CN110568189A - 犬腺病毒1型抗体elisa检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒及其应用。本发明利用pColdⅡ原核表达系统，制备具有良好反应原性的PB和Knob蛋白，对二者进行大量诱导表达，将复性后的两种蛋白分别作为包被抗原，与纯化的CAdV‑1全病毒进行比对，最终确定Knob蛋白为最佳的ELISA包被抗原。在此基础上，本发明提供了一种高效、敏感性且特异性好的针对CAdV‑1血清抗体的ELISA检测试剂盒，与SN法同时进行样品检测结果显示，本发明提供的ELISA检测试剂盒的敏感性为97.14％，特异性为90.00％，与SN符合率为93.57％，具有敏感度高，特异性好，重复性强等优点。

Description

犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及犬腺病毒1型抗体检测试剂盒，尤其涉及犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法，本发明进一步涉及犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒在检测犬腺病毒1型抗体中的应用，属于犬腺病毒1 型抗体ELISA检测试剂盒领域。

背景技术

犬腺病毒1型(canine adenovirus type 1，CAdV-1)是双链DNA病毒。 CAdV-1主要引起肝炎、肾炎(犬)和脑炎(熊和狐)，其致病性强、感染谱广，除感染犬和狐狸外，还能对野生肉食哺乳动物(狼、棕熊、黑熊、水獭)造成致死性感染(Jeong-Won et al.，2014；Lepczyk，2015)。CAdV-1 感染在世界各地均有报道，已引起广泛关注。CAdV-1病毒的监测需要特异性强、灵敏度高和准确性的检测方法。CAdV-1的传统检测方法，如病毒的分离与鉴定、SN、HA-HI等费时耗力，结果误差较大；PCR和qPCR 虽然检测敏感性高，但在操作过程中极易造成环境中病毒核酸污染 (Tasker et al.，2003)。

ELISA作为传统的、应用最广的血清学诊断方法，其可操作性强，特异性和敏感性高且价格成本低，是CAdV-1疫苗免疫效果监测和感染动物的理想诊断方法。目前，CAdV-1抗体ELISA检测方法较多处于实验室研制阶段(姜莉莉等，2008；葛艳华等，2010；Walker etal.，2016)，但市场上尚未推出商品化的CAdV-1抗体ELISA检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种最佳的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒的包被抗原；

本发明的目的之二是提供一种犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒；

本发明的目的之三提供一种制备所述犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先确定了Knob蛋白作为犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒的最佳包被抗原。

所述的Knob蛋白的制备方法包括：将Knob蛋白的编码基因通过原核表达系统在低温条件下进行表达，获得重组Knob蛋白。更优选的，所述重组Knob蛋白的制备方法包括：(1)以提取的CAdV-1 DNA作为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物扩增Knob全长基因；(2) 将所扩增的Knob全长基因连接到原核表达载体后在大肠杆菌中进行诱导表达并纯化，即得。

本发明利用pColdII原核表达系统获得可溶性表达的重组CAdV-1结构蛋白五邻体基底(Penton base，PB)和Knob，通过CsCl密度梯度离心法获得纯化后的CAdV-1 F1301株培养产物，用三种抗原分别与CAdV-1 阴、阳性血清作用，通过OD450值和P/N值的大小确定ELISA最佳包被抗原；结果显示，Knob蛋白为ELISA最佳包被抗原。

Penton由基底(Base)和纤丝(Fiber)构成，是CAdV-1的主要结构蛋白之一，Penton基底的顶部包含两个重要的凸起结构，其中一个凸起为超变的Loop结构，另一个凸起包含与宿主细胞整合素相互作用的结构域，在病毒入侵宿主细胞时，与宿主细胞整合素蛋白结合后发生相互作用，将病毒粒子内化到细胞内。Knob蛋白为三聚体Fiber的远端结构，呈球状。 Knob蛋白是CAdV-1的主要受体结合蛋白，在CAdV-1感染宿主的过程中，Knob与宿主细胞表面特异性受体结合将病毒粒子锚定于细胞表面，为进一步感染宿主细胞提供环境基础。Knob蛋白具有血凝特性，能特异性凝集红细胞，是区分CAdV-1和CAdV-2的主要抗原蛋白。五邻体基底 (Penton Base，PB)和Knob蛋白均有CAdV-1主要的型特异性抗原决定簇，二者均可以作为CAdV-1的诊断抗原(Cao et al.，2012；Simao et al.， 2016)。

