CN104634978A - 一种分型检测腺病毒中和抗体的方法以及用于分型检测腺病毒中和抗体的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分型检测腺病毒中和抗体的方法以及用于分型检测腺病毒中和抗体的试剂盒。本发明提供了一种分型检测腺病毒中和抗体的方法，其特征在于利用不同血清型腺病毒的分型中和抗原分型检测样品中腺病毒中和抗体，其中所述分型中和抗原为所述血清型腺病毒的三聚体形式的knob蛋白。还提供了以三聚体形式的knob蛋白为中和抗原检测腺病毒中和抗体的试剂盒。该方法与当前标准的病毒中和试验相比，操作更简单，检测耗时少，具有较高的安全性，而且成本低廉，对操作环境没有严格要求。另外，本发明中采用的抗原蛋白易于纯化，经过一步纯化即可达到检测需要的纯度。

Description

一种分型检测腺病毒中和抗体的方法以及用于分型检测腺病毒中和抗体的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种分型检测腺病毒中和抗体的方法以及用于分型检测腺病毒中和抗体的试剂盒，具体涉及一种以一种人血清型腺病毒的三聚体形式的knob蛋白为抗原分型检测所述血清型腺病毒的中和抗体的免疫学新方法，以及以所述血清型腺病毒的三聚体形式的konb蛋白作为中和抗原的分型检测试剂盒。 
背景技术
腺病毒自上世纪五十年代发现并成功分离，至今已经陆续发现了百余种腺病毒血清型，其中人腺病毒有57种血清型（Ad1-Ad57），分为A、B、C、D、E、F、G七个亚群[1,2]。腺病毒的衣壳为二十面体结构，由240个六邻体（hexon）、12个五邻体（penton）以及12根纤维蛋白（fiber）构成[3]，并编码主要的病毒中和表位。其中，12根纤维蛋白以五邻体蛋白为基底由衣壳表面伸出，其顶端形成三聚体形式的头节区（即knob蛋白），纤维蛋白有亚群和血清特异性，含有负责体外血细胞凝集的种属特异性抗原决定位点。头节区可以与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染中起着重要的作用[4]。 
腺病毒长期存在于人群中，可通过人、水、媒介物和器械传播。腺病毒的感染和传播具有地域和性别差异，部分血清型在儿童和军营人员中更易发生感染和大规模流行，大多数婴幼儿在出生后的5年内至少感染过1种腺病毒血清型。腺病毒常在咽、结膜、肠道及淋巴组织内繁殖，并导致各种各样的临床症状，如呼吸系统的感染、结膜炎、胃肠炎、肝炎、出血性膀胱炎、神经系统的紊乱等。腺病毒在有免疫力的宿主体内感染是温和的，而且具有自限性[5]。体液免疫在腺病毒感染的免疫应答中起重要作用，有腺病毒血症的造血干细胞移植 （HSCT）接受者，在免疫应答清除病毒的过程中会产生高水平的血清型特异性抗体。根据人群血清特异性抗体调查和病毒分离，可知腺病毒感染十分广泛，而且不同血清型的感染程度及地域差异较大。包括中国在内的许多国家很少有实验室对腺病毒进行常规检测，更少进行分型检测。直到目前血清型和亚群特异性的抗体仍只能通过病毒中和实验和血凝抑制法检测。 
随着免疫学、分子病毒学、分子生物学等各个学科的快速发展，以腺病毒作为载体在基因治疗和疫苗开发中的应用已成为研究的热点。由于腺病毒载体外源基因容量大、宿主范围广泛、制备工艺简便、产毒滴度高、基因组不与宿主细胞重组等优点，使得腺病毒成为基因治疗的理想载体而被广泛研究。目前应用最多的腺病毒载体是人血清5型腺病毒（Ad5），它也是当前肿瘤基因治疗和人类免疫缺陷病毒（HIV）疫苗的研究的主要病毒载体。另外，诸如乙肝病毒、疟疾、结核等病原体的疫苗研制也都十分重视5型腺病毒载体的应用。然而，重组5型腺病毒（rAd5）的一个主要问题是人体针对载体本身存在十分普遍的预存免疫，即人体内较高的针对Ad5的中和抗体水平会显著地降低腺病毒载体的转导效率和转基因表达水平。另外，临床研究发现当机体存在中和抗体时免疫腺病毒载体疫苗甚至可能引发意外的安全风险。最新的流行病学研究表明：我国及欧美国家Ad5中和抗体的血清阳性率为60-80％，而在非洲的撒哈拉和东南亚的部分地区高于90％[6-8]。除了预存免疫问题，rAd5可以说是一种几乎完美的基因治疗和疫苗载体。为了克服预存免疫问题，多个人稀有血清型腺病毒如Ad26、Ad35、Ad48等已被开发改造为疫苗和基因治疗载体并进入临床研究[9,10]。然而部分血清型腺病毒的全球流行病学研究显示，不同血清型的感染程度具有明显的地域差异，所以新开发的稀有血清型腺病毒载体同样可能面临预存免疫问题。因此，在一种新的腺病毒载体疫苗或基因治疗药物被使用以前，对应用人群进行腺病毒中和抗体水平的检测将十分有必要。另外，以不同血清型腺病毒为载体的疫苗和基因治疗药物在临床前研究时也需要对实验动物进行腺病毒中和抗体的检测。