15-OH；(GR)15：H-C(GR)15-OH；(PA)15：H-C(PA)15-OH；(PR)15：H-C(PR)15-OH。将5微克的BSA-未偶联的二肽重复蛋白肽在500μl PBS，pH 7.4(
Figure BDA0001307886400000901
Life TechnologiesEurope B.V.公司，楚格，瑞士)中稀释至10μg/ml的终浓度。DPR蛋白肽样品通过在旋转平台上在4℃下孵育30分钟而用25μl
Figure BDA0001307886400000902
蛋白A(
Figure BDA0001307886400000903
Life Technologies EuropeB.V.公司，楚格，瑞士)预吸附。将1μg或10μg的所选的抗体加入到预吸附的样品中，并在旋转平台上在4℃下孵育过夜。通过加入25μl蛋白A-Dynabeads并在旋转平台上4℃下孵育2小时来捕获免疫复合物。根据制造商的说明书洗涤珠，悬浮在样品缓冲液中并在95℃下加热3分钟。对于蛋白质印迹分析，通过使用
Figure BDA0001307886400000904
MES SDS运行缓冲液(LifeTechnologies Europe B.V.公司，楚格，瑞士)的SDS-PAGE(
Figure BDA0001307886400000905
Bis-Tris
Figure BDA0001307886400000906
12％；Life Technologies Europe B.V.公司，楚格，瑞士)在非还原条件下分辨免疫复合物和未偶联的DPR蛋白肽(500ng)。在
Figure BDA0001307886400000907
转移缓冲液(LifeTechnologies Europe B.V.公司，楚格，瑞士)中将分辨的蛋白电印迹(
Figure BDA0001307886400000908
Semi-DryBlotter(半干印迹仪)，1小时，25V)在甲醇活化的PVDF膜(
Figure BDA0001307886400000909
-P TransferMembrane(转移膜)，Merck&Cie，沙芙豪森，瑞士)上。在4℃下用含有2％BSA的PBS/0.1％
Figure BDA0001307886400000911
-20(Sigma-Aldrich公司，布克斯，瑞士)(PBST)封闭非特异性结合位点过夜。通过在室温下与以下检测抗体孵育1小时来揭示DPR蛋白：(GA)15：NI-308.28G1，10nM；(PR)15：NI-308.24E11，100nM；(GR)15：抗C9ORF72/C9RANT克隆5A5,1:5000稀释(MABN778，Merck&Cie，沙芙豪森，瑞士)。将膜在室温下PBST中洗涤3次，持续15分钟，并与缀合有HRP的驴抗人IgG Fcγ特异性抗体(1：10000稀释，Jackson ImmunoResearch Laboratories有限公司，西格罗夫，美国)或缀合有HRP的小鼠抗大鼠κ抗体(1：10000稀释，SouthernBiotech公司，伯明翰，美国)在室温下一起孵育1小时。使用ECL和ImageQuant 350检测(GE Healthcare，Otelfingen，瑞士)显影膜。抗体NI-308.15O7、NI-308.18F7、NI-308.45C2和NI-308.28G1在溶液中捕获聚-GA DPR蛋白肽(图6A)，而抗体NI-308.24E11和NI-308.6B11分别沉淀聚-PR和聚-GR(图6B和C)。NI-43A11同种型对照抗体确实沉淀了任何所检验的DPR蛋白肽(图6A-C)。总之，人源C9orf72 DPR抗体可以结合和沉淀溶液中的DPR蛋白肽。
实施例8：通过间接ELISA来表征重复长度依赖性结合
为了确定重组人源抗体NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2、NI-308.18F7、NI-308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI-308.6B11和NI-302.4M1对不同重复大小的C9orf72DRP的结合亲和力，进行了ELISA EC50分析。简言之，二肽重复蛋白由Schafer-N(哥本哈根，丹麦)合成和纯化：GA20：H-(GA)20HHHHHH-NH2；GA10：H-(GA)10HHHHHH-NH2；GA6：H-(GA)6HHHHHH-NH2；GA5：H-(GA)5HHHHHH-NH2；GA4：H-(GA)4HHHHHH-NH2；GA3：H-(GA)3HHHHHH-NH2；GA2：H-(GA)2HHHHHH-NH2；GP20：H-(GP)20HHHHHH-NH2；GP10：H-(GP)10HHHHHH-NH2；GP6：H-(GP)6HHHHHH-NH2；GP5：H-(GP)5HHHHHH-NH2；GP4：H-(GP)4HHHHHH-NH2；GP3：H-(GP)3HHHHHH-NH2；GP2：H-(GP)2HHHHHH-NH2；GR20：H-(GR)20HHHHHH-NH2；GR10：H-(GR)10HHHHHH-NH2；GR6：H-(GR)6HHHHHH-NH2；GR5：H-(GR)5HHHHHH-NH2；GR4：H-(GR)4HHHHHH-NH2；GR3：H-(GR)3HHHHHH-NH2；GR2：H-(GR)2HHHHHH-NH2；PA20：H-(PA)20HHHHHH-NH2；PA10：H-(PA)10HHHHHH-NH2；PA6：H-(PA)6HHHHHH-NH2；PA5：H-(PA)5HHHHHH-NH2；PA4：H-(PA)4HHHHHH-NH2；PA3：H-(PA)3HHHHHH-NH2；PA2：H-(PA)2HHHHHH-NH2；PR20：H-(PR)20HHHHHH-NH2；PR10：H-(PR)10HHHHHH-NH2；PR6：H-(PR)6HHHHHH-NH2；PR5：H-(PR)5HHHHHH-NH2；PR4：H-(PR)4HHHHHH-NH2；PR3：H-(PR)3HHHHHH-NH2；PR2：H-(PR)2HHHHHH-NH2。在包被缓冲液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3，pH 9.42)中以50μg/ml浓度的二肽重复蛋白肽包被96孔微板(Corning股份有限公司，Corning公司，美国)。在室温下用含有2％BSA的PBS/0.1％
Figure BDA0001307886400000921
-20(Sigma-Aldrich公司，布克斯，瑞士)封闭非特异性结合位点1小时。将一抗稀释到指定的浓度，并且在室温下孵育1小时，随后与HRP缀合的驴抗人IgG Fcγ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories有限公司，西格罗夫，美国)一起孵育。通过在标准比色测定中测量HRP活性来确定结合。使用GraphPadPrism软件(San Diego公司，美国)通过非线性回归来估计EC50值。
疏水性肽包被后通过间接ELISA测定所选的NI-308抗体对具有不同重复长度的C9orf72 DPR蛋白的结合亲和力。抗体NI-308.15O7和NI-308.28G1需要最少5个GA二肽重复，而抗体NI-308.18F7和NI-308.45C2需要至少6个GA重复，用于以>100nM EC50的第一个可检测的低亲和力结合(图7A、F-I)。对于具有10个或20个(GA)重复的聚-GA DPR检测到高亲和力结合，反映为亚纳摩尔或低纳摩尔范围内的EC50(图7A、C-I)。抗体NI-308.5G2和NI-308.46E9分别需要最少5个和10个GP重复(图7B、J-和N)。后2种抗体的高亲和力结合仅在具有10个和20个重复的聚-GP DPR蛋白肽的扩增重复长度检测到。此外，抗体NI-308.5G2需要最少6个GA二肽重复，用于以>100nM EC50的第一个可检测的低亲和力结合(图7A和K)。对于具有10个或20个(GA)重复的聚-GA DPR检测到高亲和力结合，反映在低纳摩尔范围内的EC50(图7A和K)。抗体NI-308.6B11需要至少3个GR-重复(图7C和L)。对于具有至少5个GR二肽重复的聚-GR DPR蛋白肽检测到此抗体的高亲和力结合(图7C和L)。此外，抗体NI-308.6B11需要最少6个GA二肽重复，用于以>100nM EC50的第一个可检测的低亲和力结合(图7A和M)。对于具有10个或20个(GA)重复的聚-GD DPR，检测到高亲和力结合，反映在低纳摩尔范围内的EC50(图7A和M)。抗体NI-308.24E11需要最少6个PR二肽重复(图7D和O)，而抗体NI-308.4M1需要至少5个PA重复(图7E和P)，分别用于以>100nM EC50的第一个可检测低亲和力结合或两位数纳摩尔结合亲和力。后2种抗体的高亲和力结合仅对具有10个或20个重复的聚-PR和聚-PA DPR的扩增重复长度分别检测到，反映为低纳摩尔或亚纳摩尔范围内的EC50(图7D、E、O和P)。总之，人源C9orf72 DPR抗体显示出对DPR的重复长度依赖性结合，同时缺少与短重复大小的结合并与扩增二肽重复的优先高亲和力结合。
实施例9：通过夹心ELISA来表征重复长度依赖性结合
为了确定重组人源抗体NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.18F7和NI-308.5G2对具有不同重复大小的C9orf72二肽重复蛋白的结合亲和力。简言之，His-标签的二肽重复蛋白肽由Schafer-N(哥本哈根，丹麦)合成和纯化：GA20：H-(GA)20HHHHHH-NH2；GA10：H-(GA)10HHHHHH-NH2；GA6：H-(GA)6HHHHHH-NH2；GA5：H-(GA)5HHHHHH-NH2；GA4：H-(GA)4HHHHHH-NH2；GA3：H-(GA)3HHHHHH-NH2；GA2：H-(GA)2HHHHHH-NH2；GP20：H-(GP)20HHHHHH-NH2；GP10：H-(GP)10HHHHHH-NH2；GP6：H-(GP)6HHHHHH-NH2；GP5：H-(GP)5HHHHHH-NH2；GP4：H-(GP)4HHHHHH-NH2；GP3：H-(GP)3HHHHHH-NH2；GP2：H-(GP)2HHHHHH-NH2。在4℃下在包被缓冲液(15mM Na2CO3、35mMNaHCO3，pH 9.42)中以10μg/ml浓度的单克隆小鼠抗His标签抗体(Takara Bio Europe/Clontech，Saint-Germain-en-Laye，法国)包被96孔微板(Corning股份有限公司，Corning公司，美国)过夜。在室温下用含有2％BSA的PBS/0.1％
Figure BDA0001307886400000932
-20(Sigma-Aldrich公司，布克斯，瑞士)封闭非特异性结合位点1小时。在洗涤步骤后，加入在PBS(pH 7.4)中以1μM或5μM的相等浓度的His标签的C9orf72 DPR蛋白肽以在室温下被抗His标签抗体靶向捕获1小时。在另外的洗涤步骤后，将NI-308抗体在含有2％BSA的PBS/0.1％
Figure BDA0001307886400000931
-20(Sigma-Aldrich公司，布克斯，瑞士)中稀释到指定的浓度，并且在室温下孵育1小时。通过以1:5000稀释的HRP缀合的驴抗人IgG Fcγ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories有限公司，西格罗夫，美国)在室温下检测与DPR蛋白肽结合的抗体1小时。通过在标准比色测定中测量HRP活性来确定结合。使用GraphPad Prism软件(San Diego公司，美国)通过非线性回归来估计EC50值。在通过夹心ELISA的His-标签捕获DPR蛋白后，确定所选的NI-308抗体对具有不同重复长度的C9orf72 DPR蛋白的结合亲和力。抗体NI-308.1507、NI-308.18F7、NI-308.28G1需要最少10个GA-重复，用于在溶液中结合至聚-GA DPR蛋白肽(图8A、C-E)。抗体NI-308.18F7和NI-308.28G1的结合亲和力在亚纳摩尔范围内，并且对于(GA)10和(GA)20DPR蛋白肽二者是等同的(图8A、D和E)。抗体NI-308.15O7显示出仅对扩增的(GA)20DPR蛋白肽的高亲和力结合(图8A和C)。抗体NI-308.5G2显示出对扩增的聚-GP DPR重复长度具有类似的结合依赖性，仅在20GP-重复开始具有显著结合(图8B和F)。总之，人源C9orf72 DPR抗体显示出对DPR显著的重复长度依赖性结合，同时缺乏对短重复的结合并优先高亲和力结合扩增的二肽重复。与疏水性包被的肽(实施例9)相比，在抗原捕获后观察到的对扩增DPR的选择性甚至更加显著。
实施例10：对单体的和聚集的C9orf72 DPR的结合分析
为了确定重组人源NI-308.18F7和NI-308.15O7抗体对单体的和聚集的GAC9orf72二肽重复蛋白的结合特异性和半数最大有效浓度(EC50)。
方法
C9orf72二肽重复蛋白肽
由Schafer-N(哥本哈根，丹麦)来合成和纯化二肽重复蛋白(GA)20(H-(GA)20HHHHHH-NH2)。将冻干的肽以10mg/ml的浓度溶解在DMSO(Sigma-Aldrich，布克斯，瑞士)中。
(GA)20DPR蛋白肽的单体的和原纤维聚集的制备物的产生
为了获得单体DPR蛋白制备物，将(GA)20肽以200μg/ml的浓度溶解在碳酸盐缓冲液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3，pH 9.42)中，并且立即在-80℃冷冻。为了获得DPR聚集体，将(GA)20肽以200μg/ml的浓度溶解在乙酸钠缓冲液(50mM C2H3O2Na、100mM KCl和1mM EDTA，pH3.0)中，并在室温振荡(600rpm)下孵育72小时。将肽制备物储存在-80℃直至使用。
透射电子显微镜
将样品吸附到辉光放电的碳涂覆的铜网格上。通过在滤纸上吸印来除去过量的样品。用2％(w/v)醋酸铀(uranyl acetate)将网格染色1分钟，用蒸馏的去离子水洗涤过量的醋酸铀。对网格进行空气干燥并使用具有100kV的加速电压的Philips CM100透射电子显微镜成像。
间接ELISA
在包被缓冲液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3，pH 9.42)中以5μg/ml浓度的单体的和聚集的(GA)20DPR蛋白肽制备物包被96孔微板(Corning股份有限公司，Corning公司，美国)。在室温下用含有2％BSA的PBS/0.1％
Figure BDA0001307886400000941
-20(Sigma-Aldrich公司，布克斯，瑞士)封闭非特异性结合位点1小时。将一抗稀释至指定浓度，并在室温下孵育1小时，随后与HRP缀合的驴抗人IgG Fcγ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories有限公司，西格罗夫，美国)一起孵育。通过在标准比色测定中测量HRP活性来确定结合。使用GraphPad Prism软件(San Diego公司，美国)通过非线性回归来估计EC50值。
夹心ELISA
在4℃下在包被缓冲液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3，pH 9.42)中以10μg/ml浓度的单克隆小鼠抗His标签抗体(Takara Bio Europe/Clontech，Saint-Germain-en-Laye，法国)包被96孔微板(Corning股份有限公司，Corning公司，美国)过夜。在室温下用含有2％BSA的PBS/0.1％
Figure BDA0001307886400000951
-20(Sigma-Aldrich公司，布克斯，瑞士)封闭非特异性结合位点1小时。在洗涤步骤后，将PBS(pH 7.4)中以5μM的相等浓度的His标签的(GA)20DPR蛋白肽制备物加入以在室温下被抗His标签抗体靶向捕获1小时。在另外的洗涤步骤后，将NI-308抗体在含有2％BSA的PBS/0.1％
Figure BDA0001307886400000952
-20(Sigma-Aldrich公司，布克斯，瑞士)中稀释至指定浓度，并在室温下孵育1小时。通过以1:5000稀释的HRP缀合的驴抗人IgG Fcγ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories有限公司，西格罗夫，美国)在室温下检测与DPR蛋白肽结合的抗体1小时。通过在标准比色测定中测量HRP活性来确定结合。使用GraphPadPrism软件(San Diego公司，美国)通过非线性回归来估计EC50值。
结果，如通过透射电子显微镜分析所显示的，在酸性条件下老化时，C9orf72(GA)20二肽重复蛋白容易聚集成重组淀粉样纤维的结构(图10B)。相比之下，在碱性条件下，(GA)20DPR蛋白肽不形成纤维状聚集体并且可能保持在单体状态(图10A)。通过间接和夹心ELISA结合测定法来确定人源抗体NI-308.18F7和NI-308.15O7对单体的和聚集的C9orf72(GA)20DPR蛋白肽制备物的结合特异性和结合亲和力(EC50)。两种抗体以相当的结合亲和力识别单体的以及聚集的(GA)20-DPR蛋白肽制备物(图9、11和12)。据报道，聚-GA二肽重复蛋白是C9orf72-FTLD中最普遍的肽种类(Mori等人，Acta Neuropathol.2013)。(GA)20二肽重复蛋白在酸性但非碱性条件下老化时容易聚集成淀粉状样纤维状结构。人源抗体NI-308.18F7和NI-308.15O7在两个独立的结合测定中以相当的结合亲和力识别单体的以及聚集的(GA)20-DPR制备物。因此，这些抗体是靶向可溶性以及不溶性构象的病理性GA DPR蛋白的合适候选物。
实施例11：通过SDS PAGE的抗体完整性分析
为了评估重组人NI-308抗体的纯度和完整性。简言之，人NI-308抗体通过瞬时转染CHO-S细胞来表达，并通过FPLC系统(
Figure BDA0001307886400000953
GE Healthcare Life Sciences)上的蛋白A亲和纯化来纯化。在PD-10柱(GE Healthcare Life Sciences)脱盐后，将抗体配制在PBS中。通过使用补充有抗氧化剂的
Figure BDA0001307886400000961
MES SDS运行缓冲液(LifeTechnologies Europe B.V.公司，楚格，瑞士)的梯度SDS-PAGE(
Figure BDA0001307886400000962
Bis-Tris
Figure BDA0001307886400000963
4-12％；Life Technologies Europe B.V.公司，楚格，瑞士)，在还原条件下分辨5μg纯化的重组人NI-308抗体，随后进行考马斯蓝染色(
Figure BDA0001307886400000964
SimplyBlue TMSafeStain，Life Technologies Europe B.V.公司，楚格，瑞士)。结果，重组人NI-308抗体的在还原条件下的SDS-PAGE分析揭示了对应于预期大小的抗体重链和轻链的两个主要条带。没有检测到显著的污染或蛋白水解降解产物(图13)。
实施例12：对在死后人C9orf72-FTLD和非神经对照脑组织中的DPR聚集体病理的结合分析
为了评估抗体NI-308.18F7、NI-308.15O7、NI-308.5G2和NI-308.4M1对来自人C9orf72-FTLD患者和非神经对照的死后小脑组织中的C9orf72二肽重复蛋白的结合。简言之，将来自具有C9orf72六核苷酸重复扩增的3个FTLD患者和1个非神经对照受试者的小脑的福尔马林固定的、石蜡包埋的5μm切片(BiOBANC HCB-IDIBAPS，巴塞罗那，西班牙)通过在1mM的EDTA缓冲液(pH 8.3)中煮沸加热和微波照射12分钟(600W)预处理用于抗原修复。通过在室温下用甲醇溶液中3％的H2O2处理10分钟来实现内源性过氧化物酶活性的猝灭。在室温下用PBS/5％血清(马/山羊)/4％BSA封闭非特异性结合位点1小时。在封闭步骤后，将切片与5nM浓度的人源NI-308.18F7、NI-308.15O7、NI-308.5G2和NI-308.4M1抗体或1:5000稀释的C9RANT对照抗体(Novus Biologicals，利特尔顿，美国)在4℃下一起孵育过夜。用生物素化驴抗人IgG(H+L)(1:350稀释，Jackson ImmunoResearch Laboratories有限公司，西格罗夫，美国)或抗兔二抗(1:250稀释，Vector Laboratories公司；伯林格姆，美国)进行检测，并用Vectastain Elite ABC试剂盒(Vector Laboratories公司，伯林格姆，美国)放大抗体信号，以及用二氨基联苯胺(DAB，Thermo Scientific公司，罗克福德，美国)进行检测。使用
Figure BDA0001307886400000965
封固介质(O.Kindler GmbH公司；弗莱堡，德国)封固载玻片。使用DotslideVS120载玻片筛选仪(Olympus Schweiz AG，瑞士)进行明场成像。通过对来自FTLD患者和非神经对照受试者的小脑切片的免疫组织化学分析，评估了NI-308.18F7、NI-308.15O7、NI-308.5G2和NI-308.4M1对病理性C9orf72二肽重复蛋白的结合。如图14A和B所示的，人源NI-308.18F7、NI-308.15O7和NI-308.5G2抗体显示了在所检验的所有三个C9orf72-FTLD病例的小脑的颗粒细胞层中突出的神经元细胞质包涵体、神经元核内包涵体和营养不良性神经突。相比之下，非神经对照小脑对所检验的所有抗体都是阴性的(图14A)。如图14C中所示的，抗体NI-308.4M1显示出在C9orf72-FTLD病例而非神经对照病例的小脑的颗粒细胞层中神经元胞质包涵体和神经元核内包涵体。总之，人源抗体NI-308.18F7、NI-308.15O7、NI-308.5G2和NI-308.4M1特异性地检测C9orf72-FTLD病例的小脑的颗粒细胞层中的C9orf72二肽重复蛋白聚集体，同时在对照小脑中未观察到染色显示了抗体的高靶特异性。
实施例13：与FTLD中的共聚集的DPR种类结合的人抗体
为了评估不同种类的C9orf72 DPR蛋白在来自携带C9orf72六核苷酸重复扩增的人FTLD患者的死后小脑组织中的定位。简言之，根据制造商的说明书，通过使用Atto 488蛋白标记试剂盒(Sigma-Aldrich公司，布克斯，瑞士)将抗体NI-308.18F7与荧光染料Atto488直接缀合。根据制造商的说明书，通过使用Atto 550蛋白标记试剂盒(Sigma-Aldrich公司，布克斯，瑞士)将抗体NI-308.5G2与Atto 550直接缀合。对于免疫荧光组织化学实验，来自具有C9orf72六核苷酸重复扩增的FTLD患者小脑的福尔马林固定的、石蜡包埋的5μm切片(BiOBANC HCB-IDIBAPS公司，巴塞罗那，西班牙)通过在1mM EDTA缓冲液(pH 8.3)中煮沸加热和微波辐射12分钟(600W)预处理用于抗原修复。在室温下用PBS/5％血清(马/山羊)/4％BSA封闭非特异性结合位点1小时。在封闭步骤后，将切片与5nM的人抗体NI-308.18F7-Atto488和NI-308.5G2-Atto 550在室温下一起孵育2小时。免疫染色后，组织切片与0.1％的苏丹黑B溶液在室温下一起孵育10分钟，以减少组织自体荧光。通过使用DAPI核酸染料(5mg/ml储备溶液，Molecular
Figure BDA0001307886400000971
Life Technologies Europe B.V.公司，楚格，瑞士的1:1000稀释液)进行核复染色。使用Hydromount(National Diagnostics公司，阿特兰，美国)介质封固载玻片。使用Dotslide VS120载玻片扫描仪(Olympus Schweiz AG，瑞士)进行荧光成像。
通过荧光显微镜评估在携带C9orf72六核苷酸重复扩增的人FTLD患者的小脑的颗粒层中的C9orf72聚-GA和聚-GP DPR蛋白定位。如图15中所示的，抗体NI-308.18F7识别广泛的神经元细胞质和核内C9orf72聚-GA包涵体(左图，绿色染色信号)。在实验条件下，选择的NI-308.5G2检测到更稀疏的细胞质和核内聚-GP包涵体的病理学(中图，红色染色信号)。大部分聚-GP DPR蛋白质聚集体与聚-GA DPR蛋白聚集体共定位(左图，黄色染色信号)，这表明两种DPR蛋白可以共聚集在病理性包涵体中。