本发明在确定了Knob蛋白作为犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒的最佳包被抗原的基础上，本发明提供了一种犬腺病毒1型抗体ELISA 检测试剂盒，包括：包被所述的Knob蛋白的ELISA板，酶标二抗、稀释液、洗涤液、封闭液、显色液、终止液、标准CAdV-1阳性血清样品或标准CAdV-1阴性血清样品。

所述酶标二抗为HRP标记的Goat anti-Dog IgG；所述封闭液优选为 BSA，最优选为为3％BSA；所述洗涤液是PBST；所述样品稀释液为含5％脱脂奶粉的洗涤液；所述终止液为浓度为1M的HCL溶液；所述显色液是TMB显色液。

本发明进一步对犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒的制备条件进行了优化，通过优化试验结果发现，确定Knob蛋白最适包被浓度为2.5 μg/mL；采用封闭液进行封闭时，最适封闭条件为37℃2h；血清最适稀释度为1：100；酶标二抗最适稀度为1：8000；血清和二抗最适作用条件分别为37℃1h和RT 1h；最终确定阴阳性样品的临界值为0.376。

作为参考，本发明提供了一种应用所述犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒检测血清样品中犬腺病毒1型抗体的方法：

(1)将Knob蛋白抗原用50mM pH9.6的缓冲液稀释至5μg/mL，包被酶标板，100μL/孔，37℃作用2h；用洗涤液洗涤3次，100μL/孔/次；加封闭液，100μL/孔，37℃作用2h，用洗涤液洗板3次；

(2)加入待检血清(1:100稀释)，100μL/孔，在同一酶标板中设置阴阳性和空白对照，37℃作用0.5h；洗板5次；

(3)加入HRP标记的Goat anti-Dog IgG(1:5000稀释)，100μL/ 孔，RT 1h；洗板5次；

(4)加TMB显色液，100μL/孔，避光静置10min，加入浓度为1M 的HCL，100μL/孔，将酶标板置于酶标仪中，读取450nm处的OD值，通过阴阳性血清OD值，计算P/N值。

(5)待检血清OD450值大于0.376定为阳性，小于0.376定为阴性。

本发明选择12份血清样品进行重复性实验，结果显示ELISA板间和板内差异系数均在10％以内。特异性试验结果显示，本方法与CDV、 CPV和CPIV阳性血清均不发生交叉反应，具有良好的特异性。敏感性实验结果显示，ELISA可检出的阳性样品最高稀释倍数为1：3200，其敏感性远高于SN的1:256。用本发明建立的ELISA方法与SN法同时进行样品检测，结果显示ELISA敏感性为97.14％，特异性为90.00％，与SN符合率为93.57％；综合结果显示，本发明提供的犬腺病毒1型抗体ELISA 检测试剂盒具有敏感度高，特异性好，重复性强等优点，具有一定的应用前景。