随着生物、化学发光技术的进步，定量的病毒中和实验方法已被建立起来。其策略主要是通过构建病毒载体表达各种发光报告基因，而血清中存在的中和抗体能阻断携带报告基因的重组腺病毒对人 胚肾细胞293（HEK293）等细胞的感染，再通过发光底物对该报告基因表达的受抑制程度做出定量，从而可以对血清样本中中和抗体的存在情况进行检测。病毒中和试验是当前分型检测人血清中腺病毒中和抗体滴度的标准方法。然而该方法成本较高、病毒载体的操作难度大、且受限于一些复制异常的病毒，因此目前仅限于实验室研究，且难以实现对所有血清型病毒的检测[11]。因此，迫切需要一种更简单、全面的方法分型检测腺病毒中和抗体，以指导新的疫苗和基因治疗载体的开发和临床研究。利用分型中和抗原建立免疫学方法来检测血清中的中和抗体是一种十分理想的检测手段，但至今尚未发现理想的分型抗原及分型中和抗原。 
发明内容
本发明通过分析确认了一种腺病毒分型中和抗原，并建立了一种经济、方便、全面的分型检测腺病毒中和抗体的免疫学新方法，以便于对人体进行腺病毒感染的分型检测，即利用不同血清型腺病毒中和抗原分型检测人血清中的腺病毒中和抗体水平，以分析人群感染不同血清型腺病毒的情况，从而利于基于腺病毒载体进行的基因治疗和疫苗的研究和应用。 
本发明人首先原核表达不同亚群多个血清型腺病毒的knob蛋白，再通过血清交叉实验确定其为一种理想的腺病毒分型中和抗原。同时，发明人以同属C亚群的Ad2和Ad5为基础，对比标准的病毒中和试验，建立酶联免疫吸附（ELISA）法检测了人血清中Ad2和Ad5的中和抗体的滴度。 
本发明的第一方面提供了一种分型检测腺病毒中和抗体的方法，其特征在于利用不同血清型腺病毒的分型中和抗原分型检测样品中腺病毒中和抗体，其中所述分型中和抗原为所述血清型腺病毒的三聚体形式的knob蛋白。 
优选地，所述方法包括以下步骤： 
a)使待测样品与一种血清型腺病毒的三聚体形式的knob蛋白接触； 
b)向步骤a)的所得物中加入带标记的对应二抗； 
c)直接检测所述标记或者向步骤b)的所得物中加入与所述标记发 生反应的指示剂后检测。 
优选地，所述方法为ELISA法。优选地，所述方法为间接ELISA法。 
所述血清型腺病毒为人血清型腺病毒，优选地，所述人血清型腺病毒选自人血清型腺病毒Ad1-Ad57。优选地，所述人血清型腺病毒为Ad12、Ad3、Ad1、Ad2、Ad5、Ad6、Ad37、Ad4或Ad41。 
优选地，所述样品为血清。优选地，所述样品为人血清或以人血清型腺病毒载体免疫的非人哺乳动物的血清。因为先前的研究表明腺病毒载体免疫的小鼠、猴子同样产生针对knob特异的中和抗体[12]，所以，本发明的方法也适于检测小鼠等小型实验动物的血清。优选地，所述非人哺乳动物选自小鼠、家兔和猴子。 
本发明的第二方面提供了不同血清型腺病毒的三聚体形式的knob蛋白用于分型检测样品中腺病毒中和抗体的用途。 
优选地，所述不同血清型腺病毒为人血清型腺病毒。优选地，所述人血清型腺病毒选自人血清型腺病毒Ad1-Ad57。优选地，所述人血清型腺病毒为Ad12、Ad3、Ad1、Ad2、Ad5、Ad6、Ad37、Ad4或Ad41。 
优选地，所述样品为血清。所述样品为人血清或以人血清型腺病毒载体免疫的非人的哺乳动物的血清，所述非人哺乳动物优选地选自小鼠、家兔和猴子。 
本发明的第三方面提供了一种分型检测样品中腺病毒中和抗体的试剂盒，其特征在于利用不同血清型腺病毒的三聚体形式的knob蛋白作为中和抗原来分型检测相应血清型腺病毒的中和抗体。 
优选地，所述血清型腺病毒为人血清型腺病毒。优选地，所述血清型腺病毒选自人血清型腺病毒Ad1-Ad57。优选地，所述人血清型腺病毒选自Ad12、Ad3、Ad1、Ad2、Ad5、Ad6、Ad37、Ad4或Ad41。 
优选地，所述样品为血清。优选地，所述样品为人血清或以人血清型腺病毒载体免疫的非人哺乳动物的血清，所述非人哺乳动物优选地选自小鼠、家兔和猴子。 
优选地，所述分型检测样品中腺病毒中和抗体的试剂盒为间接ELISA试剂盒，其包含：包被有三聚体形式的knob蛋白的ELISA反 应板、酶标二抗、所述酶标二抗的底物。为方便使用，所述试剂盒中还可以包含样品稀释液、洗涤浓缩液和终止液等。 
所述间接ELISA试剂盒除了ELISA反应板包被的是三聚体形式的knob蛋白以外，其他试剂均为本领域间接ELISA法中的常规试剂，如在《分子克隆实验指南》（第三版，科学出版社）中公开的那些。酶标二抗的实例为辣根过氧化物酶标记的山羊抗人、山羊抗非人哺乳动物（例如鼠、猴、兔）等的IgG。酶标二抗的底物的实例为邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）等。样品稀释液的实例为含有0.05%Tween-20的PBS缓冲液。洗涤浓缩液的配方实例为10×PBS（KH2PO42g；Na2HPO4·12H2O29g；NaCl80g；KCl2g）加Tween-2020mL，加蒸馏水至1000mL，使用时，将所述洗涤浓缩液以1:10稀释制备洗涤液。终止液的实例为2M硫酸溶液。 
