CN110470837B - 利用猴srv病毒gp20蛋白检测猴srv病毒的方法及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本申请属于病原微生物的检测领域，涉及用于一种利用猴SRV病毒GP20蛋白检测猴SRV病毒的方法，基于ELISA检测方法，使用猴SRV病毒GP20蛋白检测猴血清样品中抗SRV病毒的抗体。

Description

利用猴SRV病毒GP20蛋白检测猴SRV病毒的方法及其试剂盒
技术领域
本申请属于属于病原微生物比如病毒的检测领域，涉及是针对猴SRV病毒GP20蛋白的检测，尤其涉及利用猴SRV病毒GP20蛋白检测猴SRV病毒，具体涉及检测方法和检测试剂盒。
背景技术
猴D型逆转录病毒(Simian Retrovirus type D,SRV)，属于逆转录病毒科肿瘤病毒亚科的D型病毒，是SPF猴必须排除的4项病毒项目之一。生物医药研究中应用广泛的亚洲猕猴是SRV病毒的自然宿主，根据亚型的不同和宿主种属的差异，动物感染SRV的临床表现多样，有的动物可能无任何症状，有些动物感染后会产生致死性的猴获得性免疫缺陷综合症，对养殖或实验单位都会造成巨大的经济损失。
SRV病毒有6个结构蛋白：核蛋白(P4/6，P14)，基质(P10)，衣壳(P24/27)，与病毒出芽和基因组组装相关的磷蛋白(PP16/18/24)，P10，2个包膜糖蛋白GP70和GP20-22，3种功能蛋白：逆转录酶，整合酶和蛋白酶。GP70主要诱导宿主产生病毒中和抗体，而GP20-22，P27是高度保守的免疫显性蛋白，在抗原中必须存在，以保证检出率。
目前SRV已被发现有8个亚型，由于SRV-6，7是在印度的野生叶猴和猕猴中发现的，对这2个亚型的研究非常少，认为SRV-7与内源性逆转录病毒同源性非常高，所以通常SRV检测主要是针对SRV-1,2,3,4,5型及在我国新发现的8型。2012-2015年间我们从食蟹猴中先后两次分离到共5株SRV病毒株，通过测序发现区别于之前的1-7型，为新的SRV亚型，被命名为SRV-8，全基因组序列已提交GenBank(SRV8/SUZ/2012/V1-V2和SRV8/TEX/2015/V1-V3)。
根据我们的检测数据显示，SRV病毒检测的ELISA阳性的样本中，约有43.5％的样本经WB复证是阴性的。假阳性可能与目前我们在DIA和ELISA中使用的全病毒抗原存在杂蛋白有关，即使增加细胞对照抗原孔，也只能稍降低但无法避免假阳性的出现，只能通过特异性更好的WB法对初筛阳性和可疑的样本对进行复证。
目前，已有采用SRV的P27重组蛋白作为抗原建立ELISA方法的相关报道。根据我们在应用WB检测的经验，SRV各血清型的P24、P27和GP20蛋白作为主要抗原，在各血清型中较为保守，但P24和P27容易出现非特异性反应，而gp20特异性很好。
发明内容
根据上述的现有技术的缺陷，本发明在于提供一种对猴SRV病毒检测具有优秀敏感性和特异性的技术方案。
本发明的一方面在于提供一种利用猴SRV病毒GP20蛋白检测猴SRV病毒的方法，其基于ELISA检测方法，使用猴SRV病毒GP20蛋白检测猴血清样品中抗SRV病毒的抗体。
优选地，所述GP20蛋白为天然SRV的GP20蛋白或人工合成的GP20蛋白；优选地，所述GP20蛋白为人工合成的GP20蛋白，优选GST-GP20-HIS重组蛋白。
优选地，使用猴SRV病毒GP20蛋白包被微孔板，清洗后加入猴血清样品，随后洗涤之后加入显色基团标记山羊抗人IgG抗体，优选HRP标记山羊抗人IgG抗体，最后加入显色液进行检测。
本发明的一方面进一步涉及猴SRV病毒GP20蛋白用于检测猴SRV病毒的用途
本发明的另一发明涉及一种GST-GP20-HIS重组蛋白，其中GP20蛋白为猴SRV病毒GP20蛋白，其序列如下：
GSVSTGAAGLGHSITQYTKLSHQLISDVQAISSTIQDLQDQVDSLAEVVLQNRRGLDLLTAEQGGICLALQEKCCFYTNKSGVVRDKIKRLQDDLEKRRQQLIESPFWTGLNGLLPHHHHHH(SEQ ID NO:2)
本发明的另一方面涉及一种用于ELISA检测的微孔板，所述微孔板由猴SRV病毒GP20蛋白或由上述的GST-GP20-HIS重组蛋白包被。
本发明的另一方面涉及一种检测猴SRV病毒的检测试剂盒，其包括，
猴SRV病毒GP20蛋白；