本发明整体技术方案详述

本发明利用pColdⅡ低温原核表达系统，在15℃条件下诱导目的蛋白表达，与37℃相比，低温条件有利于蛋白高级结构的折叠，提高了可溶性表达效率，成功表达出可溶性的PB和Knob融合蛋白，为CAdV-1 抗体ELISA方法的建立提供了包被抗原。本试验中以纯化后的CAdV-1 全病毒抗原包被酶标板，与CAdV-1阴、阳性血清样品反应后，阳性样品 OD值为2.48，具有良好的反应效果，但阴性样品OD值为0.48，较Knob 蛋白包被时的OD值高出一倍，在临床应用中很容易漏检。以CAdV-1全病毒作为包被抗原的传统ELISA方法，其病毒粒子大多是通过超速离心方式得到，病毒的浓度及纯度均较低，在一定程度上影响了ELISA检测方法的敏感性和特异性。在病毒纯化过程中，由于超速离心机专用的离心管无法密封，很容易造成病毒粒子的逃逸，对环境的产生污染。和传统方法相比，原核表达得到的蛋白不仅具有较高的浓度和纯度，而且不会造成环境的污染(Lebarbenchon et al.，2012)。PB是CAdV-1主要结构蛋白之一，以纯化后的重组PB蛋白包被酶标板，与CAdV-1阴、阳性血清样品反应，阳性样品OD值为2.14，具有较好的反应效果，但阴性样品OD 值过高，为0.72，P/N值为2.97，总体特异性较低。相较于Knob蛋白， PB蛋白结构要复杂的多，其整体呈五聚体的郁金香形状，特异性的抗原表位暴露不充分可能是其与CAdV-1阴、阳性血清反应较差的原因(Fuschiotti et al.，2006；Galinier et al.，2002)。

以重组Knob蛋白建立的针对CAdV-1的间接ELISA检测方法稳定性高，其板内差异系数为0.36％～8.07％，板间差异系数为0.43％～5.40％，均小于10％。倍比稀释血清样品进行敏感性实验，结果显示，ELISA可检出的CAdV-1阳性样品的最高稀释度为1：3200，其敏感性远高于SN的 1:256。与CDV、CPV和CPIV三种常见的犬科动物疾病的阳性血清均不存在交叉反应，具有很强的特异性。CAdV-1抗体ELISA检测法与SN方法检测结果的敏感性(Se)为97.14％，特异性(Sp)为90％，符合率为 93.57％。结果显示本试验建立的ELISA检测方法敏感度高，特异性好，重复性强，能够代替中和试验进行大规模的临床诊断，具有一定经济价值。

本发明利用pColdⅡ原核表达系统，制备具有良好反应原性的PB和 Knob蛋白，对二者进行大量诱导表达，将复性后的两种蛋白分别作为包被抗原，与纯化的CAdV-1全病毒进行比对，筛选出最佳的ELISA包被抗原。经过系列优化，建立血清抗体的间接ELISA检测方法并提供了一种高效且敏感性和特异性好的针对CAdV-1血清抗体的ELISA检测试剂盒，并评价其与中和试验检测方法的平行关系，本发明提供的犬腺病毒1 型抗体ELISA检测试剂盒具有敏感度高，特异性好，重复性强等优点，具有一定的应用前景。

附图说明

图1基因的扩增和重组质粒的双酶切鉴定；(A)PCR扩增PB和Knob 基因，1、DNA分子质量标准；2、PB基因；3、Knob基因；4、阴性对照 (B)重组质粒的双酶切鉴定，1、DNA分子质量标准；2、pColdΠ-PB质粒； 3、pColdΠ-Knob质粒。

图2重组蛋白的表达及纯化；1：蛋白分子质量标准；2：纯化蛋白；3：全菌裂解液；4：菌体裂解上清；5：未诱导对照

图3抗原包被浓度与血清稀释度。

图4封闭液优化曲线。

图5二抗优化曲线。

图6封闭时间优化曲线。

图7血清孵育条件优化曲线。

图8二抗孵育条件。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

主要生物材料和试剂

CAdV-1标准阳性血清共70份，本室制备的CAdV-1灭活疫苗免疫银狐阳性血清32份，CAdV-1灭活疫苗免疫中华田园犬阳性血清20份， CAdV-2活疫苗免疫银狐阳性血清18份。经SN筛选获得CAdV标准阴性血清10份，全部来源于健康银狐。CDV、CPV和CPIV阳性血清均由保存。CAdV-1F1301株、CAdV-2疫苗株和MDCK细胞均为本实验室保存。 DH5α、BL21(DE3)感受态细胞和pColdII原核表达载体，购自TaKaRa 公司。