优选地，所述间接ELISA试剂盒还可包括使用说明书。 
可使用本领域已知的间接ELISA试剂盒的常规使用方法使用本发明的间接ELISA试剂盒。 
具体地，所述用于分型检测腺病毒中和抗体的间接ELISA试剂盒的使用方法如下： 
（1）用样品稀释液稀释血清得到梯度稀释的血清稀释液，将其加加入到包被有三聚体形式的knob蛋白的ELISA反应板中，并进行孵育； 
（2）用洗涤液洗涤； 
（3）加入所述血清对应的二抗；并进行孵育； 
（4）加入所述二抗的底物，进行反应； 
（5）终止反应，并进行检测。 
其中，本领域技术人员可根据需要决定使用的血清稀释滴度、加入的血清稀释液的体积、洗涤的次数、所使用的二抗和其底物、两次孵育的时间以及终止反应后如何进行检测。其他反应条件为本领域间接ELISA检测法的常规条件。例如，当所述二抗为辣根过氧化物酶标记的二抗时，可使用四甲基联苯胺（TMB）作为底物，终止反应后，可在酶标仪上于450nm测各孔的OD值。 
本发明的第四方面提供了三聚体形式的konb蛋白用于制备用于分型检测血清型腺病毒的试剂的用途。 
本发明提供的分型检测腺病毒中和抗体的方法与当前标准的病毒中和试验相比，操作更简单，检测耗时少，具有较高的安全性，而且成本低廉，对操作环境没有严格要求。另外，本发明中采用的抗原蛋白易于纯化，经过一步纯化即可达到检测需要的纯度。此外，本发明提供的腺病毒中和抗体检测方法所需的血清量很少。 
附图说明
图1.原核表达载体构建示意图和克隆结果。图1a为原核表达载体pRSET-B的示意图，图1b的上图为正确克隆的电泳图，下图为克隆的酶切鉴定结果。 
图2.抗原蛋白纯化结果和性质鉴定。左图为纯化后各knob蛋白的还原性SDS-PAGE电泳结果，可见蛋白条带在22KD左右。右图为非还原性SDS-PAGE电泳结果，可见蛋白条带位于66KD附近，表明纯化的knob蛋白为三聚体状态。 
图3.免疫血清交叉实验。将以不同的人血清型腺病毒免疫的兔血清分别与纯化的三聚体knob蛋白进行交叉反应，当血清1：100稀释时每种血清型均与对应的knob蛋白表现出良好的特异性。 
具体实施方式
本说明书和权利要求书所使用的缩写的含义如下所示： 
本发明实施例中未说明来源的试剂和仪器均为普通市售品。 
下面以具体的实施例，对本发明的技术方案做进一步的技术说明；但本发明并不限于这些实施例。 
实施例1 不同人血清型腺病毒knob蛋白原核表达载体的构建 
1.目的基因的获得 
首先从GenBank获得已发现的6个亚群（A-F）内的代表性人血清型腺病毒knob蛋白的基因序列，合成（上海生工）两端加入XhoⅠ（酶切位点：CTCGAG）和NcoⅠ（酶切位点：CCATGG）两种限制性内切酶的酶切位点的目的基因，即SEQ ID NO:1-9表示的DNA序列（见下文）。knob基因来源血清型病毒包括：Ad12（A亚群）、Ad3（B亚群）、Ad1、2、5、6（C亚群）、Ad37（D亚群）、Ad4（E亚群）、Ad41（F亚群）。其中C亚群选择4种亚型分别用于分析同亚群内的血清型特异性。 
将合成的带有knob蛋白DNA序列的质粒及pRSET-B空质粒（美国Invitrogen）用NcoⅠ、XhoⅠ两种限制性内切酶（美国NEB）于37℃酶切2小时。配制1.0%的琼脂糖凝胶，将酶切产物进行核酸琼脂糖凝胶电泳，100V，30min。电泳结束后在紫外灯下观察，对比1kb DNALadder（美国NEB），切下约500bp的knob基因以及约3000bp的pRSET-B线性质粒载体条带。胶回收试剂盒（北京天根生化科技）分别回收切下的目的片段。回收后配制1.0%的琼脂糖凝胶，再次进行核酸琼脂糖凝胶电泳，120V，20min与1kb DNA Ladder（美国NEB）亮度对比，估算回收的线性DNA浓度。 
2.表达载体的构建 
分别取回收的线性knob片段50ng，线性pRSET-B质粒载体50ng、T4DNA连接酶（美国MBI）0.5μL，用无菌水补足至10μL，将连接体系置于16℃过夜。将连接产物分别转入大肠杆菌DH5α感受态细胞（大连宝生物）中，涂于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，置于37℃恒温箱中过夜培养，次日取出，于4℃下保存。从上述平板中挑取生长良好的单菌落，接于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，过夜培养。取菌液2mL，按质粒提取试剂盒（北京天根生化科技）说明书操作，提取扩增的质粒。 