实施例14：用于研究C9orf72 DPR蛋白的致病机制的基于细胞的模型
最近在新兴细胞培养和动物模型中的报道提供了异常C9orf72 DPR蛋白的毒性的证据。例如，在苍蝇和一些细胞培养模型中，通过诱导核包涵体和核仁应激而发现特别富含精氨酸的DPR蛋白(聚-GR和聚-PR)是有毒的(Kwon等人,Science 345(2014),1139-1145；Mizielinska等人,Science 345(2014),1192-1194；Tao等人,Hum.Mol.Genet.24(2015),2426-2441；Wen等人,Neuron 84(2014),1213-1225；Yang等人,Acta Neuropathol.130(2015),525-535)，而其他人报道了细胞培养系统中细胞质聚-GA聚集体的毒性(May等人,Acta Neuropathol.128(2014),485-503；Zhang等人,Acta Neuropathol.128(2014),505-524)。
为了确定是否如tau(Yanamandra等人,Ann.Clin.Transl.Neurol.2(2013),278-288)和α-突触核蛋白(Tran等人,Cell Rep.7(2014),2054-2065)所示的，可以通过用本发明的抗体处理来防止DPR病理性的扩散，使用类似的种类的体外C9orf72 DPR毒性测定法。特别地，产生合成的DNA序列以驱动在ATG依赖性翻译中携带150个二肽重复的单个DPR蛋白的表达。使用随机密码子策略来确保仅所选的单个DPR蛋白质序列的表达。为了驱动DPR蛋白在神经元细胞(诸如SH-SY5Y、NSC-34、Neuro-2a、iPSC衍生的神经元和原代神经元)中的表达，将合成的DNA序列克隆到由神经元特异性Thy 1.2启动子调节的表达载体中。为了在广泛的真核细胞(诸如HEK293T细胞、U-2OS细胞、HeLa细胞和Cos细胞)中高水平表达，将合成的DNA序列克隆到由CMV启动子调节的表达载体中。源自C9orf72患者成纤维细胞的人iPSC衍生的神经元和转分化的神经元(iNeuron)代表另外的C9orf72 DPR蛋白细胞培养模型。
这些细胞模型可以被用于检验本发明的抗体的治疗效用。本发明的抗体的治疗效果的评估和确认可通过线粒体和/或胱天蛋白酶活性测定法监测细胞存活力、通过细胞溶解和/或膜渗漏测定法测定细胞毒性以及通过免疫组织化学测定法测定细胞DPR蛋白扩散的抑制来进行。
实施例15：用于研究C9orf72DPR蛋白的致病机制的转基因小鼠模型
针对易于聚集的和/或错误折叠的蛋白质开发的免疫治疗方法已在若干种神经退行性疾病的临床前研究和临床研究中产生了有希望的结果。最近已经开发了重现C9orf72六核苷酸重复扩增介导的ALS/FTLD的病理特征的转基因小鼠模型((Chew等人,Science348(2015),1151-1154)；和国际申请WO2014/159247A1)。为了产生这些小鼠模型，使用了携带全长或截短的六核苷酸重复扩增的C9orf72基因(在约450至500个核苷酸重复之间)的细菌人工染色体构建体或含有66个C9orf72六核苷酸重复序列的腺相关病毒载体。在这些小鼠模型中，已经在中枢神经系统中检测到C9orf72六核苷酸重复扩增介导的核RNA灶和DPR蛋白的积累。此外，在不同的转基因小鼠模型中已经观察到C9orf72疾病的病理特征诸如神经元丢失、行为异常、运动缺陷和降低的存活。这些小鼠模型可用于检验本发明的抗体的治疗效用。特别地，待筛选的抗体可以在多种可能的途径(诸如腹膜内抗体注射、颅内注射、脑室内脑输注)施用于动物和检验治疗效果。
由于人免疫系统内的进化优化和亲和力成熟，本发明的抗体提供了有价值的治疗工具，因为其从具有优异的安全性特征的高的可能性和缺乏免疫原性的健康的人受试者中分离出。这些预期的治疗效果的确认可以通过上述出版物中描述的检验方法用人抗体而不是小鼠抗体而提供。
序列表
<110> 生物控股有限公司
<120> 人源抗二肽重复（DPR）抗体
<130> PN1750243PZC
<140> PCT/EP2015/072516
<141> 2015-09-30
<150> EP 14187180.6
<151> 2014-09-30
<150> EP 15180310.3
<151> 2015-08-07
<160> 86
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 369
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(369)
<223> NI-308.18F7-VH 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(198)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (295)..(336)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 1
tgc cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg 48
Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
1 5 10 15
gag acc ctg tcc gtc acg tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc aat gat 96
Glu Thr Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Asp
20 25 30
tac tac tgg aac tgg atc cgg cag ccc gcc ggg aag gga ctg gag tgg 144
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
att ggg cgt ata tat gcc agt ggg acc atc aat tac aac cct tcc ctc 192
Ile Gly Arg Ile Tyr Ala Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
cag agt cga gtc acc atg tca att gac acg tcc aag aac cag ttc tcc 240
Gln Ser Arg Val Thr Met Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
cta gac ctc atc tct gtg tcc gcc gcg gac acg gcc gtc tac tat tgt 288
Leu Asp Leu Ile Ser Val Ser Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga tgg ggc cag gtg gtc ggg gac tac tac tac ggg atg gac gtc 336
Ala Arg Trp Gly Gln Val Val Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
tgg ggc cag ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 369
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 123
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
1 5 10 15
Glu Thr Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Arg Ile Tyr Ala Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Ser Arg Val Thr Met Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Asp Leu Ile Ser Val Ser Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Gln Val Val Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<223> NI-308.18F7 VK 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(120)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (166)..(186)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (283)..(306)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 3
tgc gaa att gtg ctg act cag tct cca ctc tcc ctg tcc gtc acc cct 48
Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro
1 5 10 15
gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc aag tct agt cag agc ctc caa cat 96
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Gln His
20 25 30
aca aat gga tac aat tac ttg gat tgg tac ctg ctg aag cca ggg cag 144
Thr Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Leu Lys Pro Gly Gln
35 40 45
tct cca caa ctc cta atc ttc ttg act tct aat cgg gcc tcc ggg gtc 192
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Phe Leu Thr Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca aat ttt aca ctg aaa 240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
atc agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtc tat tat tgc atg gaa 288
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Glu
85 90 95
ggt ata caa ttg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag ctg gag atc aaa 336
Gly Ile Gln Leu Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Gln His
20 25 30
Thr Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Leu Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Phe Leu Thr Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Glu
85 90 95
Gly Ile Gln Leu Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.18F7 VK-PIMC 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(120)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (166)..(186)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (283)..(306)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 5
tgc gac atc gtg atg acc cag tct cca ctc tcc ctg tcc gtc acc cct 48
Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro
1 5 10 15
gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc aag tct agt cag agc ctc caa cat 96
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Gln His
20 25 30
aca aat gga tac aat tac ttg gat tgg tac ctg ctg aag cca ggg cag 144
Thr Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Leu Lys Pro Gly Gln
35 40 45
tct cca caa ctc cta atc ttc ttg act tct aat cgg gcc tcc ggg gtc 192
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Phe Leu Thr Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca aat ttt aca ctg aaa 240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
atc agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtc tat tat tgc atg gaa 288
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Glu
85 90 95
ggt ata caa ttg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa 336
Gly Ile Gln Leu Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Gln His
20 25 30
Thr Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Leu Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Phe Leu Thr Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Glu
85 90 95
Gly Ile Gln Leu Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 7
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(372)
<223> NI-308.15O7 VH 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(201)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(339)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 7
tgc cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gta gtc cag cct ggg 48
Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
agg tcc ctg aga ctg tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt aat 96
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn
20 25 30
cat gct atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg 144
His Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
gtg gca gtt ata tca tat gat ggc gag aac aca tat tat gca gac tcc 192
Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Glu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
att gag ggc cga ttc acc att tcc aga gac aat ttc aag aac aca ctc 240
Ile Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
ttt cta caa atg tac agc ctg aca gct gat gac acg gct atg tac ttc 288
Phe Leu Gln Met Tyr Ser Leu Thr Ala Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe
85 90 95
tgt gcg aga ggg ggc cgt cgg ggg cac ttc acc tca tac tac ctt gac 336
Cys Ala Arg Gly Gly Arg Arg Gly His Phe Thr Ser Tyr Tyr Leu Asp
100 105 110
tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 372
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn
20 25 30
His Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Glu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Ile Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Phe Leu Gln Met Tyr Ser Leu Thr Ala Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Gly Arg Arg Gly His Phe Thr Ser Tyr Tyr Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<223> NI-308.15O7 VK 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(105)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(171)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (268)..(294)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 9
tgc gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta 48
Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
gga gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agc cag aac ata gac aag 96
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asp Lys
20 25 30
tac tta aat tgg tat cag cag ata ccg ggg aaa gcc cct aag ctc ctg 144
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
atc tat gct gca tcg agt ttg cac agt ggg gtc cca tca agg ttc agt 192
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agt gga tct ggg aca gat ttc tct ctc acc atc agc agt ctg caa 240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
cct gaa gat ttt gca att tac tac tgt caa cag agt tac agt tcc ttc 288
Pro Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Phe
85 90 95
cgg acg ttc ggc caa ggg acc aag ctg gag atc aaa 324
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asp Lys
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Phe
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.15O7 VK-PIMC 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(105)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(171)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (268)..(294)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 11
tgc gac atc cag atg acc cag tct ccg tcc tcc ctg tct gca tct gta 48
Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
gga gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agc cag aac ata gac aag 96
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asp Lys
20 25 30
tac tta aat tgg tat cag cag ata ccg ggg aaa gcc cct aag ctc ctg 144
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
atc tat gct gca tcg agt ttg cac agt ggg gtc cca tca agg ttc agt 192
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agt gga tct ggg aca gat ttc tct ctc acc atc agc agt ctg caa 240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
cct gaa gat ttt gca att tac tac tgt caa cag agt tac agt tcc ttc 288
Pro Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Phe