显色基团标记山羊抗人IgG抗体；
缓冲液。
所述GP20蛋白为天然SRV的GP20蛋白或人工合成的GP20蛋白；优选地，所述GP20蛋白为人工合成的GP20蛋白，优选GST-GP20-HIS重组蛋白；所述显色基团标记山羊抗人IgG抗体为HRP标记山羊抗人IgG抗体。
优选地，所述检测试剂盒，包括微孔板和显色液，优选微孔板预先由猴SRV病毒GP20蛋白包被。
所述的缓冲液包括PBS缓冲液、5％脱脂奶粉的PBS缓冲液。
附图说明
图1为纯化后GST-GP20-HIS重组蛋白的SDS-PAGE分析结果；
图2为利用GST-GP20-HIS的Western Blot的实验结果，其中条带依次为蛋白marker，PC：阳性样本；NC：阴性样本。
图3为GST-GP20-HIS重组蛋白与全病毒抗原的ELISA分析敏感性比较结果。
具体实施方式
为更清楚的了解本申请的发明构思和技术方案，下文将通过具体实施例和附图进一步解释本申请，其中关于实施方式中的技术方案仅是优选的实施方式，不应被解释为限制本申请的范围。对于本领域技术人员来说，在不脱离本申请的技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为落入本申请的保护范围之中。
除非另有定义或说明，本文使用的所有科技术语应视为具有本领域普通技术人员所理解的相同含义，所使用的实验方法均为常规方法；步骤中所使用的材料、试剂等均可从商业途径中获得。
SRV全病毒作为抗原用于猴SRV病毒检测时，需要利用细胞培养SRV全病毒，并且纯化困难，病毒增殖时间较长，产量较低，批次之间的效果不稳定；另外，利用SRV全病毒作为抗原时，由于宿主细胞中杂蛋白的存在，导致容易出现假阳性，所以采用SRV全病毒为抗原的ELISA方法时，阳性结果必须经WB(Western Blot)确认，这样会增加时间和物料成本。同时，以P27重组蛋白作为抗原检测猴SRV病毒时，容易出现假阳性结果。因此本发明的第一方面涉及了利用猴SRV病毒GP20蛋白检测猴SRV病毒的方法。
本发明涉及的利用猴SRV病毒GP20蛋白检测猴SRV病毒的方法，基于ELISA检测方法，使用猴SRV病毒GP20蛋白检测猴血清样品中抗SRV病毒的抗体；其中所述GP20蛋白为天然SRV的GP20蛋白或人工合成的GP20蛋白；优选地，所述GP20蛋白为人工合成的GP20蛋白，优选GST-GP20-HIS重组蛋白。
具体地，本发明的涉及的利用猴SRV病毒GP20蛋白检测猴SRV病毒的方法，包括使用猴SRV病毒GP20蛋白包被微孔板，清洗后加入猴血清样品，随后洗涤之后加入显色基团标记山羊抗人IgG抗体，优选HRP标记山羊抗人IgG抗体，最后加入显色液进行检测。
本文中，术语“ELISA”，即酶联免疫吸附测定法，测量时，将抗原或抗体结合到固相载体上，然后加入另一种抗体或抗原与酶或荧光基团结合成的偶联物，当偶联物与抗原或抗体反应结合后，检测反应后的颜色或荧光。
本发明另外还涉及GST-GP20-HIS重组蛋白。其中，GP20的氨基端带有GST标签肽，羧基端带有6*组氨酸标签肽。本发明中采用重组蛋白来取代全病毒蛋白；比如，可以采用SRV的GP20基因片段，构建原核表达系统，比如大肠杆菌表达，通过蛋白纯化得到目的蛋白，比如标签蛋白的亲和纯化，之后用于ELISA检测。
本发明中，采用人工合成基因以及重组蛋白技术，重组蛋白所用的细胞、人工合成的质粒以及人工包装的病毒等，其安全性显著高于天然活病毒。优选地，重组蛋白两端加入标签，随后利用标签蛋白进行纯化，其纯化操作技术要求降低。
本发明中，根据GenBank已公布的SRV-1/2/3/4/5/8型的基因组序列，截取gp20保守序列进行人工合成后将该片段装入表达载体pGEX-4T-2，再将重组质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)中，利用原核表达系统进行诱导表达和镍柱亲和纯化重组蛋白pGEX-GP20-His，对目的蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot检测分析表达水平和抗原性
优选地，在人工合成核酸序列时，在氨基端前加入一个GST标签序列，在羧基端加入一个6×组氨酸标签序列，GST标签序列有助于蛋白的正确折叠避免形成包涵体，GST蛋白标签和组氨酸标签均可便于蛋白的亲和纯化。本发明涉及的SRV病毒的GP20蛋白在大肠杆菌中成功高效表达，0.9L培养液纯化后获得重组蛋白约87mg，产率96mg/L。SDS-PAGE表明镍柱一步纯化后蛋白纯度很高，Western Blot结果表明该重组蛋白的抗原性很好，可与SRV的抗体反应。