对获得的质粒进行酶切鉴定，正确的克隆切出3000bp和500bp两条带（见图1）。共构建pRSETB-knob1、pRSETB-knob2、pRSETB-knob3、pRSETB-knob4、pRSETB-knob5、pRSETB-knob6、pRSETB-knob12、pRSETB-knob37、pRSETB-knob419个原核表达质粒。 
SEQ ID NO:1（562bp）为合成的编码Ad1knob蛋白（knob1）的 核苷酸序列，序列如下： 
CTCGAGACTGTGGACAACTCCTGACCCATCACCTAATTGTCAAATACACTCAGAAAAAGATGCTAAGCTAACACTAGTTTTAACTAAATGCGGCAGTCAGGTACTTGCAACTGTGTCAGCACTGGCTGTAAGGGGCAGCCTAGCTCCTATTAGCGGAACAATAAGTAGTGCTCACATTATTCTCAGATTTAATGAACATGGAGTGCTAATGAATCATTCTAGTTTGGATCCCCAATACTGGAATTTCAGAAAAGGGGATTTAACAAACGCTACAGCATATACTAACGCAGTTGGTTTTATGCCCAACCTTAAAGCTTACCCAAAAACTCAAAGTAGAACTGCAAAAAGCAACATTGTTAGTCAGGTTTATCTTAATGGAGAAAAAGAAAAACCAATGACACTCACTATTACACTTAATGGAACTGATGAAAATCAAACCACTCCCGCCAGTACATACTCAATTTCATTTTCATGGAGCTGGCCTAGCAATCAAACATACATTGGTCAAACATTTGCCACTAATTCCTACACCTTCTCCTACATTGCCCAAGAATAACCATGG 
SEQ ID NO:2（562bp）为合成的编码Ad2knob蛋白（knob2）的核苷酸序列，序列如下： 
CTCGAGACTGTGGACAACCCCAGACCCATCTCCTAACTGCAGAATTCATTCAGATAATGACTGCAAATTTACTTTGGTTCTTACAAAATGTGGGAGTCAAGTACTAGCTACTGTAGCTGCTTTGGCTGTATCTGGAGATCTTTCATCCATGACAGGCACCGTTGCAAGTGTTAGTATATTCCTTAGATTTGACCAAAACGGTGTTCTAATGGAGAACTCCTCACTTAAAAAACATTACTGGAACTTTAGAAATGGGAACTCAACTAATGCAAATCCATACACAAATGCAGTTGGATTTATGCCTAACCTTCTAGCCTATCCAAAAACCCAAAGTCAAACTGCTAAAAATAACATTGTCAGTCAAGTTTACTTGCATGGTGATAAAACTAAACCTATGATACTTACCATTACACTTAATGGCACTAGTGAATCCACAGAAACTAGCGAGGTAAGCACTTACTCTATGTCTTTTACATGGTCCTGGGAAAGTGGAAAATACACCACTGAAACTTTTGCTACCAACTCTTACACCTTCTCCTACATTGCCCAGGAATAACCATGG 
SEQ ID NO:3（577bp）为合成的编码Ad3knob蛋白（knob3）的核苷酸序列，序列如下： 
CTCGAGATTATGGACAGGTCCAAAACCAGAAGCCAACTGC ATAATTGAATACGGGAAAGAAAACCCAGATAGCAAACTAACTTTAATCCTTGTAAAAAATGGAGGAATTGTTAATGGATATGTAACGCTAATGGGAGCCTCAGACTATGTTAACACCTTATTTAAAAACAAAAATGTCTCCATTAATGTAGAATTATACTTTGATGCCACTGGTCATATATTACCAGACTTATCTTCTCTTAAAACAGATCTACAACTAAAATACAAGCAAACCACTCACTTTAGTGCAAGAGGTTTTATGCCAAGTACTACAGCGTATCCATTTGTCCTTCCTAATGCGGGAACAGATAATGAAAATTATATTTTTGGTCAATGCTACTACAAAGCAAGCGATGGCGCCCTTTTTCCGTTGGAAGTTACTGTTACGCTTAATAAACGCCTGCCAGATAGTCGCACATCCTATGTTATGACTTTTTTATGGTCCTTGAATGCTGGTCTAGCTCCAGAAACTACTCAGGCAACCCTCATAACCTCCCCATTTACCTTTTCCTATATTAGAGAAGATGACTGACCATGG 