85 90 95
cgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa 324
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asp Lys
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Phe
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(372)
<223> NI-308.5G2-VH 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (79)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1 根据由Kabat等人1983年提出的编号约定
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(201)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(339)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<400> 13
tgc gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gac ttg cgg aac cct ggg 48
Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Leu Arg Asn Pro Gly
1 5 10 15
gcc tca gtg acg gtt tcc tgc acg gct tct gga tac cat ttc gct gac 96
Ala Ser Val Thr Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr His Phe Ala Asp
20 25 30
aat gct ata aac tgg ctg cgc cag gcc ccc gga caa agg ctt gag tgg 144
Asn Ala Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp
35 40 45
atg ggg tgg atc aac att tac agt ggt aac aca aaa tat tca cag aac 192
Met Gly Trp Ile Asn Ile Tyr Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Asn
50 55 60
ttc cag ggc aga gtc acc ttt acc aga aac aca tcc gcg agc aca gcc 240
Phe Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Arg Asn Thr Ser Ala Ser Thr Ala
65 70 75 80
ttc atg cac ctg cgc agc ctg aga tca gaa gac acg gct gtg tat ttc 288
Phe Met His Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe
85 90 95
tgt gcg aga gac cct gat agc agt gga tat tac ttg ccc tat ttt gac 336
Cys Ala Arg Asp Pro Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Leu Pro Tyr Phe Asp
100 105 110
tac tgg ggc caa gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 372
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Leu Arg Asn Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Thr Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr His Phe Ala Asp
20 25 30
Asn Ala Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Trp Ile Asn Ile Tyr Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Asn
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65 70 75 80
Phe Met His Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Pro Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Leu Pro Tyr Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 342
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(342)
<223> NI-308.5G2 VK 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(123)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (169)..(189)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (286)..(312)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 15
tgc gac atc cag ttg acc cag tct cca gac tcc ctg act ttg tct ctg 48
Cys Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Thr Leu Ser Leu
1 5 10 15
ggc gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc agc cag agt gtt ttc tac 96
Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Tyr
20 25 30
aac tcc aac aat aag aac tac tta gct tgg tat cag cag aaa cca gga 144
Asn Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
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Gln Pro Pro Lys Leu Leu Met Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly
50 55 60
gtc act gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttt act ctc 240
Val Thr Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
65 70 75 80
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Gln Phe Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
atc aaa 342
Ile Lys
<210> 16
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Cys Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Thr Leu Ser Leu
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Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Tyr
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Asn Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(372)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.5G2 VH-PIMC 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (79)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1 根据由Kabat等人1983年提出的编号约定
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(201)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(339)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 17
tgc cag gtg cag ctg gtg caa tct ggg gct gac ttg cgg aac cct ggg 48
Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Leu Arg Asn Pro Gly
1 5 10 15
gcc tca gtg acg gtt tcc tgc acg gct tct gga tac cat ttc gct gac 96
Ala Ser Val Thr Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr His Phe Ala Asp
20 25 30
aat gct ata aac tgg ctg cgc cag gcc ccc gga caa agg ctt gag tgg 144
Asn Ala Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp
35 40 45
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Met Gly Trp Ile Asn Ile Tyr Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Asn
50 55 60
ttc cag ggc aga gtc acc ttt acc aga aac aca tcc gcg agc aca gcc 240
Phe Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Arg Asn Thr Ser Ala Ser Thr Ala
65 70 75 80
ttc atg cac ctg cgc agc ctg aga tca gaa gac acg gct gtg tat ttc 288
Phe Met His Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe
85 90 95
tgt gcg aga gac cct gat agc agt gga tat tac ttg ccc tat ttt gac 336
Cys Ala Arg Asp Pro Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Leu Pro Tyr Phe Asp
100 105 110
tac tgg ggc caa gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 372
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Leu Arg Asn Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Thr Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr His Phe Ala Asp
20 25 30
Asn Ala Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Trp Ile Asn Ile Tyr Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Asn
50 55 60
Phe Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Arg Asn Thr Ser Ala Ser Thr Ala
65 70 75 80
Phe Met His Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Pro Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Leu Pro Tyr Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 19
<211> 342
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
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<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.5G2 VK-PIMC 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(123)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
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<220>
<221> V_区
<222> (286)..(312)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 19
tgc gac atc gtg atg acc cag tct cca gac tcc ctg act ttg tct ctg 48
Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Thr Leu Ser Leu
1 5 10 15
ggc gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc agc cag agt gtt ttc tac 96
Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Tyr
20 25 30
aac tcc aac aat aag aac tac tta gct tgg tat cag cag aaa cca gga 144
Asn Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
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cag cct cct aag ttg ctc atg tac tgg gca tct acc cgg gag tcc ggg 192
Gln Pro Pro Lys Leu Leu Met Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly
50 55 60
gtc act gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttt act ctc 240
Val Thr Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
65 70 75 80
acc att acc aac ctg cag gct gaa gat gtg gca gtc tat tat tgt cag 288
Thr Ile Thr Asn Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95
caa ttt tat agt tct cct ctc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag 336
Gln Phe Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
atc aaa 342
Ile Lys
<210> 20
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Thr Leu Ser Leu
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<220>
<221> V_区
<222> (79)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1根据由Kabat等人1983年提出的编号约定
<220>
<221> V_区
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<220>
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<400> 21
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gag acc ctg tcg ctc acg tgc act gtc gct ggc ggc tcc gtc aat agt 96
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ala Gly Gly Ser Val Asn Ser
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tac tat tgg acc tgg atc cag cag tcc ccc ggg aag gga ctg gag tgg 144
Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Gln Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
ctt ggg cgt atc tat atc gct ggg agg acc aac tat aac ccc tcc ctc 192
Leu Gly Arg Ile Tyr Ile Ala Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
acg agt cga atc gcc ctg tca gtg gac acg tcc agg aac cag ttg tcc 240
Thr Ser Arg Ile Ala Leu Ser Val Asp Thr Ser Arg Asn Gln Leu Ser
65 70 75 80
ctg aag ctg acg tct gtg acc gcc gcg gac acg gcc ata tat tat tgt 288
Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
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gcg aga tgg gga gcg gag agt ggt gac tac tac tat gga gtg gac gtc 336
Ala Arg Trp Gly Ala Glu Ser Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp Val
100 105 110
tgg ggc cca ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 369
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 123
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Pro Ser
1 5 10 15
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ala Gly Gly Ser Val Asn Ser
20 25 30
Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Gln Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
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115 120
<210> 23
<211> 339
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<223> NI-308.28G1 VK 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(120)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (166)..(186)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (283)..(309)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 23
tgc gaa att gtg atg acg cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct 48
Cys Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc aag tct agt gag gga ctc ctg cat 96
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Glu Gly Leu Leu His
20 25 30
agt aat ggt tac acc tat ttg gat tgg tac ctg cag aag cca ggg cag 144
Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
gct ccg cag ctc ctg atc ttt ctg gct tct aat cgg gcc gcc ggg gtc 192
Ala Pro Gln Leu Leu Ile Phe Leu Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly Val
50 55 60
cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aag 240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
atc agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggc gtt tat tac tgc atg cag 288
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
gct ata caa agt cct tgg acg ttc ggc cca ggg acc aag gtg gaa atc 336
Ala Ile Gln Ser Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