Fast pfu high-fidelity DNA polymerase和T₄DNA ligase购自lnvitrogen 公司；His-Bind Purification Kit购自Thermo Fisher公司；Goat anti-Mouse IgG(HRP)、Goat anti-Dog IgG(HRP)和Anti-6X His tags抗体，购自 abcam公司；CAdV-1标准阳性血清由本实验室保存。

实施例1包被抗原的制备和筛选

1、试验方法

1.1 CsCl密度梯度离心纯化CAdV-1抗原

CAdV-1F1301株感染MDCK细胞，24h后收集培养液，反复冻融三次，4℃2000×g离心10min，使用Millipore超滤管(截留分子量50KDa) 对培养液进行20倍浓缩，参照文献(Zouet al.，2018)，使用CsCl密度梯度超速离心法纯化CAdV-1。将浓缩后的病毒上清加入1.25、1.30和1.35 g/cm³的CsCl梯度液中，4℃150000×g离心4h，收集1.30-1.35g/cm³界面上的病毒条带，在含有10mM Tris-Cl、150mM NaCl和5％甘油(pH7.6) 的缓冲液中透析两次，利用标准化的BCA试剂盒对纯化后的CAdV-1抗原进行浓度测定，保存于-80℃备用。

1.2引物设计与合成

参照CAdV-1RI261株(GenBank号：Y07760.1))基因序列，采用DNA Star软件设计引物用于扩增PB和Knob基因序列，预期扩增片段大小分别为 1434bp和519bp。引物序列如表1所示，下划线分别为酶切位点SacI和PstI。

表1特异性引物序列和位置

注：寡核苷酸位置参考CAdV-1RI261株(GenBank号Y07760.1)

1.3 PB和Knob基因的克隆及表达载体的构建

将提取的CAdV-1DNA作为模板，并用设计的特异性引物分别扩增 PB和Knob全长基因。PCR反应体系50μL:5x Buffer 10μL，dNTP Mixture 0.2mM,pfu DNA polymerase5units，上、下游引物各0.2mM，模板50ng， ddH20补足50μL。使用质量分数为0.8％的琼脂糖凝胶电泳初步鉴定扩增产物。经凝胶回收后将片段分别连接到pColdII载体，连接体系为10μL： pColdII载体200ng，胶回收产物350ng，4×T₄ DNA Ligase Master Mix 5 μL，以ddH₂O补齐体系，16℃过夜。将连接好的片段转入DH5α中，经扩大培养后收集菌液并提取质粒DNA，以SacI和PstI对提取的质粒进行双酶切鉴定，将符合双酶切结果的质粒测序。将测序后鉴定无误的重组质粒转入BL21(DE3)中，获得重组表达菌株pColdII-PB和pColdII-Knob。

1.4重组质粒的诱导表达及表达产物的纯化

将重组表达菌株pColdII-PB和pColdII-Knob均按照1：100的比例转接到培养基中(含Amp)，37℃，200r/min，至OD₆₀₀值达到0.4～0.6时，于15℃预冷20min，加入IPTG诱导剂(浓度为1mM)，15℃、200r/min 连续培养24h后离心收集菌液，沸水浴充分变性后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证正确后，以相同条件大量表达重组菌株，表达完成后收集菌液，用5倍体积PBS重悬菌液后进行低温超声裂解(冰浴，超声5s，间隔5s，功率220W，破碎50次)，将收集到的超声上清置于His-Bind层析柱中，利用镍离子与His标签的相互作用对重组蛋白进行纯化，利用标准化的BCA试剂盒对纯化后的重组蛋白进行浓度测定。