SEQ ID NO:4（571bp）为合成的编码Ad4knob蛋白（knob4）的核苷酸序列，序列如下： 
CTCGAGAAAAGACTATGATAAATTAACTTTGTGGACAACGCCTGACCCATCACCAAACTGTCAAATACTTGCAGAAAATGATGCAAAACTAACACTTTGCTTAACTAAGTGTGACAGTCAAATACTGGCCACTGTATCAGTTTTGGTTGTTAGAAGTGGAAACTTAAACCCAATTACTGGCACAGTAAGCAGTGCTCAAGTTTTTCTACGTTTTGATGCAAACGGTGTTCTTTTAACAGAACACTCTACACTAAAAAAATACTGGGGCTACAGGCAAGGAGATAGCATAGATGGCACTCCATACACCAATGCTGTTGGTTTCATGCCAAATTCAACAGCTTATCCAAAGACCCAAAGTTCTACTACTAAAAATAATATAGTGGGACAAGTATACATGAATGGAGATGTTTCAAAACCCATGCTTCTTACTATAACTCTTAATGGTACTGATGACACCACCAGTGCATACTCAATTTCATTTTCATACACCTGGACTAACGGAAGCTATATCGGAGCAACATTTGGAGCTAACTCATACACCTTCTCCTACATAGCCCAAGAATAACCATGG 
SEQ ID NO:5（559bp）为合成的编码Ad5knob蛋白（knob5）的核苷酸序列，序列如下： 
CTCGAGATTGTGGACCACACCAGCTCCATCTCCTAACTGT AGACTAAATGCAGAGAAAGATGCTAAACTCACTTTGGTCTTAACAAAATGTGGCAGTCAAATACTTGCTACAGTTTCAGTTTTGGCTGTTAAAGGCAGTTTGGCTCCAATATCTGGAACAGTTCAAAGTGCTCATCTTATTATAAGATTTGACGAAAATGGAGTGCTACTAAACAATTCCTTCCTGGACCCAGAATATTGGAACTTTAGAAATGGAGATCTTACTGAAGGCACAGCCTATACAAACGCTGTTGGATTTATGCCTAACCTATCAGCTTATCCAAAATCTCACGGTAAAACTGCCAAAAGTAACATTGTCAGTCAAGTTTACTTAAACGGAGACAAAACTAAACCTGTAACACTAACCATTACACTAAACGGTACACAGGAAACAGGAGACACAACTCCAAGTGCATACTCTATGTCATTTTCATGGGACTGGTCTGGCCACAACTACATTAATGAAATATTTGCCACATCCTCTTACACTTTTTCATACATTGCCCAAGAATAACCATGG 
SEQ ID NO:6（553bp）为合成的编码Ad6knob蛋白（knob6）的核苷酸序列，序列如下： 
CTCGAGACTTTGGACAACACCAGACCCATCCCCAAATTGCAGAATTGCTTCAGATAAAGACTGCAAGCTAACTCTGGCGCTAACAAAATGTGGCAGTCAAATTTTGGGCACTGTTTCAGCTTTGGCAGTATCAGGTAATATGGCCTCCATCAATGGAACTCTAAGCAGTGTAAACTTGGTTCTTAGATTTGATGACAACGGAGTGCTTATGTCAAATTCATCACTGGACAAACAGTATTGGAACTTTAGAAACGGGGACTCCACTAACGGTCAACCATACACTTATGCTGTTGGGTTTATGCCAAACCTAAAAGCTTACCCAAAAACTCAAAGTAAAACTGCAAAAAGTAATATTGTTAGCCAGGTGTATCTTAATGGTGACAAGTCTAAACCATTGCATTTTACTATTACGCTAAATGGAACAGATGAAACCAACCAAGTAAGCAAATACTCAATATCATTCAGTTGGTCCTGGAACAGTGGACAATACACTAATGACAAATTTGCCACCAATTCCTATACCTTCTCCTACATTGCCCAGGAATAACCATGG 
SEQ ID NO:7（520bp）为合成的编码Ad12knob蛋白（knob12）的核苷酸序列，序列如下： 