aaa 339
Lys
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1 5 10 15
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20 25 30
Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ala Pro Gln Leu Leu Ile Phe Leu Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Ala Ile Gln Ser Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 25
<211> 369
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(369)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.28G1 VH-PIMC 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (79)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1根据由Kabat等人1983年提出的编号约定
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(198)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (295)..(336)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 25
tgc cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca aga ctg gtg aag ccc tcg 48
Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Pro Ser
1 5 10 15
gag acc ctg tcg ctc acg tgc act gtc gct ggc ggc tcc gtc aat agt 96
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ala Gly Gly Ser Val Asn Ser
20 25 30
tac tat tgg acc tgg atc cag cag tcc ccc ggg aag gga ctg gag tgg 144
Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Gln Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
ctt ggg cgt atc tat atc gct ggg agg acc aac tat aac ccc tcc ctc 192
Leu Gly Arg Ile Tyr Ile Ala Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
acg agt cga atc gcc ctg tca gtg gac acg tcc agg aac cag ttg tcc 240
Thr Ser Arg Ile Ala Leu Ser Val Asp Thr Ser Arg Asn Gln Leu Ser
65 70 75 80
ctg aag ctg acg tct gtg acc gcc gcg gac acg gcc ata tat tat tgt 288
Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga tgg gga gcg gag agt ggt gac tac tac tat gga gtg gac gtc 336
Ala Arg Trp Gly Ala Glu Ser Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp Val
100 105 110
tgg ggc cca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 369
Trp Gly Pro Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 123
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Pro Ser
1 5 10 15
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ala Gly Gly Ser Val Asn Ser
20 25 30
Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Gln Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Leu Gly Arg Ile Tyr Ile Ala Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Thr Ser Arg Ile Ala Leu Ser Val Asp Thr Ser Arg Asn Gln Leu Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Ala Glu Ser Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp Val
100 105 110
Trp Gly Pro Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 339
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.28G1 VK-PIMC可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V-区
<222> (73)..(120)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V-区
<222> (166)..(186)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V-区
<222> (283)..(309)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 27
tgc gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct 48
Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc aag tct agt gag gga ctc ctg cat 96
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Glu Gly Leu Leu His
20 25 30
agt aat ggt tac acc tat ttg gat tgg tac ctg cag aag cca ggg cag 144
Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
gct ccg cag ctc ctg atc ttt ctg gct tct aat cgg gcc gcc ggg gtc 192
Ala Pro Gln Leu Leu Ile Phe Leu Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly Val
50 55 60
cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aag 240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
atc agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggc gtt tat tac tgc atg cag 288
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
gct ata caa agt cct tgg acg ttc ggc cca ggg acc aag gtg gaa atc 336
Ala Ile Gln Ser Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
aaa 339
Lys
<210> 28
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Glu Gly Leu Leu His
20 25 30
Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ala Pro Gln Leu Leu Ile Phe Leu Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Ala Ile Gln Ser Pro Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 29
<211> 387
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(387)
<223> NI-308.45C2-VH 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (79)..(114)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(114)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1根据由Kabat等人1983年提出的编号约定
<220>
<221> V_区
<222> (157)..(210)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (307)..(354)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 29
tgc cag ctg cag ctg cag gag tcg ggt cca gga ctg gtg aag ccc tcg 48
Cys Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
1 5 10 15
cag atc ctc tca ctc acc tgt gcc atc tcc ggg gac agt gtc ttc agc 96
Gln Ile Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Phe Ser
20 25 30
aac agt gct gct tgg aac tgg atc agg cag tcc cca tcg aga ggc ctt 144
Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu
35 40 45
gag tgg ctg gga agg aca tac tac agg tcc aag tgg gat aat gat tat 192
Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Asp Asn Asp Tyr
50 55 60
gca cca tct gtg aaa agt cga ata agt atc aac cca gac aca tcc aag 240
Ala Pro Ser Val Lys Ser Arg Ile Ser Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys
65 70 75 80
aac cag ttc tcc ctg cag ttg aat tct gtg act ccc gag gac acg gct 288
Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala
85 90 95
gtg tat tat tgt gca aga gag gtc gca tat tgt ggt ggt gac tgc tat 336
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Ala Tyr Cys Gly Gly Asp Cys Tyr
100 105 110
tct gtt tcc ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc 384
Ser Val Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
tcg 387
Ser
<210> 30
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Cys Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
1 5 10 15
Gln Ile Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Phe Ser
20 25 30
Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Asp Asn Asp Tyr
50 55 60
Ala Pro Ser Val Lys Ser Arg Ile Ser Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys
65 70 75 80
Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Ala Tyr Cys Gly Gly Asp Cys Tyr
100 105 110
Ser Val Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 31
<211> 339
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<223> NI-308.45C2 VK 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(120)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (166)..(186)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (283)..(309)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 31
tgc gaa att gtg atg aca cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct 48
Cys Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc ctc cag 96
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gln
20 25 30
agt aat gga tac acc tat ttg gat tgg tac ctg cag aag cca ggg cag 144
Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
tct cca cag ctc ctg atc tat ttg ggt tct aat cgg gcc tcc ggg gtc 192
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa 240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
atc agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa 288
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
gct cta caa act ccg ctc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc 336
Ala Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
aaa 339
Lys
<210> 32
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Cys Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gln
20 25 30
Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Ala Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 33
<211> 387
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(387)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.45C2 VH-PIMC 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (79)..(114)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(114)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1 根据由Kabat等人1983年提出的编号约定
<220>
<221> V_区
<222> (157)..(210)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (307)..(354)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 33
tgc cag ctg cag ctg cag cag tca ggt cca gga ctg gtg aag ccc tcg 48
Cys Gln Leu Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
1 5 10 15
cag atc ctc tca ctc acc tgt gcc atc tcc ggg gac agt gtc ttc agc 96
Gln Ile Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Phe Ser
20 25 30
aac agt gct gct tgg aac tgg atc agg cag tcc cca tcg aga ggc ctt 144
Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu
35 40 45
gag tgg ctg gga agg aca tac tac agg tcc aag tgg gat aat gat tat 192
Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Asp Asn Asp Tyr
50 55 60
gca cca tct gtg aaa agt cga ata agt atc aac cca gac aca tcc aag 240
Ala Pro Ser Val Lys Ser Arg Ile Ser Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys
65 70 75 80
aac cag ttc tcc ctg cag ttg aat tct gtg act ccc gag gac acg gct 288
Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala
85 90 95
gtg tat tat tgt gca aga gag gtc gca tat tgt ggt ggt gac tgc tat 336
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Ala Tyr Cys Gly Gly Asp Cys Tyr
100 105 110
tct gtt tcc ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc 384
Ser Val Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
tcg 387
Ser
<210> 34
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Cys Gln Leu Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
1 5 10 15
Gln Ile Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Phe Ser
20 25 30
Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Asp Asn Asp Tyr
50 55 60
Ala Pro Ser Val Lys Ser Arg Ile Ser Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys
65 70 75 80
Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Ala Tyr Cys Gly Gly Asp Cys Tyr
100 105 110
Ser Val Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 35
<211> 339
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.45C2 VK-PIMC 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(120)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (166)..(186)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (283)..(309)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 35
tgc gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct 48
Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc ctc cag 96
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gln
20 25 30
agt aat gga tac acc tat ttg gat tgg tac ctg cag aag cca ggg cag 144
Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
tct cca cag ctc ctg atc tat ttg ggt tct aat cgg gcc tcc ggg gtc 192
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa 240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