1.5 Western blotting分析

选取适量重组PB和Knob蛋白，经沸水浴完全变性后分别进行SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后将蛋白转印至NC膜，以3％BSA的 PBST缓冲液封闭，37℃条件下孵育2h。重组蛋白N端带有6X His标签，以小鼠抗His标签单克隆抗体(1∶1000稀释)和CAdV-1标准阳性血清 (1∶500稀释)作为一抗，其中，His单抗的孵育条件为4℃，12h，CAdV-1 标准阳性血清的孵育条件为30℃孵育1h。Goat anti-Mouse IgG(HRP) (1∶5000稀释)和Goat anti-DogIgG(HRP)作为二抗，进行 Western-blotting分析。

1.6 ELISA流程设定及包被抗原的筛选

将三种候选抗原用50mM pH9.6的缓冲液稀释至5μg/mL，包被酶标板，100μL/孔，37℃作用2h；用洗涤液(PBST)洗涤3次，100μL/孔/ 次；加封闭液(3％BSA)，100μL/孔，37℃作用2h；洗板3次；加入待检血清(1:100稀释)，100μL/孔，在同一酶标板中设置阴阳性和空白对照，37℃作用0.5h；洗板5次；加入Goat anti-Dog IgG(HRP)(1:5000 稀释)，100μL/孔，RT1h；洗板5次；加TMB显色液，100μL/孔，避光静置10min，加入浓度为1M的HCL，100μL/孔，将酶标板置于酶标仪中，读取450nm处的OD值，通过阴阳性血清OD值，计算P/N值。

1.7血清中和抗体试验(SN)流程

固定病毒稀释血清法：1、血清灭活，56℃孵育30min；2、将灭活后的样品在96孔板上作连续的2倍倍比稀释，50μL/孔，每个稀释度作8 个孔；每孔加入50μL CAdV-1(100TCID₅₀)，37℃孵育2h；将消化后的MDCK均匀加入96孔板，100μL/孔；将细胞板放回温箱中，逐天监测病变情况，使用Reed-Muench法计算CAdV-1的中和效价。

2试验结果

2.1 PB和Knob基因的克隆及表达载体的构建

采用CAdV-1基因组作为模板，经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后获取了与预期相符的(PB：1434bp，Knob：519bp)基因片段(图l)，将目的基因分别连接至表达载体pColdII中，用限制性内切酶SacI和PstI 进行双酶切鉴定，并送生工生物公司测序，证实本试验获得的扩增片段与目的基因完全一致。

2.2重组质粒的表达纯化及Western blot分析

将pColdII-PB和pColdII-Knob转化到BL21(DE3)感受态细胞，挑取生长良好的阳性菌株于培养基中(含Amp)，37℃，200r/min，培养 12h。将重组表达菌株pColdII-PB和pColdII-Knob均按照1：100的比例转接到新的培养基中(含Amp)，37℃，200r/min，至OD₆₀₀值达到0.4-0.6 时，于15℃预冷20min，加入诱导剂IPTG(终浓度为1mM)后于15℃培养24h。SDS-PAGE结果显示，在55和20KDa处发现与目的蛋白大小相同的条带(PB约55KDa，Knob约为20KDa)且在上清中表达，而对照菌在此处无条带产生。参照His-Bind purification kit说明书对目的蛋白进行纯化，并对纯化后的蛋白进行western blot分析，一抗为Goat anti-Mouse IgG(6×His)His和CAdV-1高免血清，二抗分别为Goat anti-Mouse IgG(HRP)和Goatanti-Dog IgG(HRP)。如图2所示，重组 PB和Knob蛋白与His单抗和CAdV-1高免血清均能发生特异性结合。

2.3最佳包被抗原的确定

将纯化后的CAdV-1、重组PB和Knob蛋白三种抗原分别稀释至10 μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL后包被96孔酶标板，检测CAdV-1标准阴、阳性血清，该三种抗原在三种浓度均可与CAdV-1阳性血清特异性结合。三种抗原以5μg/mL包被酶标板的ELISA结果如表2，由结果可以看出，重组Knob蛋白与CAdV-1阳性血清反应效果最好，其平均OD值为2.49，阴性血清样品OD值最低，仅为0.24，P/N值为10.38，远高于重组PB蛋白和纯化的CAdV-1抗原。因此，本试验确定重组Knob蛋白为最佳包被抗原建立CAdV-1抗体ELISA检测方法。