CTCGAGATGCAGCCTCATACAAGAGCTAGATGCAAAACTCACCCTGTGCTTAACAAAAAACGGATCTATTGTTAATGGCATTGTAAGTTTAGTGGGTGTTAAGGGTAATCTCCTAAATATCCAAAGTA CTACTACCACTGTAGGAGTGCATTTAGTGTTTGATGAACAGGGAAGATTAATCACATCAACCCCTACTGCCCTGGTTCCCCAAGCTTCGTGGGGATATAGACAAGGCCAATCAGTGTCTACCAATACTGTTACCAATGGTCTAGGTTTTATGCCTAATGTGAGTGCTTACCCTAGACCAAATGCCAGTGAGGCTAAAAGCCAAATGGTAAGTCTCACGTACTTACAGGGAGATACATCTAAACCTATAACAATGAAAGTTGCATTTAATGGCATTACGTCGCTAAATGGATACTCTTTAACATTCATGTGGTCAGGTCTATCAAACTATATAAATCAGCCTTTCTCTACACCATCCTGCTCCTTTTCTTACATTACCCAAGAATAACCATGG 
SEQ ID NO:8（556bp）为合成的编码Ad37knob蛋白（knob37）的核苷酸序列，序列如下： 
CTCGAGACTTTGGACAACACCAGACACATCTCCAAACTGCACAATTGCTCAAGATAAGGACTCTAAACTCACTTTGGTACTTACAAAGTGTGGAAGTCAAATATTAGCTAATGTGTCTTTGATTGTGGTCGCAGGAAAGTACCACATCATAAATAATAAGACAAATCCAAAAATAAAAAGTTTTACTATTAAACTGCTATTTAATAAGAACGGAGTGCTTTTAGACAACTCAAATCTTGGAAAAGCTTATTGGAACTTTAGAAGTGGAAATTCCAATGTTTCGACAGCTTATGAAAAAGCAATTGGTTTTATGCCTAATTTGGTAGCGTATCCAAAACCCAGTAATTCTAAAAAATATGCAAGAGACATAGTTTATGGAACTATATATCTTGGTGGAAAACCTGATCAGCCAGCAGTCATTAAAACTACCTTTAACCAAGAAACTGGATGTGAATACTCTATCACATTTAACTTTAGTTGGTCCAAAACCTATGAAAATGTTGAATTTGAAACCACCTCTTTTACCTTCTCCTATATTGCCCAAGAATGACCATGG 
SEQ ID NO:9（532bp）为合成的编码Ad41knob蛋白（knob41）的核苷酸序列，序列如下： 
CTCGAGAACCGCAGATCCATCACCTAACGCCACTTTTTATGAATCACTAGACGCCAAAGTGTGGCTAGTTTTAGTAAAATGCAACGGCATGGTTAACGGGACCATATCCATTAAAGCTCAGAAAGGCATTTTACTTAGACCTACAGCTAGTTTTATTTCCTTTGTCATGTATTTCTACAGCGATGGAACATGGAGAAAAAACTATCCCGTGTTTGACAACGAAGGGATACTAGCAAACAGTGCCACGTGGGGTTATCG ACAAGGACAGTCTGCCAACACTAACGTTTCTAATGCTGTAGAATTTATGCCTAGCTCTAAAAGATATCCCAATCAAAAAGGTTCTGAAGTTCAGAACATGGCTCTTACCTACACTTTTTTGCAAGGTGATCCTAACATGGCCATATCCTTTCAGAGTATTTATAATCATGCATTAGAAGGCTACTCATTAAAATTTACCTGGCGCGTTCGAAATAATGAACGTTTTGACATCCCCTGCTGCTCATTTTCTTATGTAACAGAACAATAACCATGG 
实施例2腺病毒knob蛋白的表达与纯化 
1.原核表达 
将上述9个原核表达质粒分别转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞（大连宝生物），涂于含有氨苄青霉素（100ug/ml）的LB固体培养基上，置于37℃恒温箱中过夜培养。在上述平板中挑取单菌落，接于5mL LB液体培养基中过夜培养。将得到的菌液接种于500mL LB液体培养基中，37℃振荡大量培养。菌体的OD600值达到0.8时，加入终浓度1mmol/L的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，北京鼎国），37℃诱导表达6小时。诱导前和诱导后的菌体留样进行SDS-PAGE电泳。 
2、蛋白纯化 