atc agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa 288
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
gct cta caa act ccg ctc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc 336
Ala Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
aaa 339
Lys
<210> 36
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gln
20 25 30
Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Ala Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 37
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<223> NI-308.24E11-VH可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (79)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1根据由Kabat等人1983年提出的编号约定
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(198)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (295)..(348)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 37
tgc cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg 48
Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
1 5 10 15
gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct act act tcc ctc aga agt 96
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Thr Thr Ser Leu Arg Ser
20 25 30
tat ttc tgg agt tgg atc cgg cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg 144
Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
att ggg tat gtc tat tac agt ggg agt acc atc tac aat ccg tcc ctc 192
Ile Gly Tyr Val Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
aag aat cga gtc acc ata tcc ata gac acg tcc aag aac cag ttc tcc 240
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
ctg aac ctg cgc tct gtg acc gct gcg gat acg gcc atg tat ttc tgt 288
Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
gcg aga ggc gtc ccg gct gag act gat gcg cgg gac ttc ccg ccc tac 336
Ala Arg Gly Val Pro Ala Glu Thr Asp Ala Arg Asp Phe Pro Pro Tyr
100 105 110
tac ttt gat cac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 381
Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 38
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
1 5 10 15
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Thr Thr Ser Leu Arg Ser
20 25 30
Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Val Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Pro Ala Glu Thr Asp Ala Arg Asp Phe Pro Pro Tyr
100 105 110
Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 39
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<223> NI-308.24E11 VK 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(105)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(171)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (268)..(294)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 39
tgc gac atc cag ttg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gcg tca gta 48
Cys Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
gga aac aga atc acc ttc act tgc cag gcg agt cag gac att aga tat 96
Gly Asn Arg Ile Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Tyr
20 25 30
tat tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg 144
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
atc tac gat gtg tcc aat ttg gat aca ggg gtg cca cca agg ttc agt 192
Ile Tyr Asp Val Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser
50 55 60
gga agt gga tct ggg aca aat ttc act ttc acc atc agc agc ctg cag 240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
cct gaa gat att gca gtt tat tac tgt caa cag tat gaa gga ctc cct 288
Pro Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Gly Leu Pro
85 90 95
gtg acc ttc ggc ggg ggg acc aag gtg gag atc aaa 324
Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 40
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Cys Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asn Arg Ile Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Tyr
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Val Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Gly Leu Pro
85 90 95
Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.24E11 VK-PIMC可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(105)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(171)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (268)..(294)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 41
tgc gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gcg tca gta 48
Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
gga aac aga atc acc ttc act tgc cag gcg agt cag gac att aga tat 96
Gly Asn Arg Ile Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Tyr
20 25 30
tat tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg 144
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
atc tac gat gtg tcc aat ttg gat aca ggg gtg cca cca agg ttc agt 192
Ile Tyr Asp Val Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser
50 55 60
gga agt gga tct ggg aca aat ttc act ttc acc atc agc agc ctg cag 240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
cct gaa gat att gca gtt tat tac tgt caa cag tat gaa gga ctc cct 288
Pro Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Gly Leu Pro
85 90 95
gtg acc ttc ggc ggg ggg acc aag gtg gag atc aaa 324
Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
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Gly Asn Arg Ile Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Tyr
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Gly Leu Pro
85 90 95
Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(372)
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<220>
<221> V_区
<222> (79)..(114)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(114)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1根据由Kabat等人1983年提出的编号约定
<220>
<221> V_区
<222> (157)..(204)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
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<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
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1 5 10 15
gag acc ctg tcc ctc act tgc act gtc tct ggt gcc tcc atc agc ggt 96
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Gly
20 25 30
agt acc tac tac tgg ggc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg 144
Ser Thr Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
gag tat att ggg aga atc tac tat agt ggg agc acc tac tac aac ccg 192
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Ser Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
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ctc tcc ctg aca ctg agt tct gtg acc gcc gca gat acg gct gtg tat 288
Leu Ser Leu Thr Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
tat tgt gtg aga ccc ttt tac gct ggt tcg ggg aac tcc ccc ttt gac 336
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100 105 110
tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 372
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
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Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
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Ser Thr Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
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<220>
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Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
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tct gaa gat ttt gtt gtt tat tac tgt cag caa tat aat aac tgg cct 288
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<210> 46
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Val Ser Val Ser Pro
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(372)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.46E9 VH-PIMC 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (79)..(114)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(114)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1 根据由Kabat等人1983年提出的编号约定
<220>
<221> V_区
<222> (157)..(204)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (301)..(339)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
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tgc cag ctg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg 48
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gag acc ctg tcc ctc act tgc act gtc tct ggt gcc tcc atc agc ggt 96
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Gly
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Ser Thr Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
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Glu Tyr Ile Gly Arg Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro
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Ser Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
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<211> 124
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<213> 智人
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<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.46E9 VK-PIMC 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(105)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
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ggg gag aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agc cag agt gtt agc acc 96
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Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu
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Pro Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 智人
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100 105
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
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<220>
<221> V_区
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<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1根据由Kabat等人1983年提出的编号约定
<220>
<221> V_区
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<220>
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<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 51
tgc gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag agg cct ggg 48
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Leu Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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tcg 387
Ser
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115 120 125
Ser
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<220>
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<223> NI-308.6B11 VK 可变K轻链(VK)序列
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<222> (73)..(105)
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<220>
<221> V_区
<222> (151)..(171)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (268)..(294)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 53
tgc gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta 48
Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
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Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ile
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tat tta aat tgg tat cag caa aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg 144