本发明涉及的检测猴SRV病毒的检测试剂盒，包括猴SRV病毒GP20蛋白、显色基团标记山羊抗人IgG抗体、缓冲液。还可以进一步包括微孔板或显色液，其中微孔板可以为预先由猴SRV病毒GP20蛋白包被或在检测中，作为检测步骤包被微孔板。
其中，所述GP20蛋白为天然SRV的GP20蛋白或人工合成的GP20蛋白；优选地，所述GP20蛋白为人工合成的GP20蛋白，优选GST-GP20-HIS重组蛋白；所述显色基团标记山羊抗人IgG抗体为HRP标记山羊抗人IgG抗体。优选地，缓冲液包括但不限于PBS缓冲液、5％脱脂奶粉的PBS缓冲液或其他用于ELISA的常规缓冲液。
实施例1
SRV抗原基因片段合成
根据GenBank公布的SRV-1/2/3/4/5/8序列，选取gp20蛋白的编码核酸序列，即来自SRV-8，按照大肠杆菌偏好性进行优化，在序列末端添加6×His标签,其核苷酸序列为：
GGATCCGTTAGTACCGGCGCAGCAGGTCTGGGTCATAGCATTACCCAGTACACCAAACTGAGCCACCAGCTGATTAGCGACGTTCAAGCGATTAGCAGCACCATTCAGGATCTGCAGGATCAGGTTGATAGCCTGGCGGAAGTTGTTCTGCAGAATCGTCGCGGTCTGGATCTGCTGACCGCAGAACAAGGCGGTATTTGTCTGGCACTGCAGGAAAAATGCTGCTTCTACACCAACAAAAGCGGCGTCGTTCGCGATAAAATCAAACGCCTGCAGGACGATCTGGAAAAACGTCGTCAACAGCTGATTGAAAGCCCGTTTTGGACGGGTCTGAACGGTCTGCTGCCGCATCATCATCATCATCATTAACTCGAG(SEQ ID NO:1)。
将该序列委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，并与pGEX-4T-2载体连接，构建为pGEX-4T-2-gp20表达质粒。将pGEX-4T-2-20质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α感受态细胞(天根生化科技有限公司，CB 101)，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基培养并选择转化子。挑取单克隆菌落，接种于3mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在恒温培养振荡器(上海智诚分析仪器制造有限公司，ZWY-240)37℃培养过夜。用高纯度质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司，DP104)制备质粒，委托苏州金唯智生物科技有限公司测序，-20℃保存备用。
实施例2
GST-GP20-HIS表达与纯化
将保存的质粒热激转化至BL21(DE3)感受态细胞(天根生化科技有限公司，CB105)，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板培养基选择转化子。挑取单克隆菌落，接种于12mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜，转接至1200mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃震荡培养，当OD600达到0.8左右时加入终浓度0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5小时，之后将菌液在4℃10000×g离心20分钟，分别收集沉淀和上清。沉淀用120mL Binding Buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH 7.4)重悬后冰水浴300W超声20分钟破碎细胞，4℃10000×g离心20分钟离心取上清。上清用HisTrapHP(GE，17-5248-02)纯化。