将大量诱导后菌体在4℃下，以4000rpm离心30min收菌，超声破碎15min，在4℃下，以12000rpm离心30min得上清、沉淀，分别取样电泳。上清经0.45μm滤膜过滤后，进行镍离子亲和柱（美国Invitrogen）纯化。先以基础液（NaH2PO450mM；NaCl500mM；pH=8.0）平衡镍离子亲和柱，再将滤后上清液挂柱。然后用基础液、含30mM咪唑的基础液、含50mM咪唑的基础液、含70mM咪唑的基础液、含100mM咪唑的基础液、含250mM咪唑的基础液、含500mM咪唑的基础液依次进行洗脱2个柱体积。每个梯度用1.5mL Ep管接样8管（每管1mL）。再用基础液和双蒸水分别洗2个柱体积，然后以20%乙醇洗一个柱体积，20%乙醇封柱，4℃保存。SDS-PAGE电泳鉴定每管收集溶液的蛋白含量及纯度。纯化后的蛋白纯度较高（图2左图），经非还原性SDS-PAGE电泳鉴定knob蛋白在溶液中呈三聚体状态（图2右图）。还原性SDS-PAGE电泳：向100μL收获的蛋白样品中加入20μL6×上样缓冲液（0.35M Tris-HCl（PH=6.8），30%甘油，10%SDS， 0.012%溴酚蓝，6%β-巯基乙醇），充分混匀，100℃煮沸5min后，4℃8000×g，离心10min，取40μL离心上清加载至12%SDS-PAGE凝胶中，160V电泳1h。非还原性SDS-PAGE电泳：向100μL收获的蛋白样品中加入20μL6×非还原性上样缓冲液（0.35M Tris-HCl（PH=6.8），30%甘油，10%SDS，0.012%溴酚蓝），充分混匀，4℃8000×g，离心10min，取40μL离心上清加载至8%SDS-PAGE凝胶中，120V电泳2h。 
实施例3ELISA检测 
1.ELISA检测用不同人血清型腺病毒免疫的兔血清 
由于国内外对腺病毒的分型检测很少，人体内又广泛存在腺病毒的交叉感染，因此想要获得每种血清型腺病毒单独感染的人血清十分困难。之前的研究表明，腺病毒在人和小鼠或家兔体内产生的免疫反应的确有一定差异，但这种差异主要体现在产生针对不同衣壳蛋白的中和抗体的量的差异[13],而以人腺病毒免疫家兔后产生的中和抗体识在别抗原的性质上与人体产生的类似[14]。因此我们以用人血清型腺病毒免疫的家兔血清进行交叉分析。 
分别以不同血清型腺病毒（Ad1、Ad2、Ad3、Ad4、Ad5、Ad6、Ad12、Ad37、Ad41）三聚体形式的knob蛋白（200ng/孔）包板，与用所述不同的血清型腺病毒（Ad1、Ad2、Ad3、Ad4、Ad5、Ad6、Ad12、Ad37、Ad41）分别免疫的兔血清（Anti-Ad1，2，3，4，5，6，12，37，41，来自北京302医院）进行间接ELISA实验。结果显示，不同血清型腺病毒免疫血清与knob蛋白间的特异性较高，无明显交叉活性，能够达到分型的目的（见图3）。发明人发现三聚体状态下的knob蛋白主要识别中和抗体，而腺病毒的中和抗体是血清型特异性的，因此knob蛋白可用于分型检测血清中的腺病毒中和抗体。间接ELISA使用的试剂如下： 
试剂： 
（a）包被液（pH=9.6；0.05M碳酸盐缓冲液）： 
Na2CO31.59g；NaHCO32.93g，加蒸馏水至1000mL； 
（b）洗涤液（pH=7.4；PBST）： 
PBS（KH2PO40.2g；Na2HPO4·12H2O2.9g；NaCl8.0g；KCl0.2g）+Tween-202mL，加蒸馏水至1000mL； 
（c）稀释液：PBS加0.05%的Tween-20 
（d）终止液：蒸馏水178.3mL，逐滴加入浓硫酸21.7mL； 
（e）底物缓冲液（pH=5.0；磷酸盐柠檬酸缓冲液）：0.2MNa2HPO4；0.1M柠檬酸； 
（f）TMB（北京鼎国）使用液： 
用双蒸水溶解TMB粉末，配制成1mg/mL，4℃，避光保存； 
（g）底物使用液：TMB使用液1mL；底物缓冲液10mL；3%H2O28μL。 
间接ELISA操作步骤： 
①包被：用包被液将纯化后的knob蛋白稀释至2ng/μL。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加100μL（200ng蛋白），阴性孔只加包被液，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤液洗3次，每次3分钟（简称洗涤，下同）。 
②封闭：用PBS配制5%的脱脂奶粉溶液，每孔200μL，37℃孵育2小时，洗涤。 
③加样：用稀释液分别按1：100、1：1000、1：10000稀释knob来源的不同血清型腺病毒免疫的兔血清（北京301医院貌盼勇教授赠送），加100μL血清稀释液于反应孔中，37℃孵育1小时，洗涤。 
④加标记二抗：于各反应孔中，加入1：100000稀释的HRP标记的山羊抗兔二抗（美国Sigma）100μL。37℃孵育1小时，洗涤。 