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
gga agt gga tct ggg aca gat ttt act ttc acc atc agc ggc ctg cag 240
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cct gaa gat gtt gca aga tat tat tgt caa cag tat gat gat ctc ccc 288
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<213> 智人
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1 5 10 15
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<221> CDS
<222> (1)..(387)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.6B11 VH-PIMC 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (79)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1 根据由Kabat等人1983年提出的编号约定
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(201)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(354)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 55
tgc cag gtc cag ctg gta cag tct ggg gct gag gtg aag agg cct ggg 48
Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly
1 5 10 15
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tta tcc atg cac tgg gtg cga cag gct cct gga aaa ggg ctt gag tgg 144
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tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc ttg tat cac 288
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Cys Ala Thr Tyr Gly Ser Ser Trp His Trp Asn Glu Gly Asn Glu Gly
100 105 110
tcc tac tac ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc 384
Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
tcg 387
Ser
<210> 56
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu
20 25 30
Leu Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Val Tyr Ala Gln Lys
50 55 60
Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His
85 90 95
Cys Ala Thr Tyr Gly Ser Ser Trp His Trp Asn Glu Gly Asn Glu Gly
100 105 110
Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 57
<211> 378
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<223> NI-308.46F8-VH 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (79)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1根据由Kabat等人1983年提出的编号约定
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(201)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(345)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 57
tgc cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggt gtg gta cgg cct ggg 48
Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly
1 5 10 15
ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt aca gcc tct gga ttc acg ttt gat gaa 96
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Glu
20 25 30
tat ggc atg agc tgg gtc cgc caa gtt cca ggg aag ggg ctg gag tgg 144
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
gtc tct ggc att aat tgg aat gga gca acc aca cgt tat gca gac tct 192
Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Ala Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tcc ctc 240
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
65 70 75 80
tat ctg caa atg aac agt ctg aga gcc gag gac acg gcc ttg tat cac 288
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His
85 90 95
tgt gcg aga gat ggg tgt agg aat acc agc tgc tat atc tgg gac tgg 336
Cys Ala Arg Asp Gly Cys Arg Asn Thr Ser Cys Tyr Ile Trp Asp Trp
100 105 110
ttc gat ccc tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 378
Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 58
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Glu
20 25 30
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Ala Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Gly Cys Arg Asn Thr Ser Cys Tyr Ile Trp Asp Trp
100 105 110
Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 59
<211> 333
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(333)
<223> NI-308.46F8 VL 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (70)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(174)
<223> 互补决定区(CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (271)..(303)
<223> 互补决定区(CDR) VL-CDR3
<400> 59
tgc cag tct gtg ttg acg cag ccg ccc tca gtg tct gcg gcc cca gga 48
Cys Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly
1 5 10 15
cag aag gtc acc atc tcc tgc tct gga agc agc tcc aac att gga aat 96
Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn
20 25 30
aat tat gta tgc tgg tac cag aac ctc cca gga aca gcc ccc aaa ctc 144
Asn Tyr Val Cys Trp Tyr Gln Asn Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
ctc att tat gac gat aat aag cga ccc tca ggg att cct gac cga ttc 192
Leu Ile Tyr Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
50 55 60
tct ggc tcc aag tct ggc acg tca gcc acc ctg ggc atc acc gga ctc 240
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
cag act ggg gac gag gcc gat tat tac tgc gga aca tgg gac agc agc 288
Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser
85 90 95
ctg agt gtt gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 333
Leu Ser Val Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 60
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Cys Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn
20 25 30
Asn Tyr Val Cys Trp Tyr Gln Asn Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Val Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 61
<211> 378
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.46F8 VH-PIMC 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (79)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1 根据由Kabat等人1983年提出的编号约定
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(201)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(345)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 61
tgc gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggt gtg gta cgg cct ggg 48
Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly
1 5 10 15
ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt aca gcc tct gga ttc acg ttt gat gaa 96
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Glu
20 25 30
tat ggc atg agc tgg gtc cgc caa gtt cca ggg aag ggg ctg gag tgg 144
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
gtc tct ggc att aat tgg aat gga gca acc aca cgt tat gca gac tct 192
Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Ala Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tcc ctc 240
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
65 70 75 80
tat ctg caa atg aac agt ctg aga gcc gag gac acg gcc ttg tat cac 288
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His
85 90 95
tgt gcg aga gat ggg tgt agg aat acc agc tgc tat atc tgg gac tgg 336
Cys Ala Arg Asp Gly Cys Arg Asn Thr Ser Cys Tyr Ile Trp Asp Trp
100 105 110
ttc gat ccc tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 378
Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 62
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Glu
20 25 30
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Ala Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Gly Cys Arg Asn Thr Ser Cys Tyr Ile Trp Asp Trp
100 105 110
Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 63
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<223> NI-308.4M1-VH 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(201)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(348)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 63
tgc gag gtg cag ctg gtg gag act ggg gga ggc gtg gtc cag ccg ggg 48
Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
ggg tcc ctg cga ctc tcc tgt gaa gcc tct gga ttc acc atc ggc acc 96
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Ile Gly Thr
20 25 30
tat gcc atg cac tgg gtc cgc cag ttt cca ggc aag ggc ctg gat tgg 144
Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp
35 40 45
gtg gca gta ata tcg ttc gat gga act act gag tac tac aca gac gcc 192
Val Ala Val Ile Ser Phe Asp Gly Thr Thr Glu Tyr Tyr Thr Asp Ala
50 55 60
gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac aca ctg 240
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
tat ctg caa atg aac tac ttg aga ggt gac gac acg gct ata tat ttc 288
Tyr Leu Gln Met Asn Tyr Leu Arg Gly Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe
85 90 95
tgt gcg cga gat ttc acc tcc tcg ggg gag acc ggt tcg tgg aca caa 336
Cys Ala Arg Asp Phe Thr Ser Ser Gly Glu Thr Gly Ser Trp Thr Gln
100 105 110
gta cct gat ctc tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 381
Val Pro Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 64
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Ile Gly Thr
20 25 30
Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp
35 40 45
Val Ala Val Ile Ser Phe Asp Gly Thr Thr Glu Tyr Tyr Thr Asp Ala
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Tyr Leu Arg Gly Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Phe Thr Ser Ser Gly Glu Thr Gly Ser Trp Thr Gln
100 105 110
Val Pro Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 65
<211> 327
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(327)
<223> NI-308.4M1 VK 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(105)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(171)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (268)..(297)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 65
tgc gaa att gtg atg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ctg tct cca 48
Cys Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
1 5 10 15
ggg gaa aga gcc acg ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt act aaa 96
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Lys
20 25 30
tac tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc 144
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
atc tat gat gta tct tac agg gcc gct ggc acc cca gcc agg ttc agt 192
Ile Tyr Asp Val Ser Tyr Arg Ala Ala Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc cta gag 240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
cct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cac caa cgt agc agc tgg cct 288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Trp Pro
85 90 95
ccg gtc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 327
Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 66
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
Cys Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Lys
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Val Ser Tyr Arg Ala Ala Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Trp Pro
85 90 95
Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 67
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.4M1 VH-PIMC 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(201)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(348)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 67
tgc cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag ccg ggg 48
Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
ggg tcc ctg cga ctc tcc tgt gaa gcc tct gga ttc acc atc ggc acc 96
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Ile Gly Thr
20 25 30