表2不同包被抗原与CAdV-1阴、阳性血清作用结果

试验例1CAdV-1抗体ELISA检测试剂盒的反应条件的优化

1、试验方法

1.1 Knob蛋白包被浓度及血清稀释度

采用方阵滴定法将Knob蛋白稀释至5μg/mL、2.5μg/mL、1.25 μg/mL、0.62μg/mL、0.31μg/mL和0.165μg/mL共6个浓度，分别包被 96孔板，以1：50，1：100，1：200，1：400的稀释度对阴阳性血清进行稀释。按照实施例1中1.6的流程操作，以试验结果确定Knob蛋白最适包被浓度和血清样品最适稀释度。

1.2封闭液的选择

将Knob蛋白以5μg/mL，2.5μg/mL和1.25μg/mL三个浓度分别包被 96孔酶标板，分别以8种封闭液进行封闭(5％马血清，3％BSA，1％鱼源明胶，1％酪蛋白，5％脱脂乳，5％山羊血清和1％猪源明胶)，37℃条件下作用2h，按实施例1中1.6的流程操作，以试验结果确定最适封闭液。

1.3二抗最适稀释度

在上述流程操作基础上，以优化后的条件进行试验操作，将Goat anti-Dog IgG(HRP)进行2000倍倍比稀释(1：2000-1:64000)，100μl/ 孔，RT条件下1h。其余按照实施例1中1.6的流程进行；以试验结果确定二抗最适稀释度。

1.4优化封闭时间

分别选择37℃孵育0.5h、1h、1.5h、2h和2.5h五个时间间隔，其他流程按实施例1中1.6的流程进行。对比阴阳性血清OD值，选择最适的包被条件。

1.5优化血清和二抗反应条件

优化血清反应条件：在RT条件反应0.5h、1h和1.5h，在37℃条件反应0.5h、1h和1.5h等6种环境下进行。其他流程按上述进行，根据各种条件下的阴阳性血清样品OD值大小，其余按照实施例1中1.6的流程进行，确定血清样品最适反应条件。

优化二抗反应条件：在RT条件反应0.5h、1h和1.5h，在37℃条件下反应0.5h、1h和1.5h等6个时间间隔。其他流程按上述进行，根据各种条件下的阴阳性血清样品OD值大小，其余按照实施例1中1.6的流程进行，确定二抗最适反应条件。

1.6阴阳性临界值的确定

采用优化后的实验条件，检测10份CAdV-1阴性血清，计算10份样品OD450的平均值(Mean)和标准差(SD)，根据公式计算阴阳性样品的临界值(阴阳性临界值＝Mean+3SD)

2、试验结果

2.1 Knob蛋白最适包被浓度与待检样品稀释倍数

采用方阵滴定法将Knob蛋白以5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL， 0.62μg/mL，0.31μg/mL和0.165μg/mL等6个浓度分别包被96孔酶标板，阴阳性血清样品做连续4次2倍倍比稀(从1：50至1：400)。检测结果显示(图3)：包被抗原浓度小于2.5μg/mL时，阳性血清OD值明显减小；阳性血清样品稀释度为1：100时，ELISA检测的OD值在2-2.5 范围内。因此，以2.5μg/mL为最适蛋白包被浓度，以1：100为血清最适稀释度。

2.2封闭液的选择

将Knob蛋白以5μg/mL，2.5μg/mL和1.25μg/mL三个浓度分别包被96孔酶标板，分别以8种封闭液进行封闭(5％马血清，3％BSA，1％鱼源明胶，1％酪蛋白，5％脱脂乳，5％山羊血清和1％猪源明胶)，试验结果显示(图4)，3％BSA封闭组的P/N值在不同浓度抗原包被条件下均最高。因此以3％BSA为最适封闭液。