⑤加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μL，室温10～30分钟。 
⑥终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸50μL。 
⑦结果判定：酶标仪（美国伯乐）于450nm测各孔OD值，OD值大于0.3（颜色反应）且大于阴性孔2倍以上为阳性。 
2.间接ELISA检测人血清 
间接ELISA检测步骤同上，共检测了200份东北地区健康人血清（来源于吉林大学第一临床医院）。以病毒中和试验结果为标准，将Ad2和Ad5（同属C亚群）knob蛋白的检测结果与病毒中和试验（病毒中和试验的方法见实施例4）结果进行对比，发现两种方法检测结果的相似度超过90%，表明该方法的准确度较高（见表1），也进一步说明三聚体knob蛋白检测的主要是中和抗体。 
表1间接ELISA检测结果与病毒中和试验结果的比较 
临界值：以20份病毒中和试验阴性的血清按1:100稀释进行ELSIA检测，计算样本OD值的平均值（X）和标准方差（SD），根据统计学原则，设定待测样本OD值>X+2SD时为阳性。因此，临界值=X+2SD。 
血清阳性率=（OD>临界值的样本/200）×100% 
准确度=（ELISA与中和试验结果一致样本数（阴性+阳性）/200）×100% 
假阳性率=（ELISA检测阳性但中和试验阴性样本/200）×100% 
假阴性率=（ELISA检测阴性但中和试验阳性样本/200）×100% 
实施例4病毒中和试验 
用2×104个HEK293细胞（购自中国科学院上海生科院细胞资源中心）铺96孔板，置于37℃，5%CO2的细胞培养箱内培养24小时。取50μL表达荧光素酶的重组2型腺病毒（rAd2-Luc，其构建流程描述于参考文献15中）和重组5型腺病毒（rAd5-Luc，其构建流程描述于参考文件15中）（感染复数均为500）与50μL梯度稀释的人血清于37℃下孵育60分钟。将100μL病毒和血清混合物加入细胞培养板中进行感染。24小时后应用荧光素酶检测试剂盒（美国Promega）在FLUOROSKAN荧光酶标检测仪（美国Thermo）上检测560nm荧光活性值，分别以不加血清和高滴度阳性血清的病毒感染孔为对照，抑制超过90%病毒感染细胞为中和抗体阳性。 
参考文献 
以下参考文献以引用的方式全文纳入本文中。 
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Claims (10)

1.一种分型检测腺病毒中和抗体的方法，其特征在于利用不同血清型腺病毒的分型中和抗原分型检测样品中腺病毒中和抗体，其中所述分型中和抗原为所述血清型腺病毒的三聚体形式的knob蛋白。
2.权利要求1的方法，包括以下步骤：
a）使待测样品与一种血清型腺病毒的三聚体形式的knob蛋白接触；
b）向步骤a）的所得物中加入带标记的对应二抗；
c）直接检测所述标记或者向步骤b）的所得物中加入与所述标记发生反应的指示剂后检测；
优选地，所述方法为ELISA法，更优选地，所述方法为间接ELISA法。
3.权利要求1的方法，其中所述血清型腺病毒为人血清型腺病毒，优选地，所述人血清型腺病毒选自人血清型腺病毒Ad1-Ad57，优选地，所述人血清型腺病毒为Ad12、Ad3、Ad1、Ad2、Ad5、Ad6、Ad37、Ad4或Ad41。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述样品为血清，优选为人血清和以人血清型腺病毒载体免疫的非人哺乳动物的血清，优选地，所述非人哺乳动物选自小鼠、家兔、猴子。
5.不同血清型腺病毒的三聚体形式的knob蛋白用于分型检测样品中腺病毒中和抗体的用途。
6.一种分型检测样品中腺病毒中和抗体的试剂盒，其特征在于利用三聚体形式的knob蛋白作为中和抗原来分型检测相应血清型腺病毒的中和抗体。
7.权利要求6的试剂盒，其中所述血清型腺病毒为人血清型腺病毒，优选地，所述人血清型腺病毒选自人血清型腺病毒Ad1-Ad57，优选地，所述人血清型腺病毒为Ad12、Ad3、Ad1、Ad2、Ad5、Ad6、Ad37、Ad4或Ad41。
8.权利要求6的试剂盒，其中所述样品为血清，优选为人血清和以人血清型腺病毒载体免疫的非人哺乳动物的血清，优选地，所述非人哺乳动物选自小鼠、家兔、猴子。
9.权利要求7的试剂盒，其为间接ELISA试剂盒，包含包被有三聚体形式的knob蛋白的ELISA反应板、酶标二抗、所述酶标二抗的底物，优选地，所述试剂盒还包含样品稀释液、洗涤浓缩液和终止液，更优选地，所述试剂盒还包含使用说明书。
10.三聚体形式的konb蛋白用于制备用于分型检测不同血清型腺病毒的试剂的用途。
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