将纯化产物加入到已用蒸馏水充分冲洗后的3.5kD Spectra/Por-3干化型标准型透析膜管(仕必纯贸易有限公司，132720)，在4℃对含2mM DTT(北京索莱宝科技有限公司，D1070)的TBS缓冲液进行透析，纯化产物与透析液体积比为1:100，换液4次共透析24hr。透析后的纯化产物用BradFord试剂盒(碧云天生物技术有限公司，P0006C)测定蛋白浓度。
实施例3
取10μg纯化透析后的GST-GP20-HIS加入2×Loading Buffer(天根生化科技有限公司，RT209)，100℃煮沸5min，简单离心后取上清，上样到10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，用
Figure BDA0002186364440000081
Tetra Cel(Bio-Rad，1658000)100V电泳1.5hr。以考马斯亮蓝染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司，PA0017A)浸泡凝胶室温染色1小时后脱色2小时，在凝胶成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司，Genosens1560)中拍照记录，用Image J 1.48分析，其结果如图1所示。
实施例4
SDS-PAGE电泳后，在CriterionTM转印设备(Bio-Rad，1704070)中400mA转印30分钟，将蛋白转印到PVDF膜上，之后用3％BSA/PBS溶液室温封闭1小时。将猴血清样本用漂洗液(0.05％PBS-Tween 20缓冲液)1:50稀释，加到膜条上，室温孵育1小时，漂洗液洗涤3次；加入用漂洗液1:5000稀释的AP标记山羊抗人IgG(H+L)抗体，室温孵育1小时，漂洗液洗涤3次；加入Western Blue显色液(Promega)显色5min，自来水冲洗1分钟，自然晾干后在膜成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司，定制)中拍照记录，用Image J 1.48分析。阳性样本约在37kDa处有特异性条带，阴性样本没有任何特异性条带出现。
实施例5
纯化的重组蛋白稀释于CBS缓冲液，100μL/孔包被微孔板(Thermo Scientific，446469)，4℃过夜后吸尽液体，用5％的脱脂奶粉/PBS溶液以350μL/孔在室温封闭30min。猴血清样本用0.05％PBS-Tween 20缓冲液1:50稀释，100μL/孔加入到微孔板中，在微孔板孵育器(杭州奥盛仪器有限公司，MK100-4A)37℃孵育30分钟；用PBS在洗板机(BioTek，ELx50)中以350μL/孔洗涤3次，在纸巾上拍干；加入1:3000稀释的HRP标记山羊抗人IgG(H+L)二抗(SeraCare)，100μL/孔，37℃孵育30分钟，重复洗涤3次；加入ABTS显色液(Invitrogen，002024)，室温孵育30min；在酶标仪(BioTek，EL406)上读OD405和OD490，将OD405-OD490的值作为ELISA最终结果。
对比例：采用SRV全病毒抗原进行ELISA分析作平行的敏感性比较，即采用本公司自产商品化猴SRV ELISA试剂盒(SRV全病毒抗原)，用相同的方法测试猴SRV阳性对照，比较分析敏感性；检测2017年，来源于不同机构送检的恒河猴或食蟹猴血清样本87份，对于结果不一致的样本用SRV全病毒Western Blot测试复检，比较两种ELISA方法的检测敏感性和特异性。
如图3所示，GST-GP20-HIS重组蛋白(方块标记)的敏感性优于SRV全病毒抗原(圆形标记)。因此，重组蛋白GST-GP20-HIS可以替代全病毒抗原提供一种低成本、准确、有效且更快捷的ELISA检测方法。
除非另有说明，本发明的实施方式和实验例采用了在本领域普通技术人员能力范围内的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术和化学方法的常规技术。尽管已经在此详细公开了本申请的特定实施方式，但是这仅是通过示例的方式实施，并且仅出于说明的目的。上述实施方式并非旨在限制所附权利要求的范围，也不意味着本申请必须依赖上述详细结构特征才能实施。