2.3二抗最适稀释倍数

将Goat anti-Dog IgG(HRP)进行2000倍倍比稀释(1：2000-1:64000)，在上述流程操作基础上，以优化后的条件按上述流程操作，检测结果显示 (图5)，随二抗稀释度的增大，阴、阳性血清样品的P/N值均先升高然后降低；最大P/N值对应的二抗稀释度为1：8000。因此二抗最适稀释度为1：8000。

2.4最适封闭时间

在37℃条件下，选择0.5h、1h、1.5h、2h和2.5h等5个时间间隔进行封闭，试验结果显示(图6)：阳性血清OD值较稳定，但阴性血清OD值随封闭时间(2h以内)延长而减小，2h左右阴性血清OD值趋于稳定，因此，确定以2h为最适封闭时间。

2.5优化血清反应条件

在RT条件反应0.5h、1h和1.5h，在37℃条件反应0.5h、1h和 1.5h等6种环境下进行试验，其他流程按上述进行，三种样品的ELISA 检测结果如图7，OD450值随作用时间延长而逐渐升高，室温条件下孵育的OD450均明显低于37℃条件下孵育的OD450，在37℃孵育1h后，OD450趋于平稳，所以选取37℃，1h作为血清最佳孵育条件。

2.6优化二反应育条件

分别选取RT条件0.5h、1h和1.5h，以及37℃条件0.5h、1h和1.5 h对二抗反应条件进行优化。三种血清样品的ELISA检测结果如图8，作用时间越长，OD值越高，但在两种温度条件下反应1h后OD值均趋于稳定，室温条件下的阴性血清OD值略低于37℃条件，因此以RT条件下作用1h为血清最佳反应条件。

2.7阴阳性临界值的确定

采用本方法检测22份CAdV-1阴性血清，结果显示，22份阴性样品的OD450均值为0.298，SD为0.078，通过计算确定阴阳性样品的临界值为0.376。待检血清OD450值大于0.376定为阳性，小于0.376定为阴性。

试验例2本发明试剂盒的重复性、敏感性以及特异性SN对比试验

1试验方法

1.1重复性试验

板间重复性实验：以同一批次纯化的Knob蛋白包被的酶标板，检测 10份阳性和2份阴性血清样品，每份样品做4个平行对照，重复检查2 次，对所得数据进行统计分析，获得批内差异值。

板内重复性实验：以3个不同批次纯化的Knob蛋白包被酶标板，检测10份阳性和2份阴性血清样品，每份样品重复检测2次，对所得数据进行统计分析，获得批间差异值。变异系数(Coefficient of variation，CV) ＝(标准差SD/平均值Mean)×100％

1.2敏感性试验

以SN法和CAdV-1血清抗体间接ELISA方法对5份CAdV-1阳性样品进行敏感性检测，将5份样品进行倍比稀释，每个稀释倍数设置2个重复，SN和ELISA检测均设置阴阳性对照，根据检测结果确定两种检测方法可检测CAdV-1阳性血清的最大稀释倍数，从而对比两种检测方法的敏感性。

1.3特异性试验

利用CAdV-1抗体ELISA方法检测三种常见的犬科动物病毒阳性血清：CDV、CPV、和CPIV。经HA-HI检测，CPV和CPIV阳性血清效价分别为1:512和1：256；经SN方法检测，CDV阳性血清样品效价为1:512。每份血清重复检测2次，同时添加CAdV-1阳性血清对照。记录样品的OD450值，比较样品OD450值与临界值的大小，判断检测样品的阴阳性。

1.4 SN对比试验

采用SN和CAdV-1抗体ELISA两种检测方法分别检测本实验室保存的80份血清样品，SN检测法以4.1.9流程进行，CAdV-1抗体ELISA法以优化后的最适条件进行。参照马凡舒的计算方法(马凡舒，2016)，计算CAdV-1抗体ELISA法与SN法检测结果的敏感性、特异性和符合率。