tat gcc atg cac tgg gtc cgc cag ttt cca ggc aag ggc ctg gat tgg 144
Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp
35 40 45
gtg gca gta ata tcg ttc gat gga act act gag tac tac aca gac gcc 192
Val Ala Val Ile Ser Phe Asp Gly Thr Thr Glu Tyr Tyr Thr Asp Ala
50 55 60
gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac aca ctg 240
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
tat ctg caa atg aac tac ttg aga ggt gac gac acg gct ata tat ttc 288
Tyr Leu Gln Met Asn Tyr Leu Arg Gly Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe
85 90 95
tgt gcg cga gat ttc acc tcc tcg ggg gag acc ggt tcg tgg aca caa 336
Cys Ala Arg Asp Phe Thr Ser Ser Gly Glu Thr Gly Ser Trp Thr Gln
100 105 110
gta cct gat ctc tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 381
Val Pro Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 68
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Ile Gly Thr
20 25 30
Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp
35 40 45
Val Ala Val Ile Ser Phe Asp Gly Thr Thr Glu Tyr Tyr Thr Asp Ala
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Tyr Leu Arg Gly Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Phe Thr Ser Ser Gly Glu Thr Gly Ser Trp Thr Gln
100 105 110
Val Pro Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 69
<211> 327
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(327)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.4M1 VK-PIMC 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(105)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(171)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (268)..(297)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 69
tgc gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ctg tct cca 48
Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
1 5 10 15
ggg gaa aga gcc acg ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt act aaa 96
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Lys
20 25 30
tac tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc 144
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
atc tat gat gta tct tac agg gcc gct ggc acc cca gcc agg ttc agt 192
Ile Tyr Asp Val Ser Tyr Arg Ala Ala Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc cta gag 240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
cct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cac caa cgt agc agc tgg cct 288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Trp Pro
85 90 95
ccg gtc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 327
Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 70
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Lys
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Val Ser Tyr Arg Ala Ala Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Trp Pro
85 90 95
Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 71
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<223> NI-308.12A3-VH 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(201)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(348)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 71
tgc gag gtg cag ctg gtg gag act ggg gga ggc ttg gta cag cct gga 48
Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
ggg tcc ctg aga ctc tcc tgc gta ggc tct gga ttt ctc ttc agt gat 96
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Leu Phe Ser Asp
20 25 30
ttt gaa atg gac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg 144
Phe Glu Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
att tca tat att agt ggt gac ggt aat atc ata tat cag aca gac tct 192
Ile Ser Tyr Ile Ser Gly Asp Gly Asn Ile Ile Tyr Gln Thr Asp Ser
50 55 60
gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aat tca ctg 240
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
65 70 75 80
ttt cta caa atg gac agc ctg acc gtc gag gac acg gct gta tat tac 288
Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Thr Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
tgt gcg aga gac gcc cgt gaa aac tgt ggt ggt gac tgc tat tcc acg 336
Cys Ala Arg Asp Ala Arg Glu Asn Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Ser Thr
100 105 110
tcc ttt gat ttt tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 381
Ser Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 72
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Leu Phe Ser Asp
20 25 30
Phe Glu Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ser Tyr Ile Ser Gly Asp Gly Asn Ile Ile Tyr Gln Thr Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
65 70 75 80
Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Thr Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Ala Arg Glu Asn Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Ser Thr
100 105 110
Ser Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 73
<211> 342
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(342)
<223> NI-308.12A3 VK 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(123)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (169)..(189)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (286)..(312)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 73
tgc gac atc cag atg acc cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg 48
Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu
1 5 10 15
ggc gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc agc cag agt ctt tta tac 96
Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr
20 25 30
act gcc aac aat agg aac tac tta gcc tgg tac cag aaa aaa gca gga 144
Thr Ala Asn Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Ala Gly
35 40 45
cag cct cct aag ctc ctc att cac tgg gca tct acc cgg gca tcc ggg 192
Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile His Trp Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly
50 55 60
gtc cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc att ctc 240
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu
65 70 75 80
acc atc agc agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tat ttt tgt caa 288
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln
85 90 95
cat tat tat aat tct ccc cgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag 342
His Tyr Tyr Asn Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
atc aaa
Ile Lys
<210> 74
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 74
Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu
1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr
20 25 30
Thr Ala Asn Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Ala Gly
35 40 45
Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile His Trp Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly
50 55 60
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu
65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln
85 90 95
His Tyr Tyr Asn Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
Ile Lys
<210> 75
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.12A3 VH-PIMC 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(201)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(348)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 75
tgc gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct gga 48
Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
ggg tcc ctg aga ctc tcc tgc gta ggc tct gga ttt ctc ttc agt gat 96
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Leu Phe Ser Asp
20 25 30
ttt gaa atg gac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg 144
Phe Glu Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
att tca tat att agt ggt gac ggt aat atc ata tat cag aca gac tct 192
Ile Ser Tyr Ile Ser Gly Asp Gly Asn Ile Ile Tyr Gln Thr Asp Ser
50 55 60
gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aat tca ctg 240
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
65 70 75 80
ttt cta caa atg gac agc ctg acc gtc gag gac acg gct gta tat tac 288
Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Thr Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
tgt gcg aga gac gcc cgt gaa aac tgt ggt ggt gac tgc tat tcc acg 336
Cys Ala Arg Asp Ala Arg Glu Asn Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Ser Thr
100 105 110
tcc ttt gat ttt tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 381
Ser Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 76
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Leu Phe Ser Asp
20 25 30
Phe Glu Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ser Tyr Ile Ser Gly Asp Gly Asn Ile Ile Tyr Gln Thr Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
65 70 75 80
Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Thr Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Ala Arg Glu Asn Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Ser Thr
100 105 110
Ser Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 77
<211> 342
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(342)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.12A3 VK-PIMC 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(123)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (169)..(189)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (286)..(312)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 77
tgc gac atc gtg atg acc cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg 48
Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu
1 5 10 15
ggc gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc agc cag agt ctt tta tac 96
Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr
20 25 30
act gcc aac aat agg aac tac tta gcc tgg tac cag aaa aaa gca gga 144
Thr Ala Asn Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Ala Gly
35 40 45
cag cct cct aag ctc ctc att cac tgg gca tct acc cgg gca tcc ggg 192
Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile His Trp Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly
50 55 60
gtc cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc att ctc 240
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu
65 70 75 80
acc atc agc agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tat ttt tgt caa 288
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln
85 90 95
cat tat tat aat tct ccc cgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag 342
His Tyr Tyr Asn Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
atc aaa
Ile Lys
<210> 78
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu
1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr
20 25 30
Thr Ala Asn Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Ala Gly
35 40 45
Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile His Trp Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly
50 55 60
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu
65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln
85 90 95
His Tyr Tyr Asn Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
Ile Lys
<210> 79
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(375)