本领域技术人员应该知晓，对本申请的任何等同替换或改进，例如对本申请所选用方法、序列、试剂等的任何等效替换或改进以及辅助部分的增加、具体方式的选择等，均落在本申请的保护范围和公开范围之内。上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110> 苏州西山生物技术有限公司
<120> 利用猴SRV病毒GP20蛋白检测猴SRV病毒的方法及其试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatccgtta gtaccggcgc agcaggtctg ggtcatagca ttacccagta caccaaactg 60
agccaccagc tgattagcga cgttcaagcg attagcagca ccattcagga tctgcaggat 120
caggttgata gcctggcgga agttgttctg cagaatcgtc gcggtctgga tctgctgacc 180
gcagaacaag gcggtatttg tctggcactg caggaaaaat gctgcttcta caccaacaaa 240
agcggcgtcg ttcgcgataa aatcaaacgc ctgcaggacg atctggaaaa acgtcgtcaa 300
cagctgattg aaagcccgtt ttggacgggt ctgaacggtc tgctgccgca tcatcatcat 360
catcattaac tcgag 375
<210> 2
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Ser Val Ser Thr Gly Ala Ala Gly Leu Gly His Ser Ile Thr Gln
1 5 10 15
Tyr Thr Lys Leu Ser His Gln Leu Ile Ser Asn Val Gln Ala Ile Ser
20 25 30
Ser Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val
35 40 45
Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly
50 55 60
Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Leu Cys Cys Phe Tyr Thr Asn Lys
65 70 75 80
Ser Gly Val Val Arg Asp Leu Ile Leu Arg Leu Gln Asp Asp Leu Glu
85 90 95
Lys Arg Arg Asn Asn Leu Ile Glu Ser Pro Phe Trp Thr Gly Leu Asn
100 105 110
Gly Leu Leu Pro His His His His His His
115 120

Claims (5)

1.一种GST-GP20-HIS重组蛋白的制备方法是，采用大肠杆菌表达系统，以pGEX-GP20-His为表达载体，构建为pGEX-4t-2-gp20表达质粒； GP20蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码GP20蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种检测猴SRV病毒的检测试剂盒，其特征在于：其包括，
猴SRV病毒GP20蛋白；
显色基团标记山羊抗人IgG抗体；
缓冲液；
所述GP20蛋白为权利要求1所述的制备方法制备的GST-GP20-HIS重组蛋白。
3.如权利要求2所述的检测猴SRV病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述显色基团标记山羊抗人IgG抗体为HRP标记山羊抗人IgG抗体。
4.如权利要求2-3任一项所述的检测猴SRV病毒的检测试剂盒，其特征在于：其包括微孔板和显色液，所述微孔板预先由猴SRV病毒GP20蛋白包被。
5.如权利要求2所述的检测猴SRV病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液包括PBS缓冲液、5％脱脂奶粉的PBS缓冲液。
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