2、试验结果

2.1重复性试验

2.1.1板间重复性试验

板间重复性实验是以同一批次纯化的Knob蛋白包被的酶标板，检测 10份阳性和2份阴性血清样品，每份样品做4个平行对照，重复检查2 次，以确定板间重复性，结果显示(表3)：板间CV值在0.43％～5.40％之间，小于10％。2.1.2板内重复性试验

板内重复性实验是以3个不同批次纯化的Knob蛋白包被酶标板，检测10份阳性和2份阴性血清样品，每份样品重复检测2次，以确定板间重复性，结果显示(表3)，板间CV值在0.36％～8.07％之间，也小于10％。板间和板内重复实验结果表明，CAdV-1抗体ELISA检测法稳定性良好。

表3重复性试验结果

2.2敏感性试验

通过检测8份CAdV-1阳性样品的最大稀释倍数来评估ELISA和SN 的敏感性。SN方法对应的CAdV-1阳性血清样品的稀释度为1:1-1:512；设置两组CAdV-1抗体ELISA检测法对应的阳性血清稀释度分别为1： 20-1：10240和1：50-1：12800。每个稀释度做3个平行对照。试验结果显示(表4)，ELISA可检出阳性血清最高稀释度为1:3200；SN法可检出阳性血清最高稀释度为1：256。结果显示基于Knob蛋白的ELISA检测方法的敏感性远高于SN法。

表4 ELISA和SN的敏感性

2.3特异性试验

以CDV、CPV和CPIV阳性血清来检测本实验建立的间接ELISA检测法的特异性。结果显示(表5)，CDV、CPV和CPIV阳性血清ELISA 检测的OD450值分别为0.237，0.22和0.198，均小于临界值0.376。检测结果说明，本实验建立的CAdV-1抗体ELISA方法与犬科其他病毒阳性血清不发生交叉反应，特异性较好。

表5 ELISA特异性检测

2.4与SN对比试验结果

以SN和ELISA两种检测方法分别对本实验室保存的80份血清进行检测，按4.1.9所述步骤进行SN检测，以优化后的最适条件进行ELISA 检测。比对两种方法的检测结果，计算ELISA法与SN法检测结果的敏感性、特异性和符合率。结果显示(表6)，SN法检出阴、阳性样品总数分别为10和70份，CAdV-1抗体ELISA检出阴、阳性样品总数分别为 11和69份。由参考公式算得，ELISA与SN检测结果的敏感性(Se)为 97.14％，特异性(Sp)为90％，符合率为93.57％。

表6 ELISA与SN比对试验

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院特产研究所

<120> 犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒及其应用

<130> JL-2001-180515A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 1

gcgagctcct atggactgga cctgatcca 29

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 2

gactacataa ttggaagtgg atagacgtca a 31

Claims (10)

1.一种犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒，包括包被抗原的ELISA板，酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、封闭液、TMB显色液、终止液、标准CAdV-1阳性血清样品、标准CAdV-1阴性血清样品，其特征在于，所述的抗原是Knob蛋白。

2.按照权利要求1所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的Knob蛋白的制备方法包括：将Knob蛋白的编码基因通过原核表达系统在低温条件下表达，获得重组Knob蛋白。

3.按照权利要求2所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括：(1)以提取的CAdV-1 DNA作为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物扩增Knob全长基因；(2)将所扩增的Knob全长基因连接到原核表达载体后在大肠杆菌中进行诱导表达并纯化，即得。

4.按照权利要求1所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为HRP标记的Goat anti-DogIgG。

5.按照权利要求1所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液为BSA。

6.按照权利要求5所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液为3％BSA。

7.按照权利要求1所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，Knob蛋白包被ELISA板的浓度为2.5μg/mL。

8.按照权利要求1所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液是PBST。

9.按照权利要求1所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为浓度为1M的HCL溶液。

10.权利要求1-9任何一项所述的犬腺病毒1型抗体ELISA检测试剂盒在制备检测犬腺病毒1型抗体的试剂中的应用。