<223> NI-308.16C10-VH 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(201)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(342)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 79
tgc gag gtg cag ctg gtg gag act ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg 48
Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
atg tcc ctg agc ctc tcc tgt gca gcg act gga ttc acc ttc agc agt 96
Met Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Thr Phe Ser Ser
20 25 30
tat ggc atg cac tgg gtc cgc caa ggt cca ggc aag ggg ccg gag tgg 144
Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp
35 40 45
gtg gcg ggt ata tgg tac gat gga aca aat aag tat tat gga gac tcc 192
Val Ala Gly Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser
50 55 60
gtg acg ggc aga gtc acc atc tcc aga gac aac tcc aag aac acg ctg 240
Val Thr Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
ttt ctg caa atg atc aac gtg aga gtc gag gac acg gct gtg tat tac 288
Phe Leu Gln Met Ile Asn Val Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
tgt gtg aag gat gca gag cgc gtc cag aaa tgg gct agt tac att atg 336
Cys Val Lys Asp Ala Glu Arg Val Gln Lys Trp Ala Ser Tyr Ile Met
100 105 110
gac gtg tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 375
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 80
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<400> 80
Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Met Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Thr Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp
35 40 45
Val Ala Gly Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser
50 55 60
Val Thr Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Phe Leu Gln Met Ile Asn Val Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Lys Asp Ala Glu Arg Val Gln Lys Trp Ala Ser Tyr Ile Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 81
<211> 315
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(315)
<223> NI-308.16C10 VK 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(174)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (271)..(285)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 81
tgc gaa att gtg ctg act cag tct cca ggc atc ctg tct ttg tct cga 48
Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ile Leu Ser Leu Ser Arg
1 5 10 15
ggg aat cgg gtc gcc ctc tcc tgc agg gcc agt cgg agt gtt aat agc 96
Gly Asn Arg Val Ala Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Ser Val Asn Ser
20 25 30
agc tac tta aat tgg tac cag caa aaa cca ggc cag gct ccc aga ctc 144
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
35 40 45
ctc atc tat ggt gca tct aaa agg gcc act ggc atc tca gac agg ttc 192
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Ser Asp Arg Phe
50 55 60
cgt ggc act ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc gtc gcc aga ctg 240
Arg Gly Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ala Arg Leu
65 70 75 80
gag cct gaa gat att gcg gtt tac tac tgt cag cac tat ggt gcc ttc 288
Glu Pro Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ala Phe
85 90 95
ggc caa ggg acc aag ctg gag atc aaa 315
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 82
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 82
Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ile Leu Ser Leu Ser Arg
1 5 10 15
Gly Asn Arg Val Ala Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Ser Val Asn Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Arg Gly Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ala Arg Leu
65 70 75 80
Glu Pro Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ala Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 83
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(375)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.16C10 VH-PIMC 可变重链(VH)序列
<220>
<221> V_区
<222> (94)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(201)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(342)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 83
tgc cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg 48
Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
atg tcc ctg agc ctc tcc tgt gca gcg act gga ttc acc ttc agc agt 96
Met Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Thr Phe Ser Ser
20 25 30
tat ggc atg cac tgg gtc cgc caa ggt cca ggc aag ggg ccg gag tgg 144
Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp
35 40 45
gtg gcg ggt ata tgg tac gat gga aca aat aag tat tat gga gac tcc 192
Val Ala Gly Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser
50 55 60
gtg acg ggc aga gtc acc atc tcc aga gac aac tcc aag aac acg ctg 240
Val Thr Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
ttt ctg caa atg atc aac gtg aga gtc gag gac acg gct gtg tat tac 288
Phe Leu Gln Met Ile Asn Val Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
tgt gtg aag gat gca gag cgc gtc cag aaa tgg gct agt tac att atg 336
Cys Val Lys Asp Ala Glu Arg Val Gln Lys Trp Ala Ser Tyr Ile Met
100 105 110
gac gtg tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 375
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 84
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Met Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Thr Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp
35 40 45
Val Ala Gly Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser
50 55 60
Val Thr Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Phe Leu Gln Met Ile Asn Val Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Lys Asp Ala Glu Arg Val Gln Lys Trp Ala Ser Tyr Ile Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 85
<211> 315
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(315)
<223> 在校正引物诱导的突变后的NI-308.16C10 VK-PIMC 可变K轻链(VK)序列
<220>
<221> V_区
<222> (73)..(108)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(174)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (271)..(285)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 85
tgc gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cga 48
Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Arg
1 5 10 15
ggg aat cgg gtc gcc ctc tcc tgc agg gcc agt cgg agt gtt aat agc 96
Gly Asn Arg Val Ala Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Ser Val Asn Ser
20 25 30
agc tac tta aat tgg tac cag caa aaa cca ggc cag gct ccc aga ctc 144
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
35 40 45
ctc atc tat ggt gca tct aaa agg gcc act ggc atc tca gac agg ttc 192
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Ser Asp Arg Phe
50 55 60
cgt ggc act ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc gtc gcc aga ctg 240
Arg Gly Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ala Arg Leu
65 70 75 80
gag cct gaa gat att gcg gtt tac tac tgt cag cac tat ggt gcc ttc 288
Glu Pro Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ala Phe
85 90 95
ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 315
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 86
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Arg
1 5 10 15
Gly Asn Arg Val Ala Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Ser Val Asn Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Arg Gly Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ala Arg Leu
65 70 75 80
Glu Pro Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ala Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

Claims (25)

1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合具有聚-甘氨酸-丙氨酸GA15重复的染色体9开放阅读框72二肽重复蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包括：
重链可变区，包括重链可变区互补决定区1、2和3，其中所述重链可变区互补决定区1、2和3分别为SEQ ID NO:8的氨基酸位置32-36所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:8的氨基酸位置51-67所示的氨基酸序列以及SEQ ID NO:8的氨基酸位置100-113所示的氨基酸；以及
轻链可变区，包括轻链可变区互补决定区1、2和3，其中所述轻链可变区互补决定区1、2和3分别为SEQ ID NO:10的氨基酸位置25-35所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:10的氨基酸位置51-57所示的氨基酸序列以及SEQ ID NO:10的氨基酸位置90-98所示的氨基酸。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区包括与SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区包括SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的一个氨基酸缺失的变体。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述轻链可变区包括与SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述轻链可变区包括SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的一个氨基酸缺失的变体。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区包括与SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，以及其中，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区包括SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的一个氨基酸缺失的变体，以及其中，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的一个氨基酸缺失的变体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体包括免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，其中，所述免疫球蛋白重链包括人IgG1恒定区，以及其中，所述免疫球蛋白轻链包括人κ恒定区。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自由单链Fv片段、F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')2片段组成的组。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体被可检测地标记。
11.根据权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中，可检测标记选自由酶、放射性同位素、荧光团和重金属组成的组。
12.一种药物组合物，包括根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
13.用于表达根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的组合物，包括：
(i)编码包括根据权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多肽的多核苷酸；以及
(ii)编码包括根据权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的多肽的多核苷酸。
14.根据权利要求13所述的组合物，每个多核苷酸进一步包括编码分泌信号肽的异源核酸。
15.用于表达根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的表达载体，包括(i)可操作地连接至编码包括根据权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多肽的多核苷酸的启动子；以及(ii)可操作地连接至编码包括根据权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的多肽的多核苷酸的启动子。
16.用于表达根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的表达载体，包括：
第一多核苷酸，其编码包括根据权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的第一多肽；以及
第二多核苷酸，其编码包括根据权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的第二多肽。
17.用于表达根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的宿主细胞，包括根据权利要求15或16所述的表达载体。
18.一种用于制备根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
在细胞培养物中培养包括编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的一种或多种表达载体的宿主细胞；以及
从所述细胞培养物中分离所述抗体或其抗原结合片段。
19.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段制备用于诊断在人受试者中与二肽重复蛋白相关的病症的诊断剂或试剂盒的用途，
其中，二肽重复蛋白物类或其片段的存在指示肌萎缩性侧索硬化和/或额颞叶变性。
20.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段制备用于在人受试者内体内检测聚-甘氨酸-丙氨酸二肽重复蛋白的试剂或试剂盒的用途。
21.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段制备用于治疗性治疗二肽重复蛋白或其聚集形式相关的疾病的药物的用途，其中所述疾病选自由肌萎缩性侧索硬化、额颞叶变性和额颞叶变性-肌萎缩性侧索硬化组成的组。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段配置成鞘内、静脉内或皮下递送。
23.一种用于诊断或监测与二肽重复蛋白相关的病症的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求13或14所述的组合物、根据权利要求15或16所述的表达载体或根据权利要求17所述的宿主细胞。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括试剂和/或使用说明书。
25.多核苷酸，编码：
(i)包括根据权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多肽；以及
(ii)包括根据权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的多肽